CN115005103A

CN115005103A - 一种可诱导柑橘组织腋芽发生的培养基及繁殖柑橘苗的方法

Info

Publication number: CN115005103A
Application number: CN202210831375.7A
Authority: CN
Inventors: 宋放; 王策; 吴黎明; 蒋迎春; 何利刚; 王志静; 马小方; 张豫
Original assignee: Institute of Fruit and Tea of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Fruit and Tea of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-07-15
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2022-09-06

Abstract

本发明提供了一种可诱导柑橘组织腋芽发生的培养基，在MT培养基的基础上，降低了无机盐离子浓度，增加了作为氮源的硝态氮，去除了Co²⁺离子，加入了抗坏血酸，并且增加了烟酸含量；还提供一种无性繁殖柑橘苗的方法。本发明的培养基培养的柑橘组织大幅提高了腋芽发生概率，并大幅降低了褐化率，极大地提高了组培成功率。通过使用本发明的培养基和方法，可将腋芽出芽率从34.17％大幅提高至最高70％以上，茎段的褐化率最低可降低至10％以下，微芽嫁接成活率从不到5％大幅提高至最高33％以上，因此，大大提高了通过组培和嫁接法来对柑橘进行扩繁的效率。

Description

一种可诱导柑橘组织腋芽发生的培养基及繁殖柑橘苗的方法

技术领域

本发明涉及柑橘扩繁领域，更特别地，涉及一种可诱导柑橘组织腋芽发生的培养基及繁殖柑橘苗的方法。

背景技术

我国是柑橘生产大国，柑橘种植面积和总产量均居于世界第一位。近几十年来我国柑橘产业规模迅猛发展，到2019年我国柑橘总产量已达到4584.5万吨。目前我国已保存有1753份柑橘品种资源，近年来又选育和引进了一大批柑橘新品种。

在柑橘品种选育和扩繁时，需要从柑橘母株上取茎段，诱导茎段发生腋芽，然后嫁接到砧木上，从而快速成长植株。然而，目前的组培处理中，茎段腋芽发生的诱导率较低，并且萌发腋芽的茎段在嫁接后的

MT培养基是目前柑橘组织培养(如播种和转基因)最常使用的培养基，但试验发现MT培养基并不适合诱导芽的产生，并且还存在茎段出芽率低和褐化严重的情况。MT培养基的成分如表1所示。

表1 MT培养基的成分

因此，需要一种新的培养基用于促进柑橘腋芽的发生和伸长。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种可诱导柑橘腋芽发生的培养基，在MT培养基的基础上，降低了无机盐离子浓度，增加了作为氮源的硝态氮，去除了Co²⁺离子，加入了抗坏血酸，并且增加了烟酸含量。

在一个具体实施方案中，钙盐以Ca(NO₃)₂·4H₂O的形式添加，钾盐以K₂SO₄的形式添加。

在一个具体实施方案中，烟酸的含量为1mg/L。

在一个具体实施方案中，抗坏血酸的含量为0.5mg/L。

在一个具体实施方案中，所述培养基含有以下组分：

NH₄NO₃ 600mg/L，K₂SO₄ 990mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L，KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·H2O 22.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，Na₂-EDTA 37.3mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，维生素B1 1mg/L,烟酸1mg/L，维生素B60.5mg/L，抗坏血酸VC 0.5mg/L。

本发明的培养基在常用的MT培养基的基础上，通过降低盐离子浓度、增加硝态氮作为氮源，使得茎段更容易吸收培养基中的营养元素，去除MT培养基中的Co²⁺，消除其对植物组织的毒害，同时加入了抗坏血酸来减轻褐化现象，并增加了烟酸的含量来提高植物组织的代谢率。通过这些改进之后，本发明的培养培养的柑橘组织大幅提高了腋芽发生概率，并大幅降低了褐化率，极大地提高了组培成功率。

本发明还提供了一种无性繁殖柑橘苗的方法，包括以下步骤：

S1：从柑橘母株取茎段，使用权利要求1-5中任一项所述的培养基培养至腋芽萌发；

S2：将所述腋芽嫁接至砧木上。

在一个具体实施方案中，S1包括以下步骤：

S11：从所述柑橘母株采集半木质化春梢或夏梢，洗净后切成茎段；

S12：将所述茎段进行生物学下端插入所述培养基中，于26℃培养。

在一个具体实施方案中，S2包括以下步骤：

S21：将砧木整形，并在所述砧木上距顶端0.5-0.8cm处切出伤口；

S22：取所述腋芽嫁接在所述伤口处，得到嫁接腋芽，

S23：将所述嫁接腋芽进行培养，得到嫁接苗。

在一个具体实施方案中，S22中，用于嫁接的腋芽的长度大于等于2mm。

在一个具体实施方案中，S23中，培养所述嫁接腋芽所用的培养基为MT培养基。

通过使用本发明的培养基和方法，可将腋芽出芽率从34.17％大幅提高至最高70％以上，茎段的褐化率最低可降低至10％以下，微芽嫁接成活率从不到5％大幅提高至最高33％以上，因此，大大提高了通过组培和嫁接法来对柑橘进行扩繁的效率。

附图说明

图1为龟井2501的茎段在MT3培养基(a)和CBM2培养基(b)中培养30d后的照片。

图2为龟井2501和桃叶橙的茎段插在CBM2培养基中培养15d后的照片。

图3为微芽嫁接过程中各阶段的照片，其中，a为CBM2培养15d腋芽已萌发的茎段；b为黄化后照自然光2～3d的砧木苗；c为“斜劈法”嫁接得到的嫁接微芽；d为微芽嫁接7d的嫁接苗；e为微芽嫁接45d的嫁接苗；f为微芽嫁接75d可炼苗移栽的嫁接苗；g为移栽后60d的嫁接苗。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.培养基配方的建立

在实验中，我们针对促进柑橘腋芽的发生和伸长进行了反复改进和试验，在MT培养基的基础上进行改进，得到CBM培养基。

该培养基可促进柑橘萌发腋芽，其配方如下：

表2 CBM培养基配方

2.砧木准备

繁殖柑橘无病毒苗木所用的砧木用实生苗，优选合适健康砧木种子，一般选当年实生种子，发芽率更高。目前用量较多是枳壳、枳橙、柠檬。种子用10％(V/V)的NaClO溶液消毒30min，用无菌水冲洗4～5次，直到将种子表面的消毒剂完全洗净，将种子的外、中表皮在灭菌滤纸上剥离后将内种皮置入MS固体培养基的试管中，置于26℃的恒温培养箱中暗培养15d左右，获得黄化苗。嫁接前放在自然光中锻炼2～3d，用作砧木。

3.接穗准备

繁殖无病毒苗木所用的接穗和砧木的品种都是适栽品种，本试验用龟井2501和桃叶橙。尽可能选择品种纯正、挂果性能稳定、丰产的老柑橘树。在6～9月份采集时温度较高，新芽带病检出率低。

对供脱毒的柑橘植株进行预处理，脱毒前需每天在40℃有光照条件下生长16h和在30℃黑暗条件下生长8h，连续处理10～15d后，采集刚刚老熟的半木质化枝梢进行下一步处理。对于2～3年生嫁接苗，可直接置于40～45℃培养箱内，控制相对湿度85％，16h光照处理，持续处理3～5d后采集半木质化枝梢进行下一步处理。

4.微芽嫁接

1)再生体系构建

外植体消毒使用间二消毒法。从供试植株上采集刚刚老熟的半木质化春梢或夏梢，适宜浓度的洗洁精浸泡，自来水反复冲洗干净，将其切成3cm左右的小茎段，放置于无菌水中，配置成5％的NaClO溶液(V/V)，在超净台上对茎段消毒10min；用无菌水冲洗4～5次，直到将茎段表面的消毒剂完全洗净，间隔48h后，重复之前消毒步骤，将茎段的生物学下端插入培养基中，置于26℃的恒温培养箱中培养至腋芽萌发。

以上实验中根据所用的培养基不同，分成5个组，如下：

MT1组：MT+1.0ZT+0.2IAA

MT2组：1/2MT+1.0ZT+0.2IAA

MT3组：1/2MT+1.0ZT+0.2IAA+100L-cys

CBM1组：CBM+1.0ZT+0.2IAA

CBM2组：CBM+1.0ZT+0.2IAA+100L-cys

以龟井2501为材料，使用上述5种培养基进行培养，结果如图1和表3所示，CBM培养基可以显著提高发芽率，同时降低褐化率。尤其是CBM2培养基将出芽率从34.17％提高至67.50％，将褐化率从61.67％降低至30.83％。

表3不同培养基对出芽率和褐化率的影响

使用CBM2培养龟井2501和桃叶橙，构建再生体系，结果如图2和表4所示，龟井2501和桃叶橙用CBM2培养基进行再生体系构建出芽率均达到70％以上，将褐化率控制在25％以下，龟井2501的褐化率已降低至9.79％。

表3再生体系构建情况统计

2)茎段腋芽嫁接

将培养好的黄化砧木苗移出试管，选取根颈部直径不小于2mm的健壮苗，将砧木的一头一尾部分去掉，根据砧木的粗细可以留不同的长度，一般留出砧木上半部分长3～4cm，留根4～5cm，然后在砧木上离茎端约0.5～0.8cm处切出接纳腋芽的伤口。本次试验中大部分采用斜劈法，切一“倒T”形切口或“△”形伤口，利用刀尖向木质部方向轻压出一空隙。接着，取约5mm大小的腋芽茎尖(可带有部分原茎段韧皮部，便于成活)放于交叉处，嫁接到“倒T”和“△”的伤口上，使茎尖切口与砧木切口木质部紧密贴合，切口处用保护凝胶(保护凝胶主要成分为低熔点琼脂糖，添加适量蜂胶、玻尿酸和还原性谷胱甘肽，主要作用是为了保护嫁接口，防止幼嫩接穗发生霉变，失水和褐化等，以提高嫁接的成活率。)包裹完全，将嫁接好的试管苗置入MT(有滤纸桥做支撑)基本液体培养基中进行培养。

5.炼苗、移栽与管护

嫁接完成后写上标签，置于25～28℃培养箱中，砧木萌芽长出需及时去萌。一般情况下1周左右就会出现萌蘖，在转管之前一般去萌2～3次，一般1个月(长到2～3片叶)后转管，此时转入新的液体培养基有利于植株吸收新的营养物质。

在新试管内继续生长至嫁接苗长出4～5片叶(一个月左右需继代一次)，将试管苗转入土壤培养基中，移栽前揭开培养瓶盖，在自然光下炼苗2～3d，移栽时把根部的培养基洗干净并晾干(防细菌滋生)，移栽后用透明罩盖上保湿，2周后植株正常生长去掉。基质为园土：椰糠∶有机肥：蛭石：珍珠岩＝3∶2∶3：1：1的比例配制(使用前灭菌处理)。配置好的轻基质混合均匀后装入33cm高，10cm宽的无纺布育苗钵中。选择10～15cm高的生长健壮且一致性好的脱毒嫁接苗移栽到基质中，并浇足定根水。移栽好的砧木苗放入温室中进行培养，室温25℃，空气湿度70％～90％，每周每棵柑橘苗浇600mL 1/2Hoagland营养液1次。一般炼苗1～2个月之后，将其移栽至更大的培养钵中，置于40目网室进行隔离培养。

结果如图3所示，使用CBM2培养能够良好促进茎段萌发腋芽(图3a)，并且，萌发腋芽的茎段通过微芽嫁接的方法在嫁接到砧木上后生长良好(图3d-g)。统计成活率如表5所示，使用再生体系构建+茎段腋芽微芽嫁接的方法使微芽嫁接成活率从茎尖微芽嫁接的不到5％提升至20％以上。

表5再生芽微芽嫁接成活率统计

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可诱导柑橘组织腋芽发生的培养基，其特征在于，在MT培养基的基础上，降低了无机盐离子浓度，增加了作为氮源的硝态氮，去除了Co²⁺离子，加入了抗坏血酸，并且增加了烟酸含量。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，钙盐以Ca(NO₃)₂·4H₂O的形式添加，钾盐以K₂SO₄的形式添加。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，烟酸的含量为1mg/L。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，抗坏血酸的含量为0.5mg/L。

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，含有以下组分：

NH₄NO₃ 600mg/L，K₂SO₄ 990mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L，MgSO₄·7H₂O370mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O556mg/L，KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·H2O 22.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，Na₂-EDTA 37.3mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L，肌醇100 mg/L，甘氨酸2 mg/L，维生素B1 1mg/L,烟酸1 mg/L，维生素B6 0.5 mg/L，抗坏血酸VC 0.5mg/L。

6.一种无性繁殖柑橘苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2：将所述腋芽嫁接至砧木上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S2包括以下步骤：

S22：取所述腋芽嫁接在所述伤口处，得到嫁接腋芽，

S23：将所述嫁接腋芽进行培养，得到嫁接苗。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，S22中，用于嫁接的腋芽的长度大于等于2mm。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，S23中，培养所述嫁接腋芽所用的培养基为MT培养基。