JP2021502078A - ＡＣＥ−ｔＲＮＡによる遺伝子再割り当てを介して終止コドンをレスキューする方法 - Google Patents

ＡＣＥ−ｔＲＮＡによる遺伝子再割り当てを介して終止コドンをレスキューする方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）に関連する疾患および障害を治療するための組成物および方法であって、アンチコドン編集（ＡＣＥ）ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）を含むか、またはそれをコードする核酸分子の投与を含む、方法を提供する。具体的には、方法は、関連障害を治療するためにＵＧＡ、ＵＡＡ、またはＵＡＧに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを対象に投与することを含む。さらに、ＡＣＥ−ｔＲＮＡの核酸配列が開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月２日に出願された米国仮出願第６２／５８０，８８７号、および２０１８年６月２０日に出願された米国仮出願第６２／６８７，０１５号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
連邦主催研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ ＧＭ１０６５６９の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
ＤＮＡ分子は、ＤＮＡポリマーを構成するヌクレオチド塩基の配列の形態で遺伝子情報を担持する。ＤＮＡには、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの４つのヌクレオチド塩基のみが利用される。この情報は、３つの連続する塩基のコドンの形態で、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームによって翻訳され、タンパク質を形成する。ＲＮＡには、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルの４つのヌクレオチド塩基が利用される。遺伝暗号は、トリプレットコドンと特定のアミノ酸との関係である。６４個の可能性のあるコドントリプレット型は、遺伝暗号を形成し、３個の終止（終結とも呼ばれる）コドンは、特定のコドンでのタンパク質産生を終止するための翻訳機械（細胞リボソーム）にシグナルを提供する。コード内の他の６１個のトリプレットは、２０個の標準アミノ酸のうちの１つに対応する。図１を参照されたい。
ＤＮＡは、リボソームによって翻訳され、ＤＮＡによって特異的に提供される遺伝子指示に従って、各アミノ酸を１つ１つ結合させてポリペプチドを形成する。リボソームが終止コドンに到達すると、タンパク質の伸長が終了する。３つの終止コドンは、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、およびＵＧＡ（オパール）である。アミノ酸コードコドンを終止コドンに変更する変異は「ナンセンス変異」と呼ばれる。これらのナンセンス変異は、ポリペプチド配列の有意なトランケーション／短縮をもたらし得、遺伝子表現型の深刻な変化を引き起こし得る。したがって、発現を指示する遺伝子が存在し得るにもかかわらず、リボソームが突然変異終止シグナルに到達すると、翻訳を終了し、未完成のタンパク質をもたらすため、重要なタンパク質が産生されないことがあり得る。
転移ＲＮＡは、リボソーム上のｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する。各ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の相補的コドンとハイブリダイズする「アンチコドン」領域を含有する。その指定されたアミノ酸を担持するｔＲＮＡは、「荷電（ｃｈａｒｇｅｄ）」ｔＲＮＡと呼ばれる。ｔＲＮＡが６１個のアミノ酸関連（すなわち、終止シグナル関連ではない）ｔＲＮＡのうちの１つである場合、通常、そのアミノ酸を伸長するペプチドに結合させる。ｔＲＮＡの構造遺伝子は、約７２〜９０ヌクレオチド長であり、クローバーリーフ構造に折り畳まれる。ｔＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、成熟ｔＲＮＡコード配列の一部となるそれら自身の遺伝子内スプリットプロモーターを含有する（Ｓｈａｒｐ Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈａａｃｋ Ｊ．，Ｃｏｏｌｅｎ Ｌ．，Ｂｕｒｋｅ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｏｌｌ Ｄ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔＲＮＡ ｇｅｎｅｓ”，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９：１０７−１４４（１９８５）、Ｇｅｉｄｕｓｃｈｅｋ Ｅ．Ｏ．，ａｎｄ Ｔｏｃｃｈｉｎｉ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：８７３−９１４（１９８８））。
「ナンセンスサプレッサー」は、「終止」シグナルをトリガーする代わりに、終結コドンに応答するアミノ酸を挿入するよう、変更されたアンチコドンを含有するｔＲＮＡ遺伝子の対立遺伝子である。例えば、オーカー変異は、ｍＲＮＡ中のＵＡＡコドンの作製をもたらす。オーカーサプレッサー遺伝子は、ＵＡＡ部位にアミノ酸を挿入するＡＵＵアンチコドンを有するｔＲＮＡを産生し、これにより、通常、翻訳における終止を引き起こすコドンの存在にもかかわらず、ｍＲＮＡの継続的な翻訳を可能にする。
多くのナンセンスサプレッサーｔＲＮＡ対立遺伝子が、原核生物と、酵母およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ等の真核生物において同定されている。異なるサプレッサーｔＲＮＡは、それらの抑制効率において異なる。大腸菌および他の系では、アンバーサプレッサーは比較的効率的であり、オーカーサプレッサーは効率的ではなく、オパールは最も少ないが、これはアンバーコドンがタンパク質合成を終結させるために使用される頻度が低く、オーカーコドンおよびオパールコドンが自然終結シグナルとして使用される頻度が高いことを示唆する。
ＤＮＡ青写真に望ましくない誤りがあると、病気の原因になり得る。例えば、青写真の最後ではなく、タンパク質の中間に予期せぬ「停止」シグナルが発生することにより、機能が変化した、または全く機能がない切断または短縮タンパク質が産生される。嚢胞性線維症（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６３，８２７−８３４）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８０，１５５−１６５）、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０２，３６１−３７０）、β ｏ−サレセミア（ｔｈａｌｅｓｓｅｍｉａ）（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｋａｎ，１９７９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，７６，２８８６−２８８９）、シスチン症（Ｋａｌａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２０，４３９−４４６）、Ｘ連鎖性腎性尿崩症（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２，１０３−１０６）、ハーラー症候群（Ｂａｌｌａｂｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７９３，６８４−６９６）、アッシャー症候群１１、多発性嚢胞腎疾患、リドル症候群、色素性乾皮症、ファンコニー貧血、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５３関連癌（例えば、ｐ５３扁平上皮（ｓｑｕａｍａｌ）細胞癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌）、食道癌、骨癌、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、肝細胞癌、線維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性逆転、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病、が含まれる多くのヒトの疾病は、タンパク質のＤＮＡリーディングフレームにおける不要な終止シグナルに起因する。加えて、ナンセンス変異は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびＡＴＭ内で生じ、さらに、それらの疾患における役割を示唆する。したがって、ＰＴＣは、全遺伝子疾患の１０〜１５％を占める、全世界で３０００万人を超える人々に罹患する、ユニークな疾患群を表す。
したがって、ＰＴＣに関連する疾患および障害の治療のために複数のｔＲＮＡ遺伝子ファミリーに一般化可能な組成物および方法が当該技術分野において必要である。本発明は、当該技術分野におけるこの満たされていないニーズに対処する
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｔアーム、Ｄアーム、およびアンチコドンアームならびにアクセプターアームを含む修飾転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供し、このＴアームは、伸長因子１−α１（ＥＦ１α）と相互作用するヌクレオチドを有するＴステムを含む。ＥＦ１αは、アミノアシル−ｔＲＮＡをリボソームに補充し、ｔＲＮＡが脱アシル化されないように保護する。合理的なヌクレオチド置換は、調整したｔＲＮＡ：リボソームへのｔＲＮＡ送達および脱アシル化からの保護を増強するＥＦ１α相互作用、を生じる。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５（チミジンは、ウラシルで置き換えられる）の修飾転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１〜５３８（チミジンは、ウラシルで置き換えられる）のいずれか１つの修飾転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供する。
ある特定の実施形態では、修飾ｔＲＮＡは、配列番号５６〜６０、６２〜６６、８４〜８６、９０〜１１１、１１３、１２８〜１４３、１４７ 〜１４９、１５３〜１５６、１６１〜１７４、１７６、１７８、１８１、１８４〜１８６、１９２、１９６〜１９７、１９９〜２０１、２０５、２１３〜２４０、２４６、２５５〜２５６、２５８〜２８５、２９９、３０５〜３１２、３１４、３１８〜３３２、３３５〜３４４、３４６、３５０〜３５４、３５７〜３６０、３６２、３６５〜３７０、３７２〜３８３、３８８〜３９０、３９２、３９４〜４０１、４０３〜４０７、４１４〜４１６、４１８、４２２、４２５、４２８〜４３３、４３７、４４４〜４４５、４５２、４５５、４５９〜４６３、４７０、４７２〜４７４、４７６、４８７〜４９２、５２５、５３０〜５３９、５４５〜５５０、５５３〜５５５、５６１〜５６３、および５６７〜５７９（チミジンは、ウラシルで置き換えられる）のうちのいずれか１つである。
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｔ−ステム、Ｄ−ステム、およびアンチコドンループ、ならびにアクセプターステムを含む修飾転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供し、（ａ）アンチコドンアームはトリヌクレオチドアンチコドンを含み、アンチコドンは５’−ＵＣＡ−３’であり、ＴＧＡ終止コドンを認識し、かつ、アクセプターアームはアルギニン、トリプトファンまたはグリシンに作動可能に連結する、（ｂ）アンチコドンアームはトリヌクレオチドアンチコドンを含み、アンチコドンは５’−ＵＵＡ−３’であり、ＴＡＡ終止コドンを認識し、かつアクセプターアームはグルタミンまたはグルタミン酸に作動可能に連結する、または（ｃ）アンチコドン−アームはトリヌクレオチドアンチコドンを含み、アンチコドンは５’−ＣＵＡ−３’であり、ＴＡＧ終止コドンを認識し、かつアクセプターアームはトリプトファン、グルタミン酸またはグルタミンに作動可能に連結する。ある特定の実施形態では、Ｔアームは、ＥＦ １αとの相互作用を調整し、その抑制活性を増強し、それによってその治療可能性を増加させる、合理的に変化したヌクレオチド配列を含む。ＥＦ １αとの相互作用を調整したｔＲＮＡは、強化したナンセンス抑制を有し、向上した治療特性を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、上述の修飾ｔＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド配列を提供し、このオリゴヌクレオチドは、１５０ヌクレオチド未満の全長を有する。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである。
ある特定の実施形態では、本発明は、第１のオリゴヌクレオチド配列および第２のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供し、第１のオリゴヌクレオチド配列および第２のオリゴヌクレオチド配列は、上述の修飾ｔＲＮＡを独立してコードし、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、１５０ヌクレオチド未満の全長を独立して有し、２つの配列はタンデム型である。
ある特定の実施形態において、本発明は、プロモーターと、上述の修飾ｔＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドをコードする核酸とを含む発現カセットを提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、上述のオリゴヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。
ある特定の実施形態では、本発明は、上述の修飾ｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、担体はリポソームである。
ある特定の実施形態では、本発明は、上述のベクターを含む細胞を提供する。
本発明は、上述の修飾ｔＲＮＡ組成物を、疾患の治療を必要とする患者に投与することを含む、終止コドンに関連する遺伝子疾患を治療する方法を提供する。
ある特定の実施形態では、未成熟終止コドンに関連する遺伝子疾患は、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β−サラセミアまたはリドル症候群である。
ある特定の実施形態では、本発明は、細胞内のナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への翻訳を復元する方法であって、上述の組成物を細胞に導入することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＮａｎｏＬｕｃを含むルシフェラーゼ酵素のナンセンスコドンの抑制を用いたハイスループットクローニングおよびスクリーニングによって、アンチコドン編集（ＡＣＥ）ｔＲＮＡを識別する方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、疾患の治療を必要とする対象におけるＰＴＣに関連する疾患を治療する方法であって、ＡＣＥ−ｔＲＮＡまたはそれをコードする核酸分子を含む少なくとも１つの組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、この疾患は、ＵＧＡ ＰＴＣに関連する疾患または障害であり、この方法は、ＵＧＡに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む。
ある特定の実施形態では、この疾患は、ＵＡＡ ＰＴＣに関連する疾患または障害であり、この方法は、ＵＡＡに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む。
ある特定の実施形態では、この疾患は、ＵＡＧ ＰＴＣに関連する疾患または障害であり、この方法は、ＵＡＧに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む。
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含み、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡの各々は、少なくとも２つの異なるアミノ酸分子をポリペプチド鎖に組み込むために特異的である。
ある特定の実施形態では、本方法は、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含み、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡの各々は、同じアミノ酸分子をポリペプチド鎖に組み込むために特異的である。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡが同じ核酸分子上にコードされる。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡは、異なる核酸分子上にコードされる。
ある特定の実施形態において、本方法は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡArg、ＡＣＥ−ｔＲＮＡGly、およびＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpからなる群から選択されるＵＧＡに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む。
ある特定の実施形態では、疾患は、デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、網膜芽細胞腫、神経線維腫症、毛細血管拡張性運動失調症、テイ・サックス病、嚢胞性線維症、ウィルムス腫瘍、血友病Ａ、血友病Ｂ、メンケス病、ウルリッヒ病、β−サラセミア、２Ａ型および３型フォン・ヴィレブランド病、ロビノウ症候群、短指症Ｂ型（指および中手骨の短縮）、マイコバクテリア感染に対する遺伝的感受性、遺伝性網膜疾患、遺伝性出血傾向、遺伝性失明、先天性感音難聴および結腸無神経節症（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｇａｎｇｌｉｏｓｉｓ）ならびに感音難聴、結腸無神経節症、末梢神経障害および中枢性髄鞘形成不全性白質ジストロフィーを含む遺伝性神経発達障害、リドル症候群、色素性乾皮症、ファンコニー貧血、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５３関連癌（例えば、ｐ５３扁平上皮（ｓｑｕａｍａｌ）細胞癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌）、食道癌、骨癌、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、肝細胞癌、繊維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性転換、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病、からなる群から選択される。
遺伝暗号表。 ｔＲＮＡは、Ｔアーム、Ｄアーム、およびアンチコドンアーム、ならびにアクセプターアームを含む一般的な４アーム構造を有する。これらの腕は全体を通して「ループ」とも呼ばれる。 ナンセンス抑制のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡ（Ｈ．Ｓａｐｉｅｎｓ ｔＲＮＡTrp TGA）。 機能的なＡＣＥ ｔＲＮＡ配列を同定するために使用されるベクターにコードされるアンチコドン編集（ＡＣＥ）−ｔＲＮＡ。このベクター配列には、ナノルシフェラーゼレポーター系が含まれる。描写されたベクターを使用して、ＴＧＡ抑制を有するＡＣＥ ｔＲＮＡを同定した。適切なｔＲＮＡ選別に対してＴＡＡおよびＴＡＧバリアントを使用した（図１４〜１７を参照されたい）。 サプレッサーｔＲＮＡを介した終止コドンによるタンパク質およびイオンチャネルのレスキューの概略図。 ヒトＡＣＥ−ｔＲＮＡによるナンセンスコドンレスキュー。図６Ａ．アンチコドン編集（ＡＣＥ）Ｔｒｐ ｔＲＮＡおよびｃｈｅｒｒｙ−ＴＧＡ−ｅＧＦＰ−ＨＡ構築物の概略図。 ヒトＡＣＥ−ｔＲＮＡによるナンセンスコドンレスキュー。図６Ｂ．ＡＣＥトリプトファンｔＲＮＡ ＃４によるｃｈｅｒｒｙ ＴＧＡ ｅＧＦＰ−ＨＡ構築物のレスキュー。 ヒト疾患において観察されたナンセンスコドンの理論的根拠および有病数。２０個の天然アミノ酸コドンは、そのヒト疾患への貢献度に関してランク付けされ、暗色のクロスハッチしたコドンが最も優勢で（ＴＧＧ、ＴＡＣ、ＴＡＴ、ＴＣＡ、およびＴＴＡ）、および点描したコドンが最も少ない。全てのクロスハッチドコドン配列は、意図されるアミノ酸から終止コドンに変換するために単一のヌクレオチド変異を必要とする。右パネル、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）内の最も一般的な疾患原因となるナンセンスコドン。本明細書では、示された変異の修復のために新規なｔＲＮＡ配列が発見されている。 トリプトファン−ＴＧＡおよびグリシン−ＴＧＡの修復のためのｔＲＮＡ配列の同定。左軸は、ルシフェラーゼ活性のバックグラウンドの上の倍数を示す。変異型アンチコドンループを有する多数のｔＲＮＡは、レスキュー活性を欠く。 Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２ ＡＣＥ−ｔＲＮＡによるＣＦＴＲ１２８２ｘのレスキュー。示されるｔＲＮＡとともにＨＥＫ細胞内で共発現したＣＦＴＲ Ｗ１２８２Ｘチャネルの生化学的ウエスタンブロットデータ。示されるｔＲＮＡの４コピーを含有する発現ベクターは、ＣＦＴＲタンパク質のより高いレスキューを示す。「Ｃ」バンドは、完全に成熟したグリコシル化ＣＦＴＲタンパク質のレスキューを示す。使用した抗体は、１：１０００希釈で嚢胞性線維症治療薬由来のＭ３Ａ７であった。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡGlyの発現により、同族アミノ酸がナンセンスコドンに特異的に組み込まれる。図１０Ａ）モデルタンパク質ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）−Ｈｉｓ−ＳｔｒｅｐＮ９４−ＴＧＡと、ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp（左）およびＡＣＥ−ｔＲＮＡGly（右）の同時発現は、親和性精製後に銀染色によって検出可能な全長ＨＤＨタンパク質（アスタリスク）が生成される。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡGlyの発現により、同族アミノ酸がナンセンスコドンに特異的に組み込まれる。図１０Ｂ）ＷＴ ＨＤＨ（上）、ＨＤＨ−Ｎ９４＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡGly（中）、およびＨＤＨ−Ｎ９４＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp（下）のスペクトル。スペクトルは、グリシン（−５７Ｄａ）およびトリプトファン（＋７２Ｄａ）と特異的に一致するＮ９４位のアミノ酸質量差を強調し、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ同族アミノ酸の挿入を示す。 ｔＲＮＡライブラリの構築のためのクローニングワークフロー。 ｔステム領域内のヌクレオチドの標的変異は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡレスキュー機能をさらに増強する。図１２Ａ．Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９をｔステム領域内で系統的に変異誘発させた。これらの試みは、ＡＣＥ ｔＲＮＡ ＴＳ−１０５２−６２Ｇ−Ｃ、（図１２Ｂ）およびクロスハッチングバーを図で特定し、これは、約２５０％増加した生物学的活性を示す。 ｔステム領域内のヌクレオチドの標的変異は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡレスキュー機能をさらに増強する。図１２Ａ．Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９をｔステム領域内で系統的に変異誘発させた。これらの試みは、ＡＣＥ ｔＲＮＡ ＴＳ−１０５２−６２Ｇ−Ｃ、（図１２Ｂ）およびクロスハッチングバーを図で特定し、これは、約２５０％増加した生物学的活性を示す。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制よりも効率的である。図１３Ａ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp＃５および図１３Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡGly＃１６を、ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧナンセンスコドンを含有するＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミドにクローニングした。ナンセンス抑制は、トランスフェクション後のＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡ構築物においてのみ測定された。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制よりも効率的である。図１３Ａ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp＃５および図１３Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡGly＃１６を、ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧナンセンスコドンを含有するＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミドにクローニングした。ナンセンス抑制は、トランスフェクション後のＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡ構築物においてのみ測定された。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制よりも効率的である。図１３Ｃおよび図１３Ｄ）ＨＥＫ２９３細胞において、ゲンチマイシン（４０ｕＭ）およびＧ４１８（１５０ｕＭ）を添加、およびＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp＃５およびＡＣＥ−ｔＲＮＡGly＃１６との同時トランスフェクションによるＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡの抑制を、図１３Ｃ）２４時間および図１３Ｄ）４８時間測定した。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制よりも効率的である。図１３Ｃおよび図１３Ｄ）ＨＥＫ２９３細胞において、ゲンチマイシン（４０ｕＭ）およびＧ４１８（１５０ｕＭ）を添加、およびＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp＃５およびＡＣＥ−ｔＲＮＡGly＃１６との同時トランスフェクションによるＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡの抑制を、図１３Ｃ）２４時間および図１３Ｄ）４８時間測定した。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制よりも効率的である。図１３Ｅおよび図１３Ｆ）ＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞をゲンチマイシン（４０ｕＭ）およびＧ４１８（１５０ｕＭ）で処理し、およびＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp＃５およびＡＣＥ−ｔＲＮＡGly＃１６でトランスフェクションした。ナンセンス抑制を、処置後、図１３Ｅ）２４時間および図１３Ｆ）４８時間で測定した。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制よりも効率的である。図１３Ｅおよび図１３Ｆ）ＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞をゲンチマイシン（４０ｕＭ）およびＧ４１８（１５０ｕＭ）で処理し、およびＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp＃５およびＡＣＥ−ｔＲＮＡGly＃１６でトランスフェクションした。ナンセンス抑制を、処置後、図１３Ｅ）２４時間および図１３Ｆ）４８時間で測定した。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ａｒｇ−ＴＧＡ。アルギニン−ＴＧＡナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定 ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ ＴＡＧ。グルタミンＴＡＧナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定。 グルタミンＴＡＡナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡ−ＧｌｎＴＡＡの同定。 グルタミン酸−ＴＡＧナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ ＴＡＧの同定。 グルタミン酸ＴＡＡナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ ＴＡＡの同定。 トリプトファンＴＡＧナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ ＴＡＧの同定。 小分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達は、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強力な抑制を支持する。図２０Ａ）ナンセンス変異を引き起こすＧ５４２ＸまたはＷ１２８２Ｘ嚢胞性線維症を有するＣＦＴＲ ｃＲＮＡを、それぞれ事前に折り畳まれたＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐの連続希釈液とともにＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中に同時注入した。ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の２極電圧クランプ記録を３６時間後に行った。 小分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達は、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強力な抑制を支持する。電流電圧関係は、図２０Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐおよび図２０Ｃ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙの事前折り畳まれたＲＮＡの増加量は、ＣＦＴＲ機能（測定されたＣＦＴＲ Ｃｌ−電流）の増加をもたらし、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ実験においてＷＴ ＣＦＴＲが達成されたことを示す。 小分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達は、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強力な抑制を支持する。電流電圧関係は、図２０Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐおよび図２０Ｃ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙの事前折り畳まれたＲＮＡの増加量は、ＣＦＴＲ機能（測定されたＣＦＴＲ Ｃｌ−電流）の増加をもたらし、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ実験においてＷＴ ＣＦＴＲが達成されたことを示す。 小分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達は、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強力な抑制を支持する。図２０Ｄ）Ｇ５４２Ｘ ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（黒丸）およびＷ１２８２Ｘ ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（白四角）レスキューの用量応答（＋４０ｍＶで誘発されたＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を＋４０ｍＶでＷＴ ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流に正規化した）。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（ＥＣ５０＝約２０ｎｇ、ヒル係数約１．４）の用量依存性は、ＷＴ ＣＦＴＲレベルで明確な飽和度を示し、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐは、右シフトである（ＥＣ５０＝約９４ｎｇ、ヒル係数１．２４）。 候補アンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）を同定するためのナンセンス変異抑制選別。図２１Ａは、概略図は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡと翻訳機構との必要な相互作用を示す。送達後、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、内在性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって認識され、それらの同族アミノ酸で荷電（アミノアシル化）される。アミノアシル化ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡが脱アシル化されないように保護し、未成熟終止コドン、この場合ＵＧＡを抑制するためにアミノアシルＡＣＥ−ｔＲＮＡをリボソームに送達する内在性伸長因子１−αによって認識される。 候補アンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）を同定するためのナンセンス変異抑制選別。図２１Ｂは、個々のＡＣＥ−ｔＲＮＡを、ＣｃｄＢ陰性選択と対合したゴールデンゲートを使用して、ハイスループットクローニングナンセンスレポータープラスミドにクローニングした。オールインワンプラスミドは、酵素性大ビットと必要なＣ末端小ビットとの間に、ＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡ ＰＴＣのいずれかを有するＮＬｕｃルシフェラーゼレポーターをｐ．１６２に含有する。 ハイスループットクローニングナンセンス変異レポータープラットフォームを有するＡＣＥ−ｔＲＮＡ遺伝子ファミリーのスクリーニング。示されるアンチコドン編集ＰＴＣ配列を、内在性アンチコドン配列から離れた１つのヌクレオチドである各ＡＣＥ−ｔＲＮＡファミリーについて試験した（図２５）。各クラスについて、複数の高性能サプレッサーｔＲＮＡを同定した。データは、正規化されたＮＬｕｃ発光に関して、Ｌｏｇ１０スケールで示される。各ｔＲＮＡデータセットを３回に分けて取得し、ＳＥＭで表示し、対応するＡＮＯＶＡ統計解析を表２に示す。コードされた同一性および対応するｔＲＮＡ配列をそれぞれ図２６および表９に示す。 操作ｔＲＮＡによる同族コード化および高忠実度抑制。図２３Ａは、「Ｘ」が抑制ＰＴＣコドンを示す、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）のトリプシン断片。ＷＴ（上）、Ｎ９４Ｇ（中）、およびＮ９４Ｗ（下）ＨＤＨについてのｙおよびｂイオンの質量を有するトリプシンフラグメントのＭＳ／ＭＳスペクトル。ｂ９イオン質量は、ＷＴアスパラギンからの−５７Ｄａおよび＋７２Ｄａの予測質量によってシフトされ、それぞれＡＣＥ−ｔＲＮＡGlyおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpによる同族アミノ酸グリシンおよびトリプトファンのコード化を示している。 操作ｔＲＮＡによる同族コード化および高忠実度抑制。図２３Ｂは、ＡＣＥ−ＴＧＡ−ｔＲＮＡGly（Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔ２）は、一時的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞におけるＵＧＡ終止コドンを選択的に抑制する。 操作ｔＲＮＡによる同族コード化および高忠実度抑制。図２３Ｃ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡGlyトランスフェクションは、ＮＬｕｃ−ＵＧＡを安定して発現するＨｅｋ２９３細胞内で４８時間のインキュベーション後、ゲンタマイシン（４０ｕＭ）およびＧ４１８（１４０ｕＭ）の両方を上回る性能を有する。 トランスクリプトーム全体の３’ＵＴＲ上のＡＣＥ−ｔＲＮＡのリボソームプロファイリング。図２４Ａは、材料および方法に記載されるように、対照（ｐｕｃ５７ＧＧ空ベクター）に対する処置細胞の読み取りデータに対するｌｏｇ２倍数変化として、３’ＵＴＲ上のリボソームフットプリント密度をプロットする。転写産物を、それらの内在性ＴＡＡ、ＴＡＧ、およびＴＧＡ終止コドンによってグループ化した。各点は、転写産物の２つの複製の平均を表す。エラーバーは、ｌｏｇ２倍変化の平均±ＳＤを示す。 トランスクリプトーム全体の３’ＵＴＲ上のＡＣＥ−ｔＲＮＡのリボソームプロファイリング。図２４Ｂ、トランスクリプトーム（１８，１０１配列）の−５０〜＋５０ｎｔの周囲終止コドンの各ヌクレオチドについて、正規化リボソームフットプリント占有率の平均対数２倍の変化をプロットした。図画は、リボソームＡ部位におけるリボソームフットプリントの５’末端から終止コドンの第１のベース位置までの約１５ｎｔのオフセットを図示する。 一般的なＰＴＣのためのコドン使用。クロスハッチングは、ヌクレオチド置換を介して終止コドンに変換され得る最も一般的なコドンおよび対応するアミノ酸型を示す。タイプごとに操作されたｔＲＮＡが開発されている。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性プロットを参照した数。 グリシンｔＲＮＡ配列の整列化。２１ｔＲＮＡＧｌｙヒト配列は、ｔＲＮＡクレード間の高い配列相同性を示す。ｔＲＮＡ画像におけるパターンは、配列におけるパターン化されたボックスに対応する。 ナノルシフェラーゼのｐ．１６２における側鎖同一性は活性に影響を及ぼさない。総発光活性は、部位における各変異について示される。 複数種およびサプレッサーｔＲＮＡ変異由来のＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp配列の分析。図２９Ａ〜２９Ｂ配列アライメント図。 複数種およびサプレッサーｔＲＮＡ変異由来のＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp配列の分析。図２９Ａ〜２９Ｂ配列アライメント図。 複数種およびサプレッサーｔＲＮＡ変異由来のＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp配列の分析。図２９ＣＢＮＬｕｃ−ＵＧＡ＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp／ＮＬｕｃ−ＵＧＡ。 ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）Ｈｉｓ（８）−ストレプタクチン発現構築物は、ＨＥＫ２９３細胞からタンパク質を効率的に１段階で単離することを可能にする。図３０Ａ）ＨＤＨ発現構築物のタンパク質配列。下線配列は、質量分析による適用範囲を示す。太字の下線アスパラギン（アミノ酸９４位）は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ忠実度を決定するためのＴＧＡ ＰＴＣに変異した残基である。デュアルアフィニティｔａｇは太字斜体で示される。 ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）Ｈｉｓ（８）−ストレプタクチン発現構築物は、ＨＥＫ２９３細胞からタンパク質を効率的に１段階で単離することを可能にする。図３０Ｂ）Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９および図３０Ｃ）Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２によるＰＴＣ抑制後のＨＤＨタンパク質の銀染色。 ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）Ｈｉｓ（８）−ストレプタクチン発現構築物は、ＨＥＫ２９３細胞からタンパク質を効率的に１段階で単離することを可能にする。図３０Ｂ）Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９および図３０Ｃ）Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２によるＰＴＣ抑制後のＨＤＨタンパク質の銀染色。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpについての、終止コドン特異性は維持される。ｔＲＮＡＴｒｐTGAＴｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９についての抑制活性３６、図２２のＴｒｐTGA抑制剤ｔＲＮＡが最良を示す。このｔＲＮＡは、指示されたｐＮａｎｏ−ＳＴＯＰプラスミドと同時発現させた。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、アミノグリコシドＰＴＣ抑制よりも効率的である。図３２Ａ）生のままのおよび図３２Ｂ）正規化された発光は、ＰＴＣレポーターＮｌｕｃ−ＵＧＡを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞で、ゲンタマイシン（４０ｕＭ）、Ｇ４１８（１５０ｕＭ）を添加し、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２でトランスフェクションした２４時間後に測定した。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、アミノグリコシドＰＴＣ抑制よりも効率的である。図３２Ａ）生のままのおよび図３２Ｂ）正規化された発光は、ＰＴＣレポーターＮｌｕｃ−ＵＧＡを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞で、ゲンタマイシン（４０ｕＭ）、Ｇ４１８（１５０ｕＭ）を添加し、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２でトランスフェクションした２４時間後に測定した。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、アミノグリコシドＰＴＣ抑制よりも効率的である。図３２Ｃ）生のままのおよび図３２Ｄ）正規化された発光は、ＨＥＫ２９３細胞で、ゲンタマイシン（４０ｕＭ）、Ｇ４１８（１５０ｕＭ）を添加し、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２を同時トランスフェクションした２４時間後に測定した。 ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、アミノグリコシドＰＴＣ抑制よりも効率的である。図３２Ｃ）生のままのおよび図３２Ｄ）正規化された発光は、ＨＥＫ２９３細胞で、ゲンタマイシン（４０ｕＭ）、Ｇ４１８（１５０ｕＭ）を添加し、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２を同時トランスフェクションした２４時間後に測定した。 ＲＮＡまたはｃＤＮＡとしての送達後のＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性の時間経過の比較。ｐＮａｎｏＬｕｃ−ＵＧＡを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞にＡＣＥ−ｔＲＮＡを送達したが、細胞生存率へのトランスフェクション試薬の影響を低減するため５μｌの反応混合物のみを細胞に添加した。ＲＮＡとして送達されたＡＣＥ−ｔＲＮＡ（白抜き記号）は、ｃＤＮＡ構築物（黒丸）よりもＰＴＣレポーターの発現を救出する際により迅速であった。しかしながら、ｃＤＮＡから発現される場合、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性は４８時間にわたって上昇し続け、ＲＮＡ提供物としては減少した。 ｃＤＮＡおよびＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡによるインビボ送達および抑制。図３４Ａ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡ ＡｒｇもしくはｐＵＣ５７空ベクター、ＮＬｕｃ−ＷＴを有するＮＬｕｃ−ＵＧＡ、または水を脛骨前筋への注入に続いて、ＤＮＡ投与後１、２、および７日目にエレクトロポレーションを行ったマウスの代表的な画像。 ｃＤＮＡおよびＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡによるインビボ送達および抑制。図３４Ｂ）ＤＮＡ注入およびエレクトロポレーション後の異なる時点での上記マウス群の脛骨前筋による発光の定量化（ｎ＝３マウス／群）。 ｃＤＮＡおよびＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡによるインビボ送達および抑制。図３４Ｃ）Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９ｃＲＮＡおよびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２ ＲＮＡ転写産物（ｎ＝３）のトランスフェクション後の安定した発現ＮＬｕｃ−ＵＧＡのレスキューされたルミネセス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅ） ｃＤＮＡおよびＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡによるインビボ送達および抑制。図３４Ｄ）ＷＴ、Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５４２Ｘ＋Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２、Ｗ１２８２Ｘ、およびＷ１２８２Ｘ＋Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９ＣＦＴＲ ｃＤＮＡのトランスフェクション３６時間後の、ＨＥＫ２９３細胞で発現されるＣＦＴＲタンパク質の代表的なウエスタンブロット分析。 ｃＤＮＡおよびＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡによるインビボ送達および抑制。ＷＴ、Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５４２Ｘ＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２、Ｗ１２８２ＸおよびＷ１２８２Ｘ＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９ＣＦＴＲｃＲＮＡを注入した後３６時間の、２極電圧クランプを使用して記録された、例示的なファミリーのＣＦＴＲＣｌ−電流トレースである。電流を−６０ｍＶ〜＋３５ｍＶの５ｍＶ電圧ステップを使用して誘発した。垂直スケールバーおよび水平スケールバーは、それぞれ１０μＡおよび５０ｍｓを示す。 ｃＤＮＡおよびＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡによるインビボ送達および抑制。Ｇ５４２Ｘ ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（黒丸）およびＷ１２８２Ｘ ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（白四角）レスキューの用量応答（＋３５ｍＶで誘発されたＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を＋３５ｍＶでＷＴ ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流に正規化した）。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙレスキューは、発現されたＣＦＴＲ電流のＷＴレベルを達成する。 ＡＣＥ ｔＲＮＡは、筋肉におけるＰＴＣルシフェラーゼタンパク質発現をレスキューする。 ＡＣＥ ｔＲＮＡは、皮膚におけるＰＴＣルシフェラーゼタンパク質発現をレスキューする。
長年にわたって、研究者は、ヒト遺伝子に確立されているナンセンスコドンをもたらした何百ものユニークな点変異を特定してきた。これらの種類の変異は、例えば、デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、網膜芽細胞腫、神経線維腫症、毛細血管拡張性運動失調症、テイ・サックス病、嚢胞性線維症、ウィルムス腫瘍、血友病Ａ、血友病Ｂ、メンケス病、ウルリッヒ病、β−サラセミア、２Ａ型および３型フォン・ヴィレブランド病、ロビノウ症候群、短指症Ｂ型（指および中手骨の短縮）、マイコバクテリア感染に対する遺伝的感受性、遺伝性網膜疾患、遺伝性出血傾向、遺伝性失明、先天性感音難聴および結腸無神経節症ならびに感音難聴、結腸無神経節症、末梢神経障害および中枢性髄鞘形成不全性白質ジストロフィーを含む遺伝性神経発達障害、リドル症候群、色素性乾皮症、ファンコニー貧血、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５３関連癌（例えば、ｐ５３扁平上皮（ｓｑｕａｍａｌ）細胞癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌）、食道癌、骨癌、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、肝細胞癌、繊維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性転換、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病、を引き起こす。乳癌に関連するＢＲＡＣＡ−１およびＢＲＡＣＡ−２遺伝子はまた、同様の変異を有する。
数百個のヒトｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、既知であり、一般にＧｅｎｂａｎｋなどの供給源を通じて当業者に利用可能である。ｔＲＮＡの構造は高度に保存されており、ｔＲＮＡは種を越えて機能することが多い。したがって、細菌または他の真核生物ｔＲＮＡ配列は、本発明の安定化ｔＲＮＡのオリゴヌクレオチドの潜在的な供給源でもある。特定のｔＲＮＡ配列が所望の哺乳類細胞において機能するかどうかの判定は、日常的な実験を通じて確認することができる。まだ知られていないさらなる追加の可能性のあるｔＲＮＡ配列は、日常的な実験を通じて安定化されるために、本明細書に記載されるように修飾され得る。
ｔＲＮＡ遺伝子は、全ての細胞型において活性である強力なプロモーターを有する。真核生物ｔＲＮＡ遺伝子のプロモーターは、ｔＲＮＡ分子自体をコードする構造配列内に含まれる。５′上流領域内に転写活性を制御するエレメントがあるが、活性な転写単位の長さは、５００塩基対よりかなり短くてもよく、したがって、送達ベクター内での収容は容易である。それらが転写および処理されると、ｔＲＮＡは、低い分解率を有する。最後に、ナンセンスサプレッサーによる遺伝子治療は、ナンセンスコドンを含有する標的遺伝子に対する内因性生理学的制御を維持する。
ナンセンス変異
転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列のタンパク質への解読で機能するＲＮＡ分子の一種である。ｔＲＮＡは、翻訳中にリボソーム内の特定の部位で機能し、ｍＲＮＡ分子からタンパク質を合成する。未成熟終止コドン（ＰＴＣ）とも呼ばれるナンセンス変異は、ヒト疾患を引き起こす単一塩基対変異の約１０〜１５％を占め、嚢胞性線維症はそれに倣う。（Ｐｅｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ．，６４：４０７−２５，２０１３）。一般に、ナンセンス変異は、遺伝子発現および活性がほぼ完全に失われ、切断された生成物の優性阻害効果の可能性があるため、ミスセンス変異よりも深刻な影響を有する。ＰＴＣは、ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）経路を介して、早期翻訳終止および加速度的なｍＲＮＡ転写産物分解をもたらす。
現在の研究は、ｔＲＮＡがそのアミノ酸を送達するＲＮＡ転写産物内の特異的部位を、ｔＲＮＡ内のアンチコドン配列の分子編集によって変更することができることを示す。このアプローチにより、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を、有効かつ治療的に元の失われたアミノ酸に戻すことが可能になった。アンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）は、新しいクラスの生物学的治療剤を形成する。
操作されたｔＲＮＡは、疾患を引き起こすナンセンスコドンを特定のアミノ酸に「再編集」することを可能にする。これらの操作されたｔＲＮＡは、ＴＡＣまたはＴＡＡを介したＴＧＡなどの１つのタイプの終止コドンのみを標的とする。これらのｔＲＮＡ分子の小さなサイズは、ｔＲＮＡ＋プロモーターがわずか約３００ｂｐであるため、それらを迅速に発現させるのに適している。簡潔に述べると、ヒト細胞内で機能するｔＲＮＡ遺伝子の構造要素を含むオリゴヌクレオチドが合成される。このオリゴヌクレオチドの配列は、ｔＲＮＡのアンチコドン領域で行われた置換で既知の配列に基づいて設計され、特異的ｔＲＮＡに、ナンセンスまたは他の特異的変異を認識させる。
リボソームとの相互作用を通じてナンセンス終止コドンを抑制するためにいくつかの小分子選別が行われ、最も優れた分子はＧ４１８、ゲンタマイシン、およびＰＴＣ１２４である。ＰＴＣ１２４またはアタルレンは、最近、嚢胞性線維症治療薬のための使用として、第３相臨床試験から解放されている。アタルレンおよびアミノグリコシドは、ナンセンス変異をミスセンス変異に変える近同族アミノ酸を入れることによって、３つのナンセンスコドンのそれぞれのリードスルーを促進する。（Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１６ Ｎｏｖ １；１１３（４４）：１２５０８−１２５１３）
アンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）
ｔＲＮＡは、Ｔアーム、Ｄアーム、およびアンチコドンアーム、ならびにアクセプターアームを含む一般的な４アーム構造を有する（図２）。
Ｔアームは、「Ｔステム」と「ＴΨＣループ」で構成されている。”ある特定の実施形態では、Ｔステムは、修飾されてｔＲＮＡの安定性を増加させる。ある特定の実施形態では、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、内在性Ｔステム配列と比較して終止部位を抑制するための生物活性を増加させる修飾Ｔステムを有する。
一実施形態における本発明は、多種多様なナンセンス変異関連疾患を治療するために、より高い有効性で使用され得る安定化ｔＲＮＡを含む組成物を含む。表１〜８の以下の配列はＤＮＡとして記載されるが、ＲＮＡ（転写ＤＮＡ）として、「Ｔ：チミジン」は「Ｕ：ウラシル」である。したがって、以下の配列から転写されるｔＲＮＡは、全て、チミジンの代わりにウラシルを含有する。
ある特定の実施形態では、ｔＲＮＡは、以下の配列を有する（ここで、チミジンは、ウラシルで置き換えられる）：
一実施形態において、ナンセンス抑制のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡは、図３（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ｔＲＮＡTrp TGA）に示されるものである。
本発明によれば、ヒトＵＡＡ、ＵＡＧ、およびＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡが設計されている。画面は、Ｔｒｐ−ＴＧＡ、Ｔｒｐ−ＴＡＧ、Ａｒｇ−ＴＧＡ、Ｇｌｎ−ＴＡＧ、Ｇｌｎ−ＴＡ、Ｇｌｕ−ＴＡＧ、Ｇｌｕ−ＴＡＡの修復のためのコドン編集ｔＲＮＡを特定している。ｔＲＮＡは、約１００ヌクレオチド長であり、野生型アミノ酸が存在するはずのナンセンスコドン変異を抑制するために細胞に導入することができる。オリゴヌクレオチドは、レシピエント細胞に直接導入され得るか、またはオリゴヌクレオチドの効力を高めるためにタンデムに連結することができる。
発現カセットとベクター
ある特定の実施形態では、ＡＣＴ−ｔＲＮＡは、発現カセットによってコードされる。さらに別の実施形態では、本発明のサプレッサーｔＲＮＡは、ベクターの使用を通じて標準的な従来の遺伝子工学技術を使用して細胞に導入され得る。ｔＲＮＡをコードする配列の内部プロモーター配列のため、ｔＲＮＡ配列を、提供することができるが、別個の転写単位に含める必要はない。
本発明の一実施形態において、本発明のヌクレオチド発現系は、適切な遺伝子導入ビヒクルであって、次に、サプレッサーｔＲＮＡを発現するために細胞を形質導入するのに使用される、遺伝子導入ビヒクル内に含まれる。遺伝子送達ビヒクルは、当該技術分野で既知の任意の送達ビヒクルであり得、受容体および／または脂質媒介トランスフェクションによって促進される裸のＤＮＡ、ならびに多数のベクターのうちのいずれかを含むことができる。かかるベクターとしては、真核ベクター、原核ベクター（例えば、細菌ベクターなど）、ならびに、これらに限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクター（ヒトおよび豚を含む他のもの）、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、痘ウイルスベクター、および偽型ウイルスベクター、が含まれるウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、ＡＣＴ−ｔＲＮＡ（ＰＴＣ）は、ベクターにコードされる。図４．ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターである。採用され得るレトロウイルスベクターの例としては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルスのもの、およびラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
レトロウイルス、レトロウイルスベクター
「レトロウイルス」という用語は、それらの複製サイクル中に逆転写酵素を利用するＲＮＡウイルスに関して使用される。レトロウイルスゲノムＲＮＡは、逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換される。ウイルスのこの二本鎖ＤＮＡ形態は、感染細胞の染色体に組み込まれることが可能であり、一度組み込まれると「プロウイルス」と呼ばれる。”プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、新しいウイルス粒子を産生するのに必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示する。プロウイルスの各末端には、「末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」または「ＬＴＲ」と呼ばれる構造が存在する。ＬＴＲは、転写調節因子、ポリアデニル化シグナル、およびウイルスゲノムの複製および組み込みに必要な配列を含む多数の制御シグナルを含有する。レトロウイルス科には、いくつかの属が含まれ、システルナウイルス（Ｃｉｓｔｅｒｎａｖｉｒｕｓ）Ａ、オンコウイルスＡ、オンコウイルスＢ、オンコウイルスＣ、オンコウイルスＤ、レンチウイルス、およびスプーマウイルスが含まれる。レトロウイルスの中には、発癌性（すなわち、腫瘍化性）であるものもあれば、そうでないものもある。腫瘍ウイルスは、影響を受けやすい種において肉腫、白血病、リンパ腫、および乳癌を誘発する。レトロウイルスは多種多様な種に感染し、水平にも垂直にも伝染する可能性がある。それらは宿主ＤＮＡに組み込まれ、細胞から細胞への宿主ＤＮＡの配列を伝達することができる。これにより、遺伝子治療を含む様々な目的のベクターとしてレトロウイルスが開発されている。
ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むレトロウイルスは、それらの標的細胞が分裂細胞に限定されておらず、その制限された宿主細胞の向性が、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープ糖タンパク質を用いたシュードタイピングを介して容易に拡大することができるため、最近多くの注目を集めている（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７［１９９３］；Ａ．Ｍ．Ｌ．Ｌｅｖｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．３：４７０−４７１［１９９６］、およびＤ．Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２１７−２２２［１９９６］を参照されたい）。
ベクター系は、一般に、レトロウイルス配列（ウイルス末端反復配列または「ＬＴＲ」およびパッケージングまたは「ｐｓｉ」シグナル）の小部分を含有するＤＮＡベクターと、パッケージング細胞株とを有する。導入される遺伝子をＤＮＡベクターに挿入する。ＤＮＡベクター上に存在するウイルス配列は、ベクターＲＮＡのウイルス粒子への挿入またはパッケージ化、および挿入された遺伝子の発現に必要なシグナルを提供する。パッケージング細胞株は、粒子組み立てに必要なウイルスタンパク質を提供する（Ｄ．Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０［１９８８］）。本発明の一実施形態では、２９３Ｔ細胞における３プラスミドトランスフェクション産生法を採用するＦＩＶシステムを使用した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９７３：４９９１−５０００）。複製能力のないウイルスを成功裏に産生した。
ベクターＤＮＡは、様々な技術（例えば、リン酸カルシウム共沈殿、リポフェクション、エレクトロポレーション）のいずれかによってパッケージング細胞に導入される。パッケージング細胞によって産生されるウイルスタンパク質は、培養上清中に流される、ウイルス粒子へのＲＮＡの形態のベクター配列の挿入を媒介する。
自然に分裂している細胞、または成長因子によって分裂するように刺激される細胞については、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクターのような単純なレトロウイルスが好適な送達系である。しかしながら、遺伝子導入における多くの一般的に使用されるレトロウイルスベクターの使用における大きな制限は、ベクターの多くが分裂細胞に限定されることである。そのため非分裂細胞が標的細胞である場合、非分裂細胞に感染することができるレンチウイルスが使用され得る。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、徐々に疾患を発症させるレトロウイルスの群（または属）を指す。この群に含まれるウイルスとしては、ヒト後天性免疫不全症候群（エイズ）の病原体であるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、羊の脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こすビスナマエディ、ヤギの免疫不全、関節炎、および脳症を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマの自己免疫性溶血性貧血、および脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシのリンパ節症、リンパ球増加症、およびおそらく中枢神経系感染症を引き起こすウイルス（ＢＩＶ）、ならびにヒトに近い霊長類の免疫不全および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。これらのウイルスによって引き起こされる病気は、潜伏期間が長く、経過が長引くのが特徴である。通常、ウイルスは最近単球やマクロファージに感染し、そこから他の細胞に広がる。ＨＩＶ、ＦＩＶ、およびＳＩＶはまた、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）に容易に感染する。
ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含むレンチウイルスは、効率的な細胞内複製のための単純な構造ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ遺伝子に加えて、いくつかのウイルス調節遺伝子に依存する。したがって、レンチウイルスは、遺伝子調節およびウイルス複製のために古典的レトロウイルスよりも複雑な戦略を使用し、パッケージシグナルは明らかにウイルスゲノム全体に広がっている。これらの追加の遺伝子は、レンチウイルスの生命サイクル中に調節機能のウェブを示す。例えば、ＨＩＶ−１感染時、転写は、ＬＴＲにおけるＲＮＡ標的（ＴＡＲ）との相互作用を通じてＴａｔの発現によって上方制御される。次いで、全長およびスプライスされたｍＲＮＡの発現は、ｇａｇ領域およびｅｎｖ領域（ＲＲＥ）に存在するＲＮＡ配列と相互作用するＲｅｖの機能によって調節される（Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：１５０−１５９［１９９２］）。ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ ｍＲＮＡの核外輸送はＲｅｖ機能に依存する。これらの２つの必須調節遺伝子に加えて、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、およびｎｅｆを含む付属遺伝子のリストもウイルスゲノムに存在し、それらがウイルス複製に絶対に必要とされるわけではないが、効率的なウイルス産生および感染性に対する効果が実証されている（（Ｋ．ａｎｄ Ｆ．Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５５：１９３−２０５（１９９１），Ｒ．Ａ．Ｓｕｂｂｒａｍａｎｉａｎ ａｎｄ Ｅ．Ａ．Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６８３１−６８３５［１９９４］、およびＤ．Ｔｒｏｎｏ，Ｃｅｌｌ ８２：１８９−１９２［１９９５］）。例示的なレンチウイルスＨＩＶ−１の構造の詳細な説明は、米国特許第６，５３１，１２３号に示されている。
「ソースの」または「元の」レトロウイルスは、偽型レトロウイルスが由来する野生型レトロウイルスであり、またはパッケージングまたは導入遺伝子ベクターの構築中に、ベクターの遺伝要素のうちの１つ以上を調製するための出発点として使用される。遺伝要素は、変化なく使用されてもよく、または変異されてもよい（ただし、元の要素と統計的に有意な配列類似性を欠く点を超えてはならない）。ベクターは、２つ以上のソースレトロウイルスを有し得、異なるソースレトロウイルスは、例えば、ＭＬＶ、ＦＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、またはＨＩＶおよびＳＩＶであり得る。「遺伝要素」という用語には、遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
同族レトロウイルスは、問題のベクターが核酸レベルで最大のパーセンテージの配列同一性を有する野生型レトロウイルスである。通常、これはソースレトロウイルスと同じになる。しかしながら、ソースレトロウイルスが広範囲に変異する場合、ベクターは次いで、いくつかの他のレトロウイルスとより密接に類似することが考えられる。同族レトロウイルスが構築の物理的出発点である必要はなく、最初に元の要素を取得してからそれを修正するのではなく、遺伝要素、特に変異体要素を直接合成することを選択することができる。「同族の」という用語は、同様に、タンパク質、遺伝子、または遺伝要素（例えば、スプライスドナー部位またはパッケージングシグナル）に適用され得る。同族タンパク質を指す場合、配列同一性のパーセンテージは、アミノ酸レベルで決定される。
「同族の」レトロウイルスという用語は、極端な場合、すなわち、全てのレトロウイルス遺伝要素が代替の非レンチウイルス遺伝要素で置き換えられている場合、解釈することが困難であり得る。この場合、前述のソースレトロウイルス株は、任意に、同族のレトロウイルスであると見なされる。
ウイルスまたはベクターに関して本明細書で使用される場合、「複製」という用語は、細胞の繁殖の結果としての染色体におけるプロウイルスＤＮＡの正常な複製、または複製の機能的起源の存在の結果としてのプラスミドＤＮＡの自律的複製を指さない。代わりに「複製」とは、ウイルスＲＮＡを含有する感染性ウイルス粒子が細胞に入り、ＲＮＡがＤＮＡに逆転写され、ＤＮＡがプロウイルスとして宿主染色体に組み込まれ、感染細胞がウイルスタンパク質を産生し、それらを全長ウイルスゲノムＲＮＡとともに新しい同様の感染性粒子に組み立てる、完全なウイルスライフサイクルの完了を指す。
「複製能力のある」という用語は、感染細胞内のウイルスの複製が、別の、以前に感染していない細胞に感染した後、後者の細胞に同様にそのような感染性ウイルス粒子を産生させる、感染性ウイルス粒子の産生をもたらすように、複製することができる野生型ウイルスまたは変異型ウイルスを指す。本発明は、複製欠損ウイルスの使用を企図する。
本明細書で使用される場合、「弱毒化ウイルス」という用語は、意図される対象におけるその病原性が実質的に低減されるように改変された任意のウイルス（例えば、弱毒化レンチウイルス）を指す。ウイルスは、臨床的見地から非病原性になるまで、すなわち、ウイルスに曝露された対象が、対照の対象と比較して統計学的に有意な増加した病理レベルを示さない点まで弱毒化され得る。
本発明は、改変レトロウイルスの調製および使用を企図する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒト免疫不全ウイルス２型、ネコ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ビスナ−マエディ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびウシ免疫不全ウイルスの変異体、または１つ以上のレトロウイルス種の部分からなるウイルス（例えば、ＭＬＶ、ＦＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、またはＨＩＶ−１および／またはＳＩＶの部分からなるハイブリッド）である。
標準ウイルスは、変異ウイルスの成分を記述する際にゲノムが使用されるウイルスである。例えば、変異ウイルスの特定の遺伝要素は、様々な置換、欠失または挿入によって標準ウイルスの同族要素と異なると言うことができる。変異ウイルスが実際に標準ウイルスに由来する必要はない。
好ましい標準ＦＩＶ配列は、Ｔａｌｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８９ ８６：５７４３−７；Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓ ＃ＮＣ＿００１４８２に見出される。ある特定の実施形態では、３プラスミド一過性トランスフェクション法は、複製能力のない偽型レトロウイルス（例えば、ＦＩＶ）を産生するために使用され得る。一般的な方法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１９９９ １０４：Ｒ５５−６２およびＪｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９ ７３：４９９１−５０００に記載される。
レトロウイルスベクター系
本発明は、導入遺伝子ベクター、１つ以上の適合性パッケージングベクター、エンベロープベクター、および好適な宿主細胞を含むレトロウイルス遺伝子増幅および導入系を企図する。使用されるベクターは、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）に由来し得る。レトロウイルスベクターは、（１）パッケージングベクターおよびエンベロープベクターを宿主細胞にトランスフェクションして、本質的にパッケージングベクター−ＲＮＡフリーのウイルス粒子を生成するパッケージング細胞株を形成することと、（２）導入遺伝子ベクターをパッケージング細胞株にトランスフェクションすることと、（３）パッケージング細胞株による導入遺伝子ベクターＲＮＡを感染性ウイルス粒子にパッケージングすることと、（４）そのような細胞が形質導入され、その後に導入遺伝子を発現するように、粒子を標的細胞に投与することと、を可能にする。
粒子を対象に直接、インビボで投与するか、対象の細胞を取り出し、粒子をインビトロで感染させ、対象の体内に戻すかのいずれかである。
本発明のパッケージングベクターおよび導入遺伝子ベクターは、複製不可能なウイルスを生成する。本発明の所与のベクター系への組み込みのために選択されるベクターは、パッケージングベクター（複数可）または導入遺伝子ベクターのさらなる変異なしには、同時トランスフェクション細胞が、パッケージングベクター（複数可）および導入遺伝子ベクターのみの相同組換えによって複製能力のあるウイルスを生成することができないようなものである。本システムで使用されるエンベロープタンパク質は、レトロウイルスエンベロープ、合成またはキメラエンベロープ、または非レトロウイルスエンベロープウイルス（例えば、バキュロウイルス）由来のエンベロープであり得る。
パッケージングシグナル
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスまたはベクターＲＮＡのウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要な、または少なくとも容易になる、レトロウイルスゲノムまたはベクター内に位置する配列を指す。ＲＮＡにおけるパッケージングシグナルは、そのＲＮＡをビリオンにパッケージするものとして識別する。「パッケージングシグナル」という用語はまた、機能性パッケージングシグナルに転写されるベクターＤＮＡ配列を指すために便宜的に使用される。ある特定のパッケージングシグナルは、遺伝子の一部であり得るが、コード化したタンパク質のペプチド部分としてではなく、ＲＮＡの形態で認識される。
パッケージングベクターと導入遺伝子ベクターとの主な区別は、パッケージングベクターにおいて、主なパッケージングシグナルが不活性化され、導入遺伝子ベクターにおいて、主なパッケージングシグナルが機能的であることである。理想的には、パッケージングベクターにおいて、全てのパッケージングシグナルが不活性化され、導入遺伝子ベクターにおいて、全てのパッケージングシグナルは機能的する。しかしながら、ウイルス力価を最大化する、または相同組換えを阻害するなどの相殺的な考慮は、そのような構築物をあまり望ましくないようにし得る。
パッケージング系、パッケージングベクター、パッケージング細胞株
パッケージング系は、好適なＲＮＡを封入し、それをビリオン産生細胞から輸送し、それを標的細胞に伝達し、かつ標的細胞において、ＲＮＡを逆転写させ、前述のＲＮＡに組み込まれた導入遺伝子を発現させることができるように宿主ゲノムに組み込むことができるビリオンを産生するために必要な全ての遺伝子情報を発現可能な形態でまとめて提供するベクターまたは複数のベクターである。しかしながら、パッケージング系は、実質的にそれ自体がパッケージングできないものでなければならない。むしろ、それは別個の導入遺伝子ベクターをパッケージ化する。
本発明では、パッケージングベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の機能的等価物（「ＧＰ」ベクター）を提供する。ｅｎｖ遺伝子（複数可）は、エンベロープベクターによって提供される。理論的には、別個のベクター上に異なるｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を構築し、それらを異なる調節可能なプロモーター（または一方が調節可能なプロモーターに、他方が構成的プロモーターに）に動作可能に連結し、それらの相対的な発現レベルを適切に調整することができるようにする場合、３つのベクター系（「Ｇ」、「Ｐ」、および「Ｅ」ベクター）が可能である。
パッケージング細胞株は、達成可能な条件下で、ウイルス粒子を産生するパッケージング系によってトランスフェクションされた好適な宿主細胞である。本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、典型的には、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を発現するが、パッケージングシグナルを含まない細胞株に関して使用される。例えば、細胞株は、そのゲノム内の１つの染色体部位、機能的なｐｓｉ+配列（Δ−ｐｓｉとして指定される）を欠くおよび５’−ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−３’−ＬＴＲ断片、およびΔ−ｐｓｉが別の染色体部位にも位置する５’−ＬＴＲ−ｅｎｖ−３’−ＬＴＲ断片で担持するように遺伝子操作されている。これらのセグメントの両方が構成的に転写されるが、ｐｓｉ+領域が欠損しており、生成されるウイルスＲＮＡ分子がフルサイズ未満であるため、空のウイルス粒子が形成される。
宿主細胞がパッケージングベクター（複数可）だけでトランスフェクションされる場合、それは、全長パッケージングベクターなしで実質的にウイルス粒子のみを産生する。一例では、パッケージング細胞によって産生されるウイルス粒子の１０％未満は、全長パッケージングベクター由来ＲＮＡを含有する。しかしながら、パッケージングベクターは機能的プライマー結合部位を欠いているため、これらの粒子が新しい細胞に感染しても、パッケージングベクターＲＮＡはＤＮＡに逆転写されず、したがって、新しい細胞はビリオンを産生しない。したがって、それ自体では、パッケージングベクターは、複製能力のないウイルスである。
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞および／または細胞株は、導入遺伝子ベクターを含有する。パッケージング細胞株は、導入遺伝子ベクターを感染性粒子にパッケージする。このような細胞株は、本明細書において「トランスジェニックビリオン産生細胞株」と称される。”
パッケージングは、誘導性であっても、非誘導性であってもよいことが企図される。誘導性パッケージング細胞およびパッケージング細胞株において、レトロウイルス粒子は、少なくとも１つの誘導物質に応答して産生される。非誘導性パッケージング細胞株およびパッケージング細胞において、レトロウイルス粒子産生を起こすために誘導物質は不要である。
パッケージングベクターは、同族の野生型ゲノムの少なくとも１つのパッケージングシグナルの不活性化より、野生型の複製能力のあるレトロウイルスゲノムとは必然的に異なる。２つ以上のパッケージングシグナルが不活性化され得る。一実施例では、パッケージングベクターによって提供されるレトロウイルス遺伝子のみが、構造的または必須の調節タンパク質をコードするものである。
導入遺伝子ベクター
導入遺伝子ベクターは、発現可能な目的の非レトロウイルス遺伝子を保有し、少なくとも１つの機能的レトロウイルスパッケージングシグナルを含む発現ベクターであり、そのため、導入遺伝子ベクターがパッケージング細胞株にトランスフェクションされた後、導入遺伝子ベクターはＲＮＡに転写され、このＲＮＡは感染性ウイルス粒子にパッケージングされる。これらの粒子は、次いで、標的細胞に感染し、それらのＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、ＤＮＡは、プロウイルス配列として宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それによって、目的の遺伝子を標的細胞に伝達する。
本明細書で使用される場合、「形質導入」という用語は、トランスフェクションによるものではなく、感染によるウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する遺伝子（複数可）の送達を指す。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは形質導入される。したがって、「形質導入遺伝子」は、レトロウイルスまたはベクター感染およびプロウイルス組み込みを介して細胞内に導入されている遺伝子である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、「導入遺伝子ベクター」）は、遺伝子を「標的細胞」または宿主細胞に形質導入する。本発明は、任意の目的の遺伝子（または、感染または遺伝子の発現を示すために使用される「マーカー遺伝子」または「レポーター遺伝子」）に連結された、本発明における使用に好適な導入遺伝子ベクターを包含する。
本明細書で使用される場合、「長期形質導入」という用語は、他のベクターで観察されるものよりも長期間、宿主または標的細胞内で形質導入されたままでいることが可能なベクターを指す。例えば、本発明は、少なくとも１２０日間、少なくとも１年間、または対象の寿命または治療に必要な時間経過の間、形質導入を維持することができるレトロウイルスベクターを提供する。発現の持続時間は、ベクターの選択よりも、プロモーターの選択と標的細胞型の関数である。
「安定した形質導入」または「安定して形質導入された」という用語は、形質導入細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入および組み込みを指す。「安定な形質導入体」という用語は、外来ＤＮＡをゲノムＤＮＡに安定的に組み込んだ細胞を指す。
「一過性形質導入」または「一過性に形質導入された」という用語は、外来ＤＮＡが形質導入細胞のゲノムに組み込まれない細胞への外来ＤＮＡの導入を指す。外来ＤＮＡは、形質導入細胞の核内に数日間存続する。この期間中、外来ＤＮＡは、染色体における内在性遺伝子の発現を支配する制御調節下におかれる。「一過性形質導入剤」という用語は、外来ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを組み込むことができなかった細胞を指す。
いくつかの実施形態では、本発明の標的細胞および／または宿主細胞は、「非分裂」細胞である。これらの細胞には、通常分裂しない神経細胞などの細胞が含まれる。しかしながら、本発明は、非分裂細胞（筋肉細胞、白血球、脾臓細胞、肝臓細胞、眼細胞、上皮細胞を含むが、これらに限定されない）に限定されることを意図しない。
いくつかの実施形態では、ベクターおよびベクター子孫は、少なくとも１０5ｃｆｕ／ｍｌのベクター力価を達成するように、複数の標的細胞を形質導入することができる。感染多重度（ＭＯＩ）は、少なくとも１つ（すなわち、１細胞当たり平均１ヒット）、または少なくとも２つであってもよい。
発現カセットとベクター
本発明は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする配列を含む発現カセットも提供する。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、プロモーターをさらに含有する。ある特定の実施形態では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＰＧＫ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、Ｈ１またはＵ６プロモーター（Ｐｏｌ ＩＩおよびＰｏｌ ＩＩＩプロモーター）である。
本発明は、上述の発現カセットを含有するベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスマロニーベースのウイルスベクターである。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる核酸配列を意味し、これは、終結シグナルに作動可能に連結され得る目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結され得るプロモーターを含み得る。ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含み得る。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードする。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよい。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは宿主細胞が何らかの特定の刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する調節可能なプロモーターの制御下にあり得る。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または臓器または発達段階に特異的であり得る。
「作動可能に連結された」は、配列のうちの１つの機能が別の配列によって影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の関連付けを指す。例えば、調節ＤＮＡ配列は、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように（すなわち、コード配列または機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）２つの配列が配置されている場合、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」または「関連付けられる」と言われる。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向の調節配列に作動可能に連結され得る。
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの小さな非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製がヘルパーウイルスに依存している点で、このファミリーの他のメンバーとは異なる。ヘルパーウイルスの不在下で、ＡＡＶは、遺伝子座特異的様式で染色体１９のｑアームに組み込まれ得る。ＡＡＶの約５ｋｂゲノムは、プラス極性またはマイナス極性のいずれかの一本鎖ＤＮＡのセグメントからなる。ゲノムの末端は、ヘアピン構造に折り畳まれ、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として機能することができる短い末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）である。物理的には、パルボウイルスビリオンはエンベロープを有さず、その二十面体カプシドは直径約２０ｎｍである。
これまで、多数の血清学的に異なるＡＡＶが特定され、１２種超えがヒトまたは霊長類から単離されている。ＡＡＶ２のゲノムは４６８０ヌクレオチド長であり、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。左のＯＲＦは、一本鎖子孫ゲノムの産生に加えて複製および転写の調節に関与する非構造的Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、およびＲｅｐ７８をコードする。さらに、Ｒｅｐタンパク質のうちの２つは、ヒト染色体１９のｑアームの領域へのＡＡＶゲノムの優先的な組み込みと関連付けられている。Ｒｅｐ６８／７８はまた、ＮＴＰ結合活性ならびにＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性を有することが示されている。Ｒｅｐタンパク質は、核局在化シグナルならびにいくつかの潜在的なリン酸化部位を有する。これらのキナーゼ部位のうちの１つの変異は、複製活性の損失をもたらした。
ゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として機能するＴ字型ヘアピン構造に折り畳む可能性を有する短い末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＩＴＲ）である。ＩＴＲ領域内では、ＩＴＲの機能の中心となる２つのエレメント、ＧＡＧＣ反復モチーフ、および末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が記載されている。反復モチーフは、ＩＴＲが線形またはヘアピン構造のいずれかにあるとき、Ｒｅｐに結合することが示されている。この結合は、部位特異的および鎖特異的様式で起こる、ｔｒｓでの切断のためのＲｅｐ６８／７８を配置するのに役立つ。これら２つのエレメントは、複製における役割に加えて、ウイルス組み込みの中心となるようである。染色体１９内に含有される組み込み遺伝子座は、隣接するｔｒｓを有するＲｅｐ結合部位である。これらのエレメントは、機能的であり、遺伝子座特異的組み込みに必要であることが示されている。
ＡＡＶビリオンは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３と呼ばれる３つの関連タンパク質からなる、直径約２５ｎｍのエンベロープを有さない二十面体粒子である。右のＯＲＦは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質は、それぞれ１：１：１０の比率で見出され、全て右手ＯＲＦに由来する。カプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび異常な開始コドンの使用によって互いに異なる。欠失解析は、選択的スプライスによるメッセージから翻訳されるＶＰ１の除去または改変が、感染粒子の収率の低下をもたらすことを示している。ＶＰ３コード領域内の変異は、任意の一本鎖子孫ＤＮＡまたは感染性粒子を産生することができなくなる。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードすることができる。粒子は、ＡＡＶ２および他のＡＡＶカプシドタンパク質（すなわち、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２等のキメラタンパク質）を含む粒子であり得る。標準的な方法によって日常的に決定され得るように、得られるＡＡＶ２カプシドを含むウイルス粒子がＡＡＶ１とは抗原的または免疫学的に異なるままである限り、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列の変化が、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子がＡＡＶ１と抗原的または免疫学的に異なるかどうかを判定することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ１とは異なる組織向性を保持する。
ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードするＡＡＶ２カプシドポリペプチドは、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列）に記載されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、全体的に少なくとも約６３％の相同性（または同一性）を有することができる。カプシドタンパク質は、ＮＣ＿００１４０１に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して、約７０％の相同性、約７５％の相同性、８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、９５％の相同性、９８％の相同性、９９％の相同性を、または１００％の相同性でさえ、有し得る。カプシドタンパク質は、ＮＣ＿００１４０１に記載のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して、約７０％同一性、約７５％同一性、８０％同一性、８５％同一性、９０％同一性、９５％同一性、９８％同一性、９９％同一性を、または１００％同一性でさえ、有し得る。粒子は、別のＡＡＶおよびＡＡＶ２カプシドタンパク質、すなわち、キメラタンパク質を含む粒子であり得る。標準的な方法によって日常的に決定され得るように、得られるＡＡＶ２カプシドを含むウイルス粒子がＡＡＶ４とは抗原的または免疫学的に異なるままである限り、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列の変化が、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子がＡＡＶ１と抗原的または免疫学的に異なるかどうかを判定することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、本明細書の実施例に例示されるようなＡＡＶ１とは異なる組織向性を保持するが、少なくとも１つのＡＡＶ２コートタンパク質を含むＡＡＶ２キメラ粒子は、ＡＡＶ２コートタンパク質のみからなるＡＡＶ２粒子のものとは異なる組織向性を有し得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、一対のＡＡＶ２末端逆位配列を含むベクターを含有する、すなわち、カプシド形成するＡＡＶ２粒子をさらに提供する。ＡＡＶ２ ＩＴＲのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知である。さらに、粒子は、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２カプシドタンパク質の両方、すなわち、キメラタンパク質を含む粒子であり得る。さらに、粒子は、他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０）からの一対のＡＡＶ末端逆位配列を含むベクターをカプシド形成する粒子であり得る。粒子内にカプシド形成されたベクターは、末端逆位配列間に挿入された外来性核酸をさらに含み得る。
以下のＡＡＶの特徴により、それは遺伝子導入のための魅力的なベクターとなった。ＡＡＶベクターは、細胞ゲノムに安定して組み込むためにインビトロで示されており、広い宿主範囲を有し、インビトロおよびインビボで分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入し、形質導入遺伝子の高い発現レベルを維持する。ウイルス粒子は熱安定性があり、溶媒、洗剤、ｐＨ変化、温度変化に耐性があり、ＣｓＣｌ勾配または他の手段によって濃縮することができる。本発明は、ＡＡＶ粒子、組換えＡＡＶベクター、および組換えＡＡＶビリオンの投与方法を提供する。例えば、ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子であるか、またはＡＡＶ１粒子は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えＡＡＶ２ベクターは、ＡＡＶ２の少なくとも１つの固有の核酸を含む核酸構築物である。組換えＡＡＶ２ビリオンは、組換えＡＡＶ２ベクターを含有する粒子である。「ＡＡＶ２ ＩＴＲ」という用語内で考慮されるために、ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２ ＩＴＲをＡＡＶ１ ＩＴＲと区別する本明細書に記載される１つまたは両方の特徴を保持しなければならない。（１）３つ（ＡＡＶ１のように４つではなく）の「ＧＡＧＣ」反復、および（２）ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｒｅｐ結合部位において、最初の２つの「ＧＡＧＣ」反復における４番目のヌクレオチドは、ＴではなくＣである。
送達されるｔＲＮＡをコードする配列の発現を駆動するプロモーターは、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現レベルおよびベクターが使用される細胞型などの既知の考慮事項によって選択される任意の所望のプロモーターであり得る。プロモーターは、外来性プロモーターまたは内在性プロモーターであり得る。プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０または誘導性メタロチオネインプロモーターのような既知の強力プロモーター、または例えばＡＡＶ ｐ５プロモーターのようなＡＡＶプロモーター、が挙げられ得る。プロモーターのさらなる例としては、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ）プロモーター、誘導性熱ショックプロモーター、呼吸器合胞体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などに由来するプロモーターが挙げられる。追加の例としては、調節されたプロモーターが挙げられる。
ＡＡＶベクターは、プロモーターに機能的に連結された外来性（異種）核酸をさらに含むことができる。「異種核酸」とは、細胞、組織または生物への導入のために任意の異種または外来性核酸をベクターに挿入することができることを意味する。核酸は、例えば、ｔＲＮＡをコードすることができる。「機能的に連結された」とは、異種核酸に対するプロモーターの適切な向きなど、当該技術分野で知られているように、プロモーターが異種核酸の発現を促進できることを意味する。さらに、異種核酸は、機能的にコードする、すなわち、核酸を発現させるために、当該技術分野で既知のように、核酸の発現に適切な全ての配列を好ましく有する。核酸は、例えば、エンハンサーなどの発現制御配列を含み得る。核酸は、パッケージ化され得る核酸の大きさによってのみ制限される、２つ以上の遺伝子産物をコードすることができる。
ＡＡＶ１粒子は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。標準的な方法によって日常的に決定され得るように、得られるＡＡＶ１カプシドを含むウイルス粒子が他のＡＡＶカプシドとは抗原的または免疫学的に異なるままである限り、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列の変化が、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子が他のＡＡＶ血清型と抗原学的または免疫学的に異なるかどうかを判定することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指し、全長タンパク質およびその断片を含む。したがって、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用されることが多い。
本方法は、核酸を細胞に送達する方法であって、一対のＡＡＶ末端逆位配列の間に挿入された核酸を含むベクターを含有するＡＡＶ粒子を細胞に投与し、それによって核酸を細胞に送達することを含む方法を提供する。細胞への投与は、任意選択で組織培養培地等の所望の液体または緩衝生理食塩溶液に含有される粒子を細胞と接触させることを含む、任意の手段によって達成することができる。粒子は、任意の所望の長さの間、細胞と接触したままにすることができ、典型的には、粒子を投与し、無期限に保持することができる。このようなインビトロ方法については、当該技術分野において公知であり、本明細書に例示されるように、標準的なウイルス形質導入方法によって、ウイルスを細胞に投与することができる。投与するウイルスの力価は、特に細胞の種類に応じて変化することができるが、一般的にＡＡＶ形質導入に使用されるものに代表される。さらに、本実施例における特定の細胞を形質導入するために使用される力価を利用することができる。細胞は、ヒト、ならびに霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびイヌなどの他の大型（非げっ歯動物）哺乳動物における任意の所望の細胞を含むことができる。
本発明は、対象の細胞に核酸を送達する方法であって、対象に、一対のＡＡＶ末端逆位配列の間に挿入された核酸を含むＡＡＶ粒子を投与し、それによって対象の細胞に核酸を送達することを含む、方法をさらに提供する。
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載のウイルスベクターを含む細胞を提供する。
ＡＡＶベクター
一実施形態において、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターは、アデノ関連ウイルスを指し、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。本用語は、別途必要な場合を除き、全てのサブタイプ、血清型および偽型、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義された抗血清とのカプシドタンパク質反応性に基づいて特定され、他のＡＡＶと区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶ、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−９、およびＡＡＶｒｈ１０の、８つの既知の血清型が存在する。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のキャップ遺伝子からコードされるカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ２血清型からの５’および３’ＩＴＲ配列を含むゲノムとを含むＡＡＶを指すために使用される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型からのカプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用されてもよく、または、あるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型由来の５’−３’ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ血清型２由来のカプシドおよびＡＡＶ血清型５由来のＩＴＲ、を指してもよい。本明細書に例示される各実施例について、ベクター設計および産生の説明は、カプシドの血清型および５’−３’ＩＴＲ配列を説明する。略称「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ関連ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる、
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）およびカプシド形成したポリヌクレオチドからなる、ウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは典型的には「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。
一実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターは、既知の技術を使用して、転写方向に少なくとも動作可能に連結された成分として、転写開始領域、目的のＤＮＡ、および転写終結領域を含む制御エレメントを提供するように構築される。制御エレメントは、哺乳動物細胞内で機能的であるように選択される。作動可能に連結された構成要素を含有する得られた構築物は、機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する（５’および３’）。
「アデノ関連ウイルス末端逆位配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該技術分野で認識される領域を意味し、これらは、ＤＮＡ複製の起点として、およびウイルスのパッケージシグナルとしてシス内で一緒に機能する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域とともに、２つの隣接ＩＴＲ間に挿入されるヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノムへの効率的な切除とレスキュー、ならびに組み込みを提供する。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７等を含むが、これらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除およびレスキューを可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在するときに、レシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするよう機能する限り、必ずしも同一であるか、または同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要はない。
一実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７等を含むが、これらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来することができる。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図するよう機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除およびレスキューを可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在するときに、レシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にするよう機能する限り、必ずしも同一であるか、または同じＡＡＶ血清型または単離株に由来する必要はない。
一実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２に由来することができる。ＡＡＶベクターで使用するのに好適なＤＮＡ分子は、約５キロ塩基（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満のサイズであり、当該技術分野において公知である。
一実施形態において、選択されたヌクレオチド配列は、対象における転写またはその発現をインビボで誘導する制御エレメントに作動可能に連結される。そのような制御エレメントは、選択された遺伝子に通常関連付けられる制御配列を含むことができる。あるいは、異種制御配列を用いることができる。有用な異種制御配列としては、概して、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが挙げられる。例としては、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時早期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列もまた、本明細書に使用することが見出される。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
一実施形態において、異種プロモーターと、組織特異的および誘導性プロモーター、エンハンサー等の他の制御エレメント、特に有用である。異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素症およびオーフィン（ａｕｆｉｎ）のＤＮＡ応答配列が挙げられる。
一実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲによって結合された目的のＤＮＡ分子を収容するＡＡＶ発現ベクターは、選択された配列（複数可）を、そこから切除された主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有する、ＡＡＶゲノムに直接挿入することによって構築することができる。複製およびパッケージ機能を可能にするのに十分な部分のＩＴＲが残っている限り、ＡＡＶゲノムの他の部分も、削除することができる。このような構築物は、当該技術分野において周知である技法を使用して設計され得る。
あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノムまたはそれを含有するＡＡＶベクターから切除され、標準的なライゲーション技術を使用して、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’および３’に融合することができる。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ ＮａＣｌで、および０℃では４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「粘着末端」ライゲーションの場合）、または１４℃では１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーションの場合）のいずれかで達成され得る。分子間「粘着末端」ライゲーションは、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの総末端濃度）で行われる。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクター
加えて、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列の５’および３’に配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むように合成的に産生され得る。完全なキメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
ｒＡＡＶビリオンを産生するために、トランスフェクションなどによる既知の技術を使用して、ＡＡＶ発現ベクターを好適な宿主細胞に導入する。当該技術分野において、多くのトランスフェクション技術が一般に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。特に好適なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性遺伝子導入、脂質媒介性形質導入、および高速マイクロプロジェクタイルを用いた核酸送達が挙げられる。
一実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを産生するのに好適な宿主細胞としては、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るか、または使用されてきた微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。この用語は、トランスフェクションされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、概して、外来性ＤＮＡ配列でトランスフェクションされた細胞を指す。安定なヒト細胞株２９３（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションを通じて受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３で、容易に入手可能）由来の細胞を、本開示の実施において使用することができる。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されたヒト胚性腎細胞株であり、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する。２９３細胞株は容易にトランスフェクションされ、ｒＡＡＶビリオンを産生するための特に便利なプラットフォームを提供する。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野認識領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムの複製に集合的に必要とされる。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の好適な相同体としては、ＡＡＶ−２ ＤＮＡ複製を媒介することも知られているヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる。
「ＡＡＶｃａｐコード領域」とは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはそれらの機能的相同体をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野で認識される領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされるパッケージング機能を供給する。
一実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前に、またはそれと同時に、宿主細胞をＡＡＶヘルパー構築物でトランスフェクションすることによって宿主細胞に導入される。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物は、生産的ＡＡＶ感染に必要な欠損しているＡＡＶ機能を補完するために、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはキャップ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠き、それ自身を複製することもパッケージすることもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポソン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードする、一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５などの、いくつかのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードするいくつかの他のベクターが記載されている。
ウイルスベクターの送達方法は、対象にＡＡＶを注入することを含む。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボまたはインビトロ形質導入技術のいずれかを使用して細胞内に導入され得る。インビトロで形質導入される場合、所望のレシピエント細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶビリオンで形質導入し、対象に再導入する。あるいは、これらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に、同系または異系細胞を使用することができる。
形質導入細胞を対象に送達および導入するための好適な方法が記載されている。例えば、細胞は、例えば適切な培地中で組換えＡＡＶビリオンを細胞と合わせることによって、インビトロで形質導入することができ、目的のＤＮＡを有する細胞についてのスクリーニングは、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用することによってスクリーニングすることができる。次いで、形質導入細胞を、以下でより詳しく説明される薬学的組成物に製剤化することができ、移植、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射によるなどの様々な技術によって対象に導入される組成物も含む。
一実施形態では、薬学的組成物は、目的の核酸の治療有効量、すなわち、問題となる疾患状態の症状を軽減または寛解するのに十分な量、または所望の利益を与えるのに十分な量を産生するのに十分な遺伝物質を含む。薬学的組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤を含有する。このような賦形剤としては、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導するものではなく、過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的薬剤が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、および水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩をそこに含み得る。さらに、そのようなビヒクルには、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が存在し得る。薬学的に許容される賦形剤の徹底した議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１年）で入手可能である。
２つ以上の導入遺伝子は、送達されたウイルスベクターによって発現され得ることを理解されたい。あるいは、各々が１つ以上の異なる導入遺伝子を発現する別個のベクターもまた、本明細書に記載されるように対象に送達することができる。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターは、他の好適な組成物および療法と組み合わされることも意図される。
本明細書の教示を鑑みて、当業者に明らかであるように、追加されるべき有効量のウイルスベクターを経験的に決定することができる。投与は、治療の過程を通じて連続的または断続的に、単回投与で行うことができる。最も有効な投与手段および投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、療法の組成物、標的細胞、および治療される対象によって変化する。単回および複数回の投与は、治療医師によって選択されている用量レベルおよびパターンで行われ得る。
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、約０．３〜２ｍｌの１×１０５〜１×１０１６ｖｇ／ｍｌの用量で投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１〜３ｍｌの１×１０７〜１×１０１４ｖｇ／ｍｌの用量で投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１〜２ｍｌの１×１０８〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌの用量で投与される。
ｒＡＡＶ粒子を含有する製剤は、有効量のｒＡＡＶ粒子をビヒクル中に含有することになり、有効量は当業者によって容易に決定される。ｒＡＡＶ粒子は、典型的には、組成物の約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）、または適切な場合、さらに高いまたは低い範囲であり得る。投与される量は、治療を検討される動物またはヒト対象の年齢、体重および健康状態などの要因に依存する。有効用量は、用量応答曲線を確立する日常的な試験を通じて当業者によって確立され得る。対象は、１つ以上の用量でｒＡＡＶ粒子を投与することによって治療される。十分な酵素活性を維持するために必要に応じて、複数の用量を投与することができる。
水、生理食塩水、人工ＣＳＦ、または他の既知の物質を含むビヒクルは、本発明とともに用いられ得る。製剤を調製するために、精製された組成物を単離し、凍結乾燥し、安定化することができる。次いで、組成物を適切な濃度に調整し、任意選択で抗炎症剤と組み合わせられ、使用のためにパッケージ化してもよい。
本発明は、細胞内の標的タンパク質のレベルを増加させるのに十分な量で、上述のタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸分子を細胞内に導入することによって、細胞内の標的タンパク質のレベルを増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、標的タンパク質の蓄積は少なくとも１０％増加する。標的タンパク質の蓄積は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％増加する。３９
治療薬をコードする核酸
「核酸」という用語は、糖、リン酸、およびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。
「核酸断片」は、所与の核酸分子の一部である。ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、標準パラメータを使用して記載されるアラインメントプログラムのうちの１つを使用する参照配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、または少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、またはさらには少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
一実施形態において、核酸分子は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡを含むＲＮＡ分子である。
一実施形態において、核酸分子は、１つ以上のＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子である。一実施形態において、核酸分子は、単一のプロモーターの制御下で、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、または２０個以上のＡＣＥ−ｔＲＮＡ分子をコードする核酸分子である。
一実施形態では、本発明は、切断部位によって分離された２つ以上のＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子を提供する。一実施形態において、切断部位は、Ｐ２Ａ部位である。一実施形態において、切断部位は、プロテアーゼ切断部位である。様々な実施形態において、プロテアーゼ切断部位としては、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１〜カスパーゼ１０）、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、グランザイムＢ、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ、ヒドロキシルアミン、膵エラスターゼ、ペプシンＡ、プロリルエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ＴＥＶプロテアーゼ、サーモリシン、またはトロンビンによって標的化される部位が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位の切断のためのプロテアーゼは、同じポリペプチドの一部としてレポーター分子をコードする２つ以上の遺伝子の下流にコードされる。一実施形態において、プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列は、プロテアーゼ切断部位によってＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする２つ以上の遺伝子のヌクレオチド配列に結合される。
一実施形態において、核酸分子は、１つ以上のレポーター分子を含む。レポーターは、その発現により細胞が検出可能な形質を細胞に付与する分子である。様々な実施形態では、レポーターには、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、アルカリホスファターゼ、ならびに、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ｍＷａｓａｂｉ、ｍＣｌｏｖｅｒ３）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ＡＱ１４３、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ３、ｍＰｌｕｍ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＴａｇＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ、Ｔｏｍａｔｏ、Ｋｕｓａｂｒｉａ Ｏｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＴａｇＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、Ｃｅｒｕｌｅａｎ，、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍｔａｇＢＦＰ２、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ｙ６６Ｈ）および近赤外蛍光タンパク質（例えば、ｉＲＦＰ６７０、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ７１３およびｉＲＦＰ７２０）、赤外蛍光タンパク質（例えば、ＩＦＰ１．４）および光活性化蛍光タンパク質（例えば、Ｋａｅｄｅ、Ｅｏｓ、ＩｒｉｓＦＰ、ＰＳ−ＣＦＰ）が含まれる蛍光タンパク質、が含まれるが、これらに限定されない。
細胞に遺伝物質を導入するための方法
外来性遺伝物質（例えば、１つ以上の治療用ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、トランスフェクションまたは形質導入などの遺伝子導入方法によってインビボで細胞に導入して遺伝子組換え細胞を提供する。様々な発現ベクター（すなわち、外来性遺伝物質の標的細胞への送達を容易にするためのビヒクル）は、当業者に公知である。
本明細書で使用される場合、「細胞のトランスフェクション」は、追加のＤＮＡを組み込むことによって細胞による新しい遺伝物質の獲得を指す。したがって、トランスフェクションは、物理的または化学的方法を使用して、細胞内に核酸を挿入することを指す。いくつかのトランスフェクション技術は、当業者に公知であり、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、およびタングステン粒子促進微粒子銃が含まれる。リン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿は、別の可能性のあるトランスフェクション法である。
対照的に、「細胞の形質導入」は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを使用して、核酸を細胞に導入するプロセスを指す。核酸を細胞に導入するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス）は、本明細書では、形質導入キメラレトロウイルスと称される。レトロウイルス内に含有される外来性遺伝物質は、形質導入細胞のゲノムに組み込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療薬をコードするｃＤＮＡを担持するアデノウイルス）で形質導入された細胞は、そのゲノムに外来性遺伝物質を組み込まないが、細胞内に染色体外で保持される外来性遺伝物質を発現することができる。
典型的には、外来性遺伝物質は、異種遺伝子（通常、治療タンパク質をコードするエキソンを含むｃＤＮＡの形態）をプロモーターとともに含み、新しい遺伝子の転写を制御する。プロモーターは、転写を開始するのに必要な特異的ヌクレオチド配列を特徴的に有する。任意選択で、外来性遺伝物質は、所望の遺伝子転写活性を得るために必要な追加の配列（すなわち、エンハンサー）をさらに含む。この議論の目的のために、「エンハンサー」とは、プロモーターによって指示された基礎転写レベルを変更するために、コード配列（シス内で）と隣接して働く任意の非翻訳ＤＮＡ配列である。外来性遺伝物質は、プロモーターとコード配列が、コード配列の転写を可能にするように動作可能に連結されるように、プロモーターからすぐ下流の細胞ゲノムに導入され得る。レトロウイルス発現ベクターは、挿入された外来性遺伝子の転写を制御する外来性プロモーターエレメントを含んでよい。このような外来性プロモーターとしては、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が挙げられる。
天然に存在する構成的プロモーターは、不可欠な細胞機能の発現を制御する。その結果、構成的プロモーターの制御下にある遺伝子は、細胞増殖のあらゆる条件下で発現される。例示的な構成的プロモーターとしては、ある特定の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター、および当業者に既知の他の構成的プロモーター。加えて、多くのウイルスプロモーターは、真核細胞において構成的に機能する。これらには、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター等々が含まれる。したがって、上述の構成的プロモーターのいずれかを使用して異種遺伝子挿入物の転写を制御することができる。
誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤の存在下でのみまたはより大きく発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にある転写は、特定の金属イオンの存在下で大幅に増加する）。誘導性プロモーターには、それらの誘導因子が結合したときに転写を刺激する応答配列（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＲＥ））が含まれる。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸、およびサイクリックＡＭＰのＲＥがある。誘導性応答を得るために、特定のＲＥを含有するプロモーターを選択することができ、いくつかの場合において、ＲＥ自体は異なるプロモーターに結合され得、それによって組換え遺伝子に誘導性を付与する。したがって、適切なプロモーター（構成的対誘導性；強対弱）を選択することによって、遺伝子組換え細胞における治療薬の存在および発現レベルの両方を制御することが可能である。治療薬をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合、インサイチュでの治療薬の送達は、例えば、薬剤の転写を制御する誘導性プロモーターの特定の誘導物質の腹腔内注射によって、インサイチュで治療薬の転写を可能にするための条件に遺伝子組換え細胞を曝露することによって、引き起こされる。例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にある遺伝子によってコードされる治療薬の遺伝子組換え細胞によるインサイチュ発現は、遺伝子組換え細胞を、インサイチュで適切な（すなわち、誘導性）金属イオンを含有する溶液と接触させることによって増強される。
したがって、インサイチュで送達される治療薬の量は、以下のような因子を制御することによって調節される：（１）挿入された遺伝子の転写を指示するために使用されるプロモーターの性質（すなわち、プロモーターが構成的であるか、誘導可能であるか、強いか、または弱いか）、（２）細胞内に挿入される外来性遺伝子のコピー数、（３）患者に投与される（例えば、埋め込まれる）形質導入／トランスフェクション細胞の数、（４）インプラントのサイズ（例えば、移植片またはカプセル化された発現系）、（５）インプラントの数、（６）形質導入／トランスフェクション細胞またはインプラントが所定の位置に留置される時間の長さ、および（７）遺伝子組換え細胞による治療薬の産生速度。治療上有効な用量の特定の治療薬の送達のためのこれらの因子の選択および最適化は、患者の上記開示された因子および臨床プロファイルを考慮して、過度な実験を伴うことなく当業者の範囲内にあると見なされる。
少なくとも１つのプロモーターおよび治療薬をコードする少なくとも１つの異種核酸に加えて、発現ベクターは、発現ベクターでトランスフェクションされまたは形質導入された細胞の選択を容易にするための選択遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。あるいは、細胞は、２つ以上の発現ベクター、治療薬（複数可）をコードする遺伝子（複数可）を含有する少なくとも１つのベクター、選択遺伝子を含有する他のベクターでトランスフェクションされる。好適なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および／またはシグナル配列の選択は、過度の実験を伴うことなく当業者の範囲内にあると見なされる。
本発明のＡＣＥ−ｔＲＮＡ構築物は、任意のタイプの標的細胞または宿主細胞に挿入され得る。発現ベクターとの関連で、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に導入され得る。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生するための方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学手段としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、および水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質系などのコロイド分散系が挙げられる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、（インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの）宿主細胞に核酸を導入するために企図される。別の態様では、核酸は、脂質と関連し得る。脂質に関連する核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に分散され、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体形成され、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルに含有されるか、またはミセルと複合体形成され、またはそれ以外の方法で脂質と関連し得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中で任意の特定の構造に限定されない。例えば、これらは、ミセルとして二層構造に存在し得るか、または「崩壊」構造を有し得る。これらはまた、溶液中に単純に分散されてもよく、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質内で天然に発生する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドを含有する化合物のクラスが挙げられる。
使用に好適な脂質を商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができ、ジセチルリン酸塩（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ研究所（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の貯蔵液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単一および多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二層膜および内側水性媒体を有する小胞状構造を有することを特徴とすることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。過剰な水性媒体中にリン脂質が懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再配列を受け、脂質二重層の間に水と溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞状構造とは異なる溶液中の構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であると推測でき、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在し得る。リポフェクタミン−核酸複合体も企図される。
本発明の核酸分子は、例えば、米国特許第７，６６４，５４５号に記載される方法によって、エレクトロポレーションを介して投与することができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、米国特許第６，３０２，８７４号、第５，６７６，６４６号、第６，２４１，７０１号、第６，２３３，４８２号、第６，２１６，０３４号、第６，２０８，８９３号、第６，１９２，２７０号、第６，１８１，９６４号、第６，１５０，１４８号、第６，１２０，４９３号、第６，０９６，０２０号、第６，０６８，６５０号、および第５，７０２，３５９号に記載される方法および／または装置によって行うことができ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、低侵襲性デバイスを介して行われ得る。
低侵襲性エレクトロポレーションデバイス（「ＭＩＤ」）は、上述の組成物および関連する流体を体組織に注入するための装置であり得る。デバイスは、中空針、ＤＮＡカセット、および流体送達手段を備えることができ、デバイスは、針を前記体組織に挿入する間、ＤＮＡを体組織に同時に（例えば、自動的に）注入するように、使用中の流体送達手段を作動させるように適合される。これは、針が挿入されている間にＤＮＡおよび関連する流体を徐々に注入する能力が、体組織を通る流体のより均等な分布につながるという利点を有する。注入中に経験した疼痛は、より大きな領域にわたって注入されるＤＮＡの分布のために軽減され得る。
ＭＩＤは、針を使用することなく組成物を組織に注入してもよい。ＭＩＤは、組成物が組織の表面を貫通し、下部組織および／または筋肉に入るような力で、組成物を小さな流れまたはジェットとして注入することができる。小さな流れまたはジェットの背後にある力は、マイクロオリフィスを通して二酸化炭素などの圧縮ガスを数分の１秒以内に膨張させることによって、提供され得る。最小侵襲性エレクトロポレーションデバイスの例およびそれらの使用方法は、公開された米国特許出願第２００８／０２３４６５号、米国特許第６，５２０，９５０号、米国特許第７，１７１，２６４号、米国特許第６，２０８，８９３号、米国特許第６，００９，３４７号、米国特許第６，１２０，４９３号、米国特許第７，２４５，９６３号、米国特許第７，３２８，０６４号、および米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、これらのそれぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＩＤは、無痛に組織を貫通する液体の高速ジェットを作製するインジェクタを含んでよい。このような無針インジェクタは市販されている。本明細書で利用することができる無針インジェクタの例としては、米国特許第３，８０５，７８３号、第４，４４７，２２３号、第５，５０５，６９７号、および第４，３４２，３１０号に記載されるものが挙げられ、これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
直接または間接的エレクトロトランスポートに好適な形態の所望の組成物は、通常、組成物の組織内への浸透を引き起こすのに十分な力で、組織表面をインジェクタと接触させて薬剤のジェットの送達を作動させることによって、治療される組織内に無針インジェクタを使用して導入（例えば、注入）され得る。例えば、治療される組織が粘膜、皮膚または筋肉である場合、薬剤を、それぞれ角質層を通って真皮層に浸透させるか、または下部組織および筋肉に浸透させるのに十分な力で粘膜または皮膚表面に向かって薬剤を発射する。
無針インジェクタは、組成物をあらゆる種類の組織、特に皮膚および粘膜に送達するのに適している。いくつかの実施形態では、無針インジェクタを使用して、組成物を含有する液体を表面におよび対象の皮膚または粘膜に推進することができる。本発明の方法を使用して治療することができる様々な種類の組織の代表的な例としては、膵臓、喉頭、鼻咽頭、舌下、口腔咽頭、唇、のど、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、精巣、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
ＭＩＤは、組織をエレクトロポレーションする針電極を有し得る。例えば長方形または正方形のパターンで設定された、複数の電極配列における複数の電極対間でのパルス発生させることによって、一対の電極の間でのパルス発生させるよりも改善された結果を提供する。例えば、「薬物および遺伝子の媒介送達のための針電極（Ｎｅｅｄｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅｓ）」と題する米国特許第５，７０２，３５９号に開示されているのは、複数の対の針が治療中にパルス発生され得る針の配列である。参照により完全に記載されるように本明細書に組み込まれるこの出願において、針は円形の配列に配置されたが、針電極の対向する対の間にパルス発生を可能にするコネクタおよびスイッチング装置を有する。組換え発現ベクターを細胞に送達するための一対の針電極が使用され得る。このようなデバイスおよびシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、通常の注射針に似た１本の針でＤＮＡの注入とエレクトロポレーションを可能にし、現在使用されているデバイスによって送達されるものよりも低い電圧のパルスを印加する１本の針デバイスを使用でき、したがって、患者によって経験される電気感覚を低減できる。
ＭＩＤは、１つ以上の電極配列を含み得る。配列は、同じ直径または異なる直径の２つ以上の針を含んでよい。針は均等にまたは不均一に間隔を開けてもよい。針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ、または０．０１５インチ〜０．０２０インチであってよい。針は、直径０．０１７５インチであってよい。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上の間隔であってよい。
ＭＩＤは、パルス発生器と、組成物およびエレクトロポレーションパルスを単一の工程で送達する２つ以上の針組成インジェクタから構成され得る。パルスジェネレータは、フラッシュカードで操作されるパーソナルコンピュータを介してパルスおよび注入パラメータの柔軟なプログラミング、ならびにエレクトロポレーションおよび患者データの包括的な記録および記憶を可能にし得る。パルス発生器は、短時間の間に様々なボルトパルスを送達できる。例えば、パルス発生器は、持続時間が１００ミリ秒の１５ボルトのパルスを３回送出することができる。このようなＭＩＤの一例は、Ｉｎｏｖｉｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＥｌｇｅｎ １０００システムであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３２８，０６４号に記載されている。
ＭＩＤは、ＤＮＡ等の巨大分子の体内または植物内の選択された組織の細胞への導入を容易にするモジュール式電極システムであるＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ ＰＡ）デバイスおよびシステムであり得る。モジュール式電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性リンクを提供する電気コネクタ、および電源を含んでよい。操作者は、支持構造上に取り付けられた複数の針電極を把握し、それらを体内または植物内の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次いで、巨大分子は、皮下針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、一定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された一定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞内への巨大分子の導入を容易にする。細胞の過熱による細胞死は、一定電流パルスにより組織内の消費電力を制限することによって最小限に抑えられる。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａデバイスおよびシステムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２４５，９６３号に記載されている。
ＭＩＤは、エルゲン１０００システム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であり得る。エルゲン１０００システムは、中空の針を提供するデバイスと、流体送達手段とを含んでよく、ここで、装置は、使用中の流体送達手段を作動させて、本明細書に記載の組成物である流体を、針を前記体組織に挿入する間に、体組織に同時に（例えば自動的に）注入するように、適合される。利点は、針が挿入されている間に徐々に流体を注入することができることで、身体組織を通じて流体のより均等な分布につながることである。また、注入中に経験した痛みは、より大きな領域にわたって注入される流体の体積の分布により軽減されると考えられる。
加えて、流体の自動注入は、注入された流体の実際の用量の自動監視と登録を容易にする。このデータは、必要に応じて、文書化のために制御ユニットによって記憶され得る。
注入速度は、線形または非線形のいずれかであり得、注入は、処置される対象の皮膚を通して針が挿入された後、およびそれらが体組織内にさらに挿入される間に行われ得ることが理解される。
流体が本発明の装置によって注入され得る好適な組織としては、腫瘍組織、皮膚または肝臓組織が挙げられるが、筋肉組織でもあり得る。
本装置は、体組織への針の挿入を導くための針挿入手段をさらに含む。流体注入速度は、針挿入速度によって制御される。これは、注射液の針挿入および注入の両方を制御して、挿入速度を必要に応じて注入速度に合わせることができるという利点を有する。それはまた、使用者が操作するのをより容易にする。必要に応じて、体組織に針を自動的に挿入するための手段を提供することができる。
使用者は、液体の注入を開始時を選択することができる。しかしながら、理想的には、注射は、針の先端が筋肉組織に達したときに開始され、装置は、注射が開始するのに十分な深さまで針が挿入されたときに感知するための手段を含み得る。これは、針が所望の深さに達したとき（通常は筋肉組織が始まる深さになる）に液体の注入を自動的に開始するよう促すことができることを意味する。筋肉組織が始まる深さは、例えば、針が皮膚層を通過するのに十分であると見なされる４ｍｍの値などの予め設定された針挿入深さとすることができる。
感知手段は、超音波プローブを含んでよい。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を検知するための手段を含んでよい。この場合、手段は、そのように、体組織内の針の深さを記録するのではなく、むしろ、針が異なる種類の体組織から筋肉に移動するにつれて、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように適合され得る。これらの代替物のどちらも、注入が開始され得る感知手段を比較的正確で簡単な操作手段を提供する。針の挿入の深さを必要に応じてさらに記録することができ、注入される流体の体積が針挿入の深さが記録されているときに決定されるように、流体の注入を制御するために使用することができる。
本装置は、針を支持するための基部と、その中で基部を受け入れるための筐体とをさらに備えてよく、基部が筐体に対して移動可能であり、その結果、基部が筐体に対して第１の後方位置にあるときに針が筐体内に引っ込められ、基部が筐体内で第２の前方位置にあるときに針が筐体外に延びる。これは、筐体を患者の皮膚上に並べることができ、次いで基部に対して筐体を移動させることによって針を患者の皮膚に挿入することができるので、使用者にとって有利である。
上述のように、針が皮膚に挿入されるにつれて針の長さ全体にわたって流体が均一に分布するように、制御された速度の流体注入を達成することが望ましい。流体送達手段は、制御された速度で流体を注入するように適合されたピストン駆動手段を含んでよい。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータによって作動させることができる。しかしながら、ピストン駆動手段は、筐体に対して軸方向に移動される基部によって作動させることができる。流体送達の代替手段が提供され得ることが理解されよう。したがって、例えば、制御された速度または制御されていない速度で流体送達のために圧搾され得る閉鎖容器を、シリンジおよびピストンシステムの代わりに提供できる。
上述の装置は、あらゆるタイプの注入に使用され得る。しかしながら、エレクトロポレーションの分野において特に有用であると考えられ、したがって、それは、針に電圧を印加するための手段をさらに含んでよい。これにより、針を注入だけでなく、エレクトロポレーション中の電極として使用することができる。これは、電界が注入された流体と同じ領域に印加されることを意味するので、特に有利である。従来、エレクトロポレーションには、電極を以前に注入された流体と正確に位置合わせすることが非常に困難であるため、使用者はより大きな領域で、必要以上の体積の流体を注入し、注入物質と電界との重複を保証するために、より高い領域に電界を印加しようとする傾向があるという、問題があった。本発明を使用して、注入される流体の体積および印加される電界の大きさの両方を減少させながら、電界と流体との間の良好な適合を達成し得る。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換え核酸配列の存在を確認するために、様々なアッセイが行われ得る。このようなアッセイには、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）または当業者に周知の他のアッセイによって特定のペプチドの存在または非存在を検出するなどの「生化学的」アッセイが含まれる。
病状と治療方法
本発明は一実施形態では、本発明の合成オリゴヌクレオチドサプレッサーｔＲＮＡの導入を介して、ナンセンス変異に関連する存在する変異の効果を逆転させることによって嚢胞性線維症を治療するための組成物および方法を含む。
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される治療薬（例えば、修飾されたおよび／または安定化されたＡＣＥ−ｔＲＮＡ）をコードするタンパク質またはベクターを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の疾患を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本開示のある特定の実施形態は、哺乳動物の疾患の治療に有用な医薬を調製するための、本明細書に記載の治療薬または治療薬をコードするベクターの使用を提供する。ＰＴＣに関連する疾患または障害としては、ジストロフィンにおけるＰＴＣによるデュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィーの変形、ＲＢ１におけるＰＴＣによる網膜芽細胞腫、ＮＦ１またはＮＦ２におけるＰＴＣによる神経線維腫症、ＡＴＭにおけるＰＴＣによる毛細血管拡張性運動失調症、ＨＥＸＡにおけるＰＴＣによるテイ・サックス病、ＣＦＴＲにおけるＰＴＣによる嚢胞性線維症、ＷＴ１におけるＰＴＣによるウィルムス腫瘍、第ＶＩＩＩにおけるＰＴＣによる血友病Ａ、第ＩＸ因子におけるＰＴＣによる血友病Ｂ、ｐ５３におけるＰＴＣによるｐ５３関連癌、メンケス病、ウルリッヒ病、ベータグロビンにおけるＰＴＣによるβ−サラセミア、ヴィレブランド因子におけるＰＴＣによる２Ａ型および３型フォン・ヴィレブランド病、ロビノウ症候群、短指症Ｂ型（指および中手骨の短縮）、ＩＦＮＧＲ１におけるＰＴＣによるマイコバクテリア感染に対する遺伝的感受性、ＣＲＸにおけるＰＴＣによる遺伝性網膜疾患、凝固因子ＸにおけるＰＴＣによる遺伝性出血傾向、ロドプシンにおけるＰＴＣによる遺伝性失明、ＳＯＸ１０におけるＰＴＣによる先天性感音難聴および結腸無神経節症ならびにＳＯＸ１０におけるＰＴＣによる、感音難聴、結腸無神経節症、末梢神経障害および中枢性髄鞘形成不全性白質ジストロフィーを含む遺伝性神経発達障害、リドル症候群、色素異種皮症、ファンコニー貧血、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５３関連癌（例えばｐ５３扁平上皮癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌）、食道癌、骨癌、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、肝細胞癌、線維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性逆転、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病、ならびに多くの他の疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示はまた、本明細書に記載されるベクターを含有する哺乳動物細胞を提供する。細胞はヒトであり得る。
本開示のある特定の態様は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、および遺伝子操作細胞（インビボで修飾される）、ならびにそれらの使用に関する。特に、本開示は、治療有効用量の治療薬の全身送達の両方を可能にする遺伝子治療のための方法に関する。
一態様によれば、哺乳動物レシピエントにおいて治療薬を発現するための細胞発現系が提供される。発現系（本明細書では「遺伝子組換え細胞」とも称される）は、細胞と、治療薬を発現するための発現ベクターとを含む。発現ベクターとしては、異種遺伝物質を細胞に送達するためのウイルス、プラスミド、および他のビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、異種の遺伝物質を細胞に送達するためのビヒクルを指す。特に、発現ベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、またはレンチウイルスもしくはレトロウイルスベクターである。
発現ベクターは、異種遺伝子の転写を制御するためのプロモーターをさらに含む。プロモーターは、誘導性プロモーター（本明細書に記載）であり得る。発現系は、哺乳動物レシピエントへの投与に好適である。発現系は、複数の非不死化遺伝子組換え細胞を含み得、各細胞は、少なくとも１つの治療薬をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含有する。
細胞発現系はインビボで形成される。また別の態様によれば、インビボで哺乳動物レシピエントを治療するための方法が提供される。この方法は、異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターを、静脈内投与などを介して、インサイチュで患者の細胞に導入することを含む。インビボで発現系を形成するために、治療薬を発現するための発現ベクターを哺乳動物レシピエントにインビボで静脈内に導入する。
また別の態様によれば、インビボで哺乳動物レシピエントを治療するための方法が提供される。本方法は、標的治療薬をインビボで患者に導入することを含む。
異種遺伝子を発現するための発現ベクターには、異種遺伝子産物の転写を制御するための誘導性プロモーターが含まれ得る。したがって、インサイチュでの治療薬の送達は、異種遺伝子の転写を誘導する条件にインサイチュで細胞を曝露することによって制御される。
本開示は、発現ベクターを細胞または患者に投与することによって哺乳動物における疾患を治療する方法を提供する。遺伝子治療方法に関して、分子生物学および遺伝子治療の当業者は、過度の実験をすることなく、本開示の新規の方法で使用される発現ベクターの適切な用量および投与経路を決定することができるであろう。
本開示は、細胞または患者に少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することによって、哺乳動物における疾患を治療する方法を提供する。遺伝子治療法に関して、分子生物学および遺伝子治療の当業者は、過度の実験をすることなく、本開示の新規の方法で使用されるＡＣＥ−ｔＲＮＡの適切な用量および投与経路を決定することができるであろう。
一実施形態では、本開示は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または４個を超えるＡＣＥ−ｔＲＮＡまたはＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子を、細胞または患者に投与することによって、哺乳動物における疾患を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、複数のＡＣＥ−ｔＲＮＡまたは複数のＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子の投与を含み、複数のＡＣＥ−ｔＲＮＡの各々は、組成物中の他のＡＣＥ−ｔＲＮＡ由来の別個のアミノ酸の組み込みに特異的である。例えば、一実施形態では、本方法は、Ａｒｇをポリペプチドに組み込むための第１のＡＣＥ−ｔＲＮＡと、Ｇｌｙをポリペプチドに組み込むための第２のＡＣＥ−ｔＲＮＡの組み合わせの投与を含む。一実施形態において、複数のＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＰＴＣ（例えば、ＵＧＡ）に特異的である。一実施形態において、複数のＡＣＥ−ｔＲＮＡは、異なるＰＴＣに特異的である。
一実施形態によれば、細胞はインビボで、形質転換されるか、またはそうでなければ遺伝子組換えされる。哺乳動物レシピエント由来の細胞は、治療薬をコードする異種（例えば組換え）遺伝子を発現するための外来性遺伝物質を含有するベクターでインビボで形質転換（すなわち、形質導入またはトランスフェクション）され、治療薬はインサイチュで送達される。
本明細書で使用される場合、「外来性遺伝物質」は、細胞内に天然に見出されない、または細胞内に天然に見出される場合、細胞によって生物学的に有意なレベルで転写または発現されない、天然または合成のいずれかの核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。したがって、「外来性遺伝物質」は、例えば、ｔＲＮＡに転写され得る非天然起源の核酸を含む。
上述の開示された治療薬および遺伝子治療に適した状態は単なる例示であり、本開示の範囲を限定することを意図しない。既知の状態を治療するための好適な治療薬の選択は、過度の実験をすることなく当業者の範囲内であると見なされる。
ある特定の実施形態では、治療法には、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）によって引き起こされる疾患であって、デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、網膜芽細胞腫、神経線維腫症、毛細血管拡張性運動失調症、テイ・サックス病、嚢胞性線維症、ウィルムス腫瘍、血友病Ａ、血友病Ｂ、メンケス病、ウルリッヒ病、β−サラセミア、２Ａ型および３型フォン・ヴィレブランド病、ロビノウ症候群、短指症Ｂ型（指および中手骨の短縮）、マイコバクテリア感染に対する遺伝的感受性、遺伝性網膜疾患、遺伝性出血傾向、遺伝性失明、先天性感音難聴および結腸無神経節症ならびに感音難聴、結腸無神経節症、末梢神経障害および中枢性髄鞘形成不全性白質ジストロフィーを含む遺伝性神経発達障害、リドル症候群、色素性乾皮症、ファンコニー貧血、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５３関連癌（例えば、ｐ５３扁平上皮（ｓｑｕａｍａｌ）細胞癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌）、食道癌、骨癌、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、肝細胞癌、繊維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性転換、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病、が含まれるが、これらに限定されない、疾患の、治療／管理に潜在的な用途がある。この治療法は、改善された終止コドン抑制特異性を提供する点で有利である。本発明の治療用ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、例えば、特定の終止コドンＴＧＡを標的とし、したがって、疾患とは無関係の終止コドンにおけるオフターゲット効果を低減する。本治療法は、アミノ酸特異性を提供する点でも有利である。発現されたｔＲＮＡは、疾患停止コドンの挿入を介して失われたアミノ酸を特異的に置換するように設計され、したがって、タンパク質の安定性、折り畳みおよび輸送に対する任意の偽の効果（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ）を否定する。
ある特定の実施形態では、この系はモジュール的であり、したがって、あらゆる可能性のある疾患ＰＴＣに対して「個別化」され得る。例えば、Ｔｒｐシンターゼによって認識されるヒトゲノム中に９つの個々のトリプトファンｔＲＮＡが存在し、これら全てがｍＲＮＡ ＵＧＧコドンを抑制する。したがって、これらの９つのＴｒｐ ｔＲＮＡの各々は、コドン再編集耐性（ＵＧＧ→ＵＧＡ）の機会を提供する。さらに、遺伝暗号における終止コドンへの近接性考えると、アルギニンコドンのＰＴＣナンセンスコドンへの変異は、疾患において一般的である。コドン編集耐性および抑制効果について試験することができる３０を超えるＡｒｇ ｔＲＮＡが存在する。
本発明のさらなる利点は、系全体（ｔＲＮＡ＋プロモーター配列）がコンパクトであるため、容易な発現および細胞特異的送達を提供することである。
本発明の薬剤の投与量、製剤および投与経路
本発明の薬剤は、遺伝子疾患（例えば、嚢胞性線維症）に関連する少なくとも１つの症状の低減をもたらすように投与される。投与される量は、選択される組成、特定の疾患、体重、健康状態、および哺乳動物の年齢、ならびに予防または治療が達成されるかどうかを含むが、これらに限定されない様々な要因に応じて変化する。かかる因子は、当該技術分野において周知である動物モデルまたは他の試験システムを用いる臨床医によって容易に決定することができる。
本発明は、本発明の薬剤、例えば、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ、発現ベクター、またはウイルス粒子の投与によって、ＰＴＣに関連する疾患または障害を治療することを想定する。本発明による治療薬の投与は、例えば、投与の目的が治療的または予防的であるかどうか、および当業者に既知の他の要因であるかどうか、レシピエントの生理学的状態に応じて、連続的または断続的であり得る。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔を空けた用量であってもよい。局所投与および全身投与の両方が想定される。
本発明の治療剤（複数可）を有する１つ以上の好適な単位剤形は、以下で論じるように、任意選択で（例えば、マイクロカプセル化を使用して）徐放のために製剤化されてもよく、静脈内および筋肉内経路を含む非経口を含む様々な経路によって、ならびに疾患組織への直接注射によって投与されてもよい。製剤は、適切な場合、個別の単位剤形で好都合に提示され得、薬学的に周知の方法のいずれかによって調製され得る。このような方法は、治療薬を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、細かく分割された固体担体またはそれらの組み合わせと会合させ、次いで必要に応じて、所望の送達系に生成物を導入または成形するステップを含み得る。
本発明の治療薬が投与のために調製されるとき、それらは、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、薬学的製剤、または単位剤形を形成し得る。このような製剤中の総有効成分としては、製剤の０．１〜９９．９重量％が含まれる。「薬学的に許容される」は、製剤の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに有害ではない担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩である。投与のための活性成分は、粉末または顆粒として、溶液、懸濁液または乳剤として存在し得る。
本発明の治療薬を含有する薬学的製剤は、周知のかつ容易に入手可能な成分を使用して当該技術分野で公知の手順によって調製され得る。本発明の治療薬は、例えば筋肉内、皮下、または静脈内経路による非経口投与に適切な溶液として製剤化されてもよい。
本発明の治療薬の薬学的製剤は、水溶液もしくは無水溶液もしくは分散液の形態、または代わりに、乳剤もしくは懸濁液の形態をとることもできる。
したがって、治療剤は、非経口投与のために（例えば、注射、例えば、ボーラス投与または連続注入によって）製剤化されてもよく、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入容器、または添加された防腐剤を有する複数回投与容器（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）での単位用量形態で提示されてもよい。活性成分は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳剤等の形態をとり得、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤等の調合剤用剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有し得る。あるいは、有効成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌された発熱物質を含まない水で構成するために、滅菌固体の無菌単離または溶液から凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。
各剤形の個々のエアロゾル用量に含まれる有効成分（複数可）の単位含有量は、複数の剤形単位の投与によって必要な有効量に達することができるため、それ自体が特定の適応症または疾患を治療するための有効量を構成する必要はないことが理解されるであろう。さらに、有効量は、個別に、または一連の投与のいずれかで、剤形中の用量未満を使用して達成され得る。
本発明の薬学的製剤は、任意の成分として、薬学的に許容される担体、希釈剤、可溶化剤または乳化剤、ならびに当該技術分野で周知である種類の塩を含んでよい。本発明の薬学的製剤に有用な担体および／または希釈剤の具体的な非限定的な例としては、水および生理的に許容される緩衝生理食塩水溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液ｐＨ７．０〜８．０および水が挙げられる。
投与方法
本明細書では、本明細書に記載される１つ以上の組成物を対象に投与することによって、治療、保護、および／または予防を必要とする対象のＰＴＣ関連疾患を治療、保護、および／または予防する方法を提供する。
組成物用量は、１μｇ〜１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／回であり得、２０μｇ〜１０ｍｇの成分／ｋｇ体重／回であり得る。組物は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のための組成物の投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回にすることができる。
組成物は、医薬分野の当業者に周知の標準的な技術に従って製剤化され得る。このような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、および状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、医療分野の当業者に周知の投与量および技術で投与され得る。
組成物は、予防的または治療的に投与され得る。治療用途では、組成物は、治療効果を引き出すのに十分な量で、治療を必要とする対象に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、投与される組成物レジメンの特定の組成物、投与方法、疾患の段階および重症度、対象の一般的な健康状態、および処方医の判断に依存するであろう。
組成物は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７））、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６年１２月３日に発行された、米国特許第５，５８０，８５９号）、Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９９７年１２月３０日に発行された米国特許第５，７０３，０５５号）、およびＣａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７年１０月２１日に発行された米国特許第５，６７９，６４７号）に記載されているように当技術分野で周知の方法によって投与することができ、これらの全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。組成物のＤＮＡは、例えば、ワクチン銃を使用して個体に投与され得る粒子またはビーズに複合化することができる。生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを当業者は知っているであろう。
組成物は、様々な経路を介して送達され得る。典型的な送達経路としては、非経口投与、例えば、皮膚内、筋肉内または皮下送達が挙げられる。他の経路としては、経口投与、鼻腔内、および膣内経路が挙げられる。特に組成物のＤＮＡについては、組成物を個体の組織の間質空に送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，７０３，０５５号（これらの全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。組成物はまた、筋肉に投与され得るか、または皮膚内または皮下注射を介して、または経皮的に、例えばイオン導入によって投与され得る。組成物の表皮投与を用いることもできる。表皮投与は、表皮の最外層を機械的または化学的に刺激して、刺激剤に対する免疫応答を刺激することを含み得る（Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６７９，６４７号（この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
組成物は、鼻腔を介して投与するために製剤化することもできる。担体が固体である、経鼻投与に好適な製剤は、例えば、約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含むことができ、これは嗅ぎタバコを服用する方法で、すなわち鼻の近くに保持される粉末の容器から鼻腔を介して急速に吸入することによって、投与される。製剤は、鼻腔用スプレー、点鼻薬、またはネブライザーによるエアロゾル投与によるものであってよい。製剤は、組成物の水溶液または油性溶液を含むことができる。
組成物は、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤などの液体調製物であり得る。組成物は、滅菌懸濁液または乳剤などの非経口、皮下、皮膚内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注射可能な投与）のための調製物でもあり得る。
組成物は、リポソーム、マイクロスフィア、または他のポリマーマトリックスに組み込まれ得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，７０３，０５５号、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉｔｏ ＩＩＩ（第２版１９９３）、その内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり得、比較的簡単に作製および投与される無毒な、生理学的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
ＡＣＥ−ｔＲＮＡまたはＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入、頬投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせを含む様々な経路によって投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的診療に従って、適切に許容される製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、または超音波などの他の物理的方法によって投与されてもよい。
ＡＣＥ−ｔＲＮＡまたはＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子は、インビボエレクトロポレーション、リポソーム媒介、ナノ粒子促進、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組換えワクシニア等の組換えベクターとともにおよびそれらを伴わず、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含むいくつかの周知の技術によって哺乳動物に送達され得る。ＡＣＥ−ｔＲＮＡまたはＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子は、ＤＮＡ注入を介して、インビボエレクトロポレーションと一緒に送達され得る。
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションを介した組成物の投与は、可逆的な孔を細胞膜内に形成させるのに有効なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得るエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者による予め設定された電流入力と同様の定電流である。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含み得る。エレクトロポレーション構成要素は、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力素子、状態報告素子、通信ポート、メモリ構成要素、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーションデバイスの様々な素子のうちの１つ以上を含み、組み込み得る。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にできる、インビボエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレータ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を使用して達成され得る。
エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの１つの素子として機能し得、他の素子は、エレクトロポレーション構成要素と通信する別個の素子（または構成要素）である。エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの２つ以上の素子として機能でき、エレクトロポレーション構成要素とは別個のエレクトロポレーションデバイスのさらに他の素子と通信し得る。１つの電気機械デバイスまたは機械デバイスの一部として存在するエレクトロポレーションデバイスの素子は、素子が１つのデバイスとして機能することができるか、または互いに通信する別個の素子として機能することができるため、限定されなくてよい。エレクトロポレーション構成要素は、所望の組織内に定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができ得、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極配列を含んでよく、電極アセンブリは、エレクトロポレーション構成要素からエネルギーパルスを受信し、電極を通じて所望の組織にそれを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達中に中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、インピーダンスをエレクトロポレーション構成要素に伝達する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信でき、エレクトロポレーション構成要素によって送達されるエネルギーのパルスを調節して、定電流を維持することができる。
複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送達し得る。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下で電極の制御を通じて分散パターンのエネルギーパルスを送達し得、プログラムされたシーケンスは、使用者によってエレクトロポレーション構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、シーケンス中に送達される複数のパルスを含んでよく、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの後続のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。
フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行され得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実行され得る。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓごとに生じるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは即時的（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技術によって決定されるように、実質的に即時的）である。中性電極は、所望の組織内のインピーダンスを測定し、フィードバック機構にインピーダンスを伝達し得、フィードバック機構は、インピーダンスに応答し、定電流を予め設定された電流と同様の値に維持するためにエネルギーのパルスを調整する。フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中に連続的かつ即時的に定電流を維持し得る。
本発明の組成物の送達を容易にし得るエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法の例としては、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．によって提出された米国特許公開２００５／００５２６３０（その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものが含まれる。組成物の送達を容易にするために使用され得る他のエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法としては、２００７年１０月１７日に出願された米国特許出願第１１／８７４０７２号（２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された第６０／９７８，９８２号に対して米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、これらの全てが本明細書に組み込まれる）に提供されるものが挙げられる。
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生物分子の導入を容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用を記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性リンクを提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。操作者は、支持構造上に取り付けられた複数の針電極を把握し、それらを体内または植物内の選択された組織に確実に挿入することができる。次いで、生体分子が皮下針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加される定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞への生体分子の導入を容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．によって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生物分子の導入を効果的に促進するために使用され得るエレクトロポレーションデバイスを記載している。エレクトロポレーションデバイスは、ソフトウェアまたはファームウェアによって動作が指定される導電デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を備える。ＥＫＤデバイスは、使用者による制御およびパルスパラメータの入力に基づいて配列内の電極間の一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスはまた、針電極の配列を有する交換可能な電極ディスク、注射針のための中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクを備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許第２００５／００５２６３０号に記載の電極配列および方法は、筋肉等の組織だけでなく、他の組織または臓器への深部浸透のために適合され得る。電極アレイの構成のため、注射針（選択した生体分子を送達するため）も標的臓器中に完全に挿入され、注入は、電極によって予め定義された領域で標的課題に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは長さ２０ｍｍおよび２１ゲージである。
加えて、エレクトロポレーションデバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態で企図されるものには、以下の特許に記載されるものであるエレクトロポレーションデバイスがある：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された米国特許第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日に発行された米国特許第６，９５８，０６０号、２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号。さらに、様々なデバイスのいずれかを使用したＤＮＡの送達に関する２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡの注入方法に引き出された２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号に提供される主題を網羅する特許が、本明細書において企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。
ＡＣＥ−ｔＲＮＡの調製方法
本明細書では、本明細書で論じられるＡＣＥ−ｔＲＮＡを含むＤＮＡプラスミドを調製するための方法が提供される。ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップの後、当該技術分野において既知の方法を使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養物を接種するために使用することができる。
本発明のＥＰデバイスで使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知のデバイスおよび技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９／０００４７１６号に記載されている最適化プラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの実施例では、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に知られている様々なデバイスおよびプロトコルを含むか、または組み込む。上記の出願および特許、それぞれ米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
定義
疾患状態：本発明の目的のために、「疾患状態」または「疾患表現型」は、細胞内の遺伝子のコード領域内の終止コドンから生じる哺乳動物細胞の特徴である（例えば、ナンセンス変異から生じる）。例えば、ヒト遺伝子疾患の増加は、ナンセンス変異によって引き起こされると考えられている（例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１３２７，１９９４を参照されたい）。いくつかの例を挙げると、β−サレセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、色素異種症、ファンコニー貧血、および嚢胞性線維症は、全て特定された遺伝子におけるナンセンス変異によって引き起こされ得る。
内在性ｔＲＮＡ合成酵素：ｔＲＮＡ合成酵素は、本発明に従ってｔＲＮＡが導入される細胞内に存在する場合、細胞に対して「内在性」であると見なされる。当業者に明らかであろうように、ｔＲＮＡ合成酵素は、関連するタイプの細胞に天然に見出されるかどうか、または問題の特定の細胞が操作されているかどうか、またはそれを含有または発現するために人間の手によって操作されているかどうかに関わらず、これらの目的のために内在性であると見なされ得る。
サプレッサーｔＲＮＡ：「サプレッサーｔＲＮＡ」は、他の場合翻訳を終了するであろうコドンとアンチコドンが相補的であるものであり、実験の条件下で検出可能なリードスルーが発生するものである。標準的な終結コドンは、アンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）、およびオパール（ＵＧＡ）コドンである。しかしながら、非標準的な終結コドン（例えば、４ヌクレオチドコドン）も文献で用いられている（例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：１９５，２０００；Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１２１９４，１９９９を参照されたい）。
ここで、本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
実施例１
遺伝暗号は、４つのヌクレオチドを使用し、次にＤＮＡからタンパク質への翻訳の基礎形成するトリプレットコドンを形成する。コドンは全部で６４個あり、そのうち６１個はアミノ酸をコードするために使用され、そのうちの３個（ＴＡＧ、ＴＧＡ、およびＴＡＡ）はタンパク質終端の「終止」または「ナンセンス」コドンをコードする。
嚢胞性線維症の症例の５〜１０パーセントは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の早期トランケーションをもたらす「ナンセンス」変異によって引き起こされる。この「クラス１」変異の例は、ＣＦＴＲ機能の喪失および重度の嚢胞性線維症表現型を引き起こす、ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｘ、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）である。アタルレンなどのいくつかの化合物は、疾患を引き起こすナンセンス変異のストップリードスルーを促進するが、終止コドン特異性が乏しくおよびインビボでのコドンスキッピングの効率が予想外に低いことを含む多くの注意事項のために、治療法としてあまり成功していない。しかしながら、これらの化合物の広範な使用および、内在性終止コドンリードスルーが後生生物において一般的であるという発見は、細胞型のサブセット、すなわち、気道上皮に送達された場合、補助的な抑制が可能であることを示唆する。しかしながら、治療的に補助される終止コドンリードスルーが成功する場合、ナンセンスコドンの位置にアミノ酸の非選択的な組み込みは、タンパク質の折り畳み、輸送、および機能に影響を及ぼす可能性がある（ＣＦＴＲ１２８２Ｘの場合と同様）ため、追加の治療介入を必要とする。したがって、急性の満たされていない必要性は、疾患のＰＴＣの性質および潜在的な治療上のサプレッサー、一般的には、ＰＴＣ疾患のより効果的な治療法、を理解するという満たされていない緊急のニーズがある。
この実施例は、ＣＦＴＲｐ．Ｔｒｐ １２８２Ｘチャネルのレスキューのためのアンチコドン編集（ＡＣＥ）Ｔｒｐ−ｔＲＮＡを特徴とする。このようなｔＲＮＡは、疾患を引き起こすＴＧＡ終止コドンを「抑制」し、ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｘ ＣＦＴＲで元のアミノ酸Ｔｒｐを組み込むように操作され、実際には、野生型ＣＦＴＲタンパク質を遺伝子的に再構築する。データは、この一般的なアプローチ（ナンセンス抑制）が、接着細胞におけるｔＲＮＡとその同族合成酵素の一過性トランスフェクション、またはそれらのより自然の気道細胞型、例えばＡ５４９気道細胞へのウイルスベース送達のいずれかを通じて、フレーム内終止コドンを担持する転写産物の強力なレスキューを生じることを示す。このアプローチは、既存の戦略よりも多くの大きなメリットを提供する。１）コドン特異性の向上−発現ｔＲＮＡは、特定の終止コドンに向けられ得るため、疾患とは無関係の終止コドンにおけるオフターゲット効果を低減する。２）アミノ酸特異性−発現ｔＲＮＡおよび／または合成酵素は、疾患終止コドンの挿入を介して失われたアミノ酸を置き換えるように操作することができ、したがって、ＣＦＴＲの安定性、折り畳みおよび輸送に対するいかなる偽の影響も否定する。３）チューナビリティ−系は、ｔＲＮＡおよびＰＴＣ変異のタイプごとに理論的に個別化することができる。４）容易な発現−系全体がコンパクト（１ｋｂ未満）であり、一時的に、またはｔＲＮＡのナノ粒子送達を介して、簡単にパッケージ化して発現することができる。５）一般的な戦略の原理的証明−インフレームの終止コドンは、ヒト疾患の主要な原因であり、治療の選択肢がほとんど存在しない。ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｘで行われる実験は、他のＣＦＴＲナンセンスコドンのメカニズムについての洞察につながると期待される。
データは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ終止コドンサプレッサーｔＲＮＡが、導入された終止部位を含有する転写産物の「レスキュー」に効果のあることを示し（図６Ａおよび６Ｂ）、そのようなｔＲＮＡが、疾患の終止部位の治療的レスキューにおける主要な生物学的ハードルとして、ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を妨害する可能性を有することを示唆する。したがって、サプレッサーｔＲＮＡを使用して、疾患におけるＮＭＤに対するより多くの分子的洞察を得る可能性を開く。
結果
終止部位、例えばＴＧＡ、を抑制するためにアンチコドン編集され、その指定されたコドンではない真核生物のｔＲＮＡを開発した。これらを、ＴＧＡ部位を含有するリンカーによって分離されるｅＧＦＰ配列を有するフレーム内の蛍光タンパク質（ｃｈｅｒｒｙ）からなる試験構築物上での５つのヒトトリプトファンｔＲＮＡで試験した。完全長タンパク質の産生を示すために、ｅＧＦＰリーディングフレームのＣ末端にＨＡエピトープを追加した。この試験システムは、ｃｈｅｒｒｙシグナルの視覚的な外観がプラスミド送達および発現を示し、ｅＧＦＰレスキューと組み合わせてＴＧＡ抑制を示すために有用である。図６Ａおよび６Ｂのデータは、この試験構築物を使用して、５つのアンチコドン編集Ｔｒｐ ｔＲＮＡヒトが、ｃｈｅｒｒｙとｅＧＦＰリーディングフレームとの間の短いリンカーにおけるＴＧＡ終止部位を抑制する能力をアッセイするウエスタンブロットデータを示す。これらの構築物のうち、候補１、２、３、および５は、この点に関して中程度の活性を示す。これは、変異に対する構造的耐性、または単一塩基だけであってもアンチコドンを変化させることによって、Ｔｒｐ合成酵素がトリプトファンでｔＲＮＡを認識および／またはアシル化する能力を妨害する可能性に起因し得る。しかしながら、これらの試験ｔＲＮＡの第４番（ｔＲＮＡ＃４）は、ＴＧＡ部位の有意な抑制活性を示し、完全長のｃｈｅｒｒｙ−ｅＧＦＰ−ＨＡタンパク質を産生する（図６Ｂ）。さらに、図６Ｂの最後のレーン、同時発現ｔＲＮＡの不在下では、リードスルーは見られなかった。
方法
Ｔｒｐ ｔＲＮＡを、コドン編集耐性（ＴＧＧ→ＴＧＡ）および一過性にトランスフェクションしたタンデムフルオロフォア（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＧＡ−ＧＦＰ）およびＣＦＴＲＴｒｐ１２８２Ｘの標的ＴＧＡ試験部位を抑制する能力について調べた。５／９Ｔｒｐ ｔＲＮＡの最初のスクリーニングで、アンチコドン編集Ｔｒｐ−ｔＲＮＡが発見され、それはＨＥＫ細胞内で一過性にトランスフェクションされ、ｃｈｅｒｒｙ−ＴＧＡ−ｅＧＦＰ−ＨＡ試験構築物をレスキューするための「スタンドアローン」機能を有する（図６Ｂ）。ＨＡエピトープの選択的存在は、成功したレスキュー、および単一細胞レベルにおけるｃｈｅｒｒｙおよびｅＧＦＰ蛍光の両方の共焦点検査を示す（図示せず）。この結果は、ａ）いくつかのＡＣＥ−ｔＲＮＡがアンチコドン編集を許容することができること、ｂ）これらのｔＲＮＡが、内在性トリプトファン合成酵素によってＴｒｐでアシル化される能力を保持すること、およびｃ）これらのｔＲＮＡが、オープンタンパク質リーディングフレーム内に埋め込まれたＴＧＡ部位を抑制することができることの原理データの証明を提供する。
残りの４つのＴｒｐ−ｔＲＮＡは、ＴＡＡからＴＧＡサプレッサーへのアンチコドン編集の耐性について機能的に検査する。これらのアンチコドン編集ｔＲＮＡは、ｃｈｅｒｒｙ−ＴＧＡ−ｅＧＦＰＨＡクローンをレスキューする能力について試験される。ｃｈｅｒｒｙおよびｅＧＦＰシグナルならびにＨＡエピトープについて生化学（ウエスタンブロット）データを取得する。ここでは、ｃｈｅｒｒｙの発現が陽性トランスフェクション対照の役割を果たす。共焦点イメージングは、単一細胞レベルでのｃｈｅｒｒｙおよびｅＧＦＰ蛍光を検証する。
トリプトファンアミノ酸でＡＣＥ−Ｔｒｐ ｔＲＮＡをチャージする内在性Ｔｒｐ合成酵素の忠実度は、精製されたレスキューされたｃｈｅｒｒｙ−Ｔｒｐ−ｅＧＦＰＨＡタンパク質のトリプシン分解断片の質量分析によって決定される。ｃｈｅｒｒｙとｅＧＦＰのリーディングフレームの間のリンカーから生成されるトリプシン分解断片の予測質量は、次のとおりである。予測質量１５９０．８１３５のＫＰＩＮＱＷＰＡＮＴＨＥＲ、太字Ｗは組み込み部位を示す、図１０。したがって、これは、野生型アミノ酸でのナンセンスコドン修復および置換の第１の例を表し、したがって、治療用アタルランなどの既存のアプローチよりも著しい進歩である。後述の例では、化合物は、間違ったアミノ酸でナンセンスコドンのリードスルーを促進するため、ストリンジェントな修復を提供する新しいｔＲＮＡ配列の発見および同定は重要である。
上記で特定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡによる一過性にトランスフェクションされたＣＦＴＲ １２８２Ｘチャネルのレスキューは、ＢおよびＣグリコシル化ＣＦＴＲバンド２０の完全成熟のための標準的な生化学方法によって評価される。したがって、チャネルは、野生型アミノ酸で修復され、完全に機能し、細胞膜への輸送に成功している。
次のステップは、電気生理学的アプローチ（単一細胞パッチクランプおよびウッシングチャンバー）および生化学的アプローチを使用して、上記で同定したＡＣＥ−ｔＲＮＡ系でレスキューされたＣＦＴＲ Ｔｒｐ１２８２Ｘチャネルを機能的に特徴付けることである。１２８２ＸｍＲＮＡのナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を減少させるための発現ｔＲＮＡの有効性を定量的ｒｔＰＣＲで評価する。再プログラムされたヒト気道細胞を使用して、天然１２８２Ｘ ＣＦＴＲチャネルの発現コドン編集Ｔｒｐ−ｔＲＮＡレスキューを試験する。
同定されたヒトＴｒｐ ｔＲＮＡにおいてアンチコドン編集が許容され、この７５塩基対転移ＲＮＡが試験構築物内のインフレームＴＧＡコドンを抑制できることが示される。これらの実験は、この発見を推測して、このＡＣＥ−ｔＲＮＡがＣＦＴＲ １２８２ＴＧＡｍＲＮＡと相互作用し、モデル細胞（ＦＲＴおよびＡ５４９）ならびにａｓｐ．１２８２Ｘヒト再プログラムされた気道細胞において機能的ＣＦＴＲチャネルを生成する能力を特徴付ける。
一過性発現ＣＦＴＲ１２８２Ｘチャネル、ならびに再プログラムされた気道細胞におけるレスキューレベルの生化学的決定抗体Ｍ３Ａ７は、レスキューされたもの（エピトープはａａ １３７０〜１３８０である）を認識し、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅを通じて入手可能なＭＭ１３〜４様Ｎ末端に結合している抗体（エピトープａａ２５〜３６）は、レスキューされたおよびレスキューされない全てのＣＦＴＲを検出するために使用される。あるいは、Ｌ１２Ｂ４（エピトープａａ ３８６−４１２、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または６６０（エピトープａａ５７６−５８５、）は、Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを通じて入手可能である。
表面機能性は、電気生理学的アプローチの、パッチクランプ、およびウッシングチャンバーの記録を通じて検査される。１２８２Ｘ ｍＲＮＡの安定性および存在量は、一過性に発現する細胞および再プログラムされた気道細胞からのＲＮＡ抽出物の定量的ｒｔＰＣＲによってアッセイされる。
ヒト気道細胞からのＲＮＡトランススクリプトームデータのバイオインフォマティクス分析は、転写産物を含有するＴＧＡコドンの存在量、状況および同一性を特定する。ＴＧＡを通常の終止部位に使用する上位１０の発現している転写産物は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ発現の前後にタンパク質生化学によって個々の転写産物のレベルでフォローアップされる。細胞アポトーシスの生化学的および免疫組織学的プローブもまた、細胞死におけるＡＣＥ−ｔＲＮＡの影響を調べるために使用される。
結論として、データは、インフレーム終止部位を有するイオンチャネル遺伝子が、このタイプの「レスキュー」に適していることを示し（図９）、系の構成要素は、気道細胞内でウイルスによって発現することができる。さらに、このアイデアの高度に単純化された形態である、ヒト起源のＡＣＥ−ｔＲＮＡは、哺乳動物細胞株におけるインフレームＣＦＴＲ ＴＧＡコドンをレスキューする「スタンドアローン」能力を示す（図９）。このアプローチは、既存の終止コドン戦略と比較して多くの利点を有し、１）ナンセンス変異依存分解機構を抑止する、２）肺細胞調製で機能する、および３）ＣＦＴＲ １２８２Ｘを特異的にレスキューする、ＡＣＥ−ｔＲＮＡの能力に関して、より詳細な検討に値する。
実施例２
いくつかの異なるナンセンス変異は、ＣＦを引き起こし、したがって、全てのＣＦ疾患のおよそ１０％の原因となる。図７．これらの症例は、１０個の特定の遺伝子病変に集中している：Ｅ６０Ｘ、Ｒ７５Ｘ、Ｇ５４２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｑ８９０Ｘ、Ｙ１０９２Ｘ、Ｒ１１５８Ｘ、Ｒ１１６２ＸおよびＷ１２８２Ｘ。スクリーニングを開発して、既存のヒトｔＲＮＡ配列を、アンチコドン編集に対する改変および耐性についてスクリーニングした。この目的のために、約１４４個のＡＣＥ−ｔＲＮＡが、疾患原因性ナンセンスコドンの修復および完全長タンパク質の発現を促進するために使用することができるものについて試験する候補であった。具体的には、図１１に記載されるスキームを使用して、ｔＲＮＡライブラリを生成して、上位のＣＦ原因性ナンセンス変異を修復する能力を有するＡＣＥ ｔＲＮＡをコードする新規ｔＲＮＡ配列を特定した。具体的には、１０ｎｇのＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするアニールオリゴを、５０ｎｇのＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミド、１μｌの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、１μｌのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）、１０ｍＭのＡＴＰ、および１μｌのＢｂｓＩ（ＮＥＢ）と組み合わせ、図１１に記載されるようにサーモサイクラー中で循環させた。１μｌの反応物をコンピテントなＥ．ｃｏｌｉで形質転換させ、形質転換体をアンピシリン寒天プレート上にプレーティングした。プレートごとに１つの形質転換体を採取し、アンピシリン選択下１ｍｌのＬＢ中で増殖させ、ミニプレップし、配列を検証した。
最初にスクリーニング試験を実施して、トリプトファンおよびグリシンから最良のＡＣＥ−ｔＲＮＡ候補を特定した。ＡＣＥ−ｔＲＮＡを有するＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミドの１２５ｎｇの配列検証したミニプレップｃＤＮＡを、リン酸カルシウムを使用してＨＥＫ細胞にトランスフェクションした。ＨＥＫ細胞を前日に４×１０4で９６ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクションの２４時間後、培地を２０μｌのＰＢＳに置き換え、１５μｌのＮａｎｏＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。プレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。データは、３以上の反復である。図８．データは、ほとんどのｔＲＮＡが不十分なコドン編集耐性を示すことを示す。しかしながら、ＡＣＥ−ＴｒｐおよびＡＣＥ−Ｇｌｙ ｔＲＮＡの識別により、画面から明確な高性能ｔＲＮＡが現れ、それは、バックグラウンドの２０倍〜１３０倍のナンセンスコドン含有タンパク質のレスキューを示す。
これらの新規なｔＲＮＡが、ナンセンスコドンを有するＣＦＴＲチャネルをレスキューすることができることを評価するために、これらを、哺乳動物ＨＥＫ細胞内でＣＦＴＲ Ｗ１２８２Ｘ ｃＤＮＡプラスミドと同時発現させた。細胞調製物を、ＣＦＴＲタンパク質のウエスタンブロット評価を介する標準的な生化学的アプローチによって分析した。ＣＦＴＲタンパク質が確立されているマルチバンドパターンを示すため、この方法は、この目的のために非常に有利である。具体的には、「Ｂ」および「Ｃ」バンドは、それぞれ、細胞表面における完全長および完全成熟の、翻訳後に進行したＣＦＴＲタンパク質を表す。この場合、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２のＡＣＴ−ｔＲＮＡによるレスキューは両方とも、「Ｂ」および「Ｃ」のＣＦＴＲ免疫陽性（抗体ＭＡ３７）バンドの強力な集団を生成し、前記完全長のｔＲＮＡによる、正常に輸送されたイオンチャネルタンパク質の促進を示す。図９．
実施例３
Ｔ−ステム修飾により、ナンセンス抑制が著しく向上する。図１０．ナンセンスコドンの抑制およびタンパク質発現の促進を目的としてそれらの機能をさらに有効にするためｔＲＮＡの追加の修飾を行われた。理論に拘束されることなく、図１０に示されるｔＲＮＡ‘ｔ−ステム’ループ内で合理的に導入された変異が、より安定で、ナンセンスコドン抑制に機能的により強力なｔＲＮＡ分子をもたらすと仮定した。この目的のために、単一および二重変異を、トリプトファンＴＧＡナンセンスコドンのレスキューのための活性で特定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡであるｔＲＮＡＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９のｔ−ステムループに直接操作した。したがって、３８個のｔＲＮＡ ｔ−ステムバリアントを生成し、図４に示すナンセンスレスキューレポーター構築物で一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ細胞においてスクリーニングした。トランスフェクションの２４時間後、図１０に示すように細胞をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。データは、強い変動を示し、抑制活性を増強した様々なｔ−ステムループ配列を有する新規ｔＲＮＡ配列を識別する。特に、そのような突然変異体であるＴＳ−３８５２−６２Ｇ−Ｃは、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９の抑制能力を約２５０％増強する（図１２）。これは一般化可能な修飾であり、すなわち、実施例１および２によって同定される新しいｔＲＮＡ配列は、さらなる理論的修飾を通じて（ナンセンスコドンをレスキューする能力のために）より良いものにすることができる。このようなアプローチは、低濃度の標的ＲＮＡを有する組織型か、またはｔＲＮＡ送達が限定的であり得る場合に対するＡＣＥ−ｔＲＮＡの治療的有用性を補助する。
実施例４
新しいタイプのｔＲＮＡによるヌクレオチド組成とナンセンスコドンを抑制する機能的能力の同定を可能にするために、ハイスループットクローニング、図１１のために、ワンポットクローニング反応を備えたオールインワンプラスミドを発明した。このアプローチは、標準的な９６ウェルフォーマットでルシフェラーゼ活性を介したＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性の容易な調査を可能にする。簡単に説明すると、ｔＲＮＡをコードする合成ヌクレオチド配列は、図１１に示されるＴＧＡナンセンスレポータープラスミドバリアントの例とともに、ＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミドにライゲーションされる。ＴＡＡ（オパール）およびＴＡＧ（アンバー）終止コドンレスキューベクターは、図１６〜１９でうまく設計され、実装されている。この利点は、このアプローチが、ｔＲＮＡライブラリをコードするＤＮＡオリゴを、制限酵素およびリガーゼの存在下で、ｔＲＮＡ挿入物（図１１）のほぼ１００％組み込みに押し進められた反応、すなわち「ワンポット」の呼称、で、ＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミド内でライゲーションされ得ることである。反応物をＥ．ｃｏｌｉで形質転換させ、得られたｃＤＮＡを標準的な方法によって精製する。本発明の方法の別の利点は、ｔＲＮＡおよびレポーターｇｅｎが単一発現カセット内にあるため、生物学的変動を低下させ、ｔＲＮＡ抑制活性の結果として得られたスクリーニングで得られるデータ品質を改善することである。次いで、精製したｃＤＮＡプラスミドを、推測されるルシフェラーゼ活性によってナンセンスコドンを修復する能力について、ハイスループット９６ウェル形式でスクリーニングする。このアプローチは、新規の治療活性のための数百〜数千個のｔＲＮＡのハイスループットスクリーニングに好適である。
図１１に記載の「ワンポット」クローニングおよび発現系は、トリプトファンおよびグリシンＡＣＥ−ｔＲＮＡ（図１３）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ａｒｇ（図１４）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−ＧｌｎＴＡＧ（図１５）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ ＴＡＡ（図１６）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ ＴＡＧ（図１７）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ ＴＡＡ（図１８）およびＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ ＴＡＧ（図１９）の修復のための固有のｔＲＮＡ配列を特定するのに用いられ成功している。図２０Ａ〜２０Ｄは、小分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達が、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強力な抑制を支持することを示す。
実施例５
未成熟終止コドンの抑制のための操作された転移ＲＮＡ
要約
未成熟終止コドン（ＰＴＣ）は、全ての遺伝性疾患の１０〜１５％の原因である。翻訳中のＰＴＣ抑制は、様々な遺伝子障害を治療する有望なアプローチを提供するが、ＰＴＣリードスルーを促進する小分子は、臨床試験において様々なパフォーマンスをもたらしている。ハイスループットの、細胞ベースのアッセイが提示され、インフレームＰＴＣを効果的に抑制し、それらの同族アミノ酸を忠実にコードすることができるアンチコドン操作（ａｎｔｉｃｏｄｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）転移ＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）を特定する。全体として、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、最も一般的なヒト疾患を引き起こすナンセンスコドンを標的とする高い抑制活性で特定された。ＰＴＣを修復するレベルでＡＣＥ−ｔＲＮＡを発現する細胞のゲノム全体のトランスクリプトームリボソームプロファイリングは、翻訳終結コドンとの相互作用が限定されていることを示す。これらのＡＣＥ−ｔＲＮＡは、哺乳動物細胞、Ｘｅｎｏｐｕｓ（アフリカツメガエル）卵母細胞およびマウスにおいてインビボで高い抑制力を示し、嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）内の疾患を引き起こす変異を含む、複数の遺伝子においてＰＴＣ修復を引き起こす。
はじめに
未成熟終止コドン（ＰＴＣ）は、標準的なトリプレットヌクレオチドコドンを３つの終止コドンのうちの１つ、例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡに変換する単一のヌクレオチド変異から発生する。ＰＴＣは、タンパク質発現の損失をもたらすため、ミスセンス変異よりも有害であることが多い。加えて、ｍＲＮＡ存在量は、ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を介して低減され、いくつかの場合において、トランケートされたタンパク質は、ドミナントネガティブ機能1~3を有し得る。したがって、ＰＴＣが、嚢胞性線維症4、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症5、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症6、β−サレセミア7、シスチン症8、Ｘ連鎖性腎性尿崩症9、ハーラー症候群10、アッシャー症候群11、および多発性嚢胞腎疾患を含む多くの重症疾患表現型と関連していることは当然のことである。加えて、ナンセンス変異は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびＡＴＭ12内で発生し、さらに、それらの疾患における役割を示唆している。ＰＴＣ変換対して最も脆弱なアミノ酸コドンは、終止コドンからの単一ヌクレオチド置換を有するものである：トリプトファン、チロシン、システイン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、ロイシン、アルギニン、およびグリシン（図２５）。このように、ＰＴＣは、全遺伝子疾患の１０〜１５％を占める、全世界で３０００万人を超える人々が罹患する、独特の疾患群を表す。13
アミノグリコシド14ジペプチド15、およびオキサジアゾール16などの低分子は、ナンセンス突然変異の「リードスルー」または「抑制」を促進する。これらの化合物は、モデル生物17、18、哺乳動物細胞株19およびいくつかの動物疾患モデル16、20において有効である。しかしながら、このアプローチは、ほぼ同族のアミノ酸21をコードすることをもたらし、ＰＴＣにおいてミスセンス変異を効果的に生成し、それ自体がタンパク質の折り畳み、輸送、および機能に有害な影響を及ぼし得る。さらに、アミノグリコシドは、聴覚毒性および腎毒性22であり、クラス内第１のオキサジアゾールであるアタルレンは、患者集団で予想外に低い有効性を示し（ＡＣＴ ＤＭＤ Ｐｈａｓｅ ３ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ，ＮＣＴ ０１８２６４８７；ＡＣＴ ＣＦ，ＮＣＴ ０２１３９３０６）、したがって、ＰＴＣ治療薬としてのそれらの有用性を制限する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集における最近および現在進行中の進歩は、ナンセンス変異に起因する疾患に対する永続的な解決策を提供する可能性がある。しかしながら、この技術の態様は、治療薬23、24として迅速に使用するためのハードルを与える。これは、各患者の遺伝的多様性の状況に基づいた、各変異に対する「精度」または「個別化」診断の要件に限定されない。
小分子の多用途性および遺伝子編集の精度を示すＰＴＣ修復アプローチが特定された。これらの基準を満たすためにｔＲＮＡが調査され、それによって、それらのアンチコドンは、ＵＧＡ、ＵＡＡまたはＵＡＧ ＰＴＣコドンを認識および抑制するために変異誘発を介して操作された。効果を発揮するために、アンチコドン編集ｔＲＮＡ、別名ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、チャージされたｔＲＮＡをリボソームに送達するためのＡＣＥ−ｔＲＮＡにそれらの同族アミノ酸と真核生物の伸長因子１ａ（ｅＥＦ−１α）をチャージするためのアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む、内在性翻訳細胞機械によってまだ認識されるべきである（図２１Ａ）。このようなサプレッサーｔＲＮＡは、限定された方法で、β−サラセミア25、色素性乾皮症26およびトランスジェニックＰＴＣレポーター遺伝子27に関連するインフレーム終止コドンをレスキューすることが示されている。
ここで、アンチコドン編集アプローチが複数のｔＲＮＡ遺伝子ファミリーに一般化できることが示され、多くの注釈されたｔＲＮＡが生物学的に生存可能であることが示される。さらに、アンチコドン編集されたサプレッサーｔＲＮＡは、それらの同族アミノ酸をコードし、終端終止コドンとの有意な相互作用を欠き、ＰＴＣを抑制するためにインビボで有効であることを実証している。全体として、このデータは、そのような操作されたｔＲＮＡが、疾患を引き起こすＰＴＣを網羅するための広範な要件を満たし、したがって有望な新しいクラスのＲＮＡ治療薬を表す可能性を支持する。
結果
この研究の理論的根拠は、所与の同族アミノ酸（アイソアクセプター）について固有の配列（アイソデコーダー）を有する複数のｔＲＮＡ遺伝子が存在し、ヒトゲノム（ｈｔｔｐ：ｌｏｗｅｌａｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ＧｔＲＮＡｄｂ／）28、29に注釈された４００超のｔＲＮＡをもたらすという観察に基づいている。まず、ｔＲＮＡ遺伝子を調べて、哺乳動物細胞におけるＰＴＣの抑制効果を保持する個々のＡＣＥ−ｔＲＮＡを特定した。配列包括度を最大化するために、ＡＣＥ−ｔＲＮＡのハイスループットクローニング（ＨＴＣ）と、哺乳動物細胞への送達後の発光を使用したＰＴＣ抑制の定量的測定の両方をサポートするオールインワンｃＤＮＡプラスミドを生成した（図２１Ｂ）。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ配列を、ｃｃｄＢネガティブ選択31と対合したゴールデンゲートクローニング30を使用して、ＤＮＡオリゴとしてＨＴＣプラスミドにクローニングした。この戦略により、約１００％のクローン効率が得られた。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ抑制効率を、分割されたＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）ＮａｎｏＢｉＴプラットフォームから読み取り、それにより、目的のＰＴＣ（ＵＧＡ、ＵＡＡ、またはＵＡＧ）を、９６ウェルフォーマットを使用して、ラージビットドメインとスモールビットドメインとの間の接合部でインフレーム導入し（図２１Ｂ）32、ＮＬｕｃ−ＰＴＣ発現細胞で得られたバックグラウンドに正規化した。２１個のグリシンＡＣＥ−ｔＲＮＡを、ＵＧＡ ＰＴＣ（図２２、左上、カラム１（バイオレット））の抑制について最初に評価した。ＡＣＥ−ｔＲＮＡGly配列の大部分は、ＵＧＡ ＮＬｕｃ ＰＴＣを抑制することができなかったが、３つのＧｌｙ−ｔＲＮＡUGAが、高い抑制収率で同定された（バックグラウンドの約１００倍）。アンチコドン耐性についてスクリーニングしたＧｌｙ−ｔＲＮＡ間の高配列保存性を考えると（図２７）、どのｔＲＮＡがアンチコドン編集に最も適しているかを新たに予測することは困難である。
次に、疾患の原因となるＰＴＣを産生し得る可能性のある単一ヌクレオチド変異の各々について、コドン編集されたｔＲＮＡ上で実行されたスクリーニングが行われた：Ａｒｇ−ｔＲＮＡUGA、Ｇｌｎ−ｔＲＮＡUAA、Ｇｌｎ−ｔＲＮＡUAGＴｒｐ−ｔＲＮＡUGA、Ｔｒｐ−ｔＲＮＡUAG、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡUAA、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡUAG、Ｃｙｓ−ｔＲＮＡUGA、Ｔｙｒ−ｔＲＮＡUAG、Ｔｙｒ−ｔＲＮＡUAA、Ｓｅｒ−ｔＲＮＡ ＵＡＧ、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡUAG、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡUAA、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡUAG、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡUGA、およびＳｅｒ−ｔＲＮＡUAG。ＮＬｕｃの酵素活性は、導入されたアミノ酸によって著しく影響されなかった（図２８）ため、ＮＬｕｃ発光の違いはＡＣＥ−ｔＲＮＡ抑制能力によるものであった。スクリーニングでは、アミノ酸および終止コドン型の各々について複数のＡＣＥ−ｔＲＮＡを識別し、３つ全ての終止コドンについて抑制カバレッジを有した（図２２）。これらのＡＣＥ−ｔＲＮＡの多くは、バックグラウンドよりも１００倍超のＰＴＣ抑制を有する強力な活性を示し、これは、本研究で使用したアミノグリコシドより著しく高い。興味深いことに、いくつかのＡＣＥ−ｔＲＮＡは、特定のアンチコドン編集に対する明確な好みを示し、ｔＲＮＡアンチコドンイソアクセプター配列33に結合する変化したアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を反映している可能性がある。例えば、トリプトファンのＵＡＧ抑制への変換では、同じＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpのＵＧＡ編集よりも１０倍高いレスキューを得られた。しかしながら、グルタミンについては、逆であり、ＵＡＧよりもＵＡＡに対して明確な好みが示された。特に、各ケースにおいて、複数の高性能サプレッサーが特定されたが、これは、ヒト疾患において特に大きい役割を果たすＰＴＣであるＡｒｇUGAで特に明らかであり、２０個の効率的なＡＣＥ−ＡｒｇUGA抑制剤が同定された。機能を示したＡＣＥ−ｔＲＮＡGluなどの他の事例では、抑制効率は、ＵＡＡおよびＵＡＧについてほぼ同じであった。そして、ＵＡＧまたはＵＧＡ抑制を介したコード化を強く映し出したＡＣＥ−ｔＲＮＡLysにおいても同様のパターンが見出された。Ｇｌｎ−ｔＲＮＡUAAでは、抑制活性は、バックグラウンドより２，０００倍超の抑制シグナルをもたらした。スクリーニング中で特定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡのうち、トリプトファンｔＲＮＡ遺伝子ファミリーは、ＵＧＡ ＰＴＣに対して最も弱い抑制活性を示した。スクリーニング可能な固有のヒトＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp配列がわずか６個であるため、ＵＧＡ抑制ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpライブラリを、様々な種のｔＲＮＡを使用して拡張した。ＵＧＡアンチコドン編集耐性を、ミスコーディングＡ９Ｃ ｔＲＮＡTrpおよび細菌Ｈｉｒｓｈ Ｔｒｐサプレッサー34~36に加えて、酵母、ハエ、マウス、ラット、ウサギ、およびカエル由来の固有の配列を有するトリプトファンｔＲＮＡ遺伝子について試験した。（図２９Ａ〜２９Ｂ）この取り組みは、ヒトＡＣＥ Ｔｒｐ ｔＲＮＡの活性を上回るＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp ＵＧＡ ＰＴＣ抑制活性を特定することに成功しなかった（図２９Ｃ）。全体として、ｔＲＮＡスクリーニングは、強力な抑制を示す複数の操作されたｔＲＮＡ（各アミノ酸および終止コドン型について）を識別し、したがって、アンチコドン編集に対する一般的な耐性を有する。
次に、スクリーニング中で特定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡが、同族アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によるアミノアシル化ストリンジェンシーを犠牲にして機能化されたかどうかを確立さした。このために、質量分析を使用して、モデル可溶性タンパク質、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）、におけるＰＴＣ抑制を調べた。（図２３Ａ）ＴＧＡコドンをアスパラギン９４（Ｎ９４）で導入し（図３０Ａ〜Ｃ）、それぞれ、上位のパフォーマンスのグリシンおよびトリプトファンＡＣＥ−ｔＲＮＡUGAであるＧｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２またはＴｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするプラスミドと並行してＨＥＫ２９３細胞内で同時発現した。得られた完全長、抑制されたＨＤＨタンパク質をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｃ末端親和性ｔａｇを介して精製し、質量分析によって分析した（図２３Ａ（図２８））。データのその後の検索は、ＡｓｎのＴｒｐへの修正、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９については（＋７２Ｄａ）、Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２については（−５７Ｄａ）を特定したため、各ＡＣＥ−ｔＲＮＡ型についての同族アミノ酸の忠実なコード化を確認した。重要なことに、各場合において、ＨＤＨｐ．Ｎ９４Ｘ部位で同定されたペプチドの９８％超が、コードされた同族トリプトファンおよびグリシンを有した。さらに、両方のＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＵＡＡおよびＵＡＧ、図２３Ｂ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡGly）および図３１（ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrp）よりも、ＵＧＡ終止コドンに対する選択性を保持した。最後に、一過性に発現すると、ＡＣＥ−ｔＲＮＡGlyは、ＨＥＫ２９３細胞において安定して発現されるＮＬｕｃ−ＵＧＡを抑制する能力において、従来の小分子抑制剤ゲンタマイシン（４０μＭ）およびＧ４１８（１４０μＭ）よりも優れていた（図２３Ｃ）。ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpについても同様であり、このＡＣＥ−ｔＲＮＡ Trpは、Ｇ４１８と比較して抑制効率は低かったが、ＰＴＣレスキューは上回った（図３３Ａ〜Ｄ）。
未成熟終止コドンの効果的な抑制を示すＡＣＥ−ｔＲＮＡが、天然終止コドンのグローバルリードスルーを誘導することもできるかどうかという疑問が提起された。この潜在的な「オフターゲット」抑制に対処するために、外来性ＡＣＥ−ｔＲＮＡまたは対照モックプラスミド（ｐｕｃ５７ＧＧ）を発現するＨＥＫ２９３細胞からリボソームフットプリントのライブラリを生成することによって、全ての細胞転写産物で活性的関与するリボソームのトランスクリプトーム全体の定量的プロファイルを得た。ストレプトマイシンを増殖培地から除去し、リードスルーアーチファクト（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ ａｒｔｉｆａｃｔ）を防止した。比較のために、リボソームフットプリントライブラリは、Ｇ４１８の存在下または非存在下（１５０μＭ、４８時間）で細胞からも生成した。図２４Ａは、３’ＵＴＲ領域における対照と比較したＧ４１８および５つのＡＣＥ−ｔＲＮＡのリボソームフットプリント密度（ｌｏｇ２−倍数変化）を示す。定量比較のために、コード配列中の最小閾値が５ＲＰＫＭであり、２つの複製ライブラリ中の３’ＵＴＲ中の０．５ＲＰＫＭである転写産物のみが含まれた（Ｇ４１８中の転写産物２５４個、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ中の転写産物４９５−７４８個）。この系では、Ｇ４１８は、３つの内在性終止コドン群のいずれかについて、トランスクリプトーム全体の３’ＵＴＲリボソーム密度に対して観察可能な効果を有しなかった。ここで調べたＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ Ｇｌｎ−ＵＡＡおよびＡｒｇ−ＵＧＡを除いて、３’ＵＴＲリボソーム密度の約２倍の増加を誘導したＡＣＥ−ｔＲＮＡアンチコドンに相補的な同族終止コドンについて、３’ＵＴＲリボソーム密度の検出可能な変化はなかった。タンパク質終止の２倍のリードスルーの生物学的意義を理解するには、さらなる研究が必要であろうが、この効果は、同じＡＣＥ−ｔＲＮＡのＰＴＣの１００倍から１０００倍の抑制と比較して実質的に低い。
複数のインフレーム終止コドンは、遺伝子37~39の末端に頻繁に見出され、ＡＣＥ−ｔＲＮＡおよびＧ４１８処置のための全体的な３’ＵＴＲリボソーム密度の微小な差を引き起こし得る。リボソーム占有率を終止コドンの下流の６０ｎｔ領域内の３’ＵＴＲ内の各ヌクレオチドで調べた。図２４Ｂは、終止コドンの第１のヌクレオチドと比較して、−３５〜＋６５ｎｔの領域内の各ヌクレオチドの天然終止コドンを囲むリボソーム占有率を示す。対照細胞と比較して、総マッピング読み取りデータ数１００万回当たりの読み取りデータを正規化し、パネルＡのようにｌｏｇ２倍数変化として報告した。５，２００を超える転写産物を、関心領域内の少なくとも１個のフットプリントにマッピングした。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ Ｇｌｎ−ＵＡＡおよびＡｒｇ−ＵＧＡは、初期領域における顕著な増加したリボソーム占有率だけでなく、特徴的な３ｎｔ周期性を示し、これは、リボソームがランダムに分布したのではなく、コドンバイコドン運動（ｃｏｄｏｎ−ｂｙ−ｃｏｄｏｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）に従ったことを示す。ＵＧＡ−Ｔｒｐ、ＵＧＡ−ＧｌｙおよびＵＡＧ−ＧｌｕのＡＣＥ−ｔＲＮＡ、またはＧ４１８は、３’ＵＴＲの初期領域においても、リボソーム占有率の観察可能な変化を一貫して示さなかった。まとめると、リボソームプロファイリングデータは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡによる天然終止コドン抑制の効率は概して低く、ＰＴＣ抑制のレベルよりも著しく低いと主張する。
議論
ＰＴＣは、多くのヒト疾患を引き起こし、それらの治療管理のための確立された治療オプションは存在しない。本明細書では、真核細胞およびマウス骨格筋において有効なＰＴＣ反転を示すアンチコドン編集ｔＲＮＡのハイスループットクローニングおよび同定、特徴付けおよび機能解析が報告される。特に、スクリーニングは、既知のヒト疾患を引き起こすＰＴＣの大部分を修復する能力を有するＡＣＥ−ｔＲＮＡを全体で特定する。操作されたｔＲＮＡは、それらの同族アミノ酸を忠実にコードし、したがって、下流のタンパク質安定性、折り畳み、および輸送に対する偽の効果を抑止し、したがって、タンパク質折り畳みまたは輸送剤を伴うタンデム療法の必要性を否定する。ｃＤＮＡとしてトランスフェクションされたとき、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＰＴＣ抑制、ＮＬｕｃルシフェラーゼレポーター、モデルタンパク質ＨＤＨ、およびＣＦＴＲにおける２つの疾患ナンセンス変異を介して複数の全長タンパク質をレスキューした。マウス骨格筋におけるインビボＰＴＣ抑制の強度および安定性を、ＡＣＥ−ｔＲＮＡArgｃＤＮＡによって示し、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性に対する特に高いレベルの細胞耐性を示唆した。筋肉におけるアルギニンに対する活性ＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定は、ナンセンス変異によって引き起こされるジストロフィン異常症の治療に関連する。ほとんどの遺伝子疾患を伴う適合に続いて、ジストロフィン異常症の１０パーセント以上は、ＣＧＡ−＞ＴＧＡ変異が最も多い43ナンセンス変異43によって引き起こされる。合成ＲＮＡ転写産物として送達されるＡＣＥ−ｔＲＮＡを用いて効率的な抑制も達成し、したがってナノ粒子製剤の開発を可能にした。核酸送達のための急速に拡大する技術の恩恵を受ける可能性が高い各組織および疾患タイプの理想的なｔＲＮＡ送達戦略を評価するために、今後の研究が必要であろう。
ＰＴＣを抑制する薬剤は、天然終止コドンのリーディングスルーも生成する可能性がある。本明細書に提示されるＲＮＡプロファイリングデータは、概して、これが、試験された細胞およびコドン編集ｔＲＮＡにおける場合ではないことを示唆する。Ａｒｇ−ｔＲＮＡUGAおよびＧｌｎ−ｔＲＮＡUAAで検出可能なリーディングスルーが見出されたが、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡUAG、ＵＧＡ−Ｇｌｙ−ｔＲＮＡUGAおよびＴｒｐ−ｔＲＮＡUGAでは、包括的な翻訳終結に対する有意な効果は測定されなかった。この挙動は、明らかに終止コドンタイプ、またはｔＲＮＡの固有のＰＴＣ抑制活性で分離されなかった。ＡＣＥ−ｔＲＮＡが実際の終止コドンでリードスルーを効果的に促進しない１つの潜在的な理由は、翻訳終結44付近の文脈配列ランドスケープに起因し得る。この可能性は、ＰＴＣにおける終端複合体の組成物が、天然の終止45、46におけるものと異なるという所見によって裏付けられる。しかしながら、より低いレベルのリードスルーが発生する場合、通常の終止リードスルー効果とその損傷効果の両方を制限するために複数の細胞機構が存在する。複数のインフレーム終止コドンは、遺伝子37~39の末端に頻繁に見出され、特殊なユビキチンリガーゼ47およびリボソーム関連経路48は、誤った翻訳終結を伴うタンパク質を識別し、分解することが知られている。しかしながら、ここで哺乳動物細胞において見られる影響は限られているにもかかわらず、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ送達および発現のために所望の細胞または組織型において同様のリボソームプロファイリング実験を行うべきである。
これまでの研究は、周囲のｍＲＮＡ配列がアミノグリコシドおよびアタルレンＰＴＣ49-52の固有の終止コドン抑制有効性に影響を及ぼすことを示しており、ＡＣＥ−ｔＲＮＡも同様に影響を及ぼし得る。さらに、ウイルスまたは非ウイルス送達を介して、ＰＴＣを含有する遺伝子を置き換えるための遺伝子付加戦略は、いくつかの場面で短期的な利益を達成しているが、導入遺伝子発現レベルを調節することは困難であり得る。対照的に、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ抑制を介したタンパク質レスキューの豊富さは、天然細胞ＲＮＡレベルに結合され、したがって、上位発現レベルは本質的に調節される。ヒトゲノム内の可変アイソアクセプターｔＲＮＡ配列の大部分について、生物学的目的は不明のままであり、これらの遺伝子のほぼ半分は転写的にサイレントな疑似遺伝子53であると推測されているが、ここでのデータは、多くの注釈されたｔＲＮＡが生存可能であることを示唆している。この可能性と一致して、抑制アプローチが、ＳｅｒおよびＬｅｕイソアクセプターファミリー54内の機能的アイソデコーダーｔＲＮＡを特定するために使用されている。ここで提示されるデータは、ゲノムコンテキストから除去されるときに、ｔＲＮＡ遺伝子配列の大部分が生存活性を支持し、複数のｔＲＮＡに対する生物学的必要性に対する謎をさらに深め、コドン使用をさらに実証する。したがって、本明細書に記載のハイスループット抑制戦略は、固有の抑制特性を有する新しいタイプのｔＲＮＡ配列を特定するのに有用であり、かかる研究は、新たなＲＮＡ試薬を産生するとともに、分子理解ｔＲＮＡ発現および抑制を促進する可能性を有する。
材料および方法
ナンセンスレポーターＨＴＣプラスミド
使用した親プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）であった。ｐＮＬｕｃをコードするｃＤＮＡを、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）で制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩに入れた。ｃＤＮＡ ｐｃｒ中に、グリシン（コドンｇｇａ）、トリプトファン（ｔｇｃ）、アンバー（ｔａｇ）、オパール（ｔｇａ）、およびオーカー（ｔａａ）をアミノ酸位置１６０に添加した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ポリＡ配列を、ｐｃｒベースのＧｉｂｓｏｎアセンブリを使用してＢｂｓＩ制限部位なしのものについて置き換えた。ハイスループットＡＣＥ−ｔＲＮＡゴールデンゲートクローニング部位は、ヒトtRNA Tyr遺伝子の５’リーダー配列（太字）をＴ７プロモーター配列（斜体）と上流で最初に挿入し、
ＡＣＥ−ｔＲＮＡライブラリのＨＴＣ
ｔＲＮＡ遺伝子配列は、ｔＲＮＡデータベースｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｇｔｒｎａｄｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ＰＭＩＤ：２６６７３６９４）から入手する。本研究で使用される全てのｔＲＮＡ遺伝子の配列は、図２６および表９に番号付けされる。ｔＲＮＡ配列は、２００ｐｍｏｌ規模で、それらの対応するアンチコドンが適切に変異した（ＵＡＧ、ＵＧＡまたはＵＡＡ）９６ウェルフォーマットでＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、ＵＳＡ）由来の相補的ウルトラマー（Ｕｌｔｒａｍｅｒ）として合成された。全てのｔＲＮＡ配列を、それぞれ前方オリゴおよび後方オリゴ上のＣＧＡＣおよびＧＧＡＣオーバーハング（注釈付き５’−＞３’）で合成した。ウルトラマーを、アニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム；３０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）中に１００ｎｇ／μｌに再懸濁してアニーリングし、９６℃に２分間加熱し、１℃／分で、サーモシレーラー中で４℃まで冷却した。９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、各ウェルは、適切なＰＴＣコドン、２ｎｇＡＣＥ−ｔＲＮＡ二本鎖、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、４００単位Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、および１０単位ＢｂｓＩ−ＨＦとともに１０ｎｇのＨＴＣプラスミドを含有し、ｄｄＨ2Ｏで１０μｌにキューインした。９６ウェルプレートをサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）で以下のようにサイクルした（［３７℃で５分、２０℃で５分］×３０サイクル、３７℃で１０分、８０℃で１０分および４℃に冷却した。ディープウェル９６ウェルプレート内で１μｌのゴールデンゲート反応物を、１０μｌのＤＨ５α化学的コンピテント細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）に加え、３０秒間４２℃でヒートショックし、１００μｌのＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ（ＳＯＣ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）に再懸濁した。形質転換体を３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで増生（ｏｕｔｇｒｏｗｎ）させ、次いで、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充した２ｍｌのルリア−ベルタニ液体培地（ＬＢ）に添加し、覆われた深４８ウェルプレートにおいて３７℃で２０時間、３００ｒｐｍで増殖させた。Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ．ｃｏｍ）からのディープウェルプレートおよびクランプにおいてＥ．ｃｏｌｉの増生を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁培養物をスピンダウンし（１０分、室温で４，０００ｇ）、プラスミドＤＮＡを調製し、１２５ｎｇ／μｌに希釈した（ＩＢＩ ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ，ＵＳＡ）。全てのクローンを配列検証した。この方法を用いて、１００％クローニング効率を実現した。
ＡＣＥ−ｔＲＮＡライブラリのＨＴＳ
トランスフェクションの前日、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中の９６ウェル細胞培養処理プレートにおいて、ＨＥＫ２９３細胞（４０継代」未満）を１．４×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ遺伝子を有するオールインワンのナンセンスレポーターを、Ｃａｌｆｅｃｔｉｎ（Ｓｉｇｎａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）／プレートでトランスフェクションした。トランスフェクションの１６時間後、培地を吸引し、２０μｌのＰＢＳを各ウェルに添加した。１５μｌの溶解性Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加した（１：５０試薬対緩衝液、Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）。プレートを、回転振とう後２分間インキュベートし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ、積分時間２００ｍｓ、エンドポイントモードで収集された全ての波長）を使用して読み取った。各実験について３つのウェルにわたって発光を平均化し、全てのＡＣＥ−ｔＲＮＡをこの様式で３回超繰り返した。各プレートはまた、三連のウェルに含有され、トランスフェクション効率およびベースラインＰＴＣリードスルーのための制御として、ＡＣＥ−ｔＲＮＡをサーバに持たないオールインワンナンセンスレポーターでトランスフェクションされた。全ての値は、ベースラインＰＴＣリードスルー発光±ＳＥＭに対するＡＣＥ−ｔＲＮＡ発光の比率として報告される。一元配置分散分析を、所与のアミノ酸ファミリーにおける全てのＡＣＥ−ｔＲＮＡにわたってＴｕｋｅｙの事後分析を用いて行った。
ＣＦＴＲ、ＨＤＨ−ｈｉｓ−ｓｔｒｅｐおよび４ｘＡＣＥ−ｔＲＮＡ発現プラスミド
哺乳動物細胞における発現のために、コード領域のｃＤＮＡおよびヒトＣＦＴＲの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の２００塩基対を、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限酵素を使用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）にライゲーションした。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）を使用して、Ｇ５４２ｔｇａおよびＷ１２８２ｔｇａ変異を導入した。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）卵母細胞における発現のために、ｃＤＮＡのコード領域と、ヒトＣＦＴＲの、５’の１４０塩基対および３’ＵＴＲの２４４塩基対をｐＧＥＭ−ＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）にライゲーションした。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ ＩＩを使用してＧ ５４２ｔｇａおよびＷ１２８２ｔｇａ変異を導入した。Ｅ．ｃｏｌｉヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを、ハツカネズミ（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）用にコドン最適化し、哺乳動物細胞からのタンパク質精製のためのｃ末端８ｘＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇで合成した（ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｉｎｃ，Ｃａｎａｄａ）。合成したｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してｐｃＤＮＡ ３．１（＋）にライゲーションした。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬＩＩを使用して、ナンセンス変異ｔａｇ、ｔａａ、およびｔｇａを導入した。多重化されたＡＣＥ−ｔＲＮＡ発現プラスミドを生成するために、ＢｂｓＩ「多重クローニング部位」
方向性のあるＢｂｓＩ認識配列は斜体化され、ライゲーションのための固有の４つの塩基対オーバーハングは太字で表される）をＥＣＯＲＩおよびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位間に挿入することによって、新規の親ゴールデンゲートＰＵＣ５７（ＡＭＰ）プラスミドを生成した。ｐＵＣ５７（ａｍｐ）は、比較的小さいサイズであり、骨格ＢｂｓＩ制限部位ならびにＴ７およびＴ３プロモーター配列を欠くため、親プラスミドとして選択された。ＨＴＳプラスミドに含まれる特徴は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡカセットに隣接するＴ７およびＴ３プロモーター配列であり、ｐｃｒ増幅に理想的な、同等の融解温度（Ｔm）を有するユニバーサルプライマー結合配列を与える。ＮＥＢゴールデンゲート組み立てツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｅｄｉｔｏｒ）を使用して、Ｔ７およびＴ３隣接配列にアニールし、遠位ＢｂｓＩ認識配列の切断後に固有の４つの塩基対オーバーハングを作製したｐｃｒプライマーを生成した。最終結果は、相補的な４つの塩基対オーバーハングを通じて「デイジーチェーン」であり得る、ワンポットのゴールデンゲート反応を使用してｐｕｃ５７ゴールデンゲートプラスミドにライゲーションされ得るユニバーサルｐｃｒプライマーを使用した４つのＡＣＥ−ｔＲＮＡ ｐｃｒ産物の生成であった。全てのクローンを配列検証した。
細胞培養、タンパク質の発現とウエスタンブロット
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を、１０％ ＦＢＳ（ＨｉＣｌｏｎｅ，ＵＳＡ）、１％ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ、１％ Ｌ−Ｇｌｕｔを高ブドウ糖ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）（ｖ／ｖ％）を含有する標準的な増殖培地中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。標準的なプロトコル（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）に従い、Ｃａｌｆｅｃｔｉｎを使用して７５％コンフルエンシーでｃＤＮＡをトランスフェクションした。３６時間後、細胞をスクラップし、０．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、２．５μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、０．７５ｍＭのベンズアミジンを補充したＰＢＳ中で４℃で８分間、７，０００ｇでペレット化した。ＣＦＴＲ発現細胞については、細胞ペレットを１００ｍＭのスクロース、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、２．５μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、０．７５ｍＭのベンズアミジン、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ ｐｈ７．４中で強力にダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）し、１００，０００ｇで遠心分離して、可溶性細胞質タンパク質から全膜を分離した。ペレットを、１％トリトン、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、および０．５μｇ／ｍｌペプスタチン、２．５μｇ／ｍｌアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌロイペプチン、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．７５ｍＭベンズアミジンを含有する緩衝液中で可溶化した。等しい細胞溶解物を、１％の２−メルカプトエタノールの存在下で４％のスタッキングゲルで３〜１５％の分離勾配ＳＤＳ−ｐａｇｅ上に充填し、５５ Ｖ Ｏ／Ｎで分離し、０．４５μ Ｍ のＬＦ ＰＶＤＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）に移した。ＰＶＤＦを、２％の非脂肪乳中の抗ＣＦＴＲ抗体Ｍ３Ａ７（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して免疫ブロットし、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ，ＵＳＡ）上で撮像した。ＨＤＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ発現細胞については、細胞ペレットを、１００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、０．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、２．５μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、および０．７５ｍＭのベンズアミジン中で強力にダウンス均質化した。溶解物を、４℃で１００，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清（可溶性細胞タンパク質）を、１％２−メルカプトエタノールの存在下で４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ｐａｇｅアクリルアミドゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）上で分離し、０．２２μＭのＬＦ ＰＶＤＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）に移し、２％の非脂肪乳中で抗Ｓｔｒｅｐ抗体（１：５０００；Ｉｂａ，ドイツ）を使用して免疫ブロットし、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ，ＵＳＡ）上で撮像した。
質量分析
精製されたＨＤＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタンパク質に関する断片化データを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙで得た。簡単に説明すると、高速スピンの可溶性画分からのＨ Ｄ Ｈ−Ｈ ｉｓ−Ｓｔｒｅｐタンパク質をＳｔｒｅｐＴｒａｐ Ｈ Ｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，スウェーデン）に通し、５カラム体積の１００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、２．５μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．１ｍＭのＰＭＳＦおよび０．７５ｍＭのベンズアミジンで洗浄した。タンパク質を、１０ｍＭのｄ−デシビオチン（ｄ−ｄｅｓｔｈｂｉｏｔｉｎ）を補充した洗浄緩衝液中で溶出させ、３０ｋＤＡカットオフＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ濾過カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）中で濃縮した。濃縮タンパク質をＮｕＰａｇｅ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）上に充填し、１５０Ｖで１．５時間分離した。ゲルを、Ｐｉｅｒｃｅ質量分析計対応の銀染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して染色した。
ゲル内トリプシン消化。簡単に説明すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル由来の標的タンパク質バンドを、それぞれ、手動で切り出し、１ｍｍ ３個に切断し、１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム：アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）、および２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム／アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）中で洗浄し、完全な脱染を達成した。ゲルピースをさらにＡＣＮで処理し、ｓｐｅｅｄ ｖａｃを介して乾燥させた。乾燥後、ゲル片を５０μｌの１０ｍＭ ＤＴＴ中、５６℃で６０分間還元し、次いで室温で５５ｍＭのＩＡＭによって３０分間アルキル化した。ゲルピースを２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム：アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）で２回洗浄し、余分なＤＴＴおよびＩＡＭを除去した。乾燥後、ゲル片を２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム中１０ｎｇ／μＬのトリプシン溶液５０μＬ中の氷上に置き、氷上で６０分間インキュベートした。次いで、３７℃で１６時間消化を行った。ペプチド抽出を、１００μｌの５０％アセトニトリル／０．２％ギ酸で０．５時間２回行った。組み合わせたエキスを、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ中で約１５μｌに濃縮した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析データを、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｅｋｓｐｅｒｔ（登録商標）ｎａｎｏＬＣ ４２５Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｃｉｅｘ）に結合したＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して収集した。Ｔｒａｐ−Ｅｌｕｔｅ Ｊｕｍｐｅｒ Ｃｈｉｐ（Ｐ／Ｎ：８００−００３８９）と、それと結合した１／１６インチ１０ポートのＶａｌｃｏ指示ローディングを、勾配１ポンプと最終溶出（勾配２ポンプによる）によって実行するカラムアセンブリを、ｅｋｓｐｅｒｔ（商標）ｃＨｉＰＬＣシステムに取り付けられた２つのタンデム７５μｍ×１５ｃｍのカラム（ＣｈｒｏｍＸＰＣ１８−ＣＬ、３μｍ１２０Ａ、ＡＢ ＳＣＩＥＸのＥｋｓｉｇｅｎｔ部分）として設計した。注射ごとに、推定０．５μｇの全消化物をローディングした。ペプチドを、緩衝液Ａが０．１％ギ酸であり、緩衝液Ｂが９５％ＡＣＮ、０．１％ギ酸である、線形および静的セグメントから構成される１２０分の勾配を使用して質量分析器とインラインで分離した。勾配は、最初に４％で３分間保持で開始され、続いて以下の遷移（％Ｂ，分）：（２６、４８）、（３５、５８）、（３５、６４）、（５０、７２）、（５０、７８）、（９４、８４）、（９４、９６）、（４、１００）、（４、１２０）で行われた。
ＬＵＭＯＳ Ｏｒｂｉｔｒａｐ上のタンデム質量分析スキャンシーケンスは、オフ軸（ｏｆｆ ａｘｉｓ）Ｏｒｂｉｔｒａｐセグメント（ＭＳ１）において６０，０００の解像度でＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ）上で取得された完全な調査（ｍ／ｚ３５０−１５００）により始まった。上述の１２０分間の勾配中、３秒ごとに勾配ＭＳ１走査を取得した。最も大量の前駆体が、２．０Ｅ５閾値で２〜８個の電荷状態イオンの中から選択された。イオンは、前の３０秒で２回標的にした場合、３０秒間動的に除外された。選択されたイオンは、ｍ／ｚ２に質量ウィンドウを備えたマルチセグメント四極によって分離され、次いで、ＩＴおよびイオン経路（ｉｏｉｎ ｒｏｕｔｉｎｇ）多重極でそれぞれＣＩＤおよびＨＣＤの両方の活性化条件にそれぞれ順次供した。ＣＩＤのＡＧＣ標的は、４．０Ｅ０４、３５％の衝突エネルギー、０．２５の活性化Ｑおよび１００ミリ秒の最大充填時間（ｍａｘｉｍｕｍ ｆｉｌｌ ｔｉｍｅ）であった。標的化された前駆体も、４０％の衝突エネルギーでの高エネルギー衝突誘発解離（ＨＣＤ）および０．２５の活性化Ｑによって断片化した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＡＧＣ１．２Ｅ０５、最大注入時間１１０ｍｓ、および４００Ｔｈで３０，０００に設定された解像度）を使用して、ＨＣＤ断片イオンを分析した。両方のＭＳ２チャネルをセントロイドとして記録し、ＭＳ１調査走査をプロファイルモードで記録した。
プロテオミクス調査。Ｓｅｑｕｅｓｔ ＨＴを使用して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ２．１．１．２１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で初期スペクトル検索を行った。Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）ｖｅｒ．２．８．２．でもスペクトルが検索された。検索データベースは、２０１６年１０月２４日にダウンロードされた、９２６４５個の配列を含む種９６０６（ヒト）についてのＵｎｉｐｒｏｔ ＫＢと、２０１６年１１月８日にダウンロードされた、１００７９個の配列を含む分類５６２（大腸菌）についてのＵｎｉｐｒｏｔ ＫＢで構成された。Ｂｙｏｎｉｃ検索では、この２つのデータベースが直接連結された。いずれかの検索において、同数のデコイエントリが作成され、標的データベース内の元のエントリを反転させることによって、同時に検索された。
インビトロｃＲＮＡ転写Ｇ５４２ＸUGA、Ｗ１２８２ＸUGA、およびＷＴ ＣＦＴＲ ｐＧＥＭＨＥ（Ｍｅｎｓｅ ｅ ｔ ａｌ．，２００６；ＰＭＩＤ：１７０３０５１）プラスミドを、１０倍過剰のＮｈｅＩ−Ｈ Ｆ制限酵素（コード領域の３’に位置する部位）（ＮｅｗＥｎｇｌ ａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ＵＳＡ）によって３７℃で３時間線形化し、標準ｃＤＮＡ沈殿法を使用して精製した。全てのｃＲＮＡを、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して転写した。転写反応からのｃＲＮＡの精製を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのカラム上で行った。濃度は、２６０ｎｍでの吸光度測定によって決定され、１％のアガロースゲル（ＲＮＡａｓｅフリー）上で品質を確認した。全てのｃＲＮＡを使用前に１μｇ／ｍｌにキューイングし、全ての結果を≧２ｃＲＮＡ調製物から生成した。
インビトロｔＲＮＡ転写Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２は、ＴｒｐおよびＧｌｙ ＡＣＥ−ｔＲＮＡを上位に実行するものであり、ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ標準ＲＮＡ ＩＶＴキット（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ，ＵＳＡ）を使用してインビトロで転写した。等モル濃度のＴ７オリゴ（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａ−３’）を、ＡＣＥ−ｔＲＮＡのためのＡＣＥ−ｔＲＮＡ ＰＡＧＥ精製ウルトラマー（２０ｕｇ；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）コードにアニールし、Ｔ７プロモーター（斜体）を先行した。重要なことに、ＣＣＡを含有する３つの末端ヌクレオチドが含まれた（太字）。
全反応体積を１００μＬに調整し、キット試薬を以下の量で添加した：１０μｌの１０Ｘ Ｔ ７−Ｓｃｒｉｂｅ転写緩衝液、７．５μｌの各ヌクレオチド（１００ｍＭストック）、１０μｌの１００ｍＭジチオスレイトール、２．５μｌのＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ ＲＮａｓｅ阻害剤、１０μｌのＴ７−Ｓｃｒｉｂｅ酵素溶液。反応物を３７℃で４〜５時間インキュベートした後、ＤＮＡテンプレートを、キットとともに提供される５μｌのＤＮａｓｅ（１Ｕ／μｌ）とともに３０〜６０分間消化した。ＡＣＥ−ｔＲＮＡを酸性フェノールクロロホルム（５：１、ｐＨ４．５）で反応物から抽出し、エタノールで沈殿させた。沈殿物ＡＣＥ−ｔＲＮＡをペレット化し、洗浄し、乾燥させ、１００μｌのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁し、Ｃｈｒｏｍａ Ｓｐｉｎ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）でさらに精製した。この手順は、おおよそ１００μｌの約５μｇ／μｌのＡＣＥ−ｔＲＮＡを得た。ＡＣＥ−ｔＲＮＡを２０ｕｇのアリコート中で再ペレット化し、洗浄し、凍結乾燥し、使用まで−８０℃で保管した。全ての結果を≧２のＡＣＥ−ｔＲＮＡ調製物から生成した。
リボソーム・フットプリント・プロファイリング・ライブラリの準備。ＡＣＥ−ｔＲＮＡおよび対照プラスミド（ｐｕｃ５７ＧＧ）で一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ ２９３細胞を、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐの不在下で４８時間標準増殖培地で増殖させた。ライブラリは、55に記載されているように、いくつかの修正を加えて調製した。簡潔に説明すると、細胞を氷冷ＰＢＳを添加することによって急速に冷却し、溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および２５Ｕｍｌ-1Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ Ｉ）中で氷上で１０分間溶解し、２６−Ｇ針を通して１０回粉砕した。４℃、１６，０００ｇで１０分間遠心分離することによってクリアランスした後、溶解物を室温でＡ260溶解物あたり１００ＵＲＮＡｓｅ Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ，ＵＳＡ）で４５分間、緩やかな撹拌で消化した後、２００ＵＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。次いで、リボソームで保護されたｍＲＮＡ断片を、改質ポリソーム緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＤＴＴ、２０Ｕｍｌ-1ＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤）で調製した１Ｍショ糖クッション上に溶解物をロードし、Ｂｅｃｋｍｅｎ ＴＬＡ−１１０ローターを使用して４℃で２時間、７０，０００ｒｐｍで遠心分離することによって単離した。ｍＲＮＡフットプリントを含有するリボソームペレットを、ＴＲＩｚｏｌを使用して抽出し、８Ｍ尿素を含有する変性１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。サイズが２６〜３４ｎｔの範囲のＲＮＡ断片をＳＹＢＲゴールド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したゲルから手動で切除し、単離して、リボソーム保護断片ライブラリを生成した。Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して枯渇したｒＲＮＡ断片の混入３’オリゴヌクレオチドアダプターのライゲーション、逆転写、環状化、およびビオチン化ｒＲＮＡ枯渇オリゴ（表９）を用いた二次ｒＲＮＡ枯渇を、記載の通り行った５５。ライブラリを、ＰＣＲ増幅中に各試料のインデックスプライマーを使用してバーコード化した。次いで、バーコード化されたライブラリを３％ＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でプールし、メーカープロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００で配列決定して、典型的には、試料あたり１８００万〜２７００万個の読み取りデータを生成した。
リボソームフットプリントデータ分析。各バーコード化試料（３’末端のマイナスアダプター配列）のデータファイルを、まず、ＨＩＳＡＴ２．０．３5６を使用して４つのｒＲＮＡ配列（ＲＮＡ５Ｓ１、ＮＲ＿０２３３６３、ＲＮＡ５−８ＳＮ５、ＮＲ＿００３２８５、ＲＮＡ１８ＳＮ５、ＮＲ＿００３２８６、およびＲＮＡ２８ＳＮ５、ＮＲ＿００３２８７）にマッピングして、ｒＲＮＡ混入読み取りデータを排除した。残りの読み取りデータを、各ヒト遺伝子の最長転写バリアント（ＵＣＳＣ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＧＲＣｈ ３ ８）のセンススタンド（ｓｅｎｓｅ ｓｔａｎｄ）に整列させた。少なくとも７５ｎｔ（１８，１０１配列）の３’ＵＴＲ長を有する転写産物をサブシーケンス分析に使用した。読み取りデータの５’末端に最大２回のミスマッチが許可された。マルチマップされた読み取りデータは全て廃棄された。２６〜３４ｎｔの長さを有する断片の読み取りデータをリボソームフットプリントとして定義し、分析に使用した。各フットプリントからの５’末端ヌクレオチドを注釈し、各転写産物上にマッピングした。各フットプリント57、58の第１６〜１８番目のヌクレオチドを占めるリボソームＡ部位の位置を使用して、各転写産物上のリボソームの位置を推測した。各個々の転写産物（１８，１０１配列）上のＲＰＫＭ（総ミリオンマッピング読み取りデータあたりの転写産物の１キロ塩基当たりのフットプリントリード）を計算した。図２４Ａで分析するために、コード配列中の最小閾値が５ＲＰＫＭ、および２つの複製ライブラリ（Ｇ４１８中の転写産物２５４個、およびＡＣＥ−ｔＲＮＡ中の転写産物４９５〜７４８個）中の３’ＵＴＲ領域中の０．５ＲＰＫＭの転写産物のみが含まれた。図２Ｂにおけるトランスクリプトーム全体のメタ遺伝子プロットについて、終止コドンの第１のヌクレオチドに対する−３５ｎｔから＋６５ｎｔまでの領域内の各ヌクレオチドのフットプリントカウントを、総ミリオンマップされた読み取りデータごとに正規化した。全ての転写産物（１８，１０１個の配列）をマッピングに使用し、５，２００個以上の転写産物を、関心領域内の少なくとも１個のフットプリントにマッピングした。次に、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２およびＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９のＰＴＣをレスキューするインビボでの生物活性を調べた。配列決定データをＧａｌａｘｙプラットフォーム59を使用して分析した。Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してグラフを生成した。
安定したＮＬｕｃレポーター細胞株の生成。アミノ酸１６０位にｔａｇ、ｔａａおよびｔｇａ終止コドンを有するｐＮＬｕｃをコードするｃＤＮＡを、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用して、レトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）の複数のクローニング部位内のＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入した。フェニックスＧＰ細胞（ＰＭＩＤ：７６９０９６０）を、Ｃａｌｆｅｃｔｉｎ（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、ｐＮＬｕｃ−ＳＴＯＰ−ｐＱＣＸＩＰおよびｃｍｖ−ＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇエンベロープシュードタイピング）プラスミドと同時トランスフェクションし、３３℃、ＣＯ2調節（５％）細胞インキュベータに４８時間置いた。レトロウイルス粒子を含有する培養培地（２０ｍｌ）を４℃に冷却し、１０，０００ｇで回転させて細胞デブリを除去し、０．４５μｍのＭＣＥ膜シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を通して、３０％の培養密度で低継代ＨＥＫ２９３細胞を播種した２つの１０ｃｍ皿にろ過した。細胞培養皿をパラフィルムで密封し、２４℃で３，５００ｇで９０分間回転させ、３７℃のＣＯ2調節された（５％）細胞培養インキュベータに入れた。対照の皿（感染なし）が完全な細胞死を示すまで、細胞を２４時間後にピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で選択した。細胞をＦＡＣＳを使用して９６ウェルプレートに単分散させ、その後クローン集団も単分散させた。ピューロマイシンは、実験中に選択されたクローンを維持するために使用されず、標準的なＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地−高グルコース、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を全ての研究で使用した。
ＲＮＡトランスフェクションｐＮＬｕｃ−ＵＧＡを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）の９６ウェル細胞培養処理プレートにおいて１．４×１０4細胞／ウェルでプレーティングした。１６〜２４時間後、細胞を、リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用してＡＣＥ−ｔＲＮＡでトランスフェクションした。簡潔に述べると、３μｇのＡＣＥ−ｔＲＮＡを１５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭに懸濁し、１２μｌのリポフェクタミン２０００を１５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。体積を組み合わせ、完全に混合し、室温で１０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体７５μｌを各ウェルに加えた。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ転写産物によるＰＴＣ抑制を上述のように定量化した。
Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）卵母細胞での発現。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞（Ｖ期およびＶＩ期）をＥｃｏｃｙｔｅ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入した。注入前に、各ＡＣＥ−ｔＲＮＡペレットを２μｌのｄｄＨ2Ｏ中に再懸濁し、破片を２１，０００×ｇ、４℃で２５分間ペレット化した。ＣＦＴＲチャネルレスキューにおけるＡＣＥ−ｔＲＮＡの用量応答を決定するために、ｄｄＨ2Ｏと体積バランスをとったＡＣＥ−ｔＲＮＡアリコートの連続希釈（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および１．５６２ｎｇ／卵母細胞）を生成した。全ての実験では、２５ｎｇのＣＦＴＲ ｃＲＮＡを１卵細胞当たりに注入し、注入体積は５０ｎｌであった。ｄｄＨ2ＯはＡＣＥ−ｔＲＮＡのないバックグラウンド対照実験では使用しなかった。注入後、卵細胞をＯＲ−３（５０％ Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚの培地、２５０ｍｇ／ｌのゲンタマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６））中に１８℃で３６時間保持した。
２極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）の記録。ＣＦＴＲ Ｃｌ-電流を、以下を（ｍＭで）含有するＮＤ ９６浴溶液で記録した。（９６ＮａＣｌ、２ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ2、および５ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を、最大ＣＦＴＲ活性化カクテル、フォルスコリン（１０μＭ；アデニレートシクラーゼ活性化剤）および３−イソブチル−１−メチルキサンチン（１ｍＭ；ホスホジエステラーゼ阻害剤）の存在下で含有する。）３ＭのＫＣｌでバックフィルされたガラス微小電極は、０．５〜２ＭΩの抵抗を有した。データを１ｋＨｚでフィルタリングし、ｐＣｌａｍｐ ９．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）によって制御されるＤｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａを使用して１０ｋＨｚでデジタル化した。ＣＦＴＲ電流を、ＯＣ−７２５Ｃ電圧クランプアンプ（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して−６０〜＋３５ｍＶの５ｍＶ電圧ステップを使用して引き出した。ＣＦＴＲＣｌ-電流が、−２０ｍＶの正に反転した卵母細胞は廃棄した。現在の解析にはＣｌａｍｐｆｉｔ ９．２ソフトウェアを使用した。全ての値は、平均±ＳＥＭとして提示される。
動物とインビボイメージング。Ｎｕ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから購入した。動物実験は、Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設動物愛護利用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（プロトコル番号：１１２７６２）によって承認された。マウスを、３０μｌの水に再懸濁した１０〜２０μｇのＤＮＡを脛骨前筋に注入し、続いてエレクトロポレーションすることによって処置した。１０μｇのｐＮａｎｏ−ＴＧＡ＋１０μｇのＡＣＥ−ｔＲＮＡ（右脛骨前部）または１０μｇのｐＮａｎｏ−ＴＧＡ＋１０μｇの空ｐＵＣ５７（左脛骨前部）を３匹のマウスに注射した。対照として、他の３匹のマウスに１０μｇのｐＮａｎｏ−ＷＴ（右脛骨前部；陽性対照）または水（左脛骨前部；陰性対照）を注射した。ＤＮＡを、３３３ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で製剤化した。ＤＮＡ注射の１分後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ３Ｐデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）でエレクトロポレーションを行った。１００μｌのフリマジン（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ基質の４０倍希釈）を腹腔内に注入し、注入の５分後ＩＶＩＳスペクトル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で撮像したマウスにおいて、ナノルシフェラーゼ活性を撮像した。イメージングはオープンフィルタで行われ、画像は４０秒で取得された。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて画像を分析した。
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４１．Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ｒ．Ｔ．＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣｌＣ−１ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｙ ａｎｄ ｍｙｏｔｏｎｉａ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７，３９５２−３９５７（２００７）．
４２．Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ ａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６６，１５７７−１５８８（２０１７）．
４３．Ｂｌａｄｅｎ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＴＲＥＡＴ−ＮＭＤ ＤＭＤ Ｇｌｏｂａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ７，０００ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ３６，３９５−４０２（２０１５）．
４４．Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，Ｐ．Ａ．，Ｔｒｏｔｍａｎ，Ｃ．Ｎ．＆Ｔａｔｅ，Ｗ．Ｐ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｔｅｔｒａ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｓｉｇｎａｌ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８，６３３９−６３４５（１９９０）．
４５．Ｓａｃｈｓ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｏｅｐｒｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｔ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｍＲＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６，１０５−１１４（２００２）．
４６．Ａｍｒａｎｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｆａｕｘ ３’−ＵＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｂｅｒｒａｎｔ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２，１１２−１１８（２００４）．
４７．Ｂｅｎｇｔｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．＆Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ａ ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６７，４７０−４７３（２０１０）．
４８．Ｃｒｏｗｄｅｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｒｋｒ１／Ｌｔｎ１ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｓｔａｌｌｅｄ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０，１８４５４−１８４６６（２０１５）．
４９．Ｒｏｗｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．＆Ｓｏｒｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５２，１９９２−２００１（２００５）．
５０．Ｍａｎｕｖａｋｈｏｖａ，Ｍ．，Ｋｅｅｌｉｎｇ，Ｋ．＆Ｂｅｄｗｅｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．ＲＮＡ ６，１０４４−１０５５（２０００）．
５１．Ｂｏｎｅｔｔｉ，Ｂ．，Ｆｕ，Ｌ．，Ｍｏｏｎ，Ｊ．＆Ｂｅｄｗｅｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５１，３３４−３４５（１９９５）．
５２．Ｘｕｅ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｒｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｉｖａｃａｆｔｏｒ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ５０，８０５−８１６（２０１４）．
５３．Ｇｏｇａｋｏｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｎｄ Ｍａｔｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ｔＲＮＡ ｂｙ Ｈｙｄｒｏ−ｔＲＮＡｓｅｑ ａｎｄ ＰＡＲ−ＣＬＰ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０，１４６３−１４７５（２０１７）．
５４．Ｇｅｓｌａｉｎ，Ｒ．＆Ｐａｎ，Ｔ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔＲＮＡ ｉｓｏｄｅｃｏｄｅｒｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９６，８２１−８３１（２０１０）．
５５．Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，Ｂｒａｒ，Ｇ．Ａ．，Ｒｏｕｓｋｉｎ，Ｓ．，ＭｃＧｅａｃｈｙ，ＭＯＲＮＩＮＧ＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｍＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ７，１５３４−１５５０（２０１２）．
５６．Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．＆Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．ＨＩＳＡＴ：ａ ｆａｓｔ ｓｐｌｉｃｅｄ ａｌｉｇｎｅｒ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，３５７−３６０（２０１５）．
５７．Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ，Ｓ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｒ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，２１８−２２３（２００９）．
５８．Ｇｕｙｄｏｓｈ，Ｎ．Ｒ．＆Ｇｒｅｅｎ，Ｒ．Ｄｏｍ３４ ｒｅｓｃｕｅｓ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ １５６，９５０−９６２（２０１４）．
５９．Ａｆｇａｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｇａｌａｘｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ：２０１６ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４，Ｗ３−Ｗ１０（２０１６）．
実施例６：ＡＣＥ−ｔＲＮＡはインビボで活性である
ここで、アンチコドン編集ｔＲＮＡは、真核細胞およびマウス骨格筋において有効なＰＴＣ復帰を示すことが実証される。
ＡＣＥ−ｔＲＮＡのインビボ活性および安定性を調べた。ＮＬｕｃ−ＵＧＡ ＰＴＣレポーターｃＤＮＡを、ＡＣＥ−ｔＲＮＡArg ＵＧＡの４コピーまたは「空のベクター対照」をコードするプラスミドとともに、エレクトロポレーションを使用してマウス骨格筋（脛骨前）に送達した（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５，３３６−３３９；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１７，３９５２−３９５７；Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，６６，１５７７−１５８８）。これらのデータを、ＷＴ ＮＬｕｃの発現と比較した。結果は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡArgＵＧＡが、強力なインビボＰＴＣサプレッサーであり、全長Ｗ Ｔ ＮＬｕｃに等しいか、またはいくつかの時点でそれより大きい、発現プロファイルを生じることを示した（図３４Ａおよび図３５）。ＮＬｕｃ−ＵＧＡプラスミドおよび非エレクトロポレーションのからのシグナルは検出できなかった。さらに、ＡＣＥ−ｔＲＮＡArg抑制活性は、レスキュータンパク質とＷＴタンパク質との間のＮＬｕｃ活性の同様の持続時間によって証明されるように、安定していた（図３４Ｂ）。さらに、ルシフェラーゼ発現のこの持続時間および強度は、インビボでの高い耐性とＡＣＥ−ｔＲＮＡArgで観察される増加したリードスルーの無視できる影響を支持して主張する。次に、ＲＮＡとして送達される機能的ＡＣＥ−ｔＲＮＡの能力が実証された。このために、ＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡGlyＲＮＡ転写産物を、ＮＬｕｃ−ＵＧＡレポーターを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ここで、結果は、両方のＡＣＥ−ｔＲＮＡがｃＤＮＡプラスミドとして発現されたときと同様に機能し、小分子ＲＮＡとして送達されたときに匹敵する倍数のレスキューを伴うことを示した（図３４Ｃ）。ＮＬｕｃ−ＵＧＡ ＰＴＣレポーターｃＤＮＡをエレクトロポレーションを使用してマウス皮膚組織に送達したとき、ＡＣＥ−ｔＲＮＡArg抑制活性も観察された（図３６）。
次に、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の突然変異を引き起こす２つの疾患をレスキューするように実験を設計した。この大きな膜タンパク質は、複数の臓器における上皮を横断する陰イオン輸送を制御し、そのリーディングフレーム内のミスセンスおよびナンセンス変異は嚢胞性線維症を引き起こす。この目的のために、ＣＦＴＲ ｐ．Ｇ５４２Ｘ（ｃ．１６５２４Ｇ＞Ｔ；ＵＧＡ終止コドン）およびｐ．Ｗ１２８２Ｘ（ｃ．３８４６Ｇ＞Ａ；ＵＧＡス終止コドン）ｃＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞でそれぞれのＡＣＥ−ｔＲＮＡ発現プラスミドと一時的に同時発現させ、Ｃ末端抗体を使用してウエスタンブロットによって分析し、全長タンパク質の産生を同定した（図３４Ｄ）。両方のレスキュー条件、ならびにＷＴＣＦＴＲ発現は、完全にグリコシル化されたバンドＣ形およびコアグリコシル化されたバンドＢ ＣＦＴＲタンパク質の両方の存在による証拠として、ＣＦＴＲタンパク質が正常に輸送された。単独でトランスフェクションされたｐ．Ｇ５４２Ｘまたはｐ．Ｗ１２８２Ｘのいずれのシグナルも見られず、これらの条件下で示されたＰＴＣの自発的リードスルー率が低いことを示す。送達または発現注意事項がない場合、各ＡＣＥ−ｔＲＮＡのＰＴＣ抑制特性をより良く定量化するために、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ濃度（ＲＮＡとして）を制御し、機能発現を定量化することができる非分割モデル細胞であるＸｅｎｏｐｕｓ ｌｅａｖｉｓ卵母細胞を使用した。具体的には、この発現系は、細胞膜におけるイオンチャネル機能を評価するための容易な電気生理学的方法であるマイクロインジェクションおよび２極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）分析に適している。ＣＦＴＲ ｃＲＮＡ（ｃＤＮＡテンプレートからｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される相補的ＲＮＡ）を単独で、または示されるＡＣＥ−ｔＲＮＡとともに、濃度を増加させて注入した（図３４Ｅおよび図３４Ｆ）。最大ＣＦＴＲ活性化カクテル、フォルスコリン（１０μＭ；アデニレートシクラーゼ活性化剤）、および３−イソブチル−１−メチルキサンチン（１ｍＭ；ホスホジエステラーゼ阻害剤）の存在下であっても、同時注入ＡＣＥ−ｔＲＮＡを欠く変異体のいずれについても、機能的ＣＦＴＲチャネルは見られなかった（図３４Ｅ、左）。しかしながら、同じ条件下で、２００ｎｇのＡＣＥ−ｔＲＮＡ Ｇｌｙ ｃｈｒ１９．ｔＲＮＡ２（図３４Ｅ、右上）またはＴｒｐ ｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９（図３４Ｅ、右下）を同時注入した場合、ＣＦＴＲ塩化物コンダクタンスが膜電位の一過性の変化に応答して測定され、両方のＡＣＥ−ｔＲＮＡが２つの疾患を引き起こすＵＧＡ ＰＴＣを抑制する際に非常に有効であったことを示す。レスキューされたチャネルの相対発現をより良く定量化するために、このレスキューをＷＴ ＣＦＴＲ ｃＲＮＡ単独（２５ｎｇ）と比較し、ＣＦＴＲにおけるＰＴＣの抑制を、様々なＡＣＥ−ｔＲＮＡ濃度にわたって評価した。得られたＡＣＥ−ｔＲＮＡ用量応答「電流電圧」関係を図３４Ｆに示す。これらのデータは、測定された電流を引き出すために使用される電圧に対して、各電圧における定常状態イオン電流をプロットすることによって生成され、チャネル関数および存在量の直接的測定値である。ＷＴ様の電流レベルでの発現は、Ｇｌｙ ｃｈｒ １９．ｔＲＮＡ２によって達成され、Ｔｒｐ ｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ ３９ＡＣＥ−ｔＲＮＡについては約５０％達成され、これらのｔＲＮＡについて所定の抑制活性および同族アミノ酸コードと一致した。
上述の明細書および実施例は、本発明を完全に開示し、可能にするが、それらは、本明細書に添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明を、その特定の実施形態に関して説明しており、多くの詳細を例示の目的で記載しているが、本発明が追加の実施形態に影響を受けやすく、本明細書に記載される特定の詳細が、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることは、当業者には明らかであろう。
本発明を説明する文脈において、用語「ａ」および「ａｎ」ならびに「ｔｈｅ」および同様の指示対象の使用は、本明細書で別段の指示がなされるか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅するように解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「含む」、および「含有する」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、範囲内に含まれる各個別の値を個別に参照する簡略法として機能することのみを意図しており、各個別の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書に提供される任意のおよび全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図しており、特に別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきではない。
本発明を実施するための発明者に知られている最良の形態を含む、本発明の実施形態を本明細書で説明する。これらの実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がかかる変形を適切に用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正および等価物を含む。さらに、本明細書に別段に示さない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせは、本発明によって包含される。

Claims (15)

  1. １つ以上の核酸分子またはその断片を含む、対象において１つ以上のアンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）またはその断片を生成するための組成物。
  2. ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするｃＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. ＡＣＥ−ｔＲＮＡを含むＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記１つ以上の核酸分子が、発現ベクター内にあるように操作される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. ＰＴＣに関連する疾患の治療を必要とする対象においてＰＴＣに関連する疾患を治療する方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
  7. 前記疾患が、ＵＧＡ ＰＴＣに関連する疾患または障害であり、さらに前記方法が、ＵＧＡに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記疾患が、ＵＡＡ ＰＴＣに関連する疾患または障害であり、さらに前記方法が、ＵＡＡに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記疾患が、ＵＡＧ ＰＴＣに関連する疾患または障害であり、さらに前記方法が、ＵＡＧに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記方法が、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含み、前記少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡの各々が、ポリペプチド鎖上の少なくとも２つの異なるアミノ酸分子に特異的である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記方法が、少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含み、前記少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡの各々が、ポリペプチド鎖上に同じアミノ酸分子を組み込むために特異的である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡが同一の核酸分子上でコードされる、請求項１０または１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記少なくとも２つのＡＣＥ−ｔＲＮＡが異なる核酸分子上でコードされる、請求項１０または１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記方法は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡArg、ＡＣＥ−ｔＲＮＡGly、およびＡＣＥ−ｔＲＮＡTrpからなる群から選択されるＵＧＡに特異的な少なくとも１つのＡＣＥ−ｔＲＮＡを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
  15. 前記疾患が、デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、網膜芽細胞腫、神経線維腫症、毛細血管拡張性運動失調症、テイ・サックス病、嚢胞性線維症、ウィルムス腫瘍、血友病Ａ、血友病Ｂ、メンケス病、ウルリッヒ病、β−サラセミア、２Ａ型および３型フォン・ヴィレブランド病、ロビノウ症候群、短指症Ｂ型（指および中手骨の短縮）、マイコバクテリア感染に対する遺伝的感受性、遺伝性網膜疾患、遺伝性出血傾向、遺伝性失明、先天性感音難聴および結腸無神経節症（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｇａｎｇｌｉｏｓｉｓ）ならびに感音難聴、結腸無神経節症、末梢神経障害および中枢性髄鞘形成不全性白質ジストロフィーを含む遺伝性神経発達障害、リドル症候群、色素性乾皮症、ファンコニー貧血、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５３関連癌（例えば、ｐ５３扁平上皮（ｓｑｕａｍａｌ）細胞癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌）、食道癌、骨癌、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、肝細胞癌、繊維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性転換、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
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