JP2016536978A - トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）メタロチオネイン様調節エレメントおよびその使用 - Google Patents

Abstract

トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子調節エレメントを用いて、植物細胞および／または植物組織中で導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１３年１０月４日出願の米国仮特許出願第６１／８８６９４３号に基づく優先権を主張するものである。

電子的に提出される材料の参照による組み込み
これと同時に提出され、以下のように特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０１４年９月２９日に作成された１つの１６ＫＢ ＡＣＩＩ（テキスト）「２２４８８３＿ＳＴ２５」という名前付きファイル。

植物の形質転換は、農学的に望ましい形質または特性を異なる作物植物種に導入するのに使用するための魅力的な技術である。特定の望ましい形質を有するよう植物種が開発および／または改変されている。一般的に、望ましい形質には、例えば、栄養価の改善、収量増加、耐有害生物性または耐病性の付与、耐乾燥性およびストレス耐性の増加、園芸品質（例えば、着色および成長）の改善、除草剤耐性の付与、植物からの産業的に有用な化合物および／または材料の製造の可能化、ならびに／あるいは医薬品の製造の可能化が含まれる。

単一ゲノム遺伝子座に積み重なった複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物は、植物の形質転換技術を介して作製される。植物の形質転換技術によって、導入遺伝子の植物細胞への導入、植物ゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子のコピーを含む稔性トランスジェニック植物の回収がもたらされ、導入遺伝子（複数可）の転写および翻訳を介したその後の導入遺伝子発現によって、望ましい形質および表現型を有するトランスジェニック植物が得られる。スタック中の各導入遺伝子は、典型的には遺伝子発現のために独立したプロモーターを要するので、複数のプロモーターが導入遺伝子スタックに使用される。

同じ形質を調節するために複数の導入遺伝子の同時発現が必要となることにより、しばしば複数の導入遺伝子の発現を駆動するために同じプロモーターを繰り返し使用することになる。しかしながら、高レベルの配列同一性を共有する配列を含むプロモーターを繰り返し使用することは、相同性ベースの遺伝子サイレンシング（homology-based gene silencing）（ＨＢＧＳ）をもたらし得る。反復ＤＮＡ配列を導入遺伝子に使用すると、ＨＢＧＳがトランスジェニック植物で頻繁に起こることが確認された（Peremarti et al., 2010）。さらに、導入遺伝子構築物に類似ＤＮＡ配列を繰り返し使用することは、プラスミドの組換えおよび不安定性のために、アグロバクテリウム（Agrobacterium）では困難と分かった。

トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子調節エレメント（例えば、プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ）が本明細書で記載される。さらに、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子調節エレメントを利用する構築物および方法が記載される。

植物細胞および／または植物組織中で導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が本明細書で開示される。一実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子の調節エレメントを、トウモロコシゲノムから精製し、前記調節エレメントと天然には連結していない配列と組み換えて、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様調節配列に生まれつき備わっていない導入遺伝子を植物細胞中で発現させるための発現ベクターを創製する。一実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子の調節エレメントがポリリンカー配列と作動可能に連結している発現ベクターが提供される。このような発現ベクターは、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子調節配列と作動可能に連結した状態で遺伝子または遺伝子カセットをベクターに挿入することを容易にする。

実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む構築物が提供される。実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、プロモーターと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、プロモーターと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、少なくとも１、２、３、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の導入遺伝子を含む。

実施形態では、遺伝子発現カセットが、独立に、ａ）トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、ｂ）トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲ、およびｃ）トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む。

一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターであって、プロモーターが配列番号１、または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列からなる、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、核酸ベクターが遺伝子カセットを含み、遺伝子カセットがプロモーター、導入遺伝子および３’非翻訳領域を含み、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結している配列番号１からなり、導入遺伝子の第２の末端が配列番号３からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。さらなる実施形態では、核酸ベクターが遺伝子カセットを含み、遺伝子カセットがプロモーター、導入遺伝子および３’非翻訳領域を含み、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結している配列番号１からなり、導入遺伝子の第２の末端が配列番号４からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。

一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターであって、プロモーターが配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列からなる、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、核酸ベクターが遺伝子カセットを含み、遺伝子カセットがプロモーター、導入遺伝子および３’非翻訳領域を含み、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結している配列番号２からなり、導入遺伝子の第２の末端が配列番号３からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。さらなる実施形態では、核酸ベクターが遺伝子カセットを含み、遺伝子カセットがプロモーター、導入遺伝子および３’非翻訳領域を含み、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結している配列番号２からなり、導入遺伝子の第２の末端が配列番号４からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。

トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物を育てる方法が本明細書で開示される。トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法も本明細書で開示される。実施形態では、本明細書で開示される方法が、植物根における組織特異的遺伝子発現を含む。

一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号１を含む、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列を含む非トウモロコシ（Zea mays）植物または植物細胞が提供される。別の実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号２を含む、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む非トウモロコシ（Zea mays）植物または植物細胞が提供される。

一実施形態では、植物がトウモロコシ変種である。一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号１または２からなる、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、遺伝子カセットを含む非トウモロコシ（Zea mays）植物または植物細胞であって、遺伝子カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含み、さらにプロモーターが配列番号１からなる、非トウモロコシ（Zea mays）植物または植物細胞が提供される。別の実施形態では、遺伝子カセットを含む非トウモロコシ（Zea mays）植物または植物細胞であって、遺伝子カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含み、さらにプロモーターが配列番号２からなる、非トウモロコシ（Zea mays）植物または植物細胞が提供される。さらなる実施形態では、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結しており、導入遺伝子の第２の末端が配列番号３からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。なおさらなる実施形態では、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結しており、導入遺伝子の第２の末端が配列番号４からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。

データベースから得られたゲノム配列データを解析するためのバイオインフォマティクス手法を用いて、トウモロコシの高発現遺伝子を同定する方法を示す概略フローチャートである。 次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による転写プロファイリング手法を用いて、トウモロコシの高発現遺伝子を同定する方法を示す概略フローチャートである。 ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の発現を制御する、完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターおよび３’−ＵＴＲ調節エレメントを含む遺伝子発現カセットを示すｐＤＡＢ１１３０２９ベクタープラスミドマップを示す図である。 試験プロモーター構築物、ｐＤＡＢ１１３０２９中に存在するｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の代わりにｙｆｐレポーター遺伝子を含むｐＤＡＢ１０１５５６対照ベクターのマップを示す図である。ｙｆｐ遺伝子発現を、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１（ＺｍＵｂｉ１）プロモーターによって駆動し、トウモロコシ（Zea mays）Ｐｅｒ５（ＺｍＰｅｒ５）３’−ＵＴＲによって終結した。 ＺｍＵｂｉ１プロモーターによって駆動され、ＳｔＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲによって終結するｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子を含むｐＤＡＢ１０８７４６、陽性対照ベクターのマップを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターおよび完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターのアラインメントを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターおよび完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターのアラインメントを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターおよび完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターのアラインメントを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターおよび完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターのアラインメントを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子および完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを示すｐＤＡＢ１１２８１６のベクタープラスミドマップを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲおよび完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲのアラインメントを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲおよび完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲのアラインメントを示す図である。 切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子および切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲで構成される遺伝子発現カセットを示すｐＤＡＢ１１２８２０のプラスミドベクターマップを示す図である。

定義
本発明を記載および主張する際、以下に示される定義にしたがって以下の専門用語を使用する。

本明細書で使用される「約」という用語は、表示されている値または値の範囲より１０％大きいまたは小さいことを意味するが、値または値の範囲をこのより広い定義のみに指定することを意図していない。「約」という用語が前にある各値または値の範囲は、表示されている絶対値または値の範囲の実施形態を包含することも意図している。

本明細書で使用する場合、「戻し交配」という用語は、育種家が雑種子孫を親の片方と交配する、例えば、第一世代雑種Ｆ１をＦ１雑種の親遺伝子型の片方と交配する過程を指す。

「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、転写因子によって認識される特異的配列を含み得る。これらの因子は、プロモーターＤＮＡ配列に結合することができ、これによってＲＮＡポリメラーゼの動員がもたらされる。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端に、転写開始部位が結合し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むよう上流（５’方向）に広がる。プロモーター配列中には、（例えば、ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって好都合に定義される）転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と作動可能に結合していてもよい。

本開示の目的で、「遺伝子」は、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するかどうかは問わない。したがって、遺伝子は、必ずしもこれに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域を含む。

本明細書で使用する場合、「天然」または「自然」という用語は、自然に見られる状態を定義する。「天然ＤＮＡ配列」は、自然な手段または伝統的な育種技術によって作製され、（例えば、分子生物学／形質転換技術を用いて）遺伝子工学によって生成されていない自然に存在するＤＮＡ配列である。

本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」は、例えば、それだけに限らないが、ｍＲＮＡを含む遺伝子産物をコードする核酸配列と定義される。一実施形態では、導入遺伝子が外因性核酸であり、ここでは導入遺伝子配列が、遺伝子工学によって、導入遺伝子が通常では見られない宿主細胞（またはその子孫）に導入されている。一例では、導入遺伝子が、産業的もしくは薬学的に有用な化合物、または所望の農業形質をコードする遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）をコードしている。さらに別の例では、導入遺伝子がアンチセンス核酸配列であり、アンチセンス核酸配列の発現によって標的核酸配列の発現が阻害される。一実施形態では、導入遺伝子が、内因性核酸の追加のゲノムコピーが望まれる内因性核酸、または宿主生物中の標的核酸の配列に対してアンチセンスの配向にある核酸である。

本明細書で定義される「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換である。

本明細書で定義される「遺伝子産物」は、遺伝子によって産生される任意の産物である。例えば、遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などの工程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、細胞、組織または生物の、遺伝子発現を増加または低下させる因子への曝露によって影響を受け得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質までの経路のどこでも調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシングに作用する制御、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解、または特定のタンパク質分子が産生された後のその分子の活性化、不活性化、区画化もしくは分解、あるいはこれらの組み合わせによって起こる。遺伝子発現は、限定されないが、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、またはインビトロ、インサイチュもしくはインビボタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む当技術分野で既知の任意の方法によってＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。

本明細書で使用する場合、「イントロン」という用語は、転写されるが翻訳されない遺伝子（または対象となる発現したヌクレオチド配列）中に含まれる任意の核酸配列と定義される。イントロンは、ＤＮＡの発現した配列中の非翻訳核酸配列、ならびにそこから転写されたＲＮＡ分子の対応する配列を含む。

本明細書に記載される構築物は、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列も含むことができる。１つのこのようなイントロンの例には、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンまたは任意の他の一般的に知られているイントロン配列がある。イントロンをプロモーター配列と組み合わせて使用して翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強することができる。

本明細書で使用する場合、「５’非翻訳領域」または「５’−ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは、５’−ＵＴＲは、典型的にはその５’末端に７−メチルグアノシンキャップを持ち、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質に向けたｍＲＮＡ輸送、翻訳装置によるｍＲＮＡの５’末端の同定、および分解からのｍＲＮＡの保護などの多くの過程に関与している。

本明細書で使用する場合、「転写ターミネーター」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端の転写セグメントと定義される。例えば、「ポリアデニル化シグナル」部位を越えたより長い長さのＤＮＡがプレｍＲＮＡとして転写される。このＤＮＡ配列は通常、プレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの適切なプロセシングのための１つまたは複数の転写終結シグナルを含む。

本明細書で使用する場合、「３’非翻訳領域」または「３’−ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは、この領域はポリ（Ａ）テールを持ち、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始およびｍＲＮＡ輸送において多くの役割を有することが知られている。

本明細書で使用する場合、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼが存在する場合、転写産物が、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの１０〜３０塩基下流に位置するポリアデニル化部位でポリアデニル化されることを可能にする、ｍＲＮＡ転写産物中に存在する核酸配列を示す。多くのポリアデニル化シグナルが当技術分野で知られており、本発明に有用である。例示的な配列には、Loke J., et al.,(2005) Plant Physiology 138 (3); 1457-1468に記載されているＡＡＵＡＡＡおよびその変異形が含まれる。

本明細書で使用される「単離された」という用語は、自然環境から取り出されたまたは化合物が最初に形成された時に存在する他の化合物から取り出されたことを意味する。「単離された」という用語は、自然源から単離された材料ならびに宿主細胞中での組換え発現による調製後に回収された材料（例えば、核酸およびタンパク質）または核酸分子、タンパク質およびペプチドなどの化学的に合成された化合物を包含する。

本明細書で使用される「精製された」という用語は、天然または自然環境で分子または化合物と通常は会合している汚染物質を実質的に含まない、あるいは化合物が最初に形成された際に存在する他の化合物に対して実質的に高濃度の形態の分子または化合物の単離に関し、元の組成物の他の成分から分離された結果として純度が増加していることを意味する。「精製された核酸」という用語は、本明細書において、成分中の化学的または機能的変化をもたらしながら、それだけに限らないが、ポリペプチド、脂質および炭水化物を含む他の生物学的化合物から分離された、とは別に産生された核酸配列を記載するために使用される（例えば、核酸は、タンパク質汚染物質を除去し、核酸と染色体中に残っているＤＮＡを結合している化学結合を破壊することによって、染色体から精製され得る）。

「組換え」という用語は、遺伝的組換えが起きた細胞または生物を意味する。これには、ヒトの介入によって人工的または合成的（すなわち、非自然的）に変化した分子（例えば、ベクター、プラスミド、核酸またはポリペプチド）も含まれる。変化は、その自然環境または状態内のまたはそこから取り出された分子に行われ得る。

本明細書で使用する場合、「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「ＨＢＧＳ」は、転写型遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称用語である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、それぞれ、プロモーターまたは転写配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生による転写阻害（転写型遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）から生じ得る。各工程に別個の細胞成分が関与していることは、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳがおそらく古代の共通の機構の多様化から生じていることを示唆している。しかしながら、ＴＧＳとＰＴＧＳの厳密な比較は、一般的に別個のサイレンシング遺伝子座の分析によるので、達成が困難であった。単一の導入遺伝子座が、異なる標的遺伝子のプロモーターおよび転写配列に対応するｄｓＲＮＡの産生により、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を誘因すると記載され得る。

本明細書で使用する場合、「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語（全３つの用語は互いに同義である）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成型ならびにこれらの混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー型を指す。「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾型を指し得る。核酸分子は、特に指定しない限り、通常少なくとも１０塩基長である。これらの用語は不定の長さのＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指し得る。これらの用語はＤＮＡの一本鎖型および二本鎖型を含む。核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド連結によって連結した天然および修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。

核酸分子は、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然ヌクレオチドの１個または複数の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電連結：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート（carbamate）等；荷電連結：例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）等；ペンダント部分：例えばペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレン等；キレート剤；アルキル化剤；および修飾連結：例えば、αアノマー核酸等）が含まれる。「核酸分子」という用語はまた、一本鎖、二本鎖、部分二重鎖、三重鎖、ヘアピン型、円形、およびパドロック型（padlocked）立体配座を含む任意のトポロジー立体配座を含む。

転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する。これは、（ピロリン酸の必須の除去とともに）リボヌクレオチド−５’−三リン酸が成長している鎖の３’末端に逐次付加することによってＲＮＡが作製されることを意味する。鎖状または円形核酸分子のいずれにおいても、別個のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）が、さらなるエレメントから５’方向に同核酸に結合しているまたは結合する場合に、別個のエレメントをさらなるエレメントに対して「上流」と呼ぶことができる。同様に、別個のエレメントが、さらなるエレメントから３’方向に同核酸に結合しているまたは結合する場合に、さらなるエレメントに対して「下流」となり得る。

本明細書で使用する場合、「塩基位置」という用語は、指定された核酸中の所与の塩基またはヌクレオチド残基の場所を指す。指定された核酸は、基準核酸とのアラインメントによって定義され得る。

本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合を含む水素結合によってオリゴヌクレオチドおよびその類似体がハイブリダイズする過程を指す。一般的に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかの窒素塩基からなる。これらの窒素塩基は、ピリミジンとプリンとの間で水素結合を形成し、ピリミジンとプリンの結合を「塩基対形成」と呼ぶ。より具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの別個の核酸配列または同じ核酸配列の２つの別個の領域間で生じる塩基対形成を指す。

本明細書で使用する場合、「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」という用語は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で、安定で特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性を指す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し、特異的結合が望まれる条件下、例えば、インビボアッセイまたは系の場合に生理学的条件下で、オリゴヌクレオチドと非標的配列の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合を特異的ハイブリダイゼーションと呼ぶ。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特に、Ｎａ^＋および／またはＭｇ^２＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに寄与するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに要するハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に論じられている。

本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的との間でのミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、さらなる特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書で使用する場合、「中等度のストリンジェンシー」条件とは、５０％超の配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件とは、２０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「極めて高いストリンジェンシー」の条件とは、１０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。特定の実施形態では、ストリンジェントな条件が、６５℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて６５℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる４０分間の洗浄を含むことができる。以下が代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
・極めて高いストリンジェンシー：５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中室温でそれぞれ１５分間の２回の洗浄；および０．５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃でそれぞれ２０分間の２回の洗浄。
・高いストリンジェンシー：５〜６×ＳＳＣ緩衝液中６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中室温でそれぞれ５〜２０分間の２回の洗浄；および１×ＳＳＣ緩衝液中５５〜７０℃でそれぞれ３０分間の２回の洗浄。
・中等度のストリンジェンシー：６×ＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２〜３×ＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間の少なくとも２回の洗浄。
実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、極めて高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。

本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの切断によって、または個々のヌクレオチド前駆体を重合することによって形成され得る。自動化合成装置によって、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡで構成されたオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）を、ポリメラーゼ連鎖反応、小型ＤＮＡ配列の増幅のための技術に使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応では、オリゴヌクレオチドを典型的には「プライマー」と呼び、プライマーによってＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長し、相補鎖を複製することが可能になる。

本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、米国特許第４６８３１９５号に記載されているように、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを増幅する手順または技術を定義する。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、対象となる領域の末端からのまたはこれを超えた配列情報が入手可能である必要があり、これらのプライマーは増幅される鋳型の逆ストランドと配列が同一または類似である。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅される材料の末端と一致し得る。ＰＣＲを使用して特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列等を増幅することができる。一般的に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) を参照されたい。

本明細書で使用する場合、「プライマー」という用語は、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合に、相補鎖に沿って合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。合成条件は、４つの異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸と逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼなどの少なくとも１種の重合誘導剤の存在を含む。これらは、補助因子であるまたは種々の適当な温度でｐＨなどの条件に影響を及ぼす構成成分を含んでもよい適当な緩衝液中に存在する。プライマーは、好ましくは増幅効率が最適化されるような一本鎖配列であるが、二本鎖配列を利用することもできる。

本明細書で使用する場合、「プローブ」という用語は、標的配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）−スタイルアッセイ手順では、プローブが２つのプライマーのアニーリング部位間に位置する標的の部分にハイブリダイズする。プローブは、約８個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド、約３０個のヌクレオチド、約４０個のヌクレオチドまたは約５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブが約８個のヌクレオチド〜約１５個のヌクレオチドを含む。

サザンブロットアッセイ手順では、プローブが膜と結合しているＤＮＡフラグメントにハイブリダイズする。プローブは、約１０個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド、約２５０個のヌクレオチド、約５００個のヌクレオチド、約１０００個のヌクレオチド、約２５００個のヌクレオチドまたは約５０００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブが約５００個のヌクレオチド〜約２５００個のヌクレオチドを含む。

プローブは、検出可能な標識、例えば、放射性標識、ビオチン化標識、蛍光体（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネート等）をさらに含むことができる。検出可能な標識は、例えば、プローブの５’末端またはプローブの３’末端に位置するプローブオリゴヌクレオチドに直接共有結合することができる。蛍光体を含むプローブは、消光剤、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）等をさらに含んでもよい。

本明細書で使用する場合、「配列同一性」または「同一性」という用語は、互換的に使用され、指定された比較窓にわたって最大一致で整列させると同じである２つの配列中の核酸残基を指すことができる。

本明細書で使用する場合、「配列同一性の百分率」という用語は、比較窓にわたって２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を比較することによって決定される値を指し、比較窓中の配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、同一核酸またはアミノ酸残基が両配列中で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。比較のために配列を整列する方法は周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73: 237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8: 155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-50に記載されている。

国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10）は、いくつかの配列解析プログラムと合わせて使用するために、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源からおよびインターネットで入手可能である。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定するのかについての説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」節においてインターネット上で入手可能である。核酸配列を比較するために、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」関数を使用することができる。基準配列とのさらに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法で評価すると、増加する同一性百分率を示す。

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結している」という用語は、互いに機能的関係になっている２つの成分を指す。調節配列およびコード配列に関して使用する場合、「作動可能に連結している」という用語は、調節配列が、連結しているコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」、「調節エレメント」または「制御エレメント」は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳のタイミングおよびレベル／量に影響を及ぼす核酸配列を指す。調節配列には、プロモーター；翻訳リーダー配列；５’および３’非翻訳領域、イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；リプレッサー結合配列；終結配列；ポリアデニル化認識配列等が含まれ得る。特定の調節配列は、これと作動可能に連結しているコード配列の上流および／または下流に位置し得る。また、コード配列と作動可能に連結している特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置し得る。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成され得る。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを核酸とライゲーションまたはアニーリングし、連続したポリヌクレオチドフラグメントを連結するのに使用する。しかしながら、エレメントが作動可能に連結するように連続している必要はない。

本明細書で使用する場合、「形質転換」という用語は、核酸分子をこのような細胞に導入することができる全ての技術を包含する。例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；電気穿孔；リポフェクション；微量注入（Mueller et al. (1978) Cell 15: 579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入；直接ＤＮＡ取り込み；ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換；および微粒子銃が挙げられる。これらの技術を植物細胞の安定な形質転換と一過性形質転換の両方に使用することができる。「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸フラグメントの導入を指す。いったん安定に形質転換されると、核酸フラグメントが宿主生物および後の世代のゲノムに安定に組み込まれる。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と呼ぶ。「一過性形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を有さない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはＤＮＡ含有小器官への核酸フラグメントの導入を指す。

本明細書で使用する場合、「形質導入する」という用語は、ウイルスが核酸を細胞内に移入する過程を指す。

本明細書で使用される「ポリリンカー」または「マルチクローニング部位」という用語は、核酸配列上の互いに１０ヌクレオチド以内に位置する３つ以上の２型制限酵素部位のクラスターを定義する。ポリリンカーを含む構築物は、遺伝子のコード領域などの核酸配列の挿入および／または切除に利用される。

本明細書で使用する場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、その各々が特異的ヌクレオチド配列でまたはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。２型制限酵素は、同部位でＤＮＡを認識および切断し、これらの酵素には、それだけに限らないが、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩ、ＡｖａＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩが含まれる。

「ベクター」という用語は、「構築物」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語と互換的に使用され、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる媒体を意味する。「非ウイルスベクター」は、ウイルスまたはレトロウイルスを含まないベクターを意味することを意図している。いくつかの実施形態では、「ベクター」が、少なくとも１つのＤＮＡ複製起点と少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子とを含むＤＮＡの配列である。例としては、それだけに限らないが、外因性ＤＮＡを細胞内に運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはウイルスが挙げられる。ベクターは１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択マーカー遺伝子ならびに当技術分野で既知の他の遺伝エレメントを含むこともできる。ベクターは、細胞に形質導入、細胞を形質転換または細胞に感染し、それによって細胞に、ベクターによってコードされた核酸分子および／またはタンパク質を発現させることができる。「プラスミド」という用語は、原核または真核宿主細胞中のいずれかで常染色体複製が可能な核酸の円形鎖を定義する。この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい核酸を含む。定義のプラスミドは、細菌複製起点に相当する配列も含み得る。

本明細書で使用される「選択マーカー遺伝子」という用語は、選択マーカー遺伝子が挿入された細胞の同定を容易にするタンパク質をコードする遺伝子または他の発現カセットを定義する。例えば、「選択マーカー遺伝子」は、レポーター遺伝子ならびに例えば、植物細胞を選択剤から保護するまたは選択剤に対する耐性／許容性を与えるために植物形質転換に使用される遺伝子を包含する。一実施形態では、機能的な選択マーカーを受容している細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂または成長することができる。選択剤の例としては、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびハイグロマイシンを含む抗生物質が挙げられる。これらの選択マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ ＩＩ）、ならびに関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびＧ４１８に関する遺伝子、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するハイグロマイシントランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子には、ｂａｒまたはｐａｔを含む除草剤耐性（グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する耐性）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）および分岐鎖アミノ酸の合成の最初のステップを妨げるスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する耐性）、グリホサート、２，４−Ｄおよび金属耐性または感受性をコードする遺伝子が含まれ得る。選択マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするタンパク質などの発現したレポーター遺伝子タンパク質の目視観察が挙げられる。「マーカー陽性」という句は、選択マーカー遺伝子を含むよう形質転換された植物を指す。

本明細書で使用する場合、「検出可能なマーカー」という用語は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出を可能にする標識を指す。検出可能なマーカーの例としては、それだけに限らないが、以下が挙げられる：蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。実施形態では、検出可能なマーカーを種々の長さのスペーサーアームによって結合して潜在的な立体障害を減少させることができる。

本明細書で使用する場合、「検出する」という用語は、特異的分子の定性的測定と定量的測定の両方、例えば、特異的ポリペプチドの測定を含むよう最も広義に使用される。

本明細書で使用する場合、「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特異的制限部位でまたは相同組換えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。本明細書で使用する場合、ＤＮＡのセグメントは、対象となるポリペプチドをコードする目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位が、確実にカセットを転写および翻訳のための適切な読み枠に挿入するよう設計される。実施形態では、発現カセットが、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有することができる。実施形態では、遺伝子発現カセットが、宿主細胞中での対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現増強を可能にするエレメントも含み得る。これらのエレメントには、それだけに限らないが、プロモーター、ミニマルプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、イントロン、５’非翻訳領域配列、３’非翻訳領域配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが含まれ得る。

本明細書で使用する場合、「リンカー」または「スペーサー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子または分子の群である。リンカーおよびスペーサーは、２つの実態の最適間隔を提供する、または２つの実態が互いに離れていることを可能にする不安定な連結をさらに提供することができる。不安定な連結には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分および酵素切断可能な基が含まれる。

本明細書で使用する場合、「異種コード配列」という用語は、宿主生物中に通常は存在せず、適当な条件下において宿主細胞中で発現され得る、ペプチドもしくはタンパク質またはその相当するアミノ酸配列、例えば、酵素をコードする、または最終的にコードする任意のポリヌクレオチドを示すために使用される。よって、「異種コード配列」は、細胞中に通常は存在しないコード配列の追加のコピーを細胞が発現しているように、宿主細胞中に通常は存在しないコード配列の１つまたは追加のコピーを含んでもよい。異種コード配列は、ＲＮＡもしくはその任意の型、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはその任意の型、例えば、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドであり得る。コード配列の例としては、それだけに限らないが、コード配列、イントロン、プロモーター領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲおよびエンハンサー領域のような特徴を含む完全長転写ユニットが挙げられる。

「異種コード配列」はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列、ならびに完全長転写ユニットのコード部分、すなわち、イントロンおよびエキソンを含む遺伝子、ならびに酵素をコードするまたはその相当するアミノ酸配列（但し、相当するアミノ酸配列は機能的タンパク質をもたらす）をコードする「コドン最適化」配列、切断された配列または変化した配列の他の形態も含む。このような相当するアミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失を有していてもよく、欠失はＮ−末端、Ｃ末端または内部である。切断された形態は、本明細書に示される触媒能力を有する限り、想起される。

本明細書で使用する場合、「対照」という用語は、比較目的で分析手順に使用される試料を指す。対照は「陽性」であっても「陰性」であってもよい。例えば、分析手順の目的が、細胞または組織中で差次的に発現した転写産物またはポリペプチドを検出することである場合、所望の発現を示している既知の植物からの試料などの陽性対照、および所望の発現を欠いている既知の植物からの試料などの陰性対照を含めることが一般的に好ましい。

本明細書で使用する場合、「植物」という用語は、全植物および植物の任意の子孫、細胞、組織または部分を含む。本発明に使用することができる植物のクラスは、一般的に被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダおよび多細胞藻類を含む突然変異誘発で修正可能な高等および下等植物のクラスと同じくらい広い。したがって、「植物」には双子葉および単子葉植物が含まれる。「植物部分」という用語には、例えば、限定されないが、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）；植物挿穂；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、シュート、葉、根、茎および外植片）を含む植物の任意の部分（複数可）が含まれる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造もしくは機能単位に組織化される植物細胞の任意の他の群であり得る。植物細胞または組織培養物は、細胞または組織を得た植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生することができ、その植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができるだろう。対照的に、いくつかの植物細胞は、植物を作製するために再生することができない。植物細胞または組織培養物に再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、ひげ、花、仁、穂、穂軸、殻または柄であり得る。実施形態では、植物材料が根組織および地下に位置する他の植物組織を含む。

植物部分には、収穫可能な部分および子孫植物の繁殖に有用な部分が含まれる。繁殖に有用な植物部分には、例えば、限定されないが、種子；果実；挿穂；実生；塊茎および根茎が含まれる。植物の収穫可能な部分は、例えば、限定されないが、花；花粉；実生；塊茎；葉；茎；果実；種子；および根を含む植物の任意の有用な部分であり得る。

植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一細胞であってもまたは細胞の集合体（例えば、もろいカルスおよび培養細胞）であってもよく、高次組織単位の一部（例えば、植物組織、植物器官および植物）であってもよい。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または全植物に再生することができる細胞もしくは細胞の集合であり得る。したがって、複数の植物細胞を含み、全植物に再生することができる種子は、本明細書の実施形態では「植物細胞」とみなされる。

本明細書で使用される「プロトプラスト」という用語は、その細胞壁が完全にまたは部分的に除去され、その脂質二重層膜がむき出しになっている植物細胞を指し、したがって、その細胞壁が完全に除去されたプロトプラスト、およびその細胞壁が部分的にのみ除去されたスフェロプラストを含むが、これらに限定されない。典型的には、プロトプラストは、細胞培養物または全植物に再生する能力を有する、細胞壁を有さない単離植物細胞である。

具体的に説明しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の共通語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994；およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995に見出すことができる。

実施形態
本明細書で開示されるように、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子の調節配列を用いて導入遺伝子を発現させるための新規な組換え構築物が提供される。これらの構築物を使用して植物細胞を含む細胞を形質転換し、その細胞内で導入遺伝子産物を発現する完全な生物を作製することができる。

調節エレメント
基礎研究または生物工学用途に使用される植物プロモーターは、一般的に一方向性であり、融合したただ１つの遺伝子をその３’末端（下流）に向ける。代謝工学および形質スタッキングのためには、通常、複数の遺伝子を植物に導入することが必要であるので、複数の遺伝子の発現を駆動するために、典型的には、複数の新規なプロモーターがトランスジェニック作物に必要である。

トランスジェニック産物の開発は、ますます複雑になっており、複数の導入遺伝子を単一遺伝子座に積み重ねることが要求されている。伝統的には、各導入遺伝子が通常は発現のための唯一のプロモーターを要し、１つの遺伝子スタック内で異なる導入遺伝子を発現させるために複数のプロモーターが要求される。これは、しばしば単一のポリジーン形質の発現のために類似のレベルの異なる遺伝子の発現パターンを得るために１つの導入遺伝子スタック内で同じプロモーターを繰り返し使用することにつながる。同じプロモーターによって駆動される多重遺伝子構築物は、この分野であまり有効でないトランスジェニック産物をもたらす遺伝子サイレンシングを引き起こすことが知られている。プロモーター反復による過剰な転写因子（ＴＦ）−結合部位のために、転写不活性化につながる内因性ＴＦの欠乏が引き起こされ得る。導入遺伝子のサイレンシングは、導入遺伝子を発現させるために作製されたトランスジェニック植物の性能におそらく望ましくない影響を及ぼす。導入遺伝子中の反復配列は、ポリヌクレオチド再配列をもたらす遺伝子の遺伝子座内相同組換えにつながり得る。

植物中で導入遺伝子を発現させるためにトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子調節エレメントを使用する方法および構築物が提供される。実施形態では、プロモーターが
ＡＣＣＡＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＴＡＡＴＡＣＡＴＣＡＣＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＧＧＴＴＧＣＡＣＣＧＴＡＡＡＧＣＴＴＴＡＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＡＣＧＣＣＴＣＧＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＡＴＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＴＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＴＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＣＴＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＣＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＣＣＴＡＡＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＴＡＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＧＴＣＧＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＴＧＡＧＡＧＴＣＧＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＡＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧＴＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＧＧＣＴＡＡＡＡＣＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＡＧＴＡＧＴＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＡＣＡＴＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＡＧＣＣＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＧＡＧＣＧＣＡＡＧＧＣＴＣＴＴＡＡＣＣＴＴＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＡＣＧＧＧＣＡＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＣＧＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＴＡＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＴＡＧＡＴＴＧＡＣＧＣＧＧＣＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＧＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＣＡＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＣＧＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＴＡＧＧＡＡＣＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＡＴＴＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＴＧＣＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＣＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号１）
のトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターであり得る。
実施形態では、プロモーターが
ＴＴＴＡＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＡＣＧＣＣＴＣＧＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＡＴＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＴＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＴＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＣＴＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＧＴＣＧＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＡＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧＴＡＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＡＣＡＴＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＡＣＧＧＧＣＡＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＣＧＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＴＡＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＴＡＧＡＴＴＧＡＣＧＣＧＧＣＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＧＧＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＣＡＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＣＧＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＴＡＧＧＡＡＣＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＡＴＴＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＴＧＣＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＣＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号２）
のトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターの切断物であり得る。

実施形態では、プロモーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、プロモーターがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子プロモーターである。実施形態では、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、ポリリンカーと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子プロモーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、プロモーターが配列番号１または配列番号２からなる。例示的実施形態では、導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットが提供され、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化のために、プロモーターに加えて、３’−非翻訳遺伝子領域（すなわち、３’ＵＴＲ）またはターミネーターが必要である。適切な転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化が導入遺伝子の安定な発現にとって重要である。多重遺伝子スタックが次の導入遺伝子への転写リードスルーを回避するために、転写終結がより重要となる。同様に、非ポリアデニル化異常ＲＮＡ（ａＲＮＡ）は、小型ＲＮＡ産生および導入遺伝子サイレンシングにつながる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）にａＲＮＡを変換する植物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）にとっての基質となる。そのため、強い転写ターミネーターが、単一遺伝子と複数遺伝子スタックの両方にとって極めて有用である。転写を駆動するためにプロモーターが必要である一方で、３’−ＵＴＲ遺伝子領域が転写を終結し、翻訳およびタンパク質合成のための得られたｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を開始することができる。３’−ＵＴＲ遺伝子領域は、導入遺伝子の安定な発現を助ける。

一実施形態によると、転写ターミネーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、転写ターミネーターがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子転写ターミネーターである。実施形態では、配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である転写ターミネーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、ポリリンカーと作動可能に連結している転写ターミネーターを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している転写ターミネーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、転写ターミネーターが配列番号３または配列番号４からなる。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結している転写ターミネーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、ポリリンカー配列、導入遺伝子、または両方の組み合わせのいずれかと作動可能に連結している転写ターミネーターを含む核酸ベクターが提供される。一実施形態では、転写ターミネーターが長さ１ｋｂ未満である。

実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと３’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、核酸構築物が３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、３’−ＵＴＲがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲである。
実施形態では、３’−ＵＴＲが
ＴＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＧＴＴＴＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＣＧＧＴＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＡＧＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＡＧＣＡＴＧＡＣＡＣＧＡＡＧＣＡＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＣＧＡＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＣＧＴＧＴＣＧＧＧＣＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＣＴＴＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＣＣＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣＣＧＣＡＡＴＴＣＣＧＣＡＴＡＡＡＴＣＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＡＣＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＴＣＧＡＴＣＡＧＧＣＴＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＣＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＣＴＡＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＧＴＡＴＣＴＣＣＧＴＴＣＡＣＣＡＧＴＧＴＧＴＡＡＧＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＡＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡＡＴＴＴＧＡＧＣＴＡＡＴＧＡＣＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＣＴＡＡＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣ（配列番号３）
のトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲであり得る。
実施形態では、３’−ＵＴＲが
ＴＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＧＴＴＴＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＣＧＧＴＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＡＧＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧ（配列番号４）
のトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲの切断物であり得る。

実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、３’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、３’−ＵＴＲがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子３’−ＵＴＲであり得る。実施形態では、３’−ＵＴＲは配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、３’−ＵＴＲとを含む核酸構築物であって、プロモーターおよび３’−ＵＴＲが共にポリリンカーの逆末端と作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、３’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットであって、プロモーターおよび３’−ＵＴＲが共に導入遺伝子の逆末端と作動可能に連結している、遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、３’−ＵＴＲが配列番号３または配列番号４からなる。一実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、３’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットが提供される。一実施形態では、プロモーターが配列番号１または配列番号２からなり、３’−ＵＴＲが配列番号３または配列番号４からなる。

例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子３’−ＵＴＲを含む。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結している３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。さらなる実施形態では、導入遺伝子が、同じトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子からのプロモーターおよび３’−ＵＴＲと作動可能に連結している。

実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、５’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、イントロンがプロモーターと作動可能に連結している。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様タンパク質をコードするトウモロコシ遺伝子から単離されたプロモーターまたはこのようなプロモーター配列の派生体と作動可能に連結しているイントロンを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、５’−ＵＴＲが
ＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＣＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号５）
のトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子５’−ＵＴＲであり得る。

実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である５’−ＵＴＲとを含む核酸構築物が提供される。実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、５’−ＵＴＲ配列と、ポリリンカーとを含む核酸構築物であって、プロモーターおよび５’−ＵＴＲがポリリンカーと作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。実施形態では、本明細書に記載されるプロモーターと、５’−ＵＴＲ配列と、導入遺伝子とを含む遺伝子発現カセットであって、プロモーターおよび５’−ＵＴＲが導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結している、遺伝子発現カセットが提供される。場合により、構築物が導入遺伝子の３’末端またはポリリンカーと作動可能に連結している３’−ＵＴＲをさらに含む。一実施形態では、プロモーターおよび３’−ＵＴＲ配列が本明細書に記載されるものから選択され、５’−ＵＴＲ配列が配列番号５からなる。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様タンパク質をコードするトウモロコシ遺伝子からの５’−ＵＴＲを含み、プロモーターがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子プロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ ｍａｓ）に由来するプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様タンパク質をコードするトウモロコシ遺伝子からの５’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

一実施形態では、プロモーターと、ポリリンカーと、場合により、以下のエレメント：
ａ）５’非翻訳領域；および
ｂ）３’非翻訳領域
の１つまたは複数とを含む核酸構築物であって、
プロモーターが配列番号１もしくは配列番号２、または配列番号１もしくは配列番号２と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
５’非翻訳領域が配列番号５または配列番号５と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
３’非翻訳領域が配列番号３もしくは配列番号４または配列番号３もしくは配列番号４と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
さらに前記プロモーターが前記ポリリンカーと作動可能に連結しており、存在する場合、各任意のエレメントもプロモーターとポリリンカーの両方と作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。

一実施形態では、プロモーターと、導入遺伝子と、場合により、以下のエレメント：
ａ）５’非翻訳領域；および
ｂ）３’非翻訳領域
の１つまたは複数とを含む核酸構築物であって、
プロモーターが配列番号１もしくは配列番号２または配列番号１もしくは配列番号２と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
５’非翻訳領域が配列番号５または配列番号５と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
３’非翻訳領域が配列番号３もしくは配列番号４または配列番号３もしくは配列番号４と９８％の配列同一性を有する配列からなり；
さらに前記プロモーターが前記導入遺伝子と作動可能に連結しており、存在する場合、各任意のエレメントもプロモーターと導入遺伝子の両方と作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。さらなる実施形態では、真上に開示される核酸構築物を含むトランスジェニック細胞が提供される。一実施形態では、トランスジェニック細胞が植物細胞であり、さらなる実施形態では、前記トランスジェニック細胞を含む植物が提供される。

実施形態では、遺伝子発現カセットがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲとを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットがａ）配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーターと；ｂ）配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である５’−ＵＴＲと；ｃ）配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲとを含む。

例えば、遺伝子発現カセットがプロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲのいずれも含んでもよく、プロモーターが配列番号１のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号３のポリヌクレオチドである。同様に、遺伝子発現カセットがプロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、プロモーターが配列番号２のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号４のポリヌクレオチドである。さらに、遺伝子発現カセットがプロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、プロモーターが配列番号２のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号３のポリヌクレオチドである。さらに、遺伝子発現カセットがプロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、プロモーターが配列番号１のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲが配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲが配列番号４のポリヌクレオチドである。

実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子または異種コード配列と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲおよびトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む。遺伝子発現カセットが１つまたは複数の導入遺伝子を含む場合、プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子と作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲおよびトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率、栄養価またはこれらの組み合わせを増強する遺伝子産物をコードする。

トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲおよびトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なるプロモーターと作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、プロモーターが植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）または細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ ｍａｓ）に由来する。さらなる実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、ベクターが本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルス、またはドナーＤＮＡなどの形質転換もしくは遺伝子標的化に使用するための切除ポリヌクレオチドフラグメントであり得る。

一実施形態によると、組換え遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、組換え遺伝子カセットがポリリンカー配列、導入遺伝子またはこれらの組み合わせと作動可能に連結しているプロモーターを含む、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、組換え遺伝子カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む。一実施形態では、組換え遺伝子カセットがポリリンカー配列と作動可能に連結している本明細書に開示されるプロモーターを含む。コード配列をポリリンカーの制限部位の１つに挿入することによって、コード配列を作動可能に連結して、ベクターを宿主細胞にトランスフェクトした場合にコード配列の発現を可能にするように、ポリリンカーがプロモーターと作動可能に連結している。

一実施形態によると、プロモーターが配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、プロモーター配列が１．５、２、２．５、３または４ｋｂ以下の全長を有する。一実施形態によると、プロモーターが配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する２０６１ｂｐ配列からなる。
一実施形態によると、プロモーターが配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、プロモーター配列が１．５、２、２．５、３または４ｋｂ以下の全長を有する。一実施形態によると、プロモーターが配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１４９８ｂｐ配列からなる。

一実施形態によると、配列番号１と、導入遺伝子と、３’−ＵＴＲとからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、配列番号１が導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、３’−ＵＴＲが導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５、９９もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する２０６１ｂｐ配列と、導入遺伝子と、３’−ＵＴＲとからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、配列番号１が導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、３’−ＵＴＲが導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５、９９もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０８０ｂｐ配列からなる。

一実施形態によると、配列番号２と、導入遺伝子と、３’−ＵＴＲとからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、配列番号２が導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、３’−ＵＴＲが導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０、９５、９９もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１４９８ｂｐ配列と、導入遺伝子と、３’−ＵＴＲとからなる遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、配列番号２が導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、３’−ＵＴＲが導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０、９５、９９もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する３７６ｂｐ配列からなる。

一実施形態によると、核酸ベクターが、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。一実施形態によると、組換え遺伝子カセットがアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界と作動可能に連結している。一実施形態によると、組換え遺伝子カセットが第１および第２のＴ−ＤＮＡ境界をさらに含み、第１のＴ−ＤＮＡ境界が遺伝子構築物の一端と作動可能に連結しており、前記第２のＴ−ＤＮＡ境界が遺伝子構築物の他端と作動可能に連結している。第１および第２のアグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界は、ノパリン合成アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界、オクトピン合成アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界、スクシナモピン合成アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ境界またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細菌株に由来するＴ−ＤＮＡ境界配列から独立に選択され得る。一実施形態では、ノパリン合成株、マンノピン合成株、スクシナモピン合成株またはオクトピン合成株からなる群から選択されるアグロバクテリウム（Agrobacterium）株であって、配列番号１、配列番号２、または配列番号１もしくは配列番号２と９０、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列から選択される配列と作動可能に連結している導入遺伝子を含むプラスミドを含む株が提供される。

対象となるおよび本開示の構築物に使用するのに適した導入遺伝子には、それだけに限らないが、（１）耐有害生物性または耐病性、（２）除草剤耐性、ならびに（３）その開示が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３１１６７００（ＤＧＴ−２８）、ＵＳ２０１１０１０７４５５（ＤＳＭ−２）、米国特許第８２８３５２２号（ＡＡＤ−１２）；第７８３８７３３号（ＡＡＤ−１）；第５１８８９６０号；第５６９１３０８号；第６０９６７０８号；および第６５７３２４０号（Ｃｒｙ１Ｆ）；米国特許第６１１４１３８号；第５７１００２０号；および第６２５１６５６号（Ｃｒｙ１Ａｃ）；米国特許第６１２７１８０号；第６６２４１４５号および第６３４０５９３号（Ｃｒｙ３４Ａｂ１）；米国特許第６０８３４９９号；第６５４８２９１号および第６３４０５９３号（Ｃｒｙ３５Ａｂ１）に開示されている価値付加形質を付与するコード配列が含まれる。一実施形態によると、導入遺伝子が殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率または栄養価を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコードする。

一実施形態によると、遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、遺伝子カセットが導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しているプロモーター領域を含み、導入遺伝子の３’末端が３’非翻訳領域と連結している、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、プロモーター領域が配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号１または配列番号２からなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み、一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０８０ｂｐ配列からなる。別の実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み、一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号６４と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する３７６ｂｐ配列からなる。

一実施形態によると、遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、遺伝子カセットが５’非翻訳配列の５’末端と作動可能に連結しているプロモーター領域を含み、５’非翻訳配列の３’末端が導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しており、導入遺伝子の３’末端が３’非翻訳領域と連結している、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する２０６１ｂｐ配列からなる。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１４９８ｂｐ配列からなる。一実施形態によると、５’非翻訳配列が配列番号５または配列番号５と９０％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態によると、５’非翻訳配列が配列番号５または配列番号５と９０％の配列同一性を有する８４ｂｐ配列からなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０８０ｂｐ配列からなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４、または配列番号４と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する３７６ｂｐ配列からなる。

一実施形態によると、遺伝子カセットを含む核酸ベクターであって、遺伝子カセットが導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結しているプロモーター領域を含み、導入遺伝子の３’末端が３’非翻訳領域と連結している、核酸ベクターが提供される。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号１または配列番号１と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する２０６１ｂｐ配列からなる。一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号１からなる。一実施形態では、プロモーター領域が配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号２または配列番号２と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１４９８ｂｐ配列からなる。一実施形態によると、プロモーター領域が配列番号２からなる。一実施形態によると、３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する１０８０ｂｐ配列からなり、一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号３からなる。一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する３７６ｂｐ配列からなり、一実施形態では、３’非翻訳配列が配列番号４からなる。

実施形態では、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物が提供される。実施形態では、細胞または植物が本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。それによって、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物がそれぞれ、トランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物となる。実施形態では、トランスジェニック植物が単子葉植物であり得る。実施形態では、トランスジェニック単子葉植物が、それだけに限らないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビおよびキビであり得る。実施形態では、トランスジェニック植物が双子葉植物であり得る。実施形態では、トランスジェニック双子葉植物が、それだけに限らないが、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナであり得る。実施形態には、本明細書に開示されるトランスジェニック植物のトランスジェニック種子も含まれる。

実施形態では、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む。２つ以上の導入遺伝子は、本明細書に開示される同じプロモーター、５’−ＵＴＲまたは３’−ＵＴＲと作動可能に連結していなくてもよい。実施形態では、遺伝子発現カセットが１つまたは複数の導入遺伝子を含む。１つまたは複数の導入遺伝子の実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子が本開示のプロモーター、５’−ＵＴＲまたは３’−ＵＴＲと作動可能に連結している。

選択マーカー
レポーター遺伝子としても記載されている種々の選択マーカーを、選択された発現ベクターに組み込んで形質転換した植物（「形質転換体」）の同定および選択を可能にすることができる。例えば、ＤＮＡ配列決定およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロット法、ＲＮＡブロット法、ベクターから発現したタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン耐性を媒介する沈殿タンパク質を検出するための免疫学的方法、またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察を含む多くの方法が、形質転換した植物中の選択マーカーの発現を確認するために利用可能である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N. Y., 2001参照）。

選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択に利用される。選択マーカー遺伝子には、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、ならびに除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。除草剤耐性遺伝子は、一般的に除草剤に非感受性の修飾標的タンパク質または除草剤が作用し得る前に植物中の除草剤を分解もしくは解毒する酵素をコードする。例えば、グリホサート耐性は、変異標的酵素、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を用いることによって得られた。ＥＰＳＰＳについての遺伝子および変異体は周知であり、以下にさらに記載される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニルおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性は、それぞれの除草剤を解毒するｐａｔもしくはＤＳＭ−２をコードする細菌遺伝子、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を用いることによって得られた。

実施形態では、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む除草剤が成長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤のためのアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の耐性／許容性の遺伝子は周知である。グリホサート耐性遺伝子には、変異５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）（ＥＰＳＰ）およびｄｇｔ−２８遺伝子（組換え核酸の導入および／または天然ＥＰＳＰ遺伝子のインビボ突然変異誘発の種々の形態を介して）、ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子がそれぞれ含まれる。他のホスホノ化合物の耐性遺伝子には、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス属（Streptomyces）の種のｂａｒ遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）が含まれる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ、Ｄｉｃｌｏｆｏｐ、Ｆｅｎｏｘｙｐｒｏｐ、Ｆｌｕａｚｉｆｏｐ、Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐを含む）に対する耐性を付与する例示的な遺伝子には、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）−−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３の遺伝子が含まれる。実施形態では、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む除草剤が光合成を阻害することができる。

実施形態では、選択マーカー遺伝子には、それだけに限らないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；シアナミドヒドラターゼ；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ；トリプロファンデカルボキシラーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作アスパラギン酸キナーゼ；ｂａｒ遺伝子；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ；アセトヒドロキシ酸シンターゼ；５−エノールピルビル−シキメート−ホスフェートシンターゼ（ａｒｏＡ）；ハロアリールニトリラーゼ；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ）；および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）をコードする遺伝子が含まれる。

実施形態には、クロラムフェニコール；メトトレキサート；ハイグロマイシン；スペクチノマイシン；ブロモキシニル；グリホサート；およびホスフィノトリシンに対する耐性をコードする遺伝子も含まれる。

選択マーカー遺伝子の上記リストは限定的であることを意図していない。いずれのレポーターまたは選択マーカー遺伝子も本発明に包含される。

選択マーカー遺伝子は、植物中での最適発現のために合成される。例えば、実施形態では、遺伝子のコード配列が、植物中での発現を増強するためのコドン最適化によって修飾されている。選択マーカー遺伝子を、特定の植物種中での発現のために最適化することができる、あるいは双子葉または単子葉植物中での最適発現のために修飾することができる。植物に好ましいコドンは、対象となる特定の植物種中で、最大量で発現しているタンパク質中の最高頻度のコドンから決定することができる。実施形態では、選択マーカー遺伝子を、植物中最高レベルで発現してより高い形質転換効率をもたらすよう設計する。植物遺伝子最適化の方法は周知である。合成ポリヌクレオチド配列の最適化および製造に関する手引きは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０１６５４６、ＷＯ２０１１１４６５２４、ＷＯ１９９７０１３４０２、米国特許第６１６６３０２号および米国特許第５３８０８３１号に見出すことができる。

形質転換
適当な植物の形質転換方法には、ＤＮＡを細胞に導入することができる任意の方法、例えば、限定されないが、電気穿孔（例えば、米国特許第５３８４２５３号参照）；微粒子銃（例えば、米国特許第５０１５５８０号；第５５５０３１８号；第５５３８８８０号；第６１６０２０８号；第６３９９８６１号および第６４０３８６５号参照）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５６３５０５５号；第５８２４８７７号；第５５９１６１６号；第５９８１８４０号および第６３８４３０１号参照）；およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５５０８１８４号参照）が含まれる。これらの方法を使用して植物を安定に形質転換または一過的に形質転換することができる。

ＤＮＡ構築物を、炭化ケイ素繊維による攪拌などの技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができる（例えば、米国特許第５３０２５２３号および第５４６４７６５号参照）、またはＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子銃などの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することができる（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物を、ナノ粒子形質転換を介して植物に導入することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／０１０４７００号参照）。

さらに、根粒菌属（Rhizobium）の種ＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム属（Agrobacterium）細菌またはウイルスを用いて遺伝子導入を達成することができる。例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11 (1): 1-4を参照されたい。

形質転換技術の適用を通して、事実上いかなる植物種の細胞も安定に形質転換することができ、これらの細胞を周知の技術によってトランスジェニック植物に発達させることができる。例えば、ワタ形質転換の文脈で特に有用となり得る技術は、米国特許第５８４６７９７号；第５１５９１３５号；第５００４８６３号および第６６２４３４４号に記載されており；アブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技術は特に、例えば、米国特許第５７５０８７１号に記載されており；ダイズを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第６３８４３０１号に記載されており；トウモロコシを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第７０６０８７６号および第５５９１６１６号ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６７２２に記載されている。

外因性核酸のレシピエント細胞への送達を行った後、一般的には形質転換細胞をさらなる培養および植物再生のために同定する。形質転換を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するために使用した形質転換ベクターと共に選択マーカー遺伝子を使用することが望ましいだろう。例示的実施形態では、形質転換細胞集団を選択剤（複数可）に曝露することによってアッセイすることができる、または細胞を所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。

選択剤への曝露に生き延びた細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性とスコア化された細胞を、植物の再生を支持する培地で培養することができる。実施形態では、成長調節剤などのさらなる物質を含めることによって任意の適当な植物組織培養培地を修飾することができる。組織を、植物再生の努力を開始するために十分な組織が利用可能となるまで成長調節剤を含めた基礎培地で維持し、または組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）の繰り返しの手動選択後、シュート形成を招く培地に移すことができる。十分なシュート形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。いったんシュートが形成したら、これらを、根形成を招く培地に移す。いったん十分な根が形成したら、植物をさらなる成長および成熟のために土壌に移すことができる。

再生植物中に提供される構築物を含む所望の核酸の存在を確認するために、種々のアッセイを行うことができる。このようなアッセイには、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロット法ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法および／またはＬＣ−ＭＳ ＭＳ分光光度法）または酵素機能によって、タンパク質産物の存在を検出する；植物部分アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；ならびに／あるいは全再生植物の表現型の分析が含まれ得る。

トランスジェニックイベントを、例えば、対象となる核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型判定は、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれる対象となる核酸分子を含むことが予想される単離宿主細胞カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続いて標準的なクローニングおよびＰＣＲ増幅産物の配列解析を含むと理解される。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は十分に記載されており（例えば、Rios et al. (2002) Plant J. 32: 243-53参照）、細胞培養物を含む、任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用することができる。標的配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを順次使用する、またはＰＣＲ増幅反応で多重化することができる。標的部位、導入された核酸配列および／または２つの組み合わせにアニーリングするよう設計したオリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略は、例えば、限定されないが、植物ゲノム中の特異的配列の増幅；植物ゲノム中の複数の特異的配列の増幅；植物ゲノム中の非特異的配列の増幅；および前記のいずれかの組み合わせを含み得る。当業者であれば、ゲノムを調べるためのプライマーおよび増幅反応のさらなる組み合わせを考案することができるだろう。例えば、順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列（複数可能）にアニーリングするように設計することができる。

順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを、導入された核酸分子に、例えば、そこに含まれる対象となるヌクレオチド配列中のコード領域に相当する配列で、または核酸分子の他の部分に特異的にアニーリングするよう設計することができる。プライマーを本明細書に記載されるプライマーと合わせて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、所望の配列にしたがって合成することができ、商業的に入手可能である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ製）。増幅に、クローニングもしくは配列決定、または増幅産物の直接配列解析が続くことができる。実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅に使用する。

導入遺伝子を発現させる方法
実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、および／またはトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲおよび／またはトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む植物を成長させるステップを含む。

実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲとを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。

実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。一実施形態では、プロモーターが、配列番号１および配列番号２から選択される配列、または配列番号１および配列番号２から選択される配列と９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有する配列からなる。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結している３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。

実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲと、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲとを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結している３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子プロモーターを含む。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターが配列番号１または配列番号２であり得る。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、プロモーターが配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲが配列番号５のポリヌクレオチドであり得る。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、５’−ＵＴＲが配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、遺伝子発現カセットが、プロモーターと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含み、プロモーターがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ ｍａｓ）に由来するプロモーターである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

トランスジェニック植物
実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲが配列番号３または配列番号４のポリヌクレオチドである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、３’−ＵＴＲが配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。

実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含み、プロモーターがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ ｍａｓ）に由来するプロモーターである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲ、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子と作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲを含み、プロモーターがトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａ ｍａｓ）に由来するプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現が植物の根に特異的である。実施形態では、導入遺伝子発現が、根で発現する２つ以上の導入遺伝子を含む。実施形態では、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法が、根特異的導入遺伝子発現を含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で導入遺伝子を発現させる方法が、根特異的組織および根特異的細胞を含む。実施形態では、根特異的発現がトウモロコシ根特異的発現を含む。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、本明細書に開示されるトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲおよび／またはトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含むベクターを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、導入遺伝子と作動可能に連結している本明細書に開示されるトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様５’−ＵＴＲおよび／またはトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを含むベクターを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。

一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している非内因性プロモーター配列を含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーター配列が配列番号１もしくは配列番号２の配列、または配列番号１もしくは配列番号２と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列を含む植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が双子葉もしくは単子葉植物、または双子葉もしくは単子葉植物に由来する細胞もしくは組織である。一実施形態では、植物がトウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される。一実施形態では、植物がトウモロコシ（Zea mays）である。一実施形態によると、植物、植物組織または植物細胞が、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１もしくは配列番号２または配列番号１もしくは配列番号２と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含み、プロモーターが配列番号１もしくは配列番号２または配列番号１もしくは配列番号２と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列からなる。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している非内因性プロモーター配列を含む遺伝子構築物が植物、植物組織または植物細胞のゲノムに組み込まれる。

一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１もしくは配列番号２、またはと配列番号１もしくは配列番号２と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む非トウモロコシ属（Zea）植物(つまり、トウモロコシ科のメンバーではない)、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、非トウモロコシ属（Zea）植物、植物組織または植物細胞が双子葉もしくは単子葉植物、または双子葉もしくは単子葉植物に由来する植物細胞もしくは組織である。一実施形態では、植物がムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーター配列が植物、植物組織または植物細胞のゲノムに組み込まれる。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、配列番号５または配列番号５と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、５’非翻訳配列が前記プロモーターと前記導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している。

一実施形態では、導入遺伝子の５’末端と作動可能に連結している配列番号１もしくは配列番号２、または配列番号１もしくは配列番号２と９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有する配列と、配列番号３もしくは配列番号４または配列番号３もしくは配列番号４と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列とを含む非トウモロコシ属（Zea）植物、植物組織または植物細胞であって、３’非翻訳配列が前記導入遺伝子と作動可能に連結している植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、非トウモロコシ属（Zea）植物、植物組織または植物細胞が双子葉もしくは単子葉植物である、または双子葉もしくは単子葉植物に由来する植物組織もしくは細胞である。一実施形態では、植物がコムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーター配列が植物、植物組織または植物細胞のゲノムに組み込まれる。一実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、配列番号５または配列番号５と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、５’非翻訳配列が前記プロモーターと前記導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している。一実施形態では、５’非翻訳配列が配列番号５からなる。

一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号３９または配列番号１もしくは配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む非トウモロコシ属（Zea）植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む非トウモロコシ属（Zea）植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号１もしくは配列番号２または配列番号１もしくは配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列からなる植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、３’非翻訳配列が、配列番号３もしくは配列番号４または配列番号３もしくは配列番号４と９０％の配列同一性を有する配列を含むまたはからなり、３’非翻訳配列が導入遺伝子の３’末端と作動可能に連結している。

実施形態では、本明細書に開示される方法による植物、植物組織または植物細胞が単子葉植物であり得る。単子葉植物、植物組織または植物細胞は、それだけに限らないが、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、エンバク、タマネギ、キビおよびライコムギであり得る。

実施形態では、本明細書に開示される方法による植物、植物組織または植物細胞が双子葉植物であり得る。双子葉植物、植物組織または植物細胞は、それだけに限らないが、ナタネ、セイヨウアブラナ、カラシナ、エチオピアマスタード（ethiopian mustard）、ダイズ、ヒマワリおよびワタであり得る。

遺伝子組換え植物の作製に関しては、植物の遺伝子工学の方法が当技術分野で周知である。例えば、双子葉植物ならびに単子葉植物のための生物学的および物理学的形質転換プロトコルを含む多数の植物形質転換方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17: 282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993) 参照）。さらに、植物細胞もしくは組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993) で入手可能である。

当業者であれば、外因性配列がトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、作動可能であることが確認された後、これを有性交雑によって他の植物に導入することができることを認識するだろう。交雑する種に応じて、いくつかの標準的な育種技術のいずれかを使用することができる。

形質転換した植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について操作した植物材料を選択またはスクリーニングすることによって同定および単離することができる。例えば、操作した植物材料を、形質転換遺伝子構築物が耐性を付与する阻害量の抗生物質または除草剤を含む培地で成長させることによって、選択を行うことができる。さらに、組換え核酸構築物上に存在し得る任意の目に見えるマーカー遺伝子（例えば、ｙｆｐ、ｇｆｐ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたはＢもしくはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって、形質転換細胞を同定することもできる。このような選択およびスクリーニング方法論は当業者に周知である。

物理的および生化学的方法を使用して挿入された遺伝子構築物を含む植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。これらの方法には、それだけに限らないが、１）組換えＤＮＡインサートの構造を検出および決定するためのサザン解析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出および調査するためのノーザンブロット法、Ｓ１ ＲＮアーゼ保護、プライマー伸長または逆転写酵素ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性（このような遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされている）を検出するための酵素的アッセイ；４）次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析；５）遺伝子構築物産物がタンパク質である、タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット技術、免疫沈降法または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などのさらなる技術を使用して、特定の植物器官および組織中の組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これら全てのアッセイを行う方法は当業者に周知である。

本明細書に開示される方法を用いた遺伝子操作の効果は、例えば、対象となる組織から単離したＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロット法によって観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するまたはｍＲＮＡの量が増加した場合、対応する導入遺伝子が発現していると仮定することができる。遺伝子および／またはコードされるポリペプチド活性を測定する他の方法を使用することができる。使用する基質、および反応産物もしくは副産物の増加もしくは減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素的アッセイを使用することができる。さらに、発現しているポリペプチドのレベルを、免疫化学的に、すなわち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび当業者に周知の他の抗体ベースのアッセイ、例えば、電気泳動検出アッセイ（染色またはウエスタンブロット法のいずれかを用いる）によって測定することができる。１つの非限定的な例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いたＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＷＯ２００５／１０７４３７参照）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）タンパク質の検出が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／００９３３６６号に記載されている。導入遺伝子は植物のいくつかの細胞型もしくは組織中でまたはいくつかの発育段階で選択的に発現され得る、または導入遺伝子は実質的にその全ての生活環に沿って実質的に全ての植物組織中で発現され得る。しかしながら、いずれの組み合わせ発現様式も適用可能である。

本開示は、上記トランスジェニック植物の種子であって、導入遺伝子または遺伝子発現カセットを含む種子も包含する。本開示は、上記トランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞であって、導入遺伝子または遺伝子構築物を含む子孫、クローン、細胞株または細胞をさらに包含する。

本発明を具体的な方法および実施形態を参照して記載してきたが、本発明から逸脱することなく種々の修正および変更を行うことができることが認識されるだろう。

高発現調節エレメントの同定
新規なトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様調節エレメントを、２つの手法を介して同定した：１）公開遺伝子発現データをプロファイリングすることによるバイオインフォマティクス手法、および２）次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いた転写プロファイリング手法。次いで、これらの調節エレメントを同定、単離およびクローニングして、トランスジェニック植物に使用するための調節エレメントの発現プロファイルを特徴付けた。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）から単離したｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子およびａａｄ−１選択マーカー遺伝子で安定に形質転換したトランスジェニックトウモロコシ系統を作製し、導入遺伝子発現レベルおよび組織特異性を評価した。こうして、新規なトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様調節エレメントを同定し、特徴付けた。遺伝子発現構築物に使用するためのプロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ調節エレメントを初めて開示する。

バイオインフォマティクス手法
３つのデータ源を利用してトウモロコシ実生の根およびシュート組織における高発現トウモロコシ遺伝子を同定した：１）２０１０年のトウモロコシデータベース（www.maizegdb.orgで入手可能）に存在する３５０００個のトウモロコシ遺伝子配列およびそのアノテーション；２）Ｖ４シュートおよび根についての全トウモロコシトランスクリプトームについての遺伝子発現データ（Wang, et al., (2009): Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell 21:1053-1069）；および３）９０００個の遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列（Alexandrov N., et al., (2009): Insights into corn genes derived from large-scale cDNA sequencing. Plant Molecular Biology 69:179-194）。遺伝子発現データを、９０００個の完全長ｃＤＮＡ配列および３５０００個のトウモロコシ遺伝子に整列した。マッピングされたフラグメント１００万個当たりエキソン１キロベース当たりのフラグメント数（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）（ＦＰＫＭ）の値、遺伝子発現の定量的測定値に基づいて、１００個の高発現遺伝子を、トウモロコシの根およびシュートの遺伝子発現データセット（図１）の各々から同定した。次に、これらの配列を、５００個の発現遺伝子またはトウモロコシゲノムの最高発現遺伝子の約１．４％に整列した、３５０００個のトウモロコシ遺伝子にマッピングした。このデータセットから、葉および根組織発現について１００個の発現遺伝子を同定した。遺伝子の数をさらに減らすために、それぞれ遺伝子特異的プライマーを用いて、３つの葉および根発達段階から単離したｃＤＮＡ試料に定量的ＰＣＲを行った。

転写プロファイリング手法
遺伝子発現カセットに使用するために望ましい発現プロファイルを有する天然トウモロコシ遺伝子の調節エレメントを同定および選択するために、転写プロファイリング用に植物成長および発達の異なる段階に成長させた植物からトウモロコシ組織を得た。例えば、３つの発達段階の葉（Ｖ４（２連）、Ｖ１２およびＲ３）および根（Ｖ４およびＶ１２結節および繊維組織）、花粉、ひげ、穂軸、未成熟仁（受粉２０日後）、殻および茎（Ｖ４およびＲ１）からの組織試料を回収した。全ｍＲＮＡを上記組織の全てから単離し、所望の量の高品質ｍＲＮＡを得た。

次に、ｍＲＮＡの試料各々からｃＤＮＡライブラリーを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてハイスループットシーケンシングを完了した。さらに、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＲＮＡ試料調製キットをＲＮＡｓｅｑ試料調製のための製造業者の推奨プロトコルにしたがって使用した。要するに、全ＲＮＡ ５μｇを、ポリＴオリゴ結合磁気ビーズを用いて精製し、引き続いて高温下で二価カチオンを用いて小さな断片（約２００ｂｐ平均長）に断片化した。次に、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素およびランダムプライマーを用いて断片化ｍＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡにコピーした。ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮアーゼＨを用いて、ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ ｃＤＮＡ）にさらに変換した。次いで、二本鎖ｃＤＮＡフラグメントに末端修復、Ａテール化、次いでインデックスＩｌｌｕｍｉｎａペア末端（ＰＥ）アダプターとのライゲーションを行った。最後に、ライブラリー産物を浄化し、１５サイクルのＰＣＲで濃縮し、精製した。濃縮ライブラリーを２ｎＭの濃度に正規化し、水酸化ナトリウムで変性し、ＨｉＳｅｑ（登録商標）フローセルの単一レーンにロードするためにハイブリダイゼーションバッファ中１２ｐＭに希釈した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ製造業者推奨シーケンシングプロトコルにしたがって、クラスター生成、プライマーハイブリダイゼーションおよびシーケンシング反応を行った。

次いで、シーケンシングリードをフィルタ処理して低品質のリードを除去した。フィルタ処理後、シーケンシングリードの約９９．９％が残った。シーケンシングリードを、ｍａｉｚｅＧＤＢで入手可能なアノテーション付きトウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ７３ゲノムに整列した。２つ以上の遺伝子座でトウモロコシゲノム上にマッピングされたシーケンシングリードを捨てて、高発現遺伝子の同定およびそのさらなる特徴付けにおける混乱を回避した。このステップにより、試料の各々からの７０％超のシーケンシングリードのトウモロコシゲノムとのアラインメントが得られた。フラグメント／エキソン１キロベース／マッピングされた１００万個のフラグメントまたはＦＲＫＭ値の定量的遺伝子発現単位を用いて、遺伝子発現構築物に使用するのに望ましい発現パターンに一致する安定な形質転換試験のための遺伝子を順位付けした。トウモロコシ中の最も高度に発現している遺伝子の約０．１％を表す約１５〜２０個の高発現遺伝子を、安定なトランスジェニック系統で試験のために優先した（図２）。

ベクター構築
プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ配列を、以前に記載されたバイオインフォマティクスおよび転写プロファイリング手法から同定されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子配列から抽出した。トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ７３ゲノムからのトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様遺伝子の天然配列を配列番号６として提供する。２０６１ｂｐプロモーター配列（配列番号１）をイタリック体にし；コード配列に隣接するＡＴＧ翻訳開始コドンおよびＴＧＡ翻訳終止コドンを太字で示す。８１ｂｐ ５’−ＵＴＲ配列（配列番号５）を大文字で示す。１０８０ｂｐ ３’−ＵＴＲ配列（配列番号３）に下線を施す。
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ＤＮＡエレメントを合成し、エントリーベクターにクローニングした。プロモーターおよび３’−ＵＴＲの長さはそれぞれ２０６１ｂｐおよび１０８０ｂｐであった。トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター、ｃｒｙ３４Ａｂ１（バチルス・チューリンゲンシス（B. thurengiensis）のレポーター遺伝子）およびトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを、その隣接するＤＮＡエレメントと最小１５ｂｐの重複相同性を含むプライマーを用いて増幅した。全てのフラグメントをゲル精製した。全３つのフラグメントを、エントリーベクター骨格、ｐＥＮＴＲ１１と一緒に、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を通して方向付けられた順序で組み立てた。次いで、得られたエントリープラスミド、ｐＤＡＢ１１３０１０およびデスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０４１５３を用いて、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応を行うと、最終的な発現ベクター、ｐＤＡＢ１１３０２９が得られた。デスティネーションベクターは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）によって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲ（米国特許第７１７９９０２号）によって終結するａａｄ−１遺伝子で構成された選択マーカーカセットを含んでいた。得られた構築物、ｐＤＡＢ１１３０２９は、ａａｄ−１遺伝子発現カセットおよびｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子発現構築物を含む異種発現構築物である（図３）。

ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子の代わりに、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ；Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50）レポーター遺伝子（図４）およびｐＤＡＢ１１３０２９中に存在するのと同じａａｄ−１発現カセットを含む陰性対照構築物、ｐＤＡＢ１０１５５６を組み立てた。ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子の発現を制御するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーターおよびジャガイモ（Solanum tuberosum）プロテアーゼ阻害剤遺伝子ＩＩ ３’−ＵＴＲ（ＳｔＰｉｎＩＩ ３’−ＵＴＲ ｖ２；An et al., (1989) Plant Cell 1; 115-22）で構成された陽性対照構築物、ｐＤＡＢ１０８７４６を構築した（図５）。ａａｄ−１カセットはｐＤＡＢ１１３０２９中に存在するものと同じであった。

反復ＤＮＡ配列を除去するためのトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターの切断
www.maizegdb.orgで入手可能なトウモロコシ転位因子データベース（例えば、RLX_ruda_AC206281_9164 repeats and Zm_CACTA_20反復）に記載されている型／クラスＩＩトランスポゾン、クラスＩ転位因子、クラスＩＩ転位因子およびクラスＩＩＩ転位因子を除去することによって、ｐＤＡＢ１１３０２９（配列番号１）の２０６１ｂｐトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター配列を１４９８ｂｐトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター配列（配列番号２）に切断した。切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターと完全長メタロチオネイン様プロモーターを比較するアラインメントを図６に提供する。切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーターを、ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーターおよび完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲの上流にクローニングした。得られた遺伝子発現カセットを、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、エントリーベクターｐＥＮＴＲ１１に組み立てた。得られたエントリープラスミド、ｐＤＡＢ１１２８１４およびデスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０４１５３をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応により組み合わせて、最終的な発現ベクター、ｐＤＡＢ１１２８１６にした。デスティネーションベクターｐＤＡＢ１１２８１６は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーターによって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲによって終結するａａｄ−１遺伝子を含む選択マーカーカセットを含んでいた（図７）。

反復ＤＮＡ配列を除去するためのトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲの切断
www.maizegdb.orgで入手可能なトウモロコシ転位因子データベースに記載されているクラスＩレトロエレメントおよび型／クラスＩＩトランスポゾンの反復を除去することによって、ｐＤＡＢ１１３０２９の１０８０ｂｐトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲ配列（配列番号３）を３７６ｂｐトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲ配列（配列番号４）に切断した。切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲと完全長トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを比較するアラインメントを図８に提供する。次いで、得られた切断されたトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様３’−ＵＴＲを、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様プロモーター（配列番号２）、ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子と一緒にエントリー骨格、ｐＥＮＴＲ１１に構築した。得られた構築物、ｐＤＡＢ１１２８１７およびデスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０４１５３をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応により組み合わせて、最終的な発現ベクター、ｐＤＡＢ１１２８２０にした。デスティネーションベクターｐＤＡＢ１１２８２０は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーターによって制御され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲによって終結するａａｄ−１遺伝子を含む選択マーカーカセットを含んでいた（図９）。

植物形質転換および分子的確認
実験構築物を、近交系トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４から単離した未成熟胚のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を介してトウモロコシに形質転換した。使用した方法は、Ishida et al., (1996)およびFrame et al., (2006)によって公開されているものと類似であるが、その方法が産業的設定におけるハイスループット形質転換を受け入れられるようにするよういくつかの修正および改善をした。Ishida Y. et al., (1996) High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnol 14:745-750；およびFrame et al., (2006) Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Rep 25: 1024-1034。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換
バイナリー発現ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株ＤＡｔ１３１９２（ＲｅｃＡ欠失三元菌株）（国際特許公開番号ＷＯ２０１２０１６２２２）に形質転換した。細菌コロニーを選択し、バイナリープラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化を介して確認した。

アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養液をグリセロールストックからＡＢ最少培地（Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79；スクロースを用いず、５ｇ／Ｌグルコースおよび１５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒを用いて作製）上に面線接種し、暗所中２０℃で３日間インキュベートした。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養液をＹＥＰ培地（Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79）のプレート上に面線接種し、暗所中２０℃で１日間インキュベートした。

実験日に、接種培地（２．２ｇ／Ｌ ＭＳ塩、６８．４ｇ／Ｌスクロース、３６ｇ／Ｌグルコース、１１５ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２ｍｇ／Ｌグリシン、１００ｍｇ／Ｌミオ−イノシトール、０．０５ｍｇ／Ｌニコチン酸、０．５ｍｇ／ＬピリドキシンＨＣｌ、０．５ｍｇ／ＬチアミンＨＣｌ）とアセトシリンゴンの混合物を実験のサイズに適した体積で調製した。アセトシリンゴンの１００％ジメチルスルホキシド中１Ｍストック溶液を接種培地に添加して、２００μＭの最終アセトシリンゴン濃度を作製した。

各構築物について、ＹＥＰプレートからの１〜２ループのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を滅菌使い捨て５０ｍｌ遠心管の内側の接種培地／アセトシリンゴン混合物１５ｍｌに懸濁し、６００ｎｍでの溶液の光学濃度（Ｏ．Ｄ．_６００）を分光光度計で測定した。次いで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を用いて、懸濁液を０．２５〜０．３５Ｏ．Ｄ．_６００に希釈した。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットホームシェーカー上に水平に置き、使用前に１〜４時間の間インキュベートした。

トウモロコシの形質転換
実験構築物を、近交系トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４から単離した未成熟胚のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を介してトウモロコシに形質転換した。使用した方法は、Ishida et al., (1996) Nature Biotechnol 14:745-750およびFrame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034によって公開されているものと類似であるが、その方法がハイスループット形質転換を受け入れられるようにするよういくつかの修正および改善をした。トウモロコシ中にいくつかのトランスジェニックイベントを生成するために使用される方法の例は、胚感染および共培養ステップで始める、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１３／０１５７３６９Ａ１に示される。

ｃｒｙ３４Ａｂ１およびａａｄ−１定量的ＰＣＲアッセイを用いて、導入遺伝子存在のためにＶ２〜３葉期で推定上のトランスジェニックトウモロコシ植物をサンプリングした。製造業者の指示通りに、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＤＮＡを葉試料から抽出した。

目的の遺伝子を検出するために、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子のＦＡＭ標識蛍光プローブおよび内因性インベルターゼ参照遺伝子対照のＨＥＸ標識蛍光プローブを含むＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて、遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを増幅した。以下のプライマーを、ｃｒｙ３４Ａｂ１およびインベルターゼ内因性参照遺伝子増幅に使用した。プライマー配列は以下の通りであった；
Ｃｒｙ３４Ａｂ１プライマー／プローブ：
順方向プライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ：ＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧ（配列番号７）
逆方向プライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ：ＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＧ（配列番号８）
プローブ：ＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＣＧＡＡＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡ／ＭＧＢ（配列番号９）
インベルターゼプライマー：
順方向プライマー：インベルターゼＦ：ＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴ（配列番号１０）
逆方向プライマー：インベルターゼＲ：ＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴ（配列番号１１）
インベルターゼプローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴ／３ＢＨＱ＿１／−３’（配列番号１２）

次に、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）５μｌ；１０μＭストック〜最終濃度４００ｎＭのＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ、ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ、インベルターゼＦおよびインベルターゼＲプライマーそれぞれ０．４μｌ；５μＭストック〜最終濃度２００ｎＭのＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐおよびインベルターゼプローブそれぞれ０．４μｌ、１０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）〜最終濃度０．１％ ０．１μｌ；１０ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡ２μｌおよび水０．５μｌを含む最終体積１０μｌの反応液でＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡを以下の条件下、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｓｙｓｔｅｍで増幅した：１サイクルの９５℃１０分間；４０サイクルの以下の３つのステップ：９５℃１０秒間；５８℃３５秒間および７２℃１秒間、ならびに最終サイクルの４℃１０秒間。未知の試料についての標的（目的の遺伝子）／参照（インベルターゼ遺伝子）値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０による出力）とｃｒｙ３４Ａｂ１コピー数対照の標的／参照値を比較することによって、ｃｒｙ３４Ａｂ１コピー数を決定した。

インベルターゼ内因性参照遺伝子を用いて、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子について上記のように、ａａｄ−１遺伝子の検出を行った。ａａｄ−１プライマー配列は以下の通りであった；
ＡＡＤ１順方向プライマー：ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡ（配列番号１３）
ＡＡＤ１逆方向プライマー：ＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号１４）
ＡＡＤ１プローブ：５’−ＦＡＭ／ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ−ＭＧＢ／ＢＨＱ−３’（配列番号１５）

最後に、目的の遺伝子を含むＴ_０植物を、ｃｒｙ３４Ａｂ１およびＡＡＤ−１葉ＥＬＩＳＡアッセイのためにＶ４〜５でサンプリングした。４枚の葉パンチをサンプリングした。共にタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイのために全根の質量のために別のセットの植物をＶ４〜５でサンプリングした。葉および根のＣｒｙ３４Ａｂ１（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）およびＡＡＤ−１（Ａｃａｄｉａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）ＥＬＩＳＡアッセイを製造業者の指示通りに行った。Ｃｒｙ３４Ａｂ１葉ＥＬＩＳＡアッセイはｎｇ／ｃｍ^２として表し、根ＥＬＩＳＡ結果は百万分率（またはタンパク質ｎｇ／全植物タンパク質ｍｇ）として表した。全根タンパク質アッセイを、製造業者の指示通りにＢｒａｄｆｏｒｄ検出法によって行った。

Ｔ_０植物をトウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４非トランスジェニック形質転換系統に自殖（self）および他殖（cross）してＴ_１種子を得た。１試験調節エレメント構築物当たり５〜６個のトランスジェニック系統またはイベントをＴ_１タンパク質およびＲＮＡ遺伝子発現試験、次いで、Ｔ_２種子産生に進めた。したがって、１イベント当たり３０〜４０個のＴ_１種子を蒔いた。実生にＶ２〜Ｖ３の発達段階でＳｕｒｅＩＩ（登録商標）を噴霧して非トランスジェニック分離個体を死滅させた。トランスジェニック植物を、以下の通りｃｒｙ３４Ａｂ１およびＡＡＤ−１ ＥＬＩＳＡのために複数の植物発達段階でサンプリングした：葉（Ｖ４、Ｖ１２およびＲ３）；根（Ｖ４およびＲ１）；茎（Ｒ１）；花粉（Ｒ１）；ひげ（Ｒ１）；殻（Ｒ３）；仁（Ｒ３）；および穂軸（Ｒ３）。全ての組織を単離し、ドライアイスに埋め込まれたチューブに入れ、次いで、これを−８０℃に移した。ＥＬＩＳＡのためにタンパク質抽出する前に、凍結組織を凍結乾燥した。

ｃｒｙ３４Ａｂ１、ｙｆｐおよびａａｄ−１導入遺伝子を含む推定上のトランスジェニックＴ_１植物を、葉ＥＬＩＳＡアッセイのためにＶ４〜５でサンプリングした。４枚の葉パンチをサンプリングした。葉パンチをチューブに入れ、単一１／８’’ステンレス鋼ビーズ（Ｈｏｏｖｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｕｍｍｉｎｇ、ＧＡ、米国）を、３００μｌ抽出緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを補足した１×ＰＢＳＴ）を含むそれぞれの１．２ｍｌチューブに添加した。試料をＧｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（商標）（ＳＰＥＸ ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）において１５００ｒｐｍで４分間処理した。試料をＳｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ ＸＦＲ（商標）遠心分離機において４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。次に、さらに抽出緩衝液３００μｌを添加し、試料をＧｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（商標）においてもう一度１５００ｒｐｍで２分間処理した。試料をもう一度４０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。最後に、上清を回収し、製造業者の指示通りに、商業的に入手可能なＣｒｙ３４Ａｂ１（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．）およびＡＡＤ−１（Ａｃａｄｉａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ＬＬＣ）ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて、タンパク質標準と一緒に異なる希釈でＥＬＩＳＡアッセイを完了した。凍結乾燥組織をペイントシェーカー中で３０秒間粉砕することによって、種々の組織型のＥＬＩＳＡのためのタンパク質抽出を行った。さらなる粉砕を必要とする組織については、粉砕ステップをさらに３０秒間繰り返した。ガーネット粉末を添加してチューブの底の曲線部分を覆った。粗く粉砕した組織を２ｍｌチューブに移し、０．５ｍｌの印まで満たした。１個のセラミックボールを各チューブに添加し、部分抽出緩衝液（プロテアーゼ阻害剤カクテル２００μｌ、５００ｍＭ ＥＤＴＡ２００μｌ、ＤＴＴ粉末１５．５ｍｇおよび２０ｍｌまでのＰＢＳＴ）０．６ｍｌも添加した。チューブの全てを氷上で１０分間保持した。冷チューブをＧｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（登録商標）の２ｍｌホルダーに移した。試料を、間に５分間氷上で冷却しながら２回、３０秒間粉砕した。次に、１０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０ ４０μｌおよび抽出緩衝液３００μｌを試料に添加した。試料を、間に５分間冷却しながら、さらに３０秒間粉砕した。最後に、各試料を１３０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を新しいチューブに慎重に移して抽出物を回収した。抽出物を抽出緩衝液に再懸濁し、ＥＬＩＳＡアッセイに必要とされるように希釈した。

Ｔ_０トランスジェニック植物の発現スクリーニング
ＥＬＩＳＡの結果は、トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様調節エレメントが、構築物、ｐＤＡＢ１１３０２９で形質転換されたＴ_０イベントにおいて、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の根特異的発現を駆動することを示した。トウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様調節エレメントによるＣｒｙ３４Ａｂ１の無視できるほどの発現がこれらのイベントの葉および根で観察された（それぞれ、表１および表２）。対照構築物ｐＤＡＢ１０８７４６から産生されたイベントは、葉組織と根組織の両方でＣｒｙ３４Ａｂ１を発現した。ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子を含まない対照構築物、ｐＤＡＢ１０１５５６で形質転換された植物イベントにおいては、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の葉発現が観察されなかった。全ての構築物が、根組織と葉組織の両方でａａｄ−１遺伝子を発現した。

さらに、表３および表４は、種々の構築物イベントの、Ｖ４〜６トウモロコシの葉および根それぞれにおけるｃｒｙ３４Ａｂ１およびＡＡＤ−１導入遺伝子発現を示すＴ_１ ＥＬＩＳＡ結果を示している。

こうして、新規なトウモロコシ（Zea mays）メタロチオネイン様調節エレメントを同定し、特徴付けた。遺伝子発現構築物に使用するためのプロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ調節エレメントを初めて開示している。種々の設計のＭＴＬプロモーターが、葉と比較して高度な根優先的発現を示した。ＭＴＬプロモーターのバージョンとその天然３’ＵＴＲの特定の組み合わせ、例えば、ｐＤＡＢ１１２８１６、ｐＤＡＢ１１２８２０およびｐＤＡＢ１１３０２９が、葉と根の両方においてＡＡＤ−１発現を有意に上方制御する下流の遺伝子カセットに対するエンハンサー効果を示した。このようなエンハンサー効果は、対照構築物、ｐＤＡＢ１０１５５６では観察されなかった。

さらに、プロモーターは、複数の組織型（例えば、葉、根、花粉、茎、ひげ、穂軸、殻等）で発現を増強するように思われる。例えば、ｐＤＡＢ１１３０２９構築物ＭＴＬプロモーター／３’ＵＴＲそれ自体は種々の組織型でｃｒｙ３４Ａｂ１を発現しないが、複数の組織型で下流のＡＡＤ１カセットの発現を増強する。

本明細書で引用される刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、本開示の明示的詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、そのため、あたかも各参考文献が個別的かつ具体的に参照により組み込まれることが示されており、本明細書に全体が示されているのと同程度に組み込まれる。本明細書に論じられる参考文献は、本出願の出願日前より前のその開示についてのみ提供される。本明細書中のいずれも、本発明者らが先行発明によってこのような開示に先立つ権利がないことの自認と解釈すべきでない。以下の実施例は、特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供されるものである。実施例は、本開示を例示される特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきでない。

Claims (28)

1. ｉ）ポリリンカー配列；
   ｉｉ）導入遺伝子または
   ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の組み合わせ
   と作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターであって、前記プロモーターは配列番号１、配列番号１、配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列、または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸ベクター。
2. 前記プロモーターが長さ３ｋｂ未満である、請求項１に記載の核酸ベクター。
3. 前記プロモーターが配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の核酸ベクター。
4. 前記プロモーターが配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の核酸ベクター。
5. 前記プロモーターが配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１に記載の核酸ベクター。
6. 前記プロモーターが配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１に記載の核酸ベクター。
7. 選択マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
8. 前記プロモーターが導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項７に記載の核酸ベクター。
9. 前記導入遺伝子が殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率または栄養価を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコードする、請求項８に記載の核酸ベクター。
10. 配列番号３、配列番号３、配列番号４と９０％の配列同一性を有する配列、または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記ポリリンカーまたは前記導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項１から６または８のいずれかに記載の核酸ベクター。
11. 前記３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１０に記載の核酸ベクター。
12. 前記３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１０に記載の核酸ベクター。
13. 配列番号５または配列番号５と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、前記５’非翻訳配列が前記プロモーター配列と前記ポリリンカーまたは導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している、請求項１から３または５のいずれかに記載の核酸ベクター。
14. 前記５’非翻訳配列が配列番号５または配列番号５と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１５に記載の核酸ベクター。
15. 導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１を含むプロモーター配列、配列番号１、配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列、または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む植物。
16. トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される、請求項１５に記載の植物。
17. トウモロコシ（Zea mays）である、請求項１５に記載の植物。
18. 前記導入遺伝子が前記植物のゲノムに挿入されている、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の植物。
19. 前記プロモーター配列が配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１５に記載の植物。
20. 前記プロモーター配列が配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１５に記載の植物。
21. 前記プロモーター配列が配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１５に記載の植物。
22. 前記プロモーター配列が配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１５に記載の植物。
23. 配列番号５または配列番号５と９０％の配列同一性を有する配列を含む５’非翻訳配列をさらに含み、前記５’非翻訳配列が前記プロモーターと前記導入遺伝子との間に挿入されており、これらと作動可能に連結している、請求項１５に記載の植物。
24. 配列番号３、配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列、配列番号４、または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、
    前記３’非翻訳配列が前記導入遺伝子と作動可能に連結している、請求項２３に記載の植物。
25. 前記３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２３に記載の植物。
26. 前記３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２３に記載の植物。
27. 前記３’非翻訳配列が配列番号３または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項２３に記載の植物。
28. 前記３’非翻訳配列が配列番号４または配列番号４と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項２３に記載の植物。