BRPI0711634B1 - Método para a preparação de sementes isentas de marcador de uma planta transgênica - Google Patents

Método para a preparação de sementes isentas de marcador de uma planta transgênica Download PDF

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S. Chomet Paul
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Abstract

métodos e composições para obter plantas transgênicas isentas de marcador. trata-se de métodos e composições para a identificação de semente transgênica que contêm um transgene de interesse, porém desprovida de um gene marcador. o uso de uma seqüência de identificação que resulta em um fenótipo detectável aumenta a eficiência de triagem da semente e plantas em que as seqüências de transgene não ligadas a um gene de interesse se segregaram da seqüência que codifica um gene de interesse.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE SEMENTES ISENTAS DE MARCADOR DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA (51) Int.CI.: C12N 15/82; C12N 9/10; C12N 15/54; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 12/05/2006 US 60/799,875 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): XUDONG YE; MICHAEL W. PETERSEN; SHIHSHIEH HUANG; PAUL S. CHOMET; DAVID WALTERS; SUSAN JOHNSON; LARRY GILBERTSON
1/61
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE SEMENTES ISENTAS DE MARCADOR DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA.
Antecedentes da Invenção [001] Esse pedido reivindica a prioridade de Pedido Provisório Norte-americano n° de série 60/799.875, depositado em 12 de maio de 2006, cuja descrição total está incorporada aqui à título de referência.
1. Campo da Invenção [002] A invenção geralmente refere-se a plantas transgênicas. Mais especificamente, a invenção se refere à identificação e remoção de DNA indesejado ou desnecessário em plantas transformadas.
2. Descrição da Técnica Relacionada [003] A identificação de DNA transgênico desnecessário ou indesejado em plantas transformadas vem sendo o assunto de inúmeras investigações e diversos métodos diferentes foram examinados em tentativas para eliminar essas seqüências transgênicas de tais plantas (por exemplo, Hanson et al., 1999; Dale et al., 1991; Ebinuma et al., 1997; Yoder et al., 1994; Kononov et. al., 1997; Hare and Chua, 2002; Scutt et al., 2002; Puchta, 2003; de Vetten et al., 2003; Halpin, 2005; Pedido U.S. Publicado 20030110532; Pedido U.S. Publicado 20040237142; Patente U.S. 6.458.594). Em geral, é vantajoso identificar plantas que não incluem DNA transgênico que não contribuem para uma característica agronomicamente útil da planta transgênica.
[004] Muitos métodos para a introdução de transgenes em plantas por transformação mediada por Agrobacterium utilizam um T-DNA (DNA transferido) que incorpora um transgene e elementos genéticos associados, e transfere esses no genoma de uma planta. Geralmente, o(s) transgene(s) é/são cercado(s) por uma molécula de DNA de margem direita (RB) e uma molécula de DNA de margem esquerda (LB), e é/são transferidos no genoma da planta, integrando-se em um ou mais
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2/61 locais. Foi observado que quando um construto de DNA contiver mais de um T-DNA, esses T-DNAs e os transgenes contidos dentro desse podem ser integrados no genoma da planta em locais separados (Framond et al., 1986). Isso é referido como co-transformação.
[005] O processo de co-transformação pode ser realizado pela entrega dos T-DNAs com uma mistura de cepas de Agrobacterium transformadas com plasmídeos que conduzem os T-DNAs separados. A co-transformação também pode ser realizada ao transformar uma cepa de Agrobacterium com duas ou mais construtos de DNA, cada uma contendo um T-DNA. Um método adicional emprega dois T-DNAs sobre um único vetor de DNA e identificar células ou plantas transgênicas que integraram os T-DNAs em locais diferentes. Em um sistema de transformação não-mediado por Agrobacterium, tal como, um método físico para introduzir o DNA que inclui bombardeamento com microprojéteis, duas moléculas de DNA poderiam ser independentemente integradas no genoma alvo, e então se separam independentemente em uma geração subseqüente. O uso de 2 construtos de T-DNA que permitem a inserção independente de seqüências e sua segregação genética, também foi descrito (por exemplo, Patente U.S. 5.731.179; Zhou et al., 2003; Breitler et al., 2004; Sato et al., 2004). Embora a descrição anterior facilite o entendimento da técnica, ainda há necessidade de métodos e composições aprimoradas para obter plantas isentas de marcador para produzir um desenvolvimento de produto mais eficaz. Os processos de triagem anteriormente descritos exigem muita mão-de-obra, por exemplo, requerem Southern blot ou análise de PCR® após o crescimento de material vegetal R0 e/ou R1. [006] A Publicação U.S. 20060041956 descreve o uso de um gene marcador visual em conjunto com a transformação mediada por Agrobacterium. Entretanto, a publicação não descreve qualquer método em que tais marcadores estão ligados a um gene marcador seleciPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 10/102
3/61 onável ou verificável e não-ligado a um gene de interesse. Assim, ainda há uma grande necessidade na técnica de métodos e composições que poderiam aprimorar a facilidade e eficiência com tais plantas desprovidas de seqüências e marcadoras e/ou outro DNA transgênico que não é agronomicamente útil pode ser identificado e abortado.
Sumário da Invenção [007] Em um aspecto, a invenção proporciona um método para preparar sementes isentas de marcador de uma planta transgênica que compreende as etapas de: a) obter sementes de uma planta transgênica transformada com um primeiro segmento de DNA que compreende um ácido nucléico de interesse e um segundo segmento de DNA que compreende um marcador vegetal físico e/ou geneticamente ligado a um cassete de DNA que é ligado de modo operacional a um promotor funcional na semente, sendo que o cassete de DNA confere um fenótipo detectável às sementes que compreendem o cassete de DNA; b) classificar as sementes pela ausência de fenótipo detectável; e c) selecionar pelo menos uma primeira semente que é desprovida do fenótipo detectável para obter uma semente que é isenta do gene marcador. Em uma modalidade, a etapa c) compreende ainda avaliar a semente pela presença do ácido nucléico de interesse e selecionar uma semente que compreende o ácido nucléico de interesse e é desprovida do gene marcador selecionável. Em algumas modalidades, o gene marcador é um gene marcador selecionável ou verificável.
[008] Em algumas modalidades, o cassete de DNA pode ser fundido de maneira traducional ou transcricional com o gene marcador selecionável; ou seja, esse pode codificar um RNA que é fundido de maneira traducional ou transcricional com o gene marcador selecionável. Em uma modalidade adicional, o cassete de DNA compreende um fragmento de DNA anti-sentido ou sentido com pelo menos 19 ou 21
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4/61 pb de homologia a um gene endógeno, por exemplo, em que o fragmento de DNA anti-sentido ou sentido é ligado de modo operacional a um promotor funcional em uma semente. Ainda em outra modalidade, o cassete de DNA compreende um par de repetições invertidas de um fragmento de DNA, em que cada fragmento possui um tamanho de pelo menos 19 ou 21 pb, e em que o fragmento de DNA é homólogo a um gene endógeno, ligado de modo operacional a um promotor funcional na semente. A repetição invertida de um fragmento de DNA homólogo a um gene endógeno também pode ser integrada em um íntron dentro do gene marcador selecionável. Em algumas modalidades, o cassete de DNA codifica um RNA sentido ou anti-sentido que compreende pelo menos 19 ou 21 nucleotídeos em que o fragmento de DNA é homólogo a um gene endógeno.
[009] Em um método para preparar sementes isentas de marcador de acordo com a invenção, a semente selecionada pode ser desprovida de um gene verificável ou selecionável e cassete de DNA. A obtenção de sementes de uma planta transgênica pode compreender transformar ou co-transformar a planta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com primeiro e segundo segmentos de DNA em construtos de DNA separadas. A obtenção de sementes de uma planta transgênica também pode compreender transformar a planta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com uma única construto de DNA que compreende os primeiro e segundo segmentos de DNA. Os primeiro e segundo segmentos de DNA podem ser ligados por seqüências de margem de T-DNA diferentes. Em um método da invenção, uma planta transgênica pode ser produzida ao transformar a planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com um construto de DNA que compreende (i) o primeiro segmento de DNA flanqueado por margens de T-DNA esquerda e direita, e (ii) o segundo segmento de DNA flanPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 12/102
5/61 queado por um segundo conjunto de margens de T-DNA esquerda e direita, em que o segundo segmento de DNA compreende, ainda, um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional na planta transgênica. Os primeiro e segundo segmentos de DNA podem ou não ser geneticamente ligados na planta transgênica.
[0010] As plantas transgênicas usadas de acordo com a invenção podem ser produzidas ao introduzir os primeiro e segundo segmentos de DNA na planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior por meio da transformação mediada por uma cepa bacteriana selecionada do gênero Agrobacterium, Rhizobium, Mesorhizobium ou Sinorhizobium. As plantas transgênicas também podem ser produzidas, por exemplo, por bombardeamento com microprojéteis.
[0011] Um marcador selecionável usado com a invenção pode codificar um produto selecionado do grupo que consiste em CP4 EPSPS, bar, DMO, NptII, glifosato acetil transferase, acetolactato sintase mutante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon desalogenase, PMI, Protox, higromicina fosfotransferase e antranilato sintase resistente a 5-metil triptofano. Uma seqüência de cassete de DNA para uso com a invenção pode ser selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste em crtB, gus, gfp, sacB, lux, um gene da síntese de antocianina, fator de transcrição DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, ARF2, ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, splA, repetições invertidas de zeína, B-peru, e levedura ATP-PFK. O cassete pode ser ligado de modo operacional a um promotor funcional em um tecido selecionado de um embrião, endosperma da semente, cotilédone, aleurona e tegumento. O promotor pode ser, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em um promotor de napina, um promotor de beta-faseolina, um promotor de subunidade beta-conglicinina, um promotor de zeína, um promotor de Osgt-1, um promotor de oleosina, um promotor de sintase de
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6/61 amido, um promotor de globulina 1, um promotor de cevada LTP2, um promotor alfa-amilase, um promotor quitinase, um promotor betaglucanase, um promotor cisteína proteinase, um promotor glutaredoxina, um promotor de HVA1, um promotor serina carboxipeptidase II, um promotor catalase, um promotor alfa-glucosidase, um promotor betaamilase, um promotor VP1, um promotor USP, promotor USP88, promotor USP99, Lectina, e um promotor bronze2. O fenótipo detectável pode ser avaliado pela detecção de uma atividade catalítica. O fenótipo detectável pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em cor de semente, opacidade de semente, germinabilidade de semente, tamanho de semente, viabilidade de semente, formato de semente, textura de semente, e uma semente defeituosa ou abortada. A triagem de sementes pode ser feita por uma máquina de seleção de semente automática.
[0012] Em outro aspecto, a invenção proporciona um construto de DNA que compreende (a) um primeiro segmento de DNA que compreende margens de T-DNA esquerda e direita que flanqueiam um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas, e (b) um segundo segmento de DNA que compreende um segundo conjunto de margens de T-DNA esquerda e direita que flanqueia um promotor funcional em uma semente ligada de modo operacional a um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável em sementes que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas. O gene de interesse pode conferir uma característica selecionada do grupo que consiste em tolerância a herbicida, resistência a inseto ou praga, resistência a doenças, biomassa aumentada, metabolismo de ácido graxo modificado, metabolismo de carboidrato modificado, e qualidade nutricional modificada. No construto, o cassete de DNA e gene marcador selecionável podem ser ligados de modo opePetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 14/102
7/61 racional ao mesmo promotor. Em uma modalidade, o cassete de DNA e o gene marcador selecionável são ligados de modo operacional a diferentes promotores. Em modalidades específicas, o gene marcador selecionável codifica um produto selecionado do grupo que consiste em CP4 EPSPS, fosfinotricina acetiltransferase, DMO, NptII, glifosato acetil transferase, acetolactato sintase mutante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon desalogenase, PMI, Protox, higromicina fosfotransferase e antranilato sintase resistente a 5-metil triptofano. Em outras modalidades, o cassete de DNA é selecionado do grupo que consiste em fator de transcrição crtB, gus, gfp, sacB, lux, um gene de síntese de antocianina, DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, ARF2, ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, splA, repetições invertidas de zeína, B-peru, e levedura ATP-PFK. O cassete de DNA pode ser ligado de modo operacional a um promotor funcional em um tecido selecionado do grupo que consiste em um embrião, endosperma de semente, cotilédone, aleurona e tegumento. Em uma modalidade, o cassete de DNA é ligado de modo operacional a um promotor selecionado do grupo que consiste em um promotor de napina, um promotor de beta-faseolina, um promotor de subunidade beta-conglicinina, um promotor de zeína, um promotor de Osgt-1, um promotor de oleosina, um promotor de sintase de amido, um promotor de globulina 1, um promotor de cevada LTP2, um promotor alfa-amilase, um promotor quitinase, um promotor beta-glucanase, um promotor cisteína proteinase, um promotor glutaredoxina, um promotor de HVA1, um promotor serina carboxipeptidase II, um promotor catalase, um promotor alfa-glucosidase, um promotor beta-amilase, um promotor VP1, um promotor USP88 ou USP99, e um promotor bronze2.
[0013] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona células e plantas transgênicas transformadas com uma construto proporcionada aqui. Em uma modalidade, uma planta transgênica que é proporcionaPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 15/102
8/61 da é co-transformada com um construto de DNA que contém um primeiro segmento de DNA compreendendo margens de T-DNA esquerda e direita que flanqueiam um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas e um segundo construto de DNA que contém um segundo segmento de DNA compreendendo um segundo conjunto de margens de T-DNA esquerda e direita que flanqueiam um promotor funcional em uma semente ligada de modo operacional a um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável em sementes que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas. As células de tal planta também são proporcionadas.
[0014] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um construto de DNA que compreende margens de T-DNA esquerda e direita, em que um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem direita e um segundo segmento de DNA que compreende um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável às sementes de plantas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador, tal como, um gene marcador selecionável, ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem esquerda.
[0015] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um construto de DNA que compreende margens de T-DNA esquerda e direita, em que um primeiro segmento de DNA que compreende um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável às sementes de plantas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem direita e um segundo segmento de DNA que compreende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem esPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 16/102
9/61 querda.
[0016] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um construto de DNA que contém duas margens de T-DNA direitas, em que um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após uma margem direita e um segundo segmento de DNA que compreende um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável às sementes de plantas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas localizado após a outra margem direita. [0017] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona uma seqüência de ácido nucléico isolada que compreende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou uma seqüência com pelo menos 70%, 75%, 85% ou 95% identidade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, e que codifica um polipeptídeo com atividade de fitoeno sintase. Em uma modalidade, a invenção também proporciona um construto de DNA recombinante que compreende uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, ou um construto de DNA recombinante que compreende uma seqüência com pelo menos 71%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, e codifica um polipeptídeo com atividade de fitoeno sintase, ligado de modo operacional a um promotor funcional heterólogo em uma planta. Uma célula hospedeira que compreende tal seqüência, sendo que a célula é uma célula bacteriana ou uma célula vegetal é outra modalidade da invenção. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma planta ou semente transgênica que compreende a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou uma seqüência com pelo menos 71%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, e codifica um polipeptídeo com atividade de fitoeno sintase.
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Breve Descrição dos Desenhos [0018] Os seguintes desenhos fazem parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para mostrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida a título de referência aos desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui.
[0019] Figura 1. Diagramas Esquemáticos de: (A) pMON10338; (B) pMON10339; e (C) pMON67465.
[0020] Figura 2. Expressão de CrtB em tecidos de soja transformados com pMON67465.
[0021] Figura 3. Expressão de CrtB em semente do evento A33908.
[0022] Figura 4. Expressão de crtB, gus, and CP4/EPSPS em semente R1 imaturas.
[0023] Figura 5. Expressão de crtB em semente R1 madura.
[0024] Figura 6. Coloração com GUS de semente pMON67465.
[0025] Figura 7. PCR de CP4 & CrtB sobre sementes positivas
GUS.
[0026] Figura 8. Comparação de abordagens de ligação-Southern e marcador verificável para triagem de eventos transgênicos.
[0027] Figura 9. Sumário Esquemático de seqüências de DNA transferidas pelo uso de construto que compreende um gene verificável ligado aos genes marcadores CP4 selecionáveis de sementes isentas de marcador. A) GOI localizado em um T-DNA flanqueado com um RB e LB e fisicamente ligado a um segundo T-DNA que contém um gene verificável ligado a um gene marcador selecionável CP4 em uma construto usada para a transformação mediada por Agrobacterium; B) Um vetor que contém duas margens, o GOI é colocado após uma RB, enquanto os genes marcadores examináveis e selecionáveis são colocados após a segunda RB ou após uma LB juntamente com a
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11/61 cadeia principal; C) O GOI e os genes examináveis-DNAs são separados em dois vetores e transformados tanto em uma célula Agrobacterium como em células de Agrobacterium separadas; D) Possível ligação de dois segmentos de DNA do GOI e genes marcadores examináveis e selecionáveis. Apenas o GOI separado irá mostrar aparência de semente normal, enquanto as células que contêm o gene verificável mostram um fenótipo visível; E) Dois segmentos de DNA separados contêm tanto o GOI como os genes marcadores examináveis e selecionáveis usados para a transformação mediada não-bacteriana.
[0028] Figura 10. pMON67420 representa uma construto de GOI para co-transformação.
[0029] Figura 11. Plasmídeo pMON99575 contendo fosfofrutoquinase dependente de ATP Schizosaccharomyces pombe conduzida pelo promotor de zeína específico de semente.
[0030] Figura 12. Espiga de milho que expressa a fosfofrutoquinase dependente de ATP de levedura específica de semente eliminou o desenvolvimento de grão normal.
[0031] Figura 13. Diagrama esquemático de construtos codificadoras de dsRNA usadas para demonstrar que as repetições invertidas colocadas dentro de um íntron de um gene marcador resultam em um fenótipo visível.
[0032] Figura 14. Repetições invertidas incluídas em um íntron originam um fenótipo visível.
[0033] Figura 15. Silenciamento de α-zeínas em grãos de milho resulta em um fenótipo visível.
[0034] Figura 16. Diagrama esquemático de pMON83530 contendo KAS4.
[0035] Figura 17. Progênie de sementes de soja transformadas com pMON83530. As sementes à esquerda são encolhidas devido à expressão de KAS4 e indicam a presença de marcador selecionável,
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12/61 enquanto as sementes à direita são normais e isentas de marcador. [0036] Figura 18. Diagrama esquemático de pMON107314 contendo KAS4 útil como uma seqüência de identificação em um construto de DNA 2T.
[0037] Figura 19. Diagrama esquemático de pMON68581 contendo um gene splA útil como um gene de identificação.
[0038] Figura 20. Progênie de sementes de soja transformadas com pMON68581. As sementes à direita são encolhidas devido à expressão de splA e indicam a presença do marcador verificável ou selecionável, enquanto as sementes à esquerda são normais e isentas de marcador.
[0039] Figura 21. Diagrama esquemático de formatos de vetor de DNA 2 T.
Descrição Detalhada da Invenção [0040] A seguir está uma descrição detalhada da invenção proporcionada para auxiliar os elementos versados na técnica na prática da presente invenção. Os elementos versados na técnica podem fazer modificações e variações nas modalidades descritas aqui sem que se abandone o espírito ou escopo da presente invenção.
[0041] A invenção supera as deficiências na técnica anterior ao proporcionar construtos e métodos que permitem distinguir de maneira eficaz as sementes desprovidas de uma seqüência de identificação e seqüência de gene marcador, porém incluindo um gene ou genes de interesse (GOI), de sementes que contêm uma seqüência de gene de identificação e seqüência de gene marcador, com base em um fenótipo conferido por um gene de identificação expresso por semente, seqüência, ou cassete. Em particular, a presente invenção proporciona, em uma modalidade, construtos e métodos de transformação para a transformação de células vegetais que incluem: (i) um gene de interesse; e (ii) uma seqüência de identificação expressa em semente e
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13/61 fisicamente ligada a um gene marcador selecionável ou verificável que pode ser expresso em vários tecidos vegetais, em que o método de construto e/ou transformação é projetado de modo que os elementos genéticos de (i) e (ii) possam se integrar independentemente no genoma da planta, e assim, se segregarem geneticamente uns dos outros.
[0042] A expressão ou ausência da mesma da seqüência de identificação em tecidos de semente permite a identificação direta de sementes e plantas que são desprovidas da seqüência de identificação expressa por semente e o gene marcador selecionável ou verificável fisicamente ligado, enquanto permite a seleção de semente e plantas que ainda contêm o transgene de interesse. A seleção de semente inclusive o gene de interesse e de seqüências desprovidas de gene marcador no nível de semente representa um avanço significativo, pois evita a necessidade de métodos de triagem anteriormente utilizados que são comparativamente dispendiosos e requerem muita mão-deobra. Adicionalmente, pode-se economizar tempo visto que a triagem pode ser feita antes ou durante a germinação sem requerer crescimento da próxima geração de plantas até um tamanho que permite a colheita de tecido, como necessário para análise de ligação Southern, por exemplo.
[0043] Em uma modalidade, a transformação de tecido vegetal é realizada por um Agrobacterium ou outro método mediado por Rhizobia (Veja, por exemplo, Pedido de Patente Provisório n°de série U.S. 60/800.872, depositado em 16 de maio de 2006, intitulado Use of Non-Agrobacterium Bacterial Species for Plant Transformation e protocolo do procurador assinado N° MONS:100USP1, cuja descrição total está especificamente incorporada aqui a título de referência), e as seqüências de DNA inclusive a seqüência de identificação expressa na semente e o gene marcador selecionável ou verificável fisicamente
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14/61 ligado estão presentes juntamente em um T-DNA ou outra seqüência (por exemplo, cadeia principal de vetor) que é transferida em uma célula vegetal (por exemplo, flanqueada por seqüências de RB e/ou LB de T-DNA ou sem uma seqüência de margem). A seqüência de identificação e gene marcador podem ser transferidos para a planta fisicamente ligada, enquanto o gene de interesse está presente em um TDNA separado flanqueado por suas próprias seqüências de RB e LB, ou outra seqüência transferida em uma célula vegetal, pode ser integrado em um local independente (por exemplo, Figura 21). O marcador selecionável e/ou verificável permite a identificação de tecidos vegetais transformados. As plantas férteis podem ser obtidas e autofecundadas ou cruzadas em um esquema de cultivo para acompanhar a segregação de fenótipos na próxima geração. As estratégias para realizar tal cultivo são bem conhecidas na técnica, e podem variar em detalhes entre plantas diferentes. A expressão de semente, ou ausência de expressão, da seqüência de identificação permite uma rápida identificação de semente com relação à presença de seqüências marcadoras e de identificação. O gene de interesse, por exemplo, pode conter pelo menos um cassete de expressão de planta que codifica uma característica selecionada do grupo que consiste em tolerância a herbicida, resistência a antibiótico, resistência a inseto, resistência a doenças, resistência a problemas (por exemplo, estiagem e frio), eficiência de uso de nutriente aumentada, teor nutritivo aumentado (por exemplo, aminoácido, proteína, açúcares, carboidratos, ácidos graxos, e/ou óleo), sistemas de esterilidade, enzimas industriais (por exemplo, produtos farmacêuticos e enzimas de processamento de biocombustíveis) e rendimento aumentado.
[0044] As seqüências que podem ser transferidas em uma célula vegetal (por exemplo, T-DNAs) podem estar presentes sobre um vetor de transformação em uma cepa bacteriana que é utilizada para transPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 22/102
15/61 formação. Em outra modalidade, as seqüências inclusive a seqüência de identificação e marcador selecionável de planta, e a(s) seqüência(s) que compreende(m) o(s) gene(s) de interesse pode(m) estar presente(s) em vetores de transformação separados na cepa bacteriana. Ainda em outra modalidade, o T-DNA que inclui a seqüência de identificação e marcador selecionável da planta e o T-DNA que compreende o gene de interesse podem ser encontrados em ou cepas células bacterianas separadas usadas juntamente para a transformação.
[0045] Ainda em outra modalidade, as seqüências de DNA que incluem o (i) gene de interesse; e (ii) a seqüência de identificação expressa em semente e fisicamente ligada a um gene marcador selecionável ou verificável pode ser introduzida em uma célula vegetal por um método físico, tal como, bombardeamento com microprojéteis. Em tal modalidade, as seqüências de DNA de (i) e (ii) podem estar localizadas em fragmentos de DNA separados que podem ser misturados uns com os outros antes ou durante o revestimento de microprojéteis com DNA. As seqüências de DNA podem estar presentes sobre um único microprojétil ou essas podem estar presentes em microprojéteis separados que são misturados antes do bombardeamento.
[0046] O fenótipo transportado pela seqüência de identificação pode ser obtido por superexpressão ectópica de um gene heterogênico ou endógeno ligado a um promotor constitutivo ou específico de semente, ou por infra-regulação de um gene endógeno que utiliza RNA anti-sentido, interferência de RNA ou tecnologia de supressão. Exemplos do gene endógeno podem incluir, porém sem caráter limitativo, genes envolvidos em metabolismo de açúcar/amido, metabolismo de proteína e metabolismo de ácido graxo.
[0047] Em uma modalidade, a expressão de semente da seqüência de identificação resulta em um fenótipo detectável na semente de uma planta transgênica que contém uma seqüência de identificação.
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Em algumas modalidades, o fenótipo pode ser detectado por inspeção visual, e pode incluir uma alteração na cor da semente, opacidade (ou translucidez), fluorescência, textura, tamanho, formato, capacidade de germinação, viabilidade, ou geralmente qualquer componente ou característica que é física ou bioquimicamente avaliável e diferente daquele encontrado no genótipo de receptor não-transgênico. Em certas modalidades, a seqüência de identificação inclui gusA, gfp (Pang et al., 1996), fitoeno sintase, ou gene codificador de fitoeno desaturase, ou um gene de antocianina (Pl, Lc, B-Peru, C1, R, Rc, mybA ou mybl (por exemplo, Selinger et al., 1998; Ludwig et al., 1989; Himi et al., 2005; Kobayashi et al., 2002)). Em uma modalidade particular, o gene de identificação compreende um gene crtB que codifica uma fitoeno sintase (Patente U.S. n°s 5.429.939; US 6.429.356; Patente U.S. 5.545.816), inclusive um gene que compreende uma seqüência crtB otimizada por códon para expressão em uma planta monocotiledônea, tal como, planta de milho. Outro exemplo de gene que poderia ser usado nesse aspecto é um gene envolvido na produção de pigmento de semente.
[0048] Em outras modalidades, o fenótipo é avaliável pela detecção de uma atividade catalítica. Ainda em outras modalidades, o fenótipo é um fenótipo de ablação de tecidos, por exemplo, um bloqueio na formação de pólen, óvulo ou tecido de semente. As composições e métodos que silenciam os genes requeridos para a produção ou viabilidade de gametas, reduzindo ou impedindo as fertilizações que incluem o gene marcador, também são previstos. Por exemplo, as seqüências que poderiam ser usadas resultam no silenciamento de genes requeridos para o desenvolvimento e viabilidade de pólen. O pólen que é proveniente de segregantes meióticos que transportam o gene marcador poderia não se desenvolver ou poderia ser inviável impedindo, assim, a transmissão do gene marcador à progênie através do pólen. Em
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17/61 polinizações cruzadas, toda a progênie poderia ser isenta de marcador. O uso de seqüências que resultam em silenciamento de outros genes endógenos (por exemplo, tecnologias de RNAi inclusive miRNA) para resultar em um fenótipo de semente também é previsto. Tais genes incluem, porém sem caráter limitativo: genes que codificam ou modificam a expressão de proteínas de armazenamento de semente tais como, zeínas, Opaque2, Waxy, e outros genes que codificam as proteínas envolvidas em acúmulo de carboidrato, proteína e/ou lipídeo em sementes.
[0049] A expressão de uma seqüência de identificação que confere um fenótipo de pólen não-viável também é desejado, pois apenas os grãos de pólen sem a seqüência de identificação serão capazes de fecundar os óvulos aumentando, assim, a produção de sementes isentas da seqüência de identificação e a seqüência marcadora quando a linhagem transgênica que transporta a seqüência de identificação sob o controle de um promotor específico de pólen for usada como um polinizador macho. A seqüência de identificação pode produzir uma proteína que é letal ao pólen ou inibitória da germinação de pólen. Alternativamente, a expressão de um par de repetições invertidas homólogas a um gene de pólen endógeno essencial pode ser usada para silenciar o gene que torna o pólen não-viável. Exemplos de genes e promotores específicos de pólen são conhecidos pelos versados na técnica e incluem, por exemplo, genes LAT52 e LAT59 e promotores de tomate, como descrito (Eyal et al., 1995).
[0050] Em outra modalidade, a seqüência de identificação pode ser expressa tanto na semente como no pólen para aumentar, adicionalmente, a seleção de sementes com o gene de interesse como para eliminar as sementes com a seqüência de identificação e o gene marcador. Isso pode ser realizado utilizando-se uma seqüência de identificação compreendida de dois transgenes; sendo que um desses é exPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 25/102
18/61 presso na semente e o outro é expresso no pólen. Alternativamente, um promotor que pode expressar a mesma seqüência de identificação no pólen e na semente também pode resultar em um fenótipo detectável tanto no pólen como na semente. Exemplos de promotores que são expressos no pólen e na semente são os promotores do gene Waxy de milho (zmGBS; Shure et al., 1983), e o gene ADP-glicose pirofosforilase de pequena subunidade de arroz (osAGP; Anderson et al., 1991). Os padrões de expressão de pólen e semente também estão descritos em Russell and Fromm, 1997.
[0051] A seqüência de identificação pode alterar altemativamente o metabolismo de carboidrato, proteína, lipídeo, ou outros produtos de célula ou semente para produzir um fenótipo detectável. Em uma modalidade, a seqüência de identificação permite a expressão específica de endosperma de um gene sacB que codifica uma levansucrase ou uma fosfofrutoquinase dependente de ATP de levedura (ATP-PFK) que elimina o acúmulo de amido em sementes que contêm a seqüência de identificação e o gene marcador (Caimi et al., 1996; Figura 12). A seqüência de identificação pode ser um gene. A seqüência de identificação pode, ainda, codificar uma fusão transcricional ou traducional (por exemplo, Publicação de Patente U.S. 6.307.123; U.S. 20060064772).
[0052] A Patente U.S. 6.307.123 se refere ao construto de uma fusão traducional entre um gene marcador selecionável (nptII) e um gene marcador verificável (gfp). O método pode ser aplicado para produzir uma fusão entre uma seqüência de identificação descrita aqui e um marcador selecionável ou verificável descrito aqui.
[0053] Outro método que pode ser usado para produzir uma fusão de polipeptídeo se baseia na via de processamento de Ubiquitina (Ub). Esse método pode ser usado para clivar um polipeptídeo longo que compreende dois domínios de proteína em duas proteínas ativas sepaPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 26/102
19/61 radas. Nesse método, um único cassete de gene pode codificar dois ORFs, onde os dois ORFs, por exemplo, para crtB e EPSPS-CP4 são separados pelos 14 aminoácidos C-terminal de Ub, seguidos por uma seqüência completa de Ub. Após a tradução in vivo, as enzimas endógenas desubiquitinantes (DUBs) clivam a poliproteína em três unidades separadas: 1) a proteína N-terminal, que compreende a seqüência de identificação crtB que termina nos 14 aminoácidos C-terminal de Ub; 2) um monômero de Ub; e 3) o polipeptídeo C-terminal, que codifica um marcador selecionável EPSPS-CP4. Tais métodos são conhecidos pelos elementos versados na técnica (por exemplo, Walker et al, 2007).
[0054] Uma fusão transcricional entre uma seqüência de identificação e um marcador selecionável ou verificável pode ser realizada utilizando-se sítios internos de entrada do ribossomo (IRES). Por exemplo, poderia ser realizada uma transcrição que codifica o ORF de crtB seguido pelo ORF de ESPSP-CP4 com um elemento IRES funcional posicionado entre esses. Diversos IRES são conhecidos pelos versados na técnica (veja, por exemplo, Dinkova et al. 2005 e referências a essa; e Patente U.S. 7.119.187, incorporada aqui a título de referência).
[0055] O fenótipo da seqüência de identificação no tecido da semente também pode ser detectado por métodos que incluem métodos visuais, bioquímicos, imunológicos e à base de ácido nucléico (por exemplo, baseados em PCR), entre outros. A seqüência de identificação pode conferir um fenótipo detectável no tecido da semente que pode ser distinguido do fenótipo do gene marcador. O fenótipo conferido pela seqüência de identificação pode incluir germinação de semente alterada. A seqüência de identificação pode ser expressa em uma ou mais partes de uma semente (núcleo), inclusive o embrião, endosperma, cotilédone(s), e tegumento (casca), de modo que um fenótipo
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20/61 possa ser reconhecido.
[0056] A seqüência de identificação também pode originar um fenótipo sem semente. Para realizar a ablação do tecido, em uma modalidade, a seqüência de identificação dirige a expressão específica do óvulo de defH9-iaaM ou rolB em plantas (por exemplo, Rotino et al. 1997, Carmi et al. 2003, GenBank AM422760, X64255, AE009418), que elimina o desenvolvimento do óvulo e resulta em um fenótipo sem semente no marcador e seqüência de identificação contendo ovários. Ainda em outra modalidade, a seqüência de identificação dirige a expressão de OsCDPK2 em cereais que atrapalham o desenvolvimento de semente (Morello et al. 2000; por exemplo, GenBank Y13658). [0057] Os elementos genéticos também podem ser projetados para suprimir a expressão de um gene endógeno, resultando na produção de um fenótipo de semente que permite a distinção de sementes que contêm o gene marcador daqueles que não contêm. Os elementos genéticos dessa seqüência de identificação são fisicamente ligados ao gene marcador, por exemplo, inseridos no cassete de DNA marcador, de modo que o fenótipo da semente seja ligado mediante a presença do marcador, permitindo a rápida identificação de sementes que contêm marcador.
[0058] O RNAi pode ser usado para silenciar um ou mais genes resultando em um fenótipo de semente facilmente classificado, de preferência, visível. As seqüências de DNA requeridas por um fenótipo de semente mediado por RNAi estão posicionadas no mesmo T-DNA que o gene marcador. Qualquer progênie de semente que contém o gene marcador também poderia apresentar um fenótipo de semente e poderia ser facilmente identificada. Pode não ser necessário que tais se desenvolvam e sejam verificadas quanto à presença do gene marcador. Assim, apenas as sementes sem o fenótipo conferido pela seqüência de identificação se desenvolvem e/ou são avaliadas quanto à presenPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 28/102
21/61 ça do GOI. Dependendo se as sementes forem autofecundadas ou cruzadas, esse método reduz pelo menos 3X o número de sementes necessário para serem plantadas e verificadas para espécies de plantas autofecundadas ou 1X para espécies de plantas cruzadas.
[0059] Uma ampla gama de composições é conhecida pelos versados na técnica, essas podem ser usadas para silenciar um gene alvo utilizando vias relacionadas com RNAi. Uma modalidade consiste em montar um cassete de DNA que irá transcrever uma repetição invertida de seqüências, de modo a produzir um RNA de cadeia dupla (dsRNA), tipicamente, com pelo menos cerca de 19 a 21 pb de comprimento e é correspondente a uma parte de um ou mais genes almejados para silenciamento. O dsRNA pode ter cerca de 19 a 21 pb de comprimento e é correspondente a uma parte de um ou mais genes almejados para silenciamento. Esse cassete de DNA que inclui uma seqüência de identificação fica posicionado dentro do mesmo T-DNA que o gene marcador selecionável. Outros métodos para silenciar um gene conhecidos pelos versados na técnica incluem, porém sem caráter limitativo: co-supressão, anti-sentido, expressão de miRNAs (naturais ou engenheirados), expressão de siRNAs transatuantes, e expressão de ribozimas. Qualquer um desses métodos pode ser usado se as seqüências requeridas para efetuar o silenciamento de gene estiverem posicionadas no mesmo T-DNA que o gene marcador.
[0060] A seqüência de identificação pode aumentar ou diminuir o tamanho da semente. Em uma modalidade, a seqüência de identificação confere a infra-regulação de gene AP2 (por exemplo, GenBank U12546) por interferência de RNA anti-sentido ou RNA ou tecnologia de co-supressão (Jofuku et al., 2005), que resulta em sementes maiores que contêm a seqüência de identificação e os genes marcadores selecionáveis. Um tamanho de semente maior também pode ser obtido por expressão ectópica de um gene ARF2 (Schruff et al., 2006; por
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22/61 exemplo, GenBank Accessions NM_203251; NM_180913), ou fator de transcrição ANT (Mizukami and Fisher, 2000; por exemplo, GenBank NM_202701, NM_119937, NM_180024, NM_101474, NM_202110). Em outra modalidade, a seqüência de identificação conduz a infraregulação de um gene LEC2 (por exemplo, GenBank AF400123) ou Snf-1 (GenBank AB101657, AB101656, AB101655) por RNA antisentido ou RNAi ou tecnologia de co-supressão, que resulta em tamanho de semente reduzido (Mendoza et al., 2005; Radchuk et al., 2006). O tamanho de semente alterado pode ser facilmente classificado por peso, formato ou peneiragem por meios manuais e/ou mecânicos. [0061] Considera-se especificamente, que as técnicas de triagem automáticas podem ser implementadas com a presente invenção para a identificação de sementes que possuem um fenótipo detectável particular. Dessa maneira, grandes quantidades de sementes podem ser verificadas de maneira eficaz e as sementes desprovidas de uma seqüência de identificação podem ser coletadas. As técnicas automáticas podem ser mais rápidas, menos dispendiosas e mais precisas do que a confiança em especialistas humanos. Tais máquinas de classificação de semente que poderiam ser usadas dessa maneira foram descritas. Por exemplo, a Patente N° U.S. 4.946.046 descreve um aparelho para classificação de sementes de acordo com a cor. Nessa máquina, as sementes são classificadas de acordo com a cor ao colocar as sementes em fileiras uniformes de indentações em um tambor giratório e passar as sementes sob uma câmera de formação de imagens digital e uma fonte de luz. As imagens são lidas pela câmera e são passadas para um computador, que também recebe informações de um sensor de velocidade de tambor. O computador gera um sinal que gera um sopro de ar que passa através de uma abertura no fundo de uma endentação que contêm uma semente colorida para coletar tal semente. As sementes coletadas são alimentadas em uma tremonha
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23/61 de coleta, e as sementes não-coloridas em uma tremonha separada. [0062] Variando-se o comprimento de onda da fonte de luz usada para a detecção de sementes coloridas, bem como, filtros de barreira colocados entre a semente colorida e a câmera de detecção, potencialmente qualquer marcador de identificação poderia ser detectado com essa técnica. Por exemplo, para detectar as sementes que expressam GFP, o comprimento de onda de excitação está no espectro UV de luz azul, tipicamente em cerca de 395 nm. As fontes de luz adequadas para emissão de UV são bem conhecidas pelos versados na técnica, e incluem lâmpadas de xenônio ou mercúrio. Os conjuntos de filtro adequados também são conhecidos pelos versados na técnica, e incluem, por exemplo, um filtro excitador BP450-490, um divisor ótico cromático FT510, e um filtro de barreira BP515-565 (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY). Tais conjuntos de filtros e comprimentos de onda de emissão são discutidos em mais detalhes em Heim and Tsien, 1996, cuja descrição está especificamente incorporada aqui a título de referência em sua totalidade.
[0063] Mediante o uso de construtos inclusive uma ou mais seqüências de identificação, o pó seletivo pode ser estendido a múltiplos genes selecionáveis e/ou verificáveis e genes de interesse. Portanto, grandes números de sementes transgênicas, que representam uma variedade de eventos de transformação diferentes, podem ser verificados de maneira eficaz e apenas aquelas sementes que possuem (ou não possuem) um conjunto de seqüências de identificação podem ser selecionadas.
[0064] Um vetor de DNA recombinante pode ser, por exemplo, um segmento de DNA linear ou um plasmídeo circular fechado. O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contêm juntamente o DNA total que será introduzido no genoma da planta. As moléculas de ácido nucléico como
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24/61 apresentado aqui podem ser, por exemplo, adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em uma célula vegetal para conduzir a expressão de uma seqüência de codificação ligada ou outra seqüência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para essa finalidade, e a seleção do vetor apropriado irá depender principalmente do tamanho do ácido nucléico que será inserido no vetor e a célula hospedeira particular que será transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo de sua função e do vetor e célula vegetal particular com os quais será usado ou é compatível.
[0065] Inúmeros vetores adequados para transformação estável de células vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgênicas são bem conhecidos, por exemplo, Gelvin et al. (1990). Tipicamente, os vetores de expressão de plantas incluem, porém sem caráter limitativo, um ou mais genes de interesse unidades de transcrição, sendo que cada um inclui: uma região 5' não-traduzida, que inclui seqüências que controlam a transcrição (por exemplo, seqüências promotoras cisatuantes, tais como, intensificadores, o sítio de iniciação de transcrição, etc.) e tradução (por exemplo, um sítio de ligação de ribossomo) de uma seqüência de codificação de proteína ligada de modo operacional (quadro de leitura aberta, ORF); uma região 3' não-traduzida que inclui regiões reguladoras adicionais da extremidade 3' de genes de plantas (Thornburg et al., 1987); An et al., 1989), por exemplo, uma região 3' terminadora para aumentar a estabilidade de mRNA. Alternativamente, um vetor de expressão de plantas pode ser designado para a expressão de uma molécula de mRNA que pode, por exemplo, alterar a expressão genética da planta por um abordagem mediada por RNAi. Ademais, tais construtos incluem comumente uma unidade de transcrição de marcador selecionável e/ou verificável e, opcionalmente, a origem de replicação ou outras seqüências requeridas para a rePetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 32/102
25/61 plicação do vetor em uma células hospedeira bacteriana.
[0066] Os construtos também podem conter os segmentos de DNA de cadeia principal de plasmídeo que proporcionam função de replicação e seleção de antibióticos em células bacterianas, por exemplo, uma de origem Escherichia coli de replicação, tal como, ori322, uma origem com ampla faixa de hospedeiros de replicação, tal como, or/V ou oriRi, e uma região de codificação de um marcador selecionável, tal como, Spec/Strp que codifica Tn7 aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) que confere resistência à espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável, gentamicina (Gm, Gent). Para a transformação de plantas, a cepa bacteriana hospedeira é geralmente Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, LBA4404, EHA101, ou EHA105 que conduz um plasmídeo que possui uma função de transferência da unidade de expressão. Outras cepas conhecidas pelos versados na técnica de transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.
[0067] Os vetores de expressão de plantas incluem opcionalmente sinais de processamento de RNA, por exemplo, íntrons, que podem ser posicionados a montante ou a jusante de uma seqüência de codificação de polipeptídeo no transgene. Ademais, os vetores de expressão também podem incluir seqüências reguladoras adicionais da região 3' não-traduzida de genes de plantas. Essas regiões 3' nãotraduzidas contêm sinais de terminação de transcrição de mRNA. Outros elementos móveis contidos em vetores de expressão de plantas podem incluir seqüências líder 5', seqüências de sinal de trânsito, e seqüências de codificação.
[0068] Os vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também referidos como um marcador selecionável de plantas. Esse gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de célula vegetais transformadas desenvolvidas
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26/61 em um regime de cultura seletivo. Os genes de seleção típicos codificam as proteínas que conferem resistência a agentes seletivos, tais como, antibióticos inclusive herbicidas, ou outras toxinas, por exemplo, neomicina, metotrexato, dicamba, glufosinato, ou glifosato. Aquelas células que são corretamente transformadas com uma proteína heteróloga ou fragmento dessa produzem uma proteína que confere, por exemplo, resistência a fármaco e, assim, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de vários marcadores selecionáveis/verificáveis/classificáveis e genes que codificam os mesmos estão descritos em Miki and McHugh, 2004.
[0069] Um vetor de expressão para produzir um mRNA também pode conter um promotor induzível ou específico de tecido que é reconhecido na célula hospedeira vegetal e é ligado de modo operacional ao ácido nucléico que codifica a molécula de ácido nucléico, ou fragmento dessa, de interesse. Os promotores de plantas são discutidos abaixo.
[0070] Em uma modalidade, o vetor de transformação de plantas que é utilizado inclui uma molécula de DNA isolada e purificada que inclui um promotor heterólogo específico de semente ligado de modo operacional a uma ou mais seqüências de nucleotídeo da presente invenção. Em outra modalidade, o promotor é expresso por semente, porém não específico de semente. Um vetor de transformação de plantas pode conter seqüências de um ou mais genes permitindo, assim, a produção de mais de um mRNA em uma célula vegetal. Um versado na técnica irá avaliar facilmente que os segmentos de DNA podem ser combinados em um único segmento de DNA de compósito para a expressão em uma planta transgênica.
[0071] Acredita-se que os métodos adequados para a transformação de células hospedeiras para uso com a invenção incluem virtualmente qualquer método por meio do qual o DNA pode ser introduzido
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27/61 em uma célula (veja, por exemplo, Miki et al., 1993), tal como, por transformação de protoplastos (Patente n° U.S. 5.508.184; Omirulleh et al., 1993), por absorção de DNA mediada por dessecação/inibição (Potrykus et al., 1985), por eletroporação (Patente n° U.S. 5.384.253), por agitação com fibras de carbureto de silício (Kaeppler et al., 1990; Patente n° U.S. 5.302.523; e Patente n° U.S. 5.464.765), por transformação mediada por Agrobacterium (Patente n°s 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; 6.384.301) e por aceleração de partículas cobertas com DNA (Patente U.S. n°s 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; 6.403.865; Padgette et al. 1995), etc. Mediante a aplicação de técnicas, tais como essas, as células virtualmente de qualquer espécie podem ser transformadas de maneira estável. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em organismos transgênicos.
[0072] O método mais amplamente utilizado para introdução de um vetor de expressão nas plantas se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacterium (por exemplo, Horsch et al., 1985). Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens and A. rhizogenes, respectivamente, conduzem genes responsáveis pela transformação genética da planta. As descrições de sistemas e métodos de vetor de Agrobacterium para transferência de gene mediada por Agrobacterium são proporcionadas por inúmeras referências, inclusive Gruber et al., 1993; Miki et al., 1993, Moloney et al., 1989, e Patente U.S. n°s 4.940.838 e 5.464.763. Outras bactérias, tais como, Sinorhizobium, Rhizobium, e Mesorhizobium que interagem com plantas podem ser naturalmente modificadas para mediar a transferência genética a inúmeras plantas diferentes (Broothaerts et al., 2005). Essas bactérias simbióticas associadas às plantas podem se tornar competentes para transferência genética por aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado como de um vetor binário adequado. As seqüências que serão transferidas por
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28/61 meio de um método de transformação mediado por Agrobacterium incluem uma ou mais seqüências de margem, tais como, seqüências de margem direita (RB) e margem esquerda (LB) que geralmente definem a extensão do DNA transferido (T-DNA) que contém um ou mais genes que serão expressos em uma célula vegetal, e podem incluir adicionalmente uma seqüência de intensificador, tal como, uma seqüência de superestímulo (overdrive) (Toro et al., 1989) ou uma pluralidade de seqüências de superestímulo, como descrito no Pedido de Patente Provisório n° U.S. 60/831.814, incorporado aqui a título de referência.
[0073] As técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão estão descritas nas Patentes U.S. n°s 5.846.797, 5.159.135, 5.004.863, e 6.624.344. As técnicas para transformação de plantas Brassica, em particular, estão descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.750.871; e as técnicas para transformação de soja estão descritas, por exemplo, em Zhang et al., 1999, Patente US 6.384.301, e US 7.002.058. As técnicas para transformar milho estão descritas no documento. Alguns exemplos não-limitadores de plantas que podem encontrar uso com a invenção incluem alfalfa, cevada, feijões, beterraba, brócolis, repolho, cenoura, canola, couve-flor, aipo, repolho chinês, milho, algodão, pepino, feijoeiro, beringela, erva-doce, feijões cultivados, abóbora, alho-poró, alface, melão, aveia, quiabo, cebola, ervilha, pimenta, abobrinha, amendoim, batata, rabanete, arroz, sorgo, soja, espinafre, milho verde, beterraba sacarina, girassol, tomate, melancia, e trigo.
[0074] Um vetor ou construto também pode incluir vários elementos reguladores. A seqüência líder 5' não-traduzida pode ser proveniente do promotor selecionado para expressar a seqüência de gene heterólogo da molécula de DNA da presente invenção, e pode ser especificamente modificada se desejado para aumentar a tradução de
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29/61 mRNA. As regiões 5' não-traduzidas também podem ser obtidas a partir de RNAs virais de plantas (por exemplo, vírus do mosaico do tabaco, vírus etch do tabaco, vírus do mosaico do milho, vírus do mosaico da alfalfa) de genes eucarióticos adequados, genes de plantas (líder de gene de proteína de ligação a/b clorofila de trigo e milho), ou de uma seqüência genética sintética. A seqüência líder também poderia ser proveniente de um promotor não-relacionado ou seqüência de codificação. As seqüências líder úteis no contexto da presente invenção incluem o líder Hsp70 de milho (Patente n° U.S. 5.362.865 e Patente n° U.S. 5.859.347, incorporadas aqui a título de referência em sua totalidade), e o elemento omega TMV (Gallie et al., 1989). Exemplos de seqüências líder de tradução incluem líderes de proteína de choque térmico de milho e petúnia (Patente n° U.S. 5.362.865), líderes de proteína capsidial do vírus da planta, líderes de ribulose-bisfosfato carboxilase oxigenase (rubisco) da planta, GmHsp (Patente U.S. 5.659.122), PhDnaK (Patente U.S. 5.362.865), AtAntl, TEV (Carrington and Freed, 1990), AGRtunos (GenBank Accession V00087; Bevan et al., 1983), OsActl (patente U.S. 5641876), OsTPI (Patente n° US 7.132.528), e OsAct15 (Publicação n° US 20060162010), entre outros.
[0075] As seqüências íntron são conhecidas na técnica para ajudar na expressão de transgenes em células vegetais de monocotiledôneas. Exemplos de íntrons incluem íntron da actina de milho (Patente US 5.641.876), o íntron HSP70 de milho (ZmHSP70; Patente US 5.859.347; Patente US 5.424.412), e íntron TPI de arroz (OsTPI; Patente n° US 7.132.528), e são úteis na prática dessa invenção.
[0076] Um vetor também pode incluir uma seqüência de ácido nucléico de peptídeo de trânsito. Muitas proteínas localizadas no cloroplasto, inclusive aquelas envolvidas na síntese de carotenóide, são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas ao cloroplasto por um peptídeo de trânsito cloroplástico (CTP)
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30/61 que é removido após as etapas de importação. Exemplos de outras tais proteínas do cloroplasto incluem a pequena subunidade (SSU) de Ribulose-1,5,-bisfosfato carboxilase, e complexos de proteína I e proteína II captadores de luz. Foi mostrado in vivo e in vitro que as proteínas de não-cloroplasto podem ser direcionadas ao cloroplasto pelo uso de fusões de proteínas com CTP e essa seqüência CTP é suficiente para direcionar uma proteína ao cloroplasto. A incorporação de um peptídeo de trânsito cloroplástico adequado, tal como, Arabidopsis thaliana (At) EPSPS CTP (Klee et al., 1987) e Petunia hybrida (Ph.) EPSPS CTP (della-Cioppa et al., 1986) mostrou direcionar as seqüências de proteína heteróloga aos cloroplastos em plantas transgênicas. Os versados na técnica irão reconhecer que vários constructos quiméricas podem ser feitos, se necessário, para que utilizem a funcionalidade de uma CTP particular para importar um determinado produto genético em um cloroplasto. Outras CTPs que podem ser úteis na prática da presente invenção incluem CTPs derivadas de PsRbcS (Pisum sativum Rubisco small subunit CTP; Coruzzi et al., 1984); AtRbcS CTP (Arabidopsis thaliana Rubisco small subunit 1A CTP; CTP1; Patente U.S. 5,728,925); AtShkG CTP (CTP2; Klee et al., 1987); AtShkGZm CTP (CTP2synthetic; codon optimized for monocot expression; SEQ ID NO:14 of WO04009761); PhShkG CTP (Petunia hybrida EPSPS; CTP4; codon optimized for monocot expression; Gasser et al., 1988); TaWaxy CTP (Triticum aestivum granule-bound starch synthase CTPsynthetic, codon optimized for corn expression: Clark et al., 1991): OsWaxy CTP (Oryza sativa starch synthase CTP; Okagaki, 1992); NtRbcS CTP (Nicotiana tabacum ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit chloroplast transit peptide; Mazur, et al., 1985); ZmAS CTP (Zea mays anthranilate synthase alpha 2 subunit gene CTP; Gardiner et al., 2004); e RgAS CTP (Ruta graveolens anthranilate synthase CTP; Bohlmann, et al., 1995).
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31/61 [0077] Outros peptídeos de trânsito que podem ser úteis incluem a seqüência de sinal cab-m7 de milho (PCT WO 97/41228) e a seqüência de sinal glutationa reductase (Pisum sativum) da ervilha (PCT WO 97/41228).
[0078] O término da transcrição pode ser realizado por uma seqüência de DNA 3' não-traduzida ligada de modo operacional a um transgene recombinante (por exemplo, o gene de interesse, a seqüência de identificação que inclui um gene verificável, ou o gene marcador selecionável da planta). A região 3' não-traduzida de uma molécula de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para induzir a adição de nucleotídeos de adenilato à extremidade 3' do RNA.A região 3' não-traduzida pode ser obtida a partir de vários genes que são expressos em células vegetais. A região 3' da nopalina sintase não-traduzida (Fraley et al., 1983), é comumente usada nessa capacidade. As moléculas de poliadenilação de um gene RbcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al., 1984), AGRtu.nos (Genbank Accession E01312), E6 (Accession # U30508), glutelina do arroz (Okita et al., 1989), e TaHsp17 (gene da proteína de choque térmico de baixo peso molecular de trigo; Accession # X13431) em particular, podem ser úteis para uso com a invenção.
[0079] Para as modalidades da invenção onde o uso de um promotor constitutivo é desejado, qualquer promotor de plantas constitutivo bem conhecido pode ser usado. Os promotores de plantas constitutivos incluem, por exemplo, o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), que confere expressão constitutiva de alto nível na maior parte dos tecidos vegetais (veja, por exemplo, Odell et al., 1985), inclusive monocotiledôneas (veja, por exemplo, Dekeyser et al., 1990); Terada et al., 1990); o promotor da nopalina sintase (An et al., 1988), o promotor da octopina sintase (Fromm et al., 1989), promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor, promotor 35S do vírus do moPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 39/102
32/61 saico da escrofulária, promotor 1 da actina do arroz, promotor da manopina sintase, e um promotor de histona.
[0080] Para outras modalidades da invenção, os promotores de gene de planta bem conhecidos que são regulados em resposta aos sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento podem ser usados, inclusive promotores regulados por (1) calor (Callis et al., 1988), (2) luz (por exemplo, promotor rbcS-3A da ervilha, Kuhlemeier et al., 1989; promotor rbcS do milho, Schaffner and Sheen, 1991; ou promotor da proteína de ligação de clorofila a/b, Simpson et al., 1985), (3) hormônios, tal como, ácido abscísico (Marcotte et al., 1989), (4) cura (por exemplo, wunl, Siebertz et al., 1989); ou (5) produtos químicos, tais como, jasmonato de metila, ácido salicílico, etc. Também pode ser vantajoso empregar (6) promotores específicos de órgão (por exemplo, Roshal et al., 1987; Schernthaner et al., 1988; Bustos et al., 1989).
[0081] Há uma grande variedade de seqüências promotoras de plantas que pode ser usada para conduzir a expressão específica de tecido de polinucleotídeos em plantas transgênicas. De fato, em modalidades particulares da invenção, o promotor usado é um promotor específico de semente. O promotor de β-conglicinina (Chen et al., 1989) ou outros promotores específicos de semente, tal como, o promotor de napina, que são regulados durante o amadurecimento da semente da planta (Kridl et al., 1991; Kohno-Murase et al., 1994), cevada Hv.Per1 (Stacey et al., 1996), faseolina (Bustos et al., 1989), inibidor de tripsina de soja (Riggs et al., 1989), ACP (Baerson et al., 1993), estearoil-ACP desaturase (Slocombe et al., 1994), subunidade α' de soja de βconglicinina (P-Gm7S, veja, por exemplo, Chen et al., 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, veja, por exemplo, SEQ ID NO: 1, 2, e 3, Publicação de Pedido U.S. 20030229918), o promotor de globulina (veja, por exemplo, Belanger and Kriz, 1991), subunidade alfa de soja de βPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 40/102
33/61 conglicinina (7S alfa; Patente U.S. 6.825.398, incorporado a título de referência) e promotor de oleosina L3 Zea mays (P-Zm.L3, veja, por exemplo, Hong et al., 1997; veja, também, Patente n° U.S. 6.433.252, cuja descrição está especificamente incorporada aqui a título de referência).
[0082] As zeínas consistem em um grupo de proteínas de armazenamento encontrado em endosperma de Zea mays. Os clones genômicos de genes de zeína foram isolados (Pedersen et al., 1982; Patente U.S. 6.326.527), e os promotores desses clones, inclusive 15 kDa, 16 kDa, 19 kDa, 22 kD, 27 kDa, e genes gama, também poderiam ser usados. Outros promotores conhecidos para funcionar, por exemplo, em Zea mays incluem os promotores dos seguintes genes: waxy (Russell and Fromm, 1997; Shure et al., 1983), Brittle (Giroux et al., 1994), Shrunken 2, enzimas de ramificação I e II, amido sintases, enzimas de desramificação, oleosinas, glutelinas, e sacarose sintases. Outro promotor de expressão de endosperma de Zea é o promotor do gene glutelina do arroz, mais particularmente, o promotor Osgt-1 (Zheng et al., 1993). Exemplos de tais promotores em arroz incluem aqueles promotores das unidades ADPGPP, o grânulo ligado e outra amido sintase, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sucrose sintases (Yang et al., 1990), e Betl1 (camada de transferência de endosperma basal) e globulina 1.
[0083] Exemplos de outros promotores que podem ser úteis com a presente invenção estão descritos na Patente U.S. 6.437.217 (promotor RS81 de milho), Patente U.S. 5.641.876 (promotor de actina do arroz; OsAct1), Patente U.S. 6.426.446 (promotor RS324 de milho), Patente U.S. 6.429.362 (promotor PR-1 de milho), Patente U.S. 6.232.526 (promotor A3 de milho), Patente U.S. 6.177.611 (promotores de milho constitutivos), Patentes U.S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), Patente U.S. 6.433.252 (promotor de olePetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 41/102
34/61 osina L3 de milho), Patente U.S. 6.429.357 (promotor da actina 2 do arroz bem como um íntron de actina 2 do arroz), Patente U.S. 5.837.848 (promotor específico de raiz), Patente U.S. 6.294.714 (promotores induzíveis por luz), Patente U.S. 6.140.078 (promotores induzíveis por sal), Patente U.S. 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno), Patente U.S. 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), Patente U.S. 6.635.806 (promotor gama-coixina), e Patente U.S. 7.151.204 (promotor de cloroplasto aldolase de milho). Os promotores adicionais que podem encontrar uso são promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., 1987), o promotor de octopina sintase (OCS) (que é conduzido sobre plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus, tal como, o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., 1987), o promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985), o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al., 1987), o promotor de sucrose sintase (Yang et al., 1990), o promotor de complexo de gene (Chandler et al., 1989), e o promotor de gene de proteína de ligação a/b, etc. Na presente invenção, CaMV35S com seqüências de intensificador (e35S; Patentes U.S. n°s 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; e 5.530.196), FMV35S (Patentes U.S. 6.051.753; 5.378.619), caulimovírus das estrias cloróticas no amendoim (PClSV; Patente US 5.850.019), At.Act 7 (Accession # U27811), At.ANT1 (Publicação de Pedido de Patente US 20060236420), FMV.35S-EF1a (Publicação de Pedido de Patente U.S. 20050022261), eIF4A10 (Accession # X79008) e AGRtu.nos (GenBank Accession V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al., 1983), triose fosfato isomerase citosólica do arroz (OsTPI; Patente N° US 7.132.528), e gene da actina 15 do arroz (OsAct15; Publicação de Pedido de Patente U.S. 20060162010) os promotores podem ser de vantagem particular. Em alguns casos, por exemplo, OsTPI e OsAct 15, um promotor pode incluir um 5'UTR
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35/61 e/ou um primeiro íntron. Outros promotores úteis na prática da invenção que são conhecidos por um versado na técnica também são contemplados pela invenção.
[0084] Um vetor de expressão de plantas também pode incluir um cassete de gene marcador verificável ou classificável que pode ser usado na presente invenção para monitorar a segregação de células ou a progênie de (perda de) de expressão. Os marcadores exemplificativos são conhecidos e incluem β-glucuronidase (GUS) que codifica uma enzima de vários substratos cromogênicos (Jefferson et al., 1987a; Jefferson et al., 1987b); e gene de local R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al., 1988); um gene da βlactamase (Sutcliffe et al., 1978); um gene que codifica uma enzima daqueles vários substratos cromogênicos é conhecido (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow et al., 1986); um gene xy1E (Zukowsky et al., 1983) que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter os catecóis cromogênicos; um gene da α-amilase (Ikatu et al., 1990); um gene da tirosinase (Katz et al., 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona que, sucessivamente, se condensa em melanina; proteína verde fluorescente (Elliot et al., 1999) e uma α-galactosidase. Um gene marcador verificável ou classificável pode codificar o mesmo produto de gene que uma seqüência de identificação que inclui um gene verificável ou classificável ou um produto de gene diferente. Entretanto, a seqüência de identificação é expressa em óvulo, pólen ou tecidos de sementes, enquanto o gene marcador verificável ou classificável é expresso durante o processo de identificação de células vegetais transformadas. A seqüência de identificação também pode ser expressa de maneira constitutiva, porém apenas conduz um fenótipo em óvulo, pólen ou tecidos de sementes.
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36/61 [0085] As plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir de uma célula vegetal transformada por métodos bem conhecidos no campo de cultura de célula vegetal. Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação de Agrobacterium contém tipicamente uma única seqüência de DNA recombinante simples inserida em um cromossoma e é referida como um evento transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como heterozigóticas da seqüência exógena inserida. Uma planta transgênica homozigótica com relação a um transgene pode ser obtida ao acasalar sexualmente (autofecundar) uma planta transgênica segregante independente que contém uma única seqüência genética exógena na mesma, por exemplo, uma planta F0, para produzir a semente F1. Um quarto da semente F1 produzido será homozigótico com relação ao transgene. A germinação de semente F1 resulta em plantas que podem ser testadas para zigosidade, utilizando tipicamente uma análise SNP ou uma análise de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (ou seja, uma análise de zigosidade).
[0086] Inúmeras seqüências de identificação podem ser usadas, por exemplo, os genes cuja expressão pode resultar em um fenótipo visível, inclusive o uso de gus, gfp, e luc (veja, por exemplo, Ow et al., 1986; WO 97/41228 e Patente U.S. 6.583.338; por exemplo, M26194; M15077). Um gene da levansucrase, sacB (Caimi et al., 1996; por exemplo, X02730) que resulta em um fenótipo de semente contraído, ou um gene da pirofosfatase (Hajirezaei et al., 1999) que resulta em inibição de germinação, também pode ser empregado. Os genes que codificam a fitoeno sintase (crtB) são conhecidos na técnica, inclusive aqueles de Erwinia uredovora (por exemplo, Misawa et al., 1990; Sandmann and Misawa, 1992; Patentes U.S. 5.429.939; 6.429.356), e Pantoea/Enterobacter agglomerans (por exemplo, GenBank M38423; M87280), entre outros. A expressão específica de semente de crtB
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37/61 que resulta em coloração laranja foi descrita (Shewmaker et al., 1999; Patente U.S. 6,429,356).
[0087] A maior parte dos transgenes que produzem fenótipos de semente pleiotrópicos pode ser usada como um gene marcador visível ligado a um marcador selecionável para identificar o gene isento de marcador de interesse de sementes positivas. O fenótipo visível pode ser produzido por superexpressão ectópica de um transgene ou resultar de infra-regulação de genes endógenos de via metabólica por RNA anti-sentido, interferência de RNA ou tecnologia de co-supressão. [0088] As seguintes definições e métodos são proporcionados para definir melhor a presente invenção e guiar os versados na técnica na prática da presente invenção. Exceto onde especificamente observado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos versados na técnica relativa. As definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al. (1991); e Lewin (1994). Utiliza-se a nomenclatura de bases de DNA como apresentado em 37 CFR § 1.822.
[0089] CP4, aroA:CP4, AGRTU. aroA:CP4, CP4 EPSPS e
EPSPS CP4 s referem ao gene da EPSP sintase ou proteína purificada a partir da cepa de Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) CP4 que quando expressa em plantas confere tolerância a formulações herbicidas contendo glifosato e glifosato (Patente N° U.S. 5.633.435, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade). A seqüência genética pode ser nativa ou modificada para expressão aumentada em plantas.
[0090] Um segmento de DNA se refere a uma região de seqüência de DNA de um construto de DNA. Um segmento de DNA pode estar dentro, entre, ou flanqueando as moléculas de T-DNA encontradas em um construto usada para a transformação de célula vegetal mediada por Agrobacterium. Por exemplo, um segmento de DNA pode conPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 45/102
38/61 ter elementos genéticos para a replicação de plasmídeos em bactérias ou outros vários elementos e cassetes de expressão do construto de DNA designado para uso na transformação de célula vegetal. Assim, um cassete de DNA pode compreender um segmento de DNA, inclusive elemento(s) para a expressão da seqüência de DNA em uma célula.
[0091] Uma proteína de fusão se refere a uma fusão tradicional expressa como uma única unidade, produzindo ainda um produto genético que confere os fenótipos da proteína codificada pelas seqüências genéticas de partida não-fundidas.
[0092] Um ácido nucléico isolado é substancialmente purificado ou separado de outras seqüências de ácido nucléico na célula do organismo onde o ácido nucléico ocorre naturalmente, ou seja, outro DNA e RNA cromossomal e extracromossomal, por métodos de purificação de ácido nucléico convencionais. O termo também inclui ácidos nucléicos recombinantes e ácido nucléicos quimicamente sintetizados. [0093] O termo gene de resistência a glifosato se refere a qualquer gene que, quando expresso como um transgene em uma planta, confere a capacidade de tolerar níveis do herbicida glifosato que poderiam de outro modo danificar ou matar a planta. Qualquer gene com tolerância a glifosato conhecido pelo versado na técnica é adequado para uso na prática da presente invenção. O glifosato (inclusive qualquer forma herbicidamente ativa de N-fosfonometilglicina e qualquer sal dessa) inibe a enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Uma variedade de enzimas EPSPS nativas e variantes foi expressa em plantas transgênicas para conferir tolerância a glifosato, sendo que qualquer uma dessas pode ser usada na invenção. Exemplos de algumas dessas EPSPSs incluem aquelas descritas e/ou isoladas de acordo com a Patente n° U.S. 4.940.835, Patente n° U.S. 4.971.908, Patente n° U.S. 5.145.783, Patente n° U.S. 5.188.642, PaPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 46/102
39/61 tente n° U.S. 5.310.667, e Patente n° U.S. 6.803.501. Essas também podem ser derivadas de uma classe estruturalmente distinta de genes EPSPS não-homólogos, tais como, os genes EPSPS da classe II isolados da cepa de Agrobacterium sp. CP4 (AGRTU.aroA:CP4).
[0094] O termo seqüência de identificação se refere a um ácido nucléico que codifica um produto que confere um fenótipo detectável, tal como, alteração em semente ou cor de gameta, opacidade ou translucidez, fluorescência, textura, tamanho, formato, capacidade de germinação, ou viabilidade ou outro produto de metabolismo de célula ou semente. A seqüência de identificação pode incluir uma seqüência de nucleotídeo (por exemplo, um fragmento de gene) que pode conferir um fenótipo através da infra-regulação da expressão de outro gene, tal como, através de um processo mediado por RNAi. Em algumas modalidades, a seqüência de identificação inclui um gene verificável, tal como, gene gusA, gfp, ou crtB. Em uma modalidade particular, a seqüência de identificação inclui um gene crtB que codifica uma fitoeno sintase de Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans; GenBank M38423, incorporada aqui a título de referência; e a Patente U.S. n°s 5.429.939, 6.429.356). A seqüência de identificação é fisicamente ligada a um gene marcador selecionável, verificável e/ou classificável da planta, tal como, um que codifica a resistência a antibiótico ou tolerância à herbicida. A seqüência de identificação pode conferir um fenótipo detectável (por exmeplo, verificável ou selecionável) em semente. [0095] Uma primeira seqüência de ácido nucléico é conectada ou ligada de modo operacional a uma segunda seqüência de ácido nucléico quando a primeira seqüência de ácido nucléico for colocada em uma relação funcional com a segunda seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor é ligado de modo operacional a uma seqüência de codificação de proteína se o promotor afetar a transcrição ou expressão da seqüência de codificação. Geralmente, as seqüênPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 47/102
40/61 cias de DNA ligadas de modo operacional são contíguas e, quando necessário unem duas regiões de codificação de proteína, e estão no mesmo quadro de leitura.
[0096] O termo planta inclui qualquer planta superior e progênie da mesma, inclusive monocotiledôneas (por exemplo, lírio, milho, arroz, trigo, cevada, etc.), dicotiledôneas (por exemplo, soja, algodão, tomate, canola, batata, Arabidopsis, tabaco, etc.), gimnospermas (pinhos, abetos, cedros, etc.) e inclui partes de plantas, inclusive unidades reprodutivas de uma planta (por exemplo, sementes, bulbos, tubérculos, ou outras partes ou tecidos daquela planta podem ser reproduzidas), fruto, flores, etc.
[0097] Um ácido nucléico recombinante é feito por uma combinação artificial de dois segmentos, de outra forma, separados de seqüência, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucléicos por técnicas de engenharia genética.
[0098] Os termos construto de DNA ou vetor de DNA se refere a qualquer plasmídeo, cosmídeo, vírus, que replica livremente a seqüência, fago, ou outro DNA ou RNA de cadeia simples ou de cadeia ramificada circular derivado de qualquer fonte que inclui uma ou mais seqüências de DNA, tais como, promotores, seqüências de codificação de proteínas, regiões 3' não-traduzidas, etc., que foram ligados de maneira funcionalmente operativa por técnicas de DNA recombinantes. Os vetores de DNA recombinante para a transformação de plantas são comumente plasmídeos circulares de cadeia dupla capazes de replicação em uma célula bacteriana. As composições e métodos convencionais para produzir e utilizar construtos de ácido nucléico recombinantes são bem conhecidos, por exemplo, Sambrook et al., 1989; e Ausubel et al., 1992 (com atualizações periódicas), e Clark et al. (1997), entre outros.
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41/61 [0099] O termo promotor ou região de promotor se refere a uma seqüência de ácido nucléico, geralmente encontrada a montante (5') de uma seqüência de codificação que controla a expressão da seqüência de codificação ao controlar a produção de RNA mensageiro (mRNA) ao proporcionar o sítio de reconhecimento para a RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para o início da transcrição no sítio correto. Como contemplado aqui, um promotor ou região promotora inclui variações de promotores derivados por meio de ligação a várias seqüências reguladoras, mutagênese aleatória ou controlada, e adição ou duplicação de seqüências de intensificador. Uma região promotora é responsável pela condução da transcrição de seqüências de codificação sob seu controle quando introduzidas em um hospedeiro como parte de um vetor recombinante adequado, como mostrado por sua capacidade de produzir mRNA.
[00100] Regeneração se refere ao processo de desenvolvimento de uma planta de uma célula vegetal (por exemplo, protoplasto ou explante da planta).
[00101] Marcador selecionável se refere a uma seqüência de ácido nucléico cuja expressão confere um fenótipo que facilita a identificação de células que contêm a seqüência de ácido nucléico. Os marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a produtos químicos tóxicos (por exemplo, resistência a antibiótico), ou conferem uma característica visualmente diferenciada (por exemplo, alterações de cor ou fluorescência).
[00102] Os genes marcadores selecionáveis da planta dominante incluem genes que codificam genes de resistência a antibiótico (por exemplo, resistência à higromicina, imidazolinona, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina ou espectinomicina); e genes de resistência à herbicida (por exemplo, fosfinotricina acetiltransferase, ALS modificado, BAR, EPSPSs de classe I modificadas, EPSPSs de classe
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II, DMOs), entre outros.
[00103] Os genes que codificam um marcador secretável cuja secreção pode ser detectada como um meio para identificar ou selecionar as células transformadas estão incluídos dentro dos termos genes marcadores classificáveis ou genes marcadores verificáveis. Exemplos desses incluem marcadores que codificam um antígeno secretável que pode ser identificado por interação de anticorpo, ou ainda enzimas secretáveis que podem ser detectadas de forma catalítica. As proteínas secretáveis podem ser divididas em inúmeras classes, inclusive pequenas proteínas difusíveis que são detectáveis, (por exemplo, por ELISA), pequenas enzimas ativas que são detectáveis em uma solução extracelular (por exemplo, α-amilase, β-lactamase, fosfinotricina acetiltransferase), ou proteínas que são inseridas ou aprisionadas na parede celular (tais como, proteínas que incluem uma seqüência líder tal como aquela encontrada na unidade de expressão de extensão ou tabaco PR-S). Outros genes marcadores selecionáveis e/ou verificáveis possíveis tornar-se-ão óbvios pelos versados na técnica. [00104] 'T-DNA se refere a uma molécula de DNA que se integra no genoma de uma planta através de Agrobacterium ou outro método de transformação mediada por Rhizobia. Pelo menos uma extremidade da molécula de T-DNA é flanqueada por pelo menos uma região de margem do T-DNA de um plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacterium. Essas de regiões de margem são geralmente referidas como as regiões de margem direita (RB) e margem esquerda (LB) e se apresentam como variações em seqüência de nucleotídeo e comprimento dependendo de sua fonte (por exemplo, cepas produtoras de nopalina ou octopina de Agrobacterium). As regiões de margem comumente usadas em construtos de DNA designadas para transferir transgenes em plantas possuem, geralmente, centenas de polinucleotídeos de comprimento e incluem um sítio de corte onde a virD2 endonuclease derivada de
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43/61 plasmídeo auxiliar Ti ou Ri digere o DNA e se liga de maneira covalente à extremidade 5' após a formação de T-filamento para guiar a integração de T-filamento no genoma de uma planta. A(s) molécula(s) de T-DNA geralmente contêm um ou mais cassetes de expressão de plantas.
[00105] O termo transgene se refere a qualquer seqüência de ácido nucléico não-nativa a uma célula ou organismo transformada na dita célula ou organismo. Transgene também pode se referir a qualquer seqüência endógena que é ectopicamente expressa ao modificar a seqüência de codificação ou seqüências reguladoras. Transgene também inclui as partes de componente de um gene de planta nativo modificado pela inserção de uma seqüência de ácido nucléico nãonativa ou nativa por recombinação direta.
Exemplos [00106] Os versados na técnica irão avaliar as diversas vantagens dos métodos e composições proporcionadas pela presente invenção. Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser observado pelos versados na técnica que os procedimentos descritos nos exemplos a seguir representam procedimentos descobertos pelos inventores que funcionam bem na prática da invenção, e assim podem ser considerados para constituir os modos preferidos para sua prática. Entretanto, os versados na técnica devem avaliar, considerando a presente descrição, que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas descritas e ainda assim obter um resultado parecido ou similar sem que se abandone o espírito e escopo da invenção. Todas as referências citadas aqui estão incorporadas aqui a título de referência na medida em que essas suplementam, explicam, proporcionam um perfil ou ensinam a metodologia, técnicas ou composições empregadas aqui.
Exemplo 1
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Preparação de Vetores de 2T-DNA com uma Seqüência de Identificação e Gene Marcador, e um Gene de Interesse [00107] Dois vetores de expressão de plantas de T-DNA, pMON67465, pMON101338 e pMON101339 (Figura 1), foram construídos de acordo com o procedimento de clonagem molecular padrão (Sambrook et al., 1989). Um T-DNA inclui um promotor 35S de CaMV ligado de modo operacional a um gene nptII que codifica a resistência à canamicina e um promotor 35S de CaMV ligado de modo operacional a um gene repórter de GUS. O outro T-DNA compreende um cassete de napina:ctp-crB: napin 3' e um cassete de EPSPS 35S:ctp:CP4, que confere resistência a glifosato. O crtB em pMON67465 com origem de replicação oriV foi conduzido por um promotor de napina específico de semente de 1,8 kb - e um terminador de napina de 1 kb de Brassica napus. O crtB em pMON101338 com replicon oriV em pMON101339 com origem de replicação de pRi foi conduzido por uma versão mais curta de promotor de napina (1 kb) e terminador (0,3 kb). O gene crtB, que codifica uma fitoeno sintase de Erwinia sp. confere cor laranja à semente de soja sem afetar a freqüência de transformação (Figura 3).
Exemplo 2
Transformação e Regeneração de Explantes de Soja com pMON67465 [00108] Os tecidos de soja (cv. A3244) foram transformados com pMON67465 (Figura 1) através de um método mediado por Agrobacterium, essencialmente como descrito antes (Patente U.S. 6.384.301, incorporada aqui a título de referência). Resumidamente, os explantes de meristema de soja cortados manualmente foram cocultivados com Agrobacterium durante 2 a 4 dias a 23°C, transferidos sobre o me io sólido de WPM com 75 μΜ de seleção de glifosato em um PLANTCON e cultivados a 28°C sob um período claro/escuro 16/8. Após duas sePetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 52/102
45/61 manas, os explantes foram transferidos para meio de WPM fresco e cultivados até a colheita do broto. Após 2 meses, os brotos com true trifolia foram cortados e cultivados em meio BRM de enraizamento durante 2 a 4 semanas. As mudas enraizadas se desenvolveram em estufa para amadurecimento da semente. Entre 40 eventos analisados, 72,5% apresentaram co-transformação com ambos os T-DNAs. 45% dos 40 eventos continham tanto genes nptlI como gus. O evento A33908, que contém T-DNAs de pMON67465, foi adicionalmente analisado.
[00109] Os eventos adicionais com plasmídeo pMON67465 foram obtidos por retransformação do plasmídeo na mesma cultivar A3244 e 13 linhagens transgênicas foram obtidas com freqüência de transformação de 0,22%. Sete dentre 13 linhagens são isentas de marcador e positivas de gene de interesse após analisar as sementes com aparência normal através de PCR em termos de presença ou ausência de um gene marcador gus ou CP4 (Figura 6). As sementes laranja de plantas R0 também foram analisadas por PCR em termos de presença do gene crtB e gene marcador CP4. Todas as sementes laranja, porém três foram consideradas positivas tanto por crtB como CP4 (Figura 7), apesar de nenhuma semente de aparência normal (Figura 7, células brancas) continham genes CP4 ou crtB, que indicam que o fenótipo de crtB está estreitamente ligado ao gene marcador CP4 selecionável. [00110] Assim, o uso de uma construto de 2T-DNA com uma seqüência de identificação inclusive um gene verificável ligado a um gene marcador selecionável permite uma triagem e seleção mais eficaz de eventos transgênicos que contêm um gene de interesse, embora desprovidos de seqüências que codificam um marcador selecionável. Uma comparação exemplificativa entre uma abordagem baseada em ligação-Southern (Padrão 2T) e uma classificação baseada em marcador (ou seja, baseada em seqüência de identificação) para a identifiPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 53/102
46/61 cação da progênie da semente em que um gene de interesse e um marcador selecionável foram independentemente segregados é encontrada na Figura 8. O uso da abordagem de seqüência de identificação permite a triagem de naus eventos transgênicos e mais progênie de cada evento para identificar a progênie útil para análise adicional. Exemplo 3
Expressão de CrtB/GUS/CP4 em Evento de Soja A33908 e Progênie R1 de Semente [00111] A inspeção visual de tecidos de evento A33908 (Figura 2) indicou que os caules e folhas expandidas jovens apresentaram um molde laranja. O tecido da folha e da raiz era de outro modo fenotipicamente normal em plantas que expressam CrtB. Os tegumentos da semente da planta R0 (ou seja, a geração de R1) apresentaram leve expressão de CrtB, enquanto os cotilédones de semente derivada de A33908 apresentaram uma cor laranja diferente e alguns com um fenótipo rugoso (Figura 3).
[00112] Doze sementes R1 imaturas do evento A33908 foram dissecadas do tegumento e submetidas a ELISA CP4-EPSPS, e análises de CrtB e visuais de GUS (Figura 4). A segregação dos fenótipos EPSPS de CrtB, GUS, e CP4 foi evidente. 9/12 da semente foram positivos em todas as três análises. 1/12 da semente era EPSPS CrtB e CP4 positivo, porém GUS negativo, mostrando a segregação de dois T-DNAs de pMON67465, com perda do gene gus. 2/12 da semente foram ELISA CP4-EPSPS negativas. Tanto a semente foi CrtB negativo como GUS positivo, mostrando assim a ligação entre a seqüência de identificação (crtB) e o gene marcador CP4-EPSPS selecionável, e a segregação desses locais transgênicos do local gus. A razão fenotípica na segregação da semente foi compatível com a segregação de mendeliana de dois locais dominantes.
Exemplo 4
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Análise Visual de Semente R1 [00113] As sementes maduras de A33908 foram visualmente analisadas em termos de cor, tamanho e formato (Figura 5). Uma mistura de (i) semente normal isenta de marcador (por exemplo, amarela e lisa); (ii) laranja e lisa; e (iii) laranja e rugosa foi observada.
Exemplo 5
Análise de PCR sobre a Semente GUS Positivo [00114] INVADER PCR (por exemplo, Mein et al., 2000) foi usado para acompanhar a segregação dos genes CP4-EPSPS, crtB, e gus distribuídos por pMON67465 em semente de plantas transgênicas de soja. O evento A33908 foi determinado por conter uma única cópia do gene marcador CP4-EPSPS e uma única cópia do gene NPTII. A segregação de semente laranja:normal seguiu uma razão esperada 3:1 no evento A33908 (Tabela 1).
Tabela 1: Fenótipo e genótipo de progênie de plantas transgênicas
Linhagem Invasor CP4 Invasor NPT II Contagem de semente Laranja/Normal Contagem de semente Laranja/Normal esperada 3:1 qui- quadrado
GM 1 1 86/26 84/28 0,19
GM 2 1 98/56 115,5/38,5 10,61
GM 1 1 130/72 151,5/50,5 12,20
GM 1 2 134/56 142,5/47,5 2,03
GM 2 0 62/30 69/23 2,84
GM 1 2 77/25 76,5/25,5
GM A339 2 2 79/40 89,25/29,75 4,71
GM A339 2 4 57/18 56,25/18,75 0,04
Exemplo 6
Uso de ATP PFK como uma Seqüência de Identificação [00115] Para grãos ricos em amido inclusive milho, a manipulação
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48/61 de metabolismo de açúcar/amido que resulta em um fenótipo de desenvolvimento de semente rugosa ou abortada pode ser utilizada. A expressão específica de semente de sacB (Caimi et al. 1996), ou expressão específica de semente de fosfofrutoquinase dependente de ATP de levedura (ATP PFK; por exemplo, Número de acesso no GenBank NC_003423, bases 2297466..2300294) em espigas de milho resulta em desenvolvimento de grão abortado (Figura 12). O construto pMON99575 que contém o marcador CP4 selecionável e ATP-PFK pode ser diretamente usada para a co-transformação com uma construto de T-DNA que contém um gene de interesse ao misturar as células de duas cepas de Agrobacterium, cada uma incluindo um desses construtos e transformar uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada. Alternativamente, o cassete ATP-PFK de expressão específica de semente pode ser subclonado em uma construto de 2T-DNA como uma seqüência de identificação, para identificação eficaz de sementes isentas de marcador. Os grãos que contêm esse gene são extremamente rugosos e não germinam. Apenas os grãos isentos de seqüência de identificação e isentos de gene marcador mostram aparência normal.
Exemplo 7
Uso de Genes Envolvidos em Síntese de Porfirina como Seqüências de identificação [00116] As uroporfirinogênio III (uro'gen) metil transferases (SUMT) dependentes de S-adenosil-L-metionina produzem compostos porfirinóides fluorescentes vermelho-claro quando superexpressas em E. coli, levedura, e células de CHO. Essa propriedade permitiu a seleção visual de colônias de E. coli transformadas (Rossner & Scott 1995) e a classificação automática de levedura transformada e células CHO (Wildt & Deuschle 1999). Essa fluorescência é o resultado de acúmulo intracelular de uro'gen di- e tri-metilado (diidrosiroidroclorina e trimetilPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 56/102
49/61 pirorocorfina), ambos são compostos encontrados em vias de síntese de porfirina (ou seja, clorofila e cobalamina).
[00117] As células transformadas com cobA que codifica SUMT a partir de Propionibacterium freudenreichii (GenBank accession U13043; incorporado aqui a título de referência) produzem um sinal fluorescente com picos de absorção em 384 nm e 500 nm juntamente com uma faixa de emissão em 605 nm. Os porfirinóides fluorescentes gerados pela metil transferase de cobA uro'gen possuem uma boa assinatura espectral para produzir o material vegetal. A excitação tanto de 384 como 500 nm evita uma forte absorção de clorofila e a emissão vermelha resultante é facilmente detectada como possuindo um deslocamento de Stokes substancial (da origem de absorção de 500), porém não se sobrepõe com a autofluorescencia da clorofila na vermelha extrema (Haseloff, 1999).
[00118] A terminação carbóxi de proteínas SUMT de milho (GenBank D83391), Arabidopsis Upm1 (GenBank L47479), e E. coli CysG (GenBank X14202) são significativamente similares às proteínas codificadas por genes de P. freudenreichii (cobA), Pseudomonas denitrificans (cobA; GenBank M59236), e de Synechocystis sp. (anteriormente Anacystis nidulans; GenBank X70966), cada uma incorporada aqui a título de referência (Sakakibara et al. 1996), e podem ser usadas de maneira similar.
[00119] Um construto inclusive um promotor com expressão de b núcleo e um gene que codifica CobA, ou uma proteína similar com atividade de SUMT, permite o uso de tal gene como uma seqüência de identificação ao verificar (a ausência de) de fluorescência vermelha visível em semente de milho, por exemplo. As siroheme sintases de plantas foram relatadas como localizadas no cloroplasto (Leustek et al., 1997). Assim, o uso de um gene de biossíntese de porfirina como uma seqüência de identificação pode incluir o uso de um peptídeo de
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50/61 trânsito cloroplástico para dirigir o produto genético ao cloroplasto. O construto pode ser diretamente usado como uma seqüência de identificação, e um T-DNA que compreende tal seqüência de identificação e um marcador selecionável podem ser, por exemplo, co-transformados com um segundo construto que compreende um T-DNA que contém um gene de interesse ao misturar duas cepas de Agrobacterium, sendo que cada uma contém um desses construtos, e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada. Um cassete de expressão de SUMT também pode ser rapidamente subclonado em outros vetores de 2 T-DNA, ou em um vetor designado para uso em transformação mediada por microprojétil, e usado como uma seqüência de identificação por um versado na técnica.
Exemplo 8
Uso de Silenciamento de Gene para Produzir um Fenótipo de Semente Detectável [00120] Uma repetição invertida posicionada dentro de um íntron do cassete de gene marcador pode resultar em silenciamento eficaz de gene em células vegetais. Isso é descrito em detalhe na Publicação de Pedido n° U.S. 2006/0200878 (por exemplo, Figuras 7, 8, 9, incorporada aqui a título de referência). Para testar se um dsRNA codificado por repetições invertidas colocado dentro de um íntron é capaz de obter o silenciamento do gene, as repetições invertidas de um segmento de ~400 pb do gene da luciferase (SEQ ID NO:1) foram colocadas no íntron do promotor de actina1 do arroz em um cassete de gene EPSPSCP4 (pMON73874) e a capacidade do construto suprimir o gene da luciferase em uma transformação temporária de protoplastos de folha de milho foi testada. Como um controle, um plasmídeo similar foi testado, exceto pelo fato que o controle de plasmídeo possuía repetições invertidas de um segmento do gene GUS em vez do gene da luciferase (pMON73875). Por fim, como um controle adicional, pMON25492,
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51/61 que é idêntico exceto pelo fato de não possuir repetições invertidas, também foi empregado (Figura 13).
[00121] Quando esses três plasmídeos foram testados em um sistema de silenciamento de gene temporário de protoplasto de folha de milho para a supressão de luciferase de vaga-lume e normalização da expressão de um controle interno de RENILLA luciferase (Promega Corp., Madison, WI), foi observado que o plasmídeo com dsRNA que codifica repetições invertidas dentro do íntron (pMON73874) foi capaz de suprimir a luciferase relativa aos controles pMON73875 e pMON25492 (Figura 14). O experimento foi repetido pela segunda vez com resultados similares.
[00122] Para testar se um fenótipo de grão de milho pode ser gerado através de uma abordagem de silenciamento de gene, foram feitos construtos designados para suprimir o gene Waxy. pMON81990 contém repetições invertidas de parte do gene Waxy. As plantas de milho transgênicas que contêm pMON81990 apresentaram silenciamento do gene Waxy em pelo menos 65% das plantas R0 independentes, como determinado ao colorir o pólen e grãos com iodo para produção de amido. Em comparação, as plantas que contêm pMON81993, que expressa um fragmento de sentido de Waxy, não apresentam silenciamento eficaz do gene Waxy.
[00123] O silenciamento de genes que codificam zeínas (proteínas de armazenamento de semente), que resulta em um fenótipo visível também pode ser mostrado. pMON73567 contém repetições invertidas de seqüências de genes que codificam α-zeínas em grãos de milho. A transcrição das repetições invertidas resulta em silenciamento desses genes, reduzindo os níveis das α-zeínas de 19kD e 22kD em 26 dentre 29 plantas R0 testadas. A Figura 15 demonstra que os grãos que resultam de células transformadas com essa seqüência de codificação de dsRNA possuem um fenótipo visual óbvio, em que os grãos com
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52/61 zeínas reduzidas são menos transparentes do que os grãos tipo selvagem.
[00124] Assim, uma seqüência de codificação de dsRNA no íntron de um gene marcador pode ser usado como uma seqüência de identificação de acordo com a presente invenção. Os construtos que contêm, por exemplo, um gene de resistência a glifosato, tal como, CP4 EPSPS como um marcador selecionável e tal seqüência de codificação de dsRNA em um íntron do gene marcador selecionável pode ser diretamente usada para co-transformção com um construto de T-DNA que contém um gene de interesse ao misturar as células de duas cepas de Agrobacterium, sendo que cada uma compreende um desses construtos e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada. Alternativamente, o cassete de codificação de dsRNA pode ser subclonado em um construto de 2T-DNA como uma seqüência de identificação, para a identificação eficaz de sementes isentas de marcador. Um versado na técnica também poderia projetar construtos análogos para uso em transformação de célula vegetal mediada por bombardeamento de microprojéteis.
Exemplo 9
Uso de KAS4 como uma Seqüência de identificação [00125] O vetor binário pMON83530 (Figura 16) contém um KAS4 (a-ceto-acetil-ACT sintase; GenBank accession AF060518) conduzido por um promotor USP88 de soja (por exemplo, Patente U.S. 7.078.588) com um cassete expressável de planta CP4 como um marcador selecionável sobre o mesmo T-DNA. A expressão específica de semente do gene KAS4 resulta em sementes rugosas que são facilmente distinguíveis das sementes normais que não contêm o gene (Figura 17). O construto pode ser diretamente usado como uma seqüência de identificação, e um T-DNA que compreende tal seqüência de identificação e um marcador selecionável pode ser co-transformado
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53/61 com um segundo construto que compreende um T-DNA contendo um gene de interesse ao misturar duas cepas de Agrobacterium, sendo que cada uma contém um desses construtos e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada.
[00126] O cassete de expressão KAS4 também está presente em um plasmídeo de 2 T-DNA como mostrado em pMON107314 (Figura 18) onde um T-DNA compreende um gene splA (Sucrose fosforilase de Agrobacterium tumefaciens; GenBank Accession AE009432) como uma seqüência de identificação e um gene marcador e o outro T-DNA pode compreender um gene de interesse como construído por métodos de clonagem usuais conhecidos pelo versado na técnica. O plasmídeo de 2 T-DNA pode ser então usado, por exemplo, para transformação de soja. O gene de identificação é usado para selecionar sementes sem o gene marcador baseado no fenótipo proporcionado pelo gene de identificação.
Exemplo 10
Uso de um gene splA como uma Seqüência de Identificação [00127] O vetor binário pMON68581 (Figura 19) contém a splA (Sucrose fosforilase de Agrobacterium tumefaciens; GenBank Accession AE009432) conduzida por um 7S alfa promotor de soja (por exemplo, GenBank M13759; Doyle et al., 1986) com um cassete expressável de planta CP4 como um marcador selecionável sobre o mesmo T-DNA. A expressão específica de semente do gene splA resulta em sementes rugosas que são facilmente distinguíveis das sementes normais que não contêm o gene (Figura 20). O construto pode ser diretamente usado como uma seqüência de identificação, e um T-DNA que compreende tal seqüência de identificação e um marcador selecionável podem ser co-transformados com um segundo construto que compreende um T-DNA contendo um gene de interesse ao misturar duas cepas de Agrobacterium, sendo que cada uma contém um desses consPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 61/102
54/61 trutos e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada. O cassete de expressão de splA também pode ser facilmente subclonado em vetores de 2 T-DNA onde um T-DNA compreende gene de splA como uma seqüência de identificação e um gene marcador e o outro T-DNA compreende um gene de interesse por métodos de clonagem rotineiros conhecidos pelo versado na técnica. O plasmídeo de 2 T-DNA pode ser então usado, por exemplo, para transformação de soja. A seqüência de identificação é usada para selecionar sementes sem um gene marcador selecionável ou verificável baseado no fenótipo proporcionado pela seqüência de identificação.
Exemplo 11
Uso de Diversas Seqüências de identificação na Produção de Semente de Milho Isenta de Marcador [00128] Múltiplos vetores de expressão de plantas de 2 T-DNA foram construídos. Em cada construto, o primeiro segmento de T-DNA compreendido de um transgene uidA expressável por planta como um exemplo de um ácido nucléico de interesse e o segundo segmento de T-DNA compreendido de um transgene CP4 EPSPS expressável por planta como um marcador selecionável e uma seqüência de identificação como mostrado na tabela abaixo. As seqüências de crtB designadas para expressão em monocotiledôneas foram preparadas por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, por otimização de códon como encontrado em SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3). pMON68412 compreende a SEQ ID NO:3. O primeiro T-DNA é flanqueado por margens direita e esquerda, enquanto o segundo T-DNA fica localizado na cadeia principal do vetor, um formato de 2 T-DNA comumente conhecido como formato em conjunto (Huang et al., 2005). Os tecidos de milho foram transformados separadamente com cada construto por métodos conhecidos na técnica. O fenótipo esperado com cada gene de identificação é indicado na Tabela 2 abaixo. Os promotores alternativos paPetição 870160078995, de 26/12/2016, pág. 62/102
55/61 ra a expressão das seqüências de identificação em endosperma incluem promotor de glutelina 1 de arroz, o promotor waxy de milho, e o promotor sensível 2 de milho.
Tabela 2: Fenótipos exemplificativos esperados com determinadas seqüências de identificação.
Cassete de Seqüência de Identificação
Promotor Seqüência de Identificação Terminador Construto Fenótipo de sementes que conduzem o gene de identificação e o gene marcador selecionável
Zeína de Milho 27 kD crtB Glutelina 1 do arroz pMON6841 2 pigmento carotenóide em endosperma, desenvolvimento de grãos defeituosos
Zeína de Milho 27 kD 19 & 22 kD repetições invertidas de zeína (US 20060200878) Glutelina 1 do arroz pMON6841 3 endosperma opaco
Zeína de Milho 27 kD Fosfofrutoqui- nase (pfk) Glutelina 1 do arroz pMON6841 4 endosperma rugoso
Zeína de Milho 27 kD B peru Glutelina 1 do arroz pMON6841 5 Antocianina pigmento em endosperma
nenhum nenhum nenhum pMON6841 5 nenhum
[00129] Todas as composições e métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida considerando a presente descrição. Embora as composições e métodos dessa invenção sejam descritos em termos das modalidades e exemplos ilustrativos anteriores, tornar-se-á óbvio para o versado na técnica que variações, alterações e modificações podem ser aplicadas
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56/61 à composição, métodos, e nas etapas ou na seqüência de etapas dos métodos descritos aqui, sem que se abandone o conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, tornar-se-á óbvio que certos agentes que são tanto química como fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, embora resultados iguais ou similares possam ser obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares evidentes para o versado na técnica estão considerados dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações em anexo.
Referências [00130] As seguintes referências, à medida que proporcionam detalhes procedurais exemplificativos ou outros suplementares àqueles apresentados aqui, estão especificamente incorporadas no presente documento a título de referência.
Patente U.S. 4.940.835; Patente U.S. 4.940.838; Patente U.S. 4.946.046; Patente U.S. 4.971.908; Patente U.S. 5.015.580; Patente U.S. 5.145.783; Patente U.S. 5.188.642; Patente U.S. 5.302.523; Patente U.S. 5.310.667; Patente U.S. 5.362.865; Patente U.S. 5.384.253; Patente U.S. 5.429.939; Patente U.S. 5.464.763; Patente U.S. 5.464.765; Patente U.S. 5.508.184; Patente U.S. 5.538.880; Patente U.S. 5.545.816; Patente U.S. 5.550.318; Patente U.S. 5.563.055; Patente U.S. 5.591.616; Patente U.S. 5.633.435; Patente U.S. 5.693.512; Patente U.S. 5.731.179; Patente U.S. 5.824.877; Patente U.S. 5.859.347; Patente U.S. 5.981.840; Patente U.S. 6.160.208; Patente U.S. 6.307.123; Patente U.S. 6.326.527; Patente U.S. 6.384.301; Patente U.S. 6.399.861; Patente U.S. 6.403.865; Patente U.S. 6.429.356; Patente U.S. 6.433.252; Patente U.S. 6.458.594; Patente U.S. 6.583.338; Patente U.S. 6.803.501; Patente U.S. 6.825.398; Patente U.S. 7.078.588; Patente U.S. 7.119.187; Patente U.S. 7.151.204. U.S. Pub. 20030110532; U.S. Pub. 20030229918; U.S. Pub.
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Claims (31)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para a preparação de sementes isentas de marcador de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    a) obter sementes de uma planta transgênica que compreende um primeiro segmento de DNA compreendendo um ácido nucléico de interesse e um segundo segmento de DNA compreendendo um gene marcador fisicamente ligado a um cassete de DNA que é ligado de modo operacional a um promotor funcional na dita semente, sendo que o cassete de DNA compreende uma sequência de um gene selecionado do grupo que consiste em crtB, KAS4, sacB, ATP-PFK de levedura, splA, e repetições invertidas de zeína que confere um fenótipo detectável selecionado do grupo que consiste em tamanho de semente alterado, textura de semente alterada, formato de semente alterado, e opacidade de semente alterada;
    b) classificar as sementes pela ausência do fenótipo detectável; e
    c) selecionar pelo menos uma primeira semente que é desprovida do fenótipo detectável para obter uma semente isenta do gene marcador.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende adicionalmente avaliar a semente pela presença do ácido nucléico de interesse e selecionar uma semente que compreende o ácido nucléico de interesse.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene marcador é um gene marcador selecionável.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene marcador é um gene marcador triável.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado
    Petição 870180017740, de 05/03/2018, pág. 7/15
    2/5 pelo fato de que o cassete de DNA codifica um RNA que é fusionado de maneira traducional ou transcricional com o gene marcador selecionável.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cassete de DNA compreende o DNA que codifica um RNA anti-sentido ou sentido que silencia um gene endógeno para resultar no fenótipo detectável.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o cassete de DNA compreende um par de repetições invertidas de um fragmento de DNA homólogo ao gene endógeno.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a repetição invertida de fragmento de DNA é inserida em um íntron dentro do gene marcador.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro segmento de DNA e segundo segmento de DNA se sobrepõem.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a semente selecionada na etapa c) é desprovida do gene marcador e cassete de DNA.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior foi cotransformada com o primeiro e segundo segmentos de DNA em construtos de DNA separadas.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo segmentos de DNA são ligados por sequências de margem de T-DNA diferentes.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende transformar a planta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com uma única construto de DNA que compreende o primeiro
    Petição 870180017740, de 05/03/2018, pág. 8/15
    3/5 e segundo segmentos de DNA.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica foi produzida ao transformar a planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com um construto de DNA que compreende (i) o primeiro segmento de DNA flanqueado por margens esquerda e direita de T-DNA que compreendem um ácido nucléico de interesse, e (ii) o segundo segmento de DNA flanqueado por um segundo conjunto de margens esquerda e direita de T-DNA, em que o segundo segmento de DNA compreende ainda um gene marcador ligado de modo operacional a um promotor funcional na planta transgênica.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os primeiro e segundo segmentos de DNA não são geneticamente ligados na dita planta transgênica.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os primeiro e segundo segmentos de DNA são geneticamente ligados na dita planta transgênica.
  17. 17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica foi produzida ao introduzir o primeiro e segundo segmentos de DNA na dita planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior por transformação mediada por uma cepa bacteriana selecionada do gênero Agrobacterium, Rhizobium, Mesorhizobium, ou Sinorhizobium.
  18. 18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica foi produzida ao introduzir os primeiro e segundo segmentos de DNA na dita planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior por bombardeamento de microprojéteis.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene marcador selecionável codifica um produto
    Petição 870180017740, de 05/03/2018, pág. 9/15
    4/5 selecionado do grupo que consiste em CP4 EPSPS, fosfinotricina acetiltransferase, DMO, NptII, glifosato acetil transferase, acetolactato sintase mutante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon desalogenase, PMI, Protox, higromicina fosfotransferase e antranilato sintase resistente a 5-metil triptofano.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cassete de DNA é ligado de modo operacional a um promotor funcional em um tecido selecionado entre um embrião, endosperma de semente, cotilédone, aleurona e tegumento.
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cassete de DNA compreende uma sequência de ácido nucléico ligada de modo operacional a um promotor selecionado do grupo que consiste em um promotor de napina, um promotor de beta-faseolina, um promotor de subunidade de beta-conglicinina, um promotor de zeína, um promotor de Osgt-1, um promotor de oleosina, um promotor de amido sintase, um promotor de globulina 1, promotor de LTP2 de cevada, um promotor de alfa-amilase, um promotor de quitinase, um promotor de beta-glucanase, um promotor de cisteína, um promotor de glutaredoxina, um promotor de HVA1, um promotor de serina carboxipeptidase II, um promotor de catalase, um promotor de alfa-glucosidase, um promotor de beta-amilase, um promotor de VP1, USP, USP88, USP99, Lectina, um promotor de bronze2.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo detectável é avaliado pela detecção de uma atividade catalítica.
  23. 23. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo detectável é um fenótipo de ablação de tecido.
  24. 24. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo detectável resulta em uma semente
    Petição 870180017740, de 05/03/2018, pág. 10/15
    5/5 defeituosa ou abortada.
  25. 25. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa c) é realizada por uma máquina de classificação de semente automática.
  26. 26. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cassete de DNA compreende uma sequência codificando sacarose fosforilase (splA).
  27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta de soja.
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a sequência codificando sacarose fosforilase é operavelmente ligada a um promotor específico de semente.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o promotor é o promotor 7s alpha de soja.
  30. 30. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o promotor é o promotor USP88.
  31. 31. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que selecionar pelo menos uma primeira semente isenta de um fenótipo detectável compreende selecionar uma semente isenta de um fenótipo conferido pela sequência codificando sacarose fosforilase.
    Petição 870180017740, de 05/03/2018, pág. 11/15
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