CN115947865A - 一种嵌合抗原受体、表达构建物、car-t细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体、表达构建物、CAR‑T细胞及其应用。所述表达构建物，其包括编核苷酸序列1，所述核苷酸序列1编码如本文所述的嵌合抗原受体和信号肽(优选还包括编码DGKα敲减元件的核苷酸序列2)。所述CAR‑T细胞包括本发明所述的表达构建物、表达载体或病毒。本发明所述的CAR‑T细胞对肿瘤的杀伤效果较强，增加DGKα敲减元件后的杀伤效果显著强于只含CAR结构的T细胞，在CAR‑T细胞中敲减DGKα与CAR结构起到了协同作用。

Description

一种嵌合抗原受体、表达构建物、CAR-T细胞及其应用

本申请要求申请日为2021年9月18日的中国专利申请CN202111133535.2的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种嵌合抗原受体、表达构建物、CAR-T细胞及其应用。

背景技术

肿瘤治疗是困扰人类的最大难题之一，常规治疗手段都各有局限。随着科技的进步，随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，肿瘤免疫治疗正逐渐成为肿瘤治疗的发展方向，被称为第四大肿瘤治疗技术。作为肿瘤免疫治疗领域的新宠，免疫细胞治疗技术在近年来迅猛发展，研究发现，T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T免疫疗法)是近几年来迅速发展起来的一种新型细胞免疫治疗技术。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是一种由抗原识别域、铰链区、跨膜区和胞内信号域依次组成的模拟TCR功能的人工受体，其中，抗原识别域通常为特异性结合靶点的单链抗体。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是通过将外源性人工设计的CAR基因导入T细胞内进行基因修饰改造后得到的表达有CAR的T细胞。

CAR-T免疫疗法在治疗血液肿瘤方面取得了前所未有的成功，诺华与吉利德(收购Kite Pharma)分别研发的Kymriah和Yescarta两款CAR-T产品在2017年相继被FDA批准上市，给全球成千上万癌症病人带来希望。截至目前，已有5款针对血液瘤的CAR-T药物获得FDA批准。

针对实体瘤的CAR-T疗法还未有上市的报道。CAR-T细胞治疗实体瘤存在的一个关键问题是缺乏特异性抗原。肿瘤中稳定并特异高表达的表面蛋白是实体瘤CAR-T细胞理想的靶点，靶点的特异性对CAR-T细胞治疗尤为重要。血液肿瘤的抗原具有特异性，在其他正常组织没有表达，而针对实体瘤的抗原一般在其他部位，如心脏、肺、肝脏等有少量表达，这就伴随了治疗的脱靶效应。

间皮素(Mesothelin，MSLN)是一种40kda的位于细胞上的糖蛋白膜。正常情况下，MSLN蛋白在正常组织中基本呈低水平表达。研究表明，MSLN基因敲除小鼠在生长、发育、繁殖和造血方面与正常小鼠相似，提示MSLN对维持机体正常功能可能不起关键作用。但MSLN在各种癌症中高表达，包括卵巢癌、胸膜间皮瘤、胰腺癌、胆管癌与三阴性乳腺癌等。虽然MSLN的生理功能尚不明确，越来越多的研究表明MSLN对于促进肿瘤的发生和发展起着重要的作用。此外，临床观察研究表明MSLN的高表达与晚期，预后差等肿瘤分级高度相关。因其在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，但在30％的肿瘤中高表达，而成为备受关注的肿瘤细胞特异性靶向抗原。

CAR-T细胞治疗实体瘤存在的另一关键问题是存在肿瘤免疫抑制微环境。由免疫检查点介导的免疫抑制信号组成的肿瘤微环境，在促进肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。在CAR-T细胞被抗原激活后，它们通过和相关配体结合，抑制CAR-T细胞的增殖和细胞因子分泌功能。特别是在肿瘤浸润CAR-T细胞上，这些抑制性分子表达进一步上调，其介导的下游信号大大限制了CAR-T细胞在实体瘤部位的抗肿瘤免疫效应。

二酰基甘油激酶(DGK)是一种将甘油二酰基磷酸化的酶磷脂酸(PA)。因为DGK可与CD3信号传导中涉及的基本蛋白如蛋白激酶C(PKC)和Ras激活蛋白(RasGRP1)相互作用，因此，DGK的激活可导致TCR远端分子的下调，包括细胞外信号相关激酶1/2(ERK1/2)。DGK的两种同型，DGKα和DGKζ，主要在T细胞中表达。近年来，许多研究表明DGKα可能是一种潜在的免疫抑制检查点(参见In-Young J,Yoon-Young K,Yu H S,et al.CRISPR/Cas9-mediatedknockout of DGK improves anti-tumor activities of human T cells[J].CancerResearch,2018:canres.0030.2018-.及Prinz P U,Mendler A N,Masouris I,et al.HighDGK-αand Disabled MAPK Pathways Cause Dysfunction of Human Tumor-InfiltratingCD8+T Cells That Is Reversible by Pharmacologic Intervention[J].Journal ofImmunology,2012,188(12):5990.)，因为它们在人肾癌患者和异种移植小鼠模型的肿瘤浸润的无能T细胞中异常高表达。通过小分子抑制DGKα活性，可重新激活功能低下的肿瘤浸润效应功能免疫细胞。基于之前的研究，抑制人T细胞中的DGKα在癌症免疫治疗中具有强大的治疗潜力。

发明内容

针对现有的CAR-T细胞在肿瘤微环境的肿瘤杀伤效果降低的缺陷，本发明提供了一种嵌合抗原受体、表达构建物、CAR-T细胞及其应用。所述表达构建物，其包括编核苷酸序列1，所述核苷酸序列1编码如本文所述的嵌合抗原受体和信号肽(优选还包括编码DGKα敲减元件的核苷酸序列2)。所述CAR-T细胞包括本发明所述的表达构建物、表达载体或病毒。本发明所述的CAR-T细胞对肿瘤的杀伤效果较强，增加DGKα敲减元件后的杀伤效果显著强于只含CAR结构的T细胞，在CAR-T细胞中敲减DGKα与CAR结构起到了协同作用。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括特异性识别MSLN的胞外结合结构域、跨膜区、共刺激结构域和信号转导域，所述胞外结合结构域为MSLN单链抗体(MSLN-scFv)，所述MSLN单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在本发明一具体实施例中，编码所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明一具体实施例中，所述跨膜区为氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的CD8α来源的跨膜区。更优选地，编码所述CD8α来源的跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明一具体实施例中，所述共刺激结构域为CD28-4-1BB，其中CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。更优选地，编码所述CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码所述4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在本发明一具体实施例中，所述信号转导域为氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的CD3ζ来源的信号转导域。更优选地，编码所述CD3ζ来源的信号转导域的核苷酸序列如SEQID NO:6所示。

在本发明一具体实施例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。优选地，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种表达构建物，其包括编核苷酸序列1，所述核苷酸序列1编码如本文所述的嵌合抗原受体和信号肽。

在本发明一具体实施例中，所述信号肽为CD8leader，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述CD8leader的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

在本发明一具体实施例中，所述核苷酸序列1还包括所述嵌合抗原受体和信号肽的转录启动子，所述转录启动子优选为EF1a，所述EF1a的序列如SEQ ID NO:28所示。

在本发明一优选实施例中，所述表达构建物还包括编码DGKα敲减元件的核苷酸序列2。

本发明中，所述DGKα敲减元件可以在细胞中抑制DGKα蛋白的表达。

优选地，所述DGKα敲减元件包括DGKαshRNA，所述DGKαshRNA的核苷酸如SEQ IDNO:8所示。更优选地，所述DGKα敲减元件还包括启动子，优选为人源H1启动子或人源U6启动子。

在本发明一具体实施例中，所述人源H1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示在本发明一具体实施例中，所述人源U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在本发明一具体实施例中，所述核苷酸序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO:22或23所示。

在本发明一具体实施例中，所述表达构建物的结构为核苷酸序列2-核苷酸序列1。

在本发明一具体实施例中，所述表达构建物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24-27任一项所示。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种表达载体，其包括如本文所述的表达构建物和出发载体。

在本发明一具体实施例中，所述出发载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体中的一种或多种；优选地，所述出发载体为慢病毒载体，所述慢病毒载体优选为pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral Expression Vector。

在本发明一具体实施例中，所述慢病毒载体的包装采用四质粒包装系统，所述四质粒包装系统包括pPACKH1-GAG质粒、pPACKH1-REV质粒、pVSV-GPSPAX2质粒和本发明所述的表达构建物。

在本发明一具体实施例中，所述嵌合抗原受体(CAR)的转录启动子为EF1a。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种病毒，所述病毒包含如本文所述的表达载体。优选地，所述的病毒为慢病毒。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：如本文所述的表达构建物、如本文所述的表达载体或如本文所述的病毒在制备靶向MSLN并敲减DGKα的CAR-T细胞中的用途。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其包括如本文所述的表达构建物、如本文所述的表达载体或如本文所述的病毒。

优选地，所述CAR-T细胞的出发细胞为真核细胞；更优选地，所述CAR-T细胞的出发细胞为分离的人细胞，例如T细胞。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：如本文所述的表达载体的制备方法1，所述制备方法1包括以下步骤：将所述编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列1和编码DGKα敲减元件的核苷酸序列2导入出发载体中，得所述表达载体。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：如本文所述的CAR-T细胞的制备方法2，所述制备方法2包括以下步骤：将如本文所述的表达构建物、如本文所述的表达载体或如本文所述的病毒转入带修饰的细胞内，从而获得所述CAR-T细胞。

优选地，所述CAR-T细胞的出发细胞为真核细胞。更优选地，所述CAR-T细胞的出发细胞为分离的人T细胞。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体以及如本文所述的CAR-T细胞。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种药盒，包括药盒A和药盒B，所述的药盒A包括包如本文所述的CAR-T细胞，所述药盒B包括化疗药物。

在本发明一具体实施例中，所述的药盒A和所述的药盒B的施用不分先后。

为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：如本文所述的表达构建物、如本文所述的表达载体、如本文所述的病毒、如本文所述的CAR-T细胞或如本文所述的药物组合物在制备抑制肿瘤的药物中的用途。优选地，所述的肿瘤为MSLN阳性的肿瘤。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明具有以下有益效果：

本发明所述的CAR-T细胞对肿瘤的杀伤效果较强，当所述CAR-T细胞还包含DGKα敲减元件后，其抗肿瘤功能得到增强，所述CAR和所述DGKα敲减元件具有协同作用。不仅可以用于MSLN阳性的多种实体肿瘤的治疗，而且解除DGKα信号通路对CAR-T细胞的抑制作用，提高CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用。本发明提供的靶向MSLN并敲减DGKα以增强抗肿瘤功能的CAR-T细胞，具有安全、高效等优点，在实体瘤免疫细胞治疗领域拥有巨大的应用价值。

附图说明

图1是本发明的CAR结构示意图；

图2是本发明的靶向MSLN的CAR-T载体的双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本发明的靶向MSLN并敲减处DGKα以增强抗肿瘤功能的CAR-T载体的双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4是本发明的CAR-T细胞的流式细胞检测图；

图5是本发明的DGKα敲减元件对CAR-T细胞中DGKα表达的抑制作用图；

图6是本发明的RTCA检测CAR-T细胞对SKOV3细胞的杀伤效率曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明提供了一种靶向MSLN并敲减DGKα以增强抗肿瘤功能的CAR-T载体，具体方案如下：包括首先制备识别并靶向Mesothelin(MSLN)的三代嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括MSLN抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，所述嵌合抗原受体由人EF1a启动子启动转录。同时，该载体包括5’端的DGKαshRNA，由人U6启动子转录。MSLN靶点具有肿瘤特异性高表达且在正常组织中表达较低的优异特点。在此基础上，通过shRNA技术敲减T细胞中的DGKα的表达，抑制了肿瘤细胞免疫逃逸的发生，进而增强CAR-T细胞对MSLN靶点阳性肿瘤细胞的杀伤效果。

载体包括PUC19质粒、pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral Expression Vector慢病毒载体，用EcoRI与NotI双酶切插入片段。该表达载体包括：EF1a启动子；外源基因插入的位置；WPRE元件；SV40 polyA序列；启动子和增强子等调控元件；慢病毒包装元件等关键元件。

该慢病毒表达载体可作为使目的基因在几乎所有哺乳动物细胞包括非分裂细胞和分裂细胞中表达的最有效载体，其可容载外源基因片段大，转染效率较高，对T细胞也能达到满意的转染效果。

一、实验材料

1.慢病毒表达质粒pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral Expression Vector购自ALSTEM，慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV和pVSV-GPSPAX2购自SBI；

2.DGKα敲减元件(SEQ ID NO:22)、EF1a(SEQ ID NO:28)和anti-MSLN CAR(SEQ IDNO:20)的表达构建物(SEQ ID NO:24)由上海美丽人生医疗科技有限公司设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以PUC19质粒形式保存，结构如图1所示；

3.限制性核酸内切酶购自NEB，包括PacI(货号R0547S)，NheI-HF(货号R3131S)，AgeI-HF(货号R3552S)，EcoRV-HF(货号R3195S)。

4.T4 DNA ligase、Free H₂O、TB

Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)购自Takara；

5.感受态细胞购自Trans；

6.胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；

7. 293T细胞(中科院目录号SCSP-502)、SKOV3(中科院目录号TCHu185)和ES-2(中科院目录号TCHu111)细胞购自中科院细胞库；

8.FBS、DMEM、1640培养基，PBS，Opti-MEM，lipofectamine 2000购自Gibco；

9.CD3单抗、CD28单抗、IL-2购自于上海近岸蛋白质科技有限公司；

10.Multiskan GO酶标仪+uDrop超微量板、流式细胞仪购自ThermoFisher；

11.HE120水平电泳槽、Tanon凝胶成像仪购自Tanon；

12.隔水式恒温培养箱、恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司；

13.Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型电泳系统购自Bio-Rad；

14.奥林巴斯显微镜购自奥林巴斯；

15.接种环、涂布棒购自洁特生物过滤股份有限公司；

16.注射器，0.45μm滤膜、各规格的培养皿，培养瓶，多孔培养板，各种规格离心管购自Corning。

实施例1靶向MSLN并敲减DGKα的CAR-T载体的构建

(一)质粒提取

从-80℃冰箱分别取出含有慢病毒表达质粒pLenti-MCS-EF1-GFP LentiviralExpression Vector和PUC19质粒的甘油菌，分别取5μL接种于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床振荡培养12-16h，条件为37℃，250rmp。

按照购自天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒(货号：DP103-03)的说明书进行质粒提取，获得慢病毒表达质粒pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral Expression Vector和含有DGKα敲减元件的PUC19质粒，以及anti-MSLN CAR结构的PUC19质粒。

(二)酶切、连接、转化

将已提取的慢病毒表达质粒pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral ExpressionVector和含有MSLN单链抗体CAR结构的PUC19质粒同时进行双酶切，将酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察并记录结果。

用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号：DP209-02)说明书进行目的条带回收，将回收片段按CAR结构：pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral Expression Vector＝5:1的摩尔比进行连接，并进行转化至感受态细胞，将转化后的感受态细胞滴于预热的固体培养基上，做好标记，在37℃孵箱过夜。

(三)提质粒、酶切验证、测序

挑取部分菌落于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床进行增菌培养并进行质粒抽提，质粒抽提之前取出500μL于1.5mL Ep管中，用作菌种保存，储存于-80℃；将抽提产物采用双酶切验证，取条带正确的质粒1μg送生工生物工程(上海)有限公司进行测序(如图2所示，图中目的片段为含有CAR结构)。将测序结果正确的质粒进行抽提。

(四)基于以上构建的含有MSLN单链抗体CAR结构的慢病毒质粒，利用上述同样的方式，将DGKα敲减元件插入含有MSLN单链抗体CAR结构的慢病毒质粒，最终获得一种靶向MSLN并敲减DGKα以增强抗肿瘤功能的CAR-T载体(如图3所示，图中目的片段为含有DGKα敲减元件)。

实施例2靶向MSLN并敲减DGKα的CAR-T的构建

(一)浓缩病毒液的制备

采用四质粒包装系统进行慢病毒包装。四质粒分别为含有DGKα敲减元件和CAR结构的慢病毒表达质粒pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral Expression Vector，慢病毒包装质粒慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-GPSPAX2。细胞为293T细胞。

具体实施步骤如下：

(1)转染前24h内进行铺板：一般选择传代次数在3代以内的细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度，生长密度达到80％的293T细胞进行铺板；

(2)待生长密度达60-90％，细胞状态良好，即可进行病毒包装；

(3)使用SBI慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV和pVSV-GPSPAX2，以及本发明构建的两种慢病毒质粒，并按照SBI说明书进行慢病毒质粒配比。

(4)转染试剂选择lipofectamine 2000(4℃保存)，加入量为2μL/μg质粒；

(5)将(3)中质粒混合物与(4)中转染试剂混合物混于一管中，室温静止20min后，加入换液细胞中，继续培养；

(6)分别收集48h、72h后培养上清，通过0.45μm滤膜过滤；

(7)将收集的病毒液采用PEG8000浓缩法进行浓缩，并测定病毒滴度，储存于﹣80℃备用。

四、慢病毒感染获得的CAR-T细胞的鉴定与检测

(一)流式细胞术检测CAR结构阳性表达率

1、检测CAR结构阳性表达率

1)将取得的NC组细胞(未进行病毒感染)和样本组细胞(已进行病毒感染)，使用PBS+2％BSA温和洗涤2次，1500rpm/6min，弃去废液；

2)NC管中加入200μL PBS，重悬；样本管中加入100μL PBS，重悬，再加入100μL一抗工作液(3μg/mL，MSLN-biotin(货号：MSN-H82E9,品牌：Acro),APC anti-biotin(货号：405207,品牌：Biolegend))，混匀；

3)室温孵育1h，1500rpm/3min，弃去废液；

4)加入200μL PBS，温和混匀重悬，1500rpm/3min，弃去废液；

5)NC管中加入200μL PBS，重悬；样本管中加入200μL PBS，重悬，再加入5μL二抗工作液，混匀；

6)室温避光孵育1h后，1500rpm/3min，弃去废液，使用PBS+2％BSA温和洗涤3次，离心条件为1500rpm、3min，弃去废液；

7)加入100μL PBS，温和混匀重悬后上机检测。

如图4所示，CAR-T细胞占T细胞总量的59.53％。

实施例3 qPCR检测DGKα敲减元件对DGKα表达的抑制作用

使用TB

Premix Ex Taq^TMII试剂盒，参考Takara的TB

Premix ExTaq^TMII(Tli RNaseH Plus)说明书，以qPCR的方法对T细胞，无DKGα敲减的CAR-T细胞，有DGKα敲减的CAR-T细胞样本进行DGKα表达检测，所用DGKΑ检测引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，具体信息如下：

hDGKα-F:5’-GAGGATGGCGAGATGGCTA-3’(SEQ ID NO:9)

hDGKα-R:5’-CCCAATCCAGGTATTCAGCC-3’(SEQ ID NO:10)

hβ-Actin F:5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID NO:11)

hβ-Actin R:5’-GAAGGTAGTTTCGTGGATGCC-3’(SEQ ID NO:12)

结果见图5，其中**表示p≤0.01，***表示p≤0.001，可见DGKα敲减元件对T细胞中DGKα的表达具有明显的抑制作用。

实施例4 RTCA实时细胞杀伤检测

1)以卵巢癌细胞SKOV3为例(为MSLN靶点阳性细胞，同时使用MSLN靶点阴性细胞ES-2作为对照)，消化后制备成细胞悬液，吹打混匀后进行细胞计数；

2)将细胞悬液稀释成5×10⁴cells/mL浓度，放置在冰上备用；

3)将RTCA检测板取出，加入50μL培养基；RTCA检测板和RTCA检测仪使用xCELLigence realtime cell analyser(RTCA)system(S16)；

4)在RTCA检测仪程序中编选本次试验的试验程序(程序2)；

5)将RTCA检测板置入检测仪中，观测程序中Messege项是否正常，待正常后启动实验程序；

6)程序1运行完毕后取出检测板，在对应孔中加入肿瘤细胞悬液100μL，加入之前混匀每管细胞悬液；

7)细胞悬液加入后，将检测板置入培养箱中静置30min，使细胞自然沉降；

8)30min后，将检测板放入检测仪中，运行程序2；

9)24h后观察细胞生长曲线，待细胞处于对数生长期时，准备加入各组效应T细胞；

10)培养瓶中取出效应T细胞，离心，清洗，计数，按1:1效靶比配制各组效应细胞浓度；

11)暂停程序，取出检测板，对应位置加入效应细胞50μL，放回检测仪中，继续程序，每天观察。

图6为RTCA检测靶向MSLN并敲减DGKα以增强抗肿瘤功能的CAR-T细胞对SKOV3细胞的杀伤效率。其中1:1表示：效应细胞：靶细胞＝1:1；Medium表示：未加效应细胞，仅有肿瘤靶细胞；Non-transduced T表示：效应细胞为未感染的T细胞，wild-type anti-MSLN CAR T表示：效应细胞为感染只含CAR结构的T细胞，DGKα-disrupted anti-MSLN CAR T表示：效应细胞为感染含DGKα敲减元件及CAR结构的T细胞。如图所示，含DGKα敲减元件及CAR结构的T细胞的杀伤效果明显强于只含CAR结构的T细胞，敲减DGKα与靶向MSLN的CAR-T具有协同作用。

综上所述，本发明提供了一种靶向MSLN并敲减DGKα以增强抗肿瘤功能的CAR-T载体，具体方案如下：包括首先制备识别并靶向Mesothelin(MSLN)的三代嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括MSLN抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，所述嵌合抗原受体由人EF1a启动子启动转录。同时，该载体包括5’端的DGKαshRNA，由人U6启动子转录。MSLN靶点具有肿瘤特异性高表达且在正常组织中表达较低的优异特点。在此基础上，通过shRNA技术敲减T细胞中的DGKα的表达，抑制了肿瘤细胞免疫逃逸的发生，进而增强CAR-T细胞对MSLN靶点阳性肿瘤细胞的杀伤效果。

上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其包括特异性识别MSLN的胞外结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域和信号转导域，其特征在于，所述胞外结合结构域为MSLN单链抗体，所述MSLN单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示的CD8α来源的跨膜区；和/或，所述共刺激结构域为CD28-4-1BB，其中CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；和/或，所述信号转导域为氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的CD3ζ来源的信号转导域；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；更优选地，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

3.一种表达构建物，其包括编核苷酸序列1，其特征在于，所述核苷酸序列1编码如权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原受体和信号肽；

优选地，编码所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或，编码所述CD8α来源的跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或，编码所述CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码所述4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；和/或，编码所述CD3ζ来源的信号转导域的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；和/或，所述信号肽为CD8leader，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

更优选地，所述核苷酸序列1还包括所述嵌合抗原受体和信号肽的转录启动子，所述转录启动子优选为EF1a，所述EF1a的序列如SEQ ID NO:28所示。

4.如权利要求3所述的表达构建物，其特征在于，所述表达构建物还包括编码DGKα敲减元件的核苷酸序列2；优选地，所述DGKα敲减元件包括DGKαshRNA，所述DGKαshRNA的核苷酸如SEQ ID NO:8所示；更优选地，所述DGKα敲减元件还包括启动子，优选为人源H1启动子或人源U6启动子；进一步优选地，所述人源H1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述人源U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

5.如权利要求4所述的表达构建物，其特征在于，所述核苷酸序列2的核苷酸序列如SEQID NO:22或23所示；和/或，所述表达构建物的结构为核苷酸序列2-核苷酸序列1；

优选地，所述表达构建物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24-27任一项所示。

6.一种表达载体，其包括如权利要求3所述的表达构建物和出发载体；

优选地，所述出发载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体中的一种或多种；更优选地，所述出发载体为慢病毒载体，所述慢病毒载体优选为pLenti-MCS-EF1-GFP Lentiviral Expression Vector；

和/或，所述慢病毒载体的包装采用四质粒包装系统，所述四质粒包装系统包括pPACKH1-GAG质粒、pPACKH1-REV质粒、pVSV-GPSPAX2质粒和如权利要求3-5任一项所述的表达构建物。

7.一种病毒，所述病毒包含如权利要求6所述的表达载体；优选地，所述的病毒为慢病毒。

8.如本权利要求3述的表达构建物、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的病毒在制备靶向MSLN并敲减DGKα的CAR-T细胞中的用途。

9.一种CAR-T细胞，其包括如本权利要求3述的表达构建物、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的病毒；

优选地，所述CAR-T细胞的出发细胞为真核细胞；更优选地，所述CAR-T细胞的出发细胞为分离的人T细胞。

10.如本权利要求3述的表达构建物、如权利要求6所述的表达载体、如权利要求7所述的病毒或如权利要求9所述的CAR-T细胞在制备抑制肿瘤的药物中的用途；优选地，所述的肿瘤为MSLN阳性的肿瘤。

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