CN118256444A - 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体T细胞表达嵌合抗原受体且敲除了所述T细胞的CISH基因、SOCS1基因或SOCS3基因中任意一种；或者，所述嵌合抗原受体T细胞表达嵌合抗原受体且过表达细胞因子信号转导抑制因子SOCS5。所述嵌合抗原受体T细胞降低了PD‑1的表达水平，降低了T细胞免疫抑制作用，从而减少T细胞耗竭。所述嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤效果显著，能够用于实体肿瘤和血液瘤，具有广阔的应用前景。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
本申请是申请号为2022104656851专利申请的分案申请(原请的申请日为2022/4/26，发明名称为一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用)。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
正常T细胞作为特异性抗肿瘤的效应细胞，其作用受到MHC的限制，通过慢病毒在正常T细胞中引入肿瘤抗原对应的嵌合抗原受体(CAR)，对T细胞进行基因工程改造，则可在无MHC限制的情况下使T细胞直接靶向肿瘤细胞。CAR-T疗法是各类癌症疗法中比较有潜力的一种免疫疗法，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)在治疗血液肿瘤方面取得了一定的进展，尤其是靶向B细胞白血病抗原CD19的CAR-T已获得上市审批。
CN108864307A公开了一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体及表达所述嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域。CD19嵌合抗原受体序列为经过信号肽优化的序列，能稳定、高效地在T细胞中表达，表达所述嵌合抗原受体的T细胞能够发挥杀伤靶细胞的作用。
CN112442508A公开了一种靶向CD22和CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD19+、CD22+以及CD19+/CD22+的B细胞淋巴瘤细胞和B细胞淋巴细胞白血病细胞有很强的杀伤作用，对不表达CD19+和CD22+的细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。
但是嵌合抗原受体T细胞在治疗实体肿瘤方面的疗效却不尽如人意，实体肿瘤组织募集了大量肿瘤相关的免疫抑制细胞，通过免疫抑制检查点分子和炎症细胞因子分泌等抑制T细胞浸润、激活和效能，导致CAR-T细胞靶向实体肿瘤的治疗效果不显著。
因此，开发一种能够降低免疫抑制分子的免疫抑制作用的嵌合抗原受体T细胞，对提升实体肿瘤的治疗效果具有重要作用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。所述嵌合抗原受体T细胞为敲除了CISH基因、SOCS1基因或SOCS3基因中任意一种的T细胞，或者，过表达细胞因子信号转导抑制因子SOCS5的T细胞；CISH基因敲除后的T细胞对IL2、IL7和IL15等细胞因子的敏感阈值降低，同时解除CIS介导的免疫负调控功能，也降低了PD-1的表达水平，降低了T细胞免疫抑制作用，从而减少T细胞耗竭。SOCS1和SOCS3是SOCS家族信号调节作用最强的蛋白，可通过MAPK/ERK、JAK-STAT3、ERK和FAK信号通路抑制细胞增殖、促进细胞凋亡；SOCS5是一种肿瘤抑癌基因，负调控表皮生长因子受体和JAK-STAT信号通路；同时，在CAR-T细胞基础上敲除SOCS1和SOCS3基因或过表达SOCS5能提升CAR-T细胞的抗肿瘤效果，所述嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤效果显著，能够用于实体肿瘤和血液瘤，具有广阔的应用前景。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达嵌合抗原受体且敲除了所述T细胞的CISH基因、SOCS1基因或SOCS3基因中任意一种；
或者，所述嵌合抗原受体T细胞表达嵌合抗原受体且过表达细胞因子信号转导抑制因子SOCS5。
细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族蛋白是调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分。所述SOCS家族成员共有8个，包括SOCS1-SOCS7以及CIS。主要通过抑制JAK-STAT信号通路的持续激活而调节细胞的增殖、分化和凋亡。在肿瘤的发生发展过程中，由于SOCS家族基因启动子区CG岛超甲基化、组蛋白异常乙酰化、基因突变或基因缺失等原因导致SOCS蛋白表达异常，使JAK-STAT被持续活化，从而导致肿瘤的发生发展与转移。
本发明中，CISH基因作为T细胞功能免疫抑制基因，CISH基因的敲除降低了CAR-T细胞对IL2、IL7和IL15等细胞因子的敏感阈值，同时解除CIS介导的免疫负调控功能，降低PD-1的表达水平，降低T细胞免疫抑制作用，从而减少T细胞耗竭，这将较大地提升CAR-T细胞的抗肿瘤效果。
本发明中，SOCS家族各成员发挥作用的方式有所不同，SOCS1的SH2结构域能够直接结合JAKs活化环，CIS和SOCS2的SH2结构域的酪氨酸残基能够发生磷酸化，SOCS3可以直接结合活性细胞因子受体。SOCS1和SOCS3是SOCS家族信号调节作用最强的蛋白，可通过MAPK/ERK、JAK-STAT3、ERK和FAK信号通路抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。
SOCS5广泛表达于脾脏、淋巴结、胸腺以及骨髓中的原代B和T细胞中，在调节免疫应答方面具有重要作用。
优选地，所述细胞因子信号转导抑制因子SOCS5包括SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.17：
MDKVGKMWNNFKYRCQNLFGHEGGSRSENVDMNSNRCLSVKEKNISIGDSTPQQQSSPLRENIALQLGLSPSKNSSRRNQNCATEIPQIVEISIEKDNDSCVTPGTRLARRDSYSRHAPWGGKKKHSCSTKTQSSLDADKKFGRTRSGLQRRERRYGVSSVHDMDSVSSRTVGSRSLRQRLQDTVGLCFPMRTYSKQSKPLFSNKRKIHLSELMLEKCPFPAGSDLAQKWHLIKQHTAPVSPHSTFFDTFDPSLVSTEDEEDRLRERRRLSIEEGVDPPPNAQIHTFEATAQVNPLYKLGPKLAPGMTEISGDSSAIPQANCDSEEDTTTLCLQSRRQKQRQISGDSHTHVSRQGAWKVHTQIDYIHCLVPDLLQITGNPCYWGVMDRYEAEALLEGKPEGTFLLRDSAQEDYLFSVSFRRYNRSLHARIEQWNHNFSFDAHDPCVFHSSTVTGLLEHYKDPSSCMFFEPLLTISLNRTFPFSLQYICRAVICRCTTYDGIDGLPLPSMLQDFLKEYHYKQKVRVRWLEREPVKAK。
优选地，所述嵌合抗原受体包括依次连接的胞外识别结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。
优选地，所述胞外识别结构域包括SEQ ID NO.1～8所示的氨基酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中所述胞外识别结构域为识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体可变区序列，所述胞外识别结构域的氨基酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：
SQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSGILEQQG；
SEQ ID NO.2：
IQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSSPFTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYIHWVRQAPGKGLEWVAWIDPENGDTEFVPKFQGRATISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCKTGGFWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPC；
SEQ ID NO.3：
DIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGSGSGGSGSGGSGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSS；
SEQ ID NO.4：
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA；
SEQ ID NO.5：
ILMTQSPAIMSAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLEIKGGSGSGGSGSGGSGSGPGLAAPSQSLSITCTVSGFSLTSYVISWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSALKSRLSISKDNSKSQVSLKMNSLQTDDTARYYCASLSYDGFDYWGQGTTV；
SEQ ID NO.6：
IPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID NO.7：
IVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSLDPKSSDKTHTCPPCP；
SEQ ID NO.8：
DTEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKAKTTPPSVYGRVKDPK。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28胞外空间域和跨膜区。
在本发明中，所述跨膜结构域为CD28胞外空间域和跨膜区，CD28胞外空间域起连接胞外识别结构域与跨膜域的作用，同时提供空间灵活性，跨膜结构域是一种跨膜结构，用于连接胞外识别结构域和胞内共刺激信号传导结构域。
优选地，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.9：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTV AFIIFWV。
优选地，所述胞内共刺激信号传导结构域包括CD28、CD3ζ和TLR2的组合。
优选地，所述胞内共刺激信号传导结构域包括SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.10：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。
优选地，所述嵌合抗原受体的靶点包括MSLN、PSCA、MUC1、GPC3、HER2、CD19、CD20或CD22中任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种sgRNA，所述sgRNA分别靶向T细胞的CISH基因、SOCS1基因或SOCS3基因；所述sgRNA靶向T细胞的CISH基因，所述sgRNA包括SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示的核苷酸序列；所述sgRNA靶向T细胞的SOCS1基因，所述sgRNA包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；所述sgRNA靶向T细胞的SOCS3基因，所述sgRNA包括SEQID NO.15和SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.11：CAAGGGCTGCATGACTGGCT；
SEQ ID NO.12：TGCTGGGGCCTTCCTCGAGG；
SEQ ID NO.13：GGCTGCCATCCAGGTGAAAG；
SEQ ID NO.14：TGGTGCGCGACAGCCGCCAG；
SEQ ID NO.15：ACCTACTGAACCCTCCTCCG；
SEQ ID NO.16：TTGAGCACGCAGTCGAAGCG。
本发明中，所述sgRNA的特异性良好，敲除效率高，稳定性较好。
第三方面，本发明提供一种第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)构建含有编码嵌合抗原受体的核酸分子的慢病毒表达载体；
(2)将步骤(1)中所述的慢病毒表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒；
(3)将步骤(2)中所述重组慢病毒导入T细胞中，制备表达嵌合抗原受体的T细胞；
(4)将权利要求3所述的sgRNA和Cas9蛋白电转到步骤(3)中表达嵌合抗原受体的T细胞中，得到所述嵌合抗原受体T细胞。
优选地，步骤(2)中，所述包装质粒包括pMD2.G质粒和psPAX2质粒。
优选地，步骤(2)中，所述病毒包装细胞包括HEK 293T细胞。
优选地，步骤(2)中，所述慢病毒表达载体与pMD2.G质粒和psPAX2质粒的质量比为(8～9):3:12，例如可以是8:3:12、8.5:3:12或9:3:12等。
优选地，步骤(3)中，所述含有嵌合抗原受体编码序列的重组慢病毒的颗粒数与T细胞的数量比为(4.5～5.5):1，例如可以是4.5:1、5:1或5.5:1等。
第四方面，本发明提供一种第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)构建含有编码嵌合抗原受体的核酸分子的慢病毒表达载体，构建含有编码细胞因子信号转导抑制因子SOCS5的核酸分子的慢病毒表达载体；
(2)将步骤(1)中的慢病毒表达载体分别与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒，分别得到含有嵌合抗原受体编码序列的重组慢病毒，和含有细胞因子信号转导抑制因子SOCS5编码序列的重组慢病毒；
(3)将步骤(2)中所述的含有嵌合抗原受体编码序列的重组慢病毒导入T细胞中，制备表达嵌合抗原受体的T细胞；
(4)将步骤(2)中所述的含有细胞因子信号转导抑制因子SOCS5编码序列的重组慢病毒转到步骤(3)中的表达嵌合抗原受体的T细胞中，得到所述嵌合抗原受体T细胞。
优选地，步骤(2)中，所述包装质粒包括pMD2.G质粒和psPAX2质粒。
优选地，步骤(2)中，所述病毒包装细胞包括HEK 293T细胞。
优选地，步骤(2)中，所述慢病毒表达载体与pMD2.G质粒和psPAX2质粒的质量比为(8～9):3:12，例如可以是8:3:12、8.5:3:12或9:3:12等。
优选地，步骤(3)中，所述重组慢病毒的颗粒数与T细胞的数量比为(4.5～5.5):1，例如可以是4.5:1、5:1或5.5:1等。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
第六方面，本发明提供第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞、第三方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法、第四方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法或第五方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括实体肿瘤和/或血液肿瘤。
优选地，所述实体肿瘤包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或子宫内膜腺癌中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述血液肿瘤包括白血病和/或淋巴肿瘤。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所提供的嵌合抗原受体T细胞，其中的CISH基因被敲除，对低浓度IL-2的响应程度更高，且在低浓度IL-2条件下培养，其细胞增殖能力更强；此外，本发明所提供的另一种嵌合抗原受体T细胞，在CAR-T细胞基础上敲除SOCS1基因或SOCS3基因，或过表达SOCS5基因，均能提升CAR-T抗肿瘤效果。
(2)本发明中的CISH基因、SOCS1基因或SOCS3基因敲除的嵌合抗原受体T细胞，或表达SOCS5基因的嵌合抗原受体T细胞具有更好的抗肿瘤效果，与未敲除组(或未过表达组)的嵌合抗原受体相比具有更强的体外杀伤肿瘤细胞能力。
(3)本发明所述嵌合抗原受体T细胞中的PD-1的表达水平更低，肿瘤及其他免疫调控细胞表面的PD-L1与所述嵌合抗原受体T细胞表面的PD-1结合数量减少，T细胞耗竭和T细胞抑制均减弱，抗肿瘤活性增强。
附图说明
图1为实施例2中pWPXLd-Anti-MSLN-CD28CD3ζT2-eGFP的质粒图谱。
图2为测试例2中不同种类嵌合抗原受体T细胞对低浓度IL-2的响应程度的曲线图。
图3A为测试例3中不同种类嵌合抗原受体T细胞对Hela-GL细胞的体外杀伤活性曲线图。
图3B为测试例3中不同种类嵌合抗原受体T细胞对Raji-GL细胞的体外杀伤活性曲线图。
图4为测试例4中不同种类嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤作用的结果曲线图。
图5A、图5B、图5C和图5D为测试例5中流式细胞术分析结果。图5A为小鼠的外周血中不同种类的嵌合抗原受体T细胞的比例图；图5B为小鼠的外周血中PD-1的阴性比例图；图5C为小鼠的肿瘤组织中不同种类的嵌合抗原受体T细胞的比例图；图5D为小鼠的肿瘤组织中PD-1的阴性比例图。
图6为测试例6中CAR-SOSC1 KO T细胞和CAR-SOCS3 KO T细胞的体内抗肿瘤作用验证结果。
图7为测试例7中CAR-SOSC5 OE T细胞的体内抗肿瘤作用验证结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一系列sgRNA，所述sgRNA分别靶向T细胞的CISH基因、SOCS1基因或SOCS3基因；所述sgRNA的特异性良好，敲除效率高，得到的子代细胞，稳定性较好。
所述sgRNA靶向T细胞的CISH基因，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示。
所述sgRNA靶向T细胞的SOCS1基因，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
所述sgRNA靶向T细胞的SOCS3基因，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
SEQ ID NO.11：CAAGGGCTGCATGACTGGCT；
SEQ ID NO.12：TGCTGGGGCCTTCCTCGAGG；
SEQ ID NO.13：GGCTGCCATCCAGGTGAAAG；
SEQ ID NO.14：TGGTGCGCGACAGCCGCCAG；
SEQ ID NO.15：ACCTACTGAACCCTCCTCCG；
SEQ ID NO.16：TTGAGCACGCAGTCGAAGCG。
实施例2
本实施例提供一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体中包含Anti-MSLN-CD28-CD3ζ–TLR2序列，所述慢病毒表达载体的制备方法包括如下步骤：
(1)将合成的Anti-MSLN-CD28-CD3ζ–TLR2序列用Mss I和Bcu I两个限制性内切酶切下，同时使用这两个限制性内切酶酶切带有eGFP报告基因的pWPXLd-2A-eGFP慢病毒骨架，在37℃酶切反应2h。
(2)使用琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，仪器设置为120V、30min；用凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后用Solution I连接酶在16℃金属浴连接1h；将连接产物与感受态细胞TransStbl3放在冰上孵育30min，42℃热激45s，在冰上放置3min，加入200μL无抗LB培养基在37℃摇床孵育45min，孵育之后均匀涂布在带有氨苄抗性的LB平板上，倒放在培养箱37℃培养12h。
(3)挑取长势良好的圆形克隆菌斑加入15mL离心管中，所述离心管中装有2mL氨苄抗性的液体LB培养基，37℃摇床220rpm培养8h。
(4)使用质粒小量提取试剂盒按说明书提取质粒，用限制性内切酶Mss I、Bcu I或Nde I酶切鉴定并测序，取100μL鉴定正确的克隆菌液至50mL离心管中，所述50mL离心管中装有30mL具有氨苄抗性的液体LB培养基，37℃摇床220rpm培养20h。
(5)使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，再次用限制性内切酶Mss I、Bcu I或Nde I酶切鉴定并测序，鉴定正确的质粒为慢病毒表达载体pWPXLd-Anti-MSLN-CD28CD3ζT2-eGFP，将所述慢病毒表达载体放在-20℃冰箱保存。pWPXLd-Anti-MSLN-CD28CD3ζT2-eGFP的质粒图谱如图1所示。
实施例3
本实施例提供一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体中包含Anti-CD19-CD28-CD3ζ–TLR2序列，所述慢病毒表达载体的制备方法包括如下步骤：
(1)将合成的Anti-CD19-CD28-CD3ζ–TLR2序列用Mss I和Bcu I两个限制性内切酶切下，同时使用这两个限制性内切酶酶切带有eGFP报告基因的pWPXLd-2A-eGFP慢病毒骨架，在37℃反应2h。
(2)使用琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，仪器设置为120V、30min；用凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后用Solution I连接酶在16℃金属浴连接1h；将连接产物与感受态细胞TransStbl3放在冰上孵育30min，42℃热激45s，在冰上放置3min，加入200μL无抗LB培养基在37℃摇床孵育45min，孵育之后均匀涂布在带有氨苄抗性的LB平板上，倒放在培养箱37℃培养12h。
(3)挑取长势良好的圆形克隆菌斑加入15mL离心管中，所述离心管中装有2mL氨苄抗性的液体LB培养基，37℃摇床220rpm培养8h。
(4)使用质粒小量提取试剂盒按说明书提取质粒，用限制性内切酶Mss I、Bcu I或Nde I酶切鉴定并测序，取100μL鉴定正确的克隆菌液加入50mL离心管中，所述50mL离心管中装有30mL具有氨苄抗性的液体LB培养基，37℃摇床220rpm培养20h。
(5)使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，再次用限制性内切酶Mss I、Bcu I或Nde I酶切鉴定并测序，鉴定正确的质粒为慢病毒表达载体pWPXLd-Anti-CD19-CD28CD3ζT2-eGFP，将所述慢病毒表达载体放在-20℃冰箱保存。
实施例4
本实施例提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用实施例2所述的慢病毒表达载体(pWPXLd-Anti-MSLN-CD28CD3ζT2-eGFP)与包装质粒共转染病毒包装细胞制备得到，所述重组慢病毒的制备方法包括如下步骤：
(1)在100mm细胞培养皿中加入适量(6×106个细胞左右)HEK293T细胞(货号iCell-h237)和8mL DMEM培养基(DMEM+10％ FBS+1％ P/S)，将细胞培养皿放置在细胞培养箱中培养。
(2)至细胞铺满培养皿底部的80％，在荧光倒置显微镜下观察细胞状态。如果细胞分布均匀且状态良好，则可用于病毒包装实验。吸除培养基上清，加入6mL DMEM病毒包装培养基(DMEM+1％ FBS+1％ P/S)，放置在培养箱中饥饿处理2h。
(3)将实施例2中制备的慢病毒表达载体pWPXLd-Anti-MSLN-CD28CD3ζT2-eGFP、辅助质粒pMD2.G质粒(货号P0262)和psPAX2质粒(货号P0261)按质量比(μg)9:3:12混合，加在0.5mL Opti-MEM里(标记为A液)，再将72μg PEI(聚乙烯亚胺)加入到0.5mL Opti-MEM中(标记为B液)室温放置5min；将A液和B液混合，室温放置20min；将混合液逐滴加入到饥饿完成的HEK 293T细胞培养皿中，轻轻摇匀。
(4)培养6h后在荧光倒置显微镜下观察细胞，应可见零星细胞发出绿色荧光。吸出培养基上清，加入10mL新鲜预热的DMEM病毒包装培养基(DMEM+1％ FBS+1％ P/S)，放回培养箱中继续培养。
(5)每过24h收集培养基上清，并添加适量新鲜预热的DMEM病毒包装培养基(DMEM+1％ FBS+1％ P/S)后放回培养箱中；将收集的病毒上清用0.45μm过滤器过滤，得到所述重组慢病毒，保存在4℃冰箱，于一周内使用。
实施例5
本实施例提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用实施例3的慢病毒表达载体pWPXLd-Anti-CD19-CD28CD3ζT2-eGFP与包装质粒共转染病毒包装细胞制备得到，所述重组慢病毒的制备方法参照实施例4中所述重组慢病毒的制备方法。
测试例1
本测试例对实施例4和实施例5制备的重组慢病毒进行病毒滴度测试。
(1)选用状态良好的Jurkat细胞(货号iCell-h117)作为病毒滴度测试的靶细胞，计数后稀释至1×105细胞/mL，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液。
(2)取10μL病毒上清按1:10稀释成10个梯度，分别取50μL各浓度梯度的病毒加入Jurkat细胞培养基中；24h后向各孔补加100μL培养基。
(3)在Jurkat细胞培养60h后，在显微镜下观察Jurkat细胞中表达绿色荧光蛋白的情况，计算最后两个带有荧光的孔中荧光细胞数量。假设最后两个数量为A和B，则病毒滴度(TU/mL)＝(A+B×10)×1000/2/50。
在本测试例中，实施例4中的病毒滴度(180TU/mL)＝(8+1×10)×1000/2/50。
在本测试例中，实施例5中的病毒滴度(320TU/mL)＝(12+2×10)×1000/2/50。
实施例6
本实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞(MSLN-CISH KO T细胞)，所述嵌合抗原受体T细胞为表达靶向MSLN的CAR-T细胞(T细胞的CISH基因被敲除)，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)外周血单核细胞的分离：
将新鲜的外周血转移至50mL离心管中，加入等量PBS缓冲溶液稀释外周血，颠倒摇匀。
在新的50mL离心管中加入三分之一体积的淋巴细胞分离液(lymphoprepTM)，小心地将稀释后的外周血加在淋巴细胞分离液上，尽量避免外周血与分离液混合，盖上盖子。
将装外周血和淋巴细胞分离液的离心管在离心力为800g离心20min(如果外周血样品自取材后放置超过2h，可延长离心时间至30min)，升速5降速1。
离心完成后可见液体清晰地分为三层，PBMC细胞(外周血单核细胞)在中间层。吸去最上层液体后用巴氏吸管将中间层细胞转移至50mL离心管中，避免混进单核细胞层外的液体；用PBS缓冲液将单核细胞悬液稀释至4倍以降低溶液密度。
离心力为300g离心10min，倒弃上清后加入5mL新鲜配制的1×RBC Lysis Buffer(红细胞裂解液)，重悬沉淀细胞，室温下裂解10min；300g离心5min。用适量PBS缓冲液重悬沉淀细胞，计数备用。
(2)Pan T细胞分选：
对PBMC细胞计数后，取所需量的细胞，离心力为300g离心10min，弃上清。
每1×107个细胞用40μL MACS Buffer(PBS+0.5％ BSA+2mM EDTA)重悬，加入10μLPan T Cell Biotin Antibody Cocktail，混合均匀，4℃孵育5min。
每1×107个细胞加30μL MACS Buffer和20μL Pan T Cell MicroBead Cocktail，混合均匀，4℃孵育10min。
准备LS柱子，将柱子固定于磁铁上，并加3mL MACS Buffer润湿、平衡柱子。
在柱子下放置15mL离心管收集T细胞；将混合液加入到柱子中，收集流过柱子的细胞悬液；再加3mL MACS Buffer，将柱子中残留的目的细胞清洗下来，计数后备用。
(3)T细胞激活：
将T细胞离心后用T细胞培养基(1640+10％ FBS+1％ P/S+300IU/mL IL-2)重悬至1×106细胞/mL，每1×106个细胞重悬液中加入10μL T Cell TransAct；混匀后将细胞悬液加入到合适的孔板中(1×106细胞/cm2)，在37℃培养箱中激活36h。
(4)病毒转导T细胞及电穿孔法敲除免疫抑制性基因：
将激活完成的T细胞离心后去上清，用T细胞培养基(1640+10％ FBS+1％ P/S+300IU/mL IL-2)重悬后计数。
将T细胞稀释成约2×106细胞/mL，加入实施例4中所述的重组慢病毒(病毒颗粒数与细胞数的比例为5:1)和聚凝胺(8μg/mL)，放置在37℃、5％ CO2培养箱中培养。
培养12h后，预热培养基；将Cas9蛋白及实施例1中的靶向CISH基因的sgRNA混合，37℃孵育15min；将T细胞计数后分装成5×106个细胞每管并离心；将100μL电转液加入Cas9蛋白/sgRNA混合液中混匀，所述混合液中Cas9蛋白/sgRNA的摩尔比为3:1，再使用所述混合液重悬T细胞。
使用电转仪运行电转程序；电转结束后吸取细胞加入到已预热的培养基中；12h后离心去上清，加入T细胞培养基；每天加一次培养基，将T细胞浓度控制在1×106细胞/mL。
培养三天后可用流式细胞仪来检测T细胞的GFP阳性率，即嵌合抗原受体T细胞(CAR-CISH KO T细胞)的比例；培养至第七天后，将T细胞计数后离心，加入冻存液(90％FBS+10％ DMSO)后混匀，冻存密度为1×108细胞/mL；每个冻存管中加入1mL细胞匀液。将冻存管放在梯度冻存盒中，于-80℃冰箱中降温；12h后转移至液氮罐中保存。
实施例7
本实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞(CD19-CISH KO T细胞)，所述嵌合抗原受体T细胞为表达靶向CD19的CAR-T细胞(T细胞的CISH基因被敲除)，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法参照实施例6，与实施例6的区别在于，所使用的重组慢病毒为实施例5中的重组慢病毒。
实施例8
本实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞(MSLN-SOSC1 KO T细胞)，所述嵌合抗原受体T细胞为表达靶向MSLN的CAR-T细胞(T细胞的SOSC1基因被敲除)，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法参照实施例6，与实施例6的区别在于，采用的sgRNA为实施例1中SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
实施例9
本实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞(MSLN-SOSC3 KO T细胞)，所述嵌合抗原受体T细胞为表达靶向MSLN的CAR-T细胞(T细胞的SOSC3基因被敲除)，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法参照实施例6，与实施例6的区别在于，采用的sgRNA为实施例1中SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。
对比例1
本对比例提供一种嵌合抗原受体T细胞(MSLN-CISH WT T细胞)，所述嵌合抗原受体T细胞为表达靶向MSLN的CAR-T细胞(T细胞的CISH基因未被敲除)，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)T细胞激活：T细胞激活的方法参照实施例6。
(2)病毒转导T细胞：将激活完成的T细胞离心后去上清，用T细胞培养基(1640+10％ FBS+1％ P/S+300IU/mL IL-2)重悬后计数。
将T细胞稀释成约2×106细胞/mL，加入实施例4中所述的重组慢病毒(病毒颗粒数与细胞数的比例为5:1)和聚凝胺(8μg/mL)，放置在37℃、5％ CO2培养箱中培养。培养后得到MSLN-CISH WT T细胞，将MSLN-CISH WT T细胞计数后离心，加入冻存液(90％FBS+10％DMSO)后混匀，冻存密度为1×108细胞/mL；每个冻存管中加入1mL细胞匀液。将冻存管放在梯度冻存盒中，于-80℃冰箱中降温；12h后转移至液氮罐中保存。
对比例2
本对比例提供一种嵌合抗原受体T细胞(CD19-CISH WT T细胞)，所述嵌合抗原受体T细胞为表达靶向CD19的CAR-T细胞(T细胞的CISH基因未被敲除)，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法参照对比例1，区别在于所使用的重组慢病毒为实施例5中所述的重组慢病毒。
测试例2
本测试例测试实施例6和对比例1中制备的嵌合抗原受体T细胞对低浓度IL-2的响应程度，使用WT T细胞(分离的T细胞)进行同步实验作为对照。
将WT T细胞(起始细胞数5×106)、MSLN-CISH WT T细胞(起始细胞数5×106)以及MSLN-CISH KO T细胞(起始细胞数10×106)转移到低浓度IL-2(10IU/mL)培养基中继续培养，每隔两天计数一次。
在用低浓度IL-2培养的条件下，MSLN-CISH WT T细胞无法有效扩增，而MSLN-CISHKO T细胞则能良好扩增，不同种类嵌合抗原受体T细胞对低浓度IL-2的响应程度的曲线图如图2所示，表明MSLN-CISH KO T细胞对低浓度的IL-2具有更好的响应能力。
测试例3
本测试例测试实施例6和对比例1中制备的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤杀伤活性，所使用的靶细胞包括Hela-GL细胞或Raji-GL细胞，使用WT T细胞(分离的T细胞)进行同步实验作为对照。本测试例还测试实施例7(CD19-CISH KO T细胞)和对比例2(CD19-CISHWT T细胞)中制备的嵌合抗原受体T细胞对低浓度IL-2的响应程度，使用WT T细胞(分离的T细胞)进行同步实验作为对照。
实施例6中的嵌合抗原受体T细胞(MSLN-CISH KO T细胞)的体外肿瘤杀伤活性检测的步骤如下所示：
将肿瘤细胞与MSLN-CISH KO T细胞共培养24h后加入荧光素酶底物进行检测，通过荧光值计算杀伤比例。包括如下具体步骤：
(1)取出适量MSLN-CISH KO T细胞至15mL离心管中，300g离心5min去上清，用PBS重悬清洗一遍后再次离心，用不含IL-2的1640培养基(1640+10％ FBS+1％ P/S)重悬，计数，将MSLN-CISH KO T细胞稀释成合适的浓度(1.6×106细胞/mL)。
(2)在白底96孔板中加入100μL 1640培养基(1640+10％ FBS+1％ P/S)，在第一排加入100μL调节好密度的MSLN-CISH KO T细胞；用排枪混匀后取100μL加入到下一排；然后依次倍比(2倍)稀释，一共设置7个梯度和一个只有培养基的空白梯度。
(3)准备靶细胞，离心后弃上清，用PBS缓冲液重悬后清洗一遍，离心弃上清，用1640培养基(1640+10％ FBS+1％ P/S)重悬，稀释至1×105细胞/mL。在白底96孔板中每孔加入100μL靶细胞；因此最终浓度为MSLN-CISH KO T细胞:靶细胞(E:T)比例为8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8和0:1，将混合好的细胞放置在37℃培养箱培养24h。
(4)培养24h后，将白底96孔板取出，向白底96孔板中每孔加入稀释好的荧光素酶底物(150μg/mL)在荧光照度计上读取荧光值，计算不同E/T比下的细胞杀伤比例。
对比例1中制备的嵌合抗原受体T细胞(MSLN-CISH WT T细胞)和WT T细胞的体外肿瘤杀伤活性检测的步骤参照MSLN-CISH KO T细胞的检测步骤。
实施例7、对比例2和WT T细胞的体外肿瘤杀伤活性检测的步骤参照MSLN-CISH KOT细胞的检测步骤。
嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤杀伤活性曲线图如图3A图3B所示，图3A为不同种类嵌合抗原受体T细胞对Hela-GL细胞的体外杀伤活性曲线图，图3A中包括WT T、MSLN-CISHWT T和MSLN-CISH KO T的体外杀伤活性结果，结果表明，与WT T细胞和MSLN-CISH WT T细胞相比而言，MSLN-CISH KO T细胞具有更强的体外杀伤肿瘤细胞能力，当MSLN-CISH KO T细胞:靶细胞比例为8:1、4:1、2:1或1:1时，MSLN-CISH KO T细胞的杀伤比例在100％左右。图3B为不同种类嵌合抗原受体T细胞对Raji-GL细胞的体外杀伤活性曲线图，图3B中包括WTT、CD19-CISH WT T和CD19-CISH KO T的体外杀伤活性结果；结果表明，与WT T细胞和CD19-CISH WT T细胞相比而言，CD19-CISH KO T细胞具有更强的体外杀伤肿瘤细胞能力。
测试例4
本测试例测试实施例6、对比例1和对比例2中制备的嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤作用。
通过皮下注射在免疫缺陷小鼠(NSI小鼠)NOD/SCID IL2rg-/-体内移植入MKN28细胞(1×106细胞/只)，待肿瘤体积长至50mm3后，给小鼠分别注射嵌合抗原受体T细胞(5×106细胞/只)，继续测量肿瘤大小。具体操作包括如下步骤：
(1)取8周龄同一性别NSI小鼠，用左手大拇指、食指和中指抓紧小鼠的颈部和背部，无名指和小指固定好小鼠的尾巴。
(2)用胰岛素注射器吸取100μL MKN28细胞系悬液(1×106细胞/只)；喷适量酒精在小鼠腹股沟部消毒；将注射器以15°角度从下往上扎入皮下，轻挑针尖水平向前推进5mm，避免扎入腹膜或者穿透皮肤。
(3)轻推注射器针栓，将细胞悬液注射至小鼠腹股沟，可见皮肤被液体撑起小包则说明注射位置正确。注射完细胞悬液后缓缓拔出针头，防止漏液。
(4)约3周后，小鼠腹股沟皮下长出肿瘤团块，挑选出肿瘤长势均一的小鼠均分成若干组。
(5)复苏冻存的嵌合抗原受体T细胞，所述冻存的嵌合抗原受体T细胞包括CD19-CISH WT T细胞、MSLN-CISH WT T细胞、MSLN-CISH KO T细胞，计数后调整至各组CAR+(通过GFP+判断)细胞比例一致，调整密度至CAR+(GFP+)细胞密度为5×107细胞/mL，并分装成每管100μL。即每管5×106个CAR-T(GFP+)细胞。用尾静脉或皮下注射方式将CAR-T细胞注射到小鼠体内。
(6)当肿瘤长到可用游标卡尺测量的大小时，每周测量肿瘤大小两次，小鼠肿瘤的长记为a，宽记为b，根据v＝0.5×a×b2计算肿瘤体积。待肿瘤体积接近1000mm3或到实验终点时，处死小鼠。
嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤作用的结果如图4所示，图4中，其中Mock表示注射的CAR-T细胞为CD19-CISH WT T细胞，MSLN表示注射的CAR-T细胞为MSLN-CISH WT T细胞，MSLN CISH KO表示注射的CAR-T细胞为MSLN-CISH KO T细胞；图4的结果表明，注射MSLNCISH KO T细胞的小鼠的肿瘤生长更缓慢，在前35天其肿瘤体积低于100mm3，低于对照组和空白对照组的肿瘤体积，表明MSLN CISH KO T细胞在体内具有更强的肿瘤抑制能力。
测试例5
本测试例测试实施例6、对比例1和对比例2中制备的嵌合抗原受体T细胞中PD-1的表达水平。
通过皮下注射在免疫缺陷小鼠(NSI小鼠)NOD/SCID IL2rg-/-体内移植入MKN28细胞(1×106细胞/只)，待肿瘤体积长至50mm3后，给小鼠注射嵌合抗原受体T细胞(5×106细胞/只)，继续测量肿瘤大小。具体操作参照测试例4。
PD-1的表达水平的检测步骤如下所示：
(1)准备好200μL的抗凝剂于1.5mL EP管中，将毛细玻璃管从中间折断，该过程避免采血口污染。
(2)右手抓住小鼠尾巴，左手拇指和食指抓紧小鼠后颈部皮肤，压迫两侧使眼球突出、眼眶后静脉丛充血。抓取成功后，右手持毛细管，用毛细管平口端从眼内眦部与鼠面呈45°角，旋转刺入；刺入深度3mm，当感觉到有阻力即停止推进。
(3)同时移动小鼠和毛细管，将毛细管另一端向下使血液滴入EP管中，滴下3滴后迅速拔出毛细管并减轻小鼠颈部压力，尽量把眼眶周围的血渍擦干净，避免血液凝结成块；该过程时间不宜太长，避免小鼠窒息死亡。
(4)采血完毕，立即盖紧EP管盖，上下颠倒晃匀，放置冰上，防止血液凝结。
(5)在血样中加入1mL PBS缓冲液进行稀释，300g离心5min，用吸液器吸除上层液体，加入1mL 1×RBC Lysis Buffer，重悬沉淀的细胞，室温下裂解5min。
(6)300g离心5min，弃上清，再加入500μL 1×RBC Lysis Buffer，重悬细胞，室温下裂解5min。
(7)300g离心5min，吸尽上清，获得小鼠PBMC沉淀。
(8)用流式抗体染色工作液重悬细胞，置于冰上染色30min，避光，通过流式细胞术进行分析。
(9)安乐死小鼠后剪下适量肿瘤组织，在PBS缓冲液中进行研磨，用滤网将研磨液过滤到1.5mL EP管中；300g离心5min，吸尽上清，获得肿瘤。
(10)用流式抗体染色工作液重悬细胞，置于冰上染色30min，避光，通过流式细胞术进行分析。
流式细胞术分析结果如图5A、图5B、图5C和图5D所示。其中Mock表示注射的CAR-T细胞为CD19-CISH WT T细胞，MSLN表示注射的CAR-T细胞为MSLN-CISH WT T细胞，MSLNCISH KO表示注射的CAR-T细胞为MSLN-CISH KO T细胞。
外周血中的流式细胞分析结果如图5A和图5B所示，其中，图5A为小鼠的外周血中不同种类的CAR-T细胞的比例图，从图5A中可知，注射MSLN-CISH KO T细胞后的小鼠的外周血中CD3+阳性(包括CD4+阳性和CD8+阳性)的CAR-T细胞的比例较大，达到1.35％，其中，CD4+阳性的CAR-T细胞的比例和CD8+阳性的CAR-T细胞的比例分别为0.90％和0.45％，远大于注射CD19-CISH WT T细胞(CD4+阳性的CAR-T细胞的比例和CD8+阳性的CAR-T细胞的比例分别为0.071％和0.053％)或MSLN-CISH WT T细胞的小鼠(CD4+阳性的CAR-T细胞的比例和CD8+阳性的CAR-T细胞的比例分别为0.088％和0.113％)；结果表明，MSLN-CISH KO T细胞的活性更强，存活能力更高。
图5B为小鼠的外周血中PD-1的阴性比例图，从图5B中可知，注射MSLN-CISH KO T细胞后的小鼠的外周血中CD8+阳性的CAR-T细胞中PD-1的阴性比例较大，达到73.0％(说明阳性比例低)；注射CD19-CISH WT T细胞的小鼠的外周血中CD8+阳性的CAR-T细胞中PD-1的阴性比例为32.1％，注射MSLN-CISH WT T细胞的小鼠的外周血中CD8+阳性的CAR-T细胞中PD-1的阴性比例为23.7％；结果显示MSLN-CISH KO T细胞在外周血中具有更低的PD-1表达水平。
肿瘤组织中的流式细胞分析结果如图5C和图5D所示，其中，图5C为小鼠的肿瘤组织中不同种类的CAR-T细胞的比例图，从图5C中可知，注射MSLN-CISH KO T细胞后的小鼠的外周血中CD3+阳性(包括CD4+阳性和CD8+阳性)的CAR-T细胞的比例较大，达到2.277％，其中，CD4+阳性的CAR-T细胞的比例和CD8+阳性的CAR-T细胞的比例分别为0.344％和1.933％，远大于注射CD19-CISH WT T(CD4+阳性的CAR-T细胞的比例和CD8+阳性的CAR-T细胞的比例分别为0.220％和0.179％)细胞或MSLN-CISH WT T细胞的小鼠，(CD4+阳性的CAR-T细胞的比例和CD8+阳性的CAR-T细胞的比例分别为0.253％和0.153％)；结果表明，MSLN-CISH KOT细胞的活性更强，在肿瘤组织中的存活能力更高。
图5D为小鼠的肿瘤组织中PD-1的阴性比例图，从图5D中可知，注射MSLN-CISH KOT细胞后的小鼠的外周血中CD8+阳性的CAR-T细胞中PD-1的阴性比例较大达到26.4％(说明阳性比例低)；注射CD19-CISH WT T细胞的小鼠的肿瘤组织中CD8+阳性的CAR-T细胞中PD-1的阴性比例为8.82％，注射MSLN-CISH WT T细胞的小鼠的肿瘤组织中CD8+阳性的CAR-T细胞中PD-1的阴性比例为19.4％；结果显示MSLN-CISH KO T细胞在肿瘤组织内具有更低的PD-1表达水平。
测试例6
本测试例验证实施例7、实施例8、对比例1和对比例2中制备的嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤作用。
通过皮下注射在免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内移植入MKN28细胞(1×106细胞/只)，待肿瘤体积长至50mm3后，给小鼠注射CAR-T细胞5×106细胞/只，继续测量肿瘤大小。具体操作包括：
(1)取8周龄同一性别NSI小鼠，用左手大拇指、食指和中指抓紧小鼠的颈部和背部，无名指和小指固定好小鼠的尾巴。
(2)用胰岛素注射器吸取100μL MKN28细胞系悬液(1×106细胞/只)。喷适量酒精在小鼠腹股沟部消毒。将注射器以15°角度从下往上扎入皮下，轻挑针尖水平向前推进5mm，避免扎入腹膜或者穿透皮肤。
(3)轻推注射器针栓，将细胞悬液注射至小鼠腹股沟，可见皮肤被液体撑起小包则说明注射位置正确。注射完细胞悬液后缓缓拔出针头，防止漏液。
(4)2～3周后，小鼠腹股沟皮下长出肿瘤团块，挑选出肿瘤长势均一的小鼠均分成若干组。
(5)复苏冻存的CAR-T细胞，包括CAR-SOSC1 KO T细胞、CAR-SOCS3 KO T细胞、CD19-CISH WT T细胞和MSLN-CISH WT T细胞，计数后调整至各组CAR+(通过GFP+判断)细胞比例一致，调整密度至CAR+(GFP+)细胞密度为5×107细胞/mL，并分装成每管100μL。即每管5×106个CAR-T(GFP+)细胞。用尾静脉或皮下注射方式将CAR-T细胞注射到小鼠体内。
(6)当肿瘤长到可用游标卡尺测量的大小时，每周测量肿瘤大小两次，小鼠肿瘤的长记为a，宽记为b，根据v＝0.5×a×b2计算肿瘤体积。待肿瘤体积接近1000mm3或到实验终点时，处死小鼠。
图6为CAR-SOSC1 KO T细胞和CAR-SOCS3 KO T细胞的体内抗肿瘤作用验证结果；其中Mock表示注射的CAR-T细胞为CD19-CISH WT T细胞，MSLN表示注射的CAR-T细胞为MSLN-CISH WT T细胞，MSLN SOSC1 KO表示注射的CAR-T细胞为CAR-SOSC1KO T细胞，MSLNSOSC3 KO表示注射的CAR-T细胞为CAR-SOSC3 KO T细胞。从图6可以看出，CAR-SOSC1 KO T细胞和CAR-SOCS3 KO T细胞均能够抑制肿瘤的生长，具有优异的体内抗肿瘤的效果。
实施例10
本实施例提供一种含有细胞因子信号转导抑制因子SOCS5编码基因的重组慢病毒，所述重组慢病毒的制备方法包括如下步骤：
(1)构建慢病毒表达载体：构建方法参照实施例2，所述细胞因子信号转导抑制因子SOCS5编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
(2)制备重组慢病毒：制备方法参照实施例4。
实施例11
本实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞(靶向MSLN的CAR-SOCS5 OE T细胞)，所述靶向MSLN的CAR-SOCS5 OE T细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)T细胞激活：T细胞激活的方法参照实施例6。
(2)病毒转导T细胞：将激活完成的T细胞离心后去上清，用T细胞培养基(1640+10％ FBS+1％ P/S+300IU/mL IL-2)重悬后计数。
将T细胞稀释成约2×106细胞/mL，加入实施例10中所述的重组慢病毒和聚凝胺(8μg/mL)，病毒颗粒数与细胞数的比例为5:1，放置在37℃、5％ CO2培养箱中培养。培养后得到靶向MSLN的CAR-SOCS5 OE T细胞，将靶向MSLN的CAR-SOCS5 OE T细胞计数后离心，加入冻存液(90％ FBS+10％ DMSO)后混匀，冻存密度为1×108细胞/mL；每个冻存管中加入1mL细胞匀液。将冻存管放在梯度冻存盒中，于-80℃冰箱中降温；12h后转移至液氮罐中保存。
测试例7
本测试例测试实施例11和对比例1中制备的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤杀伤活性。
通过皮下注射在免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内移植入MKN28细胞(1×106细胞/只)，待肿瘤体积长至50mm3后，给小鼠注射CAR-T细胞5×106细胞/只，继续测量肿瘤大小。具体操作包括：
(1)取8周龄同一性别NSI小鼠，用左手大拇指、食指和中指抓紧小鼠的颈部和背部，无名指和小指固定好小鼠的尾巴。
(2)用胰岛素注射器吸取100μL MKN28细胞系悬液(1×106细胞/只)。喷适量酒精在小鼠腹股沟部消毒。将注射器以15°角度从下往上扎入皮下，轻挑针尖水平向前推进5mm，避免扎入腹膜或者穿透皮肤。
(3)轻推注射器针栓，将细胞悬液注射至小鼠腹股沟，可见皮肤被液体撑起小包则说明注射位置正确。注射完细胞悬液后缓缓拔出针头，防止漏液。
(4)2～3周后，小鼠腹股沟皮下长出肿瘤团块，挑选出肿瘤长势均一的小鼠均分成若干组。
(5)复苏冻存的CAR-T细胞，包括CAR-SOCS5 OE T细胞和MSLN-CISH WT T细胞，使用WT T细胞(分离的T细胞)作为对照进行同步实验，计数后调整至各组CAR+(通过GFP+判断)细胞比例一致，调整密度至CAR+(GFP+)细胞密度为5×107细胞/mL，并分装成每管100μL。即每管5×106个CAR-T(GFP+)细胞。用尾静脉或皮下注射方式将CAR-SOCS5 OE T细胞注射到小鼠体内。
(6)当肿瘤长到可用游标卡尺测量的大小时，每周测量肿瘤大小两次，小鼠肿瘤的长记为a，宽记为b，根据v＝0.5×a×b2计算肿瘤体积。待肿瘤体积接近1000mm3或到实验终点时，处死小鼠。
图7为CAR-SOSC5 OE T细胞的体内抗肿瘤作用验证结果。图7中，其中WT表示注射的细胞为分离的T细胞，MSLN表示注射的CAR-T细胞为MSLN-CISH WT T细胞(表达靶向MSLN的CAR-T细胞)，MSLN-SOSC5 OE表示注射的CAR-T细胞为CAR-SOSC5 OE T细胞。从图7可以看出，CAR-SOSC5 OE T细胞能够抑制肿瘤的生长，与未过表达组相比，过表达SOCS5组的CAR-T细胞体内抗肿瘤效果更佳，具有优异的体内抗肿瘤的效果。
综上，本发明提供的嵌合抗原受体T细胞在CAR-T细胞基础上敲除了CISH基因，能够解除CIS介导的免疫负调控功能，也降低了PD-1的表达水平，降低了T细胞免疫抑制作用，从而减少T细胞耗竭；本发明提供的另一种嵌合抗原受体T细胞在CAR-T细胞基础上分别敲除SOCS1基因或SOCS3基因，或过表达SOCS5基因，所得嵌合抗原受体T细胞能提升CAR-T细胞的抗肿瘤效果；所述嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤效果显著，能够用于实体肿瘤和血液肿瘤，具有广阔的应用前景。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达嵌合抗原受体且敲除了所述T细胞的SOCS3基因；
所述嵌合抗原受体包括依次连接的胞外识别结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域；
所述胞外识别结构域包括SEQ ID NO.1～8所示的氨基酸序列中的任意一种或至少两种的组合；
所述跨膜结构域包括CD28胞外空间域和跨膜区；
所述跨膜结构域包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
所述胞内共刺激信号传导结构域包括CD28、CD3ζ和TLR2的组合；
所述胞内共刺激信号传导结构域包括SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
所述嵌合抗原受体的靶点包括MSLN、PSCA、MUC1、GPC3、HER2、CD19、CD20或CD22中任意一种或至少两种的组合。
2.一种权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)构建含有编码嵌合抗原受体的核酸分子的慢病毒表达载体；所述嵌合抗原受体的靶点包括MSLN、PSCA、MUC1、GPC3、HER2、CD19、CD20或CD22中任意一种或至少两种的组合；
(2)将步骤(1)中所述的慢病毒表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒；
(3)将步骤(2)中所述重组慢病毒导入T细胞中，制备表达嵌合抗原受体的T细胞；
(4)将sgRNA和Cas9蛋白电转到步骤(3)中表达嵌合抗原受体的T细胞中，得到所述嵌合抗原受体T细胞；所述sgRNA靶向T细胞的SOCS3基因，所述sgRNA包括SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述包装质粒包括pMD2.G质粒和psPAX2质粒。
4.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述病毒包装细胞包括HEK 293T细胞。
5.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述慢病毒表达载体与pMD2.G质粒和psPAX2质粒的质量比为(8～9):3:12。
6.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述重组慢病毒的颗粒数与T细胞的数量比为(4.5～5.5):1。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
9.权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞、权利要求2-7中任一项所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法或权利要求7或8所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括实体肿瘤和/或血液肿瘤；
所述实体肿瘤包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或子宫内膜腺癌中任意一种或至少两种的组合；
所述血液肿瘤包括白血病和/或淋巴肿瘤。
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