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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vier Nukleotidbasen von DNA-Molekülen tragen die genetische Information.
Diese Information wird in Form von Codonen, von aneinandergrenzenden
Basen durch eine mRNA transkribiert und durch eine tRNA und Ribosome
translatiert, um Proteine zu bilden. Der genetische Code ist die
Beziehung zwischen einem Triplett-Codon und einer bestimmten Aminosäure. Von
den vierundsechzig möglichen
Codon-Tripletts, die den genetischen Code bilden, gibt es drei Stopp-
oder Abschlusscodone, welche dafür
bekannt sind, die Proteinproduktion in den zellulären Ribosomen
zu stoppen; die anderen einundsechzig Tripletts im Code beziehen sich
auf die eine oder andere Aminosäure.
(siehe Tabelle 1)
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Wenn
die genetischen Instruktionen an den Ribosomen translatiert werden,
sind die Aminosäuren
aneinandergereiht, um komplexe Polypeptide zu bilden. Wenn allerdings
ein Stopp-Codon gelesen wird, wird es als Stopp-Signal interpretiert,
das die Proteinproduktion beendet. Die drei Stopp-Codons sind UAG
(Amber), UAA (Ochre) und UGA (Opal). Mutationen, die ein Codon in
ein Stopp-Codon ändern,
werden Nonsense-Mutationen genannt und, als ein Ergebnis, können genetische
Phänotypen
nicht exprimiert werden. Folglich kann trotz des Vorhandenseins
einer genführenden
Expression ein entscheidendes Protein nicht produziert werden, weil
ein unerwünschtes
Stopp-Signal ein Ribosom erreicht und ein unfertiges Protein beendet.
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Transfer-RNAs
(tRNAs) translatieren die Messenger-RNA (mRNA) an dem Ribosom in
ein Protein. Jede Transfer-RNA enthält einen Anti-Codonbereich, der
mit einer mRNA hybridisiert, sowie eine Aminosäure, welche an das wachsende
Peptid angefügt
werden kann. Das Strukturgen der tRNA ist etwa 72 bis 90 Nukleotide
lang und klappt in eine Kleeblattstruktur. Die tRNAs werden durch
die RNA-Polymerase-III
transkribiert und enthalten ihre eigenen intragenischen Spaltungspromotoren,
die ein Teil der vollentwickelten tRNA Codiersequenz wird (Sharp
S.J., Schaack J., Coolen L., Burke D.J. und D., „Structure and transcription
of eukaryotic tRNA genes",
Crit. Rev. Biochem, 19:107-144 (1985); Geiduschek E.O., und Tocchini-Valentini, „Transcription by
RNA polymerase III, Annu. Rev. Biochem. 57:873-914 (1988)).
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Nonsense-Suppressoren
sind Allele der tRNA-Gene, die in das Anticodon geändert sind,
so dass sie als Antwort auf ein Abschlusscodon (Stopp-Codon) eine
Aminosäure
einfügen
können.
Beispielsweise führt eine
Ochre-Mutation zu einer Schaffung eines UAA-Codons in der Messenger-RNA.
Ein Ochre-Suppressorgen produziert die tRNA mit einem AUU Anticodon,
das an dem UAA-Ort eine Aminosäure
einfügt,
was trotz des Vorhandenseins eines Nonsense-Codons eine kontinuierliche
Translation ermöglicht.
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Eine
Anzahl von Nonsense-Suppressor-tRNA-Allelen sind in Prokaryoten
und Eukaryoten, wie zum Beispiel in Hefe und C.elegans identifiziert
worden. Jedoch konnte bis heute keine Säugetierzelllinie, die eine funktionsfähige Suppressor-tRNA
enthält,
isoliert werden, indem man eine klassische genetische Selektion verwendet.
Versuche, Suppressor-tRNAs von höheren
Eukaryoten zu isolieren, führten
zu der Identifikation einer opal-Suppressor-Phosphoserin-tRNA im Hühnergenom
(Hatfield D.L., Dudock B.S., und Eden F.C., „Characterization and nucleotide
sequence of a chicken gene encoding an opal Suppressor-tRNA and
its flanking DNA segments",
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4940-4944 (1983)), und später in dem
menschlichen Genom (O'Neill
V.A., Eden F.C., Pratt K., und Hatfield D. L., "A human opal suppressor-tRNA gene and
pseudogene", J.
Biol. Chem. 260:2501-2508 (1985)). Diese beiden unterscheiden sich
nur bei einer einzigen Nukleotidposition voneinander. Suppressor-tRNAs
können
auch ein Durchlesen (engl.: read through) der natürlich auftretenden
Stopp-Codonen bewirken, um dadurch verlängerte Proteine mit geänderten
Funktionen zu produzieren. Die Unterdrückung des Abschlusses kann
für die
Zelle schädlich
sein, obwohl mehrere natürliche
Stopp-Codonen am Ende des Gens einen Schutz vor solchen schädlichen
Effekten zur Verfügung
stellen können.
Die unterschiedlichen Suppressor-tRNAs unterscheiden sich in ihrer
Unterdrückungseffizienz.
In E.coli und anderen Systemen sind die Amber-Suppressoren, verhältnismäßig effizienter,
Ochre-Suppressoren
weniger effizient, während
Opal-Suppressoren die Schwächsten
sind, dieses legt nahe, dass die Amber-Codonen nicht so häufig verwendet
werden, um die Proteinsynthese zu beenden, während Ochre- und Opal-Codonen
häufiger als
natürliche
Beendigungssignale verwendet werden.
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Die
Wiederherstellung eines normalen Phänotyps durch Suppressoren wird
vom Aminosäuretyp
abhängen,
der bei der Position des Nonsense-Codons eingefügt ist. Die eingefügte Aminosäure kann
mit der Struktur, der Funktion oder der Stabilität des Genproduktes inkompatibel
sein. Daher existiert ein Bedarf für eine große Vielfalt an Suppressor-tRNAs,
um unterschiedliche Aminosäuren
einzufügen.
Es wurde gezeigt, dass Amber- und Ochre-Suppressoren, die von einem
Xenopus Laevis Tyrosin-tRNA-Gen abgeleitet wurden, sowohl in Säugetierzellen
in transienten Transfektionsproben als auch in permanenten Zelllinien
funktionsfähig sind.
(Laski F.A., Belagaje U.L., RajBhandary U.L. und Sharp P.A., „An amber
Suppressor – tRNA
gene derived by site-directed mutagenesis: cloning and expression
in mammalian cells",
Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79:5813-5817 (1982); Laski F.A., Belagaje
R., Hudzoal R.M., Capecchi M.R., Palese P., RajBhandary U.L. und Sharp
P.A., „Synthesis
of an ochre suppressor tRNA gene and expression in mammalian cells", EMBO J 3:2445-2452
(1984); Hudziak R.M., Laski R.A., RajBhandary U., Sharp P.A. und
Cappecchi M.R., „Establishment
of mammalian cell lines containing multiple nonsense mutations and
functional suppressor transfer RNA genes", Cell 31:131-146 (1982)). Capone und
Mitarbeiter erzeugten in ähnlicher
Weise Amber-, Ochre-, Opal-Supressor-tRNA-Gene, die von einem menschlichen
Serin-tRNA-Gen abgeleitet sind.",
(Capone J.P., Sharp P.A. und RajBhandary U.L., „Amber, ochre and opal suppressor
tRNA genes derived from a human serine tRNA gene" EMBO J 4:213-221 (1985)).
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Zusätzlich zur
Ermöglichung
eines Durchlesens einer Mutation, die ein Nonsense-Codon in der
Mitte einer transkribierten Proteinsequenz hervorruft, gibt es auch
Zeiten, in denen man eine Translation manipulieren möchte, um
die Genprodukte abzuschneiden. In jedem Fall existiert ein Bedarf
für einen
Suppressionsmechanismus, welcher es den zellulären Ribosomen ermöglichen
würde,
derartige Stopp-Signale
zu „durchlesen", wenn sie nicht
erwünscht
sind. Es besteht auch ein Bedarf für die Gelegenheit, die Proteinsynthese
durch ein absichtliches Ändern
der Translation des genetischen Codes lagespezifisch zu modifizieren,
um etwas über
die Proteinfunktionen zu lernen.
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue Nonsense-Suppressor-tRNAs,
die in Zellen und in Anwendungsverfahren derselben in Genmanipulations-Protokollen
funktionsfähig
sind, zur Verfügung
zu stellen.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden neue Oligonukleotidsequenzen, die Suppressor-tRNAs oder
funktionale Äquivalente
dazu kodieren, zur Verfügung
gestellt, die dann, wenn sie in Zellen, die eine Nonsense-Mutation
enthalten, eingeführt
werden, die Expression des Nonsense-Stopp-Codons unterdrücken können, was
eine vollständige
Translation des Proteinproduktes ermöglicht. Auf Grundlage der Kenntnis
bekannter menschlicher tRNA – Sequenzen,
werden synthetische Oligonukleotide die sich auf Opal-, Amber- oder Ochre-Mutationen
beziehen, aufgebaut, welche dann in jeder aus einer Anzahl von Genmanipulations-Protokollen
verwendet werden können.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Oligonukleotidsequenz zur Verfügung gestellt,
die eine synthetische Suppressor-tRNA kodiert, umfassend:
- A) eine menschliche tRNA-Strukturgensequenz,
umfassend nicht mehr als zwanzig 3' flankierende Residuen und keine 5' flankierenden Residuen,
wobei die besagte Sequenz eine Anticodonregion für eine Paarung mit einer mRNA
kodiert;
- B) eine Gesamtlänge
von weniger als 150 Nukleotiden;
- C) eine Anticodonsequenz, die modifiziert wurde, um ein Codon
zu erkennen, das sich von demjenigen, das ursprünglich erkannt wurde, unterscheidet.
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Kurz
gesagt, wird ein Oligonukleotid synthetisiert, welches die strukturelle
Komponente eines bekannten tRNA-Gens aufweist. Die Sequenz dieses
Oligonukleotids ist auf Basis der bekannten Sequenz mit Substitutionen,
die in der Anticodonregion der tRNA hergestellt sind aufgebaut,
was dazu führt,
dass die spezifische tRNA eine Nonsense- oder jede andere spezifische
oder erwünschte
Mutation erkennt. Zum Beispiel wurde gemäß der vorliegenden Erfindung,
wie in 2 gezeigt, die Sequenz einer
menschlichen Serin-tRNA, die ein Anticodon von TCG hat, modifiziert,
um eine Substitution von TCA, dem Gegenstück der Opal-Mutation, aufzunehmen,
um zu bewirken, dass die tRNA das Opal-Stopp-Codon eher als das übliche Serin-Codon
erkennt.
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Wichtig
ist, dass die Sequenzen für
die Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung nur die Struktursequenz
enthalten, die sowohl das tRNA-Molekül als auch einen kleinen Teil
(rund 20 nt) der 3' flankierenden Region
kodiert. Die 5' Region
wird ausgelassen, um zu einem Oligonukleotid zu führen, das
klein ist und einfacher zu bearbeiten ist (d. h. ungefähr 100 Nukleotiden
lang). Die Oligonukleotidsequenz weist die strukturelle Komponente
der Gene auf und umfasst rund 15 Basen von der 3' flankierenden Region und keine der
5' nicht-kodierenden
Region. Herkömmliche
Verfahren die Suppressor-tRNAs bis heute verwenden, haben die kompletten
Suppressor-tRNA kodierenden Moleküle, welche isoliert, geklont
und dann lagemutiert sind, verwendet, um die Suppressor-tRNA zu
erzeugen. Die vorliegende Erfindung liefert ein viel einfacheres
Verfahren, um die Suppressor-tRNA kodierenden Oligonukleotide aufzubauen,
und zwar das Aufbauen einer Oligonukleotidsequenz, die nur die strukturellen
Sequenzen, die die tRNA kodieren und einen Teil der 3' flankierenden Region
enthält.
Dieses kleine Oligonukleotid kann dann eher synthetisch synthetisiert
als isoliert werden, wobei Standard-Genmanipulationstechniken eingesetzt
werden, und diese synthetischen Suppressor-tRNAs können gemäß den Verfahren
der Erfindung eingesetzt werden.
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Die
synthetischen Suppressor-tRNAs und die Sequenzen, die diese oder
deren funktionale Äquivalente
kodieren, können
für jedes
Protokoll einer Anzahl von Genmanipulations-Protokollen verwendet
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese synthetischen
Suppressor-kodierenden tRNAs, die einen Suppressor kodieren in einem
Genmanipulations-Protokoll, ob in-vitro, ex-vivo oder in-vivo, in
eine Zelle eingeführt,
um die Effekte der Mutationen zu unterdrücken, die zu abgeschnittenen
und inaktiven Genprodukten führen,
welche für
eine Krankheit verantwortlich sind. Die Oligonukleotide, die eine
Suppressor-tRNA kodieren, können
direkt in die Zellen eingebracht werden. Sie sind so ähnlich zu
natürlichen
tRNAs, dass sie eine signifikante immunologische Antwort unwahrscheinlich
hervorrufen werden. Zusätzlich
und in einer bevorzugten Ausführungsform
für eine
erhöhte
Abgabe von tRNAs, die einen Suppressor kodieren, kann die tRNA-synthetische Oligonukleotidsequenz
in einem passenden Expressionsträger
enthalten sein, der einen Nukleotidvektor aufweist.
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Der
Ausdruck „funktionales Äquivalent", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf jeden Abkömmling,
welcher zu der Bezugssequenz oder dem Protein funktional im Wesentlichen ähnlich ist.
Insbesondere umfasst der Ausdruck „funktionales Äquivalent" Abkömmlinge,
in denen eine Nukleotidbase (Nukleotidbasen) und/oder eine Aminosäure (Aminosäuren) ohne
eine signifikant schädliche
Wirkung auf eine biologische Funktion hinzugefügt, gelöscht oder ersetzt worden sind
und die unter hohen Auflagen hinsichtlich der Knappheit gemäß den Protokollen,
die im Stand der Technik bekannt sind und in Maniantis et. al. „Molecular
Cloning" cold Spring
Harbor Press, (1989) offenbart sind, hybridisieren werden.
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Beschreibung
der Figuren
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Die 1A, 1B und 1C sind
Diagramme, die die Grundkonzepte der vorliegenden Erfindung zeigen.
In 1A ist eine herkömmliche mRNA mit einem Tyrosin-Codon
in ein herkömmliches
Protein translatiert. In 1B ist
eine mutierte mRNA mit einer Ochre-Nonsense-Mutation translatiert, so dass
sich ein abgeschnittenes Protein ergibt. In 1C ist
eine Nonsense-(Ochre)-Suppressor-tRNA
bereitgestellt, welche eine Translation des normalen Proteins von
der mutierten mRNA oder ein „Durchlesen" der Ochre-Mutation ermöglicht.
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Die 2A und 2B sind
Diagramme, die eine Suppressor-tRNA sowie Expressionsvektorkonstrukte
zeigen. 1(A) menschliche Arginin-tRNA:
die Sequenz (nicht kodierender Strang) und die Kleeblattstruktur
einer menschlichen Arginin-tRNA sind dargestellt. Eine einzelne
Basenänderung
(gezeigt mit *) in dem Anticodon ist erforderlich, um die menschliche
Arginin-tRNA in eine Opal-Suppressor-tRNA
umzuwandeln. 1(B) zeigt einen HSV-Amplicon-Vektor:
Ampr, Ampicillin resistent; „a", HSV-Packungs-Signal; HSV-tk-Promotor,
HSV-1-Thymidinkinase-Promotor; EBNA-1 modifiziertes EBV-Nuklear-Antigen-Gen;
ori P, EBV einzeln-latenter Replikationsursprung; ori S, HSV-1 Repliktationsursprung.
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Die 2A–2D sind Abbildungen, die die Wiederherstellung
der GFP-Fluoreszenz, unter der Verwendung der hargsup tRNAOpal zeigen. (A) die GFP-Fluoreszenz, die
in XP12ROSV Zellen detektiert wird, welche mit dem mhRGFP-Expressionskonstrukt
und dem pHEhargsup-tRNAOpal-Plasmid kotransfiziert
wurden. Man beachte die helle grüne
Fluoreszenz in mehreren Zellen, die durch Fluoreszenzmikroskopie
unter Verwendung eines FITC-Filters beobachtet wurde. (B) Phasenkontrast
desselben Feldes transfizierter XP12ROSV-Zellen wie in A. (C) XP12ROSV
Zellen, die allein mit dem mhRGFP-Vektor transfiziert wurden. Keine
signifikante Fluoreszenz wird beobachtet, wenn das Nonsense-Codon
nicht unterdrückt
ist. (D) Phasenkontrast desselben Feldes wie in (C).
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Die 4A und 4B sind
Abbildungen, die die Northern- und Western-Analyse der hRGFP-Expression
zeigen. (A) die Northern-Analyse.
Die gesamte RNA (10μg/Strang)
von XP12ROSV-Zellen (Strang 1) oder XP-Zellen, die mit dem hRGFP
Gen (Strang 2) oder dem mhRGFP Gen transfiziert wurden, welche eine Opal-Nonsense-Mutation (CGC in
TGA) an der Aminosäure
73 (Strang 3) enthalten, und auf hRGFP cDNA (oberstes Feld) untersucht
wurden. GFP-Transkripte ähnlicher
Größe wurden
erhalten. Die Positionen der 18S rRNA ist gezeigt. Derselbe Blot
wurde anschließend
mit einem Glycerinaldehyd-Phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Housekeeping-Gen (unteres Feld)
wieder untersucht. Nach der Normalisierung unterschiedlicher RNA-Proben
mit dem GAPDH-Gen beobachteten wir eine um ein Drittel geringere
Menge der mhRGFP-Transkription im Vergleich zu der hRGFP-Transkription.
(B) Detektion des GFP Proteins durch Western-Analyse. Zell-Lysate
wurden in einem 10-20%-igen
SDS-PAGE-Gradienten-Gel elektrophoresiert und mit dem Anti-GFP-Antikörper untersucht.
XP12ROSV-Zellen, die das hRGFP-Gen
alleine exprimieren (Strang 2) oder das mhRGFP und die hargsup tRNAOpal koexprimieren (Strang 4), zeigten ein
27 kDa GFP-Protein in voller Länge. Rezuzierte
Niveaus des GFP-Proteins wurden in Zellen, die mit den mhRGFP- und
hargsup tRNAOpal-Plasmiden transfiziert
wurden, beobachtet. Kein GFP-Protein in voller Länge war in den Zellen, die
mhRGFP-Gene in Abwesenheit der Suppressor-tRNA exprimieren (Strang
3), detektierbar. Nicht-transfizierte XP12ROSV Zellen zeigten kein
unspezifisches Anfärben
(Strang 1).
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5 zeigt
einen Graph, der die teilweise Korrektur des DNA-reparaturfehlerhaften Phänotyps durch eine
Suppressor-tRNA. VA13-, XP12ROSV- und XP12ROSV-Zellen, die hargsup
tRNAOpal exprimieren, wurden bei unterschiedlichen
Zelldichten von 2,5 × 102 bis 1 × 106 in Abhängigkeit
von der Zelllinie und der eingesetzten UVC-Strahlendosis, gesät. Am folgenden
Tage wurden die Zellen mit PBS gespült und mit UVC-Licht (254 nm)
bei 0 bis 6 J/m2 bestrahlt. Ungefähr 10 bis
12 Tage nach der Bestrahlung wurden die Zellen fixiert und mit Kristallviolett
eingefärbt.
Die prozentuale Koloniebildungsfähigkeit
wurde durch Vergleich der Koloniezahlen der bestrahlten Platten
mit denen der unbestrahlten Platten bestimmt und gegen die verwendete UVC-Dosis
aufgetragen. Ein vier- bis fünfunddreißig-facher
Anstieg in der Koloniebildungsfähigkeit
wurde bei höheren
UV-Dosen in XP12ROSV-Zellen, die die hargsup tRNAOpal exprimieren,
beobachtet.
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6 ist
ein Graph, der die Korrektur einer fehlerhaften Reparatur des pSVCAT-Plasmids
zeigt. XP12ROSV-Zellen wurden vorübergehend mit den UVC-bestrahlten
pSVCAT- und pHEhargsup tRNAOpal-Plasmiden
kotransfiziert. Als Kontrollen wurden VA13-Zellen (positive Kontrolle)
und XP12ROSV-Zellen (negative Kontrolle) mit dem UVC-bestrahlten
pSVCAT-Plasmid und dem pHE-Vektor alleine kotransfiziert. Nach 72 Stunden
wurden Zelllysate erhalten, die unter Verwendung des Flüssigkeits-Szintillationszählverfahrens
(LSC) auf CAT-Aktivität
analysiert wurden. Die CAT-Aktivität in Zellextrakten wurde in
Prozent der Aktivität
in Zellen, die mit unbestrahlten pSVCAT Zellen transfiziert wurden,
ausgedrückt
und gegen die UV-Strahlendosis
aufgetragen, die verwendet wurde, um das pSVCAT-Plasmid zu inaktivieren. XP12ROSV-Zellen,
die die hargsup tRNAOpal exprimieren, zeigten
eine drei- bis siebzehnfach erhöhte
Fähigkeit,
das mit UV bestrahlte pSVCAT-Plasmid im Vergleich zu XP12ROSV- Zellen, die mit dem
bestrahlten pSVCAT-Plasmid alleine transfiziert wurden, zu reaktivieren.
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Die 7A und 7B sind
Northern- und Western-Analysen der XPAC-Genexpression. (A) Expression
der XPAC-Transkription. Eine Northern-Analyse der gesamten RNA (10μg/Strang)
von normalen VA13-Kontrollzellen (Strang 1) und XP12ROSV-Zellen
(Strang 2), die mit einer abgeschnittenen XPAC-cDNA überprüft wurden,
ist in dem Autoradiogramm dargestellt (oberes Feld). Die zwei Bänder in
den VA13-Zellen (normale Kontrollen) sind wegen einer alternativen
Polyadenyation (Tanaka, K. et al., „Analysis of a human DNA excision
repair gene involved in group A xeroderma pigmentosum and containing
a zinc-finger domain", Nature
348 72-78 (1990)). Das XPAC-Transkriptionsniveau wurde in den XP12ROSV-Zellen
wesentlich reduziert. Derselbe Blot wurde auf das GAPDH-Gen wiederüberprüft, um eine
relative Normalisierung der unterschiedlichen RNA-Proben zu ermöglichen,
und ist im unteren Feld dargestellt. (B) Western-Analyse, um das XPAC-Protein
nachzuweisen. Western-Analyse von DNA-reparaturfähigen VA13-Zellen (Strang 1), XP12ROSV-Zellen (Strang
2) und XP12ROSV-Zellen,
die die Suppressor-tRNA (Strang 3) exprimieren, die mit Anti-XPAC-Antikörpern untersucht
wurden. Das XPAC-Protein wird einfach in VA13-Zellen beobachtet,
es wird aber weder in XP12ROSV-Zellen alleine oder in XP12ROSV-Zellen,
die mit hargsup tRNAOpal transfiziert wurden,
nachgewiesen.
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8A und 8B zeigen
eine Transduktion von XP12ROSV-Zellen mit einem pHEhargsup tRNAOpal-Amplicon-Vektor, der in HSV-1-Virionen
verpackt ist. (A) GFP-fluoreszierende Zellen wurden beobachtet, wenn
XP12ROSV-Zellen, die das mhRGFP-Gen exprimieren, mit dem pHEhargsup
tRNAOpal Amplicon-Vektor transduziert wurden,
was auf eine erfolgreiche in-vitro Abgabe der Suppressor-tRNA durch
das Herpesvirus-Amplicon-System sowie eine Unterdrückung der
Nonsense-Mutation im mhRGFP Gen hinweist. (B) Phasenkontrast desselben
Feldes wie in (A).
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9 ist
eine Abbildung, die die menschlichen Opal-, Amber- und Ochre-Suppressor-Serin-tRNAs zeigt,
gemäß der Erfindung
aufgebaut wurden. (SEQ ID NOS: 1-6). Wie dargestellt, können die
Suppressor-tRNAs,
unter Verwendung der angedeuteten Restriktionsverbindungsstellen
im Tandem verwendet werden.
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10 ist
eine Darstellung einer menschlichen Opal-Suppressor-Serin-tRNA und menschlichen
Amber-Suppressor-Serin-tRNAs, die gemäß der vorliegenden Erfindung
aufgebaut sind, sowie eine graphische Darstellung von zwei menschlichen
Suppressor-tRNAs hintereinander, welche die angedeuteten Verbindungsstellen
verwenden. (SEQ ID NOS: 5-8)
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11 ist
ein Diagramm, das die Kleeblattstruktur, die durch die neuartige
menschliche ochre-Suppressor-Serin-tRNA der Erfindung ausgebildet
wurde, zeigt. (SEQ ID NOS: 9)
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12 ist
ein Diagramm, das die Kleeblattbildung in der Anticodon-Region einer weiteren
synthetischen Amber-Suppressor-Serin-tRNA, die gemäß der vorliegenden
Erfindung ausgebildet wurde, zeigt. (SEQ ID NOS: 10)
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13 ist
eine Zeichnung, die die Kleeblattbildung noch einer weiteren menschlichen
Opal-Suppressor-tRNA zeigt, welche die Anticodon-Region gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt. (SEQ ID NOS: 11)
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14 ist
eine Zeichnung, die die Kleeblatt- und Anticodonregionen, die durch
ein weitere menschliche Opal-Suppressor-tRNA mittels der vorliegenden
Erfindung ausgebildet wurden, zeigt. (SEQ ID NOS: 12)
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Atkinson
und Martin identifizierten 1994 bei einer Durchsuchung von Literaturbeschreibungen
nahezu 180 einzelne Punktmutationen an Nonsense-Codonen, die in
menschlichen Genen identifiziert wurden. Diese Arten der Mutationen
führen
zu muskulärer
Dystrophie, Xeroderma pigmentosum, zystischer Fibrose, Hämophilie,
Anämie,
Hypothyreodismus, einem p53 Squamal-Zellkurzinom, einem p53 hepatozellulären Karzinom, einem
p53-Eierstock-Karzinom, einem Ösophayus-Karzinom,
Knochenkrebs, Eierstockkarzinom, einem Speiseröhrenkarzinom, einem Leberzellenkarzinom,
Brustkrebs, einem hepatozellulärem
Karzinom, einem faserigen Eierstock-Karzinom, einer SRY-Geschlechtsumwandlung,
einer triosephosphaten Isomerase-Anämie, Diabetes und Knochenerweichung.
Die BRACA-1 und BRACA-2 Gene, die mit Brustkrebs in Verbindung gebracht
werden, haben auch eine ähnliche
Mutation, welche gemäß der Lehre
hierin behandelt werden kann. Die vorliegende Erfindung umfasst
in einer Ausführungsform
Verfahren zur Behandlung dieser Erkrankungen durch Umkehrung der
Effekte vorhandener Mutationen, die mit Nonsense-Mutationen verbunden
werden, durch Einführung
der synthetischen Oligonukleotid-Suppressor-tRNA
der Erfindung.
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Die
Nukleotidsequenzen, die einige menschliche tRNAs kodieren sind bekannt
und für
den Fachmann allgemein durch Quellen wie zum Beispiel die Genbank
erhältlich.
Siehe: Sprinzl, Mathias et. al., Nucleic Acids Research, volume
12, Supplement „compilation
of tRNA Sequences",
Seite r1-r57 (1984); Schimmel, P.R., et. Al. Editors, "Transfer.RNA: Structure,
Properties, and Recognition, Cold Spring Harbor Labs New York 1979; Agris,
P.F., (1983) "The
Modified Nucleosides of Transfer RNA, II, Alan R. Liss Inc., New
York (Buckland RA et al., "A
cluster of tRNA genes into [DRNI, TRR3, DDRAN] on the short arm
of human chromosome 6",
Genomics, 35 164-171 (1996)). Es wurde gezeigt, dass tRNAs stark
konserviert sind und häufig über Spezies
hinweg funktional sind und damit sind bakterielle oder andere eukaryotische
tRNA-Sequenzen auch potentielle Quellen für die Oligonukleotide der Erfindung.
Die Feststellung, ob eine bestimmte tRNA-Sequenz in einer gewünschten
Säugetierzelle
funktional sein wird, kann einfach durch routinemäßiges Experimentieren
und Untersuchungen und Verfahren, die hierin diskutiert oder eingeschlossen
sind, getroffen werden. Ferner können zusätzlich potentielle,
bislang unbekannte tRNA-Sequenzen
sowohl durch die diskutierten Untersuchungen und Protokolle als
auch durch die hierin aufgenommenen Referenzen, die Routineexperimente
verwenden, ermittelt werden.
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tRNA-Gene
haben starke Promotoren, die in allen Zelltypen aktiv sind. Die
Promotoren für
eukaryotische tRNA-Gene liegen innerhalb der Struktursequenzen,
die das tRNA-Molekül
selbst kodieren. Obwohl es Elemente gibt, die die transkriptionale
Aktivität
innerhalb der 5' Steigregion
regulieren, kann die Länge
einer aktiven transskriptionalen Einheit wesentlich kleiner als
500 Basenpaare sein, und damit stellt eine Unterbringung in einem Übergabevektor
kein Problem dar. Sobald sie transkribiert und verarbeitet wurden,
haben tRNAs geringe Degradationsraten. Letztendlich behält eine
Gentherapie mit einem Nonsense-Suppressor die endogenen physiologischen
Kontrollen über
das Zielgen bei, welches das Nonsense-Codon enthält. Ein Fachmann wird verstehen,
dass entsprechend der hierin enthaltenen Lehre die Oligonukleotide
der Erfindung nicht nur für menschliche
Generkrankungen genutzt werden können,
sondern auch für
eine Gentherapie durch eine Nonsense-Suppression, die für Mutationen in einem weiten
Bereich von Genen für
eine lagespezifische Substitution von Proteinprodukten anwendbar
sein soll.
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Kurz
gesagt, wird ein Oligonukleotid synthetisiert, das eine strukturelle
Komponente eines tRNA-Gens, das in einer menschlichen Zelle funktional
ist, umfasst. Eine Thr-Sequenz dieses Oligonukleotids wird auf Grundlage
der bekannten Sequenz mit Substitutionen, die in der Anticodon-Region
der tRNA gemacht wurden, aufgebaut, was die spezifische tRNA veranlasst,
eine Nonsense- oder andere spezifische Mutation zu erkennen. Wie
zum Beispiel in 2 gezeigt und gemäß der Erfindung
wurde die Sequenz der menschlichen Serin-tRNA, die ein Anticodon
aus TCG hat, modifiziert, um einer Substitution von TCA das Komplement
der Opal-Mutation einzuführen,
um zu erreichen, dass die tRNA das Opal-Stopp-Codon schneller als
das ursprüngliche
Serin-Codon erkennt.
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Wichtig
ist, dass die Sequenzen für
die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung nur die Struktursequenzen
enthalten, die sowohl das tRNA-Molekül als auch einen kleinen Teil
(rund 20 nt) der 3' flankierenden Region
kodieren. Die 5' Region
wird ausgelassen, um ein Oligonukleotid zu ergeben, das klein und
einfacher zu handhaben ist (d. h., ungefähr 100 Nukleotiden lang). Die
Oligonukleotidsequenz umfasst die strukturelle Komponente der Gene
und enthält
rund 15 Basen der 3' flankierenden
Region und keine der 5' nicht-kodierenden
Region. Herkömmliche
Verfahren, die bis heute Suppressor-tRNAs verwenden, haben die ganzen
Suppressor-tRNA-Moleküle
verwendet, welche isoliert, geklont und dann lagemutiert werden,
um die Suppressor-tRNA zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung stellt
ein viel einfacheres Verfahren zur Verfügung, um die Suppressor-tRNA
aufzubauen, und zwar einen Aufbau einer Oligonukleotidsequenz, die nur
die strukturellen Sequenzen, die die tRNA kodieren, und einen Teil
der 3' flankierenden
Region enthält.
Dieses kleine Oligonukleotid kann dann eher synthetisch synthetisiert
als isoliert werden, indem man Standard-Genmanipulationstechniken
einsetzt, und diese synthetischen Suppressor-tRNAs können gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
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Suppressor-tRNAs
sind derzeit als Werkzeuge ausgeführt, um grundlegende biologische
Fragen zu behandeln. Sie werden verwendet, um unnatürliche Aminosäuren lagespezifisch
in Proteine in-vivo einzubinden (Noren C.J., Anthony-Cahill S.J.,
Griffith M.C. and Schultz P.G., „A general method for site-specific
incorporation of unnatural amino acids into proteins", Science 244:182-188
(1989)) und in Kombination mit elektrophysiologischen Techniken
haben sie ein allgemeines Verfahren für Struktur-Funktionsstudien
von Rezeptoren, Kanälen
und Transportern zur Verfügung
gestellt (Nowak M.W., Kearney P.C., Sampson, J.R., Saks, M.E., Labarca
G.C. et. al., „Nicotinic
receptor binding site probed with unnatural amino acid incorporation
in intact cells",
Science 268:439-442 (1995)).
-
Allerdings
sind Suppressor-tRNAs gerade jetzt für die Behandlung von menschlichen
Krankheiten erforscht worden. Nonsense-Mutationen, die in Hauptregulatorgenen
auftreten, sind häufig
für die
Zelle schädlich
und verantwortlich für
verschiedene Arten genetischer Erkrankungen. Atkinson und Martin
(Atkinson J. und Martin R., „Mutations
to nonsense codons in human genetic disease: implications for gene
therapy by nonsense suppressor tRNAs", Nucleic Acids Res. 22:1327-1334 (1994))
untersuchten und berichteten über
eine Liste von 179 einzelnen Punktmutationen, die zu Nonsense-Mutationen
führten,
die in menschlichen Genen identifiziert wurden und menschliche genetische
Erkrankungen verursachten. Diese sind alle potentielle Ziele für eine Gentherapie (in-vivo
oder ex-vivo) für
die Behandlung einer Krankheit mit der Suppressor-tRNA-Technologie.
Die mögliche
Anwendung der Suppressor-tRNA auf die Gentherapie wurde zuerst für β-Thalassämie demonstriert
(Temple G.F., Dozy A.M., Roy K.L. and Kan Y.W., „Construction of a functional
human suppressor tRNA gene: an approach to gene therapy for β-thalassemia", Nature 296:537-540
(1982)). Eine menschliche Amber-Suppressor-Lysin-tRNA war in der
Lage, eine Nonsense-Mutation in einem mutierten β-Globin-Gen zu unterdrücken, wenn
beide gleichzeitig in-vivo in einem Xenopus-Oozyt-System exprimiert wurden. Die
in-vivo Anwendung von Suppressor-tRNAs für die Behandlung von genetischen
Krankheiten, die durch Nonsense-Mutationen verursacht wurden, wurde
kürzlich
an einer mdx-Maus demonstriert, welche ein Tiermodell für eine menschliche
Duchenne-Muskeldystrophie mit einer Ochre-Mutation im Dystrophin-Gen
ist (Li K., Zhang J., Buvoli M., Yan X.D., Leinwand L. and He H., „Orchre
suppressor transfer RNA restored dystrophin expression in mdx mice", Life Sciences 61:205-209
(1997)). Eine direkte Injektion einer Plasmid-DNA, die die Ochre-Suppressor-tRNA
kodiert, in mdx-Mäuse
verursachte dystrophin-positive Fasern. Die praktische Anwendung
der Suppressor-tRNA als therapeutische Wirkstoffe für die Gentherapie
würde weitgehend
von der Entwicklung effizienter Vektoren abhängen, welche die Genexpression
aushalten können.
-
In
letzter Zeit haben sie als Werkzeuge gedient, um grundlegende biologische
Fragen, wie zum Beispiel die Untersuchung der Zell-Zell-Wechselwirkungen
während
der Entwicklung, zu behandeln (Kunes, S. & Steller, H., „Ablation of drosophila photoreceptor
cells by conditional expression of a toxin gene", Genes Develop 5, 970-983 (1991)),
oder dazu, unnatürliche
Aminosäuren
in-vivo lagespezifisch in Proteine einzubinden (Noren, C.J., Anthony-Cahil,
S.J., Griffith, M.C. & Schultz,
P.G., „A
general method for site-specific incorporation of unnatural amino
acids into proteins" Science
244, 182-188 (1989)). In Kombination mit elektrophysiologischen
Techniken, haben sie ein allgemeines Verfahren für Struktur-Funktionsstudien von Rezeptoren, Kanälen und
Transportern bereitgestellt (Nowak, M.W. et al., „Nicotinic
receptor binding site probed with unnatural amino acid incorporation
in intact cells",
Science 268, 439-442 (1995)).
-
Zusätzliche
Verwendungen der Erfindung können
die Verwendung der Suppressor-Oligonukleotid-tRNAs als auslösende Moleküle umfassen,
um ein inaktives Toxinmolekül
in ein aktives Toxinmolekül
umzuwandeln. Siehe zum Beispiel Robinson et al., „Suppression
of single and double nonsense mutations inducted into the diphteria
toxin A-Chain Gene: a potential binary system for toxin gene therapy", Human Gene Therapy
6:137-143 (Feb. 1995).
-
Des
Weiteren können
die Oligonukleotide der Erfindung verwendet werden, um lagegerichtete
Mutagenesen von Proteinprodukten in-vitro durch Einführung von
Missense-Mutationen in Genprodukte einzuleiten, um eine Struktur
und Funktionsbeziehungen zu identifizieren.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurden menschliche Opal-, Amber- und Ochre-Suppressor-Serin- und
-Arginin-tRNAs aufgebaut, die annähernd 100 Nukleotide lang sind
und in Zellen eingefügt
werden können,
um Mutationen zu unterdrücken,
die zu Nonsense-Codonen
führen,
wo ein Serin oder Arginin vorhanden sein sollte. Die Oligonukleotide
können
direkt in Empfängerzellen
eingefügt
oder hintereinander angebunden werden, um die Wirksamkeit der Oligonukleotide
zu steigern. In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Suppressor-tRNA
der Erfindung in die Zellen unter Verwendung herkömmlicher
Standard-Genmanipulationstechniken durch die Verwendung von Vektoren
eingefügt
werden. Wegen der internen Promotorsequenzen der tRNA-kodierenden
Sequenzen muss die tRNA-Sequenz nicht in eine separate Transkriptionseinheit
eingefügt
werden, obwohl eine bereitgestellt werden kann.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Nukleotidexpressionssystem der Erfindung innerhalb eines
geeigneten Gentransferüberträgers eingeschlossen,
welcher dann eingesetzt wird, um Zellen zu transduzieren, um die
Suppressor-tRNA zu exprimieren. Der Genzuführungsträger kann ein beliebiger Zuführungsträger sein,
der aus dem Stand der Technik bekannt ist, und er kann sowohl einfach
eine nackte DNA, die durch eine rezeptorvermittelte Transfektion
unterstützt
wird, als auch jeden aus einer Anzahl von Vektoren umfassen. Derartige
Vektoren schließen
ein, sind aber nicht begrenzt auf eukaryotische Vektoren, prokaryotische
Vektoren (wie zum Beispiel bakterielle Vektoren) und Virusvektoren,
die wiederum Retrovirusvektoren, Adenovirusvektoren, adeno-zugeordnete
Virusvektoren, Lentivirusvektoren (menschliche und andere, die schweineähnliche
umfassen), Herpesvirusvektoren, Epstein-Barr-Virusvektoren, SV40-Virusvektoren,
Poxvirusvektoren, Pseudotyp-Virusvektoren.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform,
wird eine Packungs-Zelllinie mit dem Virusvektor transduziert, der
eine Nukleinsäuresequenz
umfasst, die exprimiert werden soll, um eine Erzeugerzelllinie zu
bilden, die den Virusvektor umfasst. Die Erzeugerzellen können daraufhin
direkt verabreicht werden, wodurch die Erzeugerzellen Viruspartikel
entwickeln, die geeignet sind, die Empfängerzellen zu transduzieren.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform,
ist der Virusvektor ein Retrovirus- oder ein Adenovirusvektor. Beispiele
für Retrovirusvektoren,
welche eingesetzt werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf den Moloney-Murine-Leukemia-Virus, den Milz-Necrosis-Virus und
Vektoren, die von Retroviren, wie dem Rous-Sarcoma-Virus, dem Harvey-Sarcoma-Virus,
dem Avianleukosisvirus, dem menschlichen Immunodeficiencyvirus,
dem myeloproliferativen Sarcoma-Virus und dem Brusttumorvirus abgeleitet
sind.
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Retrovirusvektoren
sind als Wirkstoffe nützlich,
um einen retroviral-vermittelte
Gentransfer in eukaryotische Zelle zu vermitteln. Retrovirusvektoren
sind allgemein so aufgebaut, dass die Mehrheit der Sequenzen, die
für die
Strukturgene des Virus kodieren, gelöscht und durch das Gen/die
Gene von Interesse ersetzt werden. Am häufigsten werden die Strukturgene
(das heißt,
gag, pol und env) von dem Retrovirus-Rückgrat entfernt, indem man
Genmanipulationstechniken aus dem Stand der Technik einsetzt. Das
kann eine Digestion mit der passenden Restriktionsendonuklease oder
in einigen Fällen
mit Bal 31-Exonuklease, um Fragmente zu erzeugen, die entsprechende
Teile des Packungs-Signals enthalten, umfassen.
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Diese
neuen Gene wurden in das provirale Rückgrat in verschiedenen allgemeinen
Wegen eingebunden. Die unkompliziertesten Aufbauten sind solche,
in denen die Strukturgene des Retrovirus durch ein einzelnes Gen
ersetzt werden, welches anschließend unter der Kontrolle der
viralregulativen Sequenzen innerhalb der langen terminalen Wiederholung
(long terminal repeat, LTR) transkribiert wird. Es sind auch retrovirale
Vektoren aufgebaut worden, welche mehr als ein Gen in die Zielzellen
einfügen
können.
Normalerweise ist in derartigen Vektoren ein Gen unter der regulativen
Kontrolle der viralen LTR, während
das zweite Gen entweder aus einer verbundenen Nachricht exprimiert
wurde oder unter der Steuerung seines eigenen inneren Promotors
ist.
-
Die
Bemühungen
sind auf die Minimierung der viralen Komponente des Virus-Rückgrates
gerichtet worden, größtenteils
in einer Bemühung,
die Chance für
eine Rekombination zwischen dem Vektor und dem packungsgestörtes Helfervirus
innerhalb der Packungs-Zellen
zu reduzieren. Ein packungsgestörtes
Helfervirus ist notwendig, um die Strukturgene eines Retrovirus
bereitzustellen, der vom Vektor selbst zerstört worden ist.
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In
einer Ausführungsform
kann der Retrovirusvektor einer aus einer Serie von Vektoren sein,
die in Bender et al., J. Virol. 61:1639-1649 (1987) beschrieben
sind, basierend auf einem N2-Vektor (Armentano, et al., J. Virol.,
61:1647-1650), der eine Reihe von Löschungen und Substitutionen
enthält,
um die Homologie zwischen dem Vektor und den Packungs-Systemen auf
ein absolutes Minimum zu reduzieren. Diese Änderungen haben auch die Wahrscheinlichkeit
verringert, dass Virus-Proteine exprimiert würden. Im ersten dieser Vektoren,
LNL-XHC, wurde durch
eine lage-gerichtete Mutagenese das natürliche ATG Start-Codon von
gag zu TAG geändert,
um dadurch eine unerwünschte
Proteinsynthese von dieser Stelle zu entfernen.
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In
dem Moloney-Murine-Leukämie-Virus
(MoMuLV), 5' bis
zum authentischen gag-Start, existiert ein offenes Leseraster, welches
die Expression eines anderen glycosylierten Proteins (pPr80gag) ermöglicht.
Das Moloney-Murine-Sarcoma-Virus (MoMoSV) hat Veränderungen
in dieser 5' Region,
die eine Rasterverschiebung und Verluste von Glycolysationsorten
einschließen,
welche eine potentielle Expression der Aminoendstelle von pPr80gag vermeidet. Deshalb wurde der Vektor LNL6
hergestellt, der sowohl die geänderte
ATG von LNL-XHC als auch den 5' Teil
von MoMOSV einbezogen hat.
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Die
5'-Struktur der
LN-Vektorreihe eliminiert somit die Möglichkeit der Expression der
retroviralen lesenden Raster mit der anschließenden Produktion viraler Antigene
in genetisch transduzierten Zielzellen. In einer letzten Änderung,
um einen Überlapp
mit dem packungsdefekten Helfervirus zu verringern, hat Miller zusätzliche
env-Sequenzen, die unmittelbar der 3' LTR in dem LN-Vektor vorausgehen, entfernt
(Miller, et al., Biotechniques, 7:980-990, 1989).
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Das
wichtigste Erfordernis, das durch jedes Gentransfersystem für seine
Anwendung auf die Gentherapie erfüllt sein muss, ist Sicherheit.
Sicherheit wird durch die Kombination der Vektorgenomstruktur zusammen
mit dem Packungs-System erreicht, die für die Produktion des infektiösen Vektors
verwendet wird. Miller et al. haben die Kombination des pPAM3-Plasmids
(das packungsgestörte
Helfergen) für
die Expression retroviraler Strukturproteine zusammen mit der LN-Vektor-Serie
entwickelt, um ein Vektor-Packungs-System
zu bilden, wo die Generation eines rekombinanten Wild-Typ-Retrovirus
durch die Entfernung fast aller Rekombinationsorte zwischen dem
Vektorgenom und dem packungsgestörten
Helfergen auf ein Minimum reduziert wird (d. h. LN mit pPAM3).
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In
einer Ausführungsform
kann der Retrovirusvektor ein Moloney-Murine-Leukemia-Virus der LN-Serie von
Vektoren sein, wie zum Beispiel jene hierin oben erwähnten, und
darüber
hinaus die in Bender, et al. (1987) und Miller, et al. (1998) beschriebenen.
Diese Vektoren haben einen Teil des Packungs-Signals von einem Maus-Sarcom-Virus erhalten
und ein mutiertes gag-Anfangs-Codon. Der Ausdruck „mutiert", wie er hier verwendet
wird, bedeutet, dass das gag-Anfangs-Codon entfernt worden oder
so verändert
worden ist, dass das gag-Protein oder Fragmente oder Verkürzungen
desselben nicht exprimiert werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann der Retrovirusvektor mindestens vier klonende Orte oder Restriktionszymerkennungsorte
einschließen,
bei denen mindestens zwei dieser Orte eine durchschnittliche Entstehungsfrequenz
in eukaryotischen Genen von weniger als einmal in 10.000 Basenpaaren
haben; d. h., das Restriktionsprodukt hat eine durchschnittliche
DNA-Größe von mindestens
10.000 Basenpaaren. Bevorzugte Klonorte werden aus einer Gruppe,
die Notl, SnaBl, Sall und Xhol umfasst, ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Retrovirusvektor jede dieser Klonorte.
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Wenn
ein Retrovirusvektor, der solche Klonorte umfasst, eingesetzt wird,
kann auch ein Pendelklonvektor [engl.: shuttle cloning vector] bereitgestellt
werden, der mindestens zwei Klonorte aufweist, die zu mindestens
zwei Klonorten kompatibel sind, welche aus einer Gruppe umfassend
Notl, SnaBl, Sall und Xhol, die an dem Retrovirusvektor angeordnet
sind, ausgewählt
werden. Der Pendelklonvektor schließt auch mindestens ein gewünschtes
Gen mit ein, welches dazu geeignet ist, dass es von dem Pendelklonvektor
zum Retrovirusvektor transferiert werden kann.
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Der
Pendelklonvektor kann von einem Basis-„Rückgrat"-Vektor oder -Fragment hergestellt werden,
an denen ein oder mehrere Verknüpfer
angebunden werden, welche Klone oder Restriktionsenzym-Erkennungs-Orte einschließen. Eingeschlossen
in die Klonorte sind die kompatiblen oder die komplementären Klonorte,
die hierin oben beschrieben worden sind. Die Gene und/oder Promotoren,
die Enden haben, die den Restriktionsorten des Pendelvektors entsprechen,
können
in den Pendelvektor durch Techniken, die aus dem Stand der Technik
bekannt sind, eingebunden werden.
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Der
Pendelklonvektor kann eingesetzt werden, um DNA-Sequenzen in prokaryotischen
Systemen zu verstärken.
Der Pendelklonvektor kann aus Plasmiden, die allgemein in prokaryotischen
Systemen und insbesondere in Bakterien verwendet werden, bereitgestellt
werden. Daher kann der Pendelklonvektor beispielsweise von Plasmiden,
wie von pBR322; pUC 18; etc abgeleitet werden.
-
Der
Vektor schließt
einen oder mehrere Promotoren ein. Geeignete Promotoren, die verwendet
werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf einen Retrovirus-LTR; den SV40-Promotor und den menschlichen
Zytomegalovirus-(CMV)-Promotor, der in Miller et al., Biotechniques,
7:(9):980-990 (1989) beschrieben ist, oder jeden anderen Promotor
(beispielsweise zelluläre
Promotoren, wie eukaryotische zelluläre Promotoren, die umfassen,
aber nicht begrenzt sind auf die Histon-, pol III-, und β-Aktin-Promotoren).
Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, schließen ein,
sind aber nicht begrenzt auf Adenovirus-Promotoren, TK-Promotoren und B19-Parvovirus-Promotoren.
Die Auswahl eines geeigneten Promotors wird für Fachleute aus der hierin
enthaltende Lehre offensichtlich sein.
-
Anschließend wird
der Vektor eingesetzt, um eine Packungs-Zelllinie zu transduzieren,
um eine Produzenten-Zelllinie auszubilden. Beispiele für Packungs-Zellen,
die transfiziert werden können,
umfassen, sind aber sind nicht beschränkt auf PE501, PA317, ψ2, ψ-AM, PA12, T19-14X,
VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86,
GP+envAM12 und DAN-Zelllinien. Der Vektor, der die Nukleinsäuresequenz
enthält,
welche den Wirkstoff kodiert, der dazu geeignet ist, die Hemmung,
Prävention
oder Zerstörung
des Tumorzellenwachstums bei Expression der Nukleinsäuresequenz,
die den Wirkstoff kodiert, zur Verfügung zu stellen, kann die Packungs-Zellen durch jedes
Mittel, das aus dem Stand der Technik bekannt ist, transduzieren.
Solche Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Elektroporation, die
Verwendung von Liposomen und CaPO4-Ablagerung.
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Die
Erzeugerzellen werden anschließend
unmittelbar an oder benachbart zu den gewünschten Empfängerzellen
verabreicht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Erfindung einen Virusvektor, der üblicherweise Menschen und eine
Packungs-Zelllinie menschlichen Ursprungs infiziert. Beispielsweise
können
Vektoren, die von Viren, die üblicherweise
Menschen infizieren, wie zum Beispiel dem Herpes-Virus, dem Epstein-Barr-Virus,
abgeleitet sind, eingesetzt werden, welche keine aktive α-Galactosyl-Hülle exprimieren.
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In
einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor
einen Herpes-Simplex-Virus-Plasmid-Vektor. Es wurde gezeigt, dass
der Herpes-Simplex-Virus-Typ-1 (HSV-1) ein potenziell nützliches Genüberträger-Vektor-System
für die
Gentherapie ist (Glorioso, J.C., „Development of Herpes Simplex
Virus Vectors for Gene Transfer to the Central Nervous System. Gene
Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer", Jon A. Wolff, Herausgeber,
1994 Birkhauser Boston, 281-302; Kennedy, P.G., "The Use of Herpes Simplex Virus Vectors
for Gene Therapy in Neurological Diseases", Q J Med, Nov. 1993, 86(11):697-702;
Latchman, D.S., "Herpes
Simplex Virus Vectors for Gene Therapy", Mol Biotechnol, Oct. 1994, 2(2):179-95.
-
HSV-1-Vektoren
sind für
die Übertragung
von Genen auf einen Muskel eingesetzt worden (Huard, J., „Herpes
Simplex Virus Type 1 Vector Mediated Gene Transfer to Muscle", Gene Therapy, 1995,
2, 385-392; und Gehirn, Kaplitt, M. G., "Preproenkephalin Promoter Yields Region-Sprecific
and Long-Term Expression in Adult Brain After Direct In-vivo Gene
Transfer Via a Defective Herpes Simplex Viral Vector", Proc Natl Acad
Sci USA, Sep 13, 1994, 91(19):8979-83) und sie sind für Behandlungen
mausartiger Gehirntumore eingesetzt worden (Boviatsis, E.J., "Long-Term Survival
of Rats Harboring Brain Neoplasms Treated With Ganciclovir and a Herpes
Simplex Virus Vector That Retains an Intact Thymidine Kinase Gene", Cancer Res, Nov
15, 1994, 54(22):5745-51; Mineta, T., "Treatment of Malignant Gliomas Using
Ganciclovir-Hypersensitive, Ribonucleotide Reductase-Deficient Herpes
Simplex Viral Mutant",
Cancer Res, Aug 1, 1994, 54(15):3963-6).
-
Helfervirusabhängige, minivirale
Vektoren sind für
eine einfachere Handhabung und wegen ihrer Kapazität für einen
größeren Eintrag
(bis zu 140 kb) entwickelt worden, Geller, Al, „An Efficient Deletion Mutant Packaging
System for Defective Herpes Simplex Virus Vectors: Potential Applications
to Human Gene Therapy and Neuronal Physiology", Proc Natl Acad Sci USA, Nov 1990,
87(22):8950-4; Frenkel, N., „The
Herpes Simplex Virus Amplicon: A Versatile Defective Virus Vector", Gene Therapy. 1.
Supplement 1, 1994. Replikationsunfähige HSV-Ampliconen wurden
im Stand der Technik aufgebaut, ein Beispiel ist der pHSVIac-Vektor durch
Geller et al., Science, 241, Sept. 1988, der hierin durch Bezugnahme
eingebunden wird. Diese HSV-Ampliconen enthalten erhebliche Streichungen
des HSV-Genoms, um Raum für
die Einbringung einer exogenen DNA zu schaffen. Üblicherweise umfassen sie den
HSV-1-Packungsort, den HSV-1-"ori
S"-Replikationsort
und die IE 4/5 Promotor-Sequenz. Diese Virionen sind für die Übertragung
von einem Helfer-Virus abhängig.
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Hauptsächlich wurden
zwei Arten von veränderten
Helferviren entwickelt, um eine Rekombination zu minimieren. Andere
komplementäre
HSV-Helfervirus-Systeme sind hierin genannt und sind innerhalb des Handlungsspielraums
von Fachleuten. Ein solches System, das entwickelt wurde, ist ein
temperaturempfindlicher Mutant. Ein HSV-temperaturempfindlicher
(TS) Mutant wurde mit einer TS-Mutation
in dem IE3-Gen entwickelt (Davison et al, 1984, J. Gen. Virol.,
65:859-863) Demzufolge hat dieses Virus einen IE-Phänotyp, repliziert
keine DNA, ändert
die zelluläre
Physiologie nicht signifikant und produziert keinen Virusabkömmling bei 37°C. Das Virus
ist bei einer erlaubten Temperatur von 37°C gewachsen. TS-Mutanten haben
jedoch eine Tendenz gehabt, zum Wild-Typ zurückzukehren.
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Im
Gegensatz dazu ist ein zweites Helfervirus-System ein Löschungsmutant,
bei dem die Mehrheit der IE3-Gene einfach gelöscht ist. Diese kehren nicht
zum Wild-Typ zurück.
Daher sind HSV-1-Vektoren, die gepackt sind, in dem sie einen Löschungsmutanten
als Helfervirus verwenden, die bevorzugtesten Helferviren der Erfindung.
Siehe zum Beispiel: Patterson et al., 1990, J. Gen. Virol., 71:1775-1783.
Andere replikations-unfähige
Helferviren können
eingesetzt werden und ein Fachmann wird erkennen, dass andere Mutationen
in den IE-Genen oder in anderen Genen, welche zu einem replikationsunfähigen Helfervirus
führen,
welches die passende Replikation und Expressionsfunktionen zur Verfügung stellen
wird, und welche mit der Helferzelllinie und Vektor koordiniert
sind, innerhalb dieser Erfindung in Betracht gezogen sind. Jede
Zelllinie kann für
diesen Schritt eingesetzt werden, solange sie geeignet ist, das
IE3- oder ein replikationsabhängiges
Gen zu exprimieren oder eine Helferzelllinie zu erhalten, die bereits
transformiert wurde und kommerziell erhältlich ist. Jede Zelllinie
kann verwendet werden, indem man pHE und das Plasmid, das gleichzeitig
das IE3-Gen enthält,
einführt.
Als nächstes
wird der Vektor der Helferzelllinie durch Elektroporation, Calciumphosphat-DNA-Transfektion oder
ein anderes passendes Verfahren geliefert. Jede Zelllinie kann verwendet
werden, indem man pHE und das Plasmid, das gleichzeitig das IE3-Gen
enthält,
einführt.
Als nächstes
werden die Zellen mit einem Helfervirus-IE3-Zerstörungsmutanten
oder einem anderen geeigneten Zerstörungsmutanten, der replikationsunfähig ist,
infiziert. Das IE3-Gen oder ein anderes derartiges Gen in der Helferzelllinie
ergänzen
das Helfervirus, was zu einer produktiven HSV-1-Infektion führt, und
das erhaltene Virusmaterial umfasst HSV-1-Partikel, die entweder eine Vektor-DNA
oder eine Helfervirus-DNA enthält,
von denen alle replikationsunfähig
sind. Weitere Informationen über
Helferzelllinien und das Verfahren sind in Geller et al., PNAS,
87:8950-8954, November 1990, „An
Efficient Deletion Mutant Packaging System for Defective Herpes
Simplex Virus Vectors: Potential Applications to Human Gene Therapy
and Neuronal Physology" offenbart.
Die Erfindung umfasst einen HSV-Mini-Vektor, der einen replikationsunfähigens HSV-Amplicon
mit anderen viralen Sequenzen, beispielsweise mit denen des Epstein-Barr-Virus,
des menschlichen Papillomavirus, oder des Rinder-Papillomavirus Typ
1, kombiniert, welche es ermöglichen,
den Vektor in der Zelle in episomaler Form beizubehalten, um einen zehnfach
größeren Titer
und eine sehr große
DNA-Einfügekapazität zu erhalten.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst einen helfervirusabhängigen Mini-Virusvektor,
umfassend: (a) die HSV-1, „a" Sequenz für das Packungs-/Teilungs-Signal
und einen „ori
S" Replikationsursprung
für die
Replikationspackung des Plasmids (als Antwort auf Signale vom Helfervirus,
zu replizieren und zu packen); (b) ein Epstein-Barr-Virus-(EBV)-Nuklear-Antigen-(EBNA-1)-Gen
und einen EBV-latenten Replikationsursprung (ori P), der es dem
Vektor ermöglicht,
dass er in episomaler Form innerhalb des Kerns für eine Replikation ohne Integration
zum Wirtsgenom und so für
eine Replikation in jeder von zwei sich teilenden Zellen beibehalten
wird; vorzugsweise (c) Gene von prokaryotischen Zellen für eine Propagation
des Vektors in E. coli (ein auswählbares
Markergen wie zum Beispiel das Ampizilin-resistente oder Tetrazyklin-resistente Gen
und das col. E1 ori); und (d) eine Sequenz, die eine Nonsense-Suppressor-tRNA kodiert.
Optional kann der Vektor auch prokaryotische Gene umfassen, die
einen auswählbaren
Marker, wie zum Beispiel die Gene für eine positive Hygromycin-Auswahl
zur Verfügung
stellen. So beschrieben in US-Patent Nummer 5,830,727, das hierin
durch Bezugnahme eingebunden wird.
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In
dieser besonderen Ausführungsform
wird die Packungs-Funktion der Mini-Vektor-DNA in Herpes-Simplex-virale
Kapside durch ein Helfervirus und eine Helferzelllinie bereitgestellt.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
kann der HSV-Vektor so aufgebaut werden, dass er einen helferfreien
Virusvektor produziert, wie in Mann et al., „Construction of a Retro-Virus
Packaging Mutant and its Use to Produce Helper-Free Defective Retrovirus", 33 Sal., p. 153-159,
May 1983, Jounal of Virology, September 1989, pp. 3822-3829, September 1989;
Samulski „Helper
Free Stocks of Recombinant Adeno-Associated Viruses: Normal Integration
Does Not Require Viral Gene Expression"; and Kohn et al., "High Efficiency Gene Transfer Into Mammalian
Cells: Generation of Helper-Free Recombinant Retrovirus With Broad
Mammalian Host Range",
PNAS, 81:6349-6353, October 1984 beschrieben. Siehe auch Okasinki,
US-Patent-Nr. 4,970,155 "HSV
HELPER VIRUS INDEPENDENT VECTOR",
das hierin durch Bezugnahme eingebunden werden.
-
Gemäß der Erfindung
wurden verschiedene tRNA-synthetische Suppressoren synthetisiert,
einschließlich
einer menschlichen Ochre-Suppressor-Serin-tRNA
(SEQ ID NO:1), einer menschlichen Amber-Suppressor-Serin-tRNA (SEQ ID NO:2),
einer menschlichen Serin-Opal-Suppressor-tRNA
(SEQ ID NO:3) und einer menschlichen Opal-Suppressor-Arginin-tRNA (SEQ ID NO:4).
Es wurde gezeigt, dass diese Oligonukleotide als aktive Suppressor-tRNAs
in menschlichen Zellen funktionieren, die ein Durchlesen von Nonsense-Mutationen
zur Verfügung
stellen. Die Erfindung schließt
daher diese Oligonukleotide sowie funktionale Äquivalente derselben mit ein.
Vektoren sind ebenfalls aufgebaut worden, welche die Oligonukleotide
einschließen
und erfolgreich an Empfängerzellen
gemäß der Erfindung
liefern, welche die pHEhargsuptRNAopal einschließen.
-
Sowohl
der Aufbau von zusätzlichen
Oligonukleotiden auf Basis der Lehre hierin als auch die Nukleotidabgabeträger, die
dieselben einschließen,
sind einfach eine Optimierung von Routine-Versuchsverfahren und sollen innerhalb
des Schutzbereichs dieser Erfindung sein.
-
Alle
hierin zitierten Referenzen werden hiermit ausdrücklich in ihrer Gesamtheit
durch Bezugnahme eingefügt.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die hier beschriebene Lehre
zu erläutern
und sind nicht dazu gedacht, die Erfindung in irgendeiner Weise
zu beschränken.
-
Beispiele
-
Xeroderma
pigmentosum (XP) ist eine autosomale rezessive Erkrankung mit einer
ausgeprägten
Prädisposition
zu sonnenlichtinduziertem Hautkrebs und anderen neurologischen Abnormalitäten, (Cleaver,
J.E., „Defective
repair replication of DNA in xeroderma pigmentosum", Nature 218, 652-656
(1968)). Diese Erkrankung ist durch eine extreme Empfindlichkeit
auf ultraviolette Strahlung und fehlerhafte DNA-Nukleotid-Exision-Reparatur
(NER) gekennzeichnet, (Hanawalt, P.C., „DNA repair comes of age", Mutation Res 336,
101-113 (1995);
Copeland, N.E., Hanke, C.W. & Michalak,
J.A., „The
molecular basis of xeroderma pigmentosum", Dermatol Surg 23, 447-455 (1997)). Zellfusionsstudien,
um DNA-Reparaturdefekte zu ergänzen,
haben zur Identifikation von sieben genetischen Ergänzungsgruppen
von XP geführt,
die als XPA-XPG bezeichnet werden (Cleaver, J.E. & Kraemer, A.L., „Xeroderma
Pigmentosum", The
Metabolic Basis of Inherited Disease Vol. II" (eds Scriver, C.R., L., B.A., Sly,
W.S. & Valle,
D.) 2949-2971 (McGraw-Hill, New York, 1989)), was andeutet, dass
mindestens sieben unterschiedliche Genprodukte in den NER-Weg eingebunden
sind. Alle der relevanten menschlichen Gene (XPA, XPB, XPC, XPD,
XPE, XPF und XPG) wurden identifiziert und auf bestimmte chromosomale
Orte abgebildet, (Cleaver, J.E. & Kraemer,
A.L., „Xeroderma
Pigmentosum", The
Metabolic Basis of Inherited Disease Vol. II" (eds Scriver, C.R., L., B.A., Sly,
W.S. & Valle,
D.) 2949-2971 (McGraw-Hill, New York, 1989); Tanaka, K. et al., "Analysis of a human
DNA excision repair gene involved in group A xeroderma pigmentosum
and containing a zinc-finger domain", Nature 348 73-78 (1990); Satokata,
I., Iwai, K., Matsuda, T., Okada, Y. & Tanaka, K., "Genomic characterization of the human
DNA excision repair-controlling gene XPAC", Gene 136, 345-348 (1993); Boulikas,
T., "Xeroderma pigmentosum
and molecular cloning of DNA repair genes", Anticancer Res 16, 693-708 (1996)).
Das Klonen und Charakterisieren dieser DNA-Reparaturgene hat das
Verständnis
der NER-Mechanismen und der Beziehung zwischen NER-Molekulardefekten
und den klinischen Erscheinungsformen der XP-Erkrankungen stark
verbessert, (Nishigori, C., Moriwaki, S.-i., Takebe, H., Tanaka,
T. & Imamura,
S., „Gene
alterations and clinical characteristics of xeroderma pigmentosum
group A patients in Japan",
Arch Dermatol 130, 191-197 (1994)). Diese Erkrankung wurde ausgewählt, um
den neuen genetischen Ansatz zur Korrektur des erkrankten Phänotyps zu
zeigen.
-
Ein
herkömmlicher
Ansatz, um den XP-Phänotypdefekt
zu korrigieren würde
sein, relevante DNA-Reparatur-Gene in Zellen, die von XP-Patienten abgeleitet
sind, einzuführen.
Verschiedene in-vitro Studien haben die Wiederherstellung eines
herkömmlichen
DNA-Reparatur-Phänotyps und
ein verbessertes Überleben nach
einer UV-Bestrahlung
von XP-Zellen, welche der Expression des herkömmlichen DNA-Reparatur-Gens folgt,
gezeigt (Mezzina, M. et al., „Correction
by the ERCC2 gene of UV sensitivity and repair deficiency phenotype
in a subset of trichothiodystrophy cells", Carcinogenesis 15, 1493-1498 (1994);
Gozukara, E.M. et al., „The
human DNA repair gene, ERCC2 (XPD), corrects ultraviolet hypersensitivity
and ultraviolet hypermutability of a shuttle vector replicated in
Xeroderma pigmentosum",
Cancer Res 54, 3837-3844 (1994); Levy, D.D., Saijo, M., Tanaka,
K., Kraemer, K.H., „expression
of a transfected DNA repair gene (XPA) in xeroderma pigmentosum
group A cells restores normal DNA repair and mutagenesis of UV-treated plasmids", Carcinogenesis
16, 1557-1563 (1995); Yagi, T. et al., "Complete restoration of normal DNA repair
characteristics in group F xeroderma pigmentosum cells by over-expression
of transfected XPF cDNA",
Carcionogenesis 19, 55-60 (1998)). Andere Forscher haben den Defekt
durch Einfügen
von DNA-Reparaturgenen von anderen Organismen, wie von Mäusen, Hefe
und Drosophila, ergänzt.
(Tanaka, K., Satokata, I., Ogita, Z., Uchida, T. & Okada, Y., „Molecular
cloning of mouse DNA repair gene that complements the defect of
group-A xeroderma pigmentosum",
Proc Natl Acad Sci, USA, 86, 5512-5516 (1989); Lambert, C., et al., "A yeast DNA repair
gene partially complements defective excision repair in mammalian
cells", EMBO J 7,
3245-3253 (1988); Shimamoto, T., et al., "Expression and functional analyses of
the Dxpa gene the drosophila homolog of the human excision repair gene
XPA", J Biol Chem
270, 22452-22459 (1995)). Ein weiterer nützlicher Ansatz wäre, den
genetischen Defekt in dem DNA-Reparaturgen oder seine Transkription
zu korrigieren und einen normalen Phänotyp wiederherzustellen. Molekulargenetische
Studien haben neue Löschungen,
Verbindungen-, Punktmutationen und Nonsense-Mutationen in dem XP-Gruppe-A-komplementären (XPAC)
Gen definiert, (Satokata, I. et al., „Characterization of a slicing
mutation in group A xeroderma pigmentosum", Proc Natl Acad Sci, USA 87, 9908-9912 (1990);
Satokata, I. et al., „Three
nonsense mutations responsible for group A xeroderma pigmentosum", Mutation Res 273,
193-202 (1992); Satokata, I., Tanaka, K. & Okada, Y., „Molecular basis of group
A xeroderma pigmentosum: a missense mutation and two deletions located
in a zinc finger consensus sequence of the XPAC gene", Hum Genet 88, 603-607
(1992); Satokata, I., Tanaka, K., Yuba, S. & Okada, Y., "Identification of splicing mutations
of the last nucleotides of exons a nonsense mutation and a missense
mutation of the XPAC gene as causes of group A xeroderma pigmentosum", Mutation Res 273,
203-212 (1992)). Der durch Nonsense-Mutationen verursachte genetische
Defekt könnte
durch Expression von Suppressor-tRNAs behoben werden, die das verfrühte Terminationssignal
erkennen, was gemäß der Lehre
der vorliegenden Erfindung zur Einbringung ihrer jeweiligen Aminosäure und
zur Wiederherstellung des normalen Phänotyps führt.
-
Materialien
und Verfahren
-
Zelllinien.
Eine DNA-reparaturfähige
menschliche Fibroblast-Zelllinie (VA13, eine SV40, die eine menschliche
W138 Fibroblast-Zelllinie transformiert, ATCC, Gaithersburg, MD)
und eine SV40 transformierte Zelllinie, die bei einem XP-Patienten
nachgewiesen wurde (XP12ROSV; eine Art Geschenk von Dr. Tanaka, Japan),
wurde zur Studie verwendet. Die Zellen, wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagles's-Medium (DMEM; Gibco
BRL, Gaithersburg, MD) gezüchtet,
das mit 1 % Glutamin und 10 % fetalem RInder-Serum (DIV Medium)
ergänzt
wurde. Die Zellen wurden bei 37°C
in einem befeuchteten CO2-Brutschrank gezüchtet. E5-Helferzellen
sind grüne
Affennierenzellen, die das IE3-Gen exprimieren und die Replikation des
IE3-gelöschten
Helfervirus (freundlicherweise von P. Johnsen, San Diego bereitgestellt)
ermöglichen.
-
Transfektion.
Unter Verwendung einer FuGENE 6 Reagenz (Boehringer Mannheim, Deutschland) wurde
die Transfektion nach Herstelleranweisungen mit geringen Modifkationen
durchgeführt.
Zellen (~1.5-2 × 105) wurden in 60 mm Gewebekultur-Platten ausgesät und es
wurde ihnen gestattet, sich für
16-20 Stunden anzusetzen. Eine FuGENE 6 Transfektions-Reagenz (12 μl) wurde
für 5 Minuten
bei Raumtemperatur (RT) in einem 88 μl opti-MEM-Medium (Gibco BRL.)
gereift, dann zu der Plasmid-DNA (4 μg) hinzugefügt und weitere 15 Minuten bei
Raumtemperatur gereift. Diese Transfektions-Mischung wurde den Zellen, die in dem
fertigen DMEM-Medium (2 ml) gewachsen sind, hinzugefügt. Nach
14-16 Stunden bei 37°C
wurden die Zellen einmal mit einer ausgewogenen Hanks-Salzlösung gewaschen
(HBSS) und dann mit dem kompletten Medium gespeist und weiter bei
37°C für eine Gesamtzeit
von 72 Stunden nach der Transfektion gereift. Transfizierte Zellen
wurden in Gegenwart von Hygromycin (100-150 μg/ml) ausgewählt.
-
Aufbau
einer menschlichen Ariginin-Opal-Suppressor-tRNA (hargsup tRNAOpal) und Subklonen in einen Herpes-Simplex-Virus
(HSV-Amplicon-Vektor). Auf Basis der beschriebenen Nukleotidsequenz
menschlicher Ariginin-tRNA-Gene (Buckland RA et al., „A cluster
of tRNA genes into [DRNI, TRR3, DDRAN] on the short arm of human
chromosome 6", Genomics,
35 164-171 (1996)), wurde die Arginin-Opal-Suppressor-tRNA aufgebaut,
die die Struktur-Sequenzen
enthielt, welche die tRNA-Moleküle
und 15 Basen der 3' flankierenden Region
kodiert. Die 3' flankierende
Region enthält
Cluster von T-Residuen in dem nicht-kodierenden Strang, die als
Signal agieren, um die Transkription zu beenden. Die Sequenz (nicht-kodierender Strang)
und die Kleeblattstrukur der menschlichen Arginin-tRNA ist so, wie
in 2A gezeigt. Ein einzelner Basenwechsel (gezeigt durch
den * in 2A) in dem Anti-Codon wurde
eingefügt,
um die menschliche Arginin-tRNA in eine Opal-Suppressor tRNA umzuwandeln. Ein Paar
von überlappenden
Oligonukleodiden: 5'-GCGCTCGAGAAAACGAAC
CCCACTTAACCACGAAGGGATTCGAACCCTCAATCTTCTGATC-3' und
5'-GCGGGT ACCGACCACGTGGCCTAATGGATAAGGCGTCTGACTTCAGATCAGAA
GATTGAGGG-3' (synthetisiert
von Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) wurden geglüht und eingefüllt, indem
man ein T7-DNA-Polymerase-(Sequenzse
Version 2, United States Biologicals) Enzym und eine Reaktionsmischung,
die alle vier Deoxynukleotide enthält, verwendet. Das Doppelstrang-Oligonukleotid
wurde mit Kpn I/Xho I digeriert und an denselben Restriktionsorten
in einen HSV-Amplicon-Vektor
ligiert (Wang, S., Young, W.-B., Jacobsen, C. & Link, C.J., „A novel Herpesvirus amplicon
system for in-vivo gene therapy",
Gene Ther 4, 1132-1141 (1997)), der modifiziert wurde, um den CMV-Promotor und die
Poly-A-Sequenzen zu entfernen. Der resultierende Expressionsvektor
pHEhargsup tRNAOpal ist so, wie in 2B gezeigt.
Der Expressionsvektor enthält
eine EBV-ori P- und EBNA-Sequenz, um das Plasmid episomal und ein
Hygromycin-resistentes Gen beizubehalten, um eine Auswahl transfizierter
Säugetierzellen
zu ermöglichen.
Das Plasmid enthält
auch den HSV-1-lytischen Replikationsursprung (ori S) und einen
HSV-1 Abschluss, der „A"-Sequenzen für eine Replikation und Packung
in HSV-Virionen in Gegenwart eines ausführenden Helfervirus packt (Wang,
S., Young, W.-B., Jacobsen, C. & Link,
C.J., „A
novel Herpesvirus amplicon system for in-vivo gene therapy", Gene Ther 4, 1132-1141
(1997); Spaete, R.R. & Frenkel,
H., „The
herpes simplex virus amplicon: A new eucaryotic defective-virus
cloning-amplifying vector",
Cell 30, 295-304 (1982); Wang, S. & Vos, J., „A hybrid infectious vector based on
Epstein-Barr virus and Herpes simplex virus type I for gene transfer
into Human Gene",
J Virol 70, 8422-8430 (1996)).
-
Einführung einer
Opal-(TGA)-Mutation bei einer festgelegten Position innerhalb eines
humanisierten, rot-verschobenen, grün-fluoreszenten Protein-(hRGFP)-Gens.
Eine Opal-Mutation wurde an der Position Arg(CGC)73Opal(TGA) in
das hRGFP-Gen eingeführt
(Levy, J.P., Muldoon, R.R., Zolotukin, S. & Link, C.J., „Retroviral transfer and expression
of humanized, red shifted green fluoescent protein into human tumor
cells", Nature Biotechnol
14, 610-614 (1996)). Die Mutation wurde durch PCR eingeführt und
aufgereiht, um die Mutation zu bestätigen. Das opal-mutierte hRGFP
wurde in den pHE700-HSV-Amplicon-Vektor subgeklont [engl.: subcloned]
(Wang, S., Young, W.-B., Jacobson, C. & Link, C.J., „A novel Herpesvirus amplicon
system for in-vivo gene therapy",
Gene Ther 4, 1132-1141 (1997)) unter der Kontrolle des CMV Promotors
(mnRGFP).
-
Northern-Analyse.
Die gesamte RNA wurde von gezüchteten
Zellen durch Verwendung der RNeasy-Total-RNA-Ausrüstung (Qiagen,
Santa Clarita, CA) isoliert. RNA-Proben (10 g) wurden mittels Elektrophorese
durch 1 % Formaldehyd-Agarose-Gele getrennt und auf Nytran-Membran-Filter
transferiert (Schleicher & Schuell,
Keene, NH). Die Filter wurden für
2 Stunden bei 42°C
in einer Hybrisol-1-Lösung (Oncor,
Gaithersburg, MD) vor-hybridisiert und anschließend über Nacht bei 42°C mit Sonden,
die mit a (Aktinson, J. & Martin, R., „Mutations
to nonsense codons in human genetic disease: implications for gene
therapy by nonsense suppressor tRNAs", Nucleic Acids Res 22, 1327-1334 (1994))
PdCTP gekennzeichnet sind, unter Verwendung der Random-Primed-DANN-Kennzeichnungsausrüstung (Boehringer
Mannheim) hybridisiert. Die Filter wurden zweimal mit 2 × SSC, 0,1
% SDS bei Raumtemperatur (RT), dann mit 0,1 × SSC und mit 0,1% SDS bei
55°C für 30 Minuten
gewaschen und autoradiographiert.
-
Western-Analyse.
Die gezüchteten
Zellen wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen
und anschließend
in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1 % Nonidet P-40, 0,1 %
SDS lysiert und enthalten als Proteasehemmstoffe Phenylmethylsulfonylfluorid
(100 μg/ml),
Aprotinin (1 μg/ml)
und Leupeptin (1 μg/ml).
Das Zelllysat, wurde auf Eis für
20 Minuten herangezüchtet,
bei 10.000 × g
für 10
Minuten bei 4°C
zentrifugiert und das Überschüssige wurde
gesammelt. Proben (30μg)
wurden mit einem 6 μl
oder einem 5 × Probenpuffer
(Laemmli, 1970) gemischt, für
3 Minuten gekocht und durch SDS-PAGE getrennt. Proteinproben wurden
auf Nitrozellulosemembran elektroblotiert und mit speziellen Antikörpern untersucht.
Die GFP- und XPAC-Proteine wurden durch erweiterte Chemilumineszenz
(Amersham, England) detektiert, indem man Anti-GFP (Clontech, Palo
Alto, CA) beziehungsweise Anti-XPAC (Santa Cruz Biotechnology, Inc.,
Santa Cruz, CA) polyklonale Antikörper und Meerrettich-Peroxidase
(HRP) gepaartes Antikaninchen-Immunoglobulin als zweiten Antikörper verwendet.
-
Klongenetische
Prüfung.
Für UV-Überlebensexperimente
wurden drei Zelllinien VA13, XP12ROSV und XP12ROSV, die die hargsup
tRNAOpal exprimiert, in dreifacher Ausfertigung
in 60 mm Platten bei unterschiedlichen Zelldichten, die von 2,5 × 102 bis 1 × 106 in 60 mm Petriplatten reichen, in Abhängigkeit
von der Zelllinie und der verwendeten UVC-Dosis plattiert. Am folgenden
Tag wurden die Zellen mit PBS gespült und einer UVC-Dosis ausgesetzt
(254 nm, Spectroline, Modell XX-15G, Spectronics Corp, NY), die
von 0-6 J/m2 reicht. Der PBS-Puffer wurde
entfernt und durch ein komplettes DMEM-Medium ersetzt, das Vitamine
und nicht lebenswichtige Aminosäuren
enthält.
Ungefähr
10-12 Tage nach der Bestrahlung wurden die Kolonien mit Formaldehyd
fixiert und mit Kristall-Violett (0,05 % in Wasser) eingefärbt. Die
prozentuale Koloniebildungsfähigkeit
wurde durch Vergleich der Koloniezahlen der bestrahlten Platten
mit denen der unbestrahlten Platten bestimmt. Separate Experimente
wurden unabhängig
voneinander zwei- bis dreimal wiederholt.
-
Reaktivierungsprüfung unter
Verwendung eines Plasmids, das ein Chloramphenikol-Acetyl-Transferase
(CAT)-Reportergen trägt.
-
Ein
Plasmid-pSVCAT (Kontrollvektor; Promega, Madison, WI), das das CAT-Gen
unter der Kontrolle des SV-Promotors exprimiert, wurde für Plasmid-Reaktivierungsuntersuchungen
verwendet. CAT-Prüfungen wurden
unter Verwendung des Herstellerprotokolls mit geringen Modifikationen
durchgeführt.
Eine Plasmid-DNA (20 μg/ml)
in Wasser wurde mit 254 nm UVC-Bestrahlung in Dosierungen, die von
0-600 J/m2 reichen, behandelt, Ethanol ausgefällt und
in ein geeignetes Volumen für
Transfektion resuspensiert. XP12ROSV-Zellen (2 × 105)
wurden in einer 60 mm Platte ausgesät und am folgenden Tag mit
pHEhargsup tRNAOpal und einer UVC-bestrahlten
pSVCAT-Plasmid-DNA
in einem Verhältnis
von 10:1 (4μg
der gesamten DNA) kotransfiziert. Als Kontrolle für die CAT-Plasmid-Reaktivierung
wurden DNA-reparaturfähige
VA13-Zellen (positive Kontolle) und XP12ROSV-Zellen (negative Kontrolle),
die in eine 60 mm Platte gesät
sind, mit dem modifizierten pHE-Vektor und dem UVC-bestrahlten pSVCAT-Plasmid
in einem Verhältnis
von 10:1 kotransfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen geerntet
und durch drei Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert. Die Lysate wurden
auf CAT-Aktivität unter
Verwendung eines Flüssigkeits-Szintillations-Zählverfahrens (LSC) untersucht. Kurz
gesagt, wurde die Reaktionsmischung, die Protein-Lysate, [15C] Chloramphenicol
(Du Pont, New England Nuclear, Wilmington DE; NEC 408A, 0,15 μCi) und n-butyryl
CoA (25 μg
als Substrat) (engültiges
Reaktionsvolumen von 125 μl)
bei 37°C
für drei
Stunden herangezüchtet.
Das Reaktionsprodukt wurde mit 300 μl eines gemischten Xylols extrahiert.
Die obere Xylol-Phase wurde gesammelt und zweimal mehr durch Hinzufügen von
100 μl von
0,25 M Tris-HCl, pH 8,0 extrahiert. Eine feste Menge der oberen
Xylol-Phase, die das butyrylierte Chloramphenicol-Produkt repräsentiert,
wurde zu der Szintillationsflüssigkeit
(5 ml; OptiScint „HiSafe"1 LKB, England) hinzugefügt und durch
Flüssigkeits-Szintillations-Spektrometrie
gezählt.
Individuelle Transfektionen wurden in doppelter Ausfertigung durchgeführt und
separate Experimente wurden unabhängig voneinander zwei- bis
dreimal wiederholt. Die Fähigkeit,
das mit UVC bestrahlte Plasmid zu reaktivieren, wurde als das Verhältnis der
CAT-Aktivität in Extrakten
von Zellen, die mit dem UV-bestrahlten Plasmid transfiziert wurden,
zu derjenigen in den Zellen, die mit dem unbestrahlten pSVCAT-Plasmid
transfiziert wurden, definiert.
-
Packung
des pHEhargsup tRNAOpal Amplicon-Vektors.
E5-Zellen (2 × 106 Zellen/10 cm Schale) wurden mit dem pHEhargsup
tRNAOpal-Vektor
transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen
unter Selektion mit Hygromycin B (150 μg/ml) platziert. Die Hygromycin-resistenten
E5-Zellen wurden mit 1 MOI eines CgaIΔ3 Helfer-Virus (freundlicherweise
von P. Johnson, San Diego, zur Verfügung gestellt) in 1 ml Opti-MEM-Medium
super-infiziert. Den Viren wurde es ermöglicht, auf den Zellen für zwei Stunden
bei 37°C
in einem befeuchteten Brutschrank mit 5 % CO2 zu
absorbieren, und anschließend
wurden 9 ml eines DEM-Mediums mit 10 % FBS hinzugefügt und die
Zellen wurden für
weitere 50-60 Stunden gebrütet.
Der virale Überschuss,
der einen Zellüberschuss
enthält,
wurde gesammelt. Die Zellen wurden durch ein Einfrier-Auftau-Verfahren (drei Wiederholungen)
lysiert, anschießend
bei 2.400 × g
zentrifugiert, um den Zellüberschuss
niederzuschlagen. Der Titer eines CgaIΔ3 Helfer-Virus wurde durch 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-Galactopyranosid
(X-gal)-Anfärbung
ermittelt, wie vorher beschrieben (Wang, S. Young, W.-B., Jacobson,
C. & Link, C.J., „A novel
Herpesvirus amplicon system for in-vivo gene therapy", Gene Ther 4, 1132-1141
(1997)). Um den in-vitro Transfer des pHEhargsup tRNAOpal Amplicon-Vektors
zu demonstrieren, wurden XP12ROSV-Zellen, die das mhRGFP-Gen exprimieren,
mit unterschiedlichen Mengen des viralen Überschusses, der in opti-MEM
verdünnt
und bei 37°C
in einem befeuchteten Brutschrank mit 5 % CO2 herangezüchtet wurde,
transduziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen für die Wiederherstellung
der GFP-Fluoreszenz visualisiert.
-
Ergebnisse
-
Wiederherstellung
der GFP-Fluoreszenz durch eine Suppressor-tRNA. Um die funktionale Aktivität der hargsup
tRNAOpal zu testen, wurde mhRGFP als Reporter-Gen
eingesetzt. Eine bei der Position Arg73 Opal im hRGFP-Gen eingeführte opal-Mutation
verhindert eine nachweisbare GFP-Fluoreszenz vollständig. Allerdings konnte
die Kotransfektion des Plasmids, das die hargsup tRNAOpal enthält, mit
dem Plasmid, das das mhRGFP-Gen in XP12ROSV-Zellen enthält, die
Opal-Mutation in mhRGFP unterdrücken
und die GFP-Fluoreszenz wiederherstellen (3A und 3B). Kontrolltransfektionen mit einem mhRGFP-Plasmid
alleine zeigten keine GFP-Fluoreszenz (3C und 3D).
-
Expression
von GFP-Transkriptionen und Protein. Um die Expression von hRGFP-
und mhRGFP-Transkriptionen in transfizierten XP12ROSV-Zellen zu
bestimmen, wurden Northern-Blots
mit der hRGFP-cDNA untersucht. Transkriptionen ähnlicher Größe wurden in beiden transfizierten
Zelllinien beobachtet (4A, oberes Feld). Nach einer
Normalisierung mit dem GAPDH-Housekeeping-Gen
(4A, unteres Feld), waren mhRGFP- Transkriptionen im
Vergleich mit den hRGFP-Transkriptionen circa ein Drittel weniger reichlich.
Eine Western-Analyse, die einen Anti-GFP-Antikörper verwendet, zeigt, dass
XP12ROSV-Zellen, die mit mhRGFP und hargsup tRNAOpal kotransfiziert
sind, ein GFP-Protein voller Länge,
das in seiner Größe dem hRGFP-Protein ähnlich ist,
exprimiert (4B). Auf diese Weise wurde der
direkte Beweis zur Verfügung
gestellt, dass eine hargsup tRNAOpal die
Nonsense-Mutation in dem mhRGFP-Gen unterdrücken und ein funktionales Protein
in voller Länger
produzieren kann. Obwohl gleiche Mengen des Proteins angereichert
wurden (Daten nicht gezeigt), wurde im Vergleich zu hRGFP alleine
eine etwa 10-fache Reduktion der Signal-Intensität in den XP12ROSV-Zellen, die
sowohl mit mhRGFP als auch mit hargsup tRNAOpal transfiziert
wurden, beobachtet. Zwei Beobachtungen erklären das viel weniger detektierte
hRGFP-Protein, das in Zellen gefunden wurde, die sowohl mit dem
mhRGFP als auch mit dem hargsup tRNAOpal kotransfiziert
wurden. Das Niveau der mhRGFP-Transkriptionsziele
für die
Suppressor-tRNA war relativ zur Expression eines Housekeeping-Gens über ein
Drittel geringer (4A). Allerdings war die Reduktion
im Proteinniveau signifikant größer als
die Abnahme in RNA-Transkriptionen, die einen zusätzlichen
Effekt von einer relativ geringen Unterdrückungseffizienz anzeigen. XP12ROSV-Zellen,
die mit dem mhRGFP-Gen allein transfiziert wurden, sollten ein abgeschnittenes
(~8 kDa) GFP-Protein produzieren, dieses wurde aber auf Grund des
verwendeten Gel-Systems
nicht detektiert.
-
Korrektur
eines XPA-NER-Mangel-Phänotyps
in XP-Zelllinien durch Nonsense-Suppressor-tRNA, wie gemessen durch
ein Post-UV-Bestrahlungs-Zellüberleben.
Um in-vitro zu zeigen, dass Suppressor tRNAs genetische Defekte,
die durch Nonsense-Mutationen
verursacht wurden, reparieren können,
wurde eine DNA-reparatur-fehlerhafte
XP-Fibroplast-Zelllinie – XP12ROSV
ausgewählt.
-
Ein
C- zu T-Übergang
am Nukleotid 619 im Exon 5 des XPAC-Gens änderte das Arg-207-Codon (CGA)
in ein Nonsense-Codon (TGA). Das führt zu einem abgeschnittenen
XPAC-Protein und zu einer Unterbrechung der funktionalen Aktivität des XPAC-Gens
(Satokata, I., et al., „Three
nonsense mutations responsible for group A xeroderma pigmentosum", Mutation Res 273,
193-202 (1992)). Diese Zelllinie hat nach der UV-Bestrahlung eine
geringe Koloniebildungsfähigkeit.
Diese Zellen wurden mit dem pHEhargsup tRNAOpal-Plasmid
transfiziert und mit Hygromycin ausgewählt. Die ausgewählten Zellen
wurden mit UVC (254 nm) in Dosen, die von 0-6 J/m2 reichen,
bestrahlt. Eine klonogenetische Prüfung wurde durchgeführt und
ein 4- bis 35-facher Anstieg in der Koloniebildungsfähigkeit
bei höherer
UV-Dosis wurde in XP12ROSV-Zellen,
die das hargsup tRNAOpal exprimieren, beobachtet
(5). Die Ergebnisse zeigten ein verbessertes UV-Überleben
der XP12ROSV-Zellen
auf Grund der partiellen Korrekturen in dem DNA-reparaturfehlerhaften-Phänotyp durch Einführung der
Suppressor-tRNA.
-
UV-bestrahlte
CAT-Plasmid-Reaktivierungs-Studien. Ein alternativer in-vitro Test,
um zu bestimmen, ob Suppressor-tRNAs die XPAC-Gen-Nonsense-Mutation
in XP12ROSV-Zellen unterdrücken
können
und eine DNA-Reparaturaktivität
wiederherstellen können,
ist die Verwendung von Expressionsvektoren. Plasmid-Vektoren, die
das bakterielle CAT-Gen exprimieren, sind häufig dazu verwendet worden,
die DNA-Reparatur und Mutagenesen in menschlichen Zellen zu messen
(Kraemer, K.H., Protic-Sabljic, M., Bredberg, A. & Seidman, M.M., „Plasmid
vectors for study of DNA repair and mutagenesis", Curr Probl Derm 17, 166-181 (1987)).
Die XP12ROSV-Zellen, die kurzzeitig mit dem UV-bestrahlten pSVCAT-Plasmid
transfiziert wurden, waren in der Hemmung der CAT-Expression im
Vergleich zu den normalen VA13-Zellen viel empfindlicher (6).
Allerdings führt
eine kurzzeitige Expression der Suppressor-tRNA in XP12ROSV- Zellen zu einer erhöhten Fähigkeit,
ein UV-bestrahltes pSVCAT-Plasmid
durch eine effiziente Unterdrückung
der Nonsense-Mutation im XPAC-Gen zu reaktivieren und die DNA-Reparaturaktivität wiederherzustellen.
Eine 3 bis 17-fache Erhöhung
in der CAT-Aktivität
bei höheren
UV-Dosen wurde in XP-Zellen, die kurzzeitig sowohl mit dem pHEhargsup
tRNAOpal-Plasmid als auch mit dem UV-geschädigten pCAT-Plasmid
transfiziert wurden, beobachtet (6).
-
Niveaus
der XPAC-Transkription und des XPAC-Proteins in XP-Zellen. Die Northern-Analyse
von XP12ROSV-Zellen zeigte eine sehr geringe Menge der XPAC-Transkription
im Vergleich zu den normalen DNA-reparaturfähigen VA13-Zellen (7A,
oberes Feld). Die erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich zu jenen, die früher berichtet
wurden (Satokata, I., et al., „Three
nonsense mutations responsible for group A xeroderma pigmetosum", Mutation Res 273,
193-202 (1992)). Um die partielle phänotypische Korrektur in XP12ROSV-Zellen durch eine
Suppressor-tRNA mit dem Vorhandensein eines Proteins voller Länge zu korrelieren,
wurde die Western-Analyse durchgeführt. 7B zeigt,
dass ein XPAC-Protein, obwohl es in den normalen VA13-Zellen detektierbar
war, in XP12ROSV-Zellen, die mit der hargsup tRNAOpal transfiziert
sind, nicht detektierbar war. Außerdem wurde kein abgetrenntes
XPAC-Polypeptid in den XP12ROSV-Zellen beobachtet.
-
Transduktion
von XP12ROSV-Zellen, die mhRGFP mit einem pHEhargsup tRNAOpal-Amplicon-Vektor exprimieren, der in
HSV-1-Vironen gepackt
ist. Der in HSV-1-Virionen gepackte pHEhargsup tRNAOpal-Amplicon-Vektor
könnte
eine Nonsense-Mutation in dem mhRGFP-Gen, das in XP12ROSV-Zellen
exprimiert wurde, erfolgreich transduzieren und unterdrücken, wie
durch die Wiederherstellung der GFP-Fluoreszenz veranschaulicht
(8A und 8B). Bei
40 MOI des Helfervirus wurde eine Wiederherstellung der GFP-Fluoreszenz
in ungefähr
5 % der Zellen beobachtet. Allerdings war eine beachtliche Zytotoxizität zwischen
24 und 48 Stunden nach der Infektion offensichtlich. Bei geringerer
MOI der Infektion wurden keine GFP-positiven Zellen beobachtet. GFP-Fluoreszenz
wurde mit der oben genannten Zelllinie nicht beobachtet, die mit
dem pHE700TK-Vektor, der in HSV-1-Vironen gepackt ist, transduziert
wurde und als negative Kontrolle eingesetzt wird, oder wenn XP12ROSV-Zellen
mit dem pHEhargsup tRNAOpal-Amplicon-Vektor
alleine transduziert wurden (Daten nicht gezeigt).
-
Diskussion.
Indem wir Xeroderma-Pigmentosum Gruppe A-Zellen als Krankheitsmodell
verwenden, sind wir in der Lage gewesen, in-vitro eine partielle
Wiederherstellung der DNA-Reparatur-Aktivität von nonsense-mutierten-XPAC-Genen
zu demonstrieren. Die XP12ROSV-Zelllinie,
die für
die Studie verwendet wurde, enthält
eine homozygote Nonsense-Mutation im XPAC-Gen (Satokata, I., et
al., „Three
nonsense mutations responsible for group A xeroderma pigmentosum", Mutation Res 273,
193-202 (1992)). Ein Arginin-(CGA)-Codon
war zu einem Opal-(TGA)-Codon in dem XPAC-Gen mutiert worden, folglich
entschieden wir, für
unsere Studien eine menschliches Arginin-opal-Suppressor-tRNA aufzubauen.
Bis heute waren keine tRNA-Suppressoren zuvor von der menschlichen
Arigin-tRNA abgeleitet
worden. Die aufgebaute Suppressor-tRNA ist klein in ihrer Größe, so dass
die 5' flankierenden
Sequenzen entfernt worden sind, während 15 Basen von den 3' flankierenden Sequenzen
beibehalten wurden, um das Ende der Transkription zu signalisieren.
Der Aufbau kleiner tRNAs durch Verwendung eines Paares von Oligonukleotiden
hat einen Vorteil gegenüber
dem mühsameren
und zeitraubenden Verfahren der lagegerichteten Mutagenese, um eine
tRNA in eine Suppressor-tRNA zu konvertieren. Durch die Verwendung
unseres Verfahrens haben wir verschiedene unterschiedliche funktionale
Suppressor-tRNAs, wie beispielsweise eine menschliche Serin-Amber-Suppressor-
und eine Tyrosin-Ochre-Suppressor-tRNA
aufgebaut. Eine hohe Durchleseffizienz bei der Verwendung von amber-
oder ochre-mutierter hRGFP als Reporter-Gen wurde auch durch eine FACS-Analyse
der GFP-Fluoreszenz beobachtet (Daten nicht dargestellt).
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Die
funktionale Aktivität
der hargsup tRNAOpal wurde zuerst unter
Verwendung eines opal-mutierten, humanisierten, rot-verschobenen,
grün-fluoreszenten
Proteins als Reportergen gezeigt. Eine hohe Effizienz von Nonsense-Suppression
(>80 %) wurde durch
die Wiederherstellung der hRGFP-Fluoreszenz und durch FACS-Analyse
für GFP-positive
Zellen gezeigt (Daten nicht gezeigt). Eine Expression der hargsup
tRNAOpal XP-Zelllinien produzierte einen
4 bis 35-fachen Anstieg beim Zellüberleben nach einer UV-Bestrahlung
und eine erhöhte
Fähigkeit
der XP-Zellen, ein mit UV bestrahltes pSVCAT-Plasmid zu reaktivieren.
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Suppressor-tRNAs
können
ein Durchlesen der natürlichen
Terminations-Codone bewirken. Die am C-Ende erweiterten Proteine
können
kodominante negative Eigenschaften aufweisen oder sie können eine streng
begrenzte Aktivität
haben oder sie können
Gegenstand einer vorzeitigen Degradation sein. All dies kann schädlich für die Zelle
sein. Allerdings kann die Zelle in der Lage sein, sich aufgrund
mehrfacher translationaler Stopp-Codone am Ende eines Gens und auch
wegen der ineffizienten Unterdrückung
unterschiedlicher Suppressor-tRNAs selbst vor solch schädlichen
Effekten zu schützen.
Vorläufige
Studien von unserer Toxizitätsprüfung offenbarten,
dass eine stabile Expression der Suppressor-tRNA in XP-Zellen den
Zyklus, wie er durch FACS-Analysen
(Daten nicht gezeigt) bestimmt wurde, nicht änderte oder eine direkte zytotoxische
Beeinflussung verursachte, der in klonogenetischen Proben detektiert
werden konnte.
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Die
praktische Anwendung der Suppressor-tRNA als therapeutische Wirkstoffe
für die
Gentherapie wird stark von der Entwicklung von effizienten Vektoren
abhängen,
die die langfristige Gen-Expression in den passenden Zielgeweben
oder Zellen aushalten können.
Einige Vektor-Arten sind für
diesen Zweck in der Entwicklung. Über die Verwendung von rekombinanten
Retroviren, um DNA-Reparatur-Gene, wie zum Beispiel XPD (Carreau,
M., et al., „Functional
retroviral vector for gene therapy of xeroderma pigmentosum group
D patients", Hum
Gene Ther 6, 1307-1315 (1995); Quilliet, X., et al., „Long-term
complementation of DNA repair deficient human primary fibroblasts
by retroviral transduction of the XPD gene", Mutation Res 364, 161-169 (1996)),
XPA, XPB und XPC Gene (Zeng, L. et al., "Retrovirusmediated gene transfer corrects
DNA repair defect of xeroderma pigmentosum cells of complementation
groups A, B and C",
Gene Ther 4, 1077-1084 (1997), in XP-Zellen mit dem entsprechenden
defekten DNA-Reparatur-Gen zu liefern, ist berichtet worden. Eine
funktionale Expression des Transgens und eine Verbesserung der DNA-Reparatur-Aktivität wurden
in den transduzierten Zellen beobachtet. Um eine effiziente Bereitstellung
der Suppressor-tRNA zu erhalten, beschlossen wir, einen neuen HSV-Amplicon-Vektor,
pHE, zu verwenden (Wang, S., Young, W.-B., Jacobsen, C. & Link, C.J., „A novel
Herpesvirus amplicon system for in-vivo gene therapy", Gene Ther 4, 1132-1141
(1997), so dass das Plasmid, welches die Suppressor-tRNA enthält, verstärkt und
in infizierten HSV-1-Virionen in Gegenwart des durchführenden
Helfervirus gepackt werden konnte. Der infektiöse pHE-Vektor hat eine effiziente
Transgenexpression in einer Vielzahl menschlicher Zelllinien. Die
aufgebaute Suppressor-tRNA
ist nur ungefähr
0,1 kb groß.
Dadurch könnten
circa 15 Kopien der tRNA in ein einfaches 152 kb-Virus-Genom gepackt
werden. Obwohl wir in der Lage sind, die Suppressor-tRNA in das
Herpes-Genom zu
packen, zeigten weniger als 5 % der transduzierten XP12ROSV-Zellen,
die das mhRGFP exprimieren, eine grüne Fluoreszenz (7). Die zelluläre Toxizität und die geringe Unterdrückungseffizienz
sind wahrscheinlich für
Helfervirus-Proteine zweitrangig, die die Wirtsproteinsynthese abschalten.
Frühere
Studien haben gezeigt, dass die HSV-Wirt-Abschaltgene, wie beispielsweise
vhs (UL41) und ICP47 (UL54) eine Wirtszellenproteinsynthesen hemmen
können (Kwong,
A.D., Kruper, J.A. & Frenkel,
N., „Herpes
simplex virus host shutoff function", J Virol 62, 912-921 (1988); Hardwicke,
M.A. & Sandri-Goldin,
R.M., „The
Herpes simplex virus regulatory protein ICP27 contributes to the
decrease in cellular mRNA levels during infection", J Virol 68, 4797-4810
(1994)). Zum Beispiel erleichtert eine Expression des vhs-Gens die
Degradation einer Wirts-mRNA
(Kwong, A.D., Kruper, J.A. & Frenkel,
N., „Herpes
simplex virus host shutoff function", J Virol 62, 912-921 (1988)). Es ist
möglich,
dass diese oder andere Helfervirus-Proteine die mRNA-Stabilität oder die
Expression des mhRGFP-Gens reduzierten und zu weniger Zielen für die Suppressor-tRNA
führten.
Studien sind im Gange, um das vor kurzem entwickelte helferfreie-Packungs-System
zu verwenden, um die Präsenz
viraler Wirtabschalt-Gene zu beseitigen und die Virus-Zytotoxizität zu reduzieren
oder zu beseitigen (Fraefel, C. et al., „Helper virus-free transfer
of herpes simplex virus type 1 plasmid vectors into neural cells", J Virol 70, 7190-7
(1996)).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung sind einige weitere menschliche Suppressor-Serin-tRNAs
synthetisiert worden und es wurde gezeigt, dass sie in Übereinstimmung
mit der hierin enthaltenen Lehre funktional sind. Diese sind in
den 8–13 offenbart.
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