JP2002508959A - ヒトのサプレッサーｔＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びそれを用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 内部ナンセンス変異の読み過ごしを与えるか、又は転写された配列の翻訳を部位特異的に変える、新規な合成サプレッサーｔＲＮＡが提供されている。色素性乾皮症のような疾病の遺伝子療法による治療を包含する、遺伝子工学のプロトコルにそれを用いることも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 ＤＮＡ分子の４個のヌクレオチド塩基は、遺伝情報を運んでいる。この情報が
、３個の連続した塩基からなるコドンの形態で、ｍＲＮＡにより転写され、ｔＲ
ＮＡ及びリボソームにより翻訳され、タンパク質が形成される。遺伝暗号は、ト
リプレット・コドンと特定のアミノ酸との間の関係である。遺伝暗号を形成する
６４個の可能なコドン・トリプレットのうち、細胞のリボソームにおけるタンパ
ク質産生を終止させることが知られている３個の終止コドン又は終結コドンが存
在する。暗号の中のその他の６１個のトリプレットは、何らかのアミノ酸に対応
している。表１を参照のこと。

【０００２】

【表１】

【０００３】 遺伝指令がリボソームにおいて翻訳されると、アミノ酸がつなぎ合わされ、複
雑なポリペプチドが形成される。しかし、終止コドンが読まれると、それは終止
シグナルとして解釈され、タンパク質産生は終結する。３個の終止コドンは、Ｕ
ＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、及びＵＧＡ（オパール）である。コド
ンを終止コドンに変化させる突然変異は、ナンセンス変異と呼ばれ、結果として
、遺伝表現型は発現されえない。このように、発現を指示する遺伝子の存在にも
関わらず、不要な終止シグナルがリボソームに到達し未完成のタンパク質を終結
させるために、重要なタンパク質が産生されないということがありうる。

【０００４】 トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、リボソーム上でｍＲＮＡをタンパク質
に翻訳する。各トランスファーＲＮＡは、ｍＲＮＡとハイブリダイズするアンチ
コドン領域、及び伸長するペプチドに接着されうるアミノ酸を含む。ｔＲＮＡの
構造遺伝子は、約７２〜９０ヌクレオチド長であり、クローバー葉構造に折り畳
まれている。ｔＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写され、成熟ｔＲ
ＮＡコーディング配列の一部となる自己の遺伝子内スプリット・プロモーター（
split promoters）を含む（Sharp S.J.,Schaack J.,Coolen L.,Burke D.J.and S
oll D.,「真核生物ｔＲＮＡ遺伝子の構造及び転写（Structure and transcripti
on of eukaryotic tRNA genes）」,Crit.Rev.Biochem,19:107-144（1985）; Gei
duschek E.O.,and Tocchini-Valentini,「ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写
（Transcription by RNA polymerase III）」,Annu.Rev.Biochem.57:873-914（1
988））。

【０００５】 ナンセンス・サプレッサーは、終結コドンに応答してアミノ酸を挿入すること
ができるよう、アンチコドンが変更された、ｔＲＮＡ遺伝子の対立遺伝子である
。例えば、オーカー変異は、メッセンジャーＲＮＡにおけるＵＡＡコドンの作出
をもたらす。オーカー・サプレッサー遺伝子は、ＵＡＡ部位にアミノ酸を挿入す
るＡＵＵアンチコドンを有するｔＲＮＡを産生し、ナンセンス・コドンの存在に
も関わらず翻訳の継続を許容する。

【０００６】 多数のナンセンス・サプレッサーｔＲＮＡ対立遺伝子が、原核生物並びに酵母
及びシー・エレガンス（C.elegans）のような真核生物において同定されている 。しかしながら、現在のところ、古典的な遺伝子選択を用いて単離された、機能
的サプレッサーｔＲＮＡを含む哺乳動物細胞株は、存在しない。高等真核生物か
らサプレッサーｔＲＮＡを単離する試みは、ニワトリ・ゲノム（Hatfield D.L.,
Dudock B.S.,and Eden F.C.,「オパール・サプレッサーｔＲＮＡをコードするニ
ワトリ遺伝子及びその隣接ＤＮＡセグメントの特徴決定及びヌクレオチド配列（
Characterization and nucleotide sequence of a chicken gene encoding an o
pal suppressor tRNA and its flanking DNA segments）」,Proc.Natl.Acad.Sci
.U.S.A.,80:4940-4944（1983））において、そして後にヒト・ゲノム（O'Neill
V.A.,Eden F.C.,Pratt K.,and Hatfield D.L.,「ヒト・オパール・サプレッサー
ｔＲＮＡ遺伝子及び偽遺伝子（A human opal suppressor tRNA gene and pseudo
gene）」,J.Biol.Chem.260:2501-2508（1985））において、オパール・サプレッ
サー・ホスホセリンｔＲＮＡの同定をもたらした。この２つは、単一のヌクレオ
チド位においてのみ互いに異なっている。サプレッサーｔＲＮＡは、天然に存在
する終止コドンのリーディングスルーを引き起こし、それにより、変更された機
能を有する伸長タンパク質を産生することもある。遺伝子の末端における複数の
天然終止コドンが、そのような危険な効果に対する安全装置を提供しうるが、終
結の抑圧は、細胞にとって有毒でありうる。異なるサプレッサーｔＲＮＡは、異
なる抑圧効率を有する。Ｅ．ｃｏｌｉ及びその他の系において、アンバー・サプ
レッサーは比較的効率がよく、オーカー・サプレッサーはそれよりも効率が悪く
、オパールは最低であり、このことは、アンバー・コドンは、タンパク質合成を
終結させるために高頻度には用いられず、オーカー・コドン及びオパール・コド
ンの方が高頻度に天然の終結シグナルとして用いられることを示唆している。

【０００７】 サプレッサーによる正常な表現型の回復は、ナンセンス・コドンの位置に挿入
されるアミノ酸の型により異なるであろう。挿入されたアミノ酸は、遺伝子産物
の構造、機能、又は安定性との適合性をもたないかもしれない。従って、異なる
アミノ酸を挿入するため、極めて多様なサプレッサーｔＲＮＡの必要が存在する
。アフリカツメガエル（Xenopus Laevis）のチロシンｔＲＮＡ遺伝子由来のアン
バー・サプレッサー及びオーカー・サプレッサーは、一過性トランスフェクショ
ン・アッセイにおいても、永久的細胞株においても、哺乳動物細胞において機能
性であることが示された（Laski F.A.,Belagaje U.L.,RajBhandary U.L.and Sha
rp P.A.,「部位特異的突然変異導入により誘導されたアンバー・サプレッサーｔ
ＲＮＡ遺伝子：クローニング及び哺乳動物細胞における発現（An amber suppres
sor tRNA gene derived by site-directed mutagenesis:cloning and expressio
n in mammalian cells）」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:5813-5817（1982）; La
ski F.A.,Belagaje R.,Hudzoal R.M.,Capecchi M.R.,Palese P.,RajBhandary U.
L.and Sharp P.A.,「オーカー・サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の合成及び哺乳動 物細胞における発現（Synthesis of an ochre suppressor tRNA gene and expre
ssion in mammalian cells）」,ENBO J 3:2445-2452（1984）; Hudziak R.M.,La
ski R.A.,RajBhandary U.,Sharp P.A.and Capecchi M.R.,「複数のナンセンス変
異及び機能的サプレッサー・トランスファーＲＮＡ遺伝子を含む哺乳動物細胞株
の樹立（Establishment of mammalian cell lines containing multiple nonsen
se mutations and functional suppressor transfer RNA genes）」,Cell 31:13
1-146（1982））。カポン（Capone）及び共同研究者らは、同様に、ヒト・セリ ンｔＲＮＡ遺伝子由来のアンバー、オーカー、及びオパール・サプレッサーｔＲ
ＮＡ遺伝子を生成させた（Capone J.P.,Sharp P.A.,and RajBhandary U.L.,「ヒ
ト・セリンｔＲＮＡ遺伝子由来のアンバー、オーカー、及びオパール・サプレッ
サーｔＲＮＡ遺伝子（Amber,ochre and opal suppressor tRNA genes derived f
rom a human serine tRNA gene）」,ENBO J 4:213-221（1985））。

【０００８】 転写されたタンパク質配列の中央においてナンセンス・コドンを引き起こす突
然変異のリーディングスルーの許容に加え、遺伝子産物を短縮するため翻訳を操
縦したい場合もある。いずれの場合においても、そのような終止シグナルが不要
である場合、それを細胞のリボソームが「リードスルー」することを許容するで
あろう抑圧機構の必要が存在する。タンパク質機能について知るため、遺伝暗号
の翻訳を故意に変更することにより、タンパク質合成を部位特異的に修飾する機
会の必要も存在する。

【０００９】 細胞において機能性である新規なナンセンス・サプレッサーｔＲＮＡ、及び遺
伝子操作プロトコルにおけるその使用法を提供することが、本発明の目的である
。

【００１０】 発明の概要 本発明により、ナンセンス変異を含む細胞へ導入されたとき、ナンセンス終止
コドンの発現を抑圧し、タンパク質産物の完全な翻訳を可能にすることができる
、サプレッサーｔＲＮＡ又はその機能的等価物をコードする新規なヌクレオチド
配列が提供される。既知のヒトｔＲＮＡ配列の知識に基づき、オパール変異、ア
ンバー変異、及びオーカー変異に関係する合成オリゴヌクレオチドが構築され、
その後それらは多数の遺伝子操作プロトコルのいずれかにおいて用いられうる。

【００１１】 簡単に述べると、既知のｔＲＮＡ遺伝子の構造成分を含むオリゴヌクレオチド
が合成される。このオリゴヌクレオチドの配列は、特定のｔＲＮＡに、ナンセン
ス変異又はその他の任意の特定のもしくは所望の突然変異を認識させる、ｔＲＮ
Ａのアンチコドン領域内に作成された置換を有する、既知の配列に基づき設計さ
れる。例えば、図２に示されるように、そして本発明に従い、ｔＲＮＡに、伝統
的なセリンコドンではなくオパール終止コドンを認識させるため、オパール変異
と相補的なＴＣＡの置換を含むよう、ＴＣＧのアンチコドンを有するヒト・セリ
ンｔＲＮＡの配列が修飾された。

【００１２】 重要なこととして、本発明のオリゴヌクレオチドの配列は、ｔＲＮＡ分子をコ
ードする構造配列、及び３’隣接領域の小部分（およそ２０ｎｔ）のみを含む。
小さく、より扱いやすいオリゴヌクレオチド（即ち、およそ１００ヌクレオチド
長）を生じさせるため、５’領域は省かれる。オリゴヌクレオチド配列は、遺伝
子の構造成分を含み、３’隣接領域由来のおよそ１５個の塩基を含み、５’非コ
ーディング領域は全く含まない。従来のサプレッサーｔＲＮＡを用いた伝統的な
方法は、単離され、クローニングされ、その後サプレッサーｔＲＮＡを作出する
ため部位特異的突然変異を導入された、全長サプレッサーｔＲＮＡコーディング
分子を用いていた。本発明は、サプレッサーｔＲＮＡコーディング・オリゴヌク
レオチドの設計、即ちｔＲＮＡをコードする構造配列及び３’隣接領域の一部の
みを含むオリゴヌクレオチド配列の設計の、はるかに簡便な方法を提供する。従
って、この小さなオリゴヌクレオチドは、単離されるのではなく、標準的な遺伝
子操作技術を用いて合成的に合成され、これらの合成サプレッサーｔＲＮＡは本
発明の方法に従い用いられうる。

【００１３】 合成サプレッサーｔＲＮＡ及びそれら又はそれらの機能的等価物をコードする
配列は、多数の遺伝子操作プロトコルのいずれかに用いられうる。好ましい実施
態様において、これらの合成サプレッサー・コーディングｔＲＮＡは、疾患の原
因である短縮型不活型遺伝子産物を生じる突然変異の効果を抑圧するため、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで、遺伝子治療プロトコルに おいて細胞に導入される。サプレッサーｔＲＮＡコーディング・オリゴヌクレオ
チドは、細胞に直接導入されうる。それらは、本来のｔＲＮＡと極めて類似して
いるため、重篤な免疫応答を生じる可能性は低いであろう。さらに、好ましい実
施態様において、サプレッサー・コーディングｔＲＮＡの輸送の増加のため、ｔ
ＲＮＡ合成オリゴヌクレオチド配列は、ヌクレオチド・ベクターを含む適当な発
現媒体内に含まれうる。

【００１４】 「機能的等価物」という語は、本明細書において用いられるように、参照配列
又はタンパク質と機能的に実質的に類似している任意の誘導体をさす。特に、「
機能的等価物」という語は、生物学的機能に対して有意に反対の効果を与えるこ
となく、（一つ又は複数の）ヌクレオチド塩基及び／又は（一つ又は複数の）ア
ミノ酸が付加、欠失、又は交換されており、当分野において既知の、Maniatis e
t.al.,「分子クローニング（Molecular Cloning）」 cold Spring Harbor Press
,（1989）に開示されたプロトコルに従い、高ストリンジェンシー条件下でハイ ブリダイズするであろう誘導体を含む。

【００１５】 発明の詳細な説明 アトキンソン（Atkinson）及びマーティン（Martin）は、１９９４年に、文献
報告の検索から、ヒト遺伝子において同定されたナンセンス・コドンに対する、
１８０近い特有の点突然変異を同定した。これらの型の突然変異は、筋ジストロ
フィー、色素性乾皮症、嚢胞性線維症、血友病、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５
３扁平上皮癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌、食道癌、骨癌、卵巣癌、食道癌
、肝細胞癌、乳癌、肝細胞癌、繊維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性転換、トリオ
ースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病、及びくる病をもたらす。乳癌に関連した
ＢＲＡＣＡ−１遺伝子及びＢＲＡＣＡ−２遺伝子も、本明細書の教示に従い治療
されうる類似の突然変異を有する。本発明は、一つの実施態様において、本発明
の合成オリゴヌクレオチド・サプレッサーｔＲＮＡの導入により、ナンセンス変
異に関連した存在する突然変異の効果を逆転させることにより、これらの疾患を
治療するための方法を含む。

【００１６】 いくつかのヒトｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が既知であり、一般的
にジェンバンク（Genbank）のような供給元から当業者に利用可能である。Sprin
zl,Mathias et.Al.,Nucleic Acids Research,第12巻,Supplement,「ｔＲＮＡ配 列の編集（compilation of tRNA Sequences）」r1-r57頁（1984）; Schimmel,P.
R.,et.Al.編,「トランスファーＲＮＡ：構造、特性、及び認識（Transfer-RNA:
Structure,Properties, and Recognition）」,Cold Spring Harbor Labs New Yo
rk 1979.; Agris,P.F.,（1983）「トランスファーＲＮＡの修飾ヌクレオシド（T
he Modified Nucleosides of Transfer RNA）」,II,Alan R.Liss Inc.,New York
（Buckland RA et al.,「ヒト第６染色体の短腕上の［ＤＲＮＩ，ＴＲＲ３，Ｄ ＤＲＡＮ］へのｔＲＮＡ遺伝子のクラスター（A cluster of tRNA genes into [
DRNI,TRR3,DDRAN]on the short arm of human chromosome 6）」,Genomics,35 1
64-171（1996））も参照のこと。ｔＲＮＡは、高度に保存されており、しばしば
異なる種においても機能性であることが示されているため、細菌又は他の真核生
物ｔＲＮＡ配列も、本発明のオリゴヌクレオチドのための可能性のある起源であ
る。特定のｔＲＮＡ配列が所望の哺乳動物細胞において機能性であるか否かの決
定は、通常の実験、並びに本明細書において論じられた、又は取り込まれたアッ
セイ及び方法により、容易に確認されうる。さらなる可能性のある未知のｔＲＮ
Ａ配列は、通常の実験を用いて、本明細書において論じられたアッセイ及びプロ
トコル、並びに取り込まれた参照により確認されうる。

【００１７】 ｔＲＮＡ遺伝子は、全ての細胞型において活性である強力なプロモーターを有
する。真核生物ｔＲＮＡ遺伝子のためのプロモーターは、ｔＲＮＡ分子をコード
する構造配列自体の内部に存在する。５’上流領域内に転写活性を制御する因子
が存在するが、活性な転写ユニットの長さは、５００塩基対よりもかなり少なく
てもよく、従って輸送ベクター内の適応は問題とならない。転写されプロセシン
グを受けた後は、ｔＲＮＡは低い分解速度を有する。最後に、ナンセンス・サプ
レッサーを用いた遺伝子治療は、ナンセンス・コドンを含む標的遺伝子の内因性
の生理学的調節を維持する。当業者は、本明細書の教示に従い、本発明のオリゴ
ヌクレオチドが、ナンセンス変異により引き起こされるヒト遺伝性疾患のみなら
ず、タンパク質産物の部位特異的置換のため、広範囲の遺伝子における突然変異
に適用可能なナンセンス抑圧による遺伝子治療に用いられうることを認識するで
あろう。

【００１８】 簡単に述べると、ヒト細胞において機能性であるｔＲＮＡ遺伝子の構造成分を
含むオリゴヌクレオチドが、合成される。このオリゴヌクレオチドのＴｈｒ配列
は、特定のｔＲＮＡに、ナンセンス変異又はその他の特定の突然変異を認識させ
る、ｔＲＮＡのアンチコドン領域内に作成された置換を有する、既知の配列に基
づき設計される。例えば、図２に示されるように、そして本発明に従い、ｔＲＮ
Ａに、伝統的なセリンコドンではなくオパール終止コドンを認識させる、オパー
ル変異と相補的なＴＣＡの置換を含むよう、ＴＣＧのアンチコドンを有するヒト
・セリンｔＲＮＡの配列が修飾された。

【００１９】 重要なこととして、本発明のオリゴヌクレオチドの配列は、ｔＲＮＡ分子をコ
ードする構造配列、及び３’隣接領域の小部分（およそ２０ｎｔ）のみを含む。
小さく、より扱いやすいオリゴヌクレオチド（即ち、およそ１００ヌクレオチド
長）を生じさせるため、５’領域は省かれる。オリゴヌクレオチド配列は、遺伝
子の構造成分を含み、３’隣接領域由来のおよそ１５個の塩基を含み、５’非コ
ーディング領域は全く含まない。従来のサプレッサーｔＲＮＡを用いた伝統的な
方法は、単離され、クローニングされ、その後サプレッサーｔＲＮＡを作出する
ため部位特異的突然変異を導入された、全長サプレッサーｔＲＮＡ分子を用いて
いた。本発明は、サプレッサーｔＲＮＡの設計、即ちｔＲＮＡをコードする構造
配列及び３’隣接領域の一部のみを含むオリゴヌクレオチド配列の設計の、はる
かに簡便な方法を提供する。従って、この小さなオリゴヌクレオチドは、単離さ
れるのではなく、標準的な遺伝子操作技術を用いて合成的に合成され、これらの
合成サプレッサーｔＲＮＡは本発明の方法に従い用いられうる。設計され、本明
細書のアッセイに従い機能性であることが示された後は、合成サプレッサーｔＲ
ＮＡは、多数の異なる技術において用いられうるが、その中で最も有望なのは遺
伝子治療である。

【００２０】 サプレッサーｔＲＮＡは、現在、基礎的な生物学的問題を解決するための道具
として操作されている。それらは、ｉｎ ｖｉｖｏで、タンパク質に非天然アミ ノ酸を部位特異的に取り込ませるために用いられており（Noren C.J.,Anthony-C
ahill S.J.,Griffith M.C.and Schultz P.G.,「非天然アミノ酸のタンパク質へ の部位特異的取り込みのための一般的な方法（A general method for site-spec
ific incorporation of unnatural amino acids into proteins）」,Science 24
4:182-188（1989））、電気生理学的技術と組み合わされて、受容体、チャンネ ル、及びトランスポーターの構造機能研究のための一般的な方法を提供した（No
wak M.W.,Kearney P.C.,Sampson,J.R.,Saks,M.E.,Labarca G.C.et al.,「完全な
細胞における非天然アミノ酸取り込みにより探索されたニコチン受容体結合部位
（Nicotinic receptor binding site probed with unnatural amino acid incor
poration in intact cells）」,Science 268:439-442（1995））。しかし、ヒト
疾患の治療に関しては、サプレッサーｔＲＮＡは現在調査されているところであ
る。重要な制御遺伝子内に生じるナンセンス変異は、しばしば、細胞にとって有
害であり、いくつかの型の遺伝性疾患の原因となる。アトキンソン（Atkinson）
及びマーティン（Martin）（Atkinson J.and Martin R.,「ヒト遺伝性疾患にお けるナンセンス・コドンに対する突然変異：ナンセンス・サプレッサーｔＲＮＡ
による遺伝子治療の意味（Mutations to nonsense codons in human genetic di
sease: implications for gene therapy by nonsense suppressor tRNAs）」,Nu
cleic Acids Res.22:1327-1334（1994））は、ヒト遺伝子において同定された、
ヒト遺伝性疾患を引き起こすナンセンス・コドンをもたらす１７９個の特有の点
突然変異のリストを調査し、報告した。これらは全て、サプレッサーｔＲＮＡ技
術による疾患の治療のための遺伝子治療（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ）の
ための、可能性のある標的である。遺伝子治療へのサプレッサーｔＲＮＡの可能
性のある適用は、βサラセミアで最初に証明された（Temple G.F.,Dozy A.M.,Ro
y K.L.and Kan Y.W.,「機能的ヒト・サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の構築：βサ ラセミアのための遺伝子治療の手法（Construction of a functional human sup
pressor tRNA gene:an approach to gene therapy for β-thalassemia）」,Nat
ure 296:537-540（1982））。両者をアフリカツメガエル卵母細胞株においてｉ ｎ ｖｉｖｏで同時発現させたとき、ヒト・アンバー・サプレッサー・リジンｔ ＲＮＡは、突然変異β−グロビン遺伝子におけるナンセンス変異を抑圧すること
ができた。ナンセンス変異により引き起こされる遺伝性疾患の治療のためのサプ
レッサーｔＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ適用は、ジストロフィン遺伝子にオーカー変 異を有するヒト・デュセーヌ筋ジストロフィーの動物モデルであるｍｄｘマウス
において、最近証明された（Li K,Zhang J.,Buvoli M.,Yan X.D.,Leinwand L.an
d He H.,「オーカー・サプレッサー・トランスファーＲＮＡはｍｄｘマウスにお
けるジストロフィン発現を回復させた（Ochre suppressor transfer RNA restor
ed dystrophin expression in mdx mice）」,Life Sciences 61:205-209（1997 ））。オーカー・サプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡのｍｄｘ
マウスへの直接注入は、ジストロフィン陽性線維を産生した。遺伝子治療用の治
療剤としてのサプレッサーｔＲＮＡの実際の適用は、遺伝子発現を持続すること
ができる効率のよいベクターの開発に大きく依存する。

【００２１】 最近、それらは、発生における細胞−細胞相互作用の研究のような基礎的な生
物学的問題を解決するため（Kunes,S.& Steller,H.,「毒素遺伝子の条件的発現 によるショウジョウバエ光受容体細胞の除去（Ablation of drosophila photore
ceptor cells by conditional expression of a toxin gene）」,Genes Develop
5,970-983（1991））、又はｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質に非天然アミノ酸を部
位特異的に取り込ませるため（Noren C.J.,Anthony-Cahil, S.J.,Griffith M.C.
& Schultz P.G.,「非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的取り込みのため の一般的な方法（A general method for site-specific incorporation of unna
tural amino acids into proteins）」,Science 244:182-188（1989））の道具 として利用された。電気生理学的技術と組み合わされて、それらは、受容体、チ
ャンネル、及びトランスポーターの構造機能研究のための一般的な方法を提供し
た（Nowak M.W.et al.,「完全な細胞における非天然アミノ酸取り込みにより探 索されたニコチン受容体結合部位（Nicotinic receptor binding site probed w
ith unnatural amino acid incorporation in intact cells）」,Science 268:4
39-442（1995））。

【００２２】 本発明のさらなる使用は、不活型毒素分子を活性型毒素分子へと変換するため
の誘発因子としてのサプレッサー・オリゴヌクレオチドｔＲＮＡの使用を含む。
例えば、Robinson et al.,「ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子内に誘導された単一及び
二重のナンセンス変異の抑圧：毒素遺伝子治療のための可能性のあるバイナリー
系（Suppression of single and double nonsense mutations induced into the
diphtheria toxin A-Chain Gene: a potential binary system for toxin gene
therapy）」,Human Gene Therapy 6:137-143（1995年2月）を参照のこと。

【００２３】 さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、構造と機能との関係を同定するため
、遺伝子産物にミスセンス変異を導入することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタン パク質産物の部位特異的突然変異を起こすために用いられうる。

【００２４】 本発明により、およそ１００ヌクレオチド長であり、セリン又はアルギニンが
存在すべき場所にナンセンス・コドンを生じる突然変異を抑圧するため細胞に導
入されうる、ヒト・オパール、アンバー、及びオーカー・サプレッサー・セリン
及びアルギニンｔＲＮＡが設計された。オリゴヌクレオチドは、受容細胞に直接
導入されてもよいし、又はオリゴヌクレオチドの効率を増加させるためタンデム
にライゲートされてもよい。さらにもう一つの実施態様において、本発明のサプ
レッサーｔＲＮＡは、ベクターの使用により、標準的な一般的な遺伝子操作技術
を用いて細胞に導入されうる。別の転写ユニットが提供されてもよいが、ｔＲＮ
Ａコーディング配列の内部プロモーター配列のため、ｔＲＮＡは別の転写ユニッ
トに含まれている必要はない。

【００２５】 好ましい実施態様において、本発明のヌクレオチド発現系は適当な遺伝子移入
媒体内に含まれ、その後それはサプレッサーｔＲＮＡを発現するよう細胞を形質
導入するために用いられる。遺伝子輸送媒体は、当分野において既知の任意の輸
送媒体であってよく、受容体媒介型トランスフェクションにより促進される単純
な裸ＤＮＡ、及び多数のベクターの任意のものを含みうる。そのようなベクター
は、これらに限定されないが、真核生物ベクター、（例えば、細菌ベクターのよ
うな）原核生物ベクター、及び、これらに限定されないが、レトロウイルス・ベ
クター、アデノウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルス・ベクター、レンチウ
イルス・ベクター（ヒト及びブタを含むその他）、ヘルペスウイルス・ベクター
、エプスタインバーウイルス・ベクター、ＳＶ４０ウイルス・ベクター、ポック
スウイルス・ベクター、シュードタイプ（pseudotype）ウイルス・ベクターを含
むウイルス・ベクターを含む。

【００２６】 好ましい実施態様において、パッケージング細胞株が、発現すべき核酸配列を
含むウイルス・ベクターで形質導入され、ウイルス・ベクターを含むプロデュー
サー細胞株が形成される。その後、プロデューサー細胞は、プロデューサー細胞
が受容細胞を形質導入することができるウイルス粒子を生成させるよう、直接投
与されうる。

【００２７】 好ましい実施態様において、ウイルス・ベクターは、レトロウイルス・ベクタ
ー又はアデノウイルス・ベクターである。使用されうるレトロウイルス・ベクタ
ーの例は、これらに限定されないが、モロニーマウス白血球ウイルス（Moloney
Murine Leukemia Virus）、脾臓壊死ウイルス（spleen necrosis virus）、並び
にラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus）、ハーベイ肉腫ウイルス（Harvey
Sarcoma Virus）、トリ白血病ウイルス（avian leukosis virus）、ヒト免疫不
全ウイルス（human immunodeficiency virus）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（myel
oproliferative sarcoma virus）、及び乳癌ウイルス（mammary tumor virus） のようなレトロウイルス由来のベクターを含む。

【００２８】 レトロウイルス・ベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介型遺伝子転移
を媒介するための薬剤として有用である。レトロウイルス・ベクターは、一般的
に、ウイルスの構造遺伝子をコードする配列の大部分が欠失し（一つ又は複数の
）目的の遺伝子と交換されるように、構築される。当分野において既知の遺伝子
操作技術を用いて、構造遺伝子（即ち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）が、レト
ロウイルス骨格から除去されることが最も多い。これは、パッケージング・シグ
ナルの適当な部分を含む断片を生成させるための、適当な制限エンドヌクレアー
ゼによる、又はいくつかの場合にはＢａｌ３１エキソヌクレアーゼによる消化を
含む。

【００２９】 これらの新規遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルス骨格に取り込
まれた。最も単純な構築は、レトロウイルスの構造遺伝子が単一遺伝子と交換さ
、その後それが、ロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）内のウイルス制御配
列の調節下で転写されるものである。一つより多い遺伝子を標的細胞へ導入する
ことができるレトロウイルス・ベクターも構築されている。通常、そのようなベ
クターにおいては、一つの遺伝子がウイルスＬＴＲの制御的調節下にあり、第二
の遺伝子は、スプライシングを受けたメッセージなしに発現されるか、又は自己
の内部プロモーターの制御下にある。

【００３０】 特に、ベクターとパッケージング細胞内のパッケージング欠陥ヘルパー・ウイ
ルスとの組み換えの確率を減少させるための努力において、ウイルス骨格のウイ
ルス成分を最少限に抑えるための努力がなされている。パッケージング欠陥ヘル
パー・ウイルスは、ベクター自体から欠失された、レトロウイルスの構造遺伝子
を提供するために必要である。

【００３１】 一つの実施態様において、レトロウイルス・ベクターは、ベクターとパッケー
ジング系との間の相同性を絶対的最小に減少させるための一連の欠失及び置換を
含む、Ｎ２ベクター（Armentano,et al.,J.Virol.61:1647-1650）に基づく、Ben
der,et al.,J.Virol.61:1639-1649（1987）に記載された一連のベクターのうち の一つでありうる。これらの変化は、ウイルス・タンパク質が発現する可能性も
減少させた。これらのベクターの最初のものＬＮＬ−ＸＨＣにおいては、部位特
異的突然変異導入によりｇａｇの天然ＡＴＧ開始コドンがＴＡＧに変更されてお
り、意図されていない、その点からのタンパク質合成が排除されていた。

【００３２】 モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）においては、本物のｇａｇ開
始点の５’に、他のグリコシル化タンパク質（ｐＰｒ８０ｇａｇ）の発現を許容
するオープン・リーディング・フレームが存在する。モロニーマウス肉腫ウイル
ス（Moloney murine sarcoma virus）（ＭｏＭｕＳＶ）は、ｐＰｒ８０ｇａｇの
アミノ末端の可能性のある発現を回避する、フレームシフト及びグリコシル化部
位の欠損を含む変更を、この５’領域に有する。従って、ＬＮＬ−ＸＨＣの変更
されたＡＴＧ及びＭｏＭｕＳＶの５’位の両方が取り込まれたベクターＬＮＬ６
が作成された。従って、ＬＮベクター系列の５’構造は、遺伝学的に形質導入さ
れた標的細胞において結果的にウイルス抗原を産生する、レトロウイルス・リー
ディング・フレームの発現の可能性を排除している。パッケージング欠陥ヘルパ
ー・ウイルスとのオーバーラップを減少させるための最後の変更において、ミラ
ー（Miller）は、ＬＮベクター内の３’ＬＴＲの直前に存在する追加的ｅｎｖ配
列を排除した（Miller,et al.,Biotechniques,7:980-990,1989）。

【００３３】 遺伝子治療への適用のため、いかなる遺伝子移入系によっても満たされなけれ
ばならない最高の必要は、安全性である。安全性は、ベクター・ゲノム構造と、
感染性ベクターの産生のため利用されるパッケージング系との組み合わせから得
られる。ミラー（Miller）らは、ベクター・ゲノムとパッケージング欠陥ヘルパ
ー・ゲノムとの間の組換えの部位ほぼ全ての排除により組換え野生型レトロウイ
ルスの生成が最少に減少している、レトロウイルス構造タンパク質の発現のため
のｐＰＡＭ３プラスミド（パッケージング欠陥ヘルパー・ゲノム）と、ベクター
・パッケージング系を作成するためのＬＮベクター系列との組み合わせを開発し
た（即ち、ｐＰＡＭ３を含むＬＮ）。

【００３４】 一つの実施態様において、レトロウイルス・ベクターは、前記の、そしてBend
er,et al（1987）及びMiller,et al.（1989）にさらに記載されているもののよ うな、ＬＮベクター系列のモロニーマウス白血病ウイルスでありうる。そのよう
なベクターは、マウス肉腫ウイルス由来のパッケージング・シグナルの一部、及
び変異したｇａｇ開始コドンを有する。「変異した」という語は、本明細書にお
いて用いられるように、ｇａｇタンパク質又はその断片もしくは短縮物が発現し
ないよう、ｇａｇ開始コドンが欠失又は変更されていることを意味する。

【００３５】 もう一つの実施態様において、レトロウイルス・ベクターは、少なくとも４個
のクローニング部位、又は制限酵素認識部位を含んでいてもよく、その部位のう
ち少なくとも２個は、１０，０００塩基対当たり１回未満という真核生物遺伝子
における平均出現頻度を有し、即ち、制限産物は少なくとも１０，０００塩基対
という平均ＤＮＡサイズを有する。好ましいクローニング部位は、ＮｏｔＩ、Ｓ
ｎａＢＩ、ＳａｌＩ、及びＸｈｏＩからなる群より選択される。好ましい実施態
様において、レトロウイルス・ベクターはこれらのクローニング部位のそれぞれ
を含む。

【００３６】 そのようなクローニング部位を含むレトロウイルス・ベクターが使用される場
合には、レトロウイルス・ベクター上に位置するＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、Ｓａｌ
Ｉ、及びＸｈｏＩからなる群より選択される少なくとも２個のクローニング部位
と適合性のある少なくとも２個のクローニング部位を含むシャトル・クローニン
グ・ベクターも提供されうる。シャトル・クローニング・ベクターは、シャトル
・クローニング・ベクターからレトロウイルス・ベクターへ転移されることがで
きる少なくとも１つの所望の遺伝子も含む。

【００３７】 シャトル・クローニング・ベクターは、クローニング部位又は制限酵素認識部
位を含む一つ又は複数のリンカーがライゲートした基本「骨格」ベクター又は断
片から構築されうる。クローニング部位には、前述の適合性のある又は相補的な
クローニング部位が含まれる。シャトル・ベクターの制限部位に対応する末端を
有する遺伝子及び／又はプロモーターが、当分野において既知の技術によりシャ
トル・ベクターとライゲートされうる。

【００３８】 シャトル・クローニング・ベクターは、原核生物系においてＤＮＡ配列を増幅
するために使用されうる。シャトル・クローニング・ベクターは、原核生物系、
特に細菌において一般的に用いられているプラスミドから調製されうる。従って
、例えば、シャトル・クローニング・ベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８な
どのようなプラスミド由来でありうる。

【００３９】 ベクターは、一つ又は複数のプロモーターを含む。使用されうる適当なプロモ
ーターは、これらに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモー
ター、及びMiller,et al.,Biotechniques,7:（9）:980-990（1989）に記載され たヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、又はその他の任意のプ
ロモーター（例えば、これらに限定されないが、ヒストン・プロモーター、ｐｏ
ｌＩＩＩプロモーター、及びβ−アクチン・プロモーターを含む真核細胞プロモ
ーターのような細胞プロモーター）を含む。使用されうるその他のウイルス・プ
ロモーターは、これらに限定されないが、アデノウイルス・プロモーター、ＴＫ
プロモーター、及びＢ１９パルボウイルス・プロモーターを含む。適当なプロモ
ーターの選択は、本明細書に含まれる教示から、当業者に明らかとなろう。

【００４０】 その後、ベクターは、プロデューサー細胞株を形成させるため、パッケージン
グ細胞株を形質導入するために使用される。トランスフェクトされうるパッケー
ジング細胞の例は、これらに限定されないが、ＰＥ５０１細胞株、ＰＡ３１７細
胞株、Ψ２細胞株、Ψ−ＡＭ細胞株、ＰＡ１２細胞株、Ｔ１９−１４Ｘ細胞株、
ＶＴ−１９−１７−Ｈ２細胞株、ΨＣＲＥ細胞株、ΨＣＲＩＰ細胞株、ＧＰ＋Ｅ
−８６細胞株、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２細胞株、及びＤＡＮ細胞株を含む。薬剤を
コードする核酸配列の発現時に、腫瘍細胞の増殖の阻害、抑制、又は破壊を提供
することができる、薬剤をコードする核酸配列を含むベクターは、当分野におい
て既知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入することができる。
そのような手段は、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、リポソ
ームの使用、及びＣａＰＯ４沈殿を含む。

【００４１】 その後、プロデューサー細胞は、所望の受容細胞に直接、又はその近傍に投与
される。

【００４２】 好ましい実施態様において、本発明は、ヒト、及びヒトに基づくパッケージン
グ細胞株に一般に感染するウイルス・ベクターを含む。例えば、活性型α−ガラ
クトシル・エンベロープを発現しない、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウ
イルスのようなヒトに一般に感染するウイルス由来のベクターが用いられうる。

【００４３】 最も好ましい実施態様において、ベクターは、ヘルペス単純ウイルス・プラス
ミド・ベクターを含む。１型ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ−１）は、遺伝子治
療のための可能性のある有用な遺伝子輸送ベクター系として証明されている（Gl
orioso,J.C.,「中枢神経系への遺伝子移入のためのヘルペス単純ウイルス・ベク
ターの開発 遺伝子治療薬：直接遺伝子移入の方法及び応用（Development of H
erpes Simplex Virus Vectors for Gene Transfer to the Central Nervous Sys
tem.Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer ）」,Jon A.Wolff編,1994 Birkhauser Boston,281-302; Kennedy,P.G.,「神経学
的疾患における遺伝子治療のためのヘルペス単純ウイルス・ベクターの使用（Th
e Use of Herpes Simplex Virus Vectors for Gene Therapy in Neurological D
isease）」,Q J Med,1993年11月,86（11）:697-702; Latchman,D.S.,「遺伝子治
療用のヘルペス単純ウイルス・ベクター（Herpes Simplex Virus Vectors for G
ene Therapy）」,Mol Biotechnol,1994年10月,2（2）:179-95）。

【００４４】 ＨＳＶ−１ベクターは、筋肉（Huard,J.,「１型ヘルペス単純ウイルス・ベク ターにより媒介される筋肉への遺伝子移入（Herpes Simplex Virus Type 1 Vect
or Mediated Gene Transfer to Muscle）」,Gene Therapy,1995,2,385-392）、 及び脳（Kaplitt,M.G.,「プレプロエンケファリン・プロモーターは、欠陥ヘル ペス単純ウイルス・ベクターを介した直接ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子移入後、成人脳 において領域特異的かつ長期的な発現をもたらす（Preproenkephalin Promotor
Yields Region-Specific and Long-Term Expression in Adult Brain After Dir
ect In Vivo Gene Transfer Via a Defective Herpes Simplex Viral Vector） 」,Proc Natl Acad Sci USA,1994年9月13日,91（19）:8979-83）への遺伝子移入
に用いられており、マウス脳腫瘍治療に用いられている（Boviatsis,E.J.,「ガ ンシクロビル及び完全なチミジンキナーゼ遺伝子を保持するヘルペス単純ウイル
ス・ベクターで治療された脳新生物を保有するラットの長期的生存（Long-Term
Survival of Rats Harboring Brain Neoplasms Treated With Ganciclovir and
a Herpes Simplex Virus Vector That Retains an Intact Thymidine Kinase Ge
ne）」,Cancer Res,1994年11月15日,54（22）:5745-51; Mineta,T.,「ガンシク ロビル過敏性リボヌクレオチド・リダクターゼ欠損ヘルペス単純ウイルス突然変
異体を用いた悪性神経膠腫の治療（Treatment of Malignant Gliomas Using Gan
ciclovir-Hypersensitive,Ribonucleotide Reductase-Deficient Herpes Simple
x Viral Mutant）」,Cancer Res,1994年8月1日,54（15）:3963-6）。

【００４５】 より容易な取り扱い及びより大きな挿入能（最大１４０ｋｂ）のため、ヘルパ
ー・ウイルス依存性ミニ・ウイルス・ベクターが開発されている（Geller,Al,「
欠陥ヘルペス単純ウイルス・ベクターのための効率のよい欠失変異パッケージン
グ系：ヒト遺伝子治療及びニューロン生理学への可能性のある適用（An Efficie
nt Deletion Mutant Packaging System for Defective Herpes Simplex Virus V
ectors: Potential Applications to Human Gene Therapy and Neuronal Physio
logy）」,Proc Natl Acad Sci USA,1990年11月,87（22）:8950-4; Frenkel,N., 「ヘルペス単純ウイルス・アンプリコン：用途の広い欠陥ウイルス・ベクター（
The Herpes Simplex Virus Amplicon: A Versatile Defective Virus Vector） 」,Gene Therapy.1.Supplement 1,1994）。複製能のないＨＳＶアンプリコンが 当分野において構築されており、一例は、参照として本明細書に取り込まれるGe
ller et al,Science,241,1988年9月によるｐＨＳＶｌａｃベクターである。これ
らのＨＳＶアンプリコンは、外因性ＤＮＡの挿入のための空間を提供するため、
ＨＳＶゲノムの大きな欠失を含む。典型的には、それらは、ＨＳＶ−１パッケー
ジング部位、ＨＳＶ−１「ｏｒｉＳ」複製部位、及びＩＥ４／５プロモーター配
列を含む。これらのビリオンは、繁殖のためヘルパー・ウイルスに依存している
。

【００４６】 組み換えを最少限に抑えるため、主に２つの型の突然変異ヘルパー・ウイルス
が開発されている。他の相補的ＨＳＶヘルパー・ウイルス系は、本明細書におい
て考慮され、当業者の範囲内である。開発されているそのような系の一つは、温
度感受性突然変異体である。ＩＥ３遺伝子内にＴＳ変異を有するＨＳＶ温度感受
性（ＴＳ）変異体が開発されている（Davison et al,1984,J.Gen.Virol.,65:859
-863）。その結果、このウイルスは、ＩＥ形質を有し、ＤＮＡを複製せず、細胞
の生理学を有意に変更せず、３７℃で子孫ウイルスを産生しない。ウイルスは、
３７℃の許容温度で増殖する。しかし、ＴＳ突然変異体は、野生型に復帰する傾
向を有する。

【００４７】 対照的に、第二のヘルパー・ウイルス系は、ＩＥ３遺伝子の大部分が単純に欠
失している欠失変異体である。これらは、野生型に復帰しない。従って、欠失変
異体を用いてパッケージされたＨＳＶ−１ベクターは、本発明の最も好ましいヘ
ルパー・ウイルスである。例えば、Patterson et al.,1990,J.Gen.Virol.,71:17
75-1783を参照のこと。その他の複製能のないヘルパー・ウイルスも用いること ができ、当業者であれば、適当な複製機能及び発現機能を提供し、ヘルパー細胞
株及びベクターと協同作用する複製能のないヘルパー・ウイルスを生じる、ＩＥ
遺伝子又はその他の遺伝子におけるその他の突然変異が、本発明において考慮さ
れることを認識するであろう。ＩＥ３もしくは複製依存性遺伝子を発現すること
ができるか、又は既に形質転換されており商業的に入手可能なヘルパー細胞株を
得ることができる限りにおいて、任意の細胞株が、この工程に用いられうる。ｐ
ＨＥ及びＩＥ３遺伝子を含むプラスミドを同時に導入することにより、任意の細
胞株が用いられうる。次に、ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カル
シウムＤＮＡトランスフェクション、又はその他の任意の適当な方法により、ヘ
ルパー細胞株に輸送される。ｐＨＥ及びＩＥ３遺伝子を含むプラスミドを同時に
導入することにより、任意の細胞株が用いられうる。次に、細胞は、ヘルパー・
ウイルスＩＥ３欠失変異体又はその他の複製能のない対応する欠失変異体を感染
させられる。ヘルパー細胞株内のＩＥ３遺伝子又はその他のそのような遺伝子は
、ヘルパー・ウイルスを補足して生産的なＨＳＶ−１感染をもたらし、得られた
ウイルス・ストックは、全て複製能がないベクターＤＮＡ又はヘルパー・ウイル
スＤＮＡを含むＨＳＶ−１粒子からなる。ヘルパー細胞株に関するさらなる情報
及び方法論は、Geller et al.,PNAS,87:8950-8954,1990年11月,「欠陥ヘルペス 単純ウイルス・ベクターのための効率のよい欠失変異パッケージング系：ヒト遺
伝子治療及びニューロン生理学への可能性のある適用（An Efficient Deletion
Mutant Packaging System for Defective Herpes Simplex Virus Vectors: Pote
ntial Applications to Human Gene Therapy and Neuronal Physiology）」に開
示されている。本発明は、複製能のないＨＳＶアンプリコンを、１０倍大きい力
価及び極めて大きいＤＮＡ挿入能を達成するエピソーム形態で細胞内にベクター
が維持されることを可能にする、エプスタインバーウイルス、ヒト・パピローマ
ウイルス、又はウシ１型パピローマウイルス由来のもののような他のウイルス配
列と組み合わせるＨＳＶミニ・ベクターを含む。

【００４８】 本発明の一つの実施態様は、（ａ）パッケージ／開裂シグナルのためのＨＳＶ
−１「ａ」配列及び（ヘルパー・ウイルス由来の複製及びパッケージングのため
のシグナルに応答した）プラスミドの複製パッケージングのための「ｏｒｉＳ」
複製起点；（ｂ）エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）核抗原（ＥＢＮＡ−１）
遺伝子及び宿主ゲノムへ組み込まれない複製のため、及び２つの分裂細胞のそれ
ぞれへの複製のため、エピソーム形態で核内にベクターが維持されることを可能
にするＥＢＶ潜在的複製開始点（ｏｒｉＰ）、好ましくは（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉに
おけるベクターの繁殖のための真核細胞由来の遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子
又はテトラサイクリン耐性遺伝子及びｃｏｌ．Ｅ１ｏｒｉのような選択可能マー
カー遺伝子）、並びに（ｄ）ナンセンス・サプレッサーｔＲＮＡをコードする配
列、を含むヘルパー・ウイルス依存性ミニ・ウイルス・ベクターを含む。場合に
より、ベクターは、陽性ハイグロマイシン選択のための遺伝子のような、第二の
選択可能マーカーを提供する、原核生物遺伝子を含んでいてもよい。例えば、参
照として本明細書に取り込まれる米国特許第５，８３０，７２７号に記載されて
いる。

【００４９】 この特定の実施態様において、ミニ・ベクターＤＮＡのヘルペス単純ウイルス
・カプシドへのパッケージング機能は、ヘルパー・ウイルス及びヘルパー細胞株
により提供される。

【００５０】 さらにもう一つの実施態様において、ＨＳＶベクターは、Mann et al.,「レト
ロウイルス・パッケージング突然変異体の構築及びヘルパー・フリー欠陥レトロ
ウイルスを作製するためのその使用（Construction of a Retro-Virus Packagin
g Mutant and its Use to Produce Helper-Free Defective Retrovirus）」,33
Sal.,153-159頁,1983年5月,Journal of Virology,1989年9月、3822-3829頁、198
9年9月; Samulski「ヘルパー・フリー組換えアデノ随伴ウイルス・ストック：正
常な取り込みはウイルス遺伝子発現を必要としない（Helper-Free Stocks of Re
combinant Adeno-Associated Viruses: Normal Integration Does Not Require
Viral Gene Expression）」;及びKohn et al.,「哺乳動物細胞への高効率遺伝子
移入：広い哺乳動物宿主域を有するヘルパー・フリー組換えレトロウイルスの生
成（High Efficiency Gene Transfer Into Mammalian Cells: Generation of He
lper-Free Recombinant Retrovirus With Broad Mammalian Host Range）」,PNA
S,81:6349-6353,1984年10月のように、ヘルパー・フリー・ウイルス・ベクター を産生するよう操作されうる。参照として本明細書に取り込まれる、オカシンキ
（Okasinki）の米国特許第４，９７０，１５５号「ＨＳＶヘルパー・ウイルス依
存性ベクター（HSV HELPER VIRUS INDEPENDENT VECTOR）」も参照のこと。

【００５１】 本発明により、ヒト・オーカー・サプレッサー・セリンｔＲＮＡ（配列番号：
１）、ヒト・アンバー・サプレッサー・セリンｔＲＮＡ（配列番号：２）、ヒト
・セリン・オパール・サプレッサーｔＲＮＡ（配列番号：３）、及びヒト・オパ
ール・サプレッサー・アルギニンｔＲＮＡ（配列番号：４）を含む、いくつかの
ｔＲＮＡ合成サプレッサーが合成された。これらのオリゴヌクレオチドは、ヒト
細胞において活性型サプレッサーｔＲＮＡとして機能し、ナンセンス変異のリー
ディングスルーを提供することが示された。従って、本発明は、これらのオリゴ
ヌクレオチド及びそれらの機能的等価物を含む。オリゴヌクレオチドを取り込み
、これらを、ｐＨＥｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌを含む本発明に係る受容 細胞へ輸送することに成功したベクターも、設計された。

【００５２】 本明細書の教示に基づくさらなるオリゴヌクレオチド、及びそれらを取り込む
ヌクレオチド輸送媒体の設計は、通常の実験過程の単純な最適化であり、本発明
の範囲に含まれるものとする。

【００５３】 本明細書において引用された全ての参照は、特別に、参照として完全に本明細
書に取り込まれる。以下の実施例は、本明細書の教示を例示するためのものであ
り、決して本発明を制限するものではない。

【００５４】 （実施例） 色素性乾皮症（ＸＰ）は、日光により誘導される皮膚癌その他の神経学的異常
の顕著な素質を伴う常染色体性劣性遺伝疾患である［Cleaver, J.E., "Defectiv
e repair replication of DNA in xeroderma pigmentosum", Nature 218, 652-6
56 (1968)］。この病気は、紫外線に対する極度の過敏性、及びＤＮＡヌクレオ チド切断修復（ＮＥＲ）の不全を特徴とする［Hanawalt, P.C., "DNA repair co
mes of age", Mutation Res. 336, 101-113 (1995)；Copeland, N.E., Hanke, C
.W. & Michalak, J.A., "The molecular basis of xeroderma pigmentosum", De
rmatol. Surg. 23, 447-455 (1997)］。ＤＮＡ修復の欠陥を補うための細胞融合
の研究は、ＸＰＡ〜ＸＰＧと名付けられたＸＰの七つの遺伝的補修群の特定へと
導き［Cleaver, J.E. & Kraemer, A.L., "Xeroderma Pigmentum", The Metaboli
c Basis of Inherited Disease Vol. II (eds. Scriver, C.R., L., B.A., Sly,
W.S. & Valle, D.) 2949-1971 (McGraw-Hill, New York, 1989)］、ＮＥＲの経
路には、少なくとも７種類の異なる遺伝子産物が関与することを示唆した。これ
らの関連するヒト遺伝子（ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＥ、ＸＰＦお
よびＸＰＧ）のすべてが、特定され、特定の染色体での位置に対して地図が作成
されている［Cleaver, J.E. & Kraemer, A.L., "Xeroderma Pigmentum", The Me
tabolic Basis of Inherited Disease Vol. II (eds. Scriver, C.R., L., B.A.
, Sly, W.S. & Valle, D.) 2949-1971 (McGraw-Hill, New York, 1989)；Tanaka
, K. et al., "Analysis of a human DNA excision repair gene involved in g
roup A xeroderma pigmentosum and containing a zinc-finger domain" Nature
348 73-78 (1990)；Satokata, I., Iwai, K., Matsuda, T., Okada, Y. & Tana
ka, K., "Genomic characterization of the human DNA excision repair-contr
olling gene XPAC", Gen 136, 345-348 (1993)；Boulikas, T., "Xeroderma pig
mentosum and molecular cloning of DNA repair genes", Anticancer Res. 16,
693-708 (1996)］。これらのＤＮＡ修復遺伝子のクローニング及び特徴付けは 、ＮＥＲの機序、及びＮＥＲの分子的欠陥とＸＰという疾病の臨床的現出との間
の関係に関する理解を大幅に増加させた［Nishigori, C., Moriwaki, S.-i., Ta
kebe, H., Tanaka, T. & Imamura, S., "Gene alterations and clinical chara
cteristics of xeroderma pigmentosum group A patients in Japna", Arch. De
rmatol. 130, 191-197 (1994)］。病的な表現型を補正するための新規な遺伝学 的取組み方を立証するために、この疾病を選んだ。

【００５５】 ＸＰ表現型の欠陥を補正するための一般的な取組み方は、ＸＰ患者に由来する
細胞に、関連するＤＮＡ修復遺伝子を導入することであると思われる。いくつか
のin vitroでの研究は、正常なＤＮＡ修復表現型の回復と、正常なＤＮＡ修復遺
伝子の発現に続いての、ＸＰ細胞のＵＶ照射後の生存率の向上とを立証した［Me
zzina, M. et al., "Correction by the ERCC2 gene of UV sensitivity and re
pair deficiency phenotype in a subset of trichothiodystrophy cells", Car
cinogensis, 15, 1493-1498 (1994)；Gozukara, E.M. et al., "The human DNA
repair gene, ERCC2 (XPD), corrects ultraviolet hypersensitivity and ultr
aviolet hypermutability of a shuttle vector replicated in Xeroderma pigm
entosum", Cancer Res., 54, 3837-3844 (1944)；Levy, D.D., Saijo, M., Tana
ka, K., Kraemer, K.H., "expression of a transfected DNA repair gene (XPA
) in Xeroderma pigmentosum group A cells restores normal DNA repair and
mutagenesis of UV-treated plasmids", Carcinogenesis, 16, 1557-1563 (1995
)；Yagi, T. et al., "Complete restoration of normal DNA repair character
istics in group F xeroderma pigmentosum cells by over-expression of tran
sfected XPF cDNA", Carcinogenesis, 19, 55-60 (1998)］。他の研究者は、マ ウス、酵母及びショウジョウバエのような、他の生物からのＤＮＡ修復遺伝子を
導入することによって、欠陥を補っている［Tanaka, K., Satokata, I., Ogita,
Z., Uchida, T. & Okada, Y., "Molecular cloning of a mouse DNA repair ge
ne that complements the defect of group-A xeroderma pigmentosum", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5512-5516 (1989)；Lambert, C., et al., "A yeas
t DNA repair gene partially complements defective excision repair in mam
malian cells", EMBO J, 7, 3245-3253 (1988)；Shimamoto, T., et al., "Expr
ession and functional analyses of the Dxpa gene the drosophila homolog o
f the human excision repair gene XPA", J. Biol. Chem., 270, 22452-22459
(1995)］。もう一つの役立つ取組み方は、ＤＮＡ修復遺伝子又はその転写物の遺
伝的欠陥を補正し、それによって、正常な表現型を回復することであると思われ
る。分子遺伝学的研究は、ＸＰ群Ａ補修（ＸＰＡＣ）遺伝子での新規な欠失、ス
プライシング、点突然変異及びナンセンス突然変異を規定している［Satoka, I.
et al., "Characterization of a splicing mutation in group A xeroderma p
igmentosum", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 9908-9912 (1990)；Satokata
, I. et al., "Three nonsense mutations responsible for group A xeroderma
pigmentosum", Mutation Res., 273, 193-202 (1992)；Satokata, I., Tanaka,
K. & Okada, Y., "Molecular basis of group A xeroderma pigmentosum: a mi
ssense mutation and two deletions located in a zinc finger consensus seq
uence of the XPAC gene", Hum. Genet., 88, 603-607 (1992)；Satokata, I.,
Tanaka, K., Yuba, S. & Okada, Y., "Identification of splicing mutations
of the last nucleotides of exons a nonsense mutation and a missense muta
tion of the XPAC gene as causes of group A xeroderma pigmentosum", Mutat
ion Res., 273, 203-212 (1992)］。ナンセンス突然変異によって生じた遺伝的 欠陥は、本発明の教示に従って、未成熟の終結シグナルを認識するサプレッサー
ｔＲＮＡを発現し、それによって、その対応するアミノ酸の挿入、及び正常な表
現型の回復を招くことによって修復することができると思われる。

【００５６】 材料及び方法 細胞系：ＤＮＡ修復に優れたヒト繊維芽細胞系（ＶＡ１３、すなわちＳＶ４０で
形質転換したヒトＷ１３８繊維芽細胞系、ATCC, Gaithersburg, MD）、及びＸＰ
患者から確立したＳＶ４０形質転換細胞系（ＸＰ１２ＲＯＳＶ；Dr. Tanaka, Ja
panの好意による贈呈品）を研究に用いた。細胞は、ダルベッコ改良イーグル培 地（ＤＭＥＭ；Gibco BRL, Gaithersburg, MD）を１％グルタミン及び１０％ウ シ胎児血清で強化した培地（ＤＩＶ培地）中で増殖させた。細胞は、湿潤化ＣＯ ₂ のインキュベーター内で、３７℃で増殖させた。Ｅ５ヘルパー細胞は、ＩＥ３ 遺伝子を発現し、ＩＥ３欠失ヘルパーウイルスの複製を許すミドリザルの腎細胞
である（P. Johnson, San Diegoの好意により贈呈さる）。

【００５７】 トランスフェクション：ＦｕＧＥＮＥ６という試薬（Boehringer Manheim、ドイ
ツ国）を用い、製造業者の指示のとおりにして、多少の変更を加えて、トランス
フェクションを実施した。細胞（１．５〜２ｘ１０⁵以下）を、６０mm組織培養 プレートに播種し、１６〜２０時間付着させた。ＦｕＧＥＮＥ６の試薬（１２μ
l）は、Opti-MEM培地（Gibco BRL）８８μl中に室温（ＲＴ）で５分間温置し、 次いで、プラスミドＤＮＡ（４μg）に加え、ＲＴで５分間更に温置した。この トランスフェクション混合物を、完全ＤＭＥＭ培地（２ml）中で増殖させた細胞
に加えた。３７℃で１４〜１６時間後、細胞を、ハンク均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ
）で１回洗浄し、次いで、完全培地を与え、トランスフェクション後に３７℃で
合計７２時間更に温置した。トランスフェクションした細胞は、ヒグロマイシン
（１００〜１５０μg／ml）の存在下で選別した。

【００５８】 ヒトアルギニンオパールサプレッサーｔＲＮＡ（hargsup tRNA^Opal）の構築、及
びヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）アンプリコンベクターへのサブク
ローニング：ヒトアルギニンｔＲＮＡ遺伝子の報告されたヌクレオチド配列［Bu
ckland, R.A. et al., "A cluster of tRNA genes into [DRNI, TRR3, DDRAN］o
n the short arm of human chromosome 6", Genomics, 35, 164-171 (1996)］に
基づき、このｔＲＮＡ分子をコードする構造配列と、３’フランキング領域から
の１５塩基とを含む、アルギニンオパールサプレッサーｔＲＮＡを構築した。３
’フランキング領域は、転写を終結するためのシグナルとして働く非コーディン
グ鎖のＴ残基のクラスターを含む。ヒトアルギニンｔＲＮＡの配列（非コーディ
ング鎖）、及びクローバー葉構造は、図２Ａに示したとおりである。アンチコド
ン中の単一塩基変化（図２Ａに*で示す）を導入して、ヒトアルギニンｔＲＮＡ をオパールサプレッサーｔＲＮＡへと転換した。１対の重複オリゴヌクレオチド
：5'-GCGCTCGAGAAAACGAAC CCCACTTAACCACGAAGGGATTCGAACCCTCAATCTTCTGATC-3'、及び5'-GCGGGT ACCGACCACGTGGCCTAATGGATAAGGCGTCTGACTTCAGATCAGAAGATTGAGGG-3'（Integrated
DNA Technologies, Inc., Coralville, IAにより合成）をアニーリングし、Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase Version 2, United States Biologicals）とい
う酵素と、４種類のデオキシヌクレオチドをすべて含む反応混合物とを用いて充
填した。この二本鎖オリゴヌクレオチドを、Kpn I／Xho Iで消化し、同じ制限部
位で、ＣＭＶプロモーター及びポリＡ配列を除去するよう変更したＨＳＶアンプ
リコン［Wang, S., Young, W.-B., Jacobson, C. & Link, C.J., "A novel Herp
esvirus amplicon system for in vivo gene therapy", Gene Ther., 4, 1132-1
141 (1997)］ベクターに結合した。得られた発現ベクターpHE hargsup tRNA^Opal は、図２Ｂに示したとおりである。この発現ベクターは、プラスミドをエピソー
ム的に維持するためのＥＢＶのori P及びＥＢＮＡ配列と、トランスフェクショ ンされた哺乳動物細胞の選別を許すためのヒグロマイシン耐性遺伝子とを含む。
このプラスミドは、トランス作用性ヘルパーウイルスの存在下で、複製し、ＨＳ
ＶビリオンにパッケージングするためのＨＳＶ−１の溶菌性複製起点（ori S） 、及びＨＳＶ−１の末端パッケージングシグナル「Ａ」配列も含む［Wang, S.,
Young, W.-B., Jacobson, C. & Link, C.J., "A novel Herpesvirus amplicon s
ystem for in vivo gene therapy", Gene Ther., 4, 1132-1141 (1997)；Spaete
, R.R. & Frenkel, H., "The herpes simplex virus amplicon: A new eucaryot
ic defective-virus cloning-amplifying vector", Cell, 30, 295-304 (1982) ；Wang, S. & Vos, J., "A hybrid infectious vector based on Epstein-Barr
virus and Herpes simplex virus type I for gene transfer into Human Gene"
, J. Virol., 70, 8422-8430 (1996)］。

【００５９】 ヒト化赤色移動緑色蛍光性タンパク質（ｈＲＧＦＰ）遺伝子内の規定された位置
でのオパール（ＴＧＡ）変異の導入：オパール変異を、ｈＲＧＦＰ遺伝子内の位
置Arg(CGC)73Opal(TGA)に導入した［Levy, J.P., Muldoon, R.R., Zolotukin, S
. & Link, C.J., "Retroviral transfer and expression of humanized, red sh
ifted green fluorescent protein into human tumor cells", Nature Biotechn
ol., 14, 610-614 (1996)］。突然変異は、ＰＣＲによって導入し、配列決定し て、突然変異を確認した。オパール変異させたｈＲＧＦＰを、ＣＭＶプロモータ
ーの制御下で、pHE700というＨＳＶアンプリコンベクター［Wang, S., Young, W
.-B., Jacobson, C. & Link, C.J., "A novel Herpesvirus amplicon system fo
r in vivo gene therapy", Gene Ther., 4, 1132-1141 (1997)］にサブクローニ
ングした（ｍｎＲＧＦＰ）。

【００６０】 ノーザン分析：RNeasy Total RNAキット（Qiagen, Santa Clarita, CA）を用い て、培養細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプル（１０ｇ）を、１％ホル
ムアルデヒドアガロースゲルによる電気泳動によって分離し、nytran膜フィルタ
ー（Schleicher & Schuell, Keene, NH）に移転した。フィルターを、hybrisol
I溶液（Oncor, Gaithersburg, MD）中で４２℃で２時間予備ハイブリダイズさせ
、次いで、ランダム開始ＤＮＡ標識化キット（Boehringer Mannheim）を用いて 、α［Atkinson, J. & Martin, R., "Mutations to nonsense codons in human
genetic disease: implications for gene therapy by nonsense suppressor tR
NAs", Nucleic Acids Res., 22, 1327-1334 (1994)］ＰｄＣＴＰで標識化したプ
ローブと４２℃で終夜ハイブリダイズさせた。フィルターを、室温で、２ｘＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで２回、次いで５５℃で３０分間、０．１ｘＳＳＣ及び０．
１％ＳＤＳで洗浄し、オートラジオグラフに付した。

【００６１】 ウエスタン分析：培養した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄
し、次いで、５０mMトリスＨＣｌ［pH７．５、０．１５モルＮａＣｌ、１％Noni
det P-40、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤のフェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（１００μg／ml）、アプロチニン（１μg／ml）及びロイペプチン（１
μg／ml）を含有］中で溶菌した。細胞溶菌液を、氷上で２０分間温置し、10,00
0ｘｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清を捕集した。サンプル（３０μg）を５
ｘサンプル緩衝液（Laemmli, 1970）６μlと混合し、３分間沸騰させ、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質サンプルを、ニトロセルロース膜にエレ
クトロブロッティングし、特異抗体で検査した。ＧＦＰ及びＸＰＡＣタンパク質
は、それぞれ、抗ＧＦＰ（Clontech, Palo Alto, CA）及び抗ＸＰＡＣ（Santa C
ruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）ポリクローナル抗体、及びセイヨ ウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ免疫グロブリンを第二抗体と
して用いて、増強化学発光（Amersham, England）によって検出した。

【００６２】 クローニングアッセー：ＵＶ生存実験については、３種類の細胞系−ＶＡ１３、
ＸＰ１２ＲＯＳＶ、及びhargsup tRNA^Opalを発現するＸＰＲＯＳＶを、６０mmプ
レートに、細胞系、及び用いるＵＶＣ線量に応じて６０mmプレート中２．５ｘ１
０²〜１ｘ１０⁶の範囲の、異なる細胞密度で３重に平板接種した。翌日、細胞を
ＰＢＳで洗い、０〜６Ｊ／ｍ²の範囲のＵＶＣ線量（２５４nm、Spectroline、モ
デルＸＸ−１５Ｇ、Spectronics Corp., NY）に被曝させた。ＰＢＳ緩衝液を除 去し、ビタミン類及び非必須アミノ酸を含有する完全ＤＭＥＭ培地に置き換えた
。照射の約１０〜１２日後に、コロニーを、ホルムアルデヒドで固定し、クリス
タルバイオレット（水中０．０５％）で染色した。照射プレートのコロニー計数
を非照射プレートのそれと比較することによって、コロニー形成能力の百分率を
決定した。別個の実験を、独立に、２〜３回反復した。

【００６３】 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のリポーター遺伝
子を有するプラスミドを用いた再活性化アッセー：ＳＶプロモーターの制御下で
ＣＡＴ遺伝子を発現するプラスミドpSVCAT（対照ベクター；Promega, Madison,
WI）を用いて、プラスミド再活性化を調べた。ＣＡＴアッセーは、製造業者のプ
ロトコルを用い、僅かな変更を加えて実施した。水中のプラスミドＤＮＡ（２０
μg／ml）を、０〜６００J／m²の範囲の線量の２５４nmＵＶＣ放射線で処理し、
エタノール沈澱させ、トランスフェクションに適した量に再懸濁させた。ＸＰ１
２ＲＯＳＶ細胞（２ｘ１０⁵）を６０mmプレートに播種し、翌日、pHE hargsup t
RNA^Opalと、ＵＶＣ照射pSVCATプラスミドＤＮＡとで１０：１の比率で（全ＤＮ Ａ４μg）同時トランスフェクションした。ＣＡＴプラスミド再活性化に対する 対照としては、６０mmプレートに播種した、ＤＮＡ修復に優れたＶＡ１３細胞（
正の対照）、及びＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞（負の対照）を、改質pHEベクターと、 ＵＶＣ照射pSVCATプラスミドとで１０：１の比率で同時トランスフェクションし
た。７２時間後、細胞を回収し、３回の凍結−解凍周期によって溶菌した。溶菌
物を、液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）法を用いて分析した。略述すると、
タンパク質溶菌物、［１５Ｃ］クロラムフェニコール（Du Pont New England Nu
clea, Wilmington, DE；ＮＥＣ ４０８Ａ、０．１５μCi）、及び基質としての
ｎ−ブチリルＣｏＡ（２５μg）を含有する反応混合物（１２５μlの最終反応体
積）を、３７℃で３時間温置した。反応生成物を混合キシレン３００μlで抽出 した。上部キシレン相を捕集し、０．２５モルのトリスＨＣｌ（pH８．０）１０
０μlを加えることによって、更に２回抽出した。ブチリル化されたクロラムフ ェニコール生成物を表す上部キシレン相の一定量を、シンチレーション液（５ml
；OptiScint "HiSafe"1 LKB、英国）に加え、液体シンチレーション分光測定に よって計数した。個々のトランスフェクションは、二重に実施し、別個の実験を
、独立に、２〜３回反復した。ＵＶＣ照射プラスミドを再活性化できる能力は、
ＵＶ照射プラスミドでトランスフェクションされた細胞からの抽出物中のＣＡＴ
活性の、非照射pSVCATプラスミドでトランスフェクションされた細胞のそれに対
する比率として定義した。

【００６４】 pHEhargsup tRNA^Opalアンプリコンベクターのパッケージング：Ｅ５細胞（２ｘ １０⁶細胞／１０cm皿）を、pHEhargsup tRNA^Opalベクターでトランスフェクショ
ンした。トランスフェクションの２日後、細胞をヒグロマイシンＢ（１５０μg ／mlによる選別に付した。ヒグロマイシン耐性Ｅ５細胞を、Opti-MEM培地１ml中
の１ＭＯＩのＣｇａｌΔ３ヘルパーベクター（P. Johnson, San Diegoの好意に より提供）に重感染させた。ウイルスを細胞に、湿潤化した５％ＣＯ₂のインキ ュベーター内で、３７℃で２時間吸着させ、次いで、１０％ＦＢＳ強化ＤＥＭ９
mlを加え、細胞を５０〜６０時間皿に温置した。細胞砕片を含有するウイルス上
清を捕集した。細胞を、凍結−解凍法（３回反復）によって溶菌し、次いで2,40
0ｘｇで遠心分離して、細胞砕片をペレット化した。ＣｇａｌΔ３ヘルパーウイ ルスの力価は、以前に記載されたとおり［Wang, S., Young, W.-B., Jacobson,
C. & Link, C.J., "A novel Herpesvirus amplicon system for in vivo gene t
herapy", Gene Ther., 4, 1132-1141 (1997)］、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−カラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）染色によって決定した。pH
Ehargsup tRNA^Opalのin vitro移転を決定するために、ｍｈＲＧＦＰ遺伝子を発 現するＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞を、Opti-MEM中で希釈した異なる量のウイルス上清
で形質導入し、湿潤化した５％ＣＯ₂のインキュベーター内で３７℃で温置した 。２４時間後、細胞をＧＦＰ蛍光の回復について可視化した。

【００６５】 結果 サプレッサーｔＲＮＡによるＧＦＰ蛍光の回復：hargsup tRNA^Opalの機能的活性
を試験するために、ｍｈＲＧＦＰをリポーター遺伝子として用いた。ｈＲＧＦＰ
遺伝子内の位置Arg73Opalに導入したオパール変異は、検出できるＧＦＰ蛍光を 完全に妨げる。しかし、hargsup tRNA^Opalを含むプラスミドと、ｍｈＲＧＦＰを
含むプラスミドとのＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞内での同時トランスフェクションは、
ｍｈＲＧＦＰ内でのオパール変異を抑制し、ＧＦＰ蛍光を回復することができた
（図３Ａ及び３Ｂ）。ｍｈＲＧＦＰプラスミド単独での対照トランスフェクショ
ンは、いかなるＧＦＰ蛍光も示さなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）。

【００６６】 ＧＦＰ転写物及びタンパク質の発現：トランスフェクションされたＸＰ１２ＲＯ
ＳＶ細胞中のｈＲＧＦＰ及びｍｈＲＧＦＰ転写物の発現を決定するために、ｈＲ
ＧＦＰｃＤＮＡでノーザンブロットを調べた。類似の大きさの転写物が、トラン
スフェクションされた両細胞系で観察された（図４Ａ、上のこま）。ＧＡＰＤＨ
ハウスキーピング遺伝子で正規化した後（図４Ａ、下のこま）、ｍｈＲＧＦＰ転
写物は、ｈＲＧＦＰ転写物に比して、存在量が約３分の１少なかった。抗ＧＦＰ
抗体を用いたウエスタン分析は、ｍｈＲＧＦＰ及びhargsup tRNA^Opalで同時トラ
ンスフェクションしたＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞が、ｈＲＧＦＰタンパク質と類似の
大きさの完全長ＧＦＰタンパク質を発現したことを示した（図４Ｂ）。したがっ
て、hargsup tRNA^OpalがｍｈＲＧＦＰ遺伝子におけるナンセンス変異を抑制し、
完全長の機能的タンパク質を生産することができる直接的な証拠を与えている。
等量のタンパク質を加えたが（データは示さず）、ｍｈＲＧＦＰとhargsup tRNA ^Opal との双方でトランスフェクションされた細胞では、ｈＲＧＦＰのみに比して
、シグナル強度の約１０倍の低下が観察された。二つの所見は、ｍｈＲＧＦＰと
hargsup tRNA^Opalとの双方で同時トランスフェクションされた細胞で見出された
、はるかに少ない検出されたｈＲＧＦＰタンパク質を説明している。サプレッサ
ーｔＲＮＡに対するｍｈＲＧＦＰ転写物の標的のレベルは、ハウスキーピング遺
伝子の発現に対して、存在量が約３分の１少なかった（図４Ｂ）。しかし、タン
パク質レベルの低下は、ＲＮＡ転写物の減少より有意に大きく、比較的低い抑制
効率からの追加的効果を示している。ｍｈＲＧＦＰ遺伝子のみでトランスフェク
ションしたＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞は、断端された（〜８kDa）ＧＦＰタンパク質 を生産しているはずであるが、これは、用いたゲル系のために検出されなかった
。

【００６７】 ＵＶ照射後の細胞生存率によって測定された限りでの、ナンセンスサプレッサー
ｔＲＮＡによるＸＰ細胞系におけるＸＰＡＮＥＲ不全の表現型の補正：サプレッ
サーｔＲＮＡがナンセンス変異によって生じる遺伝的欠陥を修復できることをin
vitroで立証するため、ＤＮＡ修復不全のＸＰ繊維芽細胞系であるＸＰ１２ＲＯ
ＳＶを選んだ。ＸＰＡＣ遺伝子の第５エキソンのヌクレオチド６１９番でのＣ−
Ｔトランジションは、Arg-207コドン（ＣＧＡ）をナンセンスコドン（ＴＧＡ） に変えた。その結果、断端ＸＰＡＣタンパク質、及びＸＰＡＣ遺伝子の機能的活
性の破壊が生じた［Satokata, I., et al., "Three nonsense mutations respon
sible for group A xeroderma pigmentosum", Mutation Res., 273, 193-202 (1
992)］。この細胞系は、ＵＶ照射後に、低いコロニー形成能を有する。これらの
細胞を、pHEhargsup tRNA^Opalプラスミドでトランスフェクションし、ヒグロマ イシンで選別した。選別した細胞を、０〜６Ｊ／ｍ²の範囲の線量のＵＶＣ（２ ５４nm）で照射した。クローン形成アッセーを実施し、より高いＵＶ線量では、
コロニー形成能の４〜３５倍の上昇が、hargsup tRNA^Opalを発現するＸＰ１２Ｒ
ＯＳＶ細胞で観察された（図５）。結果は、サプレッサーｔＲＮＡの導入による
ＤＮＡ修復不全表現型における部分的補正に起因する、ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞の
ＵＶ生存率の向上を立証した。

【００６８】 ＵＶ照射ＣＡＴプラスミドの再活性化の研究：サプレッサーｔＲＮＡが、ＸＰ１
２ＲＯＳＶ細胞でのＸＰＡＣ遺伝子のナンセンス変異を抑制し、ＤＮＡ修復活性
を回復することができるか否かを決定するための、代替的in vitro試験は、発現
ベクターの利用である。細菌ＣＡＴ遺伝子を発現するプラスミドベクターは、ヒ
トの細胞でのＤＮＡ修復及び突然変異を測定するのに広く用いられている［Krae
mer, K.H., Protic-Sabljic, M., Bredberg, A. & Seidman, M.M., "Plasmid ve
ctors for study of DNA repair and mutagenesis", Curr. Probl. Derm., 17,
166-181 (1987)］。ＵＶ照射pSVCATプラスミドで一過的にトランスフェクション
したＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞は、正常なＶＡ１３細胞に比して、ＣＡＴ発現の阻害
に対してはるかに敏感であった（図６）。しかし、ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞でのサ
プレッサーｔＲＮＡの一過性発現は、ＸＰＡＣ遺伝子でのナンセンス変異を効果
的に抑制し、ＤＮＡ修復活性を回復することによって、ＵＶ照射pSVCATプラスミ
ドを再活性化できる能力の上昇を招く。より高いＵＶ線量でのＣＡＴ活性の３〜
１７倍の上昇が、pHEhargsup tRNA^OpalプラスミドとＵＶ損傷pCATプラスミドと の双方で一過的にトランスフェクションしたＸＰ細胞で観察された（図６）。

【００６９】 ＸＰ細胞におけるＸＰＡＣ転写物及びＸＰＡＣタンパク質のレベル：ＸＰ１２Ｒ
ＯＳＶ細胞のノーザン分析は、ＤＮＡ修復に優れた正常ＶＡ１３細胞に比して、
非常に低いＸＰＡＣ転写物の存在量を示した（図７Ａ、上のこま）。得られた結
果は、以前に報告されたのと類似していた［Satokata, I., et al., "Three non
sense mutations responsible for group A xeroderma pigmentosum", Mutation
Res., 273, 193-202 (1992)］。ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞でのサプレッサーｔＲＮ
Ａによる部分的な表現型補正を完全長タンパク質の存在と関係付けるために、ウ
エスタン分析を実施した。図７Ｂは、ＸＰＡＣタンパク質は、正常なＶＡ１３細
胞では検出可能であるが、hargsup tRNA^OpalでトランスフェクションしたＸＰ１
２ＲＯＳＶ細胞では検出不能であった。更に、ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞では、断端
ＸＰＡＣポリペプチドが全く観察されなかった。 ＨＳＶ−１ビリオンにパッケージされたpHEhargsup tRNA^Opalアンプリコンベク ターによる、ｍｈＲＧＦＰを発現するＸＰ１２ＲＯＳＶの形質導入：ＨＳＶ−１
ビリオンにパッケージされたpHEhargsup tRNA^Opalアンプリコンベクターは、Ｇ ＦＰ蛍光の回復が可視化したとおり、ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞で発現されたｍｈＲ
ＧＦＰにおけるナンセンス変異を、好成績で形質導入かつ抑制することができた
（図８Ａ及び８Ｂ）。４０ＭＯＩのヘルパーウイルスでは、ＧＦＰ蛍光の回復は
、約５％の細胞で観察された。しかし、実質的な細胞毒性は、感染後２４〜４８
時間までに明白になった。より低いＭＯＩの感染では、ＧＦＰ陽性細胞は全く観
察されなかった。負の対照として用いられた、ＨＳＶ−１ビリオンにパッケージ
されたpHE700TKベクターを形質導入した上記の細胞系でか、又はpHEhargsup tRN
A^OpalアンプリコンベクターをＸＰ１２ＲＯＳＶに形質導入したときは、ＧＦＰ 蛍光が検出されなかった（データは示さず）。

【００７０】 考察 色素性乾皮症群Ａの細胞を疾病モデルとして用いて、本発明者らは、ナンセン
ス変異したＸＰＡＣ遺伝子のＤＮＡ修復活性の、in vitroでの部分的回復を立証
することができた。研究に用いたＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞系は、同型接合性ナンセ
ンス変異をＸＰＡＣ遺伝子に含む［Satokata, I., et al., "Three nonsense mu
tations responsible for group A xeroderma pigmentosum", Mutation Res., 2
73, 193-202 (1992)］。ＸＰＡＣ遺伝子では、アルギニン（ＣＧＡ）コドンがオ
パール（ＴＧＡ）コドンに突然変異していたため、本発明者らの研究には、ヒト
アルギニンオパールサプレッサーｔＲＮＡを構成することを選んだ。現在まで、
ヒトアルギニンｔＲＮＡからｔＲＮＡサプレッサーが誘導されたことはなかった
。設計されたサプレッサーｔＲＮＡは、５’フランキング配列が欠失し、一方、
３’フランキング配列からの１５塩基は、転写終結を発信するために保持されて
いるため、大きさが小さい。１対のオリゴヌクレオチドを用いることによる小型
のｔＲＮＡの構築は、ｔＲＮＡをサプレッサーｔＲＮＡに転換するための、より
退屈で時間を消費する部位指向性突然変異誘発の方法に勝る利点を有する。本発
明者らの方法を用いて、ヒトのセリンアンバーサプレッサー及びチロシンオーカ
ーサプレッサーｔＲＮＡのような、異なるいくつかの機能的サプレッサーｔＲＮ
Ａを本発明者らは構築している。アンバー又はオーカー変異ｈＲＧＦＰをリポー
ター遺伝子として用いた、高い読み過ごし効率は、ＧＦＰ蛍光のＦＡＣＳ分析に
よっても観察された（データは示さず）。

【００７１】 突然変異させたヒト化赤色移動緑色蛍光性タンパク質をリポーター遺伝子とし
て用いて、hargsup tRNA^Opalの機能的活性を最初に確立した。高い効率のナンセ
ンス抑制（＞８０％）が、ｈＲＧＦＰ蛍光の回復、及びＧＦＰ陽性細胞について
のＦＡＣＳ分析によって立証された（データは示さず）。ＸＰ細胞系でのhargsu
p tRNA^Opalの発現は、ＵＶ照射後の細胞生存率の４〜３５倍の上昇、及びＸＰ細
胞がＵＶ照射pSVCATプラスミドを再活性化できる能力の増大を生じた。

【００７２】 サプレッサーｔＲＮＡは、天然の終止コドンの読み過ごしを生じることがある
。Ｃ末端外延タンパク質は、相互優性の否定的特性を有するか、或いは非常に限
定された活性を有するか、又は成熟前の分解に付されることがあり、これらのす
べてが、細胞にとって有害であり得る。しかし、細胞は、遺伝子の末端の多数の
翻訳停止コドンのため、また異なるサプレッサーｔＲＮＡによる非効率的なサプ
レッサーのため、そのような有害な効果から自身を保護することができ得る。本
発明者らの毒性アッセーからの予備的研究は、ＸＰ細胞でのサプレッサーｔＲＮ
Ａの安定的な発現は、ＦＡＣＳ分析によって決定される限りで、周期を変えず（
データは示さず）、クローン形成アッセーで検出できると思われる、直接的な細
胞毒性効果も生じないことを明らかにした。

【００７３】 サプレッサーｔＲＮＡの、遺伝子療法の治療剤としての実際的な適用は、適切
な標的組織又は細胞での長期的な遺伝子発現を維持できる、効果的なベクターの
開発に大きく依存することになる。いくつかの種類のベクターが、この目的で開
発中である。組換えレトロウイルスを用いて、ＸＰＤ［Carreau, M., et al., "
Functional retroviral vector for gene therapy of xeroderma pigmentosum g
roup D patients", Hum. Gene Ther., 6, 1307-1315 (1995)；Quilliet, X., et
al., "Long-term complementation of DNA repair defiecient human primary
fibroblasts by retroviral transduction of the XPD gene", Mutation Res.,
364, 161-169 (1996)］、ＸＰＡ、ＸＰＢ及びＸＰＣ遺伝子［Zeng, et al., "Re
trovirus-mediated gene transfer corrects DNA repair defect of xeroderma
pigmentosum cells of complementation groups A, B and C", Gene Ther., 4,
1077-1084 (1997)］のようなＤＮＡ修復遺伝子を、対応する欠陥ＤＮＡ修復遺伝
子を有するＸＰ細胞に送達することが報告されている。トランス遺伝子の機能的
発現、及びＤＮＡ修復活性の補正が、形質導入された細胞で観察された。サプレ
ッサーｔＲＮＡの効率的な送達を達成するために、本発明者らは、新規なＨＳＶ
アンプリコンベクター、すなわちpHE［Wang, S., Young, W.B., Jacobson, C. &
Link, C.J., "A novel Herpesvirus amplicon system for in vivo gene thera
py", Gene Ther., 4, 1132-1141 (1997)］を用いることを選んだため、サプレッ
サーｔRNAを有するプラスミドを増幅し、ヘルパーウイルスの存在下で、感染性 ＨＳＶ−１のビリオンにパッケージすることができた。感染性pHEベクターは、 ヒトの様々な細胞系での効率的なトランス遺伝子発現を有する。設計されたサプ
レッサーｔＲＮＡは、大きさが約０．１kbであるにすぎない。したがって、約１
５コピーのｔＲＮＡが、単一の１５２kbウイルスゲノムにパッケージされ得ると
思われる。本発明者らは、このサプレッサーｔＲＮＡをヘルペスゲノムにパッケ
ージすることができたが、ｍｈＲＧＦＰを発現する形質導入されたＸＰ１２ＲＯ
ＳＶ細胞の５％未満が、緑色の蛍光を示した（図７）。細胞毒性、及び低い抑制
効率は、宿主のタンパク質合成を遮断するヘルパーウイルスタンパク質に対して
は、二次的であるものと思われる。従来の研究は、vhs（ＵＬ４１）及びICP47（
ＵＬ５４）のようなＨＳＶ宿主遮断遺伝子が、宿主細胞のタンパク質合成を阻害
できることを立証した［Kwon, A.D., Kruper, J.A. & Frenkel, N., "Herpes si
mplex virus host shutoff function", J. Virol., 62, 912-921 (1988)；Hardw
icke, M.A. & Sandri-Goldin, R.M., "The Herpes simplex virus regulatory p
rotein ICP27 contributes to the decrease in cellular mRNA levels during
infection", J. Virol., 68, 4797-4810 (1994)］。例えば、vhs遺伝子の発現は
、宿主ｍＲＮＡの分解を促進する［Kwon, A.D., Kruper, J.A. & Frenkel, N.,
"Herpes simplex virus host shutoff function", J. Virol., 62, 912-921 (19
88)］。これら又は他のヘルパーウイルスタンパク質は、ｍＲＮＡの安定性、又 はｍｈＲＧＦＰ遺伝子の発現を低下させ、その結果、より少ないサプレッサーｔ
ＲＮＡへの標的を生じた可能性がある。最近開発された無ヘルパーパッケージン
グ系を用いて、ウイルスの宿主遮断遺伝子の存在を排除し、ウイルスの細胞毒性
を削減又は除去するための研究が進行中である［Fraefel, C. et al., "Helper
virus-free transfer of herpes simplex virus type 1 plasmid vectors into
neural cells", J. Virol., 70, 7190-7 (1996)］。 本発明によれば、いくつかのその他のヒトサプレッサーセリンｔＲＮＡが合成
され、本明細書の教示によれば機能的であることが示された。これらは、図８〜
１３に開示されている。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、本発明の基本的な概念を描写する図である。図１
Ａにおいて、チロシン・コドンを有する正常ｍＲＮＡは、正常タンパク質へ翻訳
される。図１Ｂにおいて、オーカー・ナンセンス変異を有する突然変異ｍＲＮＡ
は、短縮型タンパク質を与えるよう翻訳される。図１Ｃにおいては、突然変異ｍ
ＲＮＡからの正常タンパク質の翻訳、又はオーカー変異の「リーディングスルー
」を可能にするナンセンス（オーカー）サプレッサーｔＲＮＡが、提供されてい
る。

【図２】 図２Ａ及び２Ｂは、サプレッサーｔＲＮＡ及び発現ベクター構築物を描写する
図である。図１（Ａ）ヒトアルギニンｔＲＮＡ：ヒト・アルギニンｔＲＮＡの配
列（非コーディング鎖）及びクローバー葉構造が示されている。アンチコドン内
の単一塩基の変化（＊で示されている）は、ヒト・アルギニンｔＲＮＡをオパー
ル・サプレッサーｔＲＮＡに変換するために必要とされる。図１（Ｂ）ＨＳＶア
ンプリコン・ベクター：Ａｍｐｒ、アンピシリン耐性；「ａ」、ＨＳＶパッケー
ジング・シグナル；ＨＳＶ−ｔｋプロモーター、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ・
プロモーター；ＥＢＮＡ−１修飾ＥＢＶ核抗原遺伝子；ｏｒｉＰ、ＥＢＶ特有潜
在的複製起点；ｏｒｉＳ、ＨＳＶ−１複製起点。

【図３】 図２Ａ〜２Ｄは、ｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌを用いたＧＦＰ蛍光の回 復を描写する図である。（Ａ）ｍｈＲＧＦＰ発現構築物及びｐＨＥｈａｒｇｓｕ
ｐ ｔＲＮＡＯｐａｌプラスミドで共トランスフェクトされたＸＰ１２ＲＯＳＶ 細胞において検出されたＧＦＰ蛍光。ＦＩＴＣフィルターを用いた蛍光顕微鏡に
より観察された複数の細胞における明るい緑色蛍光に注目されたい。（Ｂ）トラ
ンスフェクトされたＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞のＡと同一視野の位相差顕微鏡による
観察。（Ｃ）ｍｈＲＧＦＰベクター単独でトランスフェクトされたＸＰ１２ＲＯ
ＳＶ細胞。ナンセンス・コドンが抑圧されない場合には、有意な蛍光は観察され
なかった。（Ｄ）（Ｃ）と同一視野の位相差顕微鏡による観察。

【図４】 図４Ａ及び４Ｂは、ｈＲＧＦＰ発現のノーザン解析及びウェスタン解析を描写
する図である。（Ａ）ノーザン解析。ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞（レーン１）、又は
ｈＲＧＦＰ遺伝子（レーン２）もしくはアミノ酸７３にオパール・ナンセンス変
異（ＣＧＣからＴＧＡ）を含むｍｈＲＧＦＰ遺伝子（レーン３）でトランスフェ
クトされたＸＰ細胞由来の全ＲＮＡ（１０μｇ／レーン）、及びｈＲＧＦＰ ｃ ＤＮＡについて探索された全ＲＮＡ（上のパネル）。サイズが類似したＧＦＰ転
写物が得られた。１８Ｓ ｒＲＮＡの位置が示されている。その後、同一のブロ ットを、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ハウスキー
ピング遺伝子を用いて再探索した（下のパネル）。ＧＡＰＤＨ遺伝子による異な
るＲＮＡ試料の正規化の後、ｈＲＧＦＰ転写物と比較して３分の１少ないｍｈＲ
ＧＦＰ転写物の存在量が観察された。（Ｂ）ウェスタン解析によるＧＦＰタンパ
ク質の検出。細胞溶解物を１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル上で電気泳動
し、抗ＧＦＰ抗体で探索した。ｈＲＧＦＰ遺伝子単独を発現するＸＰ１２ＲＯＳ
Ｖ細胞（レーン２）又はｍｈＲＧＦＰとｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌとを 共発現するＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞（レーン４）は、２７ｋＤａの全長ＧＦＰタン
パク質を示した。ｍｈＲＧＦＰプラスミド及びｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮＡＯｐａ ｌプラスミドでトランスフェクトされた細胞には、全長ＧＦＰタンパク質のレベ
ルの減少が観察された。サプレッサーｔＲＮＡの非存在下でｍｈＲＧＦＰ遺伝子
を発現する細胞においては、全長ＧＦＰタンパク質が検出されなかった（レーン
３）。トランスフェクトされていないＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞は、非特異的な染色
を示さなかった（レーン１）。

【図５】 図５は、サプレッサーｔＲＮＡによるＤＮＡ修復欠損表現型の部分的な修正を
描写するグラフである。ＶＡ１３細胞、ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞、及びｈａｒｇｓ
ｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌを発現するＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞を、細胞株及び用いら れたＵＶＣ照射線量に応じて２．５×１０２から１×１０６までの様々な細胞濃
度で播いた。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、０から６Ｊ／ｍ２のＵＶＣ（２５４
ｎｍ）光を照射した。照射からおよそ１０日から１２日後、細胞を固定し、クリ
スタル・バイオレットで染色した。照射されたプレートのコロニー数を、照射さ
れていないプレートのコロニー数と比較することにより、コロニー形成能のパー
センテージを決定し、用いられたＵＶＣ線量に対してプロットした。より高いＵ
Ｖ線量において、ｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌを発現するＸＰ１２ＲＯＳ Ｖ細胞に、コロニー形成能の４倍から３５倍の増加が観察された。

【図６】 図６は、ｐＳＶＣＡＴプラスミドの欠陥修復の修正を描写するグラフである。
ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞を、ＵＶＣを照射されたｐＳＶＣＡＴプラスミド及びｐＨ
Ｅｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌプラスミドで一過性共トランスフェクトし た。対照として、ＶＡ１３細胞（陽性対照）及びＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞（陰性対
照）を、ＵＶＣを照射されたｐＳＶＣＡＴプラスミド及びｐＨＥベクター単独で
共トランスフェクトした。７２時間後、細胞溶解物を得て、液体シンチレーショ
ン計数（ＬＳＣ）法を用いて、ＣＡＴ活性について分析した。細胞抽出物中のＣ
ＡＴ活性を、照射されていないｐＳＶＣＡＴでトランスフェクトされた細胞にお
ける活性のパーセンテージとして表し、ｐＳＶＣＡＴプラスミドを不活化するた
めに用いられたＵＶＣ照射線量に対してプロットした。ｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮ ＡＯｐａｌを発現しているＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞は、照射されたｐＳＶＣＡＴプ
ラスミド単独でトランスフェクトされたＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞と比較して、３倍
から１７倍増加した、ＵＶ照射ｐＳＶＣＡＴプラスミドを不活化する能力を示し
た。

【図７】 図７Ａ及び７Ｂは、ＸＰＡＣ遺伝子発現のノーザン解析及びウェスタン解析で
ある。（Ａ）ＸＰＡＣ転写物の発現。短縮型ＸＰＡＣ ｃＤＮＡで探索された正 常対照ＶＡ１３細胞（レーン１）及びＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞（レーン２）由来の
全ＲＮＡ（１０μｇ／レーン）のノーザン解析が、オートラジオグラムに示され
ている（上のパネル）。ＶＡ１３細胞（正常対照）における２つのバンドは、オ
ルタナティブ・ポリアデニル化（Tanaka,K.et al.,「グループＡ色素性乾皮症に
関与し、ジンクフィンガー・ドメインを含むヒトＤＮＡ切断修復遺伝子の解析（
Analysis of a human DNA excision repair gene involved in group A xeroder
ma pigmentosum and containing a zinc-finger domain）」,Nature 348 73-78 （1990））によるものである。ＸＰＡＣ転写物レベルは、ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞
においてかなり減少した。同一ブロットを、異なるＲＮＡ試料の相対的正規化を
許容するため、ＧＡＰＤＨ遺伝子について再検索し、下のパネルに示した。（Ｂ
）ＸＰＡＣタンパク質を検出するためのウェスタン解析。抗ＸＰＡＣ抗体でプロ
ーブされた、ＤＮＡ修復能を有するＶＡ１３細胞（レーン１）、ＸＰ１２ＲＯＳ
Ｖ細胞（レーン２）、及びサプレッサーｔＲＮＡを発現しているＸＰ１２ＲＯＳ
Ｖ細胞（レーン３）のウェスタン解析。ＸＰＡＣタンパク質は、ＶＡ１３細胞に
おいては容易に観察されるが、ＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞単独においてもｈａｒｇｓ
ｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌでトランスフェクトされたＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞におい ても検出されない。

【図８】 図８Ａ及び８Ｂは、ＨＳＶ−１ビリオンへパッケージされたｐＨＥｈａｒｇｓ
ｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌアンプリコン・ベクターによるＸＰ１２ＲＯＳＶ細胞の 形質導入を描写する。（Ａ）ｍｈＲＧＦＰ遺伝子を発現するＸＰ１２ＲＯＳＶ細
胞をｐＨＥｈａｒｇｓｕｐ ｔＲＮＡＯｐａｌアンプリコン・ベクターで形質導 入したとき、ＧＦＰ蛍光細胞が観察され、このことは、ヘルペスウイルス・アン
プリコン系によるサプレッサーｔＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ輸送の成功、及びｍ ｈＲＧＦＰ遺伝子内のナンセンス変異の抑圧を示している。（Ｂ）（Ａ）と同一
視野の位相差顕微鏡による観察。

【図９】 図９は、本発明に従い設計された、ヒト・オパール、アンバー、及びオーカー
・サプレッサー・セリンｔＲＮＡを描写する図である（配列番号：１〜６）。図
示されているように、サプレッサーｔＲＮＡは、示された制限スプライス部位を
用いてタンデムで用いられうる。

【図１０】 図１０は、本発明に従い設計された、ヒト・オパール・サプレッサー・セリン
ｔＲＮＡ及びヒト・アンバー・サプレッサー・セリンｔＲＮＡの描写、並びに示
された制限スプライス部位を用いたタンデムの２つのサプレッサーｔＲＮＡのグ
ラフによる図示である。

【図１１】 図１１は、本発明の新規なヒト・オーカー・サプレッサー・セリンｔＲＮＡに
より形成されたクローバー葉構造を描写する図である（配列番号：９）。

【図１２】 図１２は、本発明に従い形成された、さらにもう一つの合成アンバー・サプレ
ッサー・セリンｔＲＮＡのアンチコドン領域におけるクローバー葉形成を描写す
る図である（配列番号：１０）。

【図１３】 図１３は、本発明によるアンチコドン領域を図示する、さらにもう一つのヒト
・セリン・オパール・サプレッサーｔＲＮＡのクローバー葉形成を描写する図で
ある（配列番号：１１）。

【図１４】 図１４は、本発明による、さらにもう一つのヒト・オパール・サプレッサーｔ
ＲＮＡにより形成されたクローバー葉及びアンチコドン領域を描写する図である
（配列番号：１２）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 31/7105 Ａ６１Ｐ 17/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｐ 17/00 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA80 CA01 CA11 CA12 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 FA10 HA17 4B065 AA90X AA93X AA93Y AA95X AB01 BA02 CA24 CA44 CA60 4C084 AA13 ZA892 ZB212 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 ZA89 ZB21 【要約の続き】

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 合成サプレッサーｔＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド
   配列であって、 （Ａ）２０以下の３’フランキング残渣を含み、５’フランキング残渣を全く含
   まない、ｍＲＮＡとの対合のためのアンチコドン領域をコードするヒトｔＲＮＡ
   構造遺伝子配列と、 （Ｂ）１５０ヌクレオチド未満の全長と、 （Ｃ）本来認識されるものとは異なるコドンを認識するよう修飾されたアンチコ
   ドン配列と を含むオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 請求項１のオリゴヌクレオチドがコードする合成サプレッサ
   ーｔＲＮＡ分子。
3. 【請求項３】 該アンチコドン領域が、アンバー（ＴＡＧ）、オーカー（Ｕ
   ＡＡ）及びオパール（ＵＧＡ）よりなる群から選ばれるナンセンス変異をコード
   する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項１記載の第二のオリゴヌクレオチド配列を更に含み、
   該二つの配列が縦に連結されている請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、セリンｔＲＮＡをコードする
   請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、アルギニンｔＲＮＡをコード
   する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 該オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜１０、それらの補体
   、及びそれらの機能的等価物よりなる群から選ばれる配列を有する請求項１記載
   のオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 細胞においてナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への翻
   訳を回復する方法であって、 （Ａ）２０以下の３’フランキング残渣を含み、５’フランキング残渣を全く含
   まない、ｍＲＮＡとの対合のためのアンチコドン領域をコードするヒトｔＲＮＡ
   構造遺伝子配列と、 （Ｂ）１５０ヌクレオチド未満の全長と、 （Ｃ）本来認識されるものとは異なるコドンを認識するよう修飾されたアンチコ
   ドン配列と を含む合成サプレッサーｔＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列を該
   細胞に導入する工程を含み、該アンチコドンが、該ナンセンス突然変異と対合す
   るそれであり、該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、該ナンセンス変異によって欠失し
   たアミノ酸をコードする方法。
9. 【請求項９】 該ナンセンス変異を有する該ヌクレオチド配列が、該細胞に
   導入されたそれである請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、セリンｔＲＮＡをコードす
    る請求項８記載のオリゴヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、アルギニンｔＲＮＡをコー
    ドする請求項８記載のオリゴヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 該オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜１０、それらの補
    体、及びそれらの機能的等価物よりなる群から選ばれる配列を有する請求項８記
    載のオリゴヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 細胞においてナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への
    翻訳を回復する方法であって、合成サプレッサーｔＲＮＡオリゴヌクレオチドを
    該細胞に導入する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが、請求項１の配列によっ
    てコードされるそれである方法。
14. 【請求項１４】 請求項１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドベクター
    。
15. 【請求項１５】 該ベクターが、ウイルスベクターである請求項１４記載の
    ヌクレオチドベクター。
16. 【請求項１６】 該ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
    関連、ヘルペスシンプレックスウイルス、及びヘルペスシンプレックスウイルス
    のベクターよりなる群から選ばれるウイルスベクターである請求項１４記載のベ
    クター。
17. 【請求項１７】 該ベクターがヘルペスウイルスベクターである請求項１４
    記載の方法。
18. 【請求項１８】 該ベクターが、プラスミドをエピソーム的に維持するため
    のエプスタイン・バーウイルスori P及びＥＢＮＡ−１配列、ヒグロマイシン耐性
    遺伝子、ＨＳＶ−１の溶菌性複製起点（ori S）、及びＨＳＶ−１の末端パッケ ージングシグナルを含む、ヘルペスウイルスミニアンプリコンベクターである請
    求項１４記載の方法。
19. 【請求項１９】 該ベクターが、pHhargsup tRNA^Opalベクターである請求項
    １４記載のベクター。
20. 【請求項２０】 請求項１のヌクレオチド配列を含む形質転換された宿主細
    胞。
21. 【請求項２１】 請求項２の合成サプレッサーｔＲＮＡ分子を含む形質転換
    された宿主細胞。
22. 【請求項２２】 翻訳されたタンパク質に部位特異的突然変異を導入する方
    法であって、 （Ａ）２０以下の３’フランキング残渣を含み、５’フランキング残渣を全く含
    まない、ｍＲＮＡとの対合のためのアンチコドン領域をコードするヒトｔＲＮＡ
    構造遺伝子配列と、 （Ｂ）１５０ヌクレオチド未満の全長と、 （Ｃ）本来認識されるものとは異なるコドンを認識するよう修飾されたアンチコ
    ドン配列と を含む合成サプレッサーｔＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列を該
    細胞に導入する工程を含み、該アンチコドンが、該ナンセンス突然変異と対合す
    るそれであり、該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、該ナンセンス変異によって欠失し
    たアミノ酸をコードする方法。
23. 【請求項２３】 該アンチコドン領域が、アンバー（ＴＡＧ）、オーカー（
    ＵＡＡ）及びオパール（ＵＧＡ）よりなる群から選ばれるナンセンス変異をコー
    ドする請求項２２記載のオリゴヌクレオチド。
24. 【請求項２４】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、セリンｔＲＮＡをコードす
    る請求項２２記載のオリゴヌクレオチド。
25. 【請求項２５】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、アルギニンｔＲＮＡをコー
    ドする請求項２２記載のオリゴヌクレオチド。
26. 【請求項２６】 該オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜１０、それらの補
    体、及びそれらの機能的等価物よりなる群から選ばれる配列を有する請求項２２
    記載のオリゴヌクレオチド。
27. 【請求項２７】 翻訳されたタンパク質に部位特異的突然変異を導入する方
    法であって、請求項１の配列がコードする合成サプレッサーｔＲＮＡを該細胞に
    導入する工程を含む方法。
28. 【請求項２８】 合成サプレッサーｔＲＮＡを設計する方法であって: （Ａ）問題のｔＲＮＡ配列を特定する工程と、 （Ｂ）該ｔＲＮＡ配列のアンチコドンを特定する工程と、 （Ｃ）異なるアミノ酸が、正常ならば翻訳されるものよりは、該アンチコドンに
    関連して翻訳されるように、代替的なアンチコドン配列を設計する工程と、 （Ｄ）（ａ）２０以下の３’フランキング残渣を含み、５’フランキング残渣を
    全く含まない、ｍＲＮＡとの対合のためのアンチコドン領域をコードするヒトｔ
    ＲＮＡ構造遺伝子配列、 （ｂ）１５０ヌクレオチド未満の全長、及び （ｃ）本来認識されるものとは異なるコドンを認識するよう修飾されたアンチコ
    ドン配列を含み、該アンチコドンが、該ナンセンス突然変異と対合するそれであ
    り、該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、該ナンセンス変異によって欠失したアミノ酸
    をコードする、オリゴヌクレオチドを合成する工程と を含む方法。
29. 【請求項２９】 該アンチコドン領域が、アンバー（ＴＡＧ）、オーカー（
    ＵＡＡ）及びオパール（ＵＧＡ）よりなる群から選ばれるナンセンス変異をコー
    ドする請求項２８記載のオリゴヌクレオチド。
30. 【請求項３０】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、セリンｔＲＮＡをコードす
    る請求項２８記載のオリゴヌクレオチド。
31. 【請求項３１】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、アルギニンｔＲＮＡをコー
    ドする請求項２８記載のオリゴヌクレオチド。
32. 【請求項３２】 動物における遺伝的疾患を治療する方法であって、 （Ａ）２０以下の３’フランキング残渣を含み、５’フランキング残渣を全く含
    まない、ｍＲＮＡとの対合のためのアンチコドン領域をコードするヒトｔＲＮＡ
    構造遺伝子配列と、 （Ｂ）１５０ヌクレオチド未満の全長と、 （Ｃ）本来認識されるものとは異なるコドンを認識するよう修飾されたアンチコ
    ドン配列と を含むサプレッサーｔＲＮＡ配列を該動物に導入する工程を含む方法。
33. 【請求項３３】 該アンチコドン領域が、アンバー（ＴＡＧ）、オーカー（
    ＵＡＡ）及びオパール（ＵＧＡ）よりなる群から選ばれるナンセンス変異をコー
    ドする請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。
34. 【請求項３４】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、セリンｔＲＮＡをコードす
    る請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。
35. 【請求項３５】 該ｔＲＮＡ構造遺伝子配列が、アルギニンｔＲＮＡをコー
    ドする請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。
36. 【請求項３６】 該オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜１０、それらの補
    体、及びそれらの機能的等価物よりなる群から選ばれる配列を有する請求項３２
    記載のオリゴヌクレオチド。
37. 【請求項３７】 該疾病が色素性乾皮症である請求項３２記載の方法。
38. 【請求項３８】 細胞の形質導入を追跡する方法であって、ナンセンス変異
    の導入によって不活性化されたレポーター遺伝子を含む、オリゴヌクレオチドベ
    クターを該細胞に導入する工程と；請求項１に記載のサプレッサーｔＲＮＡ配列
    を該細胞に導入する工程と；リポーター遺伝子の再活性化についてアッセーする
    工程とを含む方法。
39. 【請求項３９】 該リポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルト
    ランスフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質よりなる群から選ばれる請求項３８記
    載の方法。