KR20200083550A - ACE-tRNA에 의한 유전자 재지정을 통해 정지 코돈을 구조하는 방법 - Google Patents

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KR20200083550A
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유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션
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Abstract

특정 실시양태에서, 본 발명은 T-아암이 신장 인자 1 알파 단백질과 상호작용하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, T-아암, D-아암, 및 안티코돈-아암 및 수용자 아암을 포함하는 변형된 전달 RNA (tRNA), 및 그의 이용 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 T-아암, D-아암, 및 안티코돈-아암 및 수용자 아암을 포함하는 변형된 전달 RNA (tRNA)를 제공하며, (a) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-UCA-3'이고 TGA 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 아르기닌, 트립토판 또는 글리신에 작동가능하게 연결되거나; (b)안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-UUA-3'이고 TAA 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 글루타민 또는 글루타메이트에 작동가능하게 연결되거나; 또는 (c) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-CUA-3'이고 TAG 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 트립토판, 글루타메이트 또는 글루타민에 작동가능하게 연결된다.

Description

ACE-tRNA에 의한 유전자 재지정을 통해 정지 코돈을 구조하는 방법
본 발명의 우선권
본 출원은 2017년 11월 2일에 출원한 미국 가출원 번호 62/580,887 및 2018년 6월 19일에 출원한 미국 가출원 번호 62/687,015를 우선권으로 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
연방정부 후원 연구에 대한 진술
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 R01 GM106569하에 정부 지원이 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
DNA 분자는 DNA 중합체를 구성하는 뉴클레오티드 염기 서열의 형태로 유전자 정보를 보유한다. DNA에는 4가지 뉴클레오티드 염기만이 사용된다: 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민. 이 정보는 3개의 연속한 염기의 코돈 형태로 메신저 RNA (mRNA)로 전사된 다음, 전달 RNA (tRNA) 및 리보솜에 의해 번역되어, 단백질을 형성한다. RNA에는 4가지 뉴클레오티드 염기가 사용된다: 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실. 유전자 코드는 삼중 코돈과 특정 아미노산 사이의 관계이다. 64가지의 가능한 삼중 코돈이 유전자 코드를 형성하고, 여기서 3가지 정지 (종결로도 지칭됨) 코돈은 번역 기구 (세포 리보솜)에 신호를 보내어 특정 코돈에서 단백질 생성을 정지시킨다. 이 코드에서 다른 61가지 삼중 코돈은 20가지 표준 아미노산 중 하나에 상응한다. 도 1을 참고한다.
DNA는 리보솜에 의해 번역되어, DNA에 의해 특이적으로 제공된 유전자 지시에 따라 각각의 아미노산이 하나씩 함께 연결되어 폴리펩티드를 형성한다. 리보솜이 정지 코돈에 도달하면, 단백질의 신장이 종결된다. 3가지 정지 코돈은 UAG (앰버), UAA (오커) 및 UGA (오팔)이다. 아미노산-코딩 코돈을 정지 코돈으로 변화시키는 돌연변이는 "넌센스 돌연변이"로 지칭된다. 이들 넌센스 돌연변이는 폴리펩티드 서열의 유의한 말단절단/단축을 일으킬 수 있고, 유전자 표현형에서 엄청난 변화를 초래할 수 있다. 따라서, 발현을 지시하는 유전자가 존재할 수 있음에도 불구하고, 리보솜이 돌연변이성 정지 신호에 도달하면 그것이 번역을 종결시켜 미완성 단백질을 생성할 수 있기 때문에, 결정적인 단백질이 생성되지 않을 수 있다.
전달 RNA는 리보솜 상에서 mRNA를 단백질로 번역한다. 각각의 tRNA는 mRNA 상의 상보성 코돈과 혼성화하는 "안티-코돈" 영역을 함유한다. 그의 지정된 아미노산을 보유하는 tRNA는 "충전된" tRNA로 지칭된다. tRNA가 61가지 아미노산-연관된 (즉, 정지 신호와 연관되지 않은) tRNA 중 하나인 경우, 이는 일반적으로 그의 아미노산을 성장중인 펩티드에 부착시킬 것이다. tRNA의 구조적 유전자는 약 72-90개 뉴클레오티드 길이이고, 클로버형 구조체로 폴딩된다. tRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되고, 성숙한 tRNA 코딩 서열의 일부분이 되는 그들 자신의 유전자내 분열 프로모터를 함유한다 (Sharp S. J., Schaack J., Coolen L., Burke D. J. and Soll D., "Structure and transcription of eukaryotic tRNA genes", Crit. Rev. Biochem, 19:107-144 (1985); Geiduschek E. O., and Tocchini-Valentini, "Transcription by RNA polymerase III, Annu. Rev. Biochem. 57:873-914 (1988)).
"넌센스 저해자"는 변경된 안티코돈을 함유하는 tRNA 유전자의 대립유전자이며, "정지" 신호를 촉발시키는 대신에, 이들이 종결 코돈에 대한 반응으로 아미노산을 삽입한다. 예를 들어, 오커 돌연변이는 mRNA에서 UAA 코돈의 생성을 일으킨다. 오커 저해자 유전자는 UAA 부위에 아미노산을 삽입하는 AUU 안티코돈을 갖는 tRNA를 생성하며, 일반적으로 번역의 정지를 촉발시키는 코돈의 존재에도 불구하고 mRNA의 계속된 번역을 허용한다.
수많은 넌센스 저해자 tRNA 대립유전자가 원핵생물 및 진핵생물, 예컨대 효모 및 씨. 엘레간스(C. elegans)에서 확인되었다. 상이한 저해자 tRNA는 그들의 저해 효율이 상이하다. 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 시스템에서, 앰버 저해자는 비교적 더 효율적이고, 오커 저해자는 덜 효율적인 반면에, 오팔은 가장 적게 효율적이며, 이는 앰버 코돈이 단백질 합성을 종결시키는데 드물게 사용되는 반면에, 오커 및 오팔 코돈이 천연 종결 신호로서 더욱 빈번하게 사용됨을 시사한다.
DNA 청사진에서 원치않는 오류는 질환을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 청사진의 마지막에서가 아니라 단백질의 중간에서 예상치 못한 "정지" 신호의 발생은, 변경된 기능을 갖거나 기능을 전혀 갖지 않는, 말단절단되거나 단축된 단백질의 생성을 일으킨다. 여러 인간 질환, 예컨대 낭성 섬유증, 근이영양증, β-지중해 빈혈 및 리들(Liddle) 증후군은 각각 적절한 폐, 혈액, 근육 또는 신장 기능에서 중요한 단백질에 대한 DNA 리딩 프레임에서의 원치않는 정지 신호에 의해 발생한다.
따라서, 상응하는 비변형된 넌센스 저해자 tRNA와 비교하여 안정화된 신규한 변형된 넌센스 저해자 tRNA, 및 낭성 섬유증과 연관된 유전자의 종결을 저해하기 위해 증가된 활성을 갖는 넌센스 저해자 tRNA를 제공하는 것이 요구되고 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 T-아암, D-아암, 안티코돈 아암 및 수용자 아암을 포함하는 변형된 전달 RNA (tRNA)를 제공하며, T-아암은 신장 인자 1-알파 1 (EF1알파)과 상호작용하는 뉴클레오티드를 갖는 T-스템을 포함한다. EF1알파는 아미노아실-tRNA를 리보솜에 동원하고, tRNA가 탈아실화되는 것을 방지한다. 합리적인 뉴클레오티드 교체는 조정된 tRNA를 생성한다: 리보솜으로 tRNA의 전달 및 탈아실화로부터의 보호를 증강시키는 EF1α 상호작용.
특정 실시양태에서, 본 발명은 티미딘이 우라실로 교체된 것인, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55의 변형된 전달 RNA (tRNA)를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 티미딘이 우라실로 교체된 것인, 서열식별번호: 1-538 중 어느 하나의 변형된 전달 RNA (tRNA)를 제공한다.
특정 실시양태에서, 변형된 tRNA는 서열식별번호: 56-60, 62-66, 84-86, 90-111, 113, 128-143, 147-149, 153-156, 161-174, 176, 178, 181, 184-186, 192, 196-197, 199-201, 205, 213-240, 246, 255-256, 258-285, 299, 305-312, 314, 318-332, 335-344, 346, 350-354, 357-360, 362, 365-370, 372-383, 388-390, 392, 394-401, 403-407, 414-416, 418, 422, 425, 428-433, 437, 444-445, 452, 455, 459-463, 470, 472-474, 476, 487-492, 525, 530-539, 545-550, 553-555, 561-563 및 567-579 중 어느 하나이고, 티미딘이 우라실로 교체된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 T-스템, D-스템, 안티코돈-루프 및 수용자 스템을 포함하는 변형된 전달 RNA (tRNA)를 제공하며, (a) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-UCA-3'이고 TGA 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 아르기닌, 트립토판 또는 글리신에 작동가능하게 연결되거나; (b) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-UUA-3'이고 TAA 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 글루타민 또는 글루타메이트에 작동가능하게 연결되거나; 또는 (c) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-CUA-3'이고 TAG 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 트립토판, 글루타메이트 또는 글루타민에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, T-아암은 EF1α와의 상호작용을 조정하는 합리적으로 변경된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이는 그의 저해 활성을 증강시키고, 이로써 그의 치료 능력을 증가시킨다. EF1알파와의 상호작용이 조정된 tRNA는 증강된 넌센스 저해를 갖고, 증강된 치료 성질을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 변형된 tRNA를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열을 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 150개 뉴클레오티드 미만의 총 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 제1 올리고뉴클레오티드 서열 및 제2 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 기재된 변형된 tRNA를 독립적으로 코딩하고, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 독립적으로 150개 뉴클레오티드 미만의 총 길이를 갖고, 2개의 서열이 나란히 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 프로모터, 및 본원에 기재된 변형된 tRNA 또는 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 또는 플라스미드 벡터이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 변형된 tRNA, 올리고뉴클레오티드 또는 벡터, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 담체는 리포좀이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명은 상기 기재된 변형된 tRNA 조성물을 정지-코돈-연관된 유전 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 정지-코돈-연관된 유전 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 조기 정지 코돈과 연관된 유전 질환은 낭성 섬유증, 근이영양증, β-지중해 빈혈 또는 리들 증후군이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 조성물을 세포에 도입시키는 것을 포함하는, 세포에서 넌센스 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열로의 번역을 복원시키는 방법을 제공한다
특정 실시양태에서, 본 발명은 NanoLuc를 비롯한 루시페라제 효소에서 넌센스 코돈의 저해를 이용하는 고처리량 클로닝 및 스크리닝에 의해 안티-코돈 편집된 (ACE) tRNA를 확인하는 방법을 제공한다.
도 1. 유전자 코드의 표.
도 2. tRNA는 T-아암, D-아암, 안티코돈-아암 및 수용자 아암을 포함하는 일반적인 4-아암 구조체를 갖는다. 이들 아암은 전체적으로 '루프'로도 지칭된다.
도 3. 넌센스 저해에 대한 ACE-tRNA (에이치. 사피엔스(H. sapiens) tRNATrp TGA ).
도 4. 기능성 ACE tRNA 서열을 확인하기 위해 사용되는 벡터에서 코딩된 안티-코돈 편집된 (ACE)-tRNA. 이 벡터 서열은 나노루시페라제 리포터 시스템을 포함한다. 도시된 벡터를 사용하여 TGA 저해에 의해 ACE tRNA를 확인하였다. TAA 및 TAG 변이체는 적절한 tRNA 스크리닝을 위해 사용되었다 (도 14 내지 17 참고).
도 5. 저해자 tRNA를 통해 정지 코돈을 갖는 단백질 및 이온 채널을 구조하는 개략도.
도 6a 및 6b. 인간 ACE-tRNA를 갖는 넌센스 코돈 구조. 도 6a. 안티-코돈 편집된 (ACE) Trp tRNA 및 cherry-TGA-eGFP-HA 구축물의 개략도. 도 6b. ACE 트립토판 tRNA #4에 의한 cherry TGA eGFP-HA 구축물의 구조.
도 7. 인간 질환에서 관찰된 넌센스 코돈 근거 및 유병률. 20가지 천연 아미노산 코돈을 인간 질환에 대한 그들의 기여에 따라 순위를 매겼고, 어두운 망상선 코돈은 가장 많은 유병률 (TGG, TAC, TAT, TCA, 및 TTA)이고, 반점 코돈은 가장 낮은 유병률이다. 모든 망상선 코돈 서열은 의도된 아미노산으로부터 정지 코돈으로 전환시키기 위해 단일 뉴클레오티드 돌연변이를 필요로 한다. 우측 패널, 낭성 섬유증 막경유 전도도 조절인자 (CFTR) 내에서 질환의 원인이 되는 가장 흔한 넌센스 코돈. 여기서, 신규한 tRNA 서열이 지정된 돌연변이의 복구를 위해 발견되었다.
도 8. 트립토판-TGA 및 글리신-TGA의 복구를 위한 tRNA 서열의 확인. 좌측 축은 루시페라제 활성에 대한 백그라운드보다 높은 배수를 나타낸다. 돌연변이성 안티-코돈 루프를 갖는 대부분의 tRNA는 구조 활성이 결여되어 있다.
도 9. Trpchr17.trna39 및 Glychr19.trna2 ACE-tRNA에 의한 CFTR 1282x 구조. 지정된 tRNA를 갖는 HEK 세포에서 공동 발현된 CFTR W1282X 채널의 생화학적 웨스턴 블롯 데이터. 지정된 tRNA의 4개 카피를 함유하는 발현 벡터는 CFTR 단백질의 보다 높은 구조를 나타낸다. "C" 밴드는 완전히 성숙한 글리코실화된 CFTR 단백질을 구조하는 것을 나타낸다. 사용된 항체는 1:1000 희석으로 시스틱 피브로시스 테라퓨틱스(Cystic Fibrosis Therapeutics)로부터의 M3A7이었다.
도 10a 및 10b. ACE-tRNATrp 및 ACE-tRNAGly의 발현은 넌센스 코돈으로 동족 아미노산의 특이적 도입을 일으킨다. 도 10a) 모델 단백질 히스티디놀 데히드로게나제 (HDH)-His-Strep N94-TGA 및 ACE-tRNATrp (좌측) 및 ACE-tRNAGly (우측)의 공동-발현은 친화도 정제 이후 은 염색에 의해 검출가능한 전장 HDH 단백질 (별표)을 생성한다. 도 10b) WT HDH (상부), HDH-N94 + ACE-tRNAGly (중간), 및 HDH-N94 + ACE-tRNATrp (하부)의 스펙트럼. 스펙트럼은 글리신 (-57Da) 및 트립토판 (+72Da)과 특이적으로 매칭하는 위치 N94에서의 아미노산 질량 차이를 강조하며, 이는 ACE-tRNA 동족 아미노산의 삽입을 나타낸다.
도 11. tRNA 라이브러리의 구축을 위한 클로닝 워크플로우.
도 12a-12b. t-스템 영역 내의 뉴클레오티드의 표적화된 돌연변이는 ACE-tRNA 구조 기능을 추가로 증강시킨다. 도 12a. Trpchr17.tRNA 39는 t-스템 영역 내에서 체계적으로 돌연변이를 일으켰다. 이러한 노력으로 ACE tRNA TS-10 52-62 G-C가 확인되었고 (도 12b), 플롯에서의 망상선 막대는 ~250% 증가된 생물학적 활성을 나타낸다.
도 13a-13f. ACE-tRNA는 넌센스 코돈에 대해 선택적이고, 아미노글리코시드 넌센스 저해에 비해 더욱 효율적이다. 도 13a) ACE-tRNATrp#5 및 도 13b) ACE-tRNAGly#16을 TGA, TAA 또는 TAG 넌센스 코돈을 함유하는 NanoLuc 리포터 플라스미드에 클로닝하였다. 형질감염 이후에 NanoLuc-TGA 구축물에서만 넌센스 저해를 측정하였다. 도 13c & 도 13d) 겐티마이신 (40uM) 및 G418 (150uM)의 첨가 및 ACE-tRNATrp#5 및 ACE-tRNAGly#16과의 공동 형질감염에 의한 NanoLuc-TGA의 저해를 HEK293 세포에서 도 13c) 24 시간 및 도 13d) 48 시간째에 측정하였다. 도 13e & 도 13f) NanoLuc-TGA를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 겐티마이신 (40uM) 및 G418 (150uM)로 처리하고, ACE-tRNATrp#5 및 ACE-tRNAGly#16에 의해 형질감염시켰다. 처리후 도 13e) 24 시간 및 도 13f) 48 시간째에 넌센스 저해를 측정하였다.
도 14. ACE-tRNA-Arg-TGA. 아르기닌-TGA 넌센스 코돈의 복구를 위한 ACE-tRNA의 확인.
도 15. ACE-tRNA-Gln TAG. 글루타민 TAG 넌센스 코돈의 복구를 위한 ACE-tRNA의 확인.
도 16. ACE-tRNA-Gln TAA. 글루타민 TAA 넌센스 코돈의 복구를 위한 ACE-tRNA의 확인.
도 17. ACE-tRNA-Glu TAG. 글루타메이트-TAG 넌센스 코돈의 복구를 위한 ACE-tRNA의 확인.
도 18. ACE-tRNA-Gln TAA. 글루타메이트 TAA 넌센스 코돈의 복구를 위한 ACE-tRNA의 확인.
도 19. ACE-tRNA-Trp TAG. 트립토판 TAG 넌센스 코돈의 복구를 위한 ACE tRNA의 확인.
도 20a - 20d. 소형 RNA로서 ACE-tRNA의 전달은 G542X 및 W1282X 넌센스 돌연변이의 강력한 저해를 뒷받침한다. 도 20a) G542X 또는 W1282X 낭성 섬유증 유발 넌센스 돌연변이를 갖는 CFTR cRNA를 각각 사전 폴딩된 ACE-tRNAGly 및 ACE-tRNATrp의 계열 희석액과 함께 크세노푸스(Xenopus) 난모세포에 공동 주사하였다. CFTR Cl- 전류의 2-전극 전압-클램프 기록을 36 시간 후에 수행하였다. 전류-전압 관계는, 도 20b) ACE-tRNATrp 및 도 20c) ACE-tRNAGly 사전 폴딩된 RNA의 양이 증가함에 따라 ACE-tRNAGly 실험에서 달성된 WT CFTR에 비해 CFTR 기능 (측정된 CFTR Cl- 전류)을 증가시킴을 나타낸다. 도 20d) G542X ACE-tRNAGly (채워진 원) 및 W1282X ACE-tRNATrp (개방된 사각형) 구조의 용량 반응 (+40mV에서 유도된 CFTR Cl- 전류는 +40mV에서의 WT CFTR Cl- 전류에 대해 정규화되었음). ACE-tRNAGly (EC50= ~20ng; 힐 상수 ~1.4)의 용량 의존성은 WT CFTR 수준에서 명백한 포화를 나타낸 반면에, ACE-tRNATrp는 우측으로 이동되어 있다 (EC50= ~94ng; 힐 상수 1.24).
도 21a-21b. 후보 안티코돈 편집된 tRNA (ACE-tRNA)를 확인하기 위한 넌센스 돌연변이 저해 스크리닝. 도 21a, 개략도는 ACE-tRNA와 번역 기구의 필요한 상호작용을 도시한다. 전달 후에, ACE-tRNA는 내인성 아미노아실-tRNA 신테타제에 의해 인식되고, 그들의 동족 아미노산으로 충전된다 (아미노아실화된다). 아미노아실화된 ACE-tRNA는 내인성 신장 인자 1-알파에 의해 인식되고, 이는 ACE-tRNA가 탈아실화되는 것을 방지하고, 조기 종결 코돈, 이 예에서는 UGA의 저해를 위해 아미노아실 ACE-tRNA를 리보솜에 전달한다. 도 21b, CcdB 음성 선택과 함께 골든 게이트(Golden Gate)를 이용하여 개별 ACE-tRNA를 고처리량 클로닝 넌센스 리포터 플라스미드에 클로닝하였다. 올인원(all-in-one) 플라스미드는 효소적 큰 비트와 필요한 C-말단 작은 비트 사이의 p.162에 UGA, UAG 또는 UAA PTC를 갖는 NLuc 루시페라제 리포터를 함유한다.
도 22 고처리량 클로닝 넌센스 돌연변이 리포터 플랫폼에 의한 ACE-tRNA 유전자 패밀리의 스크리닝. 지정된 안티코돈 편집된 PTC 서열을 내인성 안티코돈 서열로부터 하나의 뉴클레오티드인 각각의 ACE-tRNA 패밀리에 대해 시험하였다 (도 25). 다중 고성능 저해자 tRNA가 각각의 부류에 대해 확인되었다. 데이터는 정규화된 NLuc 발광의 측면에서 Log10 규모로 도시된다. 각각의 tRNA 데이터세트를 3회 수득하였고, 표 2에서 상응하는 ANOVA 통계 분석에 의해 SEM으로 나타낸다. 코딩된 개체 및 상응하는 tRNA 서열은 각각 도 26 및 표 9에 도시된다.
도 23a-23c 조작된 tRNA에 의한 동족 코딩 및 고충실도 저해. 도 23a, 히스티디놀 데히드로게나제 (HDH)의 트립신 분해 단편이며, 여기서 "X"는 저해된 PTC 코돈을 나타낸다. WT (상부), N94G (중간) 및 N94W (하부) HDH에 대해 지정된 y 및 b 이온의 질량과 함께 트립신 분해 단편의 MS/MS 스펙트럼. b9 이온 질량은 WT 아스파라긴으로부터 -57 Da 및 +72 Da의 예상된 질량만큼 이동되며, 이는 각각 ACE-tRNAGly 및 ACE-tRNATrp에 의한 동족 아미노산 글리신 및 트립토판의 코딩을 나타낸다. 도 23b, ACE-TGA - tRNAGly (Glychr19.t2)는 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 UGA 정지 코돈을 선택적으로 저해한다. 도 23c) ACE-tRNAGly 형질감염은 NLuc-UGA를 안정하게 발현하는 Hek293 세포에서 48 시간 인큐베이션 후에 겐타마이신 (40uM) 및 G418 (140uM) 둘 다를 능가한다.
도 24a-24b. 전사체-전체 3'UTR 상에서 ACE-tRNA의 리보솜 프로파일링. 도 24a, 3'UTR 상에서 리보솜 풋프린트 밀도를 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 처리된 세포 대 대조군 (puc57GG 빈 벡터)의 판독치에 대한 log2-배수 변화로서 플롯팅한다. 전사체를 그들의 내인성 TAA, TAG 및 TGA 정지 코돈에 따라 그룹화하였다. 각각의 점은 전사체에 대한 2회 반복의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 log2-배수 변화의 평균 ± SD를 나타낸다. 도 24b, 정규화된 리보솜 풋프린트 점유의 평균 log2-배수 변화를 전사체 (18,101 서열)의 정지 코돈을 둘러싸는 -50에서 +50 nt까지의 각각의 뉴클레오티드에 대해 플롯팅하였다. 그림은 리보솜 풋프린트의 5' 말단에서부터 리보솜 A-부위에서의 정지 코돈의 첫번째 염기 위치까지 ~15 nt 오프셋을 도시한다.
도 25. 일반적인 PTC에 대한 코돈 사용. 망상선은 뉴클레오티드 치환을 통해 정지 코돈으로 전환될 수 있는 가장 일반적인 코돈 및 상응하는 아미노산 유형을 나타낸다. 조작된 tRNA는 각각의 유형에 대해 개발되었다.
도 26. 숫자로 나타낸 ACE-tRNA 활성 플롯.
도 27. 글리신 tRNA 서열의 정렬. 21개의 tRNAGly 인간 서열은 tRNA 클레이드 사이에서 높은 서열 상동성을 입증한다. tRNA 영상에서의 패턴은 서열에서 패턴화된 박스에 상응한다.
도 28. 나노루시페라제에서 p.162에서의 측쇄 동일성은 활성에 영향을 미치지 않는다. 총 발광 활성을 부위마다 각각의 돌연변이에 대해 나타낸다.
도 29a-29c. 다중 종으로부터의 ACE-tRNATrp 서열 및 저해자 tRNA 돌연변이의 분석. 도 29a-29b. 서열 정렬. 도 29c. NLuc-UGA + ACE-tRNATrp/NLuc-UGA.
도 30a-30C. 히스티디놀 데히드로게나제 (HDH) His(8)-스트렙탁틴 발현 구축물은 HEK293 세포로부터 단백질의 효율적인 1-단계 단리를 가능하게 한다. 도 30a) HDH 발현 구축물의 단백질 서열. 밑줄 친 서열은 질량 분광법에 의한 범위를 나타낸다. 볼드체의 밑줄 친 아스파라긴 (아미노산 위치 94)은 ACE-tRNA 충실도를 결정하기 위해 TGA PTC에 돌연변이된 잔기이다. 이중 친화도 태그는 볼드체 이탤릭체로 나타낸다. 도 30b) Trpchr17.trna39 및 도 30c) Glychr19.trna2에 의해 PTC 저해 이후 HDH 단백질의 은 염색.
도 31. ACE-tRNATrp에 대해 정지 코돈 특이성이 유지된다. tRNA TrpTGA Trpchr17.trna39에 대한 저해 활성 36, 상부는 TrpTGA 저해자 tRNA에 대해 수행함, 도 22. 이 tRNA는 지정된 pNano-STOP 플라스미드와 공동 발현되었다.
도 32a-32d. ACE-tRNA는 아미노글리코시드 PTC 저해에 비해 더욱 효율적이다. 겐타마이신 (40uM), G418 (150uM)의 첨가, 및 PTC 리포터 Nluc-UGA를 안정하게 발현하는 HEK293 세포에서 Trpchr17.trna39 및 Glychr19.trna2에 의한 형질감염 24 시간 후에 측정된 도 32a) 미가공 및 도 32b) 정규화된 발광. 겐타마이신 (40uM), G418 (150uM)의 첨가, 및 HEK293 세포에서 Trpchr17.trna39 및 Glychr19.trna2에 의한 공동 형질감염 24 시간 후에 측정된 도 32c) 미가공 및 도 32d) 정규화된 발광.
도 33. RNA 또는 cDNA로서 전달 후에 ACE-tRNA 활성의 시간 경과에 따른 비교. ACE-tRNA가 pNanoLuc-UGA를 안정하게 발현하는 HEK293 세포에 전달되었지만, 세포 생존력에 대한 형질감염 시약의 효과를 감소시키기 위해 단지 5μl의 반응 혼합물만이 세포에 첨가되었다. RNA로서 전달된 ACE-tRNA (개방된 기호)는 cDNA 구축물 (폐쇄된 원)에 비해 PTC 리포터의 발현을 구조하는데 더욱 신속하였다. 그러나, ACE-tRNA 활성은 cDNA로부터 발현된 경우 48 시간에 걸쳐 계속 상승하였고, RNA로서 전달가능한 경우에는 감소하였다.
수년에 걸쳐, 연구자들은 인간 유전자에서 정립된 넌센스 코돈을 초래하는 수백개의 독특한 점 돌연변이를 확인하였다. 이들 유형의 돌연변이는 예를 들어 근이영양증, 색소성 건피증, 낭성 섬유증, 혈우병, 빈혈, 갑상선 기능 저하증, p53 편평상피 세포 암종, p53 간세포 암종, p53 난소 암종, 식도 암종, 골암종, 난소 암종, 식도 암종, 간세포 암종, 유방암, 간세포 암종, 섬유 조직구종, 난소 암종, SRY 성 전환, 3탄당 인산염 아이소머라제-빈혈, 당뇨병 및 구루병을 초래한다. 유방암과 연관된 BRACA-1 및 BRACA-2 유전자 또한 유사한 돌연변이를 갖는다.
수백개의 인간 tRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진뱅크(Genbank)와 같은 공급원을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고 일반적으로 이용가능하다. tRNA의 구조체는 고도로 보존되고, tRNA는 종종 종에 따라 기능적이다. 따라서, 박테리아 또는 다른 진핵생물 tRNA 서열은 또한 본 발명의 안정화된 tRNA에 대한 올리고뉴클레오티드를 위한 잠재적인 공급원이다. 특정 tRNA 서열이 원하는 포유동물 세포에서 기능적인지 여부의 결정은 일반적인 실험을 통해 확인될 수 있다. 추가로, 아직 알려지지 않은 추가의 잠재적인 tRNA 서열은 일반적인 실험을 통해 안정화되기 위해 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
tRNA 유전자는 모든 세포 유형에서 활성인 강력한 프로모터를 갖는다. 진핵생물 tRNA 유전자에 대한 프로모터는 tRNA 분자 자체를 코딩하는 구조적 서열 내에 함유된다. 5' 상류 영역 내에서 전사 활성을 조절하는 요소가 있지만, 활성 전사 단위의 길이는 500개 염기 쌍보다 훨씬 적을 수 있고, 따라서 전달 벡터 내에 수용하는 것이 간단하다. 이들이 전사되고 가공된 후에, tRNA는 낮은 분해 속도를 갖는다. 마지막으로, 넌센스 저해자에 의한 유전자 요법은 넌센스 코돈을 함유하는 표적 유전자에 걸쳐 내인성 생리학적 제어를 유지한다.
넌센스 돌연변이
전달 RNA (tRNA)는 메신저 RNA (mRNA) 서열을 단백질로 디코딩하는 기능을 갖는 RNA 분자의 유형이다. tRNA는 번역하는 동안 리보솜의 특이적 부위에서 기능하며, mRNA 분자로부터 단백질을 합성한다. 조기 종결 코돈 (PTC)으로도 불리는 넌센스 돌연변이는 인간 질환을 유발하는 단일 염기 쌍 돌연변이의 ~10-15%를 차지하고, 낭성 섬유증이 이를 따른다. (Peltz et al., Annu Rev Med., 64:407-25, 2013). 일반적으로, 넌센스 돌연변이는 유전자 발현 및 활성의 거의 완전한 상실 및 말단절단된 생성물의 우세한 부정적인 영향의 가능성으로 인해 미스센스 돌연변이에 비해 더욱 심각한 결과를 갖는다. PTC는 넌센스 매개된 붕괴 (NMD) 경로를 통해 조기 번역 종결 및 가속된 mRNA 전사체 붕괴를 일으킨다.
현행 연구는 tRNA가 그의 아미노산을 전달하는 RNA 전사체 내의 특정한 부위가 tRNA 내의 안티-코돈 서열의 분자 편집을 통해 변화될 수 있음을 보여준다. 이 접근법은 조기 종결 코돈 (PTC)이 원래의 상실된 아미노산으로 효과적이고 치료적으로 되돌아 갈 수 있게 한다. 안티코돈-편집된 tRNA (ACE-tRNA)는 새로운 부류의 생물학적 치료제를 형성한다.
조작된 tRNA는 질환-유발 넌센스 코돈을 특이적 아미노산으로 "재편집"하는 것을 가능하게 한다. 이들 조작된 tRNA는 단지 1가지 유형의 정지 코돈, 예컨대 TAC 또는 TAA에 비해 TGA만을 표적화한다. tRNA + 프로모터가 단지 ~300 bp이기 때문에, 이들 tRNA 분자의 작은 크기는 이들이 즉시 발현될 수 있게 한다. 간략히, 인간 세포에서 기능성인 tRNA 유전자의 구조적 성분을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 이 올리고뉴클레오티드의 서열은 tRNA의 안티코돈 영역에서 치환을 갖는 공지된 서열을 기반으로 하여 설계되어, 특이적 tRNA가 넌센스 또는 다른 특이적 돌연변이를 인식하게 한다.
리보솜과의 상호작용을 통해 넌센스 정지 코돈을 저해하기 위해 여러 소분자 스크리닝이 수행되었고, 가장 뛰어난 분자는 G418, 겐타마이신 및 PTC124이다. PTC124 또는 아탈루렌은 최근에 낭성 섬유증 치료제로서 사용하기 위해 3상 임상 시험으로부터 드러나게 되었다. 아탈루렌 및 아미노글리코시드는 넌센스 돌연변이를 미스센스 돌연변이로 전환시키는 근처의 동족 아미노산을 넣음으로써 3개의 각각의 넌센스 코돈의 판독을 촉진시킨다. (Roy et al., PNAS 2016 Nov 1;113(44):12508-12513)
안티코돈-편집된 tRNA (ACE-tRNA)
tRNA는 T-아암, D-아암, 안티코돈-아암 및 수용자 아암을 포함하는 일반적인 4-아암 구조를 갖는다 (도 2).
T-아암은 "T-스템" 및 "TΨC 루프"로 구성된다. 특정 실시양태에서, tRNA의 안정성을 증가시키기 위해 T-스템을 변형시킨다. 특정 실시양태에서, ACE-tRNA는 내인성 T-스템 서열에 비해 정지 부위를 저해하기 위해 생물학적 활성을 증가시키는 변형된 T-스템을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 안정화된 tRNA를 포함하는 조성물을 포함하며, 이는 매우 다양한 넌센스 돌연변이-연관된 질환을 치료하기 위해 보다 높은 효과로 사용될 수 있다. 표 1-8에서 하기 서열은 DNA로 기재되지만, RNA (전사된 DNA)로서는 "T : 티미딘"이 "U : 우라실"이다. 따라서, 하기 서열로부터 전사된 tRNA는 모두 티미딘 대신에 우라실을 함유한다.
특정 실시양태에서, tRNA는 하기 서열을 갖는다 (티미딘이 우라실로 교체됨):
Figure pct00001
표 1
Figure pct00002
표 2
Figure pct00003
표 3
Figure pct00004
표 4
Figure pct00005
표 5
Figure pct00006
표 6
Figure pct00007
표 7
Figure pct00008
표 8
Figure pct00009
한 실시양태에서, 넌센스 저해에 대한 ACE-tRNA가 도 3에 도시된다 (에이치. 사피엔스 tRNATrp TGA ).
본 발명에 따라, 인간 UAA, UAG 및 UGA 저해자 tRNA가 설계되었다. 스크리닝에 의해 Trp-TGA, Trp-TAG, Arg-TGA, Gln-TAG, Gln-TA, Glu-TAG, Glu-TAA의 복구를 위한 코돈 편집된 tRNA가 확인되었다. tRNA는 대략 100개 뉴클레오티드 길이이고, 세포에 도입되어 넌센스 코돈 돌연변이를 저해할 수 있으며, 야생형 아미노산이 존재해야 한다. 올리고뉴클레오티드는 수용자 세포에 직접적으로 도입될 수 있거나 또는 나란히 라이게이션되어 올리고뉴클레오티드의 효능을 증가시시킬 수 있다.
발현 카세트 및 벡터
특정 실시양태에서, ACT-tRNA는 발현 카세트에 의해 코딩된다. 여전히 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 저해자 tRNA는 표준의 통상적인 유전자 조작 기술을 이용하여 벡터의 사용을 통해 세포에 도입될 수 있다. tRNA 코딩 서열의 내부 프로모터 서열로 인해, tRNA 서열은 별도의 전사 단위에 포함될 필요가 없지만, 하나가 제공될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 발현 시스템은 적절한 유전자 전달 비히클 내에 포함되고, 이를 이용하여 저해자 tRNA를 발현하도록 세포를 형질도입시킨다. 유전자 전달 비히클은 관련 기술분야에 공지된 임의의 전달 비히클일 수 있고, 수용체 및/또는 지질 매개된 형질감염을 용이하게 하는 네이키드 DNA, 뿐만 아니라 임의의 수많은 벡터를 포함할 수 있다. 이러한 벡터에는 진핵생물 벡터, 원핵생물 벡터 (예를 들어, 박테리아 벡터) 및 바이러스 벡터, 예컨대 비제한적으로 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 (인간 및 기타, 예컨대 돼지), 헤르페스 바이러스 벡터, 엡스타인-바르 바이러스 벡터, SV40 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 및 위형(pseudotyped) 바이러스 벡터가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, ACT-tRNA (PTC)는 벡터에서 코딩된다. 도 4. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다. 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터에는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스로부터 유래된 벡터가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
레트로바이러스; 레트로바이러스 벡터
용어 "레트로바이러스"는 그들의 복제 주기 동안에 역전사효소를 이용하는 RNA 바이러스를 지칭하기 위해 사용된다. 레트로바이러스 게놈 RNA는 역전사효소에 의해 이중 가닥 DNA로 전환된다. 바이러스의 이러한 이중 가닥 DNA 형태는 감염된 세포의 염색체에 통합될 수 있고; 통합되면, 이는 "프로바이러스"로 지칭된다. 프로바이러스는 RNA 폴리머라제 II를 위한 주형으로서 작용하고, 새로운 바이러스 입자를 생성하기 위해 필요한 구조적 단백질 및 효소를 코딩하는 RNA 분자의 발현을 지시한다. 프로바이러스의 각각의 말단에는 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR"이라 불리는 구조체가 있다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호, 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합을 위해 필요한 서열 비롯한 수많은 조절 신호를 함유한다. 레트로바이러스과에 포함되는 몇몇 속, 예컨대 시스테나바이러스 A, 온코바이러스 A, 온코바이러스 B, 온코바이러스 C, 온코바이러스 D, 렌티바이러스, 및 스푸마바이러스가 있다. 일부 레트로바이러스는 종양원성 (즉, 종양형성성)인 반면에, 다른 것들은 아니다. 온코바이러스는 민감성 종에서 육종, 백혈병, 림프종, 및 유방 암종을 유도한다. 레트로바이러스는 매우 다양한 종을 감염시키고, 수평적으로 및 수직적으로 모두 전염시킬 수 있다. 이들은 숙주 DNA에 통합되고, 숙주 DNA의 서열을 세포에서 세포로 전염시킬 수 있다. 이는 유전자 요법을 비롯한 다양한 목적을 위해 벡터로서 레트로바이러스의 개발을 유도하였다.
인간 거품형 바이러스 (HFV) 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)를 비롯한 레트로바이러스는, 그들의 표적 세포가 분열하는 세포에 국한되지 않고, 그들의 제한된 숙주 세포 트로피즘이 수포성 구내염 바이러스 G (VSV-G) 외피 당단백질에 의한 위형화를 통해 용이하게 확장될 수 있기 때문에, 최근에 큰 관심을 받았다 (예를 들어, [J. C. Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037 [1993]; A. M. L. Lever, Gene Therapy. 3:470-471 [1996]; 및 D. Russell and A. D. Miller, J. Virol., 70:217-222 [1996]] 참고).
벡터 시스템은 일반적으로 작은 분량의 레트로바이러스 서열 (바이러스 긴 말단 반복부 또는 "LTR" 및 패키징 또는 "psi" 신호) 및 패키징 세포주를 함유하는 DNA 벡터를 갖는다. 전달될 유전자는 DNA 벡터에 삽입된다. DNA 벡터에 존재하는 바이러스 서열은 벡터 RNA를 바이러스 입자에 삽입 또는 패키징하기 위해 및 삽입된 유전자를 발현시키기 위해 필요한 신호를 제공한다. 패키징 세포주는 입자 조립에 필요한 바이러스 단백질을 제공한다 (D. Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 [1988]). 본 발명의 한 실시양태에서, 293T 세포에서 3-플라스미드 형질감염 생성 방법을 이용하는 FIV 시스템이 사용되었다 (Johnston et al., J Virol. 1999 73:4991-5000). 복제 불능성 바이러스가 성공적으로 생성되었다.
벡터 DNA를 임의의 다양한 기술 (예를 들어, 인산칼슘 공침법, 리포펙션, 전기천공)에 의해 패키징 세포에 도입시킨다. 패키징 세포에 의해 생성된 바이러스 단백질은 RNA의 형태로 벡터 서열이 바이러스 입자에 삽입되는 것을 매개하고, 이를 배양 상청액에 흘려 보낸다.
자연적으로 분열하거나 또는 성장 인자에 의해 분열하도록 자극된 세포의 경우에는, 단순 레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 벡터가 적합한 전달 시스템이다. 그러나, 유전자 전달에서 일반적으로 사용되는 여러 레트로바이러스 벡터의 사용에서의 주요 제한은, 여러 벡터가 분열 세포에 국한된다는 것이다. 비분열 세포가 표적 세포인 경우에는, 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스가 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렌티바이러스"는 서서히 발생하는 질환을 일으키는 레트로바이러스의 그룹 (또는 속)을 지칭한다. 이 그룹에 포함되는 바이러스에는 HIV (인간 면역결핍 바이러스; 예컨대 HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2), 인간 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)의 병인체; 양에서 뇌염 (비스나) 또는 폐렴 (마에디)을 유발하는 비스나-마에디(visna-maedi), 염소에서 면역 결핍, 관절염 및 뇌병증을 유발하는 염소 관절염-뇌염 바이러스; 말에서 자가면역 용혈성 빈혈 및 뇌병증을 유발하는 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이에서 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소에서 림프절병증, 림프구 증가증, 및 가능하게는 중추 신경계 감염을 유발하는 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 인간 이하의 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 유발하는 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV)가 포함된다. 이들 바이러스에 의해 유발되는 질환은 긴 잠복 기간 및 장기간 경과를 특징으로 한다. 보통, 바이러스는 단핵구 및 대식세포를 잠재적으로 감염시키고, 이들로부터 바이러스가 다른 세포에 전파된다. HIV, FIV 및 SIV 또한 용이하게 T 림프구 (즉, T-세포)를 감염시킨다.
HIV, SIV, FIV 및 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV)를 비롯한 렌티바이러스는 효율적인 세포내 복제를 위해 간단한 구조적 gag-pol-env 유전자 외에도 몇몇 바이러스 조절 유전자에 의존한다. 따라서, 렌티바이러스는 유전자 조절 및 바이러스 복제를 위해 전형적인 레트로바이러스에 비해 더욱 복잡한 전략을 이용하고, 패키징 신호가 전체 바이러스 게놈을 거쳐 전파되는 것으로 보인다. 이들 추가의 유전자는 렌티바이러스 생활 주기 동안에 조절 기능의 웹을 나타낸다. 예를 들어, HIV-1 감염시, 전사는 LTR에서 RNA 표적 (TAR)과의 상호작용을 통해 Tat의 발현에 의해 상향조절된다. 이어서, 전장 및 스플라이싱된 mRNA의 발현은 gag 영역 및 env 영역에 존재하는 RNA 요소 (RRE)와 상호작용하는 Rev의 기능에 의해 조절된다 (S. Schwartz et al., J. Virol., 66:150-159 [1992]). gag-pol 및 env mRNA의 핵 수출은 Rev 기능에 의존적이다. 이들 2가지 필수 조절 유전자 외에도, vif, vpr, vpx, vpu 및 nef를 비롯한 보조 유전자의 목록 또한 바이러스 게놈에 존재하고, 효율적인 바이러스 생성 및 감염성에 대한 그들의 효과가 입증되었지만, 이들이 바이러스 복제에 절대적으로 필요한 것은 아니다 (K. and F. Wong-Staal, Microbiol. Rev., 55:193-205 (1991]; R. A. Subbramanian and E. A. Cohen, J. Virol. 68:6831-6835 [1994]; 및 D. Trono, Cell 82:189-192 [1995]). 예시적인 렌티바이러스, HIV-1의 구조체에 대한 상세한 설명은 미국 특허 번호 6,531,123에 제공되어 있다.
"공급원" 또는 "원래의" 레트로바이러스는 야생형 레트로바이러스이며, 이로부터 위형 레트로바이러스가 유래되거나, 또는 벡터의 유전자 요소 중 하나 이상의 제조를 위한 패키징 또는 트랜스진 벡터의 구축 동안에 시작점으로 이용된다. 유전자 요소는 변화시키지 않고 사용될 수 있거나, 또는 돌연변이될 수 있다 (그러나, 원래의 요소에서 통계적으로 유의한 서열 유사성이 결여되는 정도를 넘어서지는 않음). 벡터는 1종 초과의 공급원 레트로바이러스를 가질 수 있고, 상이한 공급원 레트로바이러스는 예를 들어 MLV, FIV, HIV-1 및 HIV-2, 또는 HIV 및 SIV일 수 있다. 용어 "유전자 요소"에는 유전자가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
동족 레트로바이러스는 야생형 레트로바이러스이며, 해당 벡터는 핵산 수준에서 가장 큰 % 서열 동일성을 갖는다. 일반적으로, 이는 공급원 레트로바이러스와 동일할 것이다. 그러나, 공급원 레트로바이러스가 광범위하게 돌연변이된 경우에는, 벡터는 일부 다른 레트로바이러스와 더 유사하게 닮을 것이라고 생각될 수 있다. 동족 레트로바이러스가 구축을 위한 물리적 시작점일 필요는 없고; 먼저 원래의 요소를 수득한 다음에 그를 변형시키기 보다는, 유전자 요소, 특히 돌연변이성 요소를 직접적으로 합성하는 것을 선택할 수 있다. 용어 "동족"은 단백질, 유전자 또는 유전자 요소 (예를 들어, 스플라이스 공여자 부위 또는 패키징 신호)에 유사하게 적용될 수 있다. 동족 단백질을 언급할 때, % 서열 동일성은 아미노산 수준에서 측정된다.
용어 "동족" 레트로바이러스는 극닥적인 경우, 즉, 모든 레트로바이러스 유전자 요소가 대용 비-렌티바이러스 유전자 요소로 교체된 경우에는 해석하기 어려울 수 있다. 이 경우에, 이전에 언급된 공급원 레트로바이러스 균주는 임의로 동족 레트로바이러스인 것으로 고려된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 바이러스 또는 벡터와 관련하여 용어 "복제"는 세포 번식의 결과로서 염색체에서 프로바이러스 DNA의 정상적인 복제, 또는 복제의 기능적 기점의 존재의 결과로서 플라스미드 DNA의 자율 복제를 지칭하지 않는다. 대신에, "복제"는 바이러스 RNA를 함유하는 감염성 바이러스 입자가 세포에 들어가고, RNA가 DNA로 역전사되고, DNA가 프로바이러스로서 숙주 염색체에 통합되고, 감염된 세포가 비리온 단백질을 생성하고, 이들을 전장 바이러스 게놈 RNA와 함께 새로운 동등하게 감염성인 입자를 조립하는 것인 완전한 바이러스 생활 주기의 완료를 지칭한다.
용어 "복제-가능성"은 복제할 수 있는 야생형 바이러스 또는 돌연변이성 바이러스를 지칭하며, 감염된 세포에서 바이러스의 복제는 감염성 비리온을 생성하고, 이는 이전에 감염되지 않은 또 다른 세포를 감염시킨 후에 감염된 세포가 이러한 감염성 비리온을 마찬가지로 생성하게 한다. 본 발명은 복제-결함성 바이러스의 사용을 고려한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약독화된 바이러스"는, 감염된 대상체에서 그의 병원성이 실질적으로 감소되도록 변형된 임의의 바이러스 (예를 들어, 약독화된 렌티바이러스)를 지칭한다. 바이러스는 임상적 관점에서 비병원성인 정도까지 약독화될 수 있고, 즉, 바이러스에 노출된 대상체는 대조군 대상체에 비해 통계적으로 유의한 증가된 수준의 병리학을 나타내지 않는다.
본 발명은 변형된 레트로바이러스의 제조 및 사용을 고려한다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 뮤린 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 유형 1, 인간 면역결핍 바이러스 유형 2, 고양이 면역결핍 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 비스나-마에디, 염소 관절염-뇌염 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스 및 소 면역 결핍 바이러스의 돌연변이, 또는 1종 초과의 레트로바이러스 종의 일부로 구성된 바이러스 (예를 들어, MLV, FIV, HIV-1 및 HIV-2, 또는 HIV-1 및/또는 SIV의 일부로 구성된 혼성체)이다.
기준 바이러스는 돌연변이성 바이러스의 성분을 기재하기 위해 게놈이 사용된 바이러스이다. 예를 들어, 돌연변이성 바이러스의 특정한 유전자 요소는 다양한 치환, 결실 또는 삽입에 의해 기준 바이러스의 동족 요소와 상이하다고 말할 수 있다. 돌연변이성 바이러스가 기준 바이러스로부터 실제로 유래될 필요는 없다.
바람직한 기준 FIV 서열은 [Talbott et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 86:5743-7]; 진뱅크 수탁번호 NC_001482에서 확인된다. 특정 실시양태에서, 3-플라스미드 일시적인 형질감염 방법을 이용하여 복제 불능성 위형 레트로바이러스 (예를 들어, FIV)를 생성할 수 있다. 일반적인 방법은 [Wang et al., J Clin Invest. 1999 104:R55-62 및 Johnston et al., J Virol. 1999 73:4991-5000]에 기재되어 있다.
레트로바이러스 벡터 시스템
본 발명은 트랜스진 벡터, 하나 이상의 상용성 패키징 벡터, 외피 벡터, 및 적합한 숙주 세포를 포함하는 레트로바이러스 유전자 증폭 및 전달 시스템을 고려한다. 사용된 벡터는 레트로바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스)로부터 유래될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 (1) 패키징 벡터 및 외피 벡터를 숙주 세포에 형질감염시켜, 본질적으로 패키징-벡터-RNA-무함유 바이러스 입자를 생성하는 패키징 세포주를 형성하고, (2) 트랜스진 벡터를 패키징 세포주에 형질감염시키고, (3) 패키징 세포주에 의해 트랜스진 벡터 RNA를 감염성 바이러스 입자에 패키징하고, (4) 입자를 표적 세포에 투여하여, 세포가 형질도입되고, 후속적으로 트랜스진을 발현하는 것을 가능하게 한다.
입자는 대상체의 생체내로 직접적으로 투여되거나, 또는 대상체의 세포를 제거하고, 시험관 내에서 입자로 감염시키고, 대상체의 체내로 되돌려 놓는다.
본 발명의 패키징 벡터 및 트랜스진 벡터는 복제-불능성 바이러스를 생성할 것이다. 본 발명의 주어진 벡터 시스템으로의 도입을 위해 선택된 벡터는, 패키징 벡터(들) 또는 트랜스진 벡터의 추가의 돌연변이 없이는, 공동 형질감염된 세포가 패키징 벡터(들) 및 트랜스진 벡터 단독의 상동성 재조합에 의해 복제-가능성 바이러스를 생성하지 못하도록 한다. 이 시스템에서 사용된 외피 단백질은 레트로바이러스 외피, 합성 또는 키메라 외피, 또는 비-레트로바이러스 외피 보유 바이러스 (예를 들어, 바쿨로바이러스)로부터의 외피일 수 있다.
패키징 신호
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 또는 벡터 RNA를 바이러스 캡시드 또는 입자에 삽입하기 위해 필요한 또는 적어도 이를 용이하게 하는 레트로바이러스 게놈 또는 벡터 내에 위치하는 서열을 지칭한다. RNA에서의 패키징 신호는 RNA가 비리온으로 패키징될 것임을 확인시킨다. 용어 "패키징 신호"는 또한 기능적 패키징 신호로 전사되는 벡터 DNA 서열을 지칭하기 위해 편리하게 사용된다. 특정한 패키징 신호는 유전자의 일부일 수 있지만, 코딩된 단백질의 펩티드 모이어티로서가 아니라 RNA의 형태로 인식된다.
패키징 벡터와 트랜스진 벡터 사이의 주요한 차이점은, 패키징 벡터에서는 주요 패키징 신호가 불활성화되고, 트랜스진 벡터에서는 주요 패키징 신호가 기능적이라는 것이다. 이상적으로, 패키징 벡터에서는 모든 패키징 신호는 불활성화될 것이고, 트랜스진 벡터에서는 모든 패키징 신호가 기능적일 것이다. 그러나, 바이러스 역가를 최대화하거나 또는 상동성 재조합을 억제하는 것과 같이 상반되는 고려는 이러한 구축물을 덜 바람직하게 만들 수 있다.
패키징 시스템; 패키징 벡터; 패키징 세포주
패키징 시스템은 벡터 또는 다수개의 벡터이며, 이는 집합적으로 적합한 RNA를 캡시드화하는 비리온을 생성하기 위해 필요한 모든 유전자 정보를 발현가능한 형태로 제공하고, 이를 비리온-생성 세포로부터 운반하고, 이를 표적 세포에 전달하고, 표적 세포에서 RNA가 역전사되고 숙주 게놈에 통합되게 하여, 상기 언급된 RNA에 포함된 트랜스진이 발현될 수 있도록 한다. 그러나, 패키징 시스템은 실질적으로 자체 패키징이 불가능하여야 한다. 오히려, 이는 별도의 트랜스진 벡터를 패키징한다.
본 발명에서, 패키징 벡터는 gag 및 pol 유전자 ("GP" 벡터)의 기능적 등가물을 제공할 것이다. env 유전자(들)은 외피 벡터에 의해 제공될 것이다. 이론적으로, 3 벡터 시스템 ("G", "P" 및 "E" 벡터)은 별도의 벡터 상에서 별개의 gag 및 pol 유전자를 구축하고, 그들의 상대적인 발현 수준이 적절하게 조정될 수 있도록 이들을 상이한 조절가능한 프로모터에 (또는 하나는 조절가능한 프로모터에, 그리고 다른 하나는 구성적 프로모터에) 작동가능하게 연결시키고자 하는 경우에 가능하다.
패키징 세포주는 달성가능한 조건하에 바이러스 입자를 생성하는 패키징 시스템에 의해 형질감염된 적합한 숙주 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "패키징 세포주"는 전형적으로 바이러스 구조적 단백질 (예를 들어, gag, pol 및 env)을 발현하지만, 패키징 신호는 함유하지 않는 세포주와 관련하여 사용된다. 예를 들어, 세포주는 그의 게놈 내의 1개의 염색체 부위에서 기능적 psi+ 서열이 결여된 (Δ-psi로 지정됨) 5'-LTR-gag-pol-3'-LTR 단편, 및 또 다른 염색체 부위에 Δ-psi가 또한 위치하는 5'-LTR-env-3'-LTR 단편을 보유하도록 유전자 조작되었다. 이들 두 세그먼트가 구성적으로 전사되지만, psi+ 영역이 없고 생성된 바이러스 RNA 분자가 전체 크기보다 작기 때문에, 빈 바이러스 입자가 형성된다.
숙주 세포가 패키징 벡터(들) 단독에 의해 형질감염되는 경우, 이는 실질적으로 전장 패키징 벡터없이 바이러스 입자만을 생성한다. 한 예에서, 패키징 세포에 의해 생성된 바이러스 입자 중 10% 미만은 전장 패키징 벡터-유래된 RNA를 함유한다. 그러나, 패키징 벡터에 기능적 프라이머-결합 부위가 결여되어 있기 때문에, 이들 입자가 새로운 세포를 감염시키더라도, 패키징 벡터 RNA는 DNA로 다시 역전사되지 않을 것이고, 따라서 새로운 세포는 비리온을 생성하지 않을 것이다. 따라서, 패키징 벡터 자체는 복제-불능성 바이러스이다.
일부 실시양태에서, 패키징 세포 및/또는 세포주는 트랜스진 벡터를 함유한다. 패키징 세포주는 트랜스진 벡터를 감염성 입자에 패키징시킬 것이다. 이러한 세포주는 본원에서 "트랜스제닉 비리온 생성 세포주"로 지칭된다.
패키징은 유도성일 뿐만 아니라 비-유도성인 것으로 고려된다. 유도성 패키징 세포 및 패키징 세포주에서는, 레트로바이러스 입자가 적어도 하나 유도인자에 대한 반응으로 생성된다. 비-유도성 패키징 세포주 및 패키징 세포에서는, 레트로바이러스 입자 생성을 일으키기 위해 유도인자가 필요하지 않다.
패키징 벡터는 동족 야생형 게놈의 적어도 하나의 패키징 신호의 불활성화로 인해 야생형의 복제-가능성 레트로바이러스 게놈과 반드시 상이하다. 1개 초과의 패키징 신호가 불활성화될 수 있다. 한 예에서, 패키징 벡터에 의해 제공된 레트로바이러스 유전자만이 구조적 또는 필수적인 조절 단백질을 코딩하는 것이다.
트랜스진 벡터
트랜스진 벡터는 관심의 대상인 발현가능한 비-레트로바이러스 유전자를 보유하는 발현 벡터이고, 적어도 하나의 기능적 레트로바이러스 패키징 신호를 포함하며, 따라서 트랜스진 벡터가 패키징 세포주에 형질감염된 후에, 트랜스진 벡터가 RNA로 전사되고, 이 RNA가 감염성 바이러스 입자로 패키징된다. 이어서, 이들 입자는 표적 세포를 감염시키고, 그들의 RNA는 DNA로 역전사되고, DNA는 프로바이러스 요소로서 숙주 세포 게놈에 포함되어, 관심 유전자를 표적 세포에 전달한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질도입"은 형질감염에 의해서가 아니라 감염 수단에 의해 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 유전자(들)을 전달하는 것을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 형질도입된다. 따라서, "형질도입된 유전자"는 레트로바이러스 또는 벡터 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포에 도입된 유전자이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터 (예를 들어, "트랜스진 벡터")는 유전자를 "표적 세포" 또는 숙주 세포에 도입시킨다. 본 발명은 임의의 관심 유전자 (또는 유전자의 감염 또는 발현을 나타내기 위해 사용된 "마커 유전자" 또는 "리포터 유전자")에 연결된, 본 발명에서 사용하기에 적합한 트랜스진 벡터를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "장기간 형질도입"은 다른 벡터에 의해 관찰되는 것보다 더 긴 기간 동안 숙주 또는 표적 세포에 형질도입된 채로 유지될 수 있는 벡터를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명은 적어도 120 일, 적어도 1 년, 또는 대상체의 수명 동안에, 또는 치료에 필요한 시간 경과 동안에 형질도입된 채로 유지될 수 있는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 발현의 지속기간은 벡터의 선택보다는 프로모터 및 표적 세포 유형의 선택의 함수이다.
용어 "안정한 형질도입" 또는 "안정하게 형질도입된"은 외래 DNA를 형질도입된 세포의 게놈에 도입 및 통합시키는 것을 지칭한다. 용어 "안정한 형질도입체"는 게놈 DNA에 안정하게 통합된 외래 DNA를 갖는 세포를 지칭한다.
용어 "일시적인 형질도입" 또는 "일시적으로 형질도입된"은 외래 DNA가 형질도입된 세포의 게놈에 통합되지 못한 세포에 외래 DNA를 도입시키는 것을 지칭한다. 외래 DNA는 며칠 동안 형질도입된 세포의 핵에서 지속된다. 이 시간 동안, 외래 DNA는 염색체에서 내인성 유전자의 발현을 지배하는 조절성 제어에 적용된다. 용어 "일시적인 형질도입체"는 외래 DNA를 흡수하였지만 이 DNA를 통합시키지 못한 세포를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 표적 및/또는 숙주 세포는 "비분열" 세포이다. 이들 세포에는 정상적으로 분열하지 않는 뉴런 세포와 같은 세포가 포함된다. 그러나, 본 발명은 비분열 세포 (예컨대, 비제한적으로 근육 세포, 백혈구, 비장 세포, 간 세포, 안구 세포, 상피 세포)로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, 벡터 및 벡터 자손은 적어도 105 cfu/ml의 벡터 역가를 달성하도록 다수개의 표적 세포를 형질도입시킬 수 있다. 감염 다중도 (MOI)는 적어도 1 (즉, 세포당 평균 1 히트), 또는 심지어 적어도 2일 수 있다.
발현 카세트 및 벡터
본 발명은 또한 ACE-tRNA를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 프로모터를 추가로 함유한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 조절가능한 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 PGK, CMV, RSV, H1 또는 U6 프로모터 (Pol II 및 Pol III 프로모터)이다.
본 발명은 본원에 기재된 발현 카세트를 함유하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 폴리오바이러스, HSV, 또는 뮤린 말로니-기재 바이러스 벡터이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현 카세트"는 적절한 숙주 세포에서 특정한 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 서열을 의미하며, 이는 종결 신호에 작동가능하게 연결될 수 있는 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 이는 또한 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위해 필요한 서열을 포함할 수 있다. 코딩 영역은 보통 관심 단백질을 코딩한다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있다. 발현 카세트는 또한 천연 발생인 것일 수 있지만, 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득되었다. 발현 카세트에서 뉴클레오티드 서열의 발현은, 숙주 세포가 일부 특정한 자극에 노출될 때에만 전사를 개시하는 구성적 프로모터 또는 조절가능한 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정한 조직 또는 장기 또는 발달 단계에 대해 특이적일 수 있다.
"작동가능하게 연결된"은 서열 중 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 조절 DNA 서열이 코딩 DNA 서열의 발현에 영향을 미치도록 (즉, 코딩 서열 또는 기능적 RNA가 프로모터의 전사 제어하에 있도록) 두 서열이 위치하는 경우에, 조절 DNA 서열이 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열과 "작동가능하게 연결된" 또는 "연관된" 것이라고 말한다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
아데노 연관된 바이러스 (AAV)
아데노 연관된 바이러스 (AAV)는 파르보비리다에 패밀리의 소형 비병원성 바이러스이다. AAV는 복제를 위해 헬퍼 바이러스에 대한 그의 의존성에 의해 이 패밀리의 다른 구성원과 구별되다. 헬퍼 바이러스의 부재하에, AAV는 유전자좌 특이적 방식으로 염색체 19의 q 아암에 통합될 수 있다. 대략 5 kb 게놈의 AAV는 + 또는 - 극성을 갖는 단일 가닥 DNA의 1개 세그먼트로 이루어진다. 게놈의 말단은 헤어핀 구조체로 접힐 수 있고 바이러스 DNA 복제의 기점으로 작용할 수 있는 짧은 반전된 말단 반복부이다. 물리적으로, 파르보바이러스 비리온은 외피가 없고, 그의 정이십면체 캡시드는 대략 20 nm 직경이다.
지금까지, 수많은 혈청학적으로 별개인 AAV가 확인되었고, 12개 초과가 인간 또는 영장류로부터 단리되었다. AAV2의 게놈은 4680개 뉴클레오티드 길이이고, 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유한다. 좌측 ORF는 비-구조적 Rep 단백질, Rep 40, Rep 52, Rep 68 및 Rep 78을 코딩하고, 이들은 단일-가닥 자손 게놈의 생성 외에도 복제 및 전사의 조절에 관여한다. 추가로, Rep 단백질 중 2가지는 AAV 게놈이 인간 염색체 19의 q 아암의 영역으로 우세하게 통합하는 것과 연관되어 있었다. Rep68/78은 또한 NTP 결합 활성 뿐만 아니라 DNA 및 RNA 헬리카제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. Rep 단백질은 핵 국지화 신호 뿐만 아니라 몇몇 잠재적인 인산화 부위를 갖는다. 이들 키나제 부위 중 하나의 돌연변이는 복제 활성을 상실시킨다.
게놈의 말단은 바이러스 DNA 복제의 기점으로서 작용하는 T-형태의 헤어핀 구조체로 접힐 가능성을 갖는 짧은 반전된 말단 반복부 (ITR)이다. ITR 영역 내에서, ITR, GAGC 반복부 모티프 및 말단 분해 부위 (trs)의 기능에서 중요한 2가지 요소가 기재되었다. 반복부 모티프는 ITR이 선형 또는 헤어핀 배좌일 때 Rep에 결합하는 것으로 확인되었다. 이 결합은 부위- 및 가닥-특이적 방식으로 발생하는 trs에서의 절단을 위해 Rep68/78을 위치화시키는 역할을 한다. 복제에서 그들의 역할 외에도, 이들 2가지 요소는 바이러스 통합에 중요한 것으로 보인다. 인접한 trs를 갖는 Rep 결합 부위가 염색체 19 통합 유전자좌 내에 함유된다. 이들 요소는 유전자좌 특이적 통합에서 기능적이고 필수적인 것으로 확인되었다.
AAV 비리온은 외피가 없고, 대략 25 nm 직경의 정이십면체 입자이며, VP1, VP2 및 VP3으로 지칭되는 3가지 관련 단백질로 이루어진다. 우측 ORF는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 이들 단백질은 각각 1:1:10의 비로 발견되고, 모두 우측 ORF로부터 유래된다. 캡시드 단백질은 대안적인 스플라이싱의 사용 및 특이한 시작 코돈에 의해 서로 상이하다. 결실 분석은, 대안적으로 스플라이싱된 메시지로부터 번역된 VP1의 제거 및 변경이 감염 입자의 수율을 감소시키는 것을 확인하였다. VP3 코딩 영역 내의 돌연변이는 임의의 단일-가닥 자손 DNA 또는 감염성 입자를 생성하지 못하게 한다. AAV 입자는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. AAV 캡시드 폴리펩티드는 전체 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 입자는 AAV2 및 다른 AAV 캡시드 단백질 (즉, 키메라 단백질, 예컨대 AAV1 및 AAV2)을 포함하는 입자일 수 있다. 표준 방법에 의해 일반적으로 측정시 AAV2 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 항원적으로 또는 면역학적으로 AAV1과 구별된 채로 유지되는 한, AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서의 변경이 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 이용하여, 바이러스 입자가 항원적으로 또는 면역학적으로 AAV1과 구별되는지 여부를 결정할 수 있다. 추가로, AAV2 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV1과 구별되는 조직 트로피즘을 보유한다.
AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. 전체 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 코딩하는 AAV2 캡시드 폴리펩티드는 전체적으로 NC_001401 (AAV2 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)에 제시된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 약 63% 상동성 (또는 동일성)을 가질 수 있다. 캡시드 단백질은 NC_001401에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질과 약 70% 상동성, 약 75% 상동성, 80% 상동성, 85% 상동성, 90% 상동성, 95% 상동성, 98% 상동성, 99% 상동성, 또는 심지어 100% 상동성을 가질 수 있다. 캡시드 단백질은 NC_001401에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질 약 70% 동일성, 약 75% 동일성, 80% 동일성, 85% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성, 98% 동일성, 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성을 가질 수 있다. 입자는 또 다른 AAV 및 AAV2 캡시드 단백질, 즉, 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. 표준 방법에 의해 일반적으로 측정시 AAV2 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 항원적으로 또는 면역학적으로 AAV4와 구별된 채로 유지되는 한, AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서의 변경이 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 이용하여, 바이러스 입자가 항원적으로 또는 면역학적으로 AAV1과 구별되는지 여부를 결정할 수 있다. 추가로, AAV2 바이러스 입자는 바람직하게는 본원의 실시예에서 예시된 바와 같이 AAV1과 구별되는 조직 트로피즘을 보유하지만, 적어도 하나의 AAV2 외피 단백질을 함유하는 AAV2 키메라 입자는 AAV2 외피 단백질만으로 이루어지는 AAV2 입자와 상이한 조직 트로피즘을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 AAV2 반전된 말단 반복부의 쌍을 포함하는 벡터를 함유하는, 즉, 캡시드화하는 AAV2 입자를 추가로 제공한다. AAV2 ITR의 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 추가로, 입자는 AAV1 및 AAV2 캡시드 단백질 둘 다, 즉, 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. 더우기, 입자는 다른 AAV (예를 들어, AAV1-AAV9 및 AAVrh10)로부터 AAV 반전된 말단 반복부의 쌍을 포함하는 벡터를 캡시드화하는 입자일 수 있다. 입자에 캡시드화된 벡터는 반전된 말단 반복부 사이에 삽입된 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
AAV의 하기 특징은 이것이 유전자 전달을 위한 매력적인 벡터가 되게 한다. AAV 벡터는 시험관 내에서 세포 게놈에 안정하게 통합되고; 넓은 숙주 범위를 갖고; 분열 및 비분열 세포 모두를 시험관 내에서 및 생체 내에서 형질도입시키고, 형질도입된 유전자의 높은 수준의 발현을 유지하는 것으로 확인되었다. 바이러스 입자는 열 안정성이고, 용매, 세제, pH, 온도 변화에 대해 저항성이고, CsCl 구배 또는 다른 수단에 의해 농축될 수 있다. 본 발명은 AAV 입자, 재조합 AAV 벡터, 및 재조합 AAV 비리온을 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들어, AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이거나, 또는 AAV1 입자는 AAV1 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. 재조합 AAV2 벡터는 적어도 하나의 독특한 AAV2 핵산을 포함하는 핵산 구축물이다. 재조합 AAV2 비리온은 재조합 AAV2 벡터를 함유하는 입자이다. 용어 "AAV2 ITR" 내에서 고려되기 위해, 뉴클레오티드 서열은 AAV1 ITR로부터 AAV2 ITR을 구별하는 본원에 기재된 1 또는 2가지 특징을 보유해야 한다: (1) 3개 (AAV1에서는 4개) "GAGC" 반복부 및 (2) AAV2 ITR Rep 결합 부위에서 처음 두 "GAGC" 반복부의 4번째 뉴클레오티드는 T가 아니라 C임.
전달하고자 하는 tRNA를 코딩하는 서열의 발현을 유도하는 프로모터는 공지된 고려사항, 예컨대 프로모터에 기능적으로 연결된 핵산의 발현 수준 및 벡터가 사용되는 세포 유형에 의해 선택된 임의의 원하는 프로모터일 수 있다. 프로모터는 외인성 또는 내인성 프로모터일 수 있다. 프로모터에는 예를 들어 공지된 강력한 프로모터, 예컨대 SV40 또는 유도성 메탈로티오네인 프로모터, 또는 AAV 프로모터, 예컨대 AAV p5 프로모터가 포함될 수 있다. 프로모터의 추가의 예에는 다음으로부터 유래된 프로모터: 액틴 유전자, 이뮤노글로불린 유전자, 시토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 유도성 열 충격 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 등이 포함된다. 추가의 예에는 조절된 프로모터가 포함된다.
AAV 벡터는 프로모터에 기능적으로 연결된 외인성 (이종성) 핵산을 추가로 포함할 수 있다. "이종성 핵산"이란, 임의의 이종성 또는 외인성 핵산이 세포, 조직 또는 유기체로의 전달을 위해 벡터에 삽입될 수 있음을 의미한다. 핵산은 예를 들어 tRNA를 코딩할 수 있다. "기능적으로 연결된"이란, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 예컨대 이종성 핵산에 대한 프로모터의 적절한 배향에 의해 프로모터는 이종성 핵산의 발현을 촉진시킬 수 있다. 추가로, 이종성 핵산은 바람직하게는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 기능적으로 코딩하기 위해, 즉, 핵산을 발현시키기 위해 핵산의 발현을 위한 모든 적절한 서열을 갖는다. 핵산은 예를 들어 발현 제어 서열, 예컨대 인핸서를 포함할 수 있다. 핵산은 1종 초과의 유전자 생성물을 코딩할 수 있으며, 이는 패키징될 수 있는 핵산의 크기에 의해서만 제한된다.
AAV1 입자는 AAV1 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. 표준 방법에 의해 일반적으로 측정시 AAV1 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 항원적으로 또는 면역학적으로 다른 AAV와 구별된 채로 유지되는 한, AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서의 변경이 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 이용하여, 바이러스 입자가 항원적으로 또는 면역학적으로 다른 AAV 혈청형과 구별되는지 여부를 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 지칭하고, 전장 단백질 및 그의 단편을 포함한다. 따라서, "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 종종 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 방법은 AAV 반전된 말단 반복부의 쌍 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를 세포에 투여하여, 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 세포로의 투여는 임의적으로 원하는 액체, 예컨대 조직 배양 배지, 또는 완충된 식염수 용액에 함유된 입자를 세포와 간단히 접촉시키는 것을 비롯한 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 입자는 임의의 원하는 길이의 시간 동안 세포와 접촉시킨 채 유지시킬 수 있고, 전형적으로 입자를 투여하고, 무기한으로 접촉한 채 유지시킨다. 이러한 시험관내 방법의 경우, 바이러스는 관련 기술분야에 공지되고 본원에 예시된 바와 같이 표준 바이러스 형질도입 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다. 투여를 위한 바이러스의 역가는 특히 세포 유형에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 AAV 형질도입을 위해 이용되는 것의 전형일 것이다. 추가로, 본 예에서 특정한 세포를 형질도입하기 위해 이용된 역가가 이용될 수 있다. 세포에는 인간 뿐만 아니라 다른 큰 (비-설치류) 포유동물, 예컨대 영장류, 말, 양, 염소, 돼지 및 개에서의 임의의 원하는 세포가 포함될 수 있다.
본 발명은 AAV 반전된 말단 반복부의 쌍 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 AAV 입자를 대상체에게 투여하여, 핵산을 대상체의 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 대상체의 세포에 전달하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
AAV 벡터
한 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. "AAV" 벡터는 아데노-연관된 바이러스를 지칭하며, 천연 발생 야생형 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용어는 달리 필요한 경우를 제외하고는 모든 아형, 혈청형 및 위형, 및 천연 발생 및 재조합 형태 둘 다를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈청형"은 정의된 항혈청을 갖는 캡시드 단백질 반응성을 기반으로 하여 정의되고 다른 AAV와 구별되는 AAV를 지칭하며, 예를 들어 영장류 AAV의 8가지 공지된 혈청형, AAV-1 내지 AAV-9 및 AAVrh10이 있다. 예를 들어, 혈청형 AAV2는 AAV2의 cap 유전자로부터 코딩된 캡시드 단백질, 및 동일한 AAV2 혈청형으로부터의 5' 및 3' ITR 서열을 함유하는 게놈을 함유하는 AAV를 지칭하기 위해 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, rAAV1은 동일한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 5'-3' ITR 둘 다를 갖는 AAV를 지칭하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 이는 한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 상이한 AAV 혈청형으로부터의 5'-3' ITR, 예를 들어 AAV 혈청형 2로부터의 캡시드 및 AAV 혈청형 5로부터의 ITR을 갖는 AAV를 지칭할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 예에서, 벡터 설계 및 생성에 대한 기재는 캡시드의 혈청형 및 5'-3' ITR 서열을 기재한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관된 바이러스를 지칭하며, 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")로도 지칭된다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 (바람직하게는 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질) 및 캡시드화 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "rAAV"로 지칭된다.
한 실시양태에서, AAV 발현 벡터는 적어도 전사 방향으로 작동가능하게 연결된 성분으로서 제어 요소, 예컨대 전사 개시 영역, 관심 DNA 및 전사 종결 영역을 제공하기 위해 공지된 기술을 이용하여 구축된다. 제어 요소는 포유동물 세포에서 기능적인 것으로 선택된다. 작동가능하게 연결된 성분을 함유하는 생성된 구축물은 기능적 AAV ITR 서열에 의해 플랭킹 (5' 및 3')된다.
"아데노-연관된 바이러스 반전된 말단 반복부" 또는 "AAV ITR"이란, DNA 복제의 기점으로서 및 바이러스에 대한 패키징 신호로서 cis로 함께 기능하는 AAV 게놈의 각각의 말단에서 발견되는 관련 기술분야에서 인식된 영역을 의미한다. AAV ITR은 AAV rep 코딩 영역과 함께 2개의 플랭킹 ITR 사이에 삽입된 뉴클레오티드 서열의 효율적인 절제 및 그로부터의 구조 및 포유동물 세포 게놈으로의 통합을 제공한다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "AAV ITR"은 도시된 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없지만, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 추가로, AAV ITR은 임의의 몇몇 AAV 혈청형, 예컨대 비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등으로부터 유래될 수 있다. 추가로, AAV 벡터에서 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' ITR은 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래될 필요는 없거나, 또는 그들이 의도된 대로 기능하는 한, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심 서열의 절제 및 구조를 가능하게 하고, AAV Rep 유전자 생성물이 세포에 존재할 때 수용자 세포 게놈으로 이종성 서열의 통합을 가능하게 하는 한 단리될 수 있다.
한 실시양태에서, AAV ITR은 임의의 몇몇 AAV 혈청형, 예컨대 비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등으로부터 유래될 수 있다. 추가로, AAV 발현 벡터에서 선택된 선택된 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' ITR은 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래될 필요는 없거나, 또는 그들이 의도된 대로 기능하는 한, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심 서열의 절제 및 구조를 가능하게 하고, AAV Rep 유전자 생성물이 세포에 존재할 때 수용자 세포 게놈으로 DNA 분자의 통합을 가능하게 하는 한 단리될 수 있다.
한 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV2로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터에서 사용하기에 적합한 DNA 분자는 약 5 킬로염기 (kb) 미만, 약 4.5 kb 미만, 약 4kb 미만, 약 3.5 kb 미만, 약 3 kb 미만, 약 2.5 kb 미만의 크기를 갖고, 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 선택된 뉴클레오티드 서열은 대상체의 생체 내에서 전사 또는 그의 발현을 지시하는 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 이러한 제어 요소는 선택된 유전자와 일반적으로 연관된 대조군 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 대조군 서열을 이용할 수 있다. 유용한 이종성 대조군 서열에는 일반적으로 포유동물 또는 바이러스 유전자를 코딩하는 서열로부터 유래된 것들이 포함된다. 그 예에는 SV40 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터 영역 (CMVIE), 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, pol II 프로모터, pol III 프로모터, 합성 프로모터, 혼성체 프로모터 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 또한, 비-바이러스 유전자, 예컨대 뮤린 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 서열 또한 본원에서 사용될 것이다. 이러한 프로모터 서열은 예를 들어 스트라타진 (스트라타진, 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 상업적으로 입수가능하다.
한 실시양태에서, 이종성 프로모터 및 다른 제어 요소 둘 다, 예컨대 조직-특이적 및 유도성 프로모터, 인핸서 등이 특별히 사용될 것이다. 이종성 프로모터의 예에는 CMV 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터의 예에는 엑디손, 테트라시클린, 저산소 및 아우핀에 대한 DNA 반응성 요소가 포함된다.
한 실시양태에서, AAV ITR에 의해 결합된 관심 DNA 분자를 보유하는 AAV 발현 벡터는 그로부터 절제되는 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 ("ORF")을 갖고 있는 AAV 게놈에 선택된 서열(들)을 직접적으로 삽입함으로써 구축될 수 있다. ITR의 충분한 부분이 복제 및 패키징 기능을 위해 남아있는 한, AAV 게놈의 다른 부분 또한 결실될 수 있다. 이러한 구축물은 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 설계될 수 있다.
대안적으로, AAV ITR은 바이러스 게놈으로부터, 또는 표준 라이게이션 기술을 이용하여 또 다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 구축물의 동일한 및 융합된 5' 및 3'을 함유하는 AAV 벡터로부터 절제될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 20 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, 및 0℃에서 40 μM ATP, 0.01-0.02 (바이쓰) 단위 T4 DNA 리가제 ("점착성 말단" 라이게이션의 경우) 또는 14℃에서 1 mM ATP, 0.3-0.6 (바이쓰(Weiss)) 단위 T4 DNA 리가제 ("평활 말단" 라이게이션의 경우) 중에서 수행될 수 있다. 분자간 "점착성 말단" 라이게이션은 보통 30-100 μg/ml 총 DNA 농도 (5-100 nM 총 최종 농도)에서 수행된다. AAV 벡터는 ITR을 함유한다.
추가로, 키메라 유전자는 하나 이상의 선택된 핵산 서열의 5' 및 3'으로 정렬된 AAV ITR 서열을 포함하도록 합성에 의해 생성될 수 있다. 완전한 키메라 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 조립된다.
rAAV 비리온을 생성하기 위해, AAV 발현 벡터는 공지된 기술, 예컨대 형질감염을 이용하여 적합한 숙주 세포에 도입된다. 수많은 형질감염 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York]을 참고한다. 특히 적합한 형질감염 방법에는 인산칼슘 공침법, 배양된 세포로 직접적인 미량-주사, 전기천공, 리포좀 매개된 유전자 전달, 지질-매개된 형질도입, 및 고속 미세투사물을 이용한 핵산 전달이 포함된다.
한 실시양태에서, rAAV 비리온을 생성하는데 적합한 숙주 세포에는 이종성 DNA 분자의 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 적이 있는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포가 포함된다. 상기 용어에는 형질감염된 원래 세포의 자손이 포함된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 안정한 인간 세포주 293 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)을 통해 수탁 번호 ATCC CRL1573로 용이하게 입수가능함)으로부터의 세포를 본 개시내용의 실시에서 사용할 수 있다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 유형-5 DNA 단편에 의해 형질전환된 인간 배아 신장 세포주이며, 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다. 293 세포주는 용이하게 형질감염되고, rAAV 비리온을 생성하기에 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.
"AAV rep 코딩 영역"이란, 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에서 인식된 영역을 의미한다. 이들 Rep 발현 생성물은 여러 기능, 예컨대 DNA 복제의 AAV 기점의 인식, 결합 및 닉킹, DNA 헬리카제 활성, 및 AAV (또는 다른 이종성) 프로모터로부터 전사의 조절을 갖는 것으로 확인되었다. Rep 발현 생성물은 집합적으로 AAV 게놈을 복제하기 위해 필요하다. AAV rep 코딩 영역의 적합한 상동체에는 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로도 공지된 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV-6) rep 유전자가 포함된다.
"AAV cap 코딩 영역"이란, 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3, 또는 그의 기능적 상동체를 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에서 인식된 영역을 의미한다. 이들 Cap 발현 생성물은 패키징 기능을 제공하며, 이들은 집합적으로 바이러스 게놈의 패키징을 위해 필요하다.
한 실시양태에서, AAV 발현 벡터의 형질감염 이전에 또는 그와 동시에 숙주 세포를 AAV 헬퍼 구축물에 의해 형질감염시킴으로써 AAV 헬퍼 기능을 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 따라서, AAV 헬퍼 구축물을 사용하여, AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적인 발현을 제공함으로써, 생성적인 AAV 감염에 필요한 결손된 AAV 기능을 보완한다. AAV 헬퍼 구축물은 AAV ITR을 갖지 않으며, 자체적으로 복제하지도 패키징하지도 못한다. 이들 구축물은 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태를 가질 수 있다. 수많은 AAV 헬퍼 구축물, 예컨대 Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 다를 코딩하는 흔히 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 기재되어 있다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 코딩하는 수많은 다른 벡터가 기재되어 있다.
바이러스 벡터의 전달 방법은 AAV를 대상체에게 주사하는 것을 포함한다. 일반적으로, rAAV 비리온을 생체내 또는 시험관내 형질도입 기술을 이용하여 세포에 도입시킬 수 있다. 시험관 내에서 형질도입된 경우, 원하는 수용자 세포가 대상체로부터 제거되고, rAAV 비리온에 의해 형질도입되고, 대상체로 재도입될 것이다. 대안적으로, 동종 또는 이종 세포가 사용될 수 있으며, 이들 세포는 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않을 것이다.
형질도입된 세포를 대상체에게 전달 및 도입하기게 적합한 방법이 기재되었다. 예를 들어, 재조합 AAV 비리온과 세포를 예를 들어 적절한 배지 중에서 조합시킴으로써 세포를 시험관 내에서 형질도입시킬 수 있고, 관심 DNA를 보유하는 이들 세포에 대한 스크리닝은 통상적인 기술, 예컨대 싸우던 블롯 및/또는 PCR을 이용하거나 또는 선택가능한 마커를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포를 하기에 충분히 기재된 바와 같이 제약 조성물로 제형화하고, 조성물을 다양한 기술, 예컨대 그래프팅, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해 대상체에게 도입시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 관심 핵산의 치료 유효량, 즉, 해당 질환 상태의 증상을 감소시키거나 개선시키는데 충분한 양 또는 원하는 이익을 부여하기에 충분한 양을 제공하기 위해 충분한 유전자 물질을 포함할 것이다. 제약 조성물은 또한 제약상 허용가능한 부형제를 함유할 것이다. 이러한 부형제에는 그 자체로는 조성물을 제공받는 개체에게 해로운 항체의 생성을 유도하지 않고 과도한 독성이 없이 투여될 수 있는 임의의 제약학적 작용제가 포함된다. 제약상 허용가능한 부형제에는 소르비톨, 트윈(Tween)80, 및 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 제약상 허용가능한 염에는 예를 들어 광물산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기 산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 포함될 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 제약상 허용가능한 부형제에 대한 철저한 논의는 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 입수가능하다.
전달된 바이러스 벡터에 의해 1개 초과의 트랜스진이 발현될 수 있음을 이해해야 한다. 대안적으로, 각각 하나 이상의 상이한 트랜스진을 발현하는 별도의 벡터 또한 본원에 기재된 바와 같이 대상체에게 전달될 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 방법에 의해 전달된 바이러스 벡터를 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합하는 것 또한 의도된다.
본 명세서의 교시의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 첨가되어야 하는 바이러스 벡터의 유효량은 경험적으로 결정될 수 있다. 투여는 치료 과정에 걸쳐 1회 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 용량을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 바이러스 벡터, 요법의 조성, 표적 세포, 및 치료할 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 및 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, rAAV는 1x105 -1x1016vg/ml의 약 0.3-2 ml의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, rAAV는 1x107 -1x1014vg/ml의 약 1-3 ml의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, rAAV는 1x108 -1x1013vg/ml의 약 1-2 ml의 용량으로 투여된다.
rAAV 입자를 함유하는 제형은 비히클 중에 유효량의 rAAV 입자를 함유할 것이고, 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. rAAV 입자는 전형적으로 조성물의 약 1% 내지 약 95% (w/w)의 범위이거나, 또는 적절한 경우 그보다 훨씬 높거나 낮을 수 있다. 투여되는 양은 치료를 위해 고려되는 동물 또는 인간 대상체의 연령, 체중 및 신체 상태와 같은 인자에 따라 달라진다. 유효 용량은 용량 반응 곡선을 정립하는 일반적인 실험을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 정립될 수 있다. 대상체는 하나 이상의 용량으로 rAAV 입자의 투여에 의해 치료된다. 적절한 효소 활성을 유지하기 위해 필요한 다중 용량이 투여될 수 있다.
물, 수성 식염수, 인공 CSF, 또는 다른 공지된 물질을 비롯한 비히클이 본 발명에서 사용될 수 있다. 제형을 제조하기 위해, 정제된 조성물을 단리하고, 동결건조시키고, 안정화시킬 수 있다. 이어서, 조성물을 적절한 농도로 조정하고, 임의적으로 항염증제와 조합하고, 사용을 위해 패키징할 수 있다.
본 발명은 세포에서 표적 단백질의 수준을 증가시키기에 충분한 양으로 상기 기재된 단백질, 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 도입시킴으로써 세포에서 표적 단백질의 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 표적 단백질의 축적은 적어도 10% 증가된다. 표적 단백질의 축적은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 또는 99% 증가된다. 39
치료제를 코딩하는 핵산
용어 "핵산"은 당, 포스페이트, 및 퓨린 또는 피리미딘인 염기를 함유하는 단량체 (뉴클레오티드)로 구성된, 단일- 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는다면, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다.
"핵산 단편"은 주어진 핵산 분자의 일부분이다. 용어 폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적인 동일성"은, 표준 파라미터를 사용하여 기재된 정렬 프로그램 중 하나를 이용하여 폴리뉴클레오티드가 기준 서열과 비교하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%, 또는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 또는 심지어 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다.
세포에 유전자 물질을 도입시키는 방법
외인성 유전자 물질 (예를 들어, 하나 이상의 치료적 ACE-tRNA를 코딩하는 DNA)을 유전자 전달 방법, 예컨대 형질감염 또는 형질도입에 의해 세포의 생체 내로 도입시켜, 유전자 변형된 세포를 제공한다. 다양한 발현 벡터 (즉, 외인성 유전자 물질의 표적 세포로의 전달을 용이하게 하는 비히클)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "세포의 형질감염"은 첨가된 DNA를 혼입시킴으로써 세포에 의한 새로운 유전자 물질의 획득을 지칭한다. 따라서, 형질감염은 물리적 또는 화학적 방법을 이용하여 세포에 핵산을 삽입하는 것을 지칭한다. 몇몇 형질감염 기술, 예컨대 인산칼슘 DNA 공침법; DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포좀-매개된 형질감염; 및 텅스텐 입자-촉진된 미세입자 충격이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 스트론튬 포스페이트 DNA 공침법은 또 다른 가능한 형질감염 방법이다.
대조적으로, "세포의 형질도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 이용하여 핵산을 세포에 전달하는 과정을 지칭한다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 RNA 바이러스 (즉, 레트로바이러스)는 본원에서 형질도입 키메라 레트로바이러스로 지칭된다. 레트로바이러스 내에 함유된 외인성 유전자 물질은 형질도입된 세포의 게놈에 혼입된다. 키메라 DNA 바이러스 (예를 들어, 치료제를 코딩하는 cDNA를 보유하는 아데노바이러스)에 의해 형질도입된 세포는 그의 게놈에 혼입된 외인성 유전자 물질을 갖지 않을 것이지만, 세포 내에에 염색체 외적으로 보유된 외인성 유전자 물질을 발현시킬 수 있다.
전형적으로, 외인성 유전자 물질은 새로운 유전자의 전사를 제어하기 위해 프로모터와 함께 이종성 유전자 (보통 치료적 단백질을 코딩하는 엑손을 포함하는 cDNA의 형태)를 포함한다. 프로모터는 특징적으로 전사를 개시하기 위해 필요한 특이적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 임의적으로, 외인성 유전자 물질은 원하는 유전자 전사 활성을 얻기 위해 필요한 추가의 서열 (즉, 인핸서)을 추가로 포함한다. 이 논의의 목적을 위해, "인핸서"는 프로모터에 의해 지시된 기본 전사 수준을 변화시키기 위해 코딩 서열과 (cis로) 인접하여 작동하는, 단순히 임의의 비번역된 DNA 서열이다. 외인성 유전자 물질은 프로모터로부터 바로 하류에 있는 세포 게놈에 도입될 수 있고, 이로써 프로모터 및 코딩 서열은 작동가능하게 연결되어, 코딩 서열의 전사를 허용한다. 레트로바이러스 발현 벡터는 삽입된 외인성 유전자의 전사를 제어하기 위해 외인성 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 이러한 외인성 프로모터에는 구성적 및 유도성 프로모터 둘 다 포함된다.
천연 발생 구성적 프로모터는 본질적인 세포 기능의 발현을 제어한다. 그 결과, 구성적 프로모터의 제어하에 유전자는 세포 성장의 모든 조건하에 발현된다. 예시적인 구성적 프로모터에는 특정한 구성적 또는 "하우스키핑" 기능을 코딩하는 하기 유전자에 대한 프로모터가 포함된다: 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 아데노신 데아미나제, 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 피루베이트 키나제, 포스포글리세롤 뮤타제, 액틴 프로모터, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 구성적 프로모터. 또한, 여러 바이러스 프로모터는 구성적으로 진핵생물 세포에서 기능한다. 이들에는 무엇보다도 SV40의 초기 및 후기 프로모터; 몰로니 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복부 (LTR); 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터가 포함된다. 따라서, 상기 언급된 임의의 구성적 프로모터를 이용하여 이종성 유전자 삽입체의 전사를 제어할 수 있다.
유도성 프로모터의 제어하에 있는 유전자는 유도제의 존재하에서만 또는 그보다 높은 정도로 발현된다 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에서의 전사는 특정한 금속 이온의 존재하에 크게 증가됨). 유도성 프로모터에는 그들의 유도 인자가 결합될 때 전사를 자극하는 반응성 요소 (RE)가 포함된다. 예를 들어, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레티노산 및 시클릭 AMP에 대한 RE가 있다. 특정한 RE를 함유하는 프로모터는 유도성 반응을 수득하기 위해 선택될 수 있고, 일부 경우에 RE 자체가 상이한 프로모터에 부착되어, 재조합 유전자에 유도성을 부여할 수 있다. 따라서, 적절한 프로모터 (구성적 대 유도성; 강력한 대 약한)를 선택함으로써, 유전자 변형된 세포에서 치료제의 발현의 존재 및 수준 둘 다를 제어할 수 있다. 치료제를 코딩하는 유전자가 유도성 프로모터의 제어하에 있는 경우, 예를 들어 작용제의 전사를 제어하는 유도성 프로모터의 특이적 유도인자의 복강내 주사에 의해, 치료제의 전사를 허용하는 조건에 유전자 변형된 세포를 계내에서 노출시킴으로써 계내에서 치료제의 전달을 촉발시킨다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에 유전자에 의해 코딩된 치료제의 유전자 변형된 세포에 의한 계내에서 발현은 계내에서 적절한 (즉, 유도성) 금속 이온을 함유하는 용액과 유전자 변형된 세포를 접촉시킴으로써 증강된다.
따라서, 계내에서 전달된 치료제의 양은 다음과 같은 인자를 제어함으로써 조절된다: (1) 삽입된 유전자의 전사를 지시하기 위해 사용되는 프로모터의 성질, (즉, 프로모터가 구성적인지 유도성인지, 강력한지 약한지 여부); (2) 세포에 삽입되는 외인성 유전자의 카피의 수; (3) 환자에게 투여된 (예를 들어, 이식된) 형질도입된/형질감염된 세포의 수; (4) 이식편 (예를 들어, 그라프트 또는 캡슐화된 발현 시스템)의 크기; (5) 이식편의 수; (6) 형질도입된/형질감염된 세포 또는 이식편이 유지되는 시간의 길이; 및 (7) 유전자 변형된 세포에 의한 치료제의 생성 속도. 특정한 치료제의 치료 유효 용량을 전달하기 위한 이들 인자의 선택 및 최적화는 과도한 실험없이도 상기 개시된 인자 및 환자의 임상 프로파일을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다.
치료제를 코딩하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 이종성 핵산 외에도, 발현 벡터는 발현 벡터에 의해 형질감염된 또는 형질도입된 세포의 선택을 용이하게 하기 위해 선택 유전자, 예를 들어 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포는 2개 이상의 발현 벡터, 치료제(들)을 코딩하는 유전자(들)을 함유하는 적어도 하나의 벡터, 선택 유전자를 함유하는 다른 벡터에 의해 형질감염된다. 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 유전자 및/또는 신호 서열 (하기 기재됨)의 선택은 과도한 실험없이도 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
질환 상태 및 치료 방법
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 합성 올리고뉴클레오티드 저해자 tRNA의 도입을 통해 넌센스 돌연변이와 연관된 존재하는 돌연변이의 효과를 역전시킴으로써 낭성 섬유증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 포유동물에게 본원에 기재된 치료제 (예를 들어, 변형된 및/또는 안정화된 ACE-tRNA)를 코딩하는 단백질 또는 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 포유동물에서 질환을 치료하는데 유용한 의약을 제조하기 위해 본원에 기재된 치료제 또는 치료제를 코딩하는 벡터의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 질환은 낭성 섬유증이다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 벡터를 함유하는 포유동물 세포를 제공한다. 세포는 인간일 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 및 유전자 조작된 세포 (생체 내에서 변형된), 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 치료제의 치료적 유효 용량을 모두 전신으로 전달할 수 있는 유전자 요법을 위한 방법에 관한 것이다.
한 측면에 따라, 포유동물 수용자에서 치료제를 발현시키기 위한 세포 발현 시스템이 제공된다. 발현 시스템 (본원에서 "유전자 변형된 세포"로도 지칭됨)은 치료제를 발현하기 위한 세포 및 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터에는 세포에 이종성 유전자 물질을 전달하기 위한 바이러스, 플라스미드 및 다른 비히클이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "발현 벡터"는 세포에 이종성 유전자 물질을 전달하기 위한 비히클을 지칭한다. 특히, 발현 벡터는 재조합 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 또는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다.
발현 벡터는 이종성 유전자의 전사를 제어하기 위한 프로모터를 추가로 포함한다. 프로모터는 (본원에 기재된) 유도성 프로모터일 수 있다. 발현 시스템은 포유동물 수용자에게 투여하기에 적합하다. 발현 시스템은 다수개의 비-불멸화된 유전자 변형된 세포를 포함할 수 있고, 각각의 세포는 적어도 하나의 치료제를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 유전자를 포함한다.
세포 발현 시스템은 생체 내에서 형성된다. 여전히 또 다른 측면에 따라, 생체 내에서 포유동물 수용자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 예컨대 정맥내 투여를 통해 이종성 유전자 생성물을 발현하는 발현 벡터를 계내에서 환자의 세포에 도입시키는 것을 포함한다. 생체 내에서 발현 시스템을 형성하기 위해, 치료제를 발현하는 발현 벡터를 생체 내에서 포유동물 수용자 정맥내로 도입시킨다.
여전히 또 다른 측면에 따라, 생체 내에서 포유동물 수용자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 표적 치료제를 생체 내에서 환자에게 도입시키는 것을 포함한다.
이종성 유전자를 발현하는 발현 벡터는 이종성 유전자 생성물의 전사를 제어하기 위한 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 계내에서 치료제의 전달은 이종성 유전자의 전사를 유도하는 조건에 계내에서 세포를 노출시킴으로써 제어된다.
본 개시내용은 발현 벡터를 세포 또는 환자에게 투여함으로써 포유동물에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 유전자 요법 방법을 위해, 분자 생물학 및 유전자 요법 분야의 통상의 기술자는 과도한 실험없이도 본 개시내용의 신규한 방법에서 사용되는 발현 벡터의 적절한 투여 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
한 실시양태에 따라, 세포는 생체 내에서 형질전환되거나 또는 달리 유전자 변형된다. 포유동물 수용자로부터의 세포는 치료제를 코딩하는 이종성 (예를 들어, 재조합) 유전자를 발현하는 외인성 유전자 물질을 함유하는 벡터에 의해 생체 내에서 형질전환되고 (즉, 형질도입되거나 또는 형질감염되고), 치료제는 계내에서 전달된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "외인성 유전자 물질"은 세포에서 천연적으로 발견되지 않거나, 또는 세포에서 천연적으로 발견되는 경우에는 세포에 의해 생물학적으로 유의한 수준으로 전사되거나 발현되지 않는 것인, 천연 또는 합성인 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, "외인성 유전자 물질"에는 예를 들어 tRNA로 전사될 수 있는 비-천연 발생 핵산이 포함된다.
유전자 요법에 적합한 상기 개시된 치료제 및 상태는 단지 예시적인 것이며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 공지된 상태를 치료하기에 적합한 치료제의 선택은 과도한 실험없이도 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다.
특정 실시양태에서, 요법은 조기 종결 코돈 (PTC)에 의해 유발된 질환, 예컨대 비제한적으로, 낭성 섬유증, 근이영양증, β-지중해 빈혈 및 리들 증후군의 치료/관리를 위해 잠재적인 용도를 갖는다. 이 요법은 개선된 정지 코돈 저해 특이성을 제공한다는 점에서 유리하다. 본 발명의 치료적 ACE-tRNA는 특이적 정지-코돈, 예를 들어 TGA를 표적화하고, 따라서 질환과 관련이 없는 정지-코돈에서의 부정확한 효과를 감소시킨다. 본 발명의 요법은 또한 아미노산 특이성을 제공한다는 점에서 유리하다. 발현된 tRNA는 질환 정지 코돈의 삽입을 통해 상실된 아미노산을 특이적으로 교체하도록 조작되어, 단백질 안정성, 폴딩 및 이동에 대한 임의의 거짓 효과를 무효화시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 시스템은 모듈식이며, 따라서 모든 가능한 질환 PTC에 대해 "개별화"될 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈에 Trp 신테타제에 의해 인식되는 9가지 개별 트립토판 tRNA가 있으며, 이들 모두는 mRNA UGG 코돈을 저해한다. 따라서, 이들 각각의 9가지 Trp tRNA는 코돈 재편집 내성 (UGG → UGA)에 대한 기회를 제공한다. 추가로, 유전자 코드에서 정지 코돈에 대한 그들의 근접성을 고려할 때, 아르기닌 코돈에서 PTC 넌센스 코돈으로의 돌연변이는 질환에서 흔하다. 코돈 편집 내성 및 저해 효능에 대해 시험할 수 있는 30개 초과의 Arg tRNA가 있다.
본 발명의 추가의 이점은 전체 시스템 (tRNA + 프로모터 서열)이 소형이기 때문에 용이한 발현 및 세포 특이적 전달을 제공한다는 것이다.
본 발명의 작용제의 투여 용량, 제형 및 경로
본 발명의 작용제는 유전 질환 (예를 들어, 낭성 섬유증)과 연관된 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 투여된다. 투여되는 양은 선택된 조성, 특정한 질환, 포유동물의 체중, 신체 상태 및 연령, 및 예방 또는 치료가 달성되어야 하는지 여부를 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자는 관련 기술분야에 널리 공지된 동물 모델 또는 다른 시험 시스템을 이용하는 임상의에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 작용제, 예를 들어 ACE-tRNA, 발현 벡터 또는 바이러스 입자의 투여에 의해 유전 질환 (예를 들어, 낭성 섬유증)을 치료하는 것을 구상한다. 본 발명에 따른 치료제의 투여는 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료적인지 예방적인지 여부, 및 숙련의에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 본 발명의 작용제의 투여는 본질적으로 예정된 시간의 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 또는 일련의 이격된 용량일 수 있다. 국부 및 전신 투여 모두 고려된다.
하기 논의되는 바와 같이 임의적으로 지속된 방출 (예를 들어, 미세캡슐화를 이용하여)을 위해 제형화될 수 있는 본 발명의 치료제(들)을 갖는 하나 이상의 적합한 단위 용량 형태는 다양한 경로, 예컨대 비경구, 예컨대 정맥내 및 근육내 경로, 뿐만 아니라 발병 조직으로 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 제형은 적절한 경우 구별된 단위 용량 형태로 편리하게 제시될 수 있고, 약학에서 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 치료제를 액체 담체, 고체 매트릭스, 반고체 담체, 미분된 고체 담체 또는 이들의 조합물과 회합시킨 다음, 필요한 경우 생성물을 원하는 전달 시스템으로 도입하거나 성형하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료제가 투여를 위해 제조되는 경우, 이들은 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합되어, 제약 제형, 또는 단위 용량 형태를 형성할 수 있다. 이러한 제형 중에서 총 활성 성분은 제형의 0.1 내지 99.9 중량%를 차지한다. "제약상 허용가능한"은 제형의 다른 성분과 상용성이고 그의 수용자에게 해롭지 않은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 염이다. 투여를 위한 활성 성분은 분말 또는 과립, 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제시될 수 있다.
본 발명의 치료제를 함유하는 제약 제형은 널리 공지되고 용이하게 입수가능한 성분을 이용하여 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 치료제는 또한 비경구 투여, 예를 들어 근육내, 피하 또는 정맥내 경로에 적절한 용액으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 치료제의 제약 제형은 또한 수성 또는 무수 용액 또는 분산액의 형태 또는 대안적으로 에멀젼 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있다.
따라서, 치료제는 비경구 투여 (예를 들어, 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입)를 위해 제형화될 수 있고, 보존제가 첨가된 앰풀, 미리 충전된 시린지, 소부피 주입 용기 또는 다중-용량 용기의 단위 용량 형태로 제시될 수 있다. 활성 성분은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균성의 발열원-무함유 물과 재구성하기 위해 멸균성 고체의 무균 단리에 의해 또는 용액으로부터 동결건조에 의해 수득되는 분말 형태일 수 있다.
다수개의 용량 단위의 투여에 의해 필요한 유효량에 도달할 수 있기 때문에, 각각의 용량 형태의 개별 에어로졸 용량에 함유된 활성 성분 또는 성분들의 단위 함량이 그 자체로 특정한 징후 또는 질환을 치료하기 위한 유효량을 구성할 필요는 없음을 이해할 것이다. 더우기, 유효량은 개별적으로 또는 일련의 투여로 용량 형태에서 용량보다 적게 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 제약 제형은 임의적인 성분으로서 제약상 허용가능한 담체, 희석제, 가용화제 또는 유화제, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 유형의 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 제형에서 유용한 담체 및/또는 희석제의 구체적이고 비제한적인 예에는 물 및 생리학적으로 허용되는 완충된 식염수 용액, 예컨대 인산염 완충된 식염수 용액 pH 7.0-8.0 및 물이 포함된다.
정의
질환 상태: 본 발명의 목적을 위해, "질환 상태" 또는 "질환 표현형"은 세포 내에서 유전자의 코딩 영역 내의 정지 코돈으로부터 유발되는 (예를 들어, 넌센스 돌연변이로부터 유발되는) 포유동물 세포의 특징이다. 예를 들어, 증가하는 수의 인간 유전 질환은 넌센스 돌연변이에 의해 유발되는 것으로 생각된다 (예를 들어, [Atkinson et al., Nuc. Acids Res. 22:1327, 1994] 참고). 예를 들어, β-지중해 빈혈, 뒤센(Duchenne) 근이영양증, 색소성 건피증, 파코니(Fanconi) 빈혈, 및 낭성 섬유증은 모두 확인된 유전자에서 넌센스 돌연변이에 의해 유발될 수 있다.
내인성 tRNA 신테타제: tRNA 신테타제는 tRNA가 본 발명에 따라 도입되는 세포에 존재하는 경우 세포에 대해 "내인성"인 것으로 고려된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, tRNA 신테타제는 관련 유형의 세포에서 천연적으로 발견되거나, 또는 해당 특정 세포가 그를 발현하도록 조작되었거나 달리 수동으로 조종된 경우에 이들 목적을 위해 내인성인 것으로 고려될 수 있다.
저해자 tRNA: "저해자 tRNA"는 그의 안티-코돈이 번역을 달리 종결시키는 코돈과 상보성인 것이며, 따라서 검출가능한 판독이 실험 조건하에 일어나게 한다. 표준 종결 코돈은 앰버 (UAG), 오커 (UAA), 및 오팔 (UGA) 코돈이다. 그러나, 비-표준 종결 코돈 (예를 들어, 4-뉴클레오티드 코돈) 또한 문헌에서 사용되었다 (예를 들어, [Moore et al., J. Mol. Biol. 298:195, 2000; Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc. 121:12194, 1999] 참고).
본 발명은 이제 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명된다.
실시예 1
유전자 코드는 4가지 뉴클레오티드를 사용하여, DNA에서 단백질로의 번역의 기초를 형성하는 삼중 코돈을 형성한다. 총 64가지 코돈이 있으며, 61가지는 아미노산을 코딩하기 위해 사용되고, 3가지는 (TAG, TGA 및 TAA) 단백질 종결 "정지" 또는 "넌센스" 코돈을 코딩한다.
낭성 섬유증 사례의 5 내지 10%는 낭성 섬유증 막경유 전도도 조절인자 (CFTR) 단백질의 조기 말단절단을 초래하는 "넌센스" 돌연변이에 의해 유발된다. 이 "부류 1" 돌연변이는 조기 종결 코돈 (PTC)인 p.Trp1282X이며, 이는 CFTR 기능의 상실 및 심각한 낭성 섬유증 표현형을 유발한다. 일부 화합물, 예컨대 아탈루렌은 넌센스 돌연변이를 생성하는 질환의 정지 판독을 촉진시키지만, 생체 내에서 불량한 정지-코돈 특이성 및 예상치못한 낮은 효율의 코돈 스키핑으로 인해 치료제로서 적당한 정도로만 성공적이었다. 그러나, 이들 화합물의 광범위한 사용, 및 내인성 정지-코돈 판독이 후생동물에서 흔하다는 발견은, 세포 유형의 하위 집합, 즉, 기도 상피에 전달되는 경우에는 보조된 저해가 가능할 수 있음을 시사한다. 그러나, 치료적으로 보조된 정지-코돈 판독이 성공적인 경우, 넌센스 코돈의 위치에서 아미노산의 비선택적인 혼입은 단백질 폴딩, 이동 및 기능에 영향을 미칠 잠재성을 갖고 (CFTR 1282X의 경우에서와 같이), 따라서 추가의 치료적 개입을 필요로 한다. 따라서, 질환 PTC의 성질 및 잠재적으로 치료적인 저해자, 및 일반적으로 PTC 질환의 더욱 효과적인 치료를 이해하는 것에 대한 요구가 극심하게 충족되지 않고 있다.
이 실시예는 CFTR p.Trp1282X 채널의 구조를 위한 안티코돈 편집된 (ACE) Trp-tRNA를 특징으로 한다. 이러한 tRNA는 질환-유발 TGA 정지 코돈을 '저해하고', p.Trp1282X CFTR에서 원래의 아미노산, Trp를 혼입시키도록 조작되어, 사실상 야생형 CFTR 단백질을 유전적으로 재구축한다. 데이터는 이 일반적인 접근법 (넌센스 저해)이 부착성 세포에서 tRNA 및 그의 동족 신테타제의 일시적인 형질감염, 또는 더욱 본래의 기도 세포-유형, 예컨대 A549 기도 세포로의 그들의 바이러스-기반 전달을 통해, 프레임내 정지 코돈을 보유하는 전사체의 강력한 구조를 제공한다는 것을 입증한다. 이 접근법은 기존 전략에 비해 수많은 유의한 이익을 제공한다: 1) 개선된 코돈 특이성 - 발현된 tRNA가 특이적 정지-코돈을 향해 지시될 수 있고, 따라서 질환과 관련이 없는 정지-코돈에서 부정확한 효과를 감소시킬 수 있다. 2) 아미노산 특이성 - 발현된 tRNA 및/또는 신테타제가 질환 정지 코돈의 삽입을 통해 상실된 아미노산을 교체하도록 조작되어, CFTR 안정성, 폴딩 및 이동에 대한 임의의 거짓 효과를 무효화시킬 수 있다. 3) 조정 가능성 - 시스템은 이론적으로 tRNA 및 PTC 돌연변이의 각각의 유형에 대해 개별화될 수 있다. 4) 용이한 발현 - 전체 시스템이 소형이고 (<1kb), 용이하게 패키징되고, 일시적으로 또는 tRNA의 나노입자 전달을 통해 발현될 수 있다. 5) 일반적인 전략에 대한 원리 증명 - 프레임내 정지 코돈은 인간 질환의 주요 원인이고, 치료 옵션이 거의 없으며; p.Trp1282X에 대해 본원에서 수행된 실험은 다른 CFTR 넌센스 코돈의 메카니즘에 대한 이해를 이끌어 낼 것으로 예상된다.
데이터는 ACE-tRNA 정지-코돈 저해자 tRNA가 정지 부위가 도입된 전사체를 "구조"하는데 효율적임을 보여주고 (도 6a 및 6b), 이는 이러한 tRNA가 질환 정지 부위의 치료적 구조에서 주요 생물학적 장애물로서 넌센스 매개된 붕괴 (NMD)를 방해할 가능성이 있음을 시사한다. 따라서, 질환에서 NMD에 대한 더 많은 분자적 이해를 얻기 위해 저해자 tRNA를 사용하는 것에 대한 가능성을 열어준다.
결과
본 발명자들은 그의 지정된 코돈이 아니라 정지 부위, 예를 들어 TGA를 저해하도록 안티코돈 편집된 진핵생물 tRNA를 발현하는 것이 가능할지에 대해 의문을 가졌다. TGA 부위를 함유하는 링커에 의해 분리된 eGFP 서열에 의해 프레임내 형광 단백질 (cherry)로 이루어진 시험 구축물에 대해 5가지 인간 트립토판 tRNA에서 이를 시험하였다. 전장 단백질의 생성을 나타내기 위해, HA 에피토프를 eGFP 리딩 프레임의 C-말단에 부가하였다. cherry 신호의 시각적 외관이 플라스미드 전달 및 발현을 나타내고, eGFP 구조와 조합하여 TGA 저해를 나타내기 때문에, 이 시험 시스템이 유용하다. 도 6a 및 6b의 데이터는 5가지 안티코돈 편집된 Trp tRNA 인간이 cherry 및 eGFP 리딩 프레임 사이의 짧은 링커에서 TGA 정지 부위를 저해하는 능력을 검정하기 위해 이 시험 구축물을 이용하는 웨스턴 블롯 데이터를 도시한다. 이들 구축물 중에서, 후보 1, 2, 3 & 5는 이와 관련하여 적절한 활성을 나타낸다. 이는 돌연변이에 대한 구조적 불내성으로 인한 것이거나, 또는 심지어 단일 염기만큼 안티코돈을 변경시키는 것이 Trp 신테타제가 트립토판을 가진 tRNA을 인식하고/거나 아실화시키는 능력을 방해할 가능성으로 인한 것일 수 있다. 그러나, 이들 시험 tRNA 중 번호 4 (tRNA #4)는 TGA 부위의 유의한 저해 활성을 나타내고, 전장 cherry-eGFP-HA 단백질을 생성한다 (도 6b). 추가로, 공동 발현된 tRNA의 부재하에서는 판독이 확인되지 않았다 (도 6b, 마지막 레인).
방법
Trp tRNA를 코돈 편집 내성 (TGG → TGA), 및 일시적으로 형질감염된 탠덤-형광단 (mCherry-TGA-GFP) 및 CFTR Trp1282X에서 표적화된 TGA 시험 부위를 저해하는 그들의 능력을 실험하였다. 5/9 Trp tRNA의 초기 스크리닝은 HEK 세포에서 일시적으로 형질감염되고 cherry-TGA-eGFP-HA 시험 구축물을 구조하는 '독자적인(stand alone)' 기능을 갖는 안티코돈 편집된 Trp-tRNA를 발견하였다 (도 6b). HA 에피토프의 선택적인 존재는 성공적인 구조, 뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 cherry 및 eGFP 형광 둘 다의 공초점 실험을 나타낸다 (도시되지 않음). 이 결과는 a) 일부 ACE - tRNA가 안티코돈 편집을 용인할 수 있고, b) 이들 tRNA가 내인성 트립토판 신테타제에 의해 Trp에 의해 아실화되는 능력을 보유하고, c) 이들 tRNA가 오픈 단백질 리딩 프레임 내에 매립된 TGA 부위를 저해할 수 있다는 원리 증명 데이터를 제공한다.
나머지 4가지 Trp-tRNA는 TAA에서 TGA 저해자로의 안티코돈 편집의 내성에 대해 기능적으로 실험한다. 이들 안티코돈 편집된 tRNA를 cherry-TGA-eGFPHA 클론을 구조하는 그들의 능력에 대해 시험한다. 생화학적 (웨스턴 블롯) 데이터를 cherry 및 eGFP 신호 뿐만 아니라 HA 에피토프에 대해 수득한다. 여기서, cherry 발현은 양성 형질감염 대조군으로 작용한다. 공초점 영상화는 단일 세포 수준에서 cherry 및 eGFP 형광을 검증한다.
ACE - Trp tRNA를 트립토판 아미노산으로 충전시키는 내인성 Trp 신테타제의 충실도는 정제되고 구조된 cherry-Trp-eGFPHA단백질의 트립신 분해 단편의 질량 분광 분석에 의해 결정된다. cherry 및 eGFP 리딩 프레임 사이의 링커로부터 생성된 트립신 분해 단편에 대해 예상된 질량은 다음과 같다: 1590.8135의 예상된 질량을 갖는 KPINQWPANTHER; 볼드체 W는 혼입 부위를 나타낸다 (도 10). 따라서, 이는 야생형 아미노산에 의한 넌센스 코돈 복구 및 교체의 첫번째 예를 나타내고, 따라서 기존 접근법, 예컨대 치료제 아탈루란에 비해 상당한 발전이다. 후자의 예에서, 화합물은 부정확한 아미노산을 갖는 넌센스 코돈의 판독을 촉진시키고, 따라서 엄격한 복구를 제공하는 새로운 tRNA 서열의 발견 및 확인이 중요하다.
상기 확인된 ACE - tRNA에 의한 일시적으로 형질감염된 CFTR 1282X 채널의 구조는 B 및 C 글리코실화된 CFTR 밴드 20의 완전한 성숙을 위한 표준 생화학적 방법에 의해 평가된다. 따라서, 채널을 야생형 아미노산에 의해 복구시켰고, 이는 완전히 기능적이고, 원형질 막으로 성공적으로 이동한다.
다음 단계는 전기생리학적 (단일 세포 패치 클램프 및 어씽(Ussing) 챔버) 및 생화학적 접근법을 이용하여 상기 확인된 ACE - tRNA 시스템에 의해 구조된 CFTR Trp1282X 채널을 기능적으로 특징분석하는 것이다. 발현된 tRNA가 1282X mRNA의 넌센스-매개된 붕괴 (NMD)를 약화시키는 효능은 정량적인 rtPCR에 의해 평가된다. 재프로그래밍된 인간 기도 세포를 사용하여, 본래의 1282X CFTR 채널의 발현된 코돈 편집된 Trp-tRNA 구조를 시험한다.
확인된 인간 Trp tRNA에서 안티코돈 편집이 허용되고, 이 75-염기 쌍 전달 RNA가 시험 구축물 내의 프레임내 TGA 코돈을 저해할 수 있음이 입증된다. 이들 실험은 이러한 발견이 상기 ACE - tRNA가 CFTR 1282TGA mRNA와 상호작용하고 모델 세포 (FRT 및 A549) 뿐만 아니라 p. 1282X 인간 재프로그래밍된 기도 세포에서 기능적 CFTR 채널을 생성하는 능력을 특징분석하는 것으로 추정한다.
일시적으로 발현된 CFTR 1282X 채널에서 뿐만 아니라 재프로그래밍된 기도 세포에서 구조 수준의 생화학적 결정. 항체 M3A7을 이용하여 구조된 것을 인식하고 (에피토프는 aa 1370-1380임), 이엠디 밀리포어(EMD Millipore)를 통해 입수가능한 MM13-4와 같이 N-말단에 결합하는 모든 CFTR (구조된 및 비-구조된) 항체 (에피토프 aa 25-36)를 검출한다. 대안적으로, L12B4 (에피토프 aa 386-412, 이엠디 밀리포어) 또는 660 (에피토프 aa 576-585)은 시스틱 피브로시스 파운데이션 테라퓨틱스(Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics)로부터 입수가능하다.
표면 기능성은 전기생리학적 접근법, 패치-클램프 및 어씽 챔버 기록을 통해 실험한다. 1282X mRNA 안정성 및 풍부성은 일시적으로 발현하는 세포 및 재프로그래밍된 기도 세포로부터의 RNA 추출물의 정량적인 rtPCR에 의해 검정된다.
인간 기도 세포로부터의 RNA 트랜스크립톰 데이터의 생물정보학 분석은 전사체를 함유하는 TGA 코돈의 풍부성, 맥락 및 동일성을 확인한다. 그들의 정상적인 정지 부위에 대해 TGA를 사용하는 상위 10개의 발현 전사체는 ACE - tRNA 발현 전 및 후에 단백질 생화학에 의해 개별 전사체의 수준에서 추적된다. 세포 아폽토시스의 생화학적 및 면역조직학적 프로브를 또한 사용하여, 세포 사망에서 ACE- tRNA의 영향을 실험한다.
결론적으로, 데이터는 프레임내 정지 부위를 갖는 이온 채널 유전자가 이러한 유형의 "구조"에 적합하고 (도 9), 시스템의 성분이 기도 세포에서 바이러스에 의해 발현될 수 있음을 보여준다. 추가로, 이러한 발상의 매우 단순화된 형태인 인간 기점의 ACE-tRNA는 포유동물 세포주에서 프레임내 CFTR TGA 코돈을 구조하는 "독자적인" 능력을 입증한다 (도 9). 이 접근법은 기존 정지-코돈 전략에 비해 여러 이점을 갖고, ACE-tRNA가 1) 넌센스 매개된 붕괴를 없애고, 2) 폐 세포 제조물에서 기능하고, 3) CFTR 1282X를 특이적으로 구조하는 능력의 측면에서 더욱 면밀한 실험의 가치가 있다.
실시예 2
몇몇 상이한 넌센스 돌연변이는 CF를 유발하고, 따라서 모든 CF 질환의 대략 10%를 차지한다. 도 7. 이들 경우는 10가지 특이적 유전자 병변에 집중된다: E60X, R75X, G542X, R553X, Q890X, Y1092X, R1158X, R1162X 및 W1282X. 본 발명자들은 올바른 접근법으로 안티-코돈 편집에 대한 변형 및 내성에 대해 기존 인간 tRNA 서열을 스크리닝하는 것이 실현가능해야 함을 제안한다. 이를 위해, 대략 144가지 ACE-tRNA가 질환의 원인이 되는 넌센스 코돈의 복구 및 전장 단백질의 발현을 촉진시키기 위해 사용될 수 있는 것에 대해 시험하기 위한 후보였다. 구체적으로, 도 11에 도시된 방식을 이용하여, tRNA 라이브러리를 생성하여, 상위 CF의 원인이 되는 넌센스 돌연변이를 복구하는 능력을 갖는 ACE tRNA를 코딩하는 신규한 tRNA 서열을 확인하였다. 구체적으로, ACE-tRNA를 코딩하는 10ng의 어닐링된 올리고를 50ng의 NanoLuc 리포터 플라스미드, 1ul의 10x 컷스마트(CutSmart) 완충제 (NEB), 1ul의 T4 리가제 (NEB), 10mM의 ATP 및 1ul의 BbsI (NEB)와 합하였고, 도 11에 기재된 바와 같이 써모사이클러에서 사이클링하였다. 1ul의 반응을 적격성 이. 콜라이로 형질전환시키고, 형질전환체를 암피실린 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트마다 1개의 형질전환체를 고르고, 암피실린 선택하에 1ml의 LB 중에서 성장시키고, 미니프렙하고, 서열을 검증하였다.
트립토판 및 글리신으로부터 최상의 ACE-tRNA 후보를 확인하기 위해 스크리닝 연구를 먼저 수행하였다. ACE-tRNA에 의한 NanoLuc 리포터 플라스미드의 서열 검증된 미니프렙 cDNA 125ng을 인산칼슘을 이용하여 HEK 세포에 형질감염시켰다. HEK 세포를 전날에 4x104으로 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 형질감염 24 시간 후에, 배지를 20ul의 PBS로 교체하고, 15ul의 나노글로(NanoGlo) 시약 (프로메가(Promega))을 첨가하였다. 플레이트를 스펙트라맥스(SpectraMax) i3 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)) 상에서 판독하였다. 데이터는 3회 이상의 반복에 대한 것이다. 도 8. 데이터는 대부분의 tRNA가 불량한 코돈 편집 내성을 입증함을 나타낸다. 그러나, 명백한 고성능 tRNA가 스크리닝으로부터 나타났고, 백그라운드에 비해 20배 내지 130배의 넌센스 코돈 함유 단백질의 구조를 입증하는 ACE-Trp 및 ACE-Gly tRNA를 확인하였다.
이들 신규한 tRNA가 넌센스 코돈을 보유하는 CFTR 채널을 구조할 수 있는지를 평가하기 위해, 이들을 포유동물 HEK 세포에서 CFTR W1282X cDNA 플라스미드에 의해 공동 발현시켰다. 세포 제조물을 CFTR 단백질의 웨스턴 블롯 평가를 통해 표준 생화학적 접근법에 의해 분석하였다. 이 방법은 CFTR 단백질이 널리 정립된 다중-밴드 패턴을 나타내기 때문에 이러한 목적에 매우 유리하다. 구체적으로, "B" 및 "C" 밴드는 각각 세포 표면에서 전장 및 완전 성숙한 번역후 가공된 CFTR 단백질을 나타낸다. 이 경우에, Trpchr17.trna39 및 Glychr19.trna2 ACT-tRNA에 의한 구조 둘 다 'B' 및 'C' CFTR 면역양성 (항체 MA37) 밴드의 강력한 집단을 생성하고, 이는 전장의 성공적으로 이동된 이온 채널 단백질의 상기 tRNA에 의한 촉진을 나타낸다. 도 9.
실시예 3
T-스템 변형은 넌센스 저해를 상당히 개선시킨다. 도 10. 여기서 본 발명자들은 넌센스 코돈을 저해하고 단백질 발현을 촉진시키는 목적을 위해 그들의 기능을 추가로 가능하게 하도록 tRNA의 추가의 변형을 제안한다. 가설은 도 10에 도시된 tRNA 't-스템' 루프 내의 합리적으로 도입된 돌연변이가 넌센스 코돈 저해를 위해 더욱 안정하고 기능적으로 더욱 강력한 tRNA 분자를 생성할 것이라는 가능성을 기반으로 한다. 이를 위해, 단일 및 이중 돌연변이를 tRNA Trpchr17.trna39의 t-스템 루프 - 트립토판 TGA 넌센스 코돈의 구조를 위한 활성을 갖는 것으로 확인된 ACE-tRNA로 직접적으로 조작하였다. 따라서, 38개의 tRNA t-스템 변이체를 생성하고, 도 4에 도시된 넌센스 구조 리포터 구축물에 의해 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 스크리닝하였다. 형질감염 24 시간 후에, 세포를 도 10에 도시된 루시페라제 활성에 대해 검정하였다. 데이터는 강력한 변이를 나타내고, 증강된 저해 활성을 갖는 변이된 t-스템 루프 서열을 가진 신규한 tRNA 서열을 확인한다. 주목할만 하게는, 이러한 1개의 돌연변이체, TS-38 52-62 G-C는 대략 250%만큼 Trpchr17.trna39의 저해 능력을 증강시킨다 (도 12). 따라서, 본 발명자들은 일반화 가능한 변형, 즉, 실시예 1 및 2에 의해 확인된 새로운 tRNA 서열이 추가의 합리적 변형을 통해 (넌센스 코돈을 구조하는 그들의 능력에 대해) 더 잘 만들어질 수 있음을 제안한다. 이러한 접근법은 저 풍부성 표적 RNA를 갖는 조직 유형 또는 tRNA 전달이 제한될 수 있는 경우에 대해 ACE-tRNA의 치료적 유용성에 도움이 된다.
실시예 4
새로운 유형의 tRNA에 의해 넌센스 코돈을 저해하는 뉴클레오티드 조성 및 기능적 능력의 확인을 가능하게 하기 위해, 원 팟 클로닝 반응에 의한 올인원 플라스미드(All-In-One Plasmid With A One Pot Cloning Reaction)를 고처리량 클로닝을 위해 발명하였다 (도 11). 이 접근법은 표준 96 웰 포맷으로 루시페라제 활성을 통해 ACE-tRNA 활성의 용이한 연구를 가능하게 한다. 간략히, tRNA를 코딩하는 합성 뉴클레오티드 서열을 NanoLuc 리포터 플라스미드에 라이게이션시키고, TGA 넌센스 리포터 플라스미드 변이체의 예는 도 11에 도시된다. TAA (오팔) 및 TAG (앰버) 정지 코돈 구조 벡터가 성공적으로 설계되었고, 도 16-19에서 실시되었다. 상기 접근법의 이점은 tRNA 라이브러리를 코딩하는 DNA 올리고가 tRNA 삽입체를 거의 100% 혼입시키는 반응에 의해 제한 효소 및 리가제의 존재하에 NanoLuc 리포터 플라스미드에 라이게이션될 수 있다는 것이다 (도 11) (따라서 '원 팟'으로 지칭됨). 반응을 이. 콜라이로 형질전환시키고, 생성된 cDNA를 표준 방법에 의해 정제한다. 발명된 방법의 또 다른 이점은 tRNA 및 리포터 유전자가 단일 발현 카세트 내에 있어서, 생물학적 변동성을 낮추고, tRNA 저해 활성의 생성된 스크리닝에서 수득되는 데이터 품질을 개선시킨다는 것이다. 이어서, 정제된 cDNA 플라스미드를 추론된 루시페라제 활성에 의해 넌센스 코돈을 복구시키는 그들의 능력에 대해 고처리량 96 웰 포맷으로 스크리닝한다. 상기 접근법은 신규한 치료 활성을 위해 수백개 내지 수천개의 tRNA의 고처리량 스크리닝에 적합하다.
도 11에 도시된 '원팟' 클로닝 및 발현 시스템은 트립토판 및 글리신 ACE-tRNA (도 13), ACE-tRNA-Arg (도 14), ACE-tRNA-Gln TAG (도 15), ACE-tRNA-Gln TAA (도 16), ACE-tRNA-Glu TAG (도 17), ACE-tRNA-Gln TAA (도 18) 및 ACE-tRNA-Trp TAG (도 19)의 복구를 위해 독특한 tRNA 서열를 확인하기 위해 성공적으로 사용되었다. 도 20a-20d는 소형 RNA로서 ACE-tRNA의 전달이 G542X 및 W1282X 넌센스 돌연변이의 강력한 저해를 뒷받침한다는 것을 보여준다.
실시예 5
조기 종결 코돈의 저해를 위한 조작된 전달 RNA
초록
조기 종결 코돈 (PTC)은 모든 유전 질환의 10-15%를 담당한다. 번역 동안에 PTC 저해는 다양한 유전 장애를 치료하는데 유망한 접근법을 제공하지만, PTC 판독을 촉진시키는 소분자가 임상 시험에서 엇갈린 성능을 나타내었다. 프레임내 PTC를 효과적으로 저해할 수 있고 그들의 동족 아미노산을 충실하게 코딩할 수 있는 안티코돈 조작된 전달 RNA (ACE-tRNA)를 확인하기 위해 고처리량 세포-기반 검정이 제시된다. 전체적으로, ACE-tRNA는 가장 흔한 인간 질환-유발 넌센스 코돈을 표적화하는 높은 정도의 저해 활성을 갖는 것으로 확인되었다. PTC를 복구하는 수준으로 ACE-tRNA를 발현하는 세포의 게놈-전체 전사체 리보솜 프로파일링은, 번역 종결 코돈과의 제한된 상호작용이 있음을 나타낸다. 이들 ACE-tRNA는 포유동물 세포, 크세노푸스 난모세포 및 마우스 생체 내에서 높은 저해 능력을 나타내고, 낭성 섬유증 막경유 전도도 조절인자 (CFTR) 내의 질환 유발 돌연변이를 비롯하여 다중 유전자에서 PTC를 복구시킨다.
서론
조기 종결 코돈 (PTC)은 정규 삼중 뉴클레오티드 코돈을 3가지 정지 코돈 중 하나, 예를 들어 TAG, TGA 또는 TAA로 전환시키는 단일 뉴클레오티드 돌연변이에서 발생한다. PTC는 종종 단백질 발현의 상실을 일으키기 때문에 미스센스 돌연변이보다 더 유해하다. 추가로, mRNA 풍부성은 넌센스-매개된 붕괴 (NMD)를 통해 감소되고, 일부 경우에 말단절단된 단백질은 우세한 부정적인 기능을 가질 수 있다 1-3. 따라서, PTC가 여러 중증의 질환 표현형, 예컨대 낭성 섬유증 4, 뒤센 근이영양증, 척수성 근위축증 5, 유아 신경원성 세로이드 리포푸신증 6, β-지중해 빈혈 7, 시스틴증 8, X-연관된 신성 요붕증 9, 헐러(Hurler) 증후군 10, 어셔(Usher) 증후군 11, 및 다낭성 신장 질환과 연관되어 있음이 놀랍지 않다. 추가로, 넌센스 돌연변이는 종양 저해자 유전자 p53 및 ATM 12 내에서 발생하고, 이는 질환에서 그들의 역할을 추가로 암시한다. PTC 전환에 가장 취약한 아미노산 코돈은 정지 코돈으로부터 단일 뉴클레오티드 치환: 트립토판, 티로신, 시스테인, 글루탐산, 리신, 글루타민, 세린, 류신, 아르기닌 및 글리신을 갖는 것들이다 (도 25). 따라서, PTC는 전세계 3천만명이 넘는 사람에서 발병하는 독특한 질환 무리를 나타내며, 모든 유전 질환의 10-15%를 차지한다 13.
소분자, 예컨대 아미노글리코시드 14, 디펩티드 15, 및 옥사디아졸 16은 넌센스 돌연변이의 "판독" 또는 "저해"를 촉진시킨다. 이들 화합물은 모델 유기체 17, 18, 포유동물 세포주 19 및 일부 동물 질환 모델 16, 20에서 효과적이다. 그러나, 이 접근법은 거의 동족인 아미노산의 코딩을 일으키고 21, PTC에서 미스센스 돌연변이를 효과적으로 생성하고, 그 자체는 단백질 폴딩, 이동 및 기능에 유해한 효과를 갖지 않을 수 있다. 추가로, 아미노글리코시드는 내이독성 및 신장독성이고 22, 혁신 옥사디아졸, 아탈루렌은 환자 집단에서 예상치 못한 낮은 효능을 나타내었고 (ACT DMD 3상 임상 시험, NCT01826487; ACT CF, NCT02139306), 따라서 PTC 치료제로서 구들의 유용성이 제한된다. CRISPR/Cas9-매개된 게놈 편집에서의 최근의 진행중인 발전은 잠재적으로 넌센스 돌연변이로부터 질환에 대한 영구적인 해결을 제공한다. 그러나, 이 기술의 측면은 치료제로서 그의 신속한 사용에 대해 장애물을 부여한다 23, 24. 이는 각각의 환자의 유전자 변이의 맥락을 기반으로 하는 각각의 돌연변이에 대한 "정확성" 또는 "개별화된" 진단의 요건으로 제한되지 않는다.
소분자의 다용성 및 유전자 편집의 정확성을 나타내는 PTC 복구 접근법이 확인되었다. tRNA는 이들 기준을 충족시키는 것으로 조사되었고, 그들의 안티코돈은 UGA, UAA 또는 UAG PTC 코돈을 인식하고 저해하도록 돌연변이 유발을 통해 조작되었다. 효과적이게 하기 위해, ACE-tRNA로도 공지된 안티코돈 편집된 tRNA는 내인성 번역 세포 기구, 예컨대 ACE-tRNA를 그들의 동족 아미노산으로 충전시키기 위한 아미노아실-tRNA 신테타제 및 충전된 tRNA를 리보솜에 전달하기 위한 진핵생물 신장 인자 1a (eEF-1α)에 의해 여전히 인식되어야 한다 (도 21a). 이러한 저해자 tRNA는 제한된 방식으로 β-지중해 빈혈 25, 색소성 건피증 26 및 트랜스제닉 PTC 리포터 유전자 27와 연관된 프레임내 정지 코돈을 구조하는 것으로 확인되었다.
여기서, 안티-코돈 편집 접근법이 다중 tRNA 유전자 패밀리에 일반화될 수 있는 것으로 확인되었고, 이는 주석이 달린(annotated) 여러 tRNA가 생물학적으로 실행가능하다는 것을 나타낸다. 추가로, 안티-코돈 편집된 저해자 tRNA가 그들의 동족 아미노산을 코딩하고, 종결 정지 코돈과의 유의한 상호작용이 결여되고, 생체 내에서 PTC를 저해하는데 유용하다는 것이 입증되었다. 전체적으로, 데이터는 이러한 조작된 tRNA가 질환-유발 PTC의 범위에 대한 넓은 요건을 충족시키고, 따라서 유망한 새로운 부류의 RNA 치료제를 나타낸다는 가능성을 뒷받침한다.
결과
이 연구의 근거는 주어진 동족 아미노산 (이소수용자(isoacceptor))에 대해 독특한 서열 (이소해독자(isodecoder))을 갖는 다중 tRNA 유전자가 있어서, 인간 게놈에서 주석이 달린 >400개 tRNA를 유도한다는 관찰을 기반으로 한다 (http:lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/) 28, 29. 먼저, 포유동물 세포에서 PTC의 저해 효능을 보유한 개별 ACE-tRNA를 확인하기 위해 tRNA 유전자를 실험하였다. 서열 범위를 최대화하기 위해, 포유동물 세포에 전달한 후 ACE-tRNA의 고처리량 클로닝 (HTC), 및 발광을 이용한 PTC 저해의 정량적 측정 둘 다를 뒷받침하는 올인원 cDNA 플라스미드를 생성하였다 (도 21b). ACE-tRNA 서열은 ccdB 음성 선택 31과 함께 골든 게이트 클로닝 30을 이용하여 DNA 올리고로서 HTC 플라스미드로 클로닝되었다. 이 전략은 ~100% 클로닝 효율을 생성하였다. ACE-tRNA 저해 효율을 스플릿 NanoLuc 루시페라제 (NLuc) NanoBiT 플랫폼으로부터 판독하였고, 이로써 관심 PTC (UGA, UAA 또는 UAG)를 96-웰 포맷을 이용하여 큰 비트 및 작은 비트 도메인 사이의 교차점에서 프레임 내에 도입시켰고 (도 21b) 32, NLuc-PTC 발현 세포에서 수득된 백그라운드에 대해 정규화하였다. 21가지 글리신 ACE-tRNA를 먼저 UGA PTC의 저해에 대해 평가하였다 (도 22, 상부 좌측, 컬럼 1 (보라색)). 대부분의 ACE-tRNAGly 서열은 UGA NLuc PTC를 저해하지 못하였지만, 3가지 Gly-tRNAUGA는 높은 저해 수율을 갖는 것으로 확인되었다 (백그라운드에 비해 ~100배). 안티-코돈 내성에 대해 스크리닝된 Gly-tRNA 사이의 높은 서열 보존성을 고려할 때 (도 27), tRNA가 안티코돈-편집에 가장 적합하다는 것을 새로 예측하는 것이 어려울 것이다.
다음으로, 수행된 스크리닝은 질환-유발 PTC를 생성할 수 있는 각각의 가능한 단일 뉴클레오티드 돌연변이에 대해 코돈-편집된 tRNA 상에서 수행되었다: Arg-tRNAUGA, Gln-tRNAUAA, Gln-tRNAUAG Trp-tRNAUGA, Trp-tRNAUAG, Glu-tRNAUAA, Glu-tRNAUAG, Cys-tRNAUGA, Tyr-tRNAUAG, Tyr-tRNAUAA, Ser-tRNAUAG, Leu-tRNAUAG, Leu-tRNAUAA, Lys-tRNAUAG, Lys-tRNAUGA 및 Ser-tRNAUAG. NLuc의 효소 활성은 도입된 아미노산에 의해 상당한 영향을 받지 않았고 (도 28), 따라서 이는 ACE-tRNA 저해 능력에 대한 NLuc 발광에서의 차이 때문이다. 스크리닝은 3가지 모든 정지 코돈에 대해 저해 범위를 갖는 각각의 아미노산 및 정지 코돈 유형에 대한 다중 ACE-tRNA를 확인하였다 (도 22). 이들 여러 ACE-tRNA는 백그라운드에 비해 >100배 PTC 저해를 갖는 강력한 활성을 나타내었고, 이는 이 연구에서 사용된 아미노글리코시드에 비해 상당히 높다. 흥미롭게도, 일부 ACE-tRNA는 특정한 안티코돈 편집에 대해 명백한 선호를 나타내었고, 이는 가능하게는 tRNA 안티코돈 이소수용자 서열에 결합하는 변경된 아미노아실-tRNA 신테타제를 반영한다 33. 예를 들어, UAG로의 트립토판 전환은 동일한 ACE-tRNATrp의 UGA 편집에 비해 10배 더 높은 구조를 제공하였다. 그러나, 글루타민의 경우에는 반대였으며, UAG에 비해 UAA에 대해 명백한 선호를 나타내었다. 주목할만 하게는, 각각의 경우에, 다중 고성능 저해자가 확인되었고, 이는 인간 질환에서 큰 역할을 하는 PTC인 ArgUGA에서 특히 명백하였고; 20가지의 효율적인 ACE-ArgUGA 저해자가 확인되었다. ACE-tRNAGlu와 같이 기능을 나타내는 것들의 다른 경우에, 저해 효율은 UAA 및 UAG에 대해 대략 동등하였다. 그리고, 유사한 패턴이 ACE-tRNALys에서 확인되었고, UAG 또는 UGA 저해를 통한 코딩을 강력하게 반영하였다. Gln-tRNAUAA의 경우, 저해 활성은 백그라운드에 비해 >2,000배의 저해 신호를 생성하였다. 스크리닝에서 확인된 ACE-tRNA 중에서, 트립토판 tRNA 유전자 패밀리는 UGA PTC에 대해 가장 약한 저해 활성을 나타내었다. 스크리닝에서 이용가능한 단지 6가지 독특한 인간 ACE-tRNATrp 서열만을 이용하여, UGA 저해 ACE-tRNATrp 라이브러리를 광범위한 종으로부터의 tRNA를 사용하여 확장시켰다. UGA 안티코돈-편집 내성을 미스코딩 A9C tRNATrp 및 박테리아 Hirsh Trp 저해자 34-36 외에도 효모, 파리, 마우스, 래트, 토끼 및 개구리로부터의 독특한 서열을 갖는 트립토판 tRNA 유전자에 대해 시험하였다 (도 29a-29b). 이러한 노력은 인간 ACE Trp tRNA의 것을 능가하는 ACE-tRNATrp UGA PTC 저해 활성을 확인하는데 실패하였다 (도 29c). 전반적으로, tRNA 스크리닝은 강력한 저해를 나타내고, 따라서 안티코돈 편집에 대해 일반적인 내성을 보유하는 다중 조작된 tRNA (각각의 아미노산 및 정지 코돈 유형에 대해)를 확인하였다.
다음으로, 스크리닝에서 확인된 ACE-tRNA가 동족 아미노아실-tRNA 신테타제에 의한 아미노아실화 엄격성을 희생하면서 기능화되는지 여부를 정립하였다. 이를 위해, 질량 분광법을 이용하여 모델 가용성 단백질인 히스티디놀 데히드로게나제 (HDH)에서 PTC 저해를 실험하였다 (도 23a). TGA 코돈을 아스파라긴 94 (N94)에 도입시키고 (도 30a-c), HEK293 세포에서 각각 최고 성능 글리신 및 트립토판 ACE-tRNAUGA인 Glychr19.trna2 또는 Trpchr17.trna39 ACE-tRNA를 코딩하는 플라스미드와 함께 공동 발현시켰다. 생성된 전장의 저해된 HDH 단백질을 스트렙-탁틴(Strep-Tactin)® C-말단 친화도 태그를 통해 정제하고, 질량 분광법에 의해 분석하였다 도 23a (도 28). 데이터의 후속적인 검색에 의해 Trp chr17.trna39의 경우 및 Glychr19.trna2의 경우 각각 Asn에서 Trp의 변형 (+72 Da) 및 (-57 Da)을 확인하였고, 따라서 각각의 ACE-tRNA 유형에 대한 동족 아미노산의 충실한 코딩을 확인하였다. 중요하게는, 각각의 경우에 HDH p.N94X 부위에서 확인된 펩티드의 >98%가 코딩된 동족 트립토판 및 글리신을 가졌다. 추가로, ACE-tRNA 둘 다 UAA 및 UAG에 비해 UGA 정지 코돈에 대한 선택성을 보유하였다 (도 23b (ACE-tRNAGly) 및 도 31 (ACE-tRNATrp)). 마지막으로, 일시적으로 발현될 때, ACE-tRNAGly는 HEK293 세포에서 안정하게 발현된 NLuc-UGA를 저해하는 그들의 능력에 있어서 통상적인 소분자 저해자 겐타마이신 (40 μM) 및 G418 (140 μM)를 능가하였다 (도 23c). ACE-tRNATrp의 경우에도 동일하였고, 이는 보다 낮은 저해 효율을 갖지만 G418에 비해에 비해 PTC 구조를 능가한다 (도 33a-d).
조기 정지 코돈의 유효한 저해를 나타내는 ACE-tRNA가 본래의 정지 코돈의 전체적인 판독을 또한 유도할 수 있는지 여부에 대한 궁금증이 제기되었다. 이러한 잠재적인 "부정확한" 저해를 다루기 위해, 모든 세포 전사체에 대해 능동적으로 결속된 리보솜의 트랜스크립톰-전체 정량적인 프로파일을 외인성 ACE-tRNA 또는 대조군 mock 플라스미드 (puc57GG)를 발현하는 HEK293 세포로부터 리보솜 풋프린트의 라이브러리를 생성함으로써 수득하였다. 성장 배지로부터 스트렙토마이신을 제거하여, 판독 허상을 방지하였다. 비교를 위해, 리보솜 풋프린트 라이브러리 또한 G418 (150 μM, 48 h)의 존재 또는 부재하에 세포로부터 생성하였다. 도 24a는 3'UTR 영역 상에서 대조군과 비교한 G418 및 5가지 ACE-tRNA의 리보솜 풋프린트 밀도 (log2-배수 변화)를 도시한다. 2개의 복제 라이브러리에서 코딩 서열에서 5 RPKM 및 3'UTR에서 0.5 RPKM의 최소 임계치를 갖는 전사체만이 정량 비교에 포함되었다 (G418에서 254개 전사체 및 ACE-tRNA에서 495-748개 전사체). 이 시스템에서, G418은 임의의 3가지 내인성 정지 코돈 그룹에 대해 전사체-전체 3'UTR 리보솜 밀도에 대해 관찰가능한 효과를 갖지 않았다. ACE-tRNA 안티코돈에 대해 상보성인 동족 정지 코돈에 대해 3'UTR 리보솜 밀도에서 대략 2배 증가를 유도한 ACE-tRNA Gln-UAA 및 Arg-UGA를 제외하고는, 여기서 실험한 ACE-tRNA는 3'UTR 리보솜 밀도의 검출가능한 변화를 갖지 않았다. 단백질 정지의 2배 판독의 생물학적 유의성을 이해하기 위해서는 추가의 연구가 필요할 것이지만, 이 효과는 동일한 ACE-tRNA에 대한 PTC의 100배 내지 1000배 저해에 비해 실질적으로 낮다.
다중 프레임내 정지 코돈은 유전자의 말단에서 빈번하게 발견되고 37-39, ACE-tRNA 및 G418 처리의 경우 전반적인 3'UTR 리보솜 밀도에서 약간의 차이를 초래할 수 있다. 리보솜 점유를 정지 코돈의 60 nt 영역 하류 내에 있는 3'UTR에서 각각의 뉴클레오티드에 대해 실험하였다. 도 24b는 정지 코돈의 첫번째 뉴클레오티드에 비해 -35 내지 +65 nt 영역 내에 있는 각각의 뉴클레오티드에 대한 본래의 정지 코돈을 둘러싸는 리보솜 점유를 입증한다. 대조군 세포와 비교하여 총 백만개-맵핑된 판독마다 판독을 정규화하였고, 패널 A에서와 같이 log2-배수 변화로서 보고하였다. 5,200개 초과의 전사체를 관심 영역에서 적어도 1개 풋프린트에 맵핑하였다. ACE-tRNA Gln-UAA 및 Arg-UGA는 초기 영역에서 현저히 증가된 리보솜 점유를 나타낼 뿐만 아니라, 특징적인 3-nt 주기성을 나타내며, 이는 리보솜이 무작위로 분포되지 않지만 코돈별 이동을 따른다는 것을 나타낸다. UGA-Trp, UGA-Gly 및 UAG-Glu에 대한 ACE-tRNA, 또는 G418는 심지어 3'UTR의 초기 영역에서도 리보솜 점유의 관찰가능한 변화를 일관되게 나타내지 않았다. 종합하면, 리보솜 프로파일링 데이터는 ACE-tRNA에 의한 본래의 정지 코돈 저해의 효율이 일반적으로 낮고, PTC 저해 수준보다 현저히 낮음을 입증한다.
논의
PTC는 수많은 인간 질환을 유발하고, 그들의 치료적 관리를 위한 정립된 치료적 옵션이 없다. 진핵생물 세포 및 마우스 골격근에서 유효한 PTC 복귀를 나타내는 안티코돈-편집된 tRNA의 고처리량 클로닝 및 확인, 특징분석 및 기능적 분석이 여기에서 보고된다. 주목할만 하게는, 스크리닝은 대부분의 공지된 인간 질환-유발 PTC를 복구하는 능력을 갖는 ACE-tRNA를 전체적으로 확인한다. 조작된 tRNA는 그들의 동족 아미노산을 충실하게 코딩하며, 따라서 하류 단백질 안정성, 폴딩 및 이동에 대한 거짓 효과를 없애고, 결과적으로 단백질 폴딩 또는 이동 작용제를 수반하는 탠덤 요법에 대한 필요성을 무효화시킨다. cDNA로서 형질감염될 때, ACE-tRNA는 PTC 저해를 통해 다중 전장 단백질을 구조하였다; NLuc 루시페라제 리포터, 모델 단백질 HDH, 및 CFTR에서의 2개의 질환 넌센스 돌연변이. 마우스 골격근에서 강력한 및 안정한 생체내 PTC 저해는 ACE-tRNAArg cDNA에 의해 나타났고, 이는 ACE-tRNA 활성에 대해 특히 높은 수준의 세포 내성을 시사한다. 근육에서 아르기닌에 대한 활성 ACE-tRNA의 확인은 넌센스 돌연변이에 의해 유발되는 디스트로핀병증의 치료와 관련이 있다. 대부분의 유전 질환과 마찬가지로, 디스트로핀병증의 10% 초과는 넌센스 돌연변이에 의해 유발되고 43, CGA->TGA 돌연변이가 가장 많이 발생하였다 43. 효율적인 저해는 또한 합성 RNA 전사체로서 전달된 ACE-tRNA에 의해 달성되었고, 따라서 나노입자 제형의 발달을 가능하게 하였다. 추가의 연구는 각각의 조직 및 질환 유형에 대해 이상적인 tRNA 전달 전략을 평가하기 위해 필요할 것이며, 노력에 의해 핵산 전달을 위해 급속히 확장된 기술로부터 이익을 얻을 것이다.
PTC를 저해하는 작용제는 본래의 정지 코돈을 또한 판독하는 잠재성을 갖는다. 본원에서 제시된 RNA 프로파일링 데이터는, 이것이 일반적으로 세포에서의 경우가 아니라, 시험된 코돈-편집된 tRNA에 대한 것임을 시사한다. Arg-tRNAUGA 및 Gln-tRNAUAA에 의해 검출가능한 판독이 발견되었지만, Glu-tRNAUAG, UGA-Gly-tRNAUGA 및 Trp-tRNAUGA에 의해 전체 번역 종결에 대한 유의한 효과는 관찰되지 않았다. 이 거동은 정지 코돈 유형, 또는 tRNA의 고유의 PTC 저해 활성과 명백하게 구분되지 않았다. ACE-tRNA가 실제 정지 코돈에서 판독을 비효과적으로 촉진시킨다는 하나의 잠재적인 이유는 번역 종결 근처의 맥락적 서열 환경으로 인한 것일 수 있다 44. 이러한 가능성은 PTC에서 종결 복합체의 조성이 본래의 정지와 상이하다는 발견에 의해 뒷받침된다 45, 46. 그러나, 보다 낮은 수준의 판독이 발생하는 경우에는, 정상적인 정지 판독 및 그의 손상 효과 둘 다를 제한하기 위해 다중 세포 메카니즘이 있다. 다중 프레임내 정지 코돈은 유전자의 말단에서 빈번하게 발견되고 37-39, 특수화된 유비퀴틴 리가제 47 및 리보솜 연관된 경로 48는 잘못된 번역 종결을 갖는 단백질을 확인하고 분해하는 것으로 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 포유동물 세포에서 확인된 제한된 영향에도 불구하고, 유사한 리보솜 프로파일링 실험이 ACE-tRNA 전달 및 발현에 대해 원하는 세포 또는 조직 유형에서 수행되어야 한다.
이전의 연구는 주변 mRNA 서열이 아미노글리코시드 및 아탈루렌 PTC의 고유의 정지 코돈 저해 효능에 영향을 미치고 49-52, ACE-tRNA가 유사하게 영향을 받을 수 있음을 보여주었다. 추가로, 바이러스 또는 비-바이러스 전달을 통해 PTC 함유 유전자를 대체하기 위한 유전자 부가 전략이 일부 상황에서는 단기간 이익을 달성하였지만, 이는 트랜스진 발현 수준을 조절하기 어려울 수 있다. 대조적으로, ACE-tRNA 저해를 통한 단백질 구조의 풍부성은 본래의 세포 RNA 수준과 연관되어, 높은 발현 수준이 본질적으로 조절될 것이다. 생물학적 목적은 인간 게놈에서 대부분의 가변 이소수용자 tRNA 서열에 대해 알려지지 않았고, 거의 절반의 이들 유전자가 전사적으로 침묵인 유사 유전자인 것으로 추측되었지만 53, 여기서 데이터는 주석이 달린 여러 tRNA가 가능함을 시사한다. 이러한 가능성과 일치하게, 저해 접근법은 Ser 및 Leu 이소수용자 패밀리 내의 기능적 이소해독자 tRNA를 확인하기 위해 이용되었다 54. 여기에 제시된 데이터는 대부분의 tRNA 유전자 서열이 게놈 맥락으로부터 제거될 때 가능한 활성을 뒷받침한다는 것을 입증하고, 이는 다수개의 tRNA에 대한 생물학적 필요 및 코돈 사용에 대한 미스터리를 심화시킨다. 따라서, 여기에 기재된 고처리량 저해 전략은 독특한 저해 성질을 갖는 tRNA 서열의 새로운 유형을 확인하는데 유용할 것이고, 이러한 연구는 새로운 RNA 시약을 생성하는 것에 대한 잠재성, 뿐만 아니라 tRNA 발현 및 저해에 대한 분자적 이해의 발전을 갖는다.
재료 및 방법
넌센스 리포터 HTC 플라스미드
사용된 모 플라스미드는 pcDNA3.1(+)이었다. pNLuc를 코딩하는 cDNA는 제한 부위 HindIII 및 XhoI로의 깁슨 어셈블드(Gibson Assembled) (미국 뉴잉글랜드 바이오랩스)이었다. 글리신 (코돈 gga), 트립토판 (tgc), 앰버 (tag), 오팔 (tga) 및 오커 (taa)를 cDNA pcr 동안에 아미노산 위치 160에 부가하였다. pcDNA3.1(+) polyA 서열을 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly) 기반의 pcr을 이용하여 BbsI 제한 부위를 갖지 않는 것으로 대체하였다. 먼저 상류에 T7 프로모터 서열 (이탤릭체)를 갖는 인간 tRNATyr 유전자 (볼드체)의 5' 리더 서열 (TAATACGACTCACTATAG AGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC) (Ye et al., 2008)에 이어서, 2개의 BbsI 제한 부위 ( 볼드체 이탤릭체 ) (TA GTCTTC GG (ccdB 카세트) AA GAAGAC CG) 및 3' 종결 서열 (볼드체)에 이어서, 역 T3 프라이머 서열 (이탤릭체) (GTCCTTTTTTTG CTTTAGTGAGGGTTAATT)을 삽입함으로써 고처리량 ACE-tRNA 골든 게이트 클로닝 부위를 생성하였다.
ACE-tRNA 라이브러리의 HTC
tRNA 유전자 서열을 tRNA 데이터베이스 tRNAscan-SE (http://gtrnadb.ucsc.edu/index.html; PMID: 26673694)로부터 입수하였다. 이 연구에서 사용된 모든 tRNA 유전자의 서열을 도 26 및 표 9에 넘버링하였다. tRNA 서열은 적절하게 돌연변이된 그들의 상응하는 안티코돈 (UAG, UGA 또는 UAA)에 의해 200pmol 규모로 96 웰 포맷에서 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈 (Integrated DNA Technologies, IDT, 미국)로부터의 상보성 울트라머로서 합성되었다. 모든 tRNA 서열은 각각 정방향 및 역방향 올리고 상에 CGAC 및 GGAC 오버행 (주석이 달린 5'->3')을 갖도록 합성되었다. 울트라머를 어닐링 완충제 (100 mM 아세트산칼륨; 30 mM HEPES, pH 7.5) 중에서 100ng/μl로 재현탁시키고, 2 분 동안 96℃로 가열하고, 써모사이클러에서 1℃/min에서 4℃로 냉각시킴으로써 어닐링하였다. 96 웰 PCR 플레이트에서, 적절한 PTC 코돈을 갖는 10ng의 HTC 플라스미드, 2ng의 ACE-tRNA 듀플렉스, 1mM ATP, 10mM DTT, 400 단위 T4 DNA 리가제, 및 10 단위 BbsI-HF를 함유하는 각각의 웰을 ddH2O에 의해 10ul로 켄칭시켰다. 96 웰 플레이트를 다음과 같이 사이클링하였다 (써모사이클러에서 [37℃에서 5 분, 20℃에서 5 분] x 30 주기, 37℃에서 10 분, 80℃에서 10 분, 및 4℃로 냉각). 깊은 웰을 갖는 96 웰 플레이트에서, 1ul의 골든 게이트 반응을 10ul의 DH5α 화학적으로 적격성인 세포 (써모피셔(ThermoFisher), 미국)에 첨가하고, 42℃에서 30 초 동안 열 충격을 가하고, 100ul의 수퍼 옵티말 브로쓰 (Super Optimal Broth, S.O.C.; 써모피셔, 미국) 중에서 재현탁시켰다. 형질전환을 37℃에서 1 시간 동안 250 rpm에서 성장시킨 다음, 100ug/ml 카르베니실린으로 보충된 2ml의 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 액체 배지 (LB)에 첨가하고, 차폐된 깊은 48 웰 플레이트에서 37℃에서 20 시간 동안 300 rpm에서 성장시켰다. 이. 콜라이 성장을 깊은 웰 플레이트 및 엔자이스크린(Enzyscreen) (http://www.enzyscreen.com)으로부터의 클램프에서 수행하였다. 이. 콜라이 현탁액 배양물을 회전시키고 (10 분, RT에서 4,000g), 플라스미드 DNA를 제조하고, 125ng/μl로 희석하였다 (아이비아이 사이언티픽(IBI scientific), 미국). 모든 클론에 대해 서열 검증하였다. 이 방법을 이용하여 100% 클로닝 효율이 달성되었다.
ACE-tRNA 라이브러리의 HTS
형질감염하기 전날에, HEK293 세포 (<40 계대)를 10% FBS, 1% Pen/Step 및 2mM L-글루타민으로 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형된 필수 배지 (DMEM) (써모피셔, 미국) 중에서 96 웰 세포 배양물 처리된 플레이트에 1.4 x 104 세포/웰로 플레이팅하였다. ACE-tRNA 유전자를 갖는 올인원 넌센스 리포터를 칼펙틴(Calfectin) (사이나겐(Signagen), 미국)을 이용하여 3벌식/플레이트에서 형질감염시켰다. 형질감염 16 시간후, 배지를 흡인하고, 20ul의 PBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 15ul의 용균성 나노-글로® 루시페라제 검정 시약을 각각의 웰에 첨가하였다 (1:50 시약 대 완충제; 프로메가, 미국). 회전식 진탕 후에 플레이트를 2 분 동안 인큐베이션하고, 스펙트라맥스 i3 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈, 미국; 통합 시간, 200ms; 종점 방식으로 수집된 모든 파장)를 이용하여 판독하였다. 발광을 각각의 실험에 대해 3개의 웰에 걸쳐 평균하였고, 모든 ACE-tRNA를 이러한 방식으로 3회 초과로 반복하였다. 각각의 플레이트는 또한 형질감염 효율 및 기준선 PTC 판독을 위한 대조군으로서 작용하기 위해 ACE-tRNA를 갖지 않는 올인원 넌센스 리포터에 의해 형질감염된 3벌식 웰에 함유되었다. 모든 값은 기준선 PTC 판독 발광에 비한 ACE-tRNA 발광의 비 ± SEM으로 보고된다. 주어진 아미노산 패밀리에서 모든 ACE-tRNA에 걸쳐 터키(Tukey) 사후 분석에 의해 일원 ANOVA를 수행하였다.
CFTR, HDH-his-strep 및 4xACE-tRNA 발현 플라스미드
포유동물 세포에서의 발현을 위해, 인간 CFTR의 3' 비번역 영역 (UTR)의 코딩 영역 및 200개 염기쌍에 대한 cDNA를 KpnI 및 XbaI 제한 효소를 사용하여 pcDNA3.1(+) (프로메가, 미국)에 라이게이션하였다. G542tga 및 W1282tga 돌연변이를 퀵체인지(QuickChange) XL II (스트라타진(Stratagene), 미국)를 이용하여 도입하였다. 크세노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 난모세포에서의 발현을 위해, 인간 CFTR의 코딩 영역 및 5'의 140개 염기쌍, 및 244개 염기쌍 3' UTR에 대한 cDNA를 pGEM-HE (프로메가, 미국)에 라이게이션하였다. G542tga 및 W1282tga 돌연변이 둘 다를 퀵체인지 XL II를 이용하여 도입하였다. 이. 콜라이 히스티디놀 데히드로게나제를 코딩하는 cDNA를 무스 무스쿨루스(mus musculus)에 대해 코돈 최적화하고, 포유동물 세포로부터 단백질 정제를 위해 c-말단 8xHis-Strep- 태그를 갖도록 합성하였다 (바이오베이직 인크(BioBasic Inc), 캐나다). 합성된 cDNA를 EcoRI 및 XhoI 제한 부위를 이용하여 pcDNA3.1(+)에 라이게이션하였다. 넌센스 돌연변이 tag, taa 및 tga를 퀵체인지 XL II를 이용하여 도입하였다. 멀티플렉스 ACE-tRNA 발현 플라스미드를 생성하기 위해, EcoRI 및 HindIII 제한 부위 사이에 BbsI "다중 클로닝 부위" (5'-GAATTCTTCCCGAGACGTTCCAAGTCTTCATGAAGACTACAGGCGTCTCCCAGGAAGC-3'; 방향성 BbsI 인식 서열은 이탤릭체로 나타내고, 라이게이션을 위한 독특한 4개 염기쌍 오버행은 볼드체로 나타냄)를 삽입함으로써 신규한 모 골든 게이트 pUC57(amp) 플라스미드를 생성하였다. pUC57(amp)은 비교적 작은 크기를 갖고 백본 BbsI 제한 부위 및 T7 및 T3 프로모터 서열을 갖지 않기 때문에, 이를 모 플라스미드로 선택하였다. HTS 플라스미드에 포함된 특징부는 ACE-tRNA 카세트를 플랭킹하는 T7 및 T3 프로모터 서열이며, 이는 pcr 증폭에 대해 이상적인 비교가능한 융점 (Tm)을 갖는 보편적인 프라이머 결합 서열을 제공한다. NEB 골든 게이트 조립 도구 (https://goldengate.neb.com/editor)를 이용하여, T7 및 T3 플랭킹 서열에 어닐링되고 원위의 BbsI 인식 서열의 절단 이후 독특한 4개 염기쌍 오버행을 생성하는 pcr 프라이머를 생성하였다. 최종 결과는, 상보성 4개 염기쌍 오버행을 통해 "데이지-연쇄될(daisy-chained)" 수 있고, 원팟 골든 게이트 반응을 이용하여 puc57 골든 게이트 플라스미드에 라이게이션될 수 있는 보편적인 pcr 프라이머를 사용하여 4개 ACE-tRNA pcr 생성물의 생성이었다. 모든 클론에 대해 서열 검증하였다.
세포 배양, 단백질 발현 및 웨스턴 블롯
HEK293T 세포 (ATCC, 미국)를 37℃, 5% CO2에서 고 글루코스 DMEM (깁코(Gibco), 미국) 중에 10% FBS (하이클론(HiClone), 미국), 1% Pen Strep, 1 % L-Glut를 함유하는 표준 성장 배지 (% v/v)에서 성장시켰다. 표준 프로토콜 (사이나겐 래버러토리즈(SignaGen Laboratories), 미국)에 따라 칼펙틴을 사용하여 75% 전면생장으로 cDNA를 형질감염시켰다. 36 시간 후에, 세포를 스크랩핑하고, 0.5 μg/ml 펩스타틴, 2.5 μg/ml 아프로티닌, 2.5 μg/ml 류펩틴, 0.1 mM PMSF, 0.75 mM 벤즈아미딘으로 보충된 PBS 중에서 7,000g하에 8 분 동안 4℃에서 펠렛화하였다. CFTR 발현 세포의 경우, 세포 펠렛을 100mM 수크로스, 150 mM NaCl, 1mM DTT, 0.5 μg/ml 펩스타틴, 2.5 μg/ml 아프로티닌, 2.5 μg/ml 류펩틴, 0.1 mM PMSF, 0.75 mM 벤즈아미딘, 50 mM Tris-HCL ph 7.4 중에서 격렬하게 다운싱하였고, 100,000g에서 원심분리하여, 가용성 시토졸 단백질로부터 전체 막을 분리하였다. 펠렛을 1% 트리톤, 250mM NaCl, 50mM tris-HCl pH 7.4, 및 0.5 μg/ml 펩스타틴, 2.5 μg/ml 아프로티닌, 2.5 μg/ml 류펩틴, 0.1 mM PMSF, 0.75 mM 벤즈아미딘을 함유하는 완충제 중에서 가용화시켰다. 동등한 세포-용해물을 1% 2-머캅토에탄올의 존재하에 4% 스택킹 겔에 의해 3-15% 분리 구배 SDS-page 상에 로딩하고, 55 V O/N에서 분리하고, 0.45 μM LF PVDF (바이오-라드(Bio-Rad), 미국)로 전달하였다. PVDF를 2% 무지방 우유 중에서 항-CFTR 항체 M3A7 (1:1000; 밀리포어, 미국)을 사용하여 면역블롯팅하고, 리-코어 오디세이(LI-COR Odyssey) 영상화 시스템 (리-코어(LI-COR), 미국) 상에서 영상화하였다. HDH-His-Strep 발현 세포의 경우, 세포 펠렛을 100mM 수크로스, 1mM DTT, 1mM EDTA, 20mM tris-HCl pH 8.0, 0.5 μg/ml 펩스타틴, 2.5 μg/ml 아프로티닌, 2.5 μg/ml 류펩틴, 0.1 mM PMSF 및 0.75 mM 벤즈아미딘 중에서 강력하게 다운싱 균질화하였다. 용해물을 100,000g하에 30 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액 (가용성 세포 단백질)을 1% 2-머캅토에탄올의 존재하에 4-12% Bis-Tris SDS-page 아크릴아미드 겔 (써모피셔, 미국) 상에서 분리하고, 0.22 μM LF PVDF (바이오-라드, 미국)로 옮기고, 2% 무지방 우유 중에서 항-Strep 항체 (1:5000; iba, 독일)를 사용하여 면역블롯팅하고, 리-코어 오디세이 영상화 시스템 (리-코어, 미국) 상에서 영상화하였다.
질량 분광법
정제된 HDH-His-Strep 단백질 상에서 단편화 데이터를 유니버시티 오브 아이오와 프로테오믹스 퍼실리티(University of Iowa Proteomics Facility)에서 입수하였다. 간략히, 고속 스핀의 가용성 분획으로부터의 HDH-His-Strep 단백질을 스트렙트랩(StrepTrap) HP 컬럼 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 스웨덴)에 통과시키고, 5 컬럼 부피의 100mM 수크로스, 1mM DTT, 1mM EDTA, 20mM tris-HCl pH 8.0, 0.5 μg/ml 펩스타틴, 2.5 μg/ml 아프로티닌, 2.5 μg/ml 류펩틴, 0.1 mM PMSF 및 0.75 mM 벤즈아미딘으로 세척하였다. 단백질을 10mM d-데스트비오틴으로 보충된 세척 완충제 중에서 용리시키고, 30kDA 컷오프 아미콘-울트라(Amicon-Ultra) 여과 컬럼 (밀리포어, 미국)에서 농축시켰다. 농축된 단백질을 누페이지(NuPage) 4-12% Bis-Tris 프리캐스트 겔 (인비트로젠(Invitrogen), 미국) 상에 로딩하고, 150V에서 1.5 시간 동안 분리시켰다. 겔을 피어스(Pierce) 질량 spec 상용성 은 염색 키트 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 미국)를 사용하여 염색하였다.
겔내 트립신 소화. 간략히, SDS-PAGE 겔로부터의 표적화된 단백질 밴드를 수동으로 절제하고, 1 mm3 조각으로 절단하고, 각각 100 mM 중탄산암모늄:아세토니트릴 (1:1, v/v) 및 25 mM 중탄산암모늄 /아세토니트릴 (1:1, v/v)로 세척하여, 완전한 탈염색을 달성하였다. 겔 조각을 ACN으로 추가로 처리하고, 스피드 백(speed vac)을 통해 건조시켰다. 건조시킨 후, 겔 조각을 56℃에서 60 분 동안 50 μl의 10 mM DTT 중에서 환원시킨 다음, 실온에서 30 분 동안 55 mM IAM에 의해 알킬화시켰다. 겔 조각을 25 mM 중탄산암모늄:아세토니트릴 (1:1, v/v)로 2회 세척하여, 과량의 DTT 및 IAM을 제거하였다. 건조시킨 후, 겔 조각을 25 mM 중탄산암모늄 중에서 10 ng/μL로 50 μL의 트립신 용액 중의 얼음 상에 놓고, 얼음 상에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 소화를 37℃에서 16 시간 동안 수행하였다. 펩티드 추출을 100 μl의 50% 아세토니트릴/0.2% 포름산에 의해 0.5 시간 동안 2회 수행하였다. 합한 추출물을 스피드 백에서 ~15 μl로 농축시켰다.
LC-MS/MS. 질량 분광법 데이터를 엑시전트 엑스퍼트(Eksigent Ekspert)™ nanoLC 425 시스템 (사이엑스(Sciex))에 커플링된 오르비트랩 퓨전 루모스(Orbitrap Fusion Lumos) 질량 분광계 (써모피셔 사이언티픽, 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 수집하였다. 트랩-일루트 점퍼 칩(Trap-Elute Jumper Chip) (P/N:800-00389) 및 커플링된 1/16" 10 포트 발코(Valco)는 구배 1 펌프에 의해 수행된 로딩 및 최종 용리 (구배 2 펌프에 의해)를 지시하였다. 컬럼 조립은 엑스퍼트™ cHiPLC 시스템에 탑재된 2개의 탠덤 75 μmx15cm 컬럼 (ChromXP C18-CL, 3μm 120A, AB 사이엑스의 엑시전트 부분)으로서 설계되었다. 각각의 주사를 위해, 추정된 0.5 μg의 총 소화물을 로딩하였다. 펩티드를 선형 및 정적 세그먼트로 구성된 120 분 구배를 이용하는 질량 분광계에 의해 인라인으로 분리하였고, 완충제 A는 0.1% 포름산이고, B는 95%ACN, 0.1% 포름산이다. 구배는 처음에는 3 분 동안 4%에서 유지로 시작한 다음, 다음과 같이 전환된다 (%B, 분): (26, 48), (35, 58), (35, 64), (50, 72), (50, 78), (94, 84), (94, 96), (4, 100), (4, 120).
루모스 오르비트랩 상에서 탠덤 질량 분광법. 스캔 순서는 오프 액시스 오르비트랩 세그먼트 (MS1)에서 60,000의 해상도에서 오르비트랩 퓨전 루모스 질량 분광계 (써모) 상에서 획득한 전체 조사 (m/z 350 -1500)로 시작되었다. 3 초마다의 구배 MS1 스캔을 상기 기재된 120 분 구배 동안에 수득하였다. 가장 풍부한 전구체는 2.0E5 임계치에서 2-8 하전 상태 이온 중에서 선택되었다. 이온이 이전 30 초 동안 2회 표적화된 경우에는, 이를 30 초 동안 동적으로 제외시켰다. 선택된 이온을 m/z 2의 질량 범위를 갖는 다중-세그먼트 사중극자에 의해 단리한 다음, 순차적으로 각각 IT 및 ioin 경로 다중극자에서 CID 및 HCD 활성화 상태 둘 다에 적용하였다. CID에 대한 AGC 표적은 4.0E04, 35% 충돌 에너지, 0.25의 활성화 Q 및 100 밀리초 최대 충전 시간이었다. 표적화된 전구체는 또한 고에너지 충돌-유도된 해리 (HCD)에 의해 40% 충돌 에너지 및 0.25의 활성화 Q에서 단편화되었다. HCD 단편 이온을 오르비트랩을 이용하여 분석하였다 (AGC 1.2E05, 최대 주사 시간 110 ms, 및 400 Th에서 30,000로 설정된 해상도). MS2 채널 둘 다 중심으로 기록되었고, MS1 조사 스캔은 프로파일 방식으로 기록되었다.
단백질 검색. 초기 스펙트럼 검색을 세퀘스트(Sequest) HT를 이용하여 프로테옴 디스커버(Proteome Discoverer) 버젼 2.1.1.21 (써모피셔 사이언티픽, 미국)에 의해 수행하였다. 스펙트럼을 또한 바이오닉 서치 엔진(Byonic search engine) (프로테인 메트릭스(Protein Metrics)) 버젼 2.8.2에 의해 검색하였다. 검색 데이터베이스는 92645개 서열을 함유하는 10/24/2016에 다운로드된 종 9606 (인간)에 대한 유니프롯(Uniprot) KB 및 10079개 서열을 함유하는 11/08/2016에 다운로드된 분류학 562 (이. 콜라이)에 대한 유니프롯 KB로 구성되었다. 바이오닉 검색의 경우, 이들 두 데이터베이스를 직접적으로 연관시켰다. 어느 하나의 검색에서, 표적 데이터베이스에서 원래의 항목을 역전시킴으로써 동시에 동등한 개수의 유인 항목을 생성하고 검색하였다.
시험관내 cRNA 전사. G542XUGA, W1282XUGA, 및 WT CFTR pGEMHE (Mense et al., 2006; PMID:1703051) 플라스미드를 10 x 과량의 NheI-HF 제한 효소 (코딩 영역의 3'에 위치하는 부위) (미국 뉴잉글랜드 바이오랩스)에 의해 37℃에서 3 시간 동안 선형화하고, 표준 cDNA 침전 방법을 이용하여 정제하였다. 모든 cRNA를 메시지 머신(mMessage mMachine) T7 키트 (써모피셔 사이언티픽, 미국)를 사용하여 전사시켰다. 전사 반응으로부터 cRNA의 정제를 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen), 독일)로부터의 컬럼 상에서 수행하였다. 농도를 260 nm에서 흡광도 측정에 의해 결정하고, 품질을 1% 아가로스 겔 (RNase-무함유) 상에서 확인하였다. 사용하기 전에 모든 cRNA를 1μg/ml로 대기시켰고, 모든 결과는 ≥2 cRNA 제조물로부터 생성되었다.
시험관내 tRNA 전사. Trpchr17.trna39 및 Glychr19.trna2, 상위 수행 Trp 및 Gly ACE-tRNA를 시험관 내에서 셀스크립트 T7-스크라이브(CellScript T7-Scribe) 표준 RNA IVT 키트 (셀스크립트(CELLSCRIPT), 미국)를 사용하여 전사시켰다. 등몰 농도의 T7 올리고 (5'-taatacgactcactata-3')는 ACE-tRNA를 코딩하는 ACE-tRNA PAGE-정제된 울트라머 (20ug; 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈, 아이오와주 코럴빌)에 어닐링하였고, T7 프로모터 (이탤릭체) 앞에 있었다. 중요하게는, CCA를 함유하는 3개의 말단 뉴클레오티드가 포함되었다 (볼드체).
Figure pct00010
총 반응 부피를 100 μl로 조정하였고, 키트 시약을 하기 양으로 첨가하였다: 10 μl의 10X T7-스크라이브 전사 완충제, 7.5 μl의 각각의 뉴클레오티드 (100 mM 스톡), 10 μl의 100 mM 디티오트레이톨, 2.5 μl 스크립트가드(ScriptGuard) RNase 억제제, 10 μl의 T7-스크라이브 효소 용액. 반응을 4-5 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에, DNA 주형을 키트에 제공된 5 μl DNase (1 U/μl)에 의해 30-60 분 동안 소화시켰다. ACE-tRNA를 산성 페놀 클로로포름 (5:1, pH 4.5)에 의해 반응으로부터 추출하고, 에탄올에 의해 침전시켰다. 침전물 ACE-tRNA를 펠렛화하고, 세척하고, 건조시키고, 100 μl의 DEPC-처리된 물 중에서 재현탁시키고, 크로마 스핀(Chroma Spin)-30 컬럼 (클론테크(Clontech), 미국)에 의해 추가로 정제하였다. 절차는 대략 100 μl의 ~5 μg/μl ACE-tRNA를 생성하였다. ACE-tRNA를 20ug 분취량으로 다시 펠렛화하고, 세척하고, 동결건조시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 모든 결과를 ≥2 ACE-tRNA 제조물로부터 생성하였다.
리보솜 풋프린트 프로파일링 라이브러리 제조. ACE-tRNA 및 대조군 플라스미드 (puc57GG)에 의해 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포를 Pen-Strep의 부재하에 표준 성장 배지에서 48 시간 동안 성장시켰다. 라이브러리를 기재된 바와 같이 제조하였고55, 일부 변형하였다. 간략히, 세포를 빙온 PBS의 첨가에 의해 급속히 냉각시키고, 용해 완충제 (20 mM Tris-HCl/pH7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% (v/v) 트리톤 X-100, 및 25 U ml-1 터보(Turbo) DNase I) 중에서 10 분 동안 얼음 상에서 용해시키고, 26-G 니들을 통해 10회 분쇄하였다. 16,000g하에 10 분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 클리어런스한 후, 200 U 리보록(RiboLock) RNase 억제제 (써모 사이언티픽)를 첨가하기 전에 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 45 분 동안 A260 용해물당 100 U RNase I (암비온(Ambion), 미국)에 의해 용해물을 소화시켰다. 이어서, 리보솜 보호된 mRNA 단편을 변형된 폴리솜 완충제 (20 mM Tris-HCl/pH7.4, 150 mM NaCl, 8.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 20 U ml-1 리보록 RNase 억제제) 중에서 제조된 1M 수크로스 쿠션 상에 용해물을 로딩함으로써 단리하고, 베크만(Beckmen) TLA-110 로터를 이용하여 70,000 rpm하에 4℃에서 2 시간 동안 원심분리하였다. mRNA 풋프린트를 함유하는 리보솜 펠렛을 TRIzol을 사용하여 추출하고, 8M 우레아를 함유하는 변성 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 26 내지 34 nt 범위의 크기를 갖는 RNA 단편을 SYBR 골드 (인비트로젠)에 의해 염색된 겔로부터 수동으로 절제하고, 단리하여, 리보솜-보호된 단편 라이브러리를 생성하였다. 리보-제로(Ribo-Zero) 키트 (일루미나(Illumina))를 사용하여 오염 rRNA 단편을 고갈시켰다. 3' 올리고뉴클레오티드 어댑터 라이게이션, 역전사, 순환, 및 비오티닐화 rRNA 고갈 올리고를 사용한 이차 rRNA 고갈 (표 9)을 기재된 바와 같이 수행하였다 55. PCR 증폭 동안에 각각의 샘플에 대해 인덱싱 프라이머를 사용하여 라이브러리를 바코딩하였다. 이어서, 바코딩된 라이브러리를 3% PhiX (일루미나)에 의해 풀링하고, 일루미나 넥스트세크(Illumina NextSeq) 500에서 제조자 프로토콜에 따라 시퀀싱하여, 전형적으로 샘플당 1800만개 내지 2700만개 판독을 생성하였다.
리보솜 풋프린트 데이터 분석. 각각의 바코딩된 샘플에 대한 데이터 파일 (3' 말단에서 마이너스 어댑터 서열)을 먼저 HISAT 2.0.3 56을 사용하여 4가지 rRNA 서열 (RNA5S1;NR_023363, RNA5-8SN5; NR_003285, RNA18SN5;NR_003286, 및 RNA28SN5;NR_003287)에 대해 맵핑하여, rRNA 오염 판독을 제거하였다. 나머지 판독을 각각의 인간 유전자 (UCSC RefSeq GRCh38)의 최장 전사체 변이체의 센스 가닥에 대해 정렬시켰다. 적어도 75 nt의 3'UTR 길이를 갖는 전사체 (18,101 서열)를 후속 분석을 위해 사용하였다. 5' 말단에서 최대 2개의 미스매치가 허용되었다. 모든 다중-맵핑된 판독을 폐기하였다. 26 내지 34 nt의 길이를 갖는 단편 판독을 리보솜 풋프린트로서 정의하고, 분석을 위해 사용하였다. 각각의 풋프린트로부터의 5' 말단 뉴클레오티드에 주석을 달고, 각각의 전사체 상에 맵핑하였다. 각각의 풋프린트57, 58의 16번째 내지 18번째 뉴클레오티드를 점유하는 리보솜 A-부위의 위치를 이용하여, 각각의 전사체 상에서 리보솜의 위치를 추론하였다. 각각의 개별 전사체 (18,101 서열) 상에서 RPKM (총 백만개-맵핑된 판독마다 전사체의 킬로염기당 풋프린트 판독)을 계산하였다. 2가지 복제 라이브러리 (ACE-tRNA에서 G418 및 495-748 전사체에서 254개 전사체)에서 코딩 서열에서 5 RPKM 및 3'UTR 영역에서 0.5 RPKM의 최소 임계치를 갖는 전사체만이 도 24a에서의 분석을 위해 포함되었다. 도 2b에서 전사체-전체 메타유전자 플롯의 경우, 정지 코돈의 첫번째 뉴클레오티드에 대해 -35 내지 +65 nt 영역 내에 있는 각각의 뉴클레오티드에 대한 풋프린트 카운트를 총 백만개-맵핑된 판독마다 정규화하였다. 모든 전사체 (18,101 서열)를 맵핑에 사용하였고, 5,200개 초과의 전사체를 관심 영역에서 적어도 1개 풋프린트에 맵핑하였다. 다음으로, 본 발명자들은 PTC를 구조하기 위해 ACE-tRNA Glychr19.trna2 및 Trpchr17.trna39의 생체내 생활성을 시험하였다. 갤럭시(Galaxy) 플랫폼을 사용하여 시퀀싱 데이터를 분석하였다 59. 프리즘(Prism) 7 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))을 이용하여 그래프를 생성하였다.
안정한 NLuc 리포터 세포주의 생성. 아미노산 위치 160에서 tag, taa 및 tga 정지 코돈을 갖는 pNLuc를 코딩하는 cDNA를 깁슨 어셈블리 (미국 뉴잉글랜드 바이오랩스)를 이용하여 레트로바이러스 벡터 pQCXIP (클론테크, 미국)의 다중 클로닝 부위 내의 AgeI 및 NotI 제한 부위에 삽입하였다. PhoenixGP 세포 (PMID: 7690960)를 칼펙틴 (사이나겐 래버러토리즈, 미국)을 이용하여 pNLuc-STOP-pQCXIP 및 cmv-VSV-G (VSV-G 외피 위형) 플라스미드에 의해 공동 형질감염시키고, 33℃ CO2-제어된 (5%) 세포 인큐베이터에서 48 시간 동안 두었다. 레트로바이러스 입자를 함유하는 배양 배지 (20ml)를 4℃로 냉각시키고, 10,000g하에 회전시켜, 세포 파편을 제거하고, 30% 전면생장에서 저-계대 HEK293 세포로 시딩된 2개의 10cm 디쉬 상에서 0.45um MCE-막 시린지 여과기 (밀리포어, 미국)를 통해 여과하였다. 세포 배양 디쉬를 파라필름으로 밀봉하고, 3,500g하에 24℃에서 90 분 동안 회전시키고, 37℃ CO2 제어된 (5%) 세포 배양 인큐베이터에 두었다. 대조군 디쉬 (감염 없음)가 완전한 세포 사멸을 나타낼 때까지, 세포를 퓨로마이신 (1ug/ml)에 의해 24 시간 후에 선택하였다. 세포를 FACS를 이용하여 96-웰 플레이트에 단분산시키고, 클론 집단을 후속적으로 사용하였다. 실험하는 동안에 선택된 클론을 유지하기 위해 퓨로마이신을 사용하지 않았고, 표준 DMEM 배지 (10% FBS, 1% Pen/Step 및 2mM L-글루타민으로 보충된 L-글루타민을 갖는 DMEM-둘베코 변형된 이글 배지-고 글루코스; 써모피셔, 미국)를 모든 연구에서 사용하였다.
RNA 형질감염. 10% FBS, 1% Pen/Step 및 2mM L-글루타민으로 보충된 둘베코 변형된 필수 배지 (DMEM) (써모피셔, 미국) 중에서 96 웰 세포 배양물 처리된 플레이트에서 1.4 x 104 세포/웰로 pNLuc-UGA를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 플레이팅하였다. 16-24 시한 후에 리포펙타민 2000 (써모피셔 사이언티픽, 미국)을 사용하여 세포를 ACE-tRNA에 의해 형질감염시켰다. 간략히, 3μg의 ACE-tRNA를 150μl의 옵티멤(OptiMEM) 중에 현탁시키고, 12μl의 리포펙타민 2000을 150ul의 옵티멤과 혼합하였다. 부피를 합하고, 철저히 혼합하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 75ul의 형질감염 복합체를 각각의 웰에 첨가하였다. ACE-tRNA 전사체에 의한 PTC 저해를 상기 기재된 바와 같이 정량화하였다.
크세노푸스 라에비스 난모세포에서 발현. 크세노푸스 라에비스 난모세포 (단계 V 및 VI)를 에코사이트(Ecocyte) (텍사스주 오스틴)에서 구입하였다. 주사하기 전에, 각각의 ACE-tRNA 펠렛을 2 μl의 ddH2O 중에 재현탁시키고, 파편을 21,000 x g하에 4℃에서 25 분 동안 펠렛화하였다. CFTR 채널 구조에 대한 ACE-tRNA의 용량 반응을 측정하기 위해, ddH2O에 의해 부피 균형을 이룬 ACE-tRNA 분취량으로부터 계열 희석액 (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 및 1.562 ng/난모세포)을 생성하였다. 모든 실험에서, 난모세포마다 25ng의 CFTR cRNA를 주사하였고, 주사 부피는 50nl이었다. ddH2O는 ACE-tRNA 없음 백그라운드 대조군 실험에서 사용되었다. 주사 후에, 난모세포를 OR-3 (50% 라이보비츠(Leibovitz) 배지, 250 mg/l 겐타마이신, 1 mM L-글루타민, 10 mM HEPES (pH 7.6)) 중에서 18℃에서 36 시간 동안 유지하였다.
2-전극 전압 클램프 (TEVC) 기록. CFTR Cl- 전류를 최대 CFTR 활성화 칵테일, 포르스콜린 (10μM; 아데닐레이트 시클라제 활성화제) 및 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (1mM; 포스포디에스테라제 억제제)의 존재하에 96 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl2, 및 5 HEPES (pH 7.5) (mM)를 함유하는 ND96 조 용액 중에서 기록하였다. 3 M KCl로 역충전된 유리 미세전극은 0.5-2 MΩ의 저항을 가졌다. 데이터를 1 kHz에서 여과하고, 피클램프(pClamp) 9.2 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈, 미국)에 의해 제어되는 디지데이터(Digidata) 1322A를 이용하여 10 kHz에서 디지털화하였다. OC-725C 전압 클램프 증폭기 (와너 인스트루먼츠(Warner Instruments), 미국)를 사용하여 -60 내지 +35mV의 5mV 전압 단계를 이용하여 CFTR 전류를 유도하였다. CFTR Cl- 전류가 -20mV의 양성으로 역전된 난모세포는 폐기하였다. 클램핏(Clampfit) 9.2 소프트웨어를 현재의 분석을 위해 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM으로 제시된다.
동물 및 생체내 영상화. Nu/J 마우스를 잭슨 랩스(Jackson labs)로부터 구입하였다. 동물 실험은 [Institutional Animal Care and Use Committee at the Wistar Institute]에 의해 승인되었다 (프로토콜 번호: 112762). 30ul의 물 중에서 재현탁된 10-20ug의 DNA를 전경골근에 주사한 후, 전기천공함으로써 마우스를 처리하였다. 10ug pNano-TGA + 10ug Arg ACE-tRNA (우측 전경골근) 또는 10ug pNano-TGA + 10ug 빈 pUC57 (좌측 전경골근)을 3마리의 마우스에 주사하였다. 대조군으로서 3마리의 다른 마우스에게 10ug pNano-WT (우측 전경골근; 양성 대조군) 또는 물 (좌측 전경골근; 음성 대조군)를 주사하였다. DNA를 333IU/ml의 히알루로니다제 (시그마(Sigma))에 의해 제형화하였다. DNA 주사 1 분 후에, 셀렉트라( CELLECTRA) 3P 기기 (이노비오 파마슈티컬스(Inovio Pharmaceuticals))에 의한 전기천공을 수행하였다. 100ul의 푸리마진 (나노-글로 기질의 40x 희석액)을 복강내로 주사하고, 주사 5 분 후에 이비스 스펙트럼(IVIS Spectrum) (퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 마우스를 영상화함으로써 나노루시페라제 활성을 마우스에서 영상화하였다. 영상화는 개방 여과기를 사용하였고, 영상을 40 초에 획득하였다. 영상을 리빙 이미지 소프트웨어(Living Image Software) (퍼킨 엘머)를 사용하여 분석하였다.
표 9. PTC 저해 활성에 대해 스크리닝된 tRNA의 주석이 달린 서열의 라이브러리. 각각의 서열에서 이탤릭체 글씨는 안티-코돈 편집의 부위를 도시한다. 볼드체 글씨는 백그라운드에 비해 5배 높은 저해 활성을 갖는 tRNA를 나타낸다. tRNA에서 티미딘은 우라실로 교체됨을 주목한다.
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실시예 5 참고문헌
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상기 상세한 설명 및 실시예가 본 발명은 충분히 개시하고 가능하게 하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 본원에 첨부된 청구항에 의해 정의된다.
모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 상기 상세한 설명에서 본 발명이 그의 특정 실시양태와 관련하여 기재되고, 여러 상세한 내용이 설명의 목적으로 기재되었지만, 본 발명이 추가의 실시양태를 허용하고, 본원에 기재된 특정한 상세한 내용이 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고 상당히 변화될 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는다면, 본 발명을 기재하는데 있어서 단수 용어 및 유사한 지시대상은 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 파악되어야 한다. 달리 언급되지 않는다면, 용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)", 및 "함유하는"은 개방형 용어로서 파악되어야 한다 (즉, "이 포함되나 이로 제한되지 않는"을 의미함). 본원에서 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 값의 범위의 인용은 단지 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 것의 약칭 방법으로서 작용하는 것으로 의도되며, 각각의 별도의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는다면, 본원에 기재된 모든 방법은 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 달리 청구되지 않는다면 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 의도된 것이고, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 파악되어서는 안된다.
본 발명을 수행하기 위해 발명자들에게 공지된 최상의 방식을 비롯하여 본 발명의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변형은 상기 기재를 읽은 후 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명자들은 숙련가들이 이러한 변형을 적절하게 이용할 것으로 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 본원에 첨부된 청구항에 인용된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더우기, 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는다면, 그의 모든 가능한 변형에서 상기 기재된 성분들의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION <120> METHODS OF RESCUING STOP CODONS VIA GENETIC REASSIGNMENT WITH ACE-TRNA <130> 17023.215WO1 <140> PCT/US2018/059065 <141> 2018-11-02 <150> 62/687,015 <151> 2018-06-19 <150> 62/580,887 <151> 2017-11-02 <160> 655 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ggcctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggttgcg ggttcaaatc 60 ccgtcggggt ca 72 <210> 2 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ggcctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggttacg ggttcaaatc 60 ccgtcggggt ca 72 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ggcctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggttccg ggttcaaatc 60 ccggcggggt ca 72 <210> 4 <211> 77 <212> DNA <213> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 cgtctcccac atggtctagc ggttaggatt cctggttcta acccaggcgg cccgggttcg 60 actcccggtg tgggaa 76 <210> 44 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 cgtctcccat atggtctagc ggttaggatt cctggttcta acccaggtgg cccgggttcg 60 actcccggta tgggaa 76 <210> 45 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 cgtctccctg gtggtctagt ggttaggatt cggcgctcta accgccgcgg cccgggttcg 60 attcccggtc agggaa 76 <210> 46 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 cgtctccctg gtggtctagt ggttaggatt cggcgctcta accgccgcgg cccgggttcg 60 attcccggtc aggaaa 76 <210> 47 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 cgtctccctg gtggtctagt ggctaggatt cggcgctcta accgccgcgg cccgggttcg 60 attcccggcc agggaa 76 <210> 48 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ggcctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 49 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 gacctcgtgg cgcaatggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggttgcg tgttcaagtc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 50 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 gacctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 51 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 gacctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggctgcg tgttcgaatc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 52 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 gacctcgtgg cgcaacggca gcgcgtctga cttcagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 53 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 gcgttggtgg tatagtggtt agcatagctg ccttcaaagc agttgacccg ggttcgattc 60 ccggccaacg ca 72 <210> 54 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 gcgttggtgg tatagtggtg agcatagctg ccttcaaagc agttgacccg ggttcgattc 60 ccggccaacg ca 72 <210> 55 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 gcgttggtgg tatagtggta agcatagctg ccttcaaagc agttgacccg ggttcgattc 60 ccggccaacg ca 72 <210> 56 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 ggcctcgtgg cgcaacggta 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 ggcctcatgg tgcaacagta gtgtgtctga cttcagatca gaaggttgta tgttcaaatc 60 acgtaggggt ca 72 <210> 62 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 ggcctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga ctctagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 63 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 gacctcgtgg cgcaatggta gcgcgtctga ctctagatca gaaggttgcg tgttcaagtc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 64 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 gacctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga ctctagatca gaaggttgcg tgttcaaatc 60 acgtcggggt ca 72 <210> 65 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 gacctcgtgg 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oligonucleotide <400> 101 gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc agaagattga gggttcgaat 60 cccttcgtgg tta 73 <210> 102 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gaccacgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc agaagattga gggttcgaat 60 cccttcgtgg ttg 73 <210> 103 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 ggccgtgtgg cctaatggat aaggcgtctg acttcagatc aaaagattgc aggtttgagt 60 tctgccacgg tcg 73 <210> 104 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaagag gctgaaggca ttcaaaggtt 60 ccgggttcga gtcccggcgg agtcg 85 <210> 105 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 ggctccgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttcc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaagat agttagagaa attcaaaggt 60 tgtgggttcg agtcccacca gagtcg 86 <210> 111 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 gtctctgtgg cgcaatggac gagcgcgctg gacttcaaat ccagaggttc cgggttcgag 60 tcccggcaga gatg 74 <210> 112 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaagcc taaatcaaga gattcaaagg 60 ttgcgggttc gagtccctcc agagtcg 87 <210> 113 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 ggctctgtgg cgcaatggat agcgcattgg acttcaaatt caaaggttgc gggttcgagt 60 ccctccagag tcg 73 <210> 114 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 ggcagcatag cagagtggtt caggttacag gttcaagatg taaactgagt tcaaatccca 60 gttctgcca 69 <210> 115 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 tggtgtaata ggtagcacag agaattctag attctcaggg gtaggttcaa ttcctat 57 <210> 116 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 taggacatgg tgtgataggt agcatggaga attctagatt ctcaggggta ggttcaattc 60 ctacagttct ag 72 <210> 117 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 taggacgtgg tgtgataggt agcatgggga attctagatt ctcaggggtg ggttcaattc 60 ctatagttct ag 72 <210> 118 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 taggacgtgg tgtagtaggt agcatggaga atgctaaatt ctcaggggta ggttcaattc 60 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 taggacgtgg tgtgataggt agcatggaga attctagatt ctcagggatg ggttcaattc 60 ctatagtcct ag 72 <210> 124 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 taggacgtgg tgtgataggt agcacggaga attctagatt ctcagggatg ggttcaattc 60 ctgtagttct ag 72 <210> 125 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 ggttccatgg tgtaatggtt agcactctgg actctaaatc cagcgatccg agttcaaatc 60 tcggtggaac ct 72 <210> 126 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 ggttccatgg tgtaatggtg accactttgg actctaaata cagtgatcag agttcaagtc 60 tcactggaac ct 72 <210> 127 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 ggttccatgg tgtaatggtg agggctttgg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 cccctggtgg tctagtgctt aggattcggt gctctaaccg ctgctgcctg cgttcgattc 60 ccggtcaggg aa 72 <210> 195 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 tccttgatgt ctagtggtta ggatttggtg ctctaactgc agcagcctgg gttcatttct 60 cagtcaggga a 71 <210> 196 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 tcccatatgg tctagcggtt aggattcctg gttctaaccc aggtggcccg ggttcgactc 60 ccggtatggg aa 72 <210> 197 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 tccgtggtgg tctagtggct aggattcggc gctctaaccg cctgcagctc gagttcgatt 60 cctggtcagg gaa 73 <210> 198 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 ccctgtggtc tagtggctaa gactttgtgc tctaattgct gcatcctagg ttcaattccc 60 agtcaggga 69 <210> 199 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 tcccacatgg tctagcggtt aggattcctg gttctaaccc aggcggcccg ggttcgactc 60 ccggtgtggg aa 72 <210> 200 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 tccctggtgg tctagtggct aggattcggc gctctaaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60 ccggccaggg aa 72 <210> 201 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 tccctggtgg tctagtggct aggattcggc gctctaaccg ccgcggcccg ggttcgattc 60 ccggtcaggg aa 72 <210> 202 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 gcgttggtgg tgtagtggtg agcacagctg cctctaaagc agttaacgcg ggttcgattc 60 ccgggtaacg aa 72 <210> 203 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 tccttggtgg tctagtggct aggattcggt gctctaacct gtgcggcccg ggttcaattc 60 ccgatgaagg aa 72 <210> 204 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 tgtctggtgg tcaagtggct aggatttggc gctctaactg ccgcggcccg cgttcgattc 60 ccggtcaggg aa 72 <210> 205 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 tccctggtgg tctagtggct aggattcggc gctctaaccg cctgcagctc gagttcgatt 60 cctggtcagg gaa 73 <210> 206 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 gcaatggtgg ttcagtggta gaattctcgc ctctactaac acaggagacc cgggttcaat 60 tcctgaccca tgta 74 <210> 207 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 ccttcaatag ttcagctggt agagcagagg actttagcta cttcctcagt aggagacgtc 60 cttaggttgc tggttcgatt ccagcttgaa gga 93 <210> 208 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 ccttcaatag ttcagctggt agagcagagg actttaggtc cttaggttgc tggttcgatt 60 ccagcttgaa gga 73 <210> 209 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 ggtaaaatgg ctgagtaagc tttagacttt aaaatctaaa gagagattga gctctctttt 60 tacca 65 <210> 210 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 ggtaaaatga ctgagtaagc attagacttt aaatctaaag acagaggtca agacctcttt 60 ttacca 66 <210> 211 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 ggtaaaatgg ctgagtaagc attagacttt aaatctaaag acagaggtca aggcctcttt 60 ttacca 66 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 tatagctcag tggtagagca tttaacttta gatcaagagg tccctggatc aactctgggt 60 g 61 <210> 217 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 gtcagtgttg cacaacggtt aagtgaagag gctttaaacc cagactggat gggttcaatt 60 cccatctctg ccg 73 <210> 218 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actttagtgg atagggcgtg gcaatcctta 60 ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89 <210> 219 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 220 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actttaggct cattaagcaa ggtatcctta 60 ggtcgctggt tcgaatccgg ctcggagga 89 <210> 221 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgaat 60 ccggctcgga gga 73 <210> 222 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatt gtatagacat ttgcggacat 60 ccttaggtcg ctggttcgat tccagctcga agga 94 <210> 223 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccagctcgaa gga 73 <210> 224 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagcta cttcctcagc aggagacatc 60 cttaggtcgc tggttcgatt ccggctcgaa gga 93 <210> 225 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 226 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttaggcg cgcgcccgtg gccatcctta 60 ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89 <210> 227 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 228 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttaagcc tgtagaaaca tttgtggaca 60 tccttaggtc gctggttcga ttccggctcg aagga 95 <210> 229 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 230 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatt gtacagacat ttgcggacat 60 ccttaggtcg ctggttcgat tccggctcga agga 94 <210> 231 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 232 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagtac ttaatgtgtg gtcatcctta 60 ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89 <210> 233 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 234 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagggg tttgaatgtg gtcatcctta 60 ggtcgctggt tcgaatccgg ctcggagga 89 <210> 235 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgaat 60 ccggctcgga gga 73 <210> 236 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagact gcggaaacgt ttgtggacat 60 ccttaggtcg ctggttcaat tccggctcga agga 94 <210> 237 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcaatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 238 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 ctttcgatag ctcagttggt agagcggagg actttaggtt cattaaacta aggcatcctt 60 aggtcgctgg ttcgaatccg gctcgaagga 90 <210> 239 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 ctttcgatag ctcagttggt agagcggagg actttagatc cttaggtcgc tggttcgaat 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 240 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 tcttcaatag ctcagctggt agagcggagg actttaaggt gcacgcccgt ggccattctt 60 aggtgctggt ttgattccga cttggagag 89 <210> 241 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 tcttcaatag ctcagctggt agagcggagg actttagatt cttaggtgct 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 246 ggtaaaatgg ctgagtaagc attagacttt aaatctaaag acagaggtca aggcctcttt 60 tttcct 66 <210> 247 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 247 ggtaaaatgg ctgagcaagc attagacttt aaatctgaaa acagaggtca aaggtctctt 60 tttacca 67 <210> 248 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 ggtaaaatgg ctgagtaagc attagacttt aaatctaaag acagaggtca aggcctcttt 60 ttacca 66 <210> 249 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 ggtaaaatga ctgaataagc cttagacttt aaatctgaag acagaggtca aggcctcttt 60 ttacca 66 <210> 250 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 ggtaaaatgg ctgagtaagc attggacttt aaatctaaag acagaggtca agacctcttt 60 ttacca 66 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 ggtaaaatga ctgagtaagc attagactct aaatctaaag acagaggtca agacctcttt 60 ttacca 66 <210> 256 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 ggtaaaatgg ctgagtaagc attagactct aaatctaaag acagaggtca aggcctcttt 60 ttacca 66 <210> 257 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 ggtaaaatgg ctgagtaagc attagactct aaatctaaag acagaggtca aggccttttt 60 acca 64 <210> 258 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actctagttg gctgtgtcct tagacatcct 60 taggtcgctg gttcgaatcc ggctcgaagg a 91 <210> 259 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actctagatc 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 265 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actctaggct cattaagcaa ggtatcctta 60 ggtcgctggt tcgaatccgg ctcggagga 89 <210> 266 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 ccttcgatag ctcagttggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgaat 60 ccggctcgga gga 73 <210> 267 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatt gtatagacat ttgcggacat 60 ccttaggtcg ctggttcgat tccagctcga agga 94 <210> 268 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccagctcgaa gga 73 <210> 269 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagcta cttcctcagc aggagacatc 60 cttaggtcgc tggttcgatt ccggctcgaa gga 93 <210> 270 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 271 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctaggcg cgcgcccgtg gccatcctta 60 ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89 <210> 272 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 273 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagcct gtagaaacat ttgtggacat 60 ccttaggtcg ctggttcgat tccggctcga agga 94 <210> 274 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 275 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatt gtacagacat ttgcggacat 60 ccttaggtcg ctggttcgat tccggctcga agga 94 <210> 276 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 277 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagtac ttaatgtgtg gtcatcctta 60 ggtcgctggt tcgattccgg ctcgaagga 89 <210> 278 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 279 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagggg tttgaatgtg gtcatcctta 60 ggtcgctggt tcgaatccgg ctcggagga 89 <210> 280 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgaat 60 ccggctcgga gga 73 <210> 281 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagact gcggaaacgt ttgtggacat 60 ccttaggtcg ctggttcaat tccggctcga agga 94 <210> 282 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 ccttcgatag ctcagctggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcaatt 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 283 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 ctttcgatag ctcagttggt agagcggagg actctaggtt cattaaacta aggcatcctt 60 aggtcgctgg ttcgaatccg gctcgaagga 90 <210> 284 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 ctttcgatag ctcagttggt agagcggagg actctagatc cttaggtcgc tggttcgaat 60 ccggctcgaa gga 73 <210> 285 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 tcttcaatag ctcagctggt agagcggagg actctaggtg cacgcccgtg gccattctta 60 ggtgctggtt tgattccgac ttggagag 88 <210> 286 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 tcttcaatag ctcagctggt agagcggagg actctagatt cttaggtgct ggtttgattc 60 cgacttggag ag 72 <210> 287 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 ggtaaaatgg ctgagtgaag cattggactc taaatctaaa gacaggggtt aagcctcttt 60 ttacca 66 <210> 288 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 ggtaaaatgg ctgagcaagc attggactct aaatctaaag acagatgttg agccatcttt 60 ttagca 66 <210> 289 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 ggtaaaatgg ctgagtgaag cattggactc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 gccgagcggt ctaaggctcc ggattttagc gccggtgtct tcggaggcat gggttcgaat 60 tccac 65 <210> 304 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 304 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagct aagcttcctc cgcggtgggg 60 attctggtct ccaatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgaca 106 <210> 305 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 305 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagtt ctggtctcca atggaggcgt 60 gggttcgaat cccacttctg aca 83 <210> 306 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 306 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagct tggcttcctc gtgttgagga 60 ttctggtctc caatggaggc gtgggttcga atcccacttc tgaca 105 <210> 307 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 307 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagtt ctggtctcca atggaggcgt 60 gggttcgaat cccacttctg aca 83 <210> 308 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 308 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagct tactgcttcc tgtgttcggg 60 tcttctggtc tccgtatgga ggcgtgggtt cgaatcccac ttctgaca 108 <210> 309 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 309 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagtt ctggtctccg tatggaggcg 60 tgggttcgaa tcccacttct gaca 84 <210> 310 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 310 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagtt gctacttccc aggtttgggg 60 cttctggtct ccgcatggag gcgtgggttc gaatcccact tctgaca 107 <210> 311 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 311 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagtt ctggtctccg catggaggcg 60 tgggttcgaa tcccacttct gaca 84 <210> 312 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 312 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttaggt aagcaccttg cctgcgggct 60 ttctggtctc cggatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgaca 106 <210> 313 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactttagtt tctggtctcc ggatggaggc 60 gtgggttcga atcccacttc tgaca 85 <210> 314 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 gcctccttag tgcagtaggt agcgcatcag tctttaaatc tgaatggtcc tgagttcaag 60 cctcagaggg ggca 74 <210> 315 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 gtcaggatgg ccgagcagtc ttaaggcgct gcgttttaat cgcaccctcc gctggaggcg 60 tgggttcgaa tcccactttt gaca 84 <210> 316 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 ggttccatgg tgtaatggtg agcactctgg actttaaatc cagaagtagt gctggaacaa 60 <210> 317 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 gtcagggtgg ctgagcagtc tgaggggctg cgttttagtc gcagtctgcc ctggaggcgt 60 gggttcgaat cccactcctg aaa 83 <210> 318 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 accaggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actttagatc caatggacat atgtccgcgt 60 gggttcgaac cccactcctg gta 83 <210> 319 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 accgggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actttagatc caatgggctg gtgcccgcgt 60 gggttcgaac cccactctcg gta 83 <210> 320 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 accagaatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actttagatc caatggattc atatccgcgt 60 gggttcgaac cccacttctg gta 83 <210> 321 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 accgggatgg ctgagtggtt aaggcgttgg actttagatc caatggacag gtgtccgcgt 60 gggttcgagc cccactcccg gta 83 <210> 322 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 actcatttgg ctgagtggtt aaggcattgg actttagatc caatggagta gtggctgtgt 60 gggtttaaac cccactactg gta 83 <210> 323 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 gagaaagtca tcgtagttac gaagttggct ttaacccagt 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 ggtagcgtgg ccgagtggtc taagacgctg gattctagct ccagtctctt cgggggcgtg 60 ggtttgaatc ccaccgctgc ca 82 <210> 333 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 gggccagtgg ctcaatggat aatgcgtctg actctaaatc agaagattcc agccttgact 60 cctggctggc tca 73 <210> 334 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 334 ggtagggtgg ccgagcggtc taaggcactg tattctaact ccagtctctt cagaggcatg 60 ggtttgaatc ccactgctgc ca 82 <210> 335 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 335 gccgagcggt ctaaggctcc ggattctagc gccggtgtct tcggaggcat gggttcgaat 60 tccac 65 <210> 336 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 336 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagct aagcttcctc cgcggtgggg 60 attctggtct ccaatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgaca 106 <210> 337 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagtt ctggtctcca atggaggcgt 60 gggttcgaat cccacttctg aca 83 <210> 338 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 338 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagct tggcttcctc gtgttgagga 60 ttctggtctc caatggaggc gtgggttcga atcccacttc tgaca 105 <210> 339 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagtt ctggtctcca atggaggcgt 60 gggttcgaat cccacttctg aca 83 <210> 340 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 340 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagct tactgcttcc tgtgttcggg 60 tcttctggtc tccgtatgga ggcgtgggtt cgaatcccac ttctgaca 108 <210> 341 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagtt ctggtctccg tatggaggcg 60 tgggttcgaa tcccacttct gaca 84 <210> 342 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 342 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagtt gctacttccc aggtttgggg 60 cttctggtct ccgcatggag gcgtgggttc gaatcccact tctgaca 107 <210> 343 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagtt ctggtctccg catggaggcg 60 tgggttcgaa tcccacttct gaca 84 <210> 344 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 344 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctaggt aagcaccttg cctgcgggct 60 ttctggtctc cggatggagg cgtgggttcg aatcccactt ctgaca 106 <210> 345 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 345 gtcaggatgg ccgagtggtc taaggcgcca gactctagtt tctggtctcc ggatggaggc 60 gtgggttcga atcccacttc tgaca 85 <210> 346 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 346 gcctccttag tgcagtaggt agcgcatcag tctctaaatc tgaatggtcc tgagttcaag 60 cctcagaggg ggca 74 <210> 347 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 gtcaggatgg ccgagcagtc ttaaggcgct gcgttctaat cgcaccctcc gctggaggcg 60 tgggttcgaa tcccactttt gaca 84 <210> 348 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 348 ggttccatgg tgtaatggtg agcactctgg actctaaatc cagaagtagt gctggaacaa 60 <210> 349 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 349 gtcagggtgg ctgagcagtc tgaggggctg cgttctagtc gcagtctgcc ctggaggcgt 60 gggttcgaat cccactcctg aaa 83 <210> 350 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 accaggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actctagatc caatggacat atgtccgcgt 60 gggttcgaac cccactcctg gta 83 <210> 351 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 accgggatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actctagatc caatgggctg gtgcccgcgt 60 gggttcgaac cccactctcg gta 83 <210> 352 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 accagaatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actctagatc caatggattc atatccgcgt 60 gggttcgaac cccacttctg gta 83 <210> 353 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 accgggatgg ctgagtggtt aaggcgttgg actctagatc caatggacag gtgtccgcgt 60 gggttcgagc cccactcccg gta 83 <210> 354 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 354 actcatttgg ctgagtggtt aaggcattgg actctaagat ccaatggagt agtggctgtg 60 tgggtttaaa ccccactact ggta 84 <210> 355 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 355 gagaaagtca tcgtagttac gaagttggct ctaacccagt tttgggaggt tcaattcctt 60 cctttctct 69 <210> 356 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 356 accaggatgg ccaagtagtt aaaggcactg gactctagag ccaatggaca tatgtctgtg 60 tgggtttgaa ccccactcct ggtg 84 <210> 357 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 357 ggtagcgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gattctagct ccagtctctt cggaggcgtg 60 ggttcgaatc ccaccgctgc ca 82 <210> 358 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 ggtagtgtgg ccgagcggtc taaggcgctg gattctagct ccagtctctt cgggggcgtg 60 ggttcgaatc ccaccactgc ca 82 <210> 359 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 ggtagcgtgg ccgagtggtc taaggcgctg gattctagct ccagtcattt cgatggcgtg 60 ggttcgaatc ccaccgctgc ca 82 <210> 360 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 ggtagtgtgg ttgaatggtc taaggcactg aattctagct ccagtctctt tggggacgtg 60 ggtttaaatc ccactgctgc aa 82 <210> 361 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 caagaaattc atagaggtta tgggattggc tctaaaccag tttcaggagg ttcgattcct 60 tcctttttgg 70 <210> 371 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 gctgtgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actctaaatc caatggggtc tccccgcgca 60 ggttcgaatc ctgctcacag cg 82 <210> 372 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 gctgtgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actctaaatc caatggggtc tccccgcgca 60 ggttcaaatc ctgctcacag cg 82 <210> 373 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 gctgtgatgg ccgagtggtt aaggtgttgg actctaaatc caatgggggt tccccgcgca 60 ggttcaaatc ctgctcacag cg 82 <210> 374 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 gtcacggtgg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 383 gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actctaaatc cattggggtt tccccgcgca 60 ggttcgaatc ctgtcggcta cg 82 <210> 384 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 384 gagaaggtca cagaggttat gggattggct tcaaaccagt ctgtgggggg ttcgattccc 60 tcctttttca 70 <210> 385 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 385 gagaaggtca tagaggttat gggattggct tcaaaccagt ctctgggggg ttcgattccc 60 tcctttttca 70 <210> 386 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 386 gaaaaagtca taggggttat gaggctggct tcaaaccagc cttaggaggt tcaattcctt 60 ccttttttg 69 <210> 387 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 387 ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgc tgcttcaaat gccagggtcg aggtttcgat 60 ccccgtacgg gcct 74 <210> 388 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 388 gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg acttcaaatc cattggggtt tccccgcgca 60 ggttcgaatc ctgccgacta cg 82 <210> 389 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg acttcaaatc cattggggtt tccccacgca 60 ggttcgaatc ctgccgacta cg 82 <210> 390 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggtgatgg acttcaaacc cattggggtc tccccgcgca 60 ggttcgaatc ctgccgacta cg 82 <210> 391 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 gggtgtatgg ctcaggggta gagaatttga cttcagatca agaggtccct 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cccatgttgg g 71 <210> 409 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 409 ccagcatgtc tcagtcggta tagtgtgaga ctttaaatct cagggtcgtg ggttcaagcc 60 ccacattggg 70 <210> 410 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 410 gtctagctag atcagttggt agagcataag actttaaatc tcagggtcat gggtttgagc 60 cctacgttgg gcg 73 <210> 411 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 411 gcccagctag ctcagccggt agagcacaag actttaaatc tcagggtcgt gggtttgagc 60 cctgtgttga gca 73 <210> 412 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 412 ccgaatagct tagttgatga agcgtgagac tttaaatctc agggtagtgg gttcaagccc 60 cacattgga 69 <210> 413 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 413 gcctggctac ctcagttggt agagcatggg actttaaatc ccagagtcag tgggttcaag 60 cctcacattg agtg 74 <210> 414 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 414 gcccggctag ctcagtcggt agagcatgag accttaaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60 cccacgttgg gcg 73 <210> 415 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 415 gcccggctag ctcagtcggt agagcatggg actttaaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60 cccacgttgg gcg 73 <210> 416 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 gcccggctag ctcagtcgat agagcatgag actttaaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60 cgcacgttgg gcg 73 <210> 417 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 gcccagctag ctcagtcggt agagcatgag actttaaatc tcagggtcat gggtttgagc 60 cccacgtttg gtg 73 <210> 418 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 418 gcctggctag ctcagtcggc aaagcatgag actttaaatc tcagggtcgt gggctcgagc 60 tccatgttgg gcg 73 <210> 419 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 gcccgactac ctcagtcggt ggagcatggg actttacatc ccagggttgt gggttcgagc 60 cccacattgg gca 73 <210> 420 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 420 ccccggctgg ctcagtcagt agatcatgag actttaaatc tcagggtcgt gggttcacgc 60 cccacactgg gcg 73 <210> 421 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 gcgctagtca gtagagcatg agactttaaa tctcagggtc gtgggttcga gccccacatc 60 gggcg 65 <210> 422 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 gcctggatag ctcagttggt agagcatcag actttaaatc tgagggtcca gggttcaagt 60 ccctgttcag gca 73 <210> 423 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 gccaggatag ttcaggtggt agagcatcag actttaaaac ctgagggttc agggttcaag 60 tctctgtttg ggcg 74 <210> 424 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 424 acccagatag ctcagtcagt agagcatcag actttaaatc tgagggtcca aggttcatgt 60 ccctttttgg gtg 73 <210> 425 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 425 acctgggtag cttagttggt agagcattgg actttaaatt tgagggccca ggtttcaagt 60 ccctgtttgg gtg 73 <210> 426 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 426 gcctgggtag ctcagtcggt agagctatca gactttaagc ctgaggattc agggttcaat 60 cccttgctgg ggcg 74 <210> 427 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 427 gatagctcag ttgatagagc atcagacttt aaatctgagg gtccagggtt catgtccctg 60 tt 62 <210> 428 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 428 gttggggtaa ctcagttggt agagtagcag actttacatc tgagggtcca gggtttaagt 60 ccatgtccag gca 73 <210> 429 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 429 gcctggatag ctcagttggt agagcatcag actttaaatc tgagggtcca gggttcaagt 60 ccctgttcag gcg 73 <210> 430 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 430 gcctggatag ctcagtcggt agagcatcag actttaaatc tgagggtcca gggttcaagt 60 ccctgttcag gcg 73 <210> 431 <211> 73 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oligonucleotide <400> 435 acctgggtag ctcagtaggt agaacatcag actttaaatc tgagggtcta gggttcaagt 60 ccctgtccag gcg 73 <210> 436 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 436 gcctggatag ctccttcggt agagcatcat cagactttaa atgtgagggt ccagggttca 60 agttcctgtt tgggcg 76 <210> 437 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 gcccagctag ctcagtcggt agagcataag actctaaatc tcagggttgt ggattcgtgc 60 cccatgctgg gtg 73 <210> 438 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 438 ctgcagctag ctcagtcggt agagcatgag actctaaatc tcagggtcat gggttcgtgc 60 cccatgttgg g 71 <210> 439 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 ccagcatgtc tcagtcggta tagtgtgaga ctctaaatct cagggtcgtg ggttcaagcc 60 ccacattggg 70 <210> 440 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 440 gtctagctag atcagttggt agagcataag actctaaatc tcagggtcat gggtttgagc 60 cctacgttgg gcg 73 <210> 441 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 gcccagctag ctcagccggt agagcacaag actctaaatc tcagggtcgt gggtttgagc 60 cctgtgttga gca 73 <210> 442 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 ccgaatagct tagttgatga agcgtgagac tctaaatctc agggtagtgg gttcaagccc 60 cacattgga 69 <210> 443 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 gcctggctac ctcagttggt agagcatggg actctaaatc ccagagtcag tgggttcaag 60 cctcacattg agtg 74 <210> 444 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 gcccggctag ctcagtcggt agagcatgag accctaaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60 cccacgttgg gcg 73 <210> 445 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 445 gcccggctag ctcagtcggt agagcatggg actctaaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60 cccacgttgg gcg 73 <210> 446 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 446 gcccggctag ctcagtcgat agagcatgag actctaaatc tcagggtcgt gggttcgagc 60 cgcacgttgg gcg 73 <210> 447 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 447 gcccagctag ctcagtcggt agagcatgag actctaaatc tcagggtcat gggtttgagc 60 cccacgtttg gtg 73 <210> 448 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 448 gcctggctag ctcagtcggc aaagcatgag actctaaatc tcagggtcgt gggctcgagc 60 tccatgttgg gcg 73 <210> 449 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 449 gcccgactac ctcagtcggt ggagcatggg actctacatc ccagggttgt gggttcgagc 60 cccacattgg gca 73 <210> 450 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 450 ccccggctgg ctcagtcagt agatcatgag actctaaatc tcagggtcgt gggttcacgc 60 cccacactgg gcg 73 <210> 451 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 gcgctagtca gtagagcatg agactctaaa tctcagggtc gtgggttcga gccccacatc 60 gggcg 65 <210> 452 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 gcctggatag ctcagttggt agagcatcag actctaaatc tgagggtcca gggttcaagt 60 ccctgttcag gca 73 <210> 453 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 gccaggatag ttcaggtggt agagcatcag actctaaacc tgagggttca gggttcaagt 60 ctctgtttgg gcg 73 <210> 454 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 acccagatag ctcagtcagt agagcatcag actctaaatc tgagggtcca aggttcatgt 60 ccctttttgg gtg 73 <210> 455 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 acctgggtag cttagttggt agagcattgg actctaaatt tgagggccca ggtttcaagt 60 ccctgtttgg gtg 73 <210> 456 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 gcctgggtag ctcagtcggt agagctatca gactctaaag cctgaggatt cagggttcaa 60 tcccttgctg gggcg 75 <210> 457 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 457 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oligonucleotide <400> 466 gcctggatag ctccttcggt agagcatcat cagactctaa atgtgagggt ccagggttca 60 agttcctgtt tgggcg 76 <210> 467 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 467 ggcagaatgg tgcagcggtt cagcacccag gctcttcagc cagctgttgc ctgggctcaa 60 atcccagctc tgcca 75 <210> 468 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 468 ggctgtatag ctcagtggta gagcatttga cttcagaatc ctatactcag gggaaggaga 60 actgggggtt tctcagtggg tcaaaggact tgtagtggta aatcaaaagc aactctataa 120 gctatgtaac aaactttaaa gtcatatgta gctgggttca aatcctgttt ctgcca 176 <210> 469 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 469 ggctgtatag ctcagtggta gagcatttga cttcagcttt aaagtcatat gtagctgggt 60 tcaaatcctg tttctgcca 79 <210> 470 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 470 gggggcatag ctcagtggta gagcatttga cttcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60 caggtgcccc ct 72 <210> 471 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 471 gggggtatag ctcaggggta gagcatttga cttcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60 caggtgcccc cc 72 <210> 472 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 472 gggggtatag cttagcggta gagcatttga cttcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60 cgggtgcccc ct 72 <210> 473 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 473 gggggtatag cttaggggta gagcatttga cttcagatca aaaggtccct ggttcaaatc 60 caggtgcccc tt 72 <210> 474 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 474 gggggtatag ctcaggggta gagcatttga 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 479 gggggtatag ttcaggggta gagcatttga cttcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60 caggtgcccc ct 72 <210> 480 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 480 gggggtatag ctcaggggta gagcatttga cttcaaatca agaggtccct gattcaaatc 60 caggtgcccc ct 72 <210> 481 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 481 gggcgtatag ctcaggggta gagcatttga cttcagatca agaggtcccc agttcaaatc 60 tgggtgcccc ct 72 <210> 482 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 482 gggggtatag ctcacaggta gagcatttga cttcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60 tgggtgcccc ct 72 <210> 483 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 483 gggcgtatag ctcaggggta gagcatttga cttcagatca agaggtcccc agttcaaatc 60 tgggtgccca 70 <210> 484 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 484 gggggtatag ctcacaggta gagcatttga cttcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60 cggttactcc ct 72 <210> 485 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 485 gggggtaggg ctcagggata gagcatttga cttcagatca agaggtcccc ggttcgaatc 60 taggtgcccc ct 72 <210> 486 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 486 ggtatatctc agggggcaga gcatttgact tcagatcaag aggtccccgg ttgaaatccg 60 ggtgct 66 <210> 487 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 487 gggggtatag ctcaggggta gagcacttga cttcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60 caggtgcccc ct 72 <210> 488 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 488 gggggtatag ctcagtggta gagcatttga cttcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60 cgggtgcccc ct 72 <210> 489 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 489 gggggtatag ctcagtgggt agagcatttg acttcagatc aagaggtccc cggttcaaat 60 ccgggtgccc cct 73 <210> 490 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 490 gggggtgtag ctcagtggta gagcatttga cttcagatca agaggtccct ggttcaaatc 60 caggtgcccc ct 72 <210> 491 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 491 gggggtatag ctcaggggta gagcatttga cttcagatca agaggtcccc ggttcaaatc 60 cgggtgcccc ct 72 <210> 492 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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cttcaaatcg aagggttgca ggttcaattc 60 ctgtccgttt ca 72 <210> 497 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 497 ggcctcatgg tgcaacagta gtgtgtctga cttcagatca gaaggttgta tgttcaaatc 60 acataggggt ca 72 <210> 498 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 498 gacctcgtgg tgaaatggta gcatgtttga cttcaaatca ggaggttgtg tgttcaagtc 60 acatcagggt ca 72 <210> 499 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 499 gaccttgtgg cgcaatggta gcatgtttga cttcaaatca ggaggttgtg tgttcaagtc 60 acatcagggt ca 72 <210> 500 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 500 gacctcgtgg cgcaacggta gcgcgtctga cttcagatca gaaggctgcg tgttcgaatc 60 acgccggggt ca 72 <210> 501 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial 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oligonucleotide <400> 559 gaaaaagtca taggggttat gaggctggct ttaaaccagc cttaggaggt tcaattcctt 60 ccttttttg 69 <210> 560 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 560 ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgc tgctttaaat gccagggtcg aggtttcgat 60 ccccgtacgg gcct 74 <210> 561 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 561 gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actttaaatc cattggggtt tccccgcgca 60 ggttcgaatc ctgccgacta cg 82 <210> 562 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 562 gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actttaaatc cattggggtt tccccacgca 60 ggttcgaatc ctgccgacta cg 82 <210> 563 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 563 gtagtcgtgg ccgagtggtt aaggtgatgg actttaaacc cattggggtc tccccgcgca 60 ggttcgaatc ctgccgacta cg 82 <210> 564 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 564 gggtgtatgg ctcaggggta gagaatttga ctttagatca agaggtccct ggttcaaatc 60 caggtgcccc ct 72 <210> 565 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 565 agttgtagct gagtggttaa ggcaacgagc tttaaattcg ttggtttctc tctgtgcagg 60 tttgaatcct gctaatta 78 <210> 566 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 566 caagaaattc atagaggtta tgggattggc tttaaaccag tttcaggagg ttcgattcct 60 tcctttttgg 70 <210> 567 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 567 gctgtgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actttaaatc caatggggtc tccccgcgca 60 ggttcgaatc ctgctcacag cg 82 <210> 568 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 568 gctgtgatgg ccgagtggtt aaggcgttgg actttaaatc caatggggtc tccccgcgca 60 ggttcaaatc ctgctcacag cg 82 <210> 569 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 569 gctgtgatgg ccgagtggtt aaggtgttgg actttaaatc caatgggggt tccccgcgca 60 ggttcaaatc ctgctcacag cg 82 <210> 570 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 570 gtcacggtgg ccgagtggtt aaggcgttgg actttaaatc caatggggtt tccccgcaca 60 ggttcgaatc ctgttcgtga cg 82 <210> 571 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 571 gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actttaaatc cattgtgctc tgcacgcgtg 60 ggttcgaatc ccaccctcgt cg 82 <210> 572 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 572 gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actttaaatc cattgtgctc tgcacgcgtg 60 ggttcgaatc ccaccttcgt cg 82 <210> 573 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 573 ggccggttag ctcagttggt tagagcgtgc tttaactaat gccagggtcg aggtttcgat 60 ccccgtacgg gcct 74 <210> 574 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 574 gacgaggtgg ccgagtggtt aaggcgatgg actttaaatc cattgtgctc tgcacacgtg 60 ggttcgaatc ccatcctcgt cg 82 <210> 575 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 575 gaggcctggc cgagtggtta aggcgatgga ctttaaatcc attgtgctct gcacgcgtgg 60 gttcgaatcc catcctcg 78 <210> 576 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 576 gcagcgatgg 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oligonucleotide <400> 580 gcggauuuag cucagddggg agagcgccag acugaayauc uggagguccu gugtucgauc 60 cacagaauuc gcacca 76 <210> 581 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 581 gaccucgugg cgcaacgguu agcgcgucug acutcagauc agaaggcugc guguucgaau 60 cacgucgggg uca 73 <210> 582 <211> 10 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 582 Asn Ile Glu Thr Phe His Thr Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 583 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 583 Ile Glu Thr Phe His Thr Ala Gln Lys 1 5 <210> 584 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 584 Asn Ile Glu Thr Phe His Thr Ala Gln 1 5 <210> 585 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 585 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 589 gaccucgugg cgcaacgguu agcgcgucug acutcagauc agaaggcucc ggguucgaau 60 cccggcgggg uca 73 <210> 590 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <400> 590 Xaa Ile Glu Thr Phe His Thr Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 591 <211> 71 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 591 gcauuggugg uucaguggua gaauucucgc cuucaacgcg ggagacccgg guucaauucc 60 cggccaaugc a 71 <210> 592 <211> 71 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 592 gcgccgcugg uguaguggua ucaugcaaga uuucaauucu ugcgacccgg guucgauucc 60 cgggcggcgc a 71 <210> 593 <211> 71 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 593 gcauuggugg uucaauggua gaauucucgc cuucaacgca ggagacccag guucgauucc 60 uggccaaugc a 71 <210> 594 <211> 71 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 594 gcguuggugg uuuaguggua gaauucucgc cuucaaugcg ggagacccgg guucaauucc 60 cggccacugc a 71 <210> 595 <211> 71 <212> RNA 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RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 619 gaccucgugg cacaauggua gcacgucuga cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 620 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 620 gaagcggugg cucaauggua gagcuuucga cuucaauuaa aucuuggaaa uuccacggaa 60 uaagauugca aucgaagggu ugcagguuca auuccugucc guuuca 106 <210> 621 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 621 gaagcggugg cucaauggua gagcuuucga cuucaaaucg aaggguugca gguucaauuc 60 cugucgguuu ca 72 <210> 622 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 622 ggccucaugg ugcaacagua gugugucuga cuucagauca gaagguugua uguucaaauc 60 acauaggggu ca 72 <210> 623 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 623 gaccucgugg ugaaauggua gcauguuuga cuucaaauca ggagguugug uguucaaguc 60 acaucagggu ca 72 <210> 624 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 624 gaccuugugg cgcaauggua gcauguuuga cuucaaauca ggagguugug uguucaaguc 60 acaucagggu ca 72 <210> 625 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 625 gaccucgugg cgcaacggua gcgcgucuga cuucagauca gaaggcugcg uguucgaauc 60 acgccggggu ca 72 <210> 626 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 626 gaccuugugg cucaauggua gcgcaucuga cuucagauca ggagguugca cguucaaauc 60 augccggggu ca 72 <210> 627 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 627 gaccuugugg cgcaacggua gcgcgucuga cuucagauca 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 632 gaccucguag cgcaacggua gcgcgucuga cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 633 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 633 agggguauag cucaauuggc agagcgucgg ucuucaaaac cgaagguugu agguucgauu 60 ccuacugccc cugcca 76 <210> 634 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 634 gaccucaugg cgcaacggua gcgcgucuga cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 635 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 635 gaccucgugg cgcaacggua gcgcgucuaa cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 636 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 636 acgggaguag cucaguuggu agagcaccgg ucuucaaaac cgggugucgg gaguucgagc 60 cucuccuccc gug 73 <210> 637 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 637 gaccucgugg cgcaacggua gcgcgucuga cuucagauca gaagguugca uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 638 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 638 gacuccgugg cgcaacggua gcgcguccga cuucagaucg gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 639 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 639 gacuccgugg cgcaacggua gcgcgucuga cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 640 <211> 72 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: TrpChr7.tRNA3-WT sequence <400> 640 ggccucgugg cgcaacggua gcgcgucuga cuccagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 641 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 641 ggccucgugg cgcaacggua gcacgucuga cuccagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 642 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 642 ggccucgucg cgcaacggua gcgcgucuga cuccagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 643 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 643 ggccucgugg cgcaacggua gcacgucuga cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 644 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 644 ggccucgucg cgcaacggua gcgcgucuga cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 645 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 645 ggccucgucg cgcaacggua gcacgucuga cuucagauca gaagguugcg uguucaaauc 60 acgucggggu ca 72 <210> 646 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 646 Met Ser Phe Asn Thr Ile Ile Asp Trp Asn Ser Cys Thr Ala Glu Gln 1 5 10 15 Gln Arg Gln Leu Leu Met Arg Pro Ala Ile Ser Ala Ser Glu Ser Ile 20 25 30 Thr Arg Thr Val Asn Asp Ile Leu Asp Asn Val Lys Ala Arg Gly Asp 35 40 45 Glu Ala Leu Arg Glu Tyr Ser Ala Lys Phe Asp Lys Thr Thr Val Thr 50 55 60 Ala Leu Lys Val Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ala Ser Glu Arg Leu 65 70 75 80 Ser Asp Glu Leu Lys Gln Ala Met Ala Val Ala Val Lys Asn Ile Glu 85 90 95 Thr Phe His Thr Ala Gln Lys Leu Pro Pro Val Asp Val Glu Thr Gln 100 105 110 Pro Gly Val Arg Cys Gln Gln Val Thr Arg Pro Val Ala Ser Val Gly 115 120 125 Leu Tyr Ile Pro Gly Gly Ser Ala Pro Leu Phe Ser Thr Val Leu Met 130 135 140 Leu Ala Thr Pro Ala Ser Ile Ala Gly Cys Lys Lys Val Val Leu Cys 145 150 155 160 Ser Pro Pro Pro Ile Ala Asp Glu Ile Leu Tyr Ala Ala Gln Leu Cys 165 170 175 Gly Val Gln Asp Val Phe Asn Val Gly Gly Ala Gln Ala Ile Ala Ala 180 185 190 Leu Ala Phe Gly Thr Glu Ser Val Pro Lys Val Asp Lys Ile Phe Gly 195 200 205 Pro Gly Asn Ala Phe Val Thr Glu Ala Lys Arg Gln Val Ser Gln Arg 210 215 220 Leu Asp Gly Ala Ala Ile Asp Met Pro Ala Gly Pro Ser Glu Val Leu 225 230 235 240 Val Ile Ala Asp Ser Gly Ala Thr Pro Asp Phe Val Ala Ser Asp Leu 245 250 255 Leu Ser Gln Ala Glu His Gly Pro Asp Ser Gln Val Ile Leu Leu Thr 260 265 270 Pro Ala Ala Asp Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Ala Val Glu Arg Gln 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Pro Arg Ala Glu Thr Ala Arg Gln Ala Leu Asn Ala 290 295 300 Ser Arg Leu Ile Val Thr Lys Asp Leu Ala Gln Cys Val Glu Ile Ser 305 310 315 320 Asn Gln Tyr Gly Pro Glu His Leu Ile Ile Gln Thr Arg Asn Ala Arg 325 330 335 Glu Leu Val Asp Ser Ile Thr Ser Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly Asp 340 345 350 Trp Ser Pro Glu Ser Ala Gly Asp Tyr Ala Ser Gly Thr Asn His Val 355 360 365 Leu Pro Thr Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Cys Ser Ser Leu Gly Leu Ala 370 375 380 Asp Phe Gln Lys Arg Met Thr Val Gln Glu Leu Ser Lys Glu Gly Phe 385 390 395 400 Ser Ala Leu Ala Ser Thr Ile Glu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Arg Leu 405 410 415 Thr Ala His Lys Asn Ala Val Thr Leu Arg Val Asn Ala Leu Lys Glu 420 425 430 Gln Ala His His His His His His His His Ser Gly Gly Ser Ala Trp 435 440 445 Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 450 455 <210> 647 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 8xHis tag <400> 647 His His His His His His His His 1 5 <210> 648 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 648 Lys Pro Ile Asn Gln Trp Pro Ala Asn Thr His Glu Arg 1 5 10 <210> 649 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 649 taatacgact cactatagag cgctccggtt tttctgtgct gaacctcagg ggacgccgac 60 acacgtacac gtc 73 <210> 650 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 650 tagtcttcgg 10 <210> 651 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 651 aagaagaccg 10 <210> 652 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 652 gtcctttttt tgctttagtg agggttaatt 30 <210> 653 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 653 gaattcttcc cgagacgttc caagtcttca tgaagactac aggcgtctcc caggaagct 59 <210> 654 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 654 attatgctga gtgatatccg gagcaccgcg ttgccatcgc gcagactgaa gtctagtctt 60 ccaacgcaca agtttagtgc agccccagtg gt 92 <210> 655 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 655 attatgctga gtgatatcgc aaccaccata taccaatcgt atcgaggaag tttcgtaact 60 gggcccaagc taagggccgg ttgcgtggt 89

Claims (25)

  1. T-아암, D-아암, 안티코돈 아암 및 수용자 아암을 포함하는 변형된 전달 RNA (tRNA)이며, 여기서 T-아암이 신장 인자 1-알파 1 (EF1알파)과 상호작용하는 뉴클레오티드를 갖는 T-스템을 포함하는 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  2. 서열식별번호: 1-538 중 어느 하나로 이루어진 변형된 전달 RNA (tRNA)이며, 여기서 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  3. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 4로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  4. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 16으로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  5. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 24로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  6. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 33으로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  7. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 38로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  8. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 44로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  9. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 48로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  10. 제2항에 있어서, tRNA가 서열식별번호: 53으로 이루어지고, 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  11. 서열식별번호: 56-60, 62-66, 84-86, 90-111, 113, 128-143, 147-149, 153-156, 161-174, 176, 178, 181, 184-186, 192, 196-197, 199-201, 205, 213-240, 246, 255-256, 258-285, 299, 305-312, 314, 318-332, 335-344, 346, 350-354, 357-360, 362, 365-370, 372-383, 388-390, 392, 394-401, 403-407, 414-416, 418, 422, 425, 428-433, 437, 444-445, 452, 455, 459-463, 470, 472-474, 476, 487-492, 525, 530-539, 545-550, 553-555, 561-563 및 567-579 중 어느 하나로 이루어지는 변형된 전달 RNA (tRNA)이며, 여기서 티미딘이 우라실로 교체된 것인 변형된 전달 RNA (tRNA).
  12. T-아암, D-아암, 안티코돈-아암 및 수용자 아암을 포함하는 변형된 전달 RNA (tRNA)이며, 여기서
    (a) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-UCA-3'이고 TGA 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 아르기닌, 트립토판 또는 글리신에 작동가능하게 연결되거나;
    (b) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-UUA-3'이고 TAA 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 글루타민 또는 글루타메이트에 작동가능하게 연결되거나; 또는
    (c) 안티코돈-아암은 트리-뉴클레오티드 안티코돈을 포함하고, 안티코돈은 5'-CUA-3'이고 TAG 정지 코돈을 인식하고, 수용자 아암은 트립토판, 글루타메이트 또는 글루타민에 작동가능하게 연결되는 것인
    변형된 전달 RNA (tRNA).
  13. 제12항에 있어서, T-아암이 신장 인자 1-알파 1 (EF1알파)과의 상호작용을 증강시키거나 조정하는 합리적인 뉴클레오티드 교체를 포함하는 것인 변형된 tRNA.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형된 tRNA를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열이며, 여기서 올리고뉴클레오티드가 150개 뉴클레오티드 미만의 총 길이를 갖는 것인 올리고뉴클레오티드 서열.
  15. 제1 올리고뉴클레오티드 서열 및 제2 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 서열은 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형된 tRNA를 독립적으로 코딩하고, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 독립적으로 150개 뉴클레오티드 미만의 총 길이를 갖고, 두 서열이 나란히 있는 것인 올리고뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA인 올리고뉴클레오티드.
  17. 프로모터, 및 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형된 tRNA 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트.
  18. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 또는 제17항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 벡터가 바이러스 또는 플라스미드 벡터인 벡터.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형된 tRNA, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 또는 제18항 또는 제19항의 벡터, 및
    제약상 허용가능한 담체
    를 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 담체가 리포좀인 조성물.
  22. 제18항 또는 제19항의 벡터를 포함하는 세포.
  23. 제20항 또는 제21항의 조성물을 정지-코돈-연관된 유전 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 정지-코돈-연관된 유전 질환을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 조기 정지 코돈과 연관된 유전 질환이 낭성 섬유증, 근이영양증, β-지중해 빈혈 또는 리들 증후군인 방법.
  25. 제20항 또는 제21항의 조성물을 세포에 도입시키는 것을 포함하는, 세포에서 넌센스 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열로의 번역을 복원시키는 방법이며, 여기서 변형된 tRNA가 넌센스 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열로의 번역을 복원시키는 것인 방법.
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