DE68922050T2

DE68922050T2 - Pflanzen, die mit einer lepidopteralen DNS-Sequenz aus Bazillus thuringiensis transformiert werden.

Info

Publication number: DE68922050T2
Application number: DE68922050T
Authority: DE
Inventors: Johan Botterman; Herman Hofte; Henk Joos; Marnix Peferoen
Original assignee: Plant Genetic Systems NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1988-09-06
Filing date: 1989-09-04
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2009-09-05
Also published as: EP0647711A1; ES2071671T3; JP3283255B2; ATE120801T1; EP0647711B1; EP0358557A2; CA1340251C; US5460963A; EP0358557A3; DE68922050D1; JPH03503123A; WO1990002801A2; WO1990002801A3; AU4075589A; DE68929471D1; EP0358557B1; ATE242327T1; AU622702B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine neue DNA-Sequenz (das "bt18-Gen") aus dem Genom des Stammes Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis HD-146 (der "Bt HD-146-Stamm"), der von der Agricultural Research culture Collection, USA, auch frei verfügbar ist. Das bt18-Gen codiert ein 130 kda-Protein (das "Bt18-Protoxin").
Die Erfindung betrifft auch ein 62 kDa-Protein (das "Bt18-Toxin"), das durch tryptische Spaltung aus dem Bt18- Protoxin erhalten werden kann.
Das Bt18-Toxin ist der aktive Inhaltsstoff in dem kristallisierten Protoxin, das von dem Bt HD-146-Stamm produziert wird und das eine hohe Aktivität gegen Lepidoptera-Arten aus der Familie der Noctuidae, wie Spodoptera-Arten sowie anderer Lepidoptera, wie Manduca sexta, besitzt.
Wie bei anderen kristallinen B. thuringiensis ("Bt")- Proteinen (Höfte et al., 1988) wird das kristalline Bt18- Protoxin bei Aufnahme durch die lnsektenlarven solubilisiert und im Mitteldarm des Insekts gespalten, wodurch das Bt18- Toxin freigesetzt wird. So beschrieben Höfte et al. (1988) allgemein drei Typen von Toxin-produzierenden Lepidopteraspezifischen B. thuringiensis mit den folgenden Eigenschaften:
Typ A (bestehend aus drei Subtypen), welcher ein Protoxin von 130 kda und ein Toxin von 60 kDa produziert, das gegen Manduca sexta und Pieris brassicae toxisch wirkt.
Typ B, welcher ein Protoxin von 133 kDa und ein Toxin von 55 kDa produziert, das gegen Pieris brassicae toxisch wirkt.
Typ C, welcher ein Protoxin von 135 kDa und ein Trypsin-aktiviertes Toxin von 63 kDa produziert, welches insektizide Aktivität gegen Spodoptera littoralis und Mamestra brassicae zeigt.
Die Erfindung betrifft weiter ein chimäres Gen, das zur Transformation einer Pflanzenzelle verwendet werden kann und das die folgenden operativ verknüpften DNA-Sequenzen enthält:
1) das gesamte oder einen insektizid wirksamen Teil des bt18-Gens, das den gesamten oder einen insektizid wirksamen Teil des Bt18-Protoxins codiert, vorzugsweise einen verkürzten Teil des bt18-Gens ("das verkürzte bt18-Gen"), das nur das Bt18-Toxin codiert;
2) einen zur Steuerung der Transkription des gesamten bt18-Gens oder eines Teils davon in der Pflanzenzelle befähigten Promotor; und
3) geeignete 3'-Transkriptionsregulationssignale zur Expression des ganzen bt18-Gens oder eines Teils davon in der Pflanzenzelle.
Dieses chimäre Gen wird nachstehend als das "chimäre bt18-Gen" bezeichnet. Bevorzugt wird die Pflanzenzelle mit einem chimären bt18-Gen transformiert, umfassend das verkürzte bt18-Gen, sowie ein Gen für einen selektierbaren Marker, wie das neo-Gen, das die Neomycin-Phosphotransferase II oder die NPTII (Reiss et al., 1984) codiert, welches mit dem verkürzten btlB-Gen als ein bt18-neo-Hybridgen fusioniert ist, das ein Bt18-Toxin-NPTII-Fusionsprotein codiert.
Die Erfindung betrifft ferner eine Pflanze, die aus der transformierten Zelle regeneriert wurde und die resistent gegen Lepidoptera, insbesondere Sphingidae, wie Manduca sexta und Noctuidae, wie Spodoptera-Arten ist, die die Hauptschädlinge von ökonomisch wichtigen Nutzpflanzen, wie Baumwolle, Mais, Sojabohne, Luzerne, Tomaten, Tabak, Zuckerrüben und anderen Gemüsen, sind.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Lokalisierung des C-terminalen Endes des minimalen toxischen Teils oder Kerns eines B. thuringiensis-Protoxins, das dem Bt18-Protoxin ähnlich ist und nachstehend als das "Bt18- artige Protoxin" bezeichnet wird; eine Pflanzenzelle und eine mit einer DNA-Sequenz, die einen toxischen Teil eines Bt18-artigen Protoxins mit einem C-terminalen Ende mit Mindestlänge codiert, transformierte Pflanze; und eine Sonde zur Identifizierung einer solchen DNA-Sequenz.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Pflanzenzellgenom mit dem chimären bt18-Gen transformiert, das das gesamte bt18-Gen oder einen Teil davon, bevorzugt das verkürzte bt18-Gen, enthält, wobei die so erhaltene Pflanzenzelle verwendet werden kann, um eine Pflanze zu ergeben, die in einigen oder allen ihren Geweben das gesamte Bt18-Protoxin oder mindestens einen toxischen Teil davon, bevorzugt das Bt18- Toxin produziert, wodurch die Pflanze gegen Lepidoptera resistent gemacht wird. Die erfindungsgemäßen transformierten Pflanzenzellen können auch verwendet werden, um die Bt-Toxine, die von diesen Zellen exprimiert werden, zu isolieren.
Ebenfalls wird erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt, um eine Pflanze gegen Lepidoptera resistent zu machen, wobei das Pflanzenzellgenom mit dem chimären bt18-Gen, das das ganze bt18-Gen oder einen Teil davon, bevorzugt das verkürzte bt18-Gen enthält, transformiert wird.
Ferner werden erfindungsgemäß DNA-Sequenzen des bt18- Gens bereitgestellt, die jeweils das Bt18-Protoxin codieren und die die DNA-Sequenzen des verkürzten bt18-Gens enthalten, die nur das Bt18-Toxin codieren. Eine mit dem vollständigen oder einem Teil dieser DNA-Sequenzen des bt18- Gens transformierte Pflanzenzelle ist gegen Lepidoptera resistent.
Weiter wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bestimmung des C-Terminus des minimalen toxischen Teils eines Bt18-artigen Protoxins gegen Lepidoptera bereitgestellt, umfassend den Schritt der Lokalisierung der folgenden intakten 12 Aminosäuren langen Sequenz in dem Protoxin:
LYIDKIEXILAD
worin X eine beliebige Aminosäure ist.
Ebenfalls werden erfindungsgemäß eine Pflanze und eine Pflanzenzelle bereitgestellt, deren Genom mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die einen toxischen Teil eines Bt18-artigen Protoxins mit einer Mindestlänge codiert, dessen C-terminales Ende im wesentlichen aus der 12 Aminosäuren langen Sequenz besteht und das bevorzugt mit dieser Sequenz endet.
Ferner wird erfindungsgemäß eine Nucleotidsequenz, die die 12 Aminosäuren lange Sequenz codiert, als Sonde verwendet, um: 1) eine Nucleotidsequenz zu identifizieren, bevorzugt eine DNA-Sequenz, die einen toxischen Teil, bevorzugt das Toxin, eines Bt18-artigen Protoxins mit einem C-Terminus mit einer Nindestlänge codiert, und 2) eine Nucleotidsequenz, die das C-terminale Ende codiert, in einer größeren Nucleotidsequenz zu lokalisieren, die das gesamte Bt18-artige Protoxin oder einen Teil davon codiert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß kann das bt18-Gen aus seinem jeweiligen Bt-HD-146-Stamm isoliert werden. Beispielsweise kann das bt18-Gen in seinem jeweiligen Bt-Stamm identifiziert werden, wobei das in der Europäischen Patentanmeldung 86 300 291.1 (welche hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird) beschriebene Verfahren angewendet wird. Das so identifizierte bt18-Gen kann dann auf herkömmliche Weise (Maxam und Gilbert, 1980) sequenziert werden, wodurch die in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenzen erhalten werden.
Die Aminosäuresequenz des Bt18-Protoxins und des Toxins können aus den DNA-Sequenzen des bt18-Gens und des verkürzten bt18-Gens bestimmt werden, Das insektizide Spektrum des Bt18-Protoxins und des Bt18-Toxins und die Nucleotidsequenzen des bt18-Gens beweisen, daß dieses Protoxin und Toxin sich von früher beschriebenen Toxinen mit Aktivität gegen Sphingidae und Noctuidae (Hofte et al., 1988) unterscheiden.
Das gesamte bt18-Gen (das das Bt18-Protoxin codiert) oder ein Teil des bt18-Gens (das einen toxischen Teil des Bt18-Protoxins codiert), bevorzugt das verkürzte bt18-Gen (das das Bt18-Toxin codiert), können stabil auf herkömmliche Weise in das Kerngenom einer einzelnen Pflanzenzelle insertiert werden, und die so transformierte Pflanzenzelle kann verwendet werden, um eine transformierte und insektenresistente Pflanze zu produzieren. Dabei kann ein nichtoncogenes Ti-Plasmid, das das chimäre bt18-Gen enthält, in Aarobacterium (z.B. A. tumefaciens) verwendet werden, um die Pflanzenzelle zu transformieren, wobei die beispielsweise in EP-A 116 718 und EP-A 270 822, der veröffentlichten PCT- Anmeldung 84/02913 und der EP 87 400 544.0 (die ebenfalls hiermit durch Bezugnahme inkorporiert sind) beschriebenen Verfahren verwendet werden. Das Genom der so erhaltenen transformierten Pflanzenzelle und Pflanze enthält darin integriert das chimäre bt18-Gen.
Ein "insektizid wirksamer Teil" oder "ein Teil" des bt18-Gens bedeutet eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid codiert, das weniger Aminosäuren als das jeweilige Bt18-Protoxin besitzt, aber das immer noch für Lepidoptera toxisch ist. Ein solcher Teil des bt18-Gens kann ein Bt18-Protoxin codieren, das in Richtung mindestens einer Trypsinspaltstelle des Protoxins verkürzt wurde (US- Patentanmeldung 821 582, eingereicht am 22. Januar 1986; europäische Patentanmeldung 86 300 291.1).
Die so erhaltene transformierte Pflanze kann in einem herkömmlichen Züchtungsschema verwendet werden, um weitere transformierte Pflanzen mit den gleichen Lepidoptera-Resistenzeigenschaften zu produzieren oder um das gesamte btlB- Gen oder einen Teil davon in andere Sorten der gleichen oder verwandter Pflanzenarten einzuschleusen. Samen, die von den transformierten Pflanzen erhalten werden, enthalten das ganze bt18-Gen oder einen Teil davon als stabile genomische Insertion. Zellen der transformierten Pflanze können gezüchtet werden, um das Bt18-Toxin zu produzieren, das zur Verwendung in herkömmlichen insektiziden Zusammensetzungen gegen Lepidoptera isoliert werden kann (US-Patentanmeldung 821 582; europäische Patentanmeldung 86 300 291.1).
Bevorzugt liegt das gesamte bt18-Gen oder ein Teil davon in dem chimären bt18-Gen vor und wird in ein Pflanzengenom stromabwärts (d.h. 3') von und unter der Kontrolle eines Promotors, der die Expression des Gens in den Pflanzenzellen steuern kann, insertiert. Bevorzugte Promotoren umfassen den starken konstitutiven 355-Promotor (Odell et al., 1985) des Blumenkohlmosaikvirus. 355-Promotoren wurden aus verschiedenen Isolaten erhalten: CM1841 (Gardner et al., 1981), Cabb-J (der "3553-Promotor") und CabbB-5 (Hull und Howell, 1987). Andere bevorzugte Promotoren umfassen den TR1'-Promotor und den TR2'-Promotor, die die Expression der 1'- bzw. 2'-Gene der T-DNA steuern (Velten et al., 1984) [der "TRI'-Promotor" bzw. der "TR2'-Promotor"].
In einer anderen Ausführungsform kann ein Promotor verwendet werden, der nicht konstitutiv ist, sondern eher für ein oder mehrere Gewebe oder Organe der Pflanze spezifisch ist, wodurch das gesamte Bt18-Protoxin oder ein toxischer Teil davon nur in den Zellen des spezifischen Gewebes/der spezifischen Gewebe oder des spezifischen Organs/der spezifischen Organe exprimiert wird. Beispielweise könnte das gesamte bt18-Gen oder ein Teil davon selektiv in den grünen Geweben einer Pflanze exprimiert werden, indem das Gen unter die Kontrolle eines lichtinduzierbaren Promotors gestellt wird, wie des Promotors für das Gen der kleinen Einheit der Ribulose-1,5- bisphosphatcarboxylase der Pflanze selbst oder einer anderen Pflanze, wie Erbsen, wie in der US-Patentanmeldung 821 582 und der europäischen Patentanmeldung 86 300 291.1 (die ebenfalls hiermit durch Bezugnahme inkorporiert sind) offenbart ist. Eine andere Ausführungsform betrifft die Verwendung eines Promotors, dessen Expression durch Temperatur oder chemische Faktoren indizierbar ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, daß das ganze btlB-Gen oder ein Teil des bt18-Gens in dem chimären bt18-Gen bereitgestellt wird und in ein Pflanzengenom stromaufwärts (d.h. 5') geeigneter 3'-Transkriptionsregulationssignale (d. h. Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale), wie des nicht-translatierten 3'-Endes des Octopinsynthase-Gens ("ocs") (Gielen et al., 1984) oder des T-DNA-Gens 7 (Velten und Schell, 1985) insertiert wird.
Es ist weiterhin bevorzugt, daß das gesamte bt18-Gen oder ein Teil des bt18-Gens in dem chimären bt18-Gen bereitgestellt wird und in ein Pflanzengenom in dieselbe Transkriptionseinheit wie ein Gen für einen selektierbaren Marker und unter der Kontrolle desselben Promotors, insertiert wird. Dieses hybride bt18-Marker-Gen wird dadurch in einer transformierten Pflanze als ein Fusionsprotein exprimiert (US-Patentanmeldung 821 582; europäische Patentanmeldung 86 300 291.1; Vaeck et al., 1987). Jedes beliebige herkömmliche Marker-Gen kann verwendet werden, mit dem es möglich ist, N-terminale Genfusionen herzustellen und dessen Expression verwendet werden kann, um transformierte Pflanzenzellen zu selektionieren. Ein Beispiel für ein geeignetes selektierbares Marker-Gen ist ein Antibiotikum-Resistenz- Gen, wie das neo-Gen, das die Neomycin-Phosphotransferase 11 codiert, welche Kanamycin-Resistenz verleiht (europäische Patentanmeldung 87 400 544.0; US-Patentanmeldung 821 582).
Jede beliebige DNA- oder RNA-Sequenz, die die vorstehend definierte 12 Aminosäuren lange Sequenz codiert, kann auf herkömmliche Weise als Sonde zur Identifizierung der Lokalisation des C-terminalen Endes des Protoxins mit der Mindestlänge in einem Gen, das ein Bt18-artiges Protoxin codiert, verwendet werden. Diese Sonde kann auch verwendet werden, um andere homologe Sequenzen, die in anderen Bt- Stämmen vorhanden sind, durch herkömmliche Methoden und durch computergesteuerte Homologie-Recherchen zu identifizieren. Diese 12 Aminosäuren lange Sequenz kann auch auf herkömmliche Weise (Höfte et al., 1988) verwendet werden, um polyclonale und/oder monoclonale Antikörper herzustellen, die gegen diese Sequenz gerichtet sind und die verwendet werden können, um Bt18-artige Protoxine, bevorzugt Bt18-artige Toxine, zu identifizieren.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Figuren, auf die in den Beispielen bezug genommen wird, sind die folgenden:
Die Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des offenen Leserasters ("ORF") des bt18-Gens, welche sich von Nucleotid 54 bis Nucleotid 3566 erstreckt. Das ATG-Startcodon ist eingerahmt und ihm geht eine eindeutige Shine-Dalgarno-Sequenz (Shine und Dalgarono, 1974) voraus, die unterstrichen ist. Die 9 N-terminalen Aminosäuren des 62 kDa-Proteins, bestimmt durch Gasphasensequenzierung sind unterstrichen (doppelt). Das "?" bedeutet, daß dieser Rest nicht zweifelsfrei bestimmt wurde. Das verkürzte bt18-Gen, das nur das Bt18-Toxin codiert, erstreckt sich von Nucleotid 54 bis zu dem Nucleotid 1856. Die C-terminale, 12 Aminosäuren lange Sequenz des Bt18-Toxins erstreckt sich von Nucleotid 1821 bis zu Nucleotid 1856 und ist in Fig. 1 unterstrichen. Der Beginn der Insertion pJI20 und das Ende der Insertion pJI21 sind ebenfalls angegeben. Eine Pfeilspitze zeigt das Ende des toxischen Fragments (Bt18-Toxin) an. Die Trypsinspaltstellen des Bt18-Protoxins liegen bei den Aminosäuren 28 und 612.
Die Fig. 2a zeigt die Restriktionskarte der BT-HD-146- DNA-Insertion in den Plasmiden pJI20 und PJI21 (Beispiel 1).
Die Fig. 2b zeigt die Restriktionskarte des bt18-Gens von pJI25 (Beispiel 2a). Die Position der gentechnisch erzeugten NcoI-Spaltstelle ist angegeben. Schraffierte Balken geben das das Bt18-Toxin codierende Fragment wieder.
Die Fig. 3 zeigt Vergleiche der Aminosäuresequenzen des erfindungsgemäßen Bt18-Protoxins [Nr. 7] und des Bt4-Protoxins [Nr. 6] mit dem Bt2-Protoxin (Höfte et al., 1986) [Nr. 2] und dem Bt15-Protoxin (Honee et al., 1988) [Nr. 5] aus den Beispielen 1 und 2. Die Aminosäuren, die homolog sind, sind in Großbuchstaben gedruckt. Eine Pfeilspitze zeigt das Ende der Aminosäuresequenz des Bt18-Toxins an (bei Aminosäureposition 601).
Die Fig. 4a zeigt eine schematische Darstellung der ortsspezifischen Mutagenese-Strategie des Beispiels 2a zur Erzeugung einer Ncoi-Spaltstelle an dem Startcodon des bt18- Gens.
Die Fig. 4b zeigt die Rekonstruktion des bt18-Gens und die Konstruktion eines E. coli-Expressionsvektors in Beispiel 2a, so daß in Plasmid pJI25 das bt18-Gen unter der Kontrolle eines starken E. coli-Promotors (Pr) steht.
Die Fig. 4c zeigt die Konstruktion eines bt18-neo- Hybrid-Gens in einem E. coli-Expressionsvektor in Beispiel 2c.
Die Fig. 4d zeigt die Konstruktion eines verkürzten bt18-Genfragments in einem E. coli-Expressionsvektor in Beispiel 2c.
Die Fig. 5a und 5b zeigen die chimären Konstruktionen von Beispiel 3 zum Erhalt der Expression des bt18-Gens in Pflanzen; die Fig. 5a zeigt die chimären Konstruktionen des bt18-Gens, des verkürzten bt18-Gens und des bt18-neo-Hybrid- Gens mit dem TR2'-Promotor; und die Fig. 5b zeigt die chimären Konstruktionen des bt18-Gens, des verkürzten bt18- Gens und des bt18-neo-Hybrid-Gens mit dem 3553-Promotor.
Die Fig. 6 zeigt die Gegenüberstellung der Mindestlänge, der C-terminalen Enden der Aminosäuresequenzen der toxischen Teile (z.B. das Toxin) des Bt18-Protoxins und anderer homologer Bt18-artiger Protoxine, d.h. der Bt14-, Bt15- und Bt18-Protoxine. Eine 12 Aminosäuren lange Konsensussequenz an den C-terminalen Enden der toxischen Teile dieser Bt18-artigen Protoxine, deren Sequenzintegrität für die Beibehaltung der gegen Lepidoptera gerichteten Aktivität solcher toxischer Teile wesentlich ist, ist in einem Kasten gezeigt. Diese Konsensusaminosäuresequenz entspricht für die jeweiligen Protoxine den folgenden Aminosäurepositionen:
Bt4 581-592
Bt18 590-601 (erfindungsgemäß)
Bt14 625-636 (Brizzard und Whiteley, 1988)
Bt15 605-616 (Honee et al., 1988; europäische Patentanmeldung 89 401 499.2).
Die Fig. 7 zeigt die ortsspezifischen Mutationen in der Konsensussequenz und in der die Konsensussequenz flankierenden Region am C-terminalen Ende des das Bt18-Toxin codierenden Genfragments in Beispiel 6.
Wenn in den Beispielen nicht anders angegeben, wurden alle Verfahren zur Herstellung und zur Manipulation der rekombinanten DNA nach den standardisierten Verfahren, die in Maniatis et al., Molecular Clonina - A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben sind, durchgeführt.

Beispiel 1: Clonierung des Bt18-Gens

Protoxinkristalle wurden aus dem Bt-HD-146-Stamm unter Verwendung des von Mahillon und Declcour (1984) beschriebenen Verfahrens isoliert. Die SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese ("SDS-PAGE") [Laemmli, 1970] der gereinigten Kristalle zeigte das Vorhandensein einer Hauptproteinbande mit 130 kda.
Die gemäß Höfte et al. (1986) durchgeführte tryptische Spaltung mit anschließender SDS-PAGE zeigte das Vorhandensein einer einzelnen Proteinbande von 62 kDa, die eine toxische Aktivität gegen S. littoralis und M. sexta zeigte und die das toxische Fragment des Bt18-Protoxins enthielt.
Die Toxizitätstests des tryptischen 62 kDa-Fragments (Bt18-Toxin) wurden, wie von Höfte et al. (1988) beschrieben, durchgeführt, und die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt. Die Toxizität ist als 50%ige letale Konzentration in ng/cm² ausgedrückt (was die Konzentration ist, die benötigt wird, um 50 % der getesteten Insekten abzutöten), gefolgt von 95%igen Zufallsfehlerbereichen und der Neigung der statistischen Wahrscheinlichkeitslinie (probitline) (Finney, 1971). Tabelle 1 Manduca sexta Spodoptera littoralis Mamestra brassicae
Um das bt18-Gen zu clonieren, wurde die Gesamt-DNA aus dem Bt-HD-146-Stamm präpariert, und diese Genombank wurde mit Mboi (Biolabs) teilgespalten und der Größe nach auf einem Saccharosegradienten fraktioniert. Fraktionen, die DNA zwischen 3 und 6 kb enthielten, wurden in dem mit BamHI gespaltenen und mit alkalischer Rinderphosphatase ("BAP") behandelten Clonierungsvektor pUCIB (Yanisch-Perron et al., 1985) ligiert. Die rekombinanten E. coli-Clone wurden mit einem 790 bp langen BclI-MluI-Restriktionsfragment aus dem bt2-Gen als Sonde (Höfte et al., 1986) abgesucht. Diese Region wurde ausgewählt, weil gezeigt wurde, daß für alle bekannten insektiziden kristallinen Proteine von 130 kda (Höfte et al., 1988) die Gene in ihrer zweiten Hälfte hochkonserviert sind. Jedoch trägt der Teil des von dieser Region codierten Proteins nicht zur toxischen Aktivität des Proteins bei (Höfte et al., 1988). Ein positiver Clon enthielt ein Plasmid "pJI20", das ein DNA-Fragment trug, das mit der Sonde (Fig. 3a) hybridisierte. Die Sequenzierung der DNA des Fragments gemäß Maxam und Gilbert (1980) zeigte das Vorhandensein eines großen ORFS. Jedoch fehlte eine einer Translationsstartregion entsprechende Nucleotidsequenz (Fig. 1). Um das 5'-Ende des bt18-Gens zu isolieren, wurde ein 300 bp langes BamHI-HpaI-Fragment aus pJI20 (Fig. 1 und 2a) verwendet, womit andere hybridisierende Clone in der Genombank gesucht wurden. Die BAMHI-Spaltstelle wurde nach Ligierung des Mboi-Fragments in die BamHI-Spaltstelle von pUCIB wieder hergestellt. Ein positiver Clon enthielt ein Plasmid "pJI21", das eine Insertion von 3 kb enthielt.
Die Sequenzierung eines Teils der Insertion von pJI21 zeigte das Vorhandensein von Translationsstartsignalen und eines ORFS, der teilweise mit der des Clons pJI20 überlappte. Daher wurde angenommen, daß beide Clone Teile des gleichen Gens btlB (Fig. 1-2a) enthielten. Um diese Tatsache zu bestätigen, wurde die gesamte DNA des Bt HD-146-Stammes mit Xbai gespalten und mit einer Sonde, bestehend aus dem 800 bp langen EcoRI-saci-Fragment aus pJI25 (aus Beispiel 2; Fig. 2b und 4b) geblottet. Das Plasmid pJI25 enthielt das vollständige bt18-Gen als Ergebnis der weiter beschriebenen Rekonstruktion des Gens. Nur zwei Banden von 460 und 720 bp zeigten eine Hybridisierung mit dieser Sonde, was anzeigte, daß nur ein Gen entsprechend dem bt18-Gen in dem Genom vorhanden war.
Die DNA-Sequenz des bt18-Gens zeigte das Vorhandensein eines ORFS von 3512 bp (Fig. 1), und die Aminosäuresequenz des Bt18-Protoxins wurde daraus abgeleitet. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des Bt18-Protoxins mit dem Bt2-Protoxin (Höfte et al., 1986) und dem Bt15-Protoxin (Honee et al., 1988) zeigte klar, daß der C-terminale Teil stark konserviert ist (Fig. 3).
Die N-terminale Sequenz des Bt18-Toxins von 62 kDa wurde bestimmt. Dazu wurde das toxische Fragment der Trypsin-gespaltenen, gesamten, kristallinen Bt18-Proteine auf eine mit Polybrene beschichtete Glasfaser (europäische Patentanmeldung 86 401 933.6) geblottet und ein etwa 62 kDa- Fragment wurde für die Aminosäuresequenzierung extrahiert, wobei ein Gasphasensequenator (Applied Biosystems Inc., USA), der, wie von Hewick et al. (1981) beschrieben, arbeitete, verwendet wurde. Die bestimmte N-terminale Aminosäuresequenz entsprach der von der Nucleotidsequenz zwischen den Positionen 138 und 164 abgeleiteten Sequenz (angegeben in Fig. 1).

Beispiel 2: Expression des bt18-Gens in E. coli

Um das bt18-Gen in E. coli und in Pflanzen zu exprimieren, wurden verschiedene Gen-Kassetten hergestellt.

a) Konstruktion einer bt18-Genkassette

Eine NcoI-Spaltstelle wurde an dem ATG-Startcodon des bt18-Gens (Fig. 4a) eingeschleust. Dies erlaubte die Fusion der das Bt18-Protoxin codierenden Sequenz mit einem ATG- Startcodon eines Pflanzenexpressionsvektors oder an ein ATG- Startcodon anderer gut exprimierter bakterieller Gene, wie beispielsweise des cro-Gens des λ-Phagen (Zabeau und Stanley, 1982).
Die NcoI-Spaltstelle wurde wie folgt (Fig. 4a) eingeschleust. Ein 30-meres Oligonucleotid mit der folgenden Sequenz:
5 'GGAGGTATT ATGGAGATAGTGAATAATC3'
wurde synthetisiert, wobei eine Applied-Biosystems-Vorrichtung gemäß dem Verfahren von Itakura et al. (1984) verwendet wurde. Dies erlaubte die Veränderung der TT-Nucleotide (bp 52-53) vor dem ATG (Fig. 1) in CC (vorstehend in der Oligonucleotidsequenz unterstrichen) durch ortsspezifische Mutagenese (Stanssens et al., 1987), wodurch eine NcoI- Spaltstelle durch die in Fig. 4a gezeigte Strategie erhalten wurde. Ein 1,4 kb langes HpaI-EcoRI-Fragment von pJI21, das die N-terminale Sequenz des bt18-Gens (Fig. 4a) enthielt, wurde in das HindIII-EcoRI gespaltene pMa5-8-Plasmid (hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungs-Nr. 4567) gemäß dem Duplex-Lücken-Verfahren ("gapped duplex") von Stanssens et al. (1987) cloniert, wodurch das Plasmid "pHW47" (Fig. 4a) erhalten wurde. Gemäß dem Verfahren nach Stanssens et al. (1987) wurde eine einzelsträngige DNA von pHW47 hergestellt, und das Oligonucleotid wurde darin insertiert. Dies ergab das Plasmid "pHW4B", das eine mit dem ATG- Startcodon des bt18-Gens überlappende Ncoi-Spaltstelle besitzt (Fig. 4a).
In einer zweiten Stufe wurde das 270 bp lange NcoI- ECORI-Fragment, das das 5'-Ende der Nucleotidsequenz des btlB-Gens von pHW4B codiert, in mit Ncol und EcoRI gespaltenes pJB6S cloniert, wodurch das Plasmid "pbt181" (Fig. 4b) erhalten wurde. pJB6S ist ein E. coli-Expressionsvektor, der den starken regulierbaren X-Pr-Promotor trägt; in diesem Vektor überlappt eine Ncoi-Spaltstelle mit dem ATG- Startcodon des λ-cro-Gens (Botterman und Zabeau, 1987). Anschließend wurde ein Polylinker in pBt181 stromabwärts der ECORI-Spaltstelle durch Austausch eines geeigneten Restriktionsfragments aus pLK37 (Botterman und Zabeau, 1987) eingeschleust, wodurch das Plasmid "pbt182" erhalten wurde. Das Vorhandensein einer Polylinker-Region stromabwärts des N-terminalen Fragments des bt18-Gens in p8t182 erlaubte die Rekonstruktion des intakten bt18-Gens mit einer gentechnisch erzeugten Ncoi-Spaltstelle an dem ATG-Startcodon. Dazu wurden ein ECORI-HINDIII-Fragment von pJI21 und ein HINDIII- Drai-Fragment aus pJI20 isoliert und in pBt182 cloniert, wodurch das Plasmid "pJI25" erhalten wurde. Dieses Plasmid enthielt das bt18-Gen unter der Kontrolle des λ-Pr-Promotors (Fig. 4b).

b) Konstruktion einer C-terminal verkürzten bt18- Genkassette und einer bt18-neo-Hybrid-Genkassette

Wie vorstehend erwähnt, umfaßt das aktive toxische Fragment des Bt18-Protoxins ein Trypsinspaltprodukt von 62 kDa. Anstelle der Expression des gesamten Gens ist es auch möglich, ein das Bt18-Toxin codierendes Genfragment oder Derivate davon in Pflanzen zu exprimieren. Dazu wurde ein verkürztes bt18-Gen konstruiert. Um leicht transgene Pflanzen selektionieren zu können, die ausreichend Bt18-Toxin produzieren, um Lepidoptera abzutöten, wurde eine hybride Genkonstruktion auch mit einem Gen, das einen selektierbaren Marker codiert, wie in der US-Patentanmeldung 821 582 und in Vaeck et al. (1987) beschrieben, hergestellt. Eine solche hybride Konstruktion erlaubte die Selektion der transformierten Pflanzen, in denen die Expression des Marker-Gens ausreicht, um vorhersagen zu können, daß die bt18-Genexpression auch ausreicht, um Transformanten gegen Lepidoptera (Höfte et al., 1988a) resistent zu machen. Zu diesem Zweck wurde ein bt18-neo-Hybrid-Gen ebenfalls konstruiert.
Eine BclI-Spaltstelle ist stromabwärts (an den Positionen 1967 bis 1972 in Fig. 1) der Nucleotidsequenz, die das Bt18-Toxin codiert, lokalisiert. Um ein verkürztes bt18-neo- Hybrid-Gen und ein C-terminal verkürztes bt18-Gen-Fragment zu konstruieren, wurde das aufgefüllte BclI-Ende an die aufgefüllte ECORI-Spaltstelle von pLKMgL (Botterman, 1986) und die aufgefüllte HINDIII-Spaltstelle von pLKg4 (Botterman und Zabeau, 1987) ligiert, wodurch die Plasmide "pJ126" bzw. "pJ127" (Fig. 4c und 4d) erhalten wurden. pLKM91 enthielt ein 5'-verkürztes neo-Genfragment, das ein enzymatisch aktives C-terminales Fragment von NPT II (Reiss et al., 1984) codiert, und pLK94 enthielt Translationsstoppcodons in drei Leserastern (Botterman und Zabeau, 1987). In pJ126 wurde das neo-Gen im Leseraster an das bt18-Gen an Position 1976 (d.h. der BclI-Spaltstelle in Fig. 1) fusioniert, und in pJ127 wurde ein Translationsstoppcodon unmittelbar stromabwärts des N-terminalen bt18-Genfragments (Fig. 4d) positioniert.

c) Expression des bt18-Gens und abgeleiteter Genfragment in E.coli

Das Plasmid pJI25 aus Beispiel 2a wurde in den E. coli- Stamm K12ΔH1ΔTrp [der "NFI-Stamm"] (Zabeau und Stanley, 1982) transformiert. Die SDS-PAGE zeigte, daß der Stamm NF1 (pJI25) dann ein 130 kda-Protein nach Temperaturinduktion des Pr-Promotors bei 42ºC, wie von Zabeau und Stanley (1982) beschrieben, produzierte. Dieses 130 kda-Protoxin war in dem NFI-Kontrollstamm ohne das Plasmid pJI25, der auf gleiche Weise gezüchtet wurde, nicht vorhanden. Das exprimierte Bt18-Protein zeigte eine ähnliche toxische Aktivität gegen S. littoralis und M. sexta wie die Trypsin-behandelten Kristalle des Bt-HD-146-Stammes. Dieses 130 kDa-Protein wurde aus dem E. coli-Clon unter Verwendung des für das Bt2- Protoxin beschriebenen Verfahrens (Höfte et al., 1986) gereinigt und enthielt das gleiche tryptische 62 kDa- Fragment. So wird angenommen, daß das Bt18-Protoxin als Vorläufer in B. thurinqiensis während der Kristallbildung und auch in dem rekombinanten E. coli-Stamm synthetisiert wird und daß das Bt18-Protoxin in das Bt18-Toxin von 62 kDa prozessiert werden kann.
Ferner wurden die Plasmide pJ126 und pJ127 aus Beispiel 2b in den E. coli-NF1-Stamm transformiert. Die Temperaturinduktion dieser Stämme bei 42ºC zeigte, daß pJ126 die Expression eines Bt18-NPTII-Fusionsproteins steuerte, welches eine NPTII-Aktivität zeigte und-welches eine toxische Aktivität gegen S. littoralis und M. sexta zeigte. pJ127 steuerte die Expression eines 62 kDa-Proteins, dessen Wanderung in der SDS-PAGE der des aktiven Bt18-Toxins entsprach und das in vitro eine toxische Aktivität gegen S. littoralis und M. sexta zeigte.

Beispiel 3: Einschleusung der chimären bt18-Gene in pflanzliche Expressionsvektoren

Die verschiedenen bt18-Genkassetten des Beispiels 3a-b werden unter die Kontrolle von Promotoren gestellt, die in Pflanzenzellen in intermediären pflanzlichen Expressionsvektoren, wie nachstehend beschrieben, aktiv sind.
Das Ncoi-BglII-Fragment aus pJI25, das das bt18-Gen codiert, das NcoI-XbaI-Fragment aus pJ127, das das verkürzte bt18-Gen codiert, und das NcoI-BglII-Fragment aus pJ126, das das bt18-neo-Hybrid-Gen codiert, werden isoliert und in die intermediären T-DNA-Vektoren pGSH150 (DSM-Hinterlegungs-Nr. 4753) und pGSH160 zwischen die terminalen begrenzenden repetitiven T-DNA-Sequenzen der Vektoren (Deblaere et al., 1988) unter der Kontrolle des TR2'-Promotors des Vektoren cloniert. pGSH160 unterscheidet sich von pGSH150 durch das Vorhandensein eines, neo-Gens unter der Kontrolle des TR1'- Promotors. Die bt18-Genfragmente aus pJI25 und pJ127 werden zwischen die ClaI- und BamHI-Spaltstellen unmittelbar stromabwärts des TR2'-Promotors in pGSHlSO und pGSH160 cloniert. Dies ergibt die Vektoren "pGSTX60" bzw. ''pGSTX61". Das bt18-neo-Hybrid-Gen wird zwischen die Clai- und BamHI- Spaltstellen von pGSH150 cloniert, was den Vektor "pGSTX50" ergibt.
Auf ähnliche Weise werden die gleichen bt18-Genfragmente in die intermediären T-DNA-Vektoren pDEl6o und pDE150, die den 3553-Promotor enthalten, cloniert. Die Vektoren pDE160 und pdelso sind pGSH150 und pGSH160 ähnlich, aber enthalten statt des TR2'-Promotors das 3553-Promotorfragment aus pDE90. pDE90 leitet sich von pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985) ab, in den der 3553-Promotor cloniert wird und der eine Ncoi-Spaltstelle an dem ersten ATG-Codon in dem 3553-Transkript enthält. pDE150 enthält das 3553-Promotorfragment, gefolgt von dem nicht-translatierten 3'-Ende des T-DNA-Gens 7. pDE160 ist mit pDE150 identisch, mit der Ausnahme, daß das neo-Gen in einer chimären Pnos-neo-3'-ocs- Genkassette (europäische Patentanmeldung 89 401 194.9) als selektierbarer Marker vorhanden ist. Die bt18-Genfragmente aus pJ125 und pJ127 werden zwischen die Ncoi- und BamHI- Spaltstellen von pDE160 cloniert, und das bt18-neo-Hybrid- Gen wird auf gleiche Weise in pDE150 cloniert. Dies ergibt die Vektoren "pGSTX62", ''pGSTX63" bzw. "pGSTXS2". Alle Vektoren enthalten das neo-Gen als einen selektierbaren Marker für die Transformationen von Pflanzen entweder als ein intaktes neo-Gen oder in einem Hybrid-Gen.

Beispiel 4: Identifizierung des bt18-Genfragments das den toxischen Teil des Bt18-Protoxins codiert, basierend auf einer am C-Terminus des toxischen Teils lokalisierten Konsensussequenz

Eine bevorzugte Strategie zur Expression von B. thurinaiensis-Toxin-Genen wie des bt18-Gens in Pflanzen ist die Verwendung eines Genfragments, das einen toxischen c- terminal verkürzten Teil des B. thuringiensis-Protoxins codiert. Um ein solches Genfragment zu konstruieren, kann eine geeigente Restriktionsspaltstelle, die stromabwärts des toxischen Teils lokalisiert ist, verwendet werden, um ein Translationsstoppcodon, wie in Fig. 7 gezeigt, einzuschleusen.
Wie in Beispiel 2b beschrieben, enthält pJ127 ein bt18- Genfragment, das einen C-terminal verkürzten, toxischen Teil des Bt18-Protoxins unter der Kontrolle des λ-pr-Promotors codiert. In dieser Konstruktion wurde die Bcli-Spaltstelle, die 112 Nucleotide stromabwärts der Konsensussequenz von Fig. 6 lokalisiert ist, zur Konstruktion eines verkürzten bt18-Genfragments ausgewählt. Die Analyse der gesamten Zellextrakte des NFI-Stammes (Zabeau und Stanley, 1982), der das Plasmid pJ127 trägt, nach Temperaturinduktion auf einem SDS-Polyacrylamidgel zeigte die Synthese eines 73 kDa- Polypeptids, wie durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht wurde. Die Mobilität der Polypeptidbande in der SDS-PAGE entsprach dem berechneten Molekulargewicht für das verkürzte bt18-Genprodukt. Die Verwendung von E. coli-Rohlysaten in Insektenfütterungstests parallel mit Extrakten eines E. coli-Stammes, der das Bt18-Protoxin überproduziert (d.h. des NFI-Stammes, der pJI25 trägt), zeigte eine vergleichbare insektenabtötende Wirkung in beiden Fällen. pJ127 steuert die Synthese eines bt18-Genproduktes, das aus dem toxischen Fragment, das durch die Konsensussequenz von Fig. 6 identifiziert wurde, besteht, gefolgt von 46 Aminosäuren, die von von Sequenzen vor der BclI-Spaltstelle codiert werden und von einem Linker abgeleiteten Sequenzen vor dem Translationsstoppcodon.
Um die Bedeutung der 12 Aminosäuren langen Konsensussequenz (gezeigt in Fig. 6) als Teil eines toxischen Teils eines Bt-Protoxins zu bewerten, können zwei Strategien ins Auge gefaßt werden: 1) Ortsspezifische Mutagenese der Gensequenz an verschiedenen Stellen in der Konsensussequenz und 2) Einschleusung von Translationsstoppcodons in die Konsensussequenz an verschiedenen Stellen durch ortsspezifische Mutagenese. Beide Techniken ergeben verschiedene Aminosäuresubstitutionen, deren toxische Wirkungen dann bewertet werden können. Beispielsweise kann die zweite Technik durch Einschleusen von drei Stoppcodons in die folgenden Stellen durchgeführt werden: a) unmittelbar stromabwärts von der und die Konsensussequenz flankierend; b) an dem vorletzten Codon der Konsensussequenz; und c) unmittelbar stromaufwärts von der und die Konsensussequenz flankierend, wie in Fig. 3 gezeigt. Ein XmnI-XbaI-Fragment aus pJ127 (Beispiel 3b, Fig. 4d) wurde isoliert und in pMa5- 8 (DSM-Hinterlegungs-Nr. 4567) cloniert, wodurch das Plasmid "pJI100" erhalten wurde. Um ein Stoppcodon (TAA) an den in Fig. 7 gekennzeichneten Positionen in das bt18-Gen einzuschleusen, wurden die folgenden Oligonucleotide durch das Verfahren von Stanssens et al. (1987) eingeschleust, wodurch die folgenden Plasmide erhalten wurden: Position Olignucleotid Plasmid meres
Diese Plasmide wurden in dem NFI-Stamm vermehrt, und Gesamtproteinextrakte wurden mittels SDS-PAGE analysiert. In allen Fällen wurde eine Polypeptidbande von etwa 68 kDa beobachtet, wie von den jeweiligen bt18-Gen-Konstruktionen erwartet wurde. In Insektentoxizitätstests wurde eine insektenabtötende Aktivität nur mit pJI101 beobachtet, wohingegen bei den anderen keine Insektentoxizität beobachtet wurde.

Beispiel 5: Transformation von Tabak- und Tomatenpflanzen

Unter Verwendung von Standardverfahren (Deblaere et al., 1988) wurden die intermediären Pflanzenexpressionsvektoren (pGSTX50, pGSTX52 und pGSTX60-63) von Beispiel 3 in den Aarobacterium-Stamm CSBCIRif (US-Patentanmeldung 821 582; europäische Patentanmeldung 86 300 291.1), der das nicht-oncogene Ti-Plasmid pGV2260 (Deblaere et al., 1988) trug, transferiert. Die Transkonjuganten mit gleichzeitig integrierten Plasmiden, bestehend aus pGV2260 und den jeweiligen intermediären Pflanzenexpressionsvektoren werden ausgewählt. Diese Agrobacterium-Stämme werden dann verwendet, um Tabakpflanzen (Nictotiana tabacum var. Petit Havana SR-1) und Tomatenpflanzen (Licopersicon esculentum), wie in der europäischen Patentanmeldung 87 400 141.5 beschrieben, zu transformieren.

Beispiel 6: Lepidoptera-Resistenz der transformierten Tabak- und Tomaten flanzen von Beispiel 5

Die insektizide Aktivität, ausgedrückt in Blättern der transformierten Tomaten- und Tabakpflanzen von Beispiel 5, wird durch Aufzeichnen der Wachstumsrate und Mortalität der Spodoptera sp. - und Manduca sexta-Larven, die mit diesen Blättern gefüttert wurden, ausgewertet. Diese Ergebnisse werden mit der Wachstumsrate der Larven, die mit nichttransformierten Blättern gefüttert wurden, verglichen. Die Toxizitätstests werden, wie in der US-Patentanmeldung 821 582 und der europäischen Patentanmeldung 86 300 291.1 beschrieben, durchgeführt. Die Mortalitätsrate von Spodoptera sp. und M. sexta ist unter denjenigen, die mit den transformierten Tomaten- und Tabakblättern gefüttert wurden, signifikant höher.
Es erübrigt sich zu erwähnen, daß diese Erfindung nicht auf Tabak- oder Tomatenpflanzen, die mit dem bt18-Gen oder dem verkürzten bt18-Gen transformiert wurden, beschränkt ist. Sie bezieht sich auch auf jede beliebige Pflanze, die mit dem ganzen bt18-Gen oder einem Teil davon transformiert wurde, wie Rübsamen, Luzerne, Sonnenblumen, Baumwolle, Mais, Sojabohnen, Kartoffeln, Rüben, Zuckerrüben und andere Gemüse.
Auch andere DNA-Sequenzen, als die in Fig. 1 für die bt18- und verkürzten bt18-Gene gezeigten, können zur Transformation von Pflanzen verwendet werden. In dieser Hinsicht kann die DNA-Sequenz von Fig. 1 modifiziert werden: 1) Durch Ersatz einiger Codons durch andere, die entweder die gleichen Aminosäuren oder andere Aminosäuren codieren und/oder 2) durch Deletieren oder Hinzufügen einiger Codons, vorausgesetzt, daß derartige Modifikationen die insektiziden Eigenschaften der codierten Proteine nicht wesentlich ändern.
Ferner werden andere rekombinante DNAS, die die vorstehend genannten DNA-Sequenzen zusammen mit anderen Fremd-DNA-Sequenzen, insbesondere der DNA von Vektoren, die für die Transformation von Pflanzen geeignet sind, enthalten, von der vorliegenden Erfindung umfaßt. In dieser Hinsicht ist die Erfindung nicht auf die spezifischen Plasmide beschränkt, die das bt18- oder verkürzte bt18-Gen, wie vorstehend beschrieben, tragen, sondern umf aßt jede rekombinante DNA, die eine DNA-Sequenz, die dieser äquivalent ist, enthält. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen chimären bt18-Gene zwischen den repetitiven T-DNA Randsequenzen eines binären Vektors, wie in der EP-A 270 822 beschrieben ist, bereitgestellt werden, um binäre Vektoren, die das gesamte bt18-Gen oder einen Teil davon unter der Kontrolle des TR2'-Promotors enthalten, herzustellen. Ferner betrifft die Erfindung alle rekombinanten DNAS, die das bt18- oder ein verkürztes bt18-Gen umfassen und zur Transformation von Mikroorganismen (z.B. Pflanzen-assoziierten Bakterien, wie Pseudomonas, Xanthomonas oder Hefen, wie Streptomyces cerevisiae) unter Bedingungen geeignet sind, die die Expression des bt18-Gens oder des verkürzten bt18- Gens und deren Isolierung aus den Mikroorganismen oder deren Überführung in eine Pflanzenzelle erlauben.
Ferner kann das C-terminale Ende der Mindestlänge eines toxischen Teils eines Bt18-artigen Protoxins gemäß der Erfindung bis zu etwa 100, bevorzugt nicht mehr als etwa 25, insbesondere nicht mehr als etwa 10 zusätzliche Aminosäuren nach der intakten 12 Aminosäuren langen Sequenz von Fig. 6 umfassen. In dieser Hinsicht ist es nicht notwendig, daß der C-Terminus eines solchen toxischen Teils eines Bt18-artigen Protoxins mit der Sequenz aus 12 Aminosäuren abschließt, vorausgesetzt, daß die zusätzlichen C-terminalen Aminosäuren die insektiziden Eigenschaften des toxischen Teils des Bt18- artigen Protoxins nicht wesentlich verändern.

Literaturangaben

- Botter:an J. und Zabeau M. (1987), DNA 6, 583-591.
- Brizzard B. und Whiteley H. (1988), Nucleic Acids Research 16, 4168-4169.
- Deblaere R., Reynaerts A., Höfte H., Hernalsteens J.-P., Leemans J. und Van Montagu X. (1988), Methods in Enzymology 153, 277-292.
- Finney D. 1971, Probit Analysis, 3rd. ed., Cambridge University Press, Cambridge, England.
- Gardner, Howarth, Hahn, Brown-Luedi, Shepard und Messing (1981), Nucleic Acids Research 9, 2871-2887.
- Gielen J, De Beukeleer M., Seurinck J., Deboeck F., De Greve H., Lemmer M., Van Montagu N. und Schell J. (1984), ENBO J. 3, 835-845.
- Hewick R. M., Hunkapillar M. W., Hood L. E., und Dreyer W. J. (1981), J. Biol. Chem. 256, 7990-7997.
- Höfte H., Dissertation Thesis, State University of Ghent, Belgium, 1988.
- Höfte H., Buyssens s., Vaeck N. und Leemans J. (1988a), FEBS Letters 226, 364-370.
- Hoffte H., De Greve H., Seurinck J., Janssens S., Mahillon J., Ampe C., Vandekerckhove J., Vanderbruggen H., Van Montagu N., Zabeau N. und Vaeck M. (1986), Eur. J. Bioch 161, 273-280.
- Höfte H., Van Rie J., Janssens S., Van Houtven A., Verbruggen H. und Valck M. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54, 2010-2017.
- Hull und Howell (1987), Virology 86, 482-483.
- Itakura K., Rossi J. und Wallace R. (1984), Annual Review of Biochemistry 53, 223-356.
- Honee G., Van der Salm J. und Visser B. (1988), Nucleic Acids Research 16, 6240.
- Hull und Howell (1987), Virology 86, 482-493.
- Laemmli U. (1970), Nature 227, 680-685.
- Mahillon J. und Delcour J. (1984), J. Microbiol. Methods 3, 69-76.
- Maxam A.M. und Gilbert W. (1980), Methods in Enzymol. 65, 499-560.
- Norrander J., Kempe T. and Messing J. (1983) Gene, 26, 101-106.
- Odell J., Nagy F. und Chua N. H. (1985), Nature 313, 810-812.
- Reiss B., Sprengel R. und Schaller H. (1984), EMBO J. 3, 3317-3322.
- Shine J. und Dalgarno L. (1974), Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 71, 1342-1346.
- Stanssens P., McKeown Y., Friedrich K. und Fritz H.J (1988), "Oligonucleotide-directed construction of mutations by the gapped duplex DNA method using the pma/c plasmid vectors", veröffentlicht in der Sammlung zusätzlicher Versuchsverfahren, verteilt im EMBO-Laborkurs über "Directed mutagenesis and protein engineering" im Juli 1992 am Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Bundesrepublik Deutschland.
Vaeck N., Reynaerts A.; Höfte H., Jansens S., De Beukeleer M., Dean C., Zabeau N., Van Montagu M. und Leemans J. (1987), Nature 327, 33-37.
- Velten J., Velten L., Hain R. und Schell J. (1984) EMBO J. 3, 2723-2730.
- Velten J. und Schell J. (1985), Nucleic Acids Research 13 6981-6998.
- Yanish-Perron C., Vieira J und Messing J.(1985), Gene 33 103-119.
- Zabeau M und Stanley K. (1982), EMBO J. 1, 1217-1224.

Claims

1. Bt18-DNA, gekennzeichnet durch

a) die DNA-Sequenz von Figur 1 von Nucleotid 54 bis Nucleotid 3566, insbesondere von Nucleotid 54 bis 1856, oder

b) eine DNA-Sequenz, die das Bt18-Protein von Figur 1 von Aminosäureposition 1 bis Aminosäureposition 1171, insbesondere von Aminosäureposition 1 bis Aminosäureposition 601, codiert; oder

eine Variante der DNA-Sequenz a) oder b), bei der einige Codons gegen andere Codons ausgetauscht und/oder einige Codons zugefügt oder entfernt sind, mit der Maßgabe, daß das codierte Protein der Variante im wesentlichen die gleichen insektiziden Eigenschaften besitzt.

2. Bt18-Protein, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz, die von der Bt18-DNA nach Anspruch 1, insbesondere der DNA-Sequenz von Figur 1 von Nucleotid 54 bis Nucleotid 3566, ganz besonders von Nucleotid 54 bis Nucleotid 1856, codiert wird.

3. Chimäres Gen, das zur Transformation einer Pflanzenzelle verwendet werden kann, gekennzeichnet durch die folgenden operativ verknüpften DNA-Sequenzen:

a) die gesamte oder ein insektizid wirksamer Teil, vorzugsweise ein verkürzter Teil, der Bt18-DNA nach Anspruch 1;

b) ein zur Steuerung der Transkription der Bt18-DNA in der Pflanzenzelle befähigter Promotor; und

c) geeignete 3'-Transkriptionsregulationssignale zur 35 Expression der Bt18-DNA in der Pflanzenzelle.

4. Transformierte Pflanzenzelle, gekennzeichnet durch das chimäre Gen nach Anspruch 3.

5. Transformierte Pflanzenzelle, gekennzeichnet durch eine den toxischen Teil eines von der Bt18-DNA nach Anspruch 1 codierten Protoxins codierende DNA-Sequenz, wobei der C-Terminus des toxischen Teils im wesentlichen aus der folgenden intakten Sequenz von 12 Aminosäuren besteht und vorzugsweise damit endet:

L Y I D K I E L I L A D.

6. Pflanze, umfassend eine Vielfalt der transformierten Zellen nach Anspruch 4 oder 5.

7. Same der Pflanze nach Anspruch 6.

8. Pflanzengenom, das das chimäre Gen von Anspruch 3 darin integriert enthält.

9. Pflanzengewebe, dessen Zellen das Pflanzengenom nach Anspruch 8 besitzen.

10. Verfahren, um eine Pflanze resistent gegen Lepidoptera, insbesondere Noctuidae, ganz besonders gegen Spodopteraspecies und Manduca sexta, zu machen, gekennzeichnet durch den Schritt der Transformation des Pflanzengenoms mit dem chimären Gen nach Anspruch 3.

11. Insektizide Zusammensetzung gegen Lepidoptera, insbesondere gegen Noctuidae, ganz besonders gegen Spodopteraspecies oder Manduca sexta, gekennzeichnet durch das Bt18-Protein nach Anspruch 2, insbesondere das Bt18- Toxin.

12. Verfahren zur Lokalisierung des C-Terminus des toxischen Teils eines Bt18-Protoxins mit der Mindestlänge, gekennzeichnet durch den Schritt der Lokalisierung der Sequenz von 12 Aminosäuren nach Anspruch 5.

13. Sonde zur Identifizierung einer Nucleotidsequenz, die einen toxischen Teil, vorzugsweise das Toxin, des C-terminalen Endes des Bt18-Protoxins mit einer Mindestlange codiert, und zur Lokalisierung einer das C-terminale Ende codierenden Nucleotidsequenz in einer größeren Nucleotidsequenz, die das gesamte oder einen Teil eines Bt18-Protoxins codiert, gekennzeichnet durch eine Nucleotidsequenz, die die Sequenz von 12 Aminosäuren nach Anspruch 5 codiert.

14. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen, beispielsweise Samen, die ein heterologes genetisches Material beinhalten, das stabil in deren Genom integriert ist und in diesem in Form eines für Insekten toxischen Proteins exprimert werden kann, umfassend die folgenden nicht-biologischen Schritte:

a) Herstellen von transformierten Pflanzenzellen oder transformiertem Pflanzengewebe, die das heterologe genetische Material aus das Protein nicht exprimierenden Ausgangspflanzenzellen oder -pflanzengewebe beinhalten,

b) Herstellen von regenerierten Pflanzen oder von Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder beidem aus den transformierten Pflanzenzellen oder dem Pflanzengewebe, die das heterologe genetische Material beinhalten, und

c) gegebenenfalls biologisches Replizieren der regenerierten Pflanzen oder des Reproduktionsmaterials oder beider, wobei der Schritt der Herstellung der transformierten Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes, die das heterologe genetische Material beinhalten, gekennzeichnet ist durch den Schritt der Transformation der Ausgangspflanzenzellen oder des Pflanzengewebes mit der gesamten oder einem insektizid wirksamen Teil der Bt18-DNA nach Anspruch 1, und außerdem regulatorischen Elementen, die die Expression der Bt18-DNA in den Pflanzenzellen oder dem Pflanzengewebe ermöglichen können, zur Bewirkung der stabilen Integration der Bt18-DNA in transformierte Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe und außerdem in den davon hergestellten Generationen von Pflanzen und Reproduktionsmaterial

15. Transformierter Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß der transformierte Mikroorganismus eine Bt18-DNA nach Anspruch 1 enthält.

16. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus E. coli ist.

17. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 15, wobei das Bt18-Protein als ein Fusionsprotein mit dem NPTII- Protein hergestellt wird.

18. Plasmid, enthaltend die Bt18-DNA nach Anspruch 1.