BR112020008733A2

BR112020008733A2 - método de resgate de códons de parada através de reatribuição genética com ace-trna

Info

Publication number: BR112020008733A2
Application number: BR112020008733-5A
Authority: BR
Inventors: Christopher Ahern; John D. Lueck
Original assignee: University Of Iowa Research Foundation
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2020-11-03
Also published as: US20230203482A1; JP2024054361A; EP3703701A1; JP7474511B2; IL274396A; RU2020117787A; CA3081737A1; US20200291401A1; AU2018360065A1; MX2020004587A; RU2020117928A3; US20230407300A1; CA3081692A1; EP3703762A1; KR20200083550A; JP7474532B2; IL274356A; KR20200090171A; BR112020008725A2; CN111712248A

Abstract

A presente invenção refere-se a um RNA de transferência (tRNA) modificado compreendendo um braço T, um braço D, um braço de anticódon e um braço aceitador, em que o braço T compreende nucleotídeos que interagem com a proteína fator de alongamento 1 alfa e métodos de uso do mesmo. Em certas modalidades, a presente invenção provê um RNA de transferência (tRNA) modificado compreendendo um braço T, um braço D, um braço de anticódon e um braço aceitador, (a) em que o braço de anticódon compreende um anticódon trinucleotídeo, em que o anticódon é 5?-UCA-3? e reconhece códons de parada TGA, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a uma arginina, triptofano ou glicina; (b) em que o braço de anticódon compreende um anticódon de trinucleotídeo, em que o anticódon é 5?-UUA-3? e reconhece códons de parada TAA, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a uma glutamina ou glutamato; ou (c) em que o braço de anticódon compreende um anticódon de trinucleotídeo, em que o anticódon é 5?-CUA-3? e reconhece códons de parada TAG, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a um triptofano, glutamato ou glutamina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO

DE RESGATE DE CÓDONS DE PARADA ATRAVÉS DE REATRIBUIÇÃO GENÉTICA COM ACE-TRNA”. PRIORIDADE DE INVENÇÃO

[001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Número 62/580.887, que foi depositado em 2 de novembro de 2017, e para o Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Número 62/687.015, que foi depositado em 19 de junho de 2018. Os conteúdos integrais dos pedidos referidos acima são aqui incorporados a título de referência.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO À PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA

[002] A invenção foi feita com apoio do governo sob R01 GM106569 concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES

[003] Moléculas de DNA carregam informação genética na forma da sequência das bases de nucleotídeo que formam o polímero de DNA. Apenas quatro bases de nucleotídeo são utilizadas em DNA: adenina, guanina, citosina e timina. Essa informação, na forma de códons de três bases contíguas, é transcrita em RNA mensageiro (mRNA), e então traduzida por RNA de transferência (tRNA) e ribossomos para formar proteínas. Quatro bases de nucleotídeo são utilizadas em RNA: adenina, guanina, citosina e uracila. O código genético é a relação entre um códon tripleto e um aminoácido particular. Sessenta e quatro tripletos de códon possíveis formam o código genético, onde três códons de parada (também chamados terminação) proveem um sinal para o maquinário de tradução (ribossomos celulares) parar a produção de proteína no códon particular. Os outros sessenta e um tripletos no código correspondem a um dos 20 aminoácidos padrão. Vide Figura 1.

[004] DNA é traduzido por ribossomos, fazendo com que cada aminoácido seja ligado junto um por um para formar polipeptídeos, de acordo com as instruções genéticas especificamente providas pelo DNA. Quando o ribossomo atinge um códon de parada, o alongamento da proteína termina. Os três códons de parada são UAG (âmbar), UAA (ocre) e UGA (opala). Mutações que ocorrem que mudam um códon de codificação de aminoácido para códon de parada são chamadas “mutação sem sentido”. Essas mutações sem sentido podem resultar em um truncamento/encurtamento significante da sequência de polipeptídeo, e podem causar uma mudança profunda em fenótipo genético. Portanto, embora uma expressão de direcionamento de gene possa estar presente, uma proteína crucial pode não ser produzida porque quando o ribossomo atinge o sinal de parada mutante, ele termina a tradução resultando em uma proteína não acabada.

[005] RNAs de transferência traduzem mRNA em uma proteína em um ribossomo. Cada tRNA contém uma região “anticódon” que hibridiza com um códon complementar no mRNA. Um tRNA que carrega seu aminoácido designado é chamado um tRNA “carregado”. Se o tRNA for um dos 61 tRNAs associados a aminoácido (isto é, não um associado a um sinal de parada), ele vai normalmente unir seu aminoácido ao peptídeo em formação. O gene estrutural de tRNA é de cerca de 72-90 nucleotídeos de comprimento e dobra em uma estrutura de folha de trevo. tRNAs são transcritos por polimerase III de RNA e contêm seus próprios promotores de união intragênicos que se tornam uma parte da sequência de codificação de tRNA maduro (Sharp, S.J., Schaack, J., Coolen, L., Burke, D. J. e Soll. D., “Structure and transcription of eucaryotic tRNA genes”, Crit. Rev. Biochem., 19:107-144 (1985); Geiduschek, E. O. e Tocchini-Valentini, “Transcription by RNA polymerase III, Annu. Rev. Biochem. 57:873-914 (1988)).

[006] “Supressores sem sentido” são alelos de genes de tRNA que contêm um anticódon alterado, de modo que ao invés de disparar um sinal de “parada”, eles inserem um aminoácido em reposta a um códon de terminação. Por exemplo, uma mutação ocre resulta na criação de um códon UAA em um mRNA. Um gene supressor ocre produz tRNA com um anticódon AUU que insere um aminoácido no sítio UAA, o que permite a tradução continuada do mRNA apesar da presença de um códon que normalmente dispararia uma parada em tradução.

[007] Vários alelos de tRNA supressores sem sentido foram identificados em procariontes e eucariontes tais como levedura e C. elegans. Os tRNAs supressores diferentes variam em sua eficiência de supressão. Em E. coli e outros sistemas, os supressores âmbar são relativamente mais eficientes, supressores ocre são menos eficientes enquanto opala são o mínimo, isso sugere que os códons âmbar são usados sem frequência para terminar síntese de proteína, enquanto de códons ocre e opala são mais frequentemente usados como sinais de terminação naturais.

[008] Erros indesejados no modelo de DNA podem causar doença. Por exemplo, a ocorrência de um sinal de “parada” inesperado no meio da proteína, ao invés de no final do modelo, resulta na produção de uma proteína truncada ou encurtada que tem uma função alterada, ou absolutamente nenhuma função. Muitas doenças humanas, tais como fibrose cística, distrofia muscular, β-talassemia e síndrome de Liddle, resultam de sinais de parada indesejados em estruturas de leitura de DNA para proteínas que são importantes para funcionamento apropriado do pulmão, sangue, músculo ou rim, respectivamente.

[009] Portanto, há uma necessidade de prover novos tRNAs supressores sem sentido modificados que sejam estabilizados comparado com os tRNAs supressores sem sentido não modificados correspondentes e tRNAs supressores sem sentido que têm uma atividade aumentada para suprimir terminação de genes associados com fibrose cística.

SUMÁRIO

[010] Em certas modalidades, a presente invenção provê um RNA de transferência (tRNA) modificado compreendendo um braço T, um braço D, um braço anticódon e um braço aceitador, em que o braço T compreende uma haste T tendo nucleotídeos que interagem com Fator de Alongamento 1-alfa 1 (EF1alfa). EF1alfa recruta aminoacila-tRNA para o ribossomo e protege o tRNA de ser desacilado. Substituição de nucleotídeo racional resulta em um tRNA ajustado: interação de EF1α que aumenta a administração de tRNA ao ribossomo e proteção de desacilação.

[011] Em certas modalidades, a presente invenção provê um RNA de transferência modificado (tRNA) de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 32, 33, 34, 35, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

[012] Em certas modalidades, a presente invenção provê um RNA de transferência (tRNA) modificado que qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-538, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

[013] Em certas modalidades, o tRNA modificado é qualquer um de SEQ ID NOs: 56-60, 62-66, 84-86, 90-111, 113, 128-143, 147-149, 153-156, 161-174, 176, 178, 181, 184-186, 192, 196-197, 199-201, 205, 213-240, 246, 255-256, 258-285, 299, 305-312, 314, 318-332, 335-344, 346, 350-354, 357-360, 362, 365-370, 372-383, 388-390, 392, 394-401, 403-407, 414-416, 428, 422, 425, 428-433, 437, 444-445, 452, 455, 459- 463, 470, 472-474, 476, 487-492, 525, 530-539, 545-550, 553-555, 561- 563 e 567-579, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

[014] Em certas modalidades, a presente invenção provê um RNA de transferência (tRNA) modificado compreendendo uma haste T, uma haste D, um anticódon-alça e uma haste aceitadora, em que (a) o braço anticódon compreende um anticódon trinucleotídeo, em que o anticódon é 5’-UCA-3’ e reconhece códons de parada TGA, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a uma arginina, triptofano ou glicina; (b) em que o braço anticódon compreende um anticódon trinucleotídeo, em que o anticódon é 5’-UUA-3’ e reconhece códons de parada TAA, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a uma glutamina ou glutamato; ou (c) em que o braço anticódon compreende um anticódon trinucleotídeo, em que o anticódon é 5’-CUA-3’ e reconhece códons de parada TAG, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a um triptofano, glutamato ou glutamina. Em certas modalidades, o braço T compreende sequências de nucleotídeo racionalmente alteradas que ajustam a interação com o EF1α, aumentando sua atividade de supressão e dessa maneira aumentando seu potencial terapêutico. tRNAs com interação ajustada com o EF1 alfa têm supressão sem sentido aperfeiçoada e proveem propriedades terapêuticas aperfeiçoadas.

[015] Em certas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de oligonucleotídeo que codifica o tRNA modificado como descrito acima, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento total de menos do que 150 nucleotídeos. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é DNA.

[016] Em certas modalidades, a presente invenção provê um oligonucleotídeo compreendendo uma primeira sequência de oligonucleotídeo e uma segunda sequência de oligonucleotídeo, em que as primeira e segunda sequências de oligonucleotídeo codificam independentemente um tRNA modificado como descrito acima, em que os primeiro e segundo oligonucleotídeos têm independentemente um comprimento total de menos do que 150 nucleotídeos, e em que as duas sequências estão em tandem.

[017] Em certas modalidades, a presente invenção provê um cassete de expressão compreendendo um promotor e um ácido nucleico codificando o tRNA modificado ou oligonucleotídeos como acima descrito.

[018] Em certas modalidades, a presente invenção provê um vetor compreendendo o oligonucleotídeo ou cassete de expressão descrito acima.

[019] Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral ou de plasmídeo.

[020] Em certas modalidades, a presente invenção provê uma composição compreendendo um tRNA modificado, um oligonucleotídeo ou um vetor descrito acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[021] Em certas modalidades, o veículo é um lipossomo.

[022] Em certas modalidades, a invenção provê uma célula compreendendo o vetor descrito acima.

[023] A presente invenção provê um método de tratamento de uma doença genética associada a códon de parada, compreendendo administrar a composição de tRNA modificado descrito acima a um paciente com necessidade do mesmo.

[024] Em certas modalidades, a doença genética associada com um códon de parada prematuro é fibrose cística, distrofia muscular, β- talassemia ou síndrome de Liddle.

[025] Em certas modalidades, a presente invenção provê um método de restauração da tradução para uma sequência de nucleotídeo que inclui uma mutação sem sentido em uma célula, compreendendo introduzir na célula a composição descrita acima.

[026] Em certas modalidades, a presente invenção provê um método de identificação de tRNAs editados anticódon (ACE) através de clonagem e avaliação de alto rendimento usando supressão de um códon sem sentido em enzimas luciferase incluindo NanoLuc.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[027] Figura 1. Tabela de Código Genético.

[028] Figura 2. tRNAs têm uma estrutura de quatro braços geral compreendendo um braço T, um braço D, um braço anticódon e um braço aceitador. Esses braços são também referidos como “alças”.

[029] Figura 3. ACE-tRNA para supressão sem sentido (tRNATrp TGA de H. sapiens).

[030] Figura 4. (ACE)-tRNA editado anticódon codificado em um vetor usado para identificar sequências de ACE tRNA funcionais. Essa sequência de vetor inclui um sistema repórter Nanoluciferase. O vetor mostrado foi usado para identificar ACE tRNA com supressão de TGA. Variantes de TAA e TAG foram usadas para as avaliações de tRNA apropriadas (vide Figuras 14 a 17).

[031] Figura 5. Esquema do resgate de proteínas e canais de íon com códons de parada por meio de tRNA supressor.

[032] Figuras 6A e 6B. Resgate de códon sem sentido com ACE- tRNA humano. Fig. 6A. Esquema do tRNA Trp Anti-Códon Editado (ACE) e construto cherry-TGA-eGFP-HA. Fig. 6B. Resgate do construto cherry TGA eGFP-HA por tRNA triptofano ACA #4.

[033] Figura 7. Lógica e prevalência de códon sem sentido observadas em doença humana. Os vinte códons de aminoácido naturais classificados quanto à sua contribuição para doença humana, com códons hachurados em cruzamento escuros sendo mais prevalentes (TGG, TAC, TAT, TCA e TTA) e códons pontilhados sendo menos prevalentes. Todas as sequências de códon hachurado em cruzamento requerem uma mutação de nucleotídeo única para converter em um códon de parada a partir do aminoácido pretendido. Painel da direita, os códons sem sentido causadores de doença mais comuns dentro do regulador de condutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR). Aqui, novas sequências de tRNA foram encontradas para o reparo da mutação indicada.

[034] Figura 8. Identificação de sequências de tRNA para o reparo de triptofano-TGA e glicina-TGA. O eixo da esquerda indica razão acima da base para atividade de luciferase. A maioria dos tRNAs com alças anticódon mutantes não tem atividade de resgate.

[035] Figura 9. Resgate de CFTR 1282x com ACE-tRNAs Trpchr17.trna39 e Glychr19.trna2. Dados de Western blot bioquímico de canais de CFTR W1282X coexpressos em células HEK com o tRNA indicado. Vetores de expressão contendo quatro cópias do tRNA indicado exibem resgate maior da proteína CFTR. A faixa “C” indica resgate da proteína CFTR glicosilada, totalmente madura. O anticorpo usado foi M3A7 de Terapêutica de Fibrose Cística em uma diluição 1:1000.

[036] Figuras 10A e 10B. Expressão de ACE-tRNATrp e ACE- tRNAGly resulta em incorporação específica de aminoácidos cognatos em códons sem sentido. Fig. 10A) Coexpressão de proteína modelo histidinol desidrogenase (HDH)-His-Strep N94-TGA e ACE-tRNATrp (esquerda) e ACE-tRNAGly (direita) resulta em proteína HDH de comprimento integral (asterisco) que é detectável por tingimento com prata seguindo purificação por afinidade. Fig. 10B) Espectros de WT HDH (superior), HDH-N94 + ACE-tRNAGly (meio) e HDH-N94 + ACE- tRNATrp (inferior). Espectros destacam diferenças em massa de aminoácido na posição N94 que correspondem especificamente a Glicina (-57Da) e Triptofano (+72Da), indicando inserção de aminoácidos cognatos ACE-tRNA.

[037] Figura 11. Fluxo de trabalho de clonagem para a construção de bibliotecas de tRNA.

[038] Figuras 12A-12B. Mutações direcionadas de nucleotídeos dentro da região de haste T melhoram mais a função de resgate de ACE-tRNA. Fig. 12A. Trpchr17.tRNA 39 foi sistematicamente mutagenizado dentro da região de haste t. Esses esforços identificaram ACE tRNA TS-10 52-62 G-C (Fig. 12B) e barra hachurada cruzada em gráfico, que exibe ~250% de atividade biológica aumentada.

[039] Figuras 13A-13F. ACE-tRNAs são seletivos para códons sem sentido e mais eficientes do que supressão sem sentido de aminoglicosídeo. Fig. 13A) ACE-tRNATpr#5 e Fig. 13B) ACE- tRNAGly#16 foram clonados em plasmídeos repórteres NanoLuc contendo códons sem sentido TGA, TAA ou TAG. Supressão sem sentido foi apenas medida em construtos NanoLuc-TGA seguindo transfecção. Fig. 13C e Fig. 13D) Supressão de NanoLuc-TGA através da adição de gentimicina (40uM) e G418 (150uM) e constransfecção com ACE-tRNATrp#5 e ACEtRNAGly#16 foram medidas na Fig. 13C) 24 e na Fig. 13D) 48 h em células HEK293. Fig. 13E e Fig. 13F) células HEK293 expressando estavelmente NanoLuc-TFA foram tratadas com gentimicina (40uM) e G418 (150uM) e transfectadas com ACE- tRNATrp#5 e ACE-tRNAGly#16. Supressão sem sentido foi medida na Fig. 13E) 24 e na Fig. 13F) 48 h pós-tratamento.

[040] Figura 14. ACE-tRNA-Arg-TGA. Identificação de ACE-tRNA para reparo de códons sem sentido de arginina-TGA.

[041] Figura 15. ACE-tRNA-Gln TAG. Identificação de ACE-tRNA para reparo de códons sem sentido glutamina TAG.

[042] Figura 16. ACE-tRNA-Gln TAA. Identificação de ACE-tRNA para reparo de códons sem sentido glutamina TAA.

[043] Figura 17. ACE-tRNA-Glu TAG. Identificação de ACE-tRNA para reparo de códons sem sentido glutamato TAG.

[044] Figura 18. ACE-tRNA-Gln TAA. Identificação de ACE-tRNA para reparo de códons sem sentido glutamato TAA.

[045] Figura 19. ACE-tRNA-Trp TAG. Identificação de ACE-tRNA para o reparo de códons sem sentido de triptofano TAG.

[046] Figuras 20A-20D. Administração de ACE-tRNAs como RNA pequeno suporta supressão robusta de mutações sem sentido G542X e W1282X. Fig. 20A) cRNA CFTR com mutações sem sentido causando fibrose cística G542X ou W1282X foi coinjetado em oócitos de Xenopus com diluições seriais de ACE-tRNAGly e ACE-tRNATrp pré-dobrados, respectivamente. Registros de braçadeira de tensão de dois eletrodos de corrente de Cl- CFTR foram realizados após 36 h. Relações de corrente-tensão ilustram que quantidades altas de RNA pré-dobrado Fig. 20B) ACE-tRNATrp e Fig. 20C) ACE-tRNAGly resultam em função de CFTR aumentada (correntes de Cl- CFTR medidas) com CFTR obtida em experimentos de ACE-tRNAGly. Fig. 20D) Dose resposta de resgate de G542X ACE-tRNAGly (círculos preenchidos) e W1282X ACE-tRNATrp (quadrados abertos) (correntes de Cl- CFTR elicitadas a +40mV foram normalizadas para correntes Cl- CFTR WT a +40mV). A dependência de dose de ACE-tRNAGly (EC50= ~20 ng; coeficiente Hill ~1,4) mostra saturação clara em níveis de CFTR WT, enquanto ACE- tRNATrp é deslocado para a direita (EC50= ~94ng; coeficiente Hill 1,24).

[047] Figuras 21A-21B. Uma avaliação de supressão de mutação sem sentido para identificar tRNAs editados anticódon (ACE-tRNAs). Fig. 21A. O esquema ilustra interações necessárias de ACE-tRNAs com maquinário traducional. Seguindo administração, ACE-tRNAs são reconhecidos por uma aminoacila-tRNA sintetase endógena e carregados (aminoacilados) com seu aminoácido cognato. O ACE-tRNA aminoacilado é reconhecido pelo fator 1-alfa de alongamento endógeno, que protege o ACE-tRNA de ser desacilado e administra o ACE-tRNA aminoacilado ao ribossomo para supressão de um códon de terminação prematuro, neste caso UGA. Fig. 21B. ACE-tRNAs individuais foram clonados no plasmídeo Repórter Sem sentido de Clonagem de Alto Rendimento usando Golden Gate emparelhado com seleção negativa para CcdB. O plasmídeo all-in-one contém o repórter da luciferase NLuc com PTC ou de UGA, UAG ou UAA em p.162 entre o bit grande enzimático e o bit pequeno C-terminal necessário.

[048] Figura 22. Avaliações de famílias de gene ACE-tRNA com a plataforma de repórter de mutação sem sentido de clonagem de alto rendimento. As sequências de PTC editadas anticódon indicadas foram testadas para cada família ACE-tRNA que está um nucleotídeo distante da sequência de anticódon endógena, Figura 25. tRNAs supressores de alto desempenho múltiplos foram identificados para cada classe. Os dados são mostrados em escala Log10 em termos de luminescência NLuc normalizada. Cada conjunto de dados de tRNA foi obtido em triplicatas e são exibidos em SEM, com a análise estatística ANOVA correspondente na Tabela 2. Identidades codificadas e sequências de tRNA correspondentes são mostradas na Figura 29 e na Tabela 9, respectivamente.

[049] Figuras 23A-23C. Codificação Cognata e Supressão de Alta Fidelidade por tRNA engenheirado. Fig. 23A. Fragmento tríptico de histidinol desidrogenase (HDH), onde “X” indica códon PTC suprimido. Espectros de EM/EM do fragmento tríptico com massas de íons y e b indicados para HDH WT (superior), N94G (meio) e N94W (inferior). A massa do íon b9 é mudada pela massa prevista de -57 Da e +72 Da a partir da asparagina WT, indicando a codificação de aminoácidos cognatos glicina e triptofano por ACE-tRNAGly e ACE-tRNATrp, respectivamente. Fig. 23B. ACE-TGA-tRNAGly (Glychr19.t2) suprime seletivamente o códon de parada de UGA em células HEK293 transientemente transfectadas. Fig. 23C) Transfecção de ACE-tRNAGly supera ambas gentamicina (40uM) e G418 (140um) seguindo uma incubação de 48 h em células Hek298 expressando estavelmente NLuc- UGA.

[050] Figuras 24A-24B. Traçado de perfil de ribossomo de ACE- tRNA em 3’UTRs de transcriptoma amplo. Fig. 24A. Densidades de pegada ribossômica em 3’UTRs são representadas em gráfico como razão log2 para leituras de células tratadas versus controle (vetor vazio puc57GG) como descrito em materiais e métodos. Os transcritos foram agrupados por seus códons de parada TAA, TAG e TGA endógenos. Cada ponto representa a média de duas réplicas para um transcrito. Barras de erro mostram Média ± DP da razão log2. Fig. 24B. A razão log2 média de ocupação de pegada de ribossomo normalizada foi representada em gráfico para cada nucleotídeo de -50 a +50 nt códons de parada circundantes de transcriptoma (18.101 sequências). O desenho ilustra o deslocamento ~15 nt da extremidade 5’ de pegada de ribossomo para a primeira posição de base de códon de parada no sítio do ribossomo A.

[051] Figura 25. Uso de códon para PTC comum. Hachura cruzada indica os aminoácidos mais comum e tipo de aminoácido correspondente que podem ser convertidos em códons de parada por meio de substituição de nucleotídeo. tRNA engenheirados foram desenvolvidos para cada tipo.

[052] Figura 26. Gráfico de atividade de ACE-tRNA referenciado por número.

[053] Figura 27. Alinhamento de sequências de tRNA de Glicina. 12 sequências humanas de tRNAGly demonstram homologia de sequência alta dentre clades de tRNA. Padrão em imagem de tRNA corresponde a caixas padronizadas em sequências.

[054] Figura 28. Identidade de cadeia lateral em p. 162 em Nanoluciferase não afeta atividade. Atividade de luminescência total é indicada para cada mutação em sítio.

[055] Figuras 29A-29C. Análise de sequências ACE-tRNATrp de espécies múltiplas e mutações de tRNA supressoras. Figs. 29A-29B. Alinhamento de sequência. Fig. 29C. NLuc-UGA + ACE-tRNATrp/NLuc- UGA.

[056] Figuras 30A-30C. Construto de expressão de histidinol desidrogenase (HDH) His(8)-estreptactina permite isolamento de uma etapa eficiente de proteína a partir de células HEK293. Fig. 30A) Sequência de proteína de construto de expressão de HDH. A sequência sublinhada indica cobertura por espectrometria de massa. A asparagina sublinhada, em negrito (posição 94 do aminoácido) é o resíduo mutado para um PTC TGA para determinação de fidelidade de ACE-tRNA. O marcador de afinidade dupla é indicado em itálico sublinhado. Tingimento cinza de proteína HDH seguindo supressão de PTC com Fig. 30B) Trpchr17.trna39 e Fig. 30C) Glychr19.trna2.

[057] Figura 31. Especificidade de códon de parada é mantida para ACE-tRNATrp. Atividade de supressão 36 para tRNA TrpTGA Trpchr17.trna39, o tRNA supressor de TrpTGA de desempenho mais alto, Figura 22. Esse tRNA foi coexpresso com a plasmídeo pNano- PARADA indicado.

[058] Figuras 32A-32D. ACE-tRNAs são mais eficientes do que supressão de PTC por aminoglicosídeo. Fig. 32A) Luminescência bruta e Fig. 32B) normalizada medida 24 h seguindo adição de gentamicina (40uM), G418 (150uM) e transfecção com Trpchr17.trna39 e Glychr19.trna2 em células HEK293 expressando estavelmente Nluc- UGA repórter PTC. Fig. 32C) Luminescência bruta e Fig. 32D) normalizada medida 24 h seguindo adição de gentamicina (40uM), G418 (150uM) e cotransfecção com Trpch17.trna39 e Glychr19.trna2 em células HEK293.

[059] Figura 33. Comparação de cursos de tempo de atividade de ACE-tRNA seguindo administração como RNA ou cDNA. ACE-tRNAs foram administrados a células HEK293 que expressam estavelmente pNanoLuc-UGA, no entanto, apenas 5 µl da mistura de reação foram adicionados às células para reduzir o efeito de reagentes de transfecção sobre viabilidade celular. ACE-tRNA administrado como RNA (símbolos abertos) foi mais rápido no resgate de expressão do repórter de PTC do que construtos de cDNA (círculos fechados). No entanto, a atividade de ACE-tRNA continuou a aumentar durante as 48 horas quando expresso a partir de cDNA e diminuiu como um RNA de liberação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[060] Ao longo dos anos, os pesquisadores identificaram centenas de mutações por ponto únicas que resultaram em códons sem sentido sendo estabelecidos em genes humanos. Esses tipos de mutações resultam, por exemplo, em distrofia muscular, xeroderma pigmentoso, fibrose cística, hemofilia, anemia, hipotireoidismo, carcinoma de célula escamosa p53, carcinoma hepatocelular p53, carcinoma ovariano p53, carcinoma esofageal, osteocarcinoma, carcinoma ovariano, carcinoma esofageal, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, carcinoma hepatocelular, histiocitoma fibroso, carcinoma ovariano, reversão de sexo SRY, anemia por triosefosfato isomerase, diabetes e raquitismo. Os genes BRACA-1 e BRACA-2 associados com câncer de mama também têm mutações similares.

[061] As sequências de nucleotídeo codificando várias centenas de tRNAs humanos são conhecidas e geralmente disponíveis para aqueles na técnica através de fontes tal como Genbank. A estrutura de tRNAs é altamente conservada e tRNAs são frequentemente funcionais entre as espécies. Portanto, sequências de tRNA bacterianas ou outras eucarióticas são também fontes potenciais para oligonucleotídeos para os tRNAs estabilizados da invenção. A determinação de se uma sequência de tRNA particular é funcional em uma célula de mamífero desejada pode ser verificada através de experimentação de rotina. Sequências de tRNA potenciais adicionais que não são ainda conhecidas podem ser modificadas como aqui descrito a fim de serem estabilizadas através de experimentação de rotina.

[062] Genes de tRNA têm promotores fortes que são ativos em todos os tipos de célula. Os promotores para genes de tRNA eucarióticos estão contidos dentro de sequências estruturais codificando a própria molécula de tRNA. Embora haja elementos que regulam a atividade transcripcional dentro da região a montante 5’, o comprimento de uma unidade transcripcional ativa pode ser consideravelmente menos do que 500 pares de base e então acomodação dentro de um vetor de administração é simples. Uma vez eles tendo sido transcritos e processados, tRNAs têm taxas de degradação baixas. Finalmente, terapia gênica com um supressor sem sentido mantém os controles fisiológicos endógenos com relação ao gene-alvo que contém o códon sem sentido. Mutações Sem Sentido

[063] RNA de transferência (tRNA) é um tipo de molécula de RNA que funciona na decodificação de uma sequência de RNA mensageiro (mRNA) em uma proteína. tRNAs funcionam em sítios específicos no ribossomo durante tradução, que sintetiza uma proteína a partir de uma molécula de mRNA. Mutações sem sentido, também chamadas Códons de Terminação Prematuros (PTCs), perfazem ~10-15% das mutações por par de base única que causam doença humana, e fibrose cística faz o mesmo. (Peltz e outros, Annu. Rev. Med., 64:407-25, 2013). Em geral, mutações sem sentido têm ramificações mais sérias do que mutações de sentido errôneo devido à quase que completa perda de expressão e atividade de gene e com a possibilidade de efeitos negativos dominantes de produtos truncados. PTCs resultam em término de tradução prematuro e declínio de transcrito de mRNA acelerado através da via de Degradação Mediada por Mutação Sem sentido (NMD).

[064] Os estudos atuais mostram que o sítio específico dentro de um transcrito de RNA ao qual um tRNA libera seu aminoácido pode ser mudado através de edição molecular da sequência anticódon dentro do tRNA. Essa abordagem permitiu que um códon de terminação prematuro (PTC) fosse efetivamente e terapeuticamente revertido de volta para seu aminoácido originalmente perdido. tRNA com anticódon editado (ACE-tRNA) forma uma classe nova de agentes terapêuticos biológicos.

[065] tRNAs engenheirados permitem “reedição” de um códon sem sentido causador de doença para um aminoácido específico. Esses tRNAs engenheirados se direcionam a apenas um tipo de códon de parada, tal como TGA com relação a TAC ou TAA. O tamanho pequeno dessas moléculas de tRNA as torna condescendentes à pronta expressão, uma vez que o tRNA + o promotor é apenas ~300 pb. Em suma, é sintetizado um oligonucleotídeo, o qual compreende o componente estrutural de um gene de tRNA funcional em células humanas. A sequência desse oligonucleotídeo é projetada com base na sequência conhecida com substituições feitas na região anticódon do tRNA fazendo com que o tRNA específico reconheça uma mutação sem sentido ou outra específica.

[066] Várias avaliações de moléculas pequenas foram realizadas para suprimir códons de parada sem sentido através de interações com o ribossomo, as moléculas mais marcantes sendo G418, Gentamicina e PTC124. PTC124 ou Ataluren foi recentemente liberado dos testes clínicos de Fase 3 como uso para um agente terapêutico para fibrose cística. Ataluren e aminoglicosídeos promovem read-through de cada um dos três códons sem sentido ao pôr um aminoácido cognato próximo que transforma uma mutação sem sentido em uma mutação silenciosa. (Roy e outros, PNAS 2016 Nov 1;113(44):12508-12513). tRNA com anticódon editado (ACE-tRNA)

[067] tRNAs têm uma estrutura de quatro braços geral compreendendo um braço T, um braço D, um braço anticódon e um braço aceitador (Figura 2).

[068] O braço T é feito de uma “haste T” e uma “alça TψC”. Em certas modalidades, a haste T é modificada para aumentar a estabilidade do tRNA. Em certas modalidades, o ACE-tRNA tem uma haste T modificada que aumenta a atividade biológica para suprimir sítios de parada relativos à sequência da haste T endógena.

[069] A presente invenção em uma modalidade inclui composições compreendendo tRNAs estabilizados, que podem ser usados com eficácia maior a fim de tratar uma ampla variedade de doenças associadas à mutação sem sentido. As sequências que seguem nas Tabelas 1-8 são escritas como DNA, mas como RNA (DNA transcrito) a “T: timidina” é “U: uracila”. Portanto, tRNAs transcritos a partir das sequências que seguem todos contêm uracilas no lugar das timidinas.

[070] Em certas modalidades, o tRNA tem as sequências que seguem (em que as timidinas são substituídas com uracilas). TS-36: GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCAGAAG GtTGCGgGTTCAAATCcCGTCGGGGTCA (SEQ ID NO: 1) TS-37: GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCAGAAG GtTaCGgGTTCAAATCcCGTCGGGGTCA (SEQ ID NO: 2) TS-38: GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCAGAAG GtTcCGgGTTCAAATCcCGgCGGGGTCA (SEQ ID NO: 3) Tabela 1 Classifi Identificador Sequência SEQ ID NO. cação ArgTGAchr9.tr CGTCGGCTCTGTGGCGCAATGGATAGCGCATTGGACTTCAA #1 4 na6/nointron ATTCAAAGGTTGTGGGTTCGAGTCCCACCAGAGTCG ArgTGAchr17. CGTCGCCCCAGTGGCCTAATGGATAAGGCACTGGCCTTCAA #2 5 trna19 AGCCAGGGATTGTGGGTTCGAGTCCCACCTGGGGTG ArgTGAchr1.tr CGTCGGCTCCGTGGCGCAATGGATAGCGCATTGGACTTCAA #3 6 na10/nointron ATTCAAAGGTTCCGGGTTCGAGTCCCGGCGGAGTCG ArgTGAchr7.tr CGTCGCCCCAGTGGCCTAATGGATAAGGCATTGGCCTTCAA #4 7 na5 AGCCAGGGATTGTGGGTTCGAGTCCCATCTGGGGTG

Classifi Identificador Sequência SEQ ID NO. cação ArgTGAchr17. CGTCGGCTCTGTGGCGCAATGGATAGCGCATTGGACTTCAA #4 8 trna3/nointron ATTCAAAGGTTGTGGGTTCGAATCCCACCAGAGTCG

CGTCGGCTCTGTGGCGCAATGGATAGCGCATTGGACTTCAA ArgTGAchr9.tr #5 GCTGAGCCTAGTGTGGTCATTCAAAGGTTGTGGGTTCGAGT 9 na6/withintron

CCCACCAGAGTCG ArgTGAchr16. CGTCGCCCCGGTGGCCTAATGGATAAGGCATTGGCCTTCAA #5 10 trna3 AGCCAGGGATTGTGGGTTCGAGTCCCACCCGGGGTA ArgTGAchr1.tr CGTCGGCTCCGTGGCGCAATGGATAGCGCATTGGACTTCAA #6 na10/withintro GAGGCTGAAGGCATTCAAAGGTTCCGGGTTCGAGTCCCGG 11 n CGGAGTCG ArgTGAchr17. CGTCGGCTCTGTGGCGCAATGGATAGCGCATTGGACTTCAA #7 trna3/withinro GTGACGAATAGAGCAATTCAAAGGTTGTGGGTTCGAATCCC 12 n ACCAGAGTCG ArgTGAchr15. CGTCGGCCGCGTGGCCTAATGGATAAGGCGTCTGACTTCA 13 trna4 GATCAGAAGATTGCAGGTTCGAGTCCTGCCGCGGTCG ArgTGAchr17. CGTCGACCGCGTGGCCTAATGGATAAGGCGTCTGACTTCAG 14 trna17 ATCAGAAGATTGAGGGTTCGAGTCCCTTCGTGGTCG ArgTGAchr11. CGTCGGCTCTGTGGCGCAATGGATAGCGCATTGGACTTCAA trna3/withintro GATAGTTAGAGAAATTCAAAGGTTGTGGGTTCGAGTCCCAC 15 n CAGAGTCG Tabela 2 Classifi- Identifica- Sequência SEQ ID NO. cação dor GlnTAGchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTctaA 16 #1 1.trna17 ATCCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAGchr CGTCGGCCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaA 17 #2 6.trna175 ATCCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT GlnTAGchr CGTCGGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAA 18 #3 6.trna63 TCCAGCAaTCCGAGTTCGAATCTCGGTGGGACCT GlnTAGchr CGTCGGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAA 19 #4 17.trna14 TCCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT GlnTAGchr CGTCGGCCCCATGGTGTAATGGTcAGCACTCTGGACTctaA 20 #5 6.trna132 ATCCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCC GlnTAGchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACTCTGGACTctaA 21

1.trna101 ATCCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT

Classifi- Identifica- Sequência SEQ ID NO. cação dor GlnTAGchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAA 22

6.trna42 TCCGGTAaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGAACCT GlnTAGchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAA 23

6.trna147 TCCAGCGaTCCGAGTTCAAGTCTCGGTGGAACCT Tabela 3 Clssifi- Identifi- Sequência SEQ ID NO. cação cador GlnTAAchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACTCTGGACTttaAA 24 #1 1.trna101 TCCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr CGTCGGCCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 25 #2 6.trna175 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT GlnTAAchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTttaAA 26 #3 1.trna17 TCCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 27 #4 6.trna1 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr CGTCGGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 28 #5 17.trna14 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT GlnTAAchr CGTCGGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 29 #5.2 6.trna63 CCAGCAaTCCGAGTTCGAATCTCGGTGGGACCT GlnTAAchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 30

6.trna42 CCGGTAaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr CGTCGGCCCCATGGTGTAATGGTcAGCACTCTGGACTttaAA 31

6.trna132 TCCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCC GlnTAAchr CGTCGGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 32

6.trna147 CCAGCGaTCCGAGTTCAAGTCTCGGTGGAACCT Tabela 4 Classifi- Identifi- Sequência SEQ ID NO. cação cador CGTCGACCTCGTGGCGCAATGGTAGCGCGTCTGACTctAGA #1 rpTAGchr1 33 TCAGAAGGtTGCGTGTTCAAGTCACGTCGGGGTCA

7.trna10 CGTCGACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTctAGA TrpTAGchr #2 TCAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA 34

6.trna171

Classifi- Identifi- Sequência SEQ ID NO. cação cador TrpTAGchr CGTCGGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTctAGA #3 35

17.trna39 TCAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTAGchr CGTCGACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTctAGA #4 36

12.trna6 TCAGAAGGcTGCGTGTTCGAATCACGTCGGGGTCA TrpTAGchr CGTCGACCTCGTGGCGCAACGGCAGCGCGTCTGACTctAGA 37

7.trna3 TCAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Tabela 5 Classifi- Identifi- Sequência SEQ ID NO. cação cador GluTAGchr CGTCTCCCACATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTctaAC 38 #1 13.trna2 CCAGGCGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTGTGGGAA GluTAGchr CGTCTCCCATATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTctaAC 39 #2 2.trna18 CCAGGTGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTATGGGAA GluTAGchr CGTCTCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTctaAC 40 #3 1.trna123 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAGchr CGTCTCCCTGGTGGTCTAGTGGTtAGGATTCGGCGCTctaAC 41 #4 1.trna106 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAGchr CGTCTCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTctaAC 42

1.trna5 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAGGGAA Tabela 6 Classifi- Identifi- Sequência SEQ ID NO. cação cador GluTAAchr CGTCTCCCACATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTctaAC 43

13.trna2 CCAGGCGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTGTGGGAA GluTAAchr CGTCTCCCATATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTctaAC 44

2.trna18 CCAGGTGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTATGGGAA GluTAAchr CGTCTCCCTGGTGGTCTAGTGGTtAGGATTCGGCGCTctaAC 45

1.trna106 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAAchr CGTCTCCCTGGTGGTCTAGTGGTtAGGATTCGGCGCTctaAC 46

1.trna55 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGAAA GluTAAchr CGTCTCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTctaAC 47

1.trna5 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAGGGAA

Tabela 7 Classifi- Identifi- Sequência SEQ ID NO. cação cador TrpTGAchr GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCA 48 #1 17.trna39 GAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr GACCTCGTGGCGCAATGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCAG 49 #2 17.trna10 AAGGtTGCGTGTTCAAGTCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCA 50 #3 6.trna171 GAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCA 51

12.trna6 GAAGGcTGCGTGTTCGAATCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr GACCTCGTGGCGCAACGGCAGCGCGTCTGACTtCAGATCA 52

7.trna3 GAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Tabela 8 Classifi- Identifica-dor Sequência SEQ ID NO. cação GlyTGAchr19. GCGTTGGTGGTATAGTGGTtAGCATAGCTGCCTTCaAAG 53 #1 trna2 CAGTTGaCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAACGCA GlyTGAchr1.tr GCGTTGGTGGTATAGTGGTgAGCATAGCTGCCTTCaAAG 54 #2 na107 CAGTTGaCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAACGCA GlyTGAchr17. GCGTTGGTGGTATAGTGGTaAGCATAGCTGCCTTCaAAG 55 #3 trna9 CAGTTGaCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAACGCA

[071] Em uma modalidade, o ACE-tRNA para supressão sem sentido é como mostrado na Figura 3 (tRNATrpTGA de H. sapiens).

[072] De acordo com a invenção, tRNAs supressores de UAA, UAG e UGA humanos foram projetados. A avaliação identificou tRNA com códon editado para o reparo de Trp-TGA, Trp-TAG, Arg-TGA, Gln- TAG, Gln-TA, Glu-TAG, Glu-TAA. Os RNAs são de aproximadamente 100 nucleotídeos de comprimento e podem ser introduzidos em células para suprimir mutações de códons sem sentido onde o aminoácido do tipo selvagem deve estar presente. Os oligonucleotídeos podem ser introduzidos diretamente em células recipientes ou podem ser ligados em tandem para aumentar a eficácia do oligonucleotídeo. Cassetes e Vetores de Expressão

[073] Em certas modalidades, o ACT-tRNA é codificado por um cassete de expressão. Em ainda uma outra modalidade, o tRNA supressor da invenção pode ser introduzido nas células usando técnicas de engenharia genética convencionais padrão através do uso de vetores. Devido às sequências promotoras internas de sequências de codificação de tRNA, a sequência de tRNA não precisa ser incluída em uma unidade de transcrição separada, embora uma possa ser provida.

[074] Em uma modalidade da presente invenção, o sistema de expressão de nucleotídeo da invenção é incluído em um veículo de transferência de gene apropriado que é então usado para transduzir células para expressar o tRNA supressor. O veículo de administração de gene pode ser qualquer veículo de administração conhecido na técnica, e pode incluir DNA nu que é facilitado por uma transfecção mediada por receptor e/ou lipídeo, bem como qualquer um de vários vetores. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores eucarióticos, vetores procarióticos (tais como, por exemplo, vetores bacterianos) e vetores virais incluindo, mas não limitado a, vetores retrovirais, vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados, vetores de lentivírus (humanos e outros incluindo suínos), vetores do vírus do Herpes, vetores virais Epstein-Barr, vetores de vírus SV40, vetores de pox vírus e vetores virais pseudotipificado.

[075] Em certas modalidades, o ACT-tRNA (PCT) é codificado em um vetor. Figura 4. Em certas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral ou adenoviral. Exemplos de vetores retrovirais que podem ser empregados incluem, mas não estão limitados a, Vírus da Leucemia de Murino Moloney, vírus da necrose do baço e vetores derivados de retrovírus tais como Vírus do Sarcoma de Rous, Vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus de tumor mamário. Retrovírus; Vetores Retrovirais

[076] O termo “retrovírus” é usado em referência a vírus de RNA que utilizam transcriptase reversa durante seu ciclo de replicação. O RNA genômico retroviral é convertido em DNA de filamento duplo através de transcriptase reversa. Essa forma de DNA de filamento duplo do vírus é capaz de ser integrada ao cromossomo da célula infectada; uma vez integrada, ela é referida como um “provírus”. O provírus serve como um modelo para polimerase II de RNA e direciona a expressão de moléculas de RNA que codificam as proteínas estruturais e enzimas necessárias para produzir novas partículas virais. Em cada final do provírus estão estruturas chamadas “repetições terminais longas” ou “LTRs”. A LTR contém vários sinais reguladores incluindo elementos de controle transcripcional, sinais de poliadenilação e sequências necessárias para replicação e integração do genoma viral. Existem vários gêneros incluídos na família Retroviridae, incluindo Cisternavírus A, Oncovírus A, Oncovírus B, Oncovírus C, Oncovírus D, Lentivírus e Spumavírus. Alguns dos retrovírus são oncogênicos (isto é, tumorigênicos), enquanto outros não são. Os oncovírus incluem sarcomas, leucemias, linfomas e carcinomas mamários em espécies suscetíveis. Retrovírus infectam uma ampla variedade de espécies, e podem ser administrados ambos horizontalmente e verticalmente. Eles são integrados ao DNA hospedeiro, e são capazes de administrar sequências de DNA hospedeiro de célula para célula. Isso levou ao desenvolvimento de retrovírus como vetores para vários propósitos incluindo terapia gênica.

[077] Retrovírus, incluindo vírus espumoso humano (HFV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV), ganharam muita atenção recente, uma vez que suas células-alvo não são limitadas a células divisoras e seu tropismo de célula hospedeira restrito pode ser prontamente expandido através de pseudotipificação com glicoproteínas do envelope do vírus G da estomatite vesicular (VSV-G) (Vide, por exemplo, J. C.

Burns e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037 [1993]; A. M. L. Lever, Gene Therapy. 3:470-471 [1996]; D. Russel e A. D. Miller, J. Virol., 70:217-222 [1996]).

[078] Sistemas de vetor geralmente têm um vetor de DNA contendo uma porção pequena da sequência retroviral (a repetição terminal longa viral ou “LTR” e o empacotamento ou sinal de “psi”) e uma linhagem de célula de empacotamento. O gene a ser transferido é inserido no vetor de DNA. As sequências virais presentes no vetor de DNA proveem os sinais necessários para a inserção ou empacotamento do RNA de vetor na partícula viral e para a expressão do gene inserido. A linhagem de célula de empacotamento provê as proteínas virais requeridas para montagem de partícula (D. Markowitz e outros, J. Virol., 62:1120 [1988]). Em uma modalidade da presente invenção, um sistema FIV empregando um método de produção de transfecção de três plasmídeos em células 293T foi usado (Johnston e outros, J. Virol. 1999 73:4991-5000). Vírus incompetente em replicação foi produzido com sucesso.

[079] O DNA de vetor é introduzido na célula de empacotamento através de qualquer um de uma variedade de técnicas (por exemplo, coprecipitação com fosfato de cálcio, lipofecção, eletroporação). As proteínas virais produzidas pela célula de empacotamento fazem a mediação da inserção das sequências de vetor na forma de RNA em partículas virais, que são derramadas sobrenadante de cultura.

[080] Para células que estão se dividindo naturalmente, ou são estimuladas a se dividir por fatores de crescimento, retrovírus simples tais como vetores do vírus da leucemia de murino (MLV) são sistemas de administração adequados. Uma grande limitação no uso de muitos vetores retrovirais comumente usados em transferência de gene, no entanto, é que muitos dos vetores são restritos a células de divisão. Se uma célula de não divisão for a célula-alvo, então um lentivírus, que é capaz de infectar células de divisão, pode ser usado.

[081] Como aqui usado, o termo “lentivírus” se refere a um grupo (ou gênero) de retrovírus que dão origem à doença de desenvolvimento lento. Vírus incluídos nesse grupo incluem HIV (vírus da imunodeficiência humana; incluindo HIV tipo 1 e HIV tipo 2), o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (AIDS); visna-maedi, que causa encefalite (visna) ou pneumonia (maedi) em ovelha, o vírus da artrite-encefalite do caprino, que causa imunodeficiência, artrite e encefalopatia em cabras; vírus da anemia infecciosa equina, que causa anemia hemolítica autoimune, e encefalopatia em cavalos; vírus da imunodeficiência felina (FIV), que causa imunodeficiência em gatos; vírus da imunodeficiência bovina (BIV), que causa linfadenopatia, linfocitose e possivelmente infecção do sistema nervoso central no gado; e vírus da imunodeficiência símia (SIV), que causa imunodeficiência e encefalopatia em primatas sub- humanos. Doenças causadas por esses vírus são caracterizadas por um período de incubação longo e curso prolongado. Geralmente, os vírus infectam latentemente monócitos e macrófagos, a partir dos quais eles se espalham para outras células. HIV, FIV e SIV também infectam prontamente linfócitos T (isto é, células T).

[082] Lentivírus incluindo HIV, SIV, FIV e vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) dependem de vários genes reguladores virais em adição aos genes gag-pol-env estruturais simples para replicação intracelular eficiente. Portanto, lentivírus usam estratégias mais complexas do que retrovírus clássicos para regulagem de gene e replicação viral, com os sinais de empacotamento aparentemente se espalhando por todo o genoma viral. Esses genes adicionais exibem uma rede de funções reguladoras durante o ciclo de vida lentiviral. Por exemplo, quando da infecção por HIV-1, transcrição é suprarregulada pela expressão de Tat através da interação com um alvo de RNA (TAR)

no LTR. Expressão dos mRNAs de comprimento integral e unidos é então regulada pela função de Rev, que interage com elementos de RNA presentes na região gag e na região env (RRE) (S. Schwartz e outros, J. Virol., 66:150-159 [1992]). Exportação nuclear de nRNAs gag- pol e env é dependente da função de Rev. Em adição a esses dois genes reguladores essenciais, uma lista de genes acessórios, incluindo vif, vpr, vpx, vpu e nef, também está presente no genoma viral e seus efeitos sobre produção de vírus eficiente e infectividade foram demonstrados, embora eles não sejam absolutamente necessários para replicação de vírus (K. e F. Wong-Staal, Microbiol. Rev., 55:193-205 (1991)]; R. A. Subbramanian e E. A. Cohen, J. Virol. 68:6831-6835

[1994]; e D. Trono, Cell 82:189-192 [1995]). Uma descrição detalhada da estrutura de um lentivírus exemplar, HIV-1, é dada na Patente US No. 6.531.123.

[083] Um retrovírus “fonte” ou “original” é um retrovírus do tipo selvagem a partir do qual um retrovírus pseudotipificado é derivado, ou é usado como um ponto de partida, durante construção do vetor de empacotamento ou de transgene, para a preparação de um ou mais dos elementos genéticos do vetor. O elemento genético pode ser empregado sem modificação ou ele pode ser mutado (mas não além do ponto onde ele não tenha uma similaridade de sequência estatisticamente significante com o elemento original). Um vetor pode ter mais de um retrovírus-fonte, e os retrovírus-fonte diferentes podem ser, por exemplo, MLV, FIV, HIV-1 e HIV-2 ou HIV e SIV. O termo “elemento genético” inclui, mas não está limitado a, um gene.

[084] Um retrovírus cognato é o retrovírus do tipo selvagem com o qual o vetor em questão tem a maior identidade de sequência percentual no nível de ácido nucleico. Normalmente, esse será igual ao retrovírus- fonte. No entanto, se o retrovírus-fonte for extensivamente mutado, é concebível que o vetor lembrará então mais alguns outros retrovírus.

Não é necessário que o retrovírus cognato seja o ponto de partida físico para a reconstrução; uma pessoa pode escolher sintetizar um elemento genético, especialmente um elemento mutante, diretamente, ao invés de primeiro obter o elemento original e então modificá-lo. O termo “cognato” pode ser similarmente aplicado a uma proteína, gene ou elemento genético (por exemplo, sítio doador de união ou sinal de empacotamento). Quando se referindo a uma proteína cognata, identidades de sequência percentuais são determinadas no nível de aminoácido.

[085] O termo retrovírus “cognato” pode ser difícil de interpretar no caso extremo, isto é, se todos os elementos genéticos retrovirais tiverem sido substituídos com elementos genéticos não lentivirais substitutos. Nesse caso, a cepa de retrovírus-fonte mencionada anteriormente é arbitrariamente considerada ser o retrovírus cognato.

[086] O termo “replicação” como aqui usado em referência a um vírus ou vetor se refere não à replicação normal de DNA proviral em um cromossomo como uma consequência de reprodução celular ou a replicação autônoma de um DNA de plasmídeo como um resultado da presença de uma origem de replicação funcional. Ao contrário, “replicação” se refere a ao término de um ciclo de vida viral completo, em que partículas virais infecciosas contendo RNA viral entram em uma célula, o RNA é transcrito reverso em DNA, o DNA integra no cromossomo hospedeiro como um provírus, a célula infectada produz proteínas vírion e as monta com RNA genômico viral de comprimento integral em partículas igualmente infecciosas, novas.

[087] O termo “competente em replicação” se refere a um vírus do tipo selvagem ou vírus mutante que é capaz de replicação, de modo que a replicação do vírus em uma célula infectada resulta na produção de vírions infecciosos que, após infectar uma outra célula, anteriormente não infectada, faz com que a última célula provavelmente produza tais vírions infecciosos. A presente invenção compreende o uso de vírus defeituosos em replicação.

[088] Como aqui usado, o termo “vírus atenuado” se refere a qualquer vírus (por exemplo, um lentivírus atenuado) que foi modificado de modo que sua patogenicidade no indivíduo pretendido é substancialmente reduzida. O vírus pode ser atenuado para o ponto que ele não é patogênico a partir de um ponto clínico, isto é, que indivíduos expostos ao vírus não exibem um nível aumentado estatisticamente significante de patologia com relação a indivíduos controle.

[089] A presente invenção compreende a preparação e uso de um retrovírus modificado. Em algumas modalidades, o retrovírus é um mutante de vírus da leucemia de murino, vírus da imunodeficiência humana tipo 1, vírus da imunodeficiência humana tipo 2, vírus da imunodeficiência felina, vírus da imunodeficiência símia, visna-maedi, vírus da encefalite caprina, vírus da anemia infecciosa equina e vírus da imunodeficiência bovina ou um vírus compreendido de porções de mais de uma espécie retroviral (por exemplo, um híbrido, compreendido de porções de MLV, FIV, HIV-1 e HIV-2 ou HIV-1 e/ou SIV).

[090] Um vírus de referência é um vírus cujo genoma é usado na descrição dos componentes de um vírus mutante. Por exemplo, um elemento genético particular do vírus mutante pode ser dito diferir do elemento cognato do vírus de referência por várias substituições, deleções ou inserções. Não é necessário que o vírus mutante seja realmente derivado do vírus de referência.

[091] A sequência de FIV de referência preferida é encontrada em Talbott e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1989 86:5743-7; No. Acesso Genbank NC_001482. Em certas modalidades, um método de transfecção transiente de três plasmídeos pode ser usado para produzir retrovírus pseutotipificados incompetentes em replicação (por exemplo, FIV). Métodos gerais são descritos em Wang e outros, J. Clin. Invest.

1999 104:R55-62 e Johnston e outros, J. Virol. 1999 73:4991-5000. Sistema de Vetor Retroviral

[092] A presente invenção compreende um sistema de amplificação e transferência de gene retroviral compreendendo um vetor de transgene, um ou mais vetores de empacotamento compatíveis, um vetor de envelope e uma célula hospedeira adequada. Os vetores usados podem ser derivados de um retrovírus (por exemplo, um lentivírus). Vetores de retrovírus permitem (1) transfecção dos vetores de empacotamento e vetores de envelope na célula hospedeira para formar uma linhagem de célula de empacotamento que produz essencialmente partículas virais livres-de-RNA-de-vetor-de- empacotamento, (2) transfecção do vetor de transgene na linhagem de célula de empacotamento, (3) o empacotamento do RNA de vetor de transgene pela linhagem de célula de empacotamento em partículas virais infecciosas e (4) a administração das partículas a células-alvo de modo que tais células são transduzidas e subsequentemente expressam um transgene.

[093] Ou as partículas são administradas diretamente ao indivíduo, in vivo, ou as células do indivíduo são removidas, infectadas in vitro com as partículas e retornadas para o corpo do indivíduo.

[094] Os vetores de empacotamento e vetores de transgene da presente invenção gerarão vírus incompetentes em replicação. Os vetores escolhidos para incorporação a um dado sistema de vetor da presente invenção são tais que não é possível, sem mutação adicional do(s) vetor(es) de empacotamento ou vetor de transgene, para as células cotransfectadas gerarem um vírus competente em replicação através de recombinação homóloga do(s) vetor(es) de empacotamento e vetor de transgene sozinhos. A proteína envelope usada no presente sistema pode ser um envelope retroviral, um envelope sintético ou quimérico ou o envelope de um vírus envelopado não retroviral (por exemplo, baculovírus). Sinal de Empacotamento

[095] Como aqui usado, o termo “sinal de empacotamento” ou “sequência de empacotamento” se refere a sequências localizadas dentro do genoma retroviral ou um vetor que são necessárias para, ou pelo menos facilitar, inserção do RNA viral ou de vetor no capsídeo ou partícula viral. Os sinais de empacotamento em um RNA identificam aquele RNA como um que deve ser empacotado em um vírion. O termo “sinal de empacotamento” é também usado por conveniência para se referir a uma sequência de DNA de vetor que é transcrita em um sinal de empacotamento funcional. Certos sinais de empacotamento podem ser parte de um gene, mas são reconhecidos na forma de RNA, ao invés de como uma porção de peptídeo da proteína codificada.

[096] A distinção-chave entre um vetor de empacotamento e um vetor de transgene é que no vetor de empacotamento, o sinal de empacotamento principal é inativado e, no vetor de transgene, o sinal de empacotamento principal é um funcional. Idealmente, no vetor de empacotamento, todos os sinais de empacotamento seriam inativados, e, no vetor de transgene, todos os sinais de empacotamento seriam funcionais. No entanto, considerações de compensação, tal como maximização do título viral, ou inibição de recombinação homóloga, podem tornar tais construtos menos desejáveis. Sistema de Empacotamento; Vetores de Empacotamento; Linhagem de Célula de Empacotamento

[097] Um sistema de empacotamento é um vetor, ou uma pluralidade de vetores, que provê em forma expressável toda a informação genética para produzir um vírion que pode encapsidar RNA adequado, transportá-lo a partir da célula de produção de vírion, adiministrá-lo a uma célula-alvo e, na célula-alvo, fazer com que o RNA seja transcrito de modo reverso e integrado ao genoma hospedeiro de tal maneira que um transgene incorporado ao RNA mencionado acima possa ser expresso. No entanto, o sistema de empacotamento deve ser substancialmente incapaz de empacotar a si mesmo. Ao contrário, ele empacota um vetor de transgene separado.

[098] Na presente invenção, o vetor de empacotamento proverá equivalentes funcionais dos genes gag e pol (um vetor “GP”). O(s) gene(s) env serão providos pelo vetor de envelope. Em teoria, um sistema de três vetores (vetores “G”, “P” e “E”) é possível se for desejado construir genes gag e pol distintos em vetores separados, e operavelmente liga-los a promotores reguláveis diferentes (ou um a um promotor regulável e o outro a um constitutivo) de modo que seus níveis de expressão relativos possam ser ajustados apropriadamente.

[099] Uma linhagem de célula de empacotamento é uma célula hospedeira adequada transfectada por um sistema de empacotamento que, sob condições que podem ser atingidas, produz partículas virais. Como aqui usado, o termo “linhagens de célula de empacotamento” é tipicamente usado em referência a linhagens de célula que expressam proteínas estruturais virais (por exemplo, gagl, pol e env), mas não contêm um sinal de empacotamento. Por exemplo, uma linhagem de célula foi geneticamente engenheirada para carregar um sítio cromossomal dentro de seu genoma, um fragmento de 5’-LTR-gag-pol- 3’-LTR que não tem uma sequência psi+ funcional (chamada Δpsi) e um fragmento de 5’-LTR-env-3’-LTR que é também Δpsi localizado em um outro sítio cromossomal. Embora ambos esses segmentos sejam transcritos constitutivamente, devido ao fato da região psi+ estar faltando e as moléculas de RNA viral produzidas serem menos do que o tamanho integral, partículas virais vazias são formadas.

[100] Se uma célula hospedeira for transfectada pelo(s) vetor(es) de empacotamento apenas, ela produz substancialmente apenas partículas virais sem o vetor de empacotamento de comprimento integral. Em um exemplo, menos do que 10% das partículas virais produzidas pela célula de empacotamento contêm RNA derivado de vetor de empacotamento de comprimento integral. No entanto, uma vez que o vetor de empacotamento não tem um sítio de ligação de primer funcional, mesmo se essas partículas infectarem uma célula nova, o RNA de vetor de empacotamento não será transcrito reverso de volta para DNA e, portanto, a célula nova não produzirá vírion. Portanto, em si mesmo, o vetor de empacotamento é um vírus incompetente em replicação.

[101] Em algumas modalidades, a célula de empacotamento e/ou linhagem de célula contém um vetor de transgene. A linhagem de célula de empacotamento empacotará o vetor de transgene em partículas infecciosas. Tal linhagem de célula é referida aqui como uma “linhagem de célula de produção de vírion transgênica”.

[102] É compreendido que empacotamento pode ser induzível, bem como não induzível. Em células de empacotamento e linhagens de célula de empacotamento induzível, partículas retrovirais são produzidas em resposta a pelo menos um indutor. Em linhagens de célula de empacotamento e células de empacotamento não induzível, nenhum indutor é necessário a fim de que produção de partícula retroviral ocorra.

[103] Os vetores de empacotamento diferem necessariamente dos genomas retrovirais competentes em replicação, do tipo selvagem, em virtude da inativação de pelo menos um sinal de empacotamento do genoma do tipo selvagem cognato. Mais de um sinal de empacotamento pode ser inativado. Em um exemplo, apenas os genes retrovirais providos pelo vetor de empacotamento são aqueles codificando proteínas estruturais, ou reguladoras essenciais. Vetores de Transgene

[104] Um vetor de transgene é um vetor de expressão que carrega um gene não retroviral expressável de interesse e inclui pelo menos um sinal de empacotamento retroviral funcional, de modo que, após o vetor de transgene ser transfectado em uma linhagem de célula de empacotamento, o vetor de transgene é transcrito em RNA, e esse RNA é empacotado em uma partícula viral infecciosa. Essas partículas, por sua vez, infectam células-alvo, seu RNA é transcrito reverso em DNA e o DNA é incorporado ao genoma da célula hospedeira como um elemento proviral, dessa maneira administrando o gene de interesse às células-alvo.

[105] Como aqui usado, o termo “transdução” se refere à administração de um gene(s) usando um vetor viral ou retroviral por meio de infecção ao invés de por transfecção. Em certas modalidades, vetores retrovirais são transduzidos. Portanto, um “gene transduzido” é um gene que foi introduzido em uma célula através de infecção retroviral ou de vetor e integração de provírus. Em certas modalidades, vetores virais (por exemplo, “vetores de transgene”) transduzem genes em “células-alvo” ou células hospedeiras. A presente invenção compreende vetores de transgene que são adequados para uso na presente invenção que são ligados a qualquer gene de interesse (ou um “gene marcador” ou “gene repórter”, usado para indicar infecção ou expressão de um gene).

[106] Como aqui usado, o termo “transdução a longo prazo” se refere a vetores que são capazes de permanecer transduzidos em células hospedeiras ou alvo por períodos de tempo que são mais longos do que aqueles observados com outros vetores. Por exemplo, a presente invenção provê vetores retrovirais que são capazes de permanecer transduzidos por pelo menos 120 dias, pelo menos um ano, ou durante a vida do indivíduo ou o curso de tempo necessário de tratamento. A duração de expressão é uma função da escolha de promotor e do tipo de célula-alvo, mais do que a escolha de vetor.

[107] O termo “transdução estável” ou “estavelmente transduzido” se refere à introdução e integração de DNA estranho ao genoma da célula transduzida. O termo “transdutor estável” se refere a uma célula que integrou estavelmente DNA estranho ao DNA genômico.

[108] O termo “transdução transiente” ou “transientemente transduzido” se refere à introdução de DNA estranho a uma célula onde o DNA estranho falha em integrar ao genoma da célula transduzida. O DNA estranho persiste no núcleo da célula transduzida por vários dias. Durante esse tempo o DNA estranho é submetido aos controles reguladores que governam a expressão de genes endógenos nos cromossomos. O termo “transdutor transiente” se refere a células que prenderam o DNA estranho, mas falharam em integrar esse DNA.

[109] Em algumas modalidades, as células-alvo e/ou hospedeiras da presente invenção são células “não divisoras”. Essas células incluem células tais como células neuronais que não se dividem normalmente. No entanto, não é pretendido que a presente invenção seja limitada a células não divisoras (incluindo, mas não limitado a, células musculares, glóbulos brancos, células do baço, células do fígado, células do olho, células epiteliais).

[110] Em algumas modalidades, o vetor e a progênie do vetor são capazes de transdução de uma pluralidade de células-alvo de modo a atingir títulos de vetor de pelo menos 105 cfu/ml. A multiplicidade de infecção (MOI) pode ser pelo menos um (isto é, um acerto em média por célula), ou até mesmo pelo menos dois. Cassetes e Vetores de Expressão

[111] A presente invenção também provê um cassete de expressão compreendendo uma sequência codificando ACE-tRNA.

[112] Em certas modalidades, o cassete de expressão contém ainda um promotor. Em certas modalidades, o promotor é um promotor regulável. Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em certas modalidades, o promotor é um promotor PGK, CMV, RSV, H1 ou U6 (promotores Pol II e Pol III).

[113] A presente invenção provê um vetor contendo o cassete de expressão descrito acima. Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em certas modalidades, o vetor viral é um vetor viral adenoviral, lentiviral, viral adenoassociado (AAV), poliovírus, HSV ou à base de Maloney de murino.

[114] “Cassete de expressão” como aqui usado significa uma sequência de ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeo particular em uma célula hospedeira apropriada, que pode incluir um promotor operavelmente ligado à sequência de nucleotídeo de interesse que pode ser operavelmente ligada a sinais de terminação. Ele pode também incluir sequências requeridas para tradução apropriada da sequência de nucleotídeo. A região de codificação geralmente codifica uma proteína de interesse. O cassete de expressão incluindo a sequência de nucleotídeo de interesse pode ser quimérico. O cassete de expressão pode ser também um que está ocorrendo naturalmente, mas foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. A expressão da sequência de nucleotídeo no cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor regulável que inicia transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a alguns estímulos particulares. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou estágio de desenvolvimento particular.

[115] “Operavelmente ligado” se refere à associação de sequências de ácido nucleico em fragmento de ácido nucleico único de modo que a função de uma das sequências é afetada por uma outra. Por exemplo, uma sequência de DNA reguladora é dita ser “operavelmente ligada a” ou “associada com” uma sequência de DNA que codifica um RNA ou um polipeptídeo se as duas sequências forem situadas de modo que a sequência de DNA reguladora afeta expressão da sequência de DNA de codificação (isto é, que a sequência de codificação ou RNA funcional está sob o controle transcripcional do promotor). Sequências de codificação podem ser operavelmente ligadas a sequências reguladoras em orientação de sentido ou antissentido. Vírus Adenoassociado (AAV)

[116] Vírus adenoassociado (AAV) é um vírus não patogênico pequeno da família parvoviridae. AAV é distinto dos outros membros dessa família pela sua independência do vírus auxiliar para replicação. Na ausência de um vírus auxiliar, AAV pode integrar de uma maneira específica de locus no braço q do cromossomo 19. O genoma de aproximadamente 5 kb de AAV consiste em um segmento de DNA de filamento único de polaridade ou mais ou menos. As extremidades do genoma são repetições terminais invertidas curtas que podem dobrar em estruturas grampo-de-cabelo e servem com a origem de replicação de DNA viral. Fisicamente, o vírion de parvovírus é não envelopado e seu capsídeo icosaédrico é de aproximadamente 20 nm de diâmetro.

[117] Até agora, vários AAVs sorologicamente distintos foram identificados, e mais de uma dúzia foi isolada de humanos ou primatas. O genoma de AAV2 é de 4680 nucleotídeos de comprimento e contém duas estruturas de leitura aberta (ORFs). A ORF esquerda codifica as proteínas Rep não estruturais, Rep 40, Rep 52, Rep 68 e Rep 78, que estão envolvidas em regulagem de replicação e transcrição em adição à produção de genomas da progênie de filamento único. Ainda, duas das proteínas Rep foram associadas à integração preferencial de genomas de AAV em uma região do braço q de cromossomo humano

19. Rep68/78 foi também mostrado possuir atividade de ligação a NTP bem como atividades de helicase de DNA e RNA. As proteínas Rep possuem um sinal de localização nuclear bem como vários sítios de fosforilação potenciais. Mutação de um desses sítios de cinase resultou em uma perda de atividade de replicação.

[118] As extremidades do genoma são repetições terminais invertidas (ITR) curtas que têm o potencial de dobrar em estruturas grampo-de-cabelo em formato em T que servem como a origem de replicação de DNA viral. Dentro da região de ITR dois elementos foram descritos, os quais são centrais para a função da ITR, um motivo de repetição GAGC e o sítio de resolução terminal (trs). O motivo de repetição foi mostrado se ligar à Rep quando a ITR está ou em uma conformação linear ou grampo-de-cabelo. Essa ligação serve para posicionar Rep68/78 para clivagem no trs, que ocorre de uma maneira específica de sítio e filamento. Em adição ao seu papel em replicação, esses dois elementos parecem ser centrais para integração viral. Contido dentro do locus de integração do cromossomo 19 está um sítio de ligação de Rep com um trs adjacente. Esses elementos foram mostrados ser funcionais e necessários para integração específica de locus.

[119] O vírion de AAV é uma partícula icosaédrica, não envelopada, de aproximadamente 25 nm de diâmetro, consistindo em três proteínas relacionadas referidas como VP1, VP2 e VP3. A ORF direita codifica as proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. Essas proteínas são encontradas em uma razão de 1:1:10, respectivamente, e são todas derivadas de ORF direita. As proteínas do capsídeo diferem uma da outra pelo uso de união alternativa e um códon de início incomum. Análise de deleção mostrou que remoção ou alteração de VP1 que é traduzida a partir de uma mensagem alternativamente unida resulta em um rendimento reduzido de partículas infecciosas. Mutações dentro da região de codificação de VP3 resultam na falha em produzir qualquer DNA de progênie de filamento simples ou partículas infecciosas. Uma partícula de AAV é uma partícula viral compreendendo uma proteína do capsídeo de AAV. Um polipeptídeo do capsídeo de AAV pode codificar o polipeptídeo VP1, VP2 e VP3 inteiro. A partícula pode ser uma partícula compreendendo AAV2 e outras proteínas do capsídeo de AAV (isto é, uma proteína quimérica, tais como AAV1 e AAV2). Variações na sequência de aminoácido da proteína do capsídeo AAV2 são compreendidas aqui, contanto que a partícula viral resultante que compreende o capsídeo AAV2 permaneça antigenicamente ou imunologicamente distinta de AAV1, como pode ser rotineiramente determinado através de métodos padrão. Especificamente, por exemplo, ELISA e Western blots podem ser usados para determinar se uma partícula viral é antigenicamente ou imunologicamente distinta de AAV1. Ainda, a partícula de AAV2 viral retém preferivelmente tropismo de tecido distinto de AAV1.

[120] Uma partícula de AAV2 é uma partícula viral compreendendo uma proteína do capsídeo de AAV2. Um polipeptídeo do capsídeo de AAV2 codificando o polipeptídeo VP1, VP2 e VP3 inteiro pode no total ter pelo menos cerca de 63% de homologia (ou identidade) com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido codificada pelos nucleotídeos mostrados em NC_001401 (sequência de nucleotídeo codificando proteína do capsídeo de AAV2). A proteína do capsídeo pode ter cerca de 70% de homologia, cerca de 75% de homologia, 80% de homologia, 85% de homologia, 90% de homologia, 95% de homologia, 98% de homologia, 99% de homologia ou até mesmo 100% de homologia com a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo mostrada em NC_001401. A proteína do capsídeo pode ter cerca de 70% de identidade, cerca de 75% de identidade, 80% de identidade, 85% de identidade, 90% de identidade, 95% de identidade, 98% de identidade, 99% de identidade ou até mesmo 100% de identidade com a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo mostrada em

NC_001401. A partícula pode ser uma partícula compreendendo uma outra proteína do capsídeo de AAV e AAV2, isto é, uma proteína quimérica. Variações na sequência de aminoácido da proteína do capsídeo de AAV2 são compreendidas aqui, contanto que a partícula viral resultante compreendendo o capsídeo de AAV2 permaneça antigenicamente ou imunologicamente distinta de AAV4, como pode ser rotineiramente determinado através de métodos padrão. Especificamente, por exemplo, ELISA e Western blots podem ser usados para determinar se uma partícula viral é antigenicamente ou imunologicamente distinta de AAV1. Ainda, a partícula viral de AAV2 retém preferivelmente distinção de tropismo de tecido de AAV1, tal como aquele exemplificado nos exemplos aqui, embora uma partícula quimérica de AAV2 compreendendo pelo menos uma proteína revestida de AAV2 possa ter um tropismo de tecido diferente daquele de uma partícula de AAV2 consistindo apenas em proteínas revestidas de AAV2.

[121] Em certas modalidades, a invenção provê ainda uma partícula de AAV2 contendo, isto é, encapsidando, um vetor compreendendo um par de repetições terminais invertidas de AAV2. A sequência de nucleotídeo de ITRs de AAV é conhecida na técnica. Ainda, a partícula pode ser uma partícula compreendendo ambas as proteínas do capsídeo de AAV1 e AAV2, isto é, uma proteína quimérica. Além disso, a partícula pode ser uma partícula encapsidando um vetor compreendendo um par de repetições terminais invertidas de AAV de outros AAVs (por exemplo, AAV1-AAV9 e AAVrh10). O vetor encapsidado na partícula pode compreender ainda um ácido nucleico exógeno inserido entre as repetições terminais invertidas.

[122] As características de AAV que seguem fizeram dele um vetor atraente para transferência de gene. Vetores de AAV foram mostrados in vitro integrar estavelmente no genoma celular; possuir uma faixa de hospedeiro ampla; transduzir ambas células divisoras e não divisoras in vitro e in vivo e manter níveis de expressão altos dos genes transduzidos. Partículas virais são estáveis ao calor, resistentes a solventes, detergentes, mudanças em pH, temperatura e podem ser concentradas em gradientes CsCl ou através de outros meios. A presente invenção provê métodos de administração de partículas de AAV, vetores de AAV recombinantes e vírions de AAV recombinantes. Por exemplo, uma partícula de AAV2 é uma partícula viral compreendendo uma proteína do capsídeo de AAV2 ou uma partícula de AAV1 é uma partícula viral compreendendo uma proteína do capsídeo de AAV1. Um vetor de AAV recombinante é um construto de ácido nucleico que compreende pelo menos um ácido nucleico único de AAV2. Um vírion de AAV2 recombinante é uma partícula contendo um vetor de AAV2 recombinante. Para ser considerado dentro do termo “ITRs de AAV” a sequência de nucleotídeo deve reter uma ou ambas as características descritas aqui que distinguem a ITR de AAV da ITR de AAV1: (1) três (ao invés de quatro como em AAV”) repetições “GAGC” e (2) no sítio de ligação de Rep de ITR de AAV2 o quarto nucleotídeo nas duas primeiras repetições “GAGC” é um C ao invés de um T.

[123] O promotor para dirigir a expressão da sequência codificando o tRNA a ser liberado pode ser qualquer promotor desejado, selecionado através de considerações conhecidas, tal como o nível de expressão de um ácido nucleico funcionalmente ligado ao promotor e o tipo de célula em que o vetor deve ser usado. Promotores podem ser um promotor exógeno ou um endógeno. Promotores podem incluir, por exemplo, promotores fortes conhecidos tal como SV40 ou o promotor de metalotioneína induzível ou um promotor de AAV, tal como um promotor p5 de AAV. Exemplos adicionais de promotores incluem promotores derivados dos genes da actina, genes da imunoglobulina, citomegalovírus (CMV), adenovírus, papiloma vírus bovino, promotores adenovirais, tal como o promotor tardio principal adenoviral, um promotor de choque térmico induzível, vírus respiratório sincicial, vírus do Sarcoma de Rous (RSV), etc. Exemplos adicionais incluem promotores regulados.

[124] O vetor de AAV compreende ainda um ácido nucleico exógeno (heterólogo) funcionalmente ligado ao promotor. Por “ácido nucleico heterólogo” quer dizer que qualquer ácido nucleico heterólogo ou exógeno pode ser inserido no vetor para transferência para uma célula, tecido ou organismo. O ácido nucleico pode codificar um tRNA, por exemplo. Por “funcionalmente ligado” quer dizer que tal promotor pode promover expressão do ácido nucleico heterólogo, como é conhecido na técnica, tal como orientação apropriada do promotor em relação ao ácido nucleico heterólogo. Ainda, o ácido nucleico heterólogo tem preferivelmente todas as sequências apropriadas para expressão do ácido nucleico, como conhecido na técnica, para funcionalmente codificar, isto é, permitir que o ácido nucleico seja expresso. O ácido nucleico pode incluir, por exemplo, sequências de controle de expressão, tal como um aumentador. O ácido nucleico pode codificar mais de um produto de gene, limitado apenas pelo tamanho de ácido nucleico que pode ser empacotado.

[125] Uma partícula de AAV1 é uma partícula viral compreendendo uma proteína do capsídeo de AAV1. Variações na sequência de aminoácido da proteína do capsídeo de AAV1 são compreendidas aqui, contanto que a partícula viral resultante compreendendo o capsídeo de AAV1 permaneça antigenicamente ou imunologicamente distinta de outros capsídeos de AAV, como pode ser rotineiramente determinado através de métodos padrão. Especificamente, por exemplo, ELISA e Western blots podem ser usados para determinar se uma partícula viral é antigenicamente ou imunologicamente distinta de outros sorotipos de AAV.

[126] O termo “polipeptídeo” como aqui usado se refere a um polímero de aminoácidos e inclui proteínas de comprimento integral e fragmentos das mesmas. Portanto, “proteína” e “polipeptídeo” são frequentemente usados intercomutavelmente aqui.

[127] O presente método provê um método de administração de um ácido nucleico para uma célula compreendendo administrar à célula uma partícula de AAV contendo um vetor compreendendo o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas de AAV, dessa maneira administrando o ácido nucleico à célula. Administração para célula pode ser obtida através de quaisquer meios, incluindo simplesmente contato da partícula, opcionalmente contida em um líquido desejado tal como meio de cultura de tecido, ou uma solução salina tamponada, com as células. A partícula pode ser deixada permanecer em contato com as células por qualquer duração de tempo desejada e, tipicamente, a partícula é administrada e deixada permanecer indefinidamente. Para tais métodos in vitro, o vírus pode ser administrado à célula através de métodos de transdução viral padrão, como conhecido na técnica e como exemplificado aqui. Títulos de vírus para administrar podem variar, particularmente dependendo do tipo de célula, mas serão típicos daqueles usados para transdução de AAV em geral. Ainda, os títulos usados para transduzir as células particulares nos presentes exemplos podem ser utilizados. As células podem incluir qualquer célula desejada em humanos, bem como outros mamíferos grandes (não roedores), tais como primatas, cavalo, ovelha, cabra, porco e cachorro.

[128] A presente invenção provê ainda um método de administração de um ácido nucleico para uma célula em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma partícula de AAV compreendendo o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas de AAV, dessa maneira administrando o ácido nucleico a uma célula no indivíduo.

[129] Certas modalidades da presente invenção proveem uma célula compreendendo um vetor viral como descrito aqui. Vetores de AAV

[130] Em uma modalidade, um vetor viral da descrição é um vetor de AAV. Um vetor de “AAV” se refere a um vírus adenoassociado, e pode ser usado para se referir ao vírus do tipo selvagem de ocorrência natural em si ou derivados do mesmo. O termo compreende todos os subtipos, sorotipos e pseudotipos, e ambas as formas de ocorrência natural e recombinantes, exceto onde de outro modo exigido. Como aqui usado, o termo “sorotipo” se refere a um AAV, que é identificado através de, e distinguido de outros AAVs com base em, reatividade de proteína do capsídeo com antissoros definidos, por exemplo, há oito sorotipos conhecidos de AAVs de primata, AAV-1 a AAV-9 e AAVrh10. Por exemplo, o sorotipo AAV2 é usado para se referir a um AAV, que contém proteínas do capsídeo codificadas do gene cap de AAV2 e um genoma contendo sequências de 5’ e 3’ ITR do mesmo sorotipo AAV2. Como aqui usado, por exemplo, rAAV1 pode ser usado para se referir a um AAV tendo ambas as proteínas do capsídeo e 5’-3’ ITRs do mesmo sorotipo ou pode se referir a um AAV tendo proteínas do capsídeo de um sorotipo e 5’-3’ ITRs de um sorotipo de AAV diferente, por exemplo, capsídeo do sorotipo 2 de AAV e ITRs de sorotipo 5 de AAV. Para cada exemplo ilustrado aqui, a descrição do projeto e produção de vetor descreve o sorotipo do capsídeo e sequências de 5’-3’ ITR. A abreviação “rAAV” se refere a vírus adenoassociado recombinante, também referido como vetor de AAV recombinante (ou “vetor de rAAV”).

[131] Um “vírus de AAV” ou “partícula viral de AAV” se refere a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV (preferivelmente por todas das proteínas do capsídeo de um AAV do tipo selvagem) e um polinucleotídeo encapsidado. Se a partícula compreender polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo exceto um genoma de AAV do tipo selvagem tal como um transgene a ser administrado a uma célula de mamífero), ela é tipicamente referida como “rAAV”.

[132] Em uma modalidade, os vetores de expressão de AAV são construídos usando técnicas conhecidas para pelo menos prover como componentes operativamente ligados na direção de transcrição, elementos de controle incluindo uma região de início de transcrição, o DNA de interesse e uma região de terminação transcripcional. Os elementos de controle são selecionados para serem funcionais em uma célula de mamífero. O construto resultante que contém os componentes operativamente ligados é flanqueado (5’ e 3’) com sequências de ITR de AAV funcionais.

[133] Por “repetições terminais invertidas de vírus adenoassociado” ou “ITRs de AAV” quer dizer as regiões reconhecidas na técnica encontradas em cada extremidade do genoma de AAV que funcionam juntas em cis como origens de replicação de DNA e como sinais de empacotamento para o vírus. ITRs de AAV, junto com a região de codificação de rep de AAV, proveem a excisão e resgate eficientes a partir de, e integração de uma sequência de nucleotídeo interposta entre duas ITRs de flanqueamento em, um genoma de célula de mamífero.

[134] As sequências de nucleotídeo de regiões de ITR de AAV são conhecidas. Como aqui usado, uma “ITR de AAV” não precisa ter a sequência de nucleotídeo do tipo selvagem mostrada, mas pode ser alterada, por exemplo, pela inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos. Ainda, a ITR de AAV pode ser derivada de qualquer um de vários sorotipos de AAV, incluindo, sem limitação, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Ainda, ITRs 5’ e 3’ que flanqueiam uma sequência de nucleotídeo selecionada em um vetor de AAV não precisam ser necessariamente idênticas ou derivadas do mesmo sorotipo ou isolato de AAV, contanto que elas funcionem como pretendido, isto é, permitir excisão e resgate da sequência de interesse a partir de um genoma ou vetor de célula hospedeira, e permitir integração da sequência heteróloga no genoma da célula recipiente quando produtos de gene Rep de AAV estão presentes na célula.

[135] Em uma modalidade, ITRs de AAV podem ser derivadas de qualquer um de vários sorotipos de AAV, incluindo, sem limitação, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Ainda, ITRs 5’ e 3’ que flanqueiam uma sequência de nucleotídeo selecionada em um vetor de expressão de AAV não precisam ser necessariamente idênticas ou derivadas do mesmo sorotipo ou isolato de AAV, contanto que elas funcionem como pretendido, isto é, permitir excisão e resgate da sequência de interesse a partir de um genoma ou vetor de célula hospedeira, e permitir integração da molécula de DNA ao genoma de célula recipiente quando os produtos de gene de Rep de AAV estão presentes na célula.

[136] Em uma modalidade, capsídeos de AAV podem ser derivados de AAV2. Moléculas de DNA adequadas para uso em vetores de AAV serão de menos do que cerca de 5 quilobases (kb), menos do que cerca de 4,5 kb, menos do que cerca de 4 kb, menos do que cerca de 3,5 kb, menos do que cerca de 3 kb, menos do que cerca de 2,5 kb de tamanho e são conhecidas na técnica.

[137] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo selecionada é operavelmente ligada a elementos de controle que direcionam a sua transcrição ou expressão no indivíduo in vivo. Tais elementos de controle podem compreender sequências de controle normalmente associadas com o gene selecionado. Alternativamente, sequências de controle heterólogas podem ser empregadas. Sequências de controle heterólogas úteis geralmente incluem aquelas derivadas de sequências codificando genes de mamífero ou virais.

Exemplos incluem, mas não estão limitados a, o promotor precoce de SV40, promotor de LTR de vírus de tumor mamário de camundongo; promotor tardio principal de adenovírus (Ad MLP); um promotor do vírus herpes simplex (HSV), um promotor de citomegalovírus (CMV) tal como a região promotora precoce imediata de CMV (CMVIE), um promotor do vírus de sarcoma de Rous (RSV), promotores pol II, promotores pol III, promotores sintéticos, promotores híbridos e similar. Ainda, sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene de metalotioneína de mamífero, também encontrarão uso aqui. Tais sequências promotoras estão comercialmente disponíveis de, por exemplo, Stratagene (San Diego, Calif.).

[138] Em uma modalidade, ambos os promotores heterólogos e outros elementos de controle, tais como promotores específicos de tecido e induzíveis, aumentadores e similar, serão de uso particular. Exemplos de promotores heterólogos incluem o promotor de CMV. Exemplos de promotores induzíveis incluem elementos responsivos do DNA para ecdisona, tetraciclina, hipoxina e aufina.

[139] Em uma modalidade, o vetor de expressão de AAV que carrega a molécula de DNA de interesse ligada pelas ITRs de AAV pode ser construído inserindo diretamente a(s) sequência(s) selecionada(s) em um genoma de AAV, que tem as estruturas de leitura aberta de AAV principais (“ORFs”) excisadas do mesmo. Outras porções do genoma de AAV podem ser também deletadas, contanto que porções suficientes das ITRs permaneçam para permitir funções de replicação e empacotamento. Tais construtos podem ser projetados usando técnicas bem conhecidas no campo.

[140] Alternativamente, ITRs de AAV podem ser excisadas do genoma viral ou de um vetor de AAV contendo as mesmas e fundidas 5’ e 3’ de um construto de ácido nucleico selecionado que está presente em um outro vetor usando técnicas de ligação padrão. Por exemplo,

ligações podem ser realizadas em Tris-Cl 10 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, 33 µg/ml de BSA, 10 mM-50 mM de NaCl e ou 40 µM de ATP, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de ligase de DNA T4 a 0o C (para ligação “de extremidade pegajosa”). Ligações de “extremidade pegajosa” intermoleculares são geralmente realizadas a 30-100 µg/ml de concentrações de DNA totais (concentração final total de 5-100 nM). Vetores de AAV que contêm ITRs.

[141] Ainda, genes quiméricos podem ser produzidos sinteticamente para incluir sequências de ITR de AAV dispostas 5’ e 3’ de uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas. A sequência quimérica completa é montada a partir de oligonucleotídeos sobrepostos preparados através de métodos padrão.

[142] A fim de produzir vírions de rAAV, um vetor de expressão de rAAV é introduzido em uma célula hospedeira adequada usando técnicas conhecidas, tal como através de transfecção. Várias técnicas de transfecção são geralmente conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nova York. Métodos de transfecção particularmente adequados incluem coprecipitação com fosfato de cálcio, microinjeção direta em células culturadas, eletroporação, transferência de gene medida por lipossoma, transdução mediada por lipídeo e administração de ácido nucleico usando microprojéteis de alta velocidade.

[143] Em uma modalidade, células hospedeiras adequadas para produção de vírions de rAAV incluem micro-organismos, células de levedura, células de inseto e células de mamífero, que podem ser, ou ter sido, usadas como recipientes de uma molécula de DNA heteróloga. O termo inclui a progênie da célula original que foi transfectada. Portanto, uma “célula hospedeira” como aqui usado geralmente se refere a uma célula que foi transfectada com uma sequência de DNA exógena. Células da linhagem de célula humana estável, 293 (prontamente disponível através da, por exemplo, American Type Culture Collection sob Número de acesso ATCC CRL1573), podem ser usadas na prática da presente invenção. Particularmente, a linhagem de célula humana 293 é uma linhagem de célula de rim embriônica humana que foi transformada com fragmentos de DNA do tipo 5 de adenovírus e expressa os genes E1a e E1b adenovirais. A linhagem de célula 293 é prontamente transfectada, e provê uma plataforma particularmente conveniente na qual produzir vírions de rAAV.

[144] Por “região de codificação de AAV” quer dizer a região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas de replicação Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40. Esses produtos de expressão de Rep foram mostrados possuir muitas funções, incluindo reconhecimento, ligação e entalhe da origem de replicação de DNA de AVV, atividade de helicase de DNA e modulação de transcrição a partir de promotores de AAV (ou outros heterólogos). Os produtos de expressão de Rep são coletivamente requeridos para replicação do genoma de AAV. Homólogos adequados da região de codificação de rep de AAV incluem o gene rep de herpes vírus humano 6 (HHV-6) que é também conhecido mediar replicação de DNA de AAV-2.

[145] Por “região de codificação de cap de AAV” quer dizer a região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3 ou seus homólogos funcionais. Esses produtos de expressão de Cap fornecem as funções de empacotamento, que são coletivamente requeridas para empacotamento do genoma viral.

[146] Em uma modalidade, funções auxiliares de AAV são introduzidas na célula hospedeira através de transfecção da célula hospedeira com um construto auxiliar de AAV ou antes da, ou concomitantemente com, a transfecção do vetor de expressão de AAV.

Construtos auxiliares de AAV são então usados para prover pelo menos expressão transiente de genes rep e/ou cap de AAV para complementar funções de AAV faltantes que são necessárias para infecção por AAV produtiva. Construtos auxiliares de AAV não têm ITRs de AAV e não podem nem replicar nem empacotar a si mesmos. Esses construtos podem estar na forma de um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou vírion. Vários construtos auxiliares de AAV foram descritos, tais como os plasmídeos comumente usados pAAV/Ad e pIM29+45 que codificam ambos os produtos de expressão de Rep e Cap. Vários outros vetores foram descritos, os quais codificam produtos de expressão de Rep e/ou Cap.

[147] Métodos de administração de vetores virais incluem injeção do AAV no indivíduo. Em geral, vírions de rAAV podem ser introduzidos em células usando ou técnicas de transdução in vivo ou in vitro. Se transduzida in vitro, a célula recipiente desejada será removida do indivíduo, transduzida com vírions de rAAV e reintroduzidas no indivíduo. Alternativamente, células singeneicas ou xenogeneicas podem ser usadas onde essas células não gerarão uma resposta imune inapropriada no indivíduo.

[148] Métodos adequados para a administração e introdução de células transduzidas em um indivíduo foram descritos. Por exemplo, células podem ser transduzidas in vitro combinando vírions de AAV recombinantes com células, por exemplo, meio apropriado, e avaliação daquelas células que carregam o DNA de interesse pode ser avaliada usando técnicas convencionais tais como Southern blots e/ou PCR, ou usando marcadores selecionáveis. Células transduzidas podem então ser formuladas em composições farmacêuticas, descritas mais integralmente abaixo, e a composição introduzida no indivíduo através de várias técnicas, tal como através de enxerto, injeção intramuscular, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.

[149] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas compreenderão material genético suficiente para produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido nucleico de interesse, isto é, uma quantidade suficiente para reduzir ou melhorar sintomas do estado de doença em questão ou uma quantidade suficiente para conferir o benefício desejado. As composições farmacêuticas também conterão um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não induza por si só a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição, e que possa ser administrado sem toxidez indevida. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sorbitol, Tween 80 e líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos nelas, por exemplo, sais de ácido mineral tais como cloridratos, bromidrato, fosfatos, sulfatos e similar; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similar. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias de tamponamento do pH, e similar, podem estar presentes em tais veículos. Uma discussão completa de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

[150] Deve ser compreendido que mais de um transgene poderia ser expresso pelo vetor viral administrado. Alternativamente, vetores separados, cada um expressando um ou mais transgenes diferentes, podem ser também administrados ao indivíduo, como descrito aqui. Ainda, é também pretendido que os vetores virais administrados através dos métodos da presente invenção sejam combinados com outras composições e terapias adequadas.

[151] Como é aparente àqueles versados na técnica em vista dos ensinamentos do presente pedido, uma quantidade eficaz de vetor viral que deve ser adicionada pode ser empiricamente determinada. Administração pode ser realizada em uma dose, continuamente ou intermitentemente durante o curso de tratamento. Métodos de determinação dos meios e dosagens mais eficazes de administração são bem conhecidos daqueles de habilidade na técnica e variarão com o vetor viral, a composição da terapia, as células-alvo e o indivíduo sendo tratado. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e padrão sendo selecionados pelo médico que realiza o tratamento.

[152] Em certas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 0,3-2 ml de 1x105 – 1x1016 vg/ml. Em certas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1-3 ml de 1x107 – 1x1014 vg/ml. Em certas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1-2 ml de 1x108 – 1x1013 vg/ml.

[153] Formulações contendo as partículas de rAAV conterão uma quantidade eficaz das partículas de rAAV em um veículo, a quantidade efetiva sendo prontamente determinada por um versado na técnica. As partículas de rAAV podem variar tipicamente de a partir de cerca de 1% a cerca de 95% (p/p) da composição, ou ainda mais ou menos se apropriado. A quantidade a ser administrada depende de fatores tais como a idade, peso e condição física do animal ou do indivíduo humano considerado para tratamento. Dosagens eficazes podem ser estabelecidas por um versado comum na técnica através de testes de rotina estabelecendo curvas de dose resposta. O indivíduo é tratado através da administração das partículas de rAAV em uma ou mais doses. Múltiplas doses podem ser administradas conforme necessário para manter a atividade de enzima adequada.

[154] Veículos incluindo água, solução salina aquosa, CSF artificial ou outras substâncias conhecidas podem ser empregados com a presente invenção. Para preparar uma formulação, a composição purificada pode ser isolada, liofilizada e estabilizada. A composição pode então ser ajustada para uma concentração apropriada, opcionalmente combinada com um agente anti-inflamatório e empacotada para uso.

[155] A presente invenção provê um método de aumento do nível de uma proteína-alvo em uma célula através da introdução de uma proteína, ou molécula de ácido nucleico codificando uma proteína descrita acima, em uma célula em uma quantidade suficiente para aumentar o nível da proteína-alvo na célula. Em certas modalidades, o acúmulo de proteína-alvo é aumentado em pelo menos 10%. O acúmulo de proteína-alvo é aumentado em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99%. Ácidos Nucleicos Codificando Agentes Terapêuticos

[156] O termo “ácido nucleico” se refere a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em forma de filamento único ou duplo, compostos de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, fosfato e uma base que é ou purina ou pirimidina. A menos que especificamente limitado, o termo compreende ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar a nucleotídeos de ocorrência natural.

[157] Um “fragmento de ácido nucleico” é uma porção de uma dada molécula de ácido nucleico. O termo “identidade substancial” de sequências de polinucleotídeo significa que um polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% ou 79% ou pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ou 89% ou pelo menos 90%, 91%, 92%, 93% ou 94% ou até mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, comparado com uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento descritos usando parâmetros padrão. Métodos para Introdução de Material Genético em Células

[158] O material genético exógeno (por exemplo, um DNA codificando um ou mais ACE-tRNAs terapêuticos) é introduzido na célula in vivo através de métodos de transferência genética, tal como transfecção ou transdução, para prover uma célula geneticamente modificada. Vários vetores de expressão (isto é, veículos para facilitação de administração de material genético exógeno em uma célula-alvo) são conhecidos de um versado de habilidade comum na técnica.

[159] Como aqui usado, “transfecção de células” se refere à aquisição por uma célula de um novo material genético através de incorporação de DNA adicionado. Desta maneira, transfecção se refere à inserção de ácido nucleico em uma célula usando métodos físicos ou químicos. Várias técnicas de transfecção são conhecidas daqueles de habilidade na técnica incluindo: coprecipitação de DNA com fosfato de cálcio; DEAE-dextrano; eletroporação; transfecção mediada por lipossoma catiônico; e bombardeamento de micropartícula facilitada por partícula de tungstênio. Coprecipitação de DNA com fosfato de estrôncio é um outro método de transfecção possível.

[160] Em contraste, “transdução de células” se refere ao processo de transferência de ácido nucleico em uma célula usando um vírus de DNA ou RNA. Um vírus de RNA (isto é, retrovírus) para transferência de um ácido nucleico para uma célula é referido aqui como um retrovírus quimérico de transdução. Material genético exógeno contido dentro do retrovírus é incorporado ao genoma da célula transduzida. Uma célula que foi transduzida com um vírus de DNA quimérico (por exemplo, um adenovírus carregando um cDNA codificando um agente terapêutico) não terá o material genético exógeno incorporado ao seu genoma, mas será capaz de expressar o material genético exógeno que está retido extracromossomalmente dentro da célula.

[161] Tipicamente, o material genético exógeno inclui o gene heterólogo (geralmente na forma de um cDNA compreendendo os exons codificando a proteína terapêutica) junto com um promotor para controlar transcrição do gene novo. O promotor tem caracteristicamente uma sequência de nucleotídeo específica necessária para iniciar transcrição. Opcionalmente, o material genético exógeno inclui ainda sequências adicionais (isto é, aumentadores) requeridos para obter a atividade de transcrição de gene desejada. Para o propósito dessa discussão, um “aumentador” é simplesmente qualquer sequência de DNA não traduzida que funciona contígua com a sequência de codificação (em cis) para mudar o nível de transcrição basal ditado pelo promotor. O material genético exógeno pode ser introduzido no genoma da célula imediatamente a jusante do promotor de modo que o promotor e sequência de codificação são operavelmente ligados de modo a permitir transcrição da sequência de codificação. Um vetor de expressão retroviral pode incluir um elemento promotor exógeno para controlar transcrição do gene exógeno inserido. Tais promotores exógenos incluem ambos os promotores constitutivos e induzíveis.

[162] Promotores constitutivos de ocorrência natural controlam a expressão de funções celulares essenciais. Como resultado, um gene sob o controle de um promotor constitutivo é expresso sob todas as condições de crescimento celular. Promotores constitutivos exemplares incluem os promotores para os genes que seguem que codificam certas funções constitutivas ou “de manutenção”: hipoxantina fosforribosil transferase (HPRT), di-hidrofolato redutase (DHFR), adenosina desaminase, fosfoglicerol cinase (PGK), piruvato cinase, fosfoglicerol mutase, o promotor da actina e outros promotores constitutivos conhecidos daqueles de habilidade na técnica. Ainda, muitos promotores virais funcionam constitutivamente em células eucarióticas. Esse incluem os promotores precoce e tardio de SV40; as repetições terminais longas (LTRs) de Vírus da Leucemia de Moloney e outros retrovírus; e o promotor da timidina cinase do Vírus Herpes Simplex, dentre muitos outros. Portanto, qualquer um dos promotores constitutivos acima referidos pode ser usado para controlar transcrição de um inserto de gene heterólogo.

[163] Os genes que estão sob o controle de promotores induzíveis são expressos apenas ou a um grau maior na presença de um agente de indução (por exemplo, transcrição sob controle do promotor da metalotioneína é aumentada bastante na presença de certos íons de metal). Promotores induzíveis incluem elementos responsivos (REs) que estimulam transcrição quando seus fatores de indução são ligados. Por exemplo, há Res para fatores de soro, hormônios esteroides, ácido retinoico e AMP cíclica. Promotores contendo um RE particular podem ser escolhidos a fim de obter uma resposta induzível e, em alguns casos, o próprio RE pode ser ligado a um promotor diferente, desta maneira conferindo capacidade de indução ao gene recombinante. Portanto, ao selecionar o promotor apropriado (constitutivo versus induzível; forte versus fraco), é possível controlar ambos a existência e nível de expressão de um agente terapêutico na célula geneticamente modificada. Se o gene codificando o agente terapêutico estiver sob o controle de um promotor induzível, administração do agente terapêutico in situ é disparada através da exposição da célula geneticamente modificada in situ a condições para permitir transcrição do agente terapêutico, por exemplo, através de injeção intraperitoneal de indutores específicos dos promotores induzíveis que controlam transcrição do agente. Por exemplo, expressão in situ por células geneticamente modificadas de um agente terapêutico codificado por um gene sob o controle do promotor da metalotioneína é aumentada através de contato das células geneticamente modificadas com uma solução contendo os íons de metal apropriados (isto é, indução) in situ.

[164] Sendo assim, a quantidade de agente terapêutico que é administrada in situ é regulada através de controle de fatores tais como: (1) a natureza do promotor usado para direcionar transcrição do gene inserido (isto é, se o promotor é constitutivo ou induzível, forte ou fraco); (2) o número de cópias do gene exógeno que são inseridas na célula; (3) o número de células transduzidas/transfectadas que são administradas (por exemplo, implantadas) no paciente; (4) o tamanho do implante (por exemplo, enxerto ou sistema de expressão encapsulado); (5) o número de implantes; (6) a duração de tempo que as células transduzidas/transfectadas ou implantes são deixados no lugar; e (7) a taxa de produção do agente terapêutico pela célula geneticamente modificada. Seleção e otimização desses fatores para administração de uma dose terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico particular são consideradas estar dentro do escopo de um versado de habilidade comum na técnica sem experimentação indevida, levando em consideração os fatores revelados acima e o perfil clínico do paciente.

[165] Em adição a pelo menos um promotor e pelo menos um ácido nucleico heterólogo codificando o agente terapêutico, o vetor de expressão pode incluir um gene de seleção, por exemplo, um gene de resistência à neomicina, para facilitação da seleção das células que foram transfectadas ou transduzidas com o vetor de expressão. Alternativamente, as células são transfectadas com dois ou mais vetores de expressão, pelo menos um vetor contendo o(s) gene(s) codificando o(s) agente(s) terapêutico(s), o outro vetor contendo um gene de seleção. A seleção de um promotor, aumentador, gene de seleção e/ou sequência de sinal adequado (descrito abaixo) é considerada estar dentro do escopo de um versado comum na técnica sem experimentação indevida. Condições de Doença e Métodos de Tratamento

[166] A presente invenção em uma modalidade inclui composições e métodos para tratamento de fibrose cística através da reversão dos efeitos de mutações presentes que estão associados com mutações sem sentido através da introdução dos tRNAs supressores de oligonucleotídeo sintéticos da invenção.

[167] Certas modalidades da presente invenção proveem um método de tratamento de uma doença em um mamífero compreendendo administrar uma proteína ou vetor codificando um agente terapêutico (por exemplo, um ACE-tRNA modificado e/ou estabilizado) como descrito aqui ao mamífero. Em certas modalidades, o mamífero é humano.

[168] Certas modalidades da presente invenção proveem um uso de um agente terapêutico ou vetor codificando um agente terapêutico como descrito aqui para preparar um medicamento útil para tratamento de doença em um animal. Em certas modalidades, a doença é fibrose cística.

[169] A presente invenção também provê uma célula de mamífero contendo um vetor descrito aqui. A célula pode ser humana.

[170] Certos aspectos da invenção se referem a polinucleotídeos, polipeptídeos, vetores e células geneticamente engenheiradas (modificadas in vivo) e ao uso dos mesmos. Em particular, a invenção refere-se a um método para terapia gênica que é capaz de ambos administração sistêmica de uma dose terapeuticamente eficaz do agente terapêutico.

[171] De acordo com um aspecto, um sistema de expressão de célula para expressão de um agente terapêutico em um recipiente mamífero é provido. O sistema de expressão (também referido aqui como uma “célula geneticamente modificada”) compreende uma célula e um vetor de expressão para expressão do agente terapêutico. Vetores de expressão incluem, mas não estão limitados a, vírus, plasmídeos e outros veículos para administração de material genético heterólogo a células. Portanto, o termo “vetor de expressão” como aqui usado se refere a um veículo para administração de material genético heterólogo a uma célula. Em particular, o vetor de expressão é um vetor adenoviral, de vírus adenoassociado ou lentivírus ou retrovírus recombinante.

[172] O vetor de expressão inclui ainda um promotor para controle da transcrição do gene heterólogo. O promotor pode ser um promotor induzível (descrito aqui). O sistema de expressão é adequado para administração ao recipiente mamífero. O sistema de expressão pode compreender uma pluralidade de células geneticamente modificadas não imortalizadas, cada célula contendo pelo menos um gene recombinante codificando pelo menos um agente terapêutico.

[173] O sistema de expressão de célula é formado in vivo. De acordo com um outro aspecto, um método para tratamento de um recipiente mamífero in vivo é provido. O método inclui introdução de um vetor de expressão para expressão de um produto de gene heterólogo em uma célula do paciente in situ, tal como através de administração intravenosa. Para formar o sistema de expressão in vivo, um vetor de expressão para expressão do agente terapêutico é introduzido in vivo no recipiente de mamífero i.v.

[174] De acordo com ainda um outro aspecto, um método para tratamento de um recipiente mamífero in vivo é provido. O método inclui introdução do agente terapêutico-alvo no paciente in vivo.

[175] O vetor de expressão para expressão do gene heterólogo pode incluir um promotor induzível para controle de transcrição do produto de gene heterólogo. Portanto, administração do agente terapêutico in situ é controlada pela exposição da célula in situ a condições que induzem transcrição do gene heterólogo.

[176] A presente invenção provê métodos de tratamento de uma doença em um mamífero através da administração de um vetor de expressão a uma célula ou paciente. Para os métodos de terapia gênica, uma pessoa de habilidade comum na técnica de biologia molecular e terapia de gene seria capaz de determinar, sem experimentação indevida, as dosagens e vias de administração apropriadas do vetor de expressão usado nos novos métodos da presente invenção.

[177] De acordo com uma modalidade, as células são transformadas ou de outro modo geneticamente modificadas in vivo. As células do recipiente mamífero são transformadas (isto é, transduzidas ou transfectadas) in vivo com um vetor contendo material genético exógeno para expressão de um gene heterólogo (por exemplo, recombinante) codificando um agente terapêutico e o agente terapêutico é administrado in situ.

[178] Como usado aqui, “material genético exógeno” se refere a um ácido nucleico ou um oligonucleotídeo, ou natural ou sintético, que não é encontrado naturalmente nas células; ou se é naturalmente encontrado nas células, não é transcrito ou expresso em níveis biologicamente significantes pelas células. Desta maneira, “material genético exógeno” inclui, por exemplo, um ácido nucleico de ocorrência não natural que pode ser transcrito em um tRNA.

[179] Os agentes terapêuticos revelados acima e condições condescendentes à terapia gênica são apenas ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da presente invenção. A seleção de um agente terapêutico adequado para tratamento de uma condição conhecida é considerada estar dentro do escopo de um versado comum na técnica sem experimentação indevida.

[180] Em certas modalidades, a terapia tem uso potencial para o tratamento/gerenciamento de doenças que são causadas por Códons de Término Prematuro (PTCs) incluindo, mas não limitado a, fibrose cística, distrofia muscular, β-talassemia e síndrome de Liddle. Essa terapia é vantajosa pelo fato de que ela provê especificidade de supressão de códon de parada aperfeiçoada. Os ACE-tRNAs terapêuticos da presente invenção se direcionam a um códon de parada específico, TGA, por exemplo, dessa maneira reduzindo efeitos fora do alvo em códons de parada não relacionados à doença. A presente terapia é também vantajosa pelo fato de que ela provê especificidade de aminoácidoO tRNA expresso é engenheirado para substituir especificamente o aminoácido que foi perdido por meio de inserção do códon de parada de doença, desta maneira negando quaisquer efeitos espúrios sobre estabilidade, dobra e tráfego da proteína.

[181] Em certas modalidades, o presente sistema é modular, e então pode ser “personalizado” para cada PTC de doença possível. Por exemplo, existem nove tRNAs de triptofano individuais no genoma humano que são reconhecidos pela Trp sintetase, todos eles suprimem o códon UGG de mRNA. Desta maneira, cada um desses nove RNA de Trp provê uma oportunidade para tolerância de reedição de códon (UGG → UGA). Ainda, dada sua proximidade com códons de parada no código genético, as mutações de códons de arginina para códons sem sentido de PTC são comuns em doença. Há mais de trinta RNA de Arg que poderiam ser testados para tolerância de adição de códon e eficácia de supressão.

[182] Uma vantagem adicional da presente invenção é que ela provê expressão fácil e administração específica de célula, porque o sistema inteiro (tRNA + sequência de promotor) é compacto. Dosagens, Formulações e Vias de Administração dos Agentes da Invenção

[183] Os agentes da invenção são administrados de modo a resultar em uma redução em pelo menos um sintoma associado com uma doença genética (por exemplo, fibrose cística). A quantidade administrada variará dependendo de vários fatores incluindo, mas não limitado a, a composição escolhida, a doença particular, o peso, a condição física e a idade do mamífero, e se prevenção ou tratamento deve ser alcançado. Tais fatores podem ser prontamente determinados pelo médico empregando modelos animais ou outros sistemas de teste que são bem conhecidos na técnica.

[184] A presente invenção prevê tratamento de doença genética (por exemplo, fibrose cística) através da administração de um agente, por exemplo, Ace-tRNA, um vetor de expressão ou uma partícula viral da invenção. Administração dos agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do recipiente, se o propósito da administração é terapêutico ou profilático e outros fatores conhecidos dos praticantes versados. A administração dos agentes da invenção pode ser essencialmente contínua durante um período de tempo pré- selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas. Ambas administrações local e sistêmica são compreendidas.

[185] Uma ou mais formas de dosagem unitárias adequadas tendo o(s) agente(s) terapêutico(s) da invenção que, como discutido abaixo, podem ser formulado(s) para liberação sustentada (por exemplo, usando microencapsulação), podem ser administradas através de uma variedade de vias incluindo parenteral, incluindo por meio de vias intravenosa e intramuscular, bem como através de injeção direta no tecido doente. As formulações podem, onde apropriado, ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem unitárias distintas e podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos bem conhecidos na farmácia. Tais métodos podem incluir a etapa de trazer em associação o agente terapêutico com veículos líquidos, matrizes sólidas, veículos semissólidos, veículos sólidos finamente divididos ou combinações dos mesmos e então, se necessário,

introduzir ou modelar o produto no sistema de administração desejado.

[186] Quando os agentes terapêuticos da invenção são preparados para administração, eles podem ser combinados com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma formulação farmacêutica ou forma de dosagem unitária. Os ingredientes ativos totais em tais formulações incluem de a partir de 0,1 a 99,9% em peso da formulação. Um “farmaceuticamente aceitável” é um veículo, diluente, excipiente e/ou sal que é compatível com os outros ingredientes da formulação, e não prejudicial para o seu recipiente. O ingrediente ativo para administração pode estar presente como um pó ou como grânulos; como uma solução, uma suspensão ou uma emulsão.

[187] Formulações farmacêuticas contendo os agentes terapêuticos da invenção podem ser preparadas através de procedimentos conhecidos na técnica usando ingredientes bem conhecidos e prontamente disponíveis. Os agentes terapêuticos da invenção também podem ser formulados como soluções apropriadas para administração parenteral, por exemplo, através de via intramuscular, subcutânea ou intravenosa.

[188] As formulações farmacêuticas dos agentes terapêuticos da invenção podem também tomar a forma de uma solução ou dispersão aquosa ou anidra, ou alternativamente a forma de uma emulsão ou suspensão.

[189] Desta maneira, o agente terapêutico pode ser formulado para administração parenteral (por exemplo, através de injeção, por exemplo, injeção de bolo ou infusão contínua) e pode ser apresentado em forma de dose unitária em ampolas, seringas pré-cheias, recipientes de infusão de volume pequeno ou em recipientes de dose múltipla com um conservante adicionado. Os ingredientes ativos podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, os ingredientes ativos podem estar em forma de pó, obtidos através de isolamento asséptico de sólido estéril ou através de liofilização a partir da solução, para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirógeno, estéril, antes do uso.

[190] Será compreendido que o teor unitário de ingrediente ou ingredientes ativos contidos em uma dose de aerossol individual de cada forma de dosagem não precisa em si constituir uma quantidade eficaz para tratamento da indicação ou doença particular uma vez que a quantidade eficaz necessária pode ser atingida através da administração de uma pluralidade de unidades de dosagem. Além disso, a quantidade eficaz pode ser atingida usando menos do que a dose na forma de dosagem, ou individualmente ou em uma série de administrações.

[191] As formulações farmacêuticas da presente invenção podem incluir, como ingredientes opcionais, veículos, diluentes, agentes de solubilização ou emulsificantes e sais farmaceuticamente aceitáveis do tipo que são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes específicos dos veículos e/ou diluentes que são úteis nas formulações farmacêuticas da presente invenção incluem água e soluções salinas tamponadas fisiologicamente aceitáveis tais como soluções salinas tamponadas com fosfato de pH 7,0-8,0 e água.

DEFINIÇÕES

[192] Estado de doença: para os propósitos da presente invenção, um “estado de doença” ou “fenótipo de doença” é uma característica de uma célula de mamífero que resulta de um códon de parada dentro da região de codificação de um gene dentro da célula (por exemplo, que resulta de uma mutação sem sentido). Por exemplo, um número grande de doenças genéticas humanas é pensado ser causado por mutações sem sentido (vide, por exemplo, Atkinson e outros, Nuc. Acids Res. 22:1327, 1994). Para dar alguns exemplos, β-talassemia, distrofia muscular de Duchenne, xeroderma pigmentoso, anemia de Fanconi e fibrose cística podem ser todas causadas por mutações sem sentido em genes identificados.

[193] tRNA sintetase endógena: uma tRNA sintetase é considerada ser “endógena” a uma célula se ela estiver presente na célula na qual um tRNA é introduzido de acordo com a presente invenção. Como será aparente àqueles de habilidade comum na técnica, uma tRNA sintetase pode ser considerada ser endógena para o propósito se ela for naturalmente encontrada em células do tipo relevante, ou se a célula particular em questão foi engenheirada ou de outro modo manipulada pela mão do homem para conter ou expressá- la.

[194] tRNA supressor: um “tRNA” supressor é um cujo anticódon é complementar a um códon que de outro modo termina tradução, de modo que leitura detectável ocorre sob as condições do experimento. Códons de terminação padrão são códons âmbar (UAG), ocre (UAA) e opala (UGA). No entanto, códons de terminação não padrão (por exemplo, códons de 4 nucleotídeos) têm sido empregados na literatura (vide, por exemplo, Moore e outros, J. Mol. Biol. 298:195, 2000; Hohsaka e outros, J. Am. Chem. Soc. 121:12194, 1999).

[195] A invenção será agora ilustrada pelos Exemplos não limitantes que seguem. EXEMPLO 1

[196] O código genético usa quatro nucleotídeos que por sua vez forma códons tripleto, que formam a base para tradução de DNA em proteína. Existem 64 códons no total, 61 dos quais são usados para codificar aminoácidos, e três (TAG, TGA e TAA) dos quais codificam códons de “parada” e “sem sentido” de terminação de proteína.

[197] Cinco a dez por cento de casos de fibrose cística são causados por mutações “sem sentido” que levam a truncamento prematuro da proteína reguladora de condutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR). Um exemplo dessa mutação “classe 1” é p.Trp1282X, um códon de terminação prematuro (PTC) que causa uma perda de função de CFTR e fenótipos de fibrose cística severos. Alguns compostos, tal como Ataluren, promovem leitura de parada de mutações sem sentido de produção de doença, mas foram modestamente bem- sucedidos como agentes terapêuticos devido a vários embargos, incluindo especificidade para códon de parada pobre e inesperadamente baixa eficiência de salto de códon in vivo. No entanto, o uso disseminado desses compostos e a constatação que read-through de códon de parada endógena é comum em metazoários, sugere que supressão assistida poderia ser viável se administrada a um subconjunto de tipos de célula, isto é, epitélio das vias aéreas. Ainda, quando read-through de códon de parada assistida terapeuticamente é bem-sucedido, a incorporação não seletiva de um aminoácido no local do códon sem sentido tem o potencial de afetar dobra, tráfego e função de proteína (como no caso com CFTR 1282X); e, desta maneira, requer intervenção terapêutica adicional. Desta maneira, há uma necessidade não satisfeita aguda de compreender a natureza de PTCs de doença e supressores potencialmente terapêuticos e, geralmente, tratamentos mais eficazes de doenças de PTCs.

[198] Esse Exemplo caracteriza Trp-tRNA com anticódon editado (ACE) para o resgate de canais de CFTR p.Trp1282X. Tais tRNAs são engenheirados para ‘suprimir’ o códon de parada de TGA causador de doença e incorporar o aminoácido original, Trp em CFTR p.Trp1282X, com efeito, reconstruindo geneticamente a proteína CFTR do tipo selvagem. Dados demonstram que essa abordagem geral (supressão de sem sentido) produz resgate robusto de transcritos que carregam códons de parada em estrutura, através ou de transfecção transiente de um tRNA e sua sintetase cognata em células aderentes, ou sua administração baseada em vírus a tipos de célula das vias respiratórias mais nativos, tais como células das vias respiratórias A549. Essa abordagem oferece vários benefícios significantes com relação a estratégias existentes: 1) especificidade de códon aperfeiçoada – o tRNA expresso pode ser direcionado a um códon de parada específico, dessa maneira reduzindo efeitos fora do alvo em códons de parada não relacionados à doença. 2) Especificidade de aminoácido – o tRNA expresso e/ou sintetase pode ser engenheirado para substituir o aminoácido que foi perdido através da inserção do códon de parada da doença, dessa maneira negando quaisquer efeitos espúrios sobre a estabilidade, dobra e tráfego da CFTR. 3) Capacidade de ajuste – o sistema pode ser teoricamente personalizado para cada tipo de mutação de tRNA e PTC. 4) Expressão fácil – o sistema todo é compacto (<1kb) e pode ser facilmente empacotado e expresso transientemente ou através de administração de nanopartícula de tRNA. 5) Prova de princípio para uma estratégia geral – códons de parada em estrutura são uma das principais causas de doença humana e poucas opções de tratamento existem; os experimentos realizados aqui em p.Trp1282X são esperados levar à compreensão sobre os mecanismos de outros códons sem sentido de CFTR.

[199] Dados mostram que tRNA supressor de códon de parada de ACE-tRNA são eficientes no “resgate” de transcritos que contêm sítios de parada introduzidos (Figuras 6A e 6B) sugerindo que tais tRNAs têm o potencial de interferir com degradação mediada por mutação sem sentido (NMD) como o principal obstáculo biológico no resgate terapêutico de sítios de parada de doença. Desta maneira abrindo a possibilidade para o uso de tRNA supressor para obter mais compreensão molecular sobre NMD em doença.

RESULTADOS

[200] Foi questionado se seria possível expressar tRNA eucariótico que tinha sido editado no anticódon para suprimir sítios de parada, TGA, por exemplo, e não seu códon designado. Isso foi testado em cinco tRNAs de triptofano humano em um construto de teste consistindo em uma proteína fluorescente (cherry) em estrutura com sequência de eGFP que são separadas por um ligante contendo um sítio de TGA. Para indicar a produção da proteína de comprimento integral um epítopo de HA foi adicionado ao terminal C da estrutura de leitura de eGFP. Esse sistema de teste é útil porque aparência visual do sinal de cherry indica administração e expressão de plasmídeo e em combinação com o resgate de eGFP mostra supressão de TGA. Dados nas Figuras 6A e 6B mostram dados de Western blot usando esse construto de teste para ensaiar a habilidade de cinco tRNAs de Trp com códon editado humanos em suprimir o sítio de parada de TGA no ligante curto entre cherry e estruturas de leitura de eGFP. Desses construtos, os candidatos 1, 2, 3 & 5 mostram atividade modesta com relação a isso. Isso pode ser devido à intolerância estrutural à mutação ou a possibilidade que alteração do anticódon, até mesmo por uma base única, rompeu a habilidade da Trp sintetase em reconhecer e/ou acilar o tRNA com triptofano. No entanto, o número 4 desses tRNAs de teste (tRNA #4) mostra atividade de supressão significante do sítio de TGA, produzindo uma proteína cherry-eGFP-HA de comprimento integral (Figura 6B). Ainda, nenhum read-through foi visto na ausência de tRNA coexpresso, última linha, Figura 6B.

MÉTODOS

[201] O tRNA de Trp foi examinado quanto à tolerância de edição de códon (TGG → TGA) e sua habilidade em suprimir um sítio de teste de TGA-alvo em um fluoróforo em tandem transientemente transfectado (mCherry-TGA-GFP) e Trp1282X CFTR. Avaliação inicial de tRNA de

Trp 5/9 constatou um Trp-tRNA com códon editado que foi transientemente transfectado em células HEK e tem funcionalidade ‘autônoma’ para resgatar um construto de teste cherry-TGA-eGFP-HA, Figura 6B. A presença seletiva do epítopo de HA indica resgate bem- sucedido, bem como exame confocal da fluorescência de ambos cherry e eGFP no nível de célula única (não mostrado). Esse resultado provê prova de dados de princípio que a) alguns ACE-tRNA podem tolerar edição anticódon, b) que esses tRNA retêm a habilidade em ser acilados com Trp por triptofano sintetase endógenas e c) esses tRNA podem suprimir sítios de TGA embutidos em estruturas de leitura de proteína abertas.

[202] Os quatro Trp-tRNA restantes são funcionalmente examinados quanto à tolerância de edição anticódon a partir de supressores de TAA para TGA. Esses tRNA editados no anticódon são testados quanto à sua habilidade em resgatar o clone de cherry-TGA- eGFPHA. Dados bioquímicos (Western blot) são obtidos para sinais de cherry e eGFP bem como epítopos de HA. Aqui, expressão de cherry serve como o controle de transfecção positivo. Imagem confocal verifica fluorescência de cherry e eGFP no nível de célula única.

[203] A fidelidade de Trp sintetases endógenas em carregar ACE- tRNA Trp com o aminoácido triptofano é determinada através de análise espectroscópica de massa de fragmentos trípticos de proteína cherry- Trp-eGFPHA resgatada purificada. Massa prevista para o fragmento tríptico gerado a partir do ligante entre as estruturas de leitura de cherry e eGFP é: KPINQWPANTHER com uma massa prevista de 1590,8135; o W em negrito indica sítio de incorporação, Figura 10. Desta maneira, isso representa o primeiro exemplo de um reparo de códon sem sentido e substituição com o aminoácido do tipo selvagem e, desta maneira, é um avanço significante com relação a abordagens existentes, tal como o agente terapêutico Ataluran. O último exemplo, o composto promove read-through do códon sem sentido com o aminoácido incorreto, dessa maneira o encontro e a identificação de novas sequências de tRNA que proveem reparo rigoroso são significantes.

[204] Resgate de canais 1282X de CFTR transientemente transfectados por ACE-tRNA identificado acima é avaliado através de métodos bioquímicos padrão para maturação integral das faixas de CFTR 20 glicosiladas B e C. Desta maneira, o canal foi reparado com o aminoácido do tipo selvagem, está integralmente funcional e traficado com sucesso para a membrana plasmática.

[205] A etapa seguinte é caracterizar funcionalmente canais Trp1282X de CFTR resgatados com sistemas de ACE-tRNA identificados acima usando abordagens eletrofisiológicas (patch clamp celular simples e câmara Ussing) e bioquímicas. A eficácia de tRNA expresso em diminuir degradação mediada por mutação sem sentido (NMD) de mRNA 1282X seria avaliada com rtPCR quantitativa. Células das vias aéreas humanas reprogramadas são usadas para testar resgate de Trp-tRNA com códon editado expresso de canais de CFTR 1282X nativos.

[206] É demonstrado que edição anticódon é tolerada em um tRNA de Trp humano identificado e esse RNA de transferência de 75 pares de base é capaz de suprimir um códon de TGA em estrutura dentro de um construto de teste. Esses experimentos extrapolam essa constatação para caracterizar a habilidade desse ACE-tRNA em interagir comi mRNA 1282TGA CFTR e produzir canais de CFTR funcionais em células de modelo (FTR e A549) bem como células das vias aéreas reprogramadas humanas p. 1282X.

[207] Determinação bioquímica de níveis de resgate em canais 1282X CFTR transientemente expressos bem como aqueles em células das vias aéreas reprogramadas. Anticorpo M3A7 é usado para reconhecer o anticorpo resgatado (o epítopo é aa 1370-1380) e para detectar todos os CFTR, resgatados e não resgatados, se ligando ao terminal N tal como MM13-4 (epítopo aa 25-36), disponível através da EMD Millipore. Alternativamente, L12B4 (epítopo aa 386-412, EMD Millipore) ou 660 (epítopo aa 576-585) está disponível da Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics.

[208] Funcionalidade da superfície é examinada através de abordagens eletrofisiológicas, patch clamp e gravação em câmara Ussing. Estabilidade e abundância de mRNA 1282X são ensaiadas através de rtPCR quantitativa de extratos de RNA a partir de células se expressando transientemente e células das vias aéreas reprogramadas.

[209] Análise de bioinformática de dados de transcriptoma de RNA de células das vias aéreas humanas identifica abundância, contexto e identidade de transcritos contendo códon de TGA. Os 10 melhores transcritos de expressão usando TGA para seus sítios de parada normais são acompanhados no nível de transcrito individual com bioquímica de proteína antes e após expressão de ACE-tRNA. Sondas bioquímicas e imunoistoquímicas de apoptose celular são também usadas para examinar o impacto de ACE-tRNA em morte celular.

[210] Concluindo, os dados mostram que genes de canal de íon com sítios de parada em estrutura são condescendentes a esse tipo de “resgate” (Figura 9) e componentes do sistema podem ser expressos viralmente em células das vias aéreas. Ainda, uma forma altamente simplificada dessa ideia, um ACE-tRNA de origem humana, demonstra a habilidade “autônoma” para resgatar códons de TGA de CFTR em estrutura em linhagens de célula de mamífero (Figuras 9). Essa abordagem tem muitas vantagens com relação a estratégias de códon de parada existentes e merece exame mais de perto em termos da habilidade de ACE-tRNA em 1) anular degradação mediada por mutação sem sentido, 2) funcionar em preparações de célula pulmonar e 3) resgatar especificamente 1282X CFTR.

EXEMPLO 2

[211] Várias mutações sem sentido diferentes causam CF, dessa maneira subjazendo aproximadamente 10% de toda doença CF. Figura

7. Esses casos são concentrados em dez lesões genéticas específicas: E60X, R75X, G542X, R553X, Q890X, Y1092X, R1158X, R1162X e W1282X. É proposto que seja viável, com a abordagem certa, avaliar sequências de tRNA humanas existentes quanto à modificação e tolerância à edição anticódon. Para essa finalidade, aproximadamente 144 ACE-tRNAs foram candidatos para testar aqueles que poderiam ser usados para promover o reparo do códon sem sentido causador de doença e a expressão da proteína de comprimento integral. Especificamente, usando o esquema descrito na Figura 11, bibliotecas de tRNA foram geradas para identificar novas sequências de tRNA que codificam ACE tRNA com a habilidade em reparar as principais mutações sem sentido causadoras de CP. Especificamente, 10ng de oligos anelados codificando os ACE-tRNAs foram combinados com 50ng de plasmídeo repórter NanoLuc, 1ul de 10x CutSmart Buffer (NEB), 1ul de T4 ligase (NEB), 10mM de ATP e 1ul de BbsI (NEB) e ciclado em um termociclador como descrito na Figura 11. 1ul da reação foi transformado em E. coli competente e os transformantes foram plaqueados em placas de ágar com ampicilina. Um transformante foi pego por placa, cultivado em 1ml de LB sob seleção com ampicilina, minipreparados e a sequência verificada.

[212] Estudos de avaliação foram primeiro realizados para identificar os melhores Candidatos a ACE-tRNA a partir de triptofano e glicina. 125ng de cDNA de miniprep com sequência verificada de plasmídeo repórter NanoLuc com ACE-tRNA foram transfectados em células HEK usando fosfato de cálcio. Células HEK foram plaqueadas em placas de 96 poços a 4x104 no dia anterior. 24h após transfecção, o meio foi substituído com 20ul de PBS e 15ul de reagente NanoGlo

(Promega) foram adicionados. As placas foram lidas em um SpectraMax i3 (Molecular Devices). Os dados são de réplicas de 3 ou mais. Figura

8. Os dados mostram que a maioria dos tRNA demonstra tolerância à edição de códon pobre. No entanto, tRNA de alto desempenho claro emerge a partir da avaliação, com identificação de ACE-Trp e ACE tRNA-Gly que demonstram resgate de proteína contendo códon sem sentido de 20 vezes a 130 vezes com relação à base.

[213] Para avaliar se esses tRNA novos poderiam resgatar canais de CFTR carregando códons sem sentido, eles foram coexpressos em células HEK de mamífero com um plasmídeo de cDNA W1282X CFTR. As preparações celulares foram analisadas através de abordagens bioquímicas padrão por meio de avaliação Western blot de proteína CFTR. Esse método é altamente vantajoso para esse propósito porque a proteína CFTR exibe um padrão de bandas múltiplas que é bem estabelecido. Especificamente, as bandas “B” e “C” representam a proteína CFTR pós-traducionalmente continuada, de comprimento integral e totalmente madura, na superfície celular, respectivamente. Nesse caso, ambos resgates com ACT-tRNAs Trpchr17.trna39 e Glychr19.trna2 produzem populações robustas de bandas imunopositivas de CFTR ‘B’ e ‘C’ (anticorpo MA37), indicando a promoção pelo dito tRNA da proteína de canal de íon traficada com sucesso, de comprimento integral. Figura 9. EXEMPLO 3

[214] A modificação na haste T melhora significantemente a supressão sem sentido. Figura 10. Aqui é proposta uma modificação adicional do tRNA para permitir mais seu funcionamento para o propósito de supressão de códons sem sentido e a promoção de expressão de proteína. A hipótese é baseada na possibilidade que mutações racionalmente produzidas dentro da alça ‘da haste t’ de tRNA, mostrado na Figura 10, renderão uma molécula de tRNA que é mais estável e funcionalmente mais potente para supressão de códon sem sentido. Para essa finalidade, mutações simples e duplas foram diretamente engenheiradas na alça da haste t de tRNA Trpchr17.trna39 – um ACE-tRNA identificado com atividade para o resgate de códons sem sentido de TGA de triptofano. Trinta e oito variantes de haste t de tRNA foram então geradas e avaliadas em células HEK transientemente transfectadas com o construto de repórter de resgate sem sentido mostrado na Figura 4. 24 horas após transfecção, as células foram ensaiadas quanto à atividade de luciferase, mostrada na Figura 10. Os dados mostram variação forte e identificaram novas sequências de tRNA com sequências de alça de haste t com atividade de supressão aumentada. Notadamente, um desses mutantes, TS38 52-62 G-C aumenta a habilidade de supressão de Trpchr17.trna19 em aproximadamente 250% (Figura 12). É então proposto que essa seja uma modificação generalizável, isto é, que novas sequências de tRNA identificadas, pelos exemplos 1 e 2, possam ser melhoradas (quanto à sua habilidade em resgatar códons sem sentido) através de modificações racionais adicionais. Tais abordagens auxiliam na utilidade terapêutica de ACE-tRNA direcionado a tipos de tecido com RNA-alvo de pouca abundância ou onde administração de tRNA pode ser limitante. EXEMPLO 4

[215] A fim de permitir a identificação da composição de nucleotídeo e habilidade funcional em suprimir códons sem sentido por novos tipos de tRNA, um All-In-One Plasmid Com um A One Pot Cloning Reaction foi desenvovlido para High Throughput Cloning Figura 11. Essa abordagem permite a investigação fácil de atividade de ACE-tRNA por meio de atividade de luciferase em um formato de 96 poços padrão. Em suma, sequências de nucleotídeo sintéticas codificando tRNA são ligadas ao plasmídeo Reporter NanoLuc, com um exemplo da variante de plasmídeo repórter sem sentido TGA mostrada na Figura 11. Vetores de resgate de códon de parada TAA (opala) e TAG (âmbar) foram projetados com sucesso e implementados nas Figuras 16-19. Os benefícios da abordagem são que oligos de DNA codificando bibliotecas de tRNA podem ser ligados ao plasmídeo repórter NanoLuc com a presença da enzima de restrição e ligase com a reação impelida para quase 100% de incorporação do inserto de tRNA (Fig. 11) – por isso a designação ‘um recipiente’. A reação é transformada em E. coli, com o cDNA resultante purificado através de métodos padrão. Um outro benefício do método da invenção é que o tRNA e o gene repórter estão dentro do cassete de expressão único, dessa maneira diminuindo a variabilidade biológica e melhorando a obtenção de qualidade de dados em avaliações resultantes de atividade de supressão de tRNA. Os plasmídeos de cDNA purificados são então avaliados em formato de 96 poços de alto rendimento quanto à sua habilidade em reparar códons sem sentido pela atividade de luciferase inferida. A abordagem é adequada para a avaliação de alto rendimento de centenas a milhares de tRNA para atividade terapêutica nova.

[216] O sistema de clonagem e expressão de “um recipiente’ descrito na Figura 11 foi usado com sucesso para identificar sequências de tRNA únicas para o reparo de ACE-tRNA (Figura 13), ACE-tRNA-Arg (Figura 14), ACE-tRNA-Gln TAG (Figura 15), ACE-tRNA-Gln TAA (Figura 16), ACE-tRNA-Glu TAG (Figura 17), ACE-tRNA-Gln TAA (Figura 18) e ACE-tRNA-Trp TAG (Figura 19). As Figuras 20A-20D mostram que administração de ACE-tRNA como RNA pequeno dá suporte à supressão robusta de mutações sem sentido G542X e W1282X. EXEMPLO 5 RNAs de transferência engenheirados para supressão de códons de terminação prematuros

[217] Códons de terminação prematuros (PTCs) são responsáveis por 10-15% de toda doença herdada. Supressão de PTC durante tradução oferece uma abordagem promissora para tratar uma variedade de distúrbios genéticos, moléculas ainda que pequenas que promovem read-through de PTC renderam desempenho misto em testes clínicos. Um ensaio baseado em célula, de alto rendimento, é apresentado para identificar RNAs de transferência com anticódon engenheirado (ACE- tRNA) que podem efetivamente suprimir PTCs em estrutura e codificam fielmente seu aminoácido cognato. No total, ACT-tRNA foram identificados com um grau alto de atividade de supressão se direcionando aos códons sem sentido causadores de doença humana mais comuns. Traçado de perfil de ribossomo de transcriptoma amplo de genoma de células expressando ACE-tRNA em níveis que reparam PTC indicam que há interações limitadas com códons de terminação de tradução. Esses ACE-tRNAs exibem potência de supressão alta em células de mamífero, oócitos de Xenopus e camundongos in vivo, produzindo reparo de PTC em genes múltiplos, incluindo mutações causadoras de doença dentro do regulador de condutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR).

INTRODUÇÃO

[218] Códons de terminação prematuros (PTCs) têm origem a partir de mutações de nucleotídeo únicas que convertem um códon de nucleotídeo tripleto canônico em um de três códons de parada, por exemplo, TAG, TGA ou TAA. PTCs são frequentemente mais prejudiciais do que mutações silenciosas porque eles resultam na perda de expressão de proteína. Ainda, abundância de mRNA é reduzida através de degradação mediada por mutação sem sentido (NMD) e, em alguns casos, proteínas truncadas podem ter uma função negativa dominante1-3. Desta maneira, não é surpreendente que PTCs estejam associados a muitos fenótipos de doença severa, incluindo fibrose cística4, distrofia muscular de Duchenne, atrofia muscular espinhal5, lipofuscinose ceroide neuronal infantil6, β-talassemia7, cistinose8, diabetes insipidus nefrogênico ligado ao X9, síndrome de Hurler10, síndrome de Usher11 e doença renal policística. Ainda, mutações sem sentido ocorrem dentro dos genes supressores de tumor p53 e ATM12, implicando mais seu papel em doença. Códons de aminoácido mais vulneráveis à conversão de PTC são aqueles com uma substituição de nucleotídeo única a partir de um códon de parada: triptofano, tirosina, cisteína, ácido glutâmico, lisina, glutamina, serina, leucina, arginina e glicina (Figura 25). Desta maneira, PTCs representam uma constelação única de doenças que afligem mais de 30 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo responsáveis por 10-15% de todas as doenças genéticas13.

[219] Moléculas pequenas, tais como aminoglicosídeos14, dipeptídeos15 e oxadiazóis16, promovem “read-through” ou “supressão” de mutações sem sentido. Esses compostos são eficazes em organismos modelo17-18, linhagens de célula de mamifero19 e alguns modelos de doença animal16,20. No entanto, essa abordagem resulta na codificação de um aminoácido próximo-do-cognato21, gerando efetivamente uma mutação sem sentido no PTC, que em si pode ter efeitos prejudiciais sobre dobra, tráfego e função de proteína. Ainda, aminoglicosídeo são oto- e nefrotóxicos22, e o oxadiazol primeiro-na- classe, Ataluren, exibiu eficácia inesperadamente baixa em populações de paciente (Teste clínico Fase 3 DMD ACT, NCT01826487; ACT CF, NCT02139306), desta maneira limitando sua utilidade como agentes terapêuticos para PTC. Avanços recentes e contínuos em edição de genoma mediada por CRISPR/Cas9 proveem potencialmente uma solução permanente para doenças resultantes de mutações sem sentido. No entanto, aspectos dessa tecnologia apresentam obstáculos para seu uso rápido como um agente terapêutico23,24. Isso não é limitado à necessidade de diagnóstico de “precisão” ou “personalizado” para cada mutação com base no contexto da variabilidade genética de cada paciente.

[220] Uma abordagem de reparo de PTC foi identificada, a qual exibe a versatilidade de moléculas pequenas e a precisão de edição de gene. tRNAs foram investigados para preencher esses critérios, de maneira que seus anticódons foram engenheirados através de mutagênese para reconhecer e suprimir códons de PTC de UGA, UAA ou UAG. A fim de que sejam eficazes, os tRNAs com anticódon editado, também conhecidos como ACE-tRNAs, devem ser ainda reconhecidos pelo maquinário celular de tradução endógeno, incluindo a aminoacila- tRNA sintetase para carregamento do ACE-tRNA com seu aminoácido cognato e o fator de alongamento eucariótico 1ª (eEF-1α) para administração do tRNA carregado ao ribossomo, Figura 21A. Tais tRNAs supressores foram mostrados, de uma maneira limitada, resgatar códons de parada em estrutura associados com β-talassemia25, xeroderma pigomentoso26 e um gene repórter de PTC transgênico27.

[221] Aqui é mostrado que uma abordagem de edição anticódon é generalizável para múltiplas famílias de gene de tRNA, indicando que muitos tRNA anotados são biologicamente viáveis. Ainda, é demonstrado que o tRNA supressor editado em anticódon codifica seu aminoácido cognato, carecem de interações significantes com códons de parada de terminação e são eficazes in vivo para suprimir PTC. No total, os dados suportam a possibilidade que tal RNA engenheirado satisfaça a exigência ampla de cobertura de PTCs causadores de doença e então represente uma nova classe promissora de agente terapêutico de RNA.

RESULTADOS

[222] A lógica para esse estudo está enraizada na observação que há múltiplos genes de RNA com sequências únicas (isodecodificadores)

para um dado aminoácido cognato (isoaceitadores), levando a >400 tRNAs anotados no genoma humano (http:lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/)28,29. Primeiro, genes de tRNA foram examinados para identificar ACE-tRNAs individuais que retêm eficácia de supressão de PTCs em células de mamífero. A fim de maximizar cobertura de sequência, um plasmídeo de cDNA all-in-one foi gerado, o qual suporta ambas clonagem de alto rendimento (HTC) de ACE-tRNAs e medição quantitativa de supressão de PTC usando luminescência seguindo administração a células de mamífero, Figura 21B. Sequências de ACE-tRNA foram clonadas como oligos de DNA no plasmídeo de HTC usando clonagem Golden Gate30 emparelhada com seleção negativo ccdB31. Essa estratégia produziu ~100% de eficiência de clonagem. Eficiência de supressão de ACE-tRNA foi lida a partir de uma plataforma NanoBit de luciferase NanoLuc (NLuc) dividida, de modo que o PTC de interesse (UGA, UAA ou UAG) foi introduzido em estrutura na junção entre os domínios de bit grande e bit pequeno, Figura 21B32, usando um formato de 96 poços e normalizado para base obtida em células expressando NLuc-PTC. Vinte e um ACE-tRNAs de glicina foram primeiro avaliados quanto à supressão no PTC UGA, Figura 22, parte superior à esquerda, coluna 1 (violeta). A maioria das sequências ACE-tRNAGly falhou em suprimir PTC NLuc UGA, no entanto, três Gly- RNAUGA foram identificados com rendimentos de supressão altos (~100 vezes com relação à base). Dada a conservação de sequência alta dentre Gly-tRNAs avaliados quando à tolerância anticódon (Figura 27), seria difícil prever de novo qual tRNA seria mais condescendente à edição anticódon.

[223] Em seguida, avaliações realizadas foram realizadas em tRNA com códon editado para cada uma das possíveis mutações de nucleotídeo únicas que produziriam um PTC causador de doença: Arg- tRNAUGA, Gln-tRNAUAA, Gln-tRNAUAG Trp-tRNAUGA, Trp-tRNAUAG, Glu-

tRNAUAA, Glu-tRNAUAG, Cys-tRNAUGA, Tyr-tRNAUAG, Tyr-tRNAUAA, Ser- tRNAUAG, Leu-tRNAUAG, Leu-tRNAUAA, Lys-tRNAUAG, Lys-tRNAUGA e Ser-tRNAUAG.

A atividade enzimática de NLuc não foi significantemente influenciada pelo aminoácido introduzido (Figura 28), portanto, devido à diferença em luminescência de NLuc para habilidade de supressão de ACE-tRNA.

A avaliação identificou ACE-tRNAs múltiplos para cada um dos aminoácidos e tipo de códon de parada, com cobertura de supressão para todos os três códons de parada, Figura 22. Muitos desses ACE-tRNAs exibiram atividade forte com >100 vezes de supressão de PTC com relação à base, o que é significantemente maior do que os aminoglicosídeo usados nesse estudo.

Interessantemente, alguns ACE-tRNAs exibiram uma preferência clara por uma edição anticódon particular, possivelmente refletindo aminoacil-tRNA sintetase alterada se ligando às sequências isoaceitadoras de anticódon de tRNA33. Por exemplo, conversão de triptofano em supressão de UAG proveu resgate que era dez vezes maior do que aquele de edição de UGA do mesmo ACE-tRNATrp.

Ainda o oposto era verdadeiro para glutamina, onde uma preferência clara foi mostrada para UAA com relação a UAG.

Notadamente, em cada caso, supressores de alto desempenho múltiplos foram identificados, e isso era especialmente evidente com ArgUGA, um PTC que exibe um papel desproporcional em doença humana; onde vinte supressores de ACE-ArgUGA eficientes foram identificados.

Em outros casos, tal como ACE-tRNAGlu, daqueles que exibiram função, a eficiência de supressão foi aproximadamente igual para UAA e UAG.

E um padrão similar foi encontrado em ACE- tRNALys onde codificação por meio doe supressão de UAG ou UGA foi fortemente espelhada.

Para Gln-tRNAUAA, a atividade de supressão resultou em sinais de supressão >2.000 vezes com relação à base.

Dos ACE-tRNAs identificados na avaliação, a família de gene de tRNA de triptofano exibiu a atividade de supressão mais fraca para PTCs UGA.

Com apenas 6 sequências de ACE-tRNATrp humanas disponíveis para avaliação, a biblioteca de ACE-tRNATrp de supressão de UGA foi expandida usando tRNA de uma gama de espécies. Tolerância à edição anticódon de UGA foi testada para genes de tRNA de triptofano com sequências únicas de levedura, mosca, camundongo, rato, coelho e sapo; em adição à tRNATrp A9C de codificação errônea e supressor de Trp Hirsh bacteriano34-46, Figuras 29A-29B. Esse esforço não foi bem- sucedido na identificação de atividade de supressão de PTC de UGA ACE-tRNATrp que excedeu aquela de tRNA Trp ACE humano, Figura 29C. No geral, as avaliações de tRNA identificaram múltiplos tRNAs engenheirados (para cada tipo de aminoácido e códon de parada) que exibiram supressão potente, dessa maneira carregando tolerância geral à edição anticódon.

[224] Em seguida, foi estabelecido se ACE-tRNAs identificados na avaliação foram funcionalizados às custas de rigor de aminoacilação pela aminoacil-tRNA sintetase cognata. Para essa finalidade, espectrometria de massa foi usada para examinar supressão de PTC em uma proteína solúvel modelo, histidinol desidrogenase (HDH), Figura 23A. Um códon de TGA foi introduzido na asparagina 94 (N94) (Figuras 30A-C) e coexpresso em células HEK293 em tandem com plasmídeos codificando ACE-tRNAs Glychr19.trna2 ou Trpchr17.trna39, os melhores ACE-tRNAUGA de glicina e triptofano, respectivamente. As proteínas HDH, suprimidas, de comprimento integral resultantes foram purificadas por meio de marcador de afinidade C-terminal Strep-Tactin® e analisadas através de espectrometria de massa, Figura 23A (Figura 28). Pesquisas subsequentes dos dados identificaram a modificação de Asn em Trp (+72 Da) para Trp chr17.trna39 e (-57 Da) para Glychr19.trna2, desta maneira confirmando a codificação verdadeira do aminoácido cognato para cada tipo de ACE-tRNA. Importante, em cada caso, >98% do peptídeo identificado no sítio p.N94X de HDH tinham o triptofano e a glicina cognatos codificados. Ainda, ambos ACE-tRNAs retiveram seletividade para o códon de parada de UGA, com relação a UAA e UAG, Figura 23B (ACE-tRNAGly) e Figura 31 (ACE-tRNATrp). Por fim, quando transientemente expresso, ACE-tRNAGly superou os supressores de molécula pequena convencionais gentamicina (40 µm) e G418 (140 µM) em sua habilidade em suprimir NLuc-UGA estavelmente expressa em células HEK293, Figura 23C. O mesmo era verdadeiro para ACE-tRNATrp, que tinha uma eficiência de supressão menor mesmo assim excedeu resgate de PTC comparado com G418, Figuras 33A-D.

[225] Foi levantada a questão se ACE-tRNAs que mostram supressão eficaz de códons de parada prematuros podem também induzir read-through global de códons de parada nativos. Para se endereçar a essa supressão “fora do alvo” potencial, um perfil quantitativo de transcriptoma amplo de ribossomos ativamente comprometidos em todos os transcritos celulares foi obtido através da geração de bibliotecas de pegadas de ribossomo de células HEK293 expressando ACE-tRNAs exógenos ou um falso-plasmídeo controle (puc57GG). Estreptomicina foi removida do meio de crescimento para prevenir artefatos de read-through. Para comparação, a biblioteca de pegada de ribossomo foi também gerada a partir de células na presença ou ausência de G418 (150 µM, 48h). A Figura 24A mostra densidades de pegada de ribossomo de G418 e cinco ACE-tRNAs comparado com controles (razão log2) em regiões 3’UTR. Apenas transcritos com um limiar mínimo de 5 RPKM na sequência de codificação e 0,5 RPKM na 3’UTR em duas bibliotecas de réplica foram incluídos para a comparação de quantitação (254 transcritos em G418 e 495-748 transcritos em ACE-tRNAs). Nesse sistema, G418 não tinha nenhum efeito observável sobre densidade de ribossomo 3’-UTR de transcriptoma amplo para nenhum dos três grupos de códon de parada endógenos. ACE-tRNAs examinados aqui não tinham nenhuma mudança detectável de densidade de ribossomo 3’UTR com a exceção de ACE-tRNA Gln-UAA e Arg-UGA que induziram um aumento de aproximadamente 2 vezes em densidade de ribossomo de 3’UTR para o códon de parada cognato complementar ao anticódon de ACE-tRNA. Compreensão da significância biológica de read-through de 2 vezes de paradas de proteína necessitará estudo adicional, mas esse efeito é substancialmente menor comparado com a supressão de 100 a 1000 vezes de PTC para o mesmo ACE-tRNA.

[226] Códons de parada em estrutura múltiplos são frequentemente encontrados na extremidade de genes37-39 e podem causar uma pequena diferença em densidade de ribossomo 3’UTR total para tratamento com ACE-tRNA e G418. Ocupação de ribossomos foi examinada em cada nucleotídeo na 3’UTR dentro de uma região de 6 nt a jusante dos códons de parada. A Figura 24B demonstra a ocupação de ribossomo circundando códons de parada nativos para cada nucleotídeo dentro da região de -35 a +65 nt em relação ao primeiro nucleotídeo de códon de parada. As leituras foram normalizadas por milhão de leituras mapeadas no total, comparadas com células controle e reportadas como razão log2 como no painel A. Mais de 5.200 transcritos foram mapeados para pelo menos 1 pegada na região de interesse. Gln-UAA e Arg-UGA de ACE-tRNA mostraram não apenas ocupação de ribossomo aumentada notável na região precoce, mas também periodicidade 3-nt característica, indicando que os ribossomos não eram distribuídos aleatoriamente, mas seguiam um movimento códon-por-códon. ACE-tRNAs para UGA-Trp, UGA-Gly e UAG-Glu, ou G418, não mostraram consistentemente nenhuma mudança observável de ocupação de ribossomo mesmo na região precoce de 3’UTR. Juntos, os dados de traçado de perfil de ribossomo demonstram que eficiência de supressão de códon de parada nativo por ACE-tRNAs é geralmente baixa, e notadamente menos do que o nível de supressão de PTC.

DISCUSSÃO

[227] PTCs causam um grande número de doenças humanas e não existem quaisquer opções terapêuticas estabelecidas para seu manejo terapêutico. A análise de clonagem e identificação, caracterização e funcional de alto rendimento de tRNA com anticódon editado que exibe reversão de PTC eficaz em células eucarióticas e músculo esqueletal de camundongo é relatada aqui. Notadamente, a avaliação identifica ACE-tRNA, no total, com a habilidade em reparar a maioria dos PTC causadores de doença humanos conhecidos. O tRNA engenheirado codifica fielmente seu aminoácido cognato, dessa maneira anulando efeitos espúrios sobre estabilidade, dobra e tráfico de proteína a jusante, e consequentemente negando a necessidade de terapias em tandem envolvendo agentes de dobra e tráfico de proteína. Quando transfectados como cDNA, ACE-tRNAs resgatam múltiplas proteínas de comprimento integral através de supressão de PTC; um repórter de luciferase NLuc, uma proteína modelo HDH e duas mutações sem sentido de doença em CFTR. Supressão de PTC in vivo potente e estável em músculo esqueletal de camundongo foi exibida por um cDNA de ACE-tRNAArg, sugerindo um nível particularmente alto de tolerância celular para atividade de ACE-tRNA. A identificação de um ACE-tRNA ativo para arginina em músculo é relevante para o tratamento de distrofinopatias causadas por mutações sem sentido. Seguindo o exemplo com a maioria das doenças genéticas, mais de 10 por cento de distrofinopatias são causados por mutações sem sentido43, onde mutações CGA->TGA são mais prevalentes43. Supressão eficiente foi também obtida com ACE-tRNAs administrados como transcritos de RNA sintéticos, dessa maneira permitindo o desenvolvimento de formulações em nanopartícula. Estudos futuros serão necessários para avaliar estratégias de administração de tRNA ideais para cada tipo de tecido e doença, onde esforços provavelmente se beneficiarão de tecnologias rapidamente em expansão para administração de ácido nucleico.

[228] Agentes que suprimem PTCs têm o potencial de também produzir read-through de códons de parada nativos. Os dados de tração de perfil de RNA apresentados aqui sugerem que esse, geralmente, não é o caso nas células e para o tRNA com códon editado que foram testados. Embora read-through detectável tenha sido encontrado com Arg-tRNAUGA e Gln-trNAUAA, nenhum efeito significante sobre término de tradução global foi medido com Glu-tRNAUAG, UGA-Gly-tRNAUUGA e Trp-tRNAUGA. Esse comportamento não segregou obviamente com o tipo de códon de parada ou a atividade de supressão de PTC intrínseca do tRNA. Uma razão potencial que ACE-tRNA promove ineficazmente read-through em códons de parada reais pode ser devido a visões de sequência contextual próximo das terminações de tradução44. Essa possibilidade é suportada pela constatação que a composição de complexos de terminação em PTCs difere daquelas das paradas nativas45, 46. No entanto, em casos onde read-through de nível menor ocorre, há múltiplos mecanismos celulares no local para limitar ambos read-through de parada normal e efeitos danosos do mesmo. Códons de parada em estrutura múltiplos são frequentemente encontrados nas extremidades de genes37-39 e ubiquitina ligases especializadas47 e vias associadas a ribossomos48 são conhecidas identificar e degradar proteínas com terminação de tradução errônea. Não obstante, apesar do impacto limitado visto aqui em células de mamífero, experimentos de traçado de perfil ribossomal similares devem ser realizados no tipo de célula ou tecido desejado para administração e expressão de ACE- tRNA.

[229] Estudos anteriores mostraram que a sequência de mRNA circundante influencia a eficácia de supressão de códon de parada inerente de aminoglicosídeo e Ataluren PTC49-52, e ACE-tRNA pode ser similarmente afetado. Ainda, embora estratégias de adição de gene para substituir um gene contendo PTC, através de administração viral ou não viral, tenham atingido benefício a curto prazo em alguns cenários, pode ser difícil regular níveis de expressão de transgene. Em contraste, a abundância de resgate de proteína através de supressão de ACE-tRNA é acoplada a níveis de RNA celular nativo, e então níveis superiores de expressão serão intrinsicamente regulados. O propósito biológico permanece desconhecido para a maioria das sequências de tRNA isoaceitadoras variáveis no genoma humano, e quase metade desses genes foi especulada ser pseudogenes transcripcionalmente silenciosos53, no entanto, os dados sugerem aqui que muitos tRNA anotados são viáveis. Consistente com essa possibilidade, uma abordagem de supressão foi usada para identificar tRNAs isodecodificadores funcionais dentro de famílias isoaceitadoras Ser e Leu54. Os dados apresentados aqui demonstram ainda mais que a maioria de sequências de gene de tRNA suporta atividade viável quando removidas do contexto genômico, aprofundando mais o mistério da necessidade biológica de uma pluralidade de tRNA, e uso de códon. Desta maneira, a estratégia de supressão de alto rendimento descrita aqui será útil para identificar novos tipos de sequências de tRNA com propriedades de supressão únicas, e tais estudos têm o potencial para produzir novos reagentes de RNA bem como avançar a compreensão molecular de expressão e supressão de tRNA.

MATERIAIS E MÉTODOS Plasmídeo HTC repórter sem sentido

[230] O plasmídeo parental usado foi pcDNA3.1(+). O cDNA codificando pNLuc Gibson Assembly (New England Biolabs, USA) em sítios de restrição HindIII e XhoI. Uma glicina (códon gga), triptofano (tgc), âmbar (tag), opala (tga) e ocre (taa) foram adicionados à posição de aminoácido 160 durante PCR de cDNA. A sequência poliA de pcDNA3.1(+) foi substituída por uma sem quaisquer sítios de restrição BbsI usando Gibson Assembly baseado em PCR. O sítio de clonagem Golden Gate de ACE-tRNA de alto rendimento foi gerado primeiro inserindo a sequência líder 5’ do gene tRNATyr humano (em negrito) com uma sequência de promotor T7 a montante (itálico) (TAATACGACTCACTATAGAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACC TCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC) (Ye e outros, 2008) seguido por dois sítios de restrição BbsI (itálico e negrito) (TAGTCTTCGG (cassete ccdB) AAGAAGACCG) e sequência de terminação 3’ (negrito) seguido por uma sequência de primer T3 reverso (itálico) (GTCCTTTTTTTGCTTTAGTGAGGGTTAATT). HTC de Biblioteca de ACE-tRNA

[231] Sequências de gene de tRNA foram obtidas do banco de dados de tRNA tRNAscan-SE (http://gtrnadb.ucsc.edu/index.html; PMID: 26673694). As sequências de todos os genes de tRNA usados nesse estudo são numeradas na Figura 26 e na Tabela 9. Sequências de tRNA foram sintetizadas como Ultramers complementares da Integrated DNA Technologies (IDT, USA) em formato de 96 poços em escala de 200 pmol com seus anticódons correspondentes mutados apropriadamente (UAG, UGA ou UAA). Todas as sequências de tRNA foram sintetizadas com sobreposições de CGAC e GGAC (anotadas 5’- >3’) em oligos avançado e reverso, respectivamente. Ultramers foram anelados ressuspendendo em tampão de anelamento (Acetato de Potássio 100 mM; HEPES 30 mM, pH 7,5) para 100ng/µl, aquecidos para 96º C por 2 min e esfriados a 1º C/min em um termociclador para 4º C. Em placas de PCR de 96 poços, cada poço continha 10ng de plasmídeo HTC com códon de PTC apropriado, 2ng de dúplex de ACE- tRNA, ATP 1mM, DTT 10mM, 400 Unidades de T4 DNA Ligase e 10

Unidades de BbsI-HF, acumulados para 10ul com ddH2O. As placas de 96 poços foram cicladas como segue ([5 min @37º C, 5 min @20º C] x 30 ciclos, 10 min @ 37º C, 10 min @ 80º C e esfriadas para 4º C em um termociclador. Em uma placa de 96 poços com poço profundo 1ul da reação Golden Gate foi adicionado a 10ul de células quimicamente competentes DH5α (ThermoFisher, USA), sofreram choque térmico @42º C por 30 seg e ressuspensas em 100ul de Super Optimal Broth (S.O.C.; Thermofisher, USA). As transformações foram deixar crescer em excesso a 37º C por 1h, 250 rpm e então adicionadas a 2ml de meio líquido Luria-Bertani (LB) suplementado com 100ug/ml de Carbenicilina e cultivadas em placas de 48 poços profundos coberta @ 37º C por 20hrs, 300 rpm. Crescimento em excesso de E. coli foi realizado em placas de poço profundo e grampos da Enzyscreen (http://www.enzyscreen.com). Culturas de suspensão de E. coli foram giradas (10min, 4000g em TA) e DNA de plasmídeo foi preparado e diluído para 125ng/µl (IBI scientific, USA). Todos os clones tiveram a sequência verificada. Usando esse método, 100% de eficiência de clonagem foram obtidos. HTS de biblioteca de ACE-tRNA

[232] No dia antes da transfecção, células HEK293 (<40 passagens) foram plaqueadas a 1,4 x 104 células/poço em placas tratadas com cultura celular de 96 poços em Meio Essencial Modificado com da Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS 10%, Pen/Estrep 1% e 2mM de L-Glutamina (Thermofisher, USA). O repórter sem sentido all- in-one com genes de ACE-tRNA foram transfectados em triplicata/placa usando Calfectin (Signagen, USA). 16 h pós-infecção, o meio foi aspirado e 20ul de PBS foram adicionados a cada cavidade. 15ul de Reagente de Ensaio de Luciferase Nano-Glo® foram adicionados a cada poço (1:50 de reagente para tampão; Promega, USA). As placas foram incubadas por 2 minutos após agitação rotacional e lidas usando uma leitora de placa SpectraMax i3 (Molecular Devices, USA; tempo de integração, 200ms; todos os comprimentos de onda coletados em modo de ponto final). Luminescência teve a média tirada em todos os três poços para cada experimento e todos os ACE-tRNAs foram repetidos >3 vezes dessa maneira. Cada placa continha em triplicata poços transfectados com o repórter sem sentido all-in-one sem nenhum ACE- tRNA para servir como controle para eficiência de transfecção e read- through de PTC de linha basal. Todos os valores são reportados como razões de luminescência de ACE-tRNA com relação à luminescência de read-through de PTC de linha basal ± SEM. ANOVAs de variância simples foram realizadas em análises post-hoc de Tukey em todos os ACE-tRNAs em uma dada família de aminoácido. Plasmídeos de expressão de CFTR, HDH-his-strep e 4xACE-tRNA

[233] Para expressão em células de mamífero, o cDNA para a região de codificação e 200 pares de base da região não traduzida 3’ (UTR) de CFTR humana foi ligado a pcDNA3.1(+) (Promega, USA) usando as enzimas de restrição KpnI e XbaI. As mutações G542tga e W1282tga foram introduzidas usando QuickChange XL II (Stratagene, USA). Para expressão em oócitos de Xenopus laevis, o cDNA para a região de codificação e 140 pares de base da 5’ e 244 pares de base da 3’ UTR de CFTR humano foi ligado a pGEM-HE (Promega, USA). Ambas as mutações G542tga e W1282tga foram introduzidas usando QuickChange XL II. O cDNA codificando a histidinol desidrogenase de E. coli foi otimizado no códon para mus musculus e sintetizado (bioBasic Inc., Canadá) com um marcador 8xHis-sstrep c-terminal para purificação de proteína a partir de células de mamífero. O cDNA sintetizado foi ligado a pcDNA3.1(+) usando sítios de restrição EcoRI e XhoI. O marcador de mutações sem sentido, taa e tga, foram introduzidos usando QuickChange XL II. Para gerar plasmídeos de expressão de ACE-tRNA multiplexados, um plasmídeo pUC57(amp) Golden Gate parental novo foi gerado inserindo um “sítio de clonagem múltiplo” BbsI (5’-

GAATTCTTCCCGAGACGTTCCAAGTCTTCATGAAGACTACAGGCGT CTCCCAGGAAGCT-3’; sequências de reconhecimento de BbsI direcionais estão em itálico e sobreposições de quatro pares de base únicas para ligação estão em negrito) entre os sítios de restrição EcoRI e HindIII. pUC57(amp) foi escolhido como um plasmídeo parental porque ele é de tamanho relativamente pequeno e não tem sítios de restrição de BbsI da estrutura principal e sequência de promotores T7 e T3. Uma característica incluída no plasmídeo HTS é a sequência de promotores T7 e T3 flanqueando o cassete de ACE-tRNA, fornecendo sequências de ligação de primer universal com temperaturas de fusão comparáveis (Tm), ideais para amplificação por PCR. Usando a NEB Golden Gate Assembly Tool (https://goldengate.neb.com/editor) primers de PCR foram gerados, os quais anelaram para a sequência de flanqueamento de T7 e T3 e criaram sobreposições de quatro pares de base únicas seguindo clivagem de sequência de reconhecimento de BbsI distal. O resultado final foi a geração de quatro produtos de PCR de ACE-tRNA usando primers de PCR universais que poderiam ser “encadeados” através de sobreposições de quatro pares de base complementares e ligados ao plasmídeo Golden Gate puc57 usando a reação Golden Gate de um recipiente. Todos os clones tiveram a sequência verificada. Cultura de célula, expressão de proteína e Western blot

[234] Células HEK293T (ATCC, USA) foram cultivadas em meio de crescimento padrão contendo (% em v/v) de FBS 10% (HiClone, USA), Pen Estrep 1%, L-Glut 1% em DMEM com alto teor de glicose (Gibco, USA) a 37º C, CO2 5%. cDNA foi transfectado a 75% de confluência usando Calfectin de acordo com protocolos padrão (SignaGen Laboratories, USA). Seguindo 36 h, as células foram raspadas e peletizadas a 7.000g por 8 min a 4º C em PBS suplementado com 0,5 µg/ml de pepstatina, 2,5 µg/ml de aprotinina, 2,5 µg/ml de leupeptina, PMSF 0,1 mM, benzamidina 0,75 mM. Para células expressando CFTR, o pelete de célula foi vigorosamente homogeneizado por meio de um douncer em sacarose 100 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, pepstatina 0,5 µg/ml, aprotinina 2,5 µg/ml, leupeptina 2,5 µg/ml, PMSF 0,1 mM, benzamidina 0,75 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 e centrifugados a 100.000 g para separar membranas totais das proteínas citosólicas solúveis. Os peletes foram solubilizados em um tampão contendo Triton 1%, NaCl 250 mM, tris-HCl 50 mM pH 7,4 e pepstatina 0,5 µg/ml, aprotinina 2,5 µg/ml, leupeptina 2,5 µg/ml, PMSF 0,1 mM, benzamidina 0,75 mM. Lisato de célula igual foi carregado em um gradiente de separação 3-15% SDS-Page com gel de empilhamento 4% na presença de 1% de 2-mercaptoetanol, separado a 55 V de um dia para o outro e transferido para PVDF LF 0,45 µM (Bio-Rad, USA). PVDF sofreu immunoblot usando anticorpo anti-CFTR M3A7(1:1000; Millipore, USA) em leite desnatado 2% e imagem feita em Li-COR Odyssey Imaging System (LI-COR, USA). Para células expressando HDH-His-Strep, o pelete de célula foi vigorosamente homogeneizado por meio de douncer em sacarose 100 mM, DTT 1mM, EDTA 1 mM, tris- HCl 20 mM pH 8,0, 0,5 µg/ml de pepstatina, 2,5 µg/ml de aprotinina, 2,5 µg/ml de leupeptina, 0,1 mM de PMSF e 0,75 mM de benzamidina. O lisato foi centrifugado a 100.000 g por 30 min a 4º C. O sobrenadante (proteína celular solúvel) foi separado em géis de acrilamida Bis-Tris SDS-page 4-12% (ThermoFisher, USA) na presença de 1% de 2- mercaptoetanol, transferido para 0,22 µM de LF PVDF (Bio-Rad, USA) e sofreu immunoblot usando anticorpo anti-Strep (1:5000; iba, Alemanha) em leite desnatado 2% e imagem feita em LI-COR Odyssey Imaging System (LI-COR, USA). Espectrometria de Massa

[235] Dados de fragmentação em proteína HDH-His-Estrep purificada foram obtidos na University of Iowa Proteomics Facility. Em suma, proteína HDH-His-strep da fração solúvel da rotação de alta velocidade foi passada através de colunas StrepTrap HP (GE Healthcare, Suécia) e lavada com 5 volumes de coluna de sacarose 100 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, tris-HCl 20 mM pH 8,0, 0,5 µg/ml de pepstatina, 2,5 µg/ml de aprotinina, 2,5 µg/ml de leupeptina, PMSF 0,1 mM e benzamidina 0,75 mM. A proteína foi eluída em tampão de lavagem suplementado com d-Desthiobiotin 10 mM e concentrada em colunas de filtragem Amicon-Ultra de corte de 30 kDa (Millipore, USA). A proteína concentrada foi carregada em géis de prefundição NuPage Bis-Tris 4-12% (Invitrogen, USA) e separada a 150V por 1,5 h. O gel foi tingido usando um estojo de tingimento prata compatível com espectrometria de massa (ThermoFisher Scientific, USA).

[236] Digestão com Tripsina Em gel. Em suma, as faixas de proteína direcionadas de gel de SDS-PAGE foram excisadas manualmente, cortadas em pedaços de 1 mm3 e lavadas em bicarbonato de amônio 100 mM:acetonitrila (1:1, v/v) e bicarbonato de amônio 25 mM/acetonitrila (1:1, v/v), respetivamente para obter retirada de tingimento completa. Após secagem, os pedaços de gel foram reduzidos em 50 µl de DTT 10 mM a 56º C por 60 min e então alquilados por IAM 55 mM por 30 min em temperatura ambiente. Os pedaços de gel foram lavados com bicarbonato de amônio 25 mM:acetonitrila (1:1, v/v) duas vezes para remover DTT e IAM em excesso. Após secagem, os pedaços de gel foram postos em gelo em 50 µL de solução de tripsina a 10 ng/µL em bicarbonato de amônio 25 mM e incubados em gelo por 60 min. Então, digestão foi realizada a 37º C por 16 h. Extração de peptídeo foi realizada duas vezes por 0,5 hora com 100 µl de acetonitrila 50%/ácido fórmico 0,2%. Os extratos combinados foram concentrados em um Spped Vac para ~15 ul.

[237] LC-MS/MS. Os dados de espectrometria de massa foram coletados usando um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos

(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) acoplado a um Eksigent Ekspert™ nanoLC 425 System (Sciex). Um Trap-Elute Jumper Chip (P/N:800-00389) e um acoplado a um carregamento direcionado Valco de 10 portas 1/16” realizado pela bomba de gradiente 1 e eluição final (pela bomba de gradiente 2). A montagem da coluna foi projetada como duas colunas de 75 µm x 15 cm em tandem (ChromXP C18-CL, 3 µm 120A, Eksigent parte da AB SCIEX) montadas no sistema Ekspert™ cHiPLC. Para cada injeção, uma estimada de 0,5 µg de digesta total foi carregada. Os peptídeos foram separados em linha com o espectrômetro de massa usando um gradiente de 120 min composto de segmentos lineares e estáticos em que o Tampão A é ácido fórmico 0,1% e B é ACN 95%, ácido fórmico 0,1%. O gradiente começa mantendo a 4% por 3 min, então faz as transições que seguem (26, 48), (35, 58), (35, 64), (50, 72), (50, 78), (94, 84), (94, 96), (4, 100), (4, 120).

[238] Espectrometria de massa em tandem em LUMOS Orbitrap. Sequências de varredura começam com uma pesquisa completa (m/z 350-1500) adquirida em um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos (Thermo) em uma resolução de 60.000 nos segmentos Orbitrap fora do eixo (MS1). A cada 3 segundos do gradiente varreduras MS1 foram adquiridas durante o gradiente de 120 min descrito acima. Os precursores mais abundantes foram selecionados dentre íons de estado de carga 2-8 em um limiar de 2,0E5. Os íons foram dinamicamente excluídos por 30 segundos se eles foram direcionados duas vezes nos 30 seg anteriores. Íons selecionados foram isolados através de um quadrupolo de múltiplos segmentos com uma janela de massa em m/z 2, então sequencialmente submetidos a ambas condições de ativação CID e HCD no IT e no multipolo de roteamento de íon, respectivamente. O alvo de AGC para CID foi

4.0E04, energia de colisão de 35%, uma ativação Q de 0,25 e um tempo de preenchimento máximo de 100 milissegundos. Precursores direcionados foram também fragmentados por dissociação induzida por colisão de alta energia (HCD) a 40% de energia de colisão, e uma ativação Q de 0,25. Íons de fragmento de HDC foram analisados usando o Orbitrap (AGC 1.2E05, tempo de injeção máximo 110ms e ajuste de resolução para 30.000 a 400 Th). Ambos os canais foram registrados como centroides e as varreduras de pesquisa de MS1 foram registradas em modo de perfil.

[239] Pesquisas Proteômicas. Pesquisas espectrais iniciais realizadas com Proteome Discoverer versão 2.1.1.21 (ThermoFisher Scientific, USA) usando Sequest HT. Os espectros foram também pesquisados com Byonic search engine (Protein Metrics) ver. 2.8.2. Bancos de dados de pesquisa eram compostos da Uniprot KB para espécies 9606 (Humano) baixado em 24/10/2016 contendo 92645 sequências e Uniprot KB para taxonomia 562 (E. coli) baixado em 08/11/2016 contendo 10079 sequências. Para pesquisas Byonic, essas duas bases de dados foram diretamente concatenadas. Em qualquer pesquisa um número igual de falsas entradas foi criado e pesquisado simultaneamente ao reverter as entradas originais nos bancos de dados-alvo.

[240] Transcrição de cRNA in vitro. Plasmídeos G542UGA, W1282XUGA e WT CFTR pGEMHE (Mense e outros, 2006; PMID:1703051) foram linearizados por excesso de 10x de enzima de restrição NheI-HF (sítio posicionado 3’ de região de codificação) (New England BioLabs, USA) por 3 h a 37º C e purificados usando métodos de precipitação de cDNA padrão. Todos os cRNAs foram transcritos usando o mMessage mMachine T7 Kit (ThermoFisher Scientific, USA). Purificação do cRNA a partir da reação de transcrição foi conduzida em colunas do RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha). A concentração foi determinada através de medições de absorbância a 260 nm e qualidade foi confirmada em um gel de agarose 1% (livre de RNase). Todo cRNA foi acumulado para 1 µg/ml antes do uso e todos os resultados foram gerados a partir de ≥2 preparações de cRNA.

[241] Transcrição de tRNA in vitro. Trpch17.trna39 e Glychr19.trna2, os melhores ACE-tRNAs de Trp e Gly, foram transcritos in vitro usando CellScript T7-Scribe Standard RNA IVT Kit (CELLSCRIPT, USA). Concentração equimolar de oligo T7 (5’- taatacgactcactata-3’) foi anelada para Ultramers purificados com ACE- tRNA PAGE (20 ug; Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) codificando o ACE-tRNA e precedido pelo promotor T7 (itálico). Importante, os três nucleotídeos terminais contendo CCA foram incluídos (negrito). Trpchr17.trna39 (3’->5’):

TGGTGACCCCGACGTGATTTGAACACGCAACCTTCTGATCTGAAGTC

AGACGCGCTACCGTTGCGCCACGAGGCCTATAGTGAGTCGTATTA Glychr19.trna2 (3’->5’):

TGGTGCGTTGGCCGGGAATCGAACCCGGGTCAATGCTTTGAAGG AGCTATGCTAACCATATACCACCAACGCTATAGTGAGTCGTATTA

[242] O volume de reação total foi ajustado para 100 µl e os reagentes do estojo foram adicionados nas quantidades que seguem: 10 µl de tampão de transcrição 10X T7-Scribe, 7,5 µl de cada nucleotídeo (estoques de 100 mM), 10 µl de Ditiotreitol 100 mM, 2,5 µl de ScriptGuard RNAse Inhibitor, 10 µl de solução de enzima T7-Scribe. Após a reação ter sido incubada por 4-5 h a 37º C, o modelo de DNA foi digerido com 5 µl de DNase (1 U/µl) provido com o estojo por 30-60 min. O ACE-tRNA foi extraído da reação com fenol ácido clorofórmio (5:1, pH 4,5) e precipitado com etanol. O ACE-tRNA precipitado foi peletizado, lavado, seco e ressuspenso em 100 µl de água tratada com DEPC e purificado mais com colunas Chroma Spin-30 (Clontech, USA). O procedimento forneceu aproximadamente 100 µl de ~5 µg/µl de ACE- tRNA. ACE-tRNAs foram novamente peletizados em alíquotas de 20ug,

lavados, liofilizados e armazenados a -80º C até uso. Todos os resultados foram gerados a partir de ≥2 preparações de ACE-tRNA.

[243] Preparação de Biblioteca de Traçado de Perfil de Pegada de Ribossomo. Células HEK293 transientemente transfectadas com ACE-tRNAs e plasmídeo controle (puc57GG) foram cultivadas em meios de crescimento padrão na ausência de Pen-Strep por 48 h. As bibliotecas foram preparadas como descrito55, com poucas modificações. Em suma, as células foram rapidamente resfriadas através da adição de PBS gelado, lisadas em tampão de lise (Tris-HCl 20 mM/pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, Triton X-100 1% (v/v) e Turbo DNase I 25 U ml-1) por 10 minutos em gelo, e trituradas dez vezes através de agulhas de 26-G. Após separação por centrifugação a 16.000g por 10 min a 4º C, os lisatos foram digeridos com RNase I 100 U (Ambion, USA) por lisato A260 em temperatura ambiente por 45 min e com agitação suave antes da adição de RiboLock RNase Inhibitor 200 U (Thermo Scientific). Fragmentos de mRNA protegidos com ribossomo foram então isolados carregando lisatos em uma almofada de sacarose 1M preparada em tampão de polissoma modificado (Tris-HCl 20 mM/pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 8,5 mM, DTT 0,5 mM, RiboLock RNase Inhibitor 20 U ml-1) e centrifugados a 70.000 rpm a 4º C por 2 h usando um rotor Beckmen TLA-110. Peletes de ribossomo contendo pegadas de mRNA foram extraídos usando TRIzol e separados em um gel de poliacrilamida 12% de desnaturação contendo ureia 8M. Fragmentos de RNA com tamanhos variando de 26 a 34 nt foram manualmente excisados do gel tingido com SYBR Gold (Invitrogen) e isolados para gerar biblioteca de fragmento protegido com ribossomo. Fragmentos de rRNA contaminantes depletados usando um Ribo-Zero kit (Illumina). Ligação de adaptador de 3’ Oligonucleotídeo, transcrição reversa, circularização e depleção de rRNA secundário usando oligos de depleção de rRNA biotinilados (Tabela 9) foram realizadas como descrito55. As bibliotecas foram codificadas com código de barras usando primers de indexação para cada amostra durante amplificação por PCR. Bibliotecas com códigos de barras foram então agrupadas com PhiX 3% (Illumina) e sequenciadas em um Illumina NextSeq 500 de acordo com o protocolo do fabricante para tipicamente gerar 18-27 milhões de leituras por amostra.

[244] Análise de Dados de Pegada de Ribossomo. Arquivos de dados para cada amostra com código de barras (menos sequência adaptadora na extremidade 3’) foram primeiro mapeados para quatro sequências de rRNA (RNA5S1;NR_023363, RNA5-8SN5; NR_003285, RNA18SN5;NR_003286 e RNA28SN5;NR_003287) usando HISAT 56

2.0.3 para eliminar leituras contaminantes de rRNA. As leituras restantes foram alinhadas com os filamentos de sentido da variante de transcrito mais longa de cada gene humano (UCSC RefSeq GRCh38). Transcritos com comprimento de 3’UTR de pelo menos 75 nt (18.101 sequências) foram usados para análise de subsequência. Um máximo de duas incompatibilidades na extremidade 5’ de leituras foi permitido. Todas as leituras multimapeadas foram descartadas. Leituras de fragmento com comprimentos entre 26 a 34 nt foram definidas como pegadas de ribossomo e usadas para análise. O nucleotídeo da extremidade 5’ de cada pegada foi anotado e mapeado em cada transcrito. Posição do sítio A do ribossomo ocupando os nucleotídeos 16º-18º de cada pegada57,58 foi usada para inferir a posição do ribossomo em cada transcrito. RPKM (Leituras Por Quilobase de pegada de transcrito por Milhão de leituras mapeadas no total) em cada transcrito individual (18.101 sequências) foi calculada. Apenas transcritos com um limiar mínimo de 5 RPKM na sequência de codificação e 0,5 RPKM em região de 3’UTR em duas bibliotecas de réplica (254 transcritos em G418 e 495-748 transcritos em ACE-tRNAs) foram incluídos para análise na Figura 24A. Para gráficos de metagene de transcriptoma amplo na Figura 2B, contagens de pegada para cada nucleotídeo dentro da região de -35 a +65 nt em relação ao primeiro nucleotídeo de códon de parada foram normalizadas de acordo com milhão de leituras mapeadas no total. Todos os transcritos (18.101 sequências) foram usados para mapeamento, e mais de 5.200 transcritos foram mapeados para pelo menos 1 pegada na região de interesse. Em seguida, a bioatividade in vivo de ACE-tRNAs Glychr19.trna2 e Trpchr17.trna29 foi examinada para resgatar PTC. Os dados de sequenciamento foram analisados usando a plataforma Galaxy59. Gráficos foram gerados usando Prism 7 (GraphPad Software).

[245] Geração de linhagens de célula repórter NLuc estáveis. Os cDNAs codificando pNLuc com códons de parada tag, taa e tga na posição de aminoácido 160 foram inseridos em sítios de restrição AgeI e NotI dentro do sítio de clonagem múltiplo do vetor retroviral pQCXIP (Clontech, USA) usando Gibson Assembly (New England Biolabs, USA). Células PhoenixGP (PMID: 7690960) foram cotransfectadas com plasmídeos pNLuc-STOP-pQCXIP e cmv-VSV-G (pseudotipificação do envelope VSV-G) usando Calfectin (SignaGen Laboratories, USA) e postas em uma incubadora de célula controlada com CO2 a 33º C (5%) por 48 h. O meio de cultura (20 ml) contendo partículas retrovirais foi arrefecido para 4º C e girado a 10.000 g para remover restos de células e filtrado em um filtro de seringa de membrana de MCE 0,45 um (Millipore, USA) em placas de 10 cm semeadas com células HEK293 de baixa passagem a 30% de confluência. Placas de cultura celular foram seladas com Parafilm e giradas por 90 minutos a 3.500 g a 24º C e postas em uma incubadora de cultura celular controlada com CO2 (5%) a 37º C. As células foram selecionadas 24 h depois com puromicina (1 ug/ml) até que a placa de controle (nenhuma infecção) mostrou morte celular completa. As células foram monodispersas em placas de 96 poços usando FACS e populações clonais foram subsequentemente.

Puromicina não foi usada para manter clones selecionados durante experimentação e meio DMEM padrão (DMEM-Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco com alto teor de glicose com L-glutamina suplementada com FBS 10%, Pen/Estrep 1% e L-Glutamina 2 mM; ThermoFisher, USA) foi usado em todos os estudos.

[246] Transfecção de RNA. Células HEK293 expressando estavelmente pNLuc-UGA foram plaqueadas a 1,4 x 104 células/poço em placas tratadas com cultura de célula de 96 poços em Meio Essencial Modificado com da Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS 10%, Pen/Strep 1% e L-Glutamina 2 mM (ThermoFisher, USA). 16- 24 h depois as células foram transfectadas com ACE-tRNAs usando lipofectamina 2000 (ThermoFisher Scientific, USA). Em suma, 3 µg de ACE-tRNA foram suspensos em 150 µl de OptiMEM e 12 µl de Lipofectamine 2000 foram misturados com 150 ul de OptiMEM. Os volumes foram combinados, misturados totalmente e incubados por 10 min em TA. 75 ul do complexo de transfecção foram adicionados a cada poço. Supressão de PCT por transcritos de ACE-tRNA foi quantificada como acima descrito.

[247] Expressão em oócitos de Xenopus laevis. Oócitos de Xenopus laevis (estágios V e VI) foram comprados da Ecocyte (Austin, TX). Antes da injeção, cada pelete de ACE-tRNA foi ressuspenso em 2 µl de ddH2O e restos foram peletizados a 21.000 x g, 4º C por 25 min. Para determinar a resposta de dose de ACE-tRNAs em resgate de canal de CFTR, diluições seriais foram geradas de alíquotas de ACE-tRNA (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 e 1,562 ng/oócito) equilibradas em volume com ddH2O. Em todos os experimentos, 25 ng de cRNA CFTR foram injetados por oócito e os volumes de injeção foram 50 nl. ddH2O não foi usado em quaisquer experimentos de controle de base de ACE- tRNA. Após injeção, oócitos foram mantidos em OR-3 (meio de Leibovitz 50%, 250 mg/ml de gentamicina, L-glutamina 1 mM, HEPES 10 mM (pH

7,6)) a 18º C por 36 h.

[248] Registros de braçadeira de tensão de dois eletrodos (TEVC). Correntes Cl- CFTR foram registradas em solução de banho ND96 que continha (em mM): 96 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl2 e 5 HEPES (pH 7,5) na presença de um coquetel de ativação de CFTR máximo, forscolina (10 µM; ativador de adenilato ciclase) e 3-isobutil-1- metilxantina (1 mM; inibidor de fosfodiesterase). Microeletrodos de vidro retrocheio com KCl 3 M tinha resistências de 0,5-2 MΩ. Os dados foram filtrados a 1 kHz e digitalizados a 10 kHz usando um Digidata 1322A controlado pelo software pClamp 9.2 (Molecular Devices, USA). Correntes de CFTR foram elicitadas usando etapas de tensão de 5 mV de -60 a +35 mV usando um amplificador de braçadeira de tensao OC- 725C (Warner Instrumens, USA). Oócitos onde a corrente Cl- CFTR reverteu positiva de -20 mV foram descartados. Software Clampfit 9.2 foi usado para análise de corrente. Todos os valores são apresentados como média ± SEM.

[249] Animais e imagem in vivo. Camundongos Nu/J foram comprados da Jackson labs. Os experimentos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee no Wistar Institute (número do protocolo: 112762). Os camundongos foram tratados através de injeção de 10-20 ug de DNA ressuspenso em 30 ul de água no músculo anterior tibial seguido por eletroporação. 10ug pNano-TGA + 10ug Arg de ACE-tRNA (tíbia anterior direita) ou 10ug de pNano-TGA + 10ug de pUC57 vazio (tíbia anterior esquerda) foram injetados em 3 camundongos. Como controles, 3 outros camundongos foram injetados com 10 ug de pNano-WT (tíbia anterior direita; controle positivo) ou água (tíbia anterior esquerda; controle negativo). O DNA foi formulado com 333 IU/ml de hialuronidase (Sigma). Um minuto após injeção de DNA, eletroporação com dispositivo CELLECTRA 3P (Inovio Pharmaceuticals) foi realizada. Atividade de nanoluciferase teve imagem feita em camundongos através da injeção de 100 ul de furimazina (diluição 40x de substrato Nano-Glo) intraperitonealmente e camundongos com imagem feita em um espectro IVIS (Perkin Elmer) 5 minutos após injeção.

Imageamento foi com filtro aberto e imagens foram adquiridas em 40 segundos.

As imagens foram analisadas usando Living Image Software (Perkin Elmer). Tabela 9. Biblioteca de sequências anotadas de tRNA avaliado quanto à atividade de subpressão de PTC.

Texto em itálico para cada sequência mostra o sítio de adição de anticódon.

Texto em negrito indica tRNAs com atividade de subpressão 5 vezes acima da base.

Observar que em tRNA as timidinas são substituídas com uracilas. tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO TrpTGAchr17.trna39 GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 56 1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr17.trna10 GACCTCGTGGCGCAATGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 57 2 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAGTCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr6.trna171 GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 58 3 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr12.trna6 GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 59 4 CAGAAGGcTGCGTGTTCGAATCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr7.trna3 GACCTCGTGGCGCAACGGCAGCGCGTCTGACTtcaGAT 60 5 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTGAchr7.trna31 GGCCTCATGGTGCAACAGTAGTGTGTCTGACTtcaGAT 61 6 CAGAAGGtTGTATGTTCAAATCACGTAGGGGTCA TrpTAGchr17.trna39 GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTctaGAT 62 1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTAGchr17.trna10 GACCTCGTGGCGCAATGGTAGCGCGTCTGACTctaGAT 63 2 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAGTCACGTCGGGGTCA TrpTAGchr6.trna171 GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTctaGAT 64 3 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpTAGchr12.trna6 GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTctaGAT 65 4 CAGAAGGcTGCGTGTTCGAATCACGTCGGGGTCA TrpTAGchr7.trna3 GACCTCGTGGCGCAACGGCAGCGCGTCTGACTctaGAT 66 5 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO TrpTAGchr7.trna31 GGCCTCATGGTGCAACAGTAGTGTGTCTGACTctaGAT 67 6 CAGAAGGtTGTATGTTCAAATCACGTAGGGGTCA GlyTGAchr1.trna122 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaACG 68 1 CGGGAGaCCCGGGTTCAATTCCCGGCCAATGCA GlyTGAchr2.trna25 GCGCCGCTGGTGTAGTGGTATCATGCAAGATTtcaaATT 69 2 CTTGCGaCCCGGGTTCGATTCCCGGGCGGCGCA GlyTGAchr17.trna11 GCATTGGTGGTTCAATGGTAGAATTCTCGCCTtcaACGC 70 3 AGGAGaCCCAGGTTCGATTCCTGGCCAATGCA GlyTGAchr1.trna120 GCGTTGGTGGTTTAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaATGC 71 4 GGGAGaCCCGGGTTCAATTCCCGGCCACTGCA GlyTGAchr1.trna2 GCCTTGGTGGTGCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaACG 72 5 TGGGAGaCCCGGGTTCAATTCCCGGCCAATGCA GlyTGAchr1.trna83 GGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaACGCGGGA 73 6 GaCCCGGGTTTAATTCCCGGTCA GlyTGAchr2.trna1 GTGGTCTAGTGGTTAGGATTCAGCGCTtcaACCGCCGC 74 7 AGCCCGGGTTCGATTCCCGGtCA GlyTGAchr1.random.tr GCGTCAGTGGTTTAGTGGTGGAATTCCTGCCTtcaATG 75 8 na2 CACGAGATCCGTGTTCAACTCCTGGTTGGTGCA GlyTGAchr1.trna102 GCGTCAGTGgTTTTAGTGGTGGAATTCCTGCCTtcaATG 76 9 CACGAGATCCGTGTTCAACTCCTGGTTGGTGCA GlyTGAchr1.trna16 GCGTTGGCAGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaACC 77 10 CGGGAGaCCTGGATTCCATTTCCGGCAAATGCA GlyTGAchr1.trna34 GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaACG 78 11 CGGGAGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCCATGCA GlyTGAchr1.trna61 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaACG 79 12 CGGGAGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAATGCA GlyTGAchr16.trna25 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaACG 80 13 CGGGAGGCCCGGGTTTGATTCCCGGCCAGTGCA GlyTGAchr1.trna42 GCATAGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTTGCCTtcaACG 81 14 CAGGAGGCCCAGGTTTGATTCCTGGCCCATGCA GlyTGAchr16.trna19 GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTtcaATGC 82 15 GGGCGGCCGGGCTTCGATTCCTgGCCAATGCA GlyTGAchr6.trna80 GCATGGGTGATTCAGTGGTAGAATTTTCACCTtcaATGC 83 16 AGGAGGTCCAGGTTCATTTCCTGGCCTATGCA GlyTGAchr19.trna2 GCGTTGGTGGTATAGTGGTtAGCATAGCTGCCTtcaAAG 84 17 CAGTTGaCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAACGCA GlyTGAchr1.trna107 GCGTTGGTGGTATAGTGGTgAGCATAGCTGCCTtcaAA 85 18 GCAGTTGaCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAACGCA tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO GlyTGAchr17.trna9 GCGTTGGTGGTATAGTGGTaAGCATAGCTGCCTtcaAA 86 19 GCAGTTGaCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAACGCA GlyTGAchr1.trna75 GCGTTGGTGGTATAGTGGTgAGCATAGTTGCCTtcaAAG 87 20 CAGTTGaCCCGGGCTCGATTCCCGCCCAACGCA GlyTGAchr1.trna75- GCGTTGGTGGTATAGTGGTgAGCATAGTTGCCTtcaAAG 88 21 mod CAGTTGaCCCGGGCTCGATTCCCGgCCAACGCA ArgTGAchr6.trna6 GGGCCAGTGGCGCAATGGAtAACGCGTCTGACTtcaGA 89 1 TCAGAAGAtTCCAGGTTCGACTCCTGGCTGGCTCG ArgTGAchr3.trna8 GGGCCAGTGGCGCAATGGAtAACGCGTCTGACTtcaGA 90 2 TCAGAAGAtTCTAGGTTCGACTCCTGGCTGGCTCG ArgTGAchr6.trna115 GGCCGCGTGGCCTAATGGAtAAGGCGTCTGATTtcaGA 91 3 TCAGAAGAtTGAGGGTTCGAGTCCCTTCGTGGTCG ArgTGAchr17.trna21 GACCCAGTGGCCTAATGGAtAAGGCATCAGCCTtcaGA 92 4 GCTGGGGAtTGTGGGTTCGAGTCCCATCTGGGTCG ArgTGAchr17.trna16 GCCCCAGTGGCCTAATGGAtAAGGCACTGGCCTtcaAA 93 5 GCCAGGGAtTGTGGGTTCGAGTCCCACCTGGGGTA ArgTGAchr17.trna19 GCCCCAGTGGCCTAATGGAtAAGGCACTGGCCTtcaAA 94 6 GCCAGGGAtTGTGGGTTCGAGTCCCACCTGGGGTG ArgTGAchr16.trna3 GCCCCGGTGGCCTAATGGAtAAGGCATTGGCCTtcaAA 95 7 GCCAGGGAtTGTGGGTTCGAGTCCCACCCGGGGTA ArgTGAchr7.trna5 GCCCCAGTGGCCTAATGGAtAAGGCATTGGCCTtcaAA 96 8 GCCAGGGAtTGTGGGTTCGAGTCCCATCTGGGGTG ArgTGAchr16.trna13 GCCCCAGTGGCCTGATGGAtAAGGTACTGGCCTtcaAA 97 9 GCCAGGGAtTGTGGGTTCGAGTTCCACCTGGGGTA ArgTGAchr15.trna4 GGCCGCGTGGCCTAATGGAtAAGGCGTCTGACTtcaGA 98 10 TCAGAAGAtTGCAGGTTCGAGTCCTGCCGCGGTCG ArgTGAchr6.trna4 GACCACGTGGCCTAATGGAtAAGGCGTCTGACTtcaGAT 99 11 CAGAAGAtTGAGGGTTCGAATCCCTCCGTGGTTA ArgTGAchr17.trna17 GACCGCGTGGCCTAATGGAtAAGGCGTCTGACTtcaGA 100 12 TCAGAAGAtTGAGGGTTCGAGTCCCTTCGTGGTCG ArgTGAchr6.trna3 GACCACGTGGCCTAATGGAtAAGGCGTCTGACTtcaGAT 101 13 CAGAAGAtTGAGGGTTCGAATCCCTTCGTGGTTA ArgTGAchr6.trna125 GACCACGTGGCCTAATGGAtAAGGCGTCTGACTtcaGAT 102 14 CAGAAGAtTGAGGGTTCGAATCCCTTCGTGGTTG ArgTGAchr9.trna5 GGCCGTGTGGCCTAATGGAtAAGGCGTCTGACTtcaGA 103 15 TCAAAAGAtTGCAGGTTTGAGTTCTGCCACGGTCG ArgTGAchr1.trna10 GGCTCCGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAga 104 16 ggctgaaggcATTCAAAGGtTCCGGGTTCGAGTCCCGGCG tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

GAGTCG ArgTGAchr1.trna10/n GGCTCCGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAA 105 17 ointron TTCAAAGGtTCCGGGTTCGAGTCCCGGCGGAGTCG ArgTGAchr17.trna3 GGCTCTGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAgt 106 gacgaatagagcaATTCAAAGGtTGTGGGTTCGAATCCCAC 18 CAGAGTCG ArgTGAchr17.trna3/n GGCTCTGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAAT 107 19 ointron TCAAAGGtTGTGGGTTCGAATCCCACCAGAGTCG ArgTGAchr9.trna6 GGCTCTGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAgct 108 gagcctagtgtggtcATTCAAAGGtTGTGGGTTCGAGTCCCAC 20 CAGAGTCG ArgTGAchr9.trna6/no GGCTCTGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAAT 109 21 intron TCAAAGGtTGTGGGTTCGAGTCCCACCAGAGTCG ArgTGAchr11.trna3 GGCTCTGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAga 110 tagttagagaaATTCAAAGGtTGTGGGTTCGAGTCCCACCA 22 GAGTCG ArgTGAchr1.trna79 GTCTCTGTGGCGCAATGGAcgAGCGCGCTGGACTtcaA 111 23 ATCCAGAGGtTCCGGGTTCGAGTCCCGGCAGAGATG ArgTGAchr6.trna52 GGCTCTGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAgc 112 ctaaatcaagagATTCAAAGGtTGCGGGTTCGAGTCCCTCC 24 AGAGTCG ArgTGAchr6.trna52/n GGCTCTGTGGCGCAATGGAtAGCGCATTGGACTtcaAAT 113 25 ointron TCAAAGGtTGCGGGTTCGAGTCCCTCCAGAGTCG ArgTGAchr5.trna4 GGCAGCATAGCAGAGTGGTtCAGGTTACAGGTtcaAGAT 114 26 GTAAACTGAGTTCAAATCCCAGTTCTGCCA GlnTAGnmt-tRNA-Gln TGGTGTAATAGGTAGCACAGAGAATTctaGATTCTCAGG 115 1 chr10.trna6 GGTAGGTTCAATTCCTAT GlnTAGnmt-tRNA-Gln TAGGACATGGTGTGATAGGTAGCATGGAGAATTctaGA 116 2 chrX.trna1 TTCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTACAGTTCTAG GlnTAGnmt-tRNA-Gln TAGGACGTGGTGTGATAGGTAGCATGGGGAATTctaGA 117 3 chr7.trna32 TTCTCAGGGGTGGGTTCAATTCCTATAGTTCTAG GlnTAGnmt-tRNA-Gln TAGGACGTGGTGTAGTAGGTAGCATGGAGAATGctaAA 118 4 chr7.trna7 TTCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTATAGTTCTAG GlnTAGnmt-tRNA-Gln TAGGACATGGTGTAATAGGTAGAATGGAGAATTctaAAT 119 5 chr2.trna24 TCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTATAGTTCTAG GlnTAGnmt-tRNA-Gln TAGGATGTGGTGTATTAGGTAGCACAGAGAATTctaGAT 120 6 chr3.trna7 TCTCAGGGGTAGGTTCGATTCCTATAATTCTAC 7 GlnTAGnmt-tRNA-Gln TAGGACTTGGTGTAATGGGTAGCACAGAGAATTctaGAT 121 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO chr16.trna15 TCTCAGGGGTGGGTTCAATTCCTTTCGTCCTAG GlnTAGnmt-tRNA-Gln TCTAGGAtgTGGTGTGATAGGTAGCATGGAGAATTctaG 122 8 chr12.trna15 ATTCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTATaTTCTAGAA GlnTAGnmt-tRNA-Gln TAGGACGTGGTGTGATAGGTAGCATGGAGAATTctaGA 123 9 chr2.trna21 TTCTCAGGGATGGGTTCAATTCCTATAGTCCTAG GlnTAGnmt-tRNA- TAGGACGTGGTGTGATAGGTAGCACGGAGAATTctaGA 124 10 Glnchr2.trna9 TTCTCAGGGATGGGTTCAATTCCTGTAGTTCTAG GlnTAGchr6.trna1 GGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAAT 125 11 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGAACCT GlnTAGchr1.trna104 GGTTCCATGGTGTAATGGTgACCACTTTGGACTctaAAT 126 12 ACAGTGATCAGAGTTCAAGTCTCACTGGAACCT GlnTAGchr1.trna28 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGGGCTTTGGACTctaACT 127 13 ACAGTGaTCAGAGTTCAAGTCTCAGTGGGACCT GlnTAGchr12.trna3 GGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACCCTGGACTctaAAT 128 14 CCAGCAaCCAGAGTTCCAGTCTCAGCGtGGACCT GlnTAGchr5.trna23 GGTAGTGTAGTCTACTGGTTAAACGCTTGGgCTctaACA 129 15 TTAAcGtCCTGGGTTCAAATCCCAGCTTTGTCA GlnTAGchr6.trna147 GGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAAT 130 16 CCAGCGaTCCGAGTTCAAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAGchr1.trna17 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTctaAAT 131 17 CCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAGchr1.trna101 GGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACTCTGGACTctaAAT 132 18 CCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAGchr6.trna42 GGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAAT 133 19 CCGGTAaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGAACCT GlnTAGchr6.trna132 GGCCCCATGGTGTAATGGTcAGCACTCTGGACTctaAAT 134 20 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCC GlnTAGchr1.trna23 GGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACTCTGGACTctaAAT 135 21 CCAGCCATCTGAGTTCGAGTCTCTGTGGAACCT GlnTAGchr1.trna111 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTTTGGACTctaAAT 136 22 ACAGTGATCAGAGTTCAAGTCTCACTGGGACCT GlnTAGchr1.trna24 GGTTCCATGgGTTAATGGTgAGCACCCTGGACTctaAAT 137 23 CAAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGTACCT GlnTAGchr19.trna4 GTTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTctaAAT 138 24 CCAGAAATACATTCAAAGAATTAAGAACA GlnTAGchr17.trna14 GGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAAT 139 25 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT 26 GlnTAGchr6.trna63 GGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAAT 140 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO CCAGCAaTCCGAGTTCGAATCTCGGTGGGACCT GlnTAGchr6.trna175 GGCCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTctaAAT 141 27 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT GlnTAGchr6.trna82 GGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGGCTctaAAT 142 28 CCAGCAaTCCGAGTTCGAATCTTGGTGGGACCT GlnTAGchr2.trna26 GGCTGTGTACCTCAGTGGGcAAGGGTATGGACTctaAA 143 29 GCCAGACTaTTTGGGTTCAAATCCCAGCTTGGCCT GlnTAG chr4.trna4 GACCATGTGGCCTAAGGGAaAAGACATCTCACTctaGG 144 30 TCAGAAGAtTGAGGGTTCAAGTCCTTTCATGGTCA GlnTAGchr8.trna10 GGTACAGTGTTAAAGGGGagaAAAATTGCTGACTctaAA 145 31 TaCAGTAGaCCTAGGTTTGAATCCTGGCTTTACCA GlnTAAnmt-tRNA-Gln TGGTGTAATAGGTAGCACAGAGAATTttaGATTCTCAGG 146 1 chr10.trna6 GGTAGGTTCAATTCCTAT GlnTAAnmt-tRNA- TAGGACATGGTGTGATAGGTAGCATGGAGAATTttaGAT 147 2 Gln chrX.trna1 TCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTACAGTTCTAG GlnTAAnmt-tRNA- TAGGACGTGGTGTGATAGGTAGCATGGGGAATTttaGA 148 3 Glnc hr7.trna32 TTCTCAGGGGTGGGTTCAATTCCTATAGTTCTAG GlnTAAnmt-tRNA- TAGGACGTGGTGTAGTAGGTAGCATGGAGAATGttaAAT 149 4 Gln chr7.trna7 TCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTATAGTTCTAG GlnTAAnmt-tRNA-Gln TAGGACATGGTGTAATAGGTAGAATGGAGAATTttaAAT 150 5 chr2.trna24 TCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTATAGTTCTAG GlnTAAnmt-tRNA-Gln TAGGATGTGGTGTATTAGGTAGCACAGAGAATTttaGAT 151 6 chr3.trna7 TCTCAGGGGTAGGTTCGATTCCTATAATTCTAC GlnTAAnmt-tRNA-Gln TAGGACTTGGTGTAATGGGTAGCACAGAGAATTttaGAT 152 7 chr16.trna15 TCTCAGGGGTGGGTTCAATTCCTTTCGTCCTAG GlnTAAnmt-tRNA- TCTAGGAtgTGGTGTGATAGGTAGCATGGAGAATTttaGA 153 8 Gln chr12.trna15 TTCTCAGGGGTAGGTTCAATTCCTATaTTCTAGAA GlnTAAnmt-tRNA- TAGGACGTGGTGTGATAGGTAGCATGGAGAATTttaGAT 154 9 Gln chr2.trna21 TCTCAGGGATGGGTTCAATTCCTATAGTCCTAG GlnTAAnmt-tRNA- TAGGACGTGGTGTGATAGGTAGCACGGAGAATTttaGA 155 10 Glnchr2.trna9 TTCTCAGGGATGGGTTCAATTCCTGTAGTTCTAG GlnTAAchr6.trna1 GGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAATC 156 11 CAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr1.trna104 GGTTCCATGGTGTAATGGTgACCACTTTGGACTttaAAT 157 12 ACAGTGATCAGAGTTCAAGTCTCACTGGAACCT GlnTAAchr1.trna28 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGGGCTTTGGACTttaACT 158 13 ACAGTGaTCAGAGTTCAAGTCTCAGTGGGACCT 14 GlnTAAchr12.trna3 GGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACCCTGGACTttaAAT 159 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO CCAGCAaCCAGAGTTCCAGTCTCAGCGtGGACCT GlnTAAchr5.trna23 GGTAGTGTAGTCTACTGGTTAAACGCTTGGgCTttaACA 160 15 TTAAcGtCCTGGGTTCAAATCCCAGCTTTGTCA GlnTAAchr6.trna147 GGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAATC 161 16 CAGCGaTCCGAGTTCAAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr1.trna17 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTttaAAT 162 17 CCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr1.trna101 GGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACTCTGGACTttaAAT 163 18 CCAGCGaTCCGAGTTCGAGTCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr6.trna42 GGTTCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAATC 164 19 CGGTAaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGAACCT GlnTAAchr6.trna132 GGCCCCATGGTGTAATGGTcAGCACTCTGGACTttaAAT 165 20 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCC GlnTAAchr1.trna23 GGTTCCATGGTGTAATGGTaAGCACTCTGGACTttaAAT 166 21 CCAGCCATCTGAGTTCGAGTCTCTGTGGAACCT GlnTAAchr1.trna111 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTTTGGACTttaAAT 167 22 ACAGTGATCAGAGTTCAAGTCTCACTGGGACCT GlnTAAchr1.trna24 GGTTCCATGgGTTAATGGTgAGCACCCTGGACTttaAAT 168 23 CAAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGTACCT GlnTAAchr19.trna4 GTTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTttaAAT 169 24 CCAGAAATACATTCAAAGAATTAAGAACA GlnTAAchr17.trna14 GGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 170 25 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT GlnTAAchr6.trna63 GGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 171 26 CCAGCAaTCCGAGTTCGAATCTCGGTGGGACCT GlnTAAchr6.trna175 GGCCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGACTttaAAT 172 27 CCAGCGaTCCGAGTTCAAATCTCGGTGGGACCT GlnTAAchr6.trna82 GGTCCCATGGTGTAATGGTtAGCACTCTGGGCTttaAAT 173 28 CCAGCAaTCCGAGTTCGAATCTTGGTGGGACCT GlnTAAchr2.trna26 GGCTGTGTACCTCAGTGGGcAAGGGTATGGACTttaAA 174 29 GCCAGACTaTTTGGGTTCAAATCCCAGCTTGGCCT GlnTAAchr4.trna4 GACCATGTGGCCTAAGGGAaAAGACATCTCACTttaGGT 175 30 CAGAAGAtTGAGGGTTCAAGTCCTTTCATGGTCA GlnTAAchr8.trna10 GGTACAGTGTTAAAGGGGagaAAAATTGCTGACTttaAAT 176 31 aCAGTAGaCCTAGGTTTGAATCCTGGCTTTACCA GluTAAchr1.trna106 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTtAGGATTCGGCGCTttaACC 177 1 GCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA 2 GluTAAchr1.trna55 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTtAGGATTCGGCGCTttaACC 178 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

GCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGAAA GluTAAchr13.trna3 CCCCTGGTGGTCTAGTGCTtAGGATTCGGTGCTttaACC 179 3 GCTGCTGCCTGCGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAAchr8.trna1 TCCTTGATGTCTAGTGGTtAGGATTTGGTGCTttaACTGC 180 4 AGCAGCCTGGGTTCATTTCTCAGTCAGGGAA GluTAAchr2.trna18 TCCCATATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTttaACC 181 5 CAGGTGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTATGGGAA GluTAAchr1.trna92 TCCGTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTttaACC 182 6 GCCTGCAGCTCGAGTTCGATTCCTGGTCAGGGAA GluTAAchr14.trna15 CCCTGTGGTCTAGTGGCtAAGACTTTGTGCTttaATTGCT 183 7 GCAtCCTAGGTTCAATTCCCAGTCAGGGA GluTAAchr13.trna2 TCCCACATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTttaACC 184 8 CAGGCGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTGTGGGAA GluTAAchr1.trna5 TCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTttaACC 185 9 GCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAGGGAA GluTAAchr1.trna123 TCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTttaACC 186 10 GCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAAchr1.trna45 GCGTTGGTGGTGTAGTGGTgAGCACAGCTGCCTttaAA 187 11 GCAGTTAaCGCGGGTTCGATTCCCGGGTAACGAA GluTAAchr1.trna99 TCCTTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGTGCTttaACC 188 12 TGTGCGGCCCGGGTTCAATTCCCGATGAAGGAA GluTAAchr1.trna95 TGTCTGGTGGTCAAGTGGCtAGGATTTGGCGCTttaACT 189 13 GCCGCGGCCCGCGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAAchr1.trna86 TCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTttaACC 190 14 GCCTGCAGCTCGAGTTCGATTCCTGGTCAGGGAA GluTAAchr2.trna16 GCAATGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTttaACAC 191 15 AGGAGaCCCGGGTTCAATTCCTGACCCATGTA GluTAGchr1.trna106 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTtAGGATTCGGCGCTctaACC 192 1 GCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAGchr1.trna55 TCCCTGGTGGTCTAGTGGTtAGGATTCGGCGCTctaACC 193 2 GCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGAAA GluTAGchr13.trna3 CCCCTGGTGGTCTAGTGCTtAGGATTCGGTGCTctaACC 194 3 GCTGCTGCCTGCGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAGchr8.trna1 TCCTTGATGTCTAGTGGTtAGGATTTGGTGCTctaACTG 195 4 CAGCAGCCTGGGTTCATTTCTCAGTCAGGGAA GluTAGchr2.trna18 TCCCATATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTctaACC 196 5 CAGGTGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTATGGGAA 6 GluTAGchr1.trna92 TCCGTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTctaAC 197 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

CGCCTGCAGCTCGAGTTCGATTCCTGGTCAGGGAA GluTAGchr14.trna15 CCCTGTGGTCTAGTGGCtAAGACTTTGTGCTctaATTGC 198 7 TGCAtCCTAGGTTCAATTCCCAGTCAGGGA GluTAGchr13.trna2 TCCCACATGGTCTAGCGGTtAGGATTCCTGGTTctaACC 199 8 CAGGCGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTGTGGGAA GluTAGchr1.trna5 TCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTctaAC 200 9 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGCCAGGGAA GluTAGchr1.trna123 TCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTctaAC 201 10 CGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAGchr1.trna45 GCGTTGGTGGTGTAGTGGTgAGCACAGCTGCCTctaAA 202 11 GCAGTTAaCGCGGGTTCGATTCCCGGGTAACGAA GluTAGchr1.trna99 TCCTTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGTGCTctaACC 203 12 TGTGCGGCCCGGGTTCAATTCCCGATGAAGGAA GluTAGchr1.trna95 TGTCTGGTGGTCAAGTGGCtAGGATTTGGCGCTctaACT 204 13 GCCGCGGCCCGCGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA GluTAGchr1.trna86 TCCCTGGTGGTCTAGTGGCtAGGATTCGGCGCTctaAC 205 14 CGCCTGCAGCTCGAGTTCGATTCCTGGTCAGGGAA GluTAGchr2.trna16 GCAATGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTctactaAC 206 15 ACAGGAGaCCCGGGTTCAATTCCTGACCCATGTA TyrTAA chr2.trna13 CCTTCAATAGTTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTttaGcta 207 cttcctcagtaggagacGTCCTTAGGtTGCTGGTTCGATTCCA 1 GCTTGAAGGA TyrTAA CCTTCAATAGTTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTttaGGT 208 2 chr2.trna13/nointron CCTTAGGtTGCTGGTTCGATTCCAGCTTGAAGGA TyrTAAchr1.trna11 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCTTTAGACTttaaAATCTAAA 209 3 GAGAGATTGAGCTCTCTTTTTACCA TyrTAAchr1.trna52 GGTAAAATGACTGAGTAAGCATTAGACTttaAATCTAAA 210 4 GaCAGAGGTCAAGACCTCTTTTTACCA TyrTAAchr11.trna9 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTttaAATCTAAA 211 5 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAAchr9.trna2 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTttaAATCTAAA 212 6 GaCAGAGGTCAAGGCCTTTTTACCA TyrTAAchr6.trna14 CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGttg 213 gctgtgtccttagacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGC 7 TCGAAGGA TyrTAAchr6.trna14/n CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 214 8 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGAAGGA 9 TyrTAA chr7.trna12 GGGGGTATAGCTCAGGGCtAGAGCTtTTTGACTttaGAG 215 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTTCTCCCT TyrTAAchr7.trna28 TATAGCTCAGTGGTAGAGCATTTAACTttaGATCAAGAG 216 10 GtCCCTGGATCAACTCTGGGTG TyrTAAchr15.trna6 GTCAGTGTTGCACAACGGTtaAGTGAAGAGGCTttaAAC 217 11 CCAGACTGGATGGGTTCAATTCCCATCTCTGCCG TyrTAA chr2.trna2 CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGtg 218 gatagggcgtggcaATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGC 12 TCGAAGGA TyrTAAchr2.trna2/noi CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 219 13 ntron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr6.trna16 CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGgc 220 tcattaagcaaggtATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGC 14 TCGGAGGA TyrTAAchr6.trna16/n CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 221 15 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGGAGGA TyrTAAchr14.trna19 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGatt 222 gtatagacatttgcggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCA 16 GCTCGAAGGA TyrTAAchr14.trna19/ CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 223 17 nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCAGCTCGAAGGA TyrTAAchr8.trna2 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGct 224 acttcctcagcaggagacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCC 18 GGCTCGAAGGA TyrTAAchr8.trna2/noi CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 225 19 ntron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr8.trna3 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGgc 226 gcgcgcccgtggccATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGC 20 TCGAAGGA TyrTAAchr8.trna3/noi CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 227 21 ntron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr14.trna20 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaaGc 228 ctgtagaaacatttgtggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCC 22 GGCTCGAAGGA TyrTAAchr14.trna20/ CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 229 23 nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr14.trna17 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGatt 230 gtacagacatttgcggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCC 24 GGCTCGAAGGA tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO TyrTAAchr14.trna17/ CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 231 25 nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr14.trna5 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGta 232 cttaatgtgtggtcATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCT 26 CGAAGGA TyrTAAchr14.trna5/n CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 233 27 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr6.trna17 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGgg 234 gtttgaatgtggtcATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCT 28 CGGAGGA TyrTAAchr6.trna17/n CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 235 29 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGGAGGA TyrTAAchr14.trna18 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGac 236 tgcggaaacgtttgtggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCAATTCC 30 GGCTCGAAGGA TyrTAAchr14.trna18/ CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGA 237 31 nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCAATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr6.trna15 CTTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGgtt 238 cattaaactaaggcATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGC 32 TCGAAGGA TyrTAAchr6.trna15/n CTTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTttaGAT 239 33 ointron CCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGAAGGA TyrTAAchr8.trna11 TCTTCAATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaaGg 240 tgcacgcccgtggccATTCTTAGGTGCTGGTTTGATTCCGAC 34 TTGGAGAG TyrTAAchr8.trna11/noi TCTTCAATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTttaGAT 241 35 ntron TCTTAGGTGCTGGTTTGATTCCGACTTGGAGAG TyrTAAchr1.trna127 GGTAAAATGGCTGAGTGAAGCATTGGACTttaAATCTAA 242 36 AGaCAGGGGTTAAGCCTCTTTTTACCA TyrTAAchr10.trna3 GGTAAAATGGCTGAGCAAGCATTGGACTttaAATCTAAA 243 37 GaCAGATGTTGAGCCATCTTTTTAGCA TyrTAAchr14.trna8 GGTAAAATGGCTGAGTGAAGCATTGGACTttaAATCTAA 244 38 AGaCAGGGGCTAAGCCTCTTTTTACCA TyrTAAchr2.trna12 GGTAAAATGGCTGAGCAAGCATTAGACTttaAATCTAAA 245 39 GaCAGAGGTTAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAAchr7.trna1 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTttaAATCTAAA 246 40 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTTCCT 41 TyrTAAchr7.trna2 GGTAAAATGGCTGAGCAAGCATTAGACTttaAATCTGAA 247 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO AaCAGAGGTCAAAGgTCTCTTTTTACCA TyrTAAchr7.trna6 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTttaAATCTAAA 248 42 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAAchr8.trna7 GGTAAAATGACTGAATAAGCCTTAGACTttaAATCTGAA 249 43 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAAchr9.trna10 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTGGACTttaAATCTAAA 250 44 GaCAGAGGTCAAGACCTCTTTTTACCA TyrTAAchr9.trna4 GGTAAAATGGCTGAGTAAAGCATTAGACTttaAATCTAA 251 45 GGaCAGAGGCTAAACCTCTTTTTACCA TyrTAGchr2.trna13 CCTTCAATAGTTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTctaGct 252 acttcctcagtaggagacGTCCTTAGGtTGCTGGTTCGATTCCA 1 GCTTGAAGGA TyrTAGchr2.trna13/noi CCTTCAATAGTTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTctaGG 253 2 ntron TCCTTAGGtTGCTGGTTCGATTCCAGCTTGAAGGA TyrTAGchr1.trna11 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCTTTAGACTctaaAATCTAA 254 3 AGAGAGATTGAGCTCTCTTTTTACCA TyrTAGchr1.trna52 GGTAAAATGACTGAGTAAGCATTAGACTctaAATCTAAA 255 4 GaCAGAGGTCAAGACCTCTTTTTACCA TyrTAGchr11.trna9 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTctaAATCTAAA 256 5 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAGchr9.trna2 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTctaAATCTAAA 257 6 GaCAGAGGTCAAGGCCTTTTTACCA TyrTAGchr6.trna14 CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGtt 258 ggctgtgtccttagacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGG 7 CTCGAAGGA TyrTAGchr6.trna14/n CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 259 8 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGAAGGA TyrTAG chr7.trna12 GGGGGTATAGCTCAGGGCtAGAGCTtTTTGACTctaaGA 260 9 GCAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTTCTCCCT TyrTAGchr7.trna28 TATAGCTCAGTGGTAGAGCATTTAACTctaGATCAAGAG 261 10 GtCCCTGGATCAACTCTGGGTG TyrTAGchr15.trna6 GTCAGTGTTGCACAACGGTtaAGTGAAGAGGCTctaAAC 262 11 CCAGACTGGATGGGTTCAATTCCCATCTCTGCCG TyrTAG chr2.trna2 CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGtg 263 gatagggcgtggcaATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGC 12 TCGAAGGA TyrTAGchr2.trna2/noi CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 264 13 ntron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO TyrTAGchr6.trna16 CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGg 265 ctcattaagcaaggtATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGC 14 TCGGAGGA TyrTAGchr6.trna16/n CCTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 266 15 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGGAGGA TyrTAGchr14.trna19 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGat 267 tgtatagacatttgcggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCA 16 GCTCGAAGGA TyrTAG CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 268 17 chr14.trna19/nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCAGCTCGAAGGA TyrTAGchr8.trna2 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGct 269 acttcctcagcaggagacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCC 18 GGCTCGAAGGA TyrTAGchr8.trna2/noi CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 270 19 ntron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAGchr8.trna3 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGg 271 cgcgcgcccgtggccATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGG 20 CTCGAAGGA TyrTAGchr8.trna3/noi CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 272 21 ntron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAGchr14.trna20 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGc 273 ctgtagaaacatttgtggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCC 22 GGCTCGAAGGA TyrTAGchr14.trna20/ CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 274 23 nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAGchr14.trna17 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGat 275 tgtacagacatttgcggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCC 24 GGCTCGAAGGA TyrTAGchr14.trna17/ CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 276 25 nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAGchr14.trna5 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGta 277 cttaatgtgtggtcATCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCT 26 CGAAGGA TyrTAGchr14.trna5/n CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 278 27 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAGchr6.trna17 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGg 279 ggtttgaatgtggtcATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGC 28 TCGGAGGA tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO TyrTAGchr6.trna17/n CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 280 29 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGGAGGA TyrTAGchr14.trna18 CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGa 281 ctgcggaaacgtttgtggacATCCTTAGGtCGCTGGTTCAATTCC 30 GGCTCGAAGGA TyrTAGchr14.trna18/ CCTTCGATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 282 31 nointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCAATTCCGGCTCGAAGGA TyrTAGchr6.trna15 CTTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGgtt 283 cattaaactaaggcATCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGC 32 TCGAAGGA TyrTAGchr6.trna15/n CTTTCGATAGCTCAGTTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 284 33 ointron TCCTTAGGtCGCTGGTTCGAATCCGGCTCGAAGGA TyrTAGchr8.trna11 TCTTCAATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGgt 285 gcacgcccgtggccATTCTTAGGTGCTGGTTTGATTCCGACT 34 TGGAGAG TyrTAGchr8.trna11/noi TCTTCAATAGCTCAGCTGGTAGAGCGGAGGACTctaGA 286 35 ntron TTCTTAGGTGCTGGTTTGATTCCGACTTGGAGAG TyrTAGchr1.trna127 GGTAAAATGGCTGAGTGAAGCATTGGACTctaAATCTAA 287 36 AGaCAGGGGTTAAGCCTCTTTTTACCA TyrTAGchr10.trna3 GGTAAAATGGCTGAGCAAGCATTGGACTctaAATCTAAA 288 37 GaCAGATGTTGAGCCATCTTTTTAGCA TyrTAGchr14.trna8 GGTAAAATGGCTGAGTGAAGCATTGGACTctaAATCTAA 289 38 AGaCAGGGGCTAAGCCTCTTTTTACCA TyrTAGchr2.trna12 GGTAAAATGGCTGAGCAAGCATTAGACTctaAATCTAAA 290 39 GaCAGAGGTTAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAGchr7.trna1 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTctaAATCTAAA 291 40 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTTCCT TyrTAGchr7.trna2 GGTAAAATGGCTGAGCAAGCATTAGACTctaAATCTGAA 292 41 AaCAGAGGTCAAAGgTCTCTTTTTACCA TyrTAGchr7.trna6 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTAGACTctaAATCTAAA 293 42 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAGchr8.trna7 GGTAAAATGACTGAATAAGCCTTAGACTctaAATCTGAA 294 43 GaCAGAGGTCAAGGCCTCTTTTTACCA TyrTAGchr9.trna10 GGTAAAATGGCTGAGTAAGCATTGGACTctaAATCTAAA 295 44 GaCAGAGGTCAAGACCTCTTTTTACCA TyrTAGchr9.trna4 GGTAAAATGGCTGAGTAAAGCATTAGACTctaAATCTAA 296 45 GGaCAGAGGCTAAACCTCTTTTTACCA 1 LeuTAAchr4.trna2 GTTAAGATGGCAGAGCCtGGTaATTGCAttaAACTTAAAA 297 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO TTTTATAAtCAGAGGTTCAACTCCTCTTCTTAACA LeuTAAnmtchrX.trna2 GTTAAGATGGCAGAGCCcGGCaATTGCAttaGACTTAAA 298 2 ACTTTATAAtCAGAGGTTCAACTCCTCTCATTAACA LeuTAAchr6.trna77 GGTAGCGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTttaG 299

CTCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTCAAATCCCACC 3 GCTGCCA LeuTAAchr6.trna127 GGTAGCGTGGCCGAGTGGTctAAGACGCTGGATTttaGC 300

TCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTTGAATCCCACCG 4 CTGCCA LeuTAAchr2.trna4 GGGCCAGTGGCTCAATGGAtAATGCGTCTGACTttaAAT 301 5 CAGAAGAtTCCAGCCTTGACTCCTGGCTGGCTCA LeuTAAchr20.trna1 GGTAGGGTGGCCGAGCGGTctAAGGCACTGTATTttaAC 302

TCCAGTCTCTTCAGAGGCATGGGTTTGAATCCCACTG 6 CTGCCA LeuTAAchr5.trna20 GCCGAGCGGTctAAGGCTCCGGATTttaGCGCCGGTGT 303 7 CTTCGGAGgCATGGGTTCGAATTCCAC LeuTAAchr6.trna100 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGc 304 taagcttcctccgcggtggggaTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGT 8 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAAchr6.trna100/ GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGT 305 nointron TCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACT 9 TCTGACA LeuTAAchr6.trna73 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGc 306 ttggcttcctcgtgttgaggaTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGG 10 GTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAAchr6.trna73/n GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGT 307 ointron TCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACT 11 TCTGACA LeuTAAchr6.trna141 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGc 308 ttactgcttcctgtgttcgggtcTTCTGGTCTCCGTATGGAGGCGT 12 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAAchr6.trna141/ GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGT 309 nointron TCTGGTCTCCGTATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 13 TTCTGACA LeuTAAchr6.trna142 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGtt 310 gctacttcccaggtttggggcTTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGT 14 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA 15 LeuTAAchr6.trna142/ GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGT 311 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO nointron TCTGGTCTCCGCATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC

TTCTGACA LeuTAAchr1.trna54 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGg 312 taagcaccttgcctgcgggctTTCTGGTCTCCGGATGGAGGCGT 16 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAAchr1.trna54/noi GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTttaGt 313 ntron TTCTGGTCTCCGGATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCA 17 CTTCTGACA LeuTAAchr11.trna1 GCCTCCTTAGTGCAGTAGGTAGCGCATCAGTCTttaAAT 314 18 CTGAATGgtCCTGAGTTCAAGCCTCAGAGGGGGCA LeuTAAchr1.trna59 GTCAGGATGGCCGAGCAGTcttAAGGCGCTGCGTTttaAT 315

CGCACCCTCCGCTGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACT 19 TTTGACA LeuTAAchr9.trna3 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTttaAAT 316 20 CCAGAAGtAGTgCTGGAACAA LeuTAAchr9.trna7 GTCAGGGTGGCTGAGCAGTctGAGGGGCTGCGTTttaGT 317

CGCAGTCTGCCCTGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACT 21 CCTGAAA LeuTAAchr6.trna81 ACCAGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaGAT 318

CCAATGGACATATGTCCGCGTGGGTTCGAACCCCACT 22 CCTGGTA LeuTAAchr6.trna135 ACCGGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaGA 319

TCCAATGGGCTGGTGCCCGCGTGGGTTCGAACCCCA 23 CTCTCGGTA LeuTAAchr11.trna4 ACCAGAATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaGAT 320

CCAATGGATTCATATCCGCGTGGGTTCGAACCCCACT 24 TCTGGTA LeuTAAchr6.trna156 ACCGGGATGGCTGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaGAT 321

CCAATGGACAGGTGTCCGCGTGGGTTCGAGCCCCACT 25 CCCGGTA LeuTAAchr6.trna79 ACTCATTTGGCTGAGTGGTtAAGGCATTGGACTttaGAT 322

CCAATGGAGTAGTGGCTGTGTGGGTTTAAACCCCACT 26 ACTGGTA LeuTAAchr1.trna9 GAGAAAGTcATCGTAGTTACGAAGTTGGCTttaACCCAG 323 27 TTTtGGGAGGTTCAATTCCTTCCTTTCTCT LeuTAAchr11.trna12 ACCAGGATGGCCAAGTAGTTaAAGGCACTGGACTttaGA 324

GCCAATGGACATATGTCTGTGTGGGTTTGAACCCCAC 28 TCCTGGTG tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO LeuTAAchr17.trna42 GGTAGCGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTttaG 325

CTCCAGTCTCTTCGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACC 29 GCTGCCA LeuTAAchr14.trna2 GGTAGTGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTttaGC 326

TCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTCGAATCCCACCA 30 CTGCCA LeuTAAchr16.trna27 GGTAGCGTGGCCGAGTGGTctAAGGCGCTGGATTttaGC 327 TCCAGTCATTTCGATGgCGTGGGTTCGAATCCCACCG 31 CTGCCA LeuTAAchr14.trna16 GGTAGTGTGGTTGAATGGTctAAGGCACTGAATTttaGCT 328 CCAGTCTCTTTGGGGaCGTGGGTTTAAATCCCACTGCT 32 GCAA LeuTAGchr4.trna2 GTTAAGATGGCAGAGCCtGGTaATTGCActaAACTTAAA 329 1 ATTTTATAAtCAGAGGTTCAACTCCTCTTCTTAACA LeuTAGnmtchrX.trna GTTAAGATGGCAGAGCCcGGCaATTGCActaGACTTAAA 330 2 2 ACTTTATAAtCAGAGGTTCAACTCCTCTCATTAACA LeuTAGchr6.trna77 GGTAGCGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTctaG 331

CTCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTCAAATCCCACC 3 GCTGCCA LeuTAGchr6.trna127 GGTAGCGTGGCCGAGTGGTctAAGACGCTGGATTctaG 332

CTCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTTGAATCCCACC 4 GCTGCCA LeuTAGchr2.trna4 GGGCCAGTGGCTCAATGGAtAATGCGTCTGACTctaAAT 333 5 CAGAAGAtTCCAGCCTTGACTCCTGGCTGGCTCA LeuTAGchr20.trna1 GGTAGGGTGGCCGAGCGGTctAAGGCACTGTATTctaAC 334

TCCAGTCTCTTCAGAGGCATGGGTTTGAATCCCACTG 6 CTGCCA LeuTAGchr5.trna20 GCCGAGCGGTctAAGGCTCCGGATTctaGCGCCGGTGT 335 7 CTTCGGAGgCATGGGTTCGAATTCCAC LeuTAGchr6.trna100 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaGc 336 taagcttcctccgcggtggggaTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGT 8 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAGchr6.trna100/ GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaG 337 nointron TTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 9 TTCTGACA LeuTAGchr6.trna73 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaGc 338 ttggcttcctcgtgttgaggaTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGG 10 GTTCGAATCCCACTTCTGACA tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO LeuTAGchr6.trna73/n GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaG 339 ointron TTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 11 TTCTGACA LeuTAGchr6.trna141 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaGc 340 ttactgcttcctgtgttcgggtcTTCTGGTCTCCGTATGGAGGCGT 12 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAGchr6.trna141/ GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaG 341 nointron TTCTGGTCTCCGTATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCA 13 CTTCTGACA LeuTAGchr6.trna142 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaGt 342 tgctacttcccaggtttggggcTTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGT 14 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAGchr6.trna142/ GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaG 343 nointron TTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCA 15 CTTCTGACA LeuTAGchr1.trna54 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaG 344 gtaagcaccttgcctgcgggctTTCTGGTCTCCGGATGGAGGCG 16 TGGGTTCGAATCCCACTTCTGACA LeuTAGchr1.trna54/no GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTctaGt 345 intron TTCTGGTCTCCGGATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCA 17 CTTCTGACA LeuTAGchr11.trna1 GCCTCCTTAGTGCAGTAGGTAGCGCATCAGTCTctaAAT 346 18 CTGAATGgtCCTGAGTTCAAGCCTCAGAGGGGGCA LeuTAGchr1.trna59 GTCAGGATGGCCGAGCAGTcttAAGGCGCTGCGTTctaA 347

TCGCACCCTCCGCTGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 19 TTTTGACA LeuTAGchr9.trna3 GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTctaAAT 348 20 CCAGAAGtAGTgCTGGAACAA LeuTAGchr9.trna7 GTCAGGGTGGCTGAGCAGTctGAGGGGCTGCGTTctaG 349

TCGCAGTCTGCCCTGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 21 TCCTGAAA LeuTAGchr6.trna81 ACCAGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaGA 350

TCCAATGGACATATGTCCGCGTGGGTTCGAACCCCAC 22 TCCTGGTA LeuTAGchr6.trna135 ACCGGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaGA 351

TCCAATGGGCTGGTGCCCGCGTGGGTTCGAACCCCA 23 CTCTCGGTA 24 LeuTAGchr11.trna4 ACCAGAATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaGA 352 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

TCCAATGGATTCATATCCGCGTGGGTTCGAACCCCAC

TTCTGGTA LeuTAGchr6.trna156 ACCGGGATGGCTGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaGA 353

TCCAATGGACAGGTGTCCGCGTGGGTTCGAGCCCCAC 25 TCCCGGTA LeuTAGchr6.trna79 ACTCATTTGGCTGAGTGGTtAAGGCATTGGACTctaaGA 354

TCCAATGGAGTAGTGGCTGTGTGGGTTTAAACCCCAC 26 TACTGGTA LeuTAGchr1.trna9 GAGAAAGTcATCGTAGTTACGAAGTTGGCTctaACCCAG 355 27 TTTtGGGAGGTTCAATTCCTTCCTTTCTCT LeuTAGchr11.trna12 ACCAGGATGGCCAAGTAGTTaAAGGCACTGGACTctaG 356

AGCCAATGGACATATGTCTGTGTGGGTTTGAACCCCA 28 CTCCTGGTG LeuTAGchr17.trna42 GGTAGCGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTctaG 357

CTCCAGTCTCTTCGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACC 29 GCTGCCA LeuTAGchr14.trna2 GGTAGTGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTctaG 358

CTCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTCGAATCCCACC 30 ACTGCCA LeuTAGchr16.trna27 GGTAGCGTGGCCGAGTGGTctAAGGCGCTGGATTctaG 359 CTCCAGTCATTTCGATGgCGTGGGTTCGAATCCCACC 31 GCTGCCA LeuTAGchr14.trna16 GGTAGTGTGGTTGAATGGTctAAGGCACTGAATTctaGC 360 TCCAGTCTCTTTGGGGaCGTGGGTTTAAATCCCACTGC 32 TGCAA GTTAAGATGGCAGAGCCtGGTaATTGCAtcaAACTTAAA 523 1 LeuTGAchr4.trna2 ATTTTATAAtCAGAGGTTCAACTCCTCTTCTTAACA GTTAAGATGGCAGAGCCcGGCaATTGCAtcaGACTTAAA 524 2 LeuTGAnmtchrX.trna2 ACTTTATAAtCAGAGGTTCAACTCCTCTCATTAACA GGTAGCGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTtcaG 525

CTCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTCAAATCCCACC 3 LeuTGAchr6.trna77 GCTGCCA GGTAGCGTGGCCGAGTGGTctAAGACGCTGGATTtcaG 526

CTCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTTGAATCCCACC 4 LeuTGAchr6.trna127 GCTGCCA GGGCCAGTGGCTCAATGGAtAATGCGTCTGACTtcaAAT 527 5 LeuTGAchr2.trna4 CAGAAGAtTCCAGCCTTGACTCCTGGCTGGCTCA 6 LeuTGAchr20.trna1 GGTAGGGTGGCCGAGCGGTctAAGGCACTGTATTtcaAC 528 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

TCCAGTCTCTTCAGAGGCATGGGTTTGAATCCCACTG

CTGCCA GCCGAGCGGTctAAGGCTCCGGATTtcaGCGCCGGTGT 529 7 LeuTGAchr5.trna20 CTTCGGAGgCATGGGTTCGAATTCCAC GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaGc 530 taagcttcctccgcggtggggaTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGT 8 LeuTGAchr6.trna100 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA 531 GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaG 532 LeuTGAchr6.trna100/ TTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 9 nointron TTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaGc 533 ttggcttcctcgtgttgaggaTTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGG 10 LeuTGAchr6.trna73 GTTCGAATCCCACTTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaG 534 LeuTGAchr6.trna73/n TTCTGGTCTCCAATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 11 ointron TTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaGc 535 ttactgcttcctgtgttcgggtcTTCTGGTCTCCGTATGGAGGCGT 12 LeuTGAchr6.trna141 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaG 536 LeuTGAchr6.trna141/ TTCTGGTCTCCGTATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCA 13 nointron CTTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaGt 537 tgctacttcccaggtttggggcTTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGT 14 LeuTGAchr6.trna142 GGGTTCGAATCCCACTTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaG 538 LeuTGAchr6.trna142/ TTCTGGTCTCCGCATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCA 15 nointron CTTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaG 539 gtaagcaccttgcctgcgggctTTCTGGTCTCCGGATGGAGGCG 16 LeuTGAchr1.trna54 TGGGTTCGAATCCCACTTCTGACA GTCAGGATGGCCGAGTGGTctAAGGCGCCAGACTtcaGt 540 LeuTGAchr1.trna54/no TTCTGGTCTCCGGATGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCA 17 intron CTTCTGACA GCCTCCTTAGTGCAGTAGGTAGCGCATCAGTCTtcaAAT 541 18 LeuTGAchr11.trna1 CTGAATGgtCCTGAGTTCAAGCCTCAGAGGGGGCA GTCAGGATGGCCGAGCAGTcttAAGGCGCTGCGTTtcaA 542 19 LeuTGAchr1.trna59 TCGCACCCTCCGCTGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

TTTTGACA GGTTCCATGGTGTAATGGTgAGCACTCTGGACTtcaAAT 543 20 LeuTGAchr9.trna3 CCAGAAGtAGTgCTGGAACAA GTCAGGGTGGCTGAGCAGTctGAGGGGCTGCGTTtcaG 544

TCGCAGTCTGCCCTGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCAC 21 LeuTGAchr9.trna7 TCCTGAAA ACCAGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaGA 545

TCCAATGGACATATGTCCGCGTGGGTTCGAACCCCAC 22 LeuTGAchr6.trna81 TCCTGGTA ACCGGGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaGA 546547

TCCAATGGGCTGGTGCCCGCGTGGGTTCGAACCCCA 23 LeuTGAchr6.trna135 CTCTCGGTA ACCAGAATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaGA 548

TCCAATGGATTCATATCCGCGTGGGTTCGAACCCCAC 24 LeuTGAchr11.trna4 TTCTGGTA ACCGGGATGGCTGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaGA 549

TCCAATGGACAGGTGTCCGCGTGGGTTCGAGCCCCAC 25 LeuTGAchr6.trna156 TCCCGGTA ACTCATTTGGCTGAGTGGTtAAGGCATTGGACTtcaGAT 550

CCAATGGAGTAGTGGCTGTGTGGGTTTAAACCCCACT 26 LeuTGAchr6.trna79 ACTGGTA GAGAAAGTcATCGTAGTTACGAAGTTGGCTtcaACCCAG 551 27 LeuTGAchr1.trna9 TTTtGGGAGGTTCAATTCCTTCCTTTCTCT ACCAGGATGGCCAAGTAGTTaAAGGCACTGGACTtcaG 552

AGCCAATGGACATATGTCTGTGTGGGTTTGAACCCCA 28 LeuTGAchr11.trna12 CTCCTGGTG GGTAGCGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTtcaG 553

CTCCAGTCTCTTCGGAGGCGTGGGTTCGAATCCCACC 29 LeuTGAchr17.trna42 GCTGCCA GGTAGTGTGGCCGAGCGGTctAAGGCGCTGGATTtcaG 554

CTCCAGTCTCTTCGGGGGCGTGGGTTCGAATCCCACC 30 LeuTGAchr14.trna2 ACTGCCA GGTAGCGTGGCCGAGTGGTctAAGGCGCTGGATTtcaG 555 CTCCAGTCATTTCGATGgCGTGGGTTCGAATCCCACC 31 LeuTGAchr16.trna27 GCTGCCA GGTAGTGTGGTTGAATGGTctAAGGCACTGAATTtcaGC 556 TCCAGTCTCTTTGGGGaCGTGGGTTTAAATCCCACTGC 32 LeuTGAchr14.trna16 TGCAA tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO SerTAGnmtchr2.trna19 GAGAAGGTcACAGAGGTtATGGGATTGGCTctaAACCAG 361 1 TCTGtGGGGGGTTCGATTCCCTCCTTTTTCA SerTAGnmtchr2.trna GAGAAGGTcATAGAGGTtATGGGATTGGCTctaAACCAG 362 2 7 TCTCTGGGGGGTTCGATTCCCTCCTTTTTCA SerTAGnmtchr17.trna3 GAAAAAGTCATAGGGGTTATGAGGCTGGCTctaAACCA 363 3 1 GCCTtAGGAGGTTCAATTCCTTCCTTTTTTG SerTAGchr6.trna41 GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGCTGCTctaAA 364 4 TGCCAGGGtCGAGGTTTCGATCCCCGTACGGGCCT SerTAGchr6.trna148 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 365

TCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC 5 GACTACG SerTAGchr6.trna50 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 366

TCCATTGGGGTTTCCCCACGCAGGTTCGAATCCTGCC 6 GACTACG SerTAGchr6.trna146 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGTGATGGACTctaaAA 367

CCCATTGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC 7 GACTACG SerTAGchr7.trna15 GGGTGTATGGCTCAGGGGTAGAGAATTTGACTctaGAT 368 8 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT SerTAGchr11.trna10 AGTTGTAGCTGAGTGGTtAAGGCAACGAGCTctaAATTC 369 9 GTTGGTTTCTCTCTgTGCAGGTTTGAATCCTGCTAATTA SerTAGchr11.trna8 CAAGAAATTCATAGAGGTTATGGGATTGGCTctaAACCA 370 10 GTTTcAGGAGGTTCGATTCCTTCCTTTTTGG SerTAGchr17.trna41 GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaAAT 371

CCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCTC 11 ACAGCG SerTAGchr6.trna34 GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaAAT 372

CCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCAAATCCTGCTC 12 ACAGCG SerTAGchr6.trna138 GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGTGTTGGACTctaAAT 373

CCAATGGGGGTTCCCCGCGCAGGTTCAAATCCTGCTC 13 ACAGCG SerTAGchr12.trna2 GTCACGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaAA 374

TCCAATGGGGTTTCCCCGCACAGGTTCGAATCCTGTT 14 CGTGACG SerTAGchr6.trna30 GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 375

TCCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCACC 15 CTCGTCG tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO SerTAGchr6.trna43 GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 376

TCCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCACC 16 TTCGTCG SerTAGchr11.trna6 GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGCTctaACTAA 377 17 TGCCAGGGtCGAGGTTTCGATCCCCGTACGGGCCT SerTAGchr6.trna61 GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 378

TCCATTGTGCTCTGCACACGTGGGTTCGAATCCCATC 18 CTCGTCG SerTAGchr6.trna176 GAGGCCTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAAT 379

CCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCATCC 19 TCG SerTAGchr10.trna2 GCAGCGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTctaAA 380

TCCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAACCCTGCT 20 CGCTGCG SerTAGchr6.trna51 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 381

TCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC 21 GACTACG SerTAGchr6.trna173 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 382

TCCATTGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC 22 GACTACG SerTAGchr6.trna149 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTctaAA 383

TCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGTC 23 GGCTACG SerTGAnmtchr2.trna19 GAGAAGGTcACAGAGGTtATGGGATTGGCTtcaAACCAG 384 1 TCTGtGGGGGGTTCGATTCCCTCCTTTTTCA SerTGAnmt-chr2.trna7 GAGAAGGTcATAGAGGTtATGGGATTGGCTtcaAACCAG 385 2 TCTCTGGGGGGTTCGATTCCCTCCTTTTTCA SerTGAnmtchr17.trna3 GAAAAAGTCATAGGGGTTATGAGGCTGGCTtcaAACCA 386 3 1 GCCTtAGGAGGTTCAATTCCTTCCTTTTTTG SerTGAchr6.trna41 GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGCTGCTtcaAA 387 4 TGCCAGGGtCGAGGTTTCGATCCCCGTACGGGCCT SerTGAchr6.trna148 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 388

TCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC 5 GACTACG SerTGAchr6.trna50 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 389

TCCATTGGGGTTTCCCCACGCAGGTTCGAATCCTGCC 6 GACTACG 7 SerTGAchr6.trna146 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGTGATGGACTtcaAA 390 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

CCCATTGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC

GACTACG SerTGAchr7.trna15 GGGTGTATGGCTCAGGGGTAGAGAATTTGACTtcaGAT 391 8 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT SerTGAchr11.trna10 AGTTGTAGCTGAGTGGTtAAGGCAACGAGCTtcaAATTC 392 9 GTTGGTTTCTCTCTgTGCAGGTTTGAATCCTGCTAATTA SerTGAchr11.trna8 CAAGAAATTCATAGAGGTTATGGGATTGGCTtcaAACCA 393 10 GTTTcAGGAGGTTCGATTCCTTCCTTTTTGG SerTGAchr17.trna41 GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaAAT 394

CCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCTC 11 ACAGCG SerTGAchr6.trna34 GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaAAT 395

CCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCAAATCCTGCTC 12 ACAGCG SerTGAchr6.trna138 GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGTGTTGGACTtcaAAT 396

CCAATGGGGGTTCCCCGCGCAGGTTCAAATCCTGCTC 13 ACAGCG SerTGAchr12.trna2 GTCACGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaAA 397

TCCAATGGGGTTTCCCCGCACAGGTTCGAATCCTGTT 14 CGTGACG SerTGAchr6.trna30 GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 398

TCCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCACC 15 CTCGTCG SerTGAchr6.trna43 GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 399

TCCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCACC 16 TTCGTCG SerTGAchr11.trna6 GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGCTtcaACTAA 400 17 TGCCAGGGtCGAGGTTTCGATCCCCGTACGGGCCT SerTGAchr6.trna61 GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 401

TCCATTGTGCTCTGCACACGTGGGTTCGAATCCCATC 18 CTCGTCG SerTGAchr6.trna176 GAGGCCTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAAT 402

CCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCATCC 19 TCG SerTGAchr10.trna2 GCAGCGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTtcaAA 403

TCCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAACCCTGCT 20 CGCTGCG 21 SerTGAchr6.trna51 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 404 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

TCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC

GACTACG SerTGAchr6.trna173 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 405

TCCATTGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCC 22 GACTACG SerTGAchr6.trna149 GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTtcaAA 406

TCCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGTC 23 GGCTACG GAGAAGGTcACAGAGGTtATGGGATTGGCTttaAACCAG 557 1 SerTAAnmtchr2.trna19 TCTGtGGGGGGTTCGATTCCCTCCTTTTTCA GAGAAGGTcATAGAGGTtATGGGATTGGCTttaAACCAG 558 2 SerTAAnmtchr2.trna7 TCTCTGGGGGGTTCGATTCCCTCCTTTTTCA SerTAAnmtchr17.trna3 GAAAAAGTCATAGGGGTTATGAGGCTGGCTttaAACCA 559 3 1 GCCTtAGGAGGTTCAATTCCTTCCTTTTTTG GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGCTGCTttaAA 560 4 SerTAAchr6.trna41 TGCCAGGGtCGAGGTTTCGATCCCCGTACGGGCCT GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAAT 561

CCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCCG 5 SerTAAchr6.trna148 ACTACG GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAAT 562

CCATTGGGGTTTCCCCACGCAGGTTCGAATCCTGCCG 6 SerTAAchr6.trna50 ACTACG GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGTGATGGACTttaAAC 563

CCATTGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCCG 7 SerTAAchr6.trna146 ACTACG GGGTGTATGGCTCAGGGGTAGAGAATTTGACTttaGAT 564 8 SerTAAchr7.trna15 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT AGTTGTAGCTGAGTGGTtAAGGCAACGAGCTttaAATTC 565 9 SerTAAchr11.trna10 GTTGGTTTCTCTCTgTGCAGGTTTGAATCCTGCTAATTA CAAGAAATTCATAGAGGTTATGGGATTGGCTttaAACCA 566 10 SerTAAchr11.trna8 GTTTcAGGAGGTTCGATTCCTTCCTTTTTGG GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaAAT 567

CCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCTC 11 SerTAAchr17.trna41 ACAGCG GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaAAT 568

CCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCAAATCCTGCTC 12 SerTAAchr6.trna34 ACAGCG 13 SerTAAchr6.trna138 GCTGTGATGGCCGAGTGGTtAAGGTGTTGGACTttaAAT 569 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO

CCAATGGGGGTTCCCCGCGCAGGTTCAAATCCTGCTC

ACAGCG GTCACGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaAAT 570

CCAATGGGGTTTCCCCGCACAGGTTCGAATCCTGTTC 14 SerTAAchr12.trna2 GTGACG GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAA 571

TCCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCACC 15 SerTAAchr6.trna30 CTCGTCG GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAA 572

TCCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCACC 16 SerTAAchr6.trna43 TTCGTCG GGCCGGTTAGCTCAGTTGGTtAGAGCGTGCTttaACTAA 573 17 SerTAAchr11.trna6 TGCCAGGGtCGAGGTTTCGATCCCCGTACGGGCCT GACGAGGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAA 574

TCCATTGTGCTCTGCACACGTGGGTTCGAATCCCATC 18 SerTAAchr6.trna61 CTCGTCG GAGGCCTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAAT 575

CCATTGTGCTCTGCACGCGTGGGTTCGAATCCCATCC 19 SerTAAchr6.trna176 TCG GCAGCGATGGCCGAGTGGTtAAGGCGTTGGACTttaAAT 576

CCAATGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAACCCTGCTC 20 SerTAAchr10.trna2 GCTGCG GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAAT 577

CCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCCG 21 SerTAAchr6.trna51 ACTACG GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAAT 578

CCATTGGGGTCTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGCCG 22 SerTAAchr6.trna173 ACTACG GTAGTCGTGGCCGAGTGGTtAAGGCGATGGACTttaAAT 579

CCATTGGGGTTTCCCCGCGCAGGTTCGAATCCTGTCG 23 SerTAAchr6.trna149 GCTACG LysTAAchr19.trna6 GCCCAGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATAAGACTttaAAT 407 1 CTCAGGGtTGTGGATTCGTGCCCCATGCTGGGTG LysTAAchr19.trna7 CTGCAGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACTttaAAT 408 2 CTCAGGGtCATGGGTTCGTGCCCCATGTTGGG LysTAAchr1.trna8 CCAGCATGTCTCAGTCGGTATAGTGTGAGACTttaAATC 409 3 TCAGGGtCGTGGGTTCAAGCCCCACATTGGG 4 LysTAAchr1.trna47 GTCTAGCTAGATCAGTTGGTAGAGCATAAGACTttaAAT 410 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO CTCAGGGtCATGGGTTTGAGCCCTACGTTGGGCG LysTAAchr16.trna14 GCCCAGCTAGCTCAGCCGGTAGAGCACAAGACTttaAA 411 5 TCTCAGGGtCGTGGGTTTGAGCCCTGTGTTGAGCA LysTAAchr11.trna2 CCGAATAGCTTAGTTGATgAAGCGTGAGACTttaAATCT 412 6 CAGGGtAGTGGGTTCAAGCCCCACATTGGA LysTAAchr15.trna7 GCCTGGCTACCTCAGTTGGTAGAGCATGGGACTttaAAT 413 7 CCCAGAGtcAGTGGGTTCAAGCCTCACATTGAGTG LysTAAchr16.trna31 GCCCGGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACCttaAA 414 8 TCTCAGGGtCGTGGGTTCGAGCCCCACGTTGGGCG LysTAAchr16.trna11 GCCCGGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGGGACTttaAA 415 9 TCTCAGGGtCGTGGGTTCGAGCCCCACGTTGGGCG LysTAAchr16.trna30 GCCCGGCTAGCTCAGTCGATAGAGCATGAGACTttaAA 416 10 TCTCAGGGtCGTGGGTTCGAGCCGCACGTTGGGCG LysTAAchr1.trna117 GCCCAGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACTttaAA 417 11 TCTCAGGGtCATGGGTTTGAGCCCCACGTTTGGTG LysTAAchr16.trna6 GCCTGGCTAGCTCAGTCGGCAAAGCATGAGACTttaAA 418 12 TCTCAGGGtCGTGGGCTCGAGCTCCATGTTGGGCG LysTAAchr5.trna25 GCCCGACTACCTCAGTCGGTgGAGCATGGGACTttaCA 419 13 TCCCAGGGtTGTGGGTTCGAGCCCCACATTGGGCA LysTAAchr16.trna1 CCCCGGCTGGCTCAGTCAGTAGATCATGAGACTttaAAT 420 14 CTCAGGGtCGTGGGTTCACGCCCCACACTGGGCG LysTAAchr7.trna30 GCGCTAGTCAGTAGAGCATGAGACTttaAATCTCAGGGt 421 15 CGTGGGTTCGAGCCCCACATCGGGCG LysTAAchr16.trna23 GCCTGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCATCAGACTttaAAT 422 16 CTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCA LysTAAchr19.trna10 GCCAGGATAGTTCAGGTGGTAGAGCATCAGACTttaaAA 423 17 CCTGAGGGtTCAGGGTTCAAGTCTCTGTTTGGGCG LysTAAchr12.trna1 ACCCAGATAGCTCAGTCAGTAGAGCATCAGACTttaAAT 424 18 CTGAGGGtCCAAGGTTCATGTCCCTTTTTGGGTG LysTAAchr19.trna8 ACCTGGGTAGCTTAGTTGGTAGAGCATTGGACTttaAAT 425 19 TTGAGGGcCCAGGTTTCAAGTCCCTGTTTGGGTG LysTAAchr6.trna119 GCCTGGGTAGCTCAGTCGGTAGAGCTaTCAGACTttaA 426 20 GCCTGAGGAtTCAGGGTTCAATCCCTTGCTGGGGCG LysTAAchr14.trna13 GATAGCTCAGTTGATAGAGCATCAGACTttaAATCTGAG 427 21 GGtCCAGGGTTCATGTCCCTGTT LysTAAchr2.trna15 GTTGGGGTAACTCAGTTGGTAGAGTAGCAGACTttaCAT 428 22 CTGAGGGtCCAGGGTTTAAGTCCATGTCCAGGCA 23 LysTAAchr11.trna11 GCCTGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCATCAGACTttaAAT 429 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO CTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCG LysTAAchr6.trna144 GCCTGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCATCAGACTttaAAT 430 24 CTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCG LysTAAchr11.trna5 GCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCATCAGACTttaAA 431 25 TCTGAGGGtCCGGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCG LysTAAchr6.trna150 GCCTGGGTAGCTCAGTCGGTAGAGCATCAGACTttaAA 432 26 TCTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTCCAGGCG LysTAAchr6.trna70 GCCTGGATAGCTCAGTTGGTAGAACATCAGACTttaAAT 433 27 CTGACGGtGCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCG LysTAAchr1.trna50 GCCCGGAGAGCTCAGTGGGTAGAGCATCAGACTttaAA 434 28 TCTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCTCGTTCGGGCA LysTAAchr6.trna53 ACCTGGGTAGCTCAGTAGGTAGAACATCAGACTttaAAT 435 29 CTGAGGGtCTAGGGTTCAAGTCCCTGTCCAGGCG LysTAAchr3.trna2 GCCTGGATAGCTCCTTCGGTAGAGCATCATcagACTttaA 436 30 ATGTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTTCCTGTTTGGGCG LysTAGchr19.trna6 GCCCAGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATAAGACTctaAA 437 1 TCTCAGGGtTGTGGATTCGTGCCCCATGCTGGGTG LysTAGchr19.trna7 CTGCAGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACTctaAA 438 2 TCTCAGGGtCATGGGTTCGTGCCCCATGTTGGG LysTAGchr1.trna8 CCAGCATGTCTCAGTCGGTATAGTGTGAGACTctaAATC 439 3 TCAGGGtCGTGGGTTCAAGCCCCACATTGGG LysTAGchr1.trna47 GTCTAGCTAGATCAGTTGGTAGAGCATAAGACTctaAAT 440 4 CTCAGGGtCATGGGTTTGAGCCCTACGTTGGGCG LysTAGchr16.trna14 GCCCAGCTAGCTCAGCCGGTAGAGCACAAGACTctaAA 441 5 TCTCAGGGtCGTGGGTTTGAGCCCTGTGTTGAGCA LysTAGchr11.trna2 CCGAATAGCTTAGTTGATgAAGCGTGAGACTctaAATCT 442 6 CAGGGtAGTGGGTTCAAGCCCCACATTGGA LysTAGchr15.trna7 GCCTGGCTACCTCAGTTGGTAGAGCATGGGACTctaAA 443 7 TCCCAGAGtcAGTGGGTTCAAGCCTCACATTGAGTG LysTAGchr16.trna31 GCCCGGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACCctaAA 444 8 TCTCAGGGtCGTGGGTTCGAGCCCCACGTTGGGCG LysTAGchr16.trna11 GCCCGGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGGGACTctaAA 445 9 TCTCAGGGtCGTGGGTTCGAGCCCCACGTTGGGCG LysTAGchr16.trna30 GCCCGGCTAGCTCAGTCGATAGAGCATGAGACTctaAA 446 10 TCTCAGGGtCGTGGGTTCGAGCCGCACGTTGGGCG LysTAGchr1.trna117 GCCCAGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACTctaAA 447 11 TCTCAGGGtCATGGGTTTGAGCCCCACGTTTGGTG 12 LysTAGchr16.trna6 GCCTGGCTAGCTCAGTCGGCAAAGCATGAGACTctaAA 448 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO TCTCAGGGtCGTGGGCTCGAGCTCCATGTTGGGCG LysTAGchr5.trna25 GCCCGACTACCTCAGTCGGTgGAGCATGGGACTctaCA 449 13 TCCCAGGGtTGTGGGTTCGAGCCCCACATTGGGCA LysTAGchr16.trna1 CCCCGGCTGGCTCAGTCAGTAGATCATGAGACTctaAA 450 14 TCTCAGGGtCGTGGGTTCACGCCCCACACTGGGCG LysTAGchr7.trna30 GCGCTAGTCAGTAGAGCATGAGACTctaAATCTCAGGGt 451 15 CGTGGGTTCGAGCCCCACATCGGGCG LysTAGchr16.trna23 GCCTGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCATCAGACTctaAA 452 16 TCTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCA LysTAGchr19.trna10 GCCAGGATAGTTCAGGTGGTAGAGCATCAGACTctaAA 453 17 CCTGAGGGtTCAGGGTTCAAGTCTCTGTTTGGGCG LysTAGchr12.trna1 ACCCAGATAGCTCAGTCAGTAGAGCATCAGACTctaAAT 454 18 CTGAGGGtCCAAGGTTCATGTCCCTTTTTGGGTG LysTAGchr19.trna8 ACCTGGGTAGCTTAGTTGGTAGAGCATTGGACTctaAAT 455 19 TTGAGGGcCCAGGTTTCAAGTCCCTGTTTGGGTG LysTAGchr6.trna119 GCCTGGGTAGCTCAGTCGGTAGAGCTaTCAGACTctaa 456 20 AGCCTGAGGAtTCAGGGTTCAATCCCTTGCTGGGGCG LysTAGchr14.trna13 GATAGCTCAGTTGATAGAGCATCAGACTctaAATCTGAG 457 21 GGtCCAGGGTTCATGTCCCTGTT LysTAGchr2.trna15 GTTGGGGTAACTCAGTTGGTAGAGTAGCAGACTctaCA 458 22 TCTGAGGGtCCAGGGTTTAAGTCCATGTCCAGGCA LysTAGchr11.trna11 GCCTGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCATCAGACTctaAA 459 23 TCTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCG LysTAGchr6.trna144 GCCTGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCATCAGACTctaAA 460 24 TCTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCG LysTAGchr11.trna5 GCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCATCAGACTctaAA 461 25 TCTGAGGGtCCGGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCG LysTAGchr6.trna150 GCCTGGGTAGCTCAGTCGGTAGAGCATCAGACTctaAA 462 26 TCTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCCTGTCCAGGCG LysTAGchr6.trna70 GCCTGGATAGCTCAGTTGGTAGAACATCAGACTctaAAT 463 27 CTGACGGtGCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCAGGCG LysTAGchr1.trna50 GCCCGGAGAGCTCAGTGGGTAGAGCATCAGACTctaAA 464 28 TCTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTCCTCGTTCGGGCA LysTAGchr6.trna53 ACCTGGGTAGCTCAGTAGGTAGAACATCAGACTctaAAT 465 29 CTGAGGGtCTAGGGTTCAAGTCCCTGTCCAGGCG LysTAGchr3.trna2 GCCTGGATAGCTCCTTCGGTAGAGCATCATcagACTcta 466 30 AATGTGAGGGtCCAGGGTTCAAGTTCCTGTTTGGGCG 1 CysTGAUndchr17.trna GGCAGAATGGTGCAGCGGTtcAGCACCCAGgCTCTtcaG 467 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO 20 cCAGCTGTTGCCTGGGCTCAAATCCCAGCTCTGCCA CysTGAchr5.trna30 GGCTGTATAGCTCAGTGGTAGAGCATTTGACTtcaGaatc 468 ctatactcaggggaaggagaactgggggtttctcagtgggtcaaaggacttgta gtggtaaatcaaaagcaactctataagctatgtaacaaaCTTTAAAGTCA 2 TAtGTAGcTGGGTTCAAATCCTGTTTCTGCCA CysTGAchr5.trna3/noi GGCTGTATAGCTCAGTGGTAGAGCATTTGACTtcaGCTT 469 ntron TAAAGTCATAtGTAGcTGGGTTCAAATCCTGTTTCTGCC 3 A CysTGAchr7.trna8 GGGGGCATAGCTCAGTGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 470 4 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna26 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 471 5 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCC CysTGAchr7.trna24 GGGGGTATAGCTTAGCGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 472 6 CAAGAGGtCCCCGGTTCAAATCCGGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna20 GGGGGTATAGCTTAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 473 7 CAAAAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCTT CysTGAchr7.trna29 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 474 8 CAAGAGGtCCCCAGTTCAAATCTGGGTGCCCCCT CysTGAchr17.trna28 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 475 9 CAAGAAGtCCCCGGTTCAAATCCGGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna13 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 476 10 CAAGAGGtCTCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna10 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCACTTGACTtcaGAT 477 11 CAAGAAGtCCTTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna19 GGGGATATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 478 12 CAAGAGGtCCCCGGTTCAAATCCGGGTGCCCCCC CysTGAchr7.trna27 GGGGGTATAGTTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 479 13 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna21 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaAAT 480 14 CAAGAGGtCCCTGATTCAAATCCAGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna14 GGGCGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 481 15 CAAGAGGtCCCCAGTTCAAATCTGGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna17 GGGGGTATAGCTCACAGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 482 16 CAAGAGGtCCCCGGTTCAAATCTGGGTGCCCCCT CysTGAchr7.trna11 GGGCGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 483 17 CAAGAGGtCCCCAGTTCAAATCTGGGTGCCCA CysTGAchr7.trna22 GGGGGTATAGCTCACAGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 484 18 CAAGAGGtCCCCGGTTCAAATCCGGTTACTCCCT tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO CysTGAchr17.trna29 GGGGGTAGGGCTCAGGGAtAGAGCATTTGACTtcaGAT 485 19 CAAGAGGtCCCCGGTTCGAATCTAGGTGCCCCCT CysTGAchr3.trna9 GGTATATCTCAGGGGGcAGAGCATTTGACTtcaGATCAA 486 20 GAGGtCCCCGGTTGAAATCCGGGTGCT CysTGAchr7.trna23 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCACTTGACTtcaGAT 487 21 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT CysTGAchr17.trna27 GGGGGTATAGCTCAGTGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 488 22 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCGGGTGCCCCCT CysTGAchr15.trna3 GGGGGTATAGCTCAGTGGGTAGAGCATTTGACTtcaGA 489 23 TCAAGAGGtCCCCGGTTCAAATCCGGGTGCCCCCT CysTGAchr3.trna6 GGGGGTGTAGCTCAGTGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 490 24 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT CysTGAchr14.trna9 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 491 25 CAAGAGGtCCCCGGTTCAAATCCGGGTGCCCCCT CysTGAchr3.trna5 GGGGGTATAGCTCAGGGGTAGAGCATTTGACTtcaGAT 492 26 CAAGAGGtCCCTGGTTCAAATCCAGGTGCCCCCT Mus_musculuschr11.tr GACCTCGTGGCGCAATGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 493 na817-Trp CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Mus_musculuschr10.tr GACCTCGTGGCACAATGGTAGCACGTCTGACTtcaGAT 494 na567 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Saccharomyces_cerevi GAAGCGGTGGCTCAATGGTAGAGCTTTCGACTtcaAttaa 495 siaechrVII.trna33 atcttggaaattccacggaataagattgcaATCGAAGGGtTGCAGGT

TCAATTCCTGTCCGTTTCA Saccharomyces_cerevi GAAGCGGTGGCTCAATGGTAGAGCTTTCGACTtcaAAT 496 siaechrVII.trna33 CGAAGGGtTGCAGGTTCAATTCCTGTCCGTTTCA Pan_troglodyteschr7.tr GGCCTCATGGTGCAACAGTAGTGTGTCTGACTtcaGAT 497 na28 CAGAAGGtTGTATGTTCAAATCACATAGGGGTCA Oryctolagus_cuniculus GACCTCGTGGTGAAATGGTAGCATGTTTGACTtcaAATC 498 chrUn0422.trna1 AGGAGGTTGTGTGTTCAAGTCACATCAGGGTCA Oryctolagus_cuniculus GACCTTGTGGCGCAATGGTAGCATGTTTGACTtcaAATC 499 _chrUn0563.trna1 AGGAGGTTGTGTGTTCAAGTCACATCAGGGTCA Oryctolagus_cuniculus GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 500 _chrUn0062.trna12 CAGAAGGCTGCGTGTTCGAATCACGCCGGGGTCA Rattus_norvegicus_chr GACCTTGTGGCTCAATGGTAGCGCATCTGACTtcaGAT 501

13.trna4571 CAGGAGGTTGCACGTTCAAATCATGCCGGGGTCA Rattus_norvegicus_chr GACCTTGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 502

17.trna3948 CAGAAGGTTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 503 tRNAscan-SE ID Sequência SEQ ID NO NA-Trp-CCA-10-1 CAGAAGGtTGCGTATTCAAATCACGTCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR GACCTCGTGGCGCAACGGCAGCGCGTCTGACTtcaCAT 504 NA-Trp-CCA-11-1 TAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR GACCTCATGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 505 NA-Trp-CCA-12-1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACATCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR GACCTCGTGGTGCAACGGTAGCGCGTATGATTtcaGAT 506 NA-Trp-CCA-13-1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR GACCTCGTAGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 507 NA-Trp-CCA-3-1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR AGGGGTATAGCTCAATTGGCAGAGCGTCGGTCTtcaAA 508 NA-Trp-CCA-5-1 ACCGAAGGtTGTAGGTTCGATTCCTACTGCCCCTGCCA Xenopus_tropicalis_tR GACCTCATGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 509 NA-Trp-CCA-6-1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTAACTtcaGAT 510 NA-Trp-CCA-7-1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Xenopus_tropicalis_tR ACGGGAGTAGCTCAGTTGGTAGAGCACCGGTCTtcaAA 511 NA-Trp-CCA-8-1 ACCGGGTGtCGGGAGTTCGAGCCTCTCCTCCCGTG Xenopus_tropicalis_tR GACCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 512 NA-Trp-CCA-9-1 CAGAAGGtTGCATGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Drosophila_melanogas GACTCCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCCGACTtcaGAT 513 ter_tRNA-Trp-CCA-2-1 CGGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA Drosophila_melanogas GACTCCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 514 ter_tRNA-Trp-CCA-1-1 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA TrpWT-chr17.trna39 GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTccaGA 515 TCAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA HirshWT GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCaCGTCTGACTccaGAT 516 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA HirshACE-tRNA CGGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCaCGTCTGACTtcaGA 517 TCAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA G9CWT GGCCTCGTcGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTccaGAT 518 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA G9CACE-tRNA GGCCTCGTcGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtcaGAT 519 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA G9C+HirshWT GGCCTCGTcGCGCAACGGTAGCaCGTCTGACTccaGAT 520 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA G9C+HirshACE-tRNA GGCCTCGTcGCGCAACGGTAGCaCGTCTGACTtcaGAT 521 CAGAAGGtTGCGTGTTCAAATCACGTCGGGGTCA

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[250] Embora o relatório e exemplos acima descrevam e habilitem em sua totalidade a presente invenção, eles não pretendem limitar o escopo da invenção, que é definido pelas reivindicações apenas à mesma.

[251] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporados a título de referência. Embora o relatório acima na presente invenção tenha sido descrito em relação a certas modalidades da mesma, e muitos detalhes tenham sido mostrados para propósitos de ilustração, será aparente àqueles versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que certos dos detalhes descritos aqui podem ser variados consideravelmente sem se afastar dos princípios básicos da invenção.

[252] O uso dos termos “um” e “um” e “o” e “a” e referentes similares no contexto de descrição da invenção deve ser considerado compreender ambos o singular e o plural, a menos que de outro modo aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” e “contendo” devem ser considerados termos abertos (isto é, significando “incluindo, mas não limitado a”) a menos que de outro modo mencionado. Menção de faixas de valores aqui pretende apenas servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado se encaixando na faixa, a menos que de outro modo aqui indicado, e cada valor separado é incorporado ao relatório como se ele fosse individualmente mencionado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou expressão exemplar (por exemplo, “tal como”) provida aqui, pretende apenas iluminar melhor a invenção e não impõe uma limitação ao escopo da invenção a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma expressão no relatório deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[253] Modalidades da presente invenção são descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido dos inventores para realizar a invenção. Variações nessas modalidades podem ser tornar aparentes àqueles de habilidade na técnica quando da leitura da descrição acima.

Os inventores esperam que o versado empregue tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outro modo que não conforme aqui especificamente descrito.

Desta maneira, a presente invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria-objeto mencionados nas reivindicações apensas à mesma conforme permitido pela lei aplicável.

Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as suas variações possíveis é compreendida pela invenção a menos que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. RNA de transferência (tRNA) modificado compreendendo um braço T, um braço D, um braço de anticódon e um braço aceitador, caracterizado pelo fato de que o braço T compreende uma haste T tendo nucleotídeos que interagem com o Fator de Alongamento 1-alfa 1 (EF1alfa).

2. RNA de transferência (tRNA) modificado, caracterizado pelo fato de que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-538, em que as timidina são substituídas com uracilas.

3. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 4, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

4. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 16, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

5. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 24, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

6. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 33, em que as timidinas são substituídas com uracilas

7. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 38, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

8. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 44, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

9. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 48, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

10. RNA de transferência (tRNA) modificado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tRNA consiste na SEQ ID NO: 53, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

11. RNA de transferência (tRNA) modificado, caracterizado pelo fato de que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 56-60, 62- 66, 84-86, 90-111, 113, 128-143, 147-149, 153-156, 161-174, 176, 178, 181, 184-186, 192, 196-197, 199-201, 205, 213-240, 246, 255-256, 258- 285, 299, 305-312, 314, 318-332, 335-344, 346, 350-354, 357-360, 362, 365-370, 372-383, 388-390, 392, 394-401, 403-407, 414-416, 418, 422, 425, 428-433, 437, 444-445, 452, 455, 459-463, 470, 472-474, 476, 487- 492, 525, 530-539, 545-550, 553-555, 561-563 e 567-579, em que as timidinas são substituídas com uracilas.

12. RNA de transferência (tRNA) modificado, caracterizado pelo fato de que compreende um braço T, um braço D, um braço de anticódon e um braço aceitador, (a) em que o braço de anticódon compreende um anticódon de trinucleotídeo, em que o anticódon é 5’-UCA-3’ e reconhece códons de parada TGA, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a uma arginina, triptofano ou glicina; (b) em que o braço de anticódon compreende um anticódon de trinucleotídeo, em que o anticódon é 5’-UUA-3’ e reconhece códons de parada TAA, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a uma glutamina ou glutamato; ou (c) em que o braço de anticódon compreende um anticódon de trinucleotídeo, em que o anticódon é 5’-CUA-3’ e reconhece códons de parada TAG, e em que o braço aceitador é operavelmente ligado a um triptofano, glutamato ou glutamina.

13. tRNA modificado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o braço T compreende substituição de nucleotídeo racional que aumenta ou ajusta a interação com Fator de

Alongamento 1-alfa 1 (EF1alfa).

14. Sequência de oligonucleotídeo que codificado o tRNA modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo tem um comprimento total de menos do que 150 nucleotídeos.

15. Oligonucleotídeo compreendendo uma primeira sequência de oligonucleotídeo e uma segunda sequência de oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que as primeira e segunda sequências de oligonucleotídeo codificam independentemente um tRNA modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que os primeiro e segundo oligonucleotídeos têm independentemente um comprimento total de menos do que 150 nucleotídeos, e em que as duas sequências estão em tandem.

16. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é DNA.

17. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor e um ácido nucleico codificando o tRNA modificado de como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou as sequências de oligonucleotídeo como definidas em qualquer uma das reivindicações 14 a 16.

18. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 16 ou o cassete de expressão como definido na reivindicação 17.

19. Vetor de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral ou de plasmídeo.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: o tRNA modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, o oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 16 ou o vetor como definido na reivindicação 18 ou 19, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o veículo é um lipossoma.

22. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 18 ou 19.

23. Método de tratamento de uma doença genética associada a códon de parada, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição como definida na reivindicação 20 ou 21 a um paciente com necessidade do mesmo.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a doença genética associada com um códon de parada prematuro é fibrose cística, distrofia muscular, β- talassemia ou síndrome de Liddle.

25. Método de restauração da tradução para uma sequência de nucleotídeo que inclui uma mutação sem sentido em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na célula a composição como definida na reivindicação 20 ou 21, em que o tRNA modificado restaura a tradução para a sequência de nucleotídeo que inclui uma mutação sem sentido.