ES2711307T3 - Transformación de cítricos juveniles y maduros - Google Patents

Abstract

Un método para transformar una célula de una planta de cítrico madura, que comprende: (a) colocar secciones de tallo que comprenden células de la planta de cítrico madura en un medio de cultivo de tejidos adecuado para la formación de tejido de callo; (b) seleccionar solo las secciones de tallo que forman callos; (c) retirar el callo y el tejido meristemático resultante de dichas secciones de tallos seleccionadas; (d) poner en contacto una o más de las células de la planta de cítrico madura procedentes de dichas secciones de tallo seleccionadas con los callos retirados, con una bacteria de Agrobacterium spp. o Sinorhizobium spp. que comprende: (i) un primer ácido nucleico que comprende una región del gen vir de un plásmido Ti, en la que la región del gen vir actúa para introducir un ácido nucleico de interés en la célula de la planta de una manera dependiente de VirD2; y (ii) un segundo ácido nucleico que comprende una o más secuencias de límite de ADN-T unidas operablemente a un ácido nucleico de interés; y (e) seleccionar al menos una célula de la planta de cítrico transformada que comprende el ácido nucleico de interés.

Description

DESCRIPCION

Transformacion de cftricos juveniles y maduros

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de patente 61/527.995, presentada el 26 de agosto de 2011.

Descripcion del archivo de texto presentado electronicamente

Los contenidos del archivo de texto presentado electronicamente junto con la presente se incorporan como referencia en la presente en su totalidad: una copia en formato de lectura por ordenador del listado de secuencias (nombre del archivo: INTE_007_01WO_SeqList_ST25.txt, fecha de grabacion: 27 de agosto de 2012, tamano del archivo 52 kilobytes).

Campo tecnico de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la biotecnologfa vegetal. En particular, la invencion se refiere a metodos para transformar plantas lenosas. En algunas realizaciones, la invencion se refiere al preacondicionamiento de cftricos maduros para conseguir aumentar en gran medida la frecuencia de transformacion de cftricos maduros, produciendo con ello plantas de cftricos maduras, puas y celulas de cftrico transgenicas utilizando especies de Rhizobiales.

Antecedentes de la invencion

Todas las publicaciones y solicitudes de patente de la presente se incorporan como referencia en el mismo grado que si cada publicacion o solicitud de patente individual se hubiera indicado espedfica e individualmente para incorporarse como referencia. La siguiente descripcion incluye informacion que puede ser util para comprender la presente invencion. Esto no es un reconocimiento de que cualquier informacion proporcionada en la presente pertenezca a la tecnica anterior o sea pertinente para las invenciones reivindicadas en la presente ni que cualquier publicacion espedfica o impftcitamente mencionada pertenezca a la tecnica anterior.

La modificacion genetica permanente de plantas requiere la introduccion de nuevo material genetico en el genoma de una celula vegetal, un proceso denominado transformacion. La modificacion genetica permanente no quimerica y uniforme de plantas requiere la introduccion de nuevo material genetico en el genoma de una celula vegetal, seguido de la regeneracion de la planta completa a partir de esa celula individual. La modificacion genetica permanente no quimerica y uniforme de plantas puede surgir de la introduccion de nuevo material genetico en el genoma nuclear, mitocondrias o cloroplastos. Puesto que existen multiples copias de los organulos en cada celula, debe procederse con mucho cuidado para asegurarse de que todos estos organulos sean descendientes directos del organulo originariamente alterado. Por tanto, la mayona de las transformaciones de plantas se disenan para dirigirse al genoma nuclear y requieren la integracion de material genetico nuevo en un cromosoma, en donde se transforma en un locus de gen nuevo y permanente.

Para lograrlo deben desarrollarse metodos para introducir ADN que atraviesen varias barreras ffsicas, de modo espedfico la pared celular vegetal, la membrana celular y la envuelta nuclear. La pared celular vegetal merece una mencion especial porque, a diferencia de las paredes celulares animales, que tienen paredes extremadamente finas, las paredes celulares vegetales forman una estructura ngida y muy espesa (aproximadamente 20 nanometros) formada por fibrillas de celulosa rodeadas por un cemento de polisacaridos y protemas. Por tanto, la transformacion de plantas requiere de metodos especializados para la penetracion de la pared celular vegetal que sean distintos a los que se emplean para la transformacion de celulas animales, que generalmente implican metodos de transferencia de ADN directos.

Sumario de la invencion

La presente invencion es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente descripcion proporciona metodos para transformar plantas lenosas. En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona metodos para transformar plantas de especies de Citrus. En algunas realizaciones, la planta de una especie de Citrus es una planta juvenil o una planta madura. En algunas realizaciones, los metodos comprenden una etapa de preacondicionamiento del tejido. En algunas realizaciones, la transformacion es una transformacion directa, por ejemplo, bombardeo de microproyectiles revestidos con ADN u otros metodos de transformacion directos conocidos. En algunas realizaciones, la transformacion es una transformacion indirecta, por ejemplo, una transformacion mediada por microorganismos. En algunas realizaciones, la transformacion indirecta es mediada por especies de la familia Rhizobiaceae. En algunas realizaciones, la especie de la familia Rhizobiaceae es una especie de Agrobacterium. En algunas realizaciones, la especie de Agrobacterium es Agrobacterium tumefaciens. En otras realizaciones, la especie de la familia Rhizobiaceae es un microorganismo que no pertenece a Agrobacterium. En algunas realizaciones, el microorganismo que no pertenece a Agrobacterium es una especie de Sinorhizobium. En algunas realizaciones, la especie de Sinorhizobium es Sinorhizobium meliloti.

Los presentes inventores han descubierto un metodo de preacondicionamiento de tejidos que potencia en gran medida la transformacion de cftricos juveniles y maduros empleando al menos unos metodos de transformacion indirectos con Agrobacterium o con microorganismos que no pertenecen a Agrobacterium. En una realizacion de la invencion se emplea Sinorhizobium meliloti para la transformacion de cftricos juveniles y maduros. En otra realizacion de la invencion se emplea Agrobacterium tumefaciens para la transformacion de cftricos juveniles y maduros. Los expertos en la tecnica pueden utilizar otros metodos de transformacion indirectos que emplean otras bacterias de la familia Rhizobiaceae, y los expertos en la tecnica pueden utilizar otros metodos directos de transformacion de celulas vegetales, tales como el bombardeo de microproyectiles revestidos con ADN u otros metodos de transformacion conocidos.

En algunas realizaciones en las que se emplea Sinorhizobium meliloti para la transformacion de cftricos juveniles y maduros, el porcentaje resultante de brotes transformados basandose en la tolerancia a un agente de seleccion (por ejemplo, crecimiento de brotes en kanamicina) es de aproximadamente 13% a aproximadamente 21%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, o de aproximadamente 0,8% a aproximadamente 12,6%. En otras realizaciones en las que se emplea Sinorhizobium meliloti para la transformacion de cftricos juveniles y maduros, el porcentaje resultante de brotes transformados con tolerancia a un agente de seleccion (por ejemplo, crecimiento de brotes en kanamicina) vana de aproximadamente 0,1% al 50%; y en algunas realizaciones es de aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,6%, aproximadamente 0,7%, aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,9%, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, aproximadamente 25%, aproximadamente 26%, aproximadamente 27%, aproximadamente 28%, aproximadamente 29%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, o aproximadamente 50%.

En algunas realizaciones en las que se emplea Agrobacterium tumefaciens para la transformacion de cftricos juveniles y maduros, el porcentaje resultante de brotes transformados con tolerancia a un agente de seleccion (por ejemplo, crecimiento de brotes en kanamicina) es aproximadamente 4% a aproximadamente 16%, o de aproximadamente 17%. En otras realizaciones en las que se emplea Agrobacterium tumefaciens para la transformacion de cftricos juveniles y maduros, el porcentaje resultante de brotes transformados con tolerancia a un agente de seleccion (por ejemplo, crecimiento de brotes en kanamicina) vana de aproximadamente 0,1% al 50%; y en algunas realizaciones es de aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,6%, aproximadamente 0,7%, aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,9%, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, o aproximadamente 50%.

En ciertas realizaciones, el porcentaje de brotes enraizantes (es decir, brotes que producen rafces) despues de la transformacion con Sinorhizobium meliloti o Agrobacterium tumefaciens es de aproximadamente 2% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 1,5% a aproximadamente 5%, o de aproximadamente 2,7% a aproximadamente 3,6%. En otras realizaciones, el porcentaje de brotes enraizantes despues de la transformacion con Sinorhizobium meliloti o Agrobacterium tumefaciens vana de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20%; y en algunas realizaciones es de aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,6%, aproximadamente 0,7%, aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,9%, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, o aproximadamente 20%.

En ciertas realizaciones, el porcentaje de brotes injertados transgenicos despues de la transformacion con Sinorhizobium meliloti o Agrobacterium tumefaciens es de aproximadamente 0,3% a aproximadamente 6%, o de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 3,5%. En otras realizaciones, el porcentaje de brotes injertados despues de la transformacion con Sinorhizobium meliloti o Agrobacterium tumefaciens vana de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20%; y en algunas realizaciones es de aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,6%, aproximadamente 0,7%, aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,9%, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, o aproximadamente 20%.

En algunas realizaciones, la etapa de preacondicionamiento comprende inducir la formacion de callos a partir de secciones del tallo de una planta de cftrico en un medio. En algunas realizaciones, las secciones del tallo son secciones del tallo internodales preparados a partir de epicotilos de brotes recien emergidos de plantas de cftricos maduras (por ejemplo, los primeros brotes de yemas de plantas maduras tras el injerto en un portainjerto o brotes muy jovenes de plantas maduras). En algunas realizaciones, la etapa de preacondicionamiento comprende ademas retirar al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 99%, o 100% del callo y de cualquier region meristematica en desarrollo en el tejido inmediatamente adyacente. Los explantes preacondicionados despues son transformados por Sinorhizobium o por cualquier otro metodo conocido. Despues de la transformacion pueden trasladarse multiples cultivos de brotes a un medio de seleccion para diferenciar las celulas transformadas y no transformadas. Posteriormente se regeneran plantas de cftricos completas o brotes que van a ser injertados en portainjertos a partir de las celulas transformadas. La presente invencion proporciona ciertas ventajas frente a los metodos existentes porque puede usarse para transformar cftricos maduros, que normalmente son reacios a la transformacion incluso a eficacias moderadas.

En algunas realizaciones, la presente descripcion proporciona metodos para producir una planta juvenil o madura transformada que comprenden: (a) cultivar un tejido no meristematico de cftrico reacio a la transformacion en un medio de cultivo para producir tejido de callo; y (b) retirar el tejido de callo y todo el tejido meristematico. En algunas realizaciones, los metodos comprenden ademas (c) introducir un acido nucleico en una celula del tejido ya preacondicionado, produciendo con ello una celula transformada que comprende el acido nucleico; y (d) regenerar una planta transformada a partir de la celula transformada. El tejido puede ser una seccion de tallo internodal extirpada de los primeros brotes de yemas de plantas maduras de cftricos tras su injerto en un portainjerto, brotes muy jovenes de plantas maduras o un epicotilo internodal procedente de una plantula juvenil. En algunas realizaciones, el cftrico maduro es un naranjo valioso desde el punto de vista comercial, tal como 'Hamlin', 'Valencia' o 'Mid-Sweet'. En algunas realizaciones, el cftrico juvenil es un portainjerto, tal como 'Carrizo'.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo de preacondicionamiento comprende al menos un regulador del crecimiento vegetal, por ejemplo, una citoquinina. En otras realizaciones, el regulador del crecimiento se selecciona del grupo que consiste en 6-furfurilaminopurina (quinetina), 6-bencilaminopurina (6-BAP), 6-dimetialilaminopurina (2ip), trans-6-(4-hidroxi-3-metilbut-2-enil)aminourina (zeatina), TDZ, acido giberelico (AG), IAA, NAA, dicamba, 2,3,5-T y 2,4-D, y sus derivados funcionales. La concentracion del regulador del crecimiento en el medio de cultivo es de aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 25 mg/l, por ejemplo, aproximadamente 0,02 mg/l, aproximadamente 0,04 mg/l, aproximadamente 0,06 mg/l, aproximadamente 0,07 mg/l, aproximadamente 0,1 mg/l, aproximadamente 0,2 mg/l, aproximadamente 0,4 mg/l, aproximadamente 0,6 mg/l, aproximadamente 0,8 mg/l, aproximadamente 1,0 mg/l, aproximadamente 2,0 mg/l, aproximadamente 4,0 mg/l, aproximadamente 6,0 mg/l, aproximadamente 8,0 mg/l, aproximadamente 10,0 mg/l, aproximadamente 12,0 mg/l, aproximadamente 14,0 mg/l, aproximadamente 16,0 mg/l, aproximadamente 18,0 mg/l, aproximadamente 20,0 mg/l, aproximadamente 22,0 mg/l, o aproximadamente 25,0 mg/l. En algunas realizaciones, la concentracion del regulador del crecimiento en el medio de cultivo es de aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, de aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 5 mg/l, o de aproximadamente 0,05 mg/l a aproximadamente 8 mg/l. En algunas realizaciones, el acido nucleico se introduce en la celula mediante bombardeo de micropartfculas, electroforesis o electroporacion, o empleando una bacteria que pertenece a la familia Rhizobiaceae. En algunas realizaciones, el acido nucleico comprende un acido nucleico que es heterologo con la planta dicotiledonea. En algunas realizaciones, el acido nucleico comprende un gen de un marcador de seleccion, por ejemplo, un gen que codifica una actividad neomicina fosfotransferasa (nptII), o un gen que codifica un polipeptido que tiene actividad GUS. En algunas realizaciones, el acido nucleico es un vector que comprende un acido nucleico que comprende un gen heterologo con la planta.

En otras realizaciones, la etapa (c) del metodo comprende: seleccionar un brote que comprende una celula de cftrico maduro transformada; cultivar el brote bajo condiciones que estimulan el alargamiento del brote para producir al menos un brote de cftrico maduro transformado; y despues cultivar dicho al menos un brote transformado para producir una planta madura transformada. Por ejemplo, dicho al menos un brote transformado crece para producir una planta madura transformada despues de injertar y cultivar dicho al menos un brote transformado sobre un portainjerto. En algunas realizaciones, el portainjerto crece a partir de semillas.

En otras realizaciones, la etapa (c) del metodo comprende: seleccionar un brote que comprende una celula de cftrico juvenil transformada; cultivar el brote bajo condiciones que estimulan el alargamiento del brote para producir al menos un brote de cftrico juvenil transformado; y despues cultivar dicho al menos un brote transformado para producir una planta transformada. En algunas realizaciones, dicho al menos un brote transformado crece para producir una planta transformada despues de cultivar dicho al menos un brote transformado en un medio que estimula la formacion de rafces.

En otras realizaciones, la etapa (c) del metodo comprende: seleccionar un brote que comprende una celula de cftrico juvenil o maduro transformada; cultivar el cultivo bajo condiciones que estimulan el alargamiento del brote para producir al menos un brote transformado; clonar dicho al menos un brote de cftrico juvenil o maduro transformado; y despues cultivar dicho al menos un brote transformado para producir plantas juveniles o maduras transformadas, mediante el injerto de clones sobre portainjertos transformados o no transformados, o mediante el cultivo de los clones en un medio que estimula la formacion de rafces.

La presente descripcion proporciona ademas una celula de una planta o una parte de una planta de cftrico transformada producida mediante uno cualquiera de los anteriores metodos, y una planta transformada producida mediante uno cualquiera de los anteriores metodos. En algunas realizaciones, la planta transformada es un naranjo maduro o un portainjertos juvenil que expresa un polipeptido de interes. En algunas realizaciones, la planta transformada es una planta de cftrico que expresa un polipeptido que tiene actividad antibacteriana. La presente descripcion proporciona ademas una semilla producida por una planta transformada descrita anteriormente, en la que la semilla comprende el acido nucleico transformado en el cultivo de celulas de la planta de cftrico y una planta cultivada a partir de la semilla.

La presente descripcion proporciona ademas metodos para producir una planta de cftrico que comprende un genoma de plastido transformado, que comprenden: (a) cultivar un tejido no meristematico de cftrico reacio a la transformacion en un medio de cultivo para producir tejido de callo; y (b) retirar el tejido de callo y todo el tejido meristematico. En algunas realizaciones, los metodos comprenden ademas (c) introducir un acido nucleico en un genoma de plastido de una celula del tejido ya preacondicionado, produciendo con ello una celula transformada que comprende el acido nucleico; y (d) regenerar una planta transformada a partir de la celula transformada. En algunas realizaciones, la celula transformada es homoplasmica para los genomas de plastido transformados. En algunas realizaciones, la planta es homoplasmica para los genomas de plastido transformados.

En algunas realizaciones, la planta es una planta dicotiledonea lenosa Por ejemplo, la planta es un miembro de la familia Rutaceae. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende al menos un regulador del crecimiento vegetal, tal como una citoquinina. En algunas realizaciones, el regulador del crecimiento se selecciona del grupo que consiste en 6-furfurilaminopurina (quinetina), 6-bencilaminopurina (6-BAP), 6-dimetialilaminopurina (2ip), trans-6-(4-hidroxi-3-metilbut-2-enil)aminourina (zeatina), TDZ, acido giberelico (AG), IAA, NAA, dicamba, 2,3,5-T y 2,4-D. En algunas realizaciones, la concentracion del regulador del crecimiento en el medio de cultivo es de aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 25 mg/l, por ejemplo, aproximadamente 0,02 mg/l, aproximadamente 0,04 mg/l, aproximadamente 0,06 mg/l, aproximadamente 0,07 mg/l, aproximadamente 0,1 mg/l, aproximadamente 0,2 mg/l, aproximadamente 0,4 mg/l, aproximadamente 0,6 mg/l, aproximadamente 0,8 mg/l, aproximadamente 1,0 mg/l, aproximadamente 2,0 mg/l, aproximadamente 4,0 mg/l, aproximadamente 6,0 mg/l, aproximadamente 8,0 mg/l, aproximadamente 10,0 mg/l, aproximadamente 12,0 mg/l, aproximadamente 14,0 mg/l, aproximadamente 16,0 mg/l, aproximadamente 18,0 mg/l, aproximadamente 20,0 mg/l, aproximadamente 22,0 mg/l, o aproximadamente 25,0 mg/l. En algunas realizaciones, la concentracion del regulador del crecimiento en el medio de cultivo es de aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, de aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 5 mg/l, o de aproximadamente 0,05 mg/l a aproximadamente 8 mg/l. El acido nucleico puede introducirse en la celula mediante bombardeo de micropartfculas, electroforesis o electroporacion. En algunas realizaciones, el acido nucleico comprende un acido nucleico que es heterologo con la planta dicotiledonea. Por ejemplo, el acido nucleico es un vector que comprende un gen heterologo con la planta dicotiledonea.

En un aspecto, la descripcion proporciona metodos para transformar una celula de una planta de cftrico, que comprenden: (a) poner en contacto al menos una primera celula de la planta con una bacteria distinta de Agrobacterium sp. que comprende: (i) un primer acido nucleico que comprende una region del gen vir de un plasmido Ti, en la que la region del gen vir actua para introducir un acido nucleico que codifica una secuencia de interes en la celula de la planta de una manera dependiente de VirD2; y (ii) un segundo acido nucleico que comprende una o mas secuencias de ftmite de ADN-T unidas operablemente a un acido nucleico de interes; y (b) seleccionar al menos una primera celula de la planta transformada con el acido nucleico de interes, en la que la celula de la planta es una celula de una planta de cftrico.

En algunas realizaciones de la invencion, la bacteria puede ser una celula de rizobio. En ciertas realizaciones, los rizobios se cultivan bajo condiciones adecuadas para minimizar la produccion de polisacaridos por las celulas de rizobios. La celula de rizobio puede cultivarse en presencia de acetosiringona u otro compuesto, tal como un compuesto fenolico, que induce la funcion del gen vir antes de ponerse en contacto con la celula de la planta. La celula de rizobio puede seleccionarse del grupo que consiste en Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Ensifer spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp., Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. En realizaciones espedficas, la celula de rizobio es una celula de Sinorhizobium meliloti.

En otro aspecto de los metodos de transformacion proporcionados por la descripcion, la celula de la planta que se transforma puede estar incluida en un explante procedente de una semilla de cftrico, por ejemplo, procedente de una plantula, callo, suspension de celulas, cotiledon, epicotilo, meristemo, o brote. El explante puede comprender un explante de meristemo embrionario; un callo; una suspension de celulas; un cotiledon; o tejido de hojas, rafces o tallos.

En otro aspecto de los metodos de transformacion proporcionados por la invencion, la celula de la planta que se transforma puede estar incluida en un explante procedente de brotes emergentes de plantas de cftrico maduras. El explante puede comprender secciones del tallo internodales no embrionarias preparadas a partir de epicotilos de plantulas de cftricos o de brotes recien emergidos de plantas de cftricos maduras (por ejemplo, los primeros brotes de yemas de plantas maduras tras el injerto en un portainjerto o brotes muy jovenes de plantas maduras). El explante puede comprender secciones de tallo internodales no embrionarias a las que se les ha retirado todo el tejido meristematico.

Una bacteria usada para la transformacion segun la invencion puede comprender acidos nucleicos introducidos, por ejemplo, mediante electroporacion o conjugacion. Las secuencias pueden comprender un acido nucleico necesario para la transferencia conjugativa independiente de la funcion de VirD2. Los acidos nucleicos pueden incluir un primer y un segundo acido nucleico.

En otro aspecto de la invencion, los metodos de transformacion proporcionados en la presente pueden comprender seleccionar una celula vegetal transformada con un acido nucleico de interes en ausencia de un agente de seleccion. La seleccion de una celula vegetal transformada con un acido nucleico de interes puede comprender cultivar la celula vegetal en presencia de un agente de seleccion, en la que el acido nucleico de interes confiere tolerancia al agente de seleccion o esta unido operablemente a otro acido nucleico que confiere tolerancia al agente de seleccion, por ejemplo, kanamicina. En algunas realizaciones, el acido nucleico de interes contiene un gen de marcador seleccionable, evaluable o puntuable. Estos componentes geneticos tambien se denominan en la presente componentes geneticos funcionales, puesto que producen un producto que posee la funcion de identificar una planta transformada o un producto de utilidad agronomica. El ADN que actua como dispositivo de seleccion o evaluacion puede actuar en un tejido de planta regenerable para producir un compuesto que confiere resistencia al tejido de la planta a un compuesto por lo demas toxico. En la tecnica se conocen una serie de genes de marcadores seleccionables o evaluables y estos pueden usarse en la presente invencion. Se describen ejemplos de marcadores seleccionables y genes que proporcionan resistencia contra ellos en Miki y McHugh, 2004. Los genes de interes para su uso como marcador seleccionable, evaluables o puntuable incluyen, pero no se limitan a gus, gfp ("green fluorescent protein", protema fluorescente verde), luciferasa (LUX), genes que confieren tolerancia a antibioticos, tales como kanamicina, neomicina, kanamicina, paromomicina, G418, aminoglicosidos, espectinomicina, estreptomicina, higromicina B, bleomicina, fleomicina, sulfonamidas, estreptotricina, cloranfenicol, metotrexato, 2-desoxiglucosa, aldetftdo de betama, S-aminoetil L-cistema, 4-metiltriptofano, D-xilosa, D-manosa, benciladenina-N-3-glucuronidasa, genes que codifican enzimas que confieren tolerancia a herbicidas, tales como glifosato (por ejemplo, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS)). Tambien pueden emplearse otros procedimientos de seleccion que incluyen mecanismos de seleccion positiva (por ejemplo, el uso del gen manA de E. coli, que permite el crecimiento en presencia de manosa) y estos tambien estanan dentro del alcance de la presente invencion (vease tambien Miki y McHugh (2004)). En otras realizaciones, el acido nucleico de interes puede definirse como no unido ffsicamente a un gen de marcador seleccionable. Por ejemplo, el gen marcador y el acido nucleico de interes pueden segregarse geneticamente en la progenie de una planta regenerada a partir de la celula vegetal transformada con el acido nucleico de interes.

Una bacteria segun la invencion puede comprender al menos un tercer acido nucleico que comprende otro acido nucleico de interes, en el que la celula de la planta de cftrico se transforma con el tercer acido nucleico. En algunas realizaciones de la invencion, una planta de cftrico puede regenerarse a partir de una celula de una planta de cftrico transgenica, en la que la planta de cftrico comprende la secuencia de interes. La regeneracion de una planta de cftrico comprende inducir la formacion de uno o mas brotes a partir de un explante que comprende la celula de la planta y cultivar al menos un primer brote para producir una planta fertil completa induciendo la formacion de rafces o injertando al menos un primer brote en un portainjerto transgenico o no transgenico, formandose una union del injerto, y el brote injertado comprende un acido nucleico de interes. En ciertas realizaciones, el portainjerto puede crecer a partir de semillas de cftrico. En otras realizaciones, el portainjerto puede crecer a partir de un cultivo de tejido y trasladarse a la tierra. En otras realizaciones, el brote injertado y la union del injerto se protegen frente a la desecacion, los insectos, los microbios y otros ataques ambientales mediante una cubierta de plastico.

En otro aspecto, la invencion proporciona una celula de rizobio seleccionada del grupo que consiste en Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Ensifer spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp., Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp., comprendiendo dicha celula (i) un primer acido nucleico que comprende una region del gen vir de un plasmido Ti, en la que la region del gen vir actua para introducir un acido nucleico que codifica una secuencia de interes en una celula vegetal de una manera dependiente de VirD2; y (ii) un segundo acido nucleico que comprende una o mas secuencias de ftmite de ADN-T unidas operablemente a un acido nucleico que codifica una secuencia de interes. En una realizacion, la celula se define tambien como que comprende un marcador seleccionable. En otra realizacion, la celula de rizobio es una celula de Sinorhizobium meliloti.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes dibujos son partes de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar con mas detalle ciertos aspectos de la presente invencion. La invencion se entendera mejor remitiendose a los dibujos, junto con la descripcion detallada de las realizaciones espedficas presentadas en la presente.

Figura 1: Mapa esquematico de pIPG955. LB, ftmite izquierdo del ADN-T; RB, ftmite derecho del ADN-T.

Figura 2: Mapa esquematico de pIPG924. LB, Ifmite izquierdo del ADN-T; RB, Ifmite derecho del ADN-T.

Figura 3: Transferencia Western de 'Carrizo' autoenraizado transgenico creado mediante el uso de S. meliloti (SM955-16 y SM955-17) y A. tumefaciens (AGL1973-1, -2 y -3) que muestra la expresion de BC empleando un anticuerpo antiprotema BC.

Figura 4: Transferencia Western de una pua 'Hamlin' madura transgenica (MC-Sm955-2) y de 'Carrizo' autoenraizado transgenico (sm955-1. -2, -12, -13, -14 y -15) creados empleado S. meliloti, que muestra la expresion de BC empleando un anticuerpo antiprotema BC.

Figura 5: Transferencia Western de puas 'Hamlin' maduras transgenicas (MC-39) y 'Valencia' maduras (MC45, MC-56) creadas mediante el uso de Agrobacterium, empleando un anticuerpo antiprotema BC.

Figura 6: Transferencia Western de 'Hamlin' (Ham-980-257 y -269) y 'Valencia' (Val-980-258) maduros transgenicos creados mediante el uso de S. meliloti, y 'Hamlin' (Ham-973-252) y 'Valencia' (Val-973-248) maduros transgenicos creados mediate el uso de Agrobacterium, que muestra la expresion de BC empleando un anticuerpo antiprotema BC. Tambien se muestra un control de 'Hamlin' no transgenico (Ham-C) y varios escapes de 'Hamlin' sin expresion (Ham-973-270, 980-260, y -266).

Figura 7: Mapa esquematico de pIPG973. LB, lfmite izquierdo del ADN-T; RB, lfmite derecho del ADN-T.

Figura 8: Mapa esquematico de pIPG980. LB, lfmite izquierdo del ADN-T; RB, lfmite derecho del ADN-T.

Descripcion detallada de la invencion

A continuacion se ofrece una descripcion detallada de la invencion proporcionada para ayudar a los expertos en la tecnica a practicar la presente invencion. Los expertos en la tecnica pueden realizar modificaciones y variaciones en las realizaciones descritas en la presente sin apartarse del alcance de la presente invencion.

Metodos de transformacion de plantas

Se han indicado varios metodos de transformacion directa de plantas usando ADN. El primero que se indico historicamente es la electroporacion, que emplea una corriente electrica aplicada a una disolucion que contiene celulas vegetales (M. E. Fromm et al., Nature, 319, 791 (1986); H. Jones et al., Plant Mol. Biol., 13, 501 (1989); y H. Yang et al., Plant Cell Reports, 7, 421 (1988). Esta tecnica se ha empleado casi exclusivamente con celulas vegetales tratadas con enzimas para retirar parcial o totalmente las espesas paredes celulares, formando protoplastos. Existen unas pocas excepciones (Lee et al., 1989; Chowrira et al., 1998), pero estas no dieron como resultado la regeneracion de plantas totalmente transgenicas. Se ha indicado el uso de la sonicacion como otro metodo para proporcionar la transformacion directa de protoplastos vegetales (Joersbo et al., 1990). Este metodo tiene el inconveniente, al igual que los otros que requieren el uso de protoplastos, de que es necesario un proceso tedioso para crear y conservar los protoplastos vegetales y despues regenerarlos para formar plantas completas tras la transformacion. La formacion y regeneracion de protoplastos es tediosa y tiene muchos requisitos tecnicos, incluso en las mejores circunstancias (Potrykus, 1990) y resulta imposible con muchas especies vegetales. Incluso si el tejido es regenerable, a menudo las plantas resultantes no son fertiles.

Un segundo metodo de transformacion directo, denominado "bombardeo biolfstico", emplea partmulas ultrafinas, habitualmente de wolframio u oro, que estan revestidas con ADN y que despues se pulverizan sobre la superficie de un tejido vegetal con la fuerza suficiente para provocar que las partmulas penetren en las celulas vegetales, incluyendo la espesa pared celular, la membrana y la envuelta nuclear, pero sin matar al menos a algunas de ellas (documento US 5.204,253, documento US 5.015.580). El metodo usado requiere un equipo especializado y reactivos caros. Un problema mas grave con este metodo es que cada partmula que entra en una celula concreta normalmente esta revestida con multiples copias del ADN proporcionado para la transformacion, con lo que habitualmente se producen multiples inserciones de ADN (Pederson et al., 1997; Kohli et al., 1998; Pawlowski y Somers, 1998; Jackson et al., 2001). Estas multiples inserciones con frecuencia conducen al silenciamiento de genes, y cuanto mayor sea el numero de inserciones, mejor es el nivel de expresion genica (Stoger et al., 1998; Popelka et al., 2003). Para que este metodo funcione para fines practicos se requiere una atencion tediosa a una combinacion de factores que deben optimizarse. Estos incluyen: cultivos de tejidos espedficos de genotipo (Shimada, 1978) y respuesta de transformacion (Iser et al., 1999; Rasco-Gaunt et al., 2001), calidad y estadio de desarrollo de los explantes en el momento del inicio del cultivo (Armaleo et al., 1990), composicion del medio de cultivo (Barro et al., 1998) y condiciones de cultivo, periodo de cultivo antes y despues de la transferencia biolfstica de genes (Rasco-Gaunt et al., 1999), tratamiento osmotico de los cultivos de tejidos para reducir los danos en los tejidos durante la transferencia biolfstica de genes (Vain et al., 1993), modulos de expresion de transgenes (Li et al., 1997), sistema de transferencia biolfstico de genes y sus parametros espedficos (Altpeter et al., 1996) y el sistema de seleccion y sus parametros (Christou y Ford, 1995). Es evidente que son necesarios metodos mejores.

La transformacion de plantas mediada por Agrobacterium implica, como primera etapa, la colocacion de fragmentos de ADN clonados en plasmidos dentro de celulas de Agrobacterium vivas, que despues se emplean para "infectar" celulas vegetales vivas individuales. Por tanto, este proceso es un metodo de transformacion indirecto y es muy conocido en la tecnica y, cuando funciona, generalmente produce inserciones de ADN transferido (ADN-T) relativamente estables en plantas (Park et al., 2004), la expresion estable del gen insertado, la recuperacion frecuente de plantas que muestran un fenotipo normal (Vidal et al., 2003), y ademas con frecuencia se observan acontecimientos de insercion individuales despues del transporte de los genes (Cheng et al., 1997; Fang et al., 2002). El proceso de infeccion con Agrobacterium requiere la union a la celula vegetal hospedante, que implica un proceso de union muy espedfico que es una parte fundamental en la determinacion de la especificidad del espectro de hospedantes de la bacteria. La union a celulas vegetales es necesaria para la transformacion y es mediada por genes de Agrobacterium codificados cromosomicamente (Lippincott y Lippincott, 1969; Douglas et al., 1982).

El espectro de hospedantes tambien puede ser determinado por un segundo proceso independiente que implica la activacion del gen Vir, pero la activacion del gen Vir pueden lograrse de modo artificial mediante induccion qmmica empleando acetosiringona (Pitzschkel y Hirt, 2010, y las referencias citadas allf). Los genes Vir de Agrobacterium se localizan en un plasmido de 200 kb denominado plasmido inductor de tumor (“tumor inducing”, Ti), que tambien codifica funciones para la transferencia del plasmido Ti entre cepas y especies bacterianas y el inicio, procesamiento y transferencia hacia el nucleo vegetal del ADN-T, que en cepas naturales de tipo salvaje codifica "oncogenes" que, cuando se expresan en celulas vegetales, causan tumores (Wood et al., 2001). El ADN-T esta delimitado por dos regiones de lfmite, denominadas lfmite derecho ("right border", RB) y lfmite izquierdo ("left border", LB). Para el objetivo de la transformacion de plantas, el ADN-T natural se modifica mediante la retirada de genes inductores de tumores que se encuentran dentro de RB y LB (estos plasmidos Ti estan "desarmados"), y la sustitucion por genes de interes. El ADN-T puede estar localizado en un vector de plasmido distinto del plasmido grande que porta los genes Vir para que sea mas comoda la clonacion del ADN; estos sistemas se denominan sistemas de vector binario de ADN-T.

La activacion de los genes Vir en Agrobacterium provoca la formacion de la maquina de secrecion de tipo 4, que puede transferir protemas de virulencia y ADN unido a protemas de virulencia procedentes de bacterias, a traves de la pared celular vegetal, hacia el citoplasma vegetal, hacia el nucleo y, en ultimo termino, integrarse en el ADN nuclear en sitios aleatorios. La activacion del gen VirD2 en particular provoca la transferencia del ADN-T. Todo el ADN localizado entre los dos lfmites se transfiere al interior de la celula vegetal. Los plasmidos que portan VirD2 actuan realizando una mella en el ADN-T para producir ADN de transferencia monocatenario (la "hebra T") con VirD2 unido covalentemente al extremo 5' de la hebra T. Una segunda protema Vir, codificada por el gen VirE2, se envuelve alrededor del ADN-T y el complejo de protema-ADN completo se transfiere al interior de la celula vegetal. Ambas protemas VirE2 y VirD2 codifican secuencias de senal de localizacion nuclear ("nuclear localization signal", NLS) y, despues de la transferencia al interior del citoplasma vegetal, estas senales NLS sirven para guiar al complejo hacia el nucleo de la celula vegetal, en donde la hebra T se integra en el genoma vegetal con la ayuda de factores vegetales y protemas de virulencia de Agrobacterium.

As ,^ Agrobacterium atraviesa las tres barreras ffsicas, la espesa pared celular, la membrana celular y la envuelta nuclear, para introducir el ADN, y el proceso esta bien documentado. Existen numerosas patentes que describen la transformacion mediada por Agrobacterium y, en particular, plasmidos de transporte de ADN disenados espedficamente para su uso con Agrobacterium, por ejemplo, los documentos US4536475, EP0265556, EP0270822, WO8504899, WO8603516, US5591616, EP0604662, EP0672752, WO8603776, WO9209696, WO9419930, WO9967357, US4399216, WO8303259, US5731179, EP068730, WO9516031, US5693512, US6051757y EP904362A1. Estas referencias ejemplifican, pero sin limitacion, el amplio espectro de hospedantes de Agrobacterium, y son la razon principal de su amplio uso.

Sin embargo, la transformacion con Agrobacterium de monocotiledoneas, que incluyen mafz, arroz, trigo, cebada y cana de azucar, en general es muy diffcil, porque las monocotiledoneas no son hospedantes naturales; la infeccion de muchas especies de dicotiledoneas que no son hospedantes tambien es muy baja y muy dependiente del genotipo (Lee et al., 2004). Por ejemplo, la transformacion del algodon con Agrobacterium se ha limitado en gran medida a los cultivares tetraploides Coker o a genotipos muy relacionados (Gould y Megallus-cedeno, 1997; Zapata et al., 1999; Satyavathi et al., 2002; Kategari et al., 2007). Hasta la fecha no ha indicado la transformacion de otros cultivares tetraploides o de cultivares de algodon diploides o nativos empleando cualquier metodo. Ademas, Agrobacterium infecta algunos tejidos vegetales con mucha mas eficacia que otros. Como resultado, la mayor parte de las patentes que cubren el uso de Agrobacterium se dirigen a formas muy concretas de obtener la transformacion de tejidos espedficos, que incluyen tejido de embrion, tejido de callo, polen, meristemos apicales, partes florales, semillas y otras partes de plantas vivas. Por ejemplo, en los ejemplos de algodon citados anteriormente, solo se emplearon metodos de transformacion de puntas de brotes. Como otro ejemplo, Zhong et al. (2005) reivindican el uso de Agrobacterium o del bombardeo de partmulas para transformar multiples estructuras de brotes inducidas en cultivos a partir de tejidos meristematicos de especies diffciles de transformar de calabaza, melon, sandfa o girasol (patente de EE. UU. n.° 6.858.777). No se indica ni se sugiere el uso de celulas que no sean de Agrobacterium con dichos tejidos.

Cuando se producen o se fuerzan infecciones por Agrobacterium de no hospedantes, la frecuencia casi siempre es mucho menor que en los hospedantes. En algunos casos, los metodos para forzar dichas infecciones son desconocidos. Esto apunta a la necesidad de desarrollar metodos de transformacion de plantas mas eficaces empleando metodos sin Agrobacterium.

Un metodo de transformacion de plantas indirecto descrito mas recientemente usa miembros vivos de un grupo de bacterias asociadas a plantas que no son Agrobacterium denominadas colectivamente rizobios (Broothaerts et al., 2005, publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. 20050289667; 20050289672; US7888552 y las referencias citadas en ellas). Los rizobios pertenecen a la misma familia bacteriana que Agrobacterium, los Rhizobiales, e incluyen Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Ensifer spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp., Ochrobactrum spp., y Bradyrhizobium spp. Diferentes rizobios muestran una amplia diversidad genetica, y hay pocas dudas de que Agrobacterium y Sinorhizobium se encuentran en clados filogeneticos diferentes (Galibert, F. et al., 2001; Wood et al., 2001). De manera importante, diferentes rizobios tambien muestran un espectro de hospedantes significativamente diferente y responden a diferentes senales moleculares espedficas de hospedante (Long, 2001). Weller et al. (2004, 2005) han indicado que varios rizobios, que incluyen cepas de Rhizobium sp. y Ochrobactrum sp. que portan plasmidos inductores de rafces ("root inducing, Ri), pero no plasmidos Ti, transfieren ADN (es decir, transforman) a plantas de pepino y tomate, lo cual conduce a la enfermedad de las "rafces pilosas".

La asignacion taxonomica puede realizarse como se conoce en la tecnica, por ejemplo, mediante la comparacion de las secuencias del ARNr 16S u otros metodos de clasificacion. Las cepas de tipo salvaje de muchas especies de rizobios generalmente son capaces de inducir la formacion de nodulos de fijacion de nitrogeno en tejidos radicales de plantas hospedantes, tales como plantas leguminosas (Fabaceae). Sin embargo, no es necesaria la capacidad de nodular rafces de una especie vegetal concreta para la transferencia de ADN mediada por rizobios hacia las celulas de la especie vegetal.

Broothaerts et al. (2005) han indicado la transformacion por cepas de Rhizobium sp., Mesorhizobium loti, y Sinorhizobium meliloti empleando un sistema de transformacion de plasmidos Ti binarios que se anade a cepas de rizobios nativas. La transformacion se limita a Arabidopsis, tabaco y arroz. En fechas mas recientes, Ye et al. (documento US7888552) demostraron el uso de Rhizobium sp., Sinorhizobium sp., y Mesorhizobium sp. para transformar especies que son diffciles de transformar con Agrobacterium. Esta patente se limita a soja, canola, mafz y celulas del cultivar tetraploide de algodon Coker. En fechas mas recientes, Wendt et al. (2011) demostraron el uso de Rhizobium sp., Mesorhizobium loti y Sinorhizobium meliloti para transformar la patata. Ambos Broothaerts et al. (2005) y Went et al. (2011) han indicado que fueron necesarias optimizaciones espedficas de cepa para la utilizacion de cepas de rizobios para transformar tejidos vegetales.

La transformacion de dtricos juveniles usando Agrobacterium se ha visto dificultada por las bajas eficacias de transformacion, y la transformacion de variedades comerciales de cftricos maduros empleando Agrobacterium es tan poco frecuente que es practicamente inutil. No se ha indicado la transferencia de ADN a celulas de cftricos por cepas bacterianas que no sean Agrobacterium. Por tanto, en la tecnica es muy necesario el desarrollo de metodos mejorados que permitan la transformacion de variedades de cultivos de cftricos importantes desde el punto de vista comercial, tales como 'Hamlin' y 'Valencia', empleando cualquier medio, que incluye cepas bacterianas que no son Agrobacterium, y mejorar las eficacias de transformacion de cftricos maduros y de cftricos en general. Otras especies de cultivo de cftricos que pueden ser transformadas mediante la presente invencion incluyen Citrus sinensis, Citrus aurantium, Citrus paradisi, Citrus limon, Citrus aurantiifolia, Citrus maxima, Citrus medica, Citrus reticulata, Citrus trifoliata, kumquats, papedas, limas australianas y diversos hftbridos, variedades, desportes y cultivares de estas especies.

El metodo o metodos utilizados no deben introducir mutaciones en el donante ni ADN transformante en el ADN del receptor. La alteracion genetica debe poder ser heredada de modo estable por la progenie de la planta transformada. La progenie puede obtenerse de modo asexual, tomando multiples secciones de la planta transformada, o sexual, a traves de la semilla. El metodo preferido para la propagacion de plantas depende de la especie; por ejemplo, los arboles de cftricos que producen frutos casi siempre se propagan de modo asexual, aunque los portainjertos casi siempre se producen a partir de semillas.

Algunas plantas habitualmente se reproducen de modo asexual a traves de la semilla en un proceso denominado apomixis (Nogler, 1984). La apomixis produce semillas fertiles en las que los embriones se derivan por completo de celulas maternas, y no de la fusion de los gametos masculino y femenino para formar un cigoto. Por tanto, los embriones apoirftcticos tienen una constitucion genetica identica a la del progenitor hembra. Muchos miembros del genero Citrus y algunos generos muy relacionados que pertenecen a Rutaceae se reproducen principalmente de modo apoirftctico mediante embrioma nucelar (Frost, 1943). Puesto que los embriones nucelares se desarrollan de modo asexual por division mitotica normal de las celulas del nucelo y el gameto masculino no contribuye a su formacion, las plantulas nucelares son identicas al progenitor materno de la semilla. En efecto, la propagacion de portainjertos de cftricos depende de la produccion de plantas clonicas a partir de plantulas nucelares, lo cual convierte a la apomixis en uno de los rasgos mas importantes y conservados en los programas de reproduccion para portainjertos de cftricos (Garda, R., 1999).

El unico caso en que las semillas de cftricos se emplean desde un punto de vista comercial es en la produccion de portainjertos y solo en operaciones de guardena especializadas con "arboles madre" de portainjertos registrados. El citranjo 'Carrizo' es un portainjerto favorito que es muy apoirftctico; los embriones cigoticos de 'Carrizo' (es decir, los que se desarrollan a partir de un cruce genetico) son muy poco frecuentes ('Swingle', 1927). Incluso con un portainjerto que muestra una proporcion relativamente alta (del 5% al 10%) de embriones cigoticos, tal como el citrumelo 'Swingle', la mayona de los embriones cigoticos surgen a traves de la autofertilizacion y no de la polinizacion cruzada, probablemente debido a diferencias en el momento de la floracion entre los diversos cultivares (Anderson et al., 1991). De modo global, las practicas culturales para la produccion de portainjertos y la seleccion del rasgo de apomixis por los productores de portainjertos se combinan para provocar que el cruzamiento exogamico de portainjertos sea muy raro. En las operaciones con portainjertos se tiene mucho cuidado en eliminar las plantulas que parecen fuera de tipo (y que pueden haber surgido de la autofertilizacion o, en casos muy poco frecuentes, de la polinizacion cruzada; Anderson et al., 1991).

Por contraste con la produccion de portainjertos, desde el punto de vista comercial, la porcion productora de fruto de una pua de un arbol de cftrico nunca se propaga mediante semillas, en parte porque las plantulas no floreceran (y, por tanto, no produciran fruto) hasta que superen la etapa juvenil, un proceso que tarda muchos anos. Despues de la floracion, se dice que un tejido es "maduro". El proceso de maduracion tarda de cinco a doce anos, dependiendo de la variedad, y esto es asf para plantulas cigoticas y nucelares (Clark, 1983; Spiegel-Roy y Goldschmidt, 1996). Por tanto, en lugar de cultivar variedades productoras de frutos desde la semilla, los productores comerciales de cftricos siempre injertan "esquejes" maduros, denominados puas, sobre portainjertos juveniles, y los esquejes maduros despues floreceran el primer ano tras haber sido injertados. Es decir, todas las puas de cftricos comerciales se propagan de modo vegetativo (es decir, asexual) y, por tanto, tienen una constitucion genetica identica a la del progenitor. Esto incluye la piel y la pulpa frutal comestible, que tambien tienen una constitucion genetica identica a la del progenitor. Solo las semillas de dicha fruta pueden tener un cruzamiento genetico exogamico y solo hasta el grado en que la variedad sea cigotica y no apoirftctica (remftase al siguiente parrafo). Cualquier semilla de cftrico que pueda producirse en esta fruta es bastante inutil para fines de propagacion, porque aunque germine, las plantulas senan juveniles y lo seguinan siendo durante anos.

Se ha logrado la transformacion de tejido de cftrico juvenil empleando Agrobacterium (Moore et al., 1987; Cervera, 1998), aunque las frecuencias son bajas a moderadas, dependiendo de la variedad del cftrico. Sin embargo, el problema principal con la transformacion de cftricos juveniles es que los arboles transformados no floreceran hasta que superen la juventud. Esto hace que sea imposible evaluar a los arboles transgenicos para determinar la calidad y cantidad de fruta y la actuacion hortfcola general durante hasta 12 anos, dependiendo de la variedad. La transformacion de cftricos maduros es una solucion potencial al problema. Sin embargo, aunque la transformacion de algunos cultivares de cftricos juveniles mediante los metodos actuales empleando Agrobacterium presenta un frecuencia de baja a moderada, la transformacion de cftricos maduros es muy diffcil, y solo dos grupos (en Espana y Brasil) la han indicado aunque no han proporcionado datos de frecuencia (Cervera et al., 1998, 2008; Almeida et al., 2003; Pena-Garda et al., documento US 6.103.955). Antes de la presente invencion, por lo que conocen los inventores, la transformacion de cftricos maduros empleando Agrobacterium sigue siendo poco practica desde el punto de vista comercial, y la transformacion de cftricos empleando cualquier otro metodo de transformacion no ha sido indicada. Los metodos de Pena-Garda et al. (documento US 6.103.955) requieren las etapas de microinjertar in vitro cftricos maduros transformados en cepas de cftricos cultivadas in vitro, seguido de la etapa adicional de injertar las plantas microinjertadas in vitro resultantes en otras cepas de cftricos o trasplantar las plantas cultivadas in vitro a la tierra para que endurezcan. El microinjerto de cftricos maduros transformados directamente en cepas de cftricos enraizadas en la tierra, tal como se describe en la presente, ahorra una etapa tediosa y larga y da como resultado un crecimiento mucho mas rapido del arbol transformado, todo lo cual no ha sido previsto ni se ha especificado en el documento US 6.103.955.

Definiciones

Se proporcionan las siguientes definiciones para ayudar a los expertos en la tecnica a comprender la descripcion detallada de la presente invencion.

Un "marcador seleccionable" o "marcador evaluable" se refiere a una secuencia de acido nucleico cuya expresion confiere un fenotipo que facilita la identificacion de celulas, tejidos o plantas que contienen la secuencia de acido nucleico.

La "transcripcion" se refiere al proceso de producir una copia de ARN a partir de un molde de ADN.

La "transformacion" se refiere al proceso de introducir una secuencia de acido nucleico exogena en una celula o un tejido. La transformacion puede ser transitoria o estable. En las transformaciones estables, parte o todo el acido nucleico exogeno se incorpora (por ejemplo, se integra o se mantiene de modo estable) en el ADN genomico nuclear, el ADN de plastido, o es capaz de una replicacion autonoma en el nucleo o el plastido.

"Transgenico" se refiere a organismos en los que una secuencia de acido nucleico exogena se ha transformado de modo estable.

Tal como se emplea en la presente, el verbo "comprende", tal como se usa en esta descripcion y en las reivindicaciones, y sus conjugaciones, se utilizan en su sentido no limitante y significa que los asuntos que siguen a la palabra se incluyen, pero que los asuntos que no se mencionan espedficamente no se excluyen.

Tal como se emplea en la presente, la expresion "parte de la planta" se refiere a cualquier parte de una planta que incluye, pero no se limita a brotes, rafces, tallos, semillas, estfpulas, hojas, petalos, flores, ovulos, bracteas, ramas, peciolos, partes internodales, corteza, vellosidades, vastagos, rizomas, frondas, briznas, polen, estambres y similares. Las dos partes principales de plantas cultivadas en algun tipo de medio, tal como tierra, a menudo se denominan parte "aerea", tambien denominada "brotes", y parte "subterranea", a menudo denominada tambien "rafces". Los "brotes recien emergidos" son brotes que han aparecido como nuevo crecimiento sobre una planta en aproximadamente el ultimo dfa, los ultimos 2 dfas, 3 dfas, 4 d^as, 5 d^as, 6 dfas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, o 4 semanas.

Tal como se emplea en la presente, la expresion "tejido de planta" se refiere a cualquier parte de una planta. Los ejemplos de organos vegetales a partir de los cuales puede obtenerse el tejido de planta incluyen, pero no se limitan a hojas, tallos, rafces, tuberculos, semillas, ramas, vellosidades, nodulos, axilas foliares, flores, polen, estambres, pistilos, petalos, pedunculos, pies, estigmas, estilos, bracteas, frutos, tronco, carpelos, sepalos, anteras, ovulos, pedicelos, agujas, conos, rizomas, estolones, brotes, pericarpo, endospermo, placenta, bayas, estambres y cubiertas foliares.

El tallo de una planta se divide en general en nodos y partes internodales. Los nodos portan yemas de las cuales crecen una o mas hojas, inflorescencias (flores), rafces, otros tallos, etc. Las partes internodales alejan a un nodo de otro. Una "seccion de tallo internodal" se refiere a un segmento cortado de una parte internodal.

Un "epicotilo" es el brote embrionario por encima de los cotiledones. En general, el epicotilo se desarrollara para producir las hojas de la planta. Los cotiledones son partes del embrion dentro de la semilla de una planta que, tras la germinacion, pueden convertirse en las primeras hojas embrionarias de una plantula.

Un "injerto" se produce conectando entre sf dos trozos de un tejido de planta vivo de modo que se unan y formen una planta funcional que posteriormente crecera como una planta nueva. La "pua" es la parte aerea de una planta que forma la corona de la nueva planta. El "portainjerto" es la parte subterranea o inferior de una planta, que a veces incluye parte del tallo y algunas ramas, y que formara el sistema de rafces de la nueva planta. La "union del injerto" es el lugar del tallo de una planta en el que la pua se une al portainjerto. El tejido de pua que se injerta sobre un portainjerto puede comprender una seccion de tallo con aproximadamente el mismo diametro que el de la seccion de tallo del portainjerto e incluye hojas, o puede ser mucho mas pequeno, como el caso de los "esquejes". Los esquejes son la parte intermedia de un brote de un ano procedentes de la variedad de pua deseada, y se emplean para proporcionar una yema axilar para el injerto. La yema axilar es un brote embrionario que se encuentra en la union del tallo y el peciolo de una planta. Estas yemas axilares, derivadas de una pua e injertadas sobre un portainjerto, generaran la parte aerea casi entera del arbol, excepto por la porcion del tallo del portainjerto que esta por encima de la tierra. Despues de que la pua injertada haya formado tallos y hojas que puedan apoyar fotosinteticamente el crecimiento de las rafces, generalmente se retiran todos los brotes del portainjerto. La mayona de los arboles de cftricos cultivados en la actualidad estan formados por una variedad de pua injertada a partir de un esqueje en un portainjerto. Despues del injerto, los "primeros florecimientos" son los primeros tallos y hojas que emergen del injerto, incluyendo injertos procedentes yemas axilares.

Tal como se emplea en la presente, la expresion "se deriva de" se refiere del origen o fuente y puede incluir moleculas naturales, recombinantes, no purificadas o purificadas. Un acido nucleico o un aminoacido derivado de un origen o fuente puede presentar todos los tipos de cambios en nucleotidos o modificaciones de protemas, tal como se define en otro punto en la presente.

En algunas realizaciones, la presente descripcion proporciona variedades derivadas de plantas producidas por medio de las composiciones, los metodos y los sistemas descritos en la presente. Tal como se emplea en la presente, el termino "variedad" se refiere a una subdivision de una especie, que consiste en un grupo de individuos dentro de la especie que se diferencian en forma o en funcion de otros conjuntos similares de individuos.

Tal como se emplea en la presente, el termino "variedad" o "cultivar" significa un grupo de plantas similares que, por medio de su actuacion y caractensticas estructurales, pueden identificarse frente a otras variedades dentro de la misma especie. El termino "variedad", tal como se emplea en la presente, tiene un significado identico a la correspondiente definicion de the International Convention for the Protection of New Varieties of Plants (tratado UPOV), del 2 de diciembre de 1961, revisado en Ginebra el 10 de noviembre de 1972, el 23 de octubre de 1978, y el 19 de marzo de 1991. Asf, una "variedad" significa un agrupamiento de plantas dentro de un unico taxon botanico de la categona mas baja conocida, y dicho agrupamiento, independientemente de que se cumplan las condiciones para la concesion de un derecho de productor, puede i) definirse mediante la expresion de las caractensticas resultantes de un genotipo concreto o combinacion de genotipos, ii) distinguirse de cualquier otro agrupamiento de plantas mediante la expresion de al menos una de dichas caractensticas, y iii) considerarse como una unidad con respecto a su idoneidad para poder propagarse sin cambios.

En algunas realizaciones, la presente descripcion proporciona genotipos derivados de plantas producidas por medio de las composiciones, los metodos y los sistemas descritos en la presente. Tal como se emplea en la presente, el termino "genotipo" se refiere a la constitucion genetica de una celula individual, cultivo celular, tejido, organismo (por ejemplo, un planta) o grupo de organismos.

En algunas realizaciones, la presente descripcion proporciona clones derivados de plantas producidas por medio de las composiciones, los metodos y los sistemas descritos en la presente. Tal como se emplea en la presente, el termino "clon" se refiere a una celula, un grupo de celulas, una parte, un tejido, un organismo (por ejemplo, un planta) o un grupo de organismos que desciende o se deriva de un unico precursor y que es geneticamente identico o sustancialmente identico a dicho precursor. En algunas realizaciones, el clon se produce en un proceso que comprende al menos una etapa asexual.

Un "explante" o "planta madre" es la fuente de celulas que se van a desarrollar durante el proceso de cultivo del tejido. Por ejemplo, el explante puede ser cualquier segmentos o coleccion de celulas procedentes de meristemos apicales, yemas terminales, yemas axilares, yemas adventicias, yemas accesorias, yemas pseudoterminales, cambio, meristemo lateral, yema lateral, yemas vegetativas, yemas reproductivas, yemas mixtas, segmentos de brotes, apices de brotes, segmentos de tallo, secciones nodales inmaduras procedentes de tallos, brotes laterales, plantulas, semillas, brotes que empiezan a surgir de la tierra, yemas florales inmaduras, inflorescencias, segmentos de corona, segmentos de hoja o cualquiera de sus partes. Un "callo" es una masa de celulas de parenquima desorganizado derivado de un tejido de planta o de explantes. Los callos pueden diferenciarse en plantas completas a traves del proceso de la regeneracion.

Una "planta lenosa" es una planta con tejidos lignificados duros o partes lenosas, en especial tallos y yemas. Las plantas lenosas generalmente son plantas perennes e incluyen arboles, arbustos y lianas. Otros ejemplos de plantas lenosas incluyen, pero no se limitan a arboles frutales, acacia, aliso, alamo temblon, haya, abedul, liquidambar, sicomoro, chopo, sauce, abeto, pino, picea, alerce, cedro y cicuta.

Un "cftrico" es una planta del genero Citrus o un genero relacionado. El genero Citrus incluye los arboles y arbustos de la familia de la ruda (Rutaceae). Un "cftrico maduro" florece y produce fruta.

El termino "un" o "una" se refiere a uno o mas de esa entidad; preferiblemente, "un gen" se refiere a uno o mas genes o al menos a un gen. Asf, los terminos "un" (o "una") y las expresiones "uno o mas" y "al menos uno" se emplean de modo intercambiable en la presente. Ademas, la referencia a "un elemento" mediante el artfculo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que mas de uno de los elementos este presente, a menos que en el contexto claramente requiera que solo exista uno y solo uno de los elementos.

Tal como se emplean en la presente, los terminos "cruzar" y "cruzamiento" y las expresiones "polinizacion cruzada" o "reproduccion cruzada" se refieren al proceso mediante el cual el polen de una flor sobre una planta se aplica (de modo artificial o natural) al ovulo (estigma) de una flor sobre otra planta.

Tal como se emplean en la presente, los terminos "vector", "plasmido" o "construccion" se refieren ampliamente a cualquier plasmido o virus que codifica un acido nucleico exogeno. Tambien debe considerarse que los terminos incluyen compuestos que no son plasirftdicos ni vfticos que facilitan la transferencia de un acido nucleico hacia el interior de viriones o celulas, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina y similares. El vector puede ser un vector vftico que sea adecuado como vetftculo de transporte para transportar el acido nucleico, o uno de sus mutantes, a una celula, o el vector puede ser un vector no vftico que sea adecuado para el mismo fin. Los ejemplos de vectores vfticos y no vfticos para el transporte de ADN a celulas y tejidos son muy conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Ma et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 94:12744-12746).

La presente invencion proporciona metodos y composiciones para la transformacion genetica eficaz de celulas de plantas importantes desde el punto de vista comercial, tales como celulas de plantas de cftricos, que incluyen las puas ampliamente utilizadas 'Hamlin' y 'Valencia' y el portainjerto 'Carrizo', con Sinorhizobium. La invencion supera importantes limitaciones en la tecnica, que incluyen la limitada eficacia de transformacion de cftricos maduros con Agrobacterium, y la ausencia de descripciones de tecnicas utiles en general para la transformacion y la regeneracion de plantas de cftricos maduras, que incluyen las variedades 'Hamlin' y 'Valencia', mediante el uso de cepas que no son de Agrobacterium. Por ejemplo, aunque se han conseguido usar bacterias distintas de Agrobacterium en varias especies y variedades vegetales, las frecuencias de transformacion han sido bajas.

Hasta la fecha se han requerido investigaciones considerables en muchos casos para aplicar incluso procedimientos de transformacion bien desarrollados, tales como la transformacion mediada por Agrobacterium, a diferentes especies vegetales. Diferentes especies dentro de los Rhizobiales muestran diferentes espectros de hospedantes y diferentes capacidades para unirse a diferentes tejidos de plantas. Las plantas de diferentes especies a menudo muestran diferencias fisiologicas importantes que afectan a la susceptibilidad a una transformacion genetica. Por tanto, los metodos para la transformacion de una especie de planta no actuan de modo eficaz, o no actuan en absoluto, con otras plantas, y la capacidad de transformar una planta no predice necesariamente la capacidad para transformar incluso especies relacionadas usando ese procedimiento. Esto resultar particularmente cierto para la transformacion bacteriana de plantas, que implica complejas interacciones bioqmmicas entre las cepas bacterianas usadas y las celulas vegetales diana. Los rizobios interaccionan con plantas en el entorno nativo y, por tanto, pueden mostrar especificidades de hospedante, cuyo impacto es desconocido para muchas especies de cultivos. Asf, la identificacion de plantas susceptibles a la transformacion mediada por rizobios y el desarrollo de procedimientos que permitan lograr mayores eficacias de transformacion tiene un gran interes. La presente invencion supera las limitaciones de la tecnica proporcionando, en una realizacion, tecnicas para el uso de Rhizobiaceae (por ejemplo, rizobios o Agrobacterium) para transformer plantas importantes desde el punto de vista comercial, tales como miembros de la familia Rutaceae (por ejemplo, cftricos). No se conoce que miembros de la familia Rutaceae, que incluyen los cftricos, hayan podido ser transformados por rizobios. La invencion tambien proporciona tecnicas para la transformacion eficaz de plantas de cftricos empleando rizobios o Agrobacterium, incluyendo cftricos juveniles o maduros, que ya se sabfa que eran susceptibles a la transformacion con Agrobacterium pero con una frecuencia baja. La descripcion tambien proporciona metodos para la transformacion de dianas de tejidos que sean distintos de las de Agrobacterium. Por ejemplo, aunque Agrobacterium generalmente requiere de un sitio de herida para infectar plantas, algunos otros miembros de los Rhizobiales, que incluyen Rhizobiaceae tales como Sinorhizobium, infectan de modo natural las rafces de la planta mediante hifas de infeccion que penetran en los tejidos de la planta, lo cual permite usartejido no herido como diana de transformacion.

El objetivo, en muchos casos, puede ser maximizar la transmision de un agente de ADN infeccioso hacia plantas de cftricos intactas y arraigadas.

La presente invencion puede usarse con cualquier vector o plasmido de transformacion de plantas adecuado que contenga un marcador seleccionable o evaluable y elementos reguladores asociados, tal como se describe, junto con uno o mas acidos nucleicos expresados de una manera suficiente para conferir un rasgo deseable concreto. Los ejemplos de genes estructurales adecuados de interes agronomico considerados por la presente invencion incluinan, pero no se limitan a genes para tolerancia a enfermedades, insectos o plagas, tolerancia a herbicidas, genes para mejoras en la calidad, tales como el rendimientos, potenciadores nutricionales, tolerancias ambientales o al estres, o cualquier cambio deseable en la fisiologfa, el crecimiento o la morfologfa de la planta o el producto o los productos de la planta, incluyendo la maduracion de la fruta (patente de EE. UU. n.° 5.512.466), resistencia al estres ambiental (patente de EE. U^u . n.° 6.072.103), peptido farmaceuticos y peptidos segregables (patentes de EE. UU. nos 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (patente de EE. UU. n.° 6.476.295), digeribilidad mejorada (patente de EE. UU. n.° 6.531.648), y sabor mejorado (patente de EE. UU. n.° 6.011.199). Cualquiera de estos u otros elementos geneticos, metodos y transgenes puede usarse con la invencion, tal como apreciaran los expertos en la tecnica, a la vista de la presente descripcion.

Como alternativa, el acido nucleico de interes puede afectar a estos fenotipos mediante la inhibicion de la expresion de un gen endogeno mediante tecnologfas de silenciamiento de genes, tales como la cosupresion, la tecnologfa antisentido, ARNi, la expresion de miARN (natural o modificado), la expresion de ARNip de accion en trans, y la expresion de ribozimas (vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente de EE. U^u .20060200878).

Los ejemplos de acidos nucleicos que pueden ser introducidos por los metodos incluidos en la presente invencion incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes procedentes de otra especie, o incluso genes o secuencias que se originan con la misma especie o que estan presentes en la misma especie, pero que se incorporan en celulas receptoras por medio de metodos de ingeniena genetica, en lugar de las tecnicas de cruzamiento o reproduccion clasicas. Sin embargo, el termino "exogeno" tambien pretende indicar genes que normalmente no estan presentes en la celula que se esta transformando, o quiza simplemente no estan presentes en la forma, estructura, etc., que se encontrana en el segmento de ADN o gen transformante, o genes que normalmente estan normalmente presentes pero se quiere que el deseado, por ejemplo, se sobreexprese. Asf, el termino gen o ADN "exogeno" pretende indicar cualquier gen o segmento de ADN que se introduce en una celula receptora, independientemente de que un gen similar pueda estar ya presente en dicha celula. El tipo de ADN incluido en el ADN exogeno puede incluir ADN que ya esta presente en la celula vegetal, ADN procedente de otra planta, ADN procedente de un organismo diferente, o ADN generado externamente, tal como una secuencia de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una version sintetica o modificada de un gen.

Aunque anteriormente se han descrito diversas realizaciones de la presente invencion, debe entenderse que estas se han presentado solo como ejemplo y no como limitacion. La presente invencion no se limita a las composiciones y los metodos descritos ni se limita a un material o protema concreto ni la presente invencion se limita a una escala o tamano de lote de produccion concreto. Asf, la amplitud y el alcance de la presente invencion no deben verse limitadas por ninguno de los ejemplos de realizaciones descritos anteriormente, sino que deben definirse solo segun las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Ejemplos

Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar las realizaciones preferidas de la invencion. Los expertos en la tecnica apreciaran que las tecnicas descritas en los siguientes ejemplos representan tecnicas descubiertas por los inventores para que actuen de modo correcto en la practica de la invencion y, por tanto, puede considerarse que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica apreciaran, a la luz de la presente descripcion, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones espedficas descritas y seguir obteniendo un resultado similar sin apartarse del concepto y el alcance de la invencion. De modo mas espedfico, sera evidente que ciertos agentes que estan relacionados desde el punto de vista ffsico y fisiologico pueden sustituir a los agentes descritos en la presente, logrando los mismos resultados o resultados similares. Se considera que todos estos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la tecnica estan dentro del alcance y el concepto de la invencion, segun se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Cepas de Sinorhizobium y Agrobacterium

La cepa de Sinorhizobium meliloti 1021 porta el plasmido de hipervirulencia pTiWB3, que es un plasmido Ti desarmado (pEHA105) procedente de la cepa de Agrobacterium tumefaciens C58 con un origen de la replicacion de amplio espectro de hospedantes, oriT (Broothaerts et al., 2005) y se obtuvo en CAMBIA (Canberra, Australia). Las cepas de S. meliloti se cultivaron en medio TY (triptona al 0,5%, extracto de levadura al 0,3% y cloruro de calcio 7 mM).

La cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1 es un derivado deficiente en la recombinacion (recA menos) de AGL0, que porta el plasmido Ti desarmado hipervirulento (pTiBo542) en un entorno C58, y se obtuvo de G. Lazo (Lazo et al., 1991). Las cepas de Agrobacterium se cultivaron en medio YEP (extracto de levadura al 1%, peptona al 1% y cloruro de sodio al 0,5%).

Ejemplo 2: Transformacion de Sinorhizobium y Agrobacterium

Se prepararon celulas de Sinorhizobium competentes lavando un cultivo en fase logantmica en medio TY con agua desionizada enfriada y glicerol al 10%, y se conservaron a -80 °C. Se introdujo el vector binario pIPG955 (figura 1) mediante electroporacion utilizando 100 pl de celulas competentes de S. meliloti 1021/pTWBi3 descongeladas mezcladas con 0,5 pg de pIPG955 y se incubo en hielo durante 30 min. La mezcla se traslado a una cubeta preenfriada (hueco de 1 mm) y se electroporo a 1100 voltios usando un electroporador Eppendorf 2510 (Hauppauge, NY). La mezcla se traslado a 1 ml de medio TY y se incubo a 28 °C con agitacion a 150 rpm durante 16 h. Se extendieron 200 pl del medio sobre una placa de agar TY que contema 100 pg/ml de espectinomicina (para seleccionar pIPG955), 250 pg/ml de estreptomicina (para seleccionar la cepa 1021) y 150 pg/ml de kanamicina (para seleccionar pTWBi3). La placa se incubo a 28 °C durante 3 dfas.

Se prepararon celulas competentes de Agrobacterium lavando un cultivo en fase logantmica en medio YEP con agua desionizada enfriada y glicerol al 10%, y se conservaron a -80 °C. Se introdujo el vector binario pIPG924 (figura 2) mediante electroporacion usando 100 pl de celulas competentes de A. tumefaciens AGL1/pTiBo542 descongeladas mezcladas con 0,5 pg de pIPG924 y se incubo en hielo durante 30 min. La mezcla se traslado a una cubeta preenfriada (hueco de 1 mm) y se electroporo a 1100 voltios usando un electroporador Eppendorf 2510 (Hauppauge, NY). La mezcla se traslado a 1 ml de medio YEP y se incubo a 28 °C con agitacion a 150 rpm durante 2 h. Se extendieron 20 pl del medio sobre una placa de agar YEP que contema 40 pg/ml de kanamicina para seleccionar pIPG924. La placa se incubo a 28 °C durante 2 dfas.

Ejemplo 3: Vectores de transformacion binarios

Se construyeron vectores de transformacion binarios usando tecnicas moleculares convencionales conocidas por los expertos en la tecnica. Se fabricaron las construcciones de plasmidos pIPG955 (figura 1; SEQ ID NO:1) y pIPG980 (figura 8; SEQ ID NO:4) para su uso con cepas que no son Agrobacterium. Se fabricaron las construcciones de plasmidos pIPG924 (figura 2; SEQ ID NO:2) y pIPG973 (figura 7; SEQ ID NO:3) para su uso con cepas de Agrobacterium. Todas las construcciones se basan en pCAMBIA2301 (Cambia, Canberra, Australia), y portan un origen de la replicacion de amplio espectro de hospedantes de pVS1 y un origen de la replicacion de pBR322 para el mantenimiento de un alto numero de copias en E. coli. El pIPG924 se construyo reemplazando en primer lugar el promotor 35S doble de pCAMBIA2301 por el promotor de nopalina sintasa (nos), que se uso para conducir la expresion del gen de neomicina fosfotransferasa (nptII), que confiere resistencia a la kanamicina, para la seleccion en cftricos. Despues el gen 35S::GUS se reemplazo por el elemento controlador de la protema de la envuelta vftica procedente del closterovirus de la remolacha amarilla ("Beet Yellows Closterovirus", BYV), de los nucleotidos 13499­ 13637 (Peremyslov et al., 1999), condensado operativamente con el gen anti-BC bacteriana interrumpido con el intron de catalasa (vease la patente de EE. UU. n.° 7.919.601 y el documento PCT/US08/70612, que se incorporan como referencia en la presente). El pIPG973 es identico a pIPG924, excepto que se uso el promotor 35S individual para sustituir al promotor de BYVP que se encuentra en pIPG924.

El pIPG955 se construyo de una manera similar a pIPG924, con el promotor 35S doble de pCAMBIA2301 reemplazado por el promotor de nos para dirigir la expresion del gen nptII, que confiere seleccion en cftricos, seguido del reemplazo del gen GUS por un fragmento de BC::intron y con un conductor de peptido rico en glicina ("glycine rich peptide", GRP), conducidos operativamente por el promotor 35S individual. Ademas, el gen de resistencia a kanamicina bacteriano fue reemplazado por un fragmento de gen de resistencia a espectinomicina procedente de pCAMBIA1105 para su uso en cepas que no son de Agrobacterium que portan pTWBi3. El pIPG980 es identico a pIPG955, excepto que se deleciono el conductor GRP y el intron se movio mas cadena abajo en el gen BC.

El pIPG955 se traslado a S. meliloti/pTWBi3 mediante electroporacion y se confirmo mediante un analisis de PCR de ADN miniprep. El pIPG924 se traslado a A. tumefaciens AGL1/pTiBo542 mediante electroporacion y se confirmo mediante un analisis de PCR similar.

Ejemplo 4: Extraccion de plasmidos auxiliares Ti desarmados y binarios desde Sinorhizobium

Los plasmidos auxiliares Ti desarmados, pTWBi3 y pTiBo542, junto con los plasmidos binarios pIPG955 y pIPG924 se extrajeron de S. meliloti 1021, y A. tumefaciens AGL1, respectivamente. Brevemente, 5 ml de un cultivo realizado durante la noche en TY con kanamicina 150 mg/l, estreptomicina 250 mg/l y espectinomicina 100 mg/l se centrifugo, se resuspendio en 250 j l de tampon P1, se mezclo con 250 j l de tampon P2, y se neutralizo con 350 j l de tampon P3 (tampones del kit QIAGEN Maxi-prep). Despues de una incubacion durante 5 min a temperatura ambiente, la mezcla se centrifugo durante 10 min a 12.000 g a 4 °C. Se mezclaron aproximadamente 750 j l de sobrenadante con 750 j l de isopropanol y se centrifugo durante 10 min a 4 °C. El sedimento se lavo una vez con etanol al 70% y se resuspendio en 50 j l de TE sin secar. Las preparaciones de plasmidos despues se conservaron a 4 °C. El ADN del plasmido se uso como molde para el analisis de PCR utilizando los metodos descritos por Broothaerts (2005). Los plasmidos pIPG955 y pIPG924 se volvieron a transformar en E. coli, despues los plasmidos se reextrajeron a mayor numero de copias y se secuencio el inserto para determinar la estabilidad despues de una transferencia a traves de S. meliloti o A. tumefaciens.

Ejemplo 5: Transformacion de cftricos juveniles mediada por Sinorhizobium meliloti

Se obtuvo el cultivar de cftricos 'Carrizo' en forma de semillas de un productor de semillas certificado del estado de Florida y se emplearon semillas de 'Carrizo' con la superficie esterilizada para la transformacion mediada por S. meliloti. Para esterilizar la superficie de las semillas se retiro la cubierta externa de las semillas mediante pelado manual, y las semillas peladas despues se colocaron en isopropanol al 70% durante 2-3 minutos. El isopropanol se retiro mediante vertido y se anadieron 100 ml de una disolucion de hipoclorito de sodio al 0,6% durante 10 min. La disolucion de cloro se retiro mediante vertido y las semillas se enjuagaron 3X con agua desionizada esteril. Las semillas se secaron con toallas de papel y se colocaron 1-2 semillas sobre aproximadamente 6 ml de medio de germinacion solidificado en tubos de ensayo esteriles de 20,32 cm (8 pulgadas) (grandes). El medio de germinacion consistio en 0,5 X sales MS, sacarosa al 1,5% y agar al 0,7%, pH 5,7. Despues se dejo que las semillas germinasen y creciesen en un incubador en la oscuridad a 26 °C. Se emplearon plantulas de cftricos etioladas procedentes de cultivos de 4-5 semanas como fuente de explantes.

Los explantes se prepararon bajo condiciones esteriles cortando secciones de epicotilo con una longitud de aproximadamente 1 cm a partir de las plantulas etioladas. Las secciones de epicotilo se cubrieron con medio de preinmersion (que consistfa en 0,5X sales MS, maltosa al 8%, MES al 0,05%, vitaminas MS de potencia completa, pH 5,7) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Despues de la preinmersion, el medio se retiro mediante vertido y se reemplazo cubriendo los explantes durante 20 minutos con una suspension de bacterias de S. meliloti preparada como sigue: se cultivaron 20 ml de un cultivo iniciador cultivado durante la noche de S. meliloti/pTWBi3 que contema pIPG955 a partir de una unica colonia en medio TY con kanamicina 150 mg/l y espectinomicina 100 mg/l. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion a 3000 X g durante 10 minutos, y se enjuagaron 2-3 X con medio de transformacion de tomate ("Tomato Transformation", TMT) (1X sales MS, sacarosa al 3%, pH 5,8) mas acetosiringona 100 jM. Las celulas se resuspendieron en aproximadamente 50 ml de TMT acetosiringona 100 uM, la densidad celular se ajusto a D.O. = 1,0, y se agitaron suavemente durante 30-60 minutos.

La suspension de S. meliloti se retiro mediante vertido, y los explantes inoculados se secaron con papel secante, se colocaron en placas de cocultivo, y se incubaron durante aproximadamente 9-12 dfas a 25 °C en oscuridad continua. Los explantes que mostraron un crecimiento de S. meliloti se colocaron en placas de cocultivo nuevas durante este tiempo. El medio de cocultivo consistfa en 1X sales MS, sacarosa al 3%, vitaminas MS de potencia completa, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7.

Despues de una incubacion en la oscuridad, los explantes se trasladaron al medio de regeneracion con seleccion con kanamicina (1X sales MS, sacarosa al 3%, vitaminas MS de potencia completa, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, sulfato de kanamicina 25 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7) y se mantuvieron en la oscuridad durante 3-6 dfas mas a 26 °C, hasta un total de 15 dfas en la oscuridad. Las placas despues se trasladaron a una camara de crecimiento durante 15-30 dfas a 26 °C con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16/8 horas hasta que emergieron los brotes. Los explantes con brotes despues se trasladaron a la superficie del medio de alargamiento de brotes (1X sales MS, sacarosa al 3%, vitaminas MS de potencia completa, BAP 0,5 mg/l, NAA 0,1 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, sulfato de kanamicina 25 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7). Se retiraron de los explantes los brotes que se alargaron hasta una longitud mayor de 1 cm y se trasladaron al medio de enraizamiento 1 [0,25X sales MS, sacarosa al 2%, vitaminas MS de potencia 1/4, IBA (acido indolbutftico) 5 mg/l, NAA 0,5 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7] durante 7-10 dfas a 26 °C con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16/8 horas.

Los brotes despues se trasladaron a placas con medio de enraizamiento 2 (0,25X sales MS, sacarosa al 2%, vitaminas MS de potencia 1/4, cefotaxima 250 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7) durante 7-20 dfas a 26 °C con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16/8 horas. Despues los brotes enraizados se volvieron a trasladar al medio de enraizamiento 2 en tubos de laboratorio convencionales (aproximadamente 7,62 cm (3 pulgadas) de medio en el tubo) para permitir el crecimiento de las rafces. Despues de que las rafces alcanzasen una longitud de aproximadamente 50,8 cm (2 pulgadas), las plantas se trasladaron a la tierra y la maceta se cubrio con plastico para mantener una humedad elevada durante un periodo de aproximadamente 1 semana. Despues se retiro el plastico tras observar un crecimiento vigoroso. Las plantas se mantuvieron durante 3 semanas mas hasta que produjeron multiples hojas. Se retiro una hoja para la extraccion de protemas y para ensayar la expresion del transgen mediante transferencia Western. Las plantulas enraizadas se trasladaron al invernadero para su posterior crecimiento y ensayo.

Basandose en los analisis de la transferencia Western, S. meliloti transporto el ADN-T que porta el transgen BC deseado a celulas del cultivar de cftricos juveniles 'Carrizo', produciendo plantas de cftricos 'Carrizo' enraizadas y completamente transgenicas que expresan el transgen deseado (figura 3 y tabla 1). Las plantas de cftricos juveniles enraizadas transgenicas se obtuvieron de experimentos de transformacion mediados por S. meliloti por medio de un metodo de transformacion directo a unas frecuencias que vanan del 1,5 al 4,7% del numero inicial de explantes. La naturaleza transgenica de estas plantas de cftricos se confirmo mediante una transferencia Western.

Tabla 1 - Resumen de la transformacion de cftricos juveniles mediada por S. meliloti

Ejemplo 6: Transformacion de cftricos juveniles mediada por Sinorhizobium meliloti usando explantes preacondicionados sin tejido meristematico

Se obtuvo el cultivar de cftricos 'Carrizo' en forma de semillas de un productor de semillas certificado del estado de Florida, se esterilizo su superficie y se germinaron en la oscuridad como se describe en el ejemplo 5. Se emplearon plantulas de cftricos etioladas procedentes de cultivos de 4-5 semanas como fuente de explantes.

Los explantes se prepararon bajo condiciones esteriles cortando secciones de epicotilo con una longitud de aproximadamente 1 cm a partir de las plantulas etioladas. Las secciones de epicotilo se cubrieron con medio de preinmersion (que consistfa en 0,5X sales MS, maltosa al 8%, MES al 0,05%, pH 5,7) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Despues de la preinmersion, el medio se retiro mediante vertido, los explantes se secaron con papel secante y se trasladaron al medio de regeneracion sin seleccion (1X sales MS, sacarosa al 3%, vitaminas MS de potencia completa, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7) y se mantuvieron en la oscuridad a 26 °C hasta que se observaron callos en las superficies cortadas de los explantes (aproximadamente 15 dfas). Se seleccionaron los explantes que mostraron formacion de callos, y se retiro completamente cualquier callo y tejido meristematico que se hubiera formado usando un escalpelo sumergido antes del corte en un inoculo de S. meliloti, preparado como se describe exactamente en el ejemplo 5. Los explantes despues se secaron con papel secante y se trasladaron a placas de cocultivo y se incubaron durante aproximadamente 9-12 dfas a 25 °C en oscuridad continua. Los explantes que mostraron un crecimiento de S. meliloti se colocaron en placas de cocultivo nuevas durante este tiempo. El medio de cocultivo consistfa en 1X sales MS, sacarosa al 3%, vitaminas MS de potencia completa, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7.

Todas las etapas de regeneracion posteriores, incluyendo la emergencia de los brotes y el enraizamiento, se realizaron exactamente como se describe en el ejemplo 5.

Basandose en los analisis de la transferencia Western, S. meliloti transporto el ADN-T que porta el transgen BC deseado a celulas del cultivar de cftricos juveniles 'Carrizo' usando este metodo de preacondicionamiento, produciendo plantas de cftrico 'Carrizo' enraizadas y completamente transgenicas que expresan el transgen deseado (figura 3y tabla 1). Las plantas de cftricos juveniles enraizadas transgenicas se obtuvieron de experimentos de transformacion mediados por S. meliloti por medio de un metodo de preacondicionamiento a unas frecuencias que vanan del 2 al 5% del numero inicial de explantes. La naturaleza transgenica de estas plantas de cftricos se confirmo mediante una transferencia Western.

Tabla 2 - Resumen de la transformacion de cftricos juveniles mediada por S. meliloti (metodo de preacondicionamiento)

Ejemplo 7: Transformacion de cftricos juveniles mediada por Agrobacterium tumefaciens comparativa Para comparar las frecuencias de transformacion obtenidas usando S. meliloti con el mismo metodo en el mismo tejido, pero utilizando Agrobacterium, se empleo A. tumefaciens AGL1 para la transformacion. Se obtuvo el cultivar de cftricos 'Carrizo' en forma de semillas de un productor de semillas certificado del estado de Florida, se esterilizo su superficie y se germinaron en la oscuridad como se describe en el ejemplo 5. Se emplearon plantulas de cftricos etioladas procedentes de cultivos de 4-5 semanas como fuente de explantes. Se preparo tejido de cftrico y se trato exactamente como se describe en el ejemplo 5, excepto que los explantes se incubaron durante 10 minutos con una suspension de bacterias de A. tumefaciens preparada como sigue: se cultivaron 20 ml de un cultivo iniciador cultivado durante la noche de A. tumefaciens AGL1 que contema pIPG924 a partir de una unica colonia en medio YEP con kanamicina 40 mg/l. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion a 3000 X g durante 10 minutos, y se enjuagaron 2-3 X con medio TMT (1X sales MS, sacarosa al 3%, pH 5,8) mas acetosiringona 100 uM. Las celulas se resuspendieron en aproximadamente 50 ml de TMT acetosiringona 100 uM, la densidad celular se ajusto a D.O. = 0,3, y se agitaron suavemente durante 30-60 minutos.

La suspension de A. tumefaciens se retiro mediante vertido, y los explantes inoculados se secaron con papel secante, se colocaron en placas de cocultivo, y se incubaron durante aproximadamente 2 dfas a 25 °C en oscuridad continua como se describe en el ejemplo 5. Despues de 2 dfas de cocultivo, los explantes se trasladaron al medio de regeneracion con kanamicina como se describe en el ejemplo 5 durante 15 dfas en oscuridad continua. Despues los explantes se trasladaron a una camara de crecimiento durante 15-30 dfas a 26 °C con un fotoperiodo de luzoscuridad de 16/8 horas hasta que emergieron los brotes y, por lo demas, se trataron como se describe en el ejemplo 5.

Basandose en analisis de la transferencia Western, Agrobacterium transporto el ADN-T que porta el transgen BC deseado a celulas del cultivar de cftricos juveniles 'Carrizo', produciendo plantas de cftricos 'Carrizo' enraizadas y completamente transgenicas que expresan el transgen deseado (figura 3 y tabla 3). Las plantas de cftricos juveniles enraizadas transgenicas se obtuvieron de experimentos de transformacion mediados por Agrobacterium a unas frecuencias que vanan del 2,7% al 3,6% del numero inicial de explantes, lo cual es comparable al 1,5 al 4,7% obtenidas usando Sinorhizobium. De modo interesante, el numero de brotes resistentes a kanamicina fue 17%. La naturaleza transgenica de estas plantas de cftricos se confirmo mediante una transferencia Western.

Tabla 3 - Resumen de la transformacion de cftricos juveniles mediada por Agrobacterium

Ejemplo 8: Transformacion de cftricos maduros mediada por Sinorhizobium meliloti usando explantes preacondicionados sin tejido meristematico

Como material de partida se usaron brotes de cultivares de cftricos maduros 'Hamlin', 'Valencia' y 'Mid-Sweet' de naranjos que se injertaron o "acogollaron" en portainjertos de cultivares de cftricos juveniles 'Carrizo' o 'Swingle' procedentes de una guardena de cftricos comercial. Se retiraron brotes semiduros jovenes recien emergidos con una longitud de aproximadamente 15,24-20,32 cm (6-8 pulgadas), que representan los primeros 2 o 3 florecimientos despues de retirar el injerto de los arboles de guardena recien acogollados, y se colocaron inmediatamente en agua. Como alternativa, pueden utilizarse tallos principales triangulares endurecidos totalmente emergidos de arboles injertados jovenes, con una longitud de aproximadamente 30,48-45,72 cm (12-18 pulgadas), evitando la porcion redonda lenosa de los tallos. Se retiran las hojas y las espinas y se enjuagan dos veces en agua destilada. Se esterilizo la superficie de este tejido mediante inmersion durante 8-10 min (30 minutos para los tallos principales triangulares) en lejfa al 1,2% (2,4% para los tallos principales triangulares) anadiendose unas pocas gotas de Tween-20. El tejido despues se enjuago 5X, cada vez mediante inmersion durante 2 minutos usando agua desionizada esteril. Los extremos se cortaron y se desecharon, y se cortaron y mantuvieron secciones internodales con una longitud de aproximadamente 1 cm. Estos explantes se cubrieron con medio de preinmersion (que consistfa en 0,5X sales MS, maltosa al 8%, MES al 0,05%, pH 5,7) durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Despues de la preinmersion, el medio se retiro mediante vertido, los explantes se secaron con papel secante y se trasladaron al medio de induccion de brotes (1X sales MS, sacarosa al 2,5%, vitaminas MS de potencia completa, MES 3 mM, PVP-40250 mg/l, leche de coco 20 ml/l, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, carbenicilina 100 mg/l, nitrato de plata 10 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7) durante 2-4 semanas en la oscuridad a 26 °C, hasta que se observaron callos en las superficies cortadas de los explantes (aproximadamente 2-4 semanas). Se seleccionaron los explantes que mostraron formacion de callos, y se retiro completamente cualquier callo y tejido meristematico que se hubiera formado usando un escalpelo. En algunos experimentos, el escalpelo se sumergio antes del corte en un inoculo de S. meliloti. En algunos experimented, los trozos cortados se sumergieron en el inoculo de S. meliloti. El inoculo de S. meliloti se preparo como sigue: se cultivaron 20 ml de un cultivo iniciador cultivado durante la noche de S. meliloti/pTWBi3 que contema pIPG955 a partir de una unica colonia en medio TY con kanamicina 150 mg/l y espectinomicina 100 mg/l. Se inocularon 50 pl de este cultivo en 150 ml de medio TY y se cultivo durante la noche hasta una DO = 1,0. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion a 3000 X g durante 10 minutos, y se enjuagaron con medio de transformacion de cftricos maduros ("Mature Citrus Transformation", MCT) (1X sales MS, sacarosa al 8%, MES 3 mM, PVP-40250 mg/l, leche de coco 20 ml/l, pH 5,7). Las celulas se resuspendieron en 150 ml de MCT, y se agitaron suavemente durante 30-60 minutos. Se anadio acetosiringona (200 pM) inmediatamente antes de poner en contacto el tejido de la planta con estas celulas.

Tras la inoculacion de S. meliloti, los explantes se secaron con papel secante y se trasladaron a placas con medio de cocultivo (CCM) y se incubaron durante aproximadamente 9-12 dfas a 25 °C en oscuridad continua. El medio de cocultivo consistfa en 1X sales MS, sacarosa al 2,5%, vitaminas MS de potencia completa, MES 3 mM, PVP-40250 mg/l, leche de coco 20 ml/l, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, nitrato de plata 10 mg/l, y agar al 0,7%, pH 5,7. Los explantes que mostraron un crecimiento de S. meliloti se colocaron en placas de CCM nuevas durante este tiempo.

Despues de 9-12 dfas en medio CCM en la oscuridad, los explantes se trasladaron a medio de induccion de brotes ("Shoot Induction Medium", SIM), que consistfa en CCM mas cefotaxima 200 mg/l y carbenicilina 100 mg/l y se mantuvieron en la oscuridad durante 1-4 semanas mas a 26 °C durante un total de 2-8 semanas de incubacion en la oscuridad para estimular la formacion de callos. Los explantes que mostraron formacion de callos despues se trasladaron a placas SIM nuevas que conteman sulfato de kanamicina 20 mg/l. Las placas despues se trasladaron a una camara de crecimiento durante 2-8 semanas a 26 °C con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16/8 horas hasta que emergieron los brotes.

Los explantes con brotes despues se trasladaron a la superficie del medio de alargamiento de brotes (SEM), formado por 1X sales MS, sacarosa al 2,5%, vitaminas MS de potencia completa, MES 3 mM, BAP 0,5 mg/l, N^aA 0,1 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, carbenicilina 100 mg/l, sulfato de kanamicina 20 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7. Los brotes que se alargaron hasta una longitud mayor que aproximadamente 1 cm se retiraron del explante y se injertaron en portainjertos de 'Carrizo' transgenicos o no transgenicos cultivados en la tierra a partir de semillas. Basandose en los analisis de la transferencia Western, S. meliloti transporto el ADN-T que porta el transgen BC deseado a celulas del cultivar de cftricos maduros 'Hamlin' y 'Valencia' usando este metodo de preacondicionamiento, produciendo puas completamente transgenicas que expresan los transgenes deseados (figuras 4 y 6 y tabla 4), injertadas en plantas de cftrico 'Carrizo'. Las plantas de cftricos maduras transgenicas se obtuvieron de experimentos de transformacion mediados por S. meliloti empleando este metodo de preacondicionamiento a una frecuencia de aproximadamente la mitad de brotes injertados con exito. Los brotes injertados con exito se obtuvieron a unas frecuencias que varian del 0,8%-12% del numero inicial de explantes. La naturaleza transgenica de aproximadamente la mitad de estas plantas de pua de cftricos (del 0,4% al 6%) se confirmo mediante transferencias Western (figuras 4 y 6; algunos datos no se muestran).

Tabla 4 - Resumen de la transformacion de cftricos maduros mediada por S. meliloti

Ejemplo 9: Injerto de brotes transformados maduros sobre portainjertos cultivados en la tierra a partir de semillas Se obtuvieron plantulas del cultivar de cftricos 'Carrizo' de uno a dos meses de edad cultivadas en tierra (con una altura de aproximadamente 15,24-25,4 cm (6-10 pulgadas) de una guardena certificada del estado de Florida. Se retiraron todas las hojas de cada plantula, y se esterilizo suavemente el tallo completo usando una toalla de papel empapada en etanol al 70%. La punta apical del tallo se retiro usando un escalpelo esteril por encima del nodo superior, dejando aproximadamente 1 cm de la parte internodal. Despues el escalpelo se usa para crear un corte longitudinal con una profundidad de aproximadamente 5 mm desde la parte superior del tallo cortado y dividiendo el tallo en forma de V. Se anade despues una gota de agua esteril al corte en V para mantener el area humeda mientras se prepara la pua para el injerto.

Se retiraron del cultivo de tejido los explantes de cftricos maduros transformados con brotes que se alargaban hasta una longitud mayor que aproximadamente 1 cm (habitualmente con 2-3 hojas), y el brote en alargamiento se corto del explante, creando un corte en forma de V en la parte inferior del tallo. El corte en forma de V en la pua madura despues se coloco cuidadosamente en el corte en forma de V del portainjerto, y las superficies se juntaron cuidadosamente y se mantuvieron en su sitio usando clips para injertos de 2,0 mm. Despues de coloco cuidadosamente una bolsa para alimentos de plastico de polietileno con un pliegue superior de cierre sobre la pua injertada completa sin tocar la union injertada y se cerro lentamente, encerrando por completo a la pua injertada por encima de la lmea de la tierra. El cerramiento se mantuvo en su sitio usando un clip colocado bajo la union del injerto y por encima de la lmea de la tierra. Los lados de la bolsa inflada se mantuvieron en su sitio mediante dos palos cortos de madera (pinchos para brochetas) colocados en la maceta y unidos al cerramiento de la bolsa de plastico con cinta adhesiva. Despues se inyectaron aproximadamente 10 ml de agua esteril en el cerramiento de la bolsa de plastico usando una jeringa para tuberculina.

Las plantas injertadas despues se incubaron a 27 °C en una camara de crecimiento equipada con luz fluorescente (fotoperiodo de 16 h) durante dos semanas. El agua dentro del cerramiento se reemplazo si fue necesario usando una jeringa para tuberculina. Las plantas injertadas despues se trasladaron a una camara de crecimiento con mayor intensidad de luz y se mantuvieron alft durante dos semanas mas.

Ejemplo 10: Transformacion de cftricos maduros mediada por Sinorhizobium meliloti usando explantes preacondicionados con tejido meristematico

Como material de partida se usaron brotes de cultivares de cftricos maduros 'Hamlin', 'Valencia' y 'Mid-Sweet' de naranjos que se injertaron o "acogollaron" en portainjertos de cultivares de cftricos juveniles 'Carrizo' o 'Swingle' procedentes de una guardena de cftricos comercial. Se retiraron los brotes semiduros jovenes recien emergidos con una longitud de aproximadamente 15,24-20,32 cm (6-8 pulgadas), que representan los primeros 2 o 3 florecimientos despues de retirar el injerto de los arboles de guardena recien acogollados, y se colocaron inmediatamente en agua. Se retiran las hojas y las espinas y se enjuagan dos veces en agua destilada. Se esterilizo la superficie de este tejido mediante inmersion durante 8-10 min en lejfa al 1,2% anadiendose unas pocas gotas de Tween-20. El tejido despues se enjuago 5X, cada vez mediante inmersion durante 2 minutos usando agua desionizada esteril. Los extremos se cortaron y se desecharon, y se cortaron y mantuvieron secciones internodales con una longitud de aproximadamente 1 cm. Se rechazaron los nodos. Estos explantes se cubrieron con medio de preinmersion (que consisrta en 0,5X sales MS, maltosa al 8%, MES al 0,05%, pH 5,7) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despues de la preinmersion, el medio se retiro mediante vertido, los explantes se secaron con papel secante y se trasladaron al medio de induccion de brotes (1X sales MS, sacarosa al 2,5%, vitaminas MS de potencia completa, MES 3 mM, PVP-40250 mg/l, leche de coco 20 ml/l, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, carbenicilina 100 mg/l, nitrato de plata 10 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7) durante 2-5 semanas en la oscuridad a 26 °C, hasta que se observaron callos en las superficies cortadas de los explantes. Se seleccionaron los explantes que mostraron callos, y trasladaron a la luz durante 1-2 semanas. Los explantes que mostraron brotes primordiales de 1-4 mm se hirieron usando una aguja para tuberculina, pinchando cerca de la base de cada brote primordial. La aguja para tuberculina se presumerge (antes de la herida) en un inoculo de S. meliloti.

El inoculo de S. meliloti se preparo como sigue: se cultivaron 20 ml de un cultivo iniciador cultivado durante la noche de S. meliloti/pTWBi3 que contema pIPG955 a partir de una unica colonia en medio TY con kanamicina 150 mg/l y espectinomicina 100 mg/l. Se inocularon 50 ul de este cultivo en 150 ml de medio TY sin antibiotico y se cultivo durante la noche hasta una DO = 1,0. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion a 3000 X g durante 10 minutos, y se enjuagaron con medio de transformacion de cftricos maduros (MCT) (1X sales MS, sacarosa al 8%, MES 3 mM, PVP-40250 mg/l, leche de coco 20 ml/l, pH 5,8). Las celulas se resuspendieron en 150 ml de MCT, y se agitaron suavemente durante 30-60 minutos. Se anadio acetosiringona hasta 200 uM y se anadio Silwet L-77 hasta 0,02% inmediatamente antes de poner en contacto el tejido de la planta con estas celulas.

Tras la inoculacion de S. meliloti, los explantes se secaron con papel secante y se trasladaron a placas con medio de cocultivo (CCM) y se incubaron durante 9 dfas a 25 °C en oscuridad continua. El medio de cocultivo consisrta en 1X sales MS, sacarosa al 2,5%, vitaminas MS de potencia completa, MES 3 mM, PVP-40250 mg/l, leche de coco 20 ml/l, BAP 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l, nitrato de plata 10 mg/l, y agar al 0,7%, pH 5,7. Los explantes que mostraron un crecimiento de S. meliloti se colocaron en placas de CCM nuevas durante este tiempo.

Despues de 10 dfas en medio CCM en la oscuridad, los explantes se trasladaron a medio de induccion de brotes (SIM), que consisrta en CCM mas cefotaxima 200 mg/l y carbenicilina 100 mg/l y se mantuvieron en la oscuridad durante 1-4 semanas mas a 26 °C durante un total de 2-8 semanas de incubacion en la oscuridad para estimular la formacion de callos. Los explantes que mostraron formacion de callos despues se trasladaron a placas SIM nuevas que conteman sulfato de kanamicina 20 mg/l. Las placas despues se trasladaron a una camara de crecimiento durante 2-8 semanas a 26 °C con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16/8 horas hasta que emergieron los brotes. Los explantes con brotes despues se trasladaron a la superficie del medio de alargamiento de brotes (SEM), formado por 1X sales MS, sacarosa al 3%, vitaminas MS de potencia completa, BAP 0,5 mg/l, NAA 0,1 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, sulfato de kanamicina 20 mg/l, agar al 0,7%, pH 5,7. Los brotes que se alargaron hasta una longitud mayor que 1 cm se retiraron del explante y se injertaron en portainjertos de 'Carrizo' no transgenicos cultivados en la tierra a partir de semillas.

Ejemplo 11: Transformacion de cftricos maduros mediada por Agrobacterium usando explantes preacondicionados sin tejido meristematico

Como material de partida se usaron brotes de naranjo de los cultivares de cftricos maduros 'Hamlin', 'Valencia' y 'Mid-Sweet' que se injertaron o "acogollaron" en portainjertos de cultivares de cftricos juveniles 'Carrizo' o 'Swingle' procedentes de una guardena de cftricos comercial y se trataron exactamente como se describe en el ejemplo 8, excepto que se uso A. tumefaciens AGL1 para la transformacion y el tejido se mantuvo en placas CCM durante 2 dfas en lugar de 9-12 dfas.

El inoculo de A. tumefaciens se preparo como sigue: se cultivaron 20 ml de un cultivo iniciador cultivado durante la noche de A. tumefaciens AGL1 que contema pIPG924 a partir de una unica colonia en medio YEP con kanamicina 40 mg/l. Se inocularon 10 pl de este cultivo en 50 ml de medio YEP y se cultivo durante la noche hasta una DO menor que 0,6. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion a 3000 X g durante 10 minutos y se ajusto la densidad celular a una D.O. = 0,3. Las celulas se volvieron a centrifugar y se enjuagaron con medio de transformacion de cftricos maduros (MCT) (1X sales MS, sacarosa al 8%, MES 3 mM, pVp-40250 mg/l, leche de coco 20 ml/l, pH 5,8). Las celulas se resuspendieron en 150 ml de MCT, y se agitaron suavemente durante 30-60 minutos. Se anadio acetosiringona (200 uM) y Silwet L-77 hasta 0,02% inmediatamente antes de poner en contacto el tejido de la planta con estas celulas.

Basandose en los analisis de la transferencia Western, A. tumefaciens transporto el ADN-T que porta el transgen BC deseado a celulas del cultivar de cftricos maduros 'Hamlin', 'Valencia' y 'Mid-Sweet' usando este metodo de preacondicionamiento, produciendo puas transgenicas que expresan el transgen (figuras 5 y 6 y tabla 5). Estas puas transgenicas se injertaron en un portainjerto 'Carrizo' no transgenico cultivado en la tierra a partir de semillas. Las plantas de cftricos maduras transgenicas se obtuvieron de experimentos de transformacion mediados por Agrobacterium mediante este metodo de preacondicionamiento a una frecuencia de aproximadamente la mitad de brotes injertados con exito. Los brotes injertados con exito se obtuvieron a unas frecuencias que vanan del 0,5% al 7% del numero inicial de explantes, lo cual es comparable al 0,6% al 12% de frecuencias obtenidas usando Sinorhizobium en el ejemplo 8. La naturaleza transgenica de aproximadamente la mitad de estas plantas de pua de cftricos (del 0,25 al 3,5%) se confirmo mediante transferencias Western (figuras 5 y 6; algunos datos no se muestran).

Tabla 5 - Resumen de la transformacion de puas de cftricos maduros mediada por Agrobacterium. Ham, 'Hamlin';

Val, 'Valencia'

A menos que se indique lo contrario, todos los terminos y expresiones tecnicos y cienrtficos empleados en la presente tienen el mismo significado que el que entienden habitualmente los expertos en la tecnica a la cual pertenece esta invencion. Las definiciones de los terminos y expresiones habituales en biologfa molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Oxford University Press, 2007 (lSBN-10 0131439812); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, edicion revisada, 2000.

Douglas C.J., Halperin W., Nester E.W. (1982), Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells, J. Bacteriol., 152:1265-1275.

Frost H.B. (1943), Seed reproduction: development of gametes and embryos, en: Webber H.J., Batchelor L.D. (eds.), The Citrus industry, vol 1., University of California Press, Berkeley, Calif., pp 767-815.

Galibert, F. et al., 2001, The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti, Science, 293:668­ 672.

Garda, R., Asins, M. J., Forner, J., y Carbonell, E. A. 1999, Genetic analysis of apomixis in Citrus and Poncirus by molecular markers, Theoretical and Applied Genetics, 99:511-518.

Gould J.H. y M. Megallanes-Cedeno, 1998, Adaptation of cotton shoot apex culture to Agrobacterium mediated transformation, Plant Mol. Biol. Rep., 16:1-10.

Kategari I.S., Vamadevaiah H.M., Udikeri S., Khadi B.M., Polumetla A.K, 2007, Genetic transformation of an elite Indian genotype of cotton (Gossypium hirsutum L.) for insect resistance, Curr. Sci., 1843-1847

Koltunow, A. M., Soltys, K., Nito, N., y Mcclure, S., 1995, Anther, Ovule Seed, and Nucellar Embryo Development in Citrus-Sinensis Cv 'Valencia', Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique, 73:1567-1582.

Lazo, G.R., P.A. Stein, y R.A. Ludwig, 1991, A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium, Bio/Technology, 9:963-967.

Lippincott B., Lippincott J.A. (1969), Bacterial attachment to a specific wound site as an essential stage in tumor initiation by Agrobacterium tumefaciens, J. Bacteriol., 97:620-628.

Long, S., 2001, Genes and Signals in the Rhizobium-Legume Symbiosis, Plant Physiol., 125:69-72.

Manner, H.I., R.S. Buker, V. Easton Smith, y C.R. Elevitch, 2006, Citrus species (citrus), ver. 2.1., en: Elevitch, C.R. (ed.), Species Profiles for Pacific Island Agroforestry. Permanent Agriculture Resources (PAR), Holualoa, Hawaii. Miki y McHugh, 2004, Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety, J. Biotechnol., 107:193-232.

Moore, G. A., Jacono, C. C., Neidigh, J. L., Lawrence, S. D. y Cline, K. Regeneration of transgenic plants, Plants Cell Rep., 11:238-2542.

Moore, G. A. y Cline, K., 1987, Genetic transformation studies in Citrus using the Agrobacterium tumefaciens vector system, Annual Review Microbiology, 22:1007.

Nogler G.A. (1984), Gametophytic apomixis, en: Jhri B.M. (ed.), Embryology of angiosperms, Springer, Berlin Heidelberg New York, pp. 475-518.

Peremyslov, V. V., Hagiwara, Y., y Dolja, V. V., 1999, HSP70 homolog functions in cell-to-cell movement of a plant virus, Proc. Natl Acad. Sci., 96:14771-14776.

Pitzschke, A. y Hirt, H., 2010, New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation, EMBO J., 29:1021-1032.

Slc, S. y Gokceoglu, M., 2007, Pollen analysis of honeys from Mediterranean region of Anatolia, Grana, 46:57-64. Spiegel-Roy, P. y Goldschmidt, E.E. (1996), pp. 185-186, en Biology of Citrus, Cambridge University Press, 230 pp. 'Swingle', W.T. (1927), Seed production in sterile Citrus hybrids-its scientific explanation and practical significance, Hort. Soc. New York Mem., 3:19-21.

Wallace, H.M., King, B.J., y Lee, L.S., 2002, Pollen flow and the effect on fruit size in an 'Imperial' mandarin orchard, HortScience, 37:84-86.

Ward, J.E., Akiyoshi, D.E., Regier, D., Datta, A., Gordon, M.P y Nester, E.W., 1988, Characterization of the virB operon from an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid, J. Biol. Chem., 263:5804-5814.

Wendt, T., Doohan, F., Winckelmann, D. y Mullins, E., 2011, Gene transfer into Solanum tuberosum via Rhizobium spp., Transgenic Res., 20:377-386.

Wood, D.W. et al., 2001, The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58, Science, 294:2317-2323.

Zapata C., Srivalakanakul M., Park S.H., Lee B.M., Salas M.G., Smith R.H. (1999), Improvement in shoot apex regeneration of two fibre crops: cotton and Kenaf, Plant Cell Tissue and Organ Cult., 12:43-50.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para transformer una celula de una planta de cftrico madura, que comprende:

(a) colocar secciones de tallo que comprenden celulas de la planta de cftrico madura en un medio de cultivo de tejidos adecuado para la formacion de tejido de callo;

(b) seleccionar solo las secciones de tallo que forman callos;

(c) retirar el callo y el tejido meristematico resultante de dichas secciones de tallos seleccionadas;

(d) poner en contacto una o mas de las celulas de la planta de cftrico madura procedentes de dichas secciones de tallo seleccionadas con los callos retirados, con una bacteria de Agrobacterium spp. o Sinorhizobium spp. que comprende:

(i) un primer acido nucleico que comprende una region del gen vir de un plasmido Ti, en la que la region del gen vir actua para introducir un acido nucleico de interes en la celula de la planta de una manera dependiente de VirD2; y (ii) un segundo acido nucleico que comprende una o mas secuencias de ftmite de ADN-T unidas operablemente a un acido nucleico de interes; y

(e) seleccionar al menos una celula de la planta de cftrico transformada que comprende el acido nucleico de interes.

2. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la bacteria de Sinorhizobium spp. se cultiva en presencia de un compuesto que potencia la funcion del gen vir antes de ponerse en contacto con la celula de la planta.

3. - El metodo de la reivindicacion 2, en el que el compuesto que potencia la funcion del gen vir es acetosiringona.

4. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la bacteria de Sinorhizobium spp. es Sinorhizobium meliloti.

5. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que las secciones de tallo comprenden secciones de tallo internodales preparadas a partir de brotes recien emergidos de plantas de cftricos maduras.

6. - Un metodo para potenciar la transformacion de una celula de una planta de cftrico madura, que comprende: (a) colocar secciones de tallo que comprenden celulas de la planta de cftrico madura en un medio de cultivo de tejidos adecuado para la formacion de tejido de callo;

(b) seleccionar solo las secciones de tallo que forman callos;

(c) retirar el callo y el tejido meristematico resultante de dichas secciones de tallos seleccionadas;

(d) introducir un acido nucleico en una o mas de las celulas de la planta de cftrico madura procedentes de dichas secciones de tallo seleccionadas con los callos retirados, usando Agrobacterium spp. o una celula de rizobio que no es Agrobacterium, produciendo con ello una celula transformada que comprende el acido nucleico; y

(e) seleccionar al menos una celula de la planta de cftrico transformada que comprende el acido nucleico de interes.

7. - El metodo de la reivindicacion 6, en el que las secciones de tallo de cftrico se toman de brotes recien emergidos de plantas de cftricos maduras.

8. - El metodo de la reivindicacion 7, en el que los brotes recien emergidos de cftricos maduros son los primeros brotes de yemas de plantas maduras tras el injerto en un portainjerto.

9. - El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6, en el que la celula de una planta de cftrico transformada se regenera en un brote transgenico mediante:

(i) la eleccion de un tejido de la planta que comprende una celula transformada mediante seleccion y/o evaluacion; y (ii) el cultivo del tejido de la planta elegido bajo condiciones que estimulan el alargamiento del brote;

en el que la celula de la planta de cftrico transformada se regenera en dicho brote transgenico.

10. - El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6, que comprende ademas regenerar una planta de cftrico a partir de la celula de la planta de cftrico transformada, en el que la planta de cftrico regenerada comprende el acido nucleico transformado.

11.- El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6, que comprende ademas regenerar una planta de cftrico a partir de la celula de la planta de cftrico transformada induciendo la formacion de un brote de cftrico transformado a partir de dicha celula de la planta de cftrico transformada, e injertando dicho brote de cftrico transformado en un portainjerto transgenico o no transgenico, en el que se forma una union del injerto, y el brote injertado comprende el acido nucleico de interes.