CN112442485B - 一种抗肿瘤效果增强的免疫细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其是涉及通过改造免疫细胞的特定基因来增强免疫细胞的抗肿瘤作用，具体为通过技术手段降低PRNP基因(prion protein,PrP，朊蛋白)的表达量来增强免疫细胞的抗肿瘤效果。通过对人组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞系敲降PrP,获得PrP低表达的免疫细胞系。该细胞系对人或小鼠的结肠癌和黑色素瘤细胞生长的抑制能力增强，同时该免疫细胞系被肿瘤细胞诱导后，自身细胞生长水平加快。

Description

一种抗肿瘤效果增强的免疫细胞系
技术领域
本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其是涉及通过改造免疫细胞的特定基因来增强免疫细胞的抗肿瘤作用，具体为通过技术手段降低PRNP基因的表达量来增强免疫细胞的抗肿瘤效果。
背景技术
癌症作为现如今的威胁人类健康的几大疾病之一，其治疗方式备受瞩目。在所有的肿瘤治疗方法中，免疫细胞治疗的疗效已在临床上被证实，而其中的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)被认为是最具有前景的治疗方式之一[1]。
CAR-T作用的基本原理是利用免疫细胞来清除癌细胞。在正常机体中，T细胞能够通过抗原递呈细胞与非正常细胞表面的MHC接触进而识别异常的细胞从而进行清除；另一方面，T细胞也可与细胞分泌的相应抗原配体结合进而识别正常细胞与非正常细胞进而进行清除。然而，机体内的癌细胞可以通过相应的逃逸机制，或隐藏MHC抗原，或分泌类似与抑制剂PD-1的PD-L1来抑制T细胞的激活，从而躲避机体的免疫杀伤[2]。而嵌合抗原受体(CAR)作为CAR-T的核心部件，其赋予了T细胞对于以癌细胞表面的特征蛋白作为靶点、不受MHC的限制，通过其他方式识别肿瘤抗原的能力。
在早期的CAR-T疗法中，其治疗效果并没有达到预期，其主要原因在于改造后的T细胞对肿瘤细胞的识别能力不足以及其回输到体内后细胞活性不足，从而很难发挥出应有的作用。在CAR的基础设计中，其包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区[3,4]。在第一代的CAR-T疗法中，T细胞激活通过CD3z链或FceRIg上的酪氨酸激活基序来完成，其中的CD3z链能够提供T细胞激活、裂解靶细胞、调节IL-2分泌以及体内发挥抗肿瘤活性所需的信号[5]。但第一代CAR-T细胞的抗肿瘤活性在体内受到了限制，T细胞增殖减少最终导致T细胞的凋亡。第二代的CAR-T疗法则是在第一代的基础上加上了一个新的共刺激信号，目前最常见的是CD28或4-1BB，显著增强了对肿瘤细胞裂解的记忆效应以及CAR介导的杀伤效应[6]。第三代则是在第二代的基础之上，对这些信号加以改变或是增加另外的信号因子来进一步强化其在体内的作用效能，而这项工作则需要对现有靶点进行改造或发现新的有关靶点来优化进而完成。
朊蛋白(Prion Protein,PrP)是由位于人类第20号染色体短臂上的PRNP基因所编码的一种糖蛋白，通过其C端的糖基磷脂酰肌醇结构锚定在细胞膜表面[7]。该基因在包括哺乳动
物、爬行类、鸟类等大多数脊椎动物中均存在，且物种间具有高度保守性。近年来的研究表明，朊蛋白可能参与了诸如信号转导、细胞黏附、免疫调控、金属离子稳态、机体凋亡调控等生命活动过程[8,9]。在对朊蛋白的生理功能的研究中，我们发现朊蛋白低表达的免疫细胞株系显示了更强的抗肿瘤效应，而且本身增殖加强，因此可以作为免疫治疗的一个新靶点，后续也可以应用在CAR-T疗法中。
发明内容
本发明的目的在于提供一个免疫治疗的新靶点。
本发明的目的在于提供一种对肿瘤细胞杀伤性增强的免疫细胞系。
本发明的目的在于提供一种能被肿瘤细胞诱导后，细胞生长增殖水平加快的免疫细胞株。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一方面，本发明提供一个免疫治疗新靶点。其特征在于，免疫细胞的PrP表达量被敲低。优选地，所述操作是在免疫细胞中对PRNP基因进行改造，其技术手段包括RNA干扰，但不限于此，可扩展为基因编辑等其它使得PrP表达量降低的技术手段。
另一方面，本发明提供一种对肿瘤细胞杀伤性增强的免疫细胞系。其特征在于应用于结肠癌和黑色素瘤，将所述细胞系与结肠癌细胞以及黑色素瘤细胞共培养后，结肠癌细胞以及黑色素瘤细胞生长与对照组相比更低。优选地，所述肿瘤包含结肠癌和黑色素瘤，但不限于以上的两种肿瘤。经实验证实，所述细胞系能抑制肿瘤细胞的生长。
作为一优选的实施方式，所述的免疫细胞，其特征在于，免疫细胞为人组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞系。优选地，所述免疫细胞来源为淋巴系细胞但不限于U937，可扩展为其它淋巴细胞系或原代淋巴细胞。
作为一优选的实施方式，对来源于人和小鼠的肿瘤细胞有效。优选地，所述针对的肿瘤来源包含人与小鼠，但不限于人和小鼠中的任意一种来源。经实验证实，所述细胞系能抑制人源和鼠源的肿瘤细胞的生长。
同时，本发明提供一种能被肿瘤细胞诱导后，细胞生长增殖水平加快的免疫细胞株。其特征在于，对PRNP基因表达进行改变，与肿瘤细胞共培养后，对肿瘤细胞生长具有抑制作用，同时该免疫细胞系能被肿瘤细胞诱导后，细胞生长水平加快。经实验证实，所述免疫细胞系能在肿瘤细胞诱导后，细胞生长水平加快。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的对肿瘤细胞抑制增强的免疫细胞系能够抑制肿瘤细胞的生长，其对于人源结肠癌细胞HT-29在1：2(肿瘤细胞：U937细胞)共培养条件下的平均抑制率达到41％，优于未加改造的空白对照系(说明书附图1)；其对于人源黑色素瘤细胞MBA-MD-435在1：2共培养条件下的平均抑制率达到12％，优于未加改造的空白对照系(说明书附图2)；其对于鼠源黑色素瘤细胞B16在1：2共培养条件下的平均抑制率达到22％，优于未加改造的空白对照系。
2.本发明提供的被肿瘤细胞诱导后本身细胞生长增殖水平加快的免疫细胞株，其与人源结肠癌细胞HT-29在1：2共培养条件下的自身增殖率比未加改造的空白对照系平均值高30％(说明书附图4)；其与人源黑色素瘤细胞MBA-MD-435在1：2共培养条件下的自身增殖率比未加改造的空白对照系平均值高21％(说明书附图5)；其与鼠源黑色素瘤细胞B16在1：2共培养条件下的自身增殖率比未加改造的空白对照系平均值高18％(说明书附图6)。而在单独培养时，该免疫细胞株增殖能力显著弱于未加改造的空白对照系(说明书附图7)。
本发明所提供的细胞具有以下特点：
第一，本发明所述免疫细胞系对来源于人和鼠的相同部位的不同肿瘤细胞在生长上均有比野生型更强的抑制作用，说明该免疫细胞系具有广谱的抗肿瘤效果，可利用于后续的肿瘤免疫治疗中。
第二，本发明所述细胞系在被肿瘤细胞诱导后，生长和增殖速度加快，说明该细胞系对肿瘤细胞有更强的敏感性以及更高的诱导增殖能力，可用作新的免疫治疗靶点。
附图说明
图1为U937-siPrP对HT29细胞生长的抑制能力优于U937-siLuc。
图2为U937-siPrP对MBA-MD-435细胞生长的抑制能力优于U937-siLuc。
图3为U937-siPrP对B16细胞生长的抑制能力优于U937-siLuc。
图4为U937-siPrP与HT29细胞共培养后自身增殖能力优于U937-siLuc。
图5为U937-siPrP与MBA-MD-435细胞共培养后自身增殖能力优于U937-siLuc。
图6为U937-siPrP与B16细胞共培养后自身增殖能力优于U937-siLuc。
图7为在单独培养时，U937-siPrP增殖能力显著弱于U937-siLuc。
图8为Western blot鉴定U937-siPrP的PrP蛋白表达量低于U937-siLuc。
具体实施方式
结合以下具体实例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
本发明用于所述细胞株构建和验证的方法，包括以下步骤：步骤S1，RNAi的位点选
择和慢病毒载体的来源；
步骤S2，细胞准备；
步骤S3，确定药筛浓度；
步骤S4，U937细胞的感染实验；步骤S5，药物筛选；
步骤S6，PrP的表达鉴定；
步骤S7，细胞系对肿瘤细胞的抑制作用和增殖率的测定。其中，获得所述细胞系的构
建进一步包括以下步骤：
一、确定PRNP基因的干扰序列为：GAGCAGGCCCATCATACAT，由商用公司代为生产慢病毒载体后，根据常规的实验方案进行细胞株系的构建。
二、细胞的准备
(1)复苏细胞：将冻存的细胞从液氮罐中快速取出，马上拧紧冻存管盖后迅速转移到装有37℃纯水的干净烧杯中，同时不断晃动，使其快速融化。
(2)待融化后迅速取出，在超净台中用枪头吸出置于1.5mL无菌离心管管中，1,000rpm离心5min。
(3)去掉上层的液体，然后用预热后的培养基吹打沉淀制成细胞悬液，转移到60mm培养皿中，放在37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱中培养，第二天观察细胞生长情况。若生长情况良好，则正常两天换一次液。
(4)在细胞生长旺盛期消化、计数，取1×106个细胞铺于六孔板中，待细胞贴壁。同时一部分细胞按1×105/孔的浓度铺于24孔板中用于做嘌呤霉素的药筛曲线；
三、确定药筛浓度
药筛浓度的确定是在24孔板的每孔中加入5×105个细胞，待细胞密度达到60-70％时分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0(单位：ug/mL)共9个浓度的嘌呤霉素，每个药物浓度我们设置了三个平行孔。U937采用去一加一的方式换液)，一周后同一浓度的24孔板孔内细胞全部死亡的最低浓度的嘌呤霉素浓度即为合适的药物筛选浓度，U937细胞药筛浓度为0.4ug/mL。
四、U937细胞的感染实验
(1)实验前一天将生长状态良好的HT29细胞和U937细胞计数后配成细胞悬液，按照分组在96孔板中每孔分装100μL培养基即接种5,000个细胞，实验时细胞融合度为50％。
(2)干扰预试验共分为二组，第一组为正常情况下感染，第二组为感染时添加5ug/mL的Polybrene以增加感染率，两组均设置不同浓度的感染梯度。
(3)感染前更换为新鲜培养基，按不同的分组情况分别在每个孔中加入所需的培养基90μL。每个感染浓度设置三个平行孔。
(4)准备2个无菌离心管，取出10μL感染系数为1×108TU/mL的病毒上清加入到第一个离心管中，需要轻轻吹打混匀，避免产生泡沫，记为10倍稀释；再从这个管中中取出10μL的液体加入到到第二离心管中，轻轻吹打混匀，记为100倍稀释。如此梯度稀释，我们得到三个不同浓度的病毒上清的梯度。
(5)将三个不同梯度的病毒上清液各取出10μL添加到加到每个感染浓度的的三个孔中，把细胞放回培养箱继续培养。
(6)8-12h以后注意观察加入病毒上清组细胞状态与未加组间有无差异，然后放回细胞培养箱中继续培养，一天后将其更换为新鲜培养基。
(7)感染3-4天后，在荧光显微镜下观察荧光表达情况，得到细胞的感染方法和感染参数。
(8)根据得到的细胞的感染方法和感染参数进行正式的感染实验。五、感染后细胞株系的分离和纯化
在正式感染3-4天后观察细胞生长状况和绿色荧光表达情况，根据细胞密度细胞转移到稍大的培养皿中继续培养，之后第二天开始加入前面确定的药筛浓度嘌呤霉素筛选掉阴性细胞，再根据荧光结果较强、感染细胞较多的平行孔细胞株继续培养、扩增，然后通过稀释重新接种到96孔培养板中进行纯化，得到荧光信号较强的细胞株。后续再进过多克隆分选进一步纯化，然后扩增后提取蛋白做WB鉴定其PrP的表达量已被敲低(说明书附图8)。六、细胞共培养
(1)共培养过程中需要使用同一种培养基，故实验开始之前需要将U937的培养基从RPMI-1640通过每次换液加入部分McMcy’s 5A的培养基，直到最后完全用McMcy’s 5A培养基培养。期间需要观察U937细胞的状态和生长情况，完全更换之后还需要用台盼蓝染液对细胞活性进行检测。本实验U937细胞可在McMcy’s 5A培养基中正常生长且细胞活性不被影响。
(2)细胞准备与混合液的配制等步骤同上，详见上文。
(3)将HT29等细胞按照50cells/uL的浓度将其按照每孔5,000个细胞分装到96孔板中，放回培养箱培养3h。
(4)将两种U937细胞按照与HT29等细胞按1:2的比例配好混合液，然后分装到已加HT29细胞的96孔板中，放回培养箱培养。期间尽量避免移动对其造成影响。
(5)共培养后的第三天用去一加一的方式换液，若小于三天则可以不换。
(6)共培养五天后摇晃96孔板后用枪头吸出培养基，其中为U937细胞，然后按照培养基与CCK8为9:1的比例加入CCK8溶液，培养3h后在酶标仪中450nm下读取吸光度；剩下的HT29细胞用PBS清洗两遍后，按照无血清培养基与MTT溶液的比例为9:1的比例每孔中分装100uL两者的混合液，培养3h。
(7)3h后用枪头吸掉96孔板中的液体，注意吸取干净，但也要注意避免下层甲腊晶体也被吸出，然后加入DMSO进行溶解，30min后在酶标仪中570nm下读取吸光度值。
(8)U937与MBA-MD-435/B16肿瘤细胞的共培养过程参照(1)-(7)，培养基为RPMI-1640。
数据分析
结合以上具体实例和附图，对本发明实施过程中所得到的数据处理和分析作进一步的详细说明。实施本发明的过程中，实施过程分成了三组，分别为不进行共培养组、与U937-siLuc共培养组以及与U937-siPrP共培养组。主要得到的数据为衡量肿瘤细胞生长增殖速度的MTT法所测OD值和衡量U937细胞生长增殖速度的CCK8法所测OD值。
为了有效地统计U937细胞系对肿瘤细胞生长的影响以及其与肿瘤细胞共培养后的生长增殖速度上的变化，因此我们提出了一下两个概念：肿瘤细胞抑制率和共培养后的U937免疫细胞增殖增长率，其计算公式如下：
(1)U937-siLuc引起的肿瘤细胞抑制率：
Figure BDA0002189928380000061
(2)U937-siPrP引起的肿瘤细胞抑制率：
Figure BDA0002189928380000062
公式(1)和(2)中，ODWT表示野生型的肿瘤细胞未进行共培养时的MTT吸光度值，ODsiLuc为与U937-siLuc细胞系共培养后的肿瘤细胞的MTT吸光度值，ODsiPrP为与U937-siPrP细胞系共培养后的肿瘤细胞的MTT吸光度值。
(3)U937-siLuc与肿瘤细胞共培养后免疫细胞自身的增殖增长率：
Figure BDA0002189928380000071
(4)U937-siPrP与肿瘤细胞共培养后免疫细胞自身的增殖增长率：
Figure BDA0002189928380000072
公式(3)和(4)中，ODWT表示U937-siLuc细胞系未与肿瘤细胞进行共培养时的CCK8的吸光度值，ODsiLuc为与肿瘤细胞共培养之后U937-siLuc细胞系的CCK8吸光度值，ODsiPrP为与肿瘤细胞共培养之后U937-siPrP细胞系的CCK8吸光度值。
特别说明：肿瘤细胞与免疫细胞的比例实施了2：1，1：1以及1：2，其效果类似，本说明书以1：2举例说明，但应用不限于此比例。另外，肿瘤细胞抑制率和免疫细胞增殖增长率换算为百分数作图。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种抗肿瘤效果增强的免疫细胞系
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagcaggccc atcatacat 19

Claims (2)

1. 一种基于 PRNP 基因干扰的免疫细胞系在制备用于抑制肿瘤细胞的生长的药物中的应用，其特征在于，通过 RNA 干扰（RNAi）手段对 PRNP 基因进行干扰，敲低 PrP 表达量；干扰序列为：GAGCAGGCCCATCATACAT，对免疫细胞系进行改造；所述基因表达产物为朊蛋白，prion protein, PrP；所述免疫细胞系为人组织细胞淋巴瘤细胞系 U937；所述肿瘤为结肠癌或黑色素瘤。
2. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为来源于人或小鼠的肿瘤细胞。
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