KR20210091160A - 면역요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20210091160A
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에이미 멜리사 베커
수르비 고엘
사라 헤세
트로이 아론 러스터
비르기트 슐츠
스테파니 에이. 야진스키
푸자 비나이
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인텔리아 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 편집, 예를 들어, DNA 서열을 변경을 위한, 조성물 및 방법이 제공된다. 예를 들어, 면역요법을 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

면역요법을 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2018년 10월 16일 출원된, 미국 특허 가출원 번호 62/746,522 및 2018년 10월 17일 출원된, 62/747,037에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 2019년 10월 24일에 생성된 ASCII 사본은 Sequence_Listing.txt로 명명되며 272 킬로바이트 크기이다.
CRISPR (일정한 간격으로 분포하는 짧은 회문성 반복 서열)는 바이러스 공격에 대해 방어하기 위해 적응형 면역 시스템으로서 박테리아에서 진화하였다. 바이러스에 노출되면, 바이러스 DNA의 짧은 세그먼트는 박테리아 게놈의 CRISPR 유전자좌로 통합된다. RNA는 바이러스 서열을 포함하는 CRISPR 유전자좌의 일부로부터 전사된다. 바이러스 게놈에 상보적인 서열을 포함하는, RNA는 바이러스 게놈에서 서열에 대한 Cas9 단백질의 표적화를 중재한다. Cas9 단백질은 절단되어　바이러스 표적을　제한한다.
최근, CRISPR/Cas 시스템은 진핵 세포에서 게놈 편집을 위해 적용되고 있다. 부위 특이적 단일 가닥 브레이크 (SSB) 또는 이중 가닥 브레이크 (DSB)의 도입은 예를 들어, 비상동 말단 결합 (NHEJ) 또는 상동성 지향 수리 (HDR)를 통해 표적 서열 변경을 허용한다.
Eyquem 등 (2017) Nature 543(7643):113-117은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 TRAC 유전자의 유전자좌에 대한 키메라 항원 수용체 (CAR)의 표적화가 종양 거부를 향상한다는 것을 보고하고 있다. 게다가, TRAC 유전자좌에 대한 이러한 표적화는 긴장성 CAR 신호전달을 방지하고 항원에 대한 단일 또는 반복 노출 후 CAR의 효과적인 내재화 및 재발현을 확립하여, 이펙터 T-세포 분화 및 고갈을　지연시킨다. 그럼에도 불구하고, 기존 접근법은 의도된 표적에 대해 원하는 활성 미만으로 T 세포를 생성할 수 있다 (TRAC 유전자좌로부터 CAR를 발현하는 T 세포 및 CAR와 상호작용할 수 있고 원하지 않는 반응성을 가진 T 세포를 제공하는 내인성 TRBC 유전자 생성물을 생성하는 것으로 포함하지만, 이에 제한되지 않음). 따라서, 면역요법을 위한 개선된 조성물 및 방법이 필요하다.
따라서, 하기 구현예가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 TRBC 및/또는 TRAC 유전자의 발현을 실질적으로 감소 또는 녹아웃시킴으로써, TCR로도 불리는, T-세포 수용체의 천연 알파 및/또는 베타 서브유닛의 생산을 실질적으로 감소 또는 제거하기 위해 CRISPR/Cas 시스템과 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제와 함께 가이드 RNA를 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다.
개요
본원에 기술된 발명은 조작된 T 세포 치료법 (예를 들어, 면역종양학 및 자가면역을 감소)에 대한 조성물 및 방법, 예를 들어, 상기 표적 서열을 표적으로 하는 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템의 도입에 의해 변형되는 것, 및 그것을 위해 제조하고 사용하는 방법을 포함하는, 그들의 게놈에서 특정 표적 서열에서 변형된 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시는 세포, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 내인성 T-세포 수용체 발현을 결여시키도록 조작된 T 세포, 예를 들어 관심있는 코딩 서열을 삽입하기 위한 추가 조작에 적합한 T 세포, 예를 들어 T-세포 수용체, 예를 들어 변형된 또는 돌연변이 T-세포 수용체를 발현하기 위해 추가로 조작되고, 면역요법에 유용한 T 세포의 게놈 편집에 유용한 gRNA 분자, CRISPR 시스템, 세포, 및 방법에 관한 것이며 이를 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 tracrRNA 및 crRNA를 포함하는 gRNA 분자를 제공하고, 상기 crRNA는 T 세포의 표적 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 표적화 도메인은 T 세포의 표적 서열과 상보적이다. 상기 T 세포는 자가 또는 동종 T 세포일 수 있다. 상기 T 세포는 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포일 수 있다.
본 발명은 청구 범위에 제공된 바와 같으며 추가 구현예는 하기에 설명되어 있다.
본 발명은 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 DNA 서열을 변형하는 방법을 제공하고, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
(b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 추가로 DNA 서열을 변형하는 방법을 제공하고, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 1-89 및 179-184에 대한 표 1 및/또는 3 중 하나에 열거된 게놈 좌표의 15개 연속 뉴클레오티드±10개 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
ii. (i)로부터의 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii.(i)로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
(b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 또한 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 추가로 제공하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i) 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
(b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 추가로 조성물을 대상체, 이의 자가 세포, 및/또는 동종 세포에 투여하는 것을 포함하는 면역요법의 방법을 제공하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i) 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
(b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 또한 TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법을 추가로 제공하고, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
(b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 추가로 방법을 제공하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
(b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 또한 조성물을 대상체, 이의 자가 세포, 및/또는 동종 세포에 투여하는 것을 포함하는 면역요법의 방법을 추가로 제공하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
(b) (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 추가로 DNA 서열을 변형하는 방법을 제공하고, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 90-218에 대한 표 2 및/또는 3 중 하나에 열거된 게놈 좌표의 15개 연속 뉴클레오티드±10개 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
ii. (i)로부터의 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. (i)로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
(b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
(c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
본 발명은 또한 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법을 추가로 제공하고, 세포에 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 전달하는 것을 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하고:
i) 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열, 그리고
상기 제2 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함한다:
i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열.
본 발명은 또한 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 추가로 제공하고, 세포에 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 전달하는 것을 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하고:
i) 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열, 그리고
상기 제2 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함한다:
i) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열.
본 발명은 추가로 대상체, 이의 자가 세포, 또는 동종 세포에 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역요법의 방법을 제공하고, 상기 조성물은 하기를 포함하고: 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA, 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산, 상기 제1 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하고:
i) 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열, 그리고
상기 제2 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함한다:
i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열.
이론에 얽매이기를 바라지 않고, 이중 TRAC/TRBC 돌연변이, 예를 들어, 녹아웃 돌연변이의 사용은 일부 구현예에서 큰 비율의 조작된/도입된 TCR이 세포 표면에 도달하므로 본 발명의 맥락에서 유리하다.
일부 구현예에서, 조작된 세포에서 외인성 TCR의 TRAC 녹인과 조합된 TRBC 녹아웃은 조작된 세포에서 외인성 TCR의 더 큰 활성을 산출하기에 유리하다.
일부 구현예에서, 조작된 세포에서 외인성 TCR의 TRAC 녹인과 조합된 TRBC 녹아웃 조작된 세포에서 외인성 TCR의 더 큰 선택성을 산출하기에 유리하다.
게다가, 일부 구현예에서, 조작된 세포에서 외인성 TCR의 TRAC 녹인과 조합된 TRBC 녹아웃은 예를 들어, 카스파제 분석에 의해 측정되는 바와 같은 더 큰 세포 사멸을 산출하기에 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 세포에서 외인성 TCR의 TRAC 녹인과 조합된 TRBC 녹아웃은 예를 들어, 펩티드 (예를 들어 윌름스 종양 유전자 (WT1) 항원) 유도에 대한 반응으로 더 큰 IFN-감마 분비를 산출하기에 유리하다.
더욱이, 일부 구현예에서, TCR을 갖는 이중 TRAC/TRBC 녹아웃은 예를 들어, CD4+ 세포에서 더 큰 IFN-감마 분비를 산출하기에 유리하다.
게다가, 유리하게 일부 구현예에서, 상기 인터페론 반응 (IFNγ 및/또는 TNFα)은 삽입된 공여자 작제물의 전사가 TRAC의 내인성 프로모터에 의해 촉진되는 편집된 세포에서 증가된다.
더욱이, 일부 구현예에서, 이들 특정 TCR을 갖는 이중 TRAC/TRBC 녹아웃은 CD4+ 세포에서 더 큰 IFN-γ 분비를 산출하기에 유리하다. 이론에 얽매이지 않기를 바라는, 일부 구현예에서, HLA 클래스 I 상에 제시되는 펩티드에 대한 반응성과 일반적으로 강하게 연결되지 않는, CD4+ 세포에서 이러한 반응성을 관찰하는 것은 더 드물다.
게다가, 일부 구현예에서, 이들 특정 TCR을 갖는 이중 TRAC/TRBC 녹아웃은 CD4+ 세포에서, 예를 들어, 탈과립 분석에서 더 큰 반응을 산출하기에 유리하다. 다시 말하지만, 이론에 얽매이지 않기를 바라는, 일부 구현예에서, HLA 클래스 I 상에 제시되는 펩티드에 대한 반응성과 일반적으로 강하게 연결되지 않는, CD4+ 세포에서 이러한 반응성을 관찰하는 것은 더 드물다.
게다가, 일부 구현예에서, 이중 TRAC/TRBC 녹아웃 돌연변이는 예를 들어, 혼합 림프구 반응을 시험할 때 TRAC 단일 녹아웃 돌연변이보다 낮은 정도의 동종이식편 반응을 산출하기에 유리하다.
본 발명은 추가로 TRAC 유전자좌에서 유전자좌 삽입을 통해 이종 면역학적 수용체를 발현하는 방법을 제공하고, 세포에 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 전달하는 것을 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하고:
i) 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 1, 2, 3, 5, 6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v) 서열 번호 2, 3, 5, 6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열, 그리고
상기 제2 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함한다:
i) 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 218로부터 선택된 가이드 서열;
ii) 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 및 218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii) 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 및 218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv) 서열 번호 90, 95, 97, 185, 및 214 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열;
v) 서열 번호 90, 95, 및 185 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
vi) 서열 번호 90 또는 214를 포함하는 가이드 서열.
단일 절단 및/또는 편집 사건은 내인성 TRAC 유전자의 "녹아웃"을 허용할 것이다. 추가 이점으로서, 편집 과정 도중 주형이 도입되거나 공급되면 관심 외인성 폴리펩티드가 편집 사건의 표적 유전자좌로 삽입될 것이다. 이러한 이점은 특히 하기 서열 번호 90, 95, 97, 185, 203, 204, 205, 206, 210, 211, 및/또는 214를 갖는 가이드 RNA의 사용으로부터 진행된다. 이들 가이드 RNA는 또한 TRBC 유전자의 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하는 gRNA와 협력하여 도입될 수 있다.
제1 가이드 RNA는 서열 번호 2의 서열을 포함할 수 있고 제2 가이드 RNA는 서열 번호 90의 서열을 포함할 수 있다.
제1 가이드 RNA는 서열 번호 180의 서열을 포함할 수 있고 제2 가이드 RNA는 서열 번호 186의 서열을 포함할 수 있다.
제1 가이드 RNA는 서열 번호 1, 2, 3, 5, 6 중 하나의 서열을 포함할 수 있고, 제2 가이드 RNA는 서열 번호 90의 서열을 포함할 수 있다.
제1 가이드 RNA는 서열 번호 1, 2, 3, 5, 6 중 하나의 서열을 포함할 수 있고, 제2 가이드 RNA는 서열 번호 214의 서열을 포함할 수 있다.
제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산은 실질적으로 동시에 도입되거나 투여될 수 있다.
TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 DNA 서열은 동시에 변경될 수 있다.
RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산은 변형 방법의 일부로서 도입되거나 투여될 수 있다.
상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(a) 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 이중 가닥 브레이크 (DSB)을 도입하는 단계; 또는
(b) 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 단일 가닥 브레이크 (SSB)을 도입하는 단계; 또는
(c) 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 단계.
상기 방법은 추가로 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함할 수 있고, 선택적으로 여기서:
(a) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 수용체를 포함하고;
(b) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 면역학적 수용체를 포함하고;
(c) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 T-세포 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 T-세포 수용체는 암 항원을 인식하고;
(d) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 WT1-특이적 T-세포 수용체를 포함하고, 상기 T-세포 수용체는 WT1 또는 이의 단편을 인식하고;
(e) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 키메라 항원 수용체는 암 항원을 인식하거나; 또는
(f) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 WT1-특이적 키메라 항원 수용체를 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체는 WT1 또는 이의 단편을 인식한다.
상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 도입하는 단계;
b. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 도입하는 단계;
c. WT1-특이적 TCR α 사슬 및 β 사슬을 도입하는 단계;
d. WT1-특이적 TCR α 사슬 및 β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 도입하는 단계;
e. 하기로부터 선택된 제1 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 501 또는 504; (ii) 서열 번호 501 또는 504와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 501 또는 504의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250개 아미노산의 연속 서열,
및
하기로부터 선택된 제2 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 502 또는 505; (ii) 서열 번호 502 또는 505와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 502 또는 505의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 아미노산의 연속 서열,
f. 하기로부터 선택된 제1 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 501 또는 513; (ii) 서열 번호 501 또는 513과 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 501 또는 513의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250개 아미노산의 연속 서열,
및
하기로부터 선택된 제2 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 511 또는 514; (ii) 서열 번호 511 또는 514와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 511 또는 514의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 아미노산의 연속 서열,
g. (e) 또는 (f)의 제1 TCR 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계;
h. (e) - (f)의 제2 TCR 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계;
i. (g) 및 (h)의 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계;
j. 선택적으로 이를 암호화하는 핵산 서열을 도입함으로써, 서열 번호 500, 503, 506, 509, 512, 515, 518, 또는 521로부터 선택된 폴리펩티드 또는 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열을 도입하는 단계; 또는
k. 하기 (i)-(viii)로부터 선택된 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 폴리펩티드, 또는 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열을 도입하는 단계:
i) 서열 번호 501 및 서열 번호 502;
ii) 서열 번호 504 및 서열 번호 505;
iii) 서열 번호 507 및 서열 번호 508;
iv) 서열 번호 510 및 서열 번호 511;
v) 서열 번호 513 및 서열 번호 514;
vi) 서열 번호 516 및 서열 번호 517;
vii) 서열 번호 519 및 서열 번호 520;
l.(k)의 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 단계.
제1 핵산 서열은 제1 표적 유전자좌에 상동인 서열 측면에 있을 수 있다. 제2 핵산 서열은 제2 표적 유전자좌에 상동인 서열 측면에 있을 수 있다. 측면 서열은 길이가 적어도 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 또는 40 뉴클레오티드일 수 있다.
제1 표적 유전자좌는 TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 유전자, 예를 들어, TRAC 유전자일 수 있다. 제2 표적 유전자좌는 TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 유전자, 예를 들어, TRBC1 또는 TRBC2 유전자일 수 있다.
도입된 핵산 서열, 또는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 프로모터 영역 없이 구성될 수, 즉 핵산은 "프로모터가 없을" 수 있다.
도입된 핵산 서열, 또는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 선택적으로 상기 프로모터는 EF-1α 프로모터 (서열 번호 603)이다.
도입된 핵산 서열, 또는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 벡터를 통해, 형질감염을 통해, 지질 나노입자를 통해, 또는 미세주입을 통해 도입될 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있고, 추가로 선택적 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터이다.
또한, 본 발명은 TCR (예를 들어 WT1-특이적 TCR)의 유전자좌 삽입의 방법을 제공하고, 하기로부터 선택된 가이드 서열을 포함하는 TCR을 삽입하기 위한 제1 가이드 RNA를 세포에 전달하는 것을 포함한다: 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 및 218, 및 선택적으로 (i) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산; 및/또는 (ii) TCR(예를 들어 WT1-특이적 TCR)을 암호화하는 공여자 핵산 분자. 상기 방법은 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 가이드 RNA를 전달하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 서열 번호 179-184로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 가이드 RNA를 전달하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기 TCR은 하기를 포함하는 WT1-특이적 TCR일 수 있다:
i) 서열 번호 500, 503, 506, 509, 512, 515, 518, 또는 521로부터 선택된 폴리펩티드 또는 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열; 또는
ii) 하기 (i)-(viii)로부터 선택된 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 폴리펩티드, 또는 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열:
i) 서열 번호 502 및 서열 번호 503;
ii) 서열 번호 504 및 서열 번호 505;
iii) 서열 번호 507 및 서열 번호 508;
iv) 서열 번호 510 및 서열 번호 511;
v) 서열 번호 513 및 서열 번호 514;
vi) 서열 번호 516 및 서열 번호 517;
vii) 서열 번호 519 및 서열 번호 520;
viii) 서열 번호 522 및 서열 번호 523.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 조성물을 제공한다:
a. 하기를 포함하는 가이드 RNA
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 선택적으로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
상기 조성물은 세포에서 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는데 사용될 수 있다. 상기 조성물은 세포에서 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 상기 조성물 중 가이드 RNA는 서열 번호 196-200 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 조성물을 제공한다:
a. 하기를 포함하는 가이드 RNA
i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 선택적으로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
상기 조성물은 세포에서 TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는데 사용될 수 있다. 상기 조성물은 세포에서 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 상기 가이드 RNA는 서열 번호 185-192 및 201-212 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 방법에 의해 변경된, 세포를 제공한다. 상기 세포는 생체 외에서 변경될 수 있다.
상기 세포는 T 세포일 수 있다. 상기 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포일 수 있다. 상기 세포는 포유동물, 영장류, 또는 인간 세포일 수 있다.
상기 세포는 내인성 T-세포 수용체가 결여될 수 있다. 상기 세포는 비-내인성 T-세포 수용체를 발현하는 T 세포의 제조를 위해 적합할 수 있다. 따라서 상기 세포는 CAR을 발현하는 T 세포의 제조에 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이 변경된 상기 세포는 CD3- 세포일 수 있다. 상기 세포는 변경되기 전에 CD3+ 세포일 수 있다.
상기 세포는 관심 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가적으로 포함할 수 있고, 선택적으로 여기서:
(a) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 수용체를 포함하고;
(b) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 면역학적 수용체를 포함하고;
(c) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 T-세포 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 T-세포 수용체는 WT1에 특이적이거나; 또는
(d) 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 키메라 항원 수용체는 WT1에 특이적이다.
상기 세포는 외인성 T-세포 수용체의 α 및 β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 세포는 외인성 T-세포 수용체의 γ 및 δ 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 세포의 외인성 T-세포 수용체의 α 및 β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열은 게놈의 TRAC 유전자좌에 있을 수 있다. 본원에 기술된 세포의 외인성 T-세포 수용체의 γ 및 δ 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열은 게놈의 TRAC 유전자좌에 있을 수 있다.
TCR α 사슬의 서열은 하기로부터 선택될 수 있고: (i) 서열 번호 501 또는 504; (ii) 서열 번호 501 또는 504와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 501 또는 504의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250개 아미노산의 연속 서열; 그리고
TCR β 사슬의 서열은 하기로부터 선택될 수 있다: (i) 서열 번호 502 또는 505; (ii) 서열 번호 502 또는 505와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 502 또는 505의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 아미노산의 연속 서열.
상기 세포의 TCR α 사슬은 서열 번호 500, 501, 503, 및 504 중 하나에 따른 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있고, β TCR 사슬은 서열 번호 500, 502, 503, 및 505 중 하나에 따라 암호화된다.
상기 TCR α 사슬의 서열은 하기로부터 선택될 수 있고: (i) 서열 번호 513; (ii) 서열 번호 513과 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 513의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 또는 800개 아미노산의 연속 하위서열, 그리고
상기 TCR β 사슬의 서열은 하기로부터 선택된다: (i) 서열 번호 514; (ii) 서열 번호 514와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 514의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 또는 800 개 아미노산의 연속 하위서열.
상기 α TCR 사슬은 서열 번호 513일 수 있고 β TCR 사슬은 서열 번호 514일 수 있다.
본원에 개시된 세포의 하나 이상의 유전자는 내인성 프로모터로부터 발현될 수 있다.
본원에 개시된 세포의 하나 이상의 유전자는 이종 프로모터로부터 발현될 수 있고, 선택적으로 상기 이종 프로모터는 EF-1α 프로모터이다.
변경된 세포는 외인성 T-세포 수용체의 α 및 β 사슬을 암호화하는 유전자 및/또는 외인성 T-세포 수용체의 γ 및 δ 사슬을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 α, β, γ, 및 δ 사슬은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO2018/197492 참조.
상기 외인성 T-세포 수용체의 α 및 β 사슬은 게놈의 TRAC 유전자좌에 있을 수 있다. 전사체 내에 제공되는 외인성 T-세포 수용체의 α 및 β 사슬은 P2A 또는 다른 절단 서열에 의해 분리된다.
본 발명은 또한 본원에서 개시된 것을 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 변경된 집단의 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과는 CD3- 세포이다.
본 발명은 또한 본원에서 개시된 것을 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 집단의 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과는 내인성 T-세포 수용체가 결여된다.
본 발명은 또한 본원에서 개시된 것을 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 집단에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현은 동일한 세포의 변경되지 않은 집단에 비해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 감소하였다.
TRBC1 유전자의 발현의 감소일 수 있다. TRBC2 유전자의 발현의 감소일 수 있다. TRAC 유전자의 발현의 감소일 수 있다.
세포 집단의 10 내지 100%, 예를 들어 집단의 30 내지 99%는 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 인델을 가질 수 있다.
더욱이, 집단의 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%는 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 인델을 가질 수 있다.
인델 또는 삽입은 TRBC1 유전자에 있을 수 있다. 인델 또는 삽입은 TRBC2 유전자에 있을 수 있다. 인델 또는 삽입은 TRAC 유전자에 있을 수 있다.
본원에 기술된 것의 사용을 위한 방법, 또는 조성물은 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 편집을 초래할 수 있다. 본원에 기술된 것의 사용을 위한 방법, 또는 조성물은 TRAC 유전자의 편집을 초래할 수 있다. 본원에 기술된 것의 사용을 위한 방법, 또는 조성물은 TRBC 유전자 및 TRAC 유전자의 편집을 초래할 수 있다.
상기 편집은 편집된 집단의 백분율로서 계산될 수 있다 (편집 백분율 또는 인델 백분율). 상기 편집 백분율은 집단의 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%일 수 있다.
본원에 기술된 상기 조성물은 하기를 포함하는 sgRNA를 포함할 수 있다:
(e) 서열 번호 179-184 및 196-200 중 어느 하나; 또는
(f) 서열 번호 1-89 중 어느 하나로부터 선택된 가이드 서열; 또는
(g) 서열 번호 1-24로부터 선택된 가이드 서열; 또는
(h) 서열 번호 1-6으로부터 선택된 가이드 서열.
본원에 기술된 상기 조성물은 하기를 포함하는 sgRNA를 포함할 수 있다:
(i) 서열 번호 186-192 및 201-212 중 어느 하나; 또는
(j) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218 중 어느 하나로부터 선택된 가이드 서열; 또는
(k) 서열 번호 90-113 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열; 또는
(l) 서열 번호 90-95로부터 선택된 가이드 서열.
상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 1, 2, 3, 또는 4에 있을 수 있다. 상기 표적 서열은 인간 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 있을 수 있다.
상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 1에 있을 수 있다. 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 2에 있을 수 있다. 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 3에 있을 수 있다. 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 4에 있을 수 있다.
상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 양성 가닥에서 표적 서열에 상보적일 수 있다. 상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 음성 가닥에서 표적 서열에 상보적일 수 있다.
제1 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 양성 가닥에서 제1 표적 서열에 상보적일 수 있고, 상기 조성물은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 음성 가닥에서 제2 표적 서열에 상보적인 제2 가이드 서열을 추가로 포함한다.
상기 가이드 RNA는 서열 번호 1-178 중 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함할 수 있고 서열 번호 400의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 서열 번호 400의 뉴클레오티드는 그의 3' 말단에서 가이드 서열을 뒤따른다.
상기 가이드 RNA는 서열 번호 1-178 중 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함할 수 있고 서열 번호 401의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 서열 번호 401의 뉴클레오티드는 그의 3' 말단에서 가이드 서열을 뒤따른다.
상기 가이드 RNA는 서열 번호 300의 패턴에 따라 변경될 수 있고, 상기 N들은 집합적으로 서열 번호 1-89의 가이드 서열 중 어느 하나이다. 서열 번호 300 중 각각의 N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 N들은 가이드 서열을 형성하고, 상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 대해 Cas9을 표적으로 한다.
제1 가이드 RNA는 서열 번호 2의 서열을 포함할 수 있고 제2 가이드 RNA는 서열 번호 90의 서열을 포함할 수 있다.
전술한 방법 중 하나는 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(a) 하기로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 250; (ii) 서열 번호 250과 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 핵산 서열; 및 (iii) 서열 번호 250의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 또는 800 뉴클레오티드의 연속 하위서열,
및
하기로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 252; (ii) 서열 번호 252와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 핵산 서열; 및 (iii) 서열 번호 252의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900개 뉴클레오티드의 연속 하위서열,
(b) 하기로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 513; (ii) 서열 번호 513과 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 핵산 서열; 및 (iii) 서열 번호 513의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 또는 800개 뉴클레오티드의 연속 하위서열,
및
하기로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 514; (ii) 서열 번호 514와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 핵산 서열; 및 (iii) 서열 번호 514의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900개 뉴클레오티드의 연속 하위서열,
(c) (a)의 제1 핵산 서열 및 (a)의 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계; 또는
(d) (b)의 제1 핵산 서열 및 (b)의 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계.
상기 sgRNA는 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 화학적으로 합성될 수 있다. 가이드 RNA는 RNP에 포함될 수 있다. 주형 핵산은 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 주형 핵산은 비바이러스 전달 작제물에 포함될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스, 및 이의 하이브리드가 당 업계에 공지되어 있다. 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 (LV) 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 하기 변형 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있다:
i) 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드.
ii) 뉴클레오티드 사이 포스포로티오에이트 (PS) 결합.
iii) 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드.
iv) 가이드 RNA의 5' 말단에서 처음 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형.
v) 가이드 RNA의 3' 말단에서 마지막 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형.
vi) 가이드 RNA의 5' 말단에서 처음 4개 뉴클레오티드 사이 PS 결합.
vii) 가이드 RNA의 3' 말단에서 마지막 4개 뉴클레오티드 사이 PS 결합.
viii) 가이드 RNA의 5' 말단에서 처음 3개 뉴클레오티드의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드.
ix) 가이드 RNA의 3' 말단에서 마지막 3개 뉴클레오티드의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드.
상기 가이드 RNA는 상기 제시된 바와 같은 변형을 갖는 서열 번호 300의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
LNP는 생분해성, 이온성 지질을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로도 불리는, (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트일 수 있다.
LNP는 중성 지질을 포함할 수 있고, 예를 들어, 중성 지질은 DSPC이다.
LNP는 헬퍼 지질을 포함할 수 있고, 예를 들어, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다.
LNP는 스텔스 지질을 포함할 수 있고, 예를 들어, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다.
상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제 조성물은 리보뉴클레오단백질 (RNP)에 포함될 수 있다.
상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 Cas9, 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA를 포함할 수 있고, 예를 들어, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas9 유전자에 의해 암호화되거나 Cas9 단백질일 수 있다.
상기 조성물은 약학 제형일 수 있고 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 약제의 제조에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 암 치료에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 대상체의 면역요법에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 윌름스 종양 항원 (WT1)을 과발현하는 종양의 치료에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 면역요법에 사용하기 위한 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 암 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 윌름스 종양 항원 (WT1)을 과발현하는 종양의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 바와 같은 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물의 치료 방법에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 바와 같은 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물에서 암 치료 방법에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 바와 같은 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물의 면역요법 방법에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 바와 같은 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물에서 윌름스 종양 항원 (WT1)을 과발현하는 종양의 치료 방법에서 본원에 기술된 조성물, 제형, 집단, 또는 세포를 제공한다.
상기 가이드 RNA는 서열 번호 1-89 중 하나로부터 선택된 서열을 가질 수 있다.
상기 가이드 RNA는 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218 중 하나로부터 선택된 서열을 가질 수 있다.
또한, 가이드 서열이 변경된 생성물에서, 각각, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 빈도의 인델을 산출하는 가이드 서열의 그룹으로부터 선택되는 구현예가 개시된다.
또한, 가이드 서열이 변경된 생성물에서, 각각, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 빈도의 공여자 핵산 분자의 삽입을 산출하는 가이드 서열의 그룹으로부터 선택되는 구현예가 개시된다.
또한, 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위해 전술한 구현예 중 하나의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도가 개시된다. 상기 대상체는 인간 또는 동물 (예를 들어 인간; 시노몰구스 원숭이)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
또한, TRBC1, TRBC2 및 TRAC 유전자 중 임의의 하나 이상을 치료에 사용하기 위하거나 변형(예를 들어, 인델 형성, 또는 프레임이동 또는 넌센스 돌연변이를 형성)에 사용하기 위한 전술한 조성물 또는 제형 중 하나가 개시된다.
전술한 세포 양태 및 구현예 중 하나에서, 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열을 포함하는 유전자, 및, 선택적으로, 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열을 포함하는 유전자 및/또는 제3 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열을 포함하는 유전자는 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열을 포함하는 유전자, 및, 선택적으로, 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열을 포함하는 유전자의 기능적 생성물 및/또는 제3 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열을 포함하는 유전자의 기능적 생성물의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변경되었다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 면역요법을 제공하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에서 기술된 바와 같은 유효량의 세포, 예를 들어, 전술한 세포 양태 및 구현예 중 하나의 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
방법의 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 기술된 바와 같은 유효량의 세포, 예를 들어, 전술한 세포 양태 및 구현예 중 하나의 세포를 대상체에 투여하기 전에 림프결핍제제 또는 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 세포 (예를 들어, 세포 집단)을 제조하는 방법을 제공한다.
면역요법은 면역 체계를 활성화하거나 억제함으로써 질환을 치료한다. 면역 반응을 유도하거나 증폭하기 위해 고안된 면역요법은 활성화 면역요법으로 분류된다. 세포 기반 면역요법은 일부 암 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 림프구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포 (NK 세포), 및/또는 세포독성 T 림프구 (CTL)와 같은 면역 이펙터 세포는 종양 세포의 표면에 발현된 비정상 항원에 반응하도록 프로그래밍될 수 있다. 따라서, 암 면역요법은 면역 체계의 구성 요소가 종양 또는 다른 암성 세포를 파괴하도록 허용한다.
다른 양태에서, 본 발명은 면역요법을 위한 세포 (예를 들어, 세포 집단)를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의　또는 모든　구성 요소의 발현을 감소시키거나 제거함으로써, 예를 들어, 상기 세포로 gRNA 분자 (본원에서 기술된 바와 같음), 또는 본원에서 개시된 바와 같은, 하나 이상의 gRNA 분자를 도입함으로써 세포를 변경하는 단계; 및 (b) 상기 세포를 확장하는 단계. 본 발명의 세포는 예를 들어 TCR/CD3 제타 사슬 신호 전달을 매개하는 폴리펩티드에 대한 이종 서열 코딩의 도입에 의한, 추가 조작에 적합하다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 야생형 또는 변이　TCR이다. 본 발명의 세포는 또한 대체 항원 결합 모이어티에 대한 이종 서열 코딩의 도입에 의한, 예를 들어 대체 (비내인성) T-세포 수용체, 예를 들어 특이적 단백질을 표적화하도록 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR)에 대한 이종 서열 코딩의 도입에 의한 조작에 적합할 수 있다. CAR는 또한 키메라 면역수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 인공 T-세포 수용체로서 알려져 있다).
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 세포를 제조하는 방법, 예를 들어, 세포를 제조하는 방법의 전술한 양태 및 구현예 중 하나의 방법에 의해 제조된 세포 (예를 들어, 세포 집단)를 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 HEK-Cas9 세포에서 TRAC 편집 정도를 나타낸다.
도 2는 인간 CD3+ T 세포에서 TRAC 편집 정도를 나타낸다.
도 3은 인간 CD3+ T 세포에서 TRAC 편집 후 TCR 발현의 양을 나타낸다.
도 4a-b는 HEK-Cas9 세포에서 TRBC 편집 정도를 나타낸다. 도 4a는 TRBC1에서 편집을 나타내고 도4b는 TRBC2에서 편집을 나타낸다.
도 5는 인간 CD3+ T 세포에서 TRBC 편집 정도를 나타낸다.
도 6은 인간 CD3+ T 세포에서 TRBC 편집 후 TCR 발현의 양을 나타낸다.
도 7a-b는 TRBC, TRAC 및 대조군 가이드 (서열 번호 193 및 194)에 대한 생화학 오프 표적 분석(잠재적 오프-표적편집 부위의 측정)을 나타낸다.
도 8a-d는 TCR 편집된 T 세포를 갖는 세포를 생산하기 위한 T-세포 수용체의 녹아웃 및 TCR 작제물의 삽입을 입증한다. 도 8a는 T-세포 수용체 녹아웃의 효율을 나타낸다. 도 8b는 TCR 작제물의 렌티바이러스 형질도입의 효율을 나타낸다. 도 8c는 편집된 T 세포에서 TCR 삽입물의 발현을 나타낸다. 도 8d는 TCR 편집된 T 세포의 표현형을 나타낸다.
도 9a-d는 원발성 AML 아세포를 사멸하는 TCR 삽입을 갖는 T 세포의 능력을 나타낸다. 도 9a 내지 9c는 HLA-A*02:01 대립유전자를 갖는 3명의 상이한 환자로부터 수득한 원발성 AML 아세포로 수득한 결과를 나타낸다. 도 9d는 대조군 샘플을 사용한 결과를 나타내고: 원발성 아세포는 특정 HLA 대립유전자를 갖지 않는다.
도 10은 다중 이중 가이드 RNA를 사용한 TRAC 및 TRBC 유전자좌의 동시 편집에 의해 수득되는 편집 빈도를 입증한다.
도 11a-d는 조합된 편집에 대해 crRNA를 표적으로 하는 TRAC 및 TRBC를 사용한 결과를 나타낸다. 도 11a는 T-세포 수용체 녹아웃의 효율을 나타낸다. 도 11b는 세포에서 HD1-TCR 작제물의 렌티바이러스 형질도입을 나타낸다. 도 11c는 편집된 T 세포에서 TCR 삽입물의 발현을 나타낸다. 도 11d는 편집된 T 세포에서 TCR의 표현형을 나타낸다.
도 12a-b는 다중 단일 가이드 RNA를 사용한 TRAC 및 TRBC 유전자좌의 동시 편집에 의해 수득되는 편집 빈도를 입증한다. 도 12a는 TRAC 및 TRBC 유전자좌의 편집 후 CD3- T 세포의 표현형 백분율을 나타낸다. 도 11b는 인간 CD3- T 세포에서 TRAC 및 TRBC 유전자좌의 인델 형성의 표현형 백분율을 나타낸다.
도 13a-b는 갭이 있는 삽입 주형을 갖는 이중 RNA 가이드 및 AAV 벡터 (AV9)를 사용하는 TRAC 유전자좌에서 GFP 삽입의 정도 (도 13a) 및 이들 이중 RNA 가이드 및 CD3-인 AAV 벡터를 사용하는 TRAC 녹아웃의 정도를 나타낸다 (도 13b). 갭이 있는 삽입 주형 (또는 단순히 갭이 있는 주형)은 "갭," 즉, 갭이 있는 삽입 주형에서 존재하지 않는 대응하는 표적 서열에서의 영역에 측면에 있는 2개의 서열을 포함한다. 상기 갭이 있는 삽입 주형은 절단에 대해 갭 내의 부위를 표적으로 하는 가이드와 호환되고 이들이 모두 갭 내의 절단 부위를 표적으로 하면, 이들이 정확히 동일한 절단 부위를 표적으로 하는지 여부에 관계없이 이러한 가이드를 정량적으로 비교하는데 유용하다.
도 14a-14b는 sgRNA 및 갭이 있는 주형 AV9를 갖는 TRAC 유전자좌에서 GFP 삽입의 정도 (도 14a), 및 이들 sgRNA 및 표현형적으로 CD3-인 갭이 있는 주형 AV9로 조작된 세포의 백분율 (도 14b)을 나타낸다.
도 15a-b는 FACS 분석 동안 양성 사량체 염색 (도 15a) 및 평균 형광 강도 (MFI) (도 15b)에 의해 측정되는 TCR 삽입에 대한 상이한 프로모터 및 역위 말단 반복 (ITR) 길이를 비교한다.
도 16a-c는 TRAC 유전자좌에서 프로모터가 없는 GFP 작제물의 AAV 삽입을 갖는 삽입 프로토콜에 의해 조작된 세포에서 내인성 TRAC 프로모터로부터 유도된 GFP 발현의 양을 나타낸다. 도 16a는 모의 형질감염 대조군을 나타내고, 도 16b는 RNP를 나타내고 도 16c는 RNP + AV10-EGFP를 나타낸다. X-축: GFP 발현; Y-축: CD3e 발현; FACS에 의해 측정됨.
도 17a-c는 TRAC 유전자좌에서 프로모터 서열 (PL - 프로모터 없음; EF1a - 프로모터 EF1알파 또는 EF-1α)이 있거나 없는 TCR 작제물 주형의 삽입 효율을 나타낸다.
도 18a-b는 2개의 상이한 TCR을 사용하는 형질전환 작제물을 포함하는 프로모터가 있거나 없는 삽입 형질전환체에서 탈과립을 측정한다.
도 19a-b는 2개의 상이한 TCR을 사용하는 형질전환 작제물을 포함하는 프로모터가 있거나 없는 삽입 형질전환체에서 인터페론 감마 발현을 측정한다.
도 20a-d는 2개의 TCR 작제물, Cys 변형을 갖는 하나 및 변형이 없는 하나의 표면 존재를 나타낸다.
도 21a-b는 유동 세포 측정법에 의해 측정되는 삽입된 작제물의 TCR 사슬과 내인성 TCR 사슬 사이의 쌍오류의 정도를 측정한다. 도 21a 및 도 21b의 FACS 데이터는 유전자삽입 또는 잘못 짝지어진 TCR을 발현하는 조작된 세포의 부분을 도시하고 도 21a 및 도 21b의 조작된 세포에서 TCR 발현의 강도는 각각, 도 21c 및 도 21d에서 MFI로 그래프로 나타낸다.
도 22는 유동 세포 측정법에 의해 측정되는 CD8+ 또는 CD4+ 세포에서 삽입된 작제물의 TCR 사슬과 내인성 TCR 사슬 사이의 쌍오류의 정도를 측정한다.
도 23은 4개의 상이한 버전의 TRBC의 녹아웃이 있거나 없는 TCR에 대한 VLD (윌름스 종양 항원) 사량체 염색을 나타내고, WT1-TCR 조작된 CD8+ 세포에 대한 쌍오류의 정도를 표시한다.
도 24는 TRBC의 녹아웃이 있거나 없는 4개의 상이한 TCR에 대한 VLD (윌름스 종양 항원) 사량체 염색을 나타내고, WT1-TCR 조작된 CD4+ 세포에 대한 쌍오류의 정도를 표시한다.
도 25는 사량체 염색의 MFI에 의해 측정되는 TRBC의 녹아웃과 함께 TRAC 유전자좌에 삽입된 4개의 TCR 작제물을 갖는 CD8+ 세포에서 TCR 발현의 강도를 나타낸다.
도 26은 사량체 염색의 MFI에 의해 측정되는 TRBC의 녹아웃과 함께 TRAC 유전자좌에 삽입된 4개의 TCR 작제물을 갖는 CD4+ 세포에서 TCR 발현의 강도를 나타낸다.
도 27은 또한 TRAC/TRBC 더블 녹아웃 또는 TRAC 단일 녹아웃인 삽입된 유전자삽입 TCR (AV11-TCR-A, AV13-TCR-B, AV12-TCR-C를 함유하는 T 세포의 세포독성을 나타낸다. 세포독성은 6시간 후 카스파제 3/7 세포사멸 세포에 대한 반응으로 세포사멸 세포로부터 형광을 측정하여 측정된다.
도 28은 또한 TRAC/TRBC 더블 녹아웃 또는 TRAC 단일 녹아웃인 삽입된 유전자삽입 TCR (AV11-TCR-A, AV14-TCR-F, AV15-TCR-G, AV16-TCR-H)를 함유하는 T 세포의 세포독성을 나타낸다. 세포독성은 6시간 후 카스파제 3/7 세포사멸 세포에 대한 반응으로 세포사멸 세포로부터 형광을 측정하여 측정된다.
도 29a-g는 또한 TRAC/TRBC 더블 녹아웃 또는 TRAC 단일 녹아웃인 삽입된 유전자삽입 TCR (AV11-TCR-A, AV13-TCR-B, AV12-TCR-C, AV14-TCR-F, AV15-TCR-G, AV16-TCR-H)를 함유하는 T 세포로부터 펩티드-특이적 IL-2 분비의 수준을 나타낸다; ELISA에 의해 측정됨.
도 30a-d는 또한 TRAC/TRBC 더블 녹아웃 또는 TRAC 단일 녹아웃인 삽입된 유전자삽입 TCR (AV11-TCR-A, AV14-TCR-F, AV15-TCR-G, AV16-TCR-H)를 함유하는 T 세포로부터 펩티드-특이적 IFN-g 분비를 나타낸다; ELISA에 의해 측정됨.
도 31a-b는 또한 TRAC/TRBC 더블 녹아웃 또는 TRAC 단일 녹아웃인 삽입된 유전자삽입 (AV11-TCR-A, AV14-TCR-F, AV15-TCR-G, AV16-TCR-H)을 함유하는 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 펩티드-특이적 IFN-g 염색의 수준을 나타낸다.
도 32a-b는 천연 TRAC는 녹아웃되고 TRBC 녹아웃이 있거나 없는 TRAC 유전자좌에서 유전자삽입 TCR을 갖는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 동종이식편 반응의 정도를 입증하는 CD107a 탈과립 분석의 결과를 나타낸다. (AV11-TCR-A, AV14-TCR-F, AV15-TCR-G, AV16-TCR-H). 도 32a는 CD8+ T-세포에서 CD107a+ 염색 세포의 백분율을 나타낸다. 도 31b는 CD4+ T-세포에서 CD107a+ 염색 세포의 백분율을 나타낸다.
도 33a-d는 천연 TRAC는 녹아웃되고 TRBC 녹아웃이 있거나 없는 TRAC 유전자좌에서 유전자삽입 TCR을 갖는 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 동종이식편 반응의 정도를 입증하는 혼합 림프구 반응의 결과를 나타낸다. CTV, CellTrace Violet (ThermoFisher).
참고 문헌이 본 발명의 특정 구현예를 상세하게 설명할 것이고, 이의 실시예는 첨부된 도면에서 도시된다. 본 교시가 다양한 구현예와 함께 기술되지만, 본 교시를 이러한 구현예로 제한하고자 의도하지 않는다. 반대로, 본 교시는 당업자에 의해 이해될 바와 같이 다양한 대안, 변형, 및 등가물을 포함한다.
본 교시를 상세하게 설명하기 전에, 본 개시가 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않고, 그 자체가 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수 참조를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "접합체"에 대한 언급은 복수의 접합체를 포함하고 "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다.
숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 측정된 및 측정 가능한 값은 유효 숫자 및 측정과 관련된 오류를 고려하여 근사치로 이해된다. 또한, "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하다(contain)", "함유하다(contains)", "함유하는(containing)", "포함하다(include)", "포함하다(includes)", 및 "포함하는(including)"의 사용은 제한하려고 의도하지 않는다. 전술한 일반적인 설명 및 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적인 것이며 교시를 제한하지 않음을 이해해야 한다.
본 명세서에서 구체적으로 언급하지 않는 한, 다양한 구성 요소를 "포함하는”을 언급하는 명세서의 구현예는 또한, 언급된 구성 요소"로 이루어진" 또는 "로 본질적으로 이루어진" 것으로 고려된다; 다양한 구성 요소"로 이루어진" 것으로 언급하는 명세서의 구현예는 또한, 언급된 구성 요소"를 포함하는" 또는 "로 본질적으로 이루어지는" 것으로 고려된다; 그리고 다양한 구성 요소"로 본질적으로 이루어진" 것으로 언급하는 명세서의 구현예는 또한, 언급하는 구성 요소"로 이루어진" 또는 "를 포함하는" 것으로 고려된다 (이 상호 교환성은 청구 범위에서 이들 용어의 사용에 적용되지 않음). 용어 "또는"은 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 명세서에서 포괄적인 의미로, 즉, "및/또는"과 등가로 사용된다. 용어 "약"은 목록 앞에 사용될 때, 목록의 각 구성원을 수정한다.
본원에서 사용되는 섹션 표제는 오직 조직적인 목적을 가지며 어떠한 방식으로 원하는 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 참고로 포함된 임의의 자료가 본 명세서에 정의된 용어 또는 본 명세서의 다른 표현 내용과 모순되는 경우, 본 명세서가 우선한다.
I. 정의
다른 언급이 없는 한, 본원에서 사용된 하기 용어 및 구절은 하기 의미를 갖도록 의도된다:
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 뉴클레오시드 또는 종래의 RNA, DNA, 혼합된 RNA-DNA, 및 이의 유사체인 중합체를 포함하는, 백본을 따라 함께 연결된 질소성 이종고리 염기 또는 염기 유사체를 갖는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 핵산 "백본"은 당-포스포디에스테르 연결, 펩티드-핵산 결합 ("펩티드 핵산" 또는 PNA; PCT 번호 WO 95/32305), 포스포로티오에이트 연결, 메틸포스포네이트 연결, 또는 이의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 다양한 연결로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보오스, 디옥시리보오스, 또는 치환, 예를 들어, 2' 메톡시 또는 2' 할라이드 치환을 갖는 유사한 화합물일 수 있다. 질소성 염기는 종래의 염기 (A, G, C, T, U), 이의 유사체 (예를 들어, 변형된 우리딘 예를 들어 5-메톡시우리딘, 슈도우리딘, 또는 N1-메틸슈도우리딘, 또는 기타); 이노신; 퓨린 또는 피리미딘의 유도체 (예를 들어, N4-메틸 데옥시구아노신, 데아자- 또는 아자-퓨린, 데아자- 또는 아자-피리미딘, 5 또는 6 위치에 치환기를 갖는 피리미딘 염기 (예를 들어, 5-메틸시토신), 2, 6, 또는 8 위치에 치환체를 갖는 퓨린 염기, 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-디메틸히드라진-피리미딘, 및 O4-알킬-피리미딘; 미국 특허 번호 5,378,825 및 PCT 번호 WO 93/13121)일 수 있다. 일반적인 논의는 The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams 등, ed., 11th ed., 1992)를 참고. 핵산은 백본이 중합체의 위치(들)에 대해 질소성 염기를 포함하는 않는 하나 이상의 "무염기" 잔기를 포함할 수 있다 (미국 특허 번호 5,585,481). 핵산은 종래의 RNA 또는 DNA 당, 염기 및 연결만을 포함할 수 있거나, 종래의 구성 요소 및 치환 (예를 들어, 2' 메톡시 치환체를 갖는 종래의 뉴클레오시드, 또는 종래의 뉴클레오시드 및 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 모두 함유하는 중합체)을 모두 포함할 수 있다. 핵산은 "잠금 핵산" (LNA), RNA 모방 당 형태에서 잠금된 비사이클릭 푸라노오스 유닛을 갖는 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드 단량체를 함유하는 유사체를 포함하고, 이는 상보적인 RNA 및 DNA 서열에 대해 혼성화 친화도를 향상시킨다 (Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41). RNA 및 DNA는 상이한 당 모이어티를 갖고 RNA에서 우라실 또는 이의 유사체 및 DNA에서 티민 또는 이의 유사체의 존재에 의해 상이할 수 있다.
"가이드 RNA", "gRNA", 및 단순히 "가이드"는 crRNA (CRISPR RNA로도 알려짐), 또는 crRNA와 trRNA (tracrRNA로도 알려짐)의 조합을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자 (단일 가이드 RNA, sgRNA) 또는 2개의 개별 RNA 분자 (이중 가이드 RNA, dgRNA)로서 결합될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각각의 유형을 지칭한다. trRNA는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열에 비해 변형 또는 변이를 갖는 trRNA 서열일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "가이드 서열"은 표적 서열에 대해 상보적인 가이드 RNA 내의 서열을 지칭하고 RNA-가이드된 DNA 결합제에 의한 결합 또는 변형 (예를 들어, 절단)을 위해 가이드 RNA를 표적 서열에 대해 지시하는 기능을 한다. "가이드 서열"은 또한 "표적화 서열," 또는 "스페이서 서열"로서 지칭될 수 있다. 가이드 서열은 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 (즉, Spy Cas9) 및 관련된 Cas9 동족체/병렬상동체의 경우, 20개 염기 쌍 길이일 수 있다. 더 짧거나 더 긴 서열 예를 들어, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24-, 또는 25-뉴클레오티드 길이는 또한 가이드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가이드 서열은 서열 번호 1-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 유전자 또는 염색체에 있고, 예를 들어, 가이드 서열에 대해 상보적이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 그의 대응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가이드 서열은 서열 번호 1-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나의 불일치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있고, 표적 서열의 총 길이는 적어도 17, 18, 19, 20개 이상 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1-4개의 불일치를 함유할 수 있고 가이드 서열은 적어도 17, 18, 19, 20개 이상 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있고 가이드 서열은 20개 뉴클레오티드를 포함한다.
RNA-가이드된 DNA 결합제에 대한 표적 서열은 RNA-가이드된 DNA 결합제에 대한 핵산 기질은 이중 가닥 핵산으로서, 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥 모두 (즉, 주어진 서열 및 서열의 역방향 상보)를 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 대해 상보적인" 것으로 언급되는 경우, 가이드 서열은 가이드 RNA를 표적 서열의 센스 또는 안티센스 가닥 (예를 들어 역방향 상보)에 결합하도록 지시할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역방향 상보에 결합하는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열 내에 T에 대한 U의 치환을 제외하고 표적 서열의 특정 뉴클레오티드와 동일하다 (예를 들어, PAM를 포함하지 않는 표적 서열).
본원에 사용된 바와 같이, "RNA-가이드된 DNA 결합제"는 폴리펩티드 또는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 복합체, 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하고, 여기서 DNA 결합 활성은 서열-특이적이고 RNA의 서열에 따라 달라진다. 예시적인 RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 클리바아제/닉카아제 및 이의 불활성화된 형태 ("dCas DNA 결합제")를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Cas 뉴클레아제"는 Cas 클리바아제, Cas 닉카아제, 및 dCas DNA 결합제를 포괄한다. 일부 구현예에서 Cas 클리바아제 또는 Cas 닉카아제는 예를 들어 FokI 도메인과의 융합을 통해 DNA 절단을 허용하도록 변형된 dCas DNA 결합제를 포괄한다. Cas 클리바아제/닉카아제 및 dCas DNA 결합제는 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, Cas10, 이의 Csm1, 또는 Cmr2 서브유닛, 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 및 이의 Cas3 서브유닛, 및 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "클래스 2 Cas 뉴클레아제"는 RNA-가이드된 DNA 결합 활성을 갖는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 클래스 2 Cas 클리바아제/닉카아제 (예를 들어, H840A, D10A, 또는 N863A 변이체)를 포함하고, 이는 추가로 RNA-가이드된 DNA 클리바아제 또는 닉카아제 활성을 가지고, 클래스 2 dCas DNA 결합제에서는 클리바아제/닉카아제 활성이 불활성화된다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9 (예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0) (예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체), 및 eSPCas9(1.1) (예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질, Zetsche 등, Cell, 163: 1-13 (2015)은 Cas9에 상동성이고, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전문이 참고로서 포함된다. 예를 들어, Zetsche, 표 S1 및 S3 참조. 예를 들어, Makarova 등, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov 등, Molecular Cell, 60:385-397 (2015) 참조.
본원에 사용된 바와 같이, "리보뉴클레오단백질" (RNP) 또는 "RNP 복합체"는 RNA-가이드된 DNA 결합제와 함께인 가이드 RNA, 예를 들어 Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas 클리바아제, Cas 닉카아제, 또는 dCas DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 Cas9과 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 표적 서열로 안내하고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하고 약제는 표적 서열에 결합하고; 약제가 클리바아제 또는 닉카아제인 경우, 결합 후 클리빙 또는 닉킹이 뒤따를 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 제1 서열의 제2 서열에 대한 정렬이 제2 서열의 전체 위치의 X% 이상이 제1 서열에 의해 일치함을 나타내는 경우 제1 서열은 제2 서열과 "적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함"하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 서열 AAG와 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는데, 그 이유는 정렬이 제2 서열의 세 위치 모두에 일치하다는 점에서 100% 동일성을 제공하기 때문이다. RNA와 DNA 사이의 상이함 (일반적으로 우리딘의 티미딘으로의 교환 또는 그 반대) 및 변형된 우리딘과 같은 뉴클레오시드 유사체의 존재는 관련 뉴클레오티드 (예를 들어 티미딘, 우리딘, 또는 변형된 우리딘)가 동일한 상보체 (예를 들어, 티미딘, 우리딘, 또는 변형된 우리딘 모두에 대한 아데노신; 다른 예는 시토신 및 5-메틸시토신이며, 둘 모두 상보체로서 구아노신 또는 변형된 구아노신을 가짐)를 가지는 한 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성 또는 상보성의 상이함에 기여하지 않는다. 따라서, 예를 들어, X가 임의의 변형된 우리딘, 예를 들어 슈도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘, 또는 5-메톡시우리딘인 서열 5'-AXG는 둘 다 동일한 서열 (5'-CAU)에 완벽하게 상보적이라는 점에서 AUG와 100% 동일한 것으로 간주된다. 예시적인 정렬 알고리즘은 당업계에 잘 알려진 Smith-Waterman 및 Needleman-Wunsch 알고리즘이다. 당업자는 어떤 알고리즘 및 파라미터 설정의 선택이 서열의 주어진 쌍이 정렬되기에 적절한지 이해할 것이며; 일반적으로 유사한 길이 및 아미노산의 경우 >50% 예상되는 동일성 또는 뉴클레오티드의 경우 >75% 예상되는 동일성의 경우, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI에 의해 제공된 Needleman-Wunsch 알고리즘 인터페이스의 기본 설정을 사용하는 Needleman-Wunsch 알고리즘이 일반적으로 적절하다.
"mRNA"는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 (즉, 리보솜 및 아미노-아실화 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 작용할 수 있는) 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. mRNA는 리보오스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어, 2'-메톡시 리보오스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 백본을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 포스페이트-당 백본의 당은 리보오스 잔기, 2'-메톡시 리보오스 잔기, 또는 이의 조합으로 본질적으로 이루어진다.
본원에 기술된 가이드 RNA 조성물 및 방법에 유용한 예시적인 가이드 서열은 표 1, 2 및 3 및 본 출원에 걸쳐 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "인델"은 표적 핵산에서 더블-가닥 브레이크 (DSB) 부위에 삽입되거나 결실된 다수의 뉴클레오티드로 이루어진 삽입/결실 돌연변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹다운"은 특정 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질, mRNA 또는 둘 다)의 발현 감소를 지칭한다. 단백질의 녹다운은 관심 조직 또는 세포 집단의 단백질의 총 세포량을 검출함으로써 측정할 수 있다. mRNA의 녹다운을 측정하는 방법은 공지되어 있으며 관심 조직 또는 세포 집단으로부터 단리한 mRNA의 시퀀싱을 포함한다. 유동 세포 측정법 분석은 단백질 발현의 녹다운 측정하기 위한 공지된 방법이다. 일부 구현예에서, "녹다운"은 특정 유전자 생성물의 발현의 일부 손실, 예를 들어 세포 집단에 의해 전사된 mRNA의 양의 감소 또는 발현된 단백질의 양의 감소를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, "녹다운"은 특정 유전자 생성물, 예를 들어 세포 표면에서 TRAC 또는 TRBC 유전자 생성물의 발현의 일부 손실을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹아웃"은 세포에서 특정 단백질의 발현 손실을 지칭한다. 녹아웃은 세포, 조직 또는 세포 집단에서 단백질의 총 세포량을 검출함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 세포에서 (예를 들어, 세포 집단에서) TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC를 "녹아웃"시킨다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 T-세포 수용체 단백질의 돌연변이체의 형성이 아니라, 세포에서 T-세포 수용체의 단백질 구성 요소 (예를 들어 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC)의 발현의 완전한 손실이다.
본원에 사용된 바와 같이, "TRBC1" 및 "TRBC2"는 T-세포 수용체 β-사슬을 암호화하는 2개의 상동 유전자를 지칭하고, 이는 TRBC1 또는 TRBC2 유전자의 유전자 생성물이다.
"TRBC"는 TRBC1 및 TRBC2를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
인간 야생형 TRBC1 서열은 NCBI Gene ID: 28639; Ensembl: ENSG00000211751에서 이용 가능하다. T-세포 수용체 베타 불변부, V_세그먼트 번역 생성물, BV05S1J2.2, TCRBC1, 및 TCRB은 TRBC1에 대한 유전자 동의어이다.
인간 야생형 TRBC2 서열은 NCBI Gene ID: 28638; Ensembl: ENSG00000211772에서 이용 가능하다. T-세포 수용체 베타 불변부, V_세그먼트 번역 생성물, 및 TCRBC2는 TRBC2에 대한 유전자 동의어이다.
인간 야생형 TRAC 서열은 NCBI Gene ID: 28755; Ensembl: ENSG00000277734에서 이용 가능하다. T-세포 수용체 알파 불변부, TCRA, IMD7, TRCA 및 TRA는 TRAC에 대한 유전자 동의어이다.
윌름스 종양 단백질 (또한, 때로는 윌름스 종양 항원으로도 지칭됨)은 WT1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 인간 야생형 WT1 서열은 NCBI Gene ID: 7490; Ensembl: ENSG00000184937에서 이용 가능하다. GUD, AWT1, WAGR, WT33, NPHS4, 및 WIT-2는 WT1에 대한 유전자 동의어이다. 윌름스 종양 단백질은 고형 종양 (윌름스 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않음) 및 혈액 암을 포함하는 다양한 암, 및 또한 종양 혈관 내피 세포 및 조혈 전구 세포에서 발현되는 것으로 보고되었다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 서열"은 gRNA의 가이드 서열과 상보성을 갖는 표적 유전자의 핵산 서열을 지칭한다. 표적 서열과 가이드 서열의 상호 작용은 RNA-가이드된 DNA 결합제가 표적 서열 내에서 결합하고, (잠재적으로 약제의 활성에 따라) 닉 또는 절단하도록 지시한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 대상체에서 질환 또는 장애에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하며, 질환 억제, 이의 발달 정지, 질환의 하나 이상의 증상 경감, 질환의 치유, 또는 질병의 하나 이상의 증상의 재발 방지를 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방법에 따라 달라진다.
Ⅱ. 조성물
A. 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물
본원에서 예를 들어, RNA-가이드된 DNA 결합제를 갖는 가이드 RNA (예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)를 사용하여 DNA 서열을 변경, 예를 들어 TRBC 및/또는 TRAC 유전자 내에서 단일-가닥 (SSB) 또는 더블-가닥 브레이크 (DSB)를 유도하는데 유용한 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 TRAC 및/또는 TRBC 서열을 변경하고 추가로 TCR 유전자를 삽입하는데 유용하다.
일부 구현예에서, TRAC 및/또는 TRBC 서열을 변경하고 추가로 TCR 유전자를 삽입하는 것은 대조군, 예를 들어, TRAC 및/또는 TRBC가 변경되지 않은 대조군에 비해 TRAC 및/또는 TRBC의 쌍오류를 유리하게 감소시킨다. 예를 들어, TRBC 서열을 변경 (예를 들어, TRBC를 녹아웃)하고 추가로 TCR 유전자를 삽입하는 것은 삽입된 TCR와 천연 TRBC 사이 쌍오류를 유리하게 감소시킬 수 있다. 또는 TRAC 서열을 변경 (예를 들어, TRAC를 녹아웃)하고 추가로 TCR 유전자를 삽입하는 것은 삽입된 TCR와 천연 TRAC 사이 쌍오류를 유리하게 감소시킬 수 있다. TRBC 유전자를 표적화하는 가이드 서열은 표 1에 서열 번호 1-89에서 나타낸다. TRAC 유전자를 표적화하는 가이드 서열은 표 2에 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218에서 나타낸다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 인간 표준 게놈 hg38로부터의 좌표에 따라, 하기 표에 나타낸 대응하는 게놈 영역에 대해 상보적이다. 추가 구현예의 가이드 서열은 표, 1, 2 및/또는 3 중 하나에 열거된 게놈 좌표에 가까운 곳의 서열에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 추가 구현예의 가이드 서열은 표, 1, 2 및/또는 3 중 하나에 열거된 게놈 좌표의 15개 연속 뉴클레오티드±10개 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 상보적일 수 있다.
표 1 및 표 2에서 서열 번호 1-89, 90-178, 185, 및 213-218에 나타낸 각각의 가이드 서열은 crRNA를 형성하기 위해, 예를 들어, 3' 말단에서 가이드 서열을 따르는 하기 예시적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 추가 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다: 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (서열 번호 400). sgRNA의 경우, 가이드 서열은 sgRNA를 형성하기 위해, 예를 들어, 가이드 서열의 3' 말단을 따르는 하기 예시적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 추가 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다: 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (서열 번호 401). 가이드 서열은 sgRNA를 형성하기 위해, 예를 들어, 가이드 서열의 3' 말단을 따르는 하기 예시적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다: 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열 번호 402).
표 1: TRBC 표적화된 및 대조군 가이드 서열 및 염색체 좌표
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
각각의 이들 가이드 서열은 일반적으로 하기와 같이 표시된 다음 예외를 제외하고, TRBC1 및 TRBC2 유전자 모두를 표적화한다:
† 서열 번호 11 및 26은 TRBC1을 특이적으로 표적화한다.
표 2: TRAC 표적화된 및 대조군 가이드 서열 및 염색체 좌표
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
표 3: sgRNA 서열, 명명, 및 구성 요소 하위서열
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
* = PS 연결; m = 2'-O-Me 뉴클레오티드; N = 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드
일부 구현예에서, 본 발명은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 지시하는 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물을 제공하고, 이는 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC에서 표적 DNA 서열에 대해 뉴클레아제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제 예를 들어 Cas9)일 수 있다. gRNA는 표 1 또는 2에 나타낸 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 하기 서열을 포함하고: (N)xGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCAC CGAGUCGGUGC (서열 번호 403), 여기서 "N"은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 전체의 N은 본원에 기술된 바와 같은 TRBC 또는 TRAC 가이드 서열을 포함한다. gRNA는 표 1 또는 3에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함할 수 있다. gRNA는 표 1 또는 2에 나타낸 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 표 1 또는 2에 나타낸 가이드 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 표 1 또는 2에 나타낸 가이드 서열에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. gRNA는 trRNA를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 각 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 RNA (sgRNA)로서 결합될 수 있거나 별개의 RNA (dgRNA) 상에 있을 수 있다. sgRNA의 맥락에서, crRNA 및 trRNA 구성 요소는 예를 들어, 포스포디에스테르 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 공유적으로 연결될 수 있다.
본원에 기술된 각 구현예에서, 가이드 RNA는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. dgRNA는 예를 들어, 표 1 또는 2에 나타낸 가이드 서열, 및 trRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함하는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 분자는 공유적으로 연결되지 않을 수 있지만, crRNA의 일부와 trRNA 사이의 염기 페어링을 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.
본원에 기술된 각 구현예에서, 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 단일 RNA 분자를 포함할 수 있다. sgRNA는 trRNA에 공유적으로 연결된 표 1 및 2에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA (또는 이의 일부)를 포함할 수 있다. sgRNA는 표 1 또는 2에 나타낸 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 crRNA의 일부와 trRNA 사이 염기 페어링을 통해 스템-루프 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 포스포디에스테르 결합이 아닌 하나 이상의 결합을 통해 공유적으로 연결된다.
일부 구현예에서, trRNA는 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된 trRNA 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, trRNA는 절단된 또는 변형된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다. 일부 구현예에서, trRNA는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 100개 이상 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, trRNA는 예를 들어, 하나 이상의 헤어핀 또는 스템-루프 구조, 또는 하나 이상의 벌지 구조와 같은 특정 이차 구조를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1-89 및 90-178 중 하나의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 179-184 중 하나를 포함하는 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1-89, 90-178, 185, 및 213-218의 핵산 중 하나와 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1-89, 90-178, 185, 및 213-218의 가이드 서열 중 둘 이상으로부터 선택된 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의, 예를 들어, 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1-89, 90-178, 185, 및 213-218의 핵산 중 하나와 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 각각 포함하는 적어도 2개의 gRNA를 포함한다.
본 발명의 가이드 RNA 조성물은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 표적 서열을 인식 (예를 들어, 혼성화)하도록 설계된다. 예를 들어, TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 표적 서열은 가이드 RNA를 포함하는 제공된 Cas 클리바아제에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 Cas 클리바아제는 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 표적 서열에 대해 가이드 RNA에 의해 지시될 수 있고, 여기서 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화되고 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 Cas 클리바아제는 표적 서열을 절단한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 표적 서열에 기초하여 결정된다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 유전자의 특정 영역에서 돌연변이 (예를 들어, 뉴클레아제-매개 DSB의 결과로서 발생하는 인델로 유발된 프레임이동 돌연변이)는 유전자의 다른 영역에서의 돌연변이보다 덜 허용될 수 있기 때문에, DSB의 위치는 발생할 수 있는 단백질 녹다운의 양이나 유형에　중요한 요소이다. 일부 구현예에서, TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 내의 표적 서열에 대해 상보적이거나 상보성을 갖는 gRNA는 적절한 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 특정 위치로 RNA-가이드된 DNA 결합제를 지시하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, gRNA는 TRBC1 및/또는 TRBC2의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 또는 엑손 4에서 표적 서열, 및/또는 TRAC의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 또는 엑손 4에서 표적 서열에 대해 상보적이거나 상보성을 갖는 가이드 서열을 갖도록 설계된다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 인간 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 존재하는 표적 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 가이드 서열 및 그의 대응하는 표적 서열 사이 상보성 또는 동일성의 정도는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 적어도 하나의 불일치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열의 총 길이는 20이다. 일부 구현예에서, 표적 서열과 gRNA의 가이드 서열은 1-4개의 불일치를 함유할 수 있고 여기서 가이드 서열은 20개 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공되고, 사용되거나, 투여된다.
B. 변형된 gRNA 및 mRNA
일부 구현예에서, gRNA는 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, gRNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하고 표준 A, G, C, 및 U 잔기 대신에 또는 추가로 사용되는 하나 이상의 비천연 및/또는 천연 발생 구성 요소 또는 구성의 존재를 기술하기 위해 "변형된" gRNA 또는 "화학적으로 변형된" gRNA로 불릴 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 비-표준 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드로 합성되며, 여기서 "변형된"으로 불린다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i)포스포디에스테르 백본 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 백본 변형); (ii) 리보오스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보오스 당 상의 2' 히드록실의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 당 변형); (iii) "데포스포" 링커를 갖는 포스페이트 모이어티의 대규모 대체 (예시적인 백본 변형); (iv) 비-표준 핵염기를 포함하는 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체 (예시적인 염기 변형); (v) 리보오스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형 (예시적인 백본 변형); (vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 모이어티, 캡 또는 링커의 말단 포스페이트 기 또는 컨쥬게이션의 제거, 변형 또는 대체 (이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 백본 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체 (예시적인 당 변형).
상기 열거된 것과 같은 화학적 변형은 2개, 3개, 4개 이상의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (집합적으로 "잔기")를 포함하는 변형된 gRNA 및/또는 mRNA를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 모든 염기는 변형되고, 예를 들어, 모든 염기는 변형된 포스페이트 기, 예를 들어 포스포로티오에이트 기를 갖는다. 특정 구현예에서, gRNA 분자의 포스페이트 기의 전부, 또는 실질적으로 전부는 포스포로티오에이트 기로 대체된다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 말단에서 또는 그 근처에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 말단에서 또는 그 근처에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 1개, 2개, 3개 이상의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA에서 위치의 적어도 5% (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%)는 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드이다.
비변형된 핵산은 예를 들어, 세포 내 뉴클레아제 또는 혈청에서 발견되는 것에 의해 저하되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 한 양태에서 본원에 기술된 gRNA는 예를 들어, 세포 내 또는 혈청 기반 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 gRNA 분자는 세포 집단으로 생체 내 및 생체 외 모두 도입될 때 감소한 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 단일 가닥 핵산을 포함하는, 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하고, 이는 사이토카인 특히 인터페론의 발현 및 방출의 유도, 및 세포 사멸을 포함한다.
백본 변형의 일부 구현예에서, 변형된 잔기의 포스페이트 기는 상이한 치환기의 산소 중 하나 이상으로 교체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 잔기, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 본원에 기술된 바와 같은 변형된 포스페이트 기를 갖는 비변형된 포스페이트 모이어티의 대규모 대체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본의 백본 변형은 비대칭 전하 분포를 갖는 하전되지 않은 링커 또는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트 기의 예시는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 비변형된 포스페이트 기에서 인 원자는 아키랄이다. 그러나 상기 원자 중 하나 또는 원자 그룹을 갖는 비-가교 산소 중 하나의 대체는 인 원자가 키랄이 되게 할 수 있다. 입체인 원자는 "R" 배열 (본원에서 Rp) 또는 "S" 배열 (본원에서 Sp)을 가질 수 있다. 또한, 백본은 가교 산소 (즉, 포스페이트를 뉴클레오시드에 연결하는 산소)를 질소 (가교 포스포로아미데이트), 황 (가교 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교 메틸렌포스포네이트)의 대체에 의해 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 또는 연결 산소 모두에서 발생할 수 있다.
포스페이트 기는 특정 백본 변형에서 비-인 함유 커넥터에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전된 포스페이트 기는 중성 모이어티에 의해 대체될 수 있다. 포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예시는 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 히드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 술포네이트, 술폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 제한없이, 포함할 수 있다.
핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드가 또한, 구성될 수 있고 거기에서 포스페이트 링커 및 리보오스 당이 뉴클레아제 저항성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대체물에 의해 대체된다. 이러한 변형은 백본 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대체물 백본에 의해 테더링될 수 있다. 예시는 모르폴리노, 시클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오시드 대체물을 제한없이, 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 즉 당 변형에서, 당 기에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 히드록실 기(OH)는 변형될, 예를 들어 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기에 대한 변형은 히드록실이 더 이상 2'-알콕시드 이온을 형성하기 위해 탈양성자화될 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다.
2' 히드록실 기 변형의 예시는 알콕시 또는 알릴옥시 (OR, 여기서 "R"은 예를 들어, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR을 포함할 수 있고 여기서 R은 예를 들어, H 또는 임의로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20의 정수일 수 있다 (예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20). 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 2'-플루오로 변형일 수 있고, 이는 2' 히드록실 기를 플루오라이드로 대체한다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 2' 히드록실이 예를 들어, 동일한 리보오스 당의 4'탄소에 대해 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 가교에 의해 연결될 수 있는 "고정된" 핵산 (LNA)을 포함할 수 있고, 여기서 예시적인 가교는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 가교; O-아미노 (여기서 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노, (여기서 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기변형은 리보오스 고리에 C2'-C3' 결합이 없는 "비고정된" 핵산 (UNA)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실 기 변형은 메톡시에틸 기 (MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 2' 변형은 수소 (즉 예를 들어, 부분적으로 dsRNA의 돌출 부분에서, 디옥시리보오스 당); 할로 (예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오드); 아미노 (여기서 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노 (여기서 아미노는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음), -NHC(O)R (여기서 R은 예를 들어, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아케닐 및 알키닐을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 아미노로 임의로 치환될 수 있다.
당 변형은 리보오스의 대응하는 탄소보다 반대 입체화학 배열을 갖는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있는 당 기를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 예를 들어, 당으로서, 아라비노스를 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 무염기 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기 당은 또한 구성성분 당 원자 중 하나 이상에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어 L- 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
변형된 핵산에 포함될 수 있는, 본원에 기술된 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 또한 핵염기로도 불리는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예시는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 핵염기는 변형된 핵산으로 통합될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 전체적으로 대체될 수 있다. 뉴클레오티드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체, 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 예를 들어, 염의 자연 발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 이용하는 구현예에서, 각각의 crRNA 및 tracr RNA는 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 crRNA 및/또는 tracr RNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 있을 수 있다. sgRNA를 포함하는 구현예에서, sgRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 잔기가 화학적으로 변형될 수 있고/거나, 내부 뉴클레오시드가 변형될 수 있고/거나, 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예는 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 구현예는 3' 말단 변형을 포함한다. 특정 구현예는 5' 말단 변형 및 3' 말단 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 2017년 12월 8일 출원된, "Chemically Modified Guide RNAs"라는 제목의 WO2018/107028 A1에 개시된 변형 패턴 중 하나를 포함하고, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 US20170114334에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함하고, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 WO2017/136794에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함하고, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, sgRNA는 본원에 나타낸 임의의 변형 패턴을 포함하고, 여기서 N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, 여기서 전체의 N은 표 1-3에서 본원에 기술된 바와 같은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 sgRNA는 하기 서열을 포함하고: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (서열 번호 300), 여기서 "N"은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드일 수 있고, 여기서 전체의 N은 표 1 및 2에 기술된 바와 같거나 본원에 기술된 바와 같은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 가이드 서열을 포함한다.　예를 들어, 본원에 포함된 것은 서열 번호 300이고, 여기서 N은 표 1 및 2에서 본원에 개시된 임의의 가이드 서열 (서열 번호 1-89, 90-178, 185, 및 213-218)로 대체된다.
하기 기술된 임의의 변형은 본원에 기술된 바와 같은 gRNA 및 mRNA에 있을 수 있다.
용어 "mA," "mC," "mU," 또는 "mG"는 2'-O-Me로 변형된 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용될 수 있다.
2'-O-메틸의 변형은 다음과 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00012
뉴클레오티드 당 고리에 영향을 줄 수 있는 것으로 나타난 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 당 고리 상의 2'-플루오로 (2'-F) 치환은 올리고뉴클레오티드 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "fA," "fC," "fU," 또는 "fG"는 2'-F로 치환된 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용될 수 있다.
2'-F의 치환은 다음과 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00013
포스포로티오에이트 (PS) 연결 또는 결합은 포스포디에스테르 연결, 예를 들어 뉴클레오티드 염기 사이의 결합에서 1개의 비-가교 포스페이트 산소에 대해 황이 치환된 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트가 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 사용되는 경우, 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 S-올리고로서 지칭될 수 있다.
"*"는 PS 변형을 표시하기 위해 사용될 수 있다. 본 출원에서, 용어 A*, C*, U*, 또는 G*는 PS 결합으로 다음 (예를 들어, 3') 뉴클레오티드에 연결된 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "mA*," "mC*," "mU*," 또는 "mG*"는 2'-O-Me로 치환되고 PS 결합으로 다음 (예를 들어, 3') 뉴클레오티드에 연결된 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용될 수 있다.
하기 다이어그램은 포스포디에스테르 결합 대신에 PS 결합을 생성하는, S-의 비-가교 포스페이트 산소로의 치환을 나타낸다:
Figure pct00014
무염기 뉴클레오티드는 질소성 염기가 없는 것을 지칭한다. 하기 도면은 염기가 없는 무염기 (아퓨린으로도 알려짐) 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드를 도시한다:
Figure pct00015
역위 염기는 정상 5'에서 3' 연결 (즉, 5'에서 5' 연결 또는 3'에서 3' 연결)로부터 역위된 연결을 갖는 것을 지칭한다. 예를 들어:
Figure pct00016
무염기 뉴클레오티드 역위 연결로 부착될 수 있다. 예를 들어, 무염기 뉴클레오티드는 5'에서 5'연결을 통해 말단 5'뉴클레오티드에 부착될 수 있거나, 무염기 뉴클레오티드는 3'에서 3' 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오티드에서 역위 무염기 뉴클레오티드는 또한 역위 무염기 말단 캡으로 불릴 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개, 4개, 또는 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상, 및 3' 말단에서 마지막 3개, 4개, 또는 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-F, 역위 무염기 뉴클레오티드, PS 결합, 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키기 위해 당업계에 잘 알려진 다른 뉴클레오티드 변형이다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 4개의 뉴클레오티드, 및 3' 말단에서 마지막 4개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 (PS) 결합으로 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개의 뉴클레오티드, 및 3' 말단에서 마지막 3개의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개의 뉴클레오티드, 및 3' 말단에서 마지막 3개의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개의 뉴클레오티드, 및 3' 말단에서 마지막 3개의 뉴클레오티드는 역위 무염기 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 변형된 sgRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 서열 번호 401에 나타낸 변형 패턴을 포함하고, 여기서 N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, 여기서 전체의 N은 예를 들어, 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC에서 뉴클레아제를 표적 서열로 지시하는 가이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 서열 번호 179-184 중 어느 하나에 나타낸 sgRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 서열 번호 1-178의 가이드 서열 및 서열 번호 401의 뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA를 포함하고, 상기 서열 번호 401의 뉴클레오티드는 가이드 서열의 3' 말단에 있고, 여기서 sgRNA는 본원 또는 서열 번호 300에 나타낸 바와 같이 변형될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용, 또는 투여된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 ORF는 "변형된 RNA-가이드된 DNA 결합제 ORF" 또는 단순히 "변형된 ORF"이고, 이는 ORF가 변형되었음을 표시하는 약칭으로 사용된다.
일부 구현예에서, 변형된 ORF는 적어도 하나, 복수의, 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5 위치에서, 예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로 변형된 우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 1 위치에서, 예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로 변형된 슈도우리딘이다. 변형된 우리딘은 예를 들어, 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-요오도리딘, 또는 이의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸 슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도리딘 및 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘 및 5-요오도리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도리딘 및 5-메톡시우리딘의 조합이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 5' 캡, 예를 들어 Cap0, Cap1, 또는 Cap2를 포함한다. 5' 캡은 일반적으로 mRNA의 5'에서 3' 사슬의 제1 뉴클레오티드의 5' 위치에 대한 5'-트리포스페이트, 즉, 제1 캡-근위 뉴클레오티드를 통해 연결된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오티드(이는 예를 들어 ARCA와 관련하여 하기 논의된 바와 같이 추가로 변형될 수 있음)이다. Cap0에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오티드의 리보오스 모두 2'-히드록실을 포함한다. Cap1에서, mRNA의 제1 및 제2 전사된 뉴클레오티드의 리보오스는 각각, 2'-메톡시 및 2'-히드록실을 포함한다. Cap2에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오티드의 리보오스 모두 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, Katibah 등 (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas 등 (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115 참조. 인간 mRNA와 같은 포유동물 mRNA를 포함하는, 대부분 내인성 고등 진핵 mRNA는 Cap1 또는 Cap2를 포함한다. Cap1 및 Cap2와 상이한 Cap0 및 다른 캡 구조는 IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천성 면역 시스템의 구성 요소에 의한 "비-자기"로서 인식때문에 포유동물, 예를 들어 인간에서는 면역원성일 수 있고, 이는 유형 I 인터페론을 포함하는 상승된 사이토카인 수준을 초래할 수 있다. IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천성 면역 시스템의 구성 요소는 mRNA의 Cap1 또는 Cap2 이외의 캡과의 결합에 대해 eIF4E와 경쟁하여, 잠재적으로 mRNA의 번역을 억제할 수 있다.
캡은 동시-전사적으로 포함될 수 있다. 예를 들어, ARCA (반-역 캡 유사체; Thermo Fisher Scientific Cat. No. AM8045)는 개시 시 전사체로 시험관 내에서 포함될 수 있는 구아닌 리보뉴클레오티드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트리포스페이트를 포함하는 캡 유사체이다. ARCA는 제1 캡-근위 뉴클레오티드의 2'위치가 히드록실인 Cap0 캡을 생성한다. 예를 들어, Stepinski 등, (2001) "Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 'anti-reverse’ cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG," RNA 7: 1486-1495 참조. ARCA 구조는 하기에 나타낸다.
Figure pct00017
CleanCapTM AG (m7G(5')ppp(5') (2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies Cat. No. N-7113) 또는 CleanCapTM GG (m7G(5')ppp(5') (2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies Cat. No. N-7133)는 동시-전사적으로 Cap1 구조를 제공하기 위해 사용될 수 있다. CleanCapTM AG 및 CleanCapTM GG의 3'-O-메틸화 버전은 또한 각각, Cat. Nos. N-7413 및 N-7433로서, TriLink Biotechnologies로부터 시판된다. CleanCapTM AG 구조는 하기에 나타낸다.
Figure pct00018
대안적으로, 캡은 전사후적으로 RNA에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소는 시판되고 (New England Biolabs Cat. No. M2080S) D1 서브유닛에 의해 제공되는 RNA 트리포스파타제 및 구아닐릴 트랜스퍼라제 활성, 및 D12 서브유닛에 의해 제공되는 구아닌 메틸트랜스퍼라제를 가진다. 이와 같이, 7-메틸구아닌을 RNA에 첨가하여, S-아데노실 메티오닌 및 GTP 존재하에 Cap0를 얻을 수 있다. 예를 들어, Guo, P. 및 Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. 및 Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479 참조.
일부 구현예에서, mRNA는 추가로 폴리-아데닐화 (폴리-A) 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 아데닌, 선택적으로 최대 300개 아데닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다.
C. 리보뉴클레오단백질 복합체
일부 구현예에서, 표 1 및 2의 하나 이상의 가이드 서열 또는 표 3의 하나 이상의 sgRNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어, 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9과 같은, Cas 뉴클레아제를 포함하는 하나 이상의 gRNA를 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제. 예를 들어 Cas9은 이중 가닥 엔도뉴클레아제 활성으로도 지칭될 수 있는, 클리바아제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. Cas9 뉴클레아제의 예시는 S. 피오게네스, S. 아우레우스, 및 다른 원핵생물의 유형 II CRISPR 시스템의 것 (예를 들어, 다음 단락의 목록 참조), 및 이의 변형된 (예를 들어, 조작된 또는 돌연변이) 버전을 포함한다. 예를 들어, US2016/0312198 A1; US 2016/0312199 A1 참조. Cas 뉴클레아제의 다른 예시는 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체 또는 이의 Cas10, Csm1, 또는 Cmr2 서브유닛; 및 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 또는 이의 Cas3 서브유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 유형-IIA, 유형-IIB, 또는 유형-IIC 시스템으로부터 유래될 수 있다. 다양한 CRISPR 시스템 및 Cas 뉴클레아제에 대한 논의는, 예를 들어, Makarova 등, Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011); Makarova 등, Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov 등, Molecular Cell, 60:385-397 (2015) 참조.
Cas 뉴클레아제가 유래될 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 볼리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 수테렐라 봐드스보텐시스(Sutterella wadsworthensis), 감마프로테오박테륨(Gammaproteobacterium), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 피브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogene), 로도스피릴륨 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실러스 액시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테륨 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 부흐네리 (Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 미크로스시라 마리나 (Microscilla marina), 부르크홀데리알레스 박테륨 (Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스 (Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 왓소니 (Crocosphaera watsonii), 사이아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로사이스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 사이네코코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로븀 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 아모니펙스 데겐시(Ammonifex degensii), 칼디셀루로시루프터 베스시(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨륨 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 액시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 액시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobacillusferrooxidans), 알로크로마튬 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 왓소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로븀 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플레텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.), 리그비아종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라테스(Microcoleus chthonoplastes), 오스실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코커스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 파르비바쿨륨 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코리네박테륨 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 액시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테륨(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 및 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 써모필루스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 네이세리아 메닌기티디스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 노비시다로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 액시다미노코커스 종으로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 라크노스피라세아에 박테륨 ND2006으로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 추가 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium), 스미텔라(Smithella), 액시다미노코커스(Acidaminococcus), 칸디다투스 메타노플라즈마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리칸니스 (Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 또는 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae)로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 특정 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 액시다미노코커스 또는 라크노스피라세아에로부터의 Cpf1 클레아제이다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제와 함께인 gRNA는 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)라고 한다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제와 함께인 gRNA는 Cas RNP라고 한다. 일부 구현예에서, RNP는 유형-I, 유형-II, 또는 유형-III 구성 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9과와 함께인 gRNA는 Cas9 RNP라고 한다.
야생형 Cas9은 2개의 뉴클레아제 도메인을 갖는다: RuvC 및 HNH. RuvC 도메인은 비-표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 하나 이상의 RuvC 도메인 및/또는 하나 이상의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 각각의 조성물, 용도, 및 방법 구현예에서, Cas는 표적 DNA에서 이중 가닥 브레이크를 유도한다.
일부 구현예에서, 키메라 Cas 뉴클레아제가 사용되며, 여기서 단백질의 하나의 도메인 또는 영역이 상이한 단백질의 일부에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레아제로부터의 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 변형된 뉴클레아제일 수 있다.
다른 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 유형-I CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 유형-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 구성 요소일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 유형-III CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 단일-가닥 닉카아제 활성을 갖고, 즉, "닉"으로도 알려진, 단일-가닥 브레이크를 생성하기 위해 하나의 DNA 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 닉카아제를 포함한다. 닉카아제는 dsDNA에서 닉을 생성하는 효소, 즉 하나의 가닥을 절단하지만 DNA 이중 나선의 다른 것은 절단하지 않는 효소이다. 일부 구현예에서, Cas 닉카아제는 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경 (예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 엔도뉴클레오틱 활성 부위가 불활성화된 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, 상기 논의된 Cas 뉴클레아제)의 버전이다. 예를 들어, Cas 닉카아제 및 예시적인 촉매 도메인 변경에 대한 논의는 미국 특허 번호 8,889,356 참조. 일부 구현예에서, Cas 닉카아제 예를 들어 Cas9 닉카아제는 불활성화된 RuvC 또는 HNH 도메인을 갖는다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 단지 하나의 기능성 뉴클레아제 도메인을 함유하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 핵산 절단 활성을 감소시키기 위해 뉴클레아제 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결손되도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성이 감소된 RuvC 도메인을 갖는 닉카아제가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 닉카아제가 사용된다. 일부 구현예에서, 감소된 활성을 갖는 HNH 도메인을 갖는 닉카아제가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 닉카아제가 사용된다.
일부 구현예에서, Cas 단백질 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 변경시키기 위해 치환된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 D10A (S. 피오게네스 Cas9 단백질에 기초함)를 포함한다. 예를 들어, Zetsche 등 (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771 참조. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 HNH 또는 HNH 유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH 유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A (S. 피오게네스 Cas9 단백질에 기초함)를 포함한다. 예를 들어, Zetsche 등 (2015) 참조. 추가 예시적인 아미노산 치환은 D917A, E1006A, 및 D1255A (프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1 (FnCpf1) 서열 (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)에 기초함)을 포함한다.
일부 구현예에서, 닉카아제를 암호화하는 mRNA는 각각 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥에 상보적인 한 쌍의 가이드 RNA와 조합하여 제공된다. 이 구현예에서, 가이드 RNA는 닉카아제를 표적 서열에 지향시키고 표적 서열의 반대편 가닥에 닉을 생성함으로써 DSB를 도입한다 (즉, 이중 닉킹). 일부 구현예에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선하고 오프-표적 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 닉카아제는 DNA의 반대편 가닥을 표적화하는 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용되어 표적 DNA에서 이중 닉을 생성한다. 일부 구현예에서, 닉카아제는 표적 근접하여 선택되는 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용되어 표적 DNA에서 이중 닉을 생 성한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 클리바아제 및 닉카아제 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 dCas DNA 결합 폴리펩티드를 포함한다. dCas 폴리펩티드는 DNA-결합 활성을 가지는 반면 촉매 (클리바아제/닉카아제) 활성이 본질적으로 결여되어 있다. 일부 구현예에서, dCas 폴리펩티드는 dCas9 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 클리바아제 및 닉카아제 활성 또는 dCas DNA-결합 폴리펩티드가 결여된 RNA-가이드된 DNA-결합제는 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경 (예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 엔도뉴클레오틱 활성 부위가 불활성화된 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, 상기 논의된 Cas 뉴클레아제)의 버전이다. 예를 들어, US 2014/0186958 A1; US 2015/0166980 A1 참조.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나 이상의 이종 기능성 도메인을 포함한다 (예를 들어, 융합 폴리펩티드이거나 이를 포함한다).
일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 세포의 핵으로의 수송을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능성 도메인은 핵 위치화 신호 (NLS)일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 1-10개의 NLS(들)과 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 1-5개의 NLS(들)과 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나의 NLS와 융합될 수 있다. 하나의 NLS가 사용되는 경우, NLS는 RNA-가이드된 DNA-결합제 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 연결될 수 있다. 또한, RNA-가이드된 DNA 결합제 서열 내에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나 이상의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 2, 3, 4, 또는 5개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 2개의 NLS와 융합될 수 있다. 특정 상황에서, 2개의 NLS는 동일하거나 (예를 들어, 2개의 SV40 NLS) 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 카르복시 말단에서 연결된 2개의 SV40 NLS 서열과 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나는 N-말단에 연결되고 하나는 C-말단에 연결되는 2개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 3개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 NLS 없이 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 예를 들어, SV40 NLS, PKKKRKV (서열 번호 600) 또는 PKKKRRV (서열 번호 601)와 같은 단절형 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 이절형 서열, 예를 들어 뉴클레오플라스민, KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호 602)의 NLS일 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 PKKKRKV (서열 번호 600) NLS는 RNA-가이드된 DNA-결합제의 C-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커가 융합 부위에 임의로 포함된다.
일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA 결합제의 세포 내 반감기를 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제의 반감기가 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA- 결합제의 반감기가 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 감소시킬 수 있다. 이종 기능성 도메인은 단백질 분해를 위한 신호 펩티드로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 분해는 예를 들어, 프로테아좀, 리소좀 프로테아제 또는 칼페인 프로테아제와 같은 단백질 분해 효소에 의해 매개될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 PEST 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 사슬의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴은 유비퀴틴-유사 단백질 (UBL)일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질의 비제한적인 예시는 작은 유비퀴틴-유사 개질제 (SUMO), 유비퀴틴 교차-반응성 단백질 (UCRP, 인터페론-자극된 유전자-15 (ISG15)로도 알려짐), 유비퀴틴-관련된 개질제-1 (URM1), 뉴런-전구체-세포-발현된 발전적으로 하향 조절된 단백질-8 (NEDD8, 또한, S. 세레비지아에에서 Rub1으로 불림), 인간 백혈구 항원 F-연관된 (FAT10), 자가포식-8 (ATG8) 및 -12 (ATG12), Fau 유비퀴틴 유사 단백질 (FUB1), 막-앵커링된 UBL (MUB), 유비퀴틴 폴드-변형제-1 (UFM1), 및 유비퀴틴-유사 단백질-5 (UBL5)를 포함한다.
일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 마커 도메인일 수 있다. 마커 도메인의 비-제한적인 예시는 형광 단백질, 정제 태그, 에피토프 태그, 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비-제한적인 예시는 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 시안 형광 단백질 (예를 들어, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-탠덤, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 오렌지 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체 Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 비-제한적인 예시적인 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질 (MBP), 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화도 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, 비오틴 카복실 캐리어 단백질 (BCCP), 폴리-His, 및 칼모둘린을 포함한다. 비-제한적인 예시적인 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP), 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT), 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 또는 형광 단백질을 포함한다.
추가적인 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 특이적 소기관, 세포 유형, 조직, 또는 기관에 RNA-가이드된 DNA-결합제를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 미토콘드리아에 RNA-가이드된 DNA-결합제를 표적화할 수 있다.
추가 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 이펙터 도메인일 수 있다. RNA-가이드된 DNA-결합제를 표적 서열에 지향시키는 경우, 예를 들어, Cas 뉴클레아제를 gRNA에 의해 표적 서열에 지향시키는 경우, 이펙터 도메인은 표적 서열을 변형시킬 수 있거나 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 핵산 결합 도메인, 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 비-Cas 뉴클레아제 도메인), 후성유전적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 뉴클레아제, 예를 들어 FokI 뉴클레아제이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9,023,649 참조. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 전사 활성화제 또는 억제인자이다. 예를 들어, Qi 등, "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression,"　Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera 등, "RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors," Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali 등, "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,"　Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert 등, "CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,"　Cell 154:442-51 (2013) 참조. 이와 같이, RNA-가이드된 DNA-결합제는 본질적으로 가이드 RNA를 사용하여 원하는 표적 서열에 결합하도록 지향시킬 수 있는 전사 인자가 된다.
D. gRNA의 효능 결정
일부 구현예에서, gRNA의 효능은 RNP를 형성하는 다른 구성 요소와 함께 전달되거나 발현될 때 결정된다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9과 함께 발현된다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제, 예를 들어 Cas 뉴클레아제 또는 닉카아제, 예를 들어 Cas9 뉴클레아제 또는 닉카아제를 이미 안정적으로 발현하는 세포주에서 전달되거나 발현된다. 일부 구현예에서 gRNA는 RNP의 일부로서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제, 예를 들어 Cas 뉴클레아제 또는 닉카아제, 예를 들어 Cas9 뉴클레아제 또는 닉카아제를 암호화하는 mRNA와 함께 세포로 전달된다.
본원에 기술된 바와 같이, 본원에 개시된 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 및 가이드 RNA의 사용은 세포 내 기계장치에 의한 수리시 삽입/결실 (인델) 돌연변이의 형태인 오류를 생성할 수 있는 DNA에서 더블-가닥 브레이크를 초래할 수 있다. 인델로 인한 많은 돌연변이는 리딩 프레임을 변경하거나 조기 정지 코돈을 도입하여 비-기능적 단백질을 생성한다.
일부 구현예에서, 특정 gRNA의 효능은 시험관 내 모델에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 시험관 내 모델은 Cas9 (HEK293_Cas9)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포이다. 일부 구현예에서 시험관 내 모델은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. 일부 구현예에서, 시험관 내 모델은 T 세포, 예를 들어 일차 인간 T 세포이다. 일차 세포 사용과 관련하여, 시판되는 일차 세포를 사용하여 실험 간의 일관성을 높일 수 있다. 일부 구현예에서, 시험관 내 모델 (예를 들어, T 세포에서)에서 결실 또는 삽입이 발생하는 오프-표적 부위의 수는 예를 들어, Cas9 mRNA 및 가이드 RNA로 시험관 내 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 분석함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 이러한 결정은 Cas9 mRNA, 가이드 RNA, 및 공여자 올리고뉴클레오티드로 시험관 내 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함한다. 이러한 결정을 위한 예시적인 절차는 HEK293 세포, PBMC, 및 인간 CD3+ T 세포가 사용되는 작업 예에서 제공된다.
일부 구현예에서, 특정 gRNA의 효능은 gRNA 선택 프로세스에 대한 다중 시험관 내 세포 모델에 걸쳐 결정된다. 일부 구현예에서, 선택된 gRNA와 데이터의 세포주 비교가 수행된다. 일부 구현예에서, 다중 세포 모델에서 교차 선별이 수행된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC의 인델 백분율에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 TRBC 및/또는 TRAC의 인델 백분율에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 TRBC 또는 TRAC의 인델 백분율에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC의 편집 백분율은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 단백질 생성물의 녹다운을 달성하기 위해 필요한 인델 백분율과 비교된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 T-세포 수용체 (TCR)의 구성 요소의 감소된 또는 제거된 발현에 의해 측정된다. 구현예에서, T-세포 수용체 (TCR)의 구성 요소의 감소된 또는 제거된 발현은 TRAC, TRBC1, TRBC2, CD3E, CD3G, 및/또는 CD3D의 감소된 또는 제거된 발현을 포함한다. 구현예에서, TCR의 상기 구성 요소의 상기 감소된 또는 제거된 발현은 하나 이상, 예를 들어, 1개 또는 2개, 예를 들어, 상기 세포로의 TCR의 상기 구성 요소에 대해 본원에 기술된 하나의 gRNA 분자의 도입의 결과이다. 구현예에서, TCR의 구성 요소의 상기 감소된 또는 제거된 발현은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 유동 세포 측정법에 의해 측정된 바와 같다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 표적 세포 유형, 예를 들어 T 세포의 게놈 내 오프-표적서열에서 인델의 수 및/또는 빈도에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 세포 집단에서 매우 낮은 빈도로 (예를 들어, <5%) 및/또는 표적 부위에서 인델 생성의 빈도에 비례하여 오프 표적 부위에서 인델을 생성하는 효과적인 가이드 RNA가 제공된다. 따라서, 본 개시는 표적 세포 유형 (예를 들어, T 세포)에서 오프-표적 인델 형성을 나타내지 않거나, 세포 집단에서 <5%의 오프-표적 인델 형성의 빈도로 및/또는 표적 부위에서 인델 생성의 빈도에 비례하여 생성하는 가이드 RNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 표적 세포 유형 (예를 들어, T 세포)에서 오프 표적 인델 형성을 나타내지 않는 가이드 RNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에서 기술된 하나 이상의 방법에 평가되는 바와 같이, 5개 미만의 오프-표적 부위에서 인델을 생성하는 가이드 RNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에서 기술된 하나 이상의 방법에 평가되는 바와 같이, 4, 3, 2, 또는 1개 이하 오프-표적 부위(들)에서 인델을 생성하는 가이드 RNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 오프-표적 부위(들)는 표적 세포 (예를 들어, 간세포) 게놈에서 단백질 코딩 영역에서 발생하지 않는다.
일부 구현예에서, 검출 유전자 편집 사건, 예를 들어 표적 DNA에서 삽입/결실 ("인델") 돌연변이의 형성 및 상동성 지향 수리 (HDR) 사건은 태그된 프라이머를 사용한 선형 증폭을 이용하고 태그된 증폭 산물을 단리한다 (이하 본원에서 "LAM-PCR," 또는 "선형 증폭 (LA)" 방법으로 지칭됨).
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 유전자의 발현된 단백질 생성물을 포함하는 기능성 단백질 복합체의 수준에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 편집된 세포의 살아있는 집단이 TCR의 손실에 대해 분석된 TCR 발현의 유동 세포 측정 분석에 의해 측정된다.
Ⅲ. 치료 방법 및 조작된 세포 또는 면역요법 시약을 제조하는 방법을 포함하는 방법
본원에 개시된 gRNA 및 관련 방법 및 조성물은 면역요법 및 면역요법 시약, 예를 들어 조작된 세포를 제조하기 위해 유용하다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 예를 들어 Cas 뉴클레아제와 함께 표 1 및 2의 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 돌연변이를 초래하는 수리 동안 DSB, 및 비상동 말단 부착 (NHEJ)을 유도한다. 일부 구현예에서, NHEJ는 뉴클레오티드(들)의 결실 또는 삽입을 초래하고, 이는 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 프레임 이동 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다.
일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 소, 돼지, 원숭이, 양, 개, 고양이, 어류, 또는 가금류이다.
일부 구현예에서, 표 1 및 2의 가이드 서열 중 하나 이상 또는 표 3의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 가이드 RNA의 용도 (예를 들어, 본원에서 제공된 조성물에서)가 면역요법이 필요한 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위해 제공된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA, 조성물, 및 제형이 돌연변이된 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자를 갖는 T 세포를 생체 외 생산하기 위해 사용된다. 변형된 T 세포는 자연 살해 (NK) T 세포일 수 있다. 변형된 T 세포는 T-세포 수용체, 예를 들어 보편적 TCR 또는 변형된 TCR를 발현할 수 있다. T 세포는 제타 사슬 신호전달 모티프를 갖는 CAR 또는 CAR 작제물을 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 단일 투여는 TRBC1, TRBC2 또는 TRAC의 발현을 녹다운시키기에 충분하다. 다른 구현예에서, 본원에서 제공된 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 1회 이상의 투여는 치료적 효과를 증가시키는데 유익할 수 있다.
gRNA 조성물의 전달
지질 나노입자 (LNP)는 뉴클레오티드 및 단백질 화물의 전달의 유용한 수단이고, 본원에 개시된 가이드 RNA, 조성물, 또는 약제학적 제형의 전달에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 핵산, 단백질, 또는 단백질과 함께인 핵산을 전달한다.
가이드 RNA 또는 (예를 들어 폴리펩티드를 암호화하는) 다른 핵산은 지질 나노입자 (LNP)와 연관될 수 있다. 적합한 LNP는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, PCT/US2018/053559, WO/2017/173054, WO2015/095340, 및 WO2014/136086의 지질, 뿐만 아니라 본원에 제공된 참고 문헌 참조.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 gRNA 중 하나를 대상체에 전달하는 방법을 포함하고, 여기서 gRNA는 LNP를 통해 전달된다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP는 또한 Cas9 또는 Cas9을 암호화하는 mRNA와 연관되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 개시된 gRNA 중 하나 및 LNP를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 Cas9 또는 Cas9을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트, 또한, 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로 불림) 또는 다른 이온성 지질을 포함한다. 예를 들어, PCT/US2018/053559 (2018년 9월 28일 출원), WO/2017/173054, WO2015/095340, 및 WO2014/136086의 지질, 뿐만 아니라 본원에 제공된 참고 문헌 참조. 일부 구현예에서, LNP 지질의 맥락에서 용어 양이온성 및 이온화 가능은 상호 교환 가능하고, 예를 들어, 여기서 이온성 지질은 pH에 따라 양이온성이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 연관된 LNP는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다.
전기천공은 화물의 전달을 위한 또 다른 유용한 수단이고, 임의의 전기천공 방법이 본원에 개시된 gRNA 중 하나의 전달에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전기천공은 본원에 개시된 gRNA 중 하나 및 Cas9 또는 Cas9을 암호화하는 mRNA의 전달에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 생체 외 세포로 본원에 개시된 gRNA 중 하나를 전달하는 방법을 포함하고, 여기서 gRNA는 LNP와 연관되거나 LNP와 연관되지 않는다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP 또는 gRNA는 Cas9 또는 Cas9을 암호화하는 mRNA와 또한 연관된다.
일부 구현예에서, 단독 또는 하나 이상의 벡터 상에 암호화되는, 본원에 기술된 가이드 RNA 조성물은 지질 나노입자에 제형화되거나 나노입자를 통해 투여되고; 예를 들어, WO/2017/173054 참조, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 가이드 서열 중 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA 중 하나를 암호화하는 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열에 더하여, 벡터는 가이드 RNA를 암호화하지 않는 핵산을 추가로 포함한다. 가이드 RNA를 암호화하지 않는 핵산은 프로모터, 인핸서, 조정 서열, 및 Cas9과 같은 뉴클레아제일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 sgRNA 및 Cas 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 또는 Cpf1일 수 있는, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 및 Cas 단백질, 예를 들어, Cas9일 수 있는, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 한 구현예에서, Cas9은 스트렙토코쿠스 피오게네스(즉, Spy Cas9)로부터 유래한다. 일부 구현예에서, crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA (sgRNA일 수 있음)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템의 반복 서열의 전부 또는 일부가 측면에 있는 가이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이로 이루어진 핵산은 추가로 벡터 서열을 포함할 수 있고 여기서 벡터 서열은 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA 와 함께인 자연적으로 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 구성 요소는 네이키드 핵산으로서, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있고, 또는 이들은 핵산 (예를 들어 gRNA) 및 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)와 같은 단백질로서 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 구성 요소는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)로서 전달될 수 있다. 핵산의 비바이러스 전달을 위한 방법 및 조성물은 전기천공, 리포펙션, 미세주입, 유전자총, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, LNP, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 핵산 (예를 들어, 네이키드 DNA/RNA), 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-향상된 흡수를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템 (Rich-Mar)을 사용한 초음파천공법이 핵산의 전달을 위해 또한 사용될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산, 예를 들어 세포에 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 주형을 전달함으로써 세포로 도입될 수 있다. 핵산 주형은 선택적으로 발현 카세트의 일부로서, 관심 폴리펩티드를 암호화할 수 있고, 여기서 주형은 측면 서열을 추가로 포함한다. 이러한 측면 서열은 선택적으로 세포에서 상동성 지향 수리 및 주형 핵산의 통합을 촉진하도록 설계된 상동성 암이다. 핵산 주형은 표적 유전자좌에서 상동성 재조합을 촉진하기 위해 제1 표적 유전자좌에 상동인 서열이 측면에 있는 관심 폴리펩티드에 대한 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 포함할 수 있다. 주형은 gRNA 절단 부위 측면에 있는 상동성 암을 포함할 수 있고, 예를 들어 여기서 상동성 암은 측면 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 측면 서열은 이러한 영역의 결실을 수득하기 위해 절단 부위에서 또는 주위에서 표적 유전자좌의 영역을 생략하도록 설계되고 따라서 수리 후 부위의 절단을 방지하고 또한 gRNA/Cas9이 주형 핵산을 절단하는 것을 방지한다. gRNA 절단 부위를 포함하는 생략된 영역 또는 "갭"은, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150개 이상 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 측면 서열은 예를 들어 10-100 뉴클레오티드 갭, 10-50 뉴클레오티드 갭, 25-100, 뉴클레오티드 갭, 또는 50-100 뉴클레오티드 갭을 삭제하도록 설계될 수 있다.
관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 바이러스 주형 또는 비바이러스 주형에 포함될 수 있다. 바이러스 벡터는 임의의 적합한 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스, 또는 이의 하이브리드일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다. 핵산 주형은 ORF의 외인성 프로모터 서열 업스트림을 포함할 수 있다. 핵산 주형은 내인성 TRAC 프로모터가 삽입된 후 관심 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있다는 점에서, 프로모터가 없을 수 있다.
관심 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 더하여, 핵산 주형은 프로모터 서열, 코작 서열, IRES 서열, 스플라이스 수용체 서열, 폴리A 서열, 및 P2A, T2A, E2A 등과 같은 절단 가능한 펩티드를 암호화하는 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 세포에 관심있는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 하나 이상의 서열을 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 면역 내성의 조절에 관여한다. 일부 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 암 표현형의 조절에 관여한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드는 수용체, 예를 들어, 면역학적 수용체를 포함한다. 면역학적 수용체는 항원을 인식할 수 있는 수용체를 의미한다. 면역학적 수용체의 예시적인 유형은 T-세포 수용체 (TCR) 및 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 구현예에서, 면역학적 수용체는 암 항원, 예를 들어 WT1를 인식한다. 특정 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 WT1 TCR이다. WT1 TCR은 VLDFAPPGA (VLD) 또는 RMFPNAPYL (RMF) WT1 펩티드를 인식할 수 있다. 특정 구현예에서 WT1 TCR은 VLD 펩티드를 인식한다. 관심 폴리펩티드는 WT1 TCR α 사슬을 포함할 수 있다. 관심 폴리펩티드는 WT1 TCR β 사슬을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 WT1 TCR α 사슬 및 WT1 TCR β사슬을 포함할 수 있다. 예시적인 WT1-특이적 TCR 서열이 당업계에 공지되어 있으며 하기를 포함한다:
표 4
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
상보성 결정 영역 (CDR)이 예를 들어, TCR 및 항체의 가변 도메인 내에 존재한다. TCR 알파 및 TCR 베타의 가변 도메인 각각에 3개의 CDR이 존재하고, 이는 가변 도메인 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된다. 이들 CDR의 정확한 경계는 공지된 방법에 따라 정의될 수 있고, 예를 들어, Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 및 Dunbar 등, "ANARCI: antigen receptor numbering and receptor classification" 참조, 이는 가변 도메인에 적용 가능한 잔기 넘버링 시스템뿐만 아니라 3개의 CDR을 정의하는 잔기 경계를 제공한다.　다른 CDR 정의 방법은 카밧-기반 CDR과 겹치는 CDR을 생성할 수 있고 특정 잔기 또는 잔기의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다. 본원의 CDR은 이들 방법 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
하나 이상의 서열은 예를 들어, 통합을 거쳐, TRAC, TRBC1, 및/또는 TRBC2와 같은 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 예를 들어, 통합을 거쳐 TRAC 유전자좌 내로 삽입된다. 하나 이상의 유전자는 이종 프로모터, 예를 들어 EF-1α 프로모터에 작동 가능한 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 유전자는 통합시 내인성 프로모터, 예를 들어, TRAC, TRBC1, 또는 TRBC2 프로모터로부터 발현되도록 구성되도록 제공될 수 있다. 하나 이상의 유전자는 자가 절단 서열에 의해 연결된 2개 이상의 폴리펩티드의 번역 융합을 포함할 수 있다. 이러한 시도는 다중-사슬 수용체 (예를 들어, T-세포 수용체)에 대한 코딩 서열이 제공되고 수용체의 발현을 유도하기 위해 단일 프로모터 (내인성 또는 이종)를 사용하는 것이 바람직한 경우 유용할 수 있다. 이와 같이, 프로모터의 활성은 개별 수용체 사슬을 제공하기 위해 절단을 겪는 폴리펩티드로 번역되는 복수의 수용체 사슬의 아미노산을 포함하는 연속 코딩 서열을 포함하는 mRNA를 초래한다.
하나 이상의 서열은 임의의 적절한 수단, 예를 들어, 형질감염, 지질 나노입자, 전기천공, 미세주입, 또는 바이러스 벡터에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노 관련 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 사용된다.
Ⅳ. 추가 예시적인 구현예
하기 추가 예시적인 구현예가 제공된다.
구현예 001. TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
b. (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 002. TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
b. (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 003. 조성물을 대상체, 이의 자가 세포, 및/또는 동종 세포에 투여하는 것을 포함하는 면역요법의 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
b. (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 004. TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 90-178로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
b. (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 005. 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 90-178로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
b. (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 006. 조성물을 대상체, 이의 자가 세포, 및/또는 동종 세포에 투여하는 것을 포함하는 면역요법의 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 90-178로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
b. (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 007. TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하고:
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열, 그리고
상기 제2 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 방법:
i. 서열 번호 90-178로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열.
구현예 008. TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하고:
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열, 그리고
상기 제2 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 방법:
i. 서열 번호 90-178로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열.
구현예 009. 대상체, 이의 자가 세포, 또는 동종 세포에 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역요법의 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하고: 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA, 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산, 상기 제1 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하고:
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열, 그리고
상기 제2 가이드 RNA는 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 방법:
i. 서열 번호 90-178로부터 선택된 가이드 서열;
ii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
iii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
iv. 서열 번호 90-113 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열.
구현예 010. 선행 구현예 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산이 투여되는 방법.
구현예 011. 하기를 포함하는 조성물:
a. 하기를 포함하는 가이드 RNA
i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 선택적으로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 012. 세포에서 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는데 사용하기 위한, 구현예 11의 조성물.
구현예 013. 세포에서 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 발현을 감소시키는데 사용하기 위한, 구현예 11의 조성물.
구현예 014. 하기를 포함하는 조성물:
a. 하기를 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열 번호 90-178로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열 번호 90-113 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 선택적으로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 015. 세포에서 TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는데 사용하기 위한, 구현예 14의 조성물.
구현예 016. 세포에서 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는데 사용하기 위한, 구현예 14의 조성물.
구현예 017. 대상체의 면역요법에서 사용하기 위한, 구현예 11-17 중 어느 하나의 조성물.
구현예 018. 구현예 1-10 중 어느 하나의 방법에 의해 변경된, 세포.
구현예 019. 세포가 생체 외에서 변경되는, 구현예 18에 따른 세포.
구현예 020. 세포가 T 세포인, 구현예 18 또는 구현예 19에 따른 세포.
구현예 021. 세포가 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포인, 구현예 18-20 중 어느 하나에 따른 세포.
구현예 022. 세포가 포유동물, 영장류, 또는 인간 세포인, 구현예 18-21 중 어느 하나에 따른 세포.
구현예 023. 대상체의 면역요법에서 사용하기 위한, 구현예 18-21 중 어느 하나에 따른 세포.
구현예 024. 구현예 1-10 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
a. 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 이중 가닥 브레이크 (DSB)를 유도하는 단계; 또는
b. 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 단일 가닥 브레이크 (SSB)를 유도하는 단계; 또는
c. 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 단계.
구현예 025. 조성물이 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 편집을 야기하는, 구현예 1-3, 7-13 중 어느 하나에 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 026. 조성물이 TRAC 유전자의 편집을 야기하는, 구현예 4-10 및 14-17 중 어느 하나에 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 027. 조성물이 TRBC 유전자 및 TRAC 유전자의 편집을 야기하는, 구현예 7-10 중 어느 하나에 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 028. 편집은 편집된 집단의 백분율로서 계산되는 (편집 백분율 또는 인델 백분율), 구현예 25-27중 어느 하나에 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 029. 편집 백분율은 집단의 10 내지 100%, 예를 들어 집단의 30 내지 99%인, 구현예 25-28 중 어느 하나에 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 030. 편집 백분율은 집단의 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%인, 구현예 25-29 중 어느 하나에 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 031. 구현예 1-3, 7-13, 17, 및 24-30 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 sgRNA를 포함하는, 방법 또는 조성물.
a. 서열 번호 179-184 중 어느 하나; 또는
b. 서열 번호 1-89 중 하나로부터 선택된 가이드 서열; 또는
c. 서열 번호 1-24로부터 선택된 가이드 서열; 또는
d. 서열 번호 1-6으로부터 선택된 가이드 서열.
구현예 032. 구현예 4-10, 14-17, 및 24-30 중 어느 하나의 방법 또는 조성물로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 sgRNA를 포함하는, 방법 또는 조성물.
a. 서열 번호 90-178 중 하나로부터 선택된 가이드 서열; 또는
b. 서열 번호 90-113으로부터 선택된 가이드 서열; 또는
c. 서열 번호 90-95로부터 선택된 가이드 서열.
구현예 033. 구현예 1-17 및 24-32 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 1, 2, 3, 또는 4에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 034. 구현예 33에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 1에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 035. 구현예 33에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 2에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 036. 구현예 33에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/ 또는 TRAC 유전자의 엑손 3에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 037. 구현예 33에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 4에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 038. 구현예 33-37 중 하나에 있어서, 상기 표적 서열은 인간 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 039. 구현예 1-17 또는 24-38 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC의 양성 가닥에서 표적 서열에 대해 상보적인, 방법 또는 조성물.
구현예 040. 구현예 1-17 또는 24-38 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 음성 가닥에서 표적 서열에 대해 상보적인, 방법 또는 조성물.
구현예 041. 구현예 1-17 또는 24-40 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 양성 가닥에서 제1 표적 서열에 대해 상보적이고, 상기 조성물은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 음성 가닥에서 제2 표적 서열에 대해 상보적인 제2 가이드 서열을 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 042. 구현예 1-17 또는 24-41 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 1-178 중 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고 서열 번호 200의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 서열 번호 200의 뉴클레오티드는 3' 말단에서 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
구현예 043. 구현예 1-17 또는 24-41 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 1-178 중 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고 서열 번호 201의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 서열 번호 201의 뉴클레오티드는 3' 말단에서 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
구현예 044. 구현예 1-17 또는 24-43중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 300의 패턴에 따라 변형되고, 상기 N은 집합적으로 표 1의 가이드 서열 (서열 번호 1-89) 중 어느 하나인, 방법 또는 조성물.
구현예 045. 구현예 44에 있어서, 상기 서열 번호 300의 각각의 N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, 상기 N은 가이드 서열을 형성하고, 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 대해 Cas9을 표적화하는, 방법 또는 조성물.
구현예 046. 구현예 42-44 중 어느 하나에 있어서, 상기 sgRNA는 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 047. 구현예 1-17 또는 24-46 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 048. 구현예 47에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 049. 뉴클레오티드 사이 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함하는, 구현예 47 또는 48의 방법 또는 조성물.
구현예 050. 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 구현예 47-49중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
구현예 051. 가이드 RNA의 5' 말단에서 처음 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 구현예 47-50중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
구현예 052. 가이드 RNA의 3' 말단에서 마지막 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 구현예 47-51중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
구현예 053. 가이드 RNA의 처음 4개 뉴클레오티드 사이 PS 결합을 포함하는, 구현예 47-52중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
구현예 054. 가이드 RNA의 마지막 4개 뉴클레오티드 사이 PS 결합을 포함하는, 구현예 47-53중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
구현예 055. 가이드 RNA의 5' 말단에 있는 처음 3개 뉴클레오티드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 구현예 47-54중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
구현예 056. 가이드 RNA의 3' 말단에 있는 마지막 3개 뉴클레오티드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 구현예 47-55 중 어느 하나의 방법 또는 조성물.
구현예 057. 구현예 47-56중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 300의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 058. 구현예 1-17 또는 24-57중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 059. 구현예 1-58중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 지질 나노입자 (LNP)와 관련되는, 방법 또는 조성물.
구현예 060. 구현예 59에 있어서, 상기 LNP는 생분해성, 이온성 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 061. 구현예 60에 있어서, 상기 이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로도 불리는, (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트인, 방법 또는 조성물.
구현예 062. 구현예 59-61 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 중성 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 063. 구현예 62에 있어서, 상기 중성 지질은 DSPC인, 방법 또는 조성물.
구현예 064. 구현예 59-63중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 헬퍼 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 065. 구현예 64에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 콜레스테롤인, 방법 또는 조성물.
구현예 066. 구현예 59-65중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 스텔스 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 067. 구현예 66에 있어서, 상기 스텔스 지질은 PEG2k-DMG인, 방법 또는 조성물.
구현예 068. 구현예 1-17 또는 24-66 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 069. 구현예 1-17 또는 24-68 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 070. 구현예 68 또는 69에 있어서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas9인, 방법 또는 조성물.
구현예 071. 구현예 1-17 또는 24-70 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 제형이고 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 072. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89 로부터 선택된 서열이 서열 번호 1인 방법, 조성물 또는 세포.
구현예 073. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 2인, 방법 또는 조성물.
구현예 074. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 3인, 방법 또는 조성물.
구현예 075. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 4인, 방법 또는 조성물.
구현예 076. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 5인, 방법 또는 조성물.
구현예 077. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 6인, 방법 또는 조성물.
구현예 078. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 7인, 방법 또는 조성물.
구현예 079. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 8인, 방법 또는 조성물.
구현예 080. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 9인, 방법 또는 조성물.
구현예 081. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 10인, 방법 또는 조성물.
구현예 082. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 11인, 방법 또는 조성물.
구현예 083. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 12인, 방법 또는 조성물.
구현예 084. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 13인, 방법 또는 조성물.
구현예 085. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 14인, 방법 또는 조성물.
구현예 086. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 15인, 방법 또는 조성물.
구현예 087. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 16인, 방법 또는 조성물.
구현예 088. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 17인, 방법 또는 조성물.
구현예 089. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 18인, 방법 또는 조성물.
구현예 090. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 19인, 방법 또는 조성물.
구현예 091. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 20인, 방법 또는 조성물.
구현예 092. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 21인, 방법 또는 조성물.
구현예 093. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 22인, 방법 또는 조성물.
구현예 094. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 23인, 방법 또는 조성물.
구현예 095. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 24인, 방법 또는 조성물.
구현예 096. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 25인, 방법 또는 조성물.
구현예 097. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 26인, 방법 또는 조성물.
구현예 098. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 27인, 방법 또는 조성물.
구현예 099. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 28인, 방법 또는 조성물.
구현예 100. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 29인, 방법 또는 조성물.
구현예 101. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 30인, 방법 또는 조성물.
구현예 102. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 31인, 방법 또는 조성물.
구현예 103. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 32인, 방법 또는 조성물.
구현예 104. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 33인, 방법 또는 조성물.
구현예 105. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 34인, 방법 또는 조성물.
구현예 106. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 35인, 방법 또는 조성물.
구현예 107. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 36인, 방법 또는 조성물.
구현예 108. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 37인, 방법 또는 조성물.
구현예 109. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 38인, 방법 또는 조성물.
구현예 110. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 39인, 방법 또는 조성물.
구현예 111. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 40인, 방법 또는 조성물.
구현예 112. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 41인, 방법 또는 조성물.
구현예 113. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 42인, 방법 또는 조성물.
구현예 114. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 43인, 방법 또는 조성물.
구현예 115. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 44인, 방법 또는 조성물.
구현예 116. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 45인, 방법 또는 조성물.
구현예 117. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 46인, 방법 또는 조성물.
구현예 118. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 47인, 방법 또는 조성물.
구현예 119. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 48인, 방법 또는 조성물.
구현예 120. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 49인, 방법 또는 조성물.
구현예 121. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 50인, 방법 또는 조성물.
구현예 122. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 51인, 방법 또는 조성물.
구현예 123. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 52인, 방법 또는 조성물.
구현예 124. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 53인, 방법 또는 조성물.
구현예 125. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 54인, 방법 또는 조성물.
구현예 126. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 55인, 방법 또는 조성물.
구현예 127. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 56인, 방법 또는 조성물.
구현예 128. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 57인, 방법 또는 조성물.
구현예 129. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 58인, 방법 또는 조성물.
구현예 130. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 59인, 방법 또는 조성물.
구현예 131. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 60인, 방법 또는 조성물.
구현예 132. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 61인, 방법 또는 조성물.
구현예 133. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 62인, 방법 또는 조성물.
구현예 134. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 63인, 방법 또는 조성물.
구현예 135. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 64인, 방법 또는 조성물.
구현예 136. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 65인, 방법 또는 조성물.
구현예 137. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 66인, 방법 또는 조성물.
구현예 138. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 67인, 방법 또는 조성물.
구현예 139. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 68인, 방법 또는 조성물.
구현예 140. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 69인, 방법 또는 조성물.
구현예 141. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 70인, 방법 또는 조성물.
구현예 142. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 71인, 방법 또는 조성물.
구현예 143. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 72인, 방법 또는 조성물.
구현예 144. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 73인, 방법 또는 조성물.
구현예 145. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 74인, 방법 또는 조성물.
구현예 146. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 75인, 방법 또는 조성물.
구현예 147. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 76인, 방법 또는 조성물.
구현예 148. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 77인, 방법 또는 조성물.
구현예 149. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 78인, 방법 또는 조성물.
구현예 150. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 79인, 방법 또는 조성물.
구현예 151. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 80인, 방법 또는 조성물.
구현예 152. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 81인, 방법 또는 조성물.
구현예 153. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 82인, 방법 또는 조성물.
구현예 154. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 83인, 방법 또는 조성물.
구현예 155. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 84인, 방법 또는 조성물.
구현예 156. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 85인, 방법 또는 조성물.
구현예 157. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 86인, 방법 또는 조성물.
구현예 158. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 87인, 방법 또는 조성물.
구현예 159. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 88인, 방법 또는 조성물.
구현예 160. 구현예 1-3, 7-13, 17, 24, 25, 27-31, 또는 33-71 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열이 서열 번호 89인, 방법 또는 조성물.
구현예 161. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 90인, 방법 또는 조성물.
구현예 162. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 91인, 방법 또는 조성물.
구현예 163. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 92인, 방법 또는 조성물.
구현예 164. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 93인, 방법 또는 조성물.
구현예 165. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 94인, 방법 또는 조성물.
구현예 166. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 95인, 방법 또는 조성물.
구현예 167. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 96인, 방법 또는 조성물.
구현예 168. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 97인, 방법 또는 조성물.
구현예 169. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 98인, 방법 또는 조성물.
구현예 170. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 99인, 방법 또는 조성물.
구현예 171. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 100인, 방법 또는 조성물.
구현예 172. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 101인, 방법 또는 조성물.
구현예 173. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 102인, 방법 또는 조성물.
구현예 174. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 103인, 방법 또는 조성물.
구현예 175. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 104인, 방법 또는 조성물.
구현예 176. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 105인, 방법 또는 조성물.
구현예 177. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 106인, 방법 또는 조성물.
구현예 178. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 107인, 방법 또는 조성물.
구현예 179. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 108인, 방법 또는 조성물.
구현예 180. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 109인, 방법 또는 조성물.
구현예 181. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 110인, 방법 또는 조성물.
구현예 182. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 111인, 방법 또는 조성물.
구현예 183. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 112인, 방법 또는 조성물.
구현예 184. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 113인, 방법 또는 조성물.
구현예 185. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 114인, 방법 또는 조성물.
구현예 186. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 115인, 방법 또는 조성물.
구현예 187. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 116인, 방법 또는 조성물.
구현예 188. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 117인, 방법 또는 조성물.
구현예 189. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 118인, 방법 또는 조성물.
구현예 190. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 119인, 방법 또는 조성물.
구현예 191. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 120인, 방법 또는 조성물.
구현예 192. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 121인, 방법 또는 조성물.
구현예 193. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 122인, 방법 또는 조성물.
구현예 194. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 123인, 방법 또는 조성물.
구현예 195. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 124인, 방법 또는 조성물.
구현예 196. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 125인, 방법 또는 조성물.
구현예 197. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 126인, 방법 또는 조성물.
구현예 198. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 127인, 방법 또는 조성물.
구현예 199. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 128인, 방법 또는 조성물.
구현예 200. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 129인, 방법 또는 조성물.
구현예 201. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 130인, 방법 또는 조성물.
구현예 202. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 131인, 방법 또는 조성물.
구현예 203. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 132인, 방법 또는 조성물.
구현예 204. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 133인, 방법 또는 조성물.
구현예 205. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 134인, 방법 또는 조성물.
구현예 206. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 135인, 방법 또는 조성물.
구현예 207. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 136인, 방법 또는 조성물.
구현예 208. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 137인, 방법 또는 조성물.
구현예 209. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 138인, 방법 또는 조성물.
구현예 210. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 139인, 방법 또는 조성물.
구현예 211. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 140인, 방법 또는 조성물.
구현예 212. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 141인, 방법 또는 조성물.
구현예 213. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 142인, 방법 또는 조성물.
구현예 214. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 143인, 방법 또는 조성물.
구현예 215. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 144인, 방법 또는 조성물.
구현예 216. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 145인, 방법 또는 조성물.
구현예 217. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 146인, 방법 또는 조성물.
구현예 218. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 147인, 방법 또는 조성물.
구현예 219. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 148인, 방법 또는 조성물.
구현예 220. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 149인, 방법 또는 조성물.
구현예 221. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 150인, 방법 또는 조성물.
구현예 222. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 151인, 방법 또는 조성물.
구현예 223. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 152인, 방법 또는 조성물.
구현예 224. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 153인, 방법 또는 조성물.
구현예 225. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 154인, 방법 또는 조성물.
구현예 226. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 155인, 방법 또는 조성물.
구현예 227. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 156인, 방법 또는 조성물.
구현예 228. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 157인, 방법 또는 조성물.
구현예 229. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 158인, 방법 또는 조성물.
구현예 230. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 159인, 방법 또는 조성물.
구현예 231. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 160인, 방법 또는 조성물.
구현예 232. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 161인, 방법 또는 조성물.
구현예 233. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 162인, 방법 또는 조성물.
구현예 234. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 163인, 방법 또는 조성물.
구현예 235. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 164인, 방법 또는 조성물.
구현예 236. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 165인, 방법 또는 조성물.
구현예 237. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 166인, 방법 또는 조성물.
구현예 238. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 167인, 방법 또는 조성물.
구현예 239. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 168인, 방법 또는 조성물.
구현예 240. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 169인, 방법 또는 조성물.
구현예 241. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 170인, 방법 또는 조성물.
구현예 242. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 171인, 방법 또는 조성물.
구현예 243. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 172인, 방법 또는 조성물.
구현예 244. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 173인, 방법 또는 조성물.
구현예 245. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 174인, 방법 또는 조성물.
구현예 246. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 175인, 방법 또는 조성물.
구현예 247. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 176인, 방법 또는 조성물.
구현예 248. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 177인, 방법 또는 조성물.
구현예 249. 구현예 4-10, 14-17, 24, 26-30, 또는 32-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 번호 90-178로부터 선택된 서열이 서열 번호 178인, 방법 또는 조성물.
구현예 250. 약제의 제조를 위한 임의의 선행 구현예의 조성물, 제형 또는 세포의 용도.
구현예 251. 약제로서 사용하기 위한 임의의 선행 구현예의 조성물, 제형 또는 세포.
구현예 252. 내인성 T 세포 수용체가 결여된, 비-내인성 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포의 제조를 위한, 구현예 18-23 중 어느 하나의 세포.
구현예 253. 내인성 T 세포 수용체가 결여된, CAR을 발현하는 T 세포의 제조를 위한, 구현예 18-23 중 어느 하나의 세포.
구현예 254. 구현예 18-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 변경된 세포가 CD3- 세포인 세포.
구현예 255. 구현예 18-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 변경되기 전 CD3+ 세포이고 변경된 세포가 CD3- 세포인 세포.
구현예 256. 구현예 18-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 변경된 집단의 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과가 CD3- 세포인 세포를 포함하는 세포 집단.
구현예 257. 구현예 256에 있어서, 상기 집단의 약 90% 초과가 CD3-인 집단.
구현예 258. 구현예 256에 있어서, 상기 집단의 약 95% 초과가 CD3-인 집단.
구현예 259. 구현예 256에 있어서, 상기 집단의 약 99% 초과가 CD3-인 집단.
구현예 260. 구현예 18-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단의 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 초과 약 99% 초과가 내인성 T 세포 수용체가 결여된 세포를 포함하는 세포 집단.
구현예 261. 구현예 260에 있어서, 상기 집단의 약 90% 초과가 내인성 T 세포 수용체가 결여된 집단.
구현예 262. 구현예 260에 있어서, 상기 집단의 약 95% 초과가 내인성 T 세포 수용체가 결여된 집단.
구현예 263. 구현예 260에 있어서, 상기 집단의 약 99% 초과가 내인성 T 세포 수용체가 결여된 집단.
구현예 264. 구현예 18-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 동일한 세포의 변경되지 않은 집단에 비해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 감소된 세포를 포함하는 세포 집단.
구현예 265. 구현예 264에서 있어서, 상기 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현의 감소가 적어도 약 90%인 집단.
구현예 266. 구현예 264에서 있어서, 상기 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현의 감소가 적어도 약 95%인 집단.
구현예 267. 구현예 264에서 있어서, 상기 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현의 감소가 적어도 약 99%인 집단
구현예 268. 구현예 264-267 중 어느 하나에 있어서, 상기 감소는 TRBC1 유전자의 발현에 있는 집단.
구현예 269. 구현예 264-267 중 어느 하나에 있어서, 상기 감소는 TRBC2 유전자의 발현에 있는 집단.
구현예 270. 구현예 264-267 중 어느 하나에 있어서, 상기 감소는 TRAC 유전자의 발현에 있는 집단.
구현예 271. 구현예 18-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 집단의 10 내지 100%, 예를 들어 집단의 30 내지 99%가 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 인델을 갖는 세포를 포함하는 세포 집단.
구현예 272. 구현예 271에 있어서, 상기 집단의 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%가 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에서 인델을 갖는 집단.
구현예 273. 구현예 271 또는 272에 있어서, 상기 인델은 TRBC1 유전자에 있는 집단.
구현예 274. 구현예 271 또는 272에 있어서, 상기 인델은 TRBC2 유전자에 있는 집단.
구현예 275. 구현예 271 또는 272에 있어서, 상기 인델은 TRAC 유전자에 있는 집단.
* * *
이 설명 및 예시적인 구현예를 제한으로 받아들여서는 안 된다. 본 명세서 및 첨부된 청구 범위의 목적을 위해, 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구 범위에 사용된 양, 백분율, 또는 비율 및 기타 수치를 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 그들이 이미 그렇게 변형되지 않은 정도까지 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구 범위에 제시된 수치 파라미터는 얻고자 하는 원하는 속성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 청구 범위의 범위에 균등 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수를 고려하고 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용되는 바와 같은, 단수 형태 "a," "an," 및 "the" 및 임의의 단어의 단수 사용은 하나의 지시 대상으로 명시적이고 분명하게 제한되지 않는 한, 복수 대상을 포함하는 것임을 주목해야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 문법적 변형은 비제한적인 것으로 의도되어, 목록에서 항목을 인용하는 것은 나열된 항목에 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목의 배제가 아니다.
실시예
다음 실시예는 특정 개시된 구현예를 예시하기 위해 제공되며 임의의 방식으로 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 재료 및 방법
게놈 DNA 단리
HEK293_Cas9 형질감염된 세포를 형질감염 후 24시간에 채취하였다. gDNA는 제조사의 프로토콜에 따라 50 μL/웰 QuickExtract™ DNA 추출 용액 (Lucigen, Cat. QE09050)을 사용하여 96-웰 플레이트의 각각의 웰로부터 추출하였다. DNA 샘플은 본원에 기술된 바와 같이 PCR 및 후속 NGS 분석을 받았다.
차세대 시퀀싱 ("NGS") 및 온-표적 절단 효율에 대한 분석
게놈의 표적 위치에서 편집 효율을 정량적으로 측정하기 위해, 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하기 위해 딥 시퀀싱을 활용하였다. PCR 프라이머는 관심 유전자 (예를 들어 TRAC) 내의 표적 부위 주위로 설계하고, 관심 게놈 영역을 증폭하였다. 프라이머 서열 설계는 현장에서 표준으로 수행하였다.
추가 PCR을 시퀀싱에 대한 화학을 추가하는 제조사 (Illumina)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 앰플리콘을 Illumina MiSeq 기기에서 시퀀싱하였다. 낮은 품질 점수를 갖는 것을 제거한 후 판독을 인간 표준 게놈 (예를 들어, hg38)에 정렬시켰다. 관심 표적 영역에 중첩된 판독을 선택하고 야생형 판독의 수 대 삽입 또는 결실 ("인델")을 함유하는 판독의 수를 계산하였다.
편집 백분율 (예를 들어, "편집 효율" 또는 "인델 백분율")은 야생형을 포함한, 서열 판독의 총 수에 삽입 또는 결실 ("인델")을 갖는 서열 판독의 총 수로 정의한다.
실시예 2: HEK 세포에서 TRAC 가이드 설계 및 선별
인간 TRAC 가이드 설계
초기 가이드 선택을 관심 영역에서 PAM을 식별하기 위해, 인간 표준 게놈 (예를 들어, hg38) 및 사용자 정의 관심 게놈 영역 (예를 들어, TRAC 단백질 코딩 엑손)을 사용하여 인실리코로 수행하였다. 각각의 식별된 PAM에 대해, 분석을 수행하고 통계를 보고하였다. gRNA 분자를 추가로 선택하고 당업계에 공지된 다수의 기준 (예를 들어, GC 함량, 예측된 온-표적 활성, 및 잠재적 오프-표적활성)에 기초하여 순위를 매겼다.
총 88개의 가이드 RNA를 단백질 엑손 코딩 영역 및 인트론 1을 표적화하는 TRAC (ENSG00000277734)에 대하여 설계하였다. 가이드 서열 및 대응하는 게놈 좌표가 제공된다 (표 2).
가이드를 HEK293_Cas9 세포에서 편집 효율에 대해 선별하였다. Spy Cas9 ("HEK293_Cas9")를 구성적으로 발현하는 인간 배아 신장 선암 세포주 HEK293을 10% 소 태아 혈청으로 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 형질감염 약 24시간 전에 96-웰 플레이트에서 10,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다 (형질감염 시 ~70% 융합). 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 RNAiMAX (ThermoFisher, Cat. 13778150)로 이중으로 형질감염시켰다. 세포를 개별 가이드 (25 nM), trRNA (25 nM), 리포펙타민 RNAiMAX (0.3 μL/웰) 및 OptiMem을 함유하는 리포플렉스로 형질감염시켰다. DNA 단리 및 NGS 분석을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 도 1 및 표 5는 HEK293_Cas9 세포에서 이들 가이드에 의한 TRAC 유전자좌에서 인델 %를 나타낸다.
표 5: HEK293_Cas9 세포에서 TRAC 가이드 편집
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 3: 인간 CD3+ T 세포에서 TRAC 가이드 선별
실시예 2의 HEK293_Cas9 세포에서 가장 높은 인델 편집 백분율을 갖는 24개의 가이드를 인간 CD3+ T 세포에서 편집 효율 및 T-세포 수용체 (TCR) 녹다운에 대해 선별하였다. CD3+ T 세포는 CD4+ T 헬퍼 세포 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 포함하는 다중 T 세포 집단으로 구성된다. 이들 세포는 전혈 또는 백혈구 채집 샘플로부터 단리될 수 있다. T 세포는 Cas9-매개 편집을 사용한 환자 T 세포를 조작함으로써, 특이적으로 암성 세포를 표적화하고 면역 원성이 낮도록 변형될 수 있다. 이러한 실시예는 T 세포에서 Cas9 RNP, 예를 들어, Cas9 RNP 표적화 TRAC를 전달하는데 사용하는 기본적 방법을 기술한다. RNP에서 표적화 crRNA만이 이러한 프로토콜을 상이한 T 세포 표적 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 것)에 적응시키기 위해 변경될 필요가 있을 것이다.
T 세포로의 RNP의 전달
T 세포는 시판을 수득하거나 (예를 들어 인간 말초 혈액 CD4+CD45RA+ T 세포, 동결, Stem Cell Technology, Cat. 70029) 류코팍으로부터 내부적으로 제조한다. 내부 제조를 위해, T 세포를 우선 시판 키트 (예를 들어, EasySep™ 인간 T 세포 단리 키트, Stem Cell Technology)를 사용하여 류코팍으로부터 농축하였다. 농축된 T 세포를 분취하고 향후 사용을 위해 (5x106/바이알에서) 동결시켰다. 이후 필요에 따라 바이알을 해동하고, T 세포 배지 (RPMI 1640, FBS, L-글루타민, 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, HEPES 완충액, 2-메르캅토에탄올 및 선택적으로 IL2)에서 3:1 비율의 CD3/CD28 비드 (Dynabeads, Life Technologies)를 첨가하여 활성화시켰다. RNP를 동일한 양의 시약을 혼합하고 95℃에서 2분 동안 배양하고 실온으로 냉각함으로써 개별 crRNA 및 trRNA를 사전어닐링하여 생성하였다. 사전어닐링된 crRNA 및 trRNA로 이루어진 이중 가이드 (dgRNA)를 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체를 형성하기 위해 Spy Cas9 단백질과 함께 배양하였다. CD3+ T 세포를 자극된 인간 T 세포에 대한 제조사의 Amaxa™ 96-웰 Shuttle™ 프로토콜을 사용하여 P3 일차 세포 96-웰 Nucleofector™ 키트 (Lonza, Cat. V4SP-3960)를 사용하여 핵 안으로 도입된 Spy Cas9 (10nM), 개별 가이드 (10 nM) 및 트레이서 RNA (10 nM)를 함유하는 RNP로 삼중 형질감염시켰다. 핵감염 후 즉시 T 세포 배지를 세포에 참가하고 2일 이상 배양하였다.
핵감염 2일 후, 게놈 DNA를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고 NGS 분석을 수행하였다. 표 6 및 도 2는 CD3+ T 세포에서 다양한 가이드를 사용한 TRAC 편집 후 인델 빈도에 대한 결과를 나타낸다.
표 6: 인간 CD3+ T 세포에서 TRAC 편집에 대한 인델 빈도
Figure pct00027
TCR 발현의 유동 세포 측정 분석
TCR의 발현을 핵감염 4일 후 측정하였다. 세포를 고정 가능한 살아있는 죽은 염료 (Thermo fisher L34975)로 염색하고 TCR을 Alexa Fluor® 647 항-인간 TCR α/β 항체 (Biolegend, Cat. 306714)를 사용하여 검출하였다. 세포를 적어도 20분 동안 얼음에서 2ul의 항체와 배양시키고, 예를 들어, Beckman Coulter CytoflexS )를 사용하여 유동 세포 측정법에 의해 분석하였다. Flow Jo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 살아있는 세포 집단을 TCR 손실에 대해 분석하였다. 결과를 표 7 및 도 3에 나타낸다.
표 7: CD3+ T 세포에서 TRAC 편집 후 TCR 발현
Figure pct00028
실시예 4: HEK 세포에서 TRBC 가이드 설계 및 선별
인간 TRBC 가이드 설계
편집 인간 TRBC1 (ENSG00000211751) 및 TRBC2 (ENSG00000211772)를 편집하기 위한 초기 가이드 선택은 실시예 2에 기술한 바와 같다. 총 89개의 가이드 RNA를 설계하였다: TRBC1 만을 표적화하는 2개 (서열 번호 11 및 서열 번호 26), TRBC2 만을 표적화하는 2개 (서열 번호 8) 및 TRBC1 및 TRBC2 모두를 표적화하는 86개. 가이드를 단백질 엑손 코딩 영역을 표적화하도록 설계하였다. 가이드 및 대응하는 게놈 좌표는 상기 제공된다 (표 1).
TRBC 가이드를 HEK293_Cas9 세포에서 편집 효율에 대해 선별하였다. 형질감염을 실시예 2에 기술한 바와 같이 수행하였다. DNA 단리 및 NGS 분석을 실시예 1에 기술한 바와 같이 수행하였다. 도 4a 및 4b 및 표 8은 HEK293_Cas9 세포에서 이들 가이드에 의한 TRBC1 및 TRBC2 유전자좌에서 인델 %를 나타낸다.
표 8: HEK293_Cas9 세포에서 TRBC 가이드 편집
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
실시예 5: 인간 CD3+ T 세포에서 TRBC 가이드 선별
실시예 4의 HEK293_Cas9 세포에서 높은 인델 편집 백분율을 갖는 TRBC 가이드를 인간 CD3+ T 세포에서 편집 효율 및 T-세포 수용체 (TCR) 발현에 대해 선별하였다. 핵감염, 편집 분석 및 TCR 발현 분석을 실시예 3에서와 같이 수행하였다. 표 9 및 도 5는 CD3+ T 세포에서 다양한 가이드를 사용한 TRBC 편집 후 인델 빈도에 대한 결과를 나타낸다. 표 10 및 도 6은 CD3+ T 세포에서 TRBC 편집 후 TCR 발현 측정 (% TCR 음성 세포로서)을 나타낸다.
표 9: CD3 + T 세포의 TRBC1에서 인델 빈도
Figure pct00032
표 10: CD3+ T 세포에서 TRBC 편집 후 TCR 발현
Figure pct00033
실시예 6: TRBC 및 TRAC 가이드의 오프-표적 분석
생화학적 방법 (예를 들어, Cameron 등, Nature Methods. 6, 600-606; 2017 참조)을 TRAC, TRBC1 또는 TRBC2를 표적으로 하는 Cas9에 의해 절단된 잠재적 오프-표적 게놈 부위를 결정하기 위해 사용하였다. 실시예 3 및 실시예 5에서 대부분의 CD3 음성 세포를 나타내는 가이드를 이 분석을 사용하여 잠재적 오프-표적 게놈 절단 부위에 대해 시험하였다. 이 실험에서, 7개의 sgRNA 표적화 인간 TRAC, 6개의 sgRNA 표적화 TRBC 및 알려진 오프-표적 프로파일을 갖는 2개의 대조군 가이드를 단리된 HEK293_Cas 게놈 DNA를 사용하여 선별하였다. 생화학적 분석에서 16 nM의 RNP 농도를 사용하여 검출된 잠재적 오프-표적 부위의 수를 도 7a에 플로팅하고 표 11에 나타낸다. 이 분석은 시험된 sgRNA에 대해 잠재적 오프-표적 부위를 식별하였다.
표 11: 생화학적 오프-표적 분석
Figure pct00034
잠재적 오프-표적 부위를 검증하기 위한 표적화된 시퀀싱
상기 사용된 생화학적 방법과 같은 알려진 오프-표적 검출 분석에서, 다수의 잠재적 오프-표적 부위가 다른 맥락에서, 예를 들어, 관심 일차 세포에서 검증될 수 있는 잠재적 부위에 대해 "넓은 그물망을 던지기" 위해서, 설계에 의해 일반적으로 회수된다. 예를 들어, 생화학적 방법은 분석이 세포 환경이 없는 정제된 고분자량 게놈 DNA를 활용하고 사용된 Cas9 RNP의 용량에 의존하기 때문에 잠재적 오프-표적 부위의 수가 일반적으로 과도하게 대표된다. 따라서, 이러한 방법에 의해 식별된 잠재적 오프-표적 부위는 식별된 잠재적 오프-표적 부위의 표적화된 시퀀싱을 사용하여 검증될 수 있다.
한 접근법에서, Cas9 및 관심 sgRNA (예를 들어, 평가를 위한 잠재적 오프-표적 부위를 갖는 sgRNA)가 일차 T 세포에 도입된다. 그런 다음 T 세포를 용해시키고 잠재적 오프-표적 부위(들) 측면에 있는 프라이머를 NGS 분석을 위한 앰플리콘을 생성하기 위해 사용하였다. 특정 수준에서 인델의 식별은 잠재적 오프-표적 부위를 검증할 수 있는 반면, 잠재적 오프-표적 부위에서 발견된 인델의 결여는 사용된 오프-표적분석에서 위양성을 나타낼 수 있다.
표적 인델 활성을 나타내는 가이드를 이 분석을 사용하여 잠재적 오프-표적 게놈 절단 부위에 대해 시험하였다. 이 실험에서, 인간 TRBC1 또는 TRBC2를 표적화하는 5개의 sgRNA 및 인간 TRAC를 표적화하는 3개의 가이드를 알려진 오프-표적 프로파일을 갖는, 대조군 가이드, 서열 번호 194 (VEGFA)와 함께 풀링된 남성 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 정제된 게놈 DNA를 사용하여 선별하였다. 생화학적 분석에서 64 nM의 가이드 농도를 사용하여 검출된 잠재적 오프-표적 부위의 수는 도 7b 및 표 12에 나타낸다.
표 12: 64 nM 오프 표적 분석
Figure pct00035
실시예 7: 다중 편집을 위한 TRAC 및 TRBC 가이드 사용
가이드를 또한 TRAC 및 TRBC 유전자좌의 동시 편집에 대해 시험하였다. 3명의 상이한 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 밀도 구배 원심 분리를 위해 Lymphoprep™ (Stem Cell Technology)를 사용하여 버피 코트로부터 단리하였다. 이들 세포를 활성화시키고 제조자 지시를 따라 Dynabeads™ ClinExVivo™ CD3/CD28 (Invitrogen)를 사용하여 분류하였다. T 세포를 IL7 및 IL15 (각각 5 ng/ml)를 갖는 5% FBS로 보충된 X-VIVO™ 15 조혈 무혈청 배양 배지 (Lonza™)에서 106 세포/ml의 농도로 접종하였다. 자극 2일 후, T 세포를 표적화 TRAC를 표적화하는 crRNA 및 표적화 TRBC를 표적화하는 crRNA와 동시에 실시예 3에 기술된 바와 같이 전기천공하였다. 한 공여자로부터의 세포를 사용하여, TRAC 및 TRBC 가이드를 분리하여 전기천공하였다. 자극 후 6일째에, 비드를 분리하고 세포를 IL7 및 IL15 (각각 5 ng/ml)를 갖는 5% FBS로 보충된 X-VIVO™ 15에서 100만/ml의 농도로 접종하였다. 7일째에 TRAC 및 TRBC 녹아웃 효율을 도 8a 및 표 13에 나타낸 바와 같은 유동 세포 측정법에 의해 CD3 분자가 없는 T 세포의 백분율을 평가함으로써 산정하였다.
표 13: TCR 녹다운의 효율
Figure pct00036
TCR 유전자의 렌티바이러스 삽입으로 동시 TRAC 및 TRBC 편집.
자극 3일 후, 편집된 T 세포를 LV를 무작위로 삽입하는 건강한 공여자 (HD1-TCR)로부터 유래된 WT1-특이적 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터 (LV)로 형질도입하였다. 간단하게, TCR α 및 β 사슬 유전자를 양방향 프로모터 하에 LV에서 단리, 코돈 최적화, 시스테인-변형, 및 클로닝하였다. HD1 TCR α 및 β 사슬 유전자의 DNA 및 아미노산 서열은 하기에 주어진다. 알파 사슬을 최소 인간 CMV 프로모터 하에 안티센스 방향으로 베타 사슬을 PGK 프로모터 하에 센스 방향으로 클로닝하였다. LV를 인테그라제-능이 있는 3세대 작제물로 패키징하고 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 외피로 위형화시켰다. T 림프구를 24 h 동안 LV로 감염시켰다. 그 후, T 세포를 106 세포/ml에서 배양하고 확장시켰다. 형질 도입 2일 후, 형질도입 효율을 특정 Vβ 유전자 (TRBV12-3/TRBV12-4) 뿐만 아니라 특정 덱스트라머 (에피토프: VLDFAPPGA)를 발현하는 T 세포의 백분율을 측정함으로써 평가하였다. 자극 후 15일째에, T 세포 표현형을 세포형광분광계 분석에 의해 평가하였다. 도 8b 및 표 14는 T 세포의 45% 이상이 CD3 분자를 발현함을 나타낸다 (평균±SEM=45,3±5,7). 덱스트라머 양성을 측정하여 평가된 WT1-특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 95% 초과였다 (평균±SEM=95,3±0,7). 덱스트라머 양성을 측정하여 평가된 WT1-특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 서열 번호 6 및 95를 사용한 경우 95% 초과였다 (평균±SEM=95,3±0,7) (도 8c, 표 14). 편집된 T 세포의 T 세포 표현형을 도 8d 및 표 15에 나타낸 바와 같이 15일째에 평가하였다.
서열 번호 250: HD1 TCR α 사슬 - DNA 서열
ATGGAAACCCTGCTGAAGGTGCTGAGCGGCACACTGCTGTGGCAGCTGACATGGGTCCGATCTCAGCAGCCTGTGCAGTCTCCTCAGGCCGTGATTCTGAGAGAAGGCGAGGACGCCGTGATCAACTGCAGCAGCTCTAAGGCCCTGTACAGCGTGCACTGGTACAGACAGAAGCACGGCGAGGCCCCTGTGTTCCTGATGATCCTGCTGAAAGGCGGCGAGCAGAAGGGCCACGAGAAGATCAGCGCCAGCTTCAACGAGAAGAAGCAGCAGTCCAGCCTGTACCTGACAGCCAGCCAGCTGAGCTACAGCGGCACCTACTTTTGTGGCACCGCCTGGATCAACGACTACAAGCTGTCTTTCGGAGCCGGCACCACAGTGACAGTGCGGGCCAATATTCAGAACCCCGATCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGATTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGTCCTGAGAGCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTCAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGAGACTGTGGTCCAGCTGA
서열 번호 251: HD1 TCR α 사슬 - 아미노산 서열
METLLKVLSGTLLWQLTWVRSQQPVQSPQAVILREGEDAVINCSSSKALYSVHWYRQKHGEAPVFLMILLKGGEQKGHEKISASFNEKKQQSSLYLTASQLSYSGTYFCGTAWINDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
서열 번호 252: HD1 TCR β 사슬 - DNA 서열
ATGGGATCTTGGACACTGTGTTGCGTGTCCCTGTGCATCCTGGTGGCCAAGCACACAGATGCCGGCGTGATCCAGTCTCCTAGACACGAAGTGACCGAGATGGGCCAAGAAGTGACCCTGCGCTGCAAGCCTATCAGCGGCCACGATTACCTGTTCTGGTACAGACAGACCATGATGAGAGGCCTGGAACTGCTGATCTACTTCAACAACAACGTGCCCATCGACGACAGCGGCATGCCCGAGGATAGATTCAGCGCCAAGATGCCCAACGCCAGCTTCAGCACCCTGAAGATCCAGCCTAGCGAGCCCAGAGATAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGAAAGACAGGCGGCTACAGCAATCAGCCCCAGCACTTTGGAGATGGCACCCGGCTGAGCATCCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCACCTGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAGATCAGCCACACACAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTATCCCGATCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGTACCGATCCTCAGCCTCTGAAAGAGCAGCCCGCTCTGAACGACAGCAGATACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGATGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCTGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGTCTGCCACAATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAAGCCACTCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGATAGCAGGGGCTGA
서열 번호 253: HD1 TCR β 사슬 -아미노산 서열
MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRKTGGYSNQPQHFGDGTRLSILEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*
표 14: 편집된 T 세포에서 TCR 삽입의 효율
Figure pct00037
표 15: TCR 편집된 T 세포의 표현형
Figure pct00038
TRAC 및 TRBC 편집 및 LV HD1-TCR 삽입을 갖는 T 세포를 원발성 AML 아세포를 사멸시시키는 능력에 대해 시험하였다. 덱스트라머 염색 및 자기적 분류를 사용하여 WT1-CD8+ 특이적 T 세포를 농축시키기 위해 편집된 T 세포를 자기적으로 분류하였다. 형질 도입 21일 후, WT1-CD8+ T 세포를 HLA-A*02:01 대립유전자를 보유한 3명의 상이한 환자로부터 수득한 원발성 AML 아세포와, 대조군으로서, 특이적 HLA 대립유전자를 보유하지 않는 일차 아세포와 공동 배양하였다. 공동 배양물을 상이한 이펙터 대 표적 비율 (1:1; 5:1; 10:1)로 접종하였다. 6시간 공동 배양 후, 살아있는 표적 세포에서 카스파제 3의 발현을 판독으로 사용하였다. 결과를 도 9a-d 및 표 16에 나타낸다. WT1을 발현하고 HLA-A*02:01을 보유하는 백혈병 아세포의 최대 43% (평균±SEM=31±6,6)에서 세포사멸의 유도가 관찰되었다. HLA-A*02:01 대립유전자를 발현하지 않는 AML 아세포에 대한 인식은 검출 가능하지 않았다.
표 16: AML 사멸
Figure pct00039
실시예 8: 다중 편집을 위한 추가 TRAC 및 TRBC 가이드
추가 crRNA를 TRAC 및 TRBC 유전자좌의 동시 편집에 대해 시험하였다. T 세포를 서열 번호 185를 함유하는 RNP, 서열 번호 6을 함유하는 RNP, 또는 두 RNP 종의 혼합물로 핵감염시켰다. 5% FBS, 50uM 베타-머캅토에탄올, 10mM N-아세틸 L-시스테인, 1X 페니실린-스트렙토마이신 용액 (Corning, Cat. 30-002-CI) 및 선택적으로 IL7 (5 ng/ml), IL15 (5 ng/ml), 및 IL2 (200-500 U/ml)으로 보충된 BioWhittaker™ X-VIVO™ 15 조혈 무혈청 배양 배지 (Lonza™, Cat. 04-418Q)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3에서와 같이 절차를 수행하였다. 핵감염 17일 후, T 세포를 채취하여 NGS로 분석하였다. 도 10 및 표 17은 동시 핵감염 후 각각 유전자좌에서 (인델 빈도로서) 편집을 나타낸다. 또한, 유동 세포 측정법을 이들의 표면에 TCR 단백질을 발현하는 T 세포의 부분을 측정함으로써 편집 효율을 시험하기 위해 사용할 수 있다.
표 17: 다중 가이드를 사용한 편집
Figure pct00040
실시예 9
crRNA를 표적으로 하는 TRAC 및 TRBC의 추가 쌍을 실시예 7에 기술된 바와 같은 조합된 편집에 대해 시험하였다. T 세포를 서열 번호 95를 함유하는 RNP, 서열 번호 2를 함유하는 RNP, 또는 두 RNP 종의 혼합물로 핵감염시켰다. TRAC 및 TRBC 녹아웃 효율을 도 11a 및 표 18에 나타낸 바와 같이 유동 세포 측정법에 의한 CD3 분자가 없는 T 세포의 백분율을 계산함으로써 평가하였다.
표 18: TCR 녹다운의 효율
Figure pct00041
렌티바이러스 형질도입 후, T 세포 표현형을 도 11b 및 표 19에 나타낸 바와 같이 세포형광분광계 분석에 의해 평가하였다. WT1-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 덱스트라머 양성을 측정함으로써 평가하였다 (도 11c, 표 19). 편집된 T 세포의 T 세포 표현형을 도 11d 및 표 20에 나타낸다.
표 19: 편집된 T 세포에서 TCR 형질도입의 효율
Figure pct00042
표 20. TCR 편집된 T 세포의 표현형
Figure pct00043
실시예 7 및 9의 조작된 세포는 TRAC gRNA 및 TRBC gRNA를 서열 번호 251의 TCR α 사슬 및 서열 번호 253의 TCR β 사슬을 갖는 WT1-특이적 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터와 조합한다. 조작된 세포는 세포에 제1 및 제2 조성물을 전달함으로써 변경될 수 있고, 상기 제1 조성물은 하기를 포함하고: (a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA: (i) 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열; (ii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; (iii) 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; (iv) 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 (iv) 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는 (b) (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로 (c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산; 상기 제2 조성물은 서열 번호 251의 TCR α 사슬 및 서열 번호 253의 TCR β 사슬을 갖는 WT1-특이적 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 하기를 추가로 포함하는 조성물을 전달함으로써 변경될 수 있다: (a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA: (i) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열; (ii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; (iii) 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; (iv) 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 (iv) 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는 (b) (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산.
실시예 10. 단일 가이드를 사용한 편집
하기 실시예는 실시예에서 달리 언급하지 않는 한 다음 방법에 의해 수행되었다.
게놈 DNA 단리
T 세포를 핵형질감염 후 >48시간에 채취하였다. DNA 단리를 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. DNA 샘플을 실시예 1에 기술된 바와 같이 PCR 및 후속 NGS 분석을 하였다.
T 세포로의 RNP의 전달
건강한 공여자 PBMC 또는 류코팍을 시판 또는 마이크로비드 키트 (Miltenyi Biotec)로부터 직접 CD4/CD8를 사용한 양성 선택 또는 제조사 프로토콜에 따라 EasySep 인간 T-세포 단리 키트 (Stem Cell Technology, Catalog #17951)를 사용한 음성 선택에 의해 단리된 T 세포를 수득하였다. T 세포를 추후 사용을 위해 Cryostor CS10 동결 배지 (Catalog # 07930)에서 동결보존하였다. 해동시, T 세포를 200 U/mL IL2 (Peprotech) 및 5 ng/mL의 각각 IL7 및 IL15로 보충된 기본 배지 (2-머캅토에탄올, N-아세틸-시스테인 및 5% 인간 AB 혈청 또는 FBS로 보충된 XVIVO15)에서 밤새 두었다. T 세포를 후속적으로 제조사가 권장하는 대로 T 세포 TransAct (Miltenyi Biotec, 130-111-160)로 활성화시키고 전기천공 전 48-72시간 동안 배양하였다.
Cas9 단백질 및 ggRNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체를 당량의 시약을 혼합하고 2분 동안 95℃에서 배양하고 실온으로 냉각함으로써 제1 프리-어닐링 개별 crRNA 및 trRNA에 의해 생성하였다. RNP의 가이드(들)은 단일 RNA 분자 (단일 가이드 RNA, sgRNA) 또는 2분 동안 95℃에서 배양한 후 주위 온도로 냉각함으로써 사전 어닐링된 2개의 개별 RNA 분자 (이중 가이드 RNA, dgRNA)로서 연관된 crRNA 및 trRNA를 이용하였다. TRAC 또는 TRBC 유전자좌를 표적으로 하는 RNP를 서열 번호 186 (TRAC) 또는 서열 번호 180 (TRBC1/2)을 SpyCas9과 2:1 몰 비로 20 uM Cas9-RNP의 최종 농도로 혼합하여 복합체화하였다. 전기천공을 위해, T 세포를 TRAC 및 TRBC와 5-20x106 세포/100uL에서 현탁시켰다. RNP를 2 μM RNP의 최종 농도로 표시된 대로 첨가하였다. T 세포를 P3 일차 세포 96-웰 Nucleofector™ 키트 (Lonza, Cat. V4SP-3960) 또는 완충액 P3 및 제조사의 펄스 코드를 사용하는 Lonza 4D-뉴클레오펙터 X 유닛 (Catalog #: AAF-1002X)을 사용하여 RNP로 핵감염시켰다. 기본 배지를 전기천공 후 즉시 세포에 첨가하고 세포를 적어도 4시간 동안 휴지시켰다.
선택 분석을 위해, 세포를 G-Rex 프로토콜을 사용하여 확장하였다. 간단하게, 전기천공 후, 1 웰의 24 웰 G-Rex의 1 ml의 사이토카인 배지의 1 x 10^6 세포　및 MOI 3 x 10^5와 동등한 바이러스를 웰에 옮긴다. 24 h 후, 사이토카인 배지를 사용하여 부피를 7 ml로 구성한다. 매 2-3일 마다, 세포를 방해하지 않고 배지의 절반 (3.5 ml)을 제거하고 2X 사이토카인 배지를 첨가한다. 11-13일 후에 채취한다.
유동 세포 측정법을 위한 세포 염색
RNP 핵감염 4 내지 12일 후, 편집된 T 세포 (200ul/200,000 세포)를 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 수집하고 5분 동안 500g로 스핀 다운하였다. 그런 다음 세포를 항체 표적화 CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA, CD27, CCR7, CD62L을 표적으로 하는 항체, 및/또는 TCR 특이적 pMHC 사량체 또는 TCR 특이적 V베타 사슬 항체의 조합을 함유하는 항체 혼합물에 재현탁하였다. 혼합물을 암실에서 실온에서 45분 동안 배양하였다. 샘플을 5분 동안 500g로 스핀 다운하고, 세포 펠릿을 수집하고, FACS 완충액에서 1:10,000 DAPI (Biolegend - #422801)로 재현탁하였다. 그런 다음 제조사의 지시에 따라 cytoflex를 사용하여 유동 세포 측정법을 수행하였다.
단일 가이드를 또한 자극된 T 세포에서 TRAC 및 TRBC 유전자좌에서 개별 및 동시 편집에 대해 시험하였다. T 세포를 TRBC1 및 TRBC2 유전자좌를 표적으로 하는 가이드 서열 번호 180을 함유하는 RNP, TRAC를 표적으로 하는 가이드 서열 번호 186을 함유하는 RNP, 또는 Cas9에 대해 2:1 비율의 가이드에서 두 RNP 종의 혼합물로 핵감염시켰다. 전기천공 2일 후, T 세포 계대 배양하고 용해물을 수집하였다.
게놈 DNA를 제조하고 NGS 분석을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 시험 샘플을 단일 모의 샘플과 함께, 삼중 수행하였다. TRAC 및 TRBC 가이드의 개별 및 동시 편집에 대한 TCR 표면 발현의 녹다운 효율을 CD3의 존재 또는 부재를 표적으로 하는 유동 세포 측정법에 의해 평가하였다. CD3 분자가 없는 T 세포의 백분율을 표 21 및 도 12a에 나타낸다.
표 21: 집단에서 편집된 CD3- 세포
Figure pct00044
인델 빈도를 CD3- T 세포에서 TRAC 및 TRBC의 개별 및 조합 편집 후 NGS 분석에 의해 평가하였다. TRAC 및 TRBC에서 가이드 편집의 백분율을 표 22 및 도 12b에 나타낸다.
표 22: T 세포에서 TRAC 및 TRBC 가이드 편집
Figure pct00045
실시예 11. TRAC 가이드 삽입 선별
T 세포로의 AAV 주형의 삽입
TRAC 유전자좌를 표적으로 하는 12개 가이드의 위치는 수리 후 부위의 절단을 방지하고 가이드/Cas9을 주형 절단으로 방지하기 위해 TRAC 유전자좌의 80 bp 영역을 삭제할 아데노바이러스-관련 바이러스 (AAV) 주형을 설계하기 위해 사용하였다. 이는 TCR이 TRAC 유전자좌로 삽입될 수 있는 유전자좌를 생성할 것이다. 80bp 결실을 갖는 상동성 암을 사용하여, 작제물은 GenScript USA Inc에 의해 합성되고 EF1a 프로모터에 의해 구동되어 모델 TCR을 삽입하고 두 번째로 GFP를 삽입하도록 설계되고 AAV 벡터로 서브클로닝하기 위한 BglII 제한 부위를 갖는 pUC19 벡터로 삽입되었다. AAV 주형은 T 세포에서 부위-특이적으로 TCR 또는 리포터 분자 (즉, GFP)를 암호화하는 유전자를 삽입하기 위해 TRAC 가이드 절단 부위를 측면에 두는 상동성 암으로 설계되었다.
T 세포 단리 및 RNP 핵형질감염 절차를 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다. 전기천공 10분 후, T 세포를 3x105의 MOI로 첨가된 AAV 주형과 함께 1x106 세포/mL로 사이토카인 배지에 첨가하였다. 전기천공 24시간 후, 기능성 분석 또는 동결보존에 사용하기 전에 정적 배양 또는 G-REX 멀티웰 플레이트 (Wilson Wolf Manufacturing)에서 추가 4-12일 동안 세포를 분할하고 확장시켰다. 유동 세포 측정법을 수행하였다.
TRAC 가이드 삽입 선별
TRAC 유전자좌의 엑손 1을 표적으로 하는 이중 가이드를 삽입 효율을 평가하기 위해 T 세포에서 선별하였다. GFP 리포터 유전자 AV9를 암호화하는 AAV-기반 삽입 주형 (AV9)을 사용하는 초기 선별은 표 23에 열거된 가이드의 표적 부위를 포함하기 위해 설계된 80 bp을 사용하여 설계하였다. AV9는 하기 표 37에 기술되어 있다. T 세포를 대조군으로 사용되는 AAV 단독으로 RNP가 없는 (모의) 샘플을 제외하고 이중 가이드를 함유하는 RNP로 이중으로 핵감염시켰다. RNP를 사용한 세포 형질도입에 대한 절차는 가이드 대 Cas9 비율이 1:1인 것을 제외하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다. TRAC 가이드의 삽입 효율을 실시예 10에 기술된 바와 같이, 표 23 및 도 13a에 나타낸 바와 같이 삽입된 작제물로부터 GFP의 형광을 검출하기 위해 유동 세포 측정법에 의해 측정하였다. TRAC 가이드에 의한 편집에 대한 TCR 표면 발현의 녹다운 효율은 CD3의 존재 또는 부재를 표적으로 하는 유동 세포 측정법에 의해 평가하였다. CD3 분자가 없는 T 세포의 백분율을 표 23 및 도 13b에 나타낸다.
표 23. 삽입된 가이드의 GFP 발현 백분율
Figure pct00046
실시예 12. TRAC 삽입을 위한 단일 가이드 선별
이어서 TRAC 유전자좌의 엑손 1을 표적으로 하는 단일 가이드를 AV9를 사용하여 삽입 효율을 평가하기 위해 T 세포에서 선별하였다. T 세포 제조 및 RNP 형질도입에 대한 절차를 가이드:Cas9 비율이 1:1인 것을 제외하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 이중으로 수행하였다. AV9를 표 24에 열거된 가이드를 사용하여 실시예 11에 기술된 바와 같이 설계하였다. NGS 인델 분석을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
TRAC 가이드의 삽입 효율을 표 24 및 도 14a에 나타낸 바와 같이 삽입된 작제물로부터 GFP의 형광을 측정하기 위해 유동 세포 측정법에 의해 측정하였다. TRAC 가이드에 의한 TCR 표면 발현의 녹아웃 효율을 CD3의 존재 또는 부재를 표적으로 하는 유동 세포 측정법에 의해 평가하였다. CD3 분자가 없는 T 세포의 백분율을 표 24 및 도 14b에 나타낸다. 화학적으로 변형된 및 비변형된 가이드의 편집 효율성을 또한 분석하였고 활성을 갖는 것으로 확인하였다.
표 24. GFP 양성 세포의 백분율
Figure pct00047
실시예 13 -외인성 TCR 삽입 및 발현에 대한 프로모터 및 ITR 평가
기능성 분석을 위한 유전자-편집 TCR-T 세포의 조작
TCR 삽입 및 후속 표면 발현을 다양한 프로모터 및 두 ITR 길이로 시험하였다. 가이드 서열 번호 185를 사용한 T 세포 단리 및 RNP 형질감염을 gRNA 대 SpyCas9의 1:1 몰 비로 사용한 것을 제외하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다. T 세포로의 TCR-C를 함유하는 AAV 작제물의 RNP 형질도입을 실시예 11에 기술된 바와 같이 수행하였다. AAV 주형은 TRAC 유전자좌에서 서열 번호 185 절단 부위의 각 측면에 있는 500 bp에 대응하는 500 bp 상동성 암을 함유하였다. 각각의 AAV 작제물은 표 25에 나타낸 바와 같이 프로모터 및 ITR의 상이한 조합을 특징으로 한다. 편집된 T 세포를 실시예 11에 기술된 바와 같이 유동 세포 측정 분석을 위해 사량체 염색하였다.
TCR-C 삽입 효율을 세포 표면상의 CD3+의 존재를 통한 T 세포 동일성 및 TCR의 특이적 리간드의 사량체, RMF 펩티드를 통해 삽입된 TCR를 발현하는 세포의 수를 평가하는 세포형광분광계 분석에 의해 평가하였다 (예를 들어, US20160083449A1 참조, 이의 내용은 본원에 참고로 포함됨). CD3+ 사량체+ 세포의 백분율은 표 25 및 도 15a에 나타낸다. 사량체 염색된 T 세포에 대한 평균 형광 강도 (MFI)는 표 25 및 도 15b에 나타낸다.
표 25. AAV 주형에 대한 프로모터 및 ITR
서열 요소 및 이 표에 나타낸 서열은 표 37에서 추가로 정의됨.
Figure pct00048
실시예 14: 내인성 TRAC 프로모터를 사용하는 조작된 T 세포에서 GFP 발현
다른 실험에서, 내인성 TRAC 프로모터가 GFP 발현을 구동할 수 있는지 결정하기 위해 P2A 리보솜 스킵 부위에 이어서 GFP 리포터 유전자 (즉, 외인성 프로모터가 없음)를 함유하는 AAV 주형 (AV10)을 TRAC 유전자좌의 엑손 1에 삽입하였다. T 세포를 가이드 서열 번호 186을 함유하는 RNP로 핵감염시키고 실시예 10에 기술된 바와 같이 AAV AV10로 형질도입하였다. 대조군 조건은 편집되지 않은 T 세포 (모의) 및 RNP 핵감염을 받지만 AAV는 없는 T 세포 (RNP 단독)를 포함한다. 배양 4일 후 편집된 T 세포를 CD3에 대해 APC-Cy7 결합 항-CD3e (Biolegend, 300318)로 공동 염색하고 표 26 및 도 16a-c에 나타낸 바와 같이 GFP 발현 및 TCR 녹아웃에 대해 유동 세포 측정법에 의해 분석하였다.
표 26 집단에서 편집된 CD3- 및 GFP 양성 세포의 백분율.
Figure pct00049
실시예 15: 내인성 및 외인성 TRAC 프로모터를 사용하는 조작된 T 세포에서 TCR 발현
추가 실험에서, 내인성 TRAC 프로모터가 삽입된 TCR의 발현 및 기능을 구동할 수 있는지 결정하기 위해 외인성 프로모터가 있거나 없이 TCR-A, TCR-C, 또는 TCR-D를 함유하는 AAV 주형을 TRAC 유전자좌로 삽입하였다. T 세포 형질감염 및 AAV 삽입을 각각 실시예 10 및 11에 기술된 바와 같이 이중으로 수행하였다. T 세포를 표 27에 나타낸 다양한 AAV 주형을 함유하는 가이드를 함유하는 RNP를 사용하여 TRAC (서열 번호 186) 및 TRBC (가이드 서열 번호 180)를 함유하는 RNP로 핵감염시켰다. 삽입된 TCR을 발현하는 T 세포를 표 27 및 도 17a-c에 나타낸 바와 같이 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 삽입된 TCR의 TCR V베타 사슬에 대해 특이적인 항체를 사용하는 유동 세포 측정법에 의해 검출하였다 (TCR-A에 대한 항-V베타8, [Biolegend Cat# 140104], 도 17b에서 TCR-D에 대한 V베타7.2 [Beckman Coulter, Cat# IM3604], 및 도 17c에 나타낸 TCR-C에 대한 V베타17 [Beckman Coulter, Cat# IM2048]).
표 27. 외인성 프로모터가 있거나 없는 조작된 TCR의 표면 발현
Figure pct00050
이 표에 나타낸 서열 요소 및 서열은 표 37에서 추가로 정의된다.
특이적 WT1 펩티드 항원에 반응하는 T-세포 탈과립 및 사이토카인 방출을 내인성 프로모터 또는 외인성 TRAC 프로모터로부터 발현된 조작된 이펙터 T 세포의 기능성을 시험하기 위해 수행하였다. 구체적으로, 조작된 T 세포를 암 세포주 OCI-AML3 (DSMZ, Cat. ACC 582)로부터 펩티드 펄스된 세포와 공동 배양 후 CD107a의 상향조절 및 IL2 및 IFNy의 발현에 대해 평가하였다. 간단하게, 100,000 OCI-AML3 세포를 기본 배지 (Xvivo 기본 배지: 30uL/mL CD107a APC/Cy7을 갖는 사이토카인 없음 + 1uL/mL 골지플러그 + 0.7uL/mL 골지스탑 (3ul/웰))에서 적정량의 9-mer 펩티드 VLDFAPPGA (VLD) 또는 0 내지 5000nM 범위인 RMFPNAPYL (RMF) 펩티드 농도로 37도에서 4-5시간 동안 펄싱하였다. 유전자 편집된 TCR+ T 세포를 30 ul/ml CD107a APC/시아닌7 항체 (Biolegend), 1 ul/ml 골지플러그 (BD) 및 0.7 ul/ml 골지스탑 (BD)의 최종 농도를 함유하는 XVIVO15 기본 배지에서 1 x 10^6 TCR 삽입된 세포/ml로 현탁시키고 1:1 이펙터:표적 (E:T) 세포 비율로 펩티드 펄스된 표적 세포에 첨가하였다. 공동 배양물을 37℃에서 밤새 배양하고, 세포를 표면 마커 CD3, CD4, CD8 및 TCR-A 또는 TCR-D의 특이적 TCR 베타 사슬에 대해 염색하고, 30분 동안 배양하였다. 표면 염색 후, 세포를 고정시키고 세포 내 IFN-b 및 TNFα 염색을 위한 시판 키트 (Invitrogen)를 사용하여 투과화한 다음 실온에서 30분 배양하였다. 세포 내 염색 후, 세포를 세척하고 유동 세포 측정법에 의해 분석하였다.
T 세포 사멸 및 사이토카인 방출에 대한 EF1a (또는 EF-1α) 및 내인성 프로모터의 영향을 각 샘플에 존재하는 CD107a, IFNy, 및 또는 TNFa에 대한 세포 양성의 백분율에 의해 측정하였다. TCR 및 프로모터 유형을 갖는 이펙터 T 세포는 표 28에 나열되어 있다. TCR+ T 세포에 대한 유동 세포 측정 결과는 표 28에 나타내고 TCR-A를 발현하는 세포에 대한 용량 반응 곡선은 도 18a에 나타낸다 (AV21 및 AV11). TCR-D를 발현하는 CD107a+ 세포의 백분율은 표 28 및 도 18b에 나타낸다 (AV20 및 AV18). T 세포에 의해 유도된 면역 반응은 표 28 및 도 19a-b에 나타낸 바와 같이 TNF-알파 및 인터페론 감마의 백분율을 측정함으로써 평가하였다.
표 28. 외인성 프로모터가 있거나 없는 TCR을 발현하는 조작된 T 세포에서 탈과립 및 인터페론 감마 반응
Figure pct00051
이 표에 나타낸 서열 요소 및 서열은 표 37에서 추가로 정의된다.
실시예 16: 내인성 T세포 수용체 알파 및 베타 사슬 모두의 녹아웃에 의한 TCR 발현의 향상
T 세포를 삽입된 알파 사슬 및 삽입된 베타 사슬을 모두 포함하는 조작된 TCR-A, TCR-B, 또는 TCR-D의 표면 발현에 대해 평가하였다. 삽입된 알파 및 베타 사슬의 쌍을 증가시키기 위한 세 가지 조건을 시험하였다: (1) 삽입된 알파 및 베타 사슬을 결합시키기 위해 시스테인 가교를 형성할 수 있는 시스테인 잔기의 첨가; (2) 내인성 TRAC 프로모터 또는 외인성 프로모터로부터의 발현 및 (3) TRAC, TRBC1 및 TRBC2의 내인성 카피의 파괴. T 세포 형질감염 및 AAV 형질도입을 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다. TCR을 상기 기술된 바와 같이, TRAC 유전자좌만을 표적으로 하는 RNP 또는 TRAC, TRBC1, 및 TRBC2 유전자좌 모두를 표적으로 하는 RNP로 AAV 주형 AV11, AV13, AV18, 또는 AV20을 통해 삽입하였다. 형질감염 후, T 세포를 실시예 10에 기술된 바와 같이 확장시켰다. 세포 확장 9일 후, 편집된 T 세포를 유동 세포 측정법을 통해 조작된 TCR을 식별하기 위해 항-CD3e 및 적절한 V-베타 시약 (PE)으로 공동염색하였다. 각 조건에 대한 TCR-A 및 TCR-B CD3+ Vb7.2+ 세포의 백분율을 표 29에 나타낸다. 도 20a 및 20b는 표 29의 데이터에 대한 조작된 TCR-A 및 TCR-B CD3+Vb7.2+ 세포의 표면 발현의 대표 실시예를 플로팅한다. CD8+ 및 CD4+ 세포 집단에서 조작된 TCR-A 및 TCR-B의 표면 발현을 또한 표 29 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 측정하였다.
표 29. 삽입된 알파 및 베타 사슬을 모두 포함하는 조작된 TCR-A 및 TCR-B의 발현의 평가
Figure pct00052
내인성 또는 외인성 프로모터를 사용하는 AV20-TCR-D 및 AV18-TCR-D CD3+ Vb7.2+ 세포의 백분율은 표 30에 나타낸다. CD8+ 및 CD4+ 세포 집단에서 조작된 TCR-D의 표면 발현을 표 30 및 도 21a-d에 나타낸 바와 같이 측정하였다.
표 30 삽입된 알파 및 베타 사슬을 모두 포함하는 조작된 TCR-D의 발현의 평가
Figure pct00053
실시예 17: 추가 TCR로부터 쌍을 이루는 알파 및 베타 사슬에 대한 TRBC 녹아웃의 영향.
T 세포를 삽입된 알파 사슬 및 삽입된 베타 사슬 모두의 페어링에 대한 내인성 베타 사슬의 영향에 대해 추가 조작된 TCR로 평가하였다. 실험은 MFI를 측정하기 위해 사량체 염색을 사용하고 표 31의 AAV 삽입물을 형질도입을 위해 사용한 것을 제외하고 본원에 기술된 바와 같이 수행하였다. 세포 확장 9일 후, 편집된 T 세포를 표 31에 나타낸 바와 같이 유동 세포 측정법에 의해 TCR 표면 발현을 갖는 세포를 식별하기 위해 VLD-사량체, V-베타 염색에 대해 직교 방법으로 공동 염색하였고 대표 실험의 데이터를 도 22, 23, 및 24에 나타낸다. 평균 형광 강도 (MFI)를 또한 표 31 및 도 25 및 26에 나타낸 바와 같이 유동 세포 측정법으로 측정하였다.
표 31. 조작된 T 세포에서 표면 TCR 발현
Figure pct00054
실시예 18 - 조작된 T 세포 세포독성 및 사이토카인 방출
조작된 T 세포를 각각, 표적 세포에서 세포 자살의 측정 및 성장 배지로 방출된 사이토카인의 측정을 통해 세포독성 및 사이토카인 반응에 대해 분석하였다. T 세포를 TRAC 유전자좌만을 표적으로 하는 RNP 또는 TRAC 및 TRBC 유전자좌 모두를 표적으로 하는 RNP와 함께 표 32에 기술된 AAV 주형 서열을 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 조작하였다. HLA-02.01 양성 T2 세포주 표적 세포를 펄싱하고 TCR+T 세포의 세포 비율이 2.5:1 E:T인 것을 제외하고 실시예 15에 기술된 바와 같이 편집된 T 세포와 함께 공동 배양하였다. 카스파제 3/7 적색 시약 (Essen Bioscience)을 2 μM의 최종 농도로 각 웰에 첨가하였다. Incucyte 라이브 셀 분석 시스템 (Essen Bioscience) 및 Incucyte S3 분석 소프트웨어 (버전 2018B)를 6시간 후 카스파제 3/7 세포사멸 세포로부터의 적색 형광을 정량하기 위해 사용하였다. 24시간 후 각 웰의 상청액을 채취하고 IL2 및 IFN-η 사이토카인 방출을 제조사 프로토콜에 따라 Duoset ELISA 키트 (R&D 시스템)를 사용하여 ELISA로 정량하였다. 평균 카스파제 3/7 통합 강도는 표 32 및 33 및 도 27a-c 및 28a-d에 나타낸다. 사이토카인 방출은 표 34AD 및 도 29a-g 및 30a-d에 나타낸다.
표 32- 세포독성
Figure pct00055
표 33- 세포독성
Figure pct00056
표 34A - IL2 사이토카인 방출
Figure pct00057
표 34B - 인터페론 감마 방출
Figure pct00058
표 34C - IL2 사이토카인 방출
Figure pct00059
표 34D - 인터페론 감마 방출
Figure pct00060
실시예 19: CD107a 탈과립 및 세포 내 사이토카인 염색 (ICS)에 의해 분석된 바와 같은 조작된 T 세포 세포독성
조작된 T 세포를 또한 각각, CD107a의 측정 및 세포 내 사이토카인 염색을 통해 세포독성 및 사이토카인 반응을 평가하였다. T 세포를 TRAC 유전자좌만 또는 TRAC 및 TRBC 유전자좌 모두를 표적으로 하는 RNP로 표 35에 기술된 AAV 주형 서열을 사용하여 실시예 18에 기술된 바와 같이 조작하였다. HLA-02.01 양성 T2 세포주를 편집된 TCR+T 세포를 1:1 E:T 세포 비율로 펩티드 펄스된 표적 세포에 첨가한 것을 제외하고 실시예 18에 기술된 바와 같이 펄싱하였다. 공동 배양물을 37C에서 밤새 배양하고, 세포를 표면 마커 CD3, CD4, CD8 및 특이적 TCR 베타 사슬 또는 사량체에 대해 염색하였다. 표면 염색 후, 세포를 고정시키고 시판 키트 (Invitrogen)를 사용하여 세포 내 IFN-γ 및 TNFα 염색을 위해 투과화하였다. TCR 발현을 유도한 면역 반응을 표 35A 및 도 31a-b에 나타낸다. TRBC 녹아웃을 갖는 발현된 TCR로부터 유래된 세포독성을 표 35B 및 도 32a-b에 나타낸 바와 같이 조작된 T 세포에서 CD107a를 측정함으로써 평가하였다.
표 35A. 세포 내 사이토카인 염색
Figure pct00061
표 35B. CD107a 탈과립
Figure pct00062
실시예 20: 동종이식편 반응 분석
실시예 18에서 제조된 조작된 T 세포를 혼합 림프구 반응 (MLR) 억제 분석에서 항원 제시 세포에 대한 비-특이적 반응성에 대해 또한 분석하였다. 조작된 T 세포를 제조사의 지시에 따라, CellTrace 바이올렛 (Invitrogen)으로 표지하였다. 동종 PBMC는 MACS (Miltenyi)를 사용하여 CD3+ 세포가 고갈되고 CTV-표지된 T 세포를 자극하기 위해 사용하였다. 구체적으로, 5x104 T 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트 (Corning)에서 3x104 CD3-고갈된 동종 PBMC로 플레이팅하였다. 5일 후, 세포를 채취하고, 항-CD4로 염색하고 유동 세포 측정법으로 분석하였다. 증식의 정도는 CellTrace 바이올렛 염료의 희석으로 정량하였다. 글루타민을 갖는 10% FBS, 1x GlutaMAX, 10mM HEPES, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 1mM 피루브산 나트륨, 50uM 2-ME, 및 1x 비필수 아미노산으로 보충된 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (RPMI; Corning)를 MLR 분석에 걸쳐 사용하였다. 낮은 수준의 CellTrace 바이올렛 (CTV)을 갖는, 즉 높은 증식 세포의 세포 염색의 평균 백분율을 표 36 및 도 33a-b에 나타낸다. 도 33a 및 33b는 CTV 수준을 분석하기 위해 사용된 게이팅을 나타낸다. TRBC RNP로 처리된 세포는 표 36 및 도 33c 및 33d에 나타낸 바와 같이 시험된 각각의 삽입된 TCR에 대해 CD4+ 및 CD4- (CD8+) 세포 모두에서 TRBC RNP로 처리되지 않는 세포보다 낮은 증식을 나타낸다.
표 36 -동종 PBMC에 대한 반응에서의 증식
Figure pct00063
표 37 - 핵산 주형. 모든 주형은 ssAAV로서 전달되고 AAV2 5' 및 3'를 포함함을 주의. 상동성 암은 상기 기술된 바와 같다. 다수는 추가적으로 하기에 제시된 바와 같이, 하나 이상의 프로모터, 절단, 또는 폴리A 서열을 포함한다. "*"는 하기, 정지 코돈을 나타낸다.
Figure pct00064
표 37에 정의된 주형의 요소는 하기와 같은 다음 순서에 따라 정의된다: EF1a (서열 번호 603); EF1 (서열 번호 604); MND-1 (서열 번호 605); MND-2 (서열 번호 606); PGK (서열 번호 607); T2A (서열 번호 608); P2A (서열 번호 609); EGFP (서열 번호 610); SV40 폴리 A (서열 번호 611); bGH 폴리A (서열 번호 612).
SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNOTHERAPY <130> 01155-0026-00PCT <140> PCT/US2019/056399 <141> 2019-10-15 <150> US 62/746,522 <151> 2018-10-16 <150> US 62/747,037 <151> 2018-10-17 <160> 632 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcucucgga gaaugacgag 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggccucggcg cugacgaucu 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 augacgagug gacccaggau 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 agaagguggc cgagacccuc 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ugagggucuc ggccaccuuc 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 agagaucucc cacacccaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 uggcucaaac acagcgaccu 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggcgcugacg aucuggguga 20 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 uggcagacag gaccccuugc 20 <210> 10 <211> 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cgaguggacc 20 <210> 35 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 accacuuccg cugucaaguc 20 <210> 36 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 aaugacgagu ggacccagga 20 <210> 37 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 acgggcucuc ggagaaugac 20 <210> 38 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 gacuccagau acugccugag 20 <210> 39 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 cgcuguguuu gagccaucag 20 <210> 40 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 agaacuggac uugacagcgg 20 <210> 41 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 gagacccuca ggcggcugcu 20 <210> 42 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 cgucauucuc cgagagcccg 20 <210> 43 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 cagcccgccc ucaaugacuc 20 <210> 44 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 ggcugcucag gcaguaucug 20 <210> 45 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 agugguugcg gggguucugc 20 <210> 46 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 ggucgcugug uuugagccau 20 <210> 47 <211> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA sequence <400> 212 uaggcagaca gacuugucac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 213 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 213 agcugguaca cggcaggguc 20 <210> 214 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 214 uaggcagaca gacuugucac 20 <210> 215 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 215 ucugugggac aagaggauca 20 <210> 216 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 216 aucuguggga caagaggauc 20 <210> 217 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 217 cuggauaucu gugggacaag 20 <210> 218 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 218 gucaggguuc uggauaucug 20 <210> 219 <400> 219 000 <210> 220 <400> 220 000 <210> 221 <400> 221 000 <210> 222 <400> 222 000 <210> 223 <400> 223 000 <210> 224 <400> 224 000 <210> 225 <400> 225 000 <210> 226 <400> 226 000 <210> 227 <400> 227 000 <210> 228 <400> 228 000 <210> 229 <400> 229 000 <210> 230 <400> 230 000 <210> 231 <400> 231 000 <210> 232 <400> 232 000 <210> 233 <400> 233 000 <210> 234 <400> 234 000 <210> 235 <400> 235 000 <210> 236 <400> 236 000 <210> 237 <400> 237 000 <210> 238 <400> 238 000 <210> 239 <400> 239 000 <210> 240 <400> 240 000 <210> 241 <400> 241 000 <210> 242 <400> 242 000 <210> 243 <400> 243 000 <210> 244 <400> 244 000 <210> 245 <400> 245 000 <210> 246 <400> 246 000 <210> 247 <400> 247 000 <210> 248 <400> 248 000 <210> 249 <400> 249 000 <210> 250 <211> 819 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 250 atggaaaccc tgctgaaggt gctgagcggc acactgctgt ggcagctgac atgggtccga 60 tctcagcagc ctgtgcagtc tcctcaggcc gtgattctga gagaaggcga ggacgccgtg 120 atcaactgca gcagctctaa ggccctgtac agcgtgcact ggtacagaca gaagcacggc 180 gaggcccctg tgttcctgat gatcctgctg aaaggcggcg agcagaaggg ccacgagaag 240 atcagcgcca gcttcaacga gaagaagcag cagtccagcc tgtacctgac agccagccag 300 ctgagctaca gcggcaccta cttttgtggc accgcctgga tcaacgacta caagctgtct 360 ttcggagccg gcaccacagt gacagtgcgg gccaatattc agaaccccga tcctgccgtg 420 taccagctga gagacagcaa 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<210> 414 <400> 414 000 <210> 415 <400> 415 000 <210> 416 <400> 416 000 <210> 417 <400> 417 000 <210> 418 <400> 418 000 <210> 419 <400> 419 000 <210> 420 <400> 420 000 <210> 421 <400> 421 000 <210> 422 <400> 422 000 <210> 423 <400> 423 000 <210> 424 <400> 424 000 <210> 425 <400> 425 000 <210> 426 <400> 426 000 <210> 427 <400> 427 000 <210> 428 <400> 428 000 <210> 429 <400> 429 000 <210> 430 <400> 430 000 <210> 431 <400> 431 000 <210> 432 <400> 432 000 <210> 433 <400> 433 000 <210> 434 <400> 434 000 <210> 435 <400> 435 000 <210> 436 <400> 436 000 <210> 437 <400> 437 000 <210> 438 <400> 438 000 <210> 439 <400> 439 000 <210> 440 <400> 440 000 <210> 441 <400> 441 000 <210> 442 <400> 442 000 <210> 443 <400> 443 000 <210> 444 <400> 444 000 <210> 445 <400> 445 000 <210> 446 <400> 446 000 <210> 447 <400> 447 000 <210> 448 <400> 448 000 <210> 449 <400> 449 000 <210> 450 <400> 450 000 <210> 451 <400> 451 000 <210> 452 <400> 452 000 <210> 453 <400> 453 000 <210> 454 <400> 454 000 <210> 455 <400> 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cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggt 238 <210> 605 <211> 457 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 605 aacagagaaa caggagaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc 60 ggctcagggc caagaacagt tggaacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120 agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct 180 cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc 240 tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct 300 ccccgagctc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca 360 tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgactctag aggatcgatc ccccgggctg 420 caggaattca agcgagaaga caagggcaga aagcacc 457 <210> 606 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 606 gatccgaaca gagagacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc 60 tgccccggct cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct 120 gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc 180 cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa 240 tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct 300 tctgctcccc gagctctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag 360 acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccga ctctagagga tccaccggtc 420 gccacc 426 <210> 607 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 607 gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60 gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120 gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180 ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240 gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300 ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360 gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420 ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480 cctcatctcc gggcctttcg 500 <210> 608 <211> 54 <212> DNA 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catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 540 tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 600 gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgagggccg 660 cggcagcctg ctgacctgcg gcgacgtgga ggagaatccc ggccccatgg gatcttggac 720 actgtgttgc gtgtccctgt gcatcctggt ggccaagcac acagatgccg gcgtgatcca 780 gtctcctaga cacgaagtga ccgagatggg ccaagaagtg accctgcgct gcaagcctat 840 cagcggccac gattacctgt tctggtacag acagaccatg atgagaggcc tggaactgct 900 gatctacttc aacaacaacg tgcccatcga cgacagcggc atgcccgagg atagattcag 960 cgccaagatg cccaacgcca gcttcagcac cctgaagatc cagcctagcg agcccagaga 1020 tagcgccgtg tacttctgcg ccagcagaaa gacaggcggc tacagcaatc agccccagca 1080 ctttggagat ggcacccggc tgagcatcct ggaagatctg aagaacgtgt tcccacctga 1140 ggtggccgtg ttcgagcctt ctgaggccga gatcagccac acacagaaag ccacactcgt 1200 gtgtctggcc accggcttct atcccgatca cgtggaactg tcttggtggg tcaacggcaa 1260 agaggtgcac agcggcgtca gcaccgatcc tcagcctctg aaagagcagc ccgctctgaa 1320 cgacagcaga tactgcctga gcagcagact 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cgacagccag accaacgtgt cccagagcaa 2220 ggacagcgac gtgtacatca ccgataagac tgtgctggac atgcggagca tggacttcaa 2280 gagcaacagc gccgtggcct ggtccaacaa gagcgatttc gcctgcgcca acgccttcaa 2340 caacagcatt atccccgagg acacattctt cccaagtcct gagagcagct gcgacgtgaa 2400 gctggtggaa aagagcttcg agacagacac caacctgaac ttccagaacc tgagcgtgat 2460 cggcttcaga atcctgctgc tcaaggtggc cggcttcaac ctgctgatga ccctgagact 2520 gtggtccagc taacctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 2580 cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 2640 gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 2700 gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 2760 atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca ctagtcgtgt 2820 accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc gattttgatt 2880 ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac aaaactgtgc 2940 tagacatgag gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc aacaaatctg 3000 actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc ttcttcccca 3060 gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca 3120 ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc 3180 ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta ctaagaaaca gtgagccttg ttctggcagt 3240 ccagagaatg acacgggaaa aaagcagatg aagagaaggt ggcaggagag ggcacgtggc 3300 ccagcctcag tctctagatc taggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc 3360 gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc 3420 gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaa 3466

Claims (322)

  1. TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    (a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv.서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    (b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    (c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  2. DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    (a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 1-89 및 179-184에 대한 표 1 및/또는 3 중 하나에 열거된 게놈 좌표의 15개 연속 뉴클레오티드±10개 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
    ii. (i)로부터의 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. (i)로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    (b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    (c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  3. 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하는, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    b. (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  4. 조성물을 대상체, 이의 자가 세포, 및/또는 동종 세포에 투여하는 것을 포함하는 면역요법 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    b. (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  5. TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 90-113, 185, 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    b. (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  6. DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    (a) 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 90-218에 대한 표 2 및/또는 3 중 어느 하나에 열거된 게놈 좌표의 15개 연속 뉴클레오티드±10개 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
    ii. (i)로부터의 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. (i)로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    (b) (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    (c) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  7. 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하는, TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii.서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 90-113, 185, 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    b. (a)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  8. 조성물을 대상체, 이의 자가 세포, 및/또는 동종 세포에 투여하는 것을 포함하는 면역요법 방법으로서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 방법:
    a. 하기로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA:
    i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 90-113, 185, 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    b. (a.)의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 선택적으로
    c. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  9. TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는 방법으로서, 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하고,
    상기 제2 가이드 RNA는
    vi. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
    vii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    viii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    ix. 서열 번호 90-113, 185, 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    x. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
  10. TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하고,
    상기 제2 가이드 RNA는
    i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 90-113, 185, 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  11. 대상체, 이의 자가 세포, 또는 동종 세포에 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역요법의 방법으로서, 상기 조성물은 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA, 및 선택적으로 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하고,
    상기 제2 가이드 RNA는
    vi. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열;
    vii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    viii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    ix. 서열 번호 90-113, 185, 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    x. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  12. TRAC 유전자좌에서 유전자좌 삽입을 통해 이종 면역학적 수용체를 발현하는 방법으로서, 세포에 제1 가이드 RNA, 제2 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA는
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열;
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    iv. 서열 번호 1, 2, 3, 5, 6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    v. 서열 번호 2, 3, 5, 6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하고,
    상기 제2 가이드 RNA는
    vi. 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 218로부터 선택된 가이드 서열;
    vii. 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 및 218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드;
    viii. 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 및 218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열;
    ix. 서열 번호 90, 95, 97, 185, 및 214 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열;
    x. 서열 번호 90, 95, 및 185 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및
    xi. 서열 번호 90 또는 214를 포함하는 가이드 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 RNA는 서열 번호 2의 서열을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA는 서열 번호 90의 서열을 포함하는, 방법.
  14. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 RNA는 서열 번호 180의 서열을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA는 서열 번호 186의 서열을 포함하는, 방법.
  15. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1, 2, 3, 5, 6 중 어느 하나의 서열을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA는 서열 번호 90의 서열을 포함하는, 방법.
  16. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1, 2, 3, 5, 6 중 어느 하나의 서열을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA는 서열 번호 214의 서열을 포함하는, 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 RNA, 상기 제2 가이드 RNA 및 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산이 실질적으로 동시에 투여되는, 방법.
  18. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 DNA 서열이 동시에 변경되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산이 도입되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    a. 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 이중 가닥 브레이크 (DSB)를 도입하는 단계; 또는
    b. 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자 내의 단일 가닥 브레이크 (SSB)를 도입하는 단계; 또는
    c. 세포 및/또는 대상체에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는 단계.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로:
    a. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 수용체를 포함하고;
    b. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 면역학적 수용체를 포함하고;
    c. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 T-세포 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 T-세포 수용체는 암 항원을 인식하고;
    d. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 WT1-특이적 T-세포 수용체를 포함하고, 상기 T-세포 수용체는 WT1 또는 이의 단편을 인식하고;
    e. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 키메라 항원 수용체는 암 항원을 인식하거나; 또는
    f. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 WT1-특이적 키메라 항원 수용체를 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체는 WT1 또는 이의 단편을 인식하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    a. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 도입하는 단계;
    b. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 도입하는 단계;
    c. WT1-특이적 TCR α 사슬 및 β 사슬을 도입하는 단계;
    d. WT1-특이적 TCR α 사슬 및 β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 도입하는 단계;
    e. 하기로부터 선택된 제1 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 501 또는 504; (ii) 서열 번호 501 또는 504와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 501 또는 504의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250개 아미노산의 연속 서열,
    및
    하기로부터 선택된 제2 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 502 또는 505; (ii) 서열 번호 502 또는 505와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 502 또는 505의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 아미노산의 연속 서열,
    f. 하기로부터 선택된 제1 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 501 또는 513; (ii) 서열 번호 501 또는 513과 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 501 또는 513의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250개 아미노산의 연속 서열,
    및
    하기로부터 선택된 제2 TCR 서열을 도입하는 단계: (i) 서열 번호 511 또는 514; (ii) 서열 번호 511 또는 514과 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 아미노산 서열; 및 (iii) 서열 번호 511 또는 514의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 아미노산의 연속 서열,
    g. (e) 또는 (f)의 제1 TCR 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계;
    h. (e) 또는 (f)의 제2 TCR 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계;
    i. (g) 및 (h)의 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계;
    j. 서열 번호 500, 503, 506, 509, 512, 515, 518, 또는 521 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 선택적으로 도입함으로써, 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열로부터 선택된 폴리펩티드를 도입하는 단계;
    k. 하기 (i)-(vii)로부터 선택된 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 폴리펩티드, 또는 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열을 도입하는 단계:
    i) 서열 번호 501 및 서열 번호 502;
    ii) 서열 번호 504 및 서열 번호 505;
    iii) 서열 번호 507 및 서열 번호 508;
    iv) 서열 번호 510 및 서열 번호 511;
    v) 서열 번호 513 및 서열 번호 514;
    vi) 서열 번호 516 및 서열 번호 517;
    vii) 서열 번호 519 및 서열 번호 520;
    l.(k)의 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 단계.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 핵산 서열이 제1 표적 유전자좌에 상동성인 서열을 측면에 구비하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 제2 핵산 서열이 제2 표적 유전자좌에 상동성인 서열을 측면에 구비하는, 방법.
  25. 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 유전자좌는 TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 유전자, 예를 들어, TRAC 유전자인, 방법.
  26. 제24항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 유전자좌는 TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 유전자, 예를 들어, TRBC1 또는 TRBC2 유전자인, 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측면 서열은 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 또는 40 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입된 핵산 서열, 또는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 프로모터를 포함하지 않는, 방법.
  29. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입된 핵산 서열, 또는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로 상기 프로모터는 EF-1α 프로모터 (예를 들어, 서열 번호 603)인, 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입된 핵산 서열, 또는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 벡터를 통해, 형질감염을 통해, 지질 나노입자를 통해, 또는 미세주입을 통해 도입되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이고, 추가로 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터인, 방법.
  32. TCR (예를 들어 WT1-특이적 TCR)의 유전자좌 삽입의 방법으로서, 세포에 (i) 서열 번호 90, 95, 97, 98, 185, 214, 및 218로부터 선택된 가이드 서열을 포함하는 TCR을 삽입하기 위한 제1 가이드 RNA, (ii) RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산; 및 (iii) TCR (예를 들어 WT1-특이적 TCR)을 암호화하는 공여자 핵산 분자를 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 가이드 RNA를 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제2 가이드 RNA는 서열 번호 179-184로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR은 하기를 포함하는 WT1-특이적 TCR인, 방법:
    (a) 서열 번호 500, 503, 506, 509, 512, 515, 518, 또는 521로부터 선택된 폴리펩티드 또는 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열; 또는
    (b) 하기 (i)-(viii)로부터 선택된 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 폴리펩티드, 또는 이와 적어도 99%, 95%, 90% 동일한 아미노산 서열:
    i) 서열 번호 501 및 서열 번호 502;
    ii) 서열 번호 504 및 서열 번호 505;
    iii) 서열 번호 507 및 서열 번호 508;
    iv) 서열 번호 510 및 서열 번호 511;
    v) 서열 번호 513 및 서열 번호 514;
    vi) 서열 번호 516 및 서열 번호 517;
    vii) 서열 번호 519 및 서열 번호 520;
    viii) 서열 번호 522 및 서열 번호 523.
  36. 하기를 포함하는 조성물:
    a. 하기를 포함하는 가이드 RNA
    i. 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 서열; 또는
    ii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
    iii. 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
    iv. 서열 번호 1-24 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    v. 서열 번호 1-6 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 선택적으로
    b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  37. 제36항에 있어서, 세포에서 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는데 사용하기 위한 조성물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 세포에서 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 발현을 감소시키는데 사용하기 위한 조성물.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 196-200 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는, 조성물.
  40. 하기를 포함하는 조성물:
    a. 하기를 포함하는 가이드 RNA
    i. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열; 또는
    ii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
    iii. 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
    iv. 서열 번호 90-113 및 213-218 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
    v. 서열 번호 90-95 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 선택적으로
    b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
  41. 제40항에 있어서, 세포에서 TRAC 유전자 내의 DNA 서열을 변경하는데 사용하기 위한 조성물.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 세포에서 TRAC 유전자의 발현을 감소시키는데 사용하기 위한 조성물.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 185-192 및 201-212 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법에 따라 변경된, 세포.
  45. 제44항에 있어서, 상기 세포는 생체 외에서 변경된, 세포.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 세포.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인, 세포.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물, 영장류, 또는 인간 세포인, 세포.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 비-내인성 T-세포 수용체를 발현하는 T 세포의 제조를 위한, 내인성 T-세포 수용체가 결여된, 세포.
  50. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, CAR을 발현하는 T 세포의 제조를 위한, 내인성 T-세포 수용체가 결여된, 세포.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변경된 세포는 CD3- 세포인, 세포.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 변경되기 전 CD3+ 세포이고 변경된 세포는 CD3- 세포인, 세포.
  53. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로
    a. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 수용체를 포함하고;
    b. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 면역학적 수용체를 포함하고;
    c. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 T-세포 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 T-세포 수용체는 WT1에 대해 특이적이거나; 또는
    d. 하나 이상의 관심 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체를 포함하고, 추가로 선택적으로 상기 키메라 항원 수용체는 WT1에 대해 특이적인, 세포.
  54. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 T-세포 수용체의 α 및 β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하는 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 외인성 T-세포 수용체의 α 및 β 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열은 게놈의 TRAC 유전자좌에 있는, 세포.
  56. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 T-세포 수용체의 γ 및 δ 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하는 세포.
  57. 제56항에 있어서, 상기 외인성 T-세포 수용체의 γ 및 δ 사슬을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열은 게놈의 TRAC 유전자좌에 있는, 세포.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR α 사슬의 서열은 하기로부터 선택되고: (i) 서열 번호 501 또는 504; (ii) 서열 번호 501 또는 504와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 501 또는 504의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250개 아미노산의 연속 서열, 그리고
    상기 TCR β 사슬의 서열은 하기로부터 선택되는 세포: (i) 서열 번호 502 또는 505; (ii) 서열 번호 502 또는 505와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 502 또는 505의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 아미노산의 연속 서열.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR α 사슬은 서열 번호 500, 501, 503, 및 504 중 하나에 따른 핵산 서열에 의해 암호화되고, β TCR 사슬은 서열 번호 500, 502, 503, 및 505 중 하나에 따라 암호화되는, 세포.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR α 사슬의 서열은 하기로부터 선택되고: (i) 서열 번호 513; (ii) 서열 번호 513과 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 513의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250개 아미노산의 연속 서열, 그리고
    상기 TCR β 사슬의 핵산 서열은 하기로부터 선택되는 세포: (i) 서열 번호 514; (ii) 서열 번호 514와 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 서열; 및 서열 번호 514의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 아미노산의 연속 하위서열.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 α TCR 사슬은 서열 번호 513이고 β TCR 사슬은 서열 번호 514인, 세포.
  62. 제44항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 내인성 프로모터로부터 발현되는, 세포.
  63. 제44항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 이종 프로모터로부터 발현되고, 선택적으로 상기 이종 프로모터는 EF-1α 프로모터인, 세포.
  64. 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 변경된 집단의 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과는 CD3- 세포인, 세포 집단.
  65. 제64항에 있어서, 상기 집단의 약 90% 초과는 CD3-인, 세포 집단.
  66. 제64항에 있어서, 상기 집단의 약 95% 초과는 CD3-인, 세포 집단.
  67. 제64항에 있어서, 상기 집단의 약 99% 초과는 CD3-인, 세포 집단.
  68. 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 집단의 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과는 내인성 T-세포 수용체가 결여된, 세포 집단.
  69. 제68항에 있어서, 상기 집단의 약 90% 초과는 내인성 T-세포 수용체가 결여된, 세포 집단.
  70. 제68항에 있어서, 상기 집단의 약 95% 초과는 내인성 T-세포 수용체가 결여된, 세포 집단.
  71. 제68항에 있어서, 상기 집단의 약 99% 초과는 내인성 T-세포 수용체가 결여된, 세포 집단.
  72. 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 집단에서 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현은 동일한 세포의 변경되지 않은 집단에 비해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 감소한 세포 집단.
  73. 제72항에 있어서, 상기 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현 감소가 적어도 약 90%인, 집단.
  74. 제72항에 있어서, 상기 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현 감소가 적어도 약 95%인, 집단.
  75. 제72항에 있어서, 상기 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 발현 감소가 적어도 약 99%인 집단.
  76. 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소가 TRBC1 유전자의 발현에서의 감소인, 집단.
  77. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소가 TRBC2 유전자의 발현에서의 감소인, 집단.
  78. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소가 TRAC 유전자의 발현에서의 감소인, 집단.
  79. 제44항 내지 제78항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 집단의 10 내지 100%, 예를 들어 집단의 30 내지 99%가 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 인델을 갖는, 세포 집단.
  80. 제79항에 있어서, 상기 집단의 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%가 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 인델을 갖는, 집단.
  81. 제76항 또는 제79항에 있어서, 상기 인델 또는 삽입이 TRBC1 유전자에 있는, 집단.
  82. 제77항 또는 제79항에 있어서, 상기 인델 또는 삽입이 TRBC2 유전자에 있는, 집단.
  83. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 인델 또는 삽입이 TRAC 유전자에 있는, 집단.
  84. 제1항 내지 제4항, 또는 제9항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 편집을 야기하는 방법, 또는 사용을 위한 조성물.
  85. 제4항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 TRAC 유전자의 편집을 야기하는 방법, 또는 사용을 위한 조성물.
  86. 제9항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 TRBC 유전자 및 TRAC 유전자의 편집을 야기하는 방법, 또는 사용을 위한 조성물.
  87. 제79항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집은 편집된 집단의 백분율 (편집 백분율 또는 인델 백분율)로서 계산되는, 방법 또는 사용을 위한 조성물.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 백분율은 집단의 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%인 방법 또는 사용을 위한 조성물.
  89. 제4항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 sgRNA를 포함하는 방법 또는 조성물:
    a. 서열 번호 179-184 및 196-200 중 어느 하나; 또는
    b. 서열 번호 1-89 중 어느 하나로부터 선택된 가이드 서열; 또는
    c. 서열 번호 1-24로부터 선택된 가이드 서열; 또는
    d. 서열 번호 1-6으로부터 선택된 가이드 서열.
  90. 제4항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하기를 포함하는 sgRNA를 포함하는 방법 또는 조성물:
    a. 서열 번호 186-192 및 201-212 중 어느 하나; 또는
    b. 서열 번호 90-178 및 213-218 중 어느 하나로부터 선택된 가이드 서열; 또는
    c. 서열 번호 90-113 및 213-218로부터 선택된 가이드 서열; 또는
    d. 서열 번호 90-95로부터 선택된 가이드 서열.
  91. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 1, 2, 3, 또는 4에 있는, 방법 또는 조성물.
  92. 제91항에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 1에 있는, 방법 또는 조성물.
  93. 제91항에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 2에 있는, 방법 또는 조성물.
  94. 제91항에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 3에 있는, 방법 또는 조성물.
  95. 제91항에 있어서, 상기 표적 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 엑손 4에 있는, 방법 또는 조성물.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 인간 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 있는, 방법 또는 조성물.
  97. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC의 양성 가닥에서 표적 서열에 대해 상보적인, 방법 또는 조성물.
  98. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 음성 가닥에서 표적 서열에 대해 상보적인, 방법 또는 조성물.
  99. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 양성 가닥에서 제1 표적 서열에 대해 상보적이고, 상기 조성물은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자의 음성 가닥에서 제2 표적 서열에 대해 상보적인 제2 가이드 서열을 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
  100. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 1-178 중 어느 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고 서열 번호 400의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 서열 번호 400의 뉴클레오티드는 3' 말단에서 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
  101. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 1-178 중 어느 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고 서열 번호 401의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 서열 번호 401의 뉴클레오티드는 3' 말단에서 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
  102. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 300의 패턴에 따라 변형되고, 상기 N은 집합적으로 서열 번호 1-89의 가이드 서열 중 어느 하나인, 방법 또는 조성물.
  103. 제102항에 있어서, 상기 서열 번호 300에서 각각의 N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, 상기 N은 가이드 서열을 형성하고, 상기 가이드 서열은 TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC 유전자에 대해 Cas9을 표적으로 하는, 방법 또는 조성물.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sgRNA는 서열 번호 1-89로부터 선택된 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 98%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  105. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 바이러스 벡터에 포함되는, 방법 또는 조성물.
  106. 제105항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터인, 방법 또는 조성물.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 서열 번호 613-632 중 하나의 핵산 서열 또는 이에 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  108. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  109. 제108항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA의 5' 말단에서 처음 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  113. 제108항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA의 3' 말단에서 마지막 5개 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  114. 제108항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA의 5' 말단에서 처음 4개 뉴클레오티드 사이에 PS 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  115. 제108항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA의 3' 말단에서 마지막 4개 뉴클레오티드 사이에 PS 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  116. 제108항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA의 5' 말단에서 처음 3개 뉴클레오티드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  117. 제108항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA의 3' 말단에서 마지막 3개 뉴클레오티드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  118. 제108항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열 번호 300의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
  119. 제108항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
  120. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
  121. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제 조성물은 리보뉴클레오단백질 (RNP)에 포함된, 방법 또는 조성물.
  122. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
  123. 제121항 또는 제122항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제가 Cas9인, 방법 또는 조성물.
  124. 제123항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제가 Cas9 단백질인, 방법 또는 조성물.
  125. 제1항 내지 제43항 및 제84항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 제형이고 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
  126. 약제의 제조를 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도.
  127. 암 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도.
  128. 대상체의 면역요법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도.
  129. 윌름스 종양 항원 (WT1)을 과발현하는 종양의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 용도.
  130. 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포.
  131. 면역요법에 사용하기 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포.
  132. 암 치료에 사용하기 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포.
  133. 윌름스 종양 항원 (WT1)을 과발현하는 종양의 치료에 사용하기 위한 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포.
  134. 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물의 치료 방법.
  135. 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물의 암 치료 방법.
  136. 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물의 면역요법의 방법.
  137. 제36항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물, 제형, 집단, 또는 세포의 투여를 포함하는 인간 또는 동물에서 윌름스 종양 항원 (WT1)을 과발현하는 종양의 치료 방법.
  138. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 1인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  139. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 2인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  140. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 3인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  141. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 4인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  142. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 5인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  143. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 6인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  144. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 7인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  145. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 8인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  146. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 9인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  147. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 10인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  148. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 11인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  149. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 12인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  150. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 13인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  151. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 14인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  152. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 15인 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  153. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 16인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  154. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 17인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  155. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 18인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  156. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 19인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  157. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 20인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  158. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 21인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  159. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 22인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  160. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 23인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  161. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 24인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  162. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 25인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  163. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 26인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  164. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 27인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  165. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 28인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  166. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 29인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  167. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 30인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  168. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 31인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  169. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 32인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  170. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 33인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  171. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 34인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  172. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 35인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  173. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 36인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  174. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 37인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  175. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 38인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  176. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 39인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  177. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 40인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  178. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 41인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  179. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 42인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  180. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 43인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  181. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 44인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  182. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 45인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  183. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 46인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  184. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 47인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  185. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 48인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  186. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 49인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  187. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 50인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  188. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 51인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  189. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 52인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  190. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 53인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  191. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 54인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  192. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 55인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  193. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 56인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  194. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 57인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  195. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 58인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  196. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 59인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  197. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 60인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  198. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 61인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  199. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 62인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  200. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 63인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  201. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 64인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  202. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 65인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  203. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 66인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  204. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 67인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  205. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 68인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  206. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 69인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  207. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 70인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  208. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 71인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  209. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 72인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  210. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 73인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  211. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 74인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  212. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 75인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  213. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 76인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  214. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 77인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  215. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 78인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  216. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 79인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  217. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 80인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  218. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 81인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  219. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 82인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  220. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 83인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  221. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 84인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  222. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 85인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  223. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 86인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  224. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 87인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  225. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 88인, 방법, 용도, 조성물, 집단, 또는 세포.
  226. 제1항 내지 제4항, 제9항 내지 제39항, 제44항 내지 제77항, 제79항 내지 제82항, 제84항, 제86항 내지 제89항, 또는 제91항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1-89로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 89인, 방법, 용도, 조성물, 또는 세포.
  227. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 185인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  228. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 90인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  229. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 91인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  230. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 92인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  231. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 93인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  232. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 94인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  233. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 95인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  234. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 96인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  235. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 97인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  236. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 98인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  237. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 99인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  238. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 100인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  239. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 101인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  240. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 102인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  241. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 103인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  242. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 104인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  243. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 105인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  244. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 106인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  245. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 107인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  246. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 108인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  247. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 109인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  248. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 110인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  249. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 111인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  250. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 112인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  251. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 113인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  252. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 114인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  253. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 115인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  254. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 116인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  255. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 117인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  256. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 118인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  257. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 119인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  258. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 120인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  259. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 121인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  260. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 122인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  261. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 123인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  262. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 124인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  263. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 125인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  264. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 126인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  265. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 127인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  266. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 128인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  267. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 129인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  268. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 130인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  269. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 131인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  270. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 132인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  271. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 133인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  272. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 134인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  273. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 135인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  274. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 136인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  275. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 137인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  276. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 138인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  277. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 139인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  278. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 140인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  279. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 141인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  280. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 142인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  281. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 143인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  282. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 144인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  283. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 145인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  284. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 146인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  285. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 147인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  286. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 148인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  287. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 149인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  288. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 150인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  289. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 151인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  290. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 152인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  291. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 153인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  292. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 154인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  293. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 155인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  294. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 156인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  295. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 157인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  296. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 158인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  297. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 159인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  298. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 160인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  299. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 161인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  300. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 162인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  301. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 163인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  302. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 164인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  303. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 165인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  304. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 166인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
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  307. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 169인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  308. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 170인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
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  313. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 175인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
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  320. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 216인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
  321. 제5항 내지 제8항, 제9항 내지 제35항, 제40항 내지 제75항, 제78항 내지 제80항, 제83항, 제85항 내지 제87항, 또는 제90항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 90-178, 185, 및 213-218로부터 선택된 가이드 RNA의 서열이 서열 번호 217인, 방법, 용도, 집단, 세포, 또는 조성물.
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