JP2022528696A - アンチコドンループを延長した合成転移ｒｎａ - Google Patents
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Abstract
延長したアンチコドンループを有する合成転移ＲＮＡに関する。フレームシフト変異に関連する神経線維腫症のような遺伝子疾患の治療に有用な合成抑制因子転移ＲＮＡを提供する。前記合成転移ＲＮＡは、４ヌクレオチドアンチコドンまたは５ヌクレオチドアンチコドンを有する延長アンチコドンループを含む。【選択図】図１
Description
本発明はアンチコドンループを延長した合成転移ＲＮＡに関する。
転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のヌクレオチド配列をタンパク質のアミノ酸配列に翻訳するために必要な成分として、生細胞のタンパク質合成機構に必須な部分である。天然のｔＲＮＡには、アミノ酸と共有結合可能なアミノ酸結合ステム、及びｍＲＮＡ上の「コドン」と呼ばれる対応する塩基トリプレットに非共有的に結合可能な「アンチコドン」と呼ばれる塩基トリプレットを含むアンチコドンループが含まれる。タンパク質は、特にリボソーム及びいくつかの補助酵素を含む多成分系に支援されて、ｍＲＮＡ上のコドン配列を鋳型として、ｔＲＮＡが担持するアミノ酸を組み立てることにより合成される。
遺伝性疾患の群に属する疾患のいくつかは、遺伝情報の変化、例えば、コード遺伝子のＤＮＡにおける変異に基づいている。これには、単一または複数のヌクレオチドの交換、欠失または挿入が含まれる。この場合、変異した遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、改変された遺伝情報も担持することになり、異常な、そして機能しない可能性のあるタンパク質が形成される。１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入（総称してインデルと呼ぶ）は、例えば、コード領域内のリーディングフレーム（即ち、リボソームがｍＲＮＡ内の情報を読み取る３ヌクレオチド域）を変化させ、その結果、変異の下流に全く新しいアミノ酸配列が生じ、非機能的なタンパク質が生成される。一例として、ニューロフィブロミン１（ＮＦ１）及びニューロフィブロミン２（ＮＦ２）をそれぞれコードする遺伝子の変異により、それぞれ神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１）及び神経線維腫症２型（ＮＦ２）という疾患が引き起こされ可能性がある。遺伝子ＮＦ１及びＮＦ２は、腫瘍抑制因子として機能すると考えられている。ＮＦ１及びＮＦ２における変異は、出生時（遺伝性またはデノボ）のみならず体細胞状態でも発生する。最も多い変異は、１～１２ヌクレオチドの欠失または挿入を伴うフレームシフト変異であり、欠失は挿入よりも頻度が高い（非特許文献１、非特許文献２）。
マクロライドなどの数種の抗生物質はフレームシフトを促進するが、フレームシフトを修正するためにマクロライドを使用する試行はこれまで報告されていない（非特許文献３、非特許文献４）。
まだ始まったばかりではあるが、患者の細胞に修正遺伝物質を導入することが含まれる遺伝子治療は、遺伝子疾患の治療に重要なものとなりつつある。遺伝子の下流にある主体、主にｍＲＮＡの修正に基づくアプローチは、遺伝子配列（またはＤＮＡ）が変化しないままであるため、古典的な遺伝子治療アプローチには属さないので好ましい。しかし、ｍＲＮＡは本質的に短命であり、ｍＲＮＡ配列の長さは治療応用に問題をもたらす。特定のｍＲＮＡは、例えば、遺伝子送達及び治療用の現在利用可能なベクターの積載容量より長い場合もある。
ｍＲＮＡと比較して、ｔＲＮＡ分子は安定性が非常に高く、平均して１０倍ほど短いため、標的組織への導入の問題が軽減される。これにより、未成熟な停止コドンを有するｍＲＮＡからトランケートタンパク質が形成されることを防止し、代わりに妥当なアミノ酸を導入する目的でｔＲＮＡを遺伝子治療に用いることが試みられている（例えば、非特許文献５、特許文献１、及び特許文献２を参照）。
アンチコドン中の余分なヌクレオチド、または短いコドンダブレットを有する天然ｔＲＮＡが細菌中で発見されている。これらの異常なコドンは、特定のフレームシフト位置を抑制するために自然に利用されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。Ｓａｋｏら（２００６年）（特許文献９）は、トランスフェクトにより細胞に導入された抑制因子ｔＲＮＡを用いて、ＰＴＣ含有ｍＲＮＡを通読するアプローチを報告している。非センストリプレットコドン及び４塩基コドンは、ヒトｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）由来の対応する抑制因子ｔＲＮＡに読み取られた。
非天然アミノ酸をタンパク質に組み込み、アンチコドンループ中６～１０ｎｔを含むｔＲＮＡを有する２、３、４、５、６塩基コドンのフレームシフト抑制の分子機序に取り組むために、４塩基または５塩基アンチコドンを含む延長アンチコドンループを有するｔＲＮＡも細菌のインビトロ翻訳系に導入している（特許文献３、特許文献４、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。しかし、非天然アミノ酸の組み込み収率は極めて低く、またｍＲＮＡの環境に影響を受ける。更に、アンチコドンループにおいて修飾したｔＲＮＡにより非天然（非標準的または非タンパク質原性）アミノ酸をタンパク質に組み込むアプローチでは、いわゆる直交翻訳系、即ち修飾ｔＲＮＡに非標準アミノ酸を結合させるために、操作したアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いる翻訳系が一般的に使用されている（非特許文献１４、非特許文献１５、特許文献５）。
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Ｍａｉｎｉ Ｒ、Ｄｅｄｋｏｖａ ＬＭ、Ｐａｕｌ Ｒ、Ｍａｄａｔｈｉｌ ＭＭ、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＳＲ、Ｃｈｅｎ Ｓ、Ｈｅｃｈｔ ＳＭ、「Ｒｉｂｏｓｏｍｅ‐Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２０１５年、第１３７号、ｐ．１１２０６‐１１２０９、ｄｏｉ１０．１０２１／ｊａｃｓ．５ｂ０３１３５
フレームシフト変異の影響の阻止する必要性、及び／またはフレームシフト変異を抑制する必要性が依然として存在する。従って、本発明の目的は、このような手段、特にフレームシフト変異に関連する遺伝子疾患、例えば神経線維腫症を治療するためのフレームシフト変異抑制因子を提供することである。
一態様では、本発明は合成転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）を提供するものであり、この合成転移ＲＮＡは、４塩基または５塩基のアンチコドンを有する延長アンチコドンループを含む。この４塩基アンチコドンはメッセンジャーＲＮＡ上の５つの連続したヌクレオチド塩基と塩基対合するように構成しており、リーディングフレーム域を－１フレーム及び＋１フレームに変化させるｍＲＮＡ上の連続したコドン塩基トリプレット中の挿入や欠失を修正する。
本発明は、－１または＋１フレームシフト変異を高い特異性で環境依存的に抑制するために使用できる新規な抑制因子ｔＲＮＡを提供する。これにより、例えば、コード配列に変異を有するｍＲＮＡから機能的タンパク質を合成する細胞の能力が回復する。これが無ければ、タンパク質配列が異なるものとなり、タンパク質の機能性が低下するか、または機能しないものとなる。本発明の合成ｔＲＮＡは、１または２ヌクレオチド延長されたアンチコドンループを含む。本発明の合成ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の２つの隣接するコドンの４または５塩基に相補的であり、第１のコドンはインデル（挿入または欠失）のあるコドンであり、第２のコドンは無傷の隣接するコドンである。４塩基または５塩基のコドンを有する本発明の合成ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上のコドン、及び後続のコドン（－１フレームシフトの場合）または先行するコドン（＋１フレームシフトの場合）の残りの部分と塩基対合する。その結果、ｔＲＮＡに担持されるアミノ酸が成長アミノ酸鎖に組み込まれ、リーディングフレームが修正される。－１フレームシフトの場合、本発明の合成ｔＲＮＡがジペプチドで（プレ）アミノアシル化されていなければ、得られるタンパク質は野生型タンパク質、即ち野生型ｍＲＮＡから合成したタンパク質よりもアミノ酸が１つ少なくなるが、それでも機能的なタンパク質が得られる可能性は高い。
有利にも、本発明は、非天然アミノ酸の組み込みに使用される先行技術の抑制因子ｔＲＮＡと比較して高い結合親和性をもたらすアンチコドンループを有するように設計した合成転移ＲＮＡを提供する。インデル（挿入または欠失）のあるコドンと、それに隣接する未改変コドンの２つの連続したコドンに結合することは、天然の２ヌクレオチド‐アンチコドン抑制因子ｔＲＮＡと比較して高い特異性が伴う。その結果、本発明の合成ｔＲＮＡは特定の変異部位に効果的に結合するように設計することが可能となり、ｍＲＮＡの他の部分的に相同な領域へ非特異的に対合するリスクを大幅に低減することが可能となる。
用語「転移リボ核酸」または「ｔＲＮＡ」とは、通常７３～９０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子を指し、これはメッセンジャーＲＮＡのヌクレオチド配列をタンパク質のアミノ酸配列へと翻訳することを媒介する。ｔＲＮＡは、アクセプターステムの末端にある３’ＣＣＡ尾部で特定のアミノ酸と共有結合し、アンチコドンアームのアンチコドンループにある３ヌクレオチドのアンチコドンを介して、メッセンジャーＲＮＡの３ヌクレオチド配列（コドン）と塩基対合することが可能である。いくつかのアンチコドンは、不安定な塩基対合として知られる現象により、複数のコドンと対合できる。ｔＲＮＡの二次的な「クローバー葉」構造は、アミノ酸と結合するアクセプターステム、及びループ（Ｄループ、ＴΨＣループ、アンチコドンループ）中で終わる３つのアーム（「Ｄアーム」、「Ｔアーム」、「アンチコドンアーム」）、即ち不対ヌクレオチドを有する部位を含む。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、ｔＲＮＡに特定のアミノ酸を担持させる（アミノアシル化する）。各ｔＲＮＡは、アミノ酸の１つ以上のコドンと塩基対合可能な、他とは明確に異なるアンチコドントリプレット配列を含む。慣習的に、ｔＲＮＡのヌクレオチドは、７６個のヌクレオチドから成る「コンセンサス」ｔＲＮＡ分子に基づいて、ｔＲＮＡの実際のヌクレオチド数には関係なく、５’リン酸末端から始まって１～７６の番号が付けられることが多い。ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ中にＤループなどの可変部分があることから、必ずしも７６ヌクレオチド長ではない（図３参照）。この慣例に従えば、天然ｔＲＮＡのヌクレオチド３４～３６位はアンチコドンの３つのヌクレオチドを指し、７４～７６位は終止ＣＣＡ尾部を指す。任意の「規定数以上の」ヌクレオチドは、コンセンサスｔＲＮＡの一部である既存のヌクレオチドの番号にアルファベットを加えて、例えば２０ａ、２０ｂ．．．のように慣例に従ってナンバリングするか、または、可変ループの場合、ヌクレオチド同士独立してナンバリングし、ｅ１１、ｅ１２．．．のように先頭文字を加えることでナンバリングすることが可能である（例えば、非特許文献１６参照）。以下では、ｔＲＮＡ固有のナンバリングを「ｔＲＮＡナンバリング規定」または「転移ＲＮＡナンバリング規定」とも称する。
用語「合成転移リボ核酸」または「合成ｔＲＮＡ」とは、非天然ｔＲＮＡを指す。また、この用語は、天然ｔＲＮＡの類似体、即ち、天然ｔＲＮＡに構造的に類似するがｔＲＮＡが構成される１つ以上のヌクレオチドの塩基成分、糖成分、及び／またはリン酸成分が修飾されているｔＲＮＡも包含する。修飾ｔＲＮＡは、例えば、ホスホジエステル架橋がホスホロチオエート、ホスホロアミデート、またはメチルホスホネート架橋に置換されるように修飾したホスホジエステル骨格を有してもよい。糖成分は、例えば、デオキシリボヌクレオチドへと脱ヒドロキシル化することにより、またはメトキシ基、メトキシエトキシ基、またはアミノエトキシ基で置換することにより、２’ＯＨ基で修飾してもよい。合成転移リボ核酸は、例えばインビトロで化学的及び／もしくは酵素的に合成可能であり、または、細胞ベースの系、例えばインビボの細菌細胞中で合成可能である。
用語「コドン」とは、タンパク質合成時に特定のアミノ酸または停止シグナルに対応するヌクレオチドトリプレット、即ち３つのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの配列を指す。コドン（ｍＲＮＡレベル）及びコード化したアミノ酸の一覧を以下に示す。
用語「コドン」とは、タンパク質合成時に特定のアミノ酸または停止シグナルに対応するヌクレオチドトリプレット、即ち３つのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの配列を指す。コドン（ｍＲＮＡレベル）及びコード化したアミノ酸の一覧を以下に示す。
アミノ酸 一文字コード コドン
Ａｌａ Ａ ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ
Ａｒｇ Ｒ ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ
Ａｓｎ Ｎ ＡＡＵ、ＡＡＣ
Ａｓｐ Ｄ ＧＡＵ、ＧＡＣ
Ｃｙｓ Ｃ ＵＧＵ、ＵＧＣ
Ｇｌｎ Ｑ ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｇｌｕ Ｅ ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｇｌｙ Ｇ ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ
Ｈｉｓ Ｈ ＣＡＵ、ＣＡＣ
Ｉｌｅ Ｉ ＡＵＵ、ＡＵＣ、ＡＵＡ
Ｌｅｕ Ｌ ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ
Ｌｙｓ Ｋ ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｍｅｔ Ｍ ＡＵＧ
Ｐｈｅ Ｆ ＵＵＵ、ＵＵＣ
Ｐｒｏ Ｐ ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ
Ｓｅｒ Ｓ ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、ＡＧＣ
Ｔｈｒ Ｔ ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ
Ｔｒｐ Ｗ ＵＧＧ
Ｔｙｒ Ｙ ＵＡＵ、ＵＡＣ
Ｖａｌ Ｖ ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ
開始：ＡＵＧ
停止：ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ、略称「Ｘ」
Ａｌａ Ａ ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ
Ａｒｇ Ｒ ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ
Ａｓｎ Ｎ ＡＡＵ、ＡＡＣ
Ａｓｐ Ｄ ＧＡＵ、ＧＡＣ
Ｃｙｓ Ｃ ＵＧＵ、ＵＧＣ
Ｇｌｎ Ｑ ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｇｌｕ Ｅ ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｇｌｙ Ｇ ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ
Ｈｉｓ Ｈ ＣＡＵ、ＣＡＣ
Ｉｌｅ Ｉ ＡＵＵ、ＡＵＣ、ＡＵＡ
Ｌｅｕ Ｌ ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ
Ｌｙｓ Ｋ ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｍｅｔ Ｍ ＡＵＧ
Ｐｈｅ Ｆ ＵＵＵ、ＵＵＣ
Ｐｒｏ Ｐ ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ
Ｓｅｒ Ｓ ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、ＡＧＣ
Ｔｈｒ Ｔ ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ
Ｔｒｐ Ｗ ＵＧＧ
Ｔｙｒ Ｙ ＵＡＵ、ＵＡＣ
Ｖａｌ Ｖ ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ
開始：ＡＵＧ
停止：ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ、略称「Ｘ」
本明細書で使用する用語「センスコドン」とは、アミノ酸をコードするコドンを指す。用語「停止コドン」または「非センスコドン」とは、通常タンパク質に見られる２０種のアミノ酸のうち１種をコードしておらず、メッセンジャーＲＮＡの翻訳の停止をシグナル伝達する遺伝子コードのコドン、即ちヌクレオチドトリプレットを指す。
用語「フレームシフト変異」とは、３で均等に割り切れない数のヌクレオチドのフレーム外挿入または欠失（総称して「インデル」と称する）を指す。これにより、３ヌクレオチド塩基のステップで進行するヌクレオチド配列の解読が阻害される。用語「－１フレームシフト変異」とは、単一のヌクレオチドを欠失すると、リーディングフレームが１ヌクレオチド分シフトし、後続のコドンの最初のヌクレオチドが、ヌクレオチドを欠失したコドンの一部として読み取られることを意味する。数個のトリプレットと共に上流のコドンから１つのヌクレオチドが欠失すること（即ち４、７、１０個等のヌクレオチドの欠失）も、－１フレームシフトと考える。用語「＋１フレームシフト変異」とは、トリプレットへの単一のヌクレオチドの挿入、または２つのヌクレオチドの欠失を指す。いずれの事象の結果も、リーディングフレームが１ヌクレオチド分シフトし、上流側コドンのヌクレオチドが下流側コドンの一部として読み取られる。数個のトリプレットと共に１つのヌクレオチドが挿入されること（３ｎ＋１ヌクレオチド、ｎは整数、即ち４、７、１０個等のヌクレオチドの挿入）、または数個のトリプレットと共に上流側コドンから２つのヌクレオチドが欠失すること（即ち、５、８、１１個等のヌクレオチドの欠失）も＋１フレームシフトと考える。フレームシフト変異は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、クローン病（ＣＤ）、テイ・サックス病（ＴＳＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）などの様々な遺伝子疾患に関与している。
用語「アンチコドン」とは、ｍＲＮＡ上のコドンの３つの塩基（ヌクレオチド）と塩基対合する（非共有結合する）通常３つのヌクレオチドの配列を指す。アンチコドンは塩基が修飾されたヌクレオチドも含み得る。用語「４ヌクレオチドアンチコドン」または「４塩基アンチコドン」とは、ｍＲＮＡ上の４つの連続した塩基と対合する４つの連続したヌクレオチド（塩基）を有するアンチコドンを指す。用語「クアドラプレットヌクレオチド・アンチコドン」または「クアドラプレット・アンチコドン」は、「４ヌクレオチドアンチコドン」を意味するために使用してもよい。用語「５ヌクレオチドアンチコドン」または「５塩基アンチコドン」とは、ｍＲＮＡ上の５つの連続した塩基に結合（塩基対合）する５つの連続したヌクレオチド（塩基）を有するアンチコドンを指す。用語「クインタプレットヌクレオチド・アンチコドン」または「クインタプレット・アンチコドン」は「５ヌクレオチドアンチコドン」を意味するために使用してもよい。
用語「アンチコドンループ」とは、アンチコドンを含むアンチコドンアームの、対合していないヌクレオチドを指す。天然ｔＲＮＡは通常、アンチコドンループ中に７つのヌクレオチドを有し、そのうち３つのヌクレオチドはｍＲＮＡ中のコドンと対合する。
用語「延長アンチコドンループ」とは、ループ内のヌクレオチドの数が天然ｔＲＮＡより多いアンチコドンループを指す。延長アンチコドンループは例えば、７個を超えるヌクレオチド、例えば、８、９、または１０個のヌクレオチドを含み得る。特にこの用語は、ｍＲＮＡ内の対応数の連続ヌクレオチドと塩基対合することが可能な３つを超える連続したヌクレオチド、例えば４、５、または６個のヌクレオチドから成るアンチコドンを含むアンチコドンループを指す。
用語「アンチコドンステム」とは、アンチコドンループを担持する、アンチコドンアームの対合したヌクレオチドを指す。
用語「Ｔステム」は、Ｔループを担持する、Ｔアームの対合したヌクレオチド、即ちＴアームの対合していないヌクレオチドを指す。
用語「可変ループ」とは、アンチコドンアームとＴアームとの間に位置するｔＲＮＡループを指す。可変ループを構成するヌクレオチドの数は、ｔＲＮＡごとに大きく変わる場合もある。そのため、可変ループは比較的短く、もしくは欠落さえしている可能性もあり、または比較的大きく、例えばヘリックスを形成している可能性もある。用語「可変アーム」は、用語「可変ループ」の同義語として使用してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「コドン塩基トリプレット」または「アンチコドン塩基トリプレット」は、コドンまたはアンチコドンを形成する３つの連続したヌクレオチドの配列を指す。同義語として、用語「３ヌクレオチドコドン」（「３塩基コドン」ともいう）もしくは「３ヌクレオチドアンチコドン」（「３塩基アンチコドン」ともいう）、またはその略語、例えば「３ｎｔコドン」または「３ｎｔアンチコドン」を使用してもよい。
用語「塩基対」とは、水素結合により接合した塩基の対、またはこのような塩基対の形成を指す。塩基対の一方の塩基は通常プリンであり、他方の塩基は通常ピリミジンである。ＲＮＡでは、塩基アデニンとウラシルとが塩基対を形成し、塩基グアニンとシトシンとが塩基対を形成できる。しかし、他の塩基対（「不安定な塩基対」）、例えばグアニン‐ウラシル（Ｇ‐Ｕ）、ヒポキサンチン‐ウラシル（Ｉ‐Ｕ）、ヒポキサンチン‐アデニン（Ｉ‐Ａ）、ヒポキサンチン‐シトシン（Ｉ‐Ｃ）の塩基対の形成も可能である。用語「塩基対合可能な」とは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列が、対応するヌクレオチドまたはヌクレオチド配列と水素結合安定化構造を形成する能力を指す。
本明細書で使用する用語「塩基」は、例えば「塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＵ」といった用語では、文脈が別段に明確に示していない限り、用語「ヌクレオチド」を包含するか、または「ヌクレオチド」の同義語として使用する。
「ＰＴＣ」とは、未成熟な終止コドンを指す。これは、非センス変異、即ち標準遺伝コードで指定されている２０種のタンパク質原性アミノ酸の１種をコードするセンスコドンが鎖終止コドンに変化する変異によりコード核酸配列に導入された停止コドンである。そのため、この用語は、ｍＲＮＡに含まれる遺伝子コードの翻訳において未成熟な停止シグナルを指す。
用語「クローン病」または「クローン氏病」とは、ＮＯＤ２遺伝子に関連する胃腸炎症性疾患を指す。この疾患に関連する共通の変異は３０２０位でのシトシンの挿入である。
用語「テイ・サックス病」とは、神経細胞の破壊をもたらす遺伝子疾患を指し、生後約２～３か月の幼児期に顕著になる。重度の運動障害、難聴、てんかん発作等を招く。多くの場合、幼児期において死亡に至る。
用語「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」（ＤＭＤ）（「ベッカー型筋ジストロフィー」（ＢＭＤ）とも称する）とは、機能的なジストロフィンタンパク質の欠失により発症する進行性の筋変性及び筋力低下を特徴とするＸ染色体関連劣性遺伝子障害を指す。ジストロフィンの欠失は、ジストロフィン遺伝子の非センス変異が原因となり得る。
「レックリングハウゼン病」とも呼ばれる「神経線維腫症１型」（ＮＦ１またはＮＦ‐１）は、ニューロフィブロミンをコードする１７番染色体上に存在するＮＦ１遺伝子の変異により引き起こされる常染色体優性遺伝性疾患である。ＮＦ１は神経系に沿って腫瘍を引き起こす。
用語「嚢胞性繊維症」とは、常染色体劣性態様で遺伝する遺伝子疾患を指す。嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症経膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の遺伝子の両複製物に変異が生じることで発症する。嚢胞性線維症は、例えば、未成熟停止コドンの導入をもたらすフレームシフト変異により発症する可能性がある（例えば、非特許文献１７参照）。
用語「神経セロイドリポフスチン症」とは、リソソーム中のトリペプチドの変化に関連する神経変性リソソーム蓄積症を指す。神経セロイドリポフスチン症は、例えば他の変異の中でも、トリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ１）またはＣＬＮ２‐遺伝子のフレームシフト変異に起因する可能性がある（例えば、非特許文献１８参照）。
用語「フレームシフト抑制」とは、フレームシフト変異の影響を消し、野生型の表現型を少なくとも部分的に復旧する機序を指す。
用語「抑制因子ｔＲＮＡ」とは、いくつかの翻訳系において、メッセンジャーＲＮＡの読み取りを改変するｔＲＮＡを指す。抑制因子ｔＲＮＡの例としては、アミノ酸を担持し、２つの連続したコドンを覆う変異コドンに塩基対合できるｔＲＮＡが挙げられる。この２つの連続したコドンの１つは無傷であり、他の１つは挿入または欠失がある。従って、翻訳系によりリーディングフレームが修正できる。
核酸に関連する用語「相同性」は、核酸のヌクレオチド配列と他の核酸のヌクレオチド配列との間の類似性または同一性の程度を指す。相同性は、第１の配列中のある位置と第２の配列中の対応する位置を比較して、その位置に同一のヌクレオチドが存在するか否かを判定することにより決定する。最良の配置を可能にするためには、配列ギャップを考慮に入れなければならない場合もある。２つの核酸間の類似性または同一性の程度を決定するためには、比較する核酸の最小長さ、例えば、各配列中のヌクレオチドの少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、または９９．５％を考慮に入れることが好ましい。好ましくは、比較のため、各核酸（単数または複数）の全長を使用する。２つの配列の類似性または同一性の程度は、ＭＵＳＣＬＥなどのコンピュータープログラム（非特許文献１９）、またはＭＡＦＦＴ（非特許文献２０）を用いて決定できる。本明細書において、「ｘ％相同的である」または「ｘ％の相同性」といった用語を使用する場合、この用語は、２つの核酸が配列同一性または類似性を有し、好ましくは配列同一性がｘ％、例えば５０％であることを意味する。
用語「アミノアシル化」とは、ｔＲＮＡにアミノ酸を担持させる酵素反応を指す。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）は、特定の同族アミノ酸またはその前駆体を、適合可能な同族ｔＲＮＡへとエステル化することを触媒し、アミノアシル‐ｔＲＮＡを形成する。従って、用語「アミノアシル‐ｔＲＮＡ」とは、アミノ酸が結合したｔＲＮＡを指す。各アミノアシル‐ｔＲＮＡ合成酵素は、あるアミノ酸に対して非常に特異的である。同じアミノ酸に対して複数のｔＲＮＡが存在する場合もあるが、２０種のタンパク質原性アミノ酸の各々に対してアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は１種しか存在しない。用語「担持」または「付加」は、「アミノアシル化」の同義語としても用いられる場合がある。本発明の合成ｔＲＮＡに関連する用語「アミノアシル化」とは、ｔＲＮＡが標的細胞に入る時に既にアシル化されているようにアミノ酸またはジペプチドを既に担持させた（事前に担持させた）合成ｔＲＮＡを指す。この文脈では、用語「事前にアミノアシル化した」を同義語として使用してもよい。
ｔＲＮＡに関する用語「修飾ヌクレオチド」（または「異常ヌクレオチド」）は、修飾または異常ヌクレオチド塩基、即ち、通常の塩基であるアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）以外の塩基を有するヌクレオチドを指す。修飾ヌクレオチドの例としては、４‐アセチルシチジン（ａｃ４ｃ）、５‐（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン（ｃｈｍ５ｕ）、２’‐Ｏ‐メチルシチジン（ｃｍ）、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２ｕ）、５‐カルボキシメチルアミノメチルウリジン（ｃｍｎｍ５ｕ）、ジヒドロウリジン（ｄ）、２’‐Ｏ‐メチルシュードウリジン（ｆｍ）、ベータ、Ｄ‐ガラクトシルキュエオシン（ｇａｌ ｑ）、２’‐Ｏ‐メチルグアノシン（ｇｍ）、イノシン（ｉ）、Ｎ６‐イソペンテニルアデノシン（ｉ６ａ）、１‐メチルアデノシン（ｍ１ａ）、１‐メチルシュードウリジン（ｍ１ｆ）、１‐メチルグアノシン（ｍ１ｇ）、１‐メチルイノシン（ｍ１ｉ）、２，２‐ジメチルグアノシン（ｍ２２ｇ）、２’‐Ｏ‐メチルアデノシン（ａｍ）、２‐メチルアデノシン（ｍ２ａ）、２‐メチルグアノシン（ｍ２ｇ）、３‐メチルシチジン（ｍ３ｃ）、５‐メチルシチジン（ｍ５ｃ）、Ｎ６‐メチルアデノシン（ｍ６ａ）、７‐メチルグアノシン（ｍ７ｇ）、５‐メチルアミノメチルウリジン（ｍａｍ５ｕ）、５‐メトキシアミノメチル‐２‐チオウリジン（ｍａｍ５ｓ２ｕ）、ベータ、Ｄ‐マンノシルキュエオシン（ｍａｎ ｑ）、５‐メトキシカルボニルメチル‐２‐チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２ｕ）、５‐メトキシカルボニルメチルウリジン（ｍｃｍ５ｕ）、５‐カルバモイルメチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５‐カルバモイルメチル‐２’‐Ｏ‐メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５‐メトキシウリジン（ｍｏ５ｕ）、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐イソペンテニルアデノシン（ｍｓ２ｉ６ａ）、Ｎ‐（（９‐ベータ‐Ｄ‐リボフラノシル‐２‐メチルチオプリン‐６‐ｙｌ）カルバモイル）トレオニン（ｍｓ２ｔ６ａ）、Ｎ‐（（９‐ベータ‐Ｄ‐リボフラノシルプリン‐６‐ｙ１）Ｎ‐メチルカルバモイル）トレオニン（ｍｔ６ａ）、ウリジン‐５‐オキシ酢酸‐メチルエステル（ｍｖ）、ウリジン‐５‐オキシ酢酸（ｏ５ｕ）、ワイブトキソシン（ｏｓｙｗ）、シュードウリジン（ｐ、Ψ）、キュエオシン（ｑ）、２‐チオシチジン（ｓ２ｃ）、５‐メチル‐２‐チオウリジン（ｓ２ｔ）、２‐チオウリジン（ｓ２ｕ）、４‐チオウリジン（ｓ４ｕ）、５‐メチルウリジン（ｔ）、Ｎ‐（（９‐ベータ‐Ｄ‐リボフラノシルプリン‐６‐イル）‐カルバモイル）トレオニン（ｔ６ａ）、２’‐Ｏ‐メチル‐５‐メチルウリジン（ｔｍ）、２’‐Ｏ‐メチルウリジン（ｕｍ）、ワイブトシン（ｙｗ）、３‐（３‐アミノ‐３‐カルボキシ‐プロピル）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕ（ｘ）が挙げられる。
用語「対応する修飾ヌクレオチド」とは、配列中の所与の位置にある修飾ヌクレオチドを指し、その修飾ヌクレオチドの塩基は、修飾ヌクレオチドを含む配列と比較すべき元の配列中の同じ位置で、ヌクレオチドの通常の、即ち修飾されていない塩基をベースとして修飾されている。従って、対応する修飾ヌクレオチドは、細胞内で、通常のヌクレオチドを修飾することにより通常のヌクレオチドから通常生成されるヌクレオチドであればどのようなヌクレオチドでもよい。ウリジンに対応する修飾ヌクレオチドは、例えば、ウリジンの修飾に由来するヌクレオチドであればどのようなヌクレオチドでもよい。一例として、配列中の特定の位置にある５‐（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン（ｃｈｍ５ｕ）は、元の配列の同じ位置にあるウリジンに対応する修飾ヌクレオチドであってもよい。ウリジンに対応する更なる修飾ヌクレオチドとしては、例えば、５‐メチルウリジン（ｔ）、２’‐Ｏ‐メチル‐５‐メチルウリジン（ｔｍ）、２’‐Ｏ‐メチルウリジン（ｕｍ）、または５‐メトキシウリジン（ｍｏ５ｕ）が挙げられる。別の例として、イノシンはアデノシンから生成されるため、アデノシンに対応する修飾ヌクレオチドである。
本発明の合成転移ＲＮＡは、天然ｔＲＮＡをベースとして合成してもよい。しかし、本発明のｔＲＮＡは、好ましくは、計算により（「インシリコ」）設計し、インビトロで化学的及び／または酵素的に合成する。本発明の合成ｔＲＮＡを計算により設計することにより、細胞内に存在する他のｔＲＮＡに干渉しないｔＲＮＡが設計及び合成できる。生細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に天然に存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素により、変異コドンに隣接するコドンまたはインデルを受けた野生型コドンにコードされた特定のアミノ酸をｔＲＮＡに担持させることができるように、本発明の合成ｔＲＮＡを選択または設計する。
アンチコドンループの拡大による不安定化の可能性を阻止するために、本発明の合成ｔＲＮＡは、そのアンチコドンループの内部または外部で、安定性が高まるように更に構造的に修飾してもよい。好ましくは、天然の３ヌクレオチドのアンチコドンが４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドのアンチコドンに置換された天然ｔＲＮＡと比較して安定性が少なくとも同等または高くなるように、または同族アミノ酸の天然ｔＲＮＡと比較して安定性が少なくとも同等または高くなるように、本発明のｔＲＮＡを設計する。用語「安定性」とは、翻訳因子が存在しない状態でｔＲＮＡが安定して正しく折り畳まれた機能的構造を取ることを指し、折り畳み時の自由エネルギー変化を推定することで予測可能であり、及び／または、ｔＲＮＡと伸長因子とを相互作用させて伸長を可能にする伸長因子との安定的な結合を指す。「高い安定性」とは、例えば、機能的状態へとｔＲＮＡが折り畳まれる時の望ましい自由エネルギー変化が大きいことを意味する。これは、所望の構成の、即ち、十分にまたは完全に折り畳まれたｔＲＮＡ分子の割合が高いことも意味する。「より高い安定性」とは、伸長因子との結合の安定性が高いこと、例えば、結合親和性が高いことを意味し得るが、更に、翻訳部位の好ましく滞りない伸長を可能にすることも意味する。４ヌクレオチドアンチコドンを有する本発明の合成転移ＲＮＡの安定性は、３ヌクレオチドアンチコドンが４ヌクレオチドアンチコドンと置換された天然転移ＲＮＡに匹敵するか、または同族アミノ酸の天然ｔＲＮＡに匹敵する。また、５ヌクレオチドアンチコドンを有する本発明の合成転移ＲＮＡの安定性は、３ヌクレオチドアンチコドンが５ヌクレオチドアンチコドンに置換された天然転移ＲＮＡに匹敵するか、または同族アミノ酸の天然ｔＲＮＡに匹敵する。安定性の低いｔＲＮＡと比較して、本発明の合成ｔＲＮＡの高い安定性により、細胞内の折り畳まれたｔＲＮＡの濃度が高まる。更に好ましくは、本発明の合成ｔＲＮＡは、伸長因子（例えばｅＥＦ１Ａ）との複合体においては安定性が低くなるように構成しているため、翻訳の際にｔＲＮＡの機能が乱雑になり、その結果、抑制が活性的になる。
ｔＲＮＡは、例えば、アンチコドンアーム、またはアンチコドンアーム以外の成分、例えば、Ｄアーム、Ｔアーム、可変アームのヌクレオチド組成に従って修飾してもよい。例えば、本発明の合成ｔＲＮＡは、アンチコドンループ中、３２位にＣ、即ちヌクレオチドＣを有し、３７位にＡ、即ちヌクレオチドＡを有することが好ましい。このナンバリングは上述のｔＲＮＡナンバリング規定に従っている。更に、アンチコドンループはＧ‐ＣまたはＣ‐Ｇ対に挟まれていること、即ち、アンチコドンループの方向にアンチコドンステムの末端でＧ‐ＣまたはＣ‐Ｇ対を有することが好ましい。用語「Ｇ‐Ｃ対」または「Ｃ‐Ｇ対」とは、水素結合を介して対合し、アンチコドンループにより５’‐３’方向に分離される塩基（ヌクレオチド）Ｃ及びＧを指す。ｔＲＮＡナンバリング規定に従って、Ｇ‐ＣまたはＣ‐Ｇ対は３１位及び３９位の位置を取る。即ち、「Ｇ‐Ｃ」対の場合、３１位にＧ、３９位にＣがあり、または「Ｃ‐Ｇ」対の場合、３１位にＣ、３９位にＧがある。別の好ましい実施形態では、Ｕ‐Ａ対（５’‐３’方向）はアンチコドンループを挟み、即ち、ｔＲＮＡのナンバリング規定によれば、アンチコドンループの方向のアンチコドンステムの末端、即ち３１位及び３９位に位置する。
＋１フレームシフト変異または１フレームシフト変異の抑制因子としての使用に適し、３１位にＵ、３９位にＡを有するアンチコドンループを持つアンチコドンアーム（Ｕ３１‐Ａ３９アンチコドンアーム）の例は以下の通りである。
＋１フレームシフト：
ＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵ（配列番号１７）
－１フレームシフト：
ＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵ（配列番号１８）
下線部のＮは４ｎｔまたは５ｎｔのアンチコドンを表す。
＋１フレームシフト：
ＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵ（配列番号１７）
－１フレームシフト：
ＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵ（配列番号１８）
下線部のＮは４ｎｔまたは５ｎｔのアンチコドンを表す。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の合成ｔＲＮＡは以下の構造を有するＴステムを含む。
Ｎ1ＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＮ2、配列中、
Ｎ1＝Ａ、Ｇ、またはＣ
Ｎ2＝Ｃ、Ｕ、またはＧ
最初の５つのヌクレオチド（Ｎ1ＣＧＧＧ）及び最後の５つのヌクレオチド（ＣＣＣＧＮ2）は対合し、Ｔステムを形成し、その間にＴループがある。
Ｎ1とＮ2との好ましい組み合わせは以下の通りである。
Ｎ1＝Ｇ、Ｎ2＝Ｃ
Ｎ1＝Ａ、Ｎ2＝Ｕ
Ｎ1＝Ｇ、Ｎ2＝Ｕ
Ｎ1＝Ｃ、Ｎ2＝Ｇ
Ｎ1ＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＮ2、配列中、
Ｎ1＝Ａ、Ｇ、またはＣ
Ｎ2＝Ｃ、Ｕ、またはＧ
最初の５つのヌクレオチド（Ｎ1ＣＧＧＧ）及び最後の５つのヌクレオチド（ＣＣＣＧＮ2）は対合し、Ｔステムを形成し、その間にＴループがある。
Ｎ1とＮ2との好ましい組み合わせは以下の通りである。
Ｎ1＝Ｇ、Ｎ2＝Ｃ
Ｎ1＝Ａ、Ｎ2＝Ｕ
Ｎ1＝Ｇ、Ｎ2＝Ｕ
Ｎ1＝Ｃ、Ｎ2＝Ｇ
好ましい実施形態では、Ｔアームは、以下の一般配列（配列番号１９）を有する。
Ｎ1ＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮ2
Ｎ1及びＮ2は上記で定義したとおりであり、
内側の連続したＮはＴループを形成し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたは任意の対応する修飾ヌクレオチドである。
Ｔループは以下の配列を有していてもよい。
ＵＵＣＧＡＡＵ
Ｎ1ＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮ2
Ｎ1及びＮ2は上記で定義したとおりであり、
内側の連続したＮはＴループを形成し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたは任意の対応する修飾ヌクレオチドである。
Ｔループは以下の配列を有していてもよい。
ＵＵＣＧＡＡＵ
従って、好ましい実施形態では、Ｔアームは以下の配列番号２０の配列を有してもよい。
Ｎ1ＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮ2
配列中、Ｎ1及びＮ2は上記で定義したとおりである。
Ｔアームの特に好ましい実施形態は以下の通りである。
ＧＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＣ、
ＡＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＵ、
ＧＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＵ、または
ＣＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＧ
Ｔループは、好ましくは、上記で与えられた配列（ＵＵＣＧＡＡＵ）を有し、Ｔアームは好ましくは、以下の配列を有する。
ＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＣ（配列番号２１）、
ＡＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＵ（配列番号２２）、
ＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＵ（配列番号２３）、または
ＣＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＧ（配列番号２４）
上記のようなＴアームを含む本発明の合成ｔＲＮＡは安定性に優れ、特にフレームシフト変異の抑制のみならず、非センス変異（センスコドンを停止コドンに変換する変異、ＰＴＣ）を抑制するための抑制因子ｔＲＮＡとしての使用に有用である。
Ｎ1ＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮ2
配列中、Ｎ1及びＮ2は上記で定義したとおりである。
Ｔアームの特に好ましい実施形態は以下の通りである。
ＧＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＣ、
ＡＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＵ、
ＧＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＵ、または
ＣＣＧＧＧ‐Ｔ‐ループ‐ＣＣＣＧＧ
Ｔループは、好ましくは、上記で与えられた配列（ＵＵＣＧＡＡＵ）を有し、Ｔアームは好ましくは、以下の配列を有する。
ＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＣ（配列番号２１）、
ＡＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＵ（配列番号２２）、
ＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＵ（配列番号２３）、または
ＣＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＧ（配列番号２４）
上記のようなＴアームを含む本発明の合成ｔＲＮＡは安定性に優れ、特にフレームシフト変異の抑制のみならず、非センス変異（センスコドンを停止コドンに変換する変異、ＰＴＣ）を抑制するための抑制因子ｔＲＮＡとしての使用に有用である。
本発明の好ましい実施形態では、合成ｔＲＮＡは以下の配列（配列番号２５）を有する可変ループを含む。
ＵＧＧＧＧＮＮＮＮＮＮＣＣＣＣＧＣ
可変ループの好ましい実施形態の１例を以下の配列（配列番号２６）に示す。
ＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣ
ＵＧＧＧＧＮＮＮＮＮＮＣＣＣＣＧＣ
可変ループの好ましい実施形態の１例を以下の配列（配列番号２６）に示す。
ＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣ
上記のＴアームを含むｔＲＮＡと同様に、上記可変ループを含む合成ｔＲＮＡは安定性に優れていることが確認されており、フレームシフト変異の抑制だけでなく、例えば非センス変異の抑制にも有利に利用できる。
本発明の合成ｔＲＮＡは、上述のＴアームまたは可変ループをそれぞれ単独で、または組み合わせて含んでもよい。本発明のｔＲＮＡは、Ｕ３１‐Ａ３９アンチコドンアーム、即ち、３１位にＵ、３９位にＡを有するアンチコドンアームを含むことが更に好ましい。アンチコドンアームは、配列番号１７または配列番号１８に示す配列を有してもよい。
当業者は、ｔＲＮＡが特定のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）により特定のアミノ酸でアミノアシル化されること、またａａＲＳがｔＲＮＡのアクセプターステム及び／またはアンチコドンループにある固有の識別要素を介してその同族ｔＲＮＡを認識可能であることは理解している。インビボでその同族アミノ酸を付加したｔＲＮＡを提供するために、当業者は、好適な固有の識別要素を有する本発明の合成ｔＲＮＡを設計することがある。また、本発明の合成ｔＲＮＡをフレキシザイムでアミノアシル化し、アミノアシル‐ｔＲＮＡとして真核細胞にトランスフェクトすることも可能である（非特許文献２１）。
本発明のｔＲＮＡは、好ましくは、どのような天然ｔＲＮＡにも配列同一性が低く、配列同一性は、好ましくはｔＲＮＡの全長に対して、好ましくは７０％未満、６５％未満、６０％未満、６５％未満、または５０％未満であり、特に好ましくは４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４４％未満、または４３％未満である。
本発明の合成転移ＲＮＡでは、アンチコドンループは、４または５ヌクレオチドのアンチコドンを収容してｍＲＮＡと塩基対合できる十分に数の多いヌクレオチドにより延長されている。本発明の合成転移ＲＮＡのアンチコドンループは、例えば、７～１２個、好ましくは７～１０個、または８～１０個、更に特に好ましくは８または９個のヌクレオチドから構成してもよい。
本発明の合成ｔＲＮＡの延長アンチコドンループは、一実施形態では、４塩基アンチコドンを含み、このアンチコドンは、ヌクレオチドを追加した標的ｍＲＮＡ上の４塩基コドン、即ちコドン塩基トリプレットと塩基対合できる。別の実施形態では、本発明の合成ｔＲＮＡは塩基ダブレットを含む５塩基アンチコドンから成り、この塩基ダブレットは、コドン中のヌクレオチドを欠失させた後にｍＲＮＡ上のコドントリプレットから残ったコドンダブレットに塩基対合することが可能である。一方、隣接するアンチコドン塩基トリプレットは好ましくは、ｍＲＮＡ上の欠失のあるコドンに先行または後続するセンスコドン、即ち５’または３’に塩基対合する。用語「先行する」または「後続する」は、翻訳の方向、即ちｍＲＮＡの５’‐３’方向を指す。
本発明の合成ｔＲＮＡの延長アンチコドンループにおける５ヌクレオチドアンチコドンの例としては、変異していないｍＲＮＡ内のＧＡＡＡＵＣ（５’‐３’）と一致するＧＡＵＵＣ（５’‐３’方向、または３’‐５’方向のＣＵＵＡＧ）が挙げられ、ここでは、ＵＣはコドンＧＡＡのＡを欠失させた後に残った塩基ダブレットＧＡと塩基対合可能であり、ＧＡＵはイソロイシンをコードするコドンＡＵＣと塩基対合可能である。
本発明の合成転移ＲＮＡはアミノアシル化してもよく、即ち、そのアクセプターステムの末端にアミノ酸またはジペプチドを担持してもよい。ｔＲＮＡは、４または５ヌクレオチドのアンチコドンと塩基対合するセンスコドンにコードされたアミノ酸によりアミノアシル化することが好ましい。本発明の合成ｔＲＮＡは、化学的及び／または酵素的に単一のアミノ酸またはジペプチドでアミノアシル化することが可能である。ｔＲＮＡにジペプチドを付加することは、当業者に公知の方法で達成できる（例えば、非特許文献２２参照）。ｔＲＮＡをジペプチドでアミノアシル化するために、例えば、操作した細菌ｔＲＮＡ合成酵素またはＲＮＡをベースとする触媒を使用してもよい。ジペプチドは、欠失の場合、連続した未変異コドンにコードされたアミノ酸から構成されることが好ましい。このようなジペプチドでアミノアシル化された合成ｔＲＮＡを使用すると、－１フレームシフトが意図した通りに抑制され、非トランケート型タンパク質が生成されるだけでなく、野生型タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が生成される。
好ましい実施形態では、本発明の合成転移ＲＮＡは以下を有するか、または含む：ａ）５’から３’方向に、連続した配列、Ａ、Ｂ、及びＣ部分から成る配列であって、Ａ部分は、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０７、配列番号０８、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０に記載の配列のうちの１つを有するか、または含み、Ｂ部分は、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０６、配列番号２５、配列番号３１、及び配列番号３２に記載の配列のうちの１つを有するか、または含み、Ｃ部分は、配列番号５、配列番号３３、及び配列番号３４に記載の配列のうちの１つを有するか、または含む、配列；あるいは、ｂ）上記ａ）に従った配列のうちの１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列；あるいは、ｃ）上記ａ）またはｂ）の配列のうちの１つに従った配列であって、ヌクレオチドの少なくとも１つは対応する修飾ヌクレオチドで置換されている、配列。本発明のｔＲＮＡは、上記Ａ、Ｂ、及びＣ部分の任意の組み合わせから構成してよいが、但しそれら部分の順序は、５’‐３’方向にＡ‐Ｂ‐Ｃである。
好ましい実施形態では、本発明の合成ｔＲＮＡは３つの配列Ａ、Ｂ、及びＣ部分から成り、これらは、例えばホスホジエステル結合を介して５’から３’方向に共有結合している。
４ｎｔアンチコドンｔＲＮＡでは、Ａ部分は４ｎｔ‐アンチコドン（以下、下線付きの「Ｎ」）を含み、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号２７、または配列番号２８の配列を有する。
配列番号１
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号２
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号２７
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮ
配列番号２８
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵＵＮ
Ｎ＝任意のヌクレオチド、または任意の対応する修飾ヌクレオチド
ここでは以下のことに留意されたい。本発明のｔＲＮＡ配列中では未知の複数のヌクレオチド（Ｎ）を組み合わせることが可能であり、即ち配列中の位置は任意のヌクレオチドまたは対応する修飾ヌクレオチドが存在可能であるが、但し、ループの１つにあるヌクレオチドのように塩基対に関与しないヌクレオチドは例外であり、例えば、Ｔループまたはアンチコドンループは、塩基対合を介して機能的ｔＲＮＡ分子を形成できるヌクレオチドに限定される。
配列番号１
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号２
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号２７
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮ
配列番号２８
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵＵＮ
Ｎ＝任意のヌクレオチド、または任意の対応する修飾ヌクレオチド
ここでは以下のことに留意されたい。本発明のｔＲＮＡ配列中では未知の複数のヌクレオチド（Ｎ）を組み合わせることが可能であり、即ち配列中の位置は任意のヌクレオチドまたは対応する修飾ヌクレオチドが存在可能であるが、但し、ループの１つにあるヌクレオチドのように塩基対に関与しないヌクレオチドは例外であり、例えば、Ｔループまたはアンチコドンループは、塩基対合を介して機能的ｔＲＮＡ分子を形成できるヌクレオチドに限定される。
Ｂ部分は、可変長であってもよく、可変ループを含むかまたは可変ループから成り、配列番号３、４、６、２５、３１、または３２（Ｎ＝任意のヌクレオチド、または任意の対応する修飾ヌクレオチド）の配列を有することが好ましい。
配列番号３
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号６
ＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧ
配列番号２５
ＵＧＧＧＧＮＮＮＮＮＮＣＣＣＣＧＣ
配列番号３１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号３２
ＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣ
配列番号３
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号６
ＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧ
配列番号２５
ＵＧＧＧＧＮＮＮＮＮＮＣＣＣＣＧＣ
配列番号３１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号３２
ＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣ
Ｃ部分は配列番号５、３３、または３４に記載の配列を有することが好ましい。
配列番号５
ＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３３
ＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３４
ＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号５
ＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３３
ＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３４
ＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
上記Ａ～Ｃ部分から成る本発明の好ましい４ｎｔ‐アンチコドンｔＲＮＡは、例えば、以下の配列を有する（配列番号９～１２、３５～３８；Ｎ＝任意のヌクレオチド、下線はアンチコドン）。
配列番号９
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１０
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１１
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１２
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３５
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３６
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３７
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３８
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号９
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１０
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１１
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１２
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３５
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３６
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３７
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３８
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
５ｎｔ‐アンチコドンの場合、ｔＲＮＡのＡ部分は５ｎｔ‐アンチコドン（下記の下線付きの「Ｎ」）を含み、好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号２９、または配列番号３０の配列を有する（Ｎ＝任意のヌクレオチド）。
Ａ部分：
配列番号７
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号８
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号２９
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮ
配列番号３０
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵＵＮ
Ａ部分：
配列番号７
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号８
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮ
配列番号２９
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮ
配列番号３０
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＣＡＵＵＮ
Ｂ部分は可変長であってもよく、可変ループを含むか、または可変ループから成る。好ましい実施形態では、Ｂ部分は以下の配列の１つを有する。
配列番号３
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号６
ＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧ
配列番号２５
ＵＧＧＧＧＮＮＮＮＮＮＣＣＣＣＧＣ
配列番号３１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号３２
ＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣ
配列番号３
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号６
ＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧ
配列番号２５
ＵＧＧＧＧＮＮＮＮＮＮＣＣＣＣＧＣ
配列番号３１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
配列番号３２
ＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣ
Ｃ部分は、好ましくは以下の配列を有する。
配列番号５
ＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３３
ＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３４
ＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号５
ＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３３
ＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３４
ＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
本発明のＡ～Ｃ部分から成る５ｎｔ‐アンチコドンｔＲＮＡは、好ましくは以下の配列を有する（Ｎ＝任意のヌクレオチド；下線はアンチコドン）。
配列番号１３
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１４
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１５
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１６
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３９
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号４０
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号４１
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号４２
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１３
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１４
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１５
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＵＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号１６
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＣＣＵＮＮＮＮＮＡＧＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＧＣＮＵＧＧＮＵＵＣＧＡＡＵＮＣＣＡＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号３９
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号４０
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号４１
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＮＮＮＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
配列番号４２
ＮＮＣＡＧＮＮＵＧＮＮＣＧＡＧＮＮＧＵＣＵＡＡＧＮＮＮＡＵＧＧＵＣＵＮＮＮＮＮＡＡＡＣＮＮＮＵＮＵＧＧＧＧＵＣＣＡＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＮＣＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＧＮＮＮＣＵＧＮＮＡＣＣＡ
上記の配列において、Ｎは塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵのいずれか、または任意の修飾塩基を表す。好ましくは、その塩基は、図３に示すような塩基対合を侵害しない。許容される塩基対は、例えばＧ‐Ｃ、Ｃ‐Ｇ、Ａ‐Ｕ、Ｕ‐Ａ、並びにＧ‐Ｕ、Ｕ‐Ｇ、Ｉ‐Ｕ、Ｕ‐Ｉ、Ｉ‐Ａ、Ａ‐Ｉ、及びＩ‐Ｃ、Ｃ‐Ｉのような不安定な塩基対である。
本明細書で使用するような記号Ｇ、Ｃ、Ａ、またはＵは、未修飾塩基または対応する任意の修飾塩基（下記参照）を表してもよい。従って、本発明のｔＲＮＡは１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
本明細書で使用するような記号Ｇ、Ｃ、Ａ、またはＵは、未修飾塩基または対応する任意の修飾塩基（下記参照）を表してもよい。従って、本発明のｔＲＮＡは１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
明確にするために、本発明の合成転移ＲＮＡは任意の修飾ヌクレオチドを含むように合成してもしていなくともよいことに留意されたい。従って、本発明の合成転移ＲＮＡはいかなる修飾ヌクレオチドも含まなくてよい。しかし、それにも関わらず、細胞に入った後、その合成ｔＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドは細胞酵素機構により細胞内で修飾されてもよい。その結果、修飾ヌクレオチドを含まずに設計、合成、及び投与されている本発明の合成ｔＲＮＡは、生細胞中で、細胞がヌクレオチドに行った修飾により、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む可能性がある。実際、本発明の合成ｔＲＮＡは、修飾ヌクレオチドを全く含まずに、細胞に何らかの修飾を残すように、合成及び投与することが好ましい。
投与前に既に修飾ヌクレオチドを含むように、修飾ヌクレオチドを用いて本発明の合成ｔＲＮＡを合成する場合、本発明のｔＲＮＡは、以下の修飾ヌクレオチド（表１）の１つ以上を含むことが好ましい。
投与前に既に修飾ヌクレオチドを含むように、修飾ヌクレオチドを用いて本発明の合成ｔＲＮＡを合成する場合、本発明のｔＲＮＡは、以下の修飾ヌクレオチド（表１）の１つ以上を含むことが好ましい。
表１．ｔＲＮＡ内の存在し得る修飾ヌクレオチド及びその位置（普及した「コンセンサス」ｔＲＮＡの特定のｔＲＮＡナンバリング規定に従った位置ナンバリング、図３も参照のこと）
ｍ１ｇ、１‐メチルグアノシン；ａｍ、２’‐Ｏ‐メチルアデノシン；ｃｍ、２’‐Ｏ‐メチルシチジン；ｇｍ、２’‐Ｏ‐メチルグアノシン；Ψ、シュードウリジン；ｍ２ｇ、Ｎ２‐メチルグアノシン；ａｃ４ｃ、Ｎ４‐アセチルシチジン；ｄ、ジヒドロウリジン；ｍ２２ｇ、Ｎ２，Ｎ２‐ジメチルグアノシン；ｍ２ｇ、Ｎ２‐メチルグアノシン；Ｉ、イノシン；ｍ５ｃ、５‐メチルシチジン；ｍｃｍ５ｕ、５‐メトキシカルボニルメチルウリジン；ｍｃｍ５ｓ２ｕ、５‐メトキシカルボニル‐メチル‐２‐チオウリジン；ｎｃｍ５ｕ、５‐カルバモイルメチルウリジン；ｎｃｍ５ｕｍ、５‐カルバモイルメチル‐２’‐Ｏ‐メチルウリジン；ｑ、キュエオシン；ｍ５ｃ、５‐メチルシチジン。
上述したように、本発明の合成ｔＲＮＡの配列における未修飾ヌクレオチドは、対応する修飾ヌクレオチドで置換してもよい。従って、本発明のｔＲＮＡの上記配列における記号Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵは、未修飾の塩基または対応する任意の修飾塩基を表してもよい。配列中のＡは、例えば、アデニンヌクレオチド（Ａ）または対応する修飾ヌクレオチド、例えば、１‐メチルアデノシン（ｍ１ａ）を表してもよい。ｔＲＮＡの合成時には、使用塩基は未修飾塩基とすることも可能である。しかし、合成したｔＲＮＡの塩基は、インビトロで化学的及び／または酵素的に修飾してもよい。細胞に導入または組み込まれると、ｔＲＮＡは、未修飾または修飾ヌクレオチドを用いてインビトロで合成されたか否かに関わらず、細胞により修飾してもよい。
更なる態様では、本発明は、医薬として使用するための、本発明の第１の態様に従った合成転移ＲＮＡに関する。本発明の転移ＲＮＡは、機能的なタンパク質の欠損またはタンパク質の機能低下を引き起こすフレームシフトに関連する疾患に罹患した患者の治療に特に有用である。本発明のｔＲＮＡが有利に使用され得る疾患の例としては、神経線維腫症１型、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、クローン病、嚢胞性線維症、神経セロイドリポフスチン症、及びテイ・サックス病が挙げられる。ｔＲＮＡを細胞に送達するための好適な組成物または手段が知られている。これら手段には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとするウイルスベクターなどのウイルスベクターや、ナノ粒子へのカプセル封入、またはナノ粒子への連結が挙げられる。
更なる態様では、本発明は、フレームシフト変異に関連する疾患に罹患した患者を治療する方法に関する。当該方法には、本発明の合成転移ＲＮＡまたは本発明の合成転移ＲＮＡを含む組成物を有効量でその患者に投与することを含む。好ましい実施形態では、当該方法は、神経線維腫症１型、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、クローン病、嚢胞性線維症、神経セロイドリポフスチン症、及び／またはテイ・サックス病を治療するための方法である。
更に別の態様では、本発明は、延長アンチコドンループを有し、以下を含む合成転移ＲＮＡに関する。
ａ）配列番号３２の配列を有するか、もしくは含む可変アーム、並びに／または
ｂ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に記載の配列のうち１つを有するか、もしくは含むＴアーム、並びに／または
ｃ）ｔＲＮＡナンバリング規定に準拠した３１位のＵ、及び３９位のＡ。
ａ）配列番号３２の配列を有するか、もしくは含む可変アーム、並びに／または
ｂ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に記載の配列のうち１つを有するか、もしくは含むＴアーム、並びに／または
ｃ）ｔＲＮＡナンバリング規定に準拠した３１位のＵ、及び３９位のＡ。
本発明のこの態様のｔＲＮＡ、特に、配列番号３２の配列を有するかもしくは含む可変アームから成るｔＲＮＡ、または配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に記載の配列のうち１つを有するかもしくは含むＴアームから成るｔＲＮＡ、または配列番号３２の配列を有するかもしくは含む可変アームと、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に記載の配列のうち１つを有するかもしくは含むＴアームとの組み合わせから成るｔＲＮＡは、細胞環境、例えば哺乳動物細胞内で安定しており、非センス変異またはフレームシフト変異を抑制するために有用である。延長アンチコドンループは、フレームシフト変異または非センス変異を抑制するために４ｎｔ‐、５ｎｔ‐、または６ｎｔ‐アンチコドンを含んでもよい。従って、このｔＲＮＡは有利にも、抑制因子分子として、このような変異に関連する疾患、例えば神経線維腫症１型、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、クローン病、嚢胞性線維症、神経セロイドリポフスチン症、またはテイ・サックス病に罹患した患者を治療するために利用できる。
本発明のこの態様のｔＲＮＡは、３１位にＵ、３９位にＡを有するアンチコドンアームを有することが好ましい。アンチコドンアームは、例えば配列番号１７または配列番号１８の配列を有してもよい。本発明の態様のｔＲＮＡは、このようなアンチドンアームを単独で含んでもよいし、このようなアンチドンアームと、上述の可変ループと組み合わせても、上述のＴアームと組み合わせても、上述の可変ループ及びＴアームと組み合わせて含んでもよい。
以下、本発明を、例を挙げて、説明のみを目的とする添付図を用いて説明する。
以下、本発明を、例を挙げて、説明のみを目的とする添付図を用いて説明する。
図１は、＋１フレームシフト抑制因子として有用な本発明の合成ｔＲＮＡ１、及びヌクレオチド１３が挿入された変異コドン１７を担持する標的ｍＲＮＡ１５の概略的な例を示す。図１Ａは、ヌクレオチド１３が挿入された変異コドン１７を有するｍＲＮＡ１５に結合した合成ｔＲＮＡ１を示し、図１Ｂは、変異コドン１７を有するｍＲＮＡ１５を示し、図Ｃは、ヌクレオチド１３が追加された元の非変異（野生型）ｍＲＮＡ１５を示す。本発明の合成ｔＲＮＡ１は、ｔＲＮＡヌクレオチド１１から成り、ＣＣＡ尾部１０を有するアクセプターステム２、ＴΨＣループ６を有するＴアーム３、Ｄループ７を有するＤアーム４、５ヌクレオチドステム部分８及びアンチコドンループ９を有するアンチコドンアーム５を含む天然ｔＲＮＡの共通クローバー葉構造を有する。アミノ酸１４はアクセプターステム２のＣＣＡ尾部１０に結合する。延長アンチコドンループ９は９つのヌクレオチド１１から成り、４ヌクレオチド（クアドラプレット）アンチコドン１２、即ち通常の３つのヌクレオチドの代わりに４つのヌクレオチド（中黒の丸）から成る「コドン」を含む。４ヌクレオチドアンチコドン１２は、ｍＲＮＡヌクレオチド１６から成る標的ｍＲＮＡ１５上の変異コドン１７（同様に中黒）と塩基対合できる。変異コドン１７は、元の塩基トリプレットコドンが挿入ヌクレオチド１３により延長されるように挿入を有する。４ヌクレオチドアンチコドン１２（中黒の丸）はｍＲＮＡ１５上の変異コドン１７（同様に中黒）と塩基対合できる。ｔＲＮＡは未変異コドンにコードされたアミノ酸を担持することが好ましい。Ｔアームとアンチコドンアームとの間の可変ループは図に示していない。
図２は、－１フレームシフト抑制因子として有用な、本発明の合成ｔＲＮＡ１の概略的な例を示す。図２Ａに示すように、本発明の合成ｔＲＮＡ１の本実施形態は、５ヌクレオチドアンチコドン１９、即ち、ｍＲＮＡ１５上の相補的な５つのヌクレオチドと塩基対合可能な５つのヌクレオチドから成るアンチコドンを担持する。図２Ｂ及び図２Ｃは、変異したｍＲＮＡ１５（Ｂ）及び元の未変異ｍＲＮＡ１５（Ｃ）を示す。変異ｍＲＮＡ１５は、ヌクレオチド２０が欠失した変異コドン２２（ハッチングした部分）を担持する。先行する未変異コドン２１、即ち元のヌクレオチドトリプレットコドンは、中黒で示す。本明細で示す実施形態では、５ヌクレオチドアンチコドン１９は、変異（トランケート）コドン２２に先行する相補的なコドン２１と塩基対合可能な３つのヌクレオチド（中黒の丸）から成り、また、残りの２つのヌクレオチド（ハッチングした丸）は、変異コドン２２（同様にハッチングしている）、即ち、元のコドン２２からヌクレオチド２０が欠失した後に残ったヌクレオチドダブレットと塩基対合可能である。ｔＲＮＡ１は、変異コドン２２に先行するコドン２１にコードされたアミノ酸１４、または元の未変異コドン２２にコードされたアミノ酸１４を担持してもよい。また、変異コドンに先行するコドン２１及び変異コドンにコードされたアミノ酸から成るジペプチドをｔＲＮＡに付加することも可能である。当然ながら、ｔＲＮＡは、変異コドンが未変異コドンに先行する２つのコドンと塩基対合するように設計することも可能である。
図３は、普及している「コンセンサス」ｔＲＮＡに適用され、５’末端が１で始まり、３’末端が７６で終わる従来のナンバリングに準拠してナンバリングしたｔＲＮＡの一例を示す。このような「コンセンサス」ｔＲＮＡでは、先行するヌクレオチドの実際の数に関わらず、天然アンチコドントリプレット２５のヌクレオチドは常に３４位、３５位、及び３６位にある。ｔＲＮＡには、例えば、１位と３４位との間、例えば、Ｄループ中や、４５位と４６位との間の可変ループ２４中にヌクレオチドが追加されてもよい。追加したヌクレオチドは、例えば、２０ａ、２０ｂ等のように、アルファベットを付加してナンバリングしてもよい。可変ループ２４では、追加したヌクレオチドは、ループ中のヌクレオチドの位置に応じて、前に「ｅ」、後ろに数字を付けてナンバリングする。例えば上記の表１に収載しているような修飾ヌクレオチドが配列中に存在してもよい。
ｔＲＮＡの安定性や非正規コドン（タンパク質原性アミノ酸をコードしないヌクレオチドトリプレット）の読み取り能力に及ぼす様々なヌクレオチド及びヌクレオチド対の影響を試験するために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中で様々な構成物を試験した。このため、初めにｔＲＮＡをインビトロで転写し、次いでレポータープラスミドと共にＨｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトした。レポータープラスミドはルシフェラーゼ遺伝子を含み、当該ルシフェラーゼ遺伝子では、開始コドンの下流で非正規コドンが組み込まれ、ここに試験ｔＲＮＡの全てが対合する。ｔＲＮＡの変化はＴ‐ステム及びアンチコドンステム中で起こり、残りのｔＲＮＡ体は一定に保たれた。
以下のＴアーム及びアンチコドンアームを単独または組み合わせて試験した（以下の表２参照）。ステム部分のみが変化し、Ｔアーム（ＵＵＣＧＡＡＵ）のループ及び試験したアンチコドンアーム（ＣＵＵＣＡＡＡ、下線はアンチコドン）のループはそのままであった。
組み合わせ実験（修正Ｔステム＋修飾アンチコドンステム）では、上述のＡ‐ステム変異体１（Ｕ３１‐Ａ３９）をアンチコドンステムとして使用した。
インビトロでのｔＲＮＡ転写
設計したｔＲＮＡのＴ７プロモーター駆動転写用テンプレートは、Ｔ７プロモーター配列（５’‐ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ‐３’）を含む各ｔＲＮＡの全長をカバーする２つの重複するＤＮＡオリゴヌクレオチド（市販品）のアニーリング及びプライマー延長により生成した。両オリゴヌクレオチドは９５℃で２分間変性させ、０．２ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、室温で３分間インキュベートすることにより、部分的に重複した領域でアニーリングした。ＤＮＡ鋳型を補完して完全二本鎖ＤＮＡにするため、アニーリングしたオリゴヌクレオチドに０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、及び１×ＲＴ緩衝液を添加し、反応物を３７℃で４０分間インキュベートした。ＤＮＡテンプレートをフェノール／クロロホルムで精製した。
設計したｔＲＮＡのＴ７プロモーター駆動転写用テンプレートは、Ｔ７プロモーター配列（５’‐ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ‐３’）を含む各ｔＲＮＡの全長をカバーする２つの重複するＤＮＡオリゴヌクレオチド（市販品）のアニーリング及びプライマー延長により生成した。両オリゴヌクレオチドは９５℃で２分間変性させ、０．２ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、室温で３分間インキュベートすることにより、部分的に重複した領域でアニーリングした。ＤＮＡ鋳型を補完して完全二本鎖ＤＮＡにするため、アニーリングしたオリゴヌクレオチドに０．４ｍＭのｄＮＴＰ、４Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、及び１×ＲＴ緩衝液を添加し、反応物を３７℃で４０分間インキュベートした。ＤＮＡテンプレートをフェノール／クロロホルムで精製した。
ｔＲＮＡのインビトロＴ７駆動型転写を行うために、１×転写緩衝液中で３０μｇのｄｓＤＮＡテンプレートと、２ｍＭのＮＴＰ、５ｍＭのＧＭＰ、及び０．６Ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を混合し、３７℃で一晩インキュベートした。ｔＲＮＡをエタノールで沈殿させ、１０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、５０ｍＭのＫＯＡｃ及び２００ｍＭのＫＣｌ ｐＨ７．０と共に、一定に振盪（１０００ｒｐｍ）しながら４℃で一晩溶出させた。ｔＲＮＡをろ過し、エタノール沈殿により回収し、ＤＥＰＣ‐Ｈ2Ｏに再懸濁した。１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動でｔＲＮＡの完全性を分析し、ｔＲＮＡを今後の使用のために－８０℃で保存した。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞中でのｔＲＮＡ効率試験
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を添加したＤＭＥＭ培地中、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。同時トランスフェクトの１日前に、約１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクト混合物は、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）中、レポータープラスミド（ｐＧＬ４．５１［ｌｕｃ２／ＣＭＶ／Ｎｅｏ］骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国））（２５ｎｇ／ウェル）、抑制因子ｔＲＮＡ（１００ｎｇ／ウェル）、リポフェクタミン３０００（０．３μｌ／ウェル）及びＰ３０００試薬（０．２μｌ／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を含む。細胞をトランスフェクト混合物と共に５時間インキュベートした。その後、培地を新鮮な培地と交換した。２４時間後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を添加し、攪拌しながら室温で１５分掛けて溶解した。Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を添加し、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、スイス）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を添加したＤＭＥＭ培地中、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。同時トランスフェクトの１日前に、約１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクト混合物は、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）中、レポータープラスミド（ｐＧＬ４．５１［ｌｕｃ２／ＣＭＶ／Ｎｅｏ］骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国））（２５ｎｇ／ウェル）、抑制因子ｔＲＮＡ（１００ｎｇ／ウェル）、リポフェクタミン３０００（０．３μｌ／ウェル）及びＰ３０００試薬（０．２μｌ／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を含む。細胞をトランスフェクト混合物と共に５時間インキュベートした。その後、培地を新鮮な培地と交換した。２４時間後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を添加し、攪拌しながら室温で１５分掛けて溶解した。Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を添加し、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、スイス）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
設計したｔＲＮＡでは、Ｔ‐ステム及びアンチコドンステム中のヌクレオチド対が変化した一方で、ｔＲＮＡの他の部分は全て一定のままであった（上述を参照）。インビトロで転写したｔＲＮＡ１００ｎｇを、非正規コドンを有するルシフェラーゼレポーターを発現するｐＧＬ４．５１［ｌｕｃ２／ＣＭＶ／Ｎｅｏ］と同時トランスフェクトし、２４時間掛けて発現させた。非正規コドンへ対合すると、ルシフェラーゼ活性が得られ、このルシフェラーゼ活性を、マイクロプレートリーダーを用いてＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ発現を測定して監視した。結果を下記表２に示す。
表２：Ｔステムまたはアンチコドン（Ａ）ステムを最適化した様々なｔＲＮＡ設計物の活性。設計したｔＲＮＡでは、Ｔ‐ステム及びアンチコドンステム中のヌクレオチド対が変化し、それによりｔＲＮＡの他の部分は全て一定のままであった。インビトロで転写したｔＲＮＡ１００ｎｇを、非正規コドンを有するルシフェラーゼレポーターを発現するｐＧＬ４．５１［ｌｕｃ２／ＣＭＶ／Ｎｅｏ］と同時トランスフェクトし、２４時間掛けて発現させた。非正規コドンへ効率的に対合すると、ルシフェラーゼ活性が得られ、このルシフェラーゼ活性を、マイクロプレートリーダーを用いてホタルルシフェラーゼ酵素活性により監視した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。
a Ｔ‐ステム変異体の安定化エネルギーは、エネルギーがΔＧ°＝０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである伸長因子への天然ヒトＳｅｒ‐ｔＲＮＡ変異体の結合を介した安定化エネルギーとの差（ΔΔＧ°）として計算する。伸長因子はＴ‐ステムに特異的に結合するため、このエネルギーはＴ‐ｓｔｅｍ変異体にのみ与えられ、複合変異体には与えられない。
b 異なるルシフェラーゼ基質を用いて複数セットの実験を行ったため、各実験はセットそれぞれの対照と比較する必要があったことに留意されたい。２つのセットは太いレーンで区切られている。
c Ｆｌｕｃ活性の割合は、野生型ルシフェラーゼ活性かｍｏｃｋ値を差し引いて計算した。
d Ａ／Ｔ変異体３及び４では、Ｔ‐ステムは更に変異して安定性aを増加させたが、これらの変異体は単一のＴ‐ステム変異体としては試験していない。
b 異なるルシフェラーゼ基質を用いて複数セットの実験を行ったため、各実験はセットそれぞれの対照と比較する必要があったことに留意されたい。２つのセットは太いレーンで区切られている。
c Ｆｌｕｃ活性の割合は、野生型ルシフェラーゼ活性かｍｏｃｋ値を差し引いて計算した。
d Ａ／Ｔ変異体３及び４では、Ｔ‐ステムは更に変異して安定性aを増加させたが、これらの変異体は単一のＴ‐ステム変異体としては試験していない。
Claims (12)
- ４ヌクレオチドのアンチコドンまたは５ヌクレオチドのアンチコドンを有する延長したアンチコドンループを含む
ことを特徴とする合成転移ＲＮＡ。 - 前記アンチコドンループは７～１２、好ましくは７～１０または８～１０ヌクレオチド、より好ましくは８または９ヌクレオチドから成る
請求項１に記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡはアミノアシル化する
請求項１または２に記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡはジペプチドでアミノアシル化する
請求項３に記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記合成ｔＲＮＡは、任意の天然ｔＲＮＡに対して７０％未満、６５％未満、６０％未満、６５％未満、または５０％未満、好ましくは４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４４％未満または４３％未満の配列同一性を有する
請求項１ないし４のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記合成転移ＲＮＡは、３ヌクレオチドのアンチコドンが４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドのアンチコドンに置換された天然転移ＲＮＡと比較して、または同族アミノ酸の天然ｔＲＮＡと比較して安定性が同等か、または高く、４ヌクレオチドアンチコドンを有する合成転移ＲＮＡの安定性は、３ヌクレオチドアンチコドンが４ヌクレオチドアンチコドンに置換された天然転移ＲＮＡに匹敵するか、または同族アミノ酸の天然ｔＲＮＡに匹敵し、また、５ヌクレオチドアンチコドンを有する合成転移ＲＮＡの安定性は、３ヌクレオチドアンチコドンが５ヌクレオチドアンチコドンに置換された天然転移ＲＮＡに匹敵するか、または同族アミノ酸の天然ｔＲＮＡに匹敵する
請求項１ないし５のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記合成転移ＲＮＡは、転移ＲＮＡナンバリング規定に準拠するナンバリングに従って、アンチコドンループ中、３２位にＣ、及び／または３７位にＡを有する
請求項１ないし６のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記延長アンチコドンループは、Ｇ‐ＣもしくはＣ‐Ｇ対に挟まれるか、または５’‐３’方向にＵ‐Ａ対に挟まれる
請求項１ないし７のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記合成転移ＲＮＡは：
ａ）５’から３’方向に、連続した配列、Ａ、Ｂ、及びＣ部分から成る配列であって、Ａ部分は、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０７、配列番号０８、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０に記載の配列のうちの１つを有するか、または含み、Ｂ部分は、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０６、配列番号２５、配列番号３１、及び配列番号３２に記載の配列のうちの１つを有するか、または含み、Ｃ部分は、配列番号５、配列番号３３、及び配列番号３４に記載の配列のうちの１つを有するか、または含む、配列；あるいは、
ｂ）上記ａ）に従った配列のうちの１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列；あるいは、
ｃ）上記ａ）またはｂ）の配列のうちの１つに従った配列であって、前記ヌクレオチドの少なくとも１つは対応する修飾ヌクレオチドで置換されている配列
を有するか、または含む
請求項１ないし８のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 医薬として使用するための
請求項１ないし９のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 野生型タンパク質と比較して機能低下または機能しないタンパク質を生成するフレームシフト変異が少なくとも部分的に原因となる疾患における医薬として使用するための
請求項１ないし９のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - クローン病、テイ・サックス病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、神経セロイドリポフスチン症、または神経線維腫症１型を治療するための医薬として使用するための
請求項１ないし９のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。
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