CN112105731B - 微小rna表达构建体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及miRNA表达构建体，诸如用于多个miRNA的表达，以及其用于敲低靶基因表达的用途。在一些方面，所述表达构建体包括启动子元件、间隔子序列和miRNA编码序列。在一些方面，构建体提供增强的免疫细胞功能。

Description

微小RNA表达构建体及其用途
本申请要求2018年3月30日提交的美国临时专利申请62/650,403和2018年3月30日提交的美国临时专利申请62/650,387的权益，所述专利申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表的并入
包含在20KB(如在Microsoft Windows中测量的)并且创建于2019年4月1日的名为“UGEN.P0020WO_ST25.txt”的文件中的序列表通过电子提交与此同时提交并且通过引用并入本文。
发明背景
1.技术领域
本发明整体涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于表达miRNA的载体及其用途。
2.背景技术
miRNA(miRNA)基因及其调节机制的发现和表征不仅为基因表达的生理调节提供了新的认识，而且为基于miRNA的治疗方法开辟了新的可能性。miRNA基因的核心件是发夹，其最终将产生核糖核蛋白复合物，通过所述复合物的转录物的鉴定和破坏来敲低靶基因的表达。发夹的结构元件提供用于通过DROSHA和DICER进行加工的信号，导致形成～20-23bp的成熟miRNA双链体(Winter等,2009)。成熟miRNA双链体的功能链被掺入RISC复合物中，这有助于靶mRNA识别，并最终促进基因敲低。合成miRNA以及miRNA途径的副产物，诸如短发夹RNA(shRNA)和小干扰RNA(siRNA)，现在是分子生物学中的常用工具。然而，该途径尚未发挥其治疗潜力(Sullenger和Nair,2016)。siRNA在临床上最为先进，但是它们寿命短并且不适合长期基因校正。绕过DROSHA加工的shRNA可能使细胞质超载双链RNA，并因此因阻碍天然miRNA途径而导致毒性(Boudreau等,2009；Grimm,2011)。合成miRNA模拟天然途径，并且因此应克服上述限制(Maczuga等,2013)，但与shRNA相比，由于miRNA的敲低活性相对较弱，其使用可能受到限制(Boudreau等,2008)。
慢病毒载体可以用于表达合成miRNA基因，因为迄今为止已证明转基因的基因组整合和在受体细胞中的长期表达在患者中是安全的(Aiuti等,2013；Biffi等,2013)。然而，需要进一步研究以优化通过合成miRNA基因实现的敲低，达到允许对病理基因表达进行有效的治疗校正的程度。
合成miRNA基因的架构，包括发夹的三维结构，对于敲低效率至关重要(Myburgh等,2014；Fowler等,2016)。下部茎的长度对于导致靶基因敲低增加的通过DROSHA进行的有效加工以及可用的成熟miRNA链的相对丰度至关重要。但是，miRNA基因的架构不限于发夹结构。其他重要元件包括启动子和不直接与发夹连接的核苷酸序列，称为“间隔子”。miRNA基因大多数时候是由polII依赖性启动子驱动的，所述启动子允许组织特异性或/和诱导型表达(Lee等,2004；Giry-Laterriere等,2011；Giry-Laterriere等,2011；Liu等,2013)。间隔子的存在似乎增强敲低效率(Stegmeier等,2005)，但是尚不清楚间隔子的序列长度或其他生物物理参数是否重要。
天然miRNA基因以串联形式存在，其架构由单个启动子控制下的若干发夹的布置组成(Bourhill等,2016)。这种串联可能是生物技术的强大工具(Sun等,2006)。在miRNA发夹之间可存在居间序列，将它们在空间上分开，并且可具有任何期望的序列。
过继细胞疗法(ACT)，并且尤其是工程改造的T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)T细胞的使用，在各种癌症和病毒感染的治疗中具有广阔的前景。据报道，某些癌症(尤其是血液系统恶性肿瘤)的治愈率极高(Jackson等,2016)，而其他恶性肿瘤(尤其是实体肿瘤)的成功率有限(O'Hara,2016；Han等,2017；Irving等,2017)。许多这些失败归因于敌对的肿瘤微环境，所述微环境提供了工程改造的免疫细胞必须克服的物理、分子和免疫抑制障碍。同样，迄今为止，尚未开发出可用于刺激免疫细胞活性或抑制免疫检查点的构建体。
发明内容
在一些实施方案中，本公开提供一种miRNA表达构建体，其包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及miRNA发夹。在一些方面，间隔子的长度介于50与1,000个核苷酸之间。在一些方面，间隔子的长度介于50与900；50与800；100与800；150与800；150与750；200与750；200与700；250与700；250与650；300与600；300与550；或300与500个核苷酸之间。在一些方面，间隔子的长度为至少60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、365、370或375个核苷酸。在一些方面，间隔子相对于启动子元件是异源的。在一些方面，间隔子包含编码的开放阅读框。
根据实施方案的启动子元件可以是真核启动子。在一些方面，真核启动子是PolII或Pol III启动子。在某些方面，真核启动子是Pol II启动子。在一些方面，启动子是诱导型、组织特异性或细胞谱系特异性启动子。在某些方面，启动子元件选自表1的启动子元件。在一些方面，启动子元件与EF1α启动子至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些方面，EF1α启动子是EF1α启动子的剪接变体。在一些方面，EF1α启动子的剪接变体是EF1s。在一些方面，EF1s启动子具有与SEQ ID NO:45至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，EF1s启动子具有与SEQ ID NO:45 100％相同的序列。
根据实施方案的间隔子可选自表9中的间隔子。在一些方面，间隔子与SEQ ID NO:46至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在某些方面，间隔子与SEQ ID NO:46 100％相同。在一些方面，间隔子与SEQ ID NO:47至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在特定方面，间隔子与SEQ ID NO:47相同。在一些方面，间隔子与SEQ ID NO:48至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在特定方面，间隔子与SEQ ID NO:48相同。在一些方面，间隔子与SEQ ID NO:49至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在特定方面，间隔子与SEQ ID NO:49相同。
根据实施方案的miRNA发夹从5′至3′并且按(a)-(g)的顺序可包含：(a)mir-16侧翼序列，其包含SEQ ID NO:25的序列；(b)第一下部茎序列，其包含SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的mir-16序列；(c)长度为22个核苷酸的反义靶序列；(d)mir-30环序列，其包含SEQ ID NO:31的序列；(e)有义序列，其中所述序列与(c)的序列互补，除了所述序列相对于(c)的序列包含一个或两个错配，其中一个或两个错配包括：i)位于有义序列的位置8至14处的错配；或ii)处于有义序列的最终3’位置(位置22)处的错配；(f)第二下部茎序列，其中所述序列与(b)的序列互补；以及(g)第二侧翼序列。在一些方面，miRNA发夹的有义序列(e)相对于序列(c)包含位于有义序列(e)的核苷酸位置11处的一个错配。在一些方面，miRNA发夹的有义序列(e)相对于序列(c)包含位于(i)有义序列(e)的位置11处和(ii)有义序列(e)的最后一个3′核苷酸(位置22)处的两个错配。在一些方面，侧翼序列(g)与mir-16侧翼序列(a)不互补。在某些方面，miRNA发夹序列选自表6中列出的序列。在一些方面，反义靶序列与CCR5 mRNA序列互补。在一些方面，miRNA表达构建体包含miRNA发夹的至少2个重复。在一些方面，至少2个重复被居间序列分开。在一些方面，miRNA表达构建体是DNA。在一些方面，miRNA表达构建体是RNA。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含miRNA表达构建体的表达载体，所述miRNA表达构建体包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及miRNA发夹。在一些方面，表达载体包含2个或更多个拷贝的miRNA表达构建体。在一些方面，2个或更多个拷贝的miRNA表达构建体形成多顺反子转录物编码序列。在一些方面，表达载体是病毒载体。在一些方面，病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。在另外的方面，表达载体包含至少一种药物抗性标志物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，其包含miRNA表达构建体，所述miRNA表达构建体包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及miRNA发夹，或包含miRNA表达构建体的表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于减少细胞中的基因表达的方法，其包括表达miRNA表达构建体，所述miRNA表达构建体包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及miRNA发夹，其中miRNA发夹包含：(a)mir-16侧翼序列，其包含SEQ ID NO:25的序列；(b)第一下部茎序列，其包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:30的mir-16序列；(c)长度为22个核苷酸的反义靶序列；(d)mir-30环序列，其包含SEQ ID NO:31的序列；(e)有义序列，其中所述序列与(c)的序列互补，除了所述序列相对于(c)的序列包含一个或两个错配，其中一个或两个错配包括：i)位于有义序列的位置8至14处的错配；或ii)处于有义序列的最终3’位置(位置22)处的错配；(f)第二下部茎序列，其中所述序列与(b)的序列互补；以及(g)第二侧翼序列；并且其中反义靶序列(c)与基因的有义链互补。在一些方面，在细胞中表达miRNA表达构建体包括用包含miRNA表达构建体的核酸转染细胞。在一些方面，表达miRNA表达构建体包括由表达载体表达miRNA表达构建体。在一些方面，表达载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。在一些方面，待沉默的基因是CCR5。在一些方面，细胞是人细胞。在一些方面，所述方法是体内方法。在其他方面，所述方法是体外或离体方法。在一些方面，所述方法还包括将表达miRNA表达构建体的细胞移植到生物体中。在一些方面，细胞包含在生物体内。
在一些实施方案中，本公开提供了一种重组核酸分子，其包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及至少一个miRNA发夹，miRNA发夹从5’至3’按(a)-(g)的顺序包含：(a)mir-16侧翼序列；(b)包含mir-16序列的第一下部茎序列；(c)长度为22个核苷酸的反义靶序列；(d)mir-30环序列；(e)有义序列，其中所述序列与(c)的序列互补，除了所述序列相对于(c)的序列包含一个或两个错配，其中一个或两个错配包括：i)位于有义序列的位置8至14处的错配；或ii)处于有义序列的最终3’位置(位置22)处的错配；(f)第二下部茎序列，其中所述序列与(b)的序列互补，其中下部茎的长度为至少11个核苷酸；以及(g)第二侧翼序列。在一些方面，下部茎的长度为11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。在一些方面，第一下部茎(b)包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ IDNO:30的mir-16序列。在一些方面，mir-16侧翼序列(a)包含SEQ ID NO:25的序列。在一些方面，mir-30环序列包含SEQ ID NO:31的序列。在一些方面，有义序列(e)相对于序列(c)包含位于有义序列(e)的核苷酸位置11处的一个错配。在一些方面，有义序列(e)相对于序列(c)包含位于(i)有义序列(e)的位置11处和(ii)有义序列(e)的最后一个3’核苷酸(位置22)处的两个错配。在一些方面，第二侧翼序列(g)与mir-16侧翼序列(a)不互补。在一些方面，miRNA发夹序列选自表6中列出的序列。在一些方面，重组核酸分子包含序列(a)-(g)的至少2个重复。在一些方面，至少2个重复被居间序列分开。在一些方面，反义靶序列与CCR5 mRNA序列互补。在一些方面，重组核酸分子是RNA。在一些方面，重组核酸分子是DNA。
在一些实施方案中，本公开提供一种包含重组核酸分子的表达载体，所述重组核酸分子包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及至少一个miRNA发夹，miRNA发夹从5’至3’按(a)-(g)的顺序包含：(a)mir-16侧翼序列；(b)包含mir-16序列的第一下部茎序列；(c)长度为22个核苷酸的反义靶序列；(d)mir-30环序列；(e)有义序列，其中所述序列与(c)的序列互补，除了所述序列相对于(c)的序列包含一个或两个错配，其中一个或两个错配包括：i)位于有义序列的位置8至14处的错配；或ii)处于有义序列的最终3’位置(位置22)处的错配；(f)第二下部茎序列，其中所述序列与(b)的序列互补，其中下部茎的长度为至少11个核苷酸；以及(g)第二侧翼序列。在一些方面，启动子是真核启动子。在某些方面，真核启动子是Pol II或Pol III启动子。在一个具体方面，真核启动子是Pol II启动子。在一些方面，启动子是诱导型、组织特异性或细胞谱系特异性启动子。在一些方面，表达载体包含重组核酸分子的2个或更多个拷贝。在一些方面，重组核酸分子的2个或更多个拷贝形成多顺反子转录物编码序列。在一些方面，表达载体是病毒载体。在某些方面，表达载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。在一些方面，表达载体还包含至少一种药物抗性标志物。
在一些实施方案中，本公开提供一种宿主细胞，其包含重组核酸分子，所述重组核酸分子包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及至少一个miRNA发夹，miRNA发夹从5’至3’按(a)-(g)的顺序包含：(a)mir-16侧翼序列；(b)包含mir-16序列的第一下部茎序列；(c)长度为22个核苷酸的反义靶序列；(d)mir-30环序列；(e)有义序列，其中所述序列与(c)的序列互补，除了所述序列相对于(c)的序列包含一个或两个错配，其中一个或两个错配包括：i)位于有义序列的位置8至14处的错配；或ii)处于有义序列的最终3’位置(位置22)处的错配；(f)第二下部茎序列，其中所述序列与(b)的序列互补，其中下部茎的长度为至少11个核苷酸；以及(g)第二侧翼序列；或包含重组核酸分子的表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供一种用于减少细胞中的基因表达的方法，其包括在细胞中表达重组核酸分子，所述重组核酸分子包含启动子元件、长度为至少50个核苷酸的间隔子以及至少一个miRNA发夹，miRNA发夹从5’至3’按(a)-(g)的顺序包含：(a)mir-16侧翼序列；(b)包含mir-16序列的第一下部茎序列；(c)长度为22个核苷酸的反义靶序列；(d)mir-30环序列；(e)有义序列，其中所述序列与(c)的序列互补，除了所述序列相对于(c)的序列包含一个或两个错配，其中一个或两个错配包括：i)位于有义序列的位置8至14处的错配；或ii)处于有义序列的最终3’位置(位置22)处的错配；(f)第二下部茎序列，其中所述序列与(b)的序列互补，其中下部茎的长度为至少11个核苷酸；以及(g)第二侧翼序列；其中反义靶序列(c)与基因的有义链互补。在一些方面，在细胞中表达核酸分子包括用重组核酸转染细胞。在一些方面，在细胞中表达重组核酸分子包括由表达载体表达核酸分子。在一些方面，表达载体是病毒载体。在具体方面，表达载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。在一些方面，基因是CCR5。在一些方面，细胞是人细胞。在一些方面，所述方法进一步限定为体内方法。在其他方面，所述方法限定为体外或离体方法。在一些方面，所述方法还包括将表达重组核酸分子的细胞移植到生物体中。在一些方面，细胞包含在生物体内。
在一些实施方案中，本公开提供一种miRNA表达构建体，其包含启动子序列和至少两个miRNA发夹，其中所述至少两个miRNA发夹靶向免疫检查点基因的转录物。在一些方面，至少两个miRNA发夹靶向不同的序列。在一些方面，至少两个miRNA发夹靶向相同基因的转录物的不同序列。在另一方面，miRNA发夹靶向不同的转录物。在一些方面，miRNA发夹靶向不同基因的转录物。在一些方面，至少两个miRNA发夹靶向至少一种免疫检查点基因的转录物，所述免疫检查点基因选自由以下组成的组：PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、CD96、BTLA、KIRs、腺苷A2a受体、Vista、IDO、FAS、SIRPα、CISH、SHP-1、FOXP3、LAIR1、PVRIG、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD160、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
根据实施方案的miRNA表达构建体可包含至少三个miRNA发夹。在一些方面，至少三个miRNA发夹彼此不同。在一些方面，至少三个不同的miRNA发夹靶向至少一种免疫检查点基因的转录物。在一些方面，至少三个不同的miRNA发夹靶向三种不同的免疫检查点基因。在一些方面，miRNA表达构建体包含至少4、5、6、7、8、9或10个miRNA发夹。在一些方面，至少4、5、6、7、8、9或10个miRNA发夹彼此不同。在一些方面，至少4、5、6、7、8、9或10个miRNA发夹靶向2、3、4或5种不同免疫检查点基因的转录物。
在一些实施方案中，miRNA表达构建体可包含位于启动子与至少两个miRNA发夹之间的间隔子序列。在一些方面，间隔子的长度介于50与1,000个核苷酸之间。
在一些方面，miRNA表达构建体的启动子序列与EF1s启动子序列至少80％相同。在一些方面，启动子序列与EF1s启动子序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些方面，启动子序列与EF1s启动子序列相同。
在一些方面，miRNA表达构建体的启动子序列与UBI启动子序列至少80％相同。在一些方面，启动子序列与UBI启动子序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些方面，启动子序列与UBI启动子序列相同。
根据实施方案的miRNA表达构建体还可包含受体序列。在一些方面，受体序列是嵌合抗原受体。在一些方面，受体序列是T细胞受体序列。
根据实施方案的miRNA表达构建体还可包含选择性标志物。在一些方面，选择性标志物是选择基因。在一些方面，选择基因是LNGFR或其衍生物。在一些方面，miRNA表达构建体还包含自杀基因。例如，自杀基因可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、诱导型半胱天冬酶9(iCasp9)、截短的内皮生长因子受体(tEGFR)、RQR8、二氢叶酸还原酶(DHFR)或胸苷酸合酶(TYMS)。
根据实施方案的miRNA表达构建体可包含肽切割位点。在一些方面，肽切割位点是2A肽。在一些方面，2A肽选自包括以下的组：2A、P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A和BmIFV 2A。在具体方面，2A肽是T2A。
在一些实施方案中，本公开提供一种包含miRNA表达构建体的载体，所述miRNA表达构建体包含启动子序列和至少两个miRNA发夹，其中所述至少两个miRNA发夹靶向免疫检查点基因的转录物。在一些方面，载体是病毒载体。在一些方面，病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。
在一些实施方案中，本公开提供一种哺乳动物细胞，其包含miRNA表达构建体，所述miRNA表达构建体包含启动子序列和至少两个miRNA发夹，其中所述至少两个miRNA发夹靶向免疫检查点基因的转录物；或包含所述miRNA表达构建体的载体。在一些方面，哺乳动物细胞是免疫效应细胞。在一些方面，免疫效应细胞选自包括以下的组：T细胞、TILS、TCR工程改造的T细胞、CAR T细胞、NK细胞、NK/T细胞和调节性T细胞。
在一些实施方案中，提供了一种用于制备工程改造的免疫效应细胞的方法，其包括用根据实施方案的miRNA表达构建体转染或转导免疫效应细胞，或用包含根据实施方案的miRNA表达构建体的载体转导免疫效应细胞。在一些方面，用于制备工程改造的免疫效应细胞的方法包括将嵌合抗原受体序列或T细胞受体序列转染或转导到免疫效应细胞中，以及接着将实施方案的miRNA表达构建体或包含实施方案的miRNA表达构建体的载体转染或转导到细胞中。
在一些实施方案中，提供了一种用于从患者制备工程改造的免疫效应细胞的方法。在一些方面，用于从患者制备工程改造的免疫效应细胞的方法包括：(a)从患者收集免疫效应细胞；以及(b)用实施方案的miRNA表达构建体转染免疫效应细胞或用包含miRNA表达构建体的载体转导免疫效应细胞，以产生工程改造的免疫效应细胞。在一些方面，用于从患者制备工程改造的免疫细胞的方法包括：(a)从患者收集免疫效应细胞；(b)用嵌合抗原受体或T细胞受体转导或转染免疫效应细胞，以产生修饰的免疫效应细胞；以及(c)用根据实施方案的miRNA表达构建体或包含根据实施方案的miRNA表达构建体的载体转导或转染修饰的免疫效应细胞，以产生工程改造的免疫效应细胞。在另外方面，实施方案的免疫效应细胞是T细胞、NK细胞或NK/T细胞。在一些方面，免疫效应细胞还表达重组T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗对其有需要的患者的方法，其包括将根据实施方案的工程改造的免疫效应细胞引入患者中。例如，在一些方面，患者是患有癌症的患者。
在另一个实施方案中，提供了一种免疫效应细胞，其包含靶向CCR5和免疫检查点抑制基因的一种或多种miRNA表达构建体。例如，检查点抑制基因可以是PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、CD96、BTLA、KIRs、腺苷A2a受体、ARG2(精氨酸酶2)、Vista、IDO、FAS、SIRPα、CISH、SHP-1、FOXP3、LAIR1、PVRIG、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD160、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2或GUCY1B3。在一些方面，检查点抑制基因是PD1。在一些方面，PD1靶序列是SEQ ID NO:59、60或61，优选SEQ ID NO:59。在一些方面，免疫效应细胞选自由以下组成的组：T细胞、TILS、TCR工程改造的T细胞、CAR T细胞、NK细胞、NK/T细胞、调节性T细胞、单核细胞和巨噬细胞。例如，细胞可以是T细胞，诸如CAR T细胞。在一些方面，细胞包含靶向HIV感染细胞的CAR。在另外方面，细胞包含靶向CCR5和至少两种免疫检查点抑制基因的一种或多种miRNA表达构建体。因此，细胞可以包含实施方案的任何miRNA表达构建体。
在另一个实施方案中，提供了一种表达构建体，其包含靶向CCR5和免疫检查点抑制基因的miRNA序列。例如，miRNA序列可以是根据本文所述的任何实施方案的序列。在一些方面，构建体还包含CAR表达序列，诸如靶向HIV感染细胞的CAR序列。
如本文所用，就指定组分而言的“基本上不含”在本文用于表示任一指定组分均未有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何无意污染导致的指定组分的总量优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不可以检测到任何量的指定组分的组合物。
如本文在说明书和权利要求中所用，“一个”或“一种”可意指一个(种)或多个(种)。如本文在说明书和权利要求中所用，当与词语“包含(括)”结合使用时，词语“一个”或“一种”可表示一个(种)或多于一个(种)。如本文在说明书和权利要求中所用，“另一个”或“另一种”可意指至少第二个(种)或更多个(种)。
如本文在说明书和权利要求中所用，术语“约”用于指示值包括用于确定该值所采用的装置、方法的固有误差变化或研究对象之间存在的变化。
通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的某些实施方案，但是详细描述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并且结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1：间隔子序列是聚合酶II启动子驱动的miRNA敲低所必需的。(a)本实验中使用的基于miRGE的示意图。所有发夹均设计成靶向CCR5。两种不同的pol II依赖性启动子(泛素C和延伸因子1短启动子)驱动miRGE表达(单个或三个发夹)，具有或不具有GFP序列作为间隔子。还研究了间隔子在启动子的5’或3’的位置。(b)将利用泛素C启动子或延伸因子1短启动子表达的构建体以0.2感染复数(MOI)转导在表达CCR5的HeLa细胞中。转导群体(mCherry+)相对于未转导群体(mCherry–)中的CCR5表达的流式细胞术测定：WT HeLa细胞(双阴性)、HeLa R5细胞(CCR5阳性)。R5+对照mCherry载体；R5+单个mirGE发夹)，具有GFP间隔子。(b’)使用转导(红色)和未转导(蓝色)群体中的平均APC荧光值计算miRNA介导的CCR5敲低。(c)示出在UBI启动子构建体情况下CCR5的相对表达的条形图。(d)示出在EF1短启动子构建体情况下CCR5的相对表达的柱状图。(e)在条形图上计算得到的不同构建体的串联效率(E)。如果E＝1，那么观察到利用串联发夹不存在累加效应(效率为0％)。如果E＝3，那么在串联体中观察到发夹的完美累加效应(效率为100％)。数据代表三个独立实验的平均值+/-SEM。
图2：基于miRNA的敲低的效率取决于间隔子。(a)靶向CCR5的基于单个miRGE发夹的构建体设计成具有不同的间隔子，所述间隔子衍生自GFP(绿色荧光蛋白)、MGST-2(微粒体谷胱甘肽S-转移酶2)、dNGFR(截短的神经生长因子受体)、HO-1(血红素加氧酶1)、HO-1和H2B(组蛋白2B)的编码序列或衍生自非编码序列(CD4基因的第一内含子＝iCD41)，并以0.2MOI转导于HeLa R5细胞中。示出通过FACS免疫染色评估的转导群体相对于未转导群体中的CCR5表达的柱状图。(b)miRGE构建体设计成具有GFP的截短形式(GFP1和GFP2)或(c)CD4的第一内含子(iCD42和iCD43)，并以0.2MOI转导于HeLa R5细胞中。柱状图示出转导群体相对于未转导群体的CCR5表达水平。数据代表三个独立实验的平均值+/-SEM。
图3：间隔子序列决定miRNA发夹串联的累加效应。(a)在表达CCR5的HeLa细胞中，对miRGE发夹串联(三个发夹的串联体)评估MGST2、H2B和GFP作为间隔子的效率。(b)柱状图示出对于GFP间隔子(黑色条柱)、GFP的第二部分(GFP2)(阴影线)、MGST2间隔子(深灰色条柱)和H2B间隔子(浅灰色条柱)，转导群体相对于其余未转导群体的CCR5表达水平。(c)条形图示出利用图9的式计算得到的三发夹构建体的串联效率。对于串联效率的计算，考量在单个miRGE发夹(敲低效力(KP))和三miRGE串联体(串联效力(CP))情况下的CCR5敲低。(d-e)还在靶向NADPH氧化酶亚基p22phox的三发夹串联体中比较MGST2和GFP作为间隔子的效力。在早幼粒细胞白血病细胞系PLB985中通过QPCR(d)和通过Amplex red测定针对NADPH氧化酶活性(e)评估的p22phox的mRNA水平。数据代表三个独立实验的平均值+/-SEM。
图4：GFP间隔子在细胞系和组织外植体中的翻译非依赖性活性。(a)在起始密码子(ATG)3’的GFP cDNA的所有可能阅读框中携带终止密码子的stopGFP间隔子的设计。(b)以>1的MOI用GFP的编码和非编码形式转导HeLa R5细胞。FACS柱状图示出转导细胞中的GFP荧光。用stopGFP构建体转导的细胞的GFP荧光与对照(未转导的HeLa细胞)相当。(c)在HeLaR5细胞中进行0.2MOI转导后，还通过FACS针对CCR5表达评估stopGFP序列的间隔子活性。柱状图示出通过FACS免疫染色评估的转导群体相对于未转导群体的CCR5表达。数据代表三个独立实验的平均值+/-SEM。(d)用逐渐增加量的靶向p22phox的stopGFP三miRGE发夹串联体(106至107个载体颗粒)转导的新生大鼠耳蜗外植体的器官型培养。对毛细胞进行肌球蛋白7a染色(绿色)，有效转导的细胞表达标志基因mCherry(红色)。体外放置五天后，通过qPCR评估病毒基因GAG(e)和p22phox(f)的表达。TU＝转导单位。
图5：间隔子序列调节miRGE的稳态水平，但不调节其半衰期。用具有GFP、LNGFR、MGST2或iCD41作为间隔子的单发夹载体转导表达CCR5的HeLa。使用匹配pri-miRGE的侧翼区域(F1-R1)或成熟miRGE的靶向链(F2-R2)的引物通过qPCR评估(a)未加工(pri-miRGE)或(e)成熟miRGE水平。(b)以GFP、NGFR和MGST2作为间隔子的未加工miRGE水平的代表性qPCR扩增图。应注意，在没有间隔子或以iCD41作为间隔子的情况下，miRGE水平低于检测阈值。使用GAPDH作为管家基因。将0.2的ΔRn定义为阈值(红线)。(c)条形图示出未加工的miRGE的相对水平，其由三个独立实验取平均值得到。标准化为1.0的miRGE表达的最高值对应于28.1±0.3的Ct值。BT＝低于检测阈值。(d)在不同时间点(0-240分钟)用放线菌素D阻断转录，并评估间隔子对未加工的miRGE的半衰期的影响。图示出相对miRGE随时间的衰减，并且每个间隔子的半衰期在表中示出。(f和g)通过qPCR评估的来自在使用不同间隔子的情况下用单个发夹(f)或三发夹串联体(g)转导的HeLa细胞的成熟miRGE的稳态水平的比较。数据代表三个独立实验的平均值+/-SEM。
图6：最大化串联并实现多靶标敲低。(a)将靶向CCR5的stopGFP三串联体(mirGE7-7-7)的效率与携带靶向CCR5或第二靶标–GFP的第四或第五发夹的构建体相比较。条形图示出通过qPCR评估的靶向CCR5(7)(b)或靶向GFP(G)(d)的成熟miRGE的稳态水平，以及这些构建体在HeLa细胞中敲低CCR5表达(c)或GFP表达(e)的能力。表达靶向CCR5或GFP的单个miRGE发夹的载体用作对照。(f)当用MGST2替代stopGFP作为间隔子时，与单个miRGE发夹对照(miRGFP)或stopGFP构建体的第五发夹相比，第四和第五发夹的活性降低。数据代表三个独立实验的平均值+/-SEM。
图7：间隔子的长度和生物物理特征对敲低效率的影响。示出CCR5敲低与(a)最小自由能/长度或(b)此图中描述的间隔子的GC含量之间关联的图。
图8：用于设计靶向NOX3活性的有效miRGE串联体的整体策略。(a)候选siRNA序列是计算机设计的，并根据其敲低靶mRNA(NOX3、p22phox或NOXO1)的能力进行选择。然后将活性最高的siRNA序列克隆到miRGE骨架中，以构建SMIG。在相同的靶表达细胞系上证实SMIG效率的验证。(b)通过amplex red方法相对于NOX3活性评估靶向编码NOX3复合物(NOX3、p22phox和NoxO1)的mRNA的8种siRNA候选物的效力。(c)通过Western Blot验证最有效序列(靶向p22phox)对NOX活性的影响。(d-e)通过QPCR(d)或通过测量ROS的产生(e)在NOX3表达细胞系上检查被设计成具有最具活性的siRNA序列的三发夹串联体SMIG的效率。
图9：miRGE发夹的串联效率的计算。(a)示出用于针对GFP、MGST2和H2B间隔子计算串联效率(E)的式的表格。为了计算串联效率，考量了在单个miRGE发夹(敲低效力(KP))和三个miRGE串联体(串联效力(CP))情况下的CCR5敲低。(b)汇总了敲低效力(KP)、串联效率(E)以及它们的乘积，即一般向量效率(general vector efficiency)的表格。(c)前者还在柱状图中示出。
图10：用于产生具有固有免疫检查点敲低的重定向的免疫治疗细胞的假想性合成小基因的示意图。选择启动子，以允许组织特异性表达，同时间隔子序列和长度经过优化，以允许所有miRNA发夹的表达。miRNA发夹可靶向特定的一个或多个目标基因，而CAR或TCR序列允许免疫治疗细胞靶向特定抗原。T2A是切割肽位点，并且LNGFR允许选择工程改造的细胞，而自杀基因将使得在存在毒性的情况下能够快速去除细胞。
图11：优化的小基因架构允许在循环细胞中实现CCR5的持续体内敲低。(A)向六只NGS新生小鼠中植入260,000个人CD34+造血干细胞(HSC)，然后用靶向CCR5的三发夹串联体转导。在28周龄时，收获血液以分析CCR5表达。(B)示出来自移植了未转导的HSC的小鼠(左)或移植了stop GFP-777转导的HSC的小鼠(中)的CD4+T细胞的FACS图。右图示出用无关抗体(未转导的HSC)染色的CD4+T细胞。mCherry+细胞指示有效转导的细胞。(C)示出相对于无关抗体(同种型)，单个移植小鼠的转导(mCherry+)和其余未转导(mCherry_)CD4 T细胞群中的CCR5表达水平的柱状图。虚线右侧的细胞代表高表达CCR5的CD4 T细胞。(D)五只植入小鼠中的高CCR5 CD4+T细胞群中的CCR5表达水平的比较。未转导的对照代表植入未转导的人CD34+细胞的小鼠(n＝3)。
图12：移植后23周，NOD/SCID小鼠中人造血干细胞的植入率。示出(a)移植了未转导的HSC的小鼠或(b)移植了用靶向CCR5的三发夹串联体转导的HSC的6只小鼠中的表达人CD45标志物的人循环白细胞的FACS图。植入率介于12.4％与44％之间。
图13：从移植小鼠血液中鉴定人CD4+T细胞。根据FSC/SSC坐标选择总淋巴细胞(a)。双联体(doublet)消除(b)后，用人CD45染色选择人白细胞(c)，然后用人CD3抗体选择人淋巴细胞(d)。最后，利用人CD4和人CD8抗体将CD4+T细胞与CD8+T细胞区分开(e)。
图14：使用针对CCR5的1-3个发夹的mirGE构建体下调CCR5的效率。(A)示出1-3个发夹的治疗性小基因的架构，其中每个发夹相同并且靶向CCR5；(B)对齐的流式细胞术柱状图，其展示出转导的HeLaR5细胞(mCherry阳性群体)内荧光强度的降低；(C)与仅mCherry对照载体转导的HeLaR5细胞相比的相对CCR5表达水平(n＝3)。
图15：用于PD1下调的最佳靶序列的鉴定。使用基于计算机设计鉴定的三个PD1靶序列构建单发夹mirGE治疗性小基因，并根据(A)中所示的实验计划将其包装到慢病毒载体中以转导原代T细胞；(B-C)流式细胞术点图和柱状图，其表明PD1-1A构建体在降低转导的T细胞群体(mCherry+)中的PD1表达方面最有效；(D-E)示出PD1表达细胞和表达水平的相对降低(n＝4)的条形图。
图16：利用1至3个发夹的mirGE治疗性小基因实现的PD1下调。鉴定出可用于PD1的mirGE下调的靶序列之后，构建两个和三个发夹的小基因(相同的发夹序列)。然后将构建体包装到慢病毒载体中，以转导来自健康供体的原代T细胞(A)；(B-C)流式细胞术点图和柱状图，其示出与1个发夹的构建体相比，利用2个和3个发夹的构建体实现的PD1的敲低增加；(D-E)条形图，其示出PD1表达细胞和PD1表达水平的相对降低(n＝3)，表明使用2个和3个发夹的构建体等效敲低PD1。
图17：使用在末端位置具有两个靶向CCR5的发夹的mirGE构建体实现的CCR5下调的效率。(A)治疗性小基因的架构，其示出靶向CCR5的发夹相对于靶向PD1和GFP的发夹的位置；(B)对齐的流式细胞术柱状图，其展示出转导的HeLaR5细胞(mCherry阳性群体)内荧光强度的降低；(C)与仅mCherry对照载体转导的HeLaR5细胞相比的相对CCR5表达水平(n＝3至5)。
图18：与HL-60靶细胞共培养四天后，抗cKit CAR T细胞中PD1敲低的效果。(A)基于mCherry阳性，具有靶向PD1的mirGE(3个发夹)的抗cKit CAR T细胞的转导率；(B)基于mCherry表达，在第4天，表达mirGE的CAR T细胞的增加；(C)与HL-60靶细胞共培养四天后，抗cKit CAR T细胞的绝对细胞数量；(D)经四天的共培养期，CAR T细胞的倍数增加(从第1天的100,000个CAR T细胞开始)；(E-F)四天的共培养期之后，CAR T细胞的流式细胞术点图、叠加图和柱状图；(G)表达PD1的CAR T细胞的百分比。
图19：原代T细胞中CCR5和PD1的敲低。(A-B)流式细胞术点图、叠加图和柱状图，其示出在用4发夹mirGE构建体(两个针对PD1的发夹，然后两个针对CCR5的发夹)和对照载体(仅mCherry)转导的原代T细胞中CCR5和PD1的独立敲低；(C)CCR5相对于PD1群体的叠加点图，在未转导的(mCherry阴性)和4发夹转导的(mCherry阳性)T细胞群体上进行门控。
具体实施方式
I.本发明实施方案
本发明整体涉及miRNA表达构建体。本发明涉及用于表达多种miRNA的构建体。本发明进一步涉及间隔子序列在启动子与miRNA序列之间的使用。在一些方面，间隔子序列可来自GFP。
II.RNA抑制
抑制性核酸可在细胞中抑制基因的转录或阻止基因转录物的翻译。抑制性核酸可长16至1000个核苷酸，并且在某些实施方案中，长18至100个核苷酸。在某些实施方案中，抑制性核酸是与目标基因结合或杂交的分离核酸。
抑制性核酸是本领域众所周知的。例如，在美国专利6,506,559和6,573,099以及美国专利公布2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中已经描述了siRNA、shRNA和双链RNA，所有这些专利通过引用整体并入本文。
自从Fire及其同事在1998年发现RNAi以来，生物化学机制已得到快速表征。双链RNA(dsRNA)被Dicer切割，所述Dicer是RNA酶III家族的核糖核酸酶。此过程产生长度为～21个核苷酸的miRNA。这些miRNA被掺入多蛋白RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，所述复合物被引导至靶mRNA。RISC在互补区域的中间切割靶mRNA。在哺乳动物细胞中，发现了为短RNA片段(～22个核苷酸)的相关miRNA。在Dicer介导的具有不完美的发夹RNA结构的较长(～70个核苷酸)前体的切割后产生miRNA。将miRNA掺入miRNA-蛋白质复合物(miRNP)中，这导致靶mRNA的翻译阻遏。
在设计RNAi时，需要考虑几个因素，诸如siRNA的性质、沉默效应的持久性以及递送系统的选择。为了产生RNAi效应，引入生物体中的miRNA通常将含有外显子序列。此外，RNAi过程是同源依赖性的，因此必须仔细选择序列，以使基因特异性最大化，同时使同源序列而不是基因特异性序列之间的交叉干扰的可能性最小。具体地讲，miRNA在miRNA的序列与靶基因的核苷酸序列的一部分之间表现出大于80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％的同一性。与靶基因的同一性小于约80％的序列实质上不太有效。因此，miRNA与待抑制的靶基因之间的同一性越大，无关基因的表达将受到影响的可能性就越小。
另外，miRNA的大小是重要的考虑因素。在一些实施方案中，本发明涉及包括至少约19-25个核苷酸并且能够调节靶基因表达的miRNA分子。在本发明的上下文中，miRNA的长度尤其小于500、200、100、50、25、24、23或22个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA的长度为约25个核苷酸至约35个核苷酸或约19个核苷酸至约25个核苷酸。
为了改善miRNA介导的基因沉默的有效性，已经开发了在mRNA上选择靶位点的指南以优化miRNA的设计(Soutschek等,2004；Wadhwa等,2004)。这些策略可提供合理的方法来选择siRNA序列以实现最大的基因敲低。为了促进miRNA进入细胞和组织，已经使用了多种载体，包括质粒和病毒载体，诸如腺病毒、慢病毒和逆转录病毒(Wadhwa等,2004)。
在抑制性核酸内，核酸的组分不必在整体上是相同类型或同质的(例如，抑制性核酸可包含核苷酸和核酸或核苷酸类似物)。通常，抑制性核酸形成双链结构；双链结构可由部分或完全互补的两个单独的核酸产生。在本发明的某些实施方案中，抑制性核酸可仅包含单个核酸(多核苷酸)或核酸类似物，并通过与自身互补形成双链结构(例如，形成发夹环)。抑制性核酸的双链结构可包含16-500个或更多个连续核碱基，包括其间的所有范围。抑制性核酸可包含17至35个连续核碱基，更特别地18至30个连续核碱基，更特别地19至25个核碱基，更特别地20至23个连续核碱基，或20至22个连续核碱基，或21个连续核碱基，其与互补核酸(可以是同一核酸的另一部分或单独的互补核酸)杂交以形成双链结构。
miRNA可以从商业来源、天然来源获得，或可以使用本领域普通技术人员众所周知的多种技术中的任何技术合成。例如，预先设计的miRNA的商业来源包括Invitrogen的StealthTM Select technology(Carlsbad,CA)、(Austin,TX)和(Valencia,CA)。可以在本发明的组合物和方法中应用的抑制性核酸可以是通过任何来源发现是经验证的靶基因下调剂的任何核酸序列。
在一些实施方案中，miRNA分子与编码全长蛋白质的任何核酸序列的至少10个连续核苷酸具有至少75％、80％、85％或90％的同源性，特别地至少95％、99％或100％的相似性或同一性，或介于前述之间的任何百分比(例如，本发明涵盖75％和更高、80％和更高、85％和更高，以此类推，并且所述范围旨在包括其间的所有整数)。
miRNA还可包含一个或多个核苷酸的改变。此类改变可以包括在诸如19至25个核苷酸RNA的末端或内部(在RNA的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸材料。在某些方面，RNA分子含有3'-羟基。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。双链寡核苷酸可包含修饰骨架，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，或本领域已知的其他修饰骨架，或可包含非天然核苷间键。siRNA的另外修饰(例如，2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，以及倒置脱氧碱性(deoxyabasic)残基掺入)可见于美国公布2004/0019001和美国专利6,673,611(其中的每一个通过引用整体并入)。总体而言，上述所有此类改变的核酸或RNA被称为修饰的miRNA。
II.用于克隆、基因转移和表达的载体
在某些方面内，表达载体用于表达目标核酸，诸如抑制特定基因表达的核酸。表达需要在载体中提供适当的信号，并包括各种调节元件，诸如来自病毒和哺乳动物来源的增强子/启动子，其驱动目标基因在宿主细胞中的表达。还定义了被设计用于优化宿主细胞中的RNA稳定性的元件。还提供了使用多种显性药物选择标志物来建立表达所述产物的永久、稳定的细胞克隆的条件，如将药物选择标志物的表达与多肽的表达相连的元件。
A.调节元件
在整个本申请中，术语“表达构建体”或“表达载体”旨在包括任何类型的基因构建体，其含有编码基因产物的核酸，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。转录物可被翻译成蛋白质，但不是必须的。在某些实施方案中，表达包括基因的转录和将mRNA翻译成基因产物。在其他实施方案中，表达仅包括编码目标基因的核酸的转录，即，如实施方案的RNA分子的情况。
在某些实施方案中，编码基因产物的核酸处于启动子的转录控制下。“启动子”是指由细胞的合成机制或引入的合成机制所识别的、启动基因的特异性转录所需的DNA序列。短语“处于转录控制下”是指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶启动和基因表达。
此处将使用术语启动子指代一组转录控制模块，所述模块簇集在真核RNA聚合酶(Pol)I、II或III的启动位点周围。关于启动子如何组织的许多思考源自对几种病毒Pol II启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的启动子。这些研究，通过近期工作的补充，已显示启动子由离散的功能模块构成，每个功能模块由大约7-20bp的DNA组成，并含有转录激活或阻遏蛋白的一个或多个识别位点。
每个启动子中至少一个模块的功能是定位RNA合成的起始位点。最有名的实例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子，诸如哺乳动物末端脱氧核苷酰转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，与起始位点重叠的离散元件本身有助于确定起始位置。
另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，但是近期已表明许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加至相隔50bp。取决于启动子，似乎各个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
在一些实施方案中，启动子包含延伸因子1短(EF1s)启动子。在其他实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可以用于获得目标编码序列的高水平表达。还设想使用本领域众所周知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子实现目标编码序列的表达，条件是表达水平对于给定目的是足够的。
通过采用具有众所周知特性的启动子，可以优化转染或转化后目标蛋白的表达水平和模式。此外，选择响应于特定生理信号而被调节的启动子可以允许基因产物的诱导型表达。表1和2列出在本发明的上下文中可用来调节目标基因表达的几种调节元件。该列表并不旨在详尽列举参与基因表达促进的所有可能元件，而仅仅是其示例。在一些方面，根据本发明实施方案使用的启动子是非组织特异性启动子，诸如组成型启动子。
增强子是增加来自位于同一DNA分子远处位置的启动子的转录的遗传元件。增强子的组织方式很像启动子。也就是说，它们由许多单独元件构成，每个元件都与一个或多个转录蛋白结合。
增强子与启动子之间的基本区别是操作性的。整个增强子区域必须能够远距离刺激转录；这对于启动子区域或其组成元件不是必须的。另一方面，启动子必须具有一个或多个在特定位点和特定方向上指导RNA合成起始的元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子通常是重叠和连续的，似乎通常具有非常类似的模块组织。
以下是可以在表达构建体中与编码目标基因或miRNA的核酸组合使用的病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表(表1和表2)。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动目标基因或miRNA的表达。截短的启动子也可用于驱动表达。如果提供适当的细菌聚合酶，无论是作为递送复合物的一部分还是作为另外的基因表达构建体，真核细胞可以支持由某些细菌启动子造成的细胞质转录。
在使用任何cDNA插入物的情况下，通常将包括聚腺苷酸化信号以实现基因转录物的正确聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信号的性质并不被认为对本发明的成功实践至关重要，并且可采用任何这样的序列，诸如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。然而，在一些方面，实施方案的载体中不包括聚腺苷酸化信号序列。例如，将这种信号序列掺入慢病毒载体中(在3’LTR之前)可以降低所得的慢病毒滴度。
间隔子序列可包括在核酸构建体中。间隔子的存在似乎增强miRNA的敲低效率(Stegmeier等,2005)。间隔子可以是任何核苷酸序列。在一些方面，间隔子是GFP。
还设想为表达盒的元件是终止子。这些元件可以用于增强消息水平，并最大程度地减少从盒通读(read through)到其他序列中。
B.选择性标志物
在本发明的某些实施方案中，细胞含有本发明的核酸构建体，可以通过在表达构建体中包括标志物来体外、离体或体内鉴定细胞。此类标志物将赋予细胞可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定含有表达构建体的细胞。通常，包含药物选择标志物有助于克隆和选择转化体，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素和组氨醇抗性的基因是有用的选择性标志物。可选地，可采用酶，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。也可以采用免疫标志物。并不认为所采用的选择性标志物很重要，只要能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择性标志物的另外实例是本领域技术人员众所周知的。
III.核酸分子和表达载体的递送
在某些方面，可以构建用于递送实施方案的核酸的载体以在细胞中表达这些因子。在一个具体方面，以下系统和方法可用于将核酸递送至期望的细胞类型。
A.同源重组
在实施方案的某些方面，编码实施方案的核酸分子的载体可以特定方式例如通过同源重组引入细胞中。目前在干细胞中表达基因的方法涉及使用病毒载体(例如，慢病毒载体)或随机整合到基因组中的转基因。这些方法之所以不成功，部分原因是随机整合的载体可以激活或抑制内源基因的表达，和/或转基因表达的沉默。通过与靶基因组中的特定基因座的同源重组，可以部分克服与随机整合相关的问题。
同源重组(HR)，也称为一般重组，是在所有生命形式中使用的一类基因重组，其中核苷酸序列在两条相似或相同的DNA链之间交换。自20世纪80年代中期以来，该技术一直是哺乳动物细胞基因组工程的标准方法。该过程涉及DNA的物理断裂和最终再连接的若干步骤。此过程在自然界中最广泛地用于修复DNA中的潜在致死双链断裂。此外，同源重组在减数分裂过程中产生DNA序列的新组合，真核生物通过该过程制造出生殖细胞，如精子和卵子。这些新的DNA组合代表了后代的基因变异，这使得种群能够随着时间的推移而在进化上适应不断变化的环境条件。同源重组还用于水平基因转移，以在细菌和病毒的不同株系和种之间交换遗传物质。同源重组还用作分子生物学中用于将遗传变化引入靶生物体中的技术。
同源重组可以用作靶向基因组修饰。在哺乳动物细胞中，标准HR的效率仅为10-6至10-9处理细胞(Capecchi,1990)。大范围核酸酶或归巢内切核酸酶(诸如I-SceI)的使用已用于提高HR的效率。天然大范围核酸酶以及具有改变的靶向特异性的工程改造的大范围核酸酶均已用于提高HR效率(Pingoud和Silva,2007；Chevalier等,2002)。提高HR效率的另一条途径是用可编程DNA特异性结构域工程改造嵌合核酸内切酶(Silva等,2011)。锌指核酸酶(ZFN)是这种嵌合分子的一个实例，其中锌指DNA结合结构域与IIS型限制性内切核酸酶诸如FokI的催化结构域融合(如Durai等,2005；PCT/US2004/030606中所综述的)。此类特异性分子的另一类别包括与IIS型限制性核酸内切酶诸如FokI的催化结构域融合的转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域(Miller等,2011:PCT/IB2010/000154)。
B.核酸递送系统
本领域技术人员将完全能够通过标准重组技术构建载体(参见，例如，Sambrook等,2001和Ausubel等,1996，两者均通过引用并入本文)。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)，诸如逆转录病毒载体(例如，衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如，衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括其可复制、复制缺陷和无病毒(gutless)形式)、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、EB(Epstein-Barr)病毒、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体。
1.附加型载体
在本发明的某些方面，也可提供基于质粒或脂质体的染色体外(即，附加型)载体的使用，例如，用于体细胞的重新编程。此类附加型载体可包括，例如，基于oriP的载体，和/或编码EBV蛋白衍生物EBNA-1的载体。这些载体可允许将大的DNA片段引入细胞并在染色体外维持，每个细胞周期复制一次，有效地分配给子细胞，并且基本上不引起免疫应答。
具体地，基于oriP的表达载体的复制所需的唯一病毒蛋白EBNA-1不引起细胞免疫应答，因为它已发展出有效机制以绕过将其抗原呈递在MHC I类分子上所需的加工(Levitskaya等,1997)。此外，EBNA-1可以反式作用，以增强克隆基因的表达，从而在一些细胞系中诱导最高至100倍的克隆基因表达(Langle-Rouault等,1998；Evans等,1997)。最后，此类基于oriP的表达载体的制造是廉价的。
其他染色体外载体包括其他基于淋巴营养性(lymphotrophic)疱疹病毒的载体。淋巴营养性疱疹病毒是在成淋巴细胞(例如，人B成淋巴细胞)中复制并在其自然生命周期的一部分变成质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性的淋巴营养性疱疹病毒包括但不限于EBV、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)；松鼠猴疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。还设想了基于附加体的载体的其他来源，诸如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。
本领域技术人员将完全能够通过标准重组技术构建载体(参见，例如，Maniatis等,1988和Ausubel等,1994，两者均通过引用并入本文)。
载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达，或以其他方式为靶细胞提供有益特性的其他组分或功能。此类其他组分包括，例如，影响对细胞的结合或靶向的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞对载体核酸的摄取的组分；影响摄取后多核苷酸在细胞内的定位的组分(诸如介导核定位的试剂)；以及影响多核苷酸表达的组分。
此类组分还可包括标志物，诸如可检测和/或选择标志物，其可以用于检测或选择已摄取并表达载体所递送的核酸的细胞。此类组分可以作为载体的天然特征提供(诸如使用某些具有介导结合和摄取的组分或功能的病毒载体)，或可以对载体进行修饰以提供此类功能。多种此类载体在本领域中是已知的并且通常是可获得的。当载体维持在宿主细胞中时，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构通过细胞稳定复制，掺入宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的核或细胞质中。
2.基于转座子的系统
根据一个具体实施方案，核酸的引入可使用转座子-转座酶系统。所用的转座子-转座酶系统可以是众所周知的睡美人(Sleeping Beauty)、青蛙王子(Frog Prince)转座子-转座酶系统(关于后者的描述，参见例如，EP1507865)，或TTAA特异性转座子piggyback系统。
转座子是可以在单个细胞的基因组内四处移动至不同位置的DNA序列，这一过程称为转座。在此过程中，它们可引起突变并且改变基因组中DNA的量。转座子也曾被称为跳跃基因，并且是可移动遗传元件的实例。
存在多种可移动遗传元件，并且可以基于它们的转座机制对它们进行分组。I类可移动遗传元件或逆转录转座子通过首先转录为RNA，然后通过逆转录酶逆转录为DNA，并且接着插入基因组中的另一位置来复制自身。II类可移动遗传元件使用转座酶在基因组内“剪切并粘贴”自身而从一个位置直接移动到另一个位置。
3.病毒载体
在产生重组病毒载体时，通常将非必需基因替换为异源(或非天然)蛋白质或核酸的基因或编码序列。病毒载体是一种表达构建体，其利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质引入细胞。某些病毒通过依赖pH或不依赖pH的机制感染细胞或进入细胞，以将其遗传物质整合到宿主细胞基因组中并且稳定且有效地表达病毒基因的能力已经使其成为将外源核酸转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。下文描述了可用于递送本发明的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例。
逆转录病毒因其将基因整合到宿主基因组中、转移大量外源遗传物质、感染广泛的物种和细胞类型以及被包装在特殊细胞系中的能力而有望作为基因递送载体(Miller,1992)。
为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建含有gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等,1983)。当将含有cDNA，连同逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入特殊细胞系中(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物(即，载体基因组)包装成病毒颗粒，然后被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann等,1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，并用于基因转移。取决于用于覆盖载体颗粒表面的包膜蛋白的向性，逆转录病毒载体能够感染广泛多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等,1975)。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，其还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见，例如，Naldini等,1996；Zuferey等,1997；Blomer等,1997；Giry-Laterriere等,2011；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可以用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，在通过引用并入本文的美国专利5,994,136中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中用携带包装功能的两种或更多种载体，即gag、pol和env以及rev和tat转染合适的宿主细胞。
C.核酸递送
将核酸，诸如DNA或RNA，引入待使用本发明编程的细胞中可使用如本文所述或如本领域技术人员已知的用于核酸递送以转化细胞的任何合适的方法进行。此类方法包括但不限于DNA的直接递送，诸如通过离体转染(Wilson等.,1989，Nabel等,1989)，通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，每一个通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub,1985；美国专利5,789,215，其通过引用并入本文)，通过电穿孔(美国专利5,384,253，其通过引用并入本文；Tur-Kaspa等,1986；Potter等,1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van DerEb,1973；Chen和Okayama,1987；Rippe等,1990)；通过先后使用DEAE-葡聚糖和聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声波装载(Fechheimer等,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,1982；Fraley等,1979；Nicolau等,1987；Wong等,1980；Kaneda等,1989；Kato等,1991)以及受体介导的转染(Wu和Wu,1987；Wu和Wu,1988)；通过微粒轰击(PCT申请WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且每一个通过引用并入本文)；通过与碳化硅纤维一起搅拌(Kaeppler等,1990；美国专利5,302,523和5,464,765，每一个通过引用并入本文)；通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(美国专利5,591,616和5,563,055，每一个通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等,1985)，以及此类方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，可稳定或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物体。
1.脂质体介导的转染
在本发明的某些实施方案中，可将核酸夹带在脂质复合物例如脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部含水介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有被含水介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前发生自我重排，并将水和溶解的溶质夹带在脂质双层之间(Ghosh和Bachhawat,1991)。还设想了与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。所用脂质体的量可根据脂质体的性质以及所用的细胞而变化，例如，可设想每1至1000万个细胞约5至约20μg的载体DNA。
外源DNA的脂质体介导的体外核酸递送和表达已经非常成功(Nicolau和Sene,1982；Fraley等,1979；Nicolau等,1987)。外源DNA的脂质体介导的在培养的鸡胚、HeLa和肝癌细胞中的递送和表达的可行性也已得到证实(Wong等,1980)。
在本发明的某些实施方案中，脂质体可与血球凝集病毒(HVJ)复合。已显示这有助于与细胞膜融合并促进脂质体包裹的DNA进入细胞(Kaneda等,1989)。在其他实施方案中，脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与其结合使用(Kato等,1991)。在另外的实施方案中，脂质体可与HVJ和HMG-1复合或与其结合使用。在其他实施方案中，递送媒介物可包括配体和脂质体。
2.电穿孔
在本发明的某些实施方案中，通过电穿孔将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔包括将细胞和DNA的悬浮液暴露于高电压放电。机械损伤可使受体细胞更易于转化。同样，所用载体的量可根据所用细胞的性质而变化，例如，可设想每1至1000万个细胞约5至约20μg的载体DNA。
使用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。以此方式已经用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter等,1984)，并且已经用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa等,1986)。
3.磷酸钙
在本发明的其他实施方案中，使用磷酸钙沉淀将核酸引入细胞。使用该技术已经用腺病毒5DNA转染了人KB细胞(Graham和Van Der Eb,1973)。同样以此方式，用新霉素标志基因转染小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞(Chen和Okayama,1987)，并用多种标志基因转染大鼠肝细胞(Rippe等,1990)。
4.DEAE-葡聚糖
在另一个实施方案中，先后用DEAE-葡聚糖和聚乙二醇将核酸递送到细胞中。以此方式，将报告基因质粒引入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞中(Gopal,1985)。
D.细胞培养
一般而言，在培养基中培养本发明的细胞，所述培养基是能够维持细胞生长的富含营养物质的缓冲溶液。
适用于根据本文所述的方法分离、扩增和分化干细胞的培养基包括但不限于高葡萄糖杜氏(Dulbecco's)改良的伊戈尔(Eagle's)培养基(DMEM)、DMEM/F-12、Liebovitz L-15、RPMI 1640、伊思柯夫(Iscove's)改良的杜氏培养基(IMDM)和Opti-MEM SFM(Invitrogen Inc.)。化学成分限定培养基包含最低必需培养基，诸如伊思柯夫改良的杜氏培养基(IMDM)(Gibco)，其补充有人血清白蛋白、人Ex Cyte脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸，丙酮酸钠、谷氨酰胺和有丝分裂原也是合适的。如本文所用，有丝分裂原是指刺激细胞的细胞分裂的试剂。试剂可以是化学物质，通常是刺激细胞开始细胞分裂，从而触发有丝分裂的某种形式的蛋白质。在一个实施方案中，无血清培养基，诸如美国序列号08/464,599和WO96/39487中描述的那些，以及如美国专利5,486,359中描述的“完全培养基”被设想与本文所述的方法一起使用。在一些实施方案中，培养基中补充有10％胎牛血清(FBS)、人自体血清、人AB血清或补充有肝素(2U/ml)的富含血小板的血浆。细胞培养物可维持在CO2气氛中，例如5％至12％，以维持培养液的pH，在37℃的潮湿气氛中孵育并传代以维持低于85％的汇合。
IV.实施例
包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，下面的实施例中所公开的技术代表了发明人在本发明的实践中发现良好发挥作用的技术，因此可以视为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员应当理解的是，根据本公开，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1-材料和方法
含有miRNA的质粒和慢病毒载体的构建。使用如先前所述的通路(gateway)系统构建质粒(Myburgh等.,2014)。除MGST2外，使用Herculase II聚合酶(Agilent,Santa Clara,CA)，利用分别携带EcoRI和XhoI限制性位点的正向和反向引物通过PCR扩增间隔子序列，并且通过消化/连接步骤将其克隆到pENTR载体(Invitrogen)中(表3)。用于克隆间隔子的大多数引物均被设计成在5’末端具有AttB1(正向引物)和AttB2(反向引物)重组位点(表4)。
通过EcoRI/XhoI限制性消化并随后连接到pENTR载体中而由pOTB7-MGST2质粒(transomic)获得MGST2间隔子。使用相同策略以及分别携带SpeI和BamHI限制性位点的正向和反向引物扩增mirGE发夹。miRGE发夹的元件可见于表5。miRGE发夹串联体是通过在miRGE引物上使用不同的限制性酶对或通过平端连接制备的，如Sun等,2006中。通过对pENTR载体进行测序来验证每个新的miRGE添加。通过测序系统地验证每个克隆的扩增子部分，包括间隔子和miRGE发夹。miRGE PCR模板和引物的oligo购自Microsynth(Balgach,Switzerland)。靶向CCR5、GFP和p22phox的miRGE发夹模板序列在表6中可获得。
通过含有人UBI启动子(pENTR-L4-UBI-L1R)或延伸因子1短启动子(pENTR-L4-EFs-L1R)以及含有处于人磷酸甘油酸酯激酶1(PGK)启动子下的编码mCherry标志基因的另外的转录单位的慢病毒载体目的盒(pCWX-R4dEST-R2-PC)的pENTR质粒的LR Clonase II(Invitrogen,Carlsbad,CA)介导的重组产生最终的慢病毒载体质粒。GFP靶序列-AAGAACGGCATCAAGGTGAACT(SEQ ID NO:57)—获自先前的出版物(Mottet-Osman等.,2007)。人CCR5(Genbank NM_000579.3)靶序列(T7)5′aAGTGTCAAGTCCAATCTATGA(SEQ ID NO:58)先前使用过(Myburgh等,2014)。
表3：慢病毒载体和滴度。
表4：克隆引物
表5：miRGE发夹组分
mir-16侧翼序列 GGTGATAGCAAT SEQ ID NO:25
下部茎序列 CAGCAGTGCCT SEQ ID NO:26
下部茎序列 TCAGCAGTGCCT SEQ ID NO:27
下部茎序列 GTCAGCAGTGCCT SEQ ID NO:28
下部茎序列 CGTCAGCAGTGCCT SEQ ID NO:29
下部茎序列 ACGTCAGCAGTGCCT SEQ ID NO:30
mir-30环序列 GTGAAGCCACAGATG SEQ ID NO:31
表6：miRGE骨架序列
慢病毒载体的产生和滴定。如先前所述，通过使用特定的慢病毒载体转移质粒对HEK 293T细胞进行瞬时转染来产生慢病毒载体原液，所述质粒是编码gag/pol的psPAX2质粒和pCAG-VSVG包膜质粒(Giry-Laterriere等.,2011a，Giry-Laterriere等,2011a)。如先前所述，使用HT-1080细胞的转导，随后在转导后五天进行mCherry阳性细胞的流式细胞术定量来进行慢病毒载体滴定(Giry-Laterriere等,2011a，Giry-Laterriere等,2011a)。
细胞培养和敲低分析。所有细胞系均在高葡萄糖杜氏改良的伊戈尔培养基(Sigma)中培养，所述培养基中补充有10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素和1％L-谷氨酰胺。对于各敲低测定，在转导后至少5天分析细胞。对于CCR5敲低研究，使用表达高水平的人CCR5的HeLa衍生的TZMb1细胞的亚克隆(AIDS Repository,Germantown,MD)，在此处称为HeLa R5。对于GFP敲低，在1个拷贝的载体上进行GFP转导并分选GFP阳性细胞后，使用相同的细胞。使用抗人CCR5-APC抗体(BD Pharmingen目录号550856)和使用FACS Cyan(BeckmanCoulter)进行的流式细胞术分析检测CCR5表达。使用GFP荧光中值在同一流式细胞仪上评估GFP表达。简而言之，用基于miRGE的敲低载体以0.2MOI转导HeLa细胞，以避免每个细胞存在高拷贝数的载体，并获得相当的条件。在转导细胞群体与其余的未转导细胞群体之间比较GFP或CCR5的表达，并表示为相对于未转导群体的CCR5表达的百分比。
实时定量逆转录酶聚合酶链反应。收获Corti器官的细胞或器官型外植体，并按照制造商的说明使用Qiagen RNeasy mini试剂盒提取mRNA。使用Nanodrop确定RNA浓度。按照制造商的说明，使用Takara PrimeScript RT reagent试剂盒将500ng用于cDNA合成。在来自ABI的7900HT SDS系统上使用SYBR green测定进行实时PCR。用cDNA的连续稀释液验证每种引物的效率。通过针对两种管家基因GAPDH和EF1a以及GAG慢病毒载体基因的几何平均值进行标准化来计算相对表达水平。最高的标准化相对量任意指定为值1.0。由这些标准化的量的平均值的商计算倍数变化，并报道为±SEM。所用的qPCR引物的序列在表7中提供。
表7.qPCR引物
用于成熟miRNA检测的定量逆转录酶聚合酶链反应。用携带不同SMIG的慢病毒载体以0.2MOI转导HeLa R5细胞。通过FACS对转导群体(表达mCherry)进行分选，得到携带单拷贝的载体/细胞的同质细胞群。根据制造商的说明，使用Trizol试剂(Ambion)提取总RNA。使用Nanodrop确定RNA浓度。使用100ng的RNA进行逆转录(miRCURY LNATMmiRNA PCR，聚腺苷酸化和cDNA合成试剂盒(exiqon))。在逆转录后使用LNATM增强引物进行实时PCR扩增(ExiLENTGreen master mix试剂盒(exiqon))。通过针对两种管家miRNA(U6和RNU5G)的几何平均值进行标准化来计算成熟miRGE的相对表达水平。由这些标准化的量的平均值的商计算倍数变化，并报道为±SEM。制造商未提供LNATM增强引物的序列。
通过Amplex Red测定进行的活性氧物类测量。在RPMI培养基(Gibco)中培养PLB-985细胞，如上所述进行转导，并在存在1.25％DMSO的情况下经5天分化成嗜中性粒细胞样细胞。然后，如先前所述(Jaquet等.,2011)，使用Amplex Red荧光测量在用100nM乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)刺激NOX2后由完整的PLB-985细胞产生的H2O2的水平。使用FluoSTAROPTIMA，BMG labtech仪器在37℃下测量荧光。
大鼠Corti器官的器官型培养和转导。将三天大的Wistar大鼠断头处死并且将头部纵切以去除脑。分离两个耳囊，并且将其转移到冰冷的汉克平衡盐溶液(HBSS)(Invitrogen,USA)中，以用镊子(World Precision Instruments,USA)在双筒显微镜(Nikon SMZ800,Japan)下进行无菌解剖。去除骨后，将耳蜗转移至具有可渗透聚酯膜(0.4μm孔径)的Transwell-Clear插入皿(insert)(6孔格式，Corning,USA)。根据制造商的方案，将膜用Celltak(Corning,USA)预涂。然后，将Corti器官(OC)与血管纹和耳蜗轴分离，并且铺板在插入皿上，使毛细胞朝上。小心去除解剖液并且将1.5ml耳用培养基：(DMEM/F12(Invitrogen,USA)、0.01％氨苄青霉素(Sigma,USA)和10％胎牛血清(Invitrogen,USA)添加到插入皿膜下方的下部隔室中。第二天，除去插入皿上的培养基，并且将其转移到空孔中。为了进行转导，在外植体上添加200μl耳用培养基以及含有106、5x106或107个靶向p22phox的stopGFP三miRGE发夹慢病毒载体的颗粒的70μl DMEM/F12(Invitrogen/USA)。在37℃和5％CO2下孵育30分钟后，向下部隔室中添加1.5ml耳用培养基。在接下来的两天中，用新鲜的耳用培养基代替所述培养基。初始转导后5天，用胰蛋白酶将耳蜗外植体剥离以进行mRNA分离，或用4％多聚甲醛固定10分钟以用于免疫染色。
大鼠Corti器官的器官型培养物的免疫染色和共聚焦显微术。将耳蜗外植体用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟。将外植体转移(通过切下插入皿膜)至24孔板，用PBS洗涤3次并用3％Triton-X 100透化30分钟。将耳蜗外植体浸入含有2％牛血清白蛋白(BSA)和0.01％Triton-X 100的封闭缓冲液中，在室温下放置1小时。将外植体与抗MyoVIIa(1:500，兔；Proteus,USA)抗体一起在封闭缓冲液中在4℃孵育过夜。第二天，将组织用PBS冲洗3次，并与二抗抗兔Alexa Fluor 488(1:500；Invitrogen,USA)一起在封闭缓冲液中在室温下孵育2小时。再次用PBS洗涤外植体3次，并用含有DAPI的Fluoroshield(Sigma Aldrich,USA)固定在载玻片上。使用配备有具有Planapochromat 10x/0.3NA物镜的CCD相机(LeicaMicrosystems)的共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM710)将标记细胞可视化。
人源化小鼠白细胞中CCR5的敲低。将使用磁珠(Miltenyi)从脐带血中分离的人CD34在活化培养基(Cell Gro培养基，含有20ng/mL重组人[rh]干细胞因子(SCF)、20ng/mLrh Flt3-L、20ng/mL rh白细胞介素-3[IL-3]、20ng/mL rh TPO1、1％v/v青霉素-链霉素[Penstrep])中培养。将细胞以1.0_106个细胞/mL接种在24孔板中，在活化培养基中在37_C下放置24h以进行预刺激。在第二天进行转导，将Lentiblast B以1:1,000的稀释度添加到培养基中。转导所用的MOI为50。具有0.1_106个细胞的一个孔不转导并且用作阴性对照。将CD34细胞培养48h，并且接着除转导对照之外对其进行收获。将指定用于移植的细胞冷冻并储存，直到将新生NGS小鼠移植到液态N2中。然后用1Gy辐照新生NGS小鼠，接着移植260,000个CD34+细胞。出生后第23周，通过分析小鼠的外周血进行植入检查。然后使用以下抗体在28周龄时研究CCR5表达：huCD45 FITC(304006)、CD3 AF700(300424)、CD4 PE-CY7(300512)、CD8 BV421(301036)和CCR5 APC(359122)(或isocontrol#400611)，来自BioLegend。
间隔子序列的最小自由能的预测。间隔子的最小自由能(MFE)使用RNA fold网络服务器计算(Institute for Theoretical Chemistry,University of Vienna，可在rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi上网获得)。为了允许在间隔子之间比较MFE，将获得的值除以间隔子的长度。
三发夹串联体的串联效率的计算。根据式E＝ln(CP)/ln(KP)计算三发夹构建体的串联效率(E)，其中KP和CP分别是通过单发夹和三发夹构建体获得的CCR5的敲低。如果E＝3，那么在串联体中观察到发夹的完全累加效应。如果E＝1，那么三发夹构建体与单发夹构建体一样有效，并且未观察到发夹串联的累加效应。
统计分析。使用GraphPad Prism 5.04(GraphPad Software,La Jolla,CA)进行统计分析。对方差进行单因素分析，然后进行Bonferroni多重比较检验以及t检验(非参数Mann-Whitney U检验)。
实施例2–结果
聚合酶II启动子驱动的miRNA介导的靶基因敲低需要间隔子序列。为了优化基于miRGE的敲低并更好地了解间隔子的作用，将绿色荧光蛋白(GFP)序列放置在慢病毒载体中miRGE发夹序列的5’或3’端(图1a)。以0.2的MOI转导表达CCR5的HeLa细胞(R5细胞)，以降低具有多于一个拷贝的转基因/细胞的统计概率(图1b)。使用靶向CCR5的单个发夹和三个发夹。使用两种不同的polII依赖性启动子：泛素启动子(UBI)和延伸因子1启动子的剪接型式，即EFs25(cgatggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtgtcgtgacgcg；SEQ ID NO:45)。当使用UBI启动子时，即使在使用三个发夹时，间隔子的缺乏也完全排除了CCR5的敲低(图1c)。
间隔子的功效取决于其位置。在间隔子位于启动子与miRNA之间的情况下，利用单个发夹观察到有效的CCR5敲低，这通过串联的三发夹构建体明显增强。当将间隔子置于miRNA基因的3’位置时，单个发夹显示出降低的CCR5敲低效率，而串联体增加的敲低效果则完全丧失(图1c和1e)。对于EFs启动子，情况略有不同(图1d)。单个发夹的功效不取决于间隔子的存在，但是在不存在间隔子的情况下，观察不到三串联体的累加效应(图1e)。相反，在间隔子位于启动子与发夹之间的情况下，实现了三串联体的最大效果，而在间隔子位于3’的情况下则观察到不太明显的效果。
总而言之，数据表明，间隔子序列-优先位于miRNA的5’-是通过两种类型的polII依赖性启动子驱动有效敲低所必需的。间隔子还是发夹串联的累加效应所必需的(图1e)。
基于miRNA的敲低的效率取决于间隔子序列。评估了几种编码和非编码间隔子序列的效力(图2a；表8)。制备五种具有编码序列的miRGE小基因作为间隔子：绿色荧光蛋白(GFP)、微粒体谷胱甘肽S-转移酶2(MGST2)、截短的神经生长因子受体(dNGFR)、血红素加氧酶1(HO-1)和组蛋白2B(H2B)cDNA(表9)。CD4基因的第一内含子iCD4用作非编码间隔子序列。使用携带相应小基因的慢病毒载体转导HeLa R5细胞。在具有所有编码序列(MGST、LNGFR、HO-1和H2B间隔子)的转导细胞群体中观察到CCR5蛋白的显著敲低。GFP序列间隔子导致CCR5的最高敲低。表现最差的间隔子是iCD4和H2B(<10％敲低)，而其他编码序列产生中等效率(图2a)。
表8.间隔子序列和生物物理特征
在鉴定间隔子序列中影响敲低效率的特定区域的尝试中，设计了GFP的截短形式(GPF1、GFP2)和iCD4的截短形式(iCD42、iCD43)(图2b和2c)。值得注意的是，截短的GFP1和GFP2的活性与全长GFP相当(图2b)。CD4内含子的情况则不同，其中较短的扩增子(iCD42和iCD43)导致中等但显著的CCR5敲低(图2c)。然而，当与类似长度的序列(GFP1或GFP2)相比时，这些截短的CD4第一内含子序列仍然是低效间隔子(图2b和图2c)。这些结果表明，间隔子活性不仅仅取决于长度，而是核苷酸序列似乎也决定其效率。在间隔子的预测最小自由能(MFE)与
敲低效率之间未观察到相关性(图7a)。评估间隔子序列的GC含量，并且发现具有较高GC含量的间隔子往往与较高的敲低效率相关(图7b)。
间隔子序列决定miRNA发夹串联的累加效应。为了确认间隔子序列在载体的串联效力中的作用，设计了具有以下不同间隔子的多发夹构建体：GFP、GFP2、MGST2或H2B(图3a)。当使用GFP或GFP2序列作为间隔子时，与单发夹构建体相比，三个发夹的串联急剧增强CCR5敲低(从60％至85％的CCR5敲低)(图3b和3c)。当使用MGST2作为间隔子时，获得显著不同的结果。在单个发夹的情况下，MGST2序列具有良好的间隔子活性，尽管不如GFP序列有效(图2)。但是，以MGST2作为间隔子，未观察到三发夹串联的累加效应(串联效率接近1)(图3c)。因此，间隔子效力与单个发夹之间不相关，而串联活性相反。虽然前者对于GFP和MGST2处于相当范围内，但在以MGST2作为间隔子的情况下后者实际上不存在(图3c)。以H2B作为间隔子观察到相反的情况：使用单个发夹时观察到相当差的敲低(～10％)，而使用三发夹构建体时存在改善的串联效应，如通过CCR5敲低所判断的(40％敲低)(图3b和3c)。为了研究这种观察是否也适用于靶向除CCR5之外的基因的发夹，构建三发夹SMIG，其靶向NOX亚基p22phox(CYBA)，以MGST2或GFP作为间隔子序列(图3d和3e；另外参见图7)。使用这些构建体转导早幼粒细胞白血病细胞系PLB-985，所述细胞系在分化时方向是嗜中性粒细胞样表型，表达所有吞噬细胞NADPH氧化酶亚基(包括NOX2和p22phox/CYBA)并通过此NADPH氧化酶产生活性氧物类(ROS)。使用MGST2间隔子/三发夹构建体，CYBA mRNA水平降低50％，而在GFP间隔子的情况下，CYBA mRNA敲低>80％(图3d)。评估吞噬细胞NADPH氧化酶的功能活性，即ROS的产生(图3e)。靶向p22phox的GFP-三发夹串联体将ROS的产生抑制60％。相比之下，通过用MGST2代替GFP作为间隔子，ROS产生的抑制不超过20％。这些数据证实，尽管用单个发夹观察到有效的敲低，但MGST2间隔子的串联活性很差(图3c和图8)。这些实验表明，间隔子序列不仅是使用单个发夹时的敲低效率所必需的，而且还是累加串联效应-串联效力所必需的。
GFP间隔子在细胞系和组织外植体中的翻译非依赖性活性。在测试的候选物中，GFP序列作为间隔子是最有效的，无论是相对于使用单个发夹时的敲低效力而言，还是相对于串联效力而言。尽管CD4内含子没有活性，但其他编码序列也产生一些显著的敲低活性。为了测试GFP的蛋白质翻译是否是SMIG的最佳功能所必需的，产生在每个可能的阅读框中携带终止密码子的构建体(图4a)。在用stopGFP转导的细胞中未检测到荧光(图4b)。使用stopGFP间隔子实现的CCR5敲低与使用标准GFP间隔子实现的敲低相当(～50％，使用单发夹构建体)。这些结果表明，间隔子的蛋白质翻译对于SMIG的功能并不重要，并且它们提供了高效的间隔子，其不导致异种基因GFP的翻译，因此与未来的临床使用相容。
为了证明包括stopGFP间隔子的优化的SMIG的治疗潜力，对内耳NADPH氧化酶NOX3的敲低进行研究，这是潜在的治疗应用。已证明，这种产生活性氧物类(ROS)的NADPH氧化酶是导致内耳损伤的ROS的相关来源，并且因此是用于内耳保护的有吸引力的敲低靶标26。设计了三miRGE串联体，其靶向NOX3亚基p22phox，处于UBI启动子的控制下，并且以stopGFP为间隔子。为了鉴定转导细胞，在构建体中还包括处于PGK启动子控制下的mCherry编码序列。用此构建体转导新生大鼠耳蜗外植体(图4d)。使用RT PCR进行载体转导的剂量反应，以检测和定量慢病毒GAG基因(图4e)。转导细胞也可以通过mCherry红色荧光进行鉴定(图4d；绿色荧光是毛细胞的标志物)。在实验条件下用所述载体转导少数毛细胞，但结果显示出p22phox mRNA的剂量依赖性降低，从而证实了具有第二临床相关靶基因的miRGE载体的效率(图4f)。
衍生自人造血干细胞的循环白细胞中持续的miRNA介导的CCR5敲低：为了进一步证明包括stopGFP间隔子的优化的SMIG的体内功效和治疗潜力，研究了另一有前景的临床应用，即HIV共受体CCR5的体内敲低(图11)。为此目的，用靶向CCR5、处于延伸因子启动子的控制下并且以stopGFP为间隔子的三miRGE串联体转导人CD34+造血干细胞(HSC)。为了鉴定转导细胞，在构建体中还包括处于PGK启动子控制下的mCherry编码序列。转导后，在辐照后将HSC植入NGS(NOD scidγ)小鼠中(图11A)，在23周后实现在12.4％与44％之间变化的植入率(图12)。植入后28周，研究循环血液中的CCR5表达(图11；13)。结果揭示了相对于未转导对照和mCherry阴性细胞中的CCR5表达的两种CD4+T细胞(图11B和11C)。在六只植入动物中的五只中，高表达CCR5的CD4 T细胞的比例从小于10％至大于50％变化，平均值接近25％(图11D，参见mCherry和未转导对照)。注意，在六只植入动物中的一只中，实际上不存在高CCR5 CD4T细胞群体，因此在图11D中未将其考虑在内。重要的是，在mCherry+转导群体中观察到CCR5表达水平的急剧下降(图5D，mCherry+)。
间隔子序列调节miRGE的稳态水平，但不调节其半衰期。设计PCR引物以对未加工的miRGE发夹(pri-miRGE)(图5a)或成熟miRGE(图5e)进行定量。如图5b和c所示，用stopGFP间隔子转导的细胞中miRGE pri-miRNA的相对表达显著强于用基于MGST-2或NGFR的载体转导的细胞。应注意，以CD4第一内含子作为间隔子时，miRGE表达低于检测阈值，这也是在不存在间隔子的情况下观察到的。为了研究miRGE稳态水平的增加是否是由转录物的半衰期延长所致，用放线菌素D将HeLa R5细胞处理不同的时间段，以阻断转录(图5d)。收获mRNA，并在不同时间点通过pri-miRGE的qPCR评估miRGE表达水平。结果显示，在使用stopGFP间隔子时，估计的mirGE半衰期为大约30分钟(图5d)，类似于使用NGFR和MGST间隔子时观察到的半衰期。成熟miRGE的稳态水平表明，stopGFP间隔子允许成熟miRGE的最佳表达(图5f)。当在使用三发夹串联体的情况下将stopGFP和MGST2间隔子相比较时，此观察结果也是有效的(图5g)。有趣的是，前体和成熟miRGE的水平都受到间隔子序列的类似影响。这些结果强烈表明，间隔子活性与miRNA转录物的稳定性或加工均无关。相反，这些结果提示了一种机制，其中间隔子与SMIG的转录有关。
最大化串联并实现多靶基因敲低。为了进一步研究具有单启动子驱动的miRNA簇的多靶基因敲低载体的可能性，向三CCR5构建体中添加靶向CCR5或第二靶基因(在这种情况下为GFP)的第四和第五mirGE发夹(图6a)。发夹的串联导致成熟miRGE稳态水平随串联体中存在的发夹数量而显著增加(图6b)。有趣的是，靶向CCR5的第四发夹的添加虽然导致最高的成熟miRGE水平，但是与三发夹构建体相比并不提供CCR5表达的另外降低，这表明CCR5靶位点可能被miRGE饱和(图6c)。另一方面，当第四发夹替换为靶向GFP的发夹时，不仅CCR5敲低保持其最大水平(～90％)，而且GFP荧光也显著降低(图6c)。因此，虽然处于第四位置的发夹不进一步增强CCR5敲低，但显然仍被有效地加工，如通过GFP敲低(图6d)和成熟miRGE-GFP的稳态水平(图6e)所证明的。有趣的是，靶向GFP的第五发夹表现出与第四发夹相似的敲低效率和成熟miRGE水平，但仍不影响CCR5的敲低。更重要的是，由第四或第五miRGE发夹介导的miRGE_GFP稳态水平以及GFP敲低与通过靶向GFP的单个miRGE发夹所实现的敲低相当。因此，在以UBI作为启动子且stopGFP作为间隔子的情况下，使用最多五个串联发夹不损失活性。但是，五发夹串联的效率很大程度上取决于间隔子。实际上，使用MGST2作为间隔子导致第四和第五发夹的GFP敲低效力急剧降低(图6f)。这些数据表明，优化的SMIG架构允许在单启动子驱动的多发夹构建体上实现有效的多靶基因敲低。
实施例3–用于免疫检查点敲低的假想性合成小基因
通过固有免疫检查点敲低对免疫治疗细胞重定向。图10中示出可用于敲低免疫检查点的假想性合成小基因的示意图。合成小基因由启动子序列、间隔子序列、至少2个miRNA发夹以及嵌合抗原受体序列或T细胞受体序列构成。合成小基因可任选地包含选择序列，诸如低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)或自杀基因序列。此外，为了均等地表达miRNA发夹、CAR或TCR序列以及选择序列，可通过“可切割肽”诸如2A序列或T2A序列将CAR或TCR序列与选择序列分开。这些合成小基因可包含针对任何免疫检查点的miRNA发夹序列。具体地，miRNA发夹序列可靶向PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、CD96、BTLA、KIRs、腺苷A2a受体、Vista、IDO、FAS、SIRPα、CISH、SHP-1、FOXP3、LAIR1、PVRIG、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD160、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3 mRNA。所用的启动子可以是任何哺乳动物启动子，诸如EF1s或UBI，或表1中列出的任何启动子。间隔子序列可以是任何长度或序列，特别是表9中列出的间隔子中的一个。任何免疫效应细胞均可使用这些miRNA表达构建体靶向。具体地，可用合成的miRNA构建体对T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR工程改造的T细胞、CAR T细胞、NK细胞或调节性T细胞进行工程改造。
可使用本文提供的合成小基因产生具有固有免疫检查点敲低的肿瘤浸润淋巴细胞。为了产生这些具有免疫检查点敲低的TIL，可从患者的肿瘤组织中分离并纯化TIL。可用包含携带针对免疫检查点mRNA的miRNA发夹的治疗性小基因的慢病毒载体转导这些纯化的TIL，以便敲低一个或多个免疫检查点的基因表达。然后，修饰的TIL可离体扩增，并最终重新引入患者。
可与TIL类似地产生具有固有免疫检查点敲低的CAR T细胞或TCR工程改造的T细胞。可以通过白细胞分离术从患者收集T细胞。然后可用单个载体转导收集的细胞，所述载体包含靶向免疫检查点mRNA的miRNA发夹以及CAR或工程改造的TCR序列。将这些放在单个载体中，如图10所示，允许实现从T细胞收集到患者治疗的更有效的周转时间。可选地，可用两种单独载体处理收集的T细胞。第一载体可包含CAR或工程改造的TCR序列，并且可转导或转染到细胞中。第二载体则包含携带具有靶向免疫检查点mRNA的miRNA发夹的miRNA表达构建体的慢病毒载体。第二载体转导后，可将这些修饰的T细胞离体扩增并且随后再引入患者中。
实施例4–合成小基因靶基因敲低
单发夹和双发夹mirGE构建体在HeLaR5细胞中高效敲低CCR5
使用优化的治疗性小基因架构(EF1s启动子、GFP2间隔子，构建单个和两个靶向CCR5的mirGE发夹，以评估其相对于我们已建立的三发夹构建体下调CCR5的有效程度(图14)。用携带所述构建体的慢病毒载体以1.0的MOI转导HeLaR5细胞，并在转导后5-7天测量CCR5下调。所有构建体还携带mCherry报告基因以鉴定转导细胞。通过流式细胞术，通过测量相同样品内的转导细胞(mCherry阳性)相对于未转导细胞的MFI来测量CCR5敲低，并且将此比率与用对照慢病毒载体转导的仅表达mCherry的HeLaR5细胞相比较。
结果表明所有三种构建体均高效下调CCR5，如通过与用对照载体转导的细胞相比时，MFI的显著降低和荧光强度的总体偏移所证明的(图14B)。单、双和三发夹构建体的相对CCR5表达水平分别为16.5％、15％和15.7％(n＝6的平均值)。值得注意的是，在使用我们的优化的治疗性小基因架构(EF1s启动子、GFP2间隔子)时，利用单个mirGE发夹可以实现HeLaR5细胞中的最大CCR5敲低。
原代T细胞中PD1的高效敲低
考虑到PD1在T耗竭并且更广泛地在工程改造的T细胞疗法领域中发挥着核心作用，开发了将最大程度地下调PD1的治疗性小基因。根据先前描述的方法(Myburgh等,2014，通过引用并入本文)设计三种使PD1沉默的mirGE构建体。使用在线软件工具，包括i-ScoreDesigner、BLOCK-iT(ThermoFisher)、GeneScript siRNA Target Finder和siDESIGNCenter(Dharmacon)鉴定靶序列。基于这些工具的评分，生成前10个靶序列的列表。然后使用BLAST在整个人基因组中针对同源性筛选各靶序列，并且排除与任何其他基因的同源性>70％的那些。最后，选择了三个靶序列(表10)用于克隆到mirGE和我们的优化的治疗性小基因架构(EF1s启动子、GFP2间隔子)中。一旦构建完成，就将三个小基因包装到慢病毒载体中，并且用于以1.0和2.5的MOI转导来自两个健康供体的原代T细胞。所有构建体还携带mCherry报告基因以鉴定转导细胞。使用流式细胞术在转导后5-7天测量PD1表达水平。由于PD1不在原代T细胞上均匀表达或组成性表达，我们首先确定表达PD1的T细胞的百分比，然后比较表达PD1的细胞相对于对照转导(仅mCherry)T细胞的MFI。
表10.PD1靶序列
鉴定物 靶序列
PD1-1A(SEQ ID NO:59) CGGAGAGCTTCGTGCTAAA
PD1-2A(SEQ ID NO:60) CCAACACATCGGAGAGCTT
PD1-3A(SEQ ID NO:61) CCAGCAACCAGACGGACAA
可用于mirGE敲低的靶序列的初始筛选得到显示出显著效果的三个候选物中的一个(PD1-1A)。如在流式细胞术点图和柱状图的实例中可以看到的(图15B-C)，用PD1-1AmirGE转导的细胞的荧光强度存在明显的偏移，而在用PD1-2A和3A转导的T细胞中则不是这样。PD1-1A转导的T细胞中表达PD1的细胞平均减少27％(图15D)，而用PD1-2A和PD1-3A构建体转导的那些减少12％和9％(p＝0.047，Kruskal-Wallis ANOVA)。此外，在表达PD1的T细胞群体中，用PD1-1A构建体转导的细胞中的PD1表达减少48％(图15E)，而用PD1-2A和3A构建体转导的T细胞减少3％和14％(p<0.001，Kruskal-Wallis ANOVA)。
因此，应用PD1-1A mirGE进行两个和三个发夹的构建体的进一步开发，以试图实现PD1的最大敲低(图16)。使用从与先前使用的相同供体中收获的T细胞，我们根据图16A所示的实验计划转导和评估PD1敲低。流式细胞术数据(图16B-C)表明，使用两个和三个发夹的mirGE构建体可以实现进一步的PD1下调，但是使用两个发夹实现最大敲低(因为当使用三个发夹的构建体时差异可忽略不计)。相对于对照载体，两个和三个发夹的构建体均将表达PD1的细胞的比例降低45％，同时还将表达PD1的细胞上的PD1表达下调了近40％(图16D-E)。
CAR T细胞中的PD1敲低防止T细胞耗竭
为了评估靶向PD1的构建体是否将防止T细胞耗竭，转导抗cKit CAR T细胞并且将这些细胞与HL-60肿瘤细胞以1:15和1:30的效应子:靶标(E:T)比率共培养四天的时间段。将纯的抗cKit CAR T细胞群体(先前选择)解冻，并在24小时后以1.0的MOI用携带针对PD1的三发夹mirGE治疗性小基因的慢病毒载体转染。共培养以100,000个CAR T细胞(具有和不具有PD1敲低的抗cKit)起始，并且添加150万和300万个HL-60肿瘤细胞以分别实现1:15和1:30的E:T比率。还包括仅CAR T细胞的阴性对照组(不与靶细胞共培养)。所有条件均在不含IL-2的培养基中培养，所述培养基由Advanced RPMI、10％FBS、1％pen-strep和1xglutamax制成。共培养四天后，收获细胞，以用于计数和CD3阳性T细胞上的PD1表达的流式细胞术分析。
在用我们的靶向PD1的治疗性小基因转导的抗cKit CAR T细胞中实现了～20％的转导率(基于mCherry阳性)。在第4天，再次在阴性对照组中评估转导率，报道为18.6％(图18A)。当评估1:15和1:30E:T比率组中mCherry阳性细胞的比例时，存在1.5倍的增加(相对于阴性对照，图18B)，表明PD1敲低的CAR T细胞以比不具有PD1敲低的CAR T细胞更高的速率增殖。阴性对照CAR T细胞经四天的时间段从100,000扩增到470万(图18C)。在不具有PD1敲低的组中，抗cKit CAR T细胞在1:15和1:30E:T比率条件下分别扩增至230万和170万。在起初具有～20％PD1敲低的CAR T细胞的组中，对于1:15和1:30E:T比率条件分别记录了320万和230万的细胞计数。加上mCherry阳性细胞的比例增加1.5倍这一事实，因此明显的是，不具有PD1敲低的CAR T细胞更快地耗竭，从而导致增殖减少和/或细胞死亡。当我们评估两种E:T条件的倍数增加时，特别是对于mCherry阳性CAR T细胞群体，这些数据得到了证实(基于第4天的1.5倍比例)。与抗cKit CAR T细胞组(不具有～20％PD1敲低亚群)相比，具有PD1敲低的CAR T细胞在1:15E:T比率下具有大于两倍的增殖率(23倍相对于48倍)，并且在1:30的比率下接近两倍(17倍相对于33倍)。
通过流式细胞术分析证实mCherry转导的CAR T细胞中的PD1敲低(图18E)。如在点图中可以看出的，当与同一样品内的未转导CAR T细胞群体(mCherry阴性)相比时，以及相对于未用mirGE治疗性小基因转导的CAR T细胞组，表达PD1的CAR T细胞群体显著减少。在1:15和1:30实验组中均观察到这一效果，这与我们先前在本文中报道的PD1敲低数据一致。当使用叠加的流式细胞术点图和对齐柱状图比较1:15和1:30E:T条件时(图18F)，基于荧光强度和表达PD1的细胞，很明显，1:30条件中的CAR T细胞表达总体更高频率的PD1，这表明这些CAR T细胞比具有PD1敲低的那些存在多得多的耗竭。最后，由两种E:T条件评估表达PD1的CAR T细胞的百分比(图18G)。在1:15的E:T比率下，两组CAR T细胞均具有中值20％的表达PD1的细胞。应记住，PD1敲低的CAR T细胞构成这一群体的～28％(经四天时间段增加了1.5倍)，很明显，这些细胞有助于拯救这些样品内的总体CAR T细胞群体。这种拯救作用在1:30条件下更加明显，其中接近70％的不具有PD1敲低的CAR T细胞是PD1阳性的，但在以～20％具有PD1敲低的CAR T细胞开始的组中降低至40％以下。
多靶标mirGE发夹维持CCR5敲低的效率
为了评估利用优化的治疗性小基因架构(EF1s启动子、GFP2间隔子)是否可以表达最多至六个mirGE发夹，构建了针对PD1、GFP和CCR5的多靶标发夹构建体(图17A)。评估在将靶向CCR5的mirGE定位在治疗性小基因末端的情况下CCR5敲低的潜在影响。进行研究以确定在靶向CCR5的发夹位于四发夹构建体内的位置3和4的情况下是否存在CCR5敲低的减小。类似地，评估这些发夹放置在位置5和6是否影响CCR5敲低。为了对此进行测试，用这些构建体转导HeLaR5细胞，并评估相对于两发夹CCR5靶向载体以及对照载体(仅mCherry)的CCR5下调。使用流式细胞术评估CCR5敲低。结果表明CCR5下调的差异可忽略不计(p＝0.135，Kruskal-Wallis ANOVA)，对于两发夹、四发夹和六发夹构建体分别为85％、81％和82％(图17B-C)。这些数据连同显示出单发夹mirGE针对CCR5和PD1的高效率的那些一起证实，我们的治疗性小基因技术可用于靶向至少两种临床相关基因以进行下调。
四个发夹的治疗性小基因有效下调原代T细胞中的PD1和CCR5
使用四发夹mirGE构建体(两个针对PD1的发夹，两个针对CCR5的发夹)，如前所述转导原代T细胞，并评估这两种临床相关靶基因的敲低。转导后五天，通过流式细胞术评估PD1和CCR5表达(图19)。实际上，观察到PD1和CCR5表达细胞的显著减少。在叠加的点图和柱状图中，观察到CCR5和PD1的显著降低(图19A和19B)。通过绘制CCR5相对于PD1的曲线并将mCherry阳性和mCherry阴性群体叠加(图19C)，在用4发夹mirGE构建体转导的T细胞中观察到CCR5+PD1+群体的明显减少(明显显露了CCR5+PD1+未转导T细胞群体，即点图右上方的数十个点)。这些数据表明我们的mirGE治疗性小基因能够有效地敲低两种临床相关靶基因的表达。
***
本文公开并且要求保护的所有方法可以根据本公开在无需过度实验的情况下进行和实施。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行描述，但对本领域技术人员将显而易见的是，可对本文所述的方法和所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地，将显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可替代本文所述的试剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为是在由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
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<210> 32
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miRGE CCR5-7
<400> 32
ggtgatagca atgtcagcag tgccttcata gattggactt gacacttgtg aagccacaga 60
tgaagtgtca agcccaatct atgcaagtaa ggttgaccat actctac 107
<210> 33
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miRGE GFP
<400> 33
ggtgatagca atgtcagcag tgcctagttc accttgatgc cgttcttgtg aagccacaga 60
tgaagaacgg caccaaggtg aaccaagtaa ggttgaccat actctac 107
<210> 34
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miRGE p22phox
<400> 34
ggtgatagca atgtcagcag tgcctacatg gcccactcga tctgcccgtg aagccacaga 60
tggggcagat cgcgtgggcc atgcaagtaa ggttgaccat actctac 107
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 35
tggacgtttc acacagtggt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 36
tggacccctt tttcctcttt 20
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 37
ggtgatagca atgtcagcag tgcct 25
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 38
gtagagtatg gtcaacctta ctt 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 39
ggagctagaa cgattcgcag tta 23
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 40
ggttgtagct gtcccagtat ttgtc 25
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 41
tccacttggt cgctttgct 19
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 42
cttcttgtcc acagctttga tga 23
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 43
tccatgacaa ctttggcatt g 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 44
cagtcttctg ggtggcagtg a 21
<210> 45
<211> 248
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EF1启动子
<400> 45
cgatggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt 60
ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga 120
aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag 180
tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtgtc 240
gtgacgcg 248
<210> 46
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 46
atggatgtaa gtaggtgagt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 60
ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 120
ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 180
gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 240
cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 300
gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 360
gagggcgacc accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 420
caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 480
cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 540
cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 600
gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 660
gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 720
cgagctgtac aagtaaagcg gcctgaatcg ccagtgtc 758
<210> 47
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 47
aattcatgga tgtaagtagg tgagtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 60
ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 120
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 180
tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 240
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 300
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 360
agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 420
acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca 480
tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 540
acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 600
tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 660
agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 720
tggacgagct gtacaagtaa agcggcctga atcgccagtg tc 762
<210> 48
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 48
aattcatgga tgtaagtagg tgagtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 60
ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 120
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 180
tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 240
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 300
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 360
agttcgaggg cgacc 375
<210> 49
<211> 394
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 49
aattccaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 60
atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 120
aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 180
gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 240
cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 300
gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 360
ctgtacaagt aaagcggcct gaatcgccag tgtc 394
<210> 50
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 50
atgccagagc cagcgaagtc tgctcccgcc ccgaaaaagg gctccaagaa ggcggtgact 60
aaggcgcaga agaaaggcgg caagaagcgc aagcgcagcc gcaaggagag ctattccatc 120
tatgtgtaca aggttctgaa gcaggtccac cctgacaccg gcatttcgtc caaggccatg 180
ggcatcatga attcgtttgt gaacgacatt ttcgagcgca tcgcaggtga ggcttcccgc 240
ctggcgcatt acaacaagcg ctcgaccatc acctccaggg agatccagac ggccgtgcgc 300
ctgctgctgc ctggggagtt ggccaagcac gccgtgtccg agggtactaa ggccgtcacc 360
aagtacacca gcgctaag 378
<210> 51
<211> 854
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 51
aattctcacc atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct 60
gttgctgctt ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta 120
cacacacagc ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg 180
tggagccaac cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt 240
gagcgcgacc gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc 300
gccgtgcgtg gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga 360
gacgactggg cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc 420
ctgccaggac aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga 480
ggccaaccac gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct 540
ccgcgagtgc acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac 600
acggtccaca cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc 660
acctccagaa caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg 720
cagctcccag cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc 780
catcctggct gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga ggtggaacag 840
ggggatcctc tagc 854
<210> 52
<211> 730
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 52
aattcggcac gagggacttc tgttccagag caaaggtcat tcagccgctt gaatcagcct 60
tttcccccca cccggtcccc aactttgttt acccgataag gaaggtcagc attcaaagtc 120
aagaagcgcc atttatcttc ccgtgcgctc tacaaatagt tccgtgagaa agatggccgg 180
gaactcgatc ctgctggctg ctgtctctat tctctcggcc tgtcagcaaa gttattttgc 240
tttgcaagtt ggaaaggcaa gattaaaata caaagttacg cccccagcag tcactgggtc 300
accagagttt gagagagtat ttcgggcaca acaaaactgt gtggagtttt atcctatatt 360
cataattaca ttgtggatgg ctgggtggta tttcaaccaa gtttttgcta cttgtctggg 420
tctggtgtac atatatggcc gtcacctata cttctgggga tattcagaag ctgctaaaaa 480
acggatcacc ggtttccgac tgagtctggg gattttggcc ttgttgaccc tcctaggtgc 540
cctgggaatt gcaaacagct ttctggatga atatctggac ctcaatattg ccaagaaact 600
gaggcggcaa ttctaacttt ttctcttccc tttaatgctt gcagaagctg ttcccaccat 660
gaaggtaata tggtatcatt tgttaaataa aaataaagtc tttattctgt taaaaaaaaa 720
aaaaaaaaac 730
<210> 53
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 53
aattcatgga gcgtccgcaa cccgacagca tgccccagga tttgtcagag gccctgaagg 60
aggccaccaa ggaggtgcac acccaggcag agaatgctga gttcatgagg aactttcaga 120
agggccaggt gacccgagac ggcttcaagc tggtgatggc ctccctgtac cacatctatg 180
tggccctgga ggaggagatt gagcgcaaca aggagagccc agtcttcgcc cctgtctact 240
tcccagaaga gctgcaccgc aaggctgccc tggagcagga cctggccttc tggtacgggc 300
cccgctggca ggaggtcatc ccctacacac cagccatgca gcgctatgtg aagcggctcc 360
acgaggtggg gcgcacagag cccgagctgc tggtggccca cgcctacacc cgctacctgg 420
gtgacctgtc tgggggccag gtgctcaaaa agattgccca gaaagccctg gacctgccca 480
gctctggcga gggcctggcc ttcttcacct tccccaacat tgccagtgcc accaagttca 540
agcagctcta ccgctcccgc atgaactccc tggagatgac tcccgcagtc aggcagaggg 600
tgatagaaga ggccaagact gcgttcctgc tcaacatcca gctctttgag gagttgcagg 660
agctgctgac ccatgacacc aaggaccaga gcccctcacg ggcaccaggg cttcgccagc 720
gggccagcaa caaagtgcaa gattctgccc ccgtggagac tcccagaggg aagcccccac 780
tcaacacccg ctcccaggct ccgcttctcc gatgggtcct tacactcagc tttctggtgg 840
cgacagttgc tgtagggctt tatgccatgt gac 873
<210> 54
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 54
aattctaata gtgaccactc ctggctaatt tttgtatttt cagtagagat agggtttcac 60
tatgttggcc aggctggtct ccaactcctg acctaaagtg atccacccac cttggtttcc 120
caaagtgctg ggattacagg cgtgagccac cgtgcctgga catatatcta tctttttttt 180
ttttgagatg gagtctcgct ctgttgccca ggctggagtg cagtggcgtg atttcggctc 240
actgcaacct ccgcctcccg ggttcaagtg attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg 300
agattacaga cgtgcgtcac catgcccagc taatttttgt atttttagta gagatgggat 360
ttcactatgt tggccaggct ggtctcgtac tcccgacctc aggtgatcca cttgccttgg 420
cctcccaaag tgctggaatt acaggtgtga gccactgcat ccggccttat atatctatct 480
tgtctgtctg actgtctaat ctaattcatc tattttatct gtttatctta tctatcatct 540
atttatctaa tctatctgtc tgtatgtctg tttttttttt gttttttttt tttttttgag 600
atagagtctt gctctgtcgc cgaggctgga gtgcggtggc gcgatctcag ctcactgctg 660
aacctccgcc tcctgggttc taagcgattc tcctgcctca atctttggag tagctgggat 720
tacaggcccg taccactgtg cccggctaat tttgtatttt tagtagagaa gggtttcacc 780
c 781
<210> 55
<211> 637
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 55
aattctaata gtgaccactc ctggctaatt tttgtatttt cagtagagat agggtttcac 60
tatgttggcc aggctggtct ccaactcctg acctaaagtg atccacccac cttggtttcc 120
caaagtgctg ggattacagg cgtgagccac cgtgcctgga catatatcta tctttttttt 180
ttttgagatg gagtctcgct ctgttgccca ggctggagtg cagtggcgtg atttcggctc 240
actgcaacct ccgcctcccg ggttcaagtg attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg 300
agattacaga cgtgcgtcac catgcccagc taatttttgt atttttagta gagatgggat 360
ttcactatgt tggccaggct ggtctcgtac tcccgacctc aggtgatcca cttgccttgg 420
cctcccaaag tgctggaatt acaggtgtga gccactgcat ccggccttat atatctatct 480
tgtctgtctg actgtctaat ctaattcatc tattttatct gtttatctta tctatcatct 540
atttatctaa tctatctgtc tgtatgtctg tttttttttt gttttttttt tttttttgag 600
atagagtctt gctctgtcgc cgaggctgga gtgcggc 637
<210> 56
<211> 254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔子
<400> 56
aattctaata gtgaccactc ctggctaatt tttgtatttt cagtagagat agggtttcac 60
tatgttggcc aggctggtct ccaactcctg acctaaagtg atccacccac cttggtttcc 120
caaagtgctg ggattacagg cgtgagccac cgtgcctgga catatatcta tctttttttt 180
ttttgagatg gagtctcgct ctgttgccca ggctggagtg cagtggcgtg atttcggctc 240
actgcaacct ccgc 254
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 57
aagaacggca tcaaggtgaa ct 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 58
aagtgtcaag tccaatctat ga 22

Claims (41)

1. 一种miRNA表达构建体，所述miRNA表达构建体是核酸分子，其包含从5’到3’的启动子元件、间隔子以及至少一个miRNA发夹，其中所述间隔子由SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO:48组成。
2.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述启动子是真核启动子。
3. 如权利要求2所述的miRNA表达构建体，其中所述真核启动子是Pol II或Pol III启动子。
4. 如权利要求3所述的miRNA表达构建体，其中所述真核启动子是Pol II启动子。
5.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述启动子是诱导型、组织特异性或细胞谱系特异性启动子。
6.如权利要求5所述的miRNA表达构建体，其中所述启动子元件与EF1α启动子至少90%相同。
7.如权利要求6所述的miRNA表达构建体，其中所述EF1α启动子是所述EF1α启动子的剪接变体。
8.如权利要求7所述的miRNA表达构建体，其中所述EF1α启动子的所述剪接变体是EF1s。
9. 如权利要求8所述的miRNA表达构建体，其中所述EF1s启动子具有与SEQ ID NO: 45至少90%或95%相同的序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA发夹从5’至3’并且按(a)-(g)的顺序包含：
(a) mir-16侧翼序列，其包含SEQ ID NO: 25的序列；
(b) 第一下部茎序列，其包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ IDNO: 29或SEQ ID NO: 30的所述mir-16序列；
(c) 长度为22个核苷酸的反义靶序列；
(d) mir-30环序列，其包含SEQ ID NO: 31的序列；
(e) 有义序列，其中所述序列与(c)的所述序列互补，除了所述序列相对于(c)的所述序列包含一个或两个错配，其中所述一个或两个错配包括：
i) 位于所述有义序列的位置8至14处的错配；或
ii) 处于所述有义序列的最终3’位置(位置22)处的错配；
(f) 第二下部茎序列，其中所述序列与(b)的所述序列互补；以及
(g) 第二侧翼序列。
11.如权利要求10所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA发夹的所述有义序列(e)相对于序列(c)包含位于所述有义序列(e)的核苷酸位置11处的一个错配。
12.如权利要求10所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA发夹的所述有义序列(e)相对于序列(c)包含位于(i)所述有义序列(e)的位置11处和(ii)所述有义序列(e)的最后3’位置(位置22)处的两个错配。
13.如权利要求10所述的miRNA表达构建体，其中侧翼序列(g)与所述miR-16侧翼序列(a)不互补。
14.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述核酸分子是RNA。
15.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述核酸分子是DNA。
16.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述核酸分子包含所述miRNA发夹的至少2个重复。
17.如权利要求16所述的miRNA表达构建体，其中所述至少2个重复被居间序列分开。
18.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其包含至少2，3,4,5,6,7,8,9,或10个miRNA发夹。
19.如权利要求18所述的miRNA表达构建体，其中miRNA发夹中至少两个靶向相同的序列。
20.如权利要求18所述的miRNA表达构建体，其中miRNA发夹中至少两个靶向不同的序列。
21.如权利要求20所述的miRNA表达构建体，其中miRNA发夹中至少两个靶向相同基因的转录物的不同序列。
22.如权利要求20所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA发夹靶向不同的转录物。
23.如权利要求22所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA发夹靶向不同基因的转录物。
24.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体还包含嵌合抗原受体或T细胞受体的编码序列。
25.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体还包含选择基因。
26.如权利要求25所述的miRNA表达构建体，其中所述选择基因是LNGFR或其衍生物。
27.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体还包含自杀基因。
28. 如权利要求27所述的miRNA表达构建体，其中所述自杀基因选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、诱导型半胱天冬酶9 (iCasp9)、截短的内皮生长因子受体(tEGFR)、RQR8、二氢叶酸还原酶(DHFR)以及胸苷酸合酶(TYMS)。
29.如权利要求1所述的miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体还包含肽切割位点。
30.如权利要求29所述的miRNA表达构建体，其中所述肽切割位点是2A肽。
31. 如权利要求30所述的miRNA表达构建体，其中所述2A肽选自包括以下的组：2A、P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A和BmIFV 2A。
32.如权利要求31所述的miRNA表达构建体，其中所述2A肽是T2A。
33.一种表达载体，其包含如权利要求1所述的miRNA表达构建体。
34.如权利要求33所述的表达载体，其中所述载体是病毒载体。
35.如权利要求34所述的表达载体，其中所述病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。
36.一种哺乳动物细胞，其包含如权利要求1所述的miRNA表达构建体或如权利要求33-35中任一项所述的表达载体，所述哺乳动物细胞非动物品种。
37.如权利要求36所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞为免疫效应细胞。
38.一种用于体外制备工程改造的免疫效应细胞的方法，其包括用如权利要求1所述的miRNA表达构建体转染或转导所述免疫效应细胞或用如权利要求33-35中任一项所述的表达载体转导所述免疫效应细胞。
39.一种用于体外制备工程改造的免疫效应细胞的方法，其包括将嵌合抗原受体序列或T细胞受体序列转染或转导到免疫效应细胞中，以及接着将如权利要求1所述的miRNA表达构建体或如权利要求33-35中任一项所述的载体转染或转导到所述细胞中。
40.如权利要求39所述的方法，其中嵌合抗原受体或T细胞受体由miRNA表达构建体或载体编码。
41.一种用于体外制备工程改造的免疫效应细胞的方法，其包括通过TALE核酸酶、megaTAL、锌指核酸酶或CRISPR/Cas9将如权利要求1所述的miRNA表达构建体掺入所述细胞的基因组中。
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Optimization of Critical Hairpin Features Allows miRNA-based Gene Knockdown Upon Single-copy Transduction;Myburgh R等;Mol Ther Nucleic Acids;第3卷(第10期);第1页右栏第1段，第2页左栏第3段，第3页左栏第1段，图2注释，补充图3，补充材料 *

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