CN116322791A - 经修饰的功能性核酸分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含靶决定序列和调节序列的功能性核酸分子，其中该功能性核酸分子包含一种或多种化学修饰，所述的功能性核酸分子尤其用于提高靶蛋白合成效率的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于上调靶mRNA表达的功能性核酸分子，尤其是功能性RNA分子。
背景技术
随着基因组学技术的发展，人们普遍认识到一类新出现的长链非编码RNA(lncRNA)，其构成转录物类型中的大多数，不编码蛋白质，但在正常细胞的生理学以及包括癌症和神经退行性疾病在内的疾病的发展中发挥关键的调节作用。
越来越多的功能性lncRNA的发现促进了新的治疗应用，包括治疗人类遗传疾病。一类新的称为SINEUP的长链非编码RNA(lncRNA)，先前被描述为能够选择性增强其靶标的翻译。SINEUP活性依赖于两个结构域的组合：赋予特异性的重叠区域或结合结构域(BD)，以及增强靶mRNA翻译的嵌入反向SINE B2元件或效应结构域(ED)。WO 2012/133947和WO2019/150346公开了包括SINEUP的功能性核酸分子。WO 2019/058304中描述了另一类lncRNA，其使用包含内部核糖体进入位点(IRES)序列的效应结构域来提供反式作用的功能性核酸分子。
在先前的研究中，用质粒转染来递送SINEUP技术，但这需要将细胞核中转录的RNA输出，以便与细胞质中的靶mRNA共定位。因此，期望提供适合用于直接转染到细胞质中的功能性lncRNA。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供功能性核酸分子，其包含：
(a)至少一个靶决定序列，所述靶决定序列包含与待增强其蛋白质翻译的靶mRNA序列反向互补的序列；和
(b)至少一个调节序列，其包含SINE B2元件或SINE B2元件的功能活性片段，
其中该功能性核酸分子包含一种或多种化学修饰。
根据本发明的另一方面，提供包含本文所述的功能性核酸分子的组合物。
根据本发明的另一方面，提供用于提高细胞中靶标的蛋白质合成效率的方法，其包括对该细胞施用本文所述的功能性核酸分子或组合物。
附图简述
图1：体外转录的SINEUP RNA在HEK293T/17细胞中的转染。(A)SINEUP构建体的示意图。SINEUP-GFP包含与EGFP mRNA重叠的区域作为结合结构域(BD)以及反向SINEB2元件作为效应结构域(ED)。SINEUP-SCR包含乱序序列(scrambled sequence)用于替换SINEUP-GFP的BD。(B)由EGFP质粒和IVT SINEUP共转染导致的EGFP翻译上调。Western印迹图像显示了IVT SINEUP影响EGFP水平的代表性图像，其中通过使用抗GFP兔多克隆抗体进行检测。数据显示为至少3个独立实验的平均值±S.D。ns：不显著(双尾Student t检验)。(C)在EGFP质粒和IVT SINEUP共转染后，对EGFP mRNA和IVT SINEUP RNA水平的定量。ns：不显著(双尾Student t检验)。数据显示为至少3个独立实验的平均值±S.D。
图2：体外转录的具有化学修饰核苷酸的SINEUP-GFP RNA在HEK293T/17细胞中的转染。(A)核苷酸修饰的SINEUP的示意图。核苷酸dCTP和dUTP分别用5-甲基胞苷-5'-三磷酸(m5C)和假尿苷-5'-三磷酸(Ψ)或N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸(N1mΨ)替换。(B)EGFP质粒和mIVT SINEUP共转染对EGFP的翻译上调。Western印迹图像显示了mIVT SINEUP影响EGFP水平的代表性图像，其中通过使用抗GFP兔多克隆抗体进行检测。从至少三个独立的实验测量EGFP水平的上调。数据显示为平均值±S.D.。**p<0.01，*p<0.05，ns：不显著(双尾Studentt检验)。(C)在EGFP质粒和mIVT SINEUP共转染后对EGFP mRNA和mIVT-SINEUP RNA水平的定量。ns：不显著(双尾Student t检验)。数据显示为来自至少3个独立实验的平均值±SD。
图3：(A)用pEGFP-C2质粒和每种转录的SINEUP共转染后EGFP mRNA水平的定量。ns：不显著(双尾Student t检验)。数据显示为来自至少3个独立实验的平均值±S.D.。(B)用EGFP载体和每种转录的SINEUP共转染后SINEUP RNA水平的定量。**p<0.01；*p<0.05；ns：不显著(双尾Student t检验)。数据显示为来自至少3个独立实验的平均值±S.D.。
图4：转染入HepG2和Hepa 1-6细胞的、用于内源性靶标的miniSINEUP-SOX9。(A)miniSINEUP-SOX9构建体的示意图。miniSINEUP-SOX9包含与SOX9 mRNA重叠的区域作为结合结构域(BD)以及来自AS-Uchl1 RNA的反向SINE B2作为效应结构域(ED)。(B)由miniSINEUP-SOX9或miniSINEUP-Random(Rd)转染导致的SOX9蛋白翻译上调，其中miniSINEUP-Random包含随机序列而非miniSINEUP-SOX9 BD。Western印迹图像显示了SINEUP影响SOX9蛋白质水平的代表性图像。与未转染细胞(对照Cont.)相比，定量SOX9水平，显示为至少3个独立实验的平均值±SD。**p<0.01；*p<0.05；ns：不显著(双尾Student t检验)。(C)用SINEUP质粒转染后对SOX9 mRNA和miniSINEUP RNA水平的定量。ns：不显著(双尾Student t检验)。数据显示为来自至少3个独立实验的平均值±S.D.。
图5：经修饰的IVT miniSINEUP-SOX9在HepG2细胞中的转染。(A)具有5-甲基胞苷-5'-三磷酸(m5C)、假尿苷-5'-三磷酸(Ψ)或N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸(N1mΨ)的miniSINEUP-SOX9构建体中的核苷酸修饰图。MiniSINEUP-SOX9包含与SOX9 mRNA的重叠区域作为结合结构域(BD)以及SINEB2元件作为效应结构域(ED)。(B-C)由经修饰的体外转录(mIVT)的SINEUP RNA转染导致的SOX9翻译上调。Western印迹图像显示了mIVT SINEUP对SOX9蛋白质水平影响的代表性图像。与未转染的细胞(Cont.)相比，SOX9水平的定量，显示为至少3个独立实验的平均值±S.D.。**p<0.01；*p<0.05；ns：不显著(双尾Student t检验)。(D-E)用mIVT SINEUP转染后SOX9 mRNA和miniSINEUP RNA水平的定量。ns：不显著(双尾Student t检验)。数据显示为来自至少3个独立实验的平均值±S.D.。
图6：(A)pCS2+的多克隆区的示意图。(B)miniSINEUP-SOX9构建体。靶向小鼠SOX9的SINEUP由与SOX9 mRNA序列重叠的结合结构域(BD)和含有来自小鼠AS-Uchl1 RNA的反向SINEB2序列的效应结构域(ED)组成。将SINEUP克隆到pCS2+的XhoI和XbaI位点中(A)。下划线显示SOX9 mRNA的BD；ED为斜体，限制位点位于序列的每一端(XhoI，CTCGAG；XbaI，TCTAGA)。
图7：SINEUP效应在经修饰的IVT RNA中恢复。不同的修饰组合适合于保留miniSINEUP DJ1的功能。(A)来自至少3个不同实验的Western印迹定量的DJ1倍数变化。(B)用携带不同修饰的miniSINEUP RNA或用对照miniSINEUP质粒转染的细胞的代表性Western印迹图像。
图8：转染后未修饰和经修饰RNA的稳定性。(A)时程实验，显示转染后48小时内未修饰和经修饰的IVT RNA的量，与6小时时间点相比。(B)与未修饰的RNA相比，经修饰的IVTRNA的稳定倍数。数据计算为归一化的基因表达与倍数RT效率的比值(数据未显示)。
图9：经修饰的IVT SINEUP的二级结构和结构-活性关系。(A)在用Am+m6A混合物修饰的不同IVT miniSINEUP中腺苷修饰的相对含量的质谱定量、及其与SINEUP活性的相关性。(B)具有各种修饰的IVT miniSINEUP的圆二色(CD)光谱，显示活性的可能结构决定因素；有活性的经修饰的IVT SINEUP RNA的光谱重叠(含有Am或m6A+Ψ的那些)，而非活性的经修饰的IVT SINEUP与非活性的未修饰的IVT SINEUP的光谱重叠。(C)未修饰和经修饰的IVT SINEUP RNA的CD谱图。点线标记功能性miniSINEUP(Am单独或m6A+Ψ修饰)。(D)含有不同比例腺苷修饰的IVT miniSINEUP的CD光谱的比较。(E)未修饰和经修饰的IVTminiSINEUP的热稳定性。
图10：来自未修饰和经修饰的IVT SINEUP-GFP分析的mICT SINEUP-GFP RNA的修饰谱。SINEUP-GFP的RNA修饰谱，显示了整个转录物长度上的Nanocompore GMM-logit p值(y轴，-log10)。通过比较(A)0％修饰的IVT SINEUP-GFP和mICT SINEUP-GFP RNA或(B)20％假尿苷-5’-三磷酸(Ψ)mIVT SINEUP-GFP RNA和mICT SINEUP-GFP RNA，产生所述GMM-logit p值。图中用星号表示富集的kmer峰，并显示了相应的5-mer序列。
图11：mICT miniSINEUP RNA的修饰谱和突变甲基化位点对SINEUP活性的影响。(A)显示使用BstI逆转录酶通过RT-qPCR鉴定的候选m6A位点的相对位置的示意图。(B)m6A位点逆转录测定的结果。图显示了METTL3敲减细胞(右图)或对照细胞(左图)中BstI和标准逆转录酶之间的逆转录效率的比值。(C)转染对照、未突变(WT)mini-SINEUP-DJ1或突变miniSINEUP-DJ1(其中所示候选m6A位点突变为尿嘧啶以防止甲基化)后，DJ1蛋白表达的倍数变化。(D)如(B)中，相对于未突变(WT)miniSINEUP-DJ1的SINEUP活性百分比。(E)转染对照、未突变(WT)mini-SINEUP-GFP或突变miniSINEUP-GFP(其中所示候选m6A位点突变为尿嘧啶以防止甲基化)后，GFP蛋白表达的倍数变化。(F)如(E)中，相对于未突变(WT)miniSINEUP-GFP的SINEUP活性百分比。(G)对照或METLL3敲减细胞中所示SINEUP RNA突变体的甲基化miniSINEUP-GFP RNA的MeRIP。
发明详述
本发明的一个目的是，提供适用于直接施用、尤其是用作治疗剂(即核酸治疗剂)，的功能性核酸分子。在现有的基于DNA的基因治疗方法外，基于RNA的药物系统有几个优势，如避免了外源基因整合入宿主基因组的风险以及避免了可能导致非预期副作用的插入突变。通过将核苷酸修饰引入IVT SINEUP中，体外转录(IVT)的SINEUP RNA可以用作基于RNA的药物工具，以仅刺激特定靶mRNA翻译而不改变内源性mRNA本身，减少非预期的免疫反应的发生率。此外，IVT SINEUP RNA可以很容易地被缩减到最小尺寸的功能性SINEUP RNA，其可以被运输到靶器官并同时最小化对宿主的侵袭影响。产生基于RNA的药物工具的另一个实例是直接化学合成，如使用自动合成仪来产生基于RNA的寡核苷酸(也称为寡核糖核苷酸)。然而，将认识到，由于直接化学合成方法中RNA的低偶联效率，在产生长链RNA寡核苷酸时，IVT将优于直接化学合成。本文提供的证据表明，合成的、化学修饰的IVT(mIVT)SINEUP具有在基于核酸的治疗中作为有效的蛋白质产生工具的潜力，并将帮助那些患有目前难以使用常规疗法(包括基于DNA的基因治疗)来治疗的疾病的患者。
定义
本文提到的“功能性核酸分子”是本发明描述的合成分子。尤其是，“功能性核酸分子”描述了能够增强目的靶mRNA翻译的核酸分子(例如DNA或RNA)。术语“功能性RNA分子”是指，该功能性核酸分子由RNA形成，并且该RNA分子能够增强目的靶mRNA的翻译。本文描述的功能性分子可称为反式作用分子。
术语“SINE”(短散在核元件)可以称为非LTR(长末端重复)反转录转座子，是一种散在重复序列，其完整或不完整的拷贝序列大量存在于活生物体的基因组中。
WO 2012/133947中定义了术语“SINE B2元件”，其中还提供了具体实例(参见PCT公开第69页开始的表格)。该术语旨在涵盖，相对于功能性核酸分子的5’至3’取向，正向取向和反向取向的SINE B2元件。例如，可以使用公开的程序如RepeatMask(Bedell等Bioinformatics.2000年11月；16(11):1040-1.MaskerAid:a performance enhancementto RepeatMasker)来鉴定SINE B2元件。通过返回Repbase数据库中相对于SINE B2的共有序列具有Smith-Waterman(SW)得分超过225(这是RepeatMasker程序中的默认截止值)的命中，可将序列识别为SINE B2元件。通常，SINE B2元件不小于20bp且不大于400bp。优选地，SINE B2源自tRNA。
术语“SINE B2元件的功能活性片段”旨在指，SINE B2元件中保留蛋白质翻译增强效率的序列部分。该术语还涵盖相对于野生型序列在一个或多个核苷酸中突变但保留蛋白质翻译增强效率的序列。该术语旨在涵盖，相对于功能性核酸分子的5’至3’取向，具有正向取向和反向取向的SINE B2元件。
WO 2019/058304中定义了术语“内部核糖体进入位点(IRES)序列”和“内部核糖体进入位点(IRES)衍生序列”。IRES序列招募40S核糖体亚基，并促进一部分的蛋白质编码mRNA的非帽依赖性翻译。IRES序列通常见于编码应激反应基因的细胞mRNA的5’非翻译区，从而顺式刺激其翻译。术语“IRES衍生序列”应理解为指，与IRES序列具有同源性以致保留其功能活性(即翻译增强活性)的核酸序列。具体而言，IRES衍生序列可以通过基因工程或化学修饰从天然存在的IRES序列获得，例如通过分离IRES序列中保留功能的特定序列，或在IRES序列中突变/缺失/引入一个或多个核苷酸，或用结构修饰的核苷酸或类似物替换IRES序列中的一个或多个核苷酸。更具体而言，本领域技术人员将知道IRES衍生序列是能够促进双顺反子构建体中第二顺反子翻译的核苷酸序列。典型地，可以使用编码双萤光素酶(萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶)的质粒进行实验测试。存在一个主要的数据库，即IRESite，用于注释已使用双报告分子或双顺反子测定通过实验验证为IRES的核苷酸序列(http://iresite.org/IRESite_web.php)。在IRESite中，可获得基于web的工具，用于搜索目的查询序列与数据库中所有注释和实验验证的IRES序列之间基于序列和基于结构的相似性。该程序的输出结果是，任何核苷酸序列能够在双顺反子构建体的验证实验中充当IRES的概率分数。其他基于序列和基于结构的网络浏览工具可用于以数值预测值提供任何给定核苷酸序列的IRES活性潜力(http://rna.informatik.uni-freiburg.de/；http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php)。
术语“miniSINEUP”旨在指，包含结合结构域(即靶mRNA的互补序列)、可选的间隔序列和作为效应结构域的任何SINE或SINE衍生序列或IRES或IRES衍生序列(或由其组成)的核酸分子(Zucchelli等,Front Cell Neurosci.,9:174,2015)。
术语“microSINEUP”旨在指，包含结合结构域(即靶mRNA的互补序列)、可选的间隔序列和SINE或SINE衍生序列或IRES衍生序列的功能活性片段(或由其组成)的核酸分子。例如，功能活性片段可以是与AS Uchl1中SINE B2元件的核苷酸44至120相对应的77bp序列。
术语“nanoSINEUP”旨在指，包含结合结构域(即靶mRNA的互补序列)、可选的间隔序列和SINE或SINE衍生序列的功能活性片段(或由其组成)的核酸分子。例如，功能活性片段可以是与AS Uchl1中的反向SINE B2元件的核苷酸64至92相对应的29bp序列(如WO2019/150346中所定义)。
如果多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核酸序列在其整个长度上具有100％序列同一性，则称该多肽或多核苷酸序列与该其他多肽或多核酸序列相同或“同一”。序列中的残基从左到右编号，即多肽从N端到C端编号；多核苷酸从5’至3’端编号。
为了比较两个密切相关的多核苷酸序列，可以使用NCBI BLAST，使用用于核苷酸序列的标准设置(BLASTN)，计算第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“％序列同一性”。为了比较两个密切相关的多肽序列，可以使用NCBI BLAST，使用用于多肽序列的标准设置(BLASTP)，计算第一多肽序列和第二多肽序列之间的“％序列同一性”。序列之间的“差异”是指与第一序列相比，在第二序列的位置插入、缺失或取代的单核苷酸。两个序列可以包含一个、两个或多个这样的差异。在与第一序列相同(100％序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代，将导致％序列同一性降低。
功能性分子
根据本发明的第一方面，提供了一种功能性核酸分子(例如功能性RNA分子)，其包含：
(a)至少一个靶决定序列，其包含与待增强其蛋白质翻译的靶mRNA序列反向互补的序列；和
(b)至少一个调节序列，其包含SINE B2元件或SINE B2元件的功能活性片段，
其中该功能性核酸分子包含一种或多种化学修饰。
本文提供的功能性核酸分子在对细胞施用之前进行化学修饰。本文提供的实施例证实，这可以提高稳定性，尤其是对于体外转录(IVT)的功能性RNA分子的开发而言。因此，在一个实施方案中，功能性RNA分子是体外转录的RNA分子。本文提供的实施例还显示，细胞内转录(ICT)的功能性RNA分子可以包含这类修饰。因此，在另一个实施方案中，功能性核酸分子是细胞内转录的，例如自包含编码该功能性RNA分子的序列的寡核苷酸转录。
本文提供的证据表明，化学修饰的SINEUP RNA是通过直接转染合成RNA来增强靶蛋白水平的一种有效方法。术语“修饰”或“化学修饰”是指，在最常见的天然核糖核苷酸——腺苷、鸟苷、胞苷或尿苷核糖核苷酸——中或上的结构变化。尤其是，本文所述的化学修饰可以是在核碱基中或上的改变(即化学碱基修饰)、或在糖中或上的改变(即化学糖修饰)。化学修饰可以通过共转录(例如通过在合成期间用经修饰的核苷酸替代一个或多个核苷酸)或在转录后(例如通过酶的作用)而引入。
化学修饰是本领域已知的，例如，由RNAInstitute提供的RNA修饰数据库中描述的(https://mods.rna.albany.edu/mods/)。许多修饰在自然界中发生，例如对天然转移RNA(tRNA)的化学修饰，其包括例如：2'-O-甲基(例如2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷和2'-O-甲基假尿苷)、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷，2-硫胞苷、5-甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、假尿苷、二氢尿苷等。
在一些实施方案中，针对特定修饰，功能性核酸分子是被均匀修饰的(例如完全修饰，在整个序列上修饰)。例如，分子可以用假尿苷(Ψ)均匀修饰，这意味着在该RNA序列中的所有尿苷残基都被假尿苷取代。类似地，通过用经修饰的残基替换，可以针对序列中存在的任何类型的核苷残基，对核酸进行均匀修饰。功能分子可以沿着分子的整个长度被部分或完全修饰。例如，一种或多种或全部或给定类型的核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任一种或多种或全部)可以在RNA分子中或在预先确定的其序列区域中(例如在靶决定序列和/或调节序列中，包括或排除可以存在的其他序列，如接头或polyA尾)被均匀修饰。
功能性核酸分子可以包含约1％至约100％的化学修饰碱基和/或糖(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、U、C或G中的任一种或多种)或其任何居间百分比的化学修饰碱基和/或糖(例如1％-20％、1％-30％、1％-40％、1％-50％、1％-60％、1％-70％、1％-80％、1％-90％、1％-95％、10％-20％、10％-30％、10％-40％、10％-50％、10％-60％、10％-70％、10％-80％、10％-90％、10％-95％、10％-100％、20％-30％、20％-40％、20％-50％、20％-60％、20％-70％、20％-80％、20％-90％、20％-95％、20％-100％、50％-60％、50％-70％、50％-80％、50％-90％、50％-95％、50％-100％、70％-80％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、90％-95％、90％-100％和95％-100％)。应理解，任何剩余百分比都是由未修饰的A、U、C或G的存在引起的。
在一个实施方案中，功能性核酸分子的至少20％，如功能性RNA分子的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，包含化学碱基修饰。在一个实施方案中，功能性RNA分子的至少20％，如功能性分子的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，包含化学糖修饰。
在一个实施方案中，化学修饰是化学碱基修饰。化学碱基修饰可以选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和/或尿嘧啶碱基的修饰。
在一个实施方案中，功能性核酸分子的至少20％的尿嘧啶碱基被化学修饰，如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的尿嘧啶碱基被化学修饰。在另一个实施方案中，功能性核酸分子的20％的尿嘧啶碱基被化学修饰。在另一个实施方案中，功能性核酸分子的50％的尿嘧啶碱基被化学修饰。在又一个实施方案中，功能性核酸分子的100％的尿嘧啶碱基被化学修饰。在一个实施方案中，功能性分子的至少20％的腺嘌呤碱基被化学修饰，如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的腺嘌呤碱基被化学修饰。在一个具体实施方案中，功能性核酸分子的20％或更多的腺嘌呤碱基被化学修饰。因此，在另一个实施方案中，功能性核酸分子的20％的腺嘌呤碱基被化学修饰。在又一个实施方案中，功能性核酸分子的50％的腺嘌呤碱基被化学修饰。在又一个实施方案中，功能性核酸分子的100％的腺嘌呤碱基被化学修饰。在一个实施方案中，功能性分子的至少20％的胞嘧啶碱基被化学修饰，如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的胞嘧啶碱基被化学修饰。在一个实施方案中，功能性分子的至少20％的鸟嘌呤碱基被化学修饰，如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的鸟嘌呤碱基被化学修饰。
在一个实施方案中，化学碱基修饰选自甲基化和/或异构化。在另一个实施方案中，化学碱基修饰选自：假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(N1mΨ)、5-甲基胞苷(m5C)和N6-甲基腺苷(m6A)。在另一个实施方案中，化学碱基修饰选自：假尿苷、N1-甲基假尿苷和N6-甲基腺苷。
在一个实施方案中，化学修饰是化学糖修饰。在一个实施方案中，化学糖修饰是甲基化。在一个实施方案中，化学糖修饰是2'修饰，如2'-O-甲基修饰。在另一个实施方案中，化学糖修饰是2'-O-甲基腺苷(Am)，如其中功能性核酸分子的100％的腺嘌呤碱基是2'-O-甲基腺苷。
应理解，功能性核酸分子可以包含化学修饰的组合，如一种或多种类型的化学碱基修饰和一种或多种类型的化学糖修饰。例如，在一个实施方案中，功能性核酸分子包含N6-甲基腺苷和2'-O-甲基腺苷修饰。在另一个实施方案中，与N6-甲基腺苷相比2'-O-甲基腺苷的量(Am:m6A)大于3:97，如大于4:96、大于5:95、大于6:94、大于7:93、大于8:92、大于9:91、大于10:90、大于11:89、大于12:88、大于13:87、大于14:86、大于15:85、大于16:84，大于17:83、大于18:82或大于19:81。在又一个实施方案中，功能性核酸分子包含Am:m6A比值为20:80的2'-O-甲基腺苷和N6-甲基腺苷修饰。因此，在一个实施方案中，功能性核酸分子包含20％或更多(如20％)的修饰为2'-O-甲基腺苷(Am)的腺苷碱基。在另一个实施方案中，功能性核酸分子包含80％或更少(如80％)的修饰为N6-甲基腺苷(m6A)的腺苷碱基。因此，在又一个实施方案中，功能性核酸分子的100％的腺嘌呤碱基被化学修饰，其中20％或更多是2'-O-甲基腺苷，80％或更少是N6-甲基腺苷。在又一个实施方案中，20％的化学修饰的腺苷碱基是2'-O-甲基腺苷，80％是N6-甲基腺苷。在其他实施方案中，功能性核酸分子包含N6-甲基腺苷和假尿苷修饰。例如，其中功能性核酸分子的100％的腺嘌呤碱基是N6-甲基腺苷，并且100％的尿嘧啶碱基是假尿苷。
在一个实施方案中，靶决定序列包含一种或多种化学碱基和/或糖修饰。在备选实施方案中，靶决定序列不包含任何化学碱基和/或糖修饰。
在一个实施方案中，调节序列包含一种或多种化学碱基和/或糖修饰。
在一个实施方案中，靶决定序列和调节序列都包含一种或多种化学碱基和/或糖修饰。
在一个实施方案中，所述一种或多种化学碱基或糖修饰位于所述功能性核酸分子的5’端、3’端或两端。在一个实施方案中，所述一种或多种化学碱基或糖修饰位于整个功能性核酸分子上。
在一个实施方案中，功能性核酸分子还在靶决定序列和调节序列之间包含至少一个接头序列。SEQ ID NO:50是间隔/接头序列的非限制性实例。在另一个实施方案中，接头序列包含一种或多种化学碱基和/或糖修饰。
已知，如本文所述的化学修饰例如化学碱基和/或糖修饰，可以在细胞中在转录过程中自然引入核酸中。因此，这种细胞内转录(ICT)的核酸可以称为经修饰的细胞内转录的(mICT)核酸。因此，在一些实施方案中，功能性核酸分子包含一种或多种由细胞内转录引起的化学碱基和/或糖修饰。在其他实施方案中，功能性核酸分子包含见于ICT功能性核酸分子如mICT功能性核酸分子中的一种或多种化学碱基和/或糖修饰。例如，当功能性核酸分子是体外转录(IVT)或直接合成的SINEUP RNA时，可以将一种或多种化学修饰引入到所述IVT/直接合成的SINEUP RNA中，以模拟ICT SINEUP RNA如mICT SINEUP-RNA中的化学修饰。将认识到，在转染到细胞中时，包含对mICT核酸中的那些修饰的模拟修饰的IVT和直接合成的功能性核酸分子(如IVT SINEUP RNA)，将可能具有与mICT核酸相似的稳定性。因此，将见于mICT功能性核酸分子中的修饰引入IVT或直接合成的功能性核酸分子中，可导致稳定且具有功能的核酸分子的产生。在一个实施方案中，使用测序，鉴定mICT功能性核酸分子如mICT SINEUP RNA中的修饰。适宜的测序技术的一个实例是Oxford Nanopore方法，mICT功能性核酸与经修饰或未修饰的IVT功能性核酸分子的比较可以通过Nanocopore进行。在另一个实施方案中，使用RT-qPCR鉴定修饰。适合用于鉴定修饰的RT-qPCR技术的一个实例是Castellanos-Rubio等(2019)Sci.Rep.,9(4220)(doi:https://doi.org/10.1038/s41598- 019-40018-6)中所述的方法，其通过BstI酶反转录m6A残基的能力降低来鉴定甲基化和m6A残基的候选位置。
因此，在一些实施方案中，化学修饰和/或化学修饰的组合，对功能性核酸分子，例如对SINEUP RNA的序列是特异的。这种功能性核酸分子特异性化学修饰和/或组合，可通过mICT功能性核酸的测序、或通过进行本文所述的RT-qPCR来鉴定。然后可以将化学修饰和/或组合引入与所测序的mICT功能性核酸具有相同序列的IVT或直接合成的功能核酸分子中，以模拟在mICT功能性核酸分子中鉴定的化学修饰和/或组合。
在一个实施方案中，功能性核酸分子是环状的。这种构象导致稳定得多的分子，所述分子在细胞内更难被降解(核酸外切酶不能降解环状分子)，并因此在更长的时间内保持活性。
在一个实施方案中，功能性核酸分子包含3’-聚腺苷酸化(polyA)尾。“3’-polyA尾”是指添加到转录物的3’-端的腺嘌呤核苷酸长链，它为RNA分子提供稳定性并能促进翻译。
在一个实施方案中，功能性核酸分子包含5’-帽。“5’-帽”是指转录物5’-端的改变的核苷酸，它为分子提供稳定性，尤其是抵抗核酸外切酶降解的稳定性，并可以促进翻译。最常见的，5’-帽是7-甲基鸟苷酸帽(m7G)，即通过5’至5’三磷酸键与RNA连接并在7位甲基化的鸟嘌呤核苷酸。
调节序列
调节序列具有蛋白质翻译增强效率。蛋白质翻译效率的提高是指，与根据本发明的功能性核酸分子不存在于系统中的情况相比，效率提高。在一个实施方案中，由靶mRNA编码的蛋白质的表达提高至少1.2倍，如至少1.5倍，尤其是至少2倍。在另一个实施方案中，由靶mRNA编码的蛋白质的表达提高1.2至3倍之间，例如1.2至1.7倍之间。
在一个实施方案中，调节序列位于靶结合序列的3’。调节序列可以相对于功能性核酸分子的5’至3’取向呈正向或反向取向。“正向”(direct)是指其中调节序列以与功能性核酸分子相同的5’至3’方向嵌入(插入)的情况。相反，“反向”(inverted)是指其中调节序列相对于功能性核酸分子为3’至5’取向的情况。
在一个实施方案中，调节序列包含SINE B2元件或SINE B2元件的功能活性片段。SINE B2元件优选相对于功能性核酸分子的5’至3’取向呈反向取向，即反向SINE B2元件。如定义部分所述，在WO 2012/133947中公开并举例说明了反向SINE B2元件。
在提供用作核酸治疗剂的功能性RNA分子时，调节序列的短片段(如SINE B2元件)是尤其有用的。RNA分子在活生物体中高度不稳定，因此通过本文所述的化学修饰提供的稳定性对于较短的RNA分子更有效。因此，在一个实施方案中，调节序列包含小于250个核苷酸如小于100个核苷酸的功能活性片段。
优选地，该至少一个调节序列包含与选自SEQ ID NO:1-49的序列具有至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选100％序列同一性的序列。在一个实施方案中，该至少一个调节序列由与选自SEQ ID NO:1-49的序列具有至少90％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选100％序列同一性的序列组成。
SEQ ID NO:1提供了源自AS Uchl1的全长反向SINE B2转座元件。尤其优选源自该反向SINE B2元件的功能性片段，如SEQ ID NO:2(AS Uchl1中的167个核苷酸的反向SINEB2元件)、SEQ ID NO:3(AS Uchl1中的反向SINE B2元件的77个核苷酸变体，包括核苷酸44至120)、SEQ ID NO:4(AS Uchl1中的反向SINE B2元件的38个核苷酸变体，包括核苷酸59至96)或SEQ ID NO:5(AS Uchl1中的反向SINE B2元件的29个核苷酸变体，包括核苷酸64至92)。
提供了其他示例性SINE B2元件。SEQ ID NO:6-21是衍生自上述AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的其他功能活性片段。SEQ ID NO:22-33是衍生自AS Uchl1的反向SINEB2转座元件的突变功能活性片段。SEQ ID NO:34-49是不同的SINE B2转座元件。
备选地，调节序列包含IRES序列或IRES衍生序列。因此，在一个实施方案中，调节序列包含IRES序列或IRES衍生序列。该序列增强靶mRNA序列的翻译。
已经成功测试了具有48至576个核苷酸的序列的几种IRES，例如人丙型肝炎病毒(HCV)IRES、人脊髓灰质炎病毒IRES、人脑心肌炎(EMCV)病毒、人蟋蟀麻痹(cricketparalysis virus，CrPV)病毒、人Apaf-1、人ELG-1、人c-MYC、人抗肌萎缩蛋白(dystrophin,DMD)。这些序列已在WO 2019/058304中公开、定义和举例说明。
在另一个实施方案中，调节序列包含短的自由右Alu单体重复元件(free rightAlu monomer repeat element,FRAM)序列，如见于人蛋白磷酸酶1调节亚基12A的R12A-AS1天然反义转录物中的序列(PPP1R12A；Schein等(2016)Scientific Reports,6(33605),doi:https://doi.org/10.1038/srep33605)。
靶决定序列
靶决定序列(也称为靶结合序列)是功能性RNA分子中与靶mRNA结合的部分。
在WO 2012/133947中，已经表明，靶结合序列只需要具有与靶mRNA的反向互补序列约60％的相似性。事实上，靶结合序列甚至可以显示大量的错配并保留活性。
靶结合序列包含长度足以与靶mRNA转录物结合的序列。因此，靶结合序列的长度可以是至少10个核苷酸，如长度至少14个核苷酸、如长度至少18个核苷酸。此外，靶结合序列的长度可以小于250个核苷酸，优选长度小于200个核苷酸、长度小于150个核苷酸、长度小于100个核苷酸、长度小于80个核苷酸、长度小于60个核苷酸或长度小于50个核苷酸。在一个实施方案中，靶结合序列的长度在4至50个核苷酸之间，如长度在18至44个核苷酸之间。
靶结合序列可设计为与靶mRNA序列的5’非翻译区(5’UTR)杂交。在一个实施方案中，该序列与5’UTR的0至50个核苷酸，如0至40、0至30、0至21或0至14个核苷酸反向互补。备选地或组合地，靶结合序列可设计为与靶mRNA序列的编码序列(CDS)杂交。在一个实施方案中，该序列与CDS的0至40个核苷酸，如0至32、0至18或0至4个核苷酸反向互补。
靶结合序列可设计为与靶mRNA序列的AUG位点(起始密码子)如CDS内的起始密码子上游的区域杂交。在一个实施方案中，该序列与AUG位点的0至80个核苷酸，如0至70或0至40个核苷酸反向互补。备选地或组合地，靶结合序列可设计为与该AUG位点下游的靶mRNA序列杂交。在一个实施方案中，该序列与该AUG位点下游的靶mRNA序列的0至40个核苷酸，如0至4个核苷酸反向互补。
在一个实施方案中，靶决定序列长度为至少10个核苷酸，并且从3’至5’包含：
-与靶mRNA序列的5’非翻译区(5’UTR)的0至50个核苷酸以及编码序列(CDS)的0至40个核苷酸反向互补的序列；或
-与靶mRNA的AUG位点(起始密码子)上游区域的0至80个核苷酸和该AUG位点下游的靶mRNA序列的CDS的0至40个核苷酸反向互补的序列。
在一个实施方案中，靶决定序列长度为至少14个核苷酸，并且从3’至5’包含：
-与靶mRNA序列的5’UTR的0至40个核苷酸以及CDS的0至32个核苷酸反向互补的序列；或
-与靶mRNA的AUG位点(起始密码子)上游区域的0至70个核苷酸和该AUG位点下游的靶mRNA序列的CDS的0至4个核苷酸反向互补的序列。
组合物和方法
本发明的功能性核酸分子可作为裸RNA或未包装的RNA施用。备选地，功能性核酸分子可以作为组合物(例如包含适宜载体的组合物)的一部分施用。在某些实施方案中，基于其促进一种或多种功能性核酸分子转染靶细胞的能力来选择载体。
因此，根据本发明的另一方面，提供了包含本文所述的功能性核酸分子的组合物。
适宜的载体可包括本领域已知的任何标准药物载体、溶媒、稀释剂或赋形剂，其通常用于促进核酸如RNA的递送。脂质体、外泌体、脂质颗粒或纳米颗粒是可用于递送RNA的适宜载体的实例。在一个优选实施方案中，载体或溶媒将其内容物递送至靶细胞，使得功能性核酸分子递送至适当的亚细胞区室，如细胞质。
本文所述的功能性核酸分子也可以通过施用包含该经修饰的功能性核酸分子的基于RNA的寡核苷酸(也称为寡核糖核苷酸)来施用。因此，根据本发明的另一方面，提供了包含本文所述经修饰的功能性核酸的基于RNA的寡核苷酸。如上文所述，这类基于RNA的寡核苷酸可通过直接化学合成产生。经修饰的基于RNA的寡核苷酸的直接化学合成可以涉及两种策略：i)提供经修饰的亚磷酰胺(phosphoramidite)构建块并随后将其掺入RNA链/寡核苷酸；和/或ii)基于全长寡核苷酸内碱基的选择性反应，在合成后修饰RNA，其允许位点特异性和受控地将修饰掺入到寡核苷酸序列中(参见Bartosik等(2020)Molecules,25:3344,doi:10.3390/molecules25153344)。合成后修饰还允许RNA寡核苷酸中的一个构建块与各种试剂反应，从而自相同起始序列提供几种不同修饰的寡核苷酸。在一个实施方案中，包含功能性核酸分子的基于RNA的寡核苷酸被修饰，即它包含本文所述的化学修饰。在另一个实施方案中，基于RNA的寡核苷酸在本文所述的功能性核酸序列中包含位点特异性修饰。在又一个实施方案中，位点特异性修饰模拟见于ICT SINEUP RNA如mICT SINEUP RNA中的那些修饰。因此，在一些实施方案中，直接合成的基于RNA的寡核苷酸包含位点特异的化学碱基和/或糖修饰，如在合成后引入、见于ICT功能性核酸分子如mICT功能性核酸分子中的修饰。在其他实施方案中，位点特异性修饰是非天然化学修饰。因此，在一个实施方案中，直接合成的基于RNA的寡核苷酸包含非天然化学修饰和/或天然存在的化学修饰。
功能性核酸分子的另一种施用方法是通过编码功能性核酸的寡核苷酸，例如通过对细胞施用包含编码功能性核酸的序列的质粒。在这方面，术语“施用”和“递送”是可互换的。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种寡核苷酸，其包含编码本文所述的功能性核酸分子如本文所述的化学修饰的功能性RNA分子的序列。
如上文所述，化学修饰在细胞中的转录过程中自然引入核酸。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸包含序列，所述序列在细胞中转录时编码本文所述的化学修饰的功能性核酸分子。在另一个实施方案中，该序列编码包含本文所述的一种或多种化学修饰的经修饰的功能性核酸分子。在一些实施方案中，位点特异性修饰是非天然化学修饰。因此，在一个实施方案中，寡核苷酸包含非天然化学修饰和/或天然存在的化学修饰。应理解，本文中描述的任何化学修饰，包括组合、量、比例、比率或包含该化学修饰的功能性核酸分子的区域，均可应用于涉及包含功能性核酸分子编码序列的寡核苷酸和直接合成的基于RNA的寡核苷酸的本发明的这些方面和实施方案。
本发明的功能性核酸分子可以增强目的靶基因的翻译，而不影响靶基因的mRNA量。因此，它们可以成功地用作分子工具以验证细胞中的基因功能、以及执行重组蛋白生产的管道。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于提高细胞中靶标的蛋白质合成效率的方法，其包括对细胞施用本文所述的功能性核酸分子或组合物。优选地，该细胞是哺乳动物细胞，如人或小鼠细胞。
本发明的方法导致细胞中靶蛋白水平的提高，因此可用于例如与基因缺陷(即编码基因的蛋白水平降低和/或功能丧失性突变)相关的疾病的治疗方法。本发明的方法尤其可用于由预先确定的正常蛋白质水平的定量降低引起的疾病。本发明的方法可以在体外、离体或体内进行。
应理解，本文所述的实施方案可应用于本发明的所有方面，即，针对功能性核酸分子描述的实施方案可同样应用于所要求保护的方法等。
现将参考以下非限制性实施例来举例说明本发明。
实施例
实施例1-材料和方法
细胞培养
人胚肾(HEK)293T/17细胞、人肝细胞癌细胞(HepG2)和小鼠肝细胞癌细胞(Hepa1-6)获自ATCC，并在37℃、5％ CO2下，在补充10％胎牛血清(Sigma)和1％青霉素-链霉素(Wako)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(1x)+GlutaMAX-1(Gibco)中培养。
质粒和构建体
pEGFP-C2质粒购自Clontech Laboratories(Takara Bio USA)。pCS2+_SINEUP-GFP质粒在先前的研究中有描述(例如，参见Carrieri等(2012)Nature 491(7424):454-457和Toki等(2019)bioRxiv,664029)。靶向GFP的SINEUP的结合结构域(BD)，Δ5′-32nt，从原始60个核苷酸(nt)SINEUP-GFP的5’端缺失28个碱基，对应于mRNA位置-28至+4(参见Takahashi等(2018)PLoS One 13,e0183229中的图1B)。pcDNA3.1_EGFP质粒是通过将编码全长EGFP的片段(-40bp至终止密码子)从质粒pEGFP-C2克隆到pcDNA3.1(–)(ThermoFisher Scientific)中而构建的。靶向小鼠SOX9的SINEUP(命名为miniSINEUP-SOX9)由以反义方式与小鼠SOX9 mRNA重叠的BD、或包含随机序列而非SOX9结合结构域的不含BD的对照(命名为miniSINEUP-Random；Rd)、以及包含来自小鼠AS-Uchl1 RNA的反向SINE B2序列(167nt)的效应结构域(ED)组成，克隆到pCS2+载体中(图6)。
对于实施例6，用XhoI和SnaBI从pCS2支架切下miniSINEUP-DJ1(Zucchelli等(2015)Front.Cell Neurosci.9:174)，并通过使用SalI和PmeI限制位点克隆到pCMV6中T7启动子下游，以获得pCMV6-miniSINEUP-DJ1。将克隆到pCS2中的miniSINEUP-DJ1(pCS2-miniSINEUP-DJ1)和相应的pCS2空载体用作对照DNA，用于RNA转染实验中。
体外转录(IVT)RNA
使用mMESSAGE mMACHINE SP6转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，按Mandal&Rossi((2013)Nature Protocols 8:568-82中所述方案的改良，使用以下核苷酸修饰，合成了SINEUP RNA：用5-甲基胞苷-5'-三磷酸(m5C)替换CTP，用假尿苷-5’-三磷酸(Ψ)或N1-甲基假尿苷-5’-三磷酸(N1mΨ)替换UTP。经修饰的核苷酸均来自TriLink(终浓度7.5mM)。将试剂与40ng/μL(终浓度)的线性化SINEUP质粒混合。使用大肠杆菌poly A聚合酶(5000U/mL；目录号M0276，New England Biolabs)，在37℃下30分钟，将poly A尾添加到体外转录(IVT)的RNA上。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取产生的经修饰的体外转录(mIVT)RNA。
对于实施例6，使用Megascript T7试剂盒(ThermoFisher Scientific)在体外转录未修饰和经修饰的RNA分子。经修饰的核苷酸三磷酸(2'-O-甲基-ATP、N6-甲基-ATP和假尿苷)购自TriLink Biotechnologies。按照试剂盒制造商的建议，组装体外转录反应，并在37℃下孵育过夜(16小时)。所有转录物在37℃下用DNAse I处理15分钟，并立即使用RNeasymini试剂盒(Qiagen)纯化。通过紫外可见分光光度法和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检查所有转录物的纯度和完整性。
质粒和RNA转染条件
将HEK293T/17细胞接种到12孔板(1x 105个细胞/孔)中，24小时后转染质粒或RNA(IVT或mIVT)。为了检测EGFP，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)和OptiMEM(1x)降血清培养基(Gibco)，在每个孔中用1380ng SINEUP-GFP质粒或720ng(m)IVT SINEUP-GFP RNA与300ng pEGFP-C2共转染。转染后24小时收获细胞。为了检测内源性SOX9，将HEK293T/17细胞接种到12孔板(1×105个细胞)中，24小时后每孔转染2μgminiSINEUP-SOX9质粒或100ngmIVT miniSINEUP-SOX9 RNA。在质粒转染后24和48小时以及mIVT转染后24小时收获细胞。
对于实施例6，将ATCC购买的HEK293T/17细胞，在补充10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素抗生素混合物以及1％HEPES缓冲液的、来自GIBCO的含L-谷氨酰胺DMEM高葡萄糖培养基(4.5g/L D-葡萄糖)中培养。将HEK293T/17细胞以1:5至1:10传代，并在传代数10内使用细胞系。按照以下流程，使用聚乙烯亚胺(PEI)(MW 25000，支链，Sigma，目录号408727)转染RNA。转染前24小时，在DMEM完全培养基中，将细胞以250000个/孔的密度接种在六孔板中。第二天，即转染前，培养基替换为每孔1ml Opti-MEM(ThermoFisher Scientific)。在室温下制备转染混合物，其在160μl不含血清和抗生素的DMEM中含有400ng RNA。向反应中加入2.5μl 40μM PEI，将管短暂涡旋1秒钟，并在室温下孵育10分钟。将管再次涡旋1秒钟并加至细胞中。在48小时收获细胞进行Western印迹和RT-qPCR分析。最后，使用200μl Opti-MEM中1μg质粒DNA(pCS2-miniSINEUP-DJ1或pCS2空载体)和3μlLipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)平行进行DNA对照转染。在这种情况下，转染后6小时更换转染培养基，并替换为每孔2ml DMEM完全培养基。在48小时收获细胞。
Western印迹(WB)
用细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology)裂解转染的细胞，并在4℃下孵育1小时。将细胞裂解物应用于10％预制聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)，通过SDS-PAGE分离，并转移至硝化纤维素膜(Amersham)。所有一抗和二抗均以1:1000稀释度使用。为了检测EGFP，使用用于RRL无细胞系统的抗GFP兔多克隆(Thermo Fisher Scientific，目录号A-6455)和抗GFP小鼠单克隆(克隆JL-8，Clontech，#632380)抗体。对于内源性SOX9检测，使用兔单克隆抗SOX9抗体(克隆EPR14335，目录号ab185230，Abcam)。为了检测DJ1，使用抗DJ1小鼠单克隆抗体(Enzo Lifesciences，目录号ADI-KAM-SA100-E)。将膜与一抗在4℃下孵育过夜，然后在室温下与HRP缀合的第二抗兔IgG(Dako)孵育45分钟。用ECL检测试剂(Amersham)显示条带。作为对照，将第一抗β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich)用作一抗，缀合HRP的抗小鼠IgG(Dako)用作二抗。使用Fusion Solo S系统(Viber Lourmat)的定量分析模块和化学发光应用流程，检测条带。
对于实施例6，在冰上在含cOmplete蛋白酶抑制剂(Roche)的裂解缓冲液(PBS+1％Tryton X100)中裂解细胞沉淀，在冰上短暂超声处理，并在4℃下以最大速度离心20分钟。在冰上收集含有总裂解物的上清液，并使用BCA测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)定量总蛋白质含量。将10μg总裂解物上样在NuPAGETM10％ Bis-Tris,1.5mm,蛋白质凝胶,10孔(ThermoFisher Scientific)上，并在120V下运行约90分钟进行SDS-PAGE。将凝胶在250mA下90分钟转移到0.2μm硝化纤维素膜(Amersham)上。用小鼠抗DJ1一抗检测DJ1，用兔抗β-肌动蛋白一抗(Sigma-Aldrich)检测肌动蛋白，两者均在含5％ BSA的Tris缓冲盐溶液-吐温-20(TBST)中1:8000稀释，并在4℃下孵育过夜。将缀合辣根过氧化物酶的第二抗小鼠和抗兔抗体1:10000稀释，并在室温下孵育1小时。用Pierce ECL plus检测试剂(ThermoFisherScientific)检测信号，并在ChemiDoc(Biorad)上读取。使用ImageJ(NIH)和Image Lab(Biorad)软件计算条带强度。
RNA提取和定量
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取总RNA，然后进行DNase I处理(TURBO无DNA试剂盒，Invitrogen)。使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒(Takara)合成cDNA，并在7900HT型快速实时PCR系统(Applied Biosystems)中使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara)进行定量实时PCR(qPCR)分析。热条件包括初始95℃30秒，95℃5秒和60℃30秒的40个循环，然后是熔解曲线绘制步骤。
对于实施例6，使用RNeasy mini试剂盒提取总RNA，然后通过UV-vis分光光度法对样品进行定量。然后在10μl反应中将1μl Turbo DNAseI(Sigma Aldrich)和1μl 10XDNAseI缓冲液加至800ng RNA，并在室温下孵育15分钟，进行DNA酶消化。通过加入1μlDNAseI终止溶液并在70℃下孵育10分钟，使DNA酶失活。按照制造商的说明，使用IscriptcDNA合成试剂盒(Biorad)在20μl反应中逆转录5μl经DNA酶处理的RNA(约400ng)。然后建立RT qPCR反应，包括2μl cDNA、5μl iTaq Universal SYBR Green Supermix(Biorad)、0.4μl正向引物和0.4μl反向引物，总体积为10μl。RT-qPCR在CFX96 Touch实时PCR检测系统(Biorad)上运行。用甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内部参考来归一化结果。
RNAFISH(RNA荧光原位杂交)
RNAFISH按之前Toki等(2019)bioRxiv,664029中所述进行。简言之，用4％多聚甲醛(Wako)固定细胞，然后在室温下用0.5％ Triton X-100(Sigma)通透5分钟。使RNA与用Stellaris RNA FISH Designer(Biosearch Technologies)设计的、荧光标记(Quasar 570用于SINEUP RNA，Quasar 670用于EGFP mRNA)的RNA FISH探针杂交，并在37℃下孵育过夜。洗涤细胞并用SP8型(Leica)共焦显微镜成像。
无细胞翻译系统
兔网织红细胞裂解物(RRL)购自Promega(TNT偶联网织红细胞裂解物系统，#L4610)，HeLa细胞的人细胞裂解物(1步人偶联IVT试剂盒–DNA，#8881)购自Thermo FisherScientific。按照制造商的流程进行体外翻译。简言之，对于每个反应，将400ng SINEUP质粒或200ng(m)IVT SINEUP RNA与120ng pcDNA3.1_EGFP混合。混合物在30℃下孵育90分钟。通过如前所述的Western印迹测量蛋白质表达。
化学修饰的细胞内转录(mICT)SINEUP-GFP的RNA提取
将HEK293T/17细胞接种在10cm的培养皿中，24小时后转染SINEUP-GFP质粒，通过Trizol/氯仿提取，收获2x107个细胞。通过RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取水相中含有SINEUP-GFP RNA的总RNA。
细胞内转录的SINEUP-GFP
RNA的Pull-Down
用裂解缓冲液将含有mICT SINEUP-GFP RNA的总RNA洗脱液调节至100μL，并与两倍体积的杂交缓冲液混合。对于2x107个细胞，添加100pmol SINEUP-GFP探针，并在37℃下搅拌过夜。探针与SINEUP-GFP RNA杂交后，向样品中加入100μL Tamavidin，在37℃下孵育30分钟，并用洗涤缓冲液洗涤4次。去除所有多余的上清液后，用100μL不含蛋白酶K的蛋白酶K缓冲液重悬小球，并在65℃下搅拌孵育5分钟。通过Trizol/氯仿提取SINEUP-GFP RNA，并按照制造商的说明书，通过RNeasy mini试剂盒(Qiagen)纯化。重复两次Pull-down提取，将SINEUP-GFP RNA溶解在水中。
Oxford Nanopore直接RNA测序的文库制备
使用SQK-RNA002(Oxford Nanopore Technology)试剂盒，按照制造商的流程，制备IVT(经修饰和未修饰)和mICT直接SINEUP-GFP RNA-seq文库。将Leger等,2019,bioRxiv(doi:https://doi.org/10.1101/843136)中描述的原始反转录衔接物(RTA)和四种条码化RTA分别用于(m)IVT和mICT SINEUP-GFP RNA。将文库应用于Mk1C测序仪并测序72小时。
Oxford Nanopore直接RNA测序的分析
测序数据通过发表在Leger等,2019,bioRxiv(doi:https://doi.org/10.1101/843136)中的方法处理。简言之，来自直接RNA seq的原始fast5读段用Guppy进行碱基读取(basecall)。Nanocompore用于未修饰的IVT SINEUP-GFP、20％ΨmIVT SINEUP-GFP和mICTSINEUP-EGFP中的每一种。首先对输出进行过滤，以去除p值大于0.01且绝对对数比值比(absLOR)小于1(即-1和+1之间的任何值)的位置。absLOR小于1表明所讨论的位置具有相似的经修饰或未修改的可能性。然后读取剩余位置上的峰读取脚本，以进一步过滤掉大数量的发现的修饰位置。
m6ARNA免疫沉淀
按上文所述用miniSINEUP-DJ1转染HEK293T、A549 ShCtrl或A549 ShMETTL3/2细胞。转染后48小时，用PBS洗涤细胞两次，并用胰蛋白酶消化以脱壁。再次用PBS洗涤细胞沉淀一次，并按照制造商的流程用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN，目录74106)提取总RNA。所有样品在提取过程中均进行DNAse I处理。
将25μg总RNA用含有2.5μg抗m6A抗体(SySy Cat.202111)的IPP缓冲液(10mM TrisHCl pH 7.4、150mM NaCl、0.1％ Igepal)稀释至终体积为200μL，并在4℃下在旋转轮上孵育2小时。然后将该混合物与15μL G-偶联的Dynabeads(Invitrogen，Cat.10003D)孵育另外2小时，以免疫沉淀所述混合物。然后用IPP缓冲液洗涤小球5次，并重悬在500μL Qiazol中。
按照Qiazol流程提取RNA，并通过qRT-PCR进行分析。IgG偶联小球(正常小鼠IgG抗体，Santa Cruz，Cat.Sc-2025)和仅小球样品用作阴性对照。
m6A RT-qPCR
转染后48小时，使用QIAGEN RNA mini试剂盒，从细胞提取总RNA。所有样品在提取过程中均进行DNAse I处理。
对于m6A逆转录反应，该流程修改自Castellanos-Rubio等。简言之，使用100ngRNA、各引物100nM、50μM dNTP和0.1U BstI(NEB，目录M0275S)或0.8U MVL-MRT。热循环仪设置为50℃15分钟、85℃3分钟和4℃∞。将1μL逆转录反应物与100nM各引物和2X iTaq SYBRgreen(BioRad)一起使用。反应在CFX96实时PCR系统(Bio-Rad)上运行，并分析熔解曲线以确保单个产物的扩增。
实施例2
本实施例显示，转染体外转录(IVT)的裸SINEUP RNA对蛋白质合成的刺激可忽略不计。此前，发现靶mRNA和SINEUP RNA在细胞质中的共定位是上调靶mRNA翻译的关键要求之一(Toki等.(2019)bioRxiv,664029)。本发明人假设，将IVT SINEUP RNA直接转染到细胞质中将比SINEUP质粒转染更有效地增强蛋白质产生，后者需要将细胞核中转录的RNA输出。为了研究使用IVT SINEUP上调翻译的效率，与EGFP质粒(作为靶标有义转录物)一起将IVTRNA转染到HEK 293T/17细胞中。IVT SINEUP-GFP RNA包含一个设计为靶向EGFP mRNA的结合结构域(BD)(图1A)，而IVT SINEUP-SCR RNA设计为阴性对照，并包含一个乱序EGFP BD。与该假设相反，IVT SINEUP-GFP没有刺激EGFP的翻译(图1B)，但与先前的研究一致，EGFPmRNA和SINEUP的RNA水平在细胞中没有变化(图1C)。这些发现也通过将IVT miniSINEUP-DJ1转染到293T/17细胞中得到确认，该IVT miniSINEUP-DJ1包含设计为靶向PARK-DJ1(一种在家族性帕金森病中发现突变的基因)的mRNA的BD。无论SINEUP-DJ1 RNA的帽化或多腺苷酸化状态如何，MiniSINEUP-DJ 1都未导致DJ-1蛋白的内源性水平发生任何显著变化(数据未显示)。
为了阐明IVT SINEUP RNA的亚细胞分布，进行了RNA FISH(荧光原位杂交)，其揭示了：大多数IVT SINEUP RNA在细胞内聚集为密集点，或者根本难以检测到IVT SINEUPRNA。这表明，IVT SINEUP RNA在转染后立即部分降解，作为片段化RNA被检测到，或存在的数量不足以实现与EGFP mRNA的充分共定位。因此，EGFP翻译没有上调。
实施例3
本实施例显示，体外转录(IVT)的SINEUP RNA需要通过核苷酸修饰来在细胞中稳定。RNA FISH实验显示，未修饰的IVT SINEUP在转染入细胞后可能聚集。制备了含有m5C、Ψ和N1mΨ修饰的化学修饰IVT(mIVT)SINEUP RNA，并与EGFP质粒直接转染入HEK293T/17细胞(图2A)。检查了mIVT SINEUP RNA的EGFP上调和亚细胞分布。与对照(仅EGFP；图2B)相比，所有mIVT SINEUP均显示了EGFP的特征性上调，而不影响EGFP mRNA水平(图2C，图3A)。此前，发现在EGFP和SINEUP-GFP质粒共转染时，从DNA质粒转录的SINEUP-GFP RNA定位在细胞核和细胞质中。然而，本数据显示，mIVT SINEUP-GFP定位在细胞质中，与EGFP质粒转染无关(由RNA FISH图像显示，数据未显示)。与此一致，EGFP mRNA翻译的上调并未显著影响细胞中的EGFP mRNA水平(图2C，图3A)。值得注意的是，mIVT SINEUP的RNA水平比未修饰的IVTSINEUP RNA高1.5倍以上(图3B)，这意味着这些修饰核苷酸不仅有助于EGFP上调，而且有助于SINEUP在细胞中的稳定。
实施例4
使用无细胞翻译系统，与RNA稳定性分开，观察SINEUP上调活性。没有一种测试的SINEUP RNA在RRL中上调EGFP，而具有Ψ和N1mΨ的mIVT SINEUP在HeLa细胞裂解物中上调EGFP(数据未显示)。这一结果表明，经修饰的核苷酸有助于无细胞系统中EGFP的上调，因此其不仅仅是RNA稳定所需要的。这也意味着细胞成分的表达对于SINEUP活性是重要的。
实施例5
本实施例表明，mIVT SINEUP可用于增强内源性靶蛋白产生。为了测试SINEUP是否可以增加内源性靶蛋白的产生，开发了一种针对SOX9的SINEUP。SOX9(性别决定区Y(SRY)-框9(SOX9))是一种在脊椎动物的几种组织和器官中调节细胞分化、发育和基因表达的转录因子。此外，已显示，损伤后成人肝脏中的SOX9阳性细胞作为肝细胞再生。SINEUP的最终目标是将其用于治疗应用，因此更小尺寸的功能性SINEUP是期望的。设计了含有与小鼠SOX9mRNA重叠的BD(-31/+4)以及来自AS-Uchl1 RNA的反向SINE B2 ED的miniSINEUP-SOX9质粒，和含有随机序列的非结合结构域而非SOX9结合结构域以及来自AS-Uchl1 RNA的反向SINE B2 ED的miniSINEUP-Rd质粒(图4A)，并将其转染到人和小鼠肝细胞癌细胞系(HepG2和Hepa 1-6)中，以检查SOX9蛋白质产生的任何增强。转染miniSINEUP-SOX9质粒的细胞显示，在HepG2细胞中在转染后24小时和48小时，以及在Hepa 1-6细胞中在转染后24小时，与对照(无SINEUP)相比，SOX9蛋白产生上调约1.5倍(图4B)。与先前靶向EGFP mRNA的研究一致，在SINEUP转染细胞中内源性靶SOX9mRNA水平没有变化(图4C)。这表明miniSINEUP-SOX9可以有效增强内源性靶标如SOX9的蛋白质水平。
还在HepG2细胞中测试了使用含有m5C、Ψ和N1mΨ的mIVT miniSINEUP-SOX9(图5A))时的翻译上调效率。与未转染mIVT miniSINEUP的对照相比，具有Ψ和N1mΨ的mIVTminiSINEUP-SOX9也显示出SOX9蛋白上调约1.5倍(图5B)。与质粒转染一致，在用mIVTminiSINEUP RNA转染的细胞中，内源性SOX9 mRNA水平没有变化(图5C)。这意味着核苷酸修饰可能有助于稳定miniSINEUP-SOX9以增强培养细胞中SOX9蛋白质水平。
实施例6
本实施例显示，不同的修饰组合适合于保留miniSINEUP-DJ1的功能。为了进一步研究经修饰和未修饰的体外转录的SINEUP的功能，使用了一种命名为miniSINEUP-DJ1的模型SINEUP，其靶向PARK7-DJ1(一种在家族性帕金森病(PD)中发现突变的基因)。使用经修饰或未修饰的核苷酸在体外转录MiniSINEUP-DJ1，并将不同的转录物以等摩尔量转染入293T/17细胞。
将未修饰的体外转录物与包括一些天然修饰(即2'-O-甲基腺苷(Am)、N6-甲基腺苷(m6A)、假尿苷(ψ)及其多种组合)的转录物进行比较。注意，由于具有不同修饰的核苷酸的不同掺入动力学，IVT混合物的组成不一定反映见于最终分子中的修饰百分比。在Am和m6A的情况下，T7 RNA聚合酶掺入后者的效率是前者的几倍。为了方便，报告了反应混合物的组成。
图7显示了，用携带不同修饰的miniSINEUP RNA或用对照miniSINEUP质粒转染的细胞进行的至少3个不同实验的、Western印迹定量的DJ1倍变化。如图7所示，虽然未修饰的转录物没有显示SINEUP活性，但保留和优化SINEUP活性的最佳修饰组合为三种，即：i)Am100％；ii)Am 99％+m6A 1％；iii)m6A 100％+ψ100％。作为RNA转染的阳性对照，还平行转染了编码相同miniSINEUP的质粒DNA，并通过Western印迹评估了SINEUP活性(图7B)。
对用未修饰和经修饰的转录物转染的细胞的总RNA提取物，进行逆转录定量PCR(RT-qPCR)，以研究在实验终点(48小时)转染的RNA的稳定性。初始实验表明，由于本研究中使用的修饰的存在，逆转录被严重减慢。然而，仍然显示出未修饰和经修饰的RNA之间的差异，在后者中更明显。这种差异可以合理地归因于转染后48小时未修饰和经修饰RNA的不同稳定性。为了进一步研究这一点，进行了时程研究，其中以等摩尔量转染未修饰和经修饰的IVT miniSINEUP RNA，并在不同时间点(转染后6、18和48小时)收获细胞。通过RT-qPCR分析总RNA提取物，并显示未修饰的转录物的稳定性在转染后48小时降至低于50％(图8A)。相反，在存在某些修饰组合的情况下，稳定性略有改善。这在m6A和Ψ的组合存在下尤为明显。来自转染细胞的RNA提取物的RT-qPCR与来自掺入IVT RNA的未转染细胞的RNA提取物的RT-qPCR之间的比率，给出了计算的“稳定倍数”，如图8B所示，取决于混合的修饰，其在2至20倍之间变化。这表明，未修饰的IVT SINEUP的活性受损至少部分是由于其对细胞内核酸酶作用的敏感性而导致的稳定性降低。
实施例7
本实施例显示，IVT SINEUP RNA中修饰的含量可以影响经修饰的IVT SINEUP RNA的功能性和结构-活性关系。如上所述，由于带有不同修饰的核苷酸的掺入动力学不同，IVT混合物的组成不一定反映见于最终分子中的修饰百分比。因此，为了更好地表征包含竞争相同位点的Am和m6A的IVT miniSINEUP RNA中的修饰的含量，对这些转录物进行了质谱分析。研究发现，当在IVT反应混合物中使用99:1的Am/m6A比率时，最终分子中两种修饰的相对丰度仅为20:80(图9A，左栏)。值得注意的是，含有较低Am/m6A比率的IVT SINEUP-DJ1RNA不具有功能，表明对于此SINEUP的活性，需要阈值水平的Am(数据未显示)。
用圆二色(CD)光谱作为工具，以比较所研究的SINEUP RNA分子在溶液中采用的构象，并评估该结构对SINEUP活性的可能作用(图9B和9C)。虽然RNA可采用的复杂多变的3D构象使得识别每一种二级结构都极具挑战性，但200nm至320nm范围内的CD光谱在提供核酸折叠的整体理解方面极为灵敏(Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids(2021)In Comprehensive Chiroptical Spectroscopy,575-586页；Sosnick,T.R.,(2001)Curr Protoc Nucleic Acid Chem,第11章,11 5单元)。
未修饰的SINEUP序列显示A型RNA的典型CD谱(Kypr,J.等(2009)Nucleic acidsresearch,37(6):1713-25)；265nm附近的最大值表示右手螺旋的存在，210nm处的最小值表示双链区的8平行取向。记录到包含单独m6A碱基的RNA序列的可比光谱。然而，在m6A与核糖上的Am修饰组合存在时，与未修饰的miniSINEUP相比，最大和最小强度的降低明显，暗示其他构象排列的可能贡献(图9B)。值得注意的是，在Am与m6A的比率增加时，这种减少更加明显。与含有单独m6A的转录物光谱相比，含有20:80的“活性”Am/m6A比率的转录物的光谱显示265nm峰减少41％，而含有3:97的非活性比率的转录物的光谱显示相同峰仅减少9.7％。因此，如通过质谱测量的，Am的百分比从3％到20％的增加(图9B)通过如下CD光谱反映，该CD光谱与完全用m6A修饰的IVT RNA(非活性)的差异更显著，与完全用Am修饰的RNA(活性；见图9D)相似。引人注目的是，完全Am修饰的序列以及包含m6A和ψ的组合的序列显示出几乎相同的CD光谱，这与未修饰的RNA的CD光谱明显不同(图9B)。这类经修饰的分子具有相似的功能，尽管具有不同的修饰。它们的光谱特征是在270nm-280nm区域中较宽的、强度较小的最大值、以及在245nm处可比强度的最小值，表明光谱特征类似于B型DNA(Sekine,M.等(2011)Org Biomol Chem,9(1):210-8)而不是RNA典型的A型(Werner,D.等(1998)Pharmaceutica Acta Helvetiae,73(1),3-10；Szabat,M.等(2015)PloS one,10(11),e0143354)的特征。
值得注意的是，含有m6A和Ψ的IVT RNA(功能性)的光谱，与含有单独m6A和含有单独Ψ的IVT-RNA(两种都非功能性)的光谱，非常不同。事实上，含有m6A的miniSINEUP的光谱与未修饰RNA的光谱非常相似。相反，用Ψ完全修饰的RNA的光谱反映了可归因于这种具体核苷酸的螺旋扭曲(Kierzek,E.等(2013)Nucleic acids research,42(5),3492-3501；Sumita,M.等(2005)RNA(New York,N.Y.),11(9),1420-9)，具有210nm处明显的负带，235nm附近的0，以及覆盖240nm和237nm之间区域的微弱最大值。此光谱不能与单一构象相关联，而是由最常见构象上的Ψ相关变化衍生的几个信号的重叠。因此，此数据表明IVT SINEUPRNA中修饰的含量可以影响RNA结构，并且显示为非活性的修饰、或非活性的修饰含量具有未修饰的IVT SINEUP RNA的结构特征。
因为结构稳定性是设计RNA用于潜在治疗应用时的关键参数(图9E)，也通过CD进行未修饰和经修饰的miniSINEUP的热稳定性研究。表观解链温度(Tm)通过跟踪270nm处的CD强度随温度的变化来测定(Ranjbar,B.等(2009)Chem Biol Drug Des,74(2):101-20)。根据文献，我们发现，与未修饰的RNA序列相比，显示与B型构象DNA相似的光谱的两种miniSINEUP显示出改善的稳定性，并使Tm增加了约15℃(Nowakowski,J.等(1997)Seminarsin Virology,8(3):153-165)。在剩余的SINEUP版本中，Am+m6A RNA序列的表观Tm与未修饰的RNA相当，而具有m6A的RNA的Tm增加5℃。
实施例8
本实施例显示，见于细胞内转录(mICT)的SINEUP-GFP RNA和未修饰或经修饰的IVT SINEUP-GFP RNA中的修饰之间的比较。这允许鉴定在细胞中转录时天然引入SINEUPRNA的修饰、以及可以人工引入IVT SINEUP RNA以模拟天然存在的mICT SINEUP RNA的修饰。
用含有20％假尿苷-5’-三磷酸(Ψ)的反应混合物产生了经修饰的IVT SINEUP-GFP。在来自Nanocompore的mICT SINEUP-GFP和IVT SINEUP-GFP中鉴定出32kmer修饰区域(表1)。在来自Nanocompore的mICT SINEUP-GFP和20％ΨmIVT SINEUP-GFP中，鉴定出64位(BD和反向SINEB2之间)、103位(反向SINEB2)、199位(反向SINEB2)、399位(Alu下游)和426位(Alu下游)的Ψ。
表1：与未修饰的IVT SINEUP-GFP相比mICT SINEUP-GFP的Nanocompore kmer峰
表2：与20％Ψ修饰的IVT SINEUP-GFP相比mICT SINEUP-GFP的Nanocompore kmer峰
使用Castellanos-Rubio等(2019)Sci.Rep.,9(4220)(doi:https://doi.org/10.1038/s41598-019-40018-6)中所述的方法，通过RT-qPCR分析mICT miniSINEUP-DJ1，以定量候选m6A区域。此方法利用了BstI酶在逆转录m6A残基方面的能力降低，可以通过定量PCR(qPCR)评估m6A诱导的BstI逆转录效率降低。鉴定了四个m6A推定位点，m6A46、m6A63、m6A81和m6A111(图11A)。其中m6A46和m6A111显示BstI逆转录效率的统计学显著变化，表明m6A修饰存在于这些位点中(图11B，左图)；然后将m6A46和/或m6A111周围区域(碱基109-111)突变为尿嘧啶残基，以防止miniSINEUP-DJ1和miniSINEUP-GFP中这些位点的甲基化，并测试了它们分别上调DJ1和GFP翻译的能力。图11C和11D分别显示了，相对于对照或未突变的miniSINEUP-DJ1(即A残基存在于第46和109-111位，在图11中称为“WT”)，突变的miniSINEUP-DJ1的DJ1蛋白表达倍数变化和SINEUP活性量。图11E和11F分别显示了，相对于对照或未突变的miniSINEUP-GFP，突变的miniSINEUP-GFP的GFP蛋白表达倍数变化和SINEUP活性量。相对于未突变(即46和111位具有甲基化)的分子，防止miniSINEUP-DJ1和miniSINEUP-GFP的46或111位甲基化降低了DJ1和GFP翻译的上调，并降低了SINEUP活性。miniSINEUP-DJ1的46位和111位的突变对SINEUP活性的影响大于单独任一位置(图11C和11D)。然而，miniSINEUP-GFP的111位似乎对SINEUP活性的影响大于46位，因为仅在此位置防止甲基化对SINEUP活性产生了最大的影响(图11E和11F)。
图11G显示了，在对照细胞或其中N6-腺苷-甲基转移酶70kDa亚基METTL3已经通过shRNA敲减的细胞(sh METTL3)中，由MeRIP免疫沉淀的甲基化的未突变或突变的miniSINEUP-GFP的量。在突变46位或109-111位以防止甲基化时，由MeRIP免疫沉淀的甲基化的miniSINEUP-GFP的量减少，并且在m6A46和109-111位都突变时，miniSINEUP-GFP的甲基化完全消除。
因此，此数据鉴定了mICT SINEUP RNA中的多种修饰，并显示这些修饰可见于整个SINEUP RNA分子中，尤其是在调节序列(也称为“效应结构域”和“ED”)内。它们有助于SINEUP RNA分子的活性，并因此可用于模拟IVT SINEUP分子。
序列表
<110> 意大利技术基金会(Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia)
国际高等研究院(Scuola Internazionale Superiore Di Studi Avanzati –SISSA)
特兰赛恩治疗学有限公司(TranSINE Therapeutics Limited)
<120> 经修饰的功能性核酸分子
<130> TSI-C-P2828PCT
<150> EP 20425038.5
<151> 2020-09-24
<160> 50
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 183
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的全长反向SINE B2转座元件
<400> 1
gggcagugcu agaggagguc agaagagggc auuggauccc ccagaacugg aguuauacgg 60
uaaccucgug gugguuguga accaccaugu ggauggauau ugaguuccaa acacuggucc 120
ugugcaagag cauccagugc ucuuaagugc ugagccaucu cuuuagcucc agucucuuaa 180
gcu 183
<210> 2
<211> 167
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的167nt的反向SINE B2转座元件
<400> 2
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauu ggauccccca gaacuggagu uauacgguaa 60
ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga guuccaaaca cugguccugu 120
gcaagagcau ccagugcucu uaagugcuga gccaucucuu uagcucc 167
<210> 3
<211> 77
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 44-120
<400> 3
gaacuggagu uauacgguaa ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga 60
guuccaaaca cuggucc 77
<210> 4
<211> 38
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 59-96
<400> 4
gguaaccucg uggugguugu gaaccaccau guggaugg 38
<210> 5
<211> 29
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 64-92
<400> 5
ccucguggug guugugaacc accaugugg 29
<210> 6
<211> 61
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 52-112
<400> 6
guuauacggu aaccucgugg ugguugugaa ccaccaugug gauggauauu gaguuccaaa 60
c 61
<210> 7
<211> 98
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 36-133
<400> 7
aucccccaga acuggaguua uacgguaacc ucgugguggu ugugaaccac cauguggaug 60
gauauugagu uccaaacacu gguccugugc aagagcau 98
<210> 8
<211> 129
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 22-150
<400> 8
gaagagggca uuggaucccc cagaacugga guuauacggu aaccucgugg ugguugugaa 60
ccaccaugug gauggauauu gaguuccaaa cacugguccu gugcaagagc auccagugcu 120
cuuaagugc 129
<210> 9
<211> 67
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 44-110
<400> 9
gaacuggagu uauacgguaa ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga 60
guuccaa 67
<210> 10
<211> 107
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 34-140
<400> 10
ggauccccca gaacuggagu uauacgguaa ccucguggug guugugaacc accaugugga 60
uggauauuga guuccaaaca cugguccugu gcaagagcau ccagugc 107
<210> 11
<211> 127
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 24-150
<400> 11
agagggcauu ggauccccca gaacuggagu uauacgguaa ccucguggug guugugaacc 60
accaugugga uggauauuga guuccaaaca cugguccugu gcaagagcau ccagugcucu 120
uaagugc 127
<210> 12
<211> 116
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 27-142
<400> 12
gggcauugga ucccccagaa cuggaguuau acgguaaccu cguggugguu gugaaccacc 60
auguggaugg auauugaguu ccaaacacug guccugugca agagcaucca gugcuc 116
<210> 13
<211> 206
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SINEUP 071和miniSINEUP 071效应结构域
<400> 13
uuauuuuaaa uauaugagua uuucaccugc auaggcgcac aguacccaca gagacuagaa 60
gaggguagua gauccccuag aacuggaguu auacgguaac cucguggugg uugugagcua 120
ccauguggau ggauacuggg aaucaaaccc agguccugug gaaggcaggc aggugcucuc 180
aagcacugag ccaucucuuc agcucc 206
<210> 14
<211> 206
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SINEUP 072和miniSINEUP 072效应结构域
<400> 14
uuauuuuaaa uauaugagua uuucaccugc auaggcgcac agugcucaag gagaucagaa 60
gagggcauca gaucuccuga gacuggaguu auacgguaac cucgugaugg uugugaacua 120
ccauguggau ggauauugag uuccaaacac agguccugug caagagcagc aggugcucuu 180
aagcacggaa ccaucucuuu agcucc 206
<210> 15
<211> 156
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SINEUP 073和miniSINEUP 073效应结构域
<400> 15
gaggcuagaa gaggguauca gauccccuga gacuggaguu auacgguaac cucguggugg 60
uugugagcca ccauguggau ggauacugag aaccaaaccc ugguccugug caagagcauc 120
aggugcucuu aagcacggaa ccaucucuuc agcucc 156
<210> 16
<211> 68
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SINEUP 074和miniSINEUP 074效应结构域
<400> 16
guccugugca agagcaucga acucggugcu cuuaagcaca gaagccacca agccaucucu 60
ucagcccc 68
<210> 17
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SINEUP 075和miniSINEUP 075效应结构域
<400> 17
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauc ccccagccuc guggugguug ugaaccacca 60
uguggcugug caagagcaug cucuuaagug cugagccauc ucuuuagcuc 110
<210> 18
<211> 126
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 24-150效应结构域
<400> 18
gagggcauug gaucccccag aacuggaguu auacgguaac cucguggugg uugugaacca 60
ccauguggau ggauauugag uuccaaacac ugguccugug caagagcauc cagugcucuu 120
aagugc 126
<210> 19
<211> 89
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C_34-122效应结构域
<400> 19
ggauccccca gaacuggagu uauacgguaa ccucguggug guugugaacc accaugugga 60
uggauauuga guuccaaaca cugguccug 89
<210> 20
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TM效应结构域
<400> 20
ugcuagagga ggucagaaga gggcauugga ugcaaaucca gugcucuuaa gugcugagcc 60
aucucuuuag cu 72
<210> 21
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MC2效应结构域
<400> 21
gagggcauug gaucccccag aacuggaguu auacgguaac gauggauauu gaguuccaaa 60
cacugguccu gugcaagagc auccagugcu cuua 94
<210> 22
<211> 180
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的G60A突变
<400> 22
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauu ggauccccca gaacuggagu uauacgauaa 60
ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga guuccaaaca cugguccugu 120
gcaagagcau ccagugcucu uaagugcuga gccaucucuu uagcuccagu cucuuaagcu 180
<210> 23
<211> 180
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的G60C 突变
<400> 23
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauu ggauccccca gaacuggagu uauacgcuaa 60
ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga guuccaaaca cugguccugu 120
gcaagagcau ccagugcucu uaagugcuga gccaucucuu uagcuccagu cucuuaagcu 180
<210> 24
<211> 180
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的A51C突变
<400> 24
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauu ggauccccca gaacuggcgu uauacgguaa 60
ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga guuccaaaca cugguccugu 120
gcaagagcau ccagugcucu uaagugcuga gccaucucuu uagcuccagu cucuuaagcu 180
<210> 25
<211> 180
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的C47G和G117C突变
<400> 25
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauu ggauccccca gaaguggagu uauacgguaa 60
ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga guuccaaaca cugcuccugu 120
gcaagagcau ccagugcucu uaagugcuga gccaucucuu uagcuccagu cucuuaagcu 180
<210> 26
<211> 180
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的46-49/115-118茎交换突变
<400> 26
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauu ggauccccca gauggugagu uauacgguaa 60
ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga guuccaaaca cgucaccugu 120
gcaagagcau ccagugcucu uaagugcuga gccaucucuu uagcuccagu cucuuaagcu 180
<210> 27
<211> 180
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的50-53和112-114 碱基交换突变
<400> 27
cagugcuaga ggaggucaga agagggcauu ggauccccca gaacugcacu auacgguaac 60
cucguggugg uugugaacca ccauguggau ggauauugag uuccaaauga gugguccugu 120
gcaagagcau ccagugcucu uaagugcuga gccaucucuu uagcuccagu cucuuaagcu 180
<210> 28
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 44-120 A45G突变
<400> 28
ggacuggagu uauacgguaa ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga 60
guuccaaaca cuggucc 77
<210> 29
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自AS Uchl1的反向SINE B2转座元件的nt 44-120 A51C突变
<400> 29
gaacuggcgu uauacgguaa ccucguggug guugugaacc accaugugga uggauauuga 60
guuccaaaca cuggucc 77
<210> 30
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 44-120 U78G SINEUP
<400> 30
gaacuggagu uauacgguaa ccucguggug guugggaacc accaugugga uggauauuga 60
guuccaaaca cuggucc 77
<210> 31
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 44-120 GUG77-79CCC SINEUP
<400> 31
gaacuggagu uauacgguaa ccucguggug guucccaacc accaugugga uggauauuga 60
guuccaaaca cuggucc 77
<210> 32
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 44-120 SINEUP 强
<400> 32
ggaccggagu uauacgguaa ccgcguggug guugugaacc accacgcgga uggauauuga 60
guuccaaaca ccggucc 77
<210> 33
<211> 77
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 44-120 SINEUP 弱
<400> 33
gaacuagagu uauacgguaa ccacauggug guugugaacc accaugugga uggauauuga 60
guuccaaaca cuaguuc 77
<210> 34
<211> 228
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 来自RepBase 的SINEB2/B3 共有序列
<400> 34
uuuuuuuaaa aauuuauuuu uauuuuaugu guaugagugu uuugccugca uguaugucug 60
uguaccacgu gcgugccugg ugcccgcgga ggccagaaga gggcgucgga uccccuggaa 120
cuggaguuac agaugguugu gagccgccau gugggugcug ggaaucgaac ccggguccuc 180
uggaagagca gccagugcuc uuaaccgcug agccaucucu ccagcccc 228
<210> 35
<211> 107
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Txnip SINEB2
<400> 35
gaugccuuag aaguggaguu aagaguugug agcugccguu uuuugguucu gggacucgaa 60
cucguuuccu cugauacuau caaccaccaa gccaucucuu cagcccc 107
<210> 36
<211> 131
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Uxt SINEB2 a
<400> 36
gccagaagaa guugugggau ucccuggaac uggagcaacc aacaguuugu gugcaccaug 60
uggguaaugg gaaucgaacc uggguccucu auaagacugg ccagugcucu uaacuacuga 120
ggugcauuuc u 131
<210> 37
<211> 187
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Uxt SINEB2 b
<400> 37
uuauuuuaaa uauaugagua uuucaccugc auaggcgcac aguacccaca gagacuagaa 60
gaggguggca gaucuccuga gacuggaguu aaugcuugug agcugccaug uggaugcugg 120
aaaucaaacc cagguccuuu ggaaggcagg caggugcucu uaaucaugga agcaucucuu 180
cagcucc 187
<210> 38
<211> 131
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Gadd45alpha SINEB2 a
<400> 38
cagcgacauc agaagaggau auuggauccc auuacagaug guugaaggcc accaugucgu 60
ugcugggaau gaacucaaga ccucuggaag agcagucagu gcucuuaacc ucugagccau 120
cucuccagcc c 131
<210> 39
<211> 114
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Gadd45alpha SINEB2 b
<400> 39
auccccucca aagcucaaga ugguuguaag ccacccugug auugcuggga uuugaacuca 60
agaccuccgg aagagcaauu agugcucuua accgcugagc aaucucucca gccc 114
<210> 40
<211> 214
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Nars2 SINEB2/B3
<400> 40
uuuuuuuuac uuguauaggu guuuugccug cauguguauc uaucuaugua ccgaauaugu 60
uccugguauc cacagagacc aaaaguggau guuguaucuc cugaaauugg agucauagac 120
aguuaugagc ugccauuuga gugcuuggaa uagaacccag guccucuuaa agagcaucca 180
gugcucuuaa aaacugagac aucucuguag ccuc 214
<210> 41
<211> 200
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Abhd11 SINEB2/B3
<400> 41
uuuauuuugc uuuauguguc ugaguguuug cuugaaugua ugucugugua ccacgccugu 60
accuugugcc uucagaguug agaggagggc auaggaucuc cuggaacugg aauugcaggu 120
gguugugagc cacccugugg guccugggga ccauacucca gcaagaacau caugugcucu 180
uaauuccuga gucuccaacc 200
<210> 42
<211> 214
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Ebp4.9 SINEB2/B3
<400> 42
uuuauuuacu uaucuuuaug uguaugagug uguugucaga cuguuauguc ugugugucac 60
augcaugccu gcuguucaug gaguccagaa gagggcaucg gauccccugg aacuggaguu 120
acagaugagu ggccauguga auguuaagaa ccaaaccugg guccucugaa agagcagaca 180
augcucuuaa cuacugagcu gucucuccag cccc 214
<210> 43
<211> 205
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Wfdc5 SINEB2/B3
<400> 43
uuauuuuauu cguguaagug uuuugccagc aucuaugucu ucgcacuaug ugcaggucug 60
gugccugagg gguccagacg agagcacugg gucuccggga acuggaguua cagaucauug 120
ugagccacca ugugggugca gggaaucgaa ccugggaccu cuggaggagc agccacugcu 180
cuuaaccacu acacuauuuc uccag 205
<210> 44
<211> 121
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Pgbd1 SINEB2/B3
<400> 44
ucuguggacc acuguguaca gaagccugag aaggcuagca gauccccaga acuggaacug 60
ugagacgcug ugcuauggag gugcuaggaa cugaaaaugg auggguccuc ugcaagagca 120
g 121
<210> 45
<211> 191
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Gsk3b SINEB2/B3
<400> 45
uuguuuuaau ugaauggcua uaggguguuu cuucuguaug uauaucuaug uuugguaccu 60
acagaggcau cagauccucu ggaacuguag uugcugacag uugugagcug ucauggggau 120
gcuggaauug aaccuggauc cuaugaaaga acagccagug uucuuaaccg cugagcuauc 180
ucuccaggcc c 191
<210> 46
<211> 205
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Rhod SINEB2_Mm2
<400> 46
uuuuuuuuuu aauuuuaaaa aaaaagauuu uauuuauuua uuuuauauau gaugaguaca 60
cugucacucu uuucagacac ccuagaaaag gggggcauca gaucccauua cagaugguug 120
ugagccacau gguugcuggg aauugaccuc aggaccucug aaagagcagu cagugcucuc 180
aaccuuugag ucaucucucc agccc 205
<210> 47
<211> 190
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS Rhod SINEB2/B3A
<400> 47
auguauaucu guaaugggac auacucacau acaugggcac gugaguauaa aaggccagaa 60
gagagcacug gacccucugg aguugagauu cuaagcaguu gugaaccauc ugauguaggu 120
gcugggaacu gaacuugggu ccuuugcuag agaaguaugu cucuuaacca cugagccgua 180
ucuccauccc 190
<210> 48
<211> 169
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS E4f1 SINEB2_Mm2
<400> 48
uaaagauuua uucauuaagu acacuguagc uaucuucaga cgcaucagaa gagggcguca 60
gaucucuuua caggugguug ugagccacca ugugguugcu ggaauuugaa cucaggaccu 120
ucaaaagagc agucaguguu cuuaaccgcu gagccaucuc uccaacccc 169
<210> 49
<211> 159
<212> RNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> AS E4f1 SINEB2_Mm1t
<400> 49
uuauuuauua uaaguacacu guagcugucu ucagacacaa caaaagaggg cgucagaucu 60
cauuacaggu gguugagcca ccaugugguu gcugggauuu gaacucagga ccuucagaac 120
agucagugcu cuuacccacu gagccagcga gccagcccc 159
<210> 50
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 50
aucugcagaa uuc 13
Claims (15)
1.功能性核酸分子，其包含：
(a)至少一个靶决定序列，其包含与待增强蛋白质翻译的靶mRNA序列反向互补的序列；和
(b)至少一个调节序列，其包含SINE B2元件或SINE B2元件的功能活性片段，
其中该功能性核酸分子包含一种或多种化学修饰。
2.权利要求1的功能性核酸分子，其中该化学修饰是选自腺嘌呤、胞嘧啶和/或尿嘧啶碱基修饰的化学碱基修饰。
3.权利要求2的功能性核酸分子，其中该化学碱基修饰选自甲基化和/或异构化。
4.权利要求2或权利要求3的功能性核酸分子，其中该化学碱基修饰选自：假尿苷、N1-甲基假尿苷，5-甲基胞苷和N6-甲基腺苷。
5.权利要求1的功能性核酸分子，其中该化学修饰是化学糖修饰。
6.权利要求5的功能性核酸分子，其中该化学糖修饰是甲基化，例如2'-O-甲基腺苷。
7.权利要求1至6中任一项的功能性核酸分子，其中该靶决定序列包含一种或多种化学修饰。
8.权利要求1至6中任一项的功能性核酸分子，其中该调节序列包含一种或多种化学修饰。
9.权利要求1至8中任一项的功能性核酸分子，其中该靶决定序列和调节序列都包含一种或多种化学修饰。
10.权利要求1至9中任一项的功能性核酸分子，其中该靶决定序列长度为至少10个核苷酸，并且从3’至5’包含：
-与靶mRNA序列的5’非翻译区(5’UTR)的0至50个核苷酸和编码序列(CDS)的0至40个核苷酸反向互补的序列；或
-与靶mRNA的AUG位点(起始密码子)上游区域的0至80个核苷酸和所述AUG位点下游的靶mRNA序列的CDS的0至40个核苷酸反向互补的序列。
11.权利要求10的功能性核酸分子，其中该靶决定序列长度为至少14个核苷酸，并且从3’至5’包含：
-与靶mRNA序列的5’UTR的0至40个核苷酸和CDS的0至32个核苷酸反向互补的序列；或
-与靶mRNA的AUG位点(起始密码子)上游区域的0至70个核苷酸和所述AUG位点下游的靶mRNA序列的CDS的0至4个核苷酸反向互补的序列。
12.权利要求1至11中任一项的功能性核酸分子，其进一步在该靶决定序列和该调节序列之间包含至少一个接头序列。
13.权利要求1至12中任一项的功能性核酸分子，其中该功能性RNA分子包含3'-聚腺苷酸化(polyA)尾和/或5'-帽。
14.组合物，其包含权利要求1至13中任一项的功能性核酸分子。
15.用于提高细胞中靶标的蛋白质合成效率的方法，其包括对该细胞施用权利要求1至13中任一项的功能性核酸分子或权利要求14的组合物。
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