JP2024054361A - ACE-tRNAを用いた遺伝的再帰属を介して終止コドンレスキューする方法 - Google Patents
ACE-tRNAを用いた遺伝的再帰属を介して終止コドンレスキューする方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ACE-tRNAを用いた遺伝的再帰属を介して終止コドンレスキューする方法の提供。【解決手段】ある実施形態において、本発明は、Tアームと、Dアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移RNA(tRNA)であって、前記Tアームが伸長因子1α1(EF1α)と相互作用するヌクレオチドを有するTステムとを含む、修飾された転移RNA(tRNA)を提供する。EF1αは、アミノアシルtRNAをリボソームにリクルートし、tRNAが脱アシル化されるのを保護する。合理的なヌクレオチド置換は、リボソームへのtRNAの送達および脱アシル化からの保護を強化する調整された(tuned)tRNA:EF1α相互作用をもたらす。【選択図】なし
Description
本願は、2017年11月2日に出願された米国仮出願第62/580,887号および2018年6月19日に出願された米国仮出願第62/687,015号の優先権を主張する。上で引用されている出願の内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
連邦により資金援助された研究に関する記述
連邦により資金援助された研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたR01 GM106569の下で政府の支援を得て為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
DNA分子は、DNAポリマーを構成するヌクレオチド塩基の配列の形態で遺伝情報を保有する。DNAでは、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンという4種のヌクレオチド塩基のみが使用されている。この情報は、コドンという3つの連続する塩基の形態で、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、次いで、転移RNA(tRNA)およびリボソームによって翻訳されて、タンパク質を形成する。RNAでは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルという4種のヌクレオチド塩基が使用されている。遺伝コードとは、トリプレットコドンと特定のアミノ酸の間の関係である。64の可能なコドントリプレットが遺伝コードを形成し、3つの終止(終結とも称される)コドンは、当該コドンの箇所でタンパク質産生を停止させるように、翻訳機構(細胞のリボソーム)にシグナルを与える。コドン中の他の61個のトリプレットは、20の標準アミノ酸の1つに対応する。図1を参照されたい。
DNAはリボソームによって翻訳され、DNAによって特異的に与えられる遺伝的指令に従って各アミノ酸を1つずつ一緒に連結させてポリペプチドを形成する。リボソームが終止コドンに達すると、タンパク質の伸長が終結する。3つの終止コドンは、UAG(アンバー)、UAA(オーカー)およびUGA(オパール)である。アミノ酸をコードするコドンを終止コドンに変化させる変異は、「ナンセンス変異」と呼ばれる。これらのナンセンス変異はポリペプチド配列の重大なトランケーション/短縮をもたらし得、遺伝的表現型の甚大な変化を引き起こし得る。このため、リボソームが変異体終止シグナルに達すると、リボソームは翻訳を終結して未完成のタンパク質をもたらすので、たとえ発現を指示する遺伝子が存在する場合でも、極めて重要なタンパク質が産生されないことがある。
転移RNAは、リボソーム上でmRNAをタンパク質に翻訳する。各tRNAは、mRNA上の相補的コドンとハイブリッドを形成する「アンチコドン」領域を含有する。その指定されたアミノ酸を運搬するtRNAは、「充填された(charged)」tRNAと呼ばれる。tRNAが、61種のアミノ酸を伴う(すなわち、終止シグナルを伴わない)tRNAの1つである場合、通常、そのアミノ酸を成長しているペプチドに結合させる。tRNAの構造遺伝子は約72~90ヌクレオチド長であり、クローバー葉の構造へ折り畳まれる。tRNAは、RNAポリメラーゼIIIによって転写され、成熟したtRNAコード配列の一部となるそれ自身の遺伝子内スプリットプロモーターを含有する(Sharp S.J.,Schaack J.,Coolen L.,Burke D.J.およびSoll D.,”Structure and transcription of eukaryotic tRNA genes”,Crit.Rev.Biochem,19:107-144(1985);Geiduschek E.O.,およびTocchini-Valentini,”Transcription by RNA polymerase III,Annu.Rev.Biochem.57:873-914(1988))。
「ナンセンスサプレッサー」は、「終止」シグナルの引き金を引く代わりに、終結コドンに応答してアミノ酸を挿入するように、変化されたアンチコドンを含有するtRNA遺伝子の対立遺伝子である。例えば、オーカー変異は、mRNA中にUAAコドンの作製をもたらす。オーカーサプレッサー遺伝子は、UAA部位にアミノ酸を挿入するAUUアンチコドンを有するtRNAを産生し、これにより、本来は翻訳の停止を引き起こすコドンが存在するにも関わらず、mRNAの継続的な翻訳を可能にする。
原核生物並びに酵母およびシー・エレガンス(C.elegans)などの真核生物中に、多数のナンセンスサプレッサーtRNA対立遺伝子が同定されてきた。異なるサプレッサーtRNAは、抑制効率が異なる。大腸菌(E.coli)および他の系では、アンバーサプレッサーが相対的により効率が高く、オーカーサプレッサーはこれより効率が低く、オパールが最も効率が低く、このことは、アンバーコドンはタンパク質合成を終結するのにあまり頻繁に使用されていないのに対して、オーカーおよびオパールコドンは、天然の終結シグナルとして、よりしばしば使用されていることを示唆する。
DNAブループリント中の望ましくないエラーは、疾患を引き起こし得る。例えば、ブループリントの末端よりむしろ、タンパク質の中央に予期せぬ「終止」シグナルが発生すると、変化した機能を有しまたは全く機能を有しないトランケートされたまたは短縮されたタンパク質の産生をもたらす。嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β-サラセミアおよびリドル症候群などの多くのヒトの疾患は、それぞれ、適切な肺、血液、筋肉または腎臓機能にとって重要なタンパク質に対するDNA読み枠中の望ましくない終結シグナルに起因する。
したがって、対応する修飾されていないナンセンスサプレッサーtRNAと比べて安定化された新規の修飾されたナンセンスサプレッサーtRNAおよび嚢胞性線維症と関連する遺伝子の終結を抑制する増大した活性を有するナンセンスサプレッサーtRNAを提供することが必要とされる。
Sharp S.J.,Schaack J.,Coolen L.,Burke D.J.およびSoll D.,"Structure and transcription of eukaryotic tRNA genes",Crit.Rev.Biochem,19:107-144(1985)
Geiduschek E.O.,およびTocchini-Valentini,"Transcription by RNA polymerase III,Annu.Rev.Biochem.57:873-914(1988)
ある実施形態において、本発明は、Tアームと、Dアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移RNA(tRNA)であって、前記Tアームが伸長因子1α1(EF1α)と相互作用するヌクレオチドを有するTステムとを含む、修飾された転移RNA(tRNA)を提供する。EF1αは、アミノアシルtRNAをリボソームにリクルートし、tRNAが脱アシル化されるのを保護する。合理的なヌクレオチド置換は、リボソームへのtRNAの送達および脱アシル化からの保護を強化する調整された(tuned)tRNA:EF1α相互作用をもたらす。
ある実施形態において、本発明は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54または55の修飾された転移RNA(tRNA)であって、チミジンがウラシルで置換されている修飾された転移RNA(tRNA)を提供する。
ある実施形態において、本発明は、配列番号1~538のいずれか一つの修飾された転移RNA(tRNA)であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移RNA(tRNA)を提供する。
ある実施形態において、修飾されたtRNAは、配列番号56~60、62~66、84~86、90~111、113、128~143、147~149、153~156、161~174、176、178、181、184~186、192、196~197、199~201、205、213~240、246、255~256、258~285、299、305~312、314、318~332、335~344、346、350~354、357~360、362、365~370、372~383、388~390、392、394~401、403~407、414~416、418、422、425、428~433、437、444~445、452、455、459~463、470、472~474、476、487~492、525、530~539、545~550、553~555、561~563および567~579のいずれか1つであって、ここで、チミジンがウラシルで置換されている。
ある実施形態において、本発明は、Tステムと、Dステムと、アンチコドンループと、アクセプタステムとを含む修飾された転移RNA(tRNA)であって、(a)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンとを含み、前記アンチコドンが5’-UCA-3’であり、かつTGA終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがアルギニン、トリプトファン若しくはグリシンに作動可能に連結されており;(b)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-UUA-3’であり、かつTAA終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがグルタミン若しくはグルタミン酸に作動可能に連結されており;または(c)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-CUA-3’であり、かつTAG終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがトリプトファン、グルタミン酸若しくはグルタミンに作動可能に連結されている、修飾された転移RNA(tRNA)を提供する。ある実施形態において、Tアームは、EF1αとの相互作用を調整する合理的に改変されたヌクレオチド配列を含み、その抑制活性を強化し、これにより、その治療的潜在能力を増大させる。EF1αとの調整された相互作用を有するtRNAは増大されたナンセンス抑制を有し、増大された治療特性を与える。
ある実施形態において、本発明は、上記の修飾されたtRNAをコードするオリゴヌクレオチド配列であって、オリゴヌクレオチドが150ヌクレオチド未満の全長を有するオリゴヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドはDNAである。
ある実施形態において、本発明は、第一のオリゴヌクレオチド配列と第二のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は、上記の修飾されたtRNAを独立にコードし、前記第一および第二のオリゴヌクレオチドが150ヌクレオチド未満の全長を独立に有し、並びに2つの配列がタンデムである、オリゴヌクレオチドを提供する。
ある実施形態において、本発明は、プロモーターと、修飾されたtRNAをコードする核酸または上記オリゴヌクレオチドとを含む発現カセットを提供する。
ある実施形態において、本発明は、上記のオリゴヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターを提供する。
ある実施形態において、ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。
ある実施形態において、本発明は、上記の修飾されたtRNA、オリゴヌクレオチドまたはベクターと、薬学的に許容され得る担体とを含む組成物を提供する。
ある実施形態において、担体はリポソームである。
ある実施形態において、本発明は、上記のベクターを含む細胞を提供する。
本発明は、終止コドン関連遺伝子疾患を処置する方法であって、終止コドン関連遺伝子疾患を処置することを必要とする患者に、上記修飾されたtRNA組成物を投与することを含む、方法を提供する。
ある実施形態において、未成熟終止コドンと関連する遺伝子疾患は、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β-サラセミアまたはリドル症候群である。
ある実施形態において、本発明は、細胞中のナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への翻訳を回復させる方法であって、上記組成物を前記細胞に導入することを含む方法を提供する。
ある実施形態において、本発明は、NanoLucなどのルシフェラーゼ酵素中のナンセンスコドンの抑制を用いるハイスループットクローニングおよびスクリーニングによって、アンチコドン編集(ACE(anti-codon edited))tRNAを同定する方法を提供する。
長年にわたって、研究者たちは、ヒト遺伝子中で確立されているナンセンスコドンをもたらす何百もの特有の点変異を同定してきた。これらの種類の変異は、例えば、筋ジストロフィー、色素性乾皮症、嚢胞性線維症、血友病、貧血、甲状腺機能低下症、p53扁平上皮(squamal)細胞癌、p53肝細胞癌、p53卵巣癌、食道癌、骨癌、卵巣癌、食道癌、肝細胞癌、乳がん、肝細胞癌、線維性組織球腫、卵巣癌、SRY性転換、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病をもたらす。乳がんと関連するBRACA-1およびBRACA-2遺伝子も類似の変異を有する。
数百のヒトtRNAをコードするヌクレオチド配列が知られており、Genbankなどの入手先を通じて、当業者は一般に入手可能である。tRNAの構造は高度に保存されており、tRNAは、しばしば、種を越えて機能する。このため、細菌または他の真核生物のtRNA配列も、本発明の安定化されたtRNAのオリゴヌクレオチドのための潜在的供給源である。特定のtRNA配列が所望の哺乳動物細胞中で機能するかどうかの決定は、定型的な実験操作を通じて確かめることができる。未知のさらなるその他の潜在的なtRNA配列は、定型的な実験操作を通じて、安定化するために本明細書に記載されているとおりに修飾することができる。
tRNA遺伝子は全ての細胞種内で活性である強力なプロモーターを有する。真核生物のtRNA遺伝子に対するプロモーターは、tRNA分子自体をコードする構造配列内に含有される。5’上流領域内に転写活性を制御する要素が存在するが、活性な転写単位の長さは500塩基対を大幅に下回ることがあり得、このため、送達ベクター内への収容は容易である。転写およびプロセシングが行われると、tRNAは低い分解速度を有する。最後に、ナンセンスサプレッサーを用いた遺伝子治療は、ナンセンスコドンを含有する標的遺伝子に対する内在性の生理的調節を維持する。
ナンセンス変異
ナンセンス変異
転移RNA(tRNA)は、メッセンジャーRNA(mRNA)配列のタンパク質への解読において機能するRNA分子の一種である。tRNAは、mRNA分子からタンパク質を合成する翻訳の間にリボソーム中の特異的な部位で機能する。未成熟終結コドン(PTC)とも称されるナンセンス変異は、ヒトの疾患を引き起こす単一塩基対変異の約10~15%を占め、嚢胞性線維症もこれに含まれる。(Peltz et al.,Annu Rev Med.,64:407-25,2013)。ほぼ完全な遺伝子発現および活性の喪失のため、並びにトランケートされた生成物のドミナントネガティブ効果の可能性のために、一般に、ナンセンス変異はミスセンス変異より深刻な派生結果を有する。PTCは、未成熟な翻訳終結およびナンセンス変異依存分解(NMD)経路を通じた加速されたmRNA転写物分解をもたらす。
現在の研究は、tRNA内のアンチコドン配列の分子編集を通じて、tRNAがそのアミノ酸を送達するRNA転写物内の特異的部位が変更され得ることを示している。このアプローチは、未成熟終結コドン(PTC)を元の失われたアミノ酸へ効果的かつ治療的に復帰させることを可能にした。アンチコドン編集tRNA(ACE-tRNA)は、新しいクラスの生物学的治療薬を形成する。
操作されたtRNAは、疾患を引き起こすナンセンスコドンの特異的なアミノ酸への「再編集」を可能にする。これらの操作されたtRNAは、TACまたはTAAよりTGAなど、1種類の終止コドンのみを標的とする。tRNA+プロモーターは約300bpに過ぎないので、これらのtRNA分子のサイズが小さいことは、即座の発現(ready
expression)に適している。簡潔に述べれば、ヒト細胞中で機能するtRNA遺伝子の構造成分を含むオリゴヌクレオチドが合成される。このオリゴヌクレオチドの配列は、特定のtRNAにナンセンスまたはその他の特異的な変異を認識させるtRNAのアンチコドン領域中になされる置換を有する既知の配列に基づいて設計される。
expression)に適している。簡潔に述べれば、ヒト細胞中で機能するtRNA遺伝子の構造成分を含むオリゴヌクレオチドが合成される。このオリゴヌクレオチドの配列は、特定のtRNAにナンセンスまたはその他の特異的な変異を認識させるtRNAのアンチコドン領域中になされる置換を有する既知の配列に基づいて設計される。
リボソームとの相互作用を通じてナンセンス終止コドンを抑制するために、いくつかの小分子のスクリーニングが行われ、最も顕著な分子はG418、ゲンタマイシンおよびPTC124であった。PTC124またはアタルレンは、最近、嚢胞性線維症治療薬として使用するために第III相臨床試験を終了した。アタルレンおよびアミノグリコシドは、近い同族アミノ酸(near-cognate amino acid)を取り込むことによって、3つのナンセンスコドンの各々のリードスルー(read-through)を促進し、ナンセンス変異をミスセンス変異に変化させる。(Roy et al.,PNAS 2016 Nov 1;113(44):12508-12513)。
アンチコドン編集tRNA(ACE-tRNA)
アンチコドン編集tRNA(ACE-tRNA)
tRNAは、Tアームと、Dアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む一般的な4アーム構造を有する(図2)。
Tアームは、「Tステム」と「TψCループ」から構成される。ある実施形態において、tRNAの安定性を増加させるためにTステムが修飾される。ある実施形態において、ACE-tRNAは、内在性Tステム配列と比べて終止部位を抑制する生物活性を増加させる修飾されたTステムを有する。
本発明は、一実施形態において、極めて様々なナンセンス変異関連疾患を処置するために、より高い有効性をもって使用することができる、安定化されたtRNAを含む組成物を含む。表1~8中の以下の配列は、DNAとして書かれているが、RNA(転写されたDNA)としては、「T:チミジン」は、「U:ウラシル」である。したがって、以下の配列から転写されたtRNAは全て、チミジンの代わりにウラシルを含有する。
ある実施形態において、tRNAは、以下の配列を有する(配列中、チミジンはウラシルで置き換えられる。)。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
一実施形態において、ナンセンス抑制のためのACE-tRNAは、図3に図示されているとおりである(ホモ・サピエンスtRNATrp
TGA)。
本発明にしたがって、ヒトUAA、UAGおよびUGAサプレッサーtRNAが設計された。スクリーニングによって、Trp-TGA、Trp-TAG、Arg-TGA、Gln-TAG、Gln-TA、Glu-TAG、Glu-TAAの修復のためのコドン編集tRNAが同定された。tRNAは約100ヌクレオチドの長さであり、そこに野生型アミノ酸が存在するべきナンセンスコドン変異を抑制するために細胞に導入することができる。オリゴヌクレオチドは、レシピエント細胞に直接導入することができ、またはオリゴヌクレオチドの効力を増加させるためにタンデムでライゲーションすることができる。
発現カセットおよびベクター
発現カセットおよびベクター
ある実施形態において、ACT-tRNAは、発現カセットによってコードされる。さらに別の実施形態において、本発明のサプレッサーtRNAは、ベクターの使用を通じて、標準的な従来の遺伝子操作技術を用いて細胞に導入され得る。tRNAコード配列の内部プロモーター配列のために、tRNA配列は別個の転写ユニット中に含められる必要はないが、これを供してもよい。
本発明の一実施形態において、本発明のヌクレオチド発現系は、次いで、サプレッサーtRNAを発現するために細胞を形質導入するために使用される適切な遺伝子移入ビヒクル内に含められる。遺伝子送達ビヒクルは、本分野において既知のあらゆる送達ビヒクルとすることができ、受容体および/または脂質媒介性形質移入によって促進される裸のDNA並びに多数のベクターのいずれをも含むことができる。このようなベクターには、真核生物ベクター、原核生物ベクター(例えば、細菌ベクターなど)並びにレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター(ヒトおよびブタを含む他のもの)、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、SV40ウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよび偽型ウイルスベクターを含むがこれらに限定されないウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態において、ACT-tRNA(PTC)は、ベクター中にコードされる。図4。ある実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターである。使用され得るレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。
レトロウイルス;レトロウイルスベクター
レトロウイルス;レトロウイルスベクター
「レトロウイルス」という用語は、その複製サイクルの間に逆転写酵素を使用するRNAウイルスを表すために使用される。レトロウイルスのゲノムRNAは、逆転写酵素によって、二本鎖DNAに転換される。ウイルスのこの二本鎖DNA形態は、感染された細胞の染色体中に組み込まれることができ、一旦組み込まれると、「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、RNAポリメラーゼIIに対する鋳型としての役割を果たし、新しいウイルス粒子を産生するために必要とされる構造タンパク質および酵素をコードするRNA分子の発現を誘導する。プロウイルスの各末端には、「長い末端反復配列」または「LTR」と称される構造が存在する。LTRは、転写調節要素、ポリアデニル化シグナル並びにウイルスゲノムの複製および組み込みのために必要とされる配列を含む多数の制御シグナルを含有する。システルナウイルスA(Cisternavirus A)、オンコウイルスA、オンコウイルスB,オンコウイルスC、オンコウイルスD、レンチウイルスおよびスプマウイルスを含むレトロウイルス科の中には、いくつかの属が含まれる。レトロウイルスのいくつかは発癌性(すなわち、腫瘍原性)であるが、その他は発癌性でない。オンコウイルスは、感受性を有する種に肉腫、白血病、リンパ腫および乳癌を誘導する。レトロウイルスは、多様な種に感染し、水平および垂直に伝達され得る。レトロウイルスは宿主DNA中に組み込まれ、宿主DNAの配列を細胞から細胞へ伝達させることができる。これにより、遺伝子治療を含む様々な目的のためのベクターとして、レトロウイルスの開発に至った。
ヒト泡沫状ウイルス(HFV)およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含むレトロウイルスは、それらの標的細胞が分裂している細胞に限定されず、水疱性口内炎ウイルスG(VSV-G)外被糖タンパク質によるシュードタイピングを介して、それらの限定的な宿主細胞指向性を容易に拡張できるので、近年大きな注目を集めてきた(例えば、J.C.Burns et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037[1993];A.M.L.Lever,Gene Therapy.3:470-471「1996];およびD.Russell and A.D.Miller,J.Virol.,70:217-222[1996]参照)。
ベクター系は、一般的に、レトロウイルス配列の小さな部分(ウイルスの長い末端反復配列または「LTR」およびパッケージングまたは「psi」シグナル)を含有するDNAベクターとパッケージング細胞株とを有する。移入されるべき遺伝子は、DNAベクター中に挿入される。DNAベクター上に存在するウイルスの配列は、ウイルス粒子中へのベクターRNAの挿入またはパッケージングのためにおよび挿入された遺伝子の発現のために必要なシグナルを提供する。パッケージング細胞株は、粒子の集合に必要とされるウイルスタンパク質を提供する(D.Markowitz et al.,J.Virol.,62:1120[1988])。本発明の一実施形態において、293T細胞中での3プラスミド形質移入産生法を使用するFIV系が使用された(Johnston et
al.,J.Virol.1999 73:4991-5000)。複製能のないウイルスが首尾よく産生された。
al.,J.Virol.1999 73:4991-5000)。複製能のないウイルスが首尾よく産生された。
ベクターDNAは、様々な技術(例えば、リン酸カルシウム共沈、リポフェクション、電気穿孔)のいずれによっても、パッケージング細胞中に導入される。パッケージング細胞によって産生されたウイルスタンパク質は、培養上清中に流出されるウイルス粒子中へのRNAの形態のベクター配列の挿入を媒介する。
自然に分裂している、または成長因子によって分裂するように刺激されている細胞については、マウス白血病ウイルス(MLV)ベクターのような単純なレトロウイルスが適切な送達系である。しかしながら、遺伝子移入において一般的に使用される多くのレトロウイルスベクターの使用における主要な限界は、ベクターの多くが分裂する細胞に限定されることである。非分裂細胞が標的細胞である場合には、非分裂細胞に感染することができるレンチウイルスが使用され得る。
本明細書において使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、ゆっくり発症する疾患を生じさせるレトロウイルスの群(または属)を表す。この群内に含まれるウイルスには、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の病原因子であるHIV(ヒト免疫不全ウイルス;HIV1型およびHIV2型を含む);ヒツジに脳炎(ビスナ)または肺炎(マエディ)を引き起こすビスナ・マエディ、ヤギに免疫不全、関節炎および脳症を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス;ウマに自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス;ネコに免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス(FIV);ウシにリンパ節腫脹、リンパ球増加症およびおそらく中枢神経系感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス(BIV);並びに類人霊長類(sub-human primates)に免疫不全および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス(SIV)が含まれる。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長い潜伏期間と長引く経過を特徴とする。通常、これらのウイルスは単球およびマクロファージに潜伏感染し、そこから他の細胞に広がる。HIV、FIVおよびSIVは、Tリンパ球(すなわち、T細胞)にも容易に感染する。
HIV、SIV、FIVおよびウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)を含むレンチウイルスは、効率的な細胞内複製のために、単純な構造的gag-pol-env遺伝子の他に、いくつかのウイルス制御遺伝子に依存する。このように、レンチウイルスは、遺伝子制御およびウイルス複製のために、古典的なレトロウイルスよりさらに複雑な戦略を使用し、パッケージングシグナルがウイルスゲノム全体にわたって広がっているようである。これらの追加の遺伝子は、レンチウイルスの生活環の間に制御機能網を呈する。例えば、HIV-1感染すると、転写は、LTR中のRNA標的(TAR)との相互作用を通じたTatの発現によって上方制御される。次いで、完全長のおよびスプライシングされたmRNAの発現は、gag領域およびenv領域中に存在するRNA要素(RRE)と相互作用するRevの機能によって制御される(S.Schwartz et al.,J.Virol.,66:150-159[1992])。gag-polおよびenv mRNAの核外輸送は、Rev機能に依存する。これら2つの不可欠な制御遺伝子の他に、vif、vpr、vpx、vpuおよびnefを含む一連のアクセサリー遺伝子もウイルスゲノム中に存在し、効率的なウイルス産生と感染性に対するその効果が実証されているが、それらはウイルス複製のために絶対的に必要なわけではない(K.and F.Wong-Staal,Microbiol.Rev.,55:193-205(1991];R.A.Subbramanian and E.A.Cohen,J.Virol.68:6831-6835[1994];およびD.Trono,Cell 82:189-192[1995])。例示的なレンチウイルスであるHIV-1の構造の詳しい説明が、米国特許第6,531,123号に与えられている。
「源(source)」または「元の」レトロウイルスは、偽型レトロウイルスがそこから誘導された野生型レトロウイルスであり、またはベクターの遺伝要素の1つもしくはそれより多くの調製のために、パッケージングまたは導入遺伝子ベクターの構築の間に出発点として使用される野生型レトロウイルスである。遺伝要素は変化せずに使用してもよく、またはそれは変異されてもよい(ただし、それは元の要素と統計学的に有意な配列類似性を欠く点を越えない)。ベクターは、1を超える源レトロウイルスを有してもよく、異なる源レトロウイルスは、例えば、MLV、FIV、HIV-1およびHIV-2またはHIVおよびSIVであり得る。「遺伝要素」という用語は、遺伝子を含むが、これに限定されない。
同族レトロウイルスは、問題のベクターが核酸レベルで最大のパーセント配列同一性を有する野生型レトロウイルスである。通常、これは、源レトロウイルスと同一であろう。しかしながら、源レトロウイルスが広範に変異されていれば、ベクターは何らかの他のレトロウイルスによりよく似ていることが考えられる。同族レトロウイルスは、構築のための物理的な出発点である必要はなく、元の要素をまず取得し、次いで、それを修飾するよりもむしろ、遺伝要素、特に変異体要素を直接合成することを選択し得る。「同族(cognate)」という用語は、タンパク質、遺伝子または遺伝要素(例えば、スプライス供与部位またはパッケージングシグナル)に同様に適用され得る。同族タンパク質に言及する場合、パーセント配列同一性はアミノ酸レベルで決定される。
「同族」レトロウイルスという用語は、極端な事例では、すなわち、全てのレトロウイルスの遺伝要素が代替非レンチウイルス遺伝要素で置換されている場合には、解釈することが困難であり得る。この場合には、前述した源レトロウイルス株が、任意に同族レトロウイルスであると考えられる。
ウイルスまたはベクターを参照して本明細書において使用される場合、「複製」という用語は、細胞複製の結果としての染色体中のプロウイルスDNAの正常な複製または機能的な複製起点の存在の結果としてのプラスミドDNAの自律的な複製を表さない。代わりに、「複製」は、ウイルスRNAを含有する感染性ウイルス粒子が細胞内に入り、RNAがDNAに逆転写され、DNAがプロウイルスとして宿主染色体中に組み込まれ、感染された細胞がビリオンタンパク質を産生し、完全長ウイルスゲノムRNAでこれらを新しい同じく感染性の粒子に組み立てる完全なウイルスの生活環の完了を表す。
「複製能を有する」という用語は、感染した細胞中でのウイルスの複製が感染性ビリオンの産生をもたらし、この感染性ビリオンが以前には感染していない別の細胞に感染した後に、この感染していない細胞にこのような感染性ビリオンを同様に産生させるように、複製することが可能な野生型ウイルスまたは変異体ウイルスを表す。本発明は、複製欠損ウイルスの使用を想定する。
本明細書において使用される場合、「弱毒化されたウイルス」という用語は、予定される対象中でその病原性が実質的に低減されるように修飾されたあらゆるウイルス(例えば、弱毒化されたレンチウイルス)を表す。ウイルスは、臨床的見地からそれが非病原性である点まで弱毒化され得る、すなわち、ウイルスに曝露されたその対象は、対照の対象と比べて統計的に有意なレベルの病状の増加を呈さない。
本発明は、修飾されたレトロウイルスの調製および使用を想定する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1型、ヒト免疫不全ウイルス2型、ネコ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ビスナ-マエディ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびウシ免疫不全ウイルスまたは1つを超えるレトロウイルス種の部分から構成されるウイルス(例えば、MLV、FIV、HIV-1およびHIV-2またはHIV-1および/またはSIVの部分から構成されるハイブリッド)の変異体である。
基準ウイルスは、変異体ウイルスの構成要素を記載する際にそのゲノムが使用されるウイルスである。例えば、変異体ウイルスの特定の遺伝要素は、様々な置換、欠失または挿入によって、基準ウイルスの同族要素と異なると言い得る。変異体ウイルスは、実際に、基準ウイルスに由来する必要はない。
好ましい基準FIV配列は、Talbott et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1989 86:5743-7;Genbank access#NC_001482中に見出される。ある実施形態において複製能のない偽型レトロウイルス(例えば、FIV)を産生するために、3プラスミド一過性形質移入法(three-plasmid transient transfection method)を使用することができる。一般的な方法は、Wang et al.,J Clin Invest.1999 104:R55-62およびJohnston et al.,J Virol.1999 73:4991-5000に記載されている。
レトロウイルスベクター系
レトロウイルスベクター系
本発明は、導入遺伝子ベクターと、1またはそれを超える適合的パッケージングベクターと、エンベロープベクターと、適切な宿主細胞とを含むレトロウイルス遺伝子増幅および移入系を想定する。使用されるベクターは、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス)に由来し得る。レトロウイルスベクターは、(1)パッケージングベクターRNAを本質的に含まないウイルス粒子を産生するパッケージング細胞株を形成するための、宿主細胞中へのパッケージングベクターおよびエンベロープベクターの形質移入、(2)パッケージング細胞株中への導入遺伝子ベクターの形質移入、(3)パッケージング細胞株による感染性ウイルス粒子中への導入遺伝子ベクターRNAのパッケージングおよび(4)このような細胞が形質導入され、続いて導入遺伝子を発現するように、標的細胞への粒子の投与を可能にする。
粒子は対象へインビボで直接投与されるか、または対象の細胞は取り出され、インビトロで粒子に感染され、対象の身体に戻される。
本発明のパッケージングベクターおよび導入遺伝子ベクターは、複製能のないウイルスを生成する。本発明の所定のベクター系中への取り込みのために選択されるベクターは、パッケージングベクター(複数可)または導入遺伝子ベクターのさらなる変異なしに、(1または複数の)パッケージングベクター(複数可)および導入遺伝子ベクターの相同組換えのみによって、共形質移入された細胞が複製能を有するウイルスを生成することができないようなベクターである。本系で使用される外被タンパク質は、レトロウイルスの外被、合成若しくはキメラ外被またはレトロウイルスでない外被で覆われたウイルス(例えば、バキュロウイルス)からの外被であり得る。
パッケージングシグナル
パッケージングシグナル
本明細書において使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスのキャプシドまたは粒子中へのウイルスRNAまたはベクターRNAの挿入のために必要とされる、または少なくともこれを促進するレトロウイルスのゲノムまたはベクター内に位置する配列を表す。RNA中のパッケージングシグナルは、そのRNAを、ビリオン中にパッケージングされるべきRNAとして同定する。便宜上、「パッケージングシグナル」という用語は、機能的なパッケージングシグナルに転写されるベクターDNA配列を表すためにも使用される。ある特定のパッケージングシグナルは遺伝子の一部であり得るが、コードされるタンパク質のペプチド部分としてより、RNAの形態で認識される。
パッケージングベクターと導入遺伝子ベクターとの重要な差異は、パッケージングベクター中において、主要なパッケージングシグナルは不活化されているのに対して、導入遺伝子ベクター中においては、主要なパッケージングシグナルは機能的であるということである。理想的には、パッケージングベクター中において、全てのパッケージングシグナルは不活化され、導入遺伝子ベクター中において、全てのパッケージングシグナルは機能的であるはずである。しかしながら、ウイルス力価を最大化することまたは相同組換えを阻害することなどの相殺検討事項(countervailing consideration)が、このような構築物をより望ましくないものとし得る。
パッケージング系;パッケージングベクター;パッケージング細胞株
パッケージング系;パッケージングベクター;パッケージング細胞株
パッケージング系とは、適切なRNAをキャプシドで包むことができるビリオンを産生し、ビリオンを産生する細胞からビリオンを輸送し、標的細胞にビリオンを伝達し、標的細胞内で、RNAを逆転写させ、前記RNA中に取り込まれた導入遺伝子が発現できる様式で宿主ゲノム中に組み込ませるために必要とされる遺伝情報の全てを、発現可能な形態で集合的に提供する1つのベクターまたは複数のベクターである。しかしながら、パッケージング系は、それ自体を実質的にパッケージングできないものでなければならない。むしろ、パッケージング系は、別個の導入遺伝子ベクターをパッケージする。
本発明において、パッケージングベクターは、gagおよびpol遺伝子の機能的等価物(「GP」ベクター)を提供する。env遺伝子(複数可)は、エンベロープベクターによって提供される。理論的には、異なるgagおよびpol遺伝子を別個のベクター上に構築し、これらの相対的発現レベルが適切に調整できるように、これらを異なる制御可能なプロモーターに(または一方を制御可能なプロモーターに、他方を構成的プロモーターに)作動可能に連結することを望むのであれば、3ベクター系(「G」、「P」および「E」ベクター)が可能である。
パッケージング細胞株は、達成可能な条件下で、ウイルス粒子を産生するパッケージング系によって形質移入される適切な宿主細胞である。本明細書において使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、典型的には、ウイルスの構造タンパク質(例えば、gag、polおよびenv)を発現するが、パッケージングシグナルを含有しない細胞株を表すために使用される。例えば、細胞株は、そのゲノム内の1つの染色体部位に、機能的psi+配列を欠く5’-LTR-gag-pol-3’-LTR断片(Δ-psiと表記される)と、同じく別の染色体部位に位置するΔ-psiである5’-LTR-env-3’-LTR断片とを有するように遺伝的に操作されている。これらのセグメントはともに構成的に転写されるが、psi+領域が喪失しており、産生されるウイルスRNA分子が完全なサイズより小さいので、空のウイルス粒子が形成される。
宿主細胞がパッケージングベクターのみによって形質移入されれば、完全長パッケージングベクターなしに実質的にウイルス粒子のみを産生する。1つの例では、パッケージング細胞によって産生されたウイルス粒子の10%未満が、完全長のパッケージングベクター由来RNAを含有する。しかしながら、パッケージングベクターは機能的なプライマー結合部位を欠くので、これらの粒子は新しい細胞に感染したとしても、パッケージングベクターRNAはDNAに逆転写されず、したがって、新しい細胞はビリオンを産生しない。このため、単独では、パッケージングベクターは複製能のないウイルスである。
いくつかの実施形態において、パッケージング細胞および/または細胞株は導入遺伝子ベクターを含有する。パッケージング細胞株は、導入遺伝子ベクターを感染性粒子中にパッケージする。このような細胞株は、本明細書において、「トランスジェニックビリオン産生細胞株」と称される。
パッケージングは誘導性であり得、非誘導性でもあり得ることが想定される。誘導性パッケージング細胞およびパッケージング細胞株において、レトロウイルス粒子は少なくとも1つの誘導因子に応答して産生される。非誘導性パッケージング細胞株およびパッケージング細胞において、レトロウイルス粒子産生が起きるためには、誘導因子は必要とされない。
パッケージングベクターは、同族野生型ゲノムの少なくとも1つのパッケージングシグナルの不活化によって、複製能を有する野生型レトロウイルスゲノムと必ず異なる。1を超えるパッケージングシグナルが不活化され得る。一例において、パッケージングベクターによって提供されるレトロウイルス遺伝子のみが、構造タンパク質または不可欠な制御タンパク質をコードするレトロウイルス遺伝子である。
導入遺伝子ベクター
導入遺伝子ベクター
導入遺伝子ベクターは、導入遺伝子ベクターがパッケージング細胞株中に形質移入された後、導入遺伝子ベクターがRNAに転写され、このRNAが感染性ウイルス粒子中にパッケージングされるように、目的の発現可能な非レトロウイルス遺伝子を有し、かつ少なくとも1つの機能的なレトロウイルスパッケージングシグナルを含む発現ベクターである。続いて、これらの粒子は標的細胞に感染し、そのRNAはDNAへ逆転写され、DNAはプロウイルスの要素として宿主細胞ゲノム中に取り込まれ、これにより、目的の遺伝子を標的細胞に伝達する。
本明細書において使用される場合、「形質導入」という用語は、形質移入によってではなく、感染による、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した遺伝子の送達を表す。ある実施形態において、レトロウイルスベクターは形質導入される。このため、「形質導入された遺伝子」は、レトロウイルス感染またはベクター感染およびプロウイルス組み込みを介して細胞中に導入された遺伝子である。ある実施形態において、ウイルスベクター(例えば、「導入遺伝子ベクター」)は、遺伝子を「標的細胞」または宿主細胞中に形質導入する。本発明は、本発明での使用に適しており、いずれかの目的の遺伝子(または遺伝子の感染若しくは発現を示すために使用される「マーカー遺伝子」若しくは「レポーター遺伝子」)に連結されている導入遺伝子ベクターを包含する。
本明細書において使用される場合、「長期形質導入」という用語は、他のベクターを用いて観察されるよりも長い期間、宿主細胞または標的細胞中に形質導入された状態で留まることができるベクターを表す。例えば、本発明は、少なくとも120日間、少なくとも1年間、または対象の生涯にわたってまたは処置の必要な期間、形質導入された状態で留まることができるレトロウイルスベクターを提供する。発現の期間は、ベクターの選択より、プロモーターの選択および標的細胞の種類の関数である。
「安定な形質導入」または「安定に形質導入された」という用語は、形質導入された細胞のゲノム中への外来DNAの導入および組み込みを表す。「安定な形質導入体」という用語は、ゲノムDNA中に安定に組み込まれた外来DNAを有する細胞を表す。
「一過性の形質導入」または「一過性に形質導入された」という用語は、形質導入された細胞のゲノム中に外来DNAが組み込まれていない、外来DNAの細胞中への導入を表す。外来DNAは、形質導入された細胞の核内に数日間存続する。この期間中、外来DNAは、染色体中の内在性遺伝子の発現を支配する制御的調節を受ける。「一過性形質導入体」という用語は、外来DNAを取り込んだが、このDNAを組み込むことができなかった細胞を表す。
いくつかの実施形態において、本発明の標的細胞および/または宿主細胞は、「非分裂」細胞である。これらの細胞には、通常分裂しない神経細胞などの細胞が含まれる。しかしながら、本発明は、非分裂細胞(筋肉細胞、白血球、脾臓細胞、肝細胞、眼細胞、上皮細胞を含むが、これらに限定されない。)に限定されることは意図されていない。
いくつかの実施例において、ベクターおよびベクターの子孫は、少なくとも105cfu/mlのベクター力価を達成するために複数の標的細胞を形質導入することが可能である。感染多重度(MOI)は、少なくとも1(すなわち、細胞当たり平均して1つ感染する)または少なくとも2でさえあり得る。
発現カセットおよびベクター
発現カセットおよびベクター
本発明は、ACE-tRNAをコードする配列を含む発現カセットも提供する。
ある実施形態において、発現カセットはプロモーターをさらに含有する。ある実施形態において、プロモーターは制御可能なプロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。ある実施形態において、プロモーターはPGK、CMV、RSV、H1またはU6プロモーター(PolIIおよびPolIIIプロモーター)である。
本発明は、上記発現カセットを含有するベクターを提供する。ある実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。ある実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ポリオウイルス、HSVまたはマウスマロニー(Maloney)をベースとするウイルスベクターである。
本明細書において使用される場合、「発現カセット」は、適切な宿主細胞中において特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することが可能な核酸配列であって、終結シグナルへ作動可能に連結され得る目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る核酸配列を意味する。発現カセットは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要とされる配列も含み得る。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードする。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得る。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現のために有用な組換え形態で取得されたものでもあり得る。発現カセット中でのヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは宿主細胞が一部の特定の刺激に曝されたときのみに転写を開始する制御可能なプロモーターの調節下にあり得る。多細胞生物の場合には、プロモーターは、特定の組織若しくは器官または発達の段階に対して特異的とすることもできる。
「作動可能に連結された」は、配列の1つの機能が別の配列によって影響を受けるように、単一の核酸断片上に複数の核酸配列が会合していることを表す。例えば、制御性DNA配列がコードDNA配列の発現に影響を与えるように(すなわち、コード配列または機能的RNAがプロモーターの転写調節下にある)2つの配列が位置していれば、制御性DNA配列が、RNAまたはポリペプチドをコードするDNA配列「に作動可能に連結されている」または「と会合している」と称される。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向性で制御配列に作動可能に連結されることができる。
アデノ随伴ウイルス(AAV)
アデノ随伴ウイルス(AAV)
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、パルボウイルス科の小さな非病原性ウイルスである。AAVは、複製のためにヘルパーウイルスに依存する点で、この科の他の一員と異なる。ヘルパーウイルスの非存在下では、AAVは、19番染色体のqアーム中に、遺伝子座特異的な様式で組み込まれ得る。AAVのおよそ5kbのゲノムは、プラスまたはマイナスのいずれかの極性の一本鎖DNAの1つのセグメントからなる。ゲノムの末端は、ヘアピン構造に折り畳まれ、ウイルスDNA複製の起点としての役割を果たすことができる短い末端逆位配列である。物理的には、パルボウイルスビリオンは外被に包まれておらず、その正二十面体(icosohedral)のキャプシドは、直径およそ20nmである。
現在まで、数多くの血清学的に異なるAAVが同定されており、12より多くがヒトまたは霊長類から単離されてきた。AAV2のゲノムは、4680ヌクレオチドの長さであり、2つの読み枠(ORF)を含有する。左のORFは、一本鎖の子孫ゲノムの産生に加えて、複製および転写の制御に関与している非構造的Repタンパク質、Rep40、Rep52、Rep68およびRep78をコードする。さらに、Repタンパク質のうち2つは、ヒト19番染色体のqアームの領域中へのAAVゲノムの優先的な組み込みと関連付けられてきた。Rep68/78は、NTP結合活性並びにDNAおよびRNAヘリカーゼ活性を有することも示されてきた。Repタンパク質は、核局在化シグナルの他、いくつかの潜在的リン酸化部位を有する。これらのキナーゼ部位の1つの変異は、複製活性の喪失をもたらした。
ゲノムの末端は、ウイルスDNA複製の起点としての役割を果たすT形状のヘアピン構造に折り畳まれる潜在能力を有する短い末端逆位配列(ITR)である。ITR領域内には、ITRの機能にとって中心となる2つの要素、GAGCリピートモチーフと末端分解部位(trs(terminal resolution site))が記載されてきた。このリピートモチーフは、ITRが直鎖またはヘアピン立体構造のいずれかであるときに、Repを結合することが示されてきた。この結合は、trsでの切断のためにRep68/78を配置する役割を果たし、これは、部位特異的および鎖特異的様式で起こる。複製での役割に加えて、これらの2つの要素はウイルスの組み込みにおいて中心を成すようである。19番染色体組み込み遺伝子座内に含有されているのは、隣接するtrsを有するRep結合部位である。これらの要素は機能的であり、遺伝子座特異的組み込みのために必要であることが示されている。
AAVビリオンは、直径がおよそ25nmで、外被に包まれていない正20面体粒子であり、VP1、VP2およびVP3と称される3つの関連するタンパク質からなる。右のORFは、キャプシドタンパク質、VP1、VP2およびVP3をコードする。これらのタンパク質は、それぞれ1:1:10の比で見出され、全て右側のORFに由来する。これらのキャプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび異常な開始コドンの使用によって互いに異なる。欠失解析は、選択的にスプライシングされたメッセージから翻訳されるVP1の除去または改変は感染粒子の低下した産生量をもたらすことを示した。VP3コード領域内変異は、いずれの一本鎖子孫DNAまたは感染性粒子をも産生できなくする。AAV粒子は、AAVキャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。AAVキャプシドポリペプチドは、完全なVP1、VP2およびVP3ポリペプチドをコードすることができる。粒子は、AAV2と他のAAVキャプシドタンパク質を含む粒子であり得る(すなわち、AAV1とAAV2などのキメラタンパク質)。標準的な方法によって定型的に決定することができるように、得られたウイルス粒子が、AAV2キャプシドを含み、AAV1と抗原的にまたは免疫学的に異なった状態を保つ限り、本明細書では、AAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列中の変動が想定される。具体的には、例えば、ウイルス粒子が抗原的にまたは免疫学的にAAV1と異なるかどうかを決定するために、ELISAおよびウェスタンブロットを使用することができる。さらに、AAV2ウイルス粒子は、好ましくは、AAV1と異なる組織指向性を保持する。
AAV2粒子は、AAV2キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。完全なVP1、VP2およびVP3ポリペプチドをコードするAAV2キャプシドポリペプチドは、NC_001401に記載されているヌクレオチドに(AAV2キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列)よってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、全体で、少なくとも約63%の相同性(または同一性)を有することができる。キャプシドタンパク質は、NC_001401に記載されているヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質と約70%の相同性、約75%の相同性、80%の相同性、85%の相同性、90%の相同性、95%の相同性、98%の相同性、99%の相同性または100%の相同性までも有することができる。キャプシドタンパク質は、NC_001401に記載されているヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質と約70%の同一性、約75%の同一性、80%の同一性、85%の同一性、90%の同一性、95%の同一性、98%の同一性、99%の同一性または100%の同一性までも有することができる。粒子は、別のAAVとAAV2キャプシドタンパク質とを含む粒子、すなわち、キメラタンパク質であり得る。標準的な方法によって定型的に決定することができるように、AAV2キャプシドを含む得られたウイルス粒子は、AAV4と抗原的にまたは免疫学的に異なった状態を保つ限り、本明細書では、AAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列中の変動が想定される。具体的には、例えば、ウイルス粒子が抗原的にまたは免疫学的にAAV1と異なるかどうかを決定するために、ELISAおよびウェスタンブロットを使用することができる。さらに、AAV2ウイルス粒子は、本明細書の実施例中に例示されているものなどの、好ましくは、AAV1と異なる組織指向性を保持するが、少なくとも1つのAAV2コートタンパク質を含むAAV2キメラ粒子は、AAV2コートタンパク質のみからなるAAV2粒子とは異なる組織指向性を有し得る。
ある実施形態において、本発明は、さらに、AAV2末端逆位配列の対を含むベクターを含有する、すなわち、キャプシドに包むAAV2粒子を提供する。AAV2 ITRのヌクレオチド配列は、本分野において既知である。さらに、粒子は、AAV1とAAV2キャプシドタンパク質の両方を含む粒子、すなわち、キメラタンパク質であり得る。さらに、粒子は、他のAAV(例えば、AAV1~AAV9およびAAVrh10)からのAAV末端逆位配列の対を含むベクターをキャプシドに包む粒子であり得る。粒子中のキャプシドに包まれたベクターは、末端逆位配列間に挿入された外来性の核酸をさらに含むことができる。
AAVの以下の特徴によって、AAVは遺伝子移入のための魅力的なベクターとなってきた。AAVベクターは、インビトロで細胞のゲノム中に安定に組み込まれること、幅広い宿主域を有すること、インビトロおよびインビボで分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入すること、形質導入された遺伝子の高いレベルの発現を維持することが示されている。ウイルス粒子は熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、pHの変化、温度に対して耐性を有し、CsCl勾配上でまたは他の手段によって濃縮することができる。本発明は、AAV粒子、組換えAAVベクターおよび組換えAAVビリオンを投与する方法を提供する。例えば、AAV2粒子はAAV2キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子であり、またはAAV1粒子はAAV1キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えAAV2ベクターは、AAV2の少なくとも1つの特有の核酸を含む核酸構築物である。組換えAAV2ビリオンは、組換えAAV2ベクターを含有する粒子である。「AAV2
ITR」という用語内にあると考えられるためには、ヌクレオチド配列は、AAV2 ITRをAAV1 ITRと区別する、ここに記載されている一方または両方の特徴を保持しなければならない。(1)(AAV1中での4つではなく)3つの「GAGC」リピートおよび(2)AAV2 ITR Rep結合部位において、最初の2つの「GAGC」リピート中の4番目のヌクレオチドがTではなくCである。
ITR」という用語内にあると考えられるためには、ヌクレオチド配列は、AAV2 ITRをAAV1 ITRと区別する、ここに記載されている一方または両方の特徴を保持しなければならない。(1)(AAV1中での4つではなく)3つの「GAGC」リピートおよび(2)AAV2 ITR Rep結合部位において、最初の2つの「GAGC」リピート中の4番目のヌクレオチドがTではなくCである。
送達されるべきtRNAをコードする配列の発現を誘導するためのプロモーターは、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現のレベルおよびベクターがその中で使用されるべき細胞の種類など、既知の検討事項によって選択されるあらゆる所望のプロモーターであり得る。プロモーターは、外来性または内在性プロモーターであり得る。プロモーターには、例えば、SV40または誘導性メタロチオネインプロモーター、またはAAVp5プロモーターなどのAAVプロモーターなどの既知の強力なプロモーターが含まれ得る。プロモーターのさらなる例には、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスの主要後期プロモーターなどのアデノウイルスのプロモーター、誘導性熱ショックプロモーター、呼吸器多核体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス(RSV)などに由来するプロモーターが含まれる。さらなる例には、制御されたプロモーターが含まれる。
AAVベクターは、プロモーターに機能的に連結された外来性(異種の)核酸をさらに含むことができる。「異種の核酸」によって、細胞、組織または生物中への移入のために、あらゆる異種または外来性の核酸がベクター中に挿入されることができることが意味される。核酸は、例えば、tRNAをコードすることができる。「機能的に連結された」によって、異種の核酸に対するプロモーターの適切な方向性など、本分野において既知であるように、プロモーターが異種の核酸の発現を促進することができることを意味する。さらに、異種の核酸は、好ましくは、本分野において既知であるとおり、機能的にコードするために、すなわち、核酸が発現されることを可能にするために核酸の発現のための全ての適切な配列を有する。核酸は、例えば、エンハンサーなどの発現調節配列を含むことができる。核酸は、パッケージされることができる核酸のサイズによってのみ限定される、1を超える遺伝子産物をコードすることができる。
AAV1粒子は、AAV1キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。標準的な方法によって定型的に決定することができるように、AAV1キャプシドを含む得られたウイルス粒子は、他のAAVキャプシドと抗原的にまたは免疫学的に異なった状態を保つ限り、本明細書では、AAV1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列中の変動が想定される。具体的には、例えば、ウイルス粒子が抗原的にまたは免疫学的に他のAAV血清型と異なるかどうかを決定するために、ELISAおよびウェスタンブロットを使用することができる。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを表し、完全長のタンパク質およびその断片を含む。このため、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、しばしば、本明細書において互換的に使用される。
本方法は、AAV末端逆位配列の対の間に挿入された核酸を含むベクターを含有するAAV粒子を細胞に投与すること、これにより、細胞に該核酸を送達することを含む、核酸を細胞に送達する方法を提供する。細胞への投与は、組織培養培地または緩衝化食塩溶液などの所望の液体中に必要に応じて含有された粒子を細胞と単に接触させることを含むあらゆる手段によって実現することができる。粒子は、あらゆる所望の長さの時間、細胞と接触させ続けることが可能であり、典型的には、粒子は投与され、無限に留まらせる。このようなインビトロ法のために、ウイルスは、本分野において知られているおよび本明細書に例示されているような、標準的なウイルス形質導入法によって細胞に投与することができる。投与すべきウイルスの力価は、特に細胞の種類に応じて変動し得るが、一般にAAV形質導入のために使用される力価が典型的である。さらに、本実施例において特定の細胞を形質導入するために使用された力価を使用することができる。細胞には、ヒト並びに霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびイヌなどの他の大型の(非げっ歯類)哺乳動物中のあらゆる所望の細胞が含まれ得る。
本発明は、さらに、AAV末端逆位配列の対の間に挿入された核酸を含むAAV粒子を対象に投与すること、これにより、対象中の細胞に核酸を送達することを含む、核酸を対象中の細胞に送達する方法を提供する。
本開示のある実施形態は、本明細書に記載されているとおりのウイルスベクターを含む細胞を提供する。
AAVベクター
AAVベクター
一実施形態において、本開示のウイルスベクターはAAVベクターである。「AAV」ベクターは、アデノ随伴ウイルスを表し、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を表すために使用され得る。本用語は、別段の必要がある場合を除き、全てのサブタイプ、血清型および偽型を包含し、天然に存在する形態と組換え形態の両方を包含する。本明細書において使用される場合、「血清型」という用語は、規定された抗血清とのキャプシドタンパク質の反応性に基づいて、それによって同定され、他のAAVと区別されるAAVを表し、例えば、霊長類AAVの8つの既知の血清型、AAV-1~AAV-9およびAAVrh10が存在する。例えば、血清型AAV2は、AAV2のcap遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質並びに同じAAV2血清型からの5’および3’ITR配列を含有するゲノムを含有するAAVを表すために使用される。本明細書において使用される場合、例えば、rAAV1は、同一の血清型に由来するキャプシドタンパク質および5’-3’ITRの両方を有するAAVを表すために使用され得、またはrAAV1は、ある血清型由来のキャプシドタンパク質および異なるAAV血清型由来の5’-3’ITRを有する、例えば、AAV血清型2由来のキャプシドおよびAAV血清型5由来のITRを有するAAVを表し得る。本明細書に例示されている各例について、ベクターの設計および作製の説明は、キャプシドと5’-3’ITR配列の血清型を記載する。略号「rAAV」は、組換えアデノ随伴ウイルスを表し、組換えAAVベクター(または「rAAVベクター」)とも称される。
「AAVウイルス」または「AAVウイルス粒子」は、少なくとも1つのAAVキャプシドタンパク質(好ましくは、野生型AAVのキャプシドタンパク質の全てによって)およびキャプシドに包まれたポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を表す。粒子が異種のポリヌクレオチド(すなわち、哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子などの野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)を含む場合、通例、「rAAV」と表される。
一実施形態において、AAV発現ベクターは、転写、転写開始領域を含む調節要素、目的のDNAおよび転写終結領域の方向に作動可能に連結された成分として少なくとも提供するために、既知の技術を用いて構築される。調節要素は、哺乳動物細胞中で機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含有する得られた構築物は、機能的なAAV ITR配列と隣接する(5’および3’)。
「アデノ随伴ウイルス末端逆位配列」または「AAV ITR」によって、AAVゲノムの各末端に見出され、DNA複製の起点としておよびウイルスのためのパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能する本分野で認知された領域を意味する。AAV ITRは、AAV repコード領域と共に、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切除および救出、並びに2つの隣接するITR間に介在するヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノム中への組み込みを与える。
AAV ITR領域のヌクレオチド配列は既知である。本明細書において使用される場合、「AAV ITR」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変され得る。さらに、AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7などを含むがこれらに限定されないいくつかのAAV血清型の何れにも由来し得る。さらに、AAVベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する5’および3’ITRは、所期のとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除および救出を可能にするために、並びにAAV Rep遺伝子産物が細胞中に存在するときに、レシピエント細胞ゲノム中への異種の配列の組み込みを可能とするために、必ずしも同一である必要はなく、同一のAAV血清型若しくは分離株に由来する必要もない。
一実施形態において、AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7などを含むがこれらに限定されないいくつかのAAV血清型の何れにも由来することができる。さらに、AAV発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する5’および3’ITRは、所期のとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除および救出を可能にするために、並びにAAV Rep遺伝子産物が細胞中に存在するときに、レシピエント細胞ゲノム中へのDNA分子の組み込みを可能とするために、必ずしも同一である必要はなく、同一のAAV血清型若しくは分離株に由来する必要もない。
一実施形態において、AAVキャプシドはAAV2に由来することができる。AAVベクター中で使用するための適切なDNA分子は、約5キロ塩基(kb)未満、約4.5kb未満、約4kb未満、約3.5kb未満、約3kb未満、約2.5kb未満のサイズであり、本分野において既知である。
一実施形態において、選択されたヌクレオチド配列は、インビボで対象中において、その転写または発現を誘導する調節要素へ作動可能に連結される。このような調節要素は、選択された遺伝子に通常は付随する調節配列を含むことができる。または、異種の調節配列を利用することもできる。有用な異種の調節配列には、一般に、哺乳動物またはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。例には、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター;アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP);単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、CMV最初期プロモーター領域(CMVIE)などのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、pol IIプロモーター、polIIIプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列も、本発明において使用できる。このようなプロモーター配列は、例えば、Stratagene(San Diego,Calif.)から市販されている。
一実施形態において、組織特異的および誘導性プロモーター、エンハンサーなど、異種のプロモーターと他の調節要素の両方が特に役立つ。異種のプロモーターの例には、CMVプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例には、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素およびオーフィン(aufin)に対するDNA応答配列(responsive element)が含まれる。
一実施形態において、AAV ITRが境を接する目的のDNA分子を保有するAAV発現ベクターは、主要なAAV読み枠(「ORF」)がそこから切り出されたAAVゲノム中に選択された配列を直接挿入することによって構築することができる。ITRの十分な部分が複製およびパッケージング機能をなお可能にする限り、AAVゲノムの他の部分も除去することができる。このような構築物は、本分野で周知の技術を用いて設計することができる。
または、AAV ITRは、ウイルスのゲノムからまたはAAV ITRを含有するAAVベクターから切り出し、標準的なライゲーション技術を用いて、別のベクター中に存在する選択された核酸構築物の5’および3’を融合することができる。例えば、ライゲーションは、20mM Tris-Cl pH7.5、10mM MgCl2、10mM
DTT、33μg/mL BSA、10mM~50mM NaClおよび40μM ATP、0.01~0.02(Weiss)単位のT4 DNAリガーゼ、0℃(「粘着末端」ライゲーションのため)または1mM ATP、0.3~0.6(Weiss)単位のT4 DNAリガーゼ、14℃(「平滑末端」ライゲーションのため)のいずれかの中で達成することができる。分子間「粘着末端」ライゲーションは、30~100μg/mLの全DNA濃度(5~100nMの総最終濃度)で通常行われる。ITRを含有するAAVベクター。
DTT、33μg/mL BSA、10mM~50mM NaClおよび40μM ATP、0.01~0.02(Weiss)単位のT4 DNAリガーゼ、0℃(「粘着末端」ライゲーションのため)または1mM ATP、0.3~0.6(Weiss)単位のT4 DNAリガーゼ、14℃(「平滑末端」ライゲーションのため)のいずれかの中で達成することができる。分子間「粘着末端」ライゲーションは、30~100μg/mLの全DNA濃度(5~100nMの総最終濃度)で通常行われる。ITRを含有するAAVベクター。
さらに、キメラ遺伝子は、1またはそれを超える選択された核酸配列の5’および3’に配置されたAAV ITR配列を含むように、合成的に産生され得る。完全なキメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
rAAVビリオンを産生するために、AAV発現ベクターは、公知の技術を使用して、例えば形質移入によって、適切な宿主細胞中に導入される。多数の形質移入技術が、本分野において一般に知られている。例えば、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New Yorkを参照されたい。特に適切な形質移入法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソーム媒介性遺伝子移入、脂質媒介性形質導入、および高速度微粒子射出(high-velocity microprojectiles)を使用する核酸送達が含まれる。
一実施形態において、rAAVビリオンを産生するための適切な宿主細胞には、異種DNA分子のレシピエントとして使用され得るまたは使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が含まれる。本用語は、形質移入された元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書で使用する場合、外来性DNA配列で形質移入された細胞を一般に指す。安定なヒト細胞株、293(例えば、受託番号ATCC CRL1573の下で米国培養細胞系統保存機関から容易に入手可能)由来の細胞が、本開示の実施において使用され得る。特に、ヒト細胞株293は、アデノウイルス5型DNA断片で形質転換されたヒト胎児由来腎臓細胞株であり、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子を発現する。293細胞株は、容易に形質移入され、その中でrAAVビリオンを産生するための特に便利なプラットホームを提供する。
「AAV repコード領域」とは、複製タンパク質Rep78、Rep68、Rep52およびRep40をコードする、AAVゲノムの、当技術分野で認識された領域を意味する。これらのRep発現産物は、DNA複製のAAV起点の認識、結合およびニック形成、DNAヘリカーゼ活性、ならびにAAV(または他の異種)プロモーターからの転写のモジュレーションを含む、多くの機能を有することが示されている。Rep発現産物は、AAVゲノムを複製するために集合的に必要とされる。AAV repコード領域の適切な相同体には、同じくAAV‐2 DNA複製を媒介することが知られているヒトヘルペスウイルス6(HHV‐6)rep遺伝子が含まれる。
「AAV capコード領域」とは、キャプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3、またはそれらの機能的相同体をコードする、AAVゲノムの、当技術分野で認識された領域を意味する。これらのCap発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされるパッケージング機能を供給する。
一実施形態では、AAVヘルパー機能は、AAV発現ベクターの形質移入の前にまたはそれと併せて、AAVヘルパー構築物で宿主細胞を形質移入することによって、宿主細胞中に導入される。したがって、AAVヘルパー構築物は、生産的なAAV感染に必要な喪失したAAV機能を補完するために、AAV repおよび/またはcap遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために使用される。AAVヘルパー構築物は、AAV ITRを欠き、それ自体では複製もパッケージングもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。RepおよびCapの両方の発現産物をコードする一般的に使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45などの、多数のAAVヘルパー構築物が記載されている。Repおよび/またはCap発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている。
ウイルスベクターの送達の方法には、AAVを対象中に注射することが含まれる。一般に、rAAVビリオンは、インビボまたはインビトロのいずれかの形質導入技術を使用して、細胞中に導入され得る。インビトロで形質導入される場合、所望のレシピエント細胞が、対象から取り出され、rAAVビリオンで形質導入され、対象中に再導入される。または、同系間または異種間細胞が使用され得、これらの細胞は、対象中で不適切な免疫応答を生じない。
対象中への形質導入された細胞の送達および導入のための適切な方法は、記載されている。例えば、例えば適切な培地中で組換えAAVビリオンを細胞と組み合わせることによって、細胞はインビトロで形質導入することができ、目的のDNAを保有する細胞についてのスクリーニングは、従来の技術、例えば、サザンブロットおよび/もしくはPCRを使用して、または選択可能なマーカーを使用することによって、スクリーニングされ得る。次いで、形質導入された細胞は、以下でさらに完全に記載される薬学的組成物へと製剤化され得、この組成物は、様々な技術によって、例えば、移植、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射によって、対象中に導入され得る。
一実施形態において、薬学的組成物は、目的の核酸の治療的有効量、すなわち、問題の疾患状態の症候を低減もしくは軽減させるのに十分な量、または所望の利益を付与するのに十分な量を産生するのに十分な遺伝子材料を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤も含有する。このような賦形剤には、組成物を受けている個体にとって害になる抗体の産生をそれ自体は誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る、任意の医薬剤(pharmaceutical agent)が含まれる。薬学的に許容され得る賦形剤には、ソルビトール、Tween80、ならびに液体、例えば、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが含まれるがこれらに限定されない。その中で、薬学的に許容され得る塩には、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など;および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが含まれ得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などが、かかるビヒクル中に存在し得る。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な論述は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991年)において入手可能である。
1を超える導入遺伝子が、送達されたウイルスベクターによって発現され得ることを理解すべきである。または、各々1またはそれを超える異なる導入遺伝子を発現する別個のベクターも、本明細書に記載されるように対象に送達され得る。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターは、他の適切な組成物および治療と組み合わされることも意図される。
本明細書の教示に照らせば当業者に明らかなように、添加されなければならないウイルスベクターの有効量は、実験的に決定され得る。投与は、1つの用量で、処置の過程を通じて持続的にまたは間欠的に実施され得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成物、標的細胞および処置されている対象によって変動する。処置を行う医師によって選択される用量レベルおよびパターンで、単回および複数回の投与が実施され得る。
ある実施形態において、rAAVは、約0.3~2mLの1×105~1×1016vg/mLの用量で投与される。ある実施形態において、rAAVは、約1~3mLの1×107~1×1014vg/mLの用量で投与される。ある実施形態において、rAAVは、約1~2mLの1×108~1×1013vg/mLの用量で投与される。
rAAV粒子を含有する製剤は、ビヒクル中に有効量のrAAV粒子を含有し、有効量は、当業者によって容易に決定される。rAAV粒子は、典型的には、組成物の約1%~約95%(w/w)の、または、適宜、より高いもしくはより低い範囲であり得る。投与すべき量は、処置が考慮される動物またはヒト対象の齢、体重および身体的状態などの要因に依存する。有効な投薬量は、用量応答曲線を確立する定型的な試験を通じて、当業者によって確立され得る。対象は、1またはそれを超える用量でのrAAV粒子の投与によって処置される。十分な酵素活性を維持することが必要とされる場合、複数の用量が投与され得る。
水、水性食塩水、人工CSFまたは他の既知の物質を含むビヒクルが、本発明で使用され得る。製剤を調製するために、精製された組成物は、単離、凍結乾燥および安定化され得る。次いで、この組成物は、必要に応じて抗炎症剤と組み合わせて、適切な濃度に調整され得、使用のためにパッケージングされ得る。
本発明は、タンパク質、または上記タンパク質をコードする核酸分子を、細胞における標的タンパク質のレベルを増加させるのに十分な量で細胞中に導入することによって、細胞における標的タンパク質のレベルを増加させる方法を提供する。ある実施形態において、標的タンパク質の蓄積は、少なくとも10%増加される。標的タンパク質の蓄積は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%増加される。39
治療剤をコードする核酸
治療剤をコードする核酸
「核酸」という用語は、糖、ホスフェートおよびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含有する単量体(ヌクレオチド)から構成される、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびこれらのポリマーを表す。特に限定されていなければ、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、および天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然のヌクレオチドの既知の類縁体を含有する核酸を包含する。
「核酸断片」は、与えられた核酸分子の一部である。ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、標準的なパラメータを用いる記載されたアラインメントプログラムの1つを用いて参照配列と比較して、あるポリヌクレオチドが、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%もしくは79%または少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%もしくは89%または少なくとも90%、91%、92%、93%もしくは94%または少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
遺伝子材料を細胞中に導入するための方法
遺伝子材料を細胞中に導入するための方法
外来性遺伝子材料(例えば、1またはそれを超える治療用ACE-tRNAをコードするDNA)は、遺伝子改変細胞を提供するために、形質移入または形質導入などの遺伝子移入法によって、インビボで細胞中に導入される。様々な発現ベクター(すなわち、標的細胞中への外来性遺伝子材料の送達を容易にするためのビヒクル)は当業者に既知である。
本明細書において使用される場合、「細胞の形質移入」は、加えられたDNAの取り込みによる、新たな遺伝子材料の細胞による獲得を表す。このため、形質移入は、物理的なまたは化学的な方法を用いた、細胞中への核酸の挿入を表す。リン酸カルシウムDNA共沈;DEAE-デキストラン;電気穿孔;陽イオンリポソーム媒介性形質移入およびタングステン粒子で促進される微粒子銃など、いくつかの形質移入技術が当業者に知られている。リン酸ストロンチウムDNA共沈は、別の可能な形質移入法である。
これに対して、「細胞の形質導入」は、DNAまたはRNAウイルスを用いて、細胞中に核酸を移入する方法を表す。細胞中に核酸を移入するためのRNAウイルス(すなわち、レトロウイルス)は、本明細書では、形質導入キメラレトロウイルスと称される。レトロウイルス内に含有される外来性遺伝子材料は、形質導入された細胞のゲノム中に取り込まれる。キメラDNAウイルス(例えば、治療剤をコードするcDNAを有するアデノウイルス)で形質導入された細胞は、そのゲノム中に取り込まれた外来性遺伝子材料を有しないが、細胞内の染色体外に保持されている外来性遺伝子材料を発現することができる。
典型的には、外来性遺伝子材料は、プロモーターとともに、新しい遺伝子の転写を調節するための(通常、治療用タンパク質をコードするエキソンを含むcDNAの形態で)異種の遺伝子を含む。プロモーターは、転写を開始するために必要な特異的ヌクレオチド配列を特徴的に有する。必要に応じて、外来性遺伝子材料は、所望の遺伝子転写活性を得るために必要とされる追加の配列(すなわち、エンハンサー)をさらに含む。この論述において、「エンハンサー」とは、単純に、プロモーターによって決定される基礎転写レベルを変化させるために、コード配列(シスに位置する)と隣接して働くあらゆる翻訳されないDNA配列である。外来性遺伝子材料は、プロモーターおよびコード配列が作用的に連結されて、コード配列の転写を許容するように、プロモーターのすぐ下流に、細胞ゲノム中に導入され得る。レトロウイルス発現ベクターは、挿入された外来性遺伝子の転写を調節するために外来性プロモーター要素を含み得る。このような外来性プロモーターには、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる。
天然に存在する構成的プロモーターは、不可欠な細胞機能の発現を調節する。その結果、構成的プロモーターの調節下にある遺伝子は、細胞成長のあらゆる条件下で発現される。例示的な構成的プロモーターには、ある特定の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子:ヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素(HPRT)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)、ピルピン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、に対するプロモーター、アクチンプロモーターおよび当業者に既知のその他の構成的プロモーターが含まれる。さらに、多くのウイルスプロモーターは真核細胞中で構成的に機能する。これらには、とりわけ、SV40の初期および後期プロモーター;モロニー白血病ウイルスの長い末端反復配列(LTR)およびその他のレトロウイルス;並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。したがって、上に引用されている構成的プロモーターのいずれもが、異種の遺伝子挿入物の転写を調節するために使用することができる。
誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子は、誘導因子の存在下でのみまたは誘導因子の存在下でより多く発現される(例えば、メタロチオネインプロモーターの調節下での転写は、ある特定の金属イオンの存在下で大幅に増加される)。誘導性プロモーターには、その誘導因子が結合したときに転写を刺激する応答配列(RE)が含まれる。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸および環状AMPに対するREが存在する。誘導性応答を得るために、特定のREを含有するプロモーターを選択することができ、いくつかの事例では、RE自体を異なるプロモーターに結合させ、これにより、組換え遺伝子に誘導性を付与し得る。このように、適切なプロモーター(構成的対誘導性:強い対弱い)を選択することによって、遺伝子改変された細胞中での治療剤の発現の存在およびレベルの両方を調節することが可能である。治療剤をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの調節下にあれば、治療剤の転写を許容するための条件に原位置で(in situ)遺伝子改変細胞を曝露することによって、例えば、治療剤の転写を調節する誘導性プロモーターの特異的誘導因子の腹腔内注射によって、原位置での治療剤の送達が誘発される。例えば、メタロチオネインプロモーターの調節下にある遺伝子によってコードされる治療剤の、遺伝子改変細胞による原位置での発現は、遺伝子改変細胞を、適切な(すなわち、誘導する)金属イオンを含有する溶液と原位置で接触させることによって増強される。
したがって、原位置で送達される治療剤の量は、以下のような要因を調節することによって制御される。(1)挿入された遺伝子の転写を誘導するために使用されるプロモーターの性質(すなわち、プロモーターが構成的であるかまたは誘導性であるか、強力であるかまたは弱いか);(2)細胞中に挿入される外来性遺伝子のコピーの数;(3)患者に投与される(例えば、移植される)形質導入された/形質移入された細胞の数;(4)移植組織(例えば、移植片または封入された発現系)のサイズ;(5)移植組織の数;(6)形質導入された/形質移入された細胞または移植組織が留置される時間の長さ;および(7)遺伝子改変細胞による治療剤の産生速度。治療的有効用量の特定の治療剤を送達するためのこれらの要因の選択および最適化は、上に開示した要因および患者の臨床的プロファイルを考慮に入れて、過度な実験をすることなしに、当業者の技術の範疇にあると見なされる。
少なくとも1つのプロモーターおよび治療剤をコードする少なくとも1つの異種の核酸に加えて、発現ベクターは、発現ベクターが形質移入または形質導入された細胞の選択を容易にするために、選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。また、細胞は、2またはそれを超える発現ベクターで形質移入され、少なくとも1つのベクターは治療剤をコードする遺伝子を含有し、他方のベクターは選択遺伝子を含有する。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および/またはシグナル配列(以下に記載されている)の選択は、過度な実験をすることなしに、当業者の技術の範疇にあるとみなされる。
疾患状態および処置の方法
疾患状態および処置の方法
本発明は、一実施形態において、本発明の合成オリゴヌクレオチドサプレッサーtRNAの導入を通じて、ナンセンス変異と関連する存在する変異の効果を逆転させることによって嚢胞性線維症を処置するための組成物および方法を含む。
本開示のある実施形態は、本明細書に記載されている治療剤(例えば、修飾されたおよび/または安定化されたACE-tRNA)をコードするタンパク質またはベクターを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における疾患を処置する方法を提供する。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本開示のある実施形態は、哺乳動物における疾患を処置するのに有用な医薬を調製するための、治療剤または本明細書に記載されている治療剤をコードするベクターの使用を提供する。ある実施形態において、疾患は嚢胞性線維症である。
本開示は、本明細書に記載されているベクターを含有する哺乳動物細胞も提供する。細胞はヒトの細胞であり得る。
本開示のある態様は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクターおよび遺伝子操作された細胞(インビボで改変された)並びにこれらの使用に関する。特に、本開示は、治療的有効用量の治療剤の両全身送達が可能な遺伝子治療の方法に関する。
一態様によれば、哺乳動物のレシピエント中で治療剤を発現するための細胞発現系が提供される。発現系(本明細書では、「遺伝子改変細胞」とも称される。)は、細胞および治療剤を発現するための発現ベクターを含む。発現ベクターには、ウイルス、プラスミドおよび異種の遺伝子材料を細胞に送達するための他のビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、本明細書において使用される場合、「発現ベクター」という用語は、異種の遺伝子材料を細胞に送達するためのビヒクルを表す。特に、発現ベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
発現ベクターは、異種の遺伝子の転写を調節するためのプロモーターをさらに含む。プロモーターは、(本明細書に記載されている)誘導性プロモーターであり得る。発現系は、哺乳動物のレシピエントへの投与に適している。発現系は、各細胞が少なくとも1つの治療剤をコードする少なくとも1つの組換え遺伝子を含有する複数の不死化されていない遺伝子改変細胞を含み得る。
細胞発現系は、インビボで形成される。さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物のレシピエントを処置するための方法が提供される。この方法は、例えば、静脈内投与を介して、原位置で患者の細胞中に、異種の遺伝子産物を発現するための発現ベクターを導入することを含む。インビボで発現系を形成するために、治療剤を発現するための発現ベクターは、静脈内投与で、哺乳動物のレシピエント中にインビボで導入される。
さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物のレシピエントを処置するための方法が提供される。この方法は、インビボで、標的治療剤を患者中に導入することを含む。
異種の遺伝子を発現するための発現ベクターは、異種の遺伝子産物の転写を調節するための誘導性プロモーターを含み得る。したがって、原位置での治療剤の送達は、異種の遺伝子の転写を誘導する条件に、原位置で細胞を曝露することによって調節される。
本開示は、発現ベクターを細胞または患者に投与することによって、哺乳動物における疾患を処置する方法を提供する。遺伝子治療法については、分子生物学および遺伝子治療の当業者は、過度な実験なしに、本開示の新規方法において使用される発現ベクターの適切な投与量および投与の経路を決定することができるはずである。
一実施形態によれば、細胞は形質転換されるか、またはその他インビボで遺伝子改変される。哺乳動物のレシピエントから得た細胞は、治療剤をコードする異種の(例えば、組換え)遺伝子を発現するための外来性遺伝子材料を含有するベクターで、インビボにおいて形質転換され(すなわち、形質導入されまたは形質移入され)、治療剤は原位置に送達される。
本明細書において使用される場合、「外来性遺伝子材料」は、細胞中に天然に見出されない、または細胞中に天然に見出される場合には、細胞によって生物学的に有意なレベルで転写または発現されない、天然または合成のいずれかの核酸またはオリゴヌクレオチドを表す。このため、「外来性遺伝子材料」は、例えば、tRNAに転写されることができる天然に存在しない核酸を含む。
遺伝子治療に好適な、上で開示されている治療剤および条件は単なる例示であり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。既知の状態を処置するための適切な治療剤の選択は、過度な実験をすることなしに、当業者の技術の範疇にあるとみなされる。
ある実施形態において、この治療は、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β-サラセミアおよびリドル症候群を含むがこれらに限定されない未成熟終結コドン(PTC)によって引き起こされる疾患の処置/管理に対して潜在的な用途を有する。この治療は、改善された終止コドン抑制特異性を与える点で有利である。本発明の治療用ACE-tRNAは、特異的終止コドン、例えばTGAを標的とし、このため、疾患と無関係な終止コドンでのオフターゲット効果を低減する。本治療は、アミノ酸特異性を与える点でも有利である。発現されたtRNAは、疾患終止コドンの挿入を介して喪失されたアミノ酸を特異的に置き換えるように操作されるので、タンパク質の安定性、折り畳みおよび輸送に対するあらゆる疑似効果をなくす。
ある実施形態において、本系はモジュール式であり、このため、あらゆる可能な疾患PTCに対して「個別化」することができる。例えば、Trp合成酵素によって認識される9個の各トリプトファンtRNAがヒトゲノム中に存在し、これらの全てがmRNA UGGコドンを抑制する。このため、これらの9個のTrp tRNAの各々が、コドン再編集耐容性(UGG→UGA)の機会を提供する。さらに、遺伝子コードでの終止コドンとの近接性を考慮すると、アルギニンコドンのPTCナンセンスコドンへの変異が疾患において一般的である。コドン編集の耐容性および抑制効果に関して試験することができる30超のArg tRNAが存在する。
本発明のさらなる利点は、系全体(tRNA+プロモーター配列)がコンパクトであるため、容易な発現および細胞特異的送達を与えることである。
本発明の薬剤の投与量、製剤および投与の経路
本発明の薬剤の投与量、製剤および投与の経路
本発明の薬剤は、遺伝子疾患(例えば、嚢胞性線維症)に付随する少なくとも1つの症候の低減をもたらすために投与される。投与される量は、選択された組成物、具体的な疾患、哺乳動物の体重、身体的状態および齢並びに予防または処置が達成されるべきかどうかを含むが、これらに限定されない様々な要因に応じて変動する。このような要因は、本分野で周知である動物モデルまたはその他の試験系を用いて、臨床医によって容易に決定することができる。
本発明は、本発明の薬剤、例えば、ACE-tRNA、発現ベクターまたはウイルス粒子の投与によって、遺伝子疾患(例えば、嚢胞性線維症)を処置することを想定する。本発明にしたがう治療剤の投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的かまたは予防的かどうか、および当業者に既知の他の要因に応じて、継続的または間欠的であり得る。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得、または間隔を置いた一連の投薬であり得る。局所および全身的投与の両方が想定される。
以下に論述されているように、(例えば、マイクロカプセル化を用いて)必要に応じて徐放用に製剤化してもよい本発明の治療剤(複数可)を有する1またはそれを超える適切な単位剤形は、静脈内および筋肉内経路によることを含む非経口、ならびに疾患組織中への直接の注射によることを含む様々な経路によって投与することができる。製剤は、適宜、別個の単位剤形で都合よく提供してもよく、薬学に周知の方法のいずれによっても調製され得る。このような方法は、治療剤を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微細化固体担体またはこれらの組み合わせと一緒にするステップ、および、次いで、必要であれば、生成物を所望の送達系中に導入しまたは成形するステップを含み得る。
本発明の治療剤が投与のために調製された時点で、本発明の治療剤は、医薬製剤、または単位剤形を形成するために、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせてもよい。このような製剤中の全活性成分は、製剤の0.1~99.9重量%を含む。「薬学的に許容され得る」とは、製剤の他の成分と適合的であり、そのレシピエントに有害でない担体、希釈剤、賦形剤および/または塩である。投与のための活性成分は、粉末としてまたは顆粒として;溶液、懸濁液またはエマルジョンとして存在し得る。
本発明の治療剤を含有する医薬製剤は、周知の容易に入手できる成分を用いて、本分野において既知の手法によって調製することができる。本発明の治療剤は、非経口投与、例えば、筋肉内、皮下または静脈内経路に適した液剤として製剤化することもできる。
本発明の治療剤の医薬製剤は、水性もしくは無水液剤もしくは分散液剤(dispersion)の形態またはエマルジョンもしくは懸濁剤の形態を取ることもできる。
このため、治療剤は、(例えば、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による)非経口投与のために製剤化され得、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入容器に入れて単位投薬形態でまたは防腐剤が添加された複数回投与容器に入れて与え得る。活性成分は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルジョンとしてこのような形態を取り得、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤化剤(formulatory agents)を含有し得る。または、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない無菌水を用いて構成するための、無菌固体の無菌単離によってまたは溶液からの凍結乾燥によって取得される粉末形態であり得る。
必要な有効量は、複数の投薬単位の投与によって達することができるので、各剤形の個別のエアロゾル用量中に含有される1つまたは複数の活性成分の単位含量は、それ自体、特定の適応症または疾患を処置するために有効な量を構成する必要はないことが理解される。さらに、個別にまたは一連の投与のいずれかで、剤形中の用量未満を用いて有効量が達成され得る。
本発明の医薬製剤は、必要に応じた成分として、本分野において周知である種類の、薬学的に許容され得る、担体、希釈剤、可溶化剤または乳化剤および塩を含み得る。本発明の医薬製剤において有用である担体および/または希釈剤の非限定的な具体例には、水およびリン酸緩衝食塩溶液pH7.0~8.0などの生理的に許容され得る緩衝食塩溶液および水が含まれる。
定義
定義
疾患状況:本発明において、「疾患状況」または「疾患表現型」は、細胞内の遺伝子のコード領域内の終止コドンに起因する(例えば、ナンセンス変異に起因する)哺乳動物細胞の特徴(characteristic)である。例えば、ますます多くのヒト遺伝疾患が、ナンセンス変異によって引き起こされると考えられている(例えば、Atkinson et al.,Nuc.Acids Res.22:1327,1994参照)。ほんの数例を上げると、β-サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、色素性乾皮症、ファンコニ貧血および嚢胞性線維症は全て、同定された遺伝子中のナンセンス変異によって引き起こされ得る。
内在性tRNA合成酵素:本発明にしたがってtRNAがその中に導入される細胞中に存在すれば、tRNA合成酵素は細胞に「内在性」であると考えられる。当業者に自明であるように、tRNA合成酵素は、該当する種類の細胞中に天然に見出されるかどうか、または当該細胞がtRNA合成酵素を含有若しくは発現するように操作されもしくは別段、人間の手によって巧みに扱われているかどうかを問わず、これらの目的に関して内在性であると考え得る。
サプレッサーtRNA:「サプレッサーtRNA」は、実験の条件下で検出可能なリードスルーが起こるような、そのアンチコドンが別段、翻訳を終結するコドンと相補的であるものをいう。標準的な終結コドンは、アンバー(UAG)、オーカー(UAA)およびオパール(UGA)コドンである。しかしながら、非標準的な終結コドン(例えば、4ヌクレオチドコドン)も、文献中で利用されてきた(例えば、Moore et al.,J.Mol.Biol.298:195.2000;Hohsaka et al.,J.Am.Chem.Soc.121:12194,1999参照)。
ここで、以下の非限定的な実施例によって、本発明を例示する。
[実施例1]
遺伝コードは、順次トリプレットコドンを形成する4つのヌクレオチドを使用し、これが、DNAのタンパク質への翻訳の基礎を成す。合計64個のコドンが存在し、そのうち61個がアミノ酸をコードするために使用され、そのうち3つ(TAG、TGAおよびTAA)がタンパク質終結「終止」または「ナンセンス」コドンをコードする
遺伝コードは、順次トリプレットコドンを形成する4つのヌクレオチドを使用し、これが、DNAのタンパク質への翻訳の基礎を成す。合計64個のコドンが存在し、そのうち61個がアミノ酸をコードするために使用され、そのうち3つ(TAG、TGAおよびTAA)がタンパク質終結「終止」または「ナンセンス」コドンをコードする
嚢胞性線維症の症例の5~10%が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)タンパク質の未成熟なトランケーションをもたらす「ナンセンス」変異によって引き起こされる。この「クラス1」変異の例は、p.Trp1282X、CFTR機能の喪失と重度の嚢胞性線維症表現型を引き起こす未成熟終結コドン(PTC)である。アタルレンなどの一部の化合物は、疾患を引き起こすナンセンス変異の終止のリードスルーを促進するが、不十分な終止コドン特異性およびインビボでの予想外に低いコドンスキップ効率などのいくつかの注意(caveat)のため、治療薬としてはわずかな成功を収めているに過ぎない。しかしながら、これらの化合物の幅広い使用および内在性終止コドンリードスルーが後生動物では一般的であるという発見から、細胞種のサブセット、すなわち、気道上皮に送達されれば、補助された抑制が実行可能であり得ることが示唆される。ただし、治療的に補助された終止コドンリードスルーが成功すると、ナンセンスコドンの位置でのアミノ酸の非選択的な取り込みが、(CFTR1282Xの場合のように)タンパク質の折り畳み、輸送および機能に影響を与える可能性があり、このため、さらなる治療的介入が必要とされる。このため、疾患PTCの性質および潜在的に治療的なサプレッサーおよび、一般的には、PTC疾患のより効果的な処置を理解する差し迫った満たされていない要望が存在する。
本実施例は、CFTR p.Trp1282Xチャンネルの救出のために、アンチコドン編集(ACE)Trp-tRNAの性質を決定する。このようなtRNAは、疾患を引き起こすTGA終止コドンを「抑制する」ように操作され、p.Trp1282X CFTRにおいて、元のアミノ酸であるTrpを取り込み、実際に、野生型CFTRタンパク質を遺伝的に再構築する。データは、この一般的なアプローチ(ナンセンス抑制)が、接着細胞中でのtRNAおよびその同族合成酵素の一過性形質移入またはA549気道細胞などのより天然の気道細胞種へのウイルスをベースとしたこれらの送達を通じて、インフレームに終止コドンを保有する転写物の強固な救出をもたらすことを実証する。このアプローチは、既存の戦略を超えて、多数の著しい利益を与える。1)改善されたコドン特異性-発現されたtRNAは特異的な終止コドンに向けて誘導され得るので、疾患と無関係な終止コドンへのオフターゲット効果を低減する。2)アミノ酸特異性-発現されたtRNAおよび/または合成酵素は、疾患終止コドンの挿入を通じて失われたアミノ酸を置き換えるように操作することができるので、CFTRの安定性、折り畳みおよび輸送に対するあらゆる疑似効果を打ち消す。3)同調性(tunability)-この系は、tRNAおよびPTC変異の各種類に対して、理論的には個別化することができる。4)容易な発現-系全体がコンパクト(1kb未満)であり、容易にパッケージし、一過性にまたはtRNAのナノ粒子送達を介して発現させることができる。5)一般的な戦略に対する原理の証明-インフレーム終止コドンはヒト疾患の主要な原因であり、処置の選択肢がほとんど存在しない;ここで、p.Trp1282Xに対して行われた実験は、他のCFTRナンセンスコドンの機序への洞察をもたらすと予想される。
データは、ACE-tRNA終止コドンサプレッサーtRNAは、導入された終止部位を含有する転写物を「救う」のに効率的であることを示し(図6Aおよび6B)、このようなtRNAが、疾患終止部位の治療的救出における主要な生物学的障害としてのナンセンス変異依存分解(NMD)を妨げる能力を有していることを示唆する。このため、サプレッサーtRNAを使用して、疾患におけるNMDへのより多くの分子的洞察を獲得する可能性が開かれる。
結果
結果
本発明者らは、終止部位、例えば、TGAを抑制し、その指定されたコドンを抑制しないようにアンチコドン編集真核生物のtRNAを発現することが可能であるかどうかを問題にした。これは、TGA部位を含有するリンカーによって隔てられた、eGFP配列とインフレームの蛍光タンパク質(チェリー)からなる試験構築物上の5つのヒトトリプトファンtRNAにおいて試験された。完全長のタンパク質の産生を示すために、eGFP読み枠のC末端にHAエピトープを付加した。チェリーシグナルの外観がプラスミドの送達および発現を示し、eGFP救出と組み合わせて、TGA抑制を示すので、この試験系は有用である。図6Aおよび6B中のデータは、この試験構築物を用いて5つのアンチコドン編集Trp tRNAヒトがチェリーとeGFP読み枠との間にある短いリンカー中のTGA終止部位を抑制する能力をアッセイしたウェスタンブロットデータを示す。これらの構築物のうち、候補1、2、3および5は、この点に関して中程度の活性を示す。これは、変異に対する構造的非耐容性によるもの、またはたった1つの塩基だけアンチコドンを変化させることが、トリプトファンを有するtRNAを認識しかつ/またはアシル化するTrp合成酵素の能力を破壊したという可能性によるものであり得る。しかしながら、これらの試験tRNAの番号4(tRNA#4)は、TGA部位の有意な抑制活性を示し、完全長のチェリー-eGFP-HAタンパク質を産生する(図6B)。さらに、共発現されたtRNAの非存在下ではリードスルーは全く見られなかった、最後のレーン、図6B。
方法
方法
コドン編集の耐容性(TGG→TGA)および一過性に形質移入されたタンデム蛍光標識試薬(mチェリー-TGA-GFP)およびCFTR Trp1282X中の標的とされるTGA試験部位を抑制する能力について、Trp tRNAを調べた。9個のうち5個のTrp tRNAの初期スクリーニングは、HEK細胞中に一過性に形質移入され、チェリー-TGA-eGFP-HA試験構築物を救うための「類のない」機能性を有するアンチコドン編集Trp-tRNAを発見した、図6B。HAエピトープの選択的な存在は、救出の成功ならびに単一細胞レベルでのチェリーおよびeGFP蛍光の両方の共焦点検査を示す(図示せず)。この結果は、a)一部のACE-tRNAはアンチコドン編集を耐容することができる、b)これらのtRNAは内在性トリプトファン合成酵素によって、Trpでアシル化される能力を保持している、およびc)これらのtRNAはタンパク質読み枠内に埋め込まれたTGA部位を抑制できるという原理的データの証明を与える。
残り4つのTrp-tRNAは、TAAからTGAサプレッサーへのアンチコドン編集の耐容性に関して機能的に調べられる。これらのアンチコドン編集tRNAは、チェリー-TGA-eGFPHAクローンを救う能力について試験される。チェリーおよびeGFPシグナルならびにHAエピトープに対して、生化学的(ウェスタンブロット)データが得られる。ここで、チェリー発現は、陽性形質移入対照としての役割を果たす。共焦点画像は、単一細胞レベルでチェリーおよびeGFP蛍光を証明する。
ACE-Trp tRNAにトリプトファンアミノ酸を導入する内在性Trp合成酵素の忠実度は、精製された救われたチェリー-Trp-eGFPHAタンパク質のトリプシン消化断片の質量分析によって決定される。チェリーとeGFP読み枠の間のリンカーから生成されるトリプシン消化断片に対して予想される質量は、以下のとおりである。1590.8135の予想質量を有する;
;太字のWは取り込み部位を示す、図10。このため、これは、ナンセンスコドン修復および野生型アミノ酸での置き換えの最初の例に相当し、したがって、治療に役立つアタルラン(Ataluran)などの既存のアプローチに比べて著しい進歩である。後者の例では、化合物は、不正確なアミノ酸によるナンセンスコドンのリードスルーを促進し、このため、厳密な修復を提供する新しいtRNA配列の発見および同定が重要である。
上で同定されたACE-tRNAによる一過性に形質移入されたCFTR1282Xチャンネルの救出は、BおよびCグリコシル化CFTRバンド20の完全な成熟に対する標準的な生化学的方法によって評価される。このように、このチャンネルは野生型アミノ酸で修復されており、完全に機能的であり、細胞膜へ首尾よく輸送される。
次の段階は、電気生理的な(単一細胞パッチクランプおよびUssingチャンバー)および生化学的アプローチを用いて、上で同定されたACE-tRNA系により救われたCFTR Trp1282Xチャンネルを機能的に特徴付けることである。1282X mRNAのナンセンス変異依存分解(NMD)を減弱する発現されたtRNAの効力は、定量的rtPCRを用いて評価され得る。発現されたコドン編集Trp-tRNAによる天然の1282X CFTRチャンネルの救出を試験するために、再プログラムされたヒト気道細胞が使用される。
同定されたヒトTrp tRNAにおいて、アンチコドン編集が耐容されること、およびこの75塩基対の転移RNAが試験構築物内のインフレームTGAコドンを抑制できることが実証されている。これらの実験は、CFTR 1282TGA mRNAと相互作用し、モデル細胞(FRTおよびA549)ならびにp.1282Xヒト再プログラムされた気道細胞中で機能的CFTRチャンネルを産生するこのACE-tRNAの能力を特徴付けるために、この発見を外挿する。
一過性に発現されたCFTR1282Xチャンネル中での救出レベルおよび再プログラムされた気道細胞中での救出レベルの生化学的決定。救われたもの(エピトープはアミノ酸1370~1380)を認識し、救われたおよび救出救われなかった全てのCFTRを検出するために、EMD Milliporeから入手可能なN末端様MM13-4(エピトープアミノ酸25~36)に結合する抗体である抗体M3A7が使用される。または、L12B4(エピトープアミノ酸386~412、EMD Millipore)または660(エピトープアミノ酸576~585)が、Cystic Fibrosis Foundation Therapeuticsを通じて入手可能である。
表面の機能性は、電気生理学的アプローチであるパッチクランプおよびUssingチャンバー記録を通じて調べられる。1282X mRNAの安定性と存在量は、一過性に発現している細胞および再プログラムされた気道細胞からのRNA抽出物の定量的rtPCRによってアッセイされる。
ヒト気道細胞から得たRNAトランスクリプトームデータのバイオインフォマティクス分析は、TGAコドンを含有する転写物の存在量、状況および同一性を特定する。その正常な終止部位に対してTGAを使用している上位10の発現転写物が、ACE-tRNA発現の前および後に、タンパク質生化学を用いて、個別の転写物のレベルで追跡される。細胞死におけるACE-tRNAの影響を調べるために、細胞のアポトーシスの生化学的および免疫組織学的プローブも使用される。
結論として、このデータは、インフレーム終止部位を有するイオンチャンネル遺伝子は、この種の「救出」に適しており(図9)、系の成分は気道細胞中でウイルスにより発現され得ることを示す。さらに、この考え方の極めて単純化された形態である、ヒト起源のACE-tRNAは、哺乳類細胞株中でインフレームCFTR TGAコドンを救う「類のない」能力を実証する(図9)。このアプローチは、既存の終止コドン戦略に対して多くの利点を有しており、1)ナンセンス変異依存分解を抑止する、2)肺細胞調製物中で機能する、および3)CFTR1282Xを特異的に救うACE-tRNAの能力に関してより詳しく調べる価値がある。
[実施例2]
[実施例2]
いくつかの異なるナンセンス変異がCFを引き起こし、このため、全てのCF疾患の概ね10%の基礎原因となる。図7。これらの症例は、以下の10個の特定の遺伝的病変に集約される。E60X、R75X、G542X,R553X、Q890X、Y1092X、R1158X、R1162XおよびW1282X。本発明者らは、適切なアプローチを用いれば、アンチコドン編集への修飾および耐容性に関して、既存のヒトtRNA配列をスクリーニングすることは実行可能であるはずであると提案する。この目的のために、およそ144個のACE-tRNAが、疾患を引き起こすナンセンスコドンの修復と完全長タンパク質の発現を促進するために使用することができるACE-tRNAに対して試験するための候補であった。具体的には、図11に記載されているスキームを用いて、上位のCFを引き起こすナンセンス変異を修復する能力を有するACE tRNAをコードする新規tRNA配列を同定するために、tRNAライブラリーを作製した。具体的には、図11に記載されているように、10ngのACE-tRNAをコードするアニーリングされたオリゴを、50ngのNanoLucレポータープラスミド、1μLの10xCutSmart Buffer(NEB)、1μLのT4リガーゼ(NEB)、10mM ATPおよび1μLのBbsI(NEB)と併せて、サーモサイクラー中でサイクリングした。形質転換受容性のある大腸菌中に1μLの反応物を形質転換し、アンピシリン寒天プレート上に形質転換体を播種した。プレート当たり1つの形質転換体を取り出して、アンピシリン選択下で1mLのLB中において成長させ、ミニプレップを行い、配列を確認した。
トリプトファンおよびグリシンから最良のACE-tRNA候補を同定するために、まず、スクリーニング研究を実施した。ACE-tRNAとともに、125ngのNanoLucレポータープラスミドの配列確認されたミニプレップcDNAを、リン酸カルシウムを用いて、HEK細胞中に形質移入した。前日に、4×104個のHEK細胞を96ウェルプレート中にプレーティングした。形質移入の24時間後に、培地を20μLのPBSで置き換え、15μLのNanoGlo試薬(Promega)を添加した。SpectraMax i3(Molecular Devices)上でプレートを読んだ。データは、3またはそれを超える反復データ(replicates)である。図8。データは、多くのtRNAが不十分なコドン編集耐容性を示すことを示している。しかしながら、明白な高性能tRNAが上記スクリーニング研究から明らかとなり、バックグラウンドと比べて、20倍~130倍のナンセンスコドン含有タンパク質の救出を実証するACE-TrpおよびACE-Gly tRNAが同定される。
これらの新規tRNAがナンセンスコドンを保有するCFTRチャンネルを救うことができるかを評価するために、これらの新規tRNAをCFTR W1282X cDNAプラスミドとともに、哺乳動物のHEK細胞中に共発現させた。CFTRタンパク質のウェスタンブロット評価を介した標準的な生化学的アプローチによって、細胞調製物を分析した。CFTRタンパク質は十分に確立されたマルチバンドのパターンを示すので、この方法は、この目的のために極めて有利である。具体的には、「B」および「C」バンドは、それぞれ、細胞表面にある、完全長のおよび完全に成熟した、翻訳後処理を受けたCFTRタンパク質に相当する。この事例では、Trpchr17.trna39 ACT-tRNAおよびGlychr19.trna2 ACT-tRNAによる両救出が、「B」および「C」CFTR免疫陽性(抗体MA37)バンドの強固な集団を産生し、このことは、前記tRNAによって、完全長の首尾よく輸送されたイオンチャンネルタンパク質が促進されることを示している。(図9)
[実施例3]
[実施例3]
t-ステムの修飾は、ナンセンス抑制を有意に改善する。図10。ここでは、本発明者らは、ナンセンスコドンを抑制し、タンパク質発現を促進する目的で、tRNAの機能をさらに与えるために、tRNAのさらなる修飾を提案する。この仮説は、図10に示されている、tRNA「t-ステム」ループ内に合理的に導入された変異が、より安定で、ナンセンスコドン抑制に関して機能的により強力なtRNA分子をもたらす可能性に基づいている。このために、トリプトファンTGAナンセンスコドンの救出に対する活性が同定されたACE-tRNAであるtRNA Trpchr17.trna39のt-ステム中に、単一および二重変異を直接操作した。このようにして、38のtRNA t-ステムバリアントが作製され、図4に示されているナンセンス救出レポーター構築物で一過性に形質移入されたHEK細胞中でスクリーニングされた。形質移入の24時間後に、図10に示されているように、ルシフェラーゼ活性に関して細胞をアッセイした。データは、強い変動を示し、強化された抑制活性を有する変化したt-ステムループ配列を有する新規tRNA配列を同定する。とりわけ、1つのこのような変異体、TS-38 52-62 G-Cは、Trpchr17.trna39の抑制能力をおよそ250%増強する(図12)。このため、本発明者らは、これが一般化可能な修飾であること、すなわち、実施例1および2によって同定された新規tRNA配列の修飾は、さらなる合理的修飾を通じて(ナンセンスコドンをレスキューするそれらの能力に関して)よりよくすることができることを提案する。このようなアプローチは、低存在量の標的RNAを有するまたはtRNA送達が限定され得る組織型に向けられるACE-tRNAの治療的有用性を補助する。
[実施例4]
[実施例4]
ヌクレオチド組成および新しい種類のtRNAによるナンセンスコドンを抑制する機能的能力の同定を可能とするために、High Throughput Cloningのために、All-In-One Plasmid With A One Pot Cloning Reactionを発明した、図11。このアプローチによって、標準的な96ウェルフォーマットで、ルシフェラーゼ活性を介して、ACE-tRNA活性の容易な調査が可能となる。簡潔に述べると、NanoLuc Reporterプラスミド中に、tRNAをコードする合成ヌクレオチド配列がライゲーションされており、TGAナンセンスレポータープラスミドのバリアントの一例が図11に示されている。図16~19では、TAA(オパール)およびTAG(アンバー)終止コドン救出ベクターが首尾よく設計され、実施された。利点は、このアプローチが、tRNAライブラリーをコードするDNAオリゴを、制限酵素およびリガーゼの存在で、NanoLucレポータープラスミド中にライゲーションすることができ、ほぼ100%のtRNAインサートの取り込みまで反応が押し進められることであり(図11)、このため「ワンポット」と表記される。この反応物を大腸菌中に形質転換し、得られるcDNAを標準的な方法によって精製する。発明された方法の別の利点は、tRNAとレポーター遺伝子(gen)が単一の発現カセット内にあり、したがって、生物学的変動性を低下させ、tRNA抑制活性の得られるスクリーニングにおいて取得されるデータの質を向上させることである。次いで、精製されたcDNAプラスミドは、推測されるルシフェラーゼ活性によって、ナンセンスコドンを修復する能力に関して、ハイスループットの96ウェルフォーマットでスクリーニングされる。このアプローチは、新規治療活性に関して、数百~数千ものtRNAをハイスループットスクリーニングするのに適している。
図11に記載されている「ワンポット」クローニングおよび発現系は、トリプトファンおよびグリシンACE-tRNA(図13)、ACE-tRNA-Arg(図14)、ACE-tRNA-Gln TAG(図15)、ACE-tRNA-Gln TAA(図16)、ACE-tRNA-Glu TAG(図17)、ACE-tRNA-Gln TAA(図18)およびACE-tRNA-Trp TAG(図19)の修復のための特有のtRNA配列を同定するために首尾よく使用された。図20A~20Dは、低分子RNAとしてのACE-tRNAの送達が、G542XおよびW1282Xナンセンス変異の強固な抑制を支えることを示す。
[実施例5]
未成熟終結コドンの抑制のための操作された転移RNA
要約
[実施例5]
未成熟終結コドンの抑制のための操作された転移RNA
要約
未成熟終結コドン(PTC)は、全ての遺伝的疾患の10~15%の原因である。翻訳の間のPTC抑制は、様々な遺伝的障害を処置するための有望なアプローチを提供するが、PTCリードスルーを促進する小分子は、臨床試験において、一貫しない成績を与えた。インフレームのPTCを効果的に抑制することができ、その同族アミノ酸を忠実にコードすることができる、アンチコドン操作された(anticodon engineered)転移RNA(ACE-tRNA)を同定するための、細胞をベースとしたハイスループットのアッセイが提供される。総合すると、最も一般的なヒトの疾患を引き起こすナンセンスコドンを標的とする高度の抑制活性を持ったACE-tRNAが同定された。PTCを修復するレベルでACE-tRNAを発現する細胞のゲノム全体にわたるトランスクリプトームリボソームプロファイリングは、翻訳終結コドンとの限られた相互作用が存在することを示す。これらのACE-tRNAは、哺乳動物細胞、アフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞およびインビボでのマウスにおいて高い抑制能を示し、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)内の疾患を引き起こす変異を含む、複数の遺伝子中にPTC修復をもたらす。
序論
序論
未成熟終結コドン(PTC)は、正規のトリプレットヌクレオチドコドンを3つの終止コドン、例えば、TAG、TGAまたはTAAの1つに転化する単ヌクレオチド変異から生じる。PTCは、タンパク質発現の喪失をもたらすので、しばしばミスセンス変異より有害である。さらに、mRNA存在量は、ナンセンス変異依存分解(NMD)を通じて低下され、いくつかの事例では、トランケートされたタンパク質は、ドミナントネガティブ機能を有し得る1-3。したがって、PTCが、嚢胞性線維症4、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症5、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis)6、β-サラセミア(β-thalessemia)7、シスチン症8、X連鎖腎性尿崩症9、ハーラー症候群10、アッシャー症候群11および多嚢胞腎疾患を含む多くの重度の疾患表現型と関連していることは驚くべきことではない。さらに、ナンセンス変異は、腫瘍抑制遺伝子p53およびATM12内で発生し、疾患におけるナンセンス変異の役割をさらに示唆する。PTC変換をもっとも受けやすいアミノ酸コドンは、終止コドンからの一塩基置換を有するアミノ酸コドン:トリプトファン、チロシン、システイン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、ロイシン、アルギニンおよびグリシンである(図25)。そのため、PTCは、世界中で3000万人を超える人々を苦しめる疾患の特有の群であり、全ての遺伝的疾患の10~15%を占める13。
アミノグリコシド14、ジペプチド15およびオキサジアゾール16などの小分子は、ナンセンス変異の「リードスルー」または「抑制」を促進する。これらの化合物は、モデル生物17、18、哺乳動物の細胞株19およびいくつかの動物疾患モデル16、20において有効である。しかしながら、このアプローチは、近い同族アミノ酸のコード化(encoding)をもたらして21、PTCにミスセンス変異を効果的に生じ、これ自体がタンパク質の折り畳み、輸送および機能に対して有害な影響を有し得る。さらに、アミノグリコシドは、聴覚毒性および腎毒性があり22、画期的医薬品オキサジアゾールであるアタルレンは、患者集団で予想外に低い効果を示し(ACT DMD第3相臨床試験、NCT01826487;ACT CF、NCT02139306)、このため、PTC治療薬としてのその有用性を限定する。CRISPR/Cas9によって媒介されるゲノム編集における最近の進行中の進歩は、潜在的に、ナンセンス変異に起因する疾患に対する恒久的な解決策をもたらす。しかしながら、この技術の側面は、治療薬としてのその早期の使用に障害を与える23、24。これは、各患者の遺伝的変動性という状況に基づくそれぞれの変異に対する「精度」または「個別化された」診断薬の要件に限定されない。
小分子の汎用性と遺伝子編集の精度を示すPTC修復アプローチが同定された。これらの基準を充足するために、UGA、UAAまたはUAG PTCコドンを認識し、抑制するための変異誘発を介してそのアンチコドンが操作されているtRNAを調べた。有効であるためには、anticodon edited tRNA、別名ACE-tRNAは、ACE-tRNAにその同族アミノ酸を導入するためのアミノアシルtRNA合成酵素および導入されたtRNAをリボソームに送達するための真核生物伸長因子1a(eEF-1α)を含む内在性翻訳細胞性機構(endogenous translation
cellular machinery)によって、なお認識されるべきである、図21A。このようなサプレッサーtRNAは、限定的な様式で、β-サラセミア25、色素性乾皮症26およびトランスジェニックPTCレポーター遺伝子27と関連するインフレーム終止コドンをレスキューことが示されている。
cellular machinery)によって、なお認識されるべきである、図21A。このようなサプレッサーtRNAは、限定的な様式で、β-サラセミア25、色素性乾皮症26およびトランスジェニックPTCレポーター遺伝子27と関連するインフレーム終止コドンをレスキューことが示されている。
本実施例では、アンチコドン編集アプローチは複数のtRNA遺伝子ファミリーに一般化可能であることが示され、このことは、多くの注釈が付された(annotated)tRNAが生物学的に生存可能であることを示唆する。さらに、アンチコドン編集サプレッサーtRNAはその同族アミノ酸をコードし、終結終止コドンとの有意な相互作用を欠き、インビボでPTCを抑制するのに効果的であることを実証する。全体として、このデータは、このような操作されたtRNAが疾患を引き起こすPTCをカバーするための幅広い要件を満たし、このため、RNA治療剤の有望な新しいクラスとなる可能性を支持する。
結果
結果
本研究の理論的根拠は、所定の同族アミン酸(イソアクセプター)に対して特有の配列を有する複数のtRNA遺伝子(イソデコーダー)が存在するという観察を基礎としており、400を超えるtRNAがヒトゲノム中で注釈付けされている(http:lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/)28,29。まず、哺乳動物細胞中でPTCの抑制効力を保持する個別のACE-tRNAを同定するために、tRNA遺伝子を調べた。カバーする配列を最大化するために、ACE-tRNAのハイスループットクローニング(HTC)と哺乳動物細胞への送達後の発光を用いたPTC抑制の定量的測定を両方サポートする、オールインワンcDNAプラスミドを作製した、図21B。ccdBネガティブセレクション31と組み合わせたGolden Gateクローニング30を用いて、HTCプラスミド中に、DNAオリゴとして、ACE-tRNA配列をクローニングした。この戦略は、約100%のクローニング効率をもたらした。ACE-tRNA抑制効率は、別のNanoLucルシフェラーゼ(NLuc)NanoBiTプラットフォームから読み取られ、このプラットフォームでは、96ウェルフォーマットを用いて、目的のPTC(UGA、UAAまたはUAG)が大きな部分(large bit)ドメインと小さな部分(small bit)ドメインの間の接合部にインフレームで導入され、図21B32、NLuc-PTCを発現している細胞中で得られたバックグラウンドに対して正規化された。まず、UGA PTCの抑制に関して、21個のグリシンACE-tRNAを評価した、図22、上部左、列1(バイオレット)。ACE-tRNAGly配列の大半が、UGA NLuc PTCを抑制することができなかったが、高い抑制収量(バックグラウンドに対して約100倍)を有する3つのGly-tRNAUGAが同定された。アンチコドン耐容性に関してスクリーニングされたGly-tRNAの間での高い配列保存を考慮すると(図27)、いずれのtRNAがアンチコドン編集に最も適しているかを新規に予測することは困難であろう。
次に、実施されたスクリーニングは、疾患を引き起こすPTCを生じ得る可能性のある以下の一塩基変異のそれぞれに対するコドン編集tRNAに対して実行された。Arg-tRNAUGA、Gln-tRNAUAA、Gln-tRNAUAG Trp-tRNAUGA、Trp-tRNAUAG、Glu-tRNAUAA、Glu-tRNAUAG、Cys-tRNAUGA、Tyr-tRNAUAG、Tyr-tRNAUAA、Ser-tRNAUAG、Leu-tRNAUAG、Leu-tRNAUAA、Lys-tRNAUAG、Lys-tRNAUGAおよびSer-tRNAUAG。NLucの酵素活性は、導入されたアミノ酸によって有意には影響を受けず(図28)、したがって、NLuc発光の差は、ACE-tRNA抑制能によるものである。スクリーニングによって、アミノ酸および終止コドン種のそれぞれに対して、複数のACE-tRNAが同定され、3つの終止コドンの全てに対して抑制がカバーされた、図22。これらのACE-tRNAの多くは、バックグラウンドの100倍超のPTC抑制という強い活性を示し、これは、本研究で使用したアミノグリコシドより有意に高かった。興味深いことに、いくつかのACE-tRNAは、特定のアンチコドン編集に対して明確な選好性を示し、tRNAアンチコドンイソアクセプター配列への変化したアミノアシルtRNA合成酵素の結合をおそらく反映している33。例えば、トリプトファンのUAG抑制への変換は、同じACE-tRNATrpのUGA編集のそれよりも10倍高い救出をもたらした。もっとも、UAGに比べてUAAに対して明確な選好性が示されたグルタミンについては、逆のことが当てはまった。とりわけ、それぞれの事例で、複数の高性能サプレッサーが同定され、このことは、ヒト疾患において特大の役割を果たすPTCである、ArgUGAにおいて特に明らかであり、ここでは、20個の効率的なACE-ArgUGAサプレッサーが同定された。他の事例では、ACE-tRNAGluなど、機能を示したもののうち、抑制効率は、UAAおよびUAGに関して概ね等しかった。UAGまたはUGA抑制を介したコード化が極めて酷似していたACE-tRNALysにおいても同様のパターンが見出された。Gln-tRNAUAAについては、抑制活性は、バックグラウンドを2,000倍上回る抑制シグナルをもたらした。スクリーニングで同定されたACE-tRNAのうち、トリプトファンtRNA遺伝子ファミリーは、UGA PTCに対して最も弱い抑制活性を示した。ヒトのユニークなACE-tRNATrp配列は6つしかスクリーニングに利用できなかったので、多様な種から得たtRNAを用いて、UGA抑制ACE-tRNATrpライブラリーを拡張した。ミスコードA9C tRNATrpおよび細菌のHirsh Trpサプレッサーに加えて、酵母、ハエ、マウス、ラット、ウサギおよびカエルから得たユニークな配列を有するトリプトファンtRNA遺伝子に対して、UGAアンチコドン編集耐容性を試験した34,36、図29A-29B。この試みは、ヒトACE Trp tRNAの抑制活性を超えるACE-tRNATrpUGA PTC抑制活性を同定することに成功しなかった、図29C。総合すると、tRNAスクリーニングは、強力な抑制を示す複数の操作されたtRNAを(各アミノ酸および終止コドンの種類に対して)に対して同定し、このため、アンチコドン編集に対する一般的な耐容性を有していた。
次に、スクリーニングで同定されたACE-tRNAが、同族アミノアシル-tRNA合成酵素によるアミノアシル化の厳格性を犠牲にして機能化されたかどうかを確定した。この目的のため、質量分析を使用して、モデル可溶性タンパク質、ヒスチジノール脱水素酵素(HDH)中でのPTC抑制を調べた、図23A。TGAコドンをアスパラギン94(N94)に導入し(図30A~C)、それぞれ、最高性能のグリシンおよびトリプトファンACE-tRNAUGAである、Glychr19.trna2またはTrpchr17.trna39 ACE-tRNAをコードするプラスミドと、タンデムで、HEK293細胞中において共発現させた。得られた完全長の抑制されたHDHタンパク質を、Strep-Tactin(登録商標)C末端アフィニティータグを介して精製し、質量分析によって分析した、図23A(図28)。その後のデータの検索によって、Trp chr17.trna39については、AsnからTrpへの修飾(+72Da)およびGlychr19.trna2については(-57Da)の修飾が同定され、各ACE-tRNAの種類に対して同族アミノ酸の忠実なコードが確認された。重要なことに、各事例で、HDH p.N94X部位において同定されたペプチドの98%超が、同族のトリプトファンおよびグリシンをコードしていた。さらに、両ACE-tRNAは、UAAおよびUAGを上回る、UGA終止コドンに対する選択性を保持していた、図23B(ACE-tRNAGly)および図31(ACE-tRNATrp)。最後に、一過性に発現されると、ACE-tRNAGlyは、従来の小分子サプレッサーであるゲンタマイシン(40μM)およびG418(140μM)より、HEK293細胞中で安定に発現されるNLuc-UGAを抑制する能力に関して優れていた、図23C。より低い抑制効率を有していたACE-tRNATrpについてさえ同じことが当てはまり、G418と比較して、PTC救出が上回っていた、図33A~D。
未成熟終止コドンの効果的な抑制を示すACE-tRNAは、天然の終止コドンのリードスルーも広く誘導し得るのかどうかという問題が持ち上がった。この潜在的な「オフターゲット」抑制に対処するために、外来性ACE-tRNAまたは対照偽プラスミド(puc57GG)を発現するHEK293細胞からリボソームフットプリントのライブラリーを作製することによって、全ての細胞転写物に対して活動的に関与するリボソームのトランスクリプトーム全体にわたる定量的プロファイルを取得した。リードスルーの人為的影響を防ぐために、ストレプトマイシンは成長培地から除去した。比較のために、G418の存在下または非存在下の細胞(150μM、48時間)からもリボソームフットプリントライブラリーを作製した。図24Aは、3’UTR領域上での、対照と比較したG418および5つのACE-tRNAのリボソームフットプリント密度を示している(log2倍数変化)。2つの複製ライブラリーにおいて、コード配列では5RPKM、3’UTRでは0.5RPKMの最小閾値を有する転写物のみを定量比較のために含めた(G418では254転写物、ACE-tRNAでは495~748転写物)。この系では、G418は、3つの内在性終止コドン群のいずれに対しても、トランスクリプトーム全体にわたる3’UTRリボソーム密度に対して観察可能な効果を有していなかった。ACE-tRNAアンチコドンに対して相補的な(complimentary)同族終止コドンに対して、およそ2倍の3’UTRリボソーム密度の増加を誘導したACE-tRNA Gln-UAAおよびArg-UGAを除き、本実施例で調べたACE-tRNAは、3’UTRリボソーム密度の検出可能な変化を有していなかった。タンパク質終止の2倍のリードスルーの生物学的重要性を理解するにはさらなる研究が必要であるが、この効果は、同じACE-tRNAに対するPTCの100倍~1000倍の抑制と比べて実質的に低い。
遺伝子の末端には、複数のインフレーム終止コドンがしばしば見出され37-39、ACE-tRNAおよびG418処置に対して、総合的な3’UTRリボソーム密度のわずかな差を引き起こし得る。終止コドンの下流の60ヌクレオチド領域内にある3’UTR中の各ヌクレオチドで、リボソームの占有を調べた。図24Bは、終止コドンの最初のヌクレオチドに対して-35~+65ntの領域内にある各ヌクレオチドに対する天然の終止コドンの周囲でのリボソームの占有を実証する。読み取りは、合計100万のマッピングされた読み取り当たりに正規化し、対照細胞に対して比較し、log2倍数変化として、パネルAとして報告した。5,200を超える転写物が、目的の領域中の少なくとも1つのフットプリントにマッピングされた。ACE-tRNA Gln-UAAおよびArg-UGAは、初期領域中で顕著な増加したリボソームの占有を示したのみならず、特徴的な3ヌクレオチド周期性を示し、リボソームが無作為に分布されたのではなく、コドンごとの動きに従ったこと示している。UGA-Trp、UGA-GlyおよびUAG-Gluに対するACE-tRNAまたはG418は、3’UTRの初期領域中でさえ、リボソーム占有の観察可能な変化を一貫して示さなかった。総合すると、リボソームプロファイリングデータは、ACE-tRNAによる天然の終止コドン抑制の効率は一般的に低く、PTC抑制のレベルより顕著に低いことを示す。
考察
考察
PTCは、多数のヒト疾患を引き起こし、治療の管理のために確立された治療の選択肢は存在しない。真核生物細胞およびマウス骨格筋中で有効なPTC復帰を示すアンチコドン編集tRNAのハイスループットクローニングおよび同定、性質決定および機能分析が本実施例に報告されている。とりわけ、スクリーニングは、全体で、既知のヒトの疾患を引き起こすPTCの大半を修復する能力を有するACE-tRNAを同定する。操作されたtRNAは、その同族アミノ酸を忠実にコードし、このため、下流のタンパク質の安定性、折り畳みおよび輸送に対する疑似効果をなくし、その結果、タンパク質折り畳み因子または輸送因子を伴うタンデム治療(tandem therapies)の必要性を無効にする。cDNAとして形質移入されると、ACE-tRNAは、PTC抑制を介して複数の完全長タンパク質、NLucルシフェラーゼレポーター、モデルタンパク質HDHおよびCFTR中の2つの疾患ナンセンス変異をレスキューした。ACE-tRNAArg cDNAによって、マウス骨格筋中での強力かつ安定なインビボでのPTC抑制が示され、ACE-tRNA活性に対する特に高いレベルの細胞の耐容性を示唆している。筋肉中でのアルギニンに対する活性なACE-tRNAの同定は、ナンセンス変異によって引き起こされるジストロフィン異常症の処置に適している。多くの遺伝的疾患と同様に、ジストロフィン異常症の10%超は、ナンセンス変異によって引き起こされ43、CGA→TGA変異が最もよく見られる43。合成RNA転写物として送達されたACE-tRNAによっても、効率的な抑制が達成され、これにより、ナノ粒子製剤の開発が可能となる。各組織および疾患の種類に対する理想的なtRNA送達戦略を評価するために、将来の研究が必要とされ、おそらく、核酸送達のための急速に拡大する技術が取り組みに役立つであろう。
PTCを抑制する因子は、天然の終止コドンのリードスルーを生じる潜在性も有する。本明細書に提示されているRNAプロファイリングデータは、一般的には、細胞中では、および試験されたコドン編集tRNAについては、これは当てはまらないことを示唆する。Arg-tRNAUGAおよびGln-tRNAUAAでは検出可能なリードスルーが見出されたが、Glu-tRNAUAG、UGA-Gly-tRNAUGAおよびTrp-tRNAUGAでは、広範囲にわたる翻訳終結に対して有意な効果は測定されなかった。この挙動は、明らかに、終止コドンの種類、またはtRNAの固有のPTC抑制活性によって分離しなかった。ACE-tRNAが本当の終止コドンのリードスルーを効果的に促進しない1つの潜在的な理由は、翻訳終結付近にある前後関係の配列ランドスケープ(sequence landscape)を原因とするものであり得る44。PTCにおける終結複合体の組成は天然の終止におけるものと異なるという知見によって、この可能性は裏付けられる45、46。しかしながら、より低いレベルのリードスルーが起こる場合には、正常な終止のリードスルーとその有害な影響の両方を制約するために、複数の細胞的機序が適切に存在する。遺伝子の末端には、複数のインフレーム終止コドンがしばしば見出され37-39、特殊化されたユビキチンリガーゼ47およびリボソーム関連経路48が、誤った翻訳終結を有するタンパク質を同定し、分解することが知られている。もっとも、哺乳動物細胞において本実施例で見られた限定的な影響にかかわらず、ACE-tRNAの送達および発現に関して、所望の細胞または組織型中で、類似のリボソームのプロファイリング実験が行われるべきである。
以前の研究は、周囲のmRNA配列がアミノグリコシドおよびアタルレンPTCの固有の終止コドン抑制効力に影響を及ぼすことを示しているので49-52、ACE-tRNAは同様に影響を受け得る。さらに、ウイルス送達または非ウイルス送達を介した、PTC含有遺伝子を置き換えるための遺伝子添加戦略は、いくつかの状況では短期の利益を達成しているが、導入遺伝子の発現レベルを制御することは困難であり得る。これに対して、ACE-tRNA抑制を介したタンパク質救出の量は、固有の細胞RNAレベルに関連しており、このため、より上昇したレベルの発現は本質的に制御される。ヒトゲノム中の可変的なイソアクセプターtRNA配列の大半に対して生物学的な目的は未知のままであり、これらの遺伝子のほぼ半分は転写的にサイレントな偽遺伝子であると推測されてきたが53、個々に提示されたデータは多くの注釈付けられたtRNAが生存可能であることを示唆している。この可能性と合致して、SerおよびLeuイソアクセプターファミリー内の機能的なイソデコーダーtRNAを同定するために、抑制アプローチが使用されてきた54。本実施例に提示されたデータは、ゲノム状況から除去されると、大半のtRNA遺伝子配列が生存可能な活性を支持することをさらに実証し、複数のtRNAおよびコドン使用に対する生物学的必要性についての謎をさらに深める。このように、本実施例に記載したハイスループット抑制戦略は、特有の抑制特性を有する新しい種類のtRNA配列を同定するために有用であり、このような研究は、新しいRNA試薬を製造する能力ならびにtRNA発現および抑制の分子的理解を進歩させる能力を有する。
材料および方法
ナンセンスレポーターHTCプラスミド
材料および方法
ナンセンスレポーターHTCプラスミド
使用した親プラスミドは、pcDNA3.1(+)であった。pNLucをコードするcDNAに、制限部位HindIIIおよびXhoI中にGibson Assembled(New England Biolabs、アメリカ)を行った。グリシン(コドンgga)、トリプトファン(tgc)、アンバー(tag)、オパール(tga)およびオーカー(taa)を、cDNA pcrの間に、アミノ酸位置160に付加した。pcrをベースとしたGibson Assemblyを用いて、pcDNA3.1(+)ポリA配列を、BbsI制限部位を有しないもので置き換えた。まず、その後に2つのBbsI制限部位(太字斜字体)
が続くT7プロモーター配列(斜字体)
(Ye et al.,2008)を上流に有するヒトtRNATyr遺伝子(太字)の5’リーダー配列およびその後にリバースT3プライマー配列(斜字体)が続く3’終結配列(太字)
を挿入することによって、ハイスループットACE-tRNA Golden Gateクローニング部位を作製した。
ACE-tRNAライブラリーのHTC
ACE-tRNAライブラリーのHTC
tRNA遺伝子配列は、tRNAデータベース、tRNAscan-SE(http://gtrnadb.ucsc.edu/index.html;PMID:26673694)から得た。本研究で用いた全てのtRNA遺伝子の配列は、図26および表9において付番されている。tRNA配列は、その対応するアンチコドン(UAG、UGAまたはUAA)を適切に変異して、200pmolのスケールで、96ウェルフォーマットで、Integrated DNA Technologies(IDT、アメリカ)から得た相補的Ultramersとして合成した。全てのtRNA配列は、それぞれ、フォワードおよびリバースオリゴ上にCGACおよびGGAC突出部(5’→3’で表記)を有するように合成した。100ng/μLになるようにアニーリング緩衝液(100mM酢酸カリウム;30mM HEPES、pH7.5)中に再懸濁することによって、Ultramersをアニールし、96℃まで2分間加熱し、サーモサイクラー中で、1℃/分で4℃まで冷却した。96ウェルPCRプレート中では、各ウェルは、10ngの適切なPTCコドンを有するHTCプラスミド、2ngのACE-tRNA二本鎖、1mM
ATP、10mM DTT、400単位のT4 DNAリガーゼおよび10単位のBbsI-HFを含有し、ddH2Oで10μLになるように列に並べた(queued)。96ウェルプレートは、サーモサイクラー中で、以下のようにサイクルを行い、([37℃で5分、20℃で5分]×30サイクル、37℃で10分、80℃で10分、4℃まで冷却した。ディープウェルの96ウェルプレート中で、10μLの化学的に形質転換受容性のあるDH5α細胞(ThermoFisher、アメリカ)に、1μLのGolden Gate反応物を添加し、42℃で30秒間、熱ショックを加え、100μLのSuper Optimal Broth(S.O.C.;Thermofisher,アメリカ)中に再懸濁した。37℃、1時間、250rpmで、形質転換体を増殖させ、次いで、100μg/mLカルベニシリンが補充された2mLのLuria-Bertani液体培地(LB)に添加し、被覆されたディープ48ウェルプレート中において、37℃で20時間、300rpmで成長させた。大腸菌の増殖は、ディープウェルプレートおよびEnzyscreen(http://www.enzyscreen.com)のクランプ中で行った。大腸菌懸濁培養物を沈降させ(室温で10分、4,000g)、プラスミドDNAを調製し、125ng/μLまで希釈した(IBI scientific,アメリカ)。全てのクローンは、配列を確認した。この方法を用いて、100%のクローニング効率が達成された。
ACE-tRNAライブラリーのHTS
ATP、10mM DTT、400単位のT4 DNAリガーゼおよび10単位のBbsI-HFを含有し、ddH2Oで10μLになるように列に並べた(queued)。96ウェルプレートは、サーモサイクラー中で、以下のようにサイクルを行い、([37℃で5分、20℃で5分]×30サイクル、37℃で10分、80℃で10分、4℃まで冷却した。ディープウェルの96ウェルプレート中で、10μLの化学的に形質転換受容性のあるDH5α細胞(ThermoFisher、アメリカ)に、1μLのGolden Gate反応物を添加し、42℃で30秒間、熱ショックを加え、100μLのSuper Optimal Broth(S.O.C.;Thermofisher,アメリカ)中に再懸濁した。37℃、1時間、250rpmで、形質転換体を増殖させ、次いで、100μg/mLカルベニシリンが補充された2mLのLuria-Bertani液体培地(LB)に添加し、被覆されたディープ48ウェルプレート中において、37℃で20時間、300rpmで成長させた。大腸菌の増殖は、ディープウェルプレートおよびEnzyscreen(http://www.enzyscreen.com)のクランプ中で行った。大腸菌懸濁培養物を沈降させ(室温で10分、4,000g)、プラスミドDNAを調製し、125ng/μLまで希釈した(IBI scientific,アメリカ)。全てのクローンは、配列を確認した。この方法を用いて、100%のクローニング効率が達成された。
ACE-tRNAライブラリーのHTS
形質移入の前日に、10%FBS、1%Pen/Stepおよび2mM L-グルタミンが補充されたダルベッコ変法基本培地(DMEM)(Thermofisher、アメリカ)中、96ウェル細胞培養物処理プレート中に、HEK293細胞(40継代未満)を1.4×104細胞/ウェルで播種した。ACE-tRNA遺伝子を有するオールインワンナンセンスレポーターを、プレート当たり3つ組で、Calfectin(Signagen、アメリカ)を用いて形質移入した。形質移入の16時間後に、培地を吸引し、20μLのPBSを各ウェルに添加した。15μLの溶解性Nano-Glo(登録商標)Luciferase Assay Reagentを各ウェルに添加した(1:50
試薬対緩衝液;Promega、アメリカ)。回転振盪後に、プレートを2分間インキュベーションし、SpectraMax i3プレートリーダーを用いて読み取った(Molecular Devices、アメリカ;積分時間、200m秒;全ての波長は、エンドポイントモードで収集した)。各実験に対して、3つのウェルにわたって、発光を平均し、この様式で、全てのACE-tRNAを3回より多く繰り返した。各プレートは、形質移入効率およびベースラインPTCリードスルーに対する対照としての役割を果たすために、ACE-tRNAなしのオールインワンナンセンスレポーターで形質移入されたウェルも3つ組で含有した。全ての値は、ベースラインPTCリードスルー発光を上回るACE-tRNA発光の比±SEMとして報告されている。一元配置ANOVAは、所定のアミノ酸ファミリー中の全てのACE-tRNAにわたって、チューキーの事後分析を用いて行った。
CFTR、HDH-his-strepおよび4×ACE-tRNA発現プラスミド
試薬対緩衝液;Promega、アメリカ)。回転振盪後に、プレートを2分間インキュベーションし、SpectraMax i3プレートリーダーを用いて読み取った(Molecular Devices、アメリカ;積分時間、200m秒;全ての波長は、エンドポイントモードで収集した)。各実験に対して、3つのウェルにわたって、発光を平均し、この様式で、全てのACE-tRNAを3回より多く繰り返した。各プレートは、形質移入効率およびベースラインPTCリードスルーに対する対照としての役割を果たすために、ACE-tRNAなしのオールインワンナンセンスレポーターで形質移入されたウェルも3つ組で含有した。全ての値は、ベースラインPTCリードスルー発光を上回るACE-tRNA発光の比±SEMとして報告されている。一元配置ANOVAは、所定のアミノ酸ファミリー中の全てのACE-tRNAにわたって、チューキーの事後分析を用いて行った。
CFTR、HDH-his-strepおよび4×ACE-tRNA発現プラスミド
哺乳動物細胞中での発現のために、KpnIおよびXbaI制限酵素を用いて、ヒトCFTRのコード領域および3’非翻訳領域(UTR)の200塩基対に対するcDNAをpcDNA3.1(+)(Promega、アメリカ)中にライゲーションした。G542tgaおよびW1282tga変異は、QuickChange XL II(Stratagene、アメリカ)を用いて導入した。アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞中での発現のために、ヒトCFTRのコード領域および5’の140塩基対および244塩基対の3’UTRに対するcDNAをpGEM-HE(Promega、アメリカ)中にライゲーションした。G542tgaおよびW1282tga変異はいずれも、QuickChange XL IIを用いて導入した。大腸菌ヒスチジノール脱水素酵素をコードするcDNAを、ムス・ムスクルス(mus musculus)に対してコドン最適化し、哺乳動物細胞からのタンパク質精製のためのc末端8×His-Strep-tagを付けて合成した(BioBasic Inc、カナダ)。EcoRIおよびXhoI制限部位を用いて、合成されたcDNAをpcDNA3.1(+)中にライゲーションした。ナンセンス変異tag、taaおよびtgaは、QuickChange XL IIを用いて導入した。多重化ACE-tRNA発現プラスミドを作製するために、EcoRIとHindIII制限部位の間に、BbsI「多重クローニング部位」
;方向性BbsI認識配列は斜字体であり、ライゲーションのためのユニークな4塩基対突出部は太字である。)を挿入することによって、新規親Golden Gate pUC57(amp)プラスミドを作製した。サイズが相対的に小さく、骨格BbsI制限部位ならびにT7およびT3プロモーター配列を欠くので、pUC57(amp)を親プラスミドとして選択した。HTSプラスミド中に含まれる特徴は、ACE-tRNAカセットに隣接するT7およびT3プロモーター配列であり、pcr増幅にとって理想的な同等の融解温度(Tm)を有するユニバーサルプライマー結合配列を与える。NEB Golden Gate Assembly Tool(https://goldengate.neb.com/editor)を用いて、T7およびT3隣接配列にアニールするpcrプライマーを作製し、遠位のBbsI認識配列の切断後に、ユニークな4塩基対突出部を作製した。最終結果は、相補的な4塩基対突出部を通じて「デイジーチェイン(daisy-chained)」することができ、ワンポットGolden Gate反応を用いて、puc57 Golden Gateプラスミド中にライゲーションされ得るユニバーサルpcrプライマーを用いた、4つのACE-tRNA pcr産物の作製であった。全てのクローンは、配列を確認した。
細胞培養、タンパク質発現およびウェスタンブロット
細胞培養、タンパク質発現およびウェスタンブロット
高グルコースDMEM(Gibco、アメリカ)中に10%FBS(HiClone、アメリカ)、1%Pen Strep、1%L-Glutを含有する(v/vでの%)標準的な成長培地中において、37℃、5%CO2で、HEK293T細胞(ATCC、アメリカ)を成長させた。標準プロトコールにしたがって(SignaGen Laboratories、アメリカ)、Calfectinを用いて、75%の集密度でcDNAを形質移入した。36時間後に、細胞をこすり取り、0.5μg/mLぺプスタチン、2.5μg/mLアプロチニン、2.5μg/mLロイペプチン、0.1mM PMSF、0.75mMベンズアミジンを補充されたPBS中において、7,000gで、8分間、4℃でペレット化した。CFTR発現細胞については、100mMスクロース、150mM NaCl、1mM DTT、0.5μg/mLぺプスタチン、2.5μg/mLアプロチニン、2.5μg/mLロイペプチン、0.1mM PMSF、0.75mMベンズアミジン、50mM Tris-HCL ph7.4中で、細胞ペレットを激しくダウンスホモジナイズし(dounced)、可溶性細胞質タンパク質から全膜を分離するために100,000gで遠心した。1%triton、250mM NaCl、50mM tris-HCl pH7.4および0.5μg/mLぺプスタチン、2.5μg/mLアプロチニン、2.5μg/mLロイペプチン、0.1mM PMSF、0.75mMベンズアミジンを含有する緩衝液中にペレットを可溶化した。1%の2-メルカプトエタノールの存在下で4%スタッキングゲルを有する3~15%の分離グラジエントSDS-page上に等しい細胞溶解物をロードし、55V O/Nで分離し、0.45μM LF
PVDF(Bio-Rad、アメリカ)に移入した。2%脱脂乳中の抗CFTR抗体M3A7(1:1000;Millipore、アメリカ)を用いて、PVDFをイムノブロットし、LI-COR Odyssey Imaging System(LI-COR、アメリカ)上で画像化した。HDH-His-Strep発現細胞については、100mMスクロース、1mM DTT、1mM EDTA、20mM tris-HCl pH8.0、0.5μg/mLぺプスタチン、2.5μg/mLアプロチニン、2.5μg/mLロイペプチン、0.1mM PMSFおよび0.75mMベンズアミジン中で細胞ペレットを激しくダウンスホモジナイズした。100,000gで30分間、4℃で、溶解物を遠心した。1%の2-メルカプトエタノールの存在下での4~12%Bis-Tris SDS-pageアクリルアミドゲル(ThermoFisher、アメリカ)上で、上清(可溶性細胞タンパク質)を分離し、0.22μM LF PVDF(Bio-Rad、アメリカ)に移入し、2%脱脂乳中で抗Strep抗体(1:5000;iba、ドイツ)を用いてイムノブロットし、LI-COR Odyssey Imaging System(LI-COR、アメリカ)上で画像化した。
質量分析
PVDF(Bio-Rad、アメリカ)に移入した。2%脱脂乳中の抗CFTR抗体M3A7(1:1000;Millipore、アメリカ)を用いて、PVDFをイムノブロットし、LI-COR Odyssey Imaging System(LI-COR、アメリカ)上で画像化した。HDH-His-Strep発現細胞については、100mMスクロース、1mM DTT、1mM EDTA、20mM tris-HCl pH8.0、0.5μg/mLぺプスタチン、2.5μg/mLアプロチニン、2.5μg/mLロイペプチン、0.1mM PMSFおよび0.75mMベンズアミジン中で細胞ペレットを激しくダウンスホモジナイズした。100,000gで30分間、4℃で、溶解物を遠心した。1%の2-メルカプトエタノールの存在下での4~12%Bis-Tris SDS-pageアクリルアミドゲル(ThermoFisher、アメリカ)上で、上清(可溶性細胞タンパク質)を分離し、0.22μM LF PVDF(Bio-Rad、アメリカ)に移入し、2%脱脂乳中で抗Strep抗体(1:5000;iba、ドイツ)を用いてイムノブロットし、LI-COR Odyssey Imaging System(LI-COR、アメリカ)上で画像化した。
質量分析
精製されたHDH-His-Strepタンパク質に対するフラグメンテーションデータは、アイオワ大学プロテオミクスファシリティーで取得した。簡潔に述べると、高速スピンの可溶性画分から得たHDH-His-Strepタンパク質を、Strep Trap HPカラム(GE Healthcare、スウェーデン)に通過させ、5カラム容積の、100mMスクロース、1mM DTT、1mM EDTA、20mM tris-HCl pH8.0、0.5μg/mLぺプスタチン、2.5μg/mLアプロチニン、2.5μg/mLロイペプチン、0.1mM PMSFおよび0.75mMベンズアミジンで洗浄した。10mM d-デスチオビオチン(desthbiotin)を補充した洗浄緩衝液でタンパク質を溶出し、30kDAカットオフAmicon-Ultrafiltrationカラム(Millipore、アメリカ)中で濃縮した。濃縮されたタンパク質をNuPage4~12%Bis-Trisプレキャストゲル(Invitrogen、アメリカ)上にロードし、150Vで1.5時間分離した。Pierce質量分析適合性銀染色キット(ThermoFisher Scientific、アメリカ)を用いてゲルを染色した。
ゲル内トリプシン消化。簡潔に述べると、SDS-PAGEゲルからの標的としたタンパク質バンドを手作業で切り出し、1mm3片に切断し、完全な脱染を達成するために、それぞれ、100mM重炭酸アンモニウム:アセトニトリル(1:1、v/v)および25mM重炭酸アンモニウム/アセトニトリル(1:1、v/v)中で洗浄した。さらに、ACNでゲル片を処理し、speed vacを用いて乾燥した。乾燥後、50μLの10mM DTT中において、56℃で60分間、ゲル片を還元し、次いで、室温で30分間、55mM IAMによってアルキル化した。過剰なDTTおよびIAMを除去するために、25mM重炭酸アンモニウム:アセトニトリル(1:1、v/v)で2回、ゲル片を洗浄した。乾燥後、25mM重炭酸アンモニウム中の10ng/μLのトリプシン溶液50μL中のゲル片を氷上に置き、氷上で60分間、インキュベートした。次いで、37℃で16時間、消化を行った。100μLの50%アセトニトリル/0.2%ギ酸で0.5時間、2回、ペプチド抽出を行った。約15μLまで、Speed Vac中で、合わせた抽出物を濃縮した。
LC-MS/MS。質量分析データは、Eksigent Ekspert(商標)nanoLC 425 System(Sciex)に連結されたOrbitrap Fusion Lumos質量分析計(Thermo Fisher Scientific、San Jose、CA)を用いて収集した。Trap-Elute Jumper Chip(製品番号:800-00389)および連結された1/16’’10ポートValcoが、グラジエント1ポンプによって行われるロードおよび(グラジエント2ポンプによる)最終溶出を方向づけた。カラムの組み立ては、ekspert(商標)cHiPLCシステム中に取り付けられた2つのタンデム75μm×15cmカラム(ChromXP C18-CL、3μm120A、AB SCIEXのEksigent部分)としてデザインした。各注射について、概ね0.5μgの全消化物をロードした。ペプチドは、緩衝液Aが0.1%ギ酸およびBが95%ACN、0.1%ギ酸である線形および定常セグメントから構成される120分グラジエントを用いて、質量分析計でインライン分離した。グラジエントは、まず3分間、4%での維持を開始し、次いで、以下の遷移(%B、分)を行う。(26、48)(35、58)、(35、64)、(50、72)、(50、78)、(94、84)、(94、96)、(4、100)、(4、120)。
LUMOS Orbitrap上でのタンデム質量分析 スキャン系列は、軸外Orbitrapセグメント(MS1)中において、60,000の分解能で、Orbitrap Fusion Lumos質量分析計(Thermo)上で獲得されたフルサーベイ(m/z 350~1500)から始まった。上記120分のグラジエントの間、3秒ごとのグラジエントMS1スキャンが獲得された。2.0E5の閾値で、2~8つの荷電状態イオンの中から、最も豊富なプリカーサーを選択した。イオンが前回の30秒中に2回標的とされた場合には、イオンは、30秒間、動的に除外された。m/z 2に質量ウィンドウを有するマルチセグメント四極子によって、選択されたイオンを単離し、次いで、それぞれ、ITおよびイオンルーティング(ioin routing)多重極中で、CIDおよびHCD活性化条件の両方に順次供した。CIDに対するAGCターゲットは、4.0E04、35%衝突エネルギー、0.25のQ値(activation Q)および100ミリ秒の最大充填時間であった。標的とされたプリカーサーは、40%衝突エネルギーおよび0.25のQ値で、高エネルギー衝突誘起解離(HCD)によっても断片化された。HCD断片イオンは、Orbitrap(AGC 1.2E05、最大注入時間110m秒および分解能は400Thで30,000に設定)を用いて分析した。両MS2チャンネルはセントロイドとして記録され、MS1サーベイスキャンは、プロファイルモードで記録した。
プロテオミクス検索。最初のスペクトル検索は、Sequest HTを用いて、Proteome Discovererバージョン2.1.1.21(ThermoFisher Scientific、アメリカ)によって行った。スペクトルは、Byonic検索エンジン(Protein Metrics)バージョン2.8.2によっても検索した。検索データベースは、92645配列を含有する2016年10月24日にダウンロードされた種9606(ヒト)に対するUniprot KBおよび10079配列を含有する2016年11月8日にダウンロードされた分類学562(大腸菌)に対するUniprotKBから成った。Byonic検索のために、これら2つのデータベースは直接連結された。いずれの検索においても、等しい数のデコイ入力を作製し、Targetデータベース中で元の入力を逆転させることによって同時に検索した。
インビトロcRNA転写。10倍過剰のNheI-HF制限酵素(コード領域の3’に位置する部位)(New England Biolabs、アメリカ)によって、37℃で3時間、G542XUGA、W1282XUGAおよびWT CFTR pGEMHE(Mense et al.,2006;PMID:1703051)プラスミドを直鎖化し、標準的なcDNA沈殿法を用いて精製した。mMessage mMachine T7キット(ThermoFisher Scientific、アメリカ)を用いて、全てのcRNAを転写した。転写反応からのcRNAの精製は、RNeasy Mini Kit(Qiagen、ドイツ)から得たカラム上で行った。濃度は、260nmでの吸光度測定によって決定され、1%アガロースゲル(RNアーゼなし)上で質を確認した。全てのcRNAは、使用前に1μg/mLの列を作り(queued)、全ての結果は、2つ以上のcRNA調製物から得られた。
インビトロtRNA転写。CellScript T7-Scribe Standard RNA IVT Kit(CELLSCRIPT、アメリカ)を用いて、最も性能がよいTrpおよびGly ACE-tRNAであるTrpchr17.trna39およびGlychr19.trna2を、インビトロで転写した。ACE-tRNAをコードし、T7プロモーター(斜字体)が前に置かれたACE-tRNA PAGE精製されたUltramer(20μg;Integrated DNA Technologies、Coralville、IA)に、等モル濃度のT7オリゴ(5’-taatacgactcactata-3’)をアニールした。重要なこととして、CCAを含有する3つの末端ヌクレオチドが含められた(太字)。
総反応容量を100μLに調整し、キット試薬を以下の量で添加した。10μLの10X T7-Scribe転写緩衝液、7.5μLの各ヌクレオチド(100mM原液)、10μLの100mMジチオスレイトール、2.5μLScriptGuard RNアーゼ阻害剤、10μLのT7-Scribe酵素溶液。37℃で4~5時間、反応物をインキュベーションした後、キットとともに提供された5μLのDNアーゼ(1U/μL)で30~60分間、DNAテンプレートを消化した。酸性フェノールクロロホルム(5:1、pH4.5)を用いて、ACE-tRNAを反応物から抽出し、エタノールで沈殿させた。沈殿物ACE-tRNAをペレットとし、洗浄し、乾燥し、100μLのDEPC処理された水の中に再懸濁し、Chroma Spin-30カラム(Clontech、アメリカ)でさらに精製した。この手順によって、概ね100μLの約5μg/μLACE-tRNAが得られた。20μgのアリコートで、ACE-tRNAを再度ペレットとし、洗浄し、凍結乾燥し、使用まで-80℃で保存した。全ての結果は、2つ以上のACE-tRNA調製物から得られた。
リボソームフットプリントプロファイリングライブラリーの調製 ACE-tRNAおよび対照プラスミド(puc57GG)で一過性に形質移入されたHEK293細胞を、Pen-Strepの非存在下で48時間、標準的な成長培地中で成長させた。少しの改変を加えて、記載されているとおりに55、ライブラリーを調製した。簡潔に述べると、氷冷したPBSの添加によって、細胞を急速に冷却し、溶解緩衝液(20mM Tris-HCl/pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、1%(v/v)TritonX-100および25Uml-1Turbo DNase I)中で、氷上で10分間溶解し、26G針を10回通してトリチュレーションを行った。4℃で10分間、16,000gでの遠心による除去後、200UのRiboLock
RNアーゼ阻害剤(Thermo Scientific)を添加する前に、穏やかに撹拌しながら、室温で45分間、A260溶解物当たり100UのRNアーゼI(Ambion、アメリカ)を用いて、溶解物を消化した。次いで、改変されたポリソーム緩衝液(20mM Tris-HCl/pH7.4、150mM NaCl、8.5mM MgCl2、0.5mM DTT、20 U ml-1RiboLock RNアーゼ阻害剤)中に調製された1Mスクロースクッション上に溶解物を載せることによって、リボソーム保護されたmRNA断片を単離し、Beckmen TLA-110ローターを用いて、4℃で2時間、70,000rpmで遠心した。TRIzolを用いてmRNAフットプリントを含有するリボソームペレットを抽出し、8M尿素を含有する変性12%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。SYBR Gold(Invitrogen)で染色されたゲルから、26~34ntの範囲のサイズを有するRNA断片を手作業で切り出し、リボソーム保護された断片のライブラリーを作製するために単離した。Ribo-Zeroキット(Illumina)を用いて、夾雑するrRNA断片を枯渇させた。3’オリゴヌクレオチドアダプターライゲーション、逆転写、環状化およびビオチン化されたrRNA枯渇オリゴ(表9)を用いた二度目のrRNA枯渇は、記載されているとおりに行った55。PCR増幅の間に、各試料に対してインデックスプライマーを使用して、ライブラリーにバーコードを付けた。次いで、3%PhiX(Illumina)とともに、バーコードが付けられたライブラリーをプールし、典型的には、試料当たり1800万~2700万の読み取り情報を生成するために、製造業者のプロトコールのとおりに、Illumina NextSeq500中で配列を決定した。
RNアーゼ阻害剤(Thermo Scientific)を添加する前に、穏やかに撹拌しながら、室温で45分間、A260溶解物当たり100UのRNアーゼI(Ambion、アメリカ)を用いて、溶解物を消化した。次いで、改変されたポリソーム緩衝液(20mM Tris-HCl/pH7.4、150mM NaCl、8.5mM MgCl2、0.5mM DTT、20 U ml-1RiboLock RNアーゼ阻害剤)中に調製された1Mスクロースクッション上に溶解物を載せることによって、リボソーム保護されたmRNA断片を単離し、Beckmen TLA-110ローターを用いて、4℃で2時間、70,000rpmで遠心した。TRIzolを用いてmRNAフットプリントを含有するリボソームペレットを抽出し、8M尿素を含有する変性12%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。SYBR Gold(Invitrogen)で染色されたゲルから、26~34ntの範囲のサイズを有するRNA断片を手作業で切り出し、リボソーム保護された断片のライブラリーを作製するために単離した。Ribo-Zeroキット(Illumina)を用いて、夾雑するrRNA断片を枯渇させた。3’オリゴヌクレオチドアダプターライゲーション、逆転写、環状化およびビオチン化されたrRNA枯渇オリゴ(表9)を用いた二度目のrRNA枯渇は、記載されているとおりに行った55。PCR増幅の間に、各試料に対してインデックスプライマーを使用して、ライブラリーにバーコードを付けた。次いで、3%PhiX(Illumina)とともに、バーコードが付けられたライブラリーをプールし、典型的には、試料当たり1800万~2700万の読み取り情報を生成するために、製造業者のプロトコールのとおりに、Illumina NextSeq500中で配列を決定した。
リボソームフットプリントデータ解析。rRNA夾雑物の読み取り情報を除去するために、HISAT2.0.356を用いて、まず、各バーコードが付けられた試料(3’末端のアダプター配列を差し引いた)に対するデータファイルを、4つのrRNA配列(RNA5S1;NR_023363、RNA5-8SN5;NR_003285、RNA18SN5;NR_003286およびRNA28SN5;NR_003287)にマッピングした。各ヒト遺伝子(UCSC RefSeq GRCh38)の最も長い転写物バリアントのセンス鎖に、残りの読み取り情報を整列させた。少なくとも75ntの3’UTR長さを有する転写物(18,101配列)を配列分析のために使用した。読み取り情報の5’末端での最大2つのミスマッチを許容した。多重マッピングされた読み取り情報は全て廃棄した。26~34ntの長さを有する断片読み取り情報をリボソームフットプリントと定義し、分析のために使用した。各フットプリントからの5’末端ヌクレオチドに注釈を付け、各転写物上にマッピングした。各フットプリントの16番目~18番目のヌクレオチドを占めるリボソームA部位の位置を57,58、各転写物上でのリボソームの位置を推測するために使用した。それぞれの個別の転写物(18,101配列)上のRPKM(合計100万のマッピングされた読み取り情報当たりの、転写物のキロベース当たりのフットプリント読み取り情報(footprint Reads Per Kilobase of transcript per total Million-mapped reads))を計算した。2つの複製ライブラリーにおいて、コード配列では5RPKM、3’UTR領域では0.5RPKMの最小閾値を有する転写物のみを(G418では254転写物、ACE-tRNAでは495~748転写物)、図24Aにおける分析のために含めた。図2Bにおけるトランスクリプトーム全体のメタ遺伝子プロットについては、終止コドンの最初のヌクレオチドに対して-35~+65ntの領域内にある各ヌクレオチドに対するフットプリント数は、合計100万のマッピングされた読み取り情報当たりに正規化した。全ての転写物(18,101配列)をマッピングのために使用し、5,200を超える転写物が、関心のある領域中の少なくとも1つのフットプリントにマッピングされた。次に、本発明者らは、ACE-tRNAであるGlychr19.trna2およびTrpchr17.trna39がPTCを救うインビボでの生物活性を調べた。配列決定データは、Galaxyプラットフォーム59を用いて分析した。グラフは、Prism 7(GraphPad Software)を用いて作成した。
安定なNLucレポーター細胞株の作製。Gibson Assembly(New England Biolabs、アメリカ)を用いて、レトロウイルスベクターpQCXIP(Clontech、アメリカ)の多重クローニング部位内のAgeIおよびNotI制限部位中に、アミノ酸位置160にtag、taaおよびtga終止コドンを有するpNLucをコードするcDNAを挿入した。Calfectin(SignaGen
Laboratories、アメリカ)を用いて、PhoenixGP細胞(PMID:7690960)を、pNLuc-STOP-pQCXIPおよびcmv-VSV-G(VSV-G外被シュードタイピング)プラスミドで共形質移入し、33℃のCO2調節された(5%)細胞恒温器中に、48時間置いた。レトロウイルスの粒子を含有する培地(20mls)を4℃に冷却し、細胞細片を除去するために10,000gで遠心し、0.45μmMCE膜シリンジフィルター(Millipore、アメリカ)を通して、30%の集密度で、低継代HEK293細胞が播種された2つの10cm皿上にろ過した。細胞培養皿をParafilmで密封し、90分間、3,500gで、24℃で遠心し、37℃のCO2調節された(5%)細胞培養恒温器中に置いた。対照皿(感染なし)が完全な細胞死を示すまで、ピューロマイシン(1μg/mL)で、24時間後に細胞を選択した。FACSを用いて、96ウェルプレート中に細胞を単分散し、続いて、クローン集団を単分散した。実験操作の間、選択されたクローンを維持するために、ピューロマイシンは使用せず、全ての研究において、標準的なDMEM培地(DMEM-ダルベッコ変法イーグル培地-10%FBS、1%Pen/Stepおよび2mM L-グルタミンが補充された、L-グルタミンを加えた高グルコース;Thermofisher、アメリカ)を使用した。
Laboratories、アメリカ)を用いて、PhoenixGP細胞(PMID:7690960)を、pNLuc-STOP-pQCXIPおよびcmv-VSV-G(VSV-G外被シュードタイピング)プラスミドで共形質移入し、33℃のCO2調節された(5%)細胞恒温器中に、48時間置いた。レトロウイルスの粒子を含有する培地(20mls)を4℃に冷却し、細胞細片を除去するために10,000gで遠心し、0.45μmMCE膜シリンジフィルター(Millipore、アメリカ)を通して、30%の集密度で、低継代HEK293細胞が播種された2つの10cm皿上にろ過した。細胞培養皿をParafilmで密封し、90分間、3,500gで、24℃で遠心し、37℃のCO2調節された(5%)細胞培養恒温器中に置いた。対照皿(感染なし)が完全な細胞死を示すまで、ピューロマイシン(1μg/mL)で、24時間後に細胞を選択した。FACSを用いて、96ウェルプレート中に細胞を単分散し、続いて、クローン集団を単分散した。実験操作の間、選択されたクローンを維持するために、ピューロマイシンは使用せず、全ての研究において、標準的なDMEM培地(DMEM-ダルベッコ変法イーグル培地-10%FBS、1%Pen/Stepおよび2mM L-グルタミンが補充された、L-グルタミンを加えた高グルコース;Thermofisher、アメリカ)を使用した。
RNA形質移入。10%FBS、1%Pen/Stepおよび2mM L-グルタミンが補充されたダルベッコ変法基本培地(DMEM)(Thermofisher、アメリカ)中の、96ウェル細胞培養処理されたプレート中に、pNLuc-UGAを安定に発現するHEK293細胞を1.4×104細胞/ウェルで播種した。16~24時間後に、リポフェクタミン2000(ThermoFisher Scientific、アメリカ)を用いて、ACE-tRNAで細胞で形質移入した。簡潔に述べれば、150μLのOptiMEM中に3μgのACE-tRNAを懸濁し、12μLのリポフェクタミン2000を150μLのOptiMEMと混合した。この容量を合わせ、完全に混合し、室温で10分間インキュベートした。75μLの形質移入複合体を各ウェルに添加した。ACE-tRNA転写物によるPTC抑制は、上述のように定量した。
アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞中での発現。アフリカツメガエル卵母細胞(ステージVおよびVI)は、Ecocyte(Austin、TX)から購入した。注入前に、各ACE-tRNAペレットを2μLのddH2O中に再懸濁し、細片を21,000×g、4℃で、25分間ペレットにした。CFTRチャンネル救出に対するACE-tRNAの用量応答を測定するために、ddH2Oで容量のバランスを取ったACE-tRNA分割試料の系列希釈物を作製した(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125および1.562ng/卵母細胞)。全ての実験において、卵母細胞当たり25ngのCFTR cRNAを注入し、注入容量は50nLであった。ACE-tRNAなしのバックグラウンド対照実験では、ddH2Oを使用した。注入後に、18℃で36時間、OR-3(50%ライボヴィッツ培地、250mg/Lゲンタマイシン、1mM L-グルタミン、10mM HEPES(pH7.6))中に卵母細胞を保った。
二電極電圧クランプ(TEVC)法による記録。CFTR Cl-電流は、以下のものを(mMで)含有するND96槽溶液中で記録した。最大CFTR活性化カクテル、ホルスコリン(10μM;アデニル酸シクラーゼ活性化因子)および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(1mM;ホスホジエステラーゼ阻害剤)の存在下で、96NaCl、2KCl、1MgCl2および5HEPES(pH7.5)。3M KClを再充填(backfilled)したガラス微小電極は、0.5~2MΩの抵抗を有していた。データは、1kHzでフィルターをかけ、pClamp9.2ソフトウェア(Molecular Devices、アメリカ)によって調節されたDigidata1322Aを用いて、10kHzでデジタル化した。OC-725C電圧固定増幅器(Warner Instruments、アメリカ)を用いて、-60から+35mVまで、5mV電圧ステップを使用して、CFTR電流を誘発した。CFTR Cl-電流が-20mVの正に反転した卵母細胞は廃棄した。電流分析のために、Clampfit9.2ソフトウェアを使用した。全ての値は、平均±SEMとして表されている。
動物およびインビボでの画像化。Nu/Jマウスは、Jackson labsから購入した。動物実験は、ウィスター研究所の所内動物実験委員会によって承認された(プロトコール番号:112762)。マウスは、前脛骨筋中に、30μLの水中に再懸濁された10~20μgのDNAを注射した後に、電気穿孔によって処置された。10μgのpNano-TGA+10μgのArgACE-tRNA(右前脛骨筋(right tibialis anterior))または10μgのpNano-TGA+10μgの空のpUC57(左前脛骨筋)を3匹のマウス中に注射した。対照として、3匹の他のマウスに、10μgのpNano-WT(右前脛骨筋;陽性対照)または水(左前脛骨筋;陰性対照)を注射した。DNAは、333IU/mLのヒアルロニダーゼ(Sigma)とともに調合した。DNA注射の1分後に、CELLECTRA 3P装置(Inovio Pharmaceuticals)を用いた電気穿孔を行った。腹腔内に100μLのフリマジン(Nano-Glo基質の40倍希釈)を注射することによって、マウス中で、Nanoluciferase活性を画像化し、注射から5分後に、IVIS Spectrum(Perkin Elmer)上でマウスを画像化した。画像化はオープンフィルターを用いて行い、40秒で画像を取得した。画像は、Living Image
Software(Perkin Elmer)を用いて分析した。
Software(Perkin Elmer)を用いて分析した。
表9 PTC抑制活性に関してスクリーニングされた、tRNAの注釈付けられた配列のライブラリー。各配列に対する斜字体の文字は、アンチコドン編集の部位を示す。太字の文字は、バックグラウンドより5倍高い抑制活性を有するtRNAを示す。tRNAでは、チミジンはウラシルで置き換えられていることに注意されたい。
[実施例5]
参考文献
参考文献
上記明細書および実施例は本発明を完全に開示し、実施可能にするが、これらは本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は本明細書に添付される特許請求の範囲によって定義される。
全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により、本明細書に組み込まれる。上記明細書において、本発明は、そのある特定の実施形態に関連して記載され、多くの詳細が例示の目的で記されているが、本発明にはさらなる実施形態の余地があること、および本発明の基本的な原理から逸脱することなく、本明細書に記載されている細部のいくつかは大幅に変更され得ることが当業者に自明である。
本発明を記載する上での用語「a」および「an」および「the」および類似の指示語の使用は、本明細書に別段の記載がなければまたは文脈上明確に矛盾しなければ、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈すべきである。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」および「含有する(containing)」は、別段の記載がなければ、非限定的な用語(すなわち、「含むが、限定されない」という意味)として解釈されなければならない。本明細書に別段の記載がなければ、本明細書における値の範囲の記述は、この範囲内に属する各個別の値を個別的に表すことの簡略な方法としての役割を果たすことが単に意図され、各個別の値は、個別的に本明細書に記載されているごとく、本明細書に組み込まれる。本明細書に別段の記載がなければ、または文脈上明らかに矛盾しなければ、本明細書に記載されている全ての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書中に提供されるあらゆる全ての例または例示的な語句(例えば、「など(such as)」の使用は、本発明を単によりよく明らかにすることが意図され、別段の主張がなければ、本発明の範囲に限定を加えるものではない。本明細書中のいずれの語句も、主張されていないいずれかの要素が本発明に不可欠であることを示すものと解釈すべきではない。
本発明を実施するための本発明者らが知る最良の態様を含む本発明の実施形態が本明細書に記載されている。前記記載を読めば、これらの実施形態の変形が当業者に自明なものとなり得る。本発明者らは、当業者が適宜このような変更を利用することを予期し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されているものとは異なって実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるところにより、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変および均等物を含む。さらに、本明細書に別段の記載がなければ、または文脈上明らかに矛盾しなければ、全ての可能なその変形中での上記要素のあらゆる組み合わせが本発明によって包含される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
Tアームと、Dアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移RNA(tRNA)であって、前記Tアームが伸長因子1-α1(EF1α)と相互作用するヌクレオチドを有するTステムを含む、修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目2)
配列番号1~538のいずれか一つからなる修飾された転移RNA(tRNA)であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目3)
前記tRNAが配列番号4からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目4)
前記tRNAが配列番号16からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目5)
前記tRNAが配列番号24からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目6)
前記tRNAが配列番号33からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目7)
前記tRNAが配列番号38からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目8)
前記tRNAが配列番号44からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目9)
前記tRNAが配列番号48からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目10)
前記tRNAが配列番号53からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目11)
配列番号56~60、62~66、84~86、90~111、113、128~143、147~149、153~156、161~174、176、178、181、184~186、192、196~197、199~201、205、213~240、246、255~256、258~285、299、305~312、314、318~332、335~344、346、350~354、357~360、362、365~370、372~383、388~390、392、394~401、403~407、414~416、418、422、425、428~433、437、444~445、452、455、459~463、470、472~474、476、487~492、525、530~539、545~550、553~555、561~563および567~579のいずれか1つからなる修飾された転移RNA(tRNA)であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目12)
Tアームと、Dアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移RNA(tRNA)であって、
(a)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-UCA-3’であり、かつTGA終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがアルギニン、トリプトファン若しくはグリシンに作動可能に連結されており;
(b)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-UUA-3’であり、かつTAA終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがグルタミン若しくはグルタミン酸に作動可能に連結されており;または
(c)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-CUA-3’であり、かつTAG終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがトリプトファン、グルタミン酸若しくはグルタミンに作動可能に連結されている;
修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目13)
前記Tアームが伸長因子1-α1(EF1α)との相互作用を増強しまたは調整する合理的なヌクレオチド置換を含む、項目12に記載の修飾されたtRNA。
(項目14)
オリゴヌクレオチドが150ヌクレオチド未満の全長を有する、項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAをコードするオリゴヌクレオチド配列。
(項目15)
第一のオリゴヌクレオチド配列と第二のオリゴヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドであって、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が、項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAを独立にコードし、前記第一および第二のオリゴヌクレオチドが150ヌクレオチド未満の全長を独立に有し、前記2つの配列がタンデムである、オリゴヌクレオチド。
(項目16)
前記オリゴヌクレオチドがDNAである、項目15に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目17)
プロモーターと、項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAをコードする核酸または項目14~16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド配列とを含む発現カセット。
(項目18)
項目14~16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは項目17に記載の発現カセットを含むベクター。
(項目19)
前記ベクターがウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、項目18に記載のベクター。
(項目20)
項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAと、項目14~16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、または項目18若しくは19に記載のベクターと、
薬学的に許容され得る担体と、
を含む、組成物。
(項目21)
前記担体がリポソームである、項目20に記載の組成物。
(項目22)
項目18または19に記載のベクターを含む細胞。
(項目23)
終止コドン関連遺伝子疾患を処置する方法であって、終止コドン関連遺伝子疾患を処置することを必要とする患者に、項目20または21に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目24)
未成熟終止コドンと関連する前記遺伝子疾患が、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β-サラセミアまたはリドル症候群である、項目23に記載の方法。
(項目25)
細胞中のナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への翻訳を回復させる方法であって、項目20または21に記載の組成物を前記細胞に導入することを含み、修飾されたtRNAが、ナンセンス変異を含む前記ヌクレオチド配列への翻訳を回復させる、方法。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
Tアームと、Dアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移RNA(tRNA)であって、前記Tアームが伸長因子1-α1(EF1α)と相互作用するヌクレオチドを有するTステムを含む、修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目2)
配列番号1~538のいずれか一つからなる修飾された転移RNA(tRNA)であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目3)
前記tRNAが配列番号4からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目4)
前記tRNAが配列番号16からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目5)
前記tRNAが配列番号24からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目6)
前記tRNAが配列番号33からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目7)
前記tRNAが配列番号38からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目8)
前記tRNAが配列番号44からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目9)
前記tRNAが配列番号48からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目10)
前記tRNAが配列番号53からなり、チミジンがウラシルで置換されている、項目2に記載の修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目11)
配列番号56~60、62~66、84~86、90~111、113、128~143、147~149、153~156、161~174、176、178、181、184~186、192、196~197、199~201、205、213~240、246、255~256、258~285、299、305~312、314、318~332、335~344、346、350~354、357~360、362、365~370、372~383、388~390、392、394~401、403~407、414~416、418、422、425、428~433、437、444~445、452、455、459~463、470、472~474、476、487~492、525、530~539、545~550、553~555、561~563および567~579のいずれか1つからなる修飾された転移RNA(tRNA)であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目12)
Tアームと、Dアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移RNA(tRNA)であって、
(a)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-UCA-3’であり、かつTGA終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがアルギニン、トリプトファン若しくはグリシンに作動可能に連結されており;
(b)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-UUA-3’であり、かつTAA終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがグルタミン若しくはグルタミン酸に作動可能に連結されており;または
(c)前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが5’-CUA-3’であり、かつTAG終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがトリプトファン、グルタミン酸若しくはグルタミンに作動可能に連結されている;
修飾された転移RNA(tRNA)。
(項目13)
前記Tアームが伸長因子1-α1(EF1α)との相互作用を増強しまたは調整する合理的なヌクレオチド置換を含む、項目12に記載の修飾されたtRNA。
(項目14)
オリゴヌクレオチドが150ヌクレオチド未満の全長を有する、項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAをコードするオリゴヌクレオチド配列。
(項目15)
第一のオリゴヌクレオチド配列と第二のオリゴヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドであって、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が、項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAを独立にコードし、前記第一および第二のオリゴヌクレオチドが150ヌクレオチド未満の全長を独立に有し、前記2つの配列がタンデムである、オリゴヌクレオチド。
(項目16)
前記オリゴヌクレオチドがDNAである、項目15に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目17)
プロモーターと、項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAをコードする核酸または項目14~16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド配列とを含む発現カセット。
(項目18)
項目14~16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは項目17に記載の発現カセットを含むベクター。
(項目19)
前記ベクターがウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、項目18に記載のベクター。
(項目20)
項目1~13のいずれか一項に記載の修飾されたtRNAと、項目14~16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、または項目18若しくは19に記載のベクターと、
薬学的に許容され得る担体と、
を含む、組成物。
(項目21)
前記担体がリポソームである、項目20に記載の組成物。
(項目22)
項目18または19に記載のベクターを含む細胞。
(項目23)
終止コドン関連遺伝子疾患を処置する方法であって、終止コドン関連遺伝子疾患を処置することを必要とする患者に、項目20または21に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目24)
未成熟終止コドンと関連する前記遺伝子疾患が、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β-サラセミアまたはリドル症候群である、項目23に記載の方法。
(項目25)
細胞中のナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への翻訳を回復させる方法であって、項目20または21に記載の組成物を前記細胞に導入することを含み、修飾されたtRNAが、ナンセンス変異を含む前記ヌクレオチド配列への翻訳を回復させる、方法。
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