JP2023516692A - ゲノムを調節するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
標的ゲノムを調節するための方法及び組成物が開示される。
Description
関連出願
本出願は、２０２０年５月４日に提出された米国特許出願第６２／９８５，２９１号明細書、及び２０２０年６月５日に提出された米国特許出願第６３／０３５６３８号明細書に対する優先権を主張し、それらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月４日に提出された米国特許出願第６２／９８５，２９１号明細書、及び２０２０年６月５日に提出された米国特許出願第６３／０３５６３８号明細書に対する優先権を主張し、それらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ゲノムへの目的の核酸の組込みは、挿入事象を促進するための特殊なタンパク質の非存在下において、低頻度で起こり、しかも部位特異性はほとんどない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のようないくつかの存在する手法は、小さい編集により適しており、長い配列の組込みには有効性が低い。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰといった他の既存の手法は、ｌｏｘＰ部位をゲノムに挿入する第１ステップ、次いで目的の配列をｌｏｘＰ部位に挿入する第２ステップを必要とする。当技術分野では、ゲノム内に目的の配列を挿入するための改善されたタンパク質が必要とされている。
本開示は、宿主細胞、組織若しくは対象における１つ若しくは複数の位置のゲノムをインビボ又はインビトロで改変するための新規の組成物、システム及び方法に関する。特に、本発明は、宿主ゲノム中に外因性遺伝因子の導入のための組成物、システム及び方法を特徴とする。
組成物又は方法の構成は、以下に列挙される実施形態の１つ以上を含み得る。
１．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ポリペプチドが、核小体局在化シグナルを不活性化及び／又は欠失する突然変異を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ポリペプチドが、核小体局在化シグナルを不活性化及び／又は欠失する突然変異を含む、システム。
２．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）例えば、第１のＺｎフィンガードメインを含む第１の標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、及び（ｉｖ）第１の標的ＤＮＡ結合ドメインに対して異種である、例えば、第２のＺｎフィンガードメインを含む第２の標的ＤＮＡ結合ドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、（ａ）が、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含む同様のポリペプチドより、標的細胞内のより少ない数の標的ＤＮＡ配列に結合し、例えば、ここで、第１のＤＮＡ結合ドメインとともにポリペプチド中の第２の標的ＤＮＡ結合ドメインの存在が、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含むポリペプチドのポリペプチド標的配列特異性に対する、ポリペプチドの標的配列を改善する、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）例えば、第１のＺｎフィンガードメインを含む第１の標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、及び（ｉｖ）第１の標的ＤＮＡ結合ドメインに対して異種である、例えば、第２のＺｎフィンガードメインを含む第２の標的ＤＮＡ結合ドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、（ａ）が、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含む同様のポリペプチドより、標的細胞内のより少ない数の標的ＤＮＡ配列に結合し、例えば、ここで、第１のＤＮＡ結合ドメインとともにポリペプチド中の第２の標的ＤＮＡ結合ドメインの存在が、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含むポリペプチドのポリペプチド標的配列特異性に対する、ポリペプチドの標的配列を改善する、システム。
３．（ｉｉｉ）が（ｉｖ）を含む、実施形態２に記載のシステム。
４．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
システムが、標的ＤＮＡの第１の鎖を、少なくとも２回（例えば、２回）切断することが可能であり、
任意選択で、ここで、切断が、互いに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００ヌクレオチド離れている（及び任意選択で、互いに５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド以下離れている）、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
システムが、標的ＤＮＡの第１の鎖を、少なくとも２回（例えば、２回）切断することが可能であり、
任意選択で、ここで、切断が、互いに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００ヌクレオチド離れている（及び任意選択で、互いに５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド以下離れている）、システム。
５．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、システムが、標的ＤＮＡの第１の鎖及び第２の鎖を切断することが可能であり、
切断間の距離が、エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、天然レトロトランスポザーゼのエンドヌクレアーゼドメインによって形成される切断間の距離と同じである、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、システムが、標的ＤＮＡの第１の鎖及び第２の鎖を切断することが可能であり、
切断間の距離が、エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、天然レトロトランスポザーゼのエンドヌクレアーゼドメインによって形成される切断間の距離と同じである、システム。
６．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）が、ポリペプチドをコードする配列、異種対象配列（例えば、異種対象配列に含まれるコード配列）、又は両方に動作可能に連結された５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲをさらに含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）が、ポリペプチドをコードする配列、異種対象配列（例えば、異種対象配列に含まれるコード配列）、又は両方に動作可能に連結された５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲをさらに含む、システム。
７．５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲが、動作可能に連結された配列の発現を、異種対象配列に関連する内因性ＵＴＲ又は最小５’ＵＴＲ及び最小３’ＵＴＲを含む以外は同様の核酸と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増加させる、実施形態６に記載のシステム。
８．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の第２の鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’標的相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み；
（ｉ）ポリペプチドは、標的部位内に含まれる配列に特異的に結合する異種標的化ドメインを（例えば、ＤＢＤ又はエンドヌクレアーゼドメイン内に）含み；及び／又は
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡは、標的部位内に含まれる配列に対する相同性が少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である異種相同配列を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の第２の鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’標的相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み；
（ｉ）ポリペプチドは、標的部位内に含まれる配列に特異的に結合する異種標的化ドメインを（例えば、ＤＢＤ又はエンドヌクレアーゼドメイン内に）含み；及び／又は
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡは、標的部位内に含まれる配列に対する相同性が少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である異種相同配列を含む、システム。
９．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｉｉ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）、又はそれらの組合せに対して異種であるリボザイムを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｉｉ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）、又はそれらの組合せに対して異種であるリボザイムを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、システム。
１０．リボザイムが、（ｂ）（ｉ）に対して異種である、実施形態９に記載のシステム。
１１．鋳型ＲＮＡが、（ｉｖ）例えば、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）、又はそれらの組合せに対して内因性である第２のリボザイムを含み、例えば、第２のリボザイムが、（ｂ）（ｉ）に対して内因性である、実施形態９又は１０に記載のシステム。
１２．異種リボザイムが、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）、又はそれらの組合せに対して内因性のリボザイムを置き換え、例えば、第２のリボザイムが、（ｂ）（ｉ）に対して内因性である、実施形態９又は１０に記載のシステム。
１３．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
任意選択で、（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉ）異種対象配列、（ｉｉｉ）フラグメント及び切断された鋳型ＲＮＡへと切断可能な５’ＵＴＲを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、ここで、５’ＵＴＲが、任意選択で、ポリペプチドに結合する配列であり、
ここで、例えば、フラグメントが、例えば、ストリンジェントな条件下で、切断された鋳型ＲＮＡ（例えば、切断された鋳型ＲＮＡの５’ＵＴＲ）にハイブリダイズするように、５’ＵＴＲが、（例えば、例えば本明細書に記載される野生型５’ＵＴＲと比べて）切断された鋳型ＲＮＡに対するフラグメントの親和性を増加させる１つ以上の突然変異を含み、例えば、ここで、ストリンジェントな条件が、約６５℃で４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、約６５℃で１×ＳＳＣ中での洗浄を含む、システム。
任意選択で、（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉ）異種対象配列、（ｉｉｉ）フラグメント及び切断された鋳型ＲＮＡへと切断可能な５’ＵＴＲを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、ここで、５’ＵＴＲが、任意選択で、ポリペプチドに結合する配列であり、
ここで、例えば、フラグメントが、例えば、ストリンジェントな条件下で、切断された鋳型ＲＮＡ（例えば、切断された鋳型ＲＮＡの５’ＵＴＲ）にハイブリダイズするように、５’ＵＴＲが、（例えば、例えば本明細書に記載される野生型５’ＵＴＲと比べて）切断された鋳型ＲＮＡに対するフラグメントの親和性を増加させる１つ以上の突然変異を含み、例えば、ここで、ストリンジェントな条件が、約６５℃で４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、約６５℃で１×ＳＳＣ中での洗浄を含む、システム。
１４．鋳型ＲＮＡ、例えば、５’ＵＴＲが、鋳型ＲＮＡ（例えば、５’ＵＴＲ中）を切断するリボザイムを含む、実施形態１３に記載のシステム。
１５．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）が、ポリペプチドの発現を増加させるイントロン、異種対象配列（例えば、異種対象配列中に位置するコード配列）、又は両方を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）が、ポリペプチドの発現を増加させるイントロン、異種対象配列（例えば、異種対象配列中に位置するコード配列）、又は両方を含む、システム。
１６．細胞、組織又は対象における標的ＤＮＡを修飾する方法であって、システムを細胞に投与することを含み、システムが、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、システムが、鋳型ＲＮＡ配列を、標的ＤＮＡ鎖中に逆転写し、それによって、標的ＤＮＡ鎖を修飾し、
ここで、細胞が、Ｒａｄ５１修復経路活性を低下させ、Ｒａｄ５１若しくはＲａｄ５１修復経路の構成要素の発現を低下させ、又は機能的Ｒａｄ５１修復経路を含まず、例えば、機能的Ｒａｄ５１遺伝子を含まず、例えば、Ｒａｄ５１遺伝子又はＲａｄ５１修復経路中の別の遺伝子の１つ又は両方のコピーを不活性化する突然変異（例えば、欠失）を含む、方法。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、システムが、鋳型ＲＮＡ配列を、標的ＤＮＡ鎖中に逆転写し、それによって、標的ＤＮＡ鎖を修飾し、
ここで、細胞が、Ｒａｄ５１修復経路活性を低下させ、Ｒａｄ５１若しくはＲａｄ５１修復経路の構成要素の発現を低下させ、又は機能的Ｒａｄ５１修復経路を含まず、例えば、機能的Ｒａｄ５１遺伝子を含まず、例えば、Ｒａｄ５１遺伝子又はＲａｄ５１修復経路中の別の遺伝子の１つ又は両方のコピーを不活性化する突然変異（例えば、欠失）を含む、方法。
１７．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、異種対象配列が、表１０Ａ～１０Ｄ又は１１Ａ～１１Ｇのいずれかの配列、例えば、遺伝子又はそのフラグメントを含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、異種対象配列が、表１０Ａ～１０Ｄ又は１１Ａ～１１Ｇのいずれかの配列、例えば、遺伝子又はそのフラグメントを含む、システム。
１８．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、ポリペプチドが、強化された活性又は改変された特異性のために修飾される、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、ポリペプチドが、強化された活性又は改変された特異性のために修飾される、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、システム。
１９．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、鋳型ＲＮＡが、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、５’リン酸リボチミジン、２’－Ｏ－メチルリボチミジン、２’－Ｏ－エチルリボチミジン、２’－フルオロリボチミジン、Ｃ－５プロピニル－デオキシシチジン（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－デオキシウリジン（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－シチジン（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－ウリジン（ｐＵ）、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、５－メチルデオキシシチジン、５－メチルデオキシウリジンメトキシ、２，６－ジアミノプリン、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆ－シチジン（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｆＵ）、５－メチルｆ－シチジン、５－メチルｆ－ウリジン、Ｃ－５プロピニル－ｍ－シチジン（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｍＵ）、５－メチルｍ－シチジン、５－メチルｍ－ウリジン、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＭＧＢ（マイナーグルーブバインダー）プソイドウリジン（Ψ）、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、又は５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）から選択される１つ以上の化学修飾を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、鋳型ＲＮＡが、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、５’リン酸リボチミジン、２’－Ｏ－メチルリボチミジン、２’－Ｏ－エチルリボチミジン、２’－フルオロリボチミジン、Ｃ－５プロピニル－デオキシシチジン（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－デオキシウリジン（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－シチジン（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－ウリジン（ｐＵ）、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、５－メチルデオキシシチジン、５－メチルデオキシウリジンメトキシ、２，６－ジアミノプリン、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆ－シチジン（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｆＵ）、５－メチルｆ－シチジン、５－メチルｆ－ウリジン、Ｃ－５プロピニル－ｍ－シチジン（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｍＵ）、５－メチルｍ－シチジン、５－メチルｍ－ウリジン、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＭＧＢ（マイナーグルーブバインダー）プソイドウリジン（Ψ）、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、又は５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）から選択される１つ以上の化学修飾を含む、システム。
２０．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、任意選択で、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、ポリペプチドが、（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の一部を置換するか、又は（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）のうちの２つを連結する内因性リンカーを置換する異種リンカーを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、任意選択で、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、ポリペプチドが、（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の一部を置換するか、又は（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）のうちの２つを連結する内因性リンカーを置換する異種リンカーを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
２１．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉ）異種対象配列、（ｉｉｉ）鋳型ＲＮＡの５’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％同一性の少なくとも５又は少なくとも１０個の塩基を有する第１のホモロジードメイン、及び（ｉｖ）鋳型ＲＮＡの３’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％同一性の少なくとも５又は少なくとも１０個の塩基を有する第２のホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉ）異種対象配列、（ｉｉｉ）鋳型ＲＮＡの５’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％同一性の少なくとも５又は少なくとも１０個の塩基を有する第１のホモロジードメイン、及び（ｉｖ）鋳型ＲＮＡの３’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％同一性の少なくとも５又は少なくとも１０個の塩基を有する第２のホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
２２．ポリペプチドが、核小体局在化シグナルを不活性化及び／又は欠失する突然変異を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
２３．核小体局在化シグナルの活性が、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％低下される、実施形態２２に記載のシステム。
２４．ポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、内因性ＮＬＳ又は外因性ＮＬＳを含む、実施形態２２又は２３のいずれかに記載のシステム。
２５．（ａ）のポリペプチドが、標的ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼドメインが、標的ＤＮＡ結合ドメインを含む）、例えば、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインを含み、又は（ａ）が、標的ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、第１の標的結合ドメインをさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
２６．
（ａ）のポリペプチドが、例えば、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインに対して又はエンドヌクレアーゼドメインに対して異種である、第２の標的ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｚｎフィンガードメインをさらに含む、実施形態２５に記載のシステム。
（ａ）のポリペプチドが、例えば、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインに対して又はエンドヌクレアーゼドメインに対して異種である、第２の標的ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｚｎフィンガードメインをさらに含む、実施形態２５に記載のシステム。
２７．エンドヌクレアーゼドメインが、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインを含む、実施形態２６に記載のシステム。
２８．第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ活性に影響を与える、実施形態２６又は２７に記載のシステム。
２９．第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ポリペプチドのＤＮＡニッキング活性に影響を与える、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３０．第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、表Ｅ３中に示される遺伝子座に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３１．表Ｅ３中の遺伝子座が、少なくとも６のゲノムスコアを有する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３２．（ａ）のポリペプチドが、第１の標的ＤＮＡ結合ドメイン又は第２の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含む同様のポリペプチドより少ない数の標的ＤＮＡ配列に結合し、例えば、ここで、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインとともにポリペプチド中の第２の標的ＤＮＡ結合ドメインの存在が、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含むポリペプチドのポリペプチド標的配列特異性と比べて、ポリペプチドの標的配列特異性を改善する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３３．第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが結合するゲノム配列から１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド未満離れたゲノムＤＮＡ配列に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３４．第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが結合するゲノム配列から１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、１～５、５～１００、５～９０、５～８０、５～７０、５～６０、５～５０、５～４０、５～３０、５～２０、５～１０、１０～１００、１０～９０、１０～８０、１０～７０、１０～６０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、２０～３０、３０～１００、３０～９０、３０～８０、３０～７０、３０～６０、３０～５０、３０～４０、４０～１００、４０～９０、４０～８０、４０～７０、４０～６０、４０～５０、５０～１００、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５０～６０、６０～１００、６０～９０、６０～８０、６０～７０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、８０～１００、８０～９０、又は９０～１００ヌクレオチド離れたゲノムＤＮＡ配列に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３５．第１又は第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬエフェクタードメイン、Ｚｎフィンガードメイン、又はメガヌクレアーゼドメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３６．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクタードメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３７．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｚｎフィンガードメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３８．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
３９．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼドメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４０．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクタードメインを含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｚｎフィンガードメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４１．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクタードメインを含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクタードメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４２．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクタードメインを含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼドメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４３．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｚｎフィンガードメインを含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｚｎフィンガードメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４４．第１の標的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｚｎフィンガードメインを含み、第２の標的ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼドメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４５．第２のＤＮＡ結合ドメインが、ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）部位又はゲノムＮａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位における配列に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４６．システムが、標的ＤＮＡの第１の鎖及び標的ＤＮＡの第２の鎖を切断することが可能であり、例えば、ここで、切断が、互いに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００ヌクレオチド離れている（及び任意選択で、互いに５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド以下離れている）、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４７．システムが、標的ＤＮＡの第１の鎖を、少なくとも２回（例えば、２回）切断することが可能であり、例えば、ここで、切断が、互いに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００ヌクレオチド離れている（及び任意選択で、互いに５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド以下離れている）、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４８．切断が、互いに１～５００、１～４００、１～３００、１～２００、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、１～５、５～５００、５～４００、５～３００、５～２００、５～１００、５～９０、５～８０、５～７０、５～６０、５～５０、５～４０、５～３０、５～２０、５～１０、１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～９０、１０～８０、１０～７０、１０～６０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２０～５００、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、２０～３０、３０～５００、３０～４００、３０～３００、３０～２００、３０～１００、３０～９０、３０～８０、３０～７０、３０～６０、３０～５０、３０～４０、４０～５００、４０～４００、４０～３００、４０～２００、４０～１００、４０～９０、４０～８０、４０～７０、４０～６０、４０～５０、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５０～６０、６０～５００、６０～４００、６０～３００、６０～２００、６０～１００、６０～９０、６０～８０、６０～７０、７０～５００、７０～４００、７０～３００、７０～２００、７０～１００、７０～９０、７０～８０、８０～５００、８０～４００、８０～３００、８０～２００、８０～１００、８０～９０、９０～５００、９０～４００、９０～３００、９０～２００、９０～１００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～５００、３００～４００、又は４００～５００ヌクレオチド離れている、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４９．切断間の距離が、エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、天然レトロトランスポザーゼのエンドヌクレアーゼドメインによって形成される切断間の距離と同じである、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５０．２つの切断が両方とも、同じエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、鋳型ＲＮＡに配置される、例えば、複数のｇＲＮＡによって指向される、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質）によって形成される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５１．ポリペプチドが、第２のエンドヌクレアーゼドメインをさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５２．
ｉ）第１のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの編集対象鎖を切断し、第２のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの非編集鎖を切断するか、又は
ｉｉ）第１のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの編集対象鎖への２つの切断の一方を形成し、第２のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの編集対象鎖への切断の他方を形成する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
ｉ）第１のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの編集対象鎖を切断し、第２のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの非編集鎖を切断するか、又は
ｉｉ）第１のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの編集対象鎖への２つの切断の一方を形成し、第２のエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼ）が、標的ＤＮＡの編集対象鎖への切断の他方を形成する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５３．（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）が、ポリペプチドをコードする配列、異種対象配列（例えば、異種対象配列に含まれるコード配列）、又は両方に動作可能に連結された５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲをさらに含み、ここで、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲが、動作可能に連結された配列の発現を増加させる、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５４．５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲが：
鋳型ＲＮＡ、（ａ）から転写されたＲＮＡ、又は両方の安定性、例えば、半減期を増加させ；及び／又は
異種対象配列、ポリペプチド、又は両方の翻訳効率を増加させる、先行する実施形態に記載のシステム。
鋳型ＲＮＡ、（ａ）から転写されたＲＮＡ、又は両方の安定性、例えば、半減期を増加させ；及び／又は
異種対象配列、ポリペプチド、又は両方の翻訳効率を増加させる、先行する実施形態に記載のシステム。
５５．５’ＵＴＲが、補体因子３（Ｃ３）又は機能的フラグメント若しくは変異体からの５’ＵＴＲを含む、先行する実施形態に記載のシステム。
５６．３’ＵＴＲが、オロソムコイド１（ＯＲＭ１）又は機能的フラグメント若しくは変異体からの３’ＵＴＲを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５７．
ｉ）５’ＵＴＲが、例えば、異種対象配列に関連する内因性ＵＴＲ又は最小５’ＵＴＲ及び最小３’ＵＴＲを含む以外は同様の核酸と比べて、翻訳速度を増加させ、
ｉｉ）３’ＵＴＲが、例えば、異種対象配列に関連する内因性ＵＴＲ又は最小５’ＵＴＲ及び最小３’ＵＴＲを含むそれ以外は同様の核酸と比べて、核酸半減期を増加させ、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
ｉ）５’ＵＴＲが、例えば、異種対象配列に関連する内因性ＵＴＲ又は最小５’ＵＴＲ及び最小３’ＵＴＲを含む以外は同様の核酸と比べて、翻訳速度を増加させ、
ｉｉ）３’ＵＴＲが、例えば、異種対象配列に関連する内因性ＵＴＲ又は最小５’ＵＴＲ及び最小３’ＵＴＲを含むそれ以外は同様の核酸と比べて、核酸半減期を増加させ、又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５８．鋳型ＲＮＡが、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）、又はそれらの組合せに対して異種であるリボザイムを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
５９．異種リボザイムが、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）、又はそれらの組合せに対して内因性のリボザイムを置き換えた、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６０．鋳型ＲＮＡが、例えば、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）、又はそれらの組合せに対して内因性である第２のリボザイムを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６１．異種リボザイムが、鋳型ＲＮＡの５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ中に位置する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６２．異種リボザイムが、異種対象配列の５’又は異種対象配列の３’である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６３．異種リボザイムが、リボザイムを含むＲＮＡを、例えば、リボザイムの５’、リボザイムの３’、又はリボザイム内で切断することが可能である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６４．異種リボザイムが、異種対象配列の５’であり、異種リボザイムの３’を切断し、例えば、ここで、異種リボザイムが、合成又は天然ハンマーヘッド型リボザイムである、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６５．異種リボザイムが、異種対象配列の３’であり、異種リボザイムの５’を切断し、例えば、ここで、異種リボザイムが、ＨＤＶファミリーリボザイム又はハチェット型リボザイムから選択される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６６．鋳型ＲＮＡが、リボザイムハイブリダイズ領域、例えば、ホモロジーアームなどを通して、改変された標的化を有する鋳型をさらに含み、リボザイムハイブリダイズ領域を含む修飾５’ＵＴＲを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６７．リボザイムの一部が、リボザイムの配列５’又は３’に（例えばワトソン・クリック型塩基対形成によって）ハイブリダイズする、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６８．リボザイム配列が、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、２５又はそれ以上の塩基対だけ、その天然配列から改変される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
６９．リボザイム配列が、標的リボザイムの５’又は３’であるホモロジーアームにハイブリダイズするために、その天然配列から改変される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７０．システムが、異種リボザイムを欠くそれ以外は同様のシステムより高い効率で異種対象配列を標的ゲノムへと統合し、例えば、ここで、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０５、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％多い細胞が、異種リボザイムを欠くシステムと比較して、異種リボザイムを含むシステムの存在下で統合を示す、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７１．鋳型ＲＮＡが、フラグメント及び切断された鋳型ＲＮＡへと切断可能な５’ＵＴＲを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７２．鋳型ＲＮＡが、例えば、５’ＵＴＲ中で、鋳型ＲＮＡを切断するリボザイムを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７３．５’ＵＴＲが、（例えば、例えば、表１若しくは３中、又は表２中に列挙されるたんぱく質ドメインからの、本明細書に記載される野生型５’ＵＴＲと比べて）１つ以上の突然変異を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７４．例えば、フラグメントが、ストリンジェントな条件下で、切断された鋳型ＲＮＡ（例えば、切断された鋳型ＲＮＡの５’ＵＴＲ）にハイブリダイズするように、１つ以上の突然変異が、切断された鋳型ＲＮＡに対するフラグメントの親和性を増加させ、例えば、ここで、ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件が、約６５℃で４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、約６５℃で１×ＳＳＣ中での洗浄を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７６．（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）が、ポリペプチドの発現を増加させるイントロン、異種対象配列（例えば、異種対象配列中に位置するコード配列）、又は両方を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７７．イントロンが、ポリペプチドをコードする配列、異種対象配列（例えば、異種対象配列中に位置するコード配列）、又は両方に動作可能に連結される（例えば、細胞スプライシングタンパク質によって認識される）、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７８．イントロンが、５’ＵＴＲ（例えば、異種対象配列の５’）中に位置する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
７９．イントロンが、異種対象配列のコード配列中に位置する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８０．イントロンが、異種対象配列のコード配列に関して順方向に位置する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８１．イントロンが、異種対象配列のコード配列に関して逆方向に位置する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８２．イントロンが、鋳型ＲＮＡの転写の後、及び標的、例えば、ゲノム、ＤＮＡへの標的プライム逆転写の前にスプライシングされる、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８３．異種対象配列が、標的、例えば、ゲノム、ＤＮＡに統合された後、イントロンが、異種対象配の転写の後にスプライシングされる、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８４．イントロンが、マイクロＲＮＡ結合部位を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８５．エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｒ２Ｔｇ又はＲ２－１＿ＺＡのエンドヌクレアーゼドメイン）が、モチーフ（例えば、ＧＧ又はＡＡＧＧ、ＴＡＡＧＧＴ、又はＴＴＡＡＧＧＴＡＧＣ）を認識し、異種ＤＮＡ結合ドメインが、ゲノムＤＮＡ配列を認識し、ここで、モチーフ及びゲノムＤＮＡ配列が、互いに１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、又は２００～２５０ヌクレオチド以内であり、任意選択で、ここで、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフが、ＴＴＡＡＧＧＴＡＧＣ、ＡＡＧＧＴＡＧＣＣＡＡＡ、若しくはＴＡＡＧＧＴＡＧＣＣＡＡＡの４、５、６、７、８、９、若しくは１０連続ヌクレオチドを含み、又は、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフが、ＡＡＧＧの２若しくは３連続ヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
８６．モチーフが、ゲノムＤＮＡ配列の上流にあり、例えば、モチーフが、ゲノムＤＮＡ配列の約３０～８０、４０～７０、５０～６０、又は５５ｎｔ上流にある、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８７．モチーフが、ゲノムＤＮＡ配列の下流にあり、例えば、モチーフが、ゲノムＤＮＡ配列の約１０～３０、１５～２５、又は２０ｎｔ下流にある、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８８．モチーフが、ゲノムＤＮＡ配列と同じ配向であるか、又はゲノムＤＮＡ配列と逆相補配向である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
８９．異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、亜鉛フィンガードメイン）が、エンドヌクレアーゼドメインのＮ末端又はＣ末端である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
９０．リンカー（例えば、表３８のリンカー）が、異種ＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとの間に配置される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
９１．システムが、１つ以上の環状ＲＮＡ分子（ｃｉｒｃＲＮＡ）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
９２．ｃｉｒｃＲＮＡが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
９３．ｃｉｒｃＲＮＡが、鋳型ＲＮＡを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
９４．ｃｉｒｃＲＮＡが、宿主細胞に送達される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
９５．ｃｉｒｃＲＮＡが、例えば、宿主細胞内、例えば、宿主細胞の核内で線形化可能である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
９５．ｃｉｒｃＲＮＡが、切断部位を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
９７．ｃｉｒｃＲＮＡが、第２の切断部位をさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
９８．切断部位が、リボザイム、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡに含まれるリボザイムによって（例えば、自己切断によって）切断され得る、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
９９．ｃｉｒｃＲＮＡが、リボザイム配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１００．リボザイム配列が、例えば、宿主細胞内、例えば、宿主細胞の核内で自己切断可能である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０１．リボザイムが、誘導性リボザイムである、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０２．リボザイムが、タンパク質応答性リボザイム、例えば、核タンパク質、例えば、ゲノム相互作用タンパク質、例えば、エピジェネティック修飾因子、例えば、ＥＺＨ２に応答するリボザイムである、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０３．リボザイムが、核酸応答性リボザイムである、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０４．リボザイムの触媒活性（例えば、自己触媒活性）が、標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、又はｍｔＲＮＡ）の存在下で活性化される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０５．リボザイムが、標的タンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質）に応答する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０６．標的タンパク質が、細胞質に限局されるか、又は核（例えば、エピジェネティック修飾因子若しくは転写因子）に限局される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０７．リボザイムが、Ｂ２若しくはＡＬＵレトロトランスポゾンのリボザイム配列、又はそれに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０８．リボザイムが、それに対するタバコ輪点ウイルスハンマーヘッド型リボザイムの配列、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１０９．リボザイムが、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムの配列、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１１０．リボザイムが、標的細胞又は標的組織内で発現される部分によって活性化される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１１１．リボザイムが、標的細胞内コンパートメント（例えば、核、核小体、細胞質、又はミトコンドリア）内で発現される部分によって活性化される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１１２．リボザイムが、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡに含まれる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１１３．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムのポリペプチドをコードする第１の環状ＲＮＡ；及び
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの鋳型ＲＮＡを含む第２の環状ＲＮＡ
を含むシステム。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの鋳型ＲＮＡを含む第２の環状ＲＮＡ
を含むシステム。
１１４．鋳型ＲＮＡ、例えば、５’ＵＴＲが、鋳型ＲＮＡ（例えば、５’ＵＴＲ中）を切断するリボザイムを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１１５．鋳型ＲＮＡが、（ａ）（ｉ）（逆転写酵素ドメイン）、（ａ）（ｉｉ）（エンドヌクレアーゼドメイン）、（ｂ）（ｉ）（ポリペプチドに結合する鋳型ＲＮＡの配列）、又はそれらの組合せに対して異種であるリボザイムを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１１６．異種リボザイムが、リボザイムを含むＲＮＡを、例えば、リボザイムの５’、リボザイムの３’、又はリボザイム内で切断することが可能である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１１７．いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、ポリペプチド（若しくはそれをコードするＲＮＡ）、核酸分子、又はシステム若しくはポリペプチドをコードするＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
１１８．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム（例えば、本明細書に記載されるような）のポリペプチド（又はそれをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を含む第１の脂質ナノ粒子；及び
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム（例えば、本明細書に記載されるような）の核酸分子を含む第２の脂質ナノ粒子
を含むシステム。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム（例えば、本明細書に記載されるような）の核酸分子を含む第２の脂質ナノ粒子
を含むシステム。
１１９．システム、核酸分子、ポリペプチド、及び／又はそれをコードするＤＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として配合される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド、又は反応混合物。
１２０．カチオン性脂質を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のＬＮＰ。
１２１．カチオン性脂質が、以下の構造：
を有する、いずれかの先行する実施形態に記載のＬＮＰ。
１２２．１つ以上の中性脂質、例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、ステロイド、例えば、コレステロール、及び／又は１つ以上のポリマーがコンジュゲート脂質、例えば、ペグ化脂質、例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ｃｅｒ又はＰＥＧジアルキルオキシプロピルカルバメートをさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のＬＮＰ。
１２３．システム、ポリペプチド、及び／又はそれをコードするＤＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として配合される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１２４．脂質ナノ粒子（又は複数の脂質ナノ粒子を含む配合物）が、反応性不純物（例えば、アルデヒド）を欠くか、又は予め選択されたレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド）を含む、実施形態Ｍ１に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１２５．脂質ナノ粒子（又は複数の脂質ナノ粒子を含む配合物）が、アルデヒドを欠くか、又は予め選択されたレベル未満のアルデヒドを含む、実施形態Ｍ１に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１２６．脂質ナノ粒子が、複数の脂質ナノ粒子を含む配合物に含まれる、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１２７．脂質ナノ粒子配合物が、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む１つ以上の脂質試薬を用いて生成される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１２８．脂質ナノ粒子配合物が、３％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む１つ以上の脂質試薬を用いて生成される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１２８．脂質ナノ粒子配合物が、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む１つ以上の脂質試薬を用いて生成される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１２９．脂質ナノ粒子配合物が、０．３％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む１つ以上の脂質試薬を用いて生成される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３０．脂質ナノ粒子配合物が、０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む１つ以上の脂質試薬を用いて生成される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３１．脂質ナノ粒子配合物が、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３２．脂質ナノ粒子配合物が、３％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３３．脂質ナノ粒子配合物が、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３４．脂質ナノ粒子配合物が、０．３％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３５．脂質ナノ粒子配合物が、０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３６．本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３７．本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、３％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３８．本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１３９．本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、０．３％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１４０．本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１４１．任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の全アルデヒド含量及び／又は量が、例えば、実施例２６に記載される方法にしたがって、例えば、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）と組み合わされた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって決定される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１４２．反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の全アルデヒド含量及び／又は量が、例えば、脂質試薬中で、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に関連する核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような）の１つ以上の化学修飾を検出することによって決定される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１４３．アルデヒド種の全アルデヒド含量及び／又は量が、例えば、実施例２７に記載されるように、例えば、脂質試薬中で、例えば、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に関連する核酸分子、例えば、本明細書に記載されるような）に含まれるか又はそれから単離された、ヌクレオチド又はヌクレオシド（例えば、リボヌクレオチド又はリボヌクレオシドの１つ以上の化学修飾を検出することによって決定される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１４４．核酸分子、ヌクレオチド、又はヌクレオシドの化学修飾が、例えば、実施例２７に記載されるように、例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、１つ以上の修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を決定することによって検出される、実施形態Ｍ２１に記載のシステム、キット、又はポリペプチド。
１４５．細胞、組織又は対象における標的ＤＮＡを修飾する方法であって、いずれかの先行する番号付けられたシステムを、細胞、組織又は対象に投与することを含み、システムが、鋳型ＲＮＡ配列を標的ＤＮＡ鎖中に逆転写し、それによって、標的ＤＮＡ鎖を修飾し、ここで、細胞が、Ｒａｄ５１修復経路活性を低下させ、Ｒａｄ５１若しくはＲａｄ５１修復経路の構成要素の発現を低下させ、又は機能的Ｒａｄ５１修復経路を含まず、例えば、機能的Ｒａｄ５１遺伝子を含まず、例えば、Ｒａｄ５１遺伝子又はＲａｄ５１修復経路中の別の遺伝子の１つ又は両方のコピーを不活性化する突然変異（例えば、欠失）を含む、方法。
１４６．いずれかの先行する番号付けられたシステムを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）であって、宿主細胞が、Ｒａｄ５１修復経路活性を低下させ、Ｒａｄ５１若しくはＲａｄ５１修復経路の構成要素の発現を低下させ、又は機能的Ｒａｄ５１修復経路を含まず、例えば、機能的Ｒａｄ５１遺伝子を含まず、例えば、Ｒａｄ５１遺伝子又はＲａｄ５１修復経路中の別の遺伝子の１つ又は両方のコピーを不活性化する突然変異（例えば、欠失）を含む、宿主細胞。
１４７．ポリペプチドが、配列のプロモーター領域、５’ＵＴＲ領域、エキソン、イントロン、又は３’ＵＴＲ領域、例えば、表１０Ａ～１０Ｄ又は１１Ａ～１１Ｇのいずれかの遺伝子又はそのフラグメントに結合する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１４８．ポリペプチドが、（ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、任意選択で、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインの一部を置換するか、又は（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）のうちの２つを連結する内因性リンカーを置換する異種リンカーをさらに含み、ここで、任意選択で、リンカーが、表３８のリンカーである、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１４９．異種リンカーが、（ｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５０．異種リンカーが、（ｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５１．異種リンカーが、（ｉｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５２．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５３．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５４．異種リンカーが、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５５．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉ）を連結する内因性リンカーを置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５６．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉｉ）を連結する内因性リンカーを置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５７．異種リンカーが、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を連結する内因性リンカーを置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５８．異種リンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１５９．異種リンカーが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、又は５００のアミノ酸を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１６０．組織が、肝臓、肺、皮膚、筋肉組織（例えば、骨格筋）、眼若しくは眼組織、血液、血液細胞、免疫細胞、又は中枢神経系である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６１．細胞が、造血系幹細胞（ＨＳＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６２．細胞が、線維芽細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６３．細胞が、初代細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６４．細胞が、不死化されていない、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６５．（ａ）が、ＲＮＡを含み、（ｂ）が、ＲＮＡを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１６６．（ａ）及び（ｂ）が、同じ核酸の一部である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１６７．（ａ）及び（ｂ）が、別の核酸である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１６８．ＲＮＡのみを含むか、又は少なくとも１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、又は１００：１のＲＮＡ：ＤＮＡ比で、ＤＮＡより多いＲＮＡを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１６９．異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける５’－３’配向でオープンリーディングフレームを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１７０．異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける３’－５’配向でオープンリーディングフレームを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１７１．ポリペプチドに結合する配列が、３’非翻訳配列である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１７２．鋳型ＲＮＡが、５’非翻訳配列をさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１７３．鋳型ＲＮＡが、異種対象配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含み、例えば、異種対象配列が、ある実施形態において、タンパク質コード配列などの配列に動作可能に連結されたプロモーターを含み得る、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１７４．プロモーターが、５’非翻訳配列と異種対象配列との間に配置される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１７５．プロモーターが、ポリペプチドに結合する３’非翻訳配列と異種対象配列との間に配置される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１７６．５’非翻訳配列が、表３の５列の配列、又はそれに対する少なくとも８０％の同一性を有する配列である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１７７．３’非翻訳配列が、表３の６列の配列、又はそれに対する少なくとも８０％の同一性を有する配列である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
１７８．異種対象配列が、酵素、膜タンパク質、血液因子、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、貯蔵タンパク質、免疫受容体タンパク質、（例えば、キメラ抗原受容体タンパク質（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体などの合成免疫受容体タンパク質）、又は抗体を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１７９．鋳型ＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの５’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも５つの塩基又は少なくとも１０個の塩基を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１８０．鋳型ＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの３’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも５つの塩基又は少なくとも１０個の塩基を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１８１．細胞、組織、又は対象における標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法であって、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムを、細胞、組織、又は対象に投与し、それによって、標的ＤＮＡ鎖を修飾することを含む、方法。
１８２．細胞のゲノムへの外因性ＤＮＡ配列の少なくとも５つの塩基対の付加をもたらす、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１８３．細胞のゲノムへの外因性ＤＮＡ配列の少なくとも１００個の塩基対の付加をもたらす、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１８４．ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０５、又は０．５コピーの平均コピー数で、標的ＤＮＡへの異種対象配列の挿入をもたらす、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１８５．非切断標的ＤＮＡへの異種対象配列の約５０～１００％の挿入をもたらす、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１８６．（ａ）の核酸が、細胞のゲノムへと統合されない、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１８７．鋳型ＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの５’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも５又は少なくとも１０個の塩基を含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
１８８．鋳型ＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの３’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも５又は少なくとも１０個の塩基を含む、いずれかの先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１８９．異種対象配列が、治療用ポリペプチドをコードするか、又は哺乳動物（例えば、ヒト）ポリペプチド、又はそのフラグメント若しくは変異体をコードする、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９０．
ｉ．異種対象配列が、タンパク質、例えば酵素（例えば、リソソーム酵素）又は血液因子（例えば、第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ若しくはＸＩＩＩ因子）をコードし；
ｉｉ．異種対象配列が、組織特異的プロモーター又はエンハンサーを含み；
ｉｉｉ．異種対象配列が、２５０、３００、４００、５００、又は１，０００超のアミノ酸、及び任意選択で７，５００以下のアミノ酸のポリペプチドをコードし；
ｉｖ．異種対象配列が、哺乳動物遺伝子のフラグメントをコードするが、全哺乳動物遺伝子をコードするわけではなく、例えば、１つ以上のエキソンをコードするが、完全長タンパク質をコードするわけではなく；
ｖ．異種対象配列が、１つ以上のイントロンをコードし；
ｖｉ．異種対象配列が、ＧＦＰ以外であり、例えば、蛍光タンパク質以外であるか、又はレポータータンパク質以外であり；又は
ｖｉｉ．異種対象配列が、Ｔ細胞キメラ抗原受容体以外である
ことのうちの１つ以上である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
ｉ．異種対象配列が、タンパク質、例えば酵素（例えば、リソソーム酵素）又は血液因子（例えば、第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ若しくはＸＩＩＩ因子）をコードし；
ｉｉ．異種対象配列が、組織特異的プロモーター又はエンハンサーを含み；
ｉｉｉ．異種対象配列が、２５０、３００、４００、５００、又は１，０００超のアミノ酸、及び任意選択で７，５００以下のアミノ酸のポリペプチドをコードし；
ｉｖ．異種対象配列が、哺乳動物遺伝子のフラグメントをコードするが、全哺乳動物遺伝子をコードするわけではなく、例えば、１つ以上のエキソンをコードするが、完全長タンパク質をコードするわけではなく；
ｖ．異種対象配列が、１つ以上のイントロンをコードし；
ｖｉ．異種対象配列が、ＧＦＰ以外であり、例えば、蛍光タンパク質以外であるか、又はレポータータンパク質以外であり；又は
ｖｉｉ．異種対象配列が、Ｔ細胞キメラ抗原受容体以外である
ことのうちの１つ以上である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９１．逆転写酵素ドメイン又はエンドヌクレアーゼドメインの１つ又は両方が、鳥レトロトランスポザーゼに由来し、例えば、表１若しくは３又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性の配列を有する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９２．ポリペプチドが、それ以外は同様の条件下で、２５℃におけるその活性の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上である、３７℃における活性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９３．ポリペプチドが、鳥レトロトランスポザーゼ、例えば、表３の８列の鳥レトロトランスポザーゼ、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列に由来する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９４．鳥レトロトランスポザーゼが、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ）、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）、ノドジロシトド（Ｚｏｎｏｔｒｉｃｈｉａ ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）、若しくはノドジロシギダチョウ（Ｔｉｎａｍｕｓ ｇｕｔｔａｔｕｓ）に由来するレトロトランスポザーゼ、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９５．ポリペプチドが、表３の８列のレトロトランスポザーゼ、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列に由来する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９６．鋳型ＲＮＡが、表３の配列（例えば、表３の６列の５’非翻訳領域及び表３の７列の３’非翻訳領域の１つ又は両方）、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
１９７．
ｉ．ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡをコードする核酸又は鋳型ＲＮＡをコードする核酸が、別の核酸であり；
ｉｉ．鋳型ＲＮＡが、活性逆転写酵素をコードせず、例えば、実施例１～２に記載されるように、例えば、不活性化突然変異体逆転写酵素を含むか、又は逆転写酵素配列を含まず；又は
ｉｉｉ．鋳型ＲＮＡが、活性エンドヌクレアーゼをコードせず、例えば、不活性化エンドヌクレアーゼを含むか、又はエンドヌクレアーゼを含まず；又は
ｉｖ．鋳型ＲＮＡが、１つ以上の化学修飾を含む
ことのうちの１つ以上である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
ｉ．ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡをコードする核酸又は鋳型ＲＮＡをコードする核酸が、別の核酸であり；
ｉｉ．鋳型ＲＮＡが、活性逆転写酵素をコードせず、例えば、実施例１～２に記載されるように、例えば、不活性化突然変異体逆転写酵素を含むか、又は逆転写酵素配列を含まず；又は
ｉｉｉ．鋳型ＲＮＡが、活性エンドヌクレアーゼをコードせず、例えば、不活性化エンドヌクレアーゼを含むか、又はエンドヌクレアーゼを含まず；又は
ｉｖ．鋳型ＲＮＡが、１つ以上の化学修飾を含む
ことのうちの１つ以上である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９８．鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）が、異種対象配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含み、
プロモーターが、ポリペプチドに結合する５’非翻訳配列と異種配列との間に配置され、又は
プロモーターが、ポリペプチドに結合する３’非翻訳配列と異種配列との間に配置される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
プロモーターが、ポリペプチドに結合する５’非翻訳配列と異種配列との間に配置され、又は
プロモーターが、ポリペプチドに結合する３’非翻訳配列と異種配列との間に配置される、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
１９９．鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）が、ポリペプチドに結合する５’非翻訳配列及びポリペプチドに結合する３’非翻訳配列をさらに含み、
異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける５’－３’配向にオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補体）を含み；又は
異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける３’－５’配向にオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補体）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける５’－３’配向にオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補体）を含み；又は
異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける３’－５’配向にオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補体）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２００．逆転写酵素ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、又は標的ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも１つが異種である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２０１．ポリペプチドが、プリン／アピリミジン酸エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインに対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である）配列、及びＡＰＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインに対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である）配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２０２．ポリペプチドが、制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインに対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である）配列、及びＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインに対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である）配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２０３．ＲＴドメインが、表１若しくは３から選択される配列又は表２の逆転写酵素ドメインの配列を含み、ここで、ＲＴドメインが、天然配列に対するいくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２０４．ＲＴドメインが、表１若しくは３から選択される配列又は表２の逆転写酵素ドメインの配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２０５．鋳型ＲＮＡが、異種対象配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２０６．ポリペプチドが、（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２０７．ポリペプチドが、配列番号１０１６の配列に対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である）配列を含む、実施形態１４０～１４４のいずれかに記載のシステム又は方法。
２０８．ポリペプチドが、表３の８列中の配列に対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である）配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２０９．ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡをコードする核酸又は鋳型ＲＮＡをコードする核酸が、共有結合され、例えば、融合核酸の一部である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２１０．融合核酸が、ＲＮＡを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２１１．融合核酸が、ＤＮＡを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２１２．（ｂ）が、鋳型ＲＮＡを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２１３．鋳型ＲＮＡが、核局在化シグナルをさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２１４．（ａ）のＲＮＡが、核局在化シグナルを含まない、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２１５．ポリペプチドが、核局在化シグナル及び／又は核小体局在化シグナルをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２１６．（ａ）が、（ｉ）ポリペプチド及び（ｉｉ）核局在化シグナル及び／又は核小体局在化シグナルをコードするＲＮＡを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２１７．ＲＮＡが、シュードノット配列、例えば、異種対象配列の５’を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２１８．ＲＮＡが、ステムループ配列又はらせん、シュードノット配列の５’を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２１９．ＲＮＡが、１つ以上（例えば、２、３、又はそれ以上）のステムループ配列又はらせん、シュードノット配列の３’、例えばシュードノット配列の３’及び異種対象配列の５’を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２２０．シュードノットを含む鋳型ＲＮＡが、触媒活性、例えば、ＲＮＡ切断活性、例えば、ｃｉｓ－ＲＮＡ切断活性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２２１．ＲＮＡが、少なくとも１つのステムループ配列又はらせん、例えば、異種対象配列の３’、例えば１、２、３、４、５又はそれ以上のステムループ配列、ヘアピン又はらせん配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
２２２．ポリペプチドが、表１～３に列挙されるポリペプチドの配列、又はその逆転写酵素ドメイン若しくはエンドヌクレアーゼドメインに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性）を有する少なくとも５０のアミノ酸（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００のアミノ酸）の配列を含む、いずれかの上記の番号付けられたシステム又は方法。
２２３．ポリペプチドが、表１～３のいずれかに列挙されるポリペプチドの配列又はその逆転写酵素ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、若しくはＤＮＡ結合ドメインに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性）を有する少なくとも５０のアミノ酸（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００のアミノ酸）の配列を含む、いずれかの上記の番号付けられたシステム又は方法。
２２４．ポリペプチドが、表３の８列のアミノ酸配列、又はその逆転写酵素ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、若しくはＤＮＡ結合ドメインに対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性）を有する少なくとも５０のアミノ酸（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００のアミノ酸）の配列を含む、いずれかの上記の番号付けられたシステム又は方法。
２２５．鋳型ＲＮＡが、表３の配列（例えば、表３の６列の５’非翻訳領域及び表３の７列の３’非翻訳領域の１つ又は両方）、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、いずれかの上記の番号付けられたシステム又は方法。
２２６．鋳型ＲＮＡが、表３の７列の３’非翻訳領域からの約１００～１２５ｂｐの配列を含み、例えば、ここで、配列が、表３の７列の３’非翻訳領域のヌクレオチド１～１００、１０１～２００、若しくは２０１～３２５、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
２２７．（ａ）が、ＲＮＡを含み、（ｂ）が、ＲＮＡを含む、いずれかの上記の番号付けられたシステム又は方法。
２２８．（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）が、ＤＮＡを含まないか、又は質量基準若しくはモル量基準で１０％、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のＤＮＡを含まない、いずれかの上記の番号付けられたシステム又は方法。
２２９．（ｂ）の介在ＤＮＡ依存性ＲＮＡ重合を有さない異種対象配列の挿入によってＤＮＡを修飾することが可能である、いずれかの上記の番号付けられたシステム。
２３０．標的プライム逆転写によってＤＮＡを修飾することが可能である、いずれかの上記の番号付けられたシステム。
２３１．ＤＮＡ修復経路の阻害剤（例えば、ＳＣＲ７、ＰＡＲＰ阻害剤）の存在下における、又はＤＮＡ修復経路を欠損した細胞株（例えば、ヌクレオチド除去修復経路若しくはホモロジー指向性修復経路を欠損した細胞株）における、異種対象配列の挿入によってＤＮＡを修飾することが可能である、いずれかの上記の番号付けられたシステム。
２３２．標的細胞内における検出可能なレベルの二本鎖切断の形成を引き起こさない、いずれかの上記の番号付けられたシステム。
２３３．逆転写酵素活性を用いて、及び任意選択で、相同的組換え活性の非存在下で、ＤＮＡを修飾することが可能である、いずれかの上記の番号付けられたシステム。
２３４．鋳型ＲＮＡが、二次構造を減少させるように処理されており、例えば、例えば、二次構造を減少させる温度に、例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、又は９５℃に加熱された、いずれかの上記の番号付けられたシステム。
２３５．鋳型ＲＮＡが、その後、例えば、二次構造を可能にする温度に、例えば、３０、２５、又は２０℃以下に冷却された、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
２３６．いずれかの先行する番号付けられたシステムを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）。
２３７．細胞、組織又は対象が、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞、組織又は対象である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２３８．細胞が、線維芽細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２３９．細胞が、初代細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２４０．細胞が、不死化されていない、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２４１．哺乳動物細胞のゲノムを修飾する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
２４２．ＤＮＡを、哺乳動物細胞のゲノム中に挿入する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
２４３．細胞へのＤＮＡの送達なしで、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐの外因性ＤＮＡを、哺乳動物細胞のゲノムに付加する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
２４４．少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐの外因性ＤＮＡを、哺乳動物細胞のゲノムに付加する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含み、
方法が、哺乳動物細胞をＤＮＡと接触させることを含まないか、又は方法が、哺乳動物細胞を、核酸の質量基準で若しくはモル量基準で１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％、若しくは０．０１％未満のＤＮＡを含む組成物と接触させることを含む、方法。
方法が、哺乳動物細胞をＤＮＡと接触させることを含まないか、又は方法が、哺乳動物細胞を、核酸の質量基準で若しくはモル量基準で１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％、若しくは０．０１％未満のＤＮＡを含む組成物と接触させることを含む、方法。
２４５．少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐの外因性ＤＮＡを、哺乳動物細胞のゲノムに付加する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含み、方法が、ＲＮＡのみを哺乳動物細胞に送達する、方法。
２４６．少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐの外因性ＤＮＡを、哺乳動物細胞のゲノムに付加する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含み、方法が、ＲＮＡ及びタンパク質を哺乳動物細胞に送達する、方法。
２４７．鋳型ＲＮＡが、外因性ＤＮＡの挿入のための鋳型として働く、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２４８．外因性ＤＮＡのＤＮＡ依存性ＲＮＡ重合を含まない、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２４９．細胞、例えば、哺乳動物細胞のゲノムへの、ＤＮＡの少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、又は５，０００個の塩基対の付加をもたらす、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５０．ヒト細胞のゲノムを修飾する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含み、
方法が、ヒト細胞のゲノム中への異種対象配列の挿入をもたらし、
ヒト細胞が、いずれかのＤＮＡ修復遺伝子及び／若しくは腫瘍抑制遺伝子の上方制御を示さず、又はＤＮＡ修復遺伝子及び／若しくは腫瘍抑制遺伝子が、１０％、５％、２％、若しくは１％超上方制御されず、例えば、上方制御が、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１４に記載されるように、ＲＮＡ－ｓｅｑによって測定される、方法。
方法が、ヒト細胞のゲノム中への異種対象配列の挿入をもたらし、
ヒト細胞が、いずれかのＤＮＡ修復遺伝子及び／若しくは腫瘍抑制遺伝子の上方制御を示さず、又はＤＮＡ修復遺伝子及び／若しくは腫瘍抑制遺伝子が、１０％、５％、２％、若しくは１％超上方制御されず、例えば、上方制御が、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１４に記載されるように、ＲＮＡ－ｓｅｑによって測定される、方法。
２５１．外因性コード領域を、細胞（例えば、哺乳動物細胞）のゲノムに付加する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含み、鋳型ＲＮＡが、外因性コード領域の非コード鎖を含み、ここで、任意選択で、鋳型ＲＮＡが、外因性コード領域のコード鎖を含まず、ここで、任意選択で、送達が、非ウイルス送達を含む、方法。
２５２．細胞（例えば、哺乳動物細胞）内でポリペプチドを発現する方法であって、細胞を、いずれかの先行する実施形態に記載のシステムと接触させることを含み、鋳型ＲＮＡが、ポリペプチドをコードし得る配列の逆相補体である非コード鎖を含み、ここで、任意選択で、鋳型ＲＮＡが、ポリペプチドをコードするコード鎖を含まず、ここで、任意選択で、送達が、非ウイルス送達を含む、方法。
２５３．哺乳動物ゲノム中に挿入される配列が、哺乳動物ゲノムに対して外因性の配列である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５４．システムが、ＤＮＡ鋳型とは独立して動作する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５５．細胞が、組織の一部である、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５６．哺乳動物細胞が、正倍数体であり、不死化されておらず、生物の一部であり、初代細胞であり、非分裂性であり、肝細胞であり、又は遺伝性疾患を有する対象に由来する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５７．接触させることが、細胞を、プラスミド、ウイルス、ウイルス様粒子、ビロソーム、リポソーム、小胞、エキソソーム、フソソーム、又は脂質ナノ粒子と接触させることを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５８．接触させることが、非ウイルス送達を使用することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２５９．細胞を、鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）と接触させることを含み、鋳型ＲＮＡが、外因性コード領域の非コード鎖を含み、ここで、任意選択で、鋳型ＲＮＡが、外因性コード領域のコード鎖を含まず、ここで、任意選択で、送達が、非ウイルス送達を含み、それによって、外因性コード領域を、細胞のゲノムに付加する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６０．細胞を、鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）と接触させることを含み、鋳型ＲＮＡが、ポリペプチドをコードし得る配列の逆相補体である非コード鎖を含み、ここで、任意選択で、鋳型ＲＮＡが、ポリペプチドをコードするコード鎖を含まず、ここで、任意選択で、送達が、非ウイルス送達を含み、それによって、細胞内でポリペプチドを発現する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６１．接触させることが、（ａ）及び（ｂ）を対象に、例えば、静脈内投与することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６２．接触させることが、（ａ）及び（ｂ）の用量を対象に、少なくとも２回投与することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６３．ポリペプチドが、鋳型ＲＮＡ配列を標的ＤＮＡ鎖中に逆転写し、それによって、標的ＤＮＡ鎖を修飾する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６４．（ａ）及び（ｂ）が、別々に投与される、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６５．（ａ）及び（ｂ）が、一緒に投与される、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６６．（ａ）の核酸が、宿主細胞のゲノムに統合されていない、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２６７．ポリペプチドに結合する配列が、以下の特徴：
（ａ）鋳型ＲＮＡの３’末端にあり；
（ｂ）鋳型ＲＮＡの５’末端にあり；
（ｂ）非コード配列であり；
（ｃ）構造化ＲＮＡであり；又は
（ｄ）少なくとも１つのヘアピンループ構造を形成する
ことのうちの１つ以上を有する、いずれかの先行する番号付けられた方法。
（ａ）鋳型ＲＮＡの３’末端にあり；
（ｂ）鋳型ＲＮＡの５’末端にあり；
（ｂ）非コード配列であり；
（ｃ）構造化ＲＮＡであり；又は
（ｄ）少なくとも１つのヘアピンループ構造を形成する
ことのうちの１つ以上を有する、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２６８．鋳型ＲＮＡが、標的ＤＮＡ鎖に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性）の少なくとも２０ヌクレオチドを含む配列をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２６９．鋳型ＲＮＡが、標的ＤＮＡ鎖に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性）のの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ヌクレオチドを含む配列をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７０．標的ＤＮＡ鎖に対して少なくとも８０％の同一性の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ヌクレオチド、又は約：２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１０～１００、若しくは２～１００ヌクレオチドを含む配列が、鋳型ＲＮＡの３’末端にある、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７１．鋳型ＲＮＡが、例えば、鋳型ＲＮＡの３’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性）の少なくとも１００ヌクレオチドを含む配列をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７２．配列が少なくとも８０％の同一性を含む標的ＤＮＡ鎖中の部位が、エンドヌクレアーゼを含むポリペプチドによって認識される（例えば、結合及び／又は切断される）標的ＤＮＡ鎖上の標的部位の近位である（例えば、標的部位の約：０～１０、１０～２０、２０～３０、３０～５０、又は５０～１００ヌクレオチド以内にある）、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２７３．標的ＤＮＡ鎖に対して少なくとも８０％の同一性の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ヌクレオチド、又は約：２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１０～１００、若しくは２～１００ヌクレオチドを含む配列が、鋳型ＲＮＡの３’末端にあり；
任意選択で、配列が少なくとも８０％の同一性を含む標的ＤＮＡ鎖中の部位が、エンドヌクレアーゼを含むポリペプチドによって認識される（例えば、結合及び／又は切断される）標的ＤＮＡ鎖上の標的部位の近位にある（例えば、標的部位の約：０～１０、１０～２０、又は２０～３０ヌクレオチド以内にある）、いずれかの先行する番号付けられた方法。
任意選択で、配列が少なくとも８０％の同一性を含む標的ＤＮＡ鎖中の部位が、エンドヌクレアーゼを含むポリペプチドによって認識される（例えば、結合及び／又は切断される）標的ＤＮＡ鎖上の標的部位の近位にある（例えば、標的部位の約：０～１０、１０～２０、又は２０～３０ヌクレオチド以内にある）、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７４．標的部位が、エンドヌクレアーゼを含むポリペプチドの天然標的部位に対して最も近い同一性を有するヒトゲノム中の部位であり、例えば、ヒトゲノム中の標的部位が、天然標的部位に対して同一である少なくとも約：１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
２７５．鋳型ＲＮＡが、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の塩基を有する、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７６．標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の塩基が、鋳型ＲＮＡの３’末端にある、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７７．標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の塩基が、鋳型ＲＮＡの５’末端にある、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７８．鋳型ＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの５’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の塩基及び鋳型ＲＮＡの３’末端において、標的ＤＮＡ鎖に対して１００％の同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の塩基を含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２７９．異種対象配列が、５０～５０，０００塩基対（例えば、５０～４０，０００ｂｐ、５００～３０，０００ｂｐ、５００～２０，０００ｂｐ、１００～１５，０００ｂｐ、５００～１０，０００ｂｐ、５０～１０，０００ｂｐ、５０～５，０００ｂｐ）である、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８０．異種対象配列が、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、又は７００ｂｐである、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８１．異種対象配列が、少なくとも７１５、７５０、８００、９５０、１，０００、２，０００、３，０００、又は４，０００ｂｐである、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８２．異種対象配列が、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、又は４０，０００ｂｐ未満である、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８３．異種対象配列が、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０、又は１００ｂｐ未満である、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８４．異種対象配列が、
（ａ）オープンリーディングフレーム、例えば、ポリペプチドをコードする配列、例えば、酵素（例えば、リソソーム酵素）、膜タンパク質、血液因子、エキソン、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質などのオルガネラタンパク質）、細胞外タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質；
（ｂ）非コード及び／若しくは調節配列、例えば、転写調節物質に結合する配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター；
（ｃ）スプライス受容部位；
（ｄ）ポリＡ部位；
（ｅ）エピジェネティック修飾部位；又は
（ｆ）遺伝子発現ユニット
を含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
（ａ）オープンリーディングフレーム、例えば、ポリペプチドをコードする配列、例えば、酵素（例えば、リソソーム酵素）、膜タンパク質、血液因子、エキソン、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質などのオルガネラタンパク質）、細胞外タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質；
（ｂ）非コード及び／若しくは調節配列、例えば、転写調節物質に結合する配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター；
（ｃ）スプライス受容部位；
（ｄ）ポリＡ部位；
（ｅ）エピジェネティック修飾部位；又は
（ｆ）遺伝子発現ユニット
を含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８５．標的ＤＮＡが、ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）部位である、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８６．標的ＤＮＡが、ゲノムＮａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位である、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８７．ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、４、又は５コピーの平均コピー数で、ゲノム中の標的部位中への異種対象配列の挿入をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８８．本明細書に記載されるアッセイ、例えば、実施例６のアッセイによって測定される際、非切断ゲノム中の標的部位への構成要素の約２５～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、７５～９５％、８０％～９０％をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２８９．細胞のゲノム中の１つの標的部位のみにおける異種対象配列の挿入をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９０．細胞内の標的部位中への異種対象配列の挿入をもたらし、ここで、挿入された異種配列が、挿入、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１２のアッセイによって測定される際、異種配列に対して１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満の突然変異（例えば、ＳＮＰ又は１つ以上の欠失、例えば、切断又は内部欠失）を含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９１．複数の細胞内の標的部位中への異種対象配列の挿入をもたらし、ここで、挿入された異種配列のコピーの１０％、５％、２％、又は１％未満が、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１２のアッセイによって測定される際、突然変異（例えば、ＳＮＰ又は欠失、例えば、切断又は内部欠失）を含む、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９２．標的細胞ゲノム中への異種対象配列の挿入をもたらし、ここで、標的細胞が、ｐ５３の上方制御を示さず、又は１０％、５％、２％、又は１％未満だけｐ５３の上方制御を示し、例えば、ここで、ｐ５３の上方制御が、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例３０に記載される方法にしたがって、ｐ５３タンパク質レベルによって、又はＳｅｒ１５及びＳｅｒ２０でリン酸化されるｐ５３のレベルによって測定される、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９３．標的細胞ゲノム中への異種対象配列の挿入をもたらし、ここで、標的細胞が、いずれかのＤＮＡ修復遺伝子及び／若しくは腫瘍抑制遺伝子の上方制御を示さず、又はＤＮＡ修復遺伝子及び／又は腫瘍抑制遺伝子が、１０％、５％、２％、若しくは１％超上方制御されず、例えば、上方制御が、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１４に記載されるように、ＲＮＡ－ｓｅｑによって測定される、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９４．例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１７に記載されるように、例えば、単一細胞ｄｄＰＣＲを用いて測定される際、システムと接触される細胞の集団中の細胞の約１～８０％、例えば、細胞の約：１～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、又は７０～８０％における標的部位（例えば、１つの挿入又は２つ以上の挿入のコピー数で）中への異種対象配列の挿入をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９５．例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１８に記載されるように、例えば、コロニー分離及びｄｄＰＣＲを用いて測定される際、システムと接触される細胞の集団中の細胞の約１～８０％、例えば、細胞の約：１～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、又は７０～８０％における１つの挿入のコピー数で、標的部位中への異種対象配列の挿入をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９６．細胞の集団における非標的部位中への挿入（オフターゲットの挿入）より高い比率で、標的部位中への異種対象配列の挿入（オンターゲットの挿入）をもたらし、ここで、オフターゲットの挿入対オフターゲットの挿入の比率が、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１１のアッセイを用いて、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１．９０：１、１００：１、２００：１、５００：１、又は１，０００：１を超える、いずれかの先行する番号付けられた方法。
２９７．ＤＮＡ修復経路の阻害剤（例えば、ＳＣＲ７、ＰＡＲＰ阻害剤）の存在下における、又はＤＮＡ修復経路を欠損した細胞株（例えば、ヌクレオチド除去修復経路若しくはホモロジー指向性修復経路を欠損した細胞株）における、異種対象配列の挿入をもたらす、いずれかの上記の番号付けられた方法。
２９８．医薬組成物として配合される、いずれかの先行する番号付けられたシステム。
２９９．薬学的に許容される担体（例えば、小胞、リポソーム、天然又は合成脂質二重層、脂質ナノ粒子、エキソソーム）中に配置される、いずれかの先行する番号付けられたシステム。
３００．ＤＮＡを調節するためのシステム（例えば、本明細書に記載されるような）を作製する方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の相同性を有する異種相同配列を含む鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡ）を提供すること、及び／又は
（ｂ）標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に特異的に結合する異種標的ドメインを含むシステムのポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び／若しくはエンドヌクレアーゼドメインを含む）を提供すること
を含む、方法。
（ａ）標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の相同性を有する異種相同配列を含む鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡ）を提供すること、及び／又は
（ｂ）標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に特異的に結合する異種標的ドメインを含むシステムのポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び／若しくはエンドヌクレアーゼドメインを含む）を提供すること
を含む、方法。
３０１．
（ａ）鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡ）中に、標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の相同性を有する異種相同配列を導入することを含み、及び／又は
（ｂ）システムのポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び／若しくはエンドヌクレアーゼドメインを含む）中に、標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に特異的に結合する異種標的ドメインを導入することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
（ａ）鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡ）中に、標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の相同性を有する異種相同配列を導入することを含み、及び／又は
（ｂ）システムのポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び／若しくはエンドヌクレアーゼドメインを含む）中に、標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に特異的に結合する異種標的ドメインを導入することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０２．（ａ）の導入することが、相同配列を鋳型核酸中に挿入することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０３．（ａ）の導入することが、鋳型核酸のセグメントを、相同配列で置換することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０４．（ａ）の導入することが、鋳型核酸の１つ以上のヌクレオチド（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド）を突然変異させ、それによって、相同配列の配列を有する鋳型核酸のセグメントを生成することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０５．（ｂ）の導入することが、標的化ドメインのアミノ酸配列を、ポリペプチドのアミノ酸配列中に挿入することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０６．（ｂ）の導入することが、標的化ドメインをコードする核酸配列を、核酸分子に含まれるポリペプチドのコード配列中に挿入することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０７．（ｂ）の導入することが、ポリペプチドの少なくとも一部を、標的化ドメインで置換することを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０８．（ａ）の導入することが、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、又はそれ以上のアミノ酸）を突然変異させることを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３０９．エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、若しくは少なくとも５０ｎｔ、又は５０、４０、３０、２０、１０、８、６、４、若しくは２以下）又は３つ未満のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅポリペプチドによって認識されるモチーフが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを再標的化するためのシードとして使用され、ここで、ＤＮＡ結合ドメインは、新たな標的部位へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの結合が、エンドヌクレアーゼ活性を可能にするためのコアモチーフへのエンドヌクレアーゼドメインの適切な位置決めをもたらすように修飾され、任意選択で、ここで、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフが、ＴＴＡＡＧＧＴＡＧＣ、ＡＡＧＧＴＡＧＣＣＡＡＡ、若しくはＴＡＡＧＧＴＡＧＣＣＡＡＡの４、５、６、７、８、９、若しくは１０連続ヌクレオチドを含み、又は、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフが、ＡＡＧＧの２又は３、若しくは４連続ヌクレオチドを含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３１０．ゲノム中のＡＡＧＧ配列が、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを再標的化するためのシードとして使用され、ここで、ＤＮＡ結合ドメインは、新たな標的部位へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの結合が、エンドヌクレアーゼ活性を可能にするためのＡＡＧＧモチーフへのエンドヌクレアーゼドメインの適切な位置決めをもたらすように修飾される、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３１１．細胞内のゲノムＤＮＡ中の標的部位を修飾するための方法であって、細胞を、以下のもの：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位に結合する配列（例えば、標的ゲノム中の部位の第２の鎖）、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’標的ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
と接触させ、それによって、細胞内のゲノムＤＮＡ中の標的部位を修飾することを含み、
ここで：
（ｉ）ポリペプチドが、ゲノムＤＮＡの標的部位に含まれるか若しくはそれに隣接する配列に特異的に結合する異種標的ドメイン（例えば、ＤＢＤ若しくはエンドヌクレアーゼドメイン中）を含み；及び／又は
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの標的部位に含まれるか若しくはそれに隣接する配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の相同性を有する異種相同配列を含む、方法。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位に結合する配列（例えば、標的ゲノム中の部位の第２の鎖）、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’標的ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
と接触させ、それによって、細胞内のゲノムＤＮＡ中の標的部位を修飾することを含み、
ここで：
（ｉ）ポリペプチドが、ゲノムＤＮＡの標的部位に含まれるか若しくはそれに隣接する配列に特異的に結合する異種標的ドメイン（例えば、ＤＢＤ若しくはエンドヌクレアーゼドメイン中）を含み；及び／又は
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの標的部位に含まれるか若しくはそれに隣接する配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の相同性を有する異種相同配列を含む、方法。
３１２．哺乳動物細胞のゲノムを修飾するためのシステムを作製する方法であって、
ａ）先行する実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡを提供することであって、例えば、鋳型ＲＮＡが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドに結合する配列、及び（ｉｉ）異種対象配列を含む、提供すること；並びに
ｂ）二次構造を減少させるために鋳型ＲＮＡを処理すること、例えば、鋳型ＲＮＡを、例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、又は９５℃に加熱すること、並びに
ｃ）その後、鋳型ＲＮＡを、例えば、二次構造を可能にする温度に、例えば、３０、２５、又は２０℃以下に冷却すること
を含む、方法。
ａ）先行する実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡを提供することであって、例えば、鋳型ＲＮＡが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドに結合する配列、及び（ｉｉ）異種対象配列を含む、提供すること；並びに
ｂ）二次構造を減少させるために鋳型ＲＮＡを処理すること、例えば、鋳型ＲＮＡを、例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、又は９５℃に加熱すること、並びに
ｃ）その後、鋳型ＲＮＡを、例えば、二次構造を可能にする温度に、例えば、３０、２５、又は２０℃以下に冷却すること
を含む、方法。
３１３．鋳型ＲＮＡを、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドと、又はポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ）と接触させることをさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３１４．鋳型ＲＮＡを、細胞と接触させることをさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載の方法。
３１５．異種対象配列が、治療用ポリペプチドをコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３１６．異種対象配列が、哺乳動物（例えば、ヒト）ポリペプチド、又はそのフラグメント若しくは変異体をコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３１７．異種対象配列が、酵素（例えば、リソソーム酵素）、血液因子（例えば、第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ若しくはＸＩＩＩ因子）、膜タンパク質、エキソン、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質などのオルガネラタンパク質）、細胞外タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質をコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３１８．異種対象配列が、組織特異的プロモーター又はエンハンサーを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３１９．異種対象配列が、２５０、３００、４００、５００、又は１，０００超のアミノ酸、及び任意選択で、１３００以下のアミノ酸のポリペプチドをコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２０．異種対象配列が、哺乳動物遺伝子のフラグメントをコードするが、完全な哺乳動物遺伝子をコードせず、例えば、１つ以上のエキソンをコードするが、完全長タンパク質をコードしない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２１．異種対象配列が、１つ以上のイントロンをコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２２．異種対象配列が、ＧＦＰ以外であり、例えば、蛍光タンパク質以外であるか、又はレポータータンパク質以外である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２３．ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ又は両方が、鳥レトロトランスポザーゼに由来し、例えば、表１若しくは３、又は表２に列挙されるタンパク質ドメインの配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２４．ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ又は両方が、鳥レトロトランスポザーゼに由来し、ここで、（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ又は両方が、天然配列に対するいくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム又は方法。
３２５．ポリペプチドが、それ以外は同様の条件下で、２５℃におけるその活性の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満である、３７℃における活性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２６．ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡをコードする核酸又は鋳型ＲＮＡをコードする核酸が、別の核酸である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２７．鋳型ＲＮＡが、活性逆転写酵素をコードせず、例えば、２参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例１又は２に記載されるように、例えば、不活性化突然変異体逆転写酵素を含み、逆転写酵素配列を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２８．鋳型ＲＮＡが、１つ以上の化学修飾を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３２９．異種対象配列が、プロモーターとポリペプチドに結合する配列との間に配置される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３３０．プロモーターが、異種対象配列とポリペプチドに結合する配列との間に配置される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３３１．異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける５’－３’配向でオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補体）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３３２．異種対象配列が、鋳型ＲＮＡにおける３’－５’配向でオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補体）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３３３．ポリペプチドが、（ａ）逆転写酵素ドメイン及び（ｂ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つが異種である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３３４．ポリペプチドが、（ａ）標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｂ）逆転写酵素ドメイン及び（ｃ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが異種である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
３３５．ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み；ここで、ＤＢＤ及び／又はエンドヌクレアーゼドメインが、標的ＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）に含まれる配列に特異的に結合する異種標的ドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸。
３３６．ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）例えば、第１のＺｎフィンガードメインを含む第１の標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、及び（ｉｖ）第１の標的ＤＮＡ結合ドメインに対して異種である、例えば、第２のＺｎフィンガードメインを含む第２の標的ＤＮＡ結合ドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸。
３３７．（ｉｉｉ）が（ｉｖ）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸。
３３８．ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、任意選択で、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含み、ここで、ポリペプチドが、（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の一部を置換するか、又は（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）のうちの２つを連結する内因性リンカーを置換する異種リンカーを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸。
３３９．異種リンカーが、（ｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４０．異種リンカーが、（ｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４１．異種リンカーが、（ｉｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４２．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４３．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４４．異種リンカーが、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の一部を置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４５．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉ）を連結する内因性リンカーを置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４６．異種リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉｉ）を連結する内因性リンカーを置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４７．異種リンカーが、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を連結する内因性リンカーを置換する、例えば、欠失する、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４８．異種リンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３４９．異種リンカーが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、又は５００のアミノ酸を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のポリペプチド。
３５０．いずれかの先行する番号付けられた実施形態に記載のポリペプチドをコードする核酸。
３５１．いずれかの先行する実施形態に記載の核酸を含むベクター。
３５２．いずれかの先行する実施形態に記載の核酸を含む宿主細胞。
３５３．いずれかの先行する番号付けられた実施形態に記載のポリペプチドを含む宿主細胞。
３５４．いずれかの先行する実施形態に記載のベクターを含む宿主細胞。
３５５．いずれかの先行する番号付けられたシステム、核酸、ポリペプチド、又はベクター；及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
３５６．薬学的に許容される賦形剤又は担体が、ベクター（例えば、ウイルス又はプラスミドベクター）、小胞（例えば、リポソーム、エキソソーム、天然又は合成脂質二重層）、脂質ナノ粒子から選択される、いずれかの先行する実施形態に記載の医薬組成物。
３５７．ポリペプチドが、核局在化配列をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のポリペプチド。
３５８．ポリペプチドが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３５９．逆転写酵素ドメインが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３６０．レトロトランスポザーゼが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３６１．ポリペプチド、逆転写酵素ドメイン、又はレトロトランスポザーゼが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３６２．ポリペプチドが、リンカー、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、又は５００のアミノ酸を含むリンカーによって、ポリペプチドの残りの部分に共有結合されたＤＮＡ結合ドメインを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３６３．リンカーが、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、又はエンドヌクレアーゼドメイン中の位置で、ポリペプチドの残りの部分に結合される、いずれかの先行する実施形態。
３６４．リンカーが、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例２６に記載されるバージョンｖ１に対応する位置で、ポリペプチドのアルファヘリックス領域のＮ末端側の位置で、ポリペプチドの残りの部分に結合される、いずれかの先行する実施形態。
３６５．リンカーが、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例２６に記載されるバージョンｖ２に対応する位置で、ポリペプチドのアルファヘリックス領域、例えば、先行するＲＮＡ結合モチーフ（例えば、ａ－１ ＲＮＡ結合モチーフ）のＣ末端側の位置で、ポリペプチドの残りの部分に結合される、いずれかの先行する実施形態。
３６６．リンカーが、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例２６に記載されるバージョンｖ３に対応する位置で、例えば、ＤＮＡ結合モチーフ（例えば、ｃ－ｍｙｂ ＤＮＡ結合モチーフ）に対してＮ末端で、ポリペプチドのランダムコイル領域のＣ末端側の位置で、ポリペプチドの残りの部分に結合される、いずれかの先行する実施形態。
３６７．リンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する実施形態。
３６８．鋳型ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも約５００、１０００、２０００、３０００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、又は４０００連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列が、標的細胞ゲノムに統合される、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３６９．鋳型ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも約５００、１０００、２０００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、又は３０００連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列が、標的細胞ゲノムに統合される、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７０．鋳型ＲＮＡ、又はその一部（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、又は４０００ヌクレオチドを含む部分）の核酸配列が、少なくとも約０．２１、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０個の構成要素／ゲノムのコピー数で、標的細胞の集団のゲノムに統合する、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７１．鋳型ＲＮＡ、又はその一部（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、又は４０００ヌクレオチドを含む部分）の核酸配列が、少なくとも約０．０８５、０．０９、０．１、０．１５、又は０．２個の構成要素／ゲノムのコピー数で、標的細胞の集団のゲノムに統合する、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７２．鋳型ＲＮＡ、又はその一部（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、又は４０００ヌクレオチドを含む部分）の核酸配列が、少なくとも約０．０３６、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、又は０．０８個の構成要素／ゲノムのコピー数で、標的細胞の集団のゲノムに統合する、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７３．ポリペプチドが、機能的エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ここで、エンドヌクレアーゼドメインが、例えば、本明細書に記載されるような、エンドヌクレアーゼ活性をなくす突然変異を含まない）を含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７４．ポリペプチドが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ２ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７５．ポリペプチドが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含み、配列天然配列に対していくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７６．逆転写酵素ドメインが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ２ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７７．逆転写酵素ドメインが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含み、配列天然配列に対するいくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７８．レトロトランスポザーゼが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ２ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３７９．レトロトランスポザーゼが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含み、配列天然配列に対するいくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８０．鋳型ＲＮＡ、又はその一部（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、又は４０００ヌクレオチドを含む部分）の核酸配列が、少なくとも約０．２１個の構成要素／ゲノムのコピー数で、標的細胞の集団のゲノムに統合する、いずれかの先行する実施形態。
３８１．ポリペプチドが、大型回虫、例えば、ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ４ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８２．ポリペプチドが、大型回虫、例えば、ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ４ポリペプチドのアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含み、配列天然配列に対するいくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８３．逆転写酵素ドメインが、大型回虫、例えば、ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ４ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８４．逆転写酵素ドメインが、大型回虫、例えば、ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ４ポリペプチドのアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含み、配列天然配列に対するいくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８５．レトロトランスポザーゼが、大型回虫、例えば、ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ４ポリペプチドに対する少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８６．レトロトランスポザーゼが、大型回虫、例えば、ヒトカイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（例えば、本明細書に記載されるような）に由来するＲ４ポリペプチドのアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを含み、配列天然配列に対するいくつかの置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換をさらに含む、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８７．鋳型ＲＮＡ、又はその一部（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、又は４０００ヌクレオチドを含む部分）の核酸配列が、少なくとも約０．０８５個の構成要素／ゲノムのコピー数で、標的細胞の集団のゲノムに統合する、いずれかの先行する実施形態。
３８８．標的細胞中へのシステムの導入が、ｐ５３及び／若しくはｐ２１タンパク質レベルの改変（例えば、上方制御）、Ｈ２ＡＸリン酸化（例えば、γＨ２ＡＸ）、ＡＴＭリン酸化、ＡＴＲリン酸化、Ｃｈｋ１リン酸化、Ｃｈｋ２リン酸化、及び／又はｐ５３リン酸化をもたらさない、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３８９．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるｐ５３タンパク質レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるｐ５３タンパク質レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９０．ｐ５３タンパク質レベルが、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例３０に記載される方法にしたがって決定される、いずれかの先行する実施形態。
３９１．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるｐ５３リン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるｐ５３リン酸化レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９２．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるｐ５３タンパク質レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるｐ２１タンパク質レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９３．ｐ２１タンパク質レベルが、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例３０に記載される方法にしたがって決定される、いずれかの先行する実施形態。
３９４．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるＨ２ＡＸリン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるＨ２ＡＸリン酸化レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９５．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるＡＴＭリン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるＡＴＭリン酸化レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９６．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるＡＴＲリン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるＡＴＲリン酸化レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９７．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるＣｈｋ１リン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるＣｈｋ１リン酸化レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９８．標的細胞中へのシステムの導入が、前記システムと同じゲノム部位を標的とする、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を導入することによって誘導されるＣｈｋ２リン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満であるレベルへの、標的細胞におけるＣｈｋ２リン酸化レベルの上方制御をもたらす、いずれかの先行する番号付けられた実施形態。
３９９．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、システム。
４００．ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ＲＴドメインが、表１若しくは３、又は表２に列挙されるタンパク質ドメインの配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を有する、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ＲＴドメインが、表１若しくは３、又は表２に列挙されるタンパク質ドメインの配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を有する、システム。
４１１．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（ｅｔＲＮＡ）（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、標的部位への少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ヌクレオチドの挿入を生じさせることができる、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（ｅｔＲＮＡ）（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、標的部位への少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ヌクレオチドの挿入を生じさせることができる、システム。
４１２．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、異種目的配列は、長さが少なくとも７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、５００又は１，０００ｎｔｓである、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、異種目的配列は、長さが少なくとも７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、５００又は１，０００ｎｔｓである、システム。
４１３．ＲＴドメインの１つ以上が、ＤＢＤに対して異種であり；ＤＢＤが、エンドヌクレアーゼドメインに対して異種であり；又はＲＴドメインが、エンドヌクレアーゼドメインに対して異種である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４１４．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、標的部位への少なくとも８１、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチドの欠失を生じさせることができる、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、標的部位への少なくとも８１、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチドの欠失を生じさせることができる、システム。
４１５．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、（ａ）（ｉｉ）及び／又は（ａ）（ｉｉｉ）は、ＴＡＬＥ分子；ジンクフィンガー分子；若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子又はその機能的バリアント（例えば、変異体）を含む、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、（ａ）（ｉｉ）及び／又は（ａ）（ｉｉｉ）は、ＴＡＬＥ分子；ジンクフィンガー分子；若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子又はその機能的バリアント（例えば、変異体）を含む、システム。
４１６．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインは、標的部位ＤＮＡの鎖の両方を切断し、切断は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は３０ヌクレオチドだけ互いに分離されている、システム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）、（ｉｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインは、標的部位ＤＮＡの鎖の両方を切断し、切断は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は３０ヌクレオチドだけ互いに分離されている、システム。
４１７．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）ＲＴドメインに特異的に結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）ＲＴドメインに特異的に結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
４１８．鋳型ＲＮＡは、（ａ）（ｉｉ）及び／又は（ａ）（ｉｉｉ）に結合する配列を更に含む、先の実施形態のいずれかのシステム。
４１９．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）第１のポリペプチド又は第１のポリペプチドをコードする核酸であって、第１のポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、及び（ｉｉ）任意選択でＤＮＡ結合ドメインを含む、第１のポリペプチド又は核酸、
（ｂ）第２のポリペプチド又は第２のポリペプチドをコードする核酸であって、第２のポリペプチドは、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、第２のポリペプチド核酸；及び
（ｃ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、第２のポリペプチドに結合する（例えば、（ｂ）（ｉ）及び／又は（ｂ）（ｉｉ）に結合する）配列、（ｉｉ）任意選択で、第１のポリペプチドに結合する（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合する）配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
（ａ）第１のポリペプチド又は第１のポリペプチドをコードする核酸であって、第１のポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、及び（ｉｉ）任意選択でＤＮＡ結合ドメインを含む、第１のポリペプチド又は核酸、
（ｂ）第２のポリペプチド又は第２のポリペプチドをコードする核酸であって、第２のポリペプチドは、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、第２のポリペプチド核酸；及び
（ｃ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、第２のポリペプチドに結合する（例えば、（ｂ）（ｉ）及び／又は（ｂ）（ｉｉ）に結合する）配列、（ｉｉ）任意選択で、第１のポリペプチドに結合する（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合する）配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
４２０．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、及び（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；並びに（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）ポリペプチドに結合する（例えば、（ａ）（ｉｉ）及び／又は（ａ）（ｉｉｉ）に結合する）配列、及び（ｉｉ）標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列を含む第１の鋳型ＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）（例えば、ここで、第１のＲＮＡは、ｇＲＮＡを含む）；
（ｃ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合する）配列、（ｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｉｉ）３’相同性ドメインを含む第２の鋳型ＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、及び（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；並びに（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、ポリペプチド又は核酸；
（ｂ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）ポリペプチドに結合する（例えば、（ａ）（ｉｉ）及び／又は（ａ）（ｉｉｉ）に結合する）配列、及び（ｉｉ）標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集鎖）に結合する配列を含む第１の鋳型ＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）（例えば、ここで、第１のＲＮＡは、ｇＲＮＡを含む）；
（ｃ）（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、ポリペプチドに結合する（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合する）配列、（ｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｉｉ）３’相同性ドメインを含む第２の鋳型ＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
４２１．第２の鋳型ＲＮＡが（ｉ）を含む、先の実施形態のいずれかのシステム。
４２２．第１の鋳型ＲＮＡは第１のコンジュゲートドメインを含み、第２の鋳型ＲＮＡは第２のコンジュゲートドメインを含む、先の実施形態のいずれかのシステム。
４２３ 第１及び第２の結合ドメインが、例えば、ストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズすることが可能である、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４２４ 第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインの結合が、第１の鋳型ＲＮＡ及び第２の鋳型ＲＮＡを共局在化する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム。
４２５．鋳型ＲＮＡが、（ｉ）を含む、いずれかの前の実施形態に記載のシステム。
４２６．鋳型ＲＮＡが、（ｉｉ）を含む、いずれかの前の実施形態に記載のシステム。
４２７．鋳型ＲＮＡが、（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、いずれかの前の実施形態に記載のシステム。
４２８．標的ＤＮＡ分子（例えばゲノムＤＮＡ）内に含まれる配列、ポリペプチドのＲＴドメインに特異的に結合する配列、及び異種目的配列に特異的に結合する標的化ドメイン（例えば異種標的化ドメイン）を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４２９．ポリペプチドが、標的ＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）に含まれる配列に特異的に結合する異種標的ドメインを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３０．異種標的ドメインが、非修飾ポリペプチドと異なる核酸配列に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３１．ポリペプチドが、機能的内因性標的化ドメインを含まない（例えば、ポリペプチドが、内因性標的化ドメインを含まない）、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３２．異種標的ドメインが、亜鉛フィンガー（例えば、標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に特異的に結合する亜鉛フィンガー）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３３．異種標的ドメインが、Ｃａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９ドメイン、又はその突然変異体若しくは変異体、例えば、標的ＤＮＡ分子に含まれる配列に特異的に結合するＣａｓ９ドメイン）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３４．Ｃａｓドメインが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と関連する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３５．異種標的ドメインが、エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、異種エンドヌクレアーゼドメイン）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３６．エンドヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９又はその突然変異体若しくは変異体）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３７．Ｃａｓドメインが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と関連する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３８．エンドヌクレアーゼドメインが、Ｆｏｋ１ドメインを含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４３９．鋳型核酸分子が、標的ＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）に含まれる配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性を有する少なくとも１つ（例えば、１つ又は２つ）の異種相同配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４０．少なくとも１つの異種相同配列の１つが、鋳型核酸分子の５’末端の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ヌクレオチドにおいて又はそれ以内に位置決めされる、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４１．少なくとも１つの異種相同配列の１つが、鋳型核酸分子の３’末端の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ヌクレオチドにおいて又はそれ以内に位置決めされる、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４２．異種相同配列が、標的ＤＮＡ分子中のニック部位（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ニッカーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼドメインによって生成される）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド以内に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４３．異種相同配列が、鋳型ＲＮＡの非修飾形態の内因性相同配列に対して相補的な核酸配列との５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の配列同一性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４４．異種相同配列が、内因性相同配列によって結合される（例えば、異種相同配列によって置換される）配列と異なる標的ＤＮＡ分子の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４５．異種相同配列が、標的ＤＮＡ分子のニック部位（例えば、ニッカーゼによってニックされる部位、例えば、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼドメイン）の５’側に位置決めされた配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性を有する配列（例えば、その３’末端で）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４６．異種相同配列が、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）開始をプライミングするのに好適な配列（例えば、その５’末端で）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４７．異種相同配列が、例えば、標的ＤＮＡ分子中の異種対象配列（例えば、本明細書に記載されるような）のための標的挿入部位（例えば、それに対して３’側）の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド以内に位置決めされた配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性を有する、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４８．鋳型核酸分子が、例えば、本明細書に記載されるようなガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４４９．鋳型核酸分子が、ｇＲＮＡスペーサー配列（例えば、その５’末端の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ヌクレオチドにおいて又はそれ以内に）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載のシステム、方法、又は鋳型ＲＮＡ。
４５０．（例えば、５’から３’に）（ｉ）標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の第２の鎖）に結合する配列、（ｉｉ）ポリペプチドのＲＴドメインに特異的に結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｖ）３’標的相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４５１．（ｖ）エンドヌクレアーゼ及び／又はポリペプチド（例えば、ＲＴドメインを含む同じポリペプチド）のＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を更に含む、先の実施形態のいずれかの鋳型ＲＮＡ。
４５２．ＲＴドメインは、表１若しくは表３の選択された配列又は表２の逆転写酵素ドメインの配列或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、先の実施形態のいずれかの鋳型ＲＮＡ。
４５３．ＲＴドメインは、表１若しくは表３の選択された配列又は表２の逆転写酵素ドメインの配列を含み、ＲＴドメインは、天然配列に対していくつかの置換、例えば少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個の置換を更に含む、先の実施形態のいずれかの鋳型ＲＮＡ。
４５４．（ｉｉ）の配列は、ＲＴドメインに特異的に結合する、先の実施形態のいずれかの鋳型ＲＮＡ。
４５５．ＲＴドメインに特異的に結合する配列は、野生型コンテキストのＲＴドメインに結合する配列、例えばＵＴＲ配列又はそれと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の同一性を有する配列である、先の実施形態のいずれかの鋳型ＲＮＡ。
４５６．５’から３’に：（ｉｉ）ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ及び／又はＤＮＡ結合ドメインに結合する配列、（ｉ）標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の第２の鎖）に結合する配列、（ｉｉｉ）異種目的配列、並びに（ｉｖ）３‘標的相同性ドメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４５７．５’から３’に：（ｉｉｉ）異種目的配列、（ｉｖ）３’標的相同性ドメイン、（ｉ）標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の第２の鎖）に結合する配列、並びに（ｉｉ）ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ及び／又はＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４５８．（例えば、５’から３’に）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）任意選択で、エンドヌクレアーゼ及び／又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４５９．鋳型ＲＮＡが、（ｉ）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載の鋳型ＲＮＡ。
４６０．鋳型ＲＮＡが、（ｉｉ）を含む、いずれかの先行する実施形態に記載の鋳型ＲＮＡ。
４６１．（例えば、５’から３’に）（ｉ）標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉ）ポリペプチドのＲＴドメインに特異的に結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４６２．ＲＴドメインが、表１若しくは３、又は表２に列挙されるタンパク質ドメインから選択される配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、いずれかの先行する実施形態に記載の鋳型ＲＮＡ。
４６３．（ｖ）エンドヌクレアーゼ及び／又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＲＴドメインを含む同じポリペプチド）に結合する配列をさらに含む、いずれかの先行する実施形態に記載の鋳型ＲＮＡ。
４６４．（ｉｉ）の配列が、表１若しくは３の、又は表２に列挙されるＲＴドメイン、又はそれに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有するＲＴドメイン配列に特異的に結合する、いずれかの先行する実施形態に記載の鋳型ＲＮＡ。
４６５．ＲＴドメインに特異的に結合する配列が、表１若しくは３、又は表２に列挙されるタンパク質ドメインの配列、又はそれに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列である、いずれかの先行する実施形態に記載の鋳型ＲＮＡ。
４６６．５’から３’に：（ｉｉ）エンドヌクレアーゼ及び／又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列、（ｉ）標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列、（ｉｉｉ）異種対象配列、及び（ｉｖ）３’ホモロジードメインを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４６７．５’から３’に：（ｉｉｉ）異種対象配列、（ｉｖ）３’ホモロジードメイン、（ｉ）配列標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列、及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼ及び／又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）。
４６８．鋳型ＲＮＡ、第１の鋳型ＲＮＡ又は第２の鋳型ＲＮＡは、ＲＴドメインに特異的に結合する配列を含む、先の実施形態のいずれかのシステム又は鋳型ＲＮＡ。
４６９．ＲＴドメインに特異的に結合する配列は、（ｉ）と（ｉｉ）との間に配置されている、先の実施形態のいずれかのシステム又は鋳型ＲＮＡ。
４７０．ＲＴドメインに特異的に結合する配列は、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に配置されている、先の実施形態のいずれかのシステム又は鋳型ＲＮＡ。
４７１．ＲＴドメインに特異的に結合する配列は、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間に配置されている、先の実施形態のいずれかのシステム又は鋳型ＲＮＡ。
４７２．ＲＴドメインに特異的に結合する配列は、（ｉｖ）と（ｉ）との間に配置されている、先の実施形態のいずれかのシステム又は鋳型ＲＮＡ。
４７３．ＲＴドメインに特異的に結合する配列は、（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に配置されている、先の実施形態のいずれかのシステム又は鋳型ＲＮＡ。
４７４．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）（ｉ）ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメイン及び／又はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に結合する配列、並びに（ｉｉ）標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集の鎖）に結合する配列を含む第１の鋳型ＲＮＡ（又は第１の鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）（例えば、ここで、第１のＲＮＡは、ｇＲＮＡを含む）；
（ｂ）（ｉ）ポリペプチド（例えば、（ａ）のポリペプチド）の逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに特異的に結合する配列、（ｉｉ）標的部位結合配列（ＴＳＢＳ）、及び（ｉｉｉ）ＲＴ鋳型配列を含む第２の鋳型ＲＮＡ（又は第２の鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
（ａ）（ｉ）ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメイン及び／又はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に結合する配列、並びに（ｉｉ）標的部位（例えば、標的ゲノムにおける部位の非編集の鎖）に結合する配列を含む第１の鋳型ＲＮＡ（又は第１の鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）（例えば、ここで、第１のＲＮＡは、ｇＲＮＡを含む）；
（ｂ）（ｉ）ポリペプチド（例えば、（ａ）のポリペプチド）の逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに特異的に結合する配列、（ｉｉ）標的部位結合配列（ＴＳＢＳ）、及び（ｉｉｉ）ＲＴ鋳型配列を含む第２の鋳型ＲＮＡ（又は第２の鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含むシステム。
４７５．第１の鋳型ＲＮＡをコードする核酸及び第２の鋳型ＲＮＡをコードする核酸は、２つの別々の核酸である、先の実施形態のいずれかのシステム。
４７６．第１の鋳型ＲＮＡをコードする核酸及び第２の鋳型ＲＮＡをコードする核酸は、同じ核酸分子の部分であり、例えば同じベクター上に存在する、先の実施形態のいずれかのシステム。
４７７．ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；及び（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ニッカーゼドメインを含み、ここで、ＲＴドメインが、表１若しくは３、又は表２に列挙されるタンパク質ドメインの配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を有する、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸。
４７８．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）第１のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、逆転写酵素（ＲＴ）ドメインであって、表１若しくは３の配列又は表２に記載されるタンパク質ドメインの配列或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を有する逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン；及び任意選択でＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）（例えば、第１のＤＢＤ）を含む、第１のポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）第２のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）ＤＢＤ（例えば、第２のＤＢＤ）；及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、第２のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸
を含むシステム。
（ａ）第１のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、逆転写酵素（ＲＴ）ドメインであって、表１若しくは３の配列又は表２に記載されるタンパク質ドメインの配列或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を有する逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン；及び任意選択でＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）（例えば、第１のＤＢＤ）を含む、第１のポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）第２のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）ＤＢＤ（例えば、第２のＤＢＤ）；及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む、第２のポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸
を含むシステム。
４７９．第１のポリペプチドをコードする核酸及び第２のポリペプチドをコードする核酸は、２つの別々の核酸である、先の実施形態のいずれかのシステム。
４８０．第１のポリペプチドをコードする核酸及び第２のポリペプチドをコードする核酸は、同じ核酸分子の部分であり、例えば同じベクター上に存在する、先の実施形態のいずれかのシステム。
４８１．システムのＲＮＡ（例えば、鋳型ＲＮＡ、（ａ）のポリペプチドをコードするＲＮＡ、又は標的ＤＮＡ中に組み込まれた異種目的配列から発現されるＲＮＡ）は、例えば３’ＵＴＲ内に、マイクロＲＮＡ結合部位を含む、先の実施形態のいずれかのシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
４８２．マイクロＲＮＡ結合部位は、非標的細胞型内に存在するが、標的細胞型内に存在しない（又は非標的細胞と比較してレベルが引き下げられて存在する）ｍｉＲＮＡによって認識される、実施形態４８１のシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
４８３．ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１４２であり、且つ／又は非標的細胞は、クップファー細胞若しくは血球、例えば免疫細胞である、実施形態４８１又は４８２のシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
４８４．ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１８２若しくはｍｉＲ－１８３であり、且つ／又は非標的細胞は、脊髄後根神経節ニューロンである、実施形態４８１又は４８２のシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
４８５．システムは、第１のｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲ－１４２）によって認識される第１のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、システムは更に、第２のｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１８２又はｍｉＲ－１８３）によって認識される第２のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、第１のｍｉＲＮＡ結合部位及び第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、システムの同じＲＮＡ上に、又は異なるＲＮＡ上に位置する、実施形態４８１～４８４のいずれかのシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
４８６．鋳型ＲＮＡは、少なくとも２、３、又は４つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位は、同じｍｉＲＮＡ又は異なるｍｉＲＮＡによって認識される、実施形態４８１～４８５のいずれかのシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
４８７．（ａ）のポリペプチドをコードするＲＮＡは、少なくとも２、３、又は４つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位は、同じｍｉＲＮＡ又は異なるｍｉＲＮＡによって認識される、実施形態４８１～４８６のいずれかのシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
４８８．標的ＤＮＡ中に組み込まれた異種目的配列から発現されるＲＮＡは、少なくとも２、３、又は４つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位は、同じｍｉＲＮＡ又は異なるｍｉＲＮＡによって認識される、実施形態４８１～４８７のいずれかのシステム、方法、キット、鋳型ＲＮＡ又は反応混合物。
定義
ドメイン：本明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の連続領域（例えば、連続配列）又は個別の非連続領域（例えば、非連続配列）を含み得る。タンパク質ドメインの例として、以下に限定されないが、エンドヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写ドメインが挙げられる；核酸のドメインの例として、調節ドメイン、例えば転写因子結合ドメインがある。
ドメイン：本明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の連続領域（例えば、連続配列）又は個別の非連続領域（例えば、非連続配列）を含み得る。タンパク質ドメインの例として、以下に限定されないが、エンドヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写ドメインが挙げられる；核酸のドメインの例として、調節ドメイン、例えば転写因子結合ドメインがある。
外性：本明細書で使用されるように、用語「外性」とは、生体分子（例えば、核酸配列又はポリペプチドなど）に関して用いられる場合、生体分子が、人為的に、宿主ゲノム、細胞若しくは生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えＤＮＡ技術又はその他の方法を用いて、既存のゲノム、細胞、組織若しくは対象に付加される核酸は、既存の核酸配列、細胞、組織若しくは対象に対して外性である。
第１／第２の鎖：本明細書中で用いられる、標的ＤＮＡの個々のＤＮＡ鎖を説明するのに用いられる第１の鎖及び第２の鎖は、２つのＤＮＡ鎖を識別し、これらの鎖に基づいて、逆転写酵素ドメインは、例えば標的プライムド合成が開始する場所に基づいて、重合を開始する。第１の鎖は、標的ＤＮＡの鎖を指し、この上で、逆転写酵素ドメインが重合を開始する、例えば、標的プライムド合成が開始される。第２の鎖は、標的ＤＮＡの他方の鎖を指す。名称第１の鎖及び第２の鎖は、その他の点では標的部位ＤＮＡ鎖を説明しない；例えば、一部の実施形態において、第１の鎖及び第２の鎖は、本明細書中に記載されるポリペプチドによってニックが入れられるが、名称「第１の」及び「第２の」鎖は、そのようなニックが出現する順序とは無関係である。
ゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨ部位）：ゲノムセーフハーバー部位は、例えば、挿入された遺伝因子が、宿主細胞若しくは生物にリスクをもたらす宿主ゲノムの有意な改変を引き起こさないように、新たな遺伝物質の組込みを収容することができる宿主ゲノム内の部位である。ＧＳＨ部位は、概して、以下の基準の１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９を満たす：（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／その他の機能性低分子ＲＮＡから＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂに位置する；（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂに位置する；（ｖ）超保存エレメントから＞５０ｋｂ離れている；（ｖｉ）低転写活性を有する（すなわちｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではない；（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン内である；及び／又は（ｉｘ）ヒトゲノム内に１コピーを有し、ユニークである。これらの基準のいくつか又は全てを満たすヒトゲノム中のＧＳＨ部位の例としては、（ｉ）アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、染色体１９上のＡＡＶウイルスの統合の天然部位；（ｉｉ）ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１コレセプターとして知られているケモカイン受容体遺伝子；（ｉｉｉ）マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログ；（ｉｖ）ｒＤＮＡ遺伝子座（ｖ）例えば、肝細胞適用のためのアルブミン遺伝子座；（ｖｉ）例えば、Ｔ細胞適用のためのＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座が挙げられる。更に別のＧＳＨ部位が知られており、例えば、Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．ｅｐｕｂ Ａｕｇｕｓｔ ２０，２０１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３９６３９０）に記載されている。
異種：用語「異種」は、第２の要素に関して第１の要素を表すために使用される場合、第１の要素と第２の要素が、記載されるような配置で天然に存在しないことを意味する。例えば、異種ポリペプチド、核酸分子、構築物若しくは配列は、（ａ）それが発現される細胞に対してネイティブではないポリペプチド、核酸分子、又はポリペプチド若しくは核酸分子配列の部分、（ｂ）その天然の状態に対して改変若しくは突然変異したポリペプチド若しくは核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子の部分、又は（ｃ）類似の条件下でのネイティブ発現レベルと比較して改変された発現を有するポリペプチド又は核酸分子を指す。例えば、異種調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）を用いて、遺伝子又は核酸分子が天然に通常発現されるものと異なる様式で遺伝子又は核酸分子の発現を調節することができる。別の例において、ポリペプチドの異種ドメイン、又は核酸配列（例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン、又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸）は、他のドメインと比較して配置されてもよいし、ポリペプチドの他のドメイン若しくは一部、又はそのコード核酸と比較して、異なる配列であっても異なる供給源由来であってもよい。特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞ゲノム内に存在し得るが、改変された発現レベル若しくは異なる配列を有するか、又はその両方であり得る。他の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞又は宿主ゲノムに内在性ではなくてもよいが、代わりに形質転換（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション）により宿主細胞に導入され得、ここで、付加される分子は、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又は一過性（例えば、ｍＲＮＡ）若しくは２世代以上にわたって半安定的（例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド若しくは他の自己複製ベクター）のいずれかで染色体外遺伝材料として存在することができる。
突然変異又は突然変異型：用語「（突然）変異型」は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列内のヌクレオチドが、参照（例えば、天然）核酸配列に比して、挿入、欠失若しくは変更されている可能性があることを意味する。単一の改変が１遺伝子座で為される（点変異）、又は単一遺伝子座で複数のヌクレオチドが挿入、欠失若しくは変更される場合もある。加えて、１核酸配列内の任意の数の遺伝子座で、１つ若しくは複数の改変が為される場合もある。核酸配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって突然変異させることができる。
核酸分子：核酸分子は、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両方を指し、限定しないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡが挙げられ、本明細書に記載される通り、ＲＮＡ鋳型のように、化学的に合成される又は組換えにより生成されるものなどの合成核酸分子も含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖、環状若しくは線状であってよい。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であってよい。別に記載のない限り、また、一般フォーマット「配列番号」として本明細書に記載される全ての配列の例として、「配列番号１」を含む核酸は、少なくともその一部が、（ｉ）配列番号１の配列、又は（ｉｉ）配列番号１と相補的な配列のどちらかを有する核酸を指す。２つのどちらを選択するかは、配列番号１が使用される状況によって決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つの間の選択は、プローブが、所望の標的と相補的であるという要件によって決定される。本開示の核酸配列は、当業者に容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾されてもよいし、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよい。こうした修飾として、例えば、標識、メチル化、類似体による１つ若しくは複数の自然発生的なヌクレオチドの置換、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩など）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分、（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えば、α－アノマー核酸など）が挙げられる。また、水素結合及びその他の化学的相互作用により指定配列と結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。こうした分子は、当技術分野において公知であり、例えば、分子の骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合を使用するものがある。他の修飾として、例えば、リボース環が、架橋部分又は「ロックド」核酸に見いだされる修飾などの他の構造を含む類似体を挙げることができる。
遺伝子発現単位：遺伝子発現単位は、少なくとも１つのエフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節核酸配列を含む核酸配列である。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的に関連して配置されるとき、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、プロモータ又はエンハンサーが、コード配列の転写若しくは発現に影響を及ぼす場合、コード配列と作動可能に連結している。作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的又は非連続であり得る。２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、作動可能に連結した配列が同じリーディングフレーム内に存在してもよい。
宿主：宿主ゲノム又は宿主細胞という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質及び／又は遺伝材料が導入された細胞及び／又はそのゲノムを指す。こうした用語は、特定の対象細胞及び／又はゲノムだけではなく、そのような細胞の子孫及び／又はそのような細胞の子孫のゲノムも指す。特定の修飾は、突然変異又は環境の影響により後の世代に起こり得ることから、こうした子孫は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、やはり本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれることを理解されたい。宿主ゲノム又は宿主細胞は、単離された細胞若しくは培養で増殖した細胞株又はそうした細胞若しくは細胞株から単離されたゲノム物質であり得るか、或いは生体組織若しくは生物を構成する宿主細胞又は宿主ゲノムであり得る。いくつかの事例では、宿主細胞は、例えば、本明細書で記載されるように、動物細胞又は植物細胞であってよい。特定の例では、宿主細胞は、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞、又はシチメンチョウ細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞、又はコメ細胞であり得る。
作用関連：本明細書中で用いられる「作用関連」は、２つの核酸配列、例えば１）プロモータと、２）異種目的配列との機能的関係を説明し、そしてそのような例では、プロモータ及び異種目的配列（例えば、注目する遺伝子）は、適切な条件の下で、プロモータが異種目的配列の発現を駆動するように、向きを定められていることを意味する。例えば、鋳型核酸は、例えば（＋）又は（－）の向きの、一本鎖であってもよいが、プロモータと異種目的配列との間の作用関連は、鋳型核酸が特定の状態で転写することとなるか否かに拘らず、適切な状態にある（例えば、必要とされる触媒因子及びＮＴＰその他の存在下で、（＋）の向きである）場合、正確に転写することを意味する。作用関連は、他の組織特異的発現制御配列（例えば、エンハンサー、リプレッサ、及びマイクロＲＮＡ認識配列）、ＩＲ／ＤＲ、ＩＴＲ、ＵＴＲ、又は相同領域、及び異種目的配列、又はトランスポザーゼをコードする配列が挙げられる、核酸の他の対に類似して当て嵌まる。
シュードノット：本明細書中で用いられる「シュードノット配列」は、自己相補性がシュードノット構造を形成するのに適した配列を有する、例えば第１のセグメント、第１のセグメントと第３のセグメントとの間の第２のセグメント（第３のセグメントは、第１のセグメントと相補的である）、及び第４のセグメント（第４のセグメントは、第２のセグメントと相補的である）を有する核酸（例えばＲＮＡ）を指す。シュードノットは、任意選択で、追加の二次構造、例えば第２のセグメント内に配置されるステムループ、第２のセグメントと第３のセグメントとの間に配置されるステム－ループ、第１のセグメントの前の配列又は第４のセグメントの後ろの配列を有してもよい。シュードノットは、第１と第２のセグメント間に、第２と第３のセグメント間に、又は第３と第４のセグメント間に、追加の配列を有してもよい。一部の実施形態において、セグメントは、５’から３’に：第１、第２、第３、そして第４と配置される。一部の実施形態において、第１及び第３のセグメントは、完全な相補性の５塩基対を含む。一部の実施形態において、第２と第４のセグメントは、任意選択で、１つ以上（例えば２つ）のバルジを有する１０塩基対を含む。一部の実施形態において、第２のセグメントは、例えばループを形成する、１つ以上の対になってないヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第３のセグメントは、例えばループを形成する、１つ以上の対になってないヌクレオチドを含む。
ステム－ループ配列：本明細書中で用いられる「ステム－ループ配列」は、自己相補性がステム－ループを形成するのに十分な、例えば、少なくとも２（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）塩基対を含むステム、及び少なくとも３（例えば４）塩基対を有するループを有する、核酸配列（例えばＲＮＡ配列）を指す。ステムは、ミスマッチ又はバルジを含んでもよい。
組織特異的発現－制御配列：本明細書中で用いられる「組織特異的発現－制御配列」は、異種目的配列を、標的組織内に組織特異的に、例えばオフターゲット組織と比較してオンターゲット組織内に優先的に含む転写産物のレベルを増減する核酸エレメントを意味する。一部の実施形態において、組織特異的発現－制御配列は、異種目的配列を、標的組織内に組織特異的に、例えばオフターゲット組織と比較してオンターゲット組織内に優先的に含む転写産物の転写、活性、又は半減期を優先的に駆動又は抑制する。例示的な組織特異的発現－制御配列は、組織特異的プロモータ、リプレッサ、エンハンサー、又はそれらの組合せ、及び組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列を含む。組織特異性は、オンターゲット（鋳型核酸の発現又は活性が所望されるか、又は容認できる組織）、及びオフターゲット（鋳型核酸の発現又は活性が所望されないか、又は容認できない組織）を指す。例えば、組織特異的プロモータ（例えば、鋳型核酸内の、又はトランスポザーゼの発現を制御するプロモータ）は、オフターゲット組織と比較して、オンターゲット組織内で優先的に発現を駆動する。これに対し、（トランスポザーゼをコードする核酸上、又は鋳型核酸上、又は両方の）組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列に結合するマイクロＲＮＡは、オンターゲット組織と比較して、オフターゲット組織内で優先的に発現されることにより、オフターゲット組織内での鋳型核酸（又はトランスポザーゼ）の発現を引き下げる。従って、同じ組織、例えば標的組織に特有のプロモータ及びマイクロＲＮＡ認識配列は、組織内での関連配列の転写、活性、又は半減期に関して、対照的な機能を有する（発現レベルを一致させて、すなわち、オフターゲット組織内でのマイクロＲＮＡの高いレベル、及びオンターゲット組織内での低いレベルをそれぞれ促進且つ抑制する一方、プロモータは、オンターゲット組織内での高い発現、及びオフターゲット組織内での低い発現を駆動する）。
特許ファイル又は出願ファイルは、色付きで仕上げた少なくとも１つの図面を含有する。色付き図面を有する特許公報又は特許出願公報のコピーは、請求と必須の料金の支払いがあれば直ぐに、庁によって提供される。
本開示は、例えば、インビボ又はインビトロで、細胞、組織若しくは対象におけるＤＮＡ配列内の１つ若しくは複数の位置で、ＤＮＡ配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する（例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的ＤＮＡ配列を挿入する）ための組成物、システム及び方法に関する。目的ＤＮＡ配列は、例えば、コード配列、調節配列、遺伝子発現単位を含み得る。
より詳細には、本開示は、対象とする配列をゲノム中に挿入するためのレトロトランスポゾンに基づくシステムを提供する。本開示は、部分的に、様々な生物（表３を参照）に由来するレトロトランスポザーゼ配列並びに関連する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを同定するために、バイオインフォマティクス解析に基づいている。
Ｇｅｎｅ－ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムエディター
非長末端反復（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンは、真核生物ゲノム内の広範囲にわたる可動遺伝エレメントの一タイプである。これは、２つのクラス：アプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）タイプ及び制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）タイプを含む。ＡＰＥクラスレトロトランスポゾンは、２つの機能的ドメイン：エンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン、及び逆転写酵素ドメインで構成される。ＲＬＥクラスは、３つの機能的ドメイン：ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインで構成される。非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインは、ＲＮＡ配列鋳型に結合して、これを宿主ゲノムの標的ＤＮＡに逆転写することによって機能する。ＲＮＡ配列鋳型は、トランスポザーゼに特異的に結合される３’非翻訳領域及び通常、トランスポザーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有する可変５’領域を有する。また、ＲＮＡ配列鋳型は、レトロトランスポザーゼに特異的に結合する５’非翻訳領域を含んでもよい。
非長末端反復（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンは、真核生物ゲノム内の広範囲にわたる可動遺伝エレメントの一タイプである。これは、２つのクラス：アプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）タイプ及び制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）タイプを含む。ＡＰＥクラスレトロトランスポゾンは、２つの機能的ドメイン：エンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン、及び逆転写酵素ドメインで構成される。ＲＬＥクラスは、３つの機能的ドメイン：ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインで構成される。非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインは、ＲＮＡ配列鋳型に結合して、これを宿主ゲノムの標的ＤＮＡに逆転写することによって機能する。ＲＮＡ配列鋳型は、トランスポザーゼに特異的に結合される３’非翻訳領域及び通常、トランスポザーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有する可変５’領域を有する。また、ＲＮＡ配列鋳型は、レトロトランスポザーゼに特異的に結合する５’非翻訳領域を含んでもよい。
非ＬＴＲレトロトランスポゾンによる逆転写は、標的プライム逆転写として記載される独自のプロセスによって起こる（Ｌｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ７２，５９５－６０５（１９９３））。統合を開始させるために、第１の一本鎖ニックが、レトロトランスポザーゼのエンドヌクレアーゼドメインによって生成されて、遊離３’－ＯＨを放出する。次に、３’末端における構造的特徴を用いてレトロトランスポザーゼによって結合されたレトロトランスポゾンＲＮＡが、遊離３’－ＯＨにおける重合を有する標的部位によってプライミングされ、逆転写のための鋳型として使用される。いくつかのシステムにおいて、第２のニックが、第２のＤＮＡ鎖に標的化され、新たな遊離３’－ＯＨが、第２の鎖合成を開始させるのに使用される。いくつかの非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、Ｒ２は、この第２のニックのためのレトロトランスポゾンＲＮＡの５’末端における第２レトロトランスポザーゼ単位との相互作用をさらに必要とすると考えられ、これは、５’末端の放出により活性化される（Ｃｒａｉｇ，Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩＩ，ＡＳＭ，ｅｄ．３（２１０５））。
本明細書中に記載されるそのような非ＬＴＲレトロトランスポゾンのエレメントは、標的ＤＮＡ配列を標的とするか、編集するか、修飾するか、又は操作するように、例えば逆転写により、標的ゲノム、例えば哺乳動物ゲノム中に目的（例えば異種）核酸配列を挿入するように、機能的にモジュール化且つ／又は修飾することができる。そのようなモジュール化且つ修飾された核酸、ポリペプチド組成物、及びシステムが、本明細書中に記載されており、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターと称される。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは：（Ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸（ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素ドメイン、並びに（ｘ）ＤＮＡ結合機能を含有するエンドヌクレアーゼドメイン、又は（ｙ）エンドヌクレアーゼドメイン及び別個のＤＮＡ結合ドメインを含む）と；（Ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、及び（ｉｉ）異種挿入配列を含む鋳型ＲＮＡとを含む。例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含んでもよい。他の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタタンパク質は、逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含んでもよい。特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディタポリペプチドのエレメントは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、ＡＰＥ－タイプ若しくはＲＬＥタイプのレトロトランスポゾン、又はその一部若しくはドメインの配列に由来し得る。一部の実施形態において、ＲＬＥタイプの非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、Ｒ２、ＮｅＳＬ、ＨＥＲＯ、Ｒ４、又はＣＲＥクレードに由来する。一部の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタは、Ｒ４エレメントＸ４＿Ｌｉｎｅに由来し、これはヒトゲノム内で見出される。一部の実施形態において、ＡＰＥ－タイプの非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、Ｒ１、又はＴｘ１クレードに由来する。一部の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタは、Ｔｘ１エレメントＭａｒｅ６に由来し、これはヒトゲノム内で見出される。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムのＲＮＡ鋳型エレメントは、典型的に、ポリペプチドエレメントに対して異種である。そして、宿主ゲノム中に挿入される（逆転写される）こととなる対象配列を提供する。一部の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタタンパク質は、標的プライムド逆転写ができる。一部の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタタンパク質は、第２の鎖の合成ができる。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムエディタを第２ポリペプチドと組み合わせる。一部の実施形態では、第２ポリペプチドは、ＡＰＥ型の非ＬＴＲレトロトランスポゾンから得られる。一部の実施形態では、第２ポリペプチドは、亜鉛ナックル様モチーフ（ｚｉｎｃ ｋｎｕｃｋｌｅ－ｌｉｋｅ ｍｏｔｉｆ）を有する。一部の実施形態では、第２ポリペプチドは、Ｇａｇタンパク質の相同体である。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、ＲＮＡ鋳型に対する特異的結合活性を有する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、核へのＲＮＡ鋳型の局在化を助ける。
実施形態において、本開示は、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド若しくは核酸分子、又は本明細書に記載されるシステムの再標的化のための、核酸分子又はシステムを提供する。再標的化（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド若しくは核酸分子、又は本明細書に記載されるシステムの）は、一般に、（ｉ）ポリペプチドが、標的部位に結合し、それを切断するように指向すること；及び／又は（ｉｉ）鋳型ＲＮＡが、標的配列に対する相補性を有するように設計することを含む。いくつかの実施形態において、例えば、鋳型ＲＮＡの３’末端がアニールし、標的部位の５’末端が、例えば、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）のためのプライマーとして働くように、鋳型ＲＮＡは、第１鎖ニックの標的配列５’に対する相補性を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメイン及びＲＮＡ鋳型の５’末端も、記載されるように修飾される。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ遺伝子エディターシステムのポリペプチド成分
ＲＴドメイン：
本発明の特定の態様において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのための逆転写酵素ドメインは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインに基づいている。ＡＰＥ型又はＲＬＥ型の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの野生型逆転写酵素ドメインは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおいて使用され得る、又は標的ＤＮＡ配列における逆転写酵素活性を改変するために、（例えば、１つ若しくは複数の残基の挿入、欠失、又は置換により）修飾され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素は、例えばヒト細胞について改善された、改変されたコドン使用を有するように、その天然配列から改変される。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、異なるレトロウイルス、ＬＴＲレトロトランスポゾン、又は非ＬＴＲレトロトランスポゾンからの異種の逆転写酵素である。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、Ｒ２、ＮｅＳＬ、ＨＥＲＯ、Ｒ４、又はＣＲＥクレードからのＲＬＥ型の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの、又はＲ１、又はＴｘ１クレードからのＡＰＥ型の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、ＬＴＲレトロトランスポゾン、グループＩＩイントロン、多様性生成エレメント、レトロン、テロメラーゼ、レトロプラスミド、レトロウイルス、又は表１若しくは表３に列記される改変されたポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、表２に列記される逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの逆転写酵素ドメインのアミノ酸配列は、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、ＬＴＲレトロトランスポゾン、グループＩＩイントロン、多様性生成エレメント、レトロン、テロメラーゼ、レトロプラスミド、レトロウイルス、若しくは配列が表１若しくは表３で参照される場合の改変されたポリメラーゼの逆転写酵素ドメイン、又は表２で記載される逆転写酵素ドメインを含むペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一である。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、表１若しくは３から選択される配列又は表２から選択されるＲＴドメインを含むペプチドの配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のＲＴ、例えば、ＨＩＶ－１ ＲＴ、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）ＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、グループＩＩイントロンのＲＴ、例えば、ユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）からのグループＩＩイントロンマチュラーゼＲＴ（ＭａｒａｔｈｏｎＲＴ）（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ２４：２２０１８）、ＬｔｒＡからのＲＴドメイン、ＲＴ ＴＧＩＲＴ（又はｔｒｔ）に由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、レトロンのＲＴ、例えば、Ｅｃ８６からの逆転写酵素（ＲＴ８６）に由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、多様性生成レトロエレメント、例えば、ＢｒｔのＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、レトロプラスミドのＲＴ、例えば、ＭａｕｒｉｃｅｖｉｌｌｅプラスミドからのＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、Ｒ２ＢｍからのＲＴ、Ｒ２ＴｇからのＲＴ、ＬＩＮＥ－１からのＲＴ、Ｐｅｎｅｌｏｐｅ又はＰｅｎｅｌｏｐｅ様エレメント（ＰＬＥ）からのＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、Ｔｙ１からの逆転写酵素に由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、テロメラーゼ、例えば、ＴＥＲＴに由来する。当技術分野における常用の技能を有する者は、他の既知の逆転写ドメインとの相同性に基づいて、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のような常用のツールを使用し、逆転写ドメインを同定することができる。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏドメインＩＰＲ０００４７７を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ｐｆａｍドメインＰＦ０００７８を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏドメインＩＰＲ０１３１０３を含む。一部の実施形態では、ＲＴは、ｐｆａｍドメインＰＦ０７７２７を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ｃｄ００３０４ ＲＴ＿ｌｉｋｅファミリーの保存タンパク質ドメイン、例えば、ｃｄ０１６４４（ＲＴ＿ｐｅｐＡ１７）、ｃｄ０１６４５（ＲＴ＿Ｒｔｖ）、ｃｄ０１６４６（ＲＴ＿Ｂａｃ＿レトロン＿Ｉ）、ｃｄ０１６４７（ＲＴ＿ＬＴＲ）、ｃｄ０１６４８（ＴＥＲＴ）、ｃｄ０１６５０（ＲＴ＿ｎＬＴＲ＿ｌｉｋｅ）、ｃｄ０１６５１（ＲＴ＿Ｇ２＿イントロン）、ｃｄ０１６９９（ＲＮＡ＿ｄｅｐ＿ＲＮＡＰ）、ｃｄ０１７０９（ＲＴ＿ｌｉｋｅ＿１）、ｃｄ０３４８７（ＲＴ＿Ｂａｃ＿レトロン＿ＩＩ）、ｃｄ０３７１４（ＲＴ＿ＤＩＲＳ１）、ｃｄ０３７１５（ＲＴ＿ＺＦＲＥＶ＿ｌｉｋｅ）を含む。これらのドメインを含有するタンパク質は、タンパク質データベース、例えばＩｎｔｅｒＰｒｏ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ３５１－３６０（２０１９））、ＵｎｉＰｒｏｔ （Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ５０６－５１５（２０１９））、又は保存ドメインデータベース（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４８，Ｄ２６５－２６８（２０２０））でドメインを検索することにより、又は予測ツール、例えばＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎを用いて逆転写酵素ドメインについてオープンリーディングフレームを走査することにより、更に見出すことができる。逆転写酵素の多様性（例えば、ＲＴドメインを含む）は、限定はしないが、原核生物によって使用される場合（Ｚｉｍｍｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ３（２）：ＭＤＮＡ３－００５８－２０１４（２０１５）；Ｌａｍｐｓｏｎ Ｂ．Ｃ．（２００７）Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｓ．Ｉｎ：Ｐｏｌａｉｎａ Ｊ．，ＭａｃＣａｂｅ Ａ．Ｐ．（ｅｄｓ）Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）、ウイルスによって使用される場合（Ｈｅｒｓｃｈｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６７（１６）：２７１７－２７４７（２０１０）；Ｍｅｎｅｎｄｅｚ－Ａｒｉａｓ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ２３４：１５３－１７６（２０１７））、及び可動エレメントによって使用される場合（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １３４（１－２）：２２１－２３４（２００８）；Ｃｒａｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩＩ ３ｒｄ Ｅｄ．ＤＯＩ：１０．１１２８／９７８１５５５８１９２１７（２０１５））（それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＲＴドメイン：
本発明の特定の態様において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのための逆転写酵素ドメインは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインに基づいている。ＡＰＥ型又はＲＬＥ型の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの野生型逆転写酵素ドメインは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおいて使用され得る、又は標的ＤＮＡ配列における逆転写酵素活性を改変するために、（例えば、１つ若しくは複数の残基の挿入、欠失、又は置換により）修飾され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素は、例えばヒト細胞について改善された、改変されたコドン使用を有するように、その天然配列から改変される。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、異なるレトロウイルス、ＬＴＲレトロトランスポゾン、又は非ＬＴＲレトロトランスポゾンからの異種の逆転写酵素である。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、Ｒ２、ＮｅＳＬ、ＨＥＲＯ、Ｒ４、又はＣＲＥクレードからのＲＬＥ型の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの、又はＲ１、又はＴｘ１クレードからのＡＰＥ型の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、ＬＴＲレトロトランスポゾン、グループＩＩイントロン、多様性生成エレメント、レトロン、テロメラーゼ、レトロプラスミド、レトロウイルス、又は表１若しくは表３に列記される改変されたポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、表２に列記される逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの逆転写酵素ドメインのアミノ酸配列は、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、ＬＴＲレトロトランスポゾン、グループＩＩイントロン、多様性生成エレメント、レトロン、テロメラーゼ、レトロプラスミド、レトロウイルス、若しくは配列が表１若しくは表３で参照される場合の改変されたポリメラーゼの逆転写酵素ドメイン、又は表２で記載される逆転写酵素ドメインを含むペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一である。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、表１若しくは３から選択される配列又は表２から選択されるＲＴドメインを含むペプチドの配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のＲＴ、例えば、ＨＩＶ－１ ＲＴ、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）ＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、グループＩＩイントロンのＲＴ、例えば、ユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）からのグループＩＩイントロンマチュラーゼＲＴ（ＭａｒａｔｈｏｎＲＴ）（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ２４：２２０１８）、ＬｔｒＡからのＲＴドメイン、ＲＴ ＴＧＩＲＴ（又はｔｒｔ）に由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、レトロンのＲＴ、例えば、Ｅｃ８６からの逆転写酵素（ＲＴ８６）に由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、多様性生成レトロエレメント、例えば、ＢｒｔのＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、レトロプラスミドのＲＴ、例えば、ＭａｕｒｉｃｅｖｉｌｌｅプラスミドからのＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、Ｒ２ＢｍからのＲＴ、Ｒ２ＴｇからのＲＴ、ＬＩＮＥ－１からのＲＴ、Ｐｅｎｅｌｏｐｅ又はＰｅｎｅｌｏｐｅ様エレメント（ＰＬＥ）からのＲＴに由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、Ｔｙ１からの逆転写酵素に由来する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、テロメラーゼ、例えば、ＴＥＲＴに由来する。当技術分野における常用の技能を有する者は、他の既知の逆転写ドメインとの相同性に基づいて、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のような常用のツールを使用し、逆転写ドメインを同定することができる。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏドメインＩＰＲ０００４７７を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ｐｆａｍドメインＰＦ０００７８を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏドメインＩＰＲ０１３１０３を含む。一部の実施形態では、ＲＴは、ｐｆａｍドメインＰＦ０７７２７を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ｃｄ００３０４ ＲＴ＿ｌｉｋｅファミリーの保存タンパク質ドメイン、例えば、ｃｄ０１６４４（ＲＴ＿ｐｅｐＡ１７）、ｃｄ０１６４５（ＲＴ＿Ｒｔｖ）、ｃｄ０１６４６（ＲＴ＿Ｂａｃ＿レトロン＿Ｉ）、ｃｄ０１６４７（ＲＴ＿ＬＴＲ）、ｃｄ０１６４８（ＴＥＲＴ）、ｃｄ０１６５０（ＲＴ＿ｎＬＴＲ＿ｌｉｋｅ）、ｃｄ０１６５１（ＲＴ＿Ｇ２＿イントロン）、ｃｄ０１６９９（ＲＮＡ＿ｄｅｐ＿ＲＮＡＰ）、ｃｄ０１７０９（ＲＴ＿ｌｉｋｅ＿１）、ｃｄ０３４８７（ＲＴ＿Ｂａｃ＿レトロン＿ＩＩ）、ｃｄ０３７１４（ＲＴ＿ＤＩＲＳ１）、ｃｄ０３７１５（ＲＴ＿ＺＦＲＥＶ＿ｌｉｋｅ）を含む。これらのドメインを含有するタンパク質は、タンパク質データベース、例えばＩｎｔｅｒＰｒｏ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ３５１－３６０（２０１９））、ＵｎｉＰｒｏｔ （Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ５０６－５１５（２０１９））、又は保存ドメインデータベース（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４８，Ｄ２６５－２６８（２０２０））でドメインを検索することにより、又は予測ツール、例えばＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎを用いて逆転写酵素ドメインについてオープンリーディングフレームを走査することにより、更に見出すことができる。逆転写酵素の多様性（例えば、ＲＴドメインを含む）は、限定はしないが、原核生物によって使用される場合（Ｚｉｍｍｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ３（２）：ＭＤＮＡ３－００５８－２０１４（２０１５）；Ｌａｍｐｓｏｎ Ｂ．Ｃ．（２００７）Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｓ．Ｉｎ：Ｐｏｌａｉｎａ Ｊ．，ＭａｃＣａｂｅ Ａ．Ｐ．（ｅｄｓ）Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）、ウイルスによって使用される場合（Ｈｅｒｓｃｈｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６７（１６）：２７１７－２７４７（２０１０）；Ｍｅｎｅｎｄｅｚ－Ａｒｉａｓ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ２３４：１５３－１７６（２０１７））、及び可動エレメントによって使用される場合（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １３４（１－２）：２２１－２３４（２００８）；Ｃｒａｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩＩ ３ｒｄ Ｅｄ．ＤＯＩ：１０．１１２８／９７８１５５５８１９２１７（２０１５））（それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ターゲットプライム逆転写（ＴＰＲＴ）開始の、例えば内因性ＲＴドメインと比較して増加したストリンジェンシーを示す。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、第１鎖ニックの直ぐ上流の標的部位内の３ｎｔ、例えばＲＮＡ鋳型をプライムするゲノムＤＮＡが、ＲＮＡ鋳型中の相同性の３ｎｔに対して少なくとも６６％若しくは１００％の相補性を有するとき、ＴＰＲＴを開始する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、鋳型ＲＮＡの相同性と標的ＤＮＡプライミング逆転写の間で５ｎｔ未満が一致しない（例えば、１、２、３、４、又は５ｎｔ未満が一致しない）とき、ＴＰＲＴを開始する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ＴＰＲＴ反応のプライミングでのミスマッチにおけるストリンジェンシーが増加するように修飾され、例えば、ＲＴドメインは、野生型（例えば、非修飾）ＲＴドメインと比較して、プライミング領域内でのミスマッチを全く許容しないか、又はミスマッチをより少なければ許容する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ＨＩＶ－１ ＲＴドメインを含む。複数の実施形態では、ＨＩＶ－１ ＲＴドメインは、代替的なＲＴドメイン（例えば、Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０７（５）：６６１－６７２（２０１１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載のとおり）と比較して、３つのヌクレオチドミスマッチであっても、より低いレベルで合成を開始する。
一部の実施形態では、ＲＴドメインは、二量体（例えば、ヘテロ二量体又はホモ二量体）を形成する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、単量体である。一部の実施形態では、ＲＴドメイン、例えば、レトロウイルスＲＴドメインは、天然には単量体又は二量体（例えば、ヘテロ二量体又はホモ二量体）として機能する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、天然には単量体として機能する、例えば、単量体として機能するウイルスに由来する。例示的な単量体ＲＴドメイン、それらのウイルス源、及びそれらに関連するＲＴシグネチャーは、表３２中のドメインシグネチャーの記載とともに、表３０に見出すことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムのＲＴドメインは、表３０のアミノ酸配列、又はその機能性断片若しくは変異体、又はそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。複数の実施形態では、ＲＴドメインは、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＬＶ；時としてＭｏＭＬＶと称される）（例えば、Ｐ０３３５５）、ブタ内因性レトロウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（ＰＥＲＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ４ＶＦＺ２）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＴＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６５）、マソン・ファイザー・サルウイルス（Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒ ｍｏｎｋｅｙ ｖｉｒｕｓ）（ＭＰＭＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７５７２）、ウシ白血病ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＢＬＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６１）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス－１（ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ－１）（ＨＴＬＶ－１）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６２）、ヒト泡沫状ウイルス（ｈｕｍａｎ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）（ＨＦＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１４３５０）、サル泡沫状ウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２３０７４）、若しくはウシ泡沫状／シンシチウムウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｆｏａｍｙ／ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＢＦＶ／ＢＳＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ４１８９４）、又はその機能性断片若しくは変異体（例えば、それと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）からのＲＴドメインから選択される。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、その天然機能性において二量体である。例示的な二量体ＲＴドメイン、それらのウイルス源、及びそれらに関連するＲＴシグネチャーは、表３２中のドメインシグネチャーの記載とともに、表３１に見出すことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムのＲＴドメインは、表３１のアミノ酸配列、又はその機能性断片若しくは変異体、又はそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、二量体として機能するウイルスに由来する。複数の実施形態では、ＲＴドメインは、トリ肉腫／白血病ウイルス（ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＳＬＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａ０Ａ１４２ＢＫＨ１）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３５４）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８３１３３）、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ）（ＨＩＶ－１）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６９）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）（ＨＩＶ－２）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５８３３）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０５８９６）、ウシ免疫不全ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＢＩＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１９５６０）、ウマ感染性貧血ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＥＩＡＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３７１）、又はネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＦＩＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１６０８８）（Ｈｅｒｓｃｈｈｏｒｎ ａｎｄ Ｈｉｚｉ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６７（１６）：２７１７－２７４７（２０１０））、又はその機能性断片若しくは変異体（例えば、それと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）からのＲＴドメインから選択される。天然には、ヘテロ二量体ＲＴドメインは、一部の実施形態では、ホモ二量体として機能的でもあり得る。一部の実施形態では、二量体ＲＴドメインは、融合タンパク質として、例えば、ホモ二量体融合タンパク質又はヘテロ二量体融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、システムのＲＴ機能は、（例えば、本明細書に記載のような）複数のＲＴドメインによって満たされる。更なる実施形態では、複数のＲＴドメインは、融合されるか又は分かれており、例えば、同じポリペプチド上又は異なるポリペプチド上に存在してもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、インテグラーゼドメインを含み、例えば、インテグラーゼドメインは、ＲＴドメインの一部であり得る。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、インテグラーゼドメインを含む。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、インテグラーゼドメインを欠いており、又は突然変異若しくは欠失によって不活性化されているインテグラーゼドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、リボヌクレアーゼＨドメインを含み、例えば、リボヌクレアーゼＨドメインは、ＲＴドメインの一部であり得る。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、リボヌクレアーゼＨドメイン、例えば、内因性リボヌクレアーゼＨドメイン又は異種リボヌクレアーゼＨドメインを含む。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、リボヌクレアーゼＨドメインを欠いている。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、異種リボヌクレアーゼＨドメインに対して、付加、欠失、突然変異、又は交換されているリボヌクレアーゼＨドメインを含む。一部の実施形態では、リボヌクレアーゼＨドメインの突然変異は、例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６（１）：２６５－２７７（１９８８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）における方法による測定として、例えば、突然変異を有しない他の類似ドメインと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけより低い、より低いリボヌクレアーゼ活性を示すポリペプチドを生成する。一部の実施形態では、リボヌクレアーゼＨ活性は、消失する。
一部の実施形態では、ＲＴドメインは、突然変異を受け、突然変異を有しない他の類似ドメインと比較して忠実度が増加する。例えば、一部の実施形態では、ＲＴドメイン内（例えば、逆転写酵素中）のＹＡＤＤ（配列番号１５４７）又はＹＭＤＤ（配列番号１５４８）モチーフは、ＹＶＤＤ（配列番号１５４９）と置換される。複数の実施形態では、ＹＡＤＤ（配列番号１５４７）又はＹＭＤＤ（配列番号１５４８）又はＹＶＤＤ（配列番号１５４９）の置換は、レトロウイルス逆転写酵素活性において、より高い忠実度をもたらす（例えば、Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１１に記載される；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、逆転写酵素ドメインは、例えば部位特異的突然変異によって修飾される。いくつかの実施形態において、逆転写酵素ドメインは、天然配列に対するいくつかのアミノ酸置換、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の置換を含む。実施形態において、逆転写酵素ドメインは、異種鋳型ＲＮＡに結合するように操作される。
エンドヌクレアーゼドメイン：
特定の実施形態において、ＡＰＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインは、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおいて、使用され得るか、又は修飾され得る（例えば、１つ以上の残基の挿入、欠失、若しくは置換によって）。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメイン又はエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメインは、改変されたコドン使用頻度を有するようにその天然配列から改変され、例えば、ヒト細胞について改善される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ要素は、異種エンドヌクレアーゼ要素、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ、ＩＩ型制限様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ型ヌクレアーゼ）、又は別のＲＬＥ型エンドヌクレアーゼ（ＲＥＬとしても知られている）である。いくつかの実施形態において、異種エンドヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼ活性を有し、二本鎖切断を形成しない。いくつかの実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、又はニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。エンドヌクレアーゼドメインの本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列が表１、２、又は３において参照されるレトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であり得る。当業者は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のようなツールを用いて、他の公知のエンドヌクレアーゼドメインに対する相同性に基づいてエンドヌクレアーゼドメインを同定することが可能である。特定の実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、Ｆｏｋ１又はその機能的フラグメントである。特定の実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、ホリデイジャンクションリゾルバーゼ又はそのホモログ、例えば、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）に由来するホリデイジャンクション解離酵素－－Ｓｓｏｌ Ｈｊｅである（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：７、２０１６）。特定の実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、スプライセオソームタンパク質の大型フラグメントのエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｐｒｐ８である（Ｍａｈｂｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ８：１６，２０１７）。例えば、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素ドメイン及びＦｏｋ１又はその機能的フラグメントを含むエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。さらに他の実施形態において、同種エンドヌクレアーゼドメインが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を改変するように、例えば部位特異的突然変異によって修飾される。さらに他の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、任意の潜在的なＤＮＡ配列特異性を除去するように修飾される。
特定の実施形態において、ＡＰＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインは、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおいて、使用され得るか、又は修飾され得る（例えば、１つ以上の残基の挿入、欠失、若しくは置換によって）。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメイン又はエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメインは、改変されたコドン使用頻度を有するようにその天然配列から改変され、例えば、ヒト細胞について改善される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ要素は、異種エンドヌクレアーゼ要素、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ、ＩＩ型制限様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ型ヌクレアーゼ）、又は別のＲＬＥ型エンドヌクレアーゼ（ＲＥＬとしても知られている）である。いくつかの実施形態において、異種エンドヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼ活性を有し、二本鎖切断を形成しない。いくつかの実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、又はニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。エンドヌクレアーゼドメインの本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列が表１、２、又は３において参照されるレトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であり得る。当業者は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のようなツールを用いて、他の公知のエンドヌクレアーゼドメインに対する相同性に基づいてエンドヌクレアーゼドメインを同定することが可能である。特定の実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、Ｆｏｋ１又はその機能的フラグメントである。特定の実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、ホリデイジャンクションリゾルバーゼ又はそのホモログ、例えば、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）に由来するホリデイジャンクション解離酵素－－Ｓｓｏｌ Ｈｊｅである（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：７、２０１６）。特定の実施形態において、異種エンドヌクレアーゼは、スプライセオソームタンパク質の大型フラグメントのエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｐｒｐ８である（Ｍａｈｂｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ８：１６，２０１７）。例えば、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素ドメイン及びＦｏｋ１又はその機能的フラグメントを含むエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。さらに他の実施形態において、同種エンドヌクレアーゼドメインが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を改変するように、例えば部位特異的突然変異によって修飾される。さらに他の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、任意の潜在的なＤＮＡ配列特異性を除去するように修飾される。
標的プライム逆転写を開始させるのに必要とされる標的部位ニックに加えて、追加のエンドヌクレアーゼ活性が、統合事象の解消を改善するのに有益であり得る（Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７６，１４９－１５７（２０１９））。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ要素は、標的プライム逆転写を開始させるためのニックを提供し、ポリペプチドのさらなる異種ドメインは、さらなるエンドヌクレアーゼ活性を提供する。いくつかの実施形態において、さらなるエンドヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼによって提供される。いくつかの実施形態において、さらなるエンドヌクレアーゼ活性は、エンドヌクレアーゼ活性も有する異種ＤＮＡ結合要素、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼによって提供され得る。いくつかの実施形態において、さらなるエンドヌクレアーゼ活性は、第１のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド内に含まれ得る。いくつかの実施形態において、さらなるエンドヌクレアーゼ活性は、別個のポリペプチドによって提供され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、例えば、本明細書における実施例３２のアッセイを用いて測定される際、標的ＤＮＡ配列中の所定の位置で切断するエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡ配列中のＧＧ部位で切断する。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡ配列中のＡＡＧＧ部位で切断する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標的ＤＮＡ配列は、ＧＧ又はＡＡＧＧモチーフ、例えば、ヒトゲノム中の天然モチーフを含む。
ＤＮＡ結合ドメイン：
特定の態様において、本明細書に記載されるＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは、所望の宿主ＤＮＡ標的配列に結合するために、選択、設計、又は構成される。特定の実施形態において、操作されたＲＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、天然レトロトランスポゾン配列に対して異種ＤＮＡ結合タンパク質又はドメインである。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、亜鉛フィンガー要素又はＴＡＬエフェクター要素、例えば、亜鉛フィンガー又はＴＡＬポリペプチド又は機能的そのフラグメントである。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、配列ガイドＤＮＡ結合要素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、又はエンドヌクレアーゼ活性を有さないように改変された他のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、エンドヌクレアーゼ活性を保持する。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、一本鎖ＤＮＡ切断活性のみを保持し、例えば、ＤＮＡニッカーゼであり、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性を有する異種ＤＮＡ結合要素は、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ要素を代替する。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性を有する異種ＤＮＡ結合要素は、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ要素を補完し、例えば、標的部位におけるさらなるニックを引き起こす。特定の実施形態において、異種ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９、ＴＡＬドメイン、ＺＦドメイン、Ｍｙｂドメイン、それらの組合せ、又はそれらの多重体のいずれか１つ以上であり得る。特定の実施形態において、異種ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書における表に記載されるレトロトランスポゾンのＤＮＡ結合ドメインである。当業者は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のようなツールを用いて、他の公知のＤＮＡ結合ドメインに対する相同性に基づいてＤＮＡ結合ドメインを同定することが可能である。さらに他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば部位特異的突然変異によって、ＤＮＡ結合特異性及び親和性を改変するように、ＤＮＡ結合要素（例えば、亜鉛フィンガーの数及び／又は特異性）を増加又は減少させるなどで修飾される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、改変されたコドン使用頻度を有するようにその天然配列から改変され、例えばヒト細胞について改善される。
特定の態様において、本明細書に記載されるＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは、所望の宿主ＤＮＡ標的配列に結合するために、選択、設計、又は構成される。特定の実施形態において、操作されたＲＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、天然レトロトランスポゾン配列に対して異種ＤＮＡ結合タンパク質又はドメインである。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、亜鉛フィンガー要素又はＴＡＬエフェクター要素、例えば、亜鉛フィンガー又はＴＡＬポリペプチド又は機能的そのフラグメントである。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、配列ガイドＤＮＡ結合要素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、又はエンドヌクレアーゼ活性を有さないように改変された他のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、エンドヌクレアーゼ活性を保持する。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡ結合要素は、一本鎖ＤＮＡ切断活性のみを保持し、例えば、ＤＮＡニッカーゼであり、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性を有する異種ＤＮＡ結合要素は、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ要素を代替する。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性を有する異種ＤＮＡ結合要素は、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ要素を補完し、例えば、標的部位におけるさらなるニックを引き起こす。特定の実施形態において、異種ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９、ＴＡＬドメイン、ＺＦドメイン、Ｍｙｂドメイン、それらの組合せ、又はそれらの多重体のいずれか１つ以上であり得る。特定の実施形態において、異種ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書における表に記載されるレトロトランスポゾンのＤＮＡ結合ドメインである。当業者は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のようなツールを用いて、他の公知のＤＮＡ結合ドメインに対する相同性に基づいてＤＮＡ結合ドメインを同定することが可能である。さらに他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば部位特異的突然変異によって、ＤＮＡ結合特異性及び親和性を改変するように、ＤＮＡ結合要素（例えば、亜鉛フィンガーの数及び／又は特異性）を増加又は減少させるなどで修飾される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、改変されたコドン使用頻度を有するようにその天然配列から改変され、例えばヒト細胞について改善される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン中の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、例えば、実施例３０のアッセイにおいてＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合活性を、例えば、対応する野生型配列の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、又は１％未満に、低下させるか又はなくす。突然変異は、例えば、ＺＦ１ドメイン、ＺＦ２ドメイン、又はｃ－ｍｙｂドメイン中であり得る。突然変異は、点突然変異であり得る。突然変異は、Ｃ残基中（例えば、ＣからＳ）、例えば、ＺＦ１若しくはＺＦ２ドメインにおけるＣ残基中；Ｒ残基中（例えば、ＲからＡ）、例えば、ｃ－ｍｙｂドメインにおけるＲ残基中；又はＷ残基中（例えば、ＷからＡ）、例えば、ｃ－ｍｙｂドメインにおけるＷ残基中；又はそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメイン中に突然変異を含むポリペプチドは、異種ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ゲノム中の天然ＡＡＧＧ配列は、Ｒ２レトロトランスポザーゼベースのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを再標的化するためのシードとして使用され、ここで、新たな標的部位へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの結合が、エンドヌクレアーゼ活性を可能にするためのＡＡＧＧモチーフへのエンドヌクレアーゼドメインの適切な位置決めをもたらすように、ＤＮＡ結合ドメインは、突然変異されるか又は異種ＤＮＡ結合ドメインで置換される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標的ＤＮＡ配列は、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフ（例えば、ＧＧ又はＡＡＧＧモチーフ）、例えば、ヒトゲノム中の天然モチーフを含む。いくつかの実施形態において、例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒのエンドヌクレアーゼドメインが、モチーフを切断するように位置決めされるように、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフの近くに結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、異種ＤＮＡ結合ドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフ（例えば、ＧＧ又はＡＡＧＧモチーフ）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０ヌクレオチド以内にある部位に結合する。ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＧ又はＡＡＧＧモチーフの上流又は下流の部位に結合し得る。ＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼドメインによって認識されるモチーフ（例えば、ＧＧ又はＡＡＧＧモチーフ）と比較して、同じ配向又は逆相補配向にある部位に結合し得る。いくつかの実施形態において、再標的化ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドは、（ｉ）モチーフを認識するエンドヌクレアーゼドメイン、及び（ｉｉ）ゲノムＤＮＡ配列を認識する異種ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、モチーフは、ゲノムＤＮＡ配列の約３０～８０、４０～７０、５０～６０、又は５５ｎｔ上流にあり、ここで、任意選択で、モチーフ及びゲノムＤＮＡ配列は、同じ配向にある。いくつかの実施形態において、モチーフは、ゲノムＤＮＡ配列の約１０～３０、１５～２５、又は２０ｎｔ下流にあり、ここで、任意選択で、モチーフは、ゲノムＤＮＡ配列に対して逆配向にある。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼドメイン（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、エンドヌクレアーゼドメイン部分中）、又はその機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼ活性、例えば、二本鎖切断及び／又はニッカーゼ活性を有する。他の実施形態において、メガヌクレアーゼドメインは、低下した活性を有し、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を欠き、例えば、メガヌクレアーゼは、触媒的に不活性である。いくつかの実施形態において、触媒的に不活性なメガヌクレアーゼが、例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＦｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（２）：８４７－８６０（２０１２）に記載されるように、ＤＮＡ結合ドメインとして使用される。実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、野生型ＤＮＡ結合ドメインに対して１つ以上の修飾、例えば、指向性進化法、例えば、ファージを用いた連続的進化法（ＰＡＣＥ）による修飾を含む。
本発明の特定の態様において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムに統合された宿主ＤＮＡ結合部位は、遺伝子中、イントロン中、エキソン中、ＯＲＦ、任意の遺伝子のコード領域の外側、遺伝子の調節領域中、又は遺伝子の調節領域の外側にあり得る。他の態様において、操作されたＲＬＥは、１つ又は２つ以上の宿主ＤＮＡ配列に結合し得る。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムが、複対立遺伝子中の標的遺伝子座を編集するのに使用される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムが、特定の対立遺伝子を編集するように設計される。例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドが、１つの対立遺伝子のみに存在する特定の配列に指向され得、例えば、標的対立遺伝子、例えば、ｇＲＮＡ又はアニーリングドメインに対する相同性を有するが、第２の同種対立遺伝子に対する相同性を有さない鋳型ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムが、ハプロタイプ特異的対立遺伝子を改変し得る。いくつかの実施形態において、特定の対立遺伝子を標的とするＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムが、その対立遺伝子を優先的に標的とし、例えば、標的対立遺伝子に対する少なくとも２、４、６、８、又は１０倍の優先度を有する。
特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムＲＮＡが、細胞内局在化配列、例えば、核局在化配列をさらに含む。核局在化配列は、核中へのＲＮＡの取り込みを促進するＲＮＡ配列であり得る。特定の実施形態において、核局在化シグナルが、鋳型ＲＮＡ上に位置する。特定の実施形態において、レトロトランスポザーゼポリペプチドは、第１のＲＮＡ上にコードされ、鋳型ＲＮＡは、第２の別個のＲＮＡであり、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡ上に位置し、レトロトランスポザーゼポリペプチドをコードするＲＮＡ上に位置しない。理論によって制約されるのを望むものではないが、いくつかの実施形態において、レトロトランスポザーゼをコードするＲＮＡが、その翻訳を促進するために主に細胞質に標的化される一方、鋳型ＲＮＡは、ゲノムへのそのレトロトランスポジションを促進するために主に核に標的化される。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡの３’末端、５’末端、又は内部領域にある。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、異種配列の３’であるか（例えば、直接、異種配列の３’である）又は異種配列の５’である（例えば、直接、異種配列の５’である）。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、５’ＵＴＲの外側又は鋳型ＲＮＡの３’ＵＴＲの外側に配置される。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの間に配置され、ここで、任意選択で、核局在化シグナルは、導入遺伝子により転写されない（例えば、核局在化シグナルは、アンチセンス配向であるか、又は転写終結シグナル若しくはポリアデニル化シグナルの下流にある）。いくつかの実施形態において、核局在化配列は、イントロンの内部に位置する。いくつかの実施形態において、複数の同じか又は異なる核局在化シグナルが、ＲＮＡ中、例えば、鋳型ＲＮＡ中にある。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ｂｐ未満の長さである。様々なＲＮＡ核局在化配列が使用され得る。例えば、Ｌｕｂｅｌｓｋｙ ａｎｄ Ｕｌｉｔｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ ５５５（１０７－１１１），２０１８には、核内へのＲＮＡ局在化を駆動するＲＮＡ配列が記載されている。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、ＳＩＮＥ駆動核ＲＮＡ局在化（ＳＩＲＬＯＩＮ）シグナルである。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、核富化タンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、ＨＮＲＮＰＫタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、ピリミジンに富み、例えば、Ｃ／Ｔリッチ、Ｃ／Ｕリッチ、Ｃリッチ、Ｔリッチ、又はＵリッチ領域である。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、長鎖非コードＲＮＡに由来する。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、ＭＡＬＡＴ１長鎖非コードＲＮＡに由来し、又はＭＡＬＡＴ１の６００ヌクレオチドＭ領域である（Ｍｉｙａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ １８，（７３８－７５１），２０１２に記載される）。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、ＢＯＲＧ長鎖非コードＲＮＡに由来し、又はＡＧＣＣＣモチーフである（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４，２３１８－２３２９（２０１４）に記載される。いくつかの実施形態において、核局在化配列は、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｅ９８４５２（２０１８）に記載される。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、ＬＴＲレトロトランスポゾン、レトロウイルス、又は内在性レトロウイルスに由来する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、１つ以上（例えば、２、３、４、５つ）の核標的化配列、例えば、上述されるような、例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳである。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、細胞核内への、ＮＬＳを含むタンパク質の組み込みを促進する。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、本明細書に記載されるＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、ＣａｓドメインのＮ末端又はＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、ＮＬＳとＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの隣接ドメインとの間に配置される。
いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号１５８５）、ＰＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５８６）、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＷＫＲＰＲＫＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５８７）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５８８）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号１５８９）、又はＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号１５９０）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１５９１）、又は機能的フラグメント若しくは変異体を含む。例示的なＮＬＳ配列はまた、ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０号明細書に記載され、その内容が、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、表３９に開示されるアミノ酸配列を含む。この表のＮＬＳは、核への細胞内局在化を改善するために、ポリペプチド中の１つ以上の位置におけるポリペプチド中の１つ以上のコピー、例えば、Ｎ末端ドメイン中、ペプチドドメイン内、ペプチドドメイン間、Ｃ末端ドメイン中、又は位置の組合せでのＮＬＳの１、２、３又はそれ以上のコピーとともに用いられ得る。複数の独自の配列が、単一のポリペプチド内で使用され得る。配列は、例えば、塩基性アミノ酸の１つ若しくは２つの伸長を有する、天然に単節型若しくは双節型であり得、又はキメラ双節型配列として使用され得る。配列参照番号は、細胞内局在化予測アルゴリズム（全体が参照により本明細書に援用されるＬｉｎ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ １３：１５７（２０１２））を用いて取り出される配列のＳｅｑＮＬＳとして示される場合を除いて、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号に対応する。
いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳである。双節型ＮＬＳは、典型的に、スペーサー配列（例えば、約１０アミノ酸長であり得る）によって隔てられる２つの塩基性アミノ酸クラスターを含む。単節型ＮＬＳは、典型的に、スペーサーを欠く。双節型ＮＬＳの例は、配列ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号１５９１）を有する核質ＮＬＳであり、ここで、スペーサーは、括弧内である。別の例示的な双節型ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５９３）を有する。例示的なＮＬＳは、核局在化配列の関する開示を含め、全体が参照により本明細書に援用される国際出願国際公開第２０２００５１５６１号パンフレットに記載される。
特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムポリペプチドは、細胞内局在化配列、例えば、核局在化配列及び／又は核小体局在化配列をさらに含む。核局在化配列及び／又は核小体局在化配列は、核及び／又は核小体内へのタンパク質の組み込みを促進するアミノ酸配列であり得、ここで、それは、ゲノムへの異種配列の統合を促進し得る。特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ遺伝子エディターシステムポリペプチド（例えば、レトロトランスポザーゼ、例えば、本明細書における表１、２、又は３のいずれかに記載のポリペプチド）は、核小体局在化配列をさらに含む。特定の実施形態において、レトロトランスポザーゼポリペプチドは、第１のＲＮＡ上にコードされ、鋳型ＲＮＡは、第２の別個のＲＮＡであり、核小体局在化シグナルは、レトロトランスポザーゼポリペプチドをコードするＲＮＡ上にコードされ、鋳型ＲＮＡ上にコードされない。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又は内部領域に位置する。いくつかの実施形態において、複数の同じか又は異なる核小体局在化シグナルが使用される。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、５、１０、２５、５０、７５、又は１００アミノ酸長未満である。様々なポリペプチド核小体局在化シグナルが使用され得る。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２，３３（２０１５）には、核小体局在化シグナルとしても機能する核局在化シグナルが記載される。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルはまた、核局在化シグナルであり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、核局在化シグナルと重複し得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、塩基性残基の伸長を含み得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、アルギニン及びリジン残基が豊富であり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、核小体に富むタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、リボソームＲＮＡ遺伝子座で豊富なタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、ｒＲＮＡに結合するタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、ＭＳＰ５８に由来し得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、単節型モチーフであり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、双節型モチーフであり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、複数の単節型又は双節型モチーフからなり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、単節型及び双節型モチーフの混合物からなり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、二重の双節型モチーフであり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化モチーフは、ＫＲＡＳＳＱＡＬＧＴＩＰＫＲＲＳＳＳＲＦＩＫＲＫＫ（配列番号１５３０）であり得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、核因子κＢ誘導キナーゼに由来し得る。いくつかの実施形態において、核小体局在化シグナルは、ＲＫＫＲＫＫＫモチーフ（配列番号１５３１）であり得る（Ｂｉｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１７（３６１５－３６２４），２００４に記載される）。
内因性核小体局在化シグナルが、ｒＤＮＡ、例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８、Ｒ９を天然に標的とするレトロトランスポゾンに由来するポリペプチドのために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを核小体に駆動するのを助け得るため、ｒＤＮＡの外部の部位に再標的化する場合、このシグナルを不活性化することが有益であり得る。内因性核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）は、核小体に局在する有効なタンパク質に向けられた公開されたアルゴリズムを用いて、計算的に予測され得る（Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（２１），７３８８－７３９９（２０１０））。予測されるＮｏＬＳ配列は、両方のアミノ酸配列、アミノ酸配列コンテキスト、及びレトロトランスポザーゼの予測される二次構造に基づいている。同定された配列は、典型的に、塩基性アミノ酸が豊富であり（Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（２１），７３８８－７３９９（２０１０））、これらの残基を、単純な側鎖、非塩基性アミノ酸に突然変異するか、又はそれらをポリペプチド鎖から除去することは、核小体への局在化を防止し得る（Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２（１），１－１５．（２０１５）、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｕｓ，６（４），３１４－３２５（２０１５））。いくつかの実施形態において、ＮｏＬＳ配列は、逆転写酵素ドメインと制限様エンドヌクレアーゼドメインとの間にあるレトロトランスポザーゼのアミノ酸領域に位置する。いくつかの実施形態において、予測されるＮｏＬＳ領域は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及び／又はグルタミンアミノ酸を含有し、核小体局在化が、これらの残基の１つ以上の、アラニンへの突然変異及び／又はポリペプチドからの除去によって不活性化される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡ、又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、マイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムの標的細胞特異性を増加させるのに使用される。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位は、非標的細胞型で存在するが、標的細胞型で存在しない（又は非標的細胞と比べて低下したレベルで存在する）ｍｉＲＮＡによって認識されるということに基づいて選択され得る。したがって、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡが、非標的細胞中に存在するとき、それは、ｍｉＲＮＡによって結合され得、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡが、標的細胞中に存在するとき、それは、ｍｉＲＮＡによって結合されないであろう（又は結合されるが、非標的細胞と比べて低下したレベルで結合される）。理論によって制約されるのを望むものではないが、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡへのｍｉＲＮＡの結合は、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを分解することによって、又は翻訳を妨げることによって、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドの生成を減少させ得る。したがって、異種対象配列は、非標的細胞のゲノム中より効率的に標的細胞のゲノム中に挿入されるであろう。ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡ中にマイクロＲＮＡ結合部位を有するシステム（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ中でコードされる）はまた、例えば、「Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムの鋳型ＲＮＡ成分」という表題の節において本明細書に記載されるような、第２のマイクロＲＮＡ結合部位によって調節される鋳型ＲＮＡと組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態において、例えば、肝臓適応症について、ｍｉＲＮＡが、参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＤＮＡは、プロモーター配列、例えば、組織特異的プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの標的細胞特異性を増加させるのに使用される。例えば、プロモーターは、標的細胞型で活性であるが、非標的細胞型で活性でない（又はより低いレベルで活性である）ということに基づいて選択され得る。ポリペプチドのＤＮＡ中に組織特異的プロモーター配列を有するシステムがまた、例えば、本明細書に記載されるような、例えば、鋳型ＲＮＡ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）タンパク質をコードする核酸中で、マイクロＲＮＡ結合部位と組み合わせて使用され得る。Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＤＮＡ中に組織特異的プロモーター配列を有するシステムがまた、例えば、非標的細胞中より標的細胞中のＲＮＡ鋳型のより高いレベルを達成するために、組織特異的プロモーターによって駆動されるＲＮＡ鋳型をコードするＤＮＡと組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態において、例えば、肝臓適応症について、組織特異的プロモーターが、参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３から選択される。
当業者は、表１～３に示される受託番号に基づいて、例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）又は保存ドメイン解析のためのＣＤ－Ｓｅａｒｃｈのような日常的な配列解析ツールを使用することによって、核酸並びに各レトロトランスポゾン及びそのドメインの対応するポリペプチド配列を決定し得る。他の配列解析ツールが公知であり、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ－ｔｏｏｌｓ．ｃａ、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ－ｔｏｏｌｓ．ｃａ／Ｍｏｔｉｆｓ．ｈｔｍに見出され得る。配列番号１～１１２は、表１中の各行と一致し、配列番号１１３～１０１５は、表２中の最初の９０３行と一致する。
本明細書における表１～３は、レトロトランスポザーゼが、鋳型ＲＮＡ、及び完全トランスポゾン核酸配列に結合するのを可能にするために、レトロトランスポザーゼのアミノ酸配列、並びに５’及び３’非翻訳領域の配列を含む例示的なトランスポゾンの配列を示す。いくつかの実施形態において、表１～３のいずれかの５’ＵＴＲが、レトロトランスポザーゼが鋳型ＲＮＡに結合するのを可能にする。いくつかの実施形態において、表１～３のいずれかの３’ＵＴＲが、レトロトランスポザーゼが、鋳型ＲＮＡに結合するのを可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかに使用するためのポリペプチドが、本明細書における表１～３のいずれかのポリペプチド、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列であり得る。いくつかの実施形態において、システムは、例えば、同じ表の同じ行に示されるように、上記の文において言及されるポリペプチドと同じトランスポゾンに由来する、本明細書における表１～３のいずれかの５’又は３’非翻訳領域の１つ又は両方（又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列）をさらに含む。いくつかの実施形態において、システムは、本明細書における表１～３のいずれかの５’又は３’非翻訳領域の１つ又は両方、例えば、レトロトランスポザーゼ、及び／又は予測される５’ＵＴＲ若しくは予測される３’ＵＴＲという表題の列に示される部分配列に結合することが可能であるＲＮＡをコードする完全トランスポゾン配列のセグメントを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかに使用するためのポリペプチドは、複数のレトロトランスポゾンの整列されたポリペプチド配列に基づく分子再構成又は祖先再構成であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかに使用するための５’又は３’非翻訳領域は、複数のレトロトランスポゾンの整列された５’又は３’非翻訳領域に基づく分子再構成であり得る。当業者は、本明細書に示される受託番号に基づいて、例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）又は保存ドメイン解析のためのＣＤ－Ｓｅａｒｃｈのような日常的な配列解析ツールを使用することによって、ポリペプチド又は核酸配列を整列し得る。分子再構成は、例えば、Ｉｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９７，５０１－５１０；Ｗａｇｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０１３，８８－９９に記載される手法を用いて、配列コンセンサスに基づいて作成され得る。いくつかの実施形態において、５’又は３’非翻訳領域又はポリペプチドが由来するレトロトランスポゾンは、Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０００，９１５－９２８に記載されるものなどの系統発生的方法によって評価される際、若いか又は最近活性な可動要素である。
表３（下記）は、データマイニングを用いて同定された、様々なレトロトランスポザーゼからの例示的なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質及び関連配列を示す。列１は、レトロトランスポゾンが属するファミリーを示す。列２は、エレメント名を列挙する。列３は、もしあれば、受託番号を示す。列４は、レトロトランスポザーゼが形成される生物を列挙する。列５は、レトロトランスポゾンのＤＮＡ配列を列挙する。列６は、予測される５’非翻訳領域を列挙し、列７は、予測される３’非翻訳領域を列挙し；両方とも、鋳型ＲＮＡが、列８のレトロトランスポザーゼに結合するのを可能にすると予測される列５の配列の一部である。（列５～７が、ＤＮＡ配列を示すこと、列５～７のいずれかで示されるＲＮＡ配列が、典型的に、チミジンよりウラシルを含み得ることが理解される）。列８は、列５のレトロトランスポゾン中でコードされる予測されるレトロトランスポザーゼ配列を列挙する。
例示的なＣｉｓ Ｇｅｎｅ－Ｗｒｉｔｉｎｇ実施形態
一部の実施形態では、ライティングドメイン（例えば、ＲＴドメイン）は、例えば、ＲＮＡ配列に特異的に結合するＲＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ライティングドメインのＲＮＡ結合ドメインによって特異的に結合されるＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、ライティングドメイン（例えば、ＲＴドメイン）は、例えば、ＲＮＡ配列に特異的に結合するＲＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ライティングドメインのＲＮＡ結合ドメインによって特異的に結合されるＲＮＡ配列を含む。
鋳型核酸結合ドメイン：
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、典型的に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）と会合することが可能な領域を有する。一部の実施形態では、鋳型核酸結合ドメインは、ＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、特定のシグネチャー、例えば構造モチーフ、例えば非ＬＴＲレトロトランスポゾンにおける３’ＵＴＲに存在する二次構造を含むＲＮＡ分子と会合し得るモジュラードメインである。他の実施形態では、鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）は、逆転写ドメイン内に含まれ、例えば、逆転写酵素由来の成分は、ＲＮＡの優先性についての既知のシグネチャー、例えば、非ＬＴＲレトロトランスポゾンにおける３’ＵＴＲに存在する二次構造を有する。他の実施形態では、鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）は、ＤＮＡ結合ドメイン内に含まれる。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｇＲＮＡを含む鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の構造を認識するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の結合に関与するスキャフォールド配列と、ゲノム標的に対するユーザ定義の約２０ヌクレオチドの標的配列とからなる短い合成ＲＮＡである。完全ｇＲＮＡの構造は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，Ｐ９３５－９４９（２０１４）に記載された。ｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡとも称される）は、人工的テトラループで接続されたｃｒＲＮＡ由来及びｔｒａｃｒＲＮＡ由来の配列からなる。ｃｒＲＮＡ配列は、ガイド（２０ｎｔ）及びリピート（１２ｎｔ）領域に分割され得る一方で、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、アンチリピート（１４ｎｔ）及び３つのｔｒａｃｒＲＮＡステムループに分割され得る（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，Ｐ９３５－９４９（２０１４））。実際、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７～２４の間のヌクレオチド（例えば、１９、２０、若しくは２１ヌクレオチド）の長さを有し、且つ標的核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡのジェネレーター及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計における使用のため、商業的に利用可能である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、天然ＣＲＩＳＰＲシステムからの２つのＲＮＡ成分、例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。当技術分野で周知のように、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼを編集／結合について標的化された配列に導くため）の両方からの配列を含むキメラの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も含み得る。化学修飾ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質での使用に有効であることも証明されており；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子と会合されるＤＮＡ配列に対して相補的である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインが標的ゲノムＤＮＡ配列に結合することを可能にする、ｇＲＮＡと会合するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を含むＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）内部に含まれることで、ＤＮＡ結合ドメインは、鋳型核酸結合ドメインでもある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、複数のドメイン内にＲＮＡ結合機能を有し、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ＤＮＡ結合ドメイン内のｇＲＮＡ構造及び非ＬＴＲレトロトランスポゾン由来の逆転写ドメイン内の３’ＵＴＲ構造に結合し得る。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、典型的に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）と会合することが可能な領域を有する。一部の実施形態では、鋳型核酸結合ドメインは、ＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、特定のシグネチャー、例えば構造モチーフ、例えば非ＬＴＲレトロトランスポゾンにおける３’ＵＴＲに存在する二次構造を含むＲＮＡ分子と会合し得るモジュラードメインである。他の実施形態では、鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）は、逆転写ドメイン内に含まれ、例えば、逆転写酵素由来の成分は、ＲＮＡの優先性についての既知のシグネチャー、例えば、非ＬＴＲレトロトランスポゾンにおける３’ＵＴＲに存在する二次構造を有する。他の実施形態では、鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）は、ＤＮＡ結合ドメイン内に含まれる。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｇＲＮＡを含む鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の構造を認識するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の結合に関与するスキャフォールド配列と、ゲノム標的に対するユーザ定義の約２０ヌクレオチドの標的配列とからなる短い合成ＲＮＡである。完全ｇＲＮＡの構造は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，Ｐ９３５－９４９（２０１４）に記載された。ｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡとも称される）は、人工的テトラループで接続されたｃｒＲＮＡ由来及びｔｒａｃｒＲＮＡ由来の配列からなる。ｃｒＲＮＡ配列は、ガイド（２０ｎｔ）及びリピート（１２ｎｔ）領域に分割され得る一方で、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、アンチリピート（１４ｎｔ）及び３つのｔｒａｃｒＲＮＡステムループに分割され得る（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，Ｐ９３５－９４９（２０１４））。実際、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７～２４の間のヌクレオチド（例えば、１９、２０、若しくは２１ヌクレオチド）の長さを有し、且つ標的核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡのジェネレーター及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計における使用のため、商業的に利用可能である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、天然ＣＲＩＳＰＲシステムからの２つのＲＮＡ成分、例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。当技術分野で周知のように、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼを編集／結合について標的化された配列に導くため）の両方からの配列を含むキメラの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も含み得る。化学修飾ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質での使用に有効であることも証明されており；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子と会合されるＤＮＡ配列に対して相補的である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインが標的ゲノムＤＮＡ配列に結合することを可能にする、ｇＲＮＡと会合するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を含むＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）内部に含まれることで、ＤＮＡ結合ドメインは、鋳型核酸結合ドメインでもある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、複数のドメイン内にＲＮＡ結合機能を有し、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ＤＮＡ結合ドメイン内のｇＲＮＡ構造及び非ＬＴＲレトロトランスポゾン由来の逆転写ドメイン内の３’ＵＴＲ構造に結合し得る。
エンドヌクレアーゼドメイン：
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、エンドヌクレアーゼドメインを介したＤＮＡ標的部位切断の機能を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインでもある。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）結合ドメインでもある。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡに結合し、標的ＤＮＡ配列（例えば、ｇＲＮＡの一部に対する相補性を有する）に結合し、且つ標的ＤＮＡ配列を切断する、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインを含む。特定の実施形態では、ＡＰＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインは、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおいて、使用され得るか又は（例えば、１つ若しくは複数の残基の挿入、欠失、又は置換によって）修飾され得る。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメインは、例えばヒト細胞について改善された、改変されたコドン使用を有するように、その天然配列から改変される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼエレメントは、異種エンドヌクレアーゼエレメント、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ、ＩＩ型制限ｌ様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ型ヌクレアーゼ）、又は別のＲＬＥ型エンドヌクレアーゼ（ＲＥＬとしても知られる）である。一部の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼ活性を有し、二本鎖切断を形成しない。本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列が表１、２又は３に参照される、レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であってもよい。当技術分野における常用の技能を有する者は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）などのツールを使用し、他の既知のエンドヌクレアーゼドメインに対する相同性に基づいて、エンドヌクレアーゼドメインを同定することができる。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、Ｆｏｋ１又はその機能性断片である。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ホリデイジャンクションリゾルバーゼ又はその相同体、例えば、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）からのホリデイジャンクション切断酵素（Ｓｓｏｌ Ｈｊｅ）である（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：７，２０１６）。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、Ｐｒｐ８などのスプライセオソームタンパク質の大きい断片のエンドヌクレアーゼである（Ｍａｈｂｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ８：１６，２０１７）。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、Ｃａｓ９に由来する。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ｓｓＤＮＡ切断活性のみ、例として、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである、ニッカーゼ活性のみを有するように改変される。例えば、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンからの逆転写酵素ドメイン及びＦｏｋ１又はその機能性断片を含むエンドヌクレアーゼドメインを含んでもよい。更に他の実施形態では、相同性エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、部位特異的突然変異によって修飾され、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が改変される。更に他の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、任意の潜在ＤＮＡの配列特異性を除去するように修飾される。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、エンドヌクレアーゼドメインを介したＤＮＡ標的部位切断の機能を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインでもある。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）結合ドメインでもある。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡに結合し、標的ＤＮＡ配列（例えば、ｇＲＮＡの一部に対する相補性を有する）に結合し、且つ標的ＤＮＡ配列を切断する、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインを含む。特定の実施形態では、ＡＰＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインは、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおいて、使用され得るか又は（例えば、１つ若しくは複数の残基の挿入、欠失、又は置換によって）修飾され得る。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメインは、例えばヒト細胞について改善された、改変されたコドン使用を有するように、その天然配列から改変される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼエレメントは、異種エンドヌクレアーゼエレメント、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ、ＩＩ型制限ｌ様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ型ヌクレアーゼ）、又は別のＲＬＥ型エンドヌクレアーゼ（ＲＥＬとしても知られる）である。一部の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼ活性を有し、二本鎖切断を形成しない。本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列が表１、２又は３に参照される、レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であってもよい。当技術分野における常用の技能を有する者は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）などのツールを使用し、他の既知のエンドヌクレアーゼドメインに対する相同性に基づいて、エンドヌクレアーゼドメインを同定することができる。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、Ｆｏｋ１又はその機能性断片である。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ホリデイジャンクションリゾルバーゼ又はその相同体、例えば、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）からのホリデイジャンクション切断酵素（Ｓｓｏｌ Ｈｊｅ）である（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：７，２０１６）。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、Ｐｒｐ８などのスプライセオソームタンパク質の大きい断片のエンドヌクレアーゼである（Ｍａｈｂｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ８：１６，２０１７）。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、Ｃａｓ９に由来する。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ｓｓＤＮＡ切断活性のみ、例として、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである、ニッカーゼ活性のみを有するように改変される。例えば、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンからの逆転写酵素ドメイン及びＦｏｋ１又はその機能性断片を含むエンドヌクレアーゼドメインを含んでもよい。更に他の実施形態では、相同性エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、部位特異的突然変異によって修飾され、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が改変される。更に他の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、任意の潜在ＤＮＡの配列特異性を除去するように修飾される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ニッカーゼ活性を有し、二本鎖切断を形成しない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、二本鎖切断より高い頻度で一本鎖切断を形成し、例えば、切断の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％は、一本鎖切断であり、又は切断の１０％、５％、４％、３％、２％、若しくは１％未満は、二本鎖切断である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖切断を実質的に形成しない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、検出可能なレベルの二本鎖切断を形成しない。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、編集対象鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れるニッカーゼ活性を有し；例えば、一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ライティングドメインによって伸長されることになる鎖上の改変部位近傍の標的部位のゲノムＤＮＡを切断する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、編集対象鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れ、非編集鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れないニッカーゼ活性を有する。例えば、ポリペプチドが、ニッカーゼ活性を有し、且つ二本鎖切断を形成しないＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインを含むとき、一部の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインは、ＰＡＭ部位を含む標的部位ＤＮＡ鎖に切れ目を入れる（例えば、そしてＰＡＭ部位を含まない標的部位ＤＮＡ鎖に切れ目を入れない）。
いくつかの他の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、編集対象鎖及び非編集鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れるニッカーゼ活性を有する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、本明細書に記載のポリペプチドのライティングドメイン（例えば、ＲＴドメイン）が鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の異種目的配列から重合（例えば、逆転写）後、細胞ＤＮＡ修復機構は、編集対象のＤＮＡ鎖上のニックを修復しなければならない。標的部位ＤＮＡはここで、編集対象のＤＮＡ鎖に対して２つの異なる配列を含み：１番目は元のゲノムＤＮＡに対応し、２番目は異種目的配列から重合されたものに対応する。２つの異なる配列が互いに平衡化し、まず一方、次いで他方が非編集鎖とハイブリダイズすると考えられ、ここで細胞ＤＮＡ修復装置のその修復標的部位への組み込みはランダムであると考えられる。特定の理論に束縛されることは意図しないが、更なるニックの非編集鎖への導入が、異種目的配列に基づく配列を元のゲノム配列よりも頻繁に用いるように、細胞ＤＮＡ修復機構をバイアスし得ると考えられる。一部の実施形態では、更なるニックは、標的部位修飾（例えば、挿入、欠失、又は置換）の５’若しくは３’、又は編集対象鎖上のニックに対して、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５若しくは１５０ヌクレオチドに位置づけられる。
代替的に又は追加的に、特定の理論に束縛されることは意図しないが、非編集鎖に対する更なるニックが第２鎖合成を促進し得ると考えられる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒが編集鎖の一部を挿入又は置換している場合、非編集鎖における挿入／置換に対応する新しい配列の合成が必要である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性を有する単一ドメイン（例えば、単一エンドヌクレアーゼドメイン）を含み、前記ドメインは、編集対象鎖及び非編集鎖の両方に切れ目を入れる。例えば、こうした実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインであり得、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、編集対象鎖のニッキングを導くｇＲＮＡ及び非編集鎖のニッキングを導く更なるｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性を有する複数のドメインを含み、第１のエンドヌクレアーゼドメインは、編集対象鎖に切れ目を入れ、且つ第２のエンドヌクレアーゼドメインは、非編集鎖に切れ目を入れる（任意選択で、第１のエンドヌクレアーゼドメインは、非編集鎖に切れ目を入れず（例えば、それができず）、且つ第２のエンドヌクレアーゼドメインは、編集対象鎖に切れ目を入れない（例えば、それができない））。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１鎖及び第２鎖に切れ目を入れることができる。一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖ニックは、標的部位における同じ位置で起こるが、逆鎖上では起きない。一部の実施形態では、第２鎖ニックは、例えば、第１ニックから上流又は下流の、ねじれた位置で起こる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第２鎖ニックが第１鎖ニックの上流にある場合、標的部位の欠失を生成する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第２鎖ニックが第１鎖ニックの下流にある場合、標的部位の重複を生成する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１及び第２鎖ニックが（例えば、Ｇｌａｄｙｓｈｅｖ ａｎｄ Ａｒｋｈｉｐｏｖａ Ｇｅｎｅ ２００９に記載のとおり；その全体は参照により本明細書に組み込まれる）標的部位の同じ位置で起こる場合、重複及び／又は欠失を生成しない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００６に記載のとおり；その全体は参照により本明細書に組み込まれる）第１鎖又は第２鎖のニッキングを促進する、タンパク質立体構造又はＲＮＡ結合状態に応じた、改変された活性を有する。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えばファミリー名に示されるとおり、例えば、保存されたアミノ酸モチーフを有する、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１５９４）、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘ、又はＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫファミリーからのメガヌクレアーゼ、又はその機能性断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、Ｉ－ＳｍａＭＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｆ７ＷＤ４２）、Ｉ－ＳｃｅＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３８８２）、Ｉ－ＡｎｉＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３８８０）、Ｉ－ＤｍｏＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２１５０５）、Ｉ－ＣｒｅＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０５７２５）、Ｉ－ＴｅｖＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１３２９９）、Ｉ－ＯｎｕＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ４ＶＷＷ５）、又はＩ－ＢｍｏＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＡＮＲ６）から選択されるメガヌクレアーゼ、又はその断片を含む。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、天然には、その機能的形態において、単量体、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、又は二量体、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩである。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１５９４）モチーフの単一コピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１５９４）メガヌクレアーゼは、一般にホモ二量体を形成する一方で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１５９４）モチーフの２つのコピーを有するメンバーは、一般に単量体として見出される。一部の実施形態では、通常は二量体として形成するメガヌクレアーゼは、融合体として発現され、例えば、２つのサブユニットは、単一のＯＲＦとして、任意選択で、リンカーによって連結された、例えばＩ－ＣｒｅＩ二量体融合体として発現される（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｆｏｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０２０；その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片は、二本鎖ＤＮＡ分子、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ（Ｋ１２２Ｉ及び／又はＫ２２３Ｉ）（Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００８）、Ｉ－ＡｎｉＩ（Ｋ２２７Ｍ）（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００９）、Ｉ－ＤｍｏＩ（Ｑ４２Ａ及び／又はＫ１２０Ｍ）（Ｍｏｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１５）の一方の鎖においてニッカーゼ活性を優先するように改変される。一部の実施形態では、一本鎖切断についてのこの優先性を有するメガヌクレアーゼ又はその機能性断片は、例えばニッカーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインとして使用される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、安全な港湾部位、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩを標的にするＳＨ６部位を天然に標的にする、又は標的にするように改変された、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片を含む（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｆｏｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、上記）。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、配列耐性触媒ドメインを有する、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片、例えば、最小モチーフＣＮＮＮＧを認識するＩ－ＴｅｖＩを含む（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１２）。一部の実施形態では、標的配列耐性触媒ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに融合され、例として、例えば、Ｉ－ＴｅｖＩを、（ｉ）Ｔｅｖ－ＺＦＥを作出するためのＺｎフィンガー（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１２）、（ｉｉ）ＭｅｇａＴｅｖを作出するための他のメガヌクレアーゼ（Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１４）、及び／又は（ｉｉｉ）ＴｅｖＣａｓ９を作出するためのＣａｓ９（Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１６）に融合させることによって活性を誘導する。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、制限酵素、例えば、タイプＩＩＳ又はタイプＩＩＰ制限酵素を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、タイプＩＩＳ制限酵素、例えば、ＦｏｋＩ又はその断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、タイプＩＩＰ制限酵素、例えば、ＰｖｕＩＩ又はその断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、二量体制限酵素は、それが一本鎖として機能するように、融合体、例えば、ＦｏｋＩ二量体融合体として発現される（Ｍｉｎｃｚｕｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６（１２）：３９２６－３９３８（２００８））。
更なるエンドヌクレアーゼドメインの使用は、例えば、Ｇｕｈａ ａｎｄ Ｅｄｇｅｌｌ Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １８（２２）：２５６５（２０１７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載されるような）は、Ｃａｓタンパク質、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）又は機能的フラグメント若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、修飾ＳｐＣａｓ９を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を改変する修飾を含む。複数の実施形態では、ＰＡＭは、核酸配列５’－ＮＧＴ－３’に対する特異性を有する。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、例えば、以下：Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、又はＲ１３３５の１つ若しくは複数の位置に、１つ若しくは複数のアミノ酸置換を含み、それは、例えば、以下：Ｌ１１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｖから選択される。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、アミノ酸置換Ｔ１３３７Ｒと、以下：Ｌ１１１１、Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｔ１３３７、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｑ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ、及びＴ１３３７Ｍ、又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、以下：（ｉ）以下：Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７から選択される１つ若しくは複数のアミノ酸置換；並びに（ｉｉ）以下：Ｌ１１１１Ｒ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｒ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ、及びＴ１３３７Ｍ、又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、表４０に列記されるようなＣａｓタンパク質を含んでもよい。表４０に示されるようなＣａｓタンパク質におけるニッカーゼ活性を設けるための予測又は検証されたニッカーゼ突然変異は、ＳｐＣａｓ９（Ｎ８６３Ａ）突然変異のシグネチャーに基づく。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、表３のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質及び表４０ＡのＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、表３のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質は、表４０ＡのＣａｓタンパク質に融合される。
表４０Ｂは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇのために表３Ａに列挙されるＣａｓ変異体を適用するように、ｇＲＮＡ及び／又は鋳型ＲＮＡを設計するための必要な構成要素を規定するパラメータを提供する。層は、それらが所与の遺伝子座において使用するために利用可能である場合、好ましいＣａｓ変異体を示す。切断部位は、有効な又は予測されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）要件、切断部位の有効な又は予測される位置（ＰＡＭ部位の最も上流の塩基に比べて）を示す。所与の酵素のためのｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡ、Ｔｅｔｒａｌｏｏｐ、及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結させ、標的部位においてプロトスペーサーに一致するスペーサー（ｍｉｎ）及びスペーサー（ｍａｘ）内の長さの５’スペーサーをさらに付加することによって組み合わされ得る。さらに、標的におけるｓｓＤＮＡニックの予測される位置は、標的プライム逆転写を開始させるために、ニックの直ぐ５’側の配列にアニールする必要がある鋳型ＲＮＡの３’領域を設計するのに重要である。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載されるような）は、Ｃａｓドメイン、例えば、Ｃａｓ９ドメインを含む。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓドメイン、Ｃａｓニッカーゼ（ｎＣａｓ）ドメイン、又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ（ｄＣａｓ）を含む。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９ドメイン、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン、又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ）を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９のＣａｓ９ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）若しくはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５，７２６－７３７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｃａｓ９配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ、例えば、本明細書に記載されるように、Ｃａｓ９、又はその変異体のＨＮＨヌクレアーゼサブドメイン及び／又はＲｕｖＣ１サブドメインを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓポリペプチド（例えば、酵素）、又はその機能性断片を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓポリペプチド（例えば酵素）は、以下：Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（例えば、Ｃｓｎ１若しくはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、超精密（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９変異体（ＨｙｐａＣａｓ９）、それらの相同体、それらの修飾若しくは操作バージョン、及び／又はそれらの機能性断片から選択される。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、例えば、以下：Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、及びＤ１１２７Ａから選択される１つ又は複数の置換を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、以下：Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／又はＡ９８７から選択される位置に１つ若しくは複数の突然変異、例えば、以下：Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／又はＤ９８６Ａから選択される１つ若しくは複数の置換を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、以下：コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）、ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）、サイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）、スタフィロコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、若しくは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、又はその機能性断片若しくは変異体に由来するＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）配列を含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載されるような）は、例えば、位置：Ｄ９１７、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５又はそれらの任意の組合せに、例えば、以下：Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、及びＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａから選択される、１つ若しくは複数の置換を含む、Ｃｐｆ１ドメインを含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載されるような）は、ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ（配列番号１６９６）、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ（配列番号１６９７）、ｘＣａｓ９（ｓｐ）、ｓａＣａｓ９、ｓａＣａｓ９－ＫＫＨ、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ（配列番号１６９８）、ｓｐＣａｓ９－ＬＲＫＩＱＫ（配列番号１６９９）、又はｓｐＣａｓ９－ＬＲＶＳＱＬ（配列番号１７００）を含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載されるような）は、以下の表３７に列挙されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０以下の相違（例えば、突然変異）を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａを含むエンドヌクレアーゼドメインを有する。複数の実施形態では、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａは、以下のアミノ酸配列を有する。
Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）：
Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）：
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドは、レトロウイルス逆転写酵素からのＲＴドメイン、例として、例えば、以下の配列を含む野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴを含む。
Ｍ－ＭＬＶ（ＷＴ）：
Ｍ－ＭＬＶ（ＷＴ）：
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドは、レトロウイルス逆転写酵素からのＲＴドメイン、例として、例えば以下の配列を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドは、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸６５９～１３２９の配列を含むレトロウイルス逆転写酵素からのＲＴドメインを含む。複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドは、例えば、以下に示される、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸６５９～１３２９の配列のＮ末端に、１つの更なるアミノ酸を更に含む。
コアＲＴ（太字）、上記の注釈
リボヌクレアーゼＨ（下線部）、上記の注釈
リボヌクレアーゼＨ（下線部）、上記の注釈
複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドは、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸６５９～１３２９の配列のＣ末端に１つの更なるアミノ酸を更に含む。複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドは、リボヌクレアーゼＨ１ドメイン（例えば、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸１１７８～１３１８）を含む。
一部の実施形態では、レトロウイルス逆転写酵素ドメイン、例えばＭ－ＭＬＶ ＲＴは、ＲＴの特徴、例えば、熱安定性、処理能力、及び／又は鋳型結合を改善し得る、野生型配列からの１つ又は複数の突然変異を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、上のＭ－ＭＬＶ（ＷＴ）配列に対して、例えば、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、Ｒ１１０Ｓ、Ｋ１０３Ｌから選択される１つ又は複数の突然変異、例えば、任意選択でＴ３０６Ｋ及びＷ３１３Ｆを更に含む、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、及びＴ３３０Ｐなどの突然変異の組合せを含む。一部の実施形態では、本明細書で用いられるＭ－ＭＬＶ ＲＴは、突然変異Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ及びＷ３１３Ｆを含む。複数の実施形態では、変異体Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、以下のアミノ酸配列を含む。
Ｍ－ＭＬＶ（ＰＥ２）：
Ｍ－ＭＬＶ（ＰＥ２）：
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、エンドヌクレアーゼとＲＴドメインの間のフレキシブルリンカー、例えば、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号１６０１）を含むリンカーを含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドのＲＴドメインは、エンドヌクレアーゼドメインに対するＣ末端に位置してもよい。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドのＲＴドメインは、エンドヌクレアーゼドメインに対するＮ末端に位置してもよい。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、Ｄ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａ突然変異を含むｄＣａｓ９配列、例えば以下の配列を含む。
一部の実施形態では、システムにおける使用のための鋳型ＲＮＡ分子は、５’から３’にかけて、（１）ｇＲＮＡスペーサー；（２）ｇＲＮＡスキャフォールド；（３）異種目的配列 （４）３’相同性ドメインを含む。一部の実施形態において：
（１）約１８～２２ｎｔのＣａｓ９スペーサーであり、例えば、２０ｎｔである
（２）鋳型をニッカーゼＣａｓ９ドメインと会合させるための１つ又は複数のヘアピンループ、例えば、１、２、又は３つのループを含むｇＲＮＡスキャフォールドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドは、５’から３’にかけて、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣ（配列番号１６０３）の配列を有する。
（３）一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが、例えば、７～７４ｎｔ、例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～６０ｎｔ、６０～７０ｎｔ、又は７０～８０ｎｔ若しくは８０～９０ｎｔである。一部の実施形態では、配列の最初（ほぼ５’）の塩基は、Ｃでない
（４）一部の実施形態では、ニッキングが起きた後、標的プライミング配列に結合する３’相同性ドメインは、例えば、３～２０ｎｔ、例えば、７～１５ｎｔ、例えば、１２～１４ｎｔである。一部の実施形態では、３’相同性ドメインは、４０～６０％のＧＣ含量を有する。
（１）約１８～２２ｎｔのＣａｓ９スペーサーであり、例えば、２０ｎｔである
（２）鋳型をニッカーゼＣａｓ９ドメインと会合させるための１つ又は複数のヘアピンループ、例えば、１、２、又は３つのループを含むｇＲＮＡスキャフォールドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドは、５’から３’にかけて、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣ（配列番号１６０３）の配列を有する。
（３）一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが、例えば、７～７４ｎｔ、例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～６０ｎｔ、６０～７０ｎｔ、又は７０～８０ｎｔ若しくは８０～９０ｎｔである。一部の実施形態では、配列の最初（ほぼ５’）の塩基は、Ｃでない
（４）一部の実施形態では、ニッキングが起きた後、標的プライミング配列に結合する３’相同性ドメインは、例えば、３～２０ｎｔ、例えば、７～１５ｎｔ、例えば、１２～１４ｎｔである。一部の実施形態では、３’相同性ドメインは、４０～６０％のＧＣ含量を有する。
システムと会合される第２のｇＲＮＡは、完全な組み込みの駆動を補助し得る。一部の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、第１鎖ニックから０～２００ｎｔ離れた、例えば、第１鎖ニックから０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～２００ｎｔ離れた位置を標的にし得る。一部の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、編集がなされた後、その標的配列にのみ結合することができ、例えば、ｇＲＮＡは、異種目的配列内に存在するが、初期標的配列内に存在しない配列に結合する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、Ｕ２ＯＳ、又はＨｅＬａ細胞に編集を実施する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、初代細胞、例えば、Ｅ１８．５マウスからの初代皮質ニューロンに編集を実施する。
一部の実施形態では、逆転写酵素又はＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、ＭｏＭＬＶ ＲＴ配列又はその変異体を含む。複数の実施形態では、ＭｏＭＬＶ ＲＴ配列は、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、Ｒ１１０Ｓ、及びＫ１０３Ｌから選択される１つ又は複数の突然変異を含む。複数の実施形態では、ＭｏＭＬＶ ＲＴ配列は、任意選択で、Ｔ３０６Ｋ及び／又はＷ３１３Ｆを更に含む、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、及びＴ３３０Ｐなどの突然変異の組合せを含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、例えばＨ８４０Ａ突然変異を含む、ｎＣＡＳ９を含む。
一部の実施形態では、（例えば、本明細書に記載のシステムの）異種目的配列は、約１～５０、約５０～１００、約１００～２００、約２００～３００、約３００～４００、約４００～５００、約５００～６００、約６００～７００、約７００～８００、約８００～９００、約９００～１０００、又はそれ以上のヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、ＲＴ及びエンドヌクレアーゼドメインは、例えば、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号１６０１）を含む、フレキシブルリンカーによって連結される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＲＴドメインに対するＮ末端である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＲＴドメインに対するＣ末端である。
一部の実施形態では、システムは、例えば、本明細書に記載のように、ＴＰＲＴによって異種目的配列を標的部位に組み込む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステム又は方法は、米国特許出願公開第２０２０００６３１２６号明細書、米国特許出願公開第２０１９０００２８８９号明細書、若しくは米国特許出願公開第２０１９０００２８７５号明細書（それらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡターゲティング酵素若しくはシステム又はその機能性断片若しくは変異体を含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチド又はＣａｓエンドヌクレアーゼは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載のポリペプチド配列を含み、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ又はガイドＲＮＡは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載の核酸配列を含む。
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集システムの鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）成分は、典型的に、システムのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することが可能である３’領域を有する。結合領域、例えば、３’領域は、例えば、システムのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することが可能な少なくとも１、２又は３つのヘアピンループを有する構造化ＲＮＡ領域であり得る。結合領域は、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）を、ポリペプチドモジュールのいずれかと結合させる。いくつかの実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の結合領域は、ポリペプチド中のＲＮＡ結合ドメインと結合し得る。いくつかの実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の結合領域は、ポリペプチドの逆転写ドメイン（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合する）と結合し得る。例えば、逆転写ドメインが、非ＬＴＲレトロトランスポゾンに由来する場合、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、非ＬＴＲレトロトランスポゾン結合領域、例えば、非ＬＴＲレトロトランスポゾンに由来する３’ＵＴＲを含有し得る。いくつかの実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインと結合し得、例えば、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９由来のＤＮＡ結合ドメインと結合する。いくつかの実施形態において、結合領域は、ＤＮＡ標的認識も提供し得、例えば、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ポリペプチドの複数の成分、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及び逆転写ドメインと結合し得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、Ｃａｓ９由来のＤＮＡ結合ドメイン及び非ＬＴＲレトロトランスポゾン由来の逆転写ドメインと結合される非ＬＴＲレトロトランスポゾンに由来する３’ＵＴＲと結合するｇＲＮＡ領域を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステム又は方法は、単一の鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステム又は方法は、複数の鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）を含む。例えば、本明細書に記載されるシステムは、（例えば、５’から３’に）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及び／又はエンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ｇＲＮＡ）に結合する配列及び標的部位（例えば、標的ゲノム中の部位の非編集鎖）に結合する配列を含む第１のＲＮＡ、並びに（例えば、５’から３’に）任意選択で、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドに結合する（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合する）配列、異種対象配列、及び３’ホモロジードメインを含む第２のＲＮＡ（例えば、鋳型ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、システムが、複数の核酸を含むとき、各核酸は、結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインが、例えば、相補配列のハイブリダイゼーションによって、核酸分子の結合を可能にする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される鋳型核酸分子は、５’ホモロジー領域及び／又は３’ホモロジー領域を含む。いくつかの実施形態において、５’ホモロジー領域は、標的核酸分子に含まれる核酸配列との少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態において、標的核酸分子中の核酸配列は、例えば、鋳型核酸分子に含まれる、例えば、異種対象配列について、標的挿入部位（例えば、それに対して５’側）の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド以内である。
いくつかの実施形態において、３’ホモロジー領域は、標的核酸分子に含まれる核酸配列との少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。実施形態において、標的核酸分子中の核酸配列は、例えば、鋳型核酸分子に含まれる、例えば、異種対象配列について、標的挿入部位（例えば、それに対して３’側）の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド以内である。いくつかの実施形態において、５’ホモロジー領域は、鋳型核酸分子の残りの部分に対して異種である。いくつかの実施形態において、３’ホモロジー領域は、鋳型核酸分子の残りの部分に対して異種である。
いくつかの実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、３’標的ホモロジードメインを含む。いくつかの実施形態において、３’標的ホモロジードメインは、異種対象配列の３’側に配置され、本明細書に記載されるシステムによって修飾される部位に隣接する配列に対して相補的であり、又はシステム／Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）によって修飾される部位に隣接する配列に対して相補的な配列に対する１、２、３、４、若しくは５つ以下のミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、３’ホモロジー領域は、標的核酸分子中のニック部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド以内に結合する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子への３’ホモロジー領域の結合が、例えば、ＴＰＲＴのためのプライマーとして作用する３’ホモロジー領域による、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）の開始を可能にする。いくつかの実施形態において、３’標的ホモロジードメインは、標的部位にアニールし、これが、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドによるＴＰＲＴの開始のための結合部位及び３’ヒドロキシルを提供する。いくつかの実施形態において、３’標的ホモロジードメインは、３～５、５～１０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１９、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１０～１２、１０～１１、１１～３０、１１～２５、１１～２０、１１～１９、１１～１８、１１～１７、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１１～１２、１２～３０、１２～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１２～１３、１３～３０、１３～２５、１３～２０、１３～１９、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１３～１４、１４～３０、１４～２５、１４～２０、１４～１９、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１４～１５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１５～１６、１６～３０、１６～２５、１６～２０、１６～１９、１６～１８、１６～１７、１７～３０、１７～２５、１７～２０、１７～１９、１７～１８、１８～３０、１８～２５、１８～２０、１８～１９、１９～３０、１９～２５、１９～２０、２０～３０、２０～２５、又は２５～３０ｎｔの長さ、例えば、１０～１７、１２～１６、又は１２～１４ｎｔの長さである。
いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡは、ｇＲＮＡ（例えば、ｐｅｇＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡは、鋳型核酸のｇＲＮＡ部分と、鋳型核酸結合ドメイン、例えば、ＲＮＡ結合ドメイン（例えば、異種ＲＮＡ結合ドメイン）との相互作用によって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドに結合し得る。いくつかの実施形態において、異種ＲＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９である。
いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、ｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡの領域は、標的ＤＮＡに結合されたｇＲＮＡの巻戻し（ｕｎｄｅｒｗｏｕｎｄ）リボン状構造を採る（例えば、Ｍｕｌｅｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９ Ｓｅｐ ２０１４：Ｖｏｌ．３４５，Ｉｓｓｕｅ ６２０３，ｐｐ．１４７９－１４８４に記載されるように）。理論に制約されるのを望むものではないが、この非標準構造は、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドからの６ヌクレオチドごとの回転によって促進されると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、ｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡの領域は、ある間隔で、例えば、６塩基ごとに、標的部位との増加したミスマッチを許容し得る。いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、標的部位に対する相同性を含むｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡの領域は、一定の間隔で、例えば、６塩基ごとに、標的部位と塩基対合する必要がないゆらぎ位置（ｗｏｂｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を有し得る。
誘導性活性を有するｇＲＮＡ
いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡは、誘導性活性を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。誘導性活性は、（ｇＲＮＡに加えて）ブロッキングドメインをさらに含む鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡによって達成され得、ここで、ブロッキングドメインの一部又は全ての配列が、ｇＲＮＡの一部又は全てに対して少なくとも部分的に相補的である。したがって、ブロッキングドメインは、ｇＲＮＡの一部又は全てにハイブリダイズする又は実質的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡが、ブロッキングドメインがｇＲＮＡにハイブリダイズされる又は実質的にハイブリダイズされる第１の立体配座、及びブロッキングドメインが又はｇＲＮＡにハイブリダイズされない又は実質的にハイブリダイズされない第２の立体配座を採り得るように、ブロッキングドメイン及び誘導的に活性なｇＲＮＡが、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡ上に配置される。いくつかの実施形態において、第１の立体配座において、ｇＲＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、鋳型核酸結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、若しくはエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質））に結合することができないか、又はブロッキングドメインを欠くそれ以外は同様の鋳型ＲＮＡと比較して実質的に低下した親和性で結合する。いくつかの実施形態において、第２の立体配座において、ｇＲＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、鋳型核酸結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、又はエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質））に結合することができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡが、第１又は第２の立体配座のどちらにあるかが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドが含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の）ＤＮＡ結合又はエンドヌクレアーゼ活性が活性であるかどうかに影響を与え得る。いくつかの実施形態において、ブロッキングドメインへのｇＲＮＡのハイブリダイゼーションが、オープナー分子を用いて破壊され得る。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、ｇＲＮＡ又はブロッキングドメイン一部又は全てに結合し、ブロッキングドメインへのｇＲＮＡのハイブリダイゼーションを阻害する剤を含む。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、例えば、ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、又は両方に対して部分的に又は完全に相補的な配列を含む核酸を含む。適切なオープナー分子を選択又は設計することによって、オープナー分子を提供することは、それが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の関連する機能（例えば、ＤＮＡ結合及び／又はエンドヌクレアーゼ活性）を提供し得るように、ｇＲＮＡの立体配座の変化を促進し得る。理論に制約されるのを望むものではないが、選択された時間及び／又は位置においてオープナー分子を提供することは、それを含むｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの活性の空間的及び時間的制御を可能にし得る。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド及び又は鋳型核酸を含む細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、内因性剤（例えば、ｇＲＮＡ及びブロッキングドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド及び又は鋳型核酸を含む細胞に対して内因性である）を含む。例えば、誘導性ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、及びオープナー分子は、オープナー分子が、標的細胞又は組織内で発現される内因性剤であり、例えば、それによって、標的細胞又は組織内のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの活性を確実にするように選択され得る。さらなる例として、誘導性ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、及びオープナー分子は、オープナー分子が、１つ以上の非標的細胞又は組織内で存在しないか、又は実質的に発現されず、例えば、それによって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの活性が、１つ以上の非標的細胞若しくは組織内で生じない若しくは実質的に生じないか、又は標的細胞若しくは組織と比較して低下したレベルで生じるのを確実にするように選択され得る。例示的なブロッキングドメイン、オープナー分子、及びその使用が、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願公開国際公開第２０２００４４０３９Ａ１号パンフレットに記載される。いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡは、１つ以上のＵＴＲｓ（例えば、Ｒ２型レトロトランスポゾンに由来する）及びｇＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの書き込み（ｗｒｉｔｉｎｇ）ドメイン、例えば、逆転写酵素ドメインとの鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の相互作用を促進する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ポリペプチドの鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）との相互作用を促進する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば、標的細胞ゲノム内で、ポリペプチドを、一致する標的配列に指向する。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、逆転写酵素結合モチーフ（例えば、Ｒ２由来の３’ＵＴＲ）のみを含有し得、ｇＲＮＡは、標的部位認識のための第２の核酸分子（例えば、第２のＲＮＡ分子）として提供され得る。いくつかの実施形態において、ＲＴ結合モチーフを含有する鋳型核酸は、ｇＲＮＡと同じ分子上に存在し得るが、切断活性によって２つのＲＮＡ分子（例えばリボザイム）へと処理され得る。
いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡは、誘導性活性を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。誘導性活性は、（ｇＲＮＡに加えて）ブロッキングドメインをさらに含む鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡによって達成され得、ここで、ブロッキングドメインの一部又は全ての配列が、ｇＲＮＡの一部又は全てに対して少なくとも部分的に相補的である。したがって、ブロッキングドメインは、ｇＲＮＡの一部又は全てにハイブリダイズする又は実質的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡが、ブロッキングドメインがｇＲＮＡにハイブリダイズされる又は実質的にハイブリダイズされる第１の立体配座、及びブロッキングドメインが又はｇＲＮＡにハイブリダイズされない又は実質的にハイブリダイズされない第２の立体配座を採り得るように、ブロッキングドメイン及び誘導的に活性なｇＲＮＡが、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡ上に配置される。いくつかの実施形態において、第１の立体配座において、ｇＲＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、鋳型核酸結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、若しくはエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質））に結合することができないか、又はブロッキングドメインを欠くそれ以外は同様の鋳型ＲＮＡと比較して実質的に低下した親和性で結合する。いくつかの実施形態において、第２の立体配座において、ｇＲＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、鋳型核酸結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、又はエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質））に結合することができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡが、第１又は第２の立体配座のどちらにあるかが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドが含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の）ＤＮＡ結合又はエンドヌクレアーゼ活性が活性であるかどうかに影響を与え得る。いくつかの実施形態において、ブロッキングドメインへのｇＲＮＡのハイブリダイゼーションが、オープナー分子を用いて破壊され得る。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、ｇＲＮＡ又はブロッキングドメイン一部又は全てに結合し、ブロッキングドメインへのｇＲＮＡのハイブリダイゼーションを阻害する剤を含む。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、例えば、ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、又は両方に対して部分的に又は完全に相補的な配列を含む核酸を含む。適切なオープナー分子を選択又は設計することによって、オープナー分子を提供することは、それが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と結合し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の関連する機能（例えば、ＤＮＡ結合及び／又はエンドヌクレアーゼ活性）を提供し得るように、ｇＲＮＡの立体配座の変化を促進し得る。理論に制約されるのを望むものではないが、選択された時間及び／又は位置においてオープナー分子を提供することは、それを含むｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの活性の空間的及び時間的制御を可能にし得る。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド及び又は鋳型核酸を含む細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態において、オープナー分子は、内因性剤（例えば、ｇＲＮＡ及びブロッキングドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド及び又は鋳型核酸を含む細胞に対して内因性である）を含む。例えば、誘導性ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、及びオープナー分子は、オープナー分子が、標的細胞又は組織内で発現される内因性剤であり、例えば、それによって、標的細胞又は組織内のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの活性を確実にするように選択され得る。さらなる例として、誘導性ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、及びオープナー分子は、オープナー分子が、１つ以上の非標的細胞又は組織内で存在しないか、又は実質的に発現されず、例えば、それによって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの活性が、１つ以上の非標的細胞若しくは組織内で生じない若しくは実質的に生じないか、又は標的細胞若しくは組織と比較して低下したレベルで生じるのを確実にするように選択され得る。例示的なブロッキングドメイン、オープナー分子、及びその使用が、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願公開国際公開第２０２００４４０３９Ａ１号パンフレットに記載される。いくつかの実施形態において、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡは、１つ以上のＵＴＲｓ（例えば、Ｒ２型レトロトランスポゾンに由来する）及びｇＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの書き込み（ｗｒｉｔｉｎｇ）ドメイン、例えば、逆転写酵素ドメインとの鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の相互作用を促進する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ポリペプチドの鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）との相互作用を促進する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば、標的細胞ゲノム内で、ポリペプチドを、一致する標的配列に指向する。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、逆転写酵素結合モチーフ（例えば、Ｒ２由来の３’ＵＴＲ）のみを含有し得、ｇＲＮＡは、標的部位認識のための第２の核酸分子（例えば、第２のＲＮＡ分子）として提供され得る。いくつかの実施形態において、ＲＴ結合モチーフを含有する鋳型核酸は、ｇＲＮＡと同じ分子上に存在し得るが、切断活性によって２つのＲＮＡ分子（例えばリボザイム）へと処理され得る。
いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、標的細胞のゲノムＤＮＡにおける所与の突然変異を補正するようにカスタマイズされ得る（例えば、対象中、例えば、標的組織又は器官中、例えば、エクスビボ又はインビボで）。例えば、突然変異は、野生型配列に対する疾患関連の突然変異であり得る。理論に制約されるのを望むものではないが、一連の実験パラメータが、鋳型ＲＮＡ又はその部分の最適な初期のインシリコ設計を確実にするのを助ける）。選択された突然変異についての非限定的な例示的な例として、以下の設計パラメータが用いられ得る。いくつかの実施形態において、設計は、標的領域として働くように突然変異の両側に約５００ｂｐ（例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００ｂｐ以下、及び任意選択で、少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、又は６５０ｂｐ）の隣接配列を取得することによって開始される。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、ｇＲＮＡを含む。ｇＲＮＡを設計するための方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、標的部位に結合する配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）を含む。いくつかの実施形態において、鋳型核酸を標的領域に標的化するのに使用するための標的部位に結合する配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）は、使用される特定のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含む、例えば、エンドヌクレアーゼドメイン又は書き込みドメイン、）（例えば、２０ｎｔのｇＲＮＡ結合領域の直ぐ３’側のＮＧＧのＣａｓ９、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について）を考慮することによって選択される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、ＰＡＭがＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ誘導性編集によって破壊されるかどうかによってまず順位付けすることによって選択される。いくつかの実施形態において、ＰＡＭの破壊は、編集効率を高め得る。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ中に標的部位に（例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的部位への別の修飾の一部として又はそれに加えて）サイレント突然変異（例えば、もしあれば、標的核酸配列によってコードされるアミノ酸残基を改変しない突然変異）を導入することによっても、破壊され得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、所望の編集位置に対するそれらの対応するゲノム部位の近接性によって配列を順位付けすることによって選択される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ骨格を含む。いくつかの実施形態において、使用されるｇＲＮＡ骨格は、標準的な骨格（例えば、Ｃａｓ９、５’－ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣ－３’（配列番号１６０３）について）であり得、又は１つ以上のヌクレオチド置換を含有し得る。いくつかの実施形態において、異種対象配列は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによって標的部位に書き込まれ得る任意の挿入、置換、又は欠失を除いて、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するか、又は第１の鎖ニックの標的部位の３’側（例えば、第１の鎖ニックの直ぐ３’又は第１の鎖ニックの３’側の１、２、３、４、若しくは５ヌクレオチドまで）に対する１、２、３、４、又は５つ以下の非同一性位置を含む。いくつかの実施形態において、３’標的ホモロジードメインは、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含み、又は第１の鎖ニックの標的部位の５’側（例えば、第１の鎖ニックの直ぐ５’又は第１の鎖ニックの３’側の１、２、３、４、若しくは５ヌクレオチドまで）に対する１、２、３、４、又は５以下の非同一性位置を含む。
いくつかの実施形態において、鋳型は、鋳型と、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドとの結合を助ける１つ以上の配列を有する。いくつかの実施形態において、これらの配列は、レトロトランスポゾンＵＴＲに由来し得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、所望の挿入配列に隣接して位置し得る。いくつかの実施形態において、標的部位相同性を有する配列が、１つ又は両方のＵＴＲの外部に位置し得る。いくつかの実施形態において、標的部位相同性を有する配列は、標的配列にアニールして、逆転写をプライミングし得る。いくつかの実施形態において、５’及び／又は３’ＵＴＲは、例えば、標的プライム逆転写が、５’及び／又は３’ＵＴＲの逆転写を除外するように、標的部位相同配列に対して末端に位置し得る。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、さらなる配列なしで所望のペイロードの挿入をもたらし得る（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質を結合するのに使用されるＵＴＲなしの遺伝子発現ユニット）。
鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ遺伝子座における挿入、突然変異、又は欠失をもたらすように設計され得る。いくつかの実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ中への挿入を引き起こすように設計され得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、異種配列を含有し得、ここで、逆転写は、標的ＤＮＡ中への異種配列の挿入をもたらす。他の実施形態において、ＲＮＡ鋳型は、欠失を標的ＤＮＡに書き込むように設計され得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、所望の欠失の上流及び下流で標的ＤＮＡに一致し得、ここで、逆転写は、介在配列なしで鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）からの上流及び下流の配列の複製をもたらし、例えば、介在配列の欠失を引き起こす。他の実施形態において、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、編集を標的ＤＮＡに書き込むように設計され得る。例えば、鋳型ＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドを除いて、標的ＤＮＡ配列と一致し得、ここで、逆転写は、標的ＤＮＡ中にこれらの編集の複製をもたらし、例えば、突然変異、例えば、転移又はトランスバージョン突然変異をもたらす。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ヌクレオチド（及び任意選択で、５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド以下）の標的部位中への挿入を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ヌクレオチド（及び任意選択で、５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド以下）の標的部位中への挿入を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０キロベース（及び任意選択で、１、５、１０、又は２０キロベース以下）の標的部位中への挿入を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも８１、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチド（及び任意選択で、５００、４００、３００、又は２００ヌクレオチド以下）の欠失を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも８１、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチド（及び任意選択で、５００、４００、３００、又は２００ヌクレオチド以下）の欠失を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ヌクレオチド（及び任意選択で、５００、４００、３００、又は２００ヌクレオチド以下）の欠失を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０キロベース（及び任意選択で、１、５、１０、又は２０キロベース以下）の欠失を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００又はそれ以上のヌクレオチドの標的部位中の置換を生成することが可能である。いくつかの実施形態において、置換は、転移突然変異である。いくつかの実施形態において、置換は、トランスバージョン突然変異である。いくつかの実施形態において、置換は、アデニンをチミンに、アデニンをグアニンに、アデニンをシトシンに、グアニンをチミンに、グアニンをシトシンに、グアニンをアデニンに、チミンをシトシンに、チミンをアデニンに、チミンをグアニンに、シトシンをアデニンに、シトシンをグアニンに、又はシトシンをチミンに変換する。
修飾ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡ）のための方法及び組成物
いくつかの実施形態において、システムのＲＮＡ成分（例えば、鋳型ＲＮＡ又はｇＲＮＡ、例えば、本明細書に記載されるような）は、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの修飾パターンは、非修飾又は末端修飾ガイドと比較して、インビボ活性に著しく影響を与え得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２（９）：２２２７－２２３５（２０１８）からの図１Ｄに示されるように）。理論に制約されるのを望むものではないが、このプロセスは、少なくとも部分的に、修飾によって与えられるＲＮＡの安定化に起因し得る。このような修飾の非限定的な例は、ヌクレオチド間の２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－０－（２－メトキシエチル）（２’－０－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、Ｇ－Ｃ置換、及びヌクレオチド間の反転脱塩基結合並びにそれらの同等物を含み得る。
いくつかの実施形態において、システムのＲＮＡ成分（例えば、鋳型ＲＮＡ又はｇＲＮＡ、例えば、本明細書に記載されるような）は、１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの修飾パターンは、非修飾又は末端修飾ガイドと比較して、インビボ活性に著しく影響を与え得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２（９）：２２２７－２２３５（２０１８）からの図１Ｄに示されるように）。理論に制約されるのを望むものではないが、このプロセスは、少なくとも部分的に、修飾によって与えられるＲＮＡの安定化に起因し得る。このような修飾の非限定的な例は、ヌクレオチド間の２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－０－（２－メトキシエチル）（２’－０－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、Ｇ－Ｃ置換、及びヌクレオチド間の反転脱塩基結合並びにそれらの同等物を含み得る。
いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ（例えば、標的部位に結合するその部分において）又はガイドＲＮＡは、５’末端領域を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ又はガイドＲＮＡは、５’末端領域を含まない。いくつかの実施形態において、５’末端領域は、例えば、ｓｇＲＮＡに関して、Ｂｒｉｎｅｒ ＡＥ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３－３３９（２０１４）（全体が参照により本明細書に援用される；本明細書において、例えば、全てのガイドＲＮＡに適用可能である）に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲスペーサー領域を含む。いくつかの実施形態において、５’末端領域は、５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態において、スペーサー領域を有する又は有さない５’末端領域は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ及び／又はｄｇＲＮＡと結合され得る。ＣＲＩＳＰＲスペーサー領域は、ある場合に、ガイド領域、ガイドドメイン、又は標的化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、標的ドメイン又は標的配列は、ガイド領域／ドメインがヌクレアーゼを切断に指向する核酸の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ｓｐｙＣａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲスペーサー領域中に存在するヌクレオチドによって、標的核酸分子の標的配列に、ガイド領域／ドメインによって指向され得る。
いくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるような、鋳型ＲＮＡ（例えば、標的部位に結合するその部分において）又はガイドＲＮＡは、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４に示される配列のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、配列が、ガイド及び／又はスペーサー領域を示す場合、組成物は、この領域を含んでも又は含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、例えば、配列番号によってその中で同定されるように、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４に示される配列のいずれかの修飾の１つ以上を含む。実施形態において、ヌクレオチドは、同じか又は異なっていてもよく、及び／又は示される修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４に示されるガイド配列の修飾パターンと同じか又は同様であり得る。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、ｇＲＮＡの修飾又はｇＲＮＡの領域（例えば、５’末端領域、下側ステム領域、バルジ領域、上側ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、３’末端領域）の相対位置及び同一性を含む。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列カラムに示される配列のいずれか１つの、及び／又は配列の１つ以上の領域にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の修飾を含有する。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列カラムに示される配列のいずれか１つの修飾パターンに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、例えば、５’末端領域、下側ステム領域、バルジ領域、上側ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、及び／又は３’末端領域において、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４に示される配列の１つ以上の領域にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、５’末端領域にわたって配列の修飾パターンに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、下側ステムにわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、バルジにわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、上側ステムにわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、ネクサスにわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、ヘアピン１にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、ヘアピン２にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、３’末端にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列の修飾パターン、又は、例えば、０、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のヌクレオチドにおける、このような配列の領域（例えば、５’末端、下側ステム、バルジ、上側ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端）と異なる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば、０、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のヌクレオチドにおける、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列の修飾と異なる修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば、０、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のヌクレオチドにおける、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列の領域（例えば、５’末端、下側ステム、バルジ、上側ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端）の修飾と異なる修飾を含む。
いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ（例えば、標的部位に結合するその部分において）又はｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、５’末端修飾、３’末端修飾、又は５’及び３’末端修飾を含む。いくつかの実施形態において、５’末端修飾は、ヌクレオチド間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態において、５’末端修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、及び／又は２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５’末端修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合並びに２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、及び／又は２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含む。末端修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、及び／又は２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾を含み得る。同等の末端修飾はまた、本明細書に記載される実施形態によって包含される。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ又はｇＲＮＡは、鋳型ＲＮＡ又はｇＲＮＡの１つ以上の領域の修飾と組み合わせて末端修飾を含む。ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡ、及びその配合物を保護するためのさらなる例示的な修飾及び方法が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１８１２６１７６Ａ１号パンフレットに記載される。
いくつかの実施形態において、構造に基づく及び系統的な手法が、例えば、Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）（全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、修飾（例えば、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ、２’－Ｆ－ＲＮＡ、及びＰＳ修飾）を、鋳型ＲＮＡ又はガイドＲＮＡに導入するのに使用される。いくつかの実施形態において、２’－Ｆ－ＲＮＡの組み込みは、Ｃ３’－ｅｎｄｏ糖パッカリングを最小限に妨げながら、例えば、ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の熱及びヌクレアーゼ安定性を増加させる。いくつかの実施形態において、２’－Ｆは、２’－ＯＨがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖安定性にとって重要である位置において２’－ＯＭｅより耐性が良好であり得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡは、例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＭｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）の補足の表１に記載されるように、Ｃａｓ９活性を低下させない１つ以上の修飾、例えば、Ｃ１０、Ｃ２０、又はＣ２１（完全に修飾された）を含む。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）の補足の表１のＣａｓ９活性を低下させない１つ以上の修飾、例えば、Ｔ２、Ｔ６、Ｔ７、又はＴ８（完全に修飾された）を含む。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡは、１つ以上の修飾、例えば、Ｃ２０及びＴ２を含むｔｒａｃｒＲＮＡと対合され得る１つ以上の修飾（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのキメラを含む（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２））。実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡからの修飾が、例えば、向上した安定性を有する修飾ｇＲＮＡを生成するために、単一ガイドキメラ上にマッピングされる。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、天然構成成分、例えば、ヘアピンの付加又は除去によって修飾され得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１８１０６７２７号パンフレットに記載されるように、１つ以上の３’ヘアピン要素が除去されたｇＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、スペーサー領域中に付加されたヘアピン構造、例えば、付加されたヘアピン構造を含有し得、これは、Ｋｏｃａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７（６）：６５７－６６６（２０１９）の教示においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特異性を増加させることが示された。短縮ｇＲＮＡ及びインビボ活性を改善する特定の修飾の例を含むさらなる修飾が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１９０３１６１２１号明細書に見出され得る。
いくつかの実施形態において、構造に基づく及び系統的な手法（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＭｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）に記載されるような）が、鋳型ＲＮＡのための修飾を発見するのに用いられる。実施形態において、修飾は、鋳型ＲＮＡのガイド領域の包含又は除外により同定される。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡに結合されたポリペプチドの構造が、例えば、ポリペプチドとのＲＮＡの結合を破壊するより低いリスクを伴い、修飾のためにその後選択され得るＲＮＡの非タンパク質接触ヌクレオチドを決定するのに使用される。鋳型ＲＮＡにおける二次構造はまた、ソフトウェアツール、例えば、ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂにおいて入手可能なＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅツール（全体が参照により本明細書に援用されるＢｅｌｌａｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：Ｗ４７１－Ｗ４７４（２０１３））によってインシリコで予測されて、例えば、修飾、例えば、ヘアピン、ステム、及び／又はバルジを選択するための二次構造が決定され得る。
本明細書にさらに含まれるのは、完全又は部分的な鋳型ＲＮＡ分子（例えば、任意選択で、ｇＲＮＡ、又は別個のｇＲＮＡ分子を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ鋳型ＲＮＡ分子）の組み立てのための組成物及び方法である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、互いに２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）のＲＮＡセグメントの結合によって組み立てられ得る。一態様において、本開示は、核酸分子を生成するための方法を提供し、この方法は、第１のＲＮＡセグメントの５’末端が第２のＲＮＡセグメントの３’末端と共有結合されるのを可能にする条件下で、２つ以上の線状ＲＮＡセグメントを互いに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、結合された分子は、結合された分子の５’末端が、第３のＲＮＡセグメントの３’末端と共有結合されるのを可能にする条件下で、第３のＲＮＡセグメントと接触され得る。実施形態において、この方法は、第４、第５、又はさらなるＲＮＡセグメントを、伸長された分子に結合することをさらに含む。この形態の組み立ては、ある場合に、ＲＮＡ分子の迅速及び効率的な組み立てを可能にし得る。
本開示はまた、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の結合（例えば、共有結合）のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、異なる標的部位に対する特異性を有するガイドＲＮＡ分子が、標的部位特異的ｃｒＲＮＡ分子／セグメントに結合された単一のｔｒａｃｒＲＮＡ分子／セグメントを用いて生成され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書の図１０に示されるように）。例えば、米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書の図１０は、ガイドＲＮＡ分子を形成するためにｔｒａｃｒＲＮＡ分子に結合されたｃｒＲＮＡ分子３とともに異なるｃｒＲＮＡ分子を含む４つのチューブを示し、それによって、生成物ＲＮＡ分子を形成するための２つのＲＮＡセグメントの例示的な結合を示す。
本開示はまた、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド及び／又はゲノム標的部位に対する特異性を有する鋳型ＲＮＡ分子の生成のための組成物及び方法を提供する。一態様において、この方法は、（１）標的部位及びそれに対する所望の修飾の同定、（２）上流の相同性セグメント、異種対象配列セグメント、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド結合モチーフ、及びｇＲＮＡセグメントを含むＲＮＡセグメントの生成、並びに／又は（３）少なくとも１つの分子中への、例えば、単一のＲＮＡ分子中への４つ以上のセグメントの結合を含む。いくつかの実施形態において、（２）に含まれる鋳型ＲＮＡセグメントのいくつか又は全てが、鋳型ＲＮＡ分子、例えば、列挙される成分の１、２、３、又は４つに組み立てられる。いくつかの実施形態において、（２）に含まれるセグメントは、さらにセグメント化された分子中で生成され得、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によってその後組み立てられる、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５つ又はそれ以上のサブセグメントに分割され得る。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡセグメントは、化学合成によって生成され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡセグメントは、例えば、ＲＮＡ転写産物を生成するためのＤＮＡ鋳型の同種プロモーターに対して作用するＲＮＡポリメラーゼを提供することによって、核酸鋳型のインビトロ転写によって生成され得る。いくつかの実施形態において、インビトロ転写は、例えば、同種プロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーターの転写制御下で、ＤＮＡ、例えば、例えばＲＮＡセグメントをコードする、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、線状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、線状ＤＮＡアンプリコン、線状化プラスミドＤＮＡに対して作用する、例えば、Ｔ７、Ｔ３、若しくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、又はそれらの誘導体を用いて行われる。いくつかの実施形態において、化学合成及びインビトロ転写の組合せを用いて、組み立てのためのＲＮＡセグメントを生成する。実施形態において、ｇＲＮＡ、上流の標的相同性、及びＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド結合セグメントが、化学合成によって生成され、異種対象配列セグメントが、インビトロ転写によって生成される。理論に制約されるのを望むものではないが、インビトロ転写は、より長いＲＮＡ分子の生成により良好に適し得る。いくつかの実施形態において、インビトロ転写のための反応温度が、例えば、３７℃未満（例えば、０～１０Ｃ、１０～２０Ｃ、又は２０～３０Ｃ）になるように低下されて、完全長転写産物のより高い生成をもたらし得る（Ｋｒｉｅｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：６４６３（１９９０））。いくつかの実施形態において、例えば、インビトロで２７ｋｂの転写産物を生成し得るＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓの使用などの、長い転写産物の改善された合成のためのプロトコルが、長い鋳型ＲＮＡ、例えば、５ｋｂ超の鋳型ＲＮＡを合成するのに用いられる（Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２（６）：１２７３－１２８１（２００１））。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子に対する修飾は、１つ以上のＲＮＡセグメント、又はそれらの組合せの組み立て後の、化学的又は酵素的プロセスによるＲＮＡセグメントの合成の後、（例えば、修飾ヌクレオチドの包含又は代替的な結合化学によって）ＲＮＡセグメントの合成中に組み込まれ得る。
いくつかの実施形態において、システムのｍＲＮＡ（例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）が、線状化ＤＮＡ鋳型からのＴ７ポリメラーゼ媒介性ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写を用いてインビトロで合成され、ここで、ＵＴＰが、１－メチルプソイドＵＴＰで任意選択で置換される。いくつかの実施形態において、転写産物は、５’及び３’ＵＴＲ、例えば、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１６０４）及びＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号１６０５）、又はその機能的フラグメント若しくは変異体を組み込み、任意選択で、ポリ－Ａテイルを含み、これは、ＤＮＡ鋳型中でコードされ得るか、又は転写後に酵素的に付加され得る。いくつかの実施形態において、ドナーメチル基、例えば、Ｓ－アデノシルメチオニンが、キャップ０構造を有するメチル化キャップＲＮＡに付加されて、ｍＲＮＡ翻訳効率を高めるキャップ１構造が得られる（Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７））。
いくつかの実施形態において、Ｔ７プロモーターからの転写産物は、ＧＧＧモチーフから開始する。いくつかの実施形態において、Ｔ７プロモーターからの転写産物は、ＧＧＧモチーフから開始しない。転写開始の時点でのＧＧＧモチーフが、優れた収量を提供するにもかかわらず、＋１～＋３の鋳型鎖中の３つのＣ残基における転写のスリップの結果として、ポリ（Ｇ）生成物のラダー（ｌａｄｄｅｒ）を生成するＴ７ ＲＮＡＰにつながり得ることが示されている（Ｉｍｂｕｒｇｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（３４）：１０４１９－１０４３０（２０００）。転写レベルを調整し、別の５’ＵＴＲに適合するように転写開始部位ヌクレオチドを改変するために、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ ４３３－４４３（２０１０）の教示が、これらの特質の両方を達成する、Ｔ７プロモーター変異体、及びその発見方法を記載する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡセグメントは、共有結合によって互いに結合され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、２つ以上のＲＮＡセグメントを互いに結合するのに使用され得る。ＲＮＡリガーゼなどの試薬が使用されるとき、５’末端は、典型的に、３’末端に連結される。いくつかの実施形態において、２つのセグメントが結合される場合、形成され得る２つの可能な線状構築物（すなわち、（１）５’－セグメント１－セグメント２－３’及び（２）５’－セグメント２－セグメント１－３’）がある。いくつかの実施形態において、分子内環状化も起こり得る。これらの問題の両方が、ＲＮＡリガーゼが末端を別の末端にライゲートすることができないように、例えば、１つの５’末端又は１つの３’末端をブロックすることによって対処され得る。実施形態において、５’－セグメント１－セグメント２－３’の構築物が所望される場合、セグメント１の５’末端又はセグメント２の３’末端のいずれかに保護基を配置することが、適切な線状ライゲーション生成物のみの形成をもたらし、及び／又は分子内環状化を防止し得る。２つの核酸（例えば、ＲＮＡ）セグメントの共有結合のための組成物及び方法が、２つの一本鎖ＲＮＡセグメントを互いに指向的にライゲートするためのＲＮＡリガーゼの使用を含む方法とともに、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）に開示される。
例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼとともに使用され得る末端ブロッカーの一例は、ジデオキシターミネーターである。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、典型的に、５’－ホスフェートと３’－ヒドロキシル末端との間のホスホジエステル結合のＡＴＰ－依存性ライゲーションを触媒する。いくつかの実施形態において、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼが使用されるとき、好適な末端が、ライゲートされる末端上に存在しなければならない。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを末端上にブロックするための１つの手段は、適切な末端形式を有することができないことを含む。一般に、５－ヒドロキシル又は３’－ホスフェートを有するＲＮＡセグメントの末端は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼのための基質として作用しないであろう。
ＲＮＡセグメントを結合するのに使用され得るさらなる例示的な方法は、クリック化学による（例えば、全開示内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，３７５，２３４号明細書及び７，０７０，９４１号明細書、及び米国特許出願公開第２０１３／００４６０８４号明細書に記載されるように）。例えば、１つの例示的なクリック化学反応は、アルキン基とアジド基との間で起こる（全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書の図１１を参照）。任意のクリック反応が、ＲＮＡセグメント（例えば、Ｃｕ－アジド－アルキン、歪み促進型アジド－アルキン、シュタウディンガーライゲーション、テトラジンライゲーション、光誘導性テトラゾール－アルケン、チオール－エン、ＮＨＳエステル、エポキシド、イソシアネート、及びアルデヒド－アミノオキシ）を連結するために潜在的に使用され得る。いくつかの実施形態において、クリック化学反応が、迅速で、モジュール式で、効率的であり、多くの場合、毒性の廃棄物を生成せず、溶媒として水を用いて行われ得、及び／又は立体特異的であるように設定され得るため、クリック化学反応を用いたＲＮＡ分子のライゲーションが、有利である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡセグメントは、アジド－アルキンヒュスゲン環化付加反応を用いて結合され得、これは、典型的に、ＲＮＡセグメントのライゲーションのための１，２，３－トリアゾールを得るための、アジドと末端若しくは内部アルキンとの間の１，３－双極子環化付加である。理論に制約されるのを望むものではないが、このライゲーション方法の１つの利点は、この反応が、必要とされるＣｕ（Ｉ）イオンの付加によって開始され得ることであり得る。ＲＮＡセグメントが結合され得る他の例示的な機構としては、限定はされないが、ハロゲン（Ｆ－、Ｂｒ－、Ｉ－）／アルキン付加反応、カルボニル／スルフヒドリル／マレイミド、及びカルボキシル／アミン結合の使用が挙げられる。例えば、１つのＲＮＡ分子が、３’においてチオールで修飾され得（ジスルフィドアミダイト及びユニバーサルサポート又はジスルフィド修飾担体を用いて）、他のＲＮＡ分子が、５’においてアクリダイトで修飾され得る場合（アクリル酸ホスホロアミダイトを用いて）、２つのＲＮＡ分子が、マイケル付加反応によって結合され得る。この手法はまた、結合する複数のＲＮＡ分子に段階的に適用され得る。３つ以上（例えば、３、４、５、６つなど）のＲＮＡ分子を互いに連結するための方法も提供される。理論に制約されるのを望むものではないが、これは、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）に示されるように、例えば、化学合成効率が低下するように、所望のＲＮＡ分子が約４０ヌクレオチドより長いときに有用であり得る。
例示として、ｔｒａｃｒＲＮＡは、典型的に、約８０ヌクレオチド長である。このようなＲＮＡ分子は、例えば、インビトロ転写又は化学合成などのプロセスによって生成され得る。いくつかの実施形態において、化学合成が、このようなＲＮＡ分子を生成するのに使用されるとき、それらは、単一の合成生成物として、又は２つ以上の合成ＲＮＡセグメントを互いに連結することによって生成され得る。実施形態において、３つ以上のＲＮＡセグメントが、互いに結合されるとき、様々な方法が、個々のセグメントを一緒に連結するのに使用され得る。また、ＲＮＡセグメントは、ワンポット（例えば、容器、槽、ウェル、チューブ、皿、又は他のレセプタクル）で、全て同時に、又は異なる時点で、ワンポットで、又は異なる時点で、異なるポットで、互いに結合され得る。非限定的な例において、ＲＮＡセグメント１、２及び３を番号順に組み立てるために、ＲＮＡセグメント１及び２は、まず、５’から３’に、互いに結合され得る。次に、反応生成物は、反応混合物成分のために精製され得（例えば、クロマトグラフィーによって）、次に、ＲＮＡセグメント３の５’末端との３’末端の結合のために、第２のポットに入れられ得る。次に、最終的な反応生成物は、ＲＮＡセグメント３の５’末端に結合され得る。
別の非限定的な例において、ＲＮＡセグメント１（約３０ヌクレオチド）は、ｃｒＲＮＡの標的遺伝子座認識配列及びヘアピン領域１の一部である。ＲＮＡセグメント２（約３５ヌクレオチド）は、ヘアピン領域１の残りの部分及びヘアピン領域１とヘアピン領域２との間の線状ｔｒａｃｒＲＮＡの一部を含有する。ＲＮＡセグメント３（約３５ヌクレオチド）は、ヘアピン領域１とヘアピン領域２との間の線状ｔｒａｃｒＲＮＡの残りの部分及びヘアピン領域２の全てを含有する。この実施例において、ＲＮＡセグメント２及び３は、クリック化学を用いて、５’から３’に連結される。さらに、反応生成物の５’及び３’末端は両方ともリン酸化される。次に、反応生成物は、３’末端ヒドロキシル基を有するＲＮＡセグメント１、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼと接触されて、ガイドＲＮＡ分子が生成される。
いくつかのさらなる連結化学が、本発明の方法にしたがってＲＮＡセグメントを結合するのに使用され得る。これらの化学のいくつかが、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書の表６に記載される。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓ、例えば、熱安定性Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓ
特定の理論に束縛されることは意図しないが、一部の実施形態では、冷却環境下で進化したレトロトランスポザーゼは、ヒト体温で同様に機能しないことがある。本願は、トリレトロトランスポザーゼ由来のタンパク質を含む、いくつかの熱安定性Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓを提供する。表３中の例示的なトリトランスポザーゼ配列は、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ）（キンカチョウ；トランスポゾン名Ｒ２－１＿ＴＧ）、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（ガラパゴスフィンチ；トランスポゾン名Ｒ２－１＿Ｇｆｏ）、ノドジロシトド（Ｚｏｎｏｔｒｉｃｈｉａ ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）（ノドジロシトド；トランスポゾン名Ｒ２－１＿ＺＡ）、及びノドジロシギダチョウ（Ｔｉｎａｍｕｓ ｇｕｔｔａｔｕｓ）（ノドジロシギダチョウ；トランスポゾン名Ｒ２－１＿ＴＧｕｔ）のものを含む。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、一部の実施形態では、冷却環境下で進化したレトロトランスポザーゼは、ヒト体温で同様に機能しないことがある。本願は、トリレトロトランスポザーゼ由来のタンパク質を含む、いくつかの熱安定性Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓを提供する。表３中の例示的なトリトランスポザーゼ配列は、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ）（キンカチョウ；トランスポゾン名Ｒ２－１＿ＴＧ）、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ）（ガラパゴスフィンチ；トランスポゾン名Ｒ２－１＿Ｇｆｏ）、ノドジロシトド（Ｚｏｎｏｔｒｉｃｈｉａ ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）（ノドジロシトド；トランスポゾン名Ｒ２－１＿ＺＡ）、及びノドジロシギダチョウ（Ｔｉｎａｍｕｓ ｇｕｔｔａｔｕｓ）（ノドジロシギダチョウ；トランスポゾン名Ｒ２－１＿ＴＧｕｔ）のものを含む。
熱安定性は、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒが、高温（例えば、３７℃）及び低温（例えば、２５℃）で、インビトロでＤＮＡを重合する能力を試験することによって測定されてもよい。ＤＮＡ重合活性（例えば、処理能力）をインビトロでアッセイするのに適した条件は、例えば、Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，“Ｈｉｇｈ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｆｒｏｍ ａ Ｎｏｎ－ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ”（２００２）ＪＢＣ ２７７，３４８３６－３４８４５に記載されている。一部の実施形態では、熱安定性Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、他の類似条件下、２５℃でのその活性の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％以上である３７℃で、活性、例えばＤＮＡ重合活性を有する。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、表１又は表３の配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列）は、哺乳動物（例えば、ヒト）又は鳥類から選択される対象において安定である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、３７℃で機能的である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、３７℃で、より低い温度、例えば、３０℃、２５℃、又は２０℃で有するよりも高い活性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ヒト細胞において、ゼブラフィッシュ細胞におけるよりも高い活性を有する。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、例えば、本明細書の実施例６又は実施例７のアッセイを用いて、３７℃で培養されたヒト細胞において活性がある。
一部の実施形態では、アッセイは、（１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１つ又は複数の６．４ｍｍ径のウェルに１０，０００細胞／ウェルで導入するステップと、（２）細胞を３７℃で２４時間インキュベートするステップと、（３）ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬及び８０ｎｇのＤＮＡ（ここでＤＮＡは、（ａ）ＣＭＶプロモータ、（ｂ）標的部位の１００ｂｐ上流に対して相同な１００ｂｐの配列、（ｃ）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質に結合する５’非翻訳領域をコードする配列、（ｄ）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質をコードする配列、（ｅ）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質に結合する３’非翻訳領域をコードする配列 （ｆ）標的部位の１００ｂｐ下流に対して相同な１００ｂｐの配列、及び（ｇ）ＢＧＨポリアデニル化配列を順に含むプラスミドである）及び１０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭの場合、０．５μｌを含むトランスフェクション混合物を準備し、室温で１５分間インキュベートするステップと、（４）トランスフェクション混合物を細胞に加えるステップと、（５）細胞を３日間インキュベートするステップと、（６）外因性配列の細胞ゲノム中の標的遺伝子座（例えば、ｒＤＮＡ）への組み込みをアッセイするステップとを含み、例えば、先行するステップの１つ又は複数は、本明細書の実施例６に記載のように実施される。
いくつかの実施形態において、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドは、ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、４、又は５コピーの平均コピー数で、標的遺伝子座（例えば、ｒＤＮＡ）中への異種対象配列（例えば、ＧＦＰ遺伝子）の挿入をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞（例えば、標的挿入部位に異種配列を含む細胞）は、ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、４、又は５コピーの平均コピー数で、異種対象配列を含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、末端での比較的より少ない切断事象を伴う標的ＲＮＡ内の配列の組み込みを引き起こす。例えば、一部の実施形態では、（例えば、配列番号１０１６の）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質は、本明細書に記載のアッセイ、例えば、本明細書の実施例６及び図８のアッセイによる測定として、切断されていない標的部位への、約２５～１００％、約５０～１００％、約６０～１００％、約７０～１００％、約７５～９５％、約８０％～９０％、若しくは約８６．１７％の組み込み体をもたらす。一部の実施形態では、（例えば、配列番号１０１６の）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質は、本明細書に記載のアッセイによる測定として、切断されていない標的部位への、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、若しくは約９０％の組み込み体をもたらす。一部の実施形態では、組み込み体は、エレメント（例として、例えばキンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ）の野生型トランスポゾン配列）の末端から５６５ｂｐに位置するフォワードプライマー及び標的挿入部位のゲノムＤＮＡ、例えばｒＤＮＡ中に位置するリバースプライマーによる増幅を含むアッセイを用いて、切断型及び非切断型として分類される。一部の実施形態では、標的挿入部位における完全長組み込み体の数は、標的挿入部位において３００～５６５ヌクレオチドだけ切断された組み込み体の数よりも多く、例えば、完全長組み込み体の数は、切断された組み込み体の数の少なくとも１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、若しくは１０倍であり、又は完全長組み込み体の数は、切断された組み込み体の数の少なくとも１．１倍～１０倍、２倍～１０倍、３倍～１０倍、若しくは５倍～１０倍である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、標的細胞のゲノム中の１つの標的部位に限って、異種目的配列の挿入をもたらす。挿入は、例えば、実施例８に記載のように、例えば、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％超の閾値を用いて測定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列の挿入をもたらし、ここで挿入の１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％未満は、例えば、本明細書に記載のアッセイ、例えば実施例８のアッセイを用いて、標的部位以外の部位に存在する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列の「無傷の」挿入をもたらす一方で、一部の実施形態では、標的部位は、異種配列の挿入の結果として、内因性ＤＮＡの欠失又は重複を示し得る。異なるレトロトランスポゾンの機構は、標的部位でレトロトランスポジションの間に生じる、宿主ゲノムにおける重複又は欠失の異なるパターンをもたらし得る。一部の実施形態では、システムは、周囲のゲノムＤＮＡにおける重複又は欠失を伴わずに、無傷の挿入をもたらす。一部の実施形態では、システムは、挿入の上流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の欠失をもたらす。一部の実施形態では、システムは、挿入の下流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の欠失をもたらす。一部の実施形態では、システムは、挿入の上流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の重複をもたらす。一部の実施形態では、システムは、挿入の下流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の重複をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はそのＤＮＡ結合ドメインは、例えば、実施例２１のアッセイを用いる測定として、その標的部位に特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はそのＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位に、ヒトゲノム中の任意の他の結合部位よりも強力に結合する。例えば、一部の実施形態では、実施例２１のアッセイにおいて、標的部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はそのＤＮＡ結合ドメインのヒトゲノムＤＮＡへの結合事象の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％超を表す。
遺伝子改変された、例えば二量体化されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓ
一部の非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、レトロトランスポジションを完了するための２つのサブユニットを利用する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２００６）。一部の実施形態では、本明細書に記載のレトロトランスポザーゼは、単一ポリペプチドとして、２つの結合されたサブユニットを含む。例えば、２つの野生型レトロトランスポザーゼであれば、共有結合的に「二量体化された」タンパク質を形成するため、リンカーで結合され得る（図１７参照）。一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼをコードする核酸は、単一ポリペプチドとして発現されるべき２つのレトロトランスポザーゼサブユニットをコードする。一部の実施形態では、サブユニットは、例えば、本明細書中の「リンカー」という表題のセクションや、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０１３に記載されている、ペプチドリンカーによって結合される。一部の実施形態では、ポリペプチドにおける２つのサブユニットは、リジッドリンカーによって結合される。一部の実施形態では、リジッドリンカーは、モチーフ（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１５３４）からなる。他の実施形態では、ポリペプチドにおける２つのサブユニットは、フレキシブルリンカーによって結合される。一部の実施形態では、フレキシブルリンカーは、モチーフ（Ｇｌｙ）ｎからなる。一部の実施形態では、フレキシブルリンカーは、モチーフ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１５３５）からなる。一部の実施形態では、リジッド又はフレキシブルリンカーは、レトロトランスポジションを実現するため、長さが１、２、３、４、５、１０、１５、若しくはそれ以上のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカーは、リジッド及びフレキシブルリンカーモチーフの組合せからなる。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、リンカー、例えば、ペプチドリンカー、例えば、表３８に記載されるリンカーを含み得る。表３８は、複数の機能的ドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの発現、安定性、及び機能を向上させるためのリンカー配列を示す。
一部の非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、レトロトランスポジションを完了するための２つのサブユニットを利用する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２００６）。一部の実施形態では、本明細書に記載のレトロトランスポザーゼは、単一ポリペプチドとして、２つの結合されたサブユニットを含む。例えば、２つの野生型レトロトランスポザーゼであれば、共有結合的に「二量体化された」タンパク質を形成するため、リンカーで結合され得る（図１７参照）。一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼをコードする核酸は、単一ポリペプチドとして発現されるべき２つのレトロトランスポザーゼサブユニットをコードする。一部の実施形態では、サブユニットは、例えば、本明細書中の「リンカー」という表題のセクションや、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０１３に記載されている、ペプチドリンカーによって結合される。一部の実施形態では、ポリペプチドにおける２つのサブユニットは、リジッドリンカーによって結合される。一部の実施形態では、リジッドリンカーは、モチーフ（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１５３４）からなる。他の実施形態では、ポリペプチドにおける２つのサブユニットは、フレキシブルリンカーによって結合される。一部の実施形態では、フレキシブルリンカーは、モチーフ（Ｇｌｙ）ｎからなる。一部の実施形態では、フレキシブルリンカーは、モチーフ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１５３５）からなる。一部の実施形態では、リジッド又はフレキシブルリンカーは、レトロトランスポジションを実現するため、長さが１、２、３、４、５、１０、１５、若しくはそれ以上のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカーは、リジッド及びフレキシブルリンカーモチーフの組合せからなる。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、リンカー、例えば、ペプチドリンカー、例えば、表３８に記載されるリンカーを含み得る。表３８は、複数の機能的ドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの発現、安定性、及び機能を向上させるためのリンカー配列を示す。
機構に基づくと、両方のレトロトランスポザーゼサブユニットからの機能の全てが必要なわけでない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、十分に機能的なサブユニットと１つ又は複数の機能ドメインが欠如した第２のサブユニットとからなってもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素の機能性が欠如してもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素ドメインが欠如してもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼ活性のみを有してもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、例えば、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の図１７Ａ～１７Ｆのいずれかに示されるように、共有結合的に二量体化された形態を有する。示されるタンパク質は、以下のとおりである：図１７Ａ：野生型完全長酵素。図１７Ｂ、リンカーによって結合される２つの完全長酵素（それぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む）。図１７Ｃ、リンカーによって完全長酵素に結合されるＤＮＡ結合ドメイン及びＲＮＡ結合ドメイン。図１７Ｄ、リンカーによってＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインに結合されるＤＮＡ結合ドメイン及びＲＮＡ結合ドメイン。図１７Ｅ、第１のリンカーによってＲＮＡ結合ドメインに結合され、それが第２のリンカーによって第２のＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインに結合されるＤＮＡ結合ドメイン。図１７Ｆ、第１のリンカーによってＲＮＡ結合ドメインに結合され、それが第２のリンカーによって複数のＲＮＡ結合ドメイン（この図において、分子は、３つのＲＮＡ結合ドメインを含む）に結合され、それがリンカーによって逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインに結合されるＤＮＡ結合ドメイン。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、鋳型ＲＮＡ中でＵＴＲに結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのモジュールは、逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、複数のＲＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、モジュールシステムは、分割され、システムが２つの異なるＤＮＡ結合モジュール、例えば、標的プライム逆転写のためにＲＮＡ鋳型を動員するＲＮＡ結合モジュールに融合された第１のＤＮＡ結合モジュールを含む第１のタンパク質、並びに統合の部位において結合し、逆転写及びエンドヌクレアーゼモジュールに融合される第２のＤＮＡ結合モジュールを含む第２のタンパク質を使用する場合、それがＤＮＡ上で結合する場合のみ活性である。いくつかの実施形態において、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質が、２つの別個の遺伝子から発現され、翻訳された後、タンパク質スプライシングによって融合されるように、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸は、インテインを含む。いくつかの実施形態において、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、非ＬＴＲタンパク質、例えば、Ｒ２タンパク質に由来する。
一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼドメインのみを有してもよい。一部の実施形態では、単一ポリペプチドを含む２つのサブユニットは、相補的機能を提供してもよい。
一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼの機能性が欠如してもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼドメインが欠如してもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素活性のみを有してもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素ドメインのみを有してもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成の機能性のみを有してもよい。
リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムのドメイン（例えば、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ及び逆転写酵素ドメイン又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン及び逆転写酵素ドメイン）は、リンカーにより連結され得る。リンカーエレメントを含む本明細書に記載の組成物は、一般的形態Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有し、ここで、Ｓ１及びＳ２は、同じであるか又は異なり得、リンカーで互いに結合された２つの部分（例えば、各々、ポリペプチド又は核酸ドメイン）を呈示する。一部の実施形態では、リンカーは、２つのポリペプチドを連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、２つの核酸分子を連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドと核酸分子を連結し得る。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であってよい。リンカーは、柔軟、剛直、及び／又は切断可能であってよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。概して、ペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれを超えるアミノ酸長、例えば、２～５０アミノ酸長、２～３０アミノ酸長である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムのドメイン（例えば、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ及び逆転写酵素ドメイン又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン及び逆転写酵素ドメイン）は、リンカーにより連結され得る。リンカーエレメントを含む本明細書に記載の組成物は、一般的形態Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有し、ここで、Ｓ１及びＳ２は、同じであるか又は異なり得、リンカーで互いに結合された２つの部分（例えば、各々、ポリペプチド又は核酸ドメイン）を呈示する。一部の実施形態では、リンカーは、２つのポリペプチドを連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、２つの核酸分子を連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドと核酸分子を連結し得る。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であってよい。リンカーは、柔軟、剛直、及び／又は切断可能であってよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。概して、ペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれを超えるアミノ酸長、例えば、２～５０アミノ酸長、２～３０アミノ酸長である。
最も一般的に使用される柔軟リンカーは、主としてＧｌｙ及びＳｅｒ残基の区間からなる配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。柔軟リンカーは、ある程度の移動又は相互作用を必要とするドメインの連結に有用であると考えられ、小さい無極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴｈｒの組込みは、水分子を用いて水素結合を形成することにより、水溶液中のリンカーの安定性を維持することもできるため、リンカーと他の部分との好ましくない相互作用を低減することができる。こうしたリンカーの例としては、構造［ＧＧＳ］≧１又は［ＧＧＧＳ］≧１（配列番号１５３６）を有するものが挙げられる。剛直リンカーは、ドメイン間の定距離を保持すると共に、それらの独立の機能を維持するのに有用である。剛直リンカーは、薬剤中の１つ若しくは複数の成分の安定性又は生物活性を保存するためにドメインの空間的分離が不可欠である場合にも有用となり得る。剛直リンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎを有し得る（Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、若しくはＧｌｕを指す）。切断可能なリンカーは、遊離機能性ドメインをインビボで放出し得る。一部の実施形態では、リンカーは、特定の条件下、例えば、還元剤又はプロテアーゼの存在下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を利用する場合がある。一例として、２つのＣｙｓ残基の間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）がある。ＣＰＲＳＣ（配列番号１５３７）のインビトロトロンビン処理により、トロンビン感受性配列の切断が起こるのに対し、可逆性ジスルフィド結合はインタクトなままである。こうしたリンカーは、周知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。本明細書に記載の組成物中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞若しくは組織において、病状（例えば、癌若しくは炎症）下、インビボで発現されるか、又は特定の細胞コンパートメント内に拘束されたプロテアーゼによっても実施され得る。様々なプロテアーゼの特異性により、拘束されたコンパートメント内のリンカーの緩徐な切断が可能になる。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、天然のポリペプチド内のこうしたドメインの間に存在する内在性アミノ酸（又はそれらと相同性）である。一部の実施形態では、そのようなドメインの間に存在する内在性アミノ酸は、置換されているが、長さは天然の長さから不変である。一部の実施形態では、ドメイン間に天然に存在するアミノ酸残基に、追加のアミノ酸残基が付加される。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、タンパク質機能を最大化するように、コンピューターにより設計されるか、又はスクリーニングされる（Ａｎａｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８７：１９，２０１３）。
単一の転写産物上で完全にコードされることに加えて、ポリペプチドは、一般に、ホロ酵素を再構成する２つ以上のポリペプチドフラグメントを別々に発現させることによって生成され得る。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、操作タンパク質間相互作用によってホロ酵素を再構築する別個のサブユニットとして発現させることによって生成される。いくつかの実施形態において、ホロ酵素の再構成は、サブユニット間の共有結合を含まない。ペプチドはまた、インテインのトランススプライシングによって一緒に融合し得る（Ｔｏｒｎａｂｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １１，ｅａａｖ４５２３（２０１９））。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒホロ酵素は、サブユニットにおけるスプリットインテインの存在によって融合タンパク質を生成するように設計される別個のサブユニットとして発現される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒホロ酵素は、サブユニット間の共有結合の形成によって再構成される。いくつかの実施形態において、タンパク質サブユニットは、操作タンパク質－タンパク質結合パートナー、例えば、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒによって再構築される（Ｚａｋｅｒｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０９，Ｅ６９０－Ｅ６９７（２０１２））。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるさらなるドメイン、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、上述されるように共有又は非共有相互作用によってＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドと結合する別個のポリペプチドとして発現される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの、サブユニットへの分解は、各部分をコードする核酸を、ウイルス送達ベクター、例えば、ＡＡＶの最適なパッケージング限度内に保持することによって、タンパク質の送達を助け得る（Ｔｏｒｎａｂｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １１，ｅａａｖ４５２３（２０１９））。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、上述されるように共有又は非共有相互作用の使用によって二量体化されるように設計される。
他のタイプの逆転写機械、例えば、レトロウイルスＲＴ及びＬＴＲレトロトランスポゾンと対照的に、非ＬＴＲレトロトランスポゾン様Ｒ２における逆転写が、特定の認識配列を含むＲＮＡ鋳型のみに対して行われる。Ｒ２レトロトランスポザーゼは、ＴＰＲＴを開始させるために最小３’ＵＴＲ領域を含むその鋳型を必要とする（Ｌｕａｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５，３８８２－９１（１９９５））。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、必要とされる結合モチーフを有するレトロトランスポザーゼに由来し、鋳型ＲＮＡは、所望の鋳型のみの特定のレトロトランスポジションがあるように、前記結合モチーフを含むように設計される（例えば、実施例２２を参照）。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、表３から選択されるレトロトランスポゾンに由来し、ＲＮＡ鋳型上の３’ＵＴＲは、表３中の同じレトロトランスポゾンからの３’ＵＴＲを含む。
いくつかの可動要素が、非自己要素を移動させることが可能であり、例えば、Ｌ１レトロトランスポザーゼが、ヒトゲノム中の非自律的Ａｌｕ及びＳＶＡ要素の移動を促進することは、公知の現象である（Ｃｒａｉｇ，Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩＩ，ＡＳＭ，ｅｄ．３（２１０５））。最近の研究は、非ＬＴＲレトロトランスポゾンを含む、ヒトゲノム中に存在する様々な転位因子をマッピングした（Ｋｏｊｉｍａ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ９（２０１８））。ヒトゲノムにおける活性転位が疾患に関連付けられている、例えば、腫瘍形成におけるＬＩＮＥ－１レトロトランスポジションの役割（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２０２０））を所与とすると、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒが、転位因子又は疑似要素を認識せず、動員しないことが望ましい。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、任意の内因性ヒトＤＮＡの動員を引き起こさない。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ヒトゲノム中に存在しないレトロトランスポザーゼに由来する。いくつかの実施形態において、ヒトゲノム中に存在するレトロトランスポザーゼに由来するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（例えば、Ｋｏｊｉｍａ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ９（２０１８）を参照）は、それが鋳型ＲＮＡ中の異種配列を認識し、親レトロトランスポゾンの天然ＵＴＲをもはや認識しないように操作され、例えば、ヒトゲノム中に存在する３’ＵＴＲと結合しない異種ＲＮＡ結合ドメインを有する。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ヒトゲノム中に存在するいずれの配列も認識しないＲＮＡ結合ドメインを含む。
タンパク質発現を最適化するために、タンパク質活性を調節するのに使用され得る調節可能な対照を提供することが有益であり得る。いくつかの実施形態において、調節可能なシステムは、少なくとも１つの刺激に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを含み得る。システムは、限定はされないが、不安定化ドメイン（ＤＤ）システムであり得る。このシステムは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書、並びに２０１６年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／３２０，８６４号明細書、２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６６，５９６号明細書、及び国際公開第２０１７／１８０５８７号パンフレット（これらのそれぞれの内容は、全体が参照により本明細書に援用される）においてさらに教示される。いくつかの実施形態において、調節可能なシステムは、第１のエフェクターモジュールを含み得る。いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、少なくとも１つのペイロードに動作可能に連結された第１の刺激応答要素（ＳＲＥ）を含み得る。一態様において、ペイロードは、免疫療法薬であり得る。一態様において、組成物の第１のＳＲＥは、少なくとも１つの刺激に応答するか又はそれと相互作用し得る。いくつかの実施形態において、第１のＳＲＥは、不安定化ドメイン（ＤＤ）を含み得る。ＤＤは、親タンパク質又は親タンパク質と比較して１、２、３つ、若しくはそれ以上のアミノ酸突然変異を有する突然変異タンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態において、親タンパク質は、限定はされないが、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書の配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトタンパク質ＦＫＢＰ；全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＤＨＦＲ（ｈＤＨＦＲ）；全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書の配列番号１のアミノ酸配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＦＲ；全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書の配列番号４のアミノ酸配列を含むＰＤＥ５；全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書の配列番号５のアミノ酸配列を含むＰＰＡＲ、γ；全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書の配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＡ２；又は全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０７０４号明細書の配列番号７のアミノ酸配列を含むＮＱ０２から選択され得る。いくつかの実施形態において、調節可能な対照は、例えば、ＤＤ及び刺激が、鋳型統合効率を調節するのに使用され得るように、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドに適用される。いくつかの実施形態において、調節可能な対照は、例えば、ＤＤ及び刺激が、ゲノム的に統合されたペイロードの活性を調節するのに使用され得るように、鋳型の異種対象配列内にコードされる１つ以上のペプチドに適用される。特定の実施形態において、ＤＤを含むペイロードは、治療用タンパク質、例えば、内因的に突然変異された遺伝子の機能的コピーであり得る。特定の実施形態において、ＤＤを含むペイロードは、異種タンパク質、例えば、ＣＡＲであり得る。
本明細書に提供されるシステム及び方法において使用される際、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓ（商標）は、ポリペプチド、又はそれらをコードする核酸のいずれかとして提供され得る。
核酸の特徴
本発明によって提供されるシステムの要素は、特に、特許請求の範囲及び列挙される実施形態に記載されるような核酸、例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）、並びに、特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド（例えば、レトロトランスポザーゼ）をコードする核酸として提供され得る。様々な実施形態において、核酸は、組織特異的発現制御配列（例えば、組織特異的プロモーター及び組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列）などのさらなる遺伝因子、並びにさらなる要素、例えば、反転リピート（例えば、ウイルス、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲからの又はそれに由来する要素などの反転末端リピート）及びタンデムリピート、相同性領域（標的ＤＮＡに対する様々な程度の相同性を有するセグメント）、ＵＴＲ（５’、３’、又は両方５’及び３’ＵＴＲ）、並びに上記の様々な組合せと動作可能に結合している。本発明によって提供されるシステムの核酸要素は、一本鎖、二本鎖、環状、線状、開放末端を有する線状、閉鎖末端を有する線状、及びこれらの特定の形態、例えば、ドギーボーンＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ）、閉鎖末端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含む様々なトポロジーで提供され得る。
本発明によって提供されるシステムの要素は、特に、特許請求の範囲及び列挙される実施形態に記載されるような核酸、例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）、並びに、特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド（例えば、レトロトランスポザーゼ）をコードする核酸として提供され得る。様々な実施形態において、核酸は、組織特異的発現制御配列（例えば、組織特異的プロモーター及び組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列）などのさらなる遺伝因子、並びにさらなる要素、例えば、反転リピート（例えば、ウイルス、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲからの又はそれに由来する要素などの反転末端リピート）及びタンデムリピート、相同性領域（標的ＤＮＡに対する様々な程度の相同性を有するセグメント）、ＵＴＲ（５’、３’、又は両方５’及び３’ＵＴＲ）、並びに上記の様々な組合せと動作可能に結合している。本発明によって提供されるシステムの核酸要素は、一本鎖、二本鎖、環状、線状、開放末端を有する線状、閉鎖末端を有する線状、及びこれらの特定の形態、例えば、ドギーボーンＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ）、閉鎖末端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含む様々なトポロジーで提供され得る。
いくつかの特定の実施形態において、組織特異的発現制御配列は、参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３（その最後の列を除く）（配列番号参照）；又は参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４（その最後の列を除く）（配列番号参照）中の配列の１つ以上を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸（例えば、レトロトランスポザーゼをコードする鋳型核酸又は鋳型）は、プロモーター配列、例えば、組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの標的細胞特異性を増加させるのに使用される。例えば、プロモーターは、それが標的細胞型において活性であるが、非標的細胞型において活性でない（又はより低いレベルで活性である）ことに基づいて選択され得る。したがって、ポリペプチドをコードする核酸が、非標的細胞中に送達されたとしても、それは、レトロトランスポザーゼの発現を駆動せず（又は低いレベルの発現を駆動するに過ぎない）、ＲＮＡ鋳型の統合を抑える。レトロトランスポザーゼＤＮＡ中の組織特異的プロモーター配列を有するシステムがまた、例えば、本明細書に記載されるような、例えば、レトロトランスポザーゼＤＮＡ中でコードされる、マイクロＲＮＡ結合部位と組み合わせて使用され得る。レトロトランスポザーゼＤＮＡ中の組織特異的プロモーター配列を有するシステムがまた、例えば、非標的細胞内より標的細胞内でより高いレベルの統合及び異種対象配列発現を達成するために、組織特異的プロモーターによって駆動される異種対象配列を含有するＲＮＡ鋳型と組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＲＮＡ、又はＲＮＡをコードするＤＮＡ、又は鋳型核酸）は、マイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの標的細胞特異性を増加させるのに使用される。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位は、それが非標的細胞型中に存在するｍｉＲＮＡによって認識されるが、標的細胞型中に存在しない（又は非標的細胞と比べて低下したレベルで存在する）ことに基づいて選択され得る。したがって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＲＮＡが、非標的細胞中に存在するとき、それが、ｍｉＲＮＡによって結合され得、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＲＮＡが、標的細胞中に存在するとき、それが、ｍｉＲＮＡによって結合されない（又は結合されるが、非標的細胞と比べて低下したレベルで結合される）。理論によって制約されるのを望むものではないが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＲＮＡへのｍｉＲＮＡの結合が、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを分解することによって、又は翻訳を妨げることによって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドの生成を減少させ得る。したがって、異種対象配列は、非標的細胞のゲノム中より効率的に標的細胞のゲノム中に挿入されるであろう。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＲＮＡ中のマイクロＲＮＡ結合部位を有するシステム（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ中でコードされる）はまた、例えば、「Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムの鋳型成分」という表題の節において本明細書に記載されるような、第２のマイクロＲＮＡ結合部位によって調節される鋳型ＲＮＡと組み合わせて使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の配列（例えば、レトロトランスポザーゼ又は異種対象配列）によって提供されるシステムの核酸成分は、タンパク質発現レベルを調節する非翻訳領域（ＵＴＲ）（ＵＴＲｅｘｐと呼ばれることもある）（図１１及び１５、実施例６）によって隣接される。タンパク質発現に対する様々な５’及び３’ＵＴＲの影響は、当該技術分野において公知である。例えば、いくつかの実施形態において、コード配列は、ＲＮＡ安定性又はタンパク質翻訳を調節する５’ＵＴＲが前に付き得る。いくつかの実施形態において、この配列は、ＲＮＡ安定性又は翻訳を調節する３’ＵＴＲが後ろに付き得る。いくつかの実施形態において、この配列は、５’ＵＴＲが前に付き、ＲＮＡ安定性又は翻訳を調節する３’ＵＴＲが後ろに付き得る。いくつかの実施形態において、５’及び／又は３’ＵＴＲは、補体因子３（Ｃ３）（ｃａｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｃｔｃｔｃｃｃｔｃｔｇｔｃｃｃｔｃｔｇｔｃｃｃｔｃｔｇａｃｃｃｔｇｃａｃｔｇｔｃｃｃａｇｃａｃｃ（配列番号１６０６））又はオロソムコイド１（ＯＲＭ１）（ｃａｇｇａｃａｃａｇｃｃｔｔｇｇａｔｃａｇｇａｃａｇａｇａｃｔｔｇｇｇｇｇｃｃａｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｃｃａａｃｃｃｇａｃａｔｇｔｇｔａｃｃｔｃａｇｃｔｔｔｔｔｃｃｃｔｃａｃｔｔｇｃａｔｃａａｔａａａｇｃｔｔｃｔｇｔｇｔｔｔｇｇａａｃａｇｃｔａａ（配列番号１６０７））の５’及び３’ＵＴＲから選択され得る（Ａｓｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１８）。特定の実施形態において、５’ＵＴＲは、Ｃ３からの５’ＵＴＲであり、３’ＵＴＲは、ＯＲＭ１からの３’ＵＴＲである。
特定の実施形態において、タンパク質発現のための５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又は異種対象配列のためのｍＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、最適化された発現配列を含む。いくつかの実施形態において、例えば、配列が参照により本明細書に援用されるＲｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）に記載されるように、５’ＵＴＲは、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１６０８）を含み、及び／又は３’ＵＴＲは、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号１６０９）を含む。
いくつかの実施形態において、５’及び／又は３’ＵＴＲは、タンパク質発現を強化するように選択され得る。いくつかの実施形態において、５’及び／又は３’ＵＴＲは、過剰産生阻害が最小限に抑えられるように、タンパク質発現を調節するように選択され得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、コード配列の周り、例えば、コード配列の外側、及び他の実施形態において、コード配列の近位にあり、いくつかの実施形態において、さらなる調節要素（例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位、ｃｉｓ調節部位）が、ＵＴＲに含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（又はｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）のＯＲＦ又は異種対象配列のｍＲＮＡ（又はｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）の１つ以上のＯＲＦが、その発現を強化する５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）によって隣接される。いくつかの実施形態において、システムのｍＲＮＡ成分の５’ＵＴＲ（又はＤＮＡ成分から生成される転写産物）は、配列５’－ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ－３’（配列番号１６１０）を含む。いくつかの実施形態において、システムのｍＲＮＡ成分の３’ＵＴＲ（又はＤＮＡ成分から生成される転写産物）は、配列５’－ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ－３’（配列番号１６１１）を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのこの組合せが、教示及び配列が参照により本明細書に援用されるＲｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）によって動作可能に連結されたＯＲＦの望ましい発現をもたらすことが示されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、転写産物をコードするＤＮＡを含み、ここで、ＤＮＡは、上に列挙される配列中でＴをＵと置き換えて、対応する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列を含む）。いくつかの実施形態において、システムのＲＮＡ成分を生成するのに使用されるＤＮＡベクターは、インビトロ転写を開始させるための５’ＵＴＲの上流のプロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーターをさらに含む。上記の５’ＵＴＲは、ＧＧＧから開始し、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を最適化するための好適な開始である。転写レベルを調整し、代替的な５’ＵＴＲに適合するように転写開始部位ヌクレオチドを改変するために、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ ４３３－４４３（２０１０）の教示が、これらの特質の両方を達成する、Ｔ７プロモーター変異体、及びその発見方法を記載する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム中の環状ＲＮＡ
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、細胞中に天然に存在することが分かっており、ヒト細胞における非コード及びタンパク質コードの役割の両方を含む多様な機能を有することが分かっている。ｃｉｒｃＲＮＡが、自己スプライシングイントロンを、ＲＮＡの環状化をもたらすＲＮＡ分子（又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ）に組み込むことによって操作され得ること、及び操作ｃｉｒｃＲＮＡが、強化されたタンパク質生成及び安定性を有し得ることが示されている（Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８）。標的細胞内での配合、送達、又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ反応中に環状及び／又は線状ＲＮＡ状態を用いることが有用であり得ることが考えられる。したがって、本明細書に記載される態様のいずれかのいくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、１つ以上の環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を含む。本明細書に記載される態様のいずれかのいくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、１つ以上の線状ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、又は両方をコードする核酸分子）は、ｃｉｒｃＲＮＡである。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、宿主細胞に送達される。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるような、レコンビナーゼをコードする。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、宿主細胞に送達される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、翻訳前に線形化される（例えば、宿主細胞内で）。
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、細胞中に天然に存在することが分かっており、ヒト細胞における非コード及びタンパク質コードの役割の両方を含む多様な機能を有することが分かっている。ｃｉｒｃＲＮＡが、自己スプライシングイントロンを、ＲＮＡの環状化をもたらすＲＮＡ分子（又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ）に組み込むことによって操作され得ること、及び操作ｃｉｒｃＲＮＡが、強化されたタンパク質生成及び安定性を有し得ることが示されている（Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８）。標的細胞内での配合、送達、又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ反応中に環状及び／又は線状ＲＮＡ状態を用いることが有用であり得ることが考えられる。したがって、本明細書に記載される態様のいずれかのいくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、１つ以上の環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を含む。本明細書に記載される態様のいずれかのいくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、１つ以上の線状ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、又は両方をコードする核酸分子）は、ｃｉｒｃＲＮＡである。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、宿主細胞に送達される。いくつかの実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるような、レコンビナーゼをコードする。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、宿主細胞に送達される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、翻訳前に線形化される（例えば、宿主細胞内で）。
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、若しくは鋳型ＲＮＡ、又は両方をコードする）は、ｃｉｒｃＲＮＡとして提供される。いくつかの実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上のリボザイム配列を含む。いくつかの実施形態において、リボザイム配列は、例えば、宿主細胞内で、自己切断のために活性化され、例えば、それによって、ｃｉｒｃＲＮＡの線形化をもたらす。いくつかの実施形態において、リボザイムは、マグネシウムの濃度が、例えば、宿主細胞内で、切断のために十分なレベルに達したときに活性化される。いくつかの実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、宿主細胞への送達の前に、低いマグネシウム環境中に維持される。いくつかの実施形態において、リボザイムは、タンパク質応答性リボザイムである。いくつかの実施形態において、リボザイムは、核酸応答性リボザイムである。
いくつかの実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、標的細胞の核内で線形化される。いくつかの実施形態において、細胞の核内でのｃｉｒｃＲＮＡの線形化は、例えば、切断事象を活性化するための細胞の核内に存在する成分を含む。例えば、Ｂ２及びＡＬＵレトロトランスポゾンは、活性がＰｏｌｙｃｏｍｂタンパク質、ＥＺＨ２との相互作用によって強化される自己切断リボザイムを含有する（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１７（１）：４１５－４２５（２０２０））。したがって、いくつかの実施形態において、核内要素、例えば、核タンパク質、例えば、ゲノム相互作用タンパク質、例えば、エピジェネティック修飾因子、例えば、ＥＺＨ２に応答する、リボザイム、例えば、Ｂ２又はＡＬＵ要素からのリボザイムが、例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡに組み込まれる。いくつかの実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡの核局在化は、リボザイムの自己触媒活性及びｃｉｒｃＲＮＡの線形化の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、誘導性リボザイム（例えば、本明細書に記載されるｃｉｒｃＲＮＡ中の）は、例えば、タンパク質リガンド応答性アプタマー設計を用いるすることによって、合成的に生成される。ＭＳ２コートタンパク質の存在下でリボザイム活性の活性化をもたらす、ＭＳ２コートタンパク質アプタマーとともにタバコ輪点ウイルスハンマーヘッド型リボザイムのサテライトＲＮＡを用いるためのシステムが記載されている（全体が参照により本明細書に援用されるＫｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２（１９）：１２３０６－１２３２１（２０１４））。実施形態において、このようなシステムは、細胞質又は核に局在化されたタンパク質リガンドに応答する。いくつかの実施形態において、タンパク質リガンドは、ＭＳ２でない。標的リガンドに対するＲＮＡアプタマーを生成するための方法が、例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）に基づいて記載されており（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（４９６８）：５０５－５１０（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６（６２８７）：８１８－８２２（１９９０）；そのそれぞれの方法が参照により本明細書に援用される）、ある場合に、インシリコ設計によって支援されている（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１７（１５）：８４８６－８４９３、その方法が参照により本明細書に援用される）。したがって、いくつかの実施形態において、標的リガンドのためのアプタマーが、生成され、例えば、タンパク質リガンドの存在下で、例えば、リボザイム媒介性切断及びｃｉｒｃＲＮＡ線形化を引き起こすために、合成リボザイムシステムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ線形化は、例えば、細胞質内のリガンドと結合するアプタマーを用いて、細胞質内で引き起こされる。いくつかの実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ線形化は、例えば、核内でリガンドと結合するアプタマーを用いて、核内で引き起こされる。実施形態において、核中のリガンドは、エピジェネティック修飾因子又は転写因子を含む。いくつかの実施形態において、線形化を引き起こすリガンドは、オフターゲットの細胞よりオンターゲットの細胞内により高いレベルで存在する。
核酸応答性リボザイムシステムが、ｃｉｒｃＲＮＡ線形化のために用いられ得ることがさらに考えられる。例えば、リボザイム活性化を引き起こす所定の標的核酸分子を感知するバイオセンサが、例えば、Ｐｅｎｃｈｏｖｓｋｙ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３２（５）：１０１５－１０２７（２０１４）、参照により本明細書に援用される）に記載される。これらの方法によって、リボザイムは、自然に折り畳まれて、不活性状態になり、所定の標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の存在下でのみ活性化される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡは、所定の標的核酸、例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、又はｍｔＲＮＡの存在下で活性化される核酸応答性リボザイムを含む。いくつかの実施形態において、線形化を引き起こす核酸は、オフターゲットの細胞よりオンターゲットの細胞内により高いレベルで存在する。
本明細書における態様のいずれかのいくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、対象とする標的組織又は標的細胞に対する誘導性特異性を有する１つ以上のリボザイム、例えば、対象とする標的組織又は標的細胞内により高いレベルで存在するリガンド又は核酸によって活性化されるリボザイムを組み込む。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、細胞内コンパートメント、例えば、核、核小体、細胞質、又はミトコンドリアに対する誘導性特異性を有するリボザイムを組み込む。いくつかの実施形態において、標的細胞内コンパートメント内により高いレベルで存在するリガンド又は核酸によって活性化されるリボザイム。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのＲＮＡ成分は、例えば、線形化によって活性化されるｃｉｒｃＲＮＡとして提供される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡの線形化が、翻訳のために分子を活性化する。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡ成分を活性化するシグナルは、オンターゲットの細胞又は組織中により高いレベルで存在し、例えば、システムが、これらの細胞内で特異的に活性化されるようになっている。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのＲＮＡ成分は、線形化によって不活性化されるｃｉｒｃＲＮＡとして提供される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡは、切断及び分解によって不活性化される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡは、ポリペプチドのコード配列から翻訳シグナルを分離する切断によって不活性化される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡ成分を不活性化するシグナルは、オフターゲットの細胞又は組織中により高いレベルで存在し、システムが、これらの細胞内で特異的に不活性化されるようになっている。
いくつかの実施形態において、細胞に送達される核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする、又は鋳型ＲＮＡ、又は両方をコードする）は、共有結合的に閉鎖された線状ＤＮＡ、又はいわゆる「ドギーボーン」ＤＮＡである。その周期中、バクテリオファージＮ１５は、プロテロメラーゼを用いて、そのゲノムを、環状プラスミドＤＮＡから線状プラスミドＤＮＡに変換する（Ｒａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００１）。このプロセスは、インビトロでの共有結合的に閉鎖された線状ＤＮＡの生成のために適合されている（例えば、国際公開第２０１００８６６２６Ａ１号パンフレットを参照）。いくつかの実施形態において、プロテロメラーゼが、１つ以上のプロテロメラーゼ認識部位を含有するＤＮＡと接触され、ここで、プロテロメラーゼが、ＤＮＡの相補鎖の１つ以上の部位における切断及びその後のライゲーションをもたらし、相補鎖間の共有結合をもたらす。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする、又は鋳型ＲＮＡ、又は両方をコードする）が、共有結合的に閉鎖された線状ＤＮＡを得るためにプロテロメラーゼと接触される単一のプロテロメラーゼ認識部位を含有する環状プラスミドＤＮＡとしてまず生成される。いくつかの実施形態において、プラスミド又は線状ＤＮＡ上のプロテロメラーゼ認識部位によって隣接される核酸（例えば、トランスポザーゼをコードする、又は鋳型ＲＮＡ、又は両方をコードする）が、プロテロメラーゼ認識部位間に含まれるＤＮＡの身を含有する共有結合的に閉鎖された線状ＤＮＡを生成するために、プロテロメラーゼと接触される。いくつかの実施形態において、プロテロメラーゼ認識部位によって所望の核酸配列に隣接する手法は、細菌のクローニング及び維持に使用されるプラスミド要素を欠く共有結合閉環状ＤＮＡをもたらす。いくつかの実施形態において、核酸及び１つ以上のプロテロメラーゼ認識部位を含有するプラスミド又は線状ＤＮＡは、例えば、ローリングサークル増幅又はＰＣＲによって、プロテロメラーゼ反応の前に任意選択で増幅される。
いくつかの実施形態において、細胞に送達される核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする、又は鋳型ＲＮＡ、又は両方をコードする）は、閉鎖末端、線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ ＤＮＡ又はｃｅＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡは、ＡＡＶゲノムの複製型に由来する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３）。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする、又は鋳型ＲＮＡ、又は両方をコードする）は、ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接され、ここで、ＩＴＲの少なくとも１つが、末端解離部位及び複製タンパク質結合部位（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）（複製タンパク質結合部位（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）と呼ばれることもある）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はそれらの組合せに由来する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、対称である。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、非対称である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質は、構築物の複製を可能にするために提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質は、アデノ随伴ウイルス、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はそれらの組合せに由来する。いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡは、生成細胞に、（ｉ）ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接されるＤＮＡ、及び（ｉｉ）ＩＴＲ依存性複製に必要とされる成分、例えば、ＡＡＶタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２（又はタンパク質をコードする核酸）を提供することによって生成される。いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡは、任意のカプシドタンパク質を含まず、例えば、感染性ＡＡＶ粒子中にパッケージングされない。いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡは、ＬＮＰ中に配合される（例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ１号パンフレットを参照）。
いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターは、前記発現カセットに隣接する、２つの自己相補的配列、例えば、本明細書において定義される非対称又は対称又は実質的に対称なＩＴＲからなり、ここで、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドタンパク質と結合されない。いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中に見られる２つの自己相補的配列を含み、ここで、少なくとも１つのＩＴＲは、動作性Ｒｅｐ結合要素（ＲＢＥ）（本明細書において「ＲＢＳ」と呼ばれることもある）及びＡＡＶの末端解離部位（ｔｒｓ）又はＲＢＥの機能的変異体を含む。例えば、国際公開第２０１９１１３３１０号パンフレットを参照されたい。
いくつかの実施形態において、細胞に送達される核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする、又は鋳型ＲＮＡ、又は両方をコードする）は、ミニサークルとして設計され、ここで、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）に関連しないプラスミド骨格配列は、細胞への投与前に除去される。ミニサークルは、細菌部分（例えば、細菌複製起点、抗生物質選択カセット）を含有する骨格を有するプラスミドと比較してより高いトランスフェクション効率及び遺伝子発現をもたらすことが示されており、転位の効率を改善するのに使用されており（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１３）。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターは、ミニサークルとして送達される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型をコードするＤＮＡベクターは、ミニサークルとして送達される。いくつかの実施形態において、細菌部分は、組換え部位、例えば、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ部位によって隣接される。いくつかの実施形態において、同種レコンビナーゼの付加は、分子内組換え及び細菌部分の除去をもたらす。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼ部位は、ｐｈｉＣ３１レコンビナーゼによって認識される。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅレコンビナーゼによって認識される。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼ部位は、ＦＬＰレコンビナーゼによって認識される。プラスミドＤＮＡに加えて、ミニサークルは、ウイルス骨格から、所望の構築物、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド発現カセット又は鋳型ＲＮＡ発現カセットを除去することによって生成され得る。以前に、ウイルス骨格からのドナー配列の除去及び環状化が、トランスポザーゼ媒介性統合効率のために重要であり得ることが示されている（Ｙａｎｔ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２）。いくつかの実施形態において、ミニサークルは、まず、配合され、次に、標的細胞に送達される。他の実施形態において、ミニサークルは、レコンビナーゼの共送達によって細胞内にＤＮＡベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ、ｒＡＡＶ、ｓｃＡＡＶ、ｃｅＤＮＡ、ドギーボーンＤＮＡ）から形成されで、レコンビナーゼ認識部位隣接核酸、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードする、又はＲＮＡ鋳型、又は両方をコードする核酸の除去及び環状化をもたらす。
ウイルスベクター及びその成分
ウイルスは、本明細書において使用されるポリメラーゼ及びポリメラーゼ機能、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素の供給源として、本明細書に記載される関連酵素又はドメインの供給源に加えて、本明細書に記載されるシステムのための送達ビヒクルの有用な供給源である。いくつかの酵素、例えば、逆転写酵素は、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合及びＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合の両方、例えば、第１及び第２の鎖合成を行うことが可能な複数の活性を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ送達システム又はその構成要素の供給源として使用されるウイルスは、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ ３５（３）：２３５－２４１（１９７１）によって記載される群から選択され得る。
ウイルスは、本明細書において使用されるポリメラーゼ及びポリメラーゼ機能、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素の供給源として、本明細書に記載される関連酵素又はドメインの供給源に加えて、本明細書に記載されるシステムのための送達ビヒクルの有用な供給源である。いくつかの酵素、例えば、逆転写酵素は、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合及びＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合の両方、例えば、第１及び第２の鎖合成を行うことが可能な複数の活性を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ送達システム又はその構成要素の供給源として使用されるウイルスは、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ ３５（３）：２３５－２４１（１９７１）によって記載される群から選択され得る。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、グループＩウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｄｓＤＮＡをビリオンへとパッケージングする。いくつかの実施形態において、グループＩウイルスは、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスから選択される。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、グループＩＩウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｓｓＤＮＡをビリオンへとパッケージングする。いくつかの実施形態において、グループＩＩウイルスは、例えば、パルボウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、パルボウイルスは、デペンドパルボウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、グループＩＩＩウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｄｓＲＮＡをビリオンへとパッケージングする。いくつかの実施形態において、グループＩＩＩウイルスは、例えば、Ｒｅｏウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、このようなビリオンに含まれるｄｓＲＮＡの１つ又は両方の鎖は、宿主細胞中への形質導入時にｍＲＮＡとして直接働くことが可能なコード分子であり、例えば、何らかの介在する核酸複製又は重合工程を必要とせずに、宿主細胞中への形質導入時にタンパク質中へと直接翻訳され得る。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、グループＩＶウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンへとパッケージングする。いくつかの実施形態において、グループＩＶウイルスは、例えば、コロナウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、このようなビリオンに含まれるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞中への形質導入時にｍＲＮＡとして直接働くことが可能なコード分子であり、例えば、何らかの介在する核酸複製又は重合工程を必要とせずに、宿主細胞中への形質導入時にタンパク質中へと直接翻訳され得る。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、グループＶウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（－）をビリオンへとパッケージングする。いくつかの実施形態において、グループＶウイルスは、例えば、オルトミクソウイルス、ラブドウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、ｓｓＲＮＡ（－）ゲノムを有するＲＮＡウイルスはまた、ウイルスゲノムとともに宿主細胞に導入されるビリオンの内部の酵素、例えば、宿主によって直接翻訳され得るｓｓＲＮＡ（＋）へとｓｓＲＮＡ（－）を複製することが可能なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有する。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、グループＶＩウイルスから選択され、例えば、レトロウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンへとパッケージングする。いくつかの実施形態において、グループＶＩウイルスは、例えば、レトロウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶである。いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、スプマウイルス、例えば、泡沫状ウイルス、例えば、ＨＦＶ、ＳＦＶ、ＢＦＶである。いくつかの実施形態において、このようなビリオンに含まれるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞中への形質導入時にｍＲＮＡとして直接働くことが可能なコード分子であり、例えば、何らかの介在する核酸複製又は重合工程を必要とせずに、宿主細胞中への形質導入時にタンパク質中へと直接翻訳され得る。いくつかの実施形態において、ｓｓＲＮＡ（＋）は、まず、逆転写され、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成するように複製され、それから、ｍＲＮＡが、宿主細胞内で転写され得る。いくつかの実施形態において、ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムを有するＲＮＡウイルスはまた、ウイルスゲノムとともに宿主細胞に導入されるビリオンの内部の酵素、例えば、ｍＲＮＡ中に転写され、宿主によって翻訳され得るｄｓＤＮＡへとｓｓＲＮＡ（＋）を複製することが可能なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する。いくつかの実施形態において、グループＶＩレトロウイルスからの逆転写酵素が、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの逆転写酵素ドメインとして組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、グループＶＩＩウイルスから選択され、例えば、レトロウイルスであり、ｄｓＲＮＡをビリオンへとパッケージングする。いくつかの実施形態において、グループＶＩＩウイルスは、例えば、肝炎ウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、このようなビリオンに含まれるｄｓＲＮＡの１つ又は両方の鎖は、宿主細胞中への形質導入時にｍＲＮＡとして直接働くことが可能なコード分子であり、例えば、何らかの介在する核酸複製又は重合工程を必要とせずに、宿主細胞中への形質導入時にタンパク質中へと直接翻訳され得る。いくつかの実施形態において、このようなビリオンに含まれるｄｓＲＮＡの１つ又は両方の鎖は、まず、逆転写され、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成するように複製され、それから、ｍＲＮＡが、宿主細胞内で転写され得る。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡゲノムを有するＲＮＡウイルスはまた、ウイルスゲノムとともに宿主細胞に導入されるビリオンの内部の酵素、例えば、ｍＲＮＡ中に転写され、宿主によって翻訳され得るｄｓＤＮＡへとｄｓＲＮＡを複製することが可能なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する。いくつかの実施形態において、グループＶＩＩレトロウイルスからの逆転写酵素が、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの逆転写酵素ドメインとして組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本発明における核酸を送達するのに使用されるビリオンはまた、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇのプロセスに関与する酵素を有し得る。例えば、レトロウイルスビリオンは、核酸とともに宿主細胞中に送達される逆転写酵素ドメインを含有し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ鋳型は、ビリオン中でＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドと結合され得、両方が、ウイルス粒子からの核酸の形質導入時に標的細胞に共送達されるようになっている。いくつかの実施形態において、ビリオン中の核酸は、ＤＮＡ、例えば、線状ｓｓＤＮＡ、線状ｄｓＤＮＡ、環状ｓｓＤＮＡ、環状ｄｓＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ｄｂＤＮＡ、ｃｅＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ビリオン中の核酸は、ＲＮＡ、例えば、線状ｓｓＲＮＡ、線状ｄｓＲＮＡ、環状ｓｓＲＮＡ、環状ｄｓＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、宿主細胞内への形質導入時に環状化し得、例えば、線状ｓｓＲＮＡ分子は、共有結合を生じて、環状ｓｓＲＮＡを形成し得、線状ｄｓＲＮＡ分子は、共有結合を生じて、環状ｄｓＲＮＡ又は１つ以上の環状ｓｓＲＮＡを形成し得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、宿主細胞内でローリングサークル複製によって複製し得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、単一の核酸分子を含んでもよく、例えば、非セグメント化ゲノムを含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、２つ以上の核酸分子を含んでもよく、例えば、セグメント化ゲノムを含み得る。いくつかの実施形態において、ビリオン中の核酸は、１つ又はタンパク質と結合され得る。いくつかの実施形態において、ビリオン中の１つ以上のタンパク質は、形質導入時に宿主細胞に送達され得る。いくつかの実施形態において、天然ウイルスは、標的核酸へのビリオンパッケージングシグナルの付加によって核酸送達のために適合され得、ここで、宿主細胞が、パッケージングシグナルを含む標的核酸をパッケージングするのに使用される。
いくつかの実施形態において、送達ビヒクルとして使用されるビリオンは、共生ヒトウイルスを含む。いくつかの実施形態において、送達ビヒクルとして使用されるビリオンは、アネロウイルスを含んでもよく、その使用が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１８２３２０１７Ａ１号パンフレットに記載される。
アデノ随伴ウイルス
いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質及び３つのカプシドタンパク質をそれぞれコードする２つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子は、両側で、１４５－ｂｐの反転末端リピート（ＩＴＲ）によって隣接される。いくつかの実施形態において、ビリオンは、例えば、１：１：１０の比率で生成される３つまでのカプシドタンパク質（Ｖｐ１、Ｖｐ２、及び／又はＶｐ３）を含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレームから、及び／又は差動スプライシング（Ｖｐ１）及び選択的翻訳開始部位（それぞれＶｐ２及びＶｐ３）から生成される。一般に、Ｖｐ３は、ビリオン中の最も豊富なサブユニットであり、ウイルスの指向性を規定する細胞表面における受容体認識に関与する。いくつかの実施形態において、Ｖｐ１は、例えば、Ｖｐ１のＮ末端において、ウイルス感染性において機能するホスホリパーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質及び３つのカプシドタンパク質をそれぞれコードする２つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子は、両側で、１４５－ｂｐの反転末端リピート（ＩＴＲ）によって隣接される。いくつかの実施形態において、ビリオンは、例えば、１：１：１０の比率で生成される３つまでのカプシドタンパク質（Ｖｐ１、Ｖｐ２、及び／又はＶｐ３）を含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレームから、及び／又は差動スプライシング（Ｖｐ１）及び選択的翻訳開始部位（それぞれＶｐ２及びＶｐ３）から生成される。一般に、Ｖｐ３は、ビリオン中の最も豊富なサブユニットであり、ウイルスの指向性を規定する細胞表面における受容体認識に関与する。いくつかの実施形態において、Ｖｐ１は、例えば、Ｖｐ１のＮ末端において、ウイルス感染性において機能するホスホリパーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターのパッケージング能力は、ベクターへとパッケージングされ得る塩基エディターのサイズを制限する。例えば、ＡＡＶのパッケージング能力は、例えば、１つ又は２つの反転末端リピート（ＩＴＲ）、例えば、１４５塩基ＩＴＲを含む、約４．５ｋｂ（例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、又は６．０ｋｂ）であり得る。
いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、例えば、外来ＤＮＡのパッケージングのために４．５ｋｂまでを提供する、ｃｉｓ作用性１４５－ｂｐのＩＴＲ隣接ベクター導入遺伝子カセットを含む。感染に続いて、ｒＡＡＶは、ある場合に、本発明の融合タンパク質を発現し、環状頭－尾結合コンカテマー中にエピソームとして存在することによって、宿主ゲノム中への統合なしで持続し得る。ｒＡＡＶは、例えば、インビトロ及びインビボで使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ媒介性遺伝子送達は、遺伝子のコード配列の長さが、野生型ＡＡＶゲノムのサイズと等しいか又はそれより長いことを必要とする。
このサイズを超える遺伝子のＡＡＶ送達及び／又は大きい生理学的調節要素の使用が、例えば、２つ以上のフラグメント中に送達されるようにタンパク質を分割することによって達成され得る。いくつかの実施形態において、Ｎ末端フラグメントは、スプリットインテイン－Ｎに融合される。いくつかの実施形態において、Ｃ末端フラグメントは、スプリットインテイン－Ｃに融合される。実施形態において、フラグメントは、２つ以上のＡＡＶベクター中にパッケージングされる。
いくつかの実施形態において、二重ＡＡＶベクターが、大きい導入遺伝子発現カセットを、２つの別個の半部（５及び３末端、又は頭及び尾）に分割することによって生成され、例えば、ここで、カセットの各半部が、単一のＡＡＶベクター（＜５ｋｂの）中にパッケージングされる。次に、完全長導入遺伝子発現カセットの再構築が、いくつかの実施形態において、両方の二重ＡＡＶベクターによって同じ細胞の共感染時に達成され得る。いくつかの実施形態において、共感染は、（１）５及び３ゲノム間の相同的組換え（ＨＲ）（二重ＡＡＶ重複ベクター）；（２）５及び３ゲノムのＩＴＲ媒介性ｔ尾－頭結合コンカテマー化（二重ＡＡＶトランススプライシングベクター）；及び／又は（３）これらの２つの機構の組合せ（二重ＡＡＶハイブリッドベクター）のうちの１つ以上が後に続く。いくつかの実施形態において、インビボでの二重ＡＡＶベクターの使用は、完全長タンパク質の発現をもたらす。いくつかの実施形態において、二重ＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０ｋｂを超える導入遺伝子のための効率的な及び実行可能な遺伝子導入手法を表す。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターはまた、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生成において、標的核酸を有する細胞を形質導入するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、インビボ及びエクスビボ遺伝子治療手順のために使用され得る（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照；これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）。組換えＡＡＶベクターの構築が、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）（全体が参照により本明細書に援用される）を含むいくつかの刊行物に記載される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（例えば、１つ以上のガイド核酸を有する又は有さない）は、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルスのための配合物、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶのための配合物、用量）及び米国特許第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドのための配合物、用量）からの並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスに関与する臨床試験及び臨床試験に関する刊行物からの配合物及び用量を用いて、ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを用いて送達され得る。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、配合物及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶに関与する臨床試験において記載されるとおりであり得る。アデノウイルスについて、投与経路、配合物及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスに関与する臨床試験において記載されるとおりであり得る。プラスミド送達について、投与経路、配合物及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドに関与する臨床試験において記載されるとおりであり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）に基づくか又はそれから推定され得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物のために調整され得る。投与の頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全体的な健康、他の条件及び対処される特定の病態又は症状を含む通常の要因に応じて、医学又は獣医学の実践者（例えば、医師、獣医）の領域の範囲内である。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、対象とする組織中に注入され得る。細胞型特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇについて、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及び任意選択のガイド核酸の発現は、いくつかの実施形態において、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、例えば、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離法を必要としない精製方法による、低い毒性を可能にする。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、例えば、それが、宿主ゲノム中に実質的に統合しないため、挿入突然変異誘発を引き起こす低い確率を可能にする。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、約４．４、４．５、４．６、４．７、又は４．７５ｋｂのパッケージング限度を有する。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、プロモーター、及び転写ターミネーターは、単一のウイルスベクター中に適合し得る。ＳｐＣａｓ９（４．１ｋｂ）は、ある場合に、ＡＡＶ中にパッケージングするのが困難であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、他のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓ又は塩基エディターより長さが短いＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒが使用される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓは、約４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、又は１．５ｋｂ未満である。
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶのタイプは、標的化される細胞に関して選択される；例えば、ＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せは、標的化脳又は神経細胞のために選択され得；又はＡＡＶ４は、標的化心臓組織のために選択され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８は、肝臓への送達のために選択される。これらの細胞に関して例示的なＡＡＶ血清型が、例えば、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）（全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、全ての血清型、亜型、及び天然ＡＡＶ並びに組換えＡＡＶを指す。ＡＡＶは、ウイルス自体又はその誘導体を指すのに使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ １２、ｒｈｌＯ、及びそのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、並びに天然末端リピート（ＴＲｓ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当該技術分野において公知である。このような配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見出され得る。さらなる例示的なＡＡＶ血清型は、表３６に列挙される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物（例えば、本明細書に記載されるＡＡＶを含む）は、１０％未満の空のカプシド、８％未満の空のカプシド、７％未満の空のカプシド、５％未満の空のカプシド、３％未満の空のカプシド、又は１％未満の空のカプシドを有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約５％未満の空のカプシドを有する。いくつかの実施形態において、空のカプシドの数は、検出限界未満である。いくつかの実施形態において、例えば、空のカプシドは、例えば、実質的な治療効果をほとんど又は全く伴わずに、有害反応（例えば、免疫応答、炎症反応、肝臓反応、及び／又は心臓反応）を生成し得るため、医薬組成物が少量の空のカプシドを有することが有利である。
いくつかの実施形態において、医薬組成物中の残りの宿主細胞タンパク質（ｒＨＣＰ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１００ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ、例えば、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１～５０ｎｇ／ｍｌのｒＨＣＰである。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり５ｎｇ未満のｒＨＣＰ、１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり３ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又はそれらの間の任意の濃度を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物中の残りの宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ、又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌのｈｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物中の残りの宿主細胞ＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ当たり５．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり２．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．０×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．９×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．８×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、又はそれらの間の任意の濃度である。
いくつかの実施形態において、医薬組成物中の残りのプラスミドＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０５ｐｇ／ｍｌ以下、又は１×１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ、又は１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、医薬組成物中の残りのＤＮＡプラスミドは、１．０×１０１３ｖｇ基準で１０．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ基準で８．０×１０５ｐｇ未満又は１．０×１０１３ｖｇ基準で６．８×１０５ｐｇ未満である。実施形態において、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．５ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．３ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満又は１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の任意の中間濃度を含む。実施形態において、医薬組成物中のベンゾエートは、１．０×１０１３ｖｇ基準で０．２ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ基準で０．１ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ基準で０．０９ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ基準で０．０８ｎｇ未満又は任意の中間濃度である。実施形態において、医薬組成物中のポロキサマー１８８は、約１０～１５０ｐｐｍ、約１５～１００ｐｐｍ又は約２０～８０ｐｐｍである。実施形態において、医薬組成物中のセシウムは、５０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満又は２０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満又は任意の中間濃度である。
実施形態において、医薬組成物は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定される際、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又はそれらの間の任意のパーセンテージの総不純物を含む。実施形態において、総純度は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定される際、９０％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又はそれらの間の任意のパーセンテージである。実施形態において、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定される際、５％超、４％超、３％超又は２％超、又はそれらの間の任意のパーセンテージの単一の不明の関連不純物はない。実施形態において、医薬組成物は、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９１．９％超、９２％超、９３％超、又はそれらの間の任意のパーセンテージの総カプシドに対する充填カプシドのパーセンテージ（例えば、分析的超遠心分離法によって測定される際のピーク１＋ピーク２）を含む。医薬組成物の実施形態において、分析的超遠心分離法によってピーク１において測定された充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２５～７５％、３０～７５％、３５～７５％、又は３７．４～７０．３％である。医薬組成物の実施形態において、分析的超遠心分離法によってピーク２において測定された充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２０～７０％、２２～６５％、２４～６２％、又は２４．９～６０．１％である。
一実施形態において、医薬組成物は、１．０～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．２～３．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を含む。一実施形態において、医薬組成物は、５ＣＦＵ／ｍＬ未満、４ＣＦＵ／ｍＬ未満、３ＣＦＵ／ｍＬ未満、２ＣＦＵ／ｍＬ未満又は１ＣＦＵ／ｍＬ未満又は任意の中間縮小の生物学的負荷を示す。実施形態において、ＵＳＰで表されるエンドトキシンの量、例えば、ＵＳＰ＜８５＞（全体が参照により援用される）は、１．０ＥＵ／ｍＬ未満、０．８ＥＵ／ｍＬ未満又は０．７５ＥＵ／ｍＬ未満である。実施形態において、ＵＳＰで表される医薬組成物の浸透圧濃度、例えば、ＵＳＰ＜７８５＞（全体が参照により援用される）は、３５０～４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３７０～４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ又は３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇである。実施形態において、医薬組成物は、容器当たり２５μｍ超である１２００個未満の粒子、容器当たり２５μｍ超である１０００個未満の粒子、容器当たり２５μｍ超である５００個未満の粒子又は任意の中間値を含有する。実施形態において、医薬組成物は、容器当たり１０μｍ超である１０，０００個未満の粒子、容器当たり１０μｍ超である８０００個未満の粒子又は容器当たり１０ｐｍ超である６００個未満の粒子を含有する。
一実施形態において、医薬組成物は、０．５～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．０～４．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．５～３．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を有する。一実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、以下の１つ以上を含む：１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、約３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０～８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残りのＤＮＡプラスミド、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残りのｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ満のｒＨＣＰ、ｐＨ７．７～８．３、約３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、容器当たりのサイズが＞２５μｍである約６００個未満の粒子、容器当たりのサイズが＞１０μｍである約６０００個未満の粒子、約１．７×１０１３～２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８～８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００～３００ｐｇの総タンパク質、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターによるＡ７ＳＭＡマウスにおける＞２４日間の平均生存、インビトロ細胞ベースアッセイに基づく約７０～１３０％の相対効力及び／又は約５％未満の空のカプシド。様々な実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、本明細書に記載されるウイルス粒子のいずれかを含み、参照標準の±２０％の間、±１５％の間、±１０％の間又は±５％以内の効力を保持する。いくつかの実施形態において、効力は、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて測定される。
ＡＡＶ粒子の調製、特性評価、及び投与のさらなる方法が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９０９４２５３号パンフレットに教示される。
本発明と適合して用いられ得るさらなるｒＡＡＶ構築物としては、全体が参照により援用される、／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７３－０１９－００１２－９において入手可能なＷａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１９（その表１を含む）に記載されるものが挙げられる。
インテイン
いくつかの実施形態において、以下により詳細に記載されるように、インテイン－Ｎは、本明細書に記載される第１のドメインのＮ末端部分に融合され得、インテイン－Ｃは、Ｃ末端部分へのＮ末端部分の結合のために本明細書に記載される第２のドメインのＣ末端部分に融合され得、それによって、第１及び第２のドメインを結合する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のドメインはそれぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ＲＴドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインから独立して選択される。
いくつかの実施形態において、以下により詳細に記載されるように、インテイン－Ｎは、本明細書に記載される第１のドメインのＮ末端部分に融合され得、インテイン－Ｃは、Ｃ末端部分へのＮ末端部分の結合のために本明細書に記載される第２のドメインのＣ末端部分に融合され得、それによって、第１及び第２のドメインを結合する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のドメインはそれぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ＲＴドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインから独立して選択される。
本明細書において使用される際、「インテイン」は、例えば、隣接するＮ末端及びＣ末端エクステイン（例えば、結合されるフラグメント）をライゲートする自己スプライシングタンパク質イントロン（例えば、ペプチド）を指す。インテインは、ある場合に、それ自体を除去し、タンパク質スプライシングとして公知のプロセスにおいて残りのフラグメント（エクステイン）を、ペプチド結合と結合することが可能なタンパク質のフラグメントを含み得る。インテインは、「タンパク質イントロン」とも呼ばれる。インテイン自体を除去し、タンパク質の残りの部分を結合するプロセスは、本明細書において「タンパク質スプライシング」又は「インテイン媒介性タンパク質スプライシング」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、前駆体タンパク質のインテイン（インテイン媒介性タンパク質スプライシングの前にタンパク質を含有するインテイン）は、２つの遺伝子に由来する。このようなインテインは、本明細書においてスプリットインテイン（例えば、スプリットインテイン－Ｎ及びスプリットインテイン－Ｃ）と呼ばれる。例えば、シアノバクテリア、ＤｎａＥにおいて、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの触媒サブユニットが、２つの別個の遺伝子、ｄｎａＥ－ｎ及びｄｎａＥ－ｃによってコードされる。ｄｎａＥ－ｎ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書において「インテイン－Ｎ」と呼ばれ得る。ｄｎａＥ－ｃ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書において「インテイン－Ｃ」と呼ばれ得る。
異種タンパク質フラグメントを結合するためのインテインの使用が、例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２－９（２０１４）（全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。例えば、別個のタンパク質フラグメントに融合されるとき、インテインＩｎｔＮ及びＩｎｔＣは、互いに認識し、それ自体をスプライシングで切り出し、及び／又はそれらが融合されるタンパク質フラグメントの隣接するＮ末端及びＣ末端エクステインを同時にライゲートし、それによって、２つのタンパク質フラグメントからの完全長タンパク質を再構成し得る。
いくつかの実施形態において、ｄｎａＥインテイン、Ｃｆａ－Ｎ（例えば、スプリットインテイン－Ｎ）及びＣｆａ－Ｃ（例えば、スプリットインテイン－Ｃ）インテイン対に基づく合成インテインが、使用される。このようなインテインの例が、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１６ Ｆｅｂ．２４；１３８（７）：２１６２－５（全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。本開示にしたがって使用され得るインテイン対の非限定的な例としては、Ｃｆａ ＤｎａＥインテイン、Ｓｓｐ ＧｙｒＢインテイン、Ｓｓｐ ＤｎａＸインテイン、Ｔｅｒ ＤｎａＥ３インテイン、Ｔｅｒ ＴｈｙＸインテイン、Ｒｍａ ＤｎａＢインテイン及びＣｎｅ Ｐｒｐ８インテインが挙げられる（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第８，３９４，６０４号明細書に記載されるように。
いくつかの実施形態において、インテイン－Ｎ及びインテイン－Ｃは、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分及びスプリットＣａｓ９のＣ末端部分を結合するために、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分及びスプリットＣａｓ９のＣ末端部分にそれぞれ融合され得る。例えば、いくつかの実施形態において、インテイン－Ｎは、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分のＣ末端に融合されて、すなわち、Ｎ－［スプリットＣａｓ９のＮ末端部分］－［インテイン－Ｎ］～Ｃの構造を形成する。いくつかの実施形態において、インテイン－Ｃは、スプリットＣａｓ９のＣ末端部分のＮ末端に融合されて、すなわち、Ｎ－［インテイン－Ｃ］～［スプリットＣａｓ９のＣ末端部分］－Ｃの構造を形成する。インテインが（例えば、スプリットＣａｓ９）に融合される、タンパク質を結合するためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構が、参照により本明細書に援用されるＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０１４；５（ｌ）：４４６－４６ｌに記載される。インテインを設計及び使用するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、国際公開第２０２００５１５６１号パンフレット、国際公開第２０１４００４３３６号パンフレット、国際公開第２０１７１３２５８０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５０３４４５４９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１８０１２７７８０号明細書によって記載され、これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、スプリットは、２つ以上のフラグメントへの分割を指す。いくつかの実施形態において、スプリットＣａｓ９タンパク質又はスプリットＣａｓ９は、２つの別個のヌクレオチド配列によってコードされるＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントとして提供されるＣａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分及びＣ末端部分に対応するポリペプチドは、スプライシングされて、再構成されたＣａｓ９タンパク質を形成し得る。実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １５６，Ｉｓｓｕｅ ５，ｐｐ．９３５－９４９，２０１４に記載されるように、又はＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：８６７－８７１及びＰＤＢ ｆｉｌｅ：５Ｆ９Ｒ（これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、タンパク質の不規則領域内の２つのフラグメントへと分割される。不規則領域は、限定はされないが、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光法、電子顕微鏡法（例えば、ｃｒｙｏＥＭ）、及び／又はインシリコタンパク質モデリングを含む、当該技術分野において公知の１つ以上のタンパク質構造決定技術によって決定され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、任意のＣ、Ｔ、Ａ、又はＳにおいて、例えば、アミノ酸Ａ２９２－Ｇ３６４、Ｆ４４５－Ｋ４８３、若しくはＥ５６５－Ｔ６３７の間のＳｐＣａｓ９の領域内で、又は任意の他のＣａｓ９、Ｃａｓ９変異体（例えば、ｎＣａｓ９、ｄＣａｓ９）、若しくは他のｎａｐＤＮＡｂｐにおける対応する位置で、２つのフラグメントへと分割される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＳｐＣａｓ９ Ｔ３１０、Ｔ３１３、Ａ４５６、Ｓ４６９、又はＣ５７４において、２つのフラグメントへと分割される。いくつかの実施形態において、タンパク質を２つのフラグメントへと分割するためのプロセスは、タンパク質の分割と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、タンパク質フラグメントは、約２～１０００アミノ酸（例えば、２～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、又は９００～１０００アミノ酸）長の範囲である。いくつかの実施形態において、タンパク質フラグメントは、約５～５００のアミノ酸（例えば、５～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、又は４００～５００のアミノ酸）長の範囲である。いくつかの実施形態において、タンパク質フラグメントは、約２０～２００アミノ酸（例えば、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００、又は１００～２００アミノ酸）長の範囲である。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの一部又はフラグメント（例えば、Ｃａｓ９－Ｒ２Ｔｇ）が、インテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の一部又はフラグメントが、インテインに融合され、ＡＡＶカプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼ及びカプシドタンパク質は、任意の配列（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で一緒に融合され得る。いくつかの実施形態において、インテインのＮ末端は、融合タンパク質のＣ末端に融合され、インテインのＣ末端は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端に融合される。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼＣａｓ９ドメイン）は、インテイン－Ｎに融合され、ＲＴドメインを含むポリペプチドが、インテイン－Ｃに融合される。
対象とする例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列が、以下に示される：
ＤｎａＥインテイン－Ｎ ＤＮＡ：
ＤｎａＥインテイン－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号１６１３）
ＤｎａＥインテイン－Ｃ ＤＮＡ：
ＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴ（配列番号１６１４）
インテイン－Ｃ：
ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号１６１５）
Ｃｆａ－Ｎ ＤＮＡ：
Ｃｆａ－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号１６１７）
Ｃｆａ－Ｃ ＤＮＡ：
Ｃｆａ－Ｃタンパク質：
ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１６１９）
ＤｎａＥインテイン－Ｎ ＤＮＡ：
ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号１６１３）
ＤｎａＥインテイン－Ｃ ＤＮＡ：
ＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴ（配列番号１６１４）
インテイン－Ｃ：
ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号１６１５）
Ｃｆａ－Ｎ ＤＮＡ：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号１６１７）
Ｃｆａ－Ｃ ＤＮＡ：
ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号１６１９）
脂質ナノ粒子
本発明によって提供される方法及びシステムは、特定の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、任意の好適な担体又は送達様式を用い得る。脂質ナノ粒子、いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性イオン性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲート脂質など）などの１つ以上のイオン性脂質；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）；並びに、任意選択で、１つ以上の標的化分子（例えば、コンジュゲートされた受容体、受容体リガンド、抗体）；又は上記の組合せを含む。
本発明によって提供される方法及びシステムは、特定の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、任意の好適な担体又は送達様式を用い得る。脂質ナノ粒子、いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性イオン性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲート脂質など）などの１つ以上のイオン性脂質；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）；並びに、任意選択で、１つ以上の標的化分子（例えば、コンジュゲートされた受容体、受容体リガンド、抗体）；又は上記の組合せを含む。
ナノ粒子配合物において使用され得る脂質（例えば、脂質ナノ粒子）としては、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に記載されるものが挙げられ、例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４中の脂質の１つ以上を含み得る。脂質ナノ粒子は、さらなる要素、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーなどのポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により援用される）の表２に記載されるもの、並びに上記の組合せの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子に組み込まれ得るステロールとしては、参照により援用される国際公開第２００９／１２７０６０又は米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書中のものなどのコレステロール又はコレステロール誘導体の１つ以上が挙げられる。さらなる例示的なステロールとしては、植物ステロール、参照により本明細書に援用されるＥｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２０２０），ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及びステロールを含む。これらの成分の量は、独立して、所望の特定を達成するために変化され得る。例えば、いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、総脂質の約２０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の量でイオン化可能な脂質（他の実施形態において、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）又は４０～５０％（ｍｏｌ）；約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％であり得る）、総脂質の約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量のコンジュゲート脂質、及び総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。総脂質対核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又は鋳型核酸をコードする）の比率は、必要に応じて変化され得る。例えば、総脂質対核酸（質量又は重量）の比率は、約１０：１～約３０：１であり得る。
いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能カチオン性脂質、例えば、ｐＨに応じて正荷電若しくは中性形態で存在し得るカチオン性脂質、又は容易にプロトン化され得るアミン含有脂質であり得る。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、例えば、生理学的条件下で、正荷電であることが可能な脂質である。例示的なカチオン性脂質としては、正電荷を有する１つ以上のアミン基が挙げられる。いくつかの実施形態において、脂質粒子は、中性脂質、イオン化可能アミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール及びポリマーがコンジュゲート脂質の１つ以上との配合物中でカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、イオン化可能カチオン性脂質であり得る。本明細書に開示される例示的なカチオン性脂質は、６．０を超える有効ｐＫａを有し得る。実施形態において、脂質ナノ粒子は、第１のカチオン性脂質と異なる有効ｐＫａ（例えば、第１の有効ｐＫａを超える）を有する第２のカチオン性脂質を含み得る。脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子内に封入されるか又は脂質ナノ粒子と結合された、４０～６０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、及び治療剤、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする鋳型核酸又は核酸）を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、カチオン性脂質と共配合される。核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰの表面に吸着され得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰに封入され得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、例えば、標的化剤で被覆された標的部分を含み得る。実施形態において、ＬＮＰ配合物は、生分解性である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の脂質、例えば、式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉｉ）及び／又は（ｉｘ）を含む脂質ナノ粒子は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は１００％のＲＮＡ分子、例えば、鋳型ＲＮＡ及び／又はＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する。
いくつかの実施形態において、脂質対核酸の比率（質量／質量比；ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のＮ／Ｐ比、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＮ／Ｐ比を提供するように調整され得る。一般に、脂質ナノ粒子配合物の全脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
脂質ナノ粒子配合物において使用され得る例示的なイオン化可能な脂質としては、限定はされないが、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレットの表１に列挙されるものが挙げられる。さらなる例示的な脂質としては、限定はされないが、以下の式の１つ以上：米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ若しくはＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ、若しくはＩＩＡ；米国特許出願公開第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０３０３５８７号明細書又は米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、若しくはＶ；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ若しくはＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、若しくはＩＶ；米国特許出願公開第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ若しくはＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ、若しくはＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ若しくはＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ、若しくはＩＩＩ－ＸＸＩＶ；米国特許出願公開第２０１３／０３３８２１０号明細書の；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、若しくはＩＶ；米国特許出願公開第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ若しくはＸＸＸＶ；米国特許出願公開第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ若しくはＸＶＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２６９号明細書の；米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ、若しくはＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、若しくはＸＶＩ；米国特許出願公開第２００６／００８３７８号明細書のＩ若しくはＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ若しくはＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願公開第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ、若しくはＸＶＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、若しくはＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、若しくはＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ若しくはＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ－Ｘ；米国特許出願公開第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願公開第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ；米国特許出願公開第１０，２２１，１２７号明細書の５、６、若しくは１０；国際公開第２０１８／０８１４８０号パンフレットのＩＩＩ－３；国際公開第２０２０／０８１９３８号パンフレットのＩ－５若しくはＩ－８；米国特許出願公開第９，８６７，８８８号明細書の１８若しくは２５；米国特許出願公開第２０１９／０１３６２３１号明細書のＡ；国際公開第２０２０／２１９８７６号パンフレットのＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書の１；米国特許出願公開第２０１９／０２４０３４９号明細書のＯＦ－０２；米国特許第１０，０８６，０１３号明細書の２３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）のｃＫＫ－Ｅ１２／Ａ６；国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットのＣ１２～２００；Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）の７Ｃ１；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌの３０４－Ｏ１３又は５０３－Ｏ１３；米国特許第９，７０８，６２８号明細書のＴＳ－Ｐ４Ｃ２；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩが挙げられる。
いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例９に記載されるように、ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３ｌ－テトラエン－ｌ９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１０に記載されるように、脂質ＡＴＸ－００２である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１１に記載されるように、（ｌ３Ｚ，ｌ６Ｚ）－Ａ，Ａ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３、ｌ６－ジエン－ｌ－アミン（化合物３２）である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１２に記載されるように、化合物６又は化合物２２である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許第９，８６７，８８８号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１に記載されるように、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１３において合成されるように、９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（ＬＰ０１）である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例７、８、若しくは９において合成されるように、ジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１４及び１６において合成されるように、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２～２００）である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、イミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）脂質（３Ｓ、１０Ｒ、１３Ｒ、１７Ｒ）－１０、１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２、３、４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－テトラデカヒドロ－ｌＨ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート、例えば、国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）からの構造（Ｉ）である。
本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする鋳型核酸又は核酸）の送達のための脂質ナノ粒子を形成するために（例えば、他の脂質成分と組み合わせて）使用され得る脂質化合物使用されるのいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられ、
いくつかの実施形態において、式（ｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ組成物を、肝臓及び／又は肝細胞に送達するのに使用される。
Ｘ１が、Ｏ、ＮＲ１、又は直接結合であり、Ｘ２が、Ｃ２～５アルキレンであり、Ｘ３が、Ｃ（＝０）又は直接結合であり、Ｒ１が、Ｈ又はＭｅであり、Ｒ３が、Ｃｉ－３アルキルであり、Ｒ２が、Ｃｉ－３アルキルであり、又はＲ２が、それが結合される窒素原子及びＸ２の１～３個の炭素原子と一緒になって、４員、５員、又は６員環を形成し、又はＸ１が、ＮＲ１であり、Ｒ１及びＲ２が、それらが結合される窒素原子と一緒になって、５員又は６員環を形成し、又はＲ２が、Ｒ３及びそれらが結合される窒素原子と一緒になって、５員、６員、又は７員環を形成し、Ｙ１が、Ｃ２～１２アルキレンであり、Ｙ２が、
ｎが、０～３であり、Ｒ４が、Ｃｉ－１５アルキル、Ｚ１が、Ｃｉ－６アルキレン又は直接結合であり、Ｚ２が、
又は存在せず、ただし、Ｚ１が、直接結合である場合、Ｚ２が存在せず；
Ｒ５が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｒ６が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｗが、メチレン又は直接結合であり、Ｒ７が、Ｈ又はＭｅ、又はその塩であり、ただし、Ｒ３及びＲ２が、Ｃ２アルキルであり、Ｘ１がＯであり、Ｘ２が、直鎖状Ｃ３アルキレンであり、Ｘ３が、Ｃ（＝０）であり、Ｙ１が、直鎖状Ｃｅアルキレンであり、（Ｙ２）ｎ－Ｒ４が、
いくつかの実施形態において、式（ｘｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ組成物を、肝臓及び／又は肝細胞に送達するのに使用される。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ｘｉｉｉ）の化合物及び式（ｘｉｖ）の化合物を含む。
例示的な非カチオン性脂質としては、限定はされないが、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、ｌ８－ｌ－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水添ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用され得ることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸から誘導されるアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。さらなる例示的な脂質、特定の実施形態において、限定はされないが、参照により本明細書に援用されるＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものが挙げられる。このような脂質としては、いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、ＤＧＴＳ）による肝臓トランスフェクションを改善することが分かっている植物脂質が挙げられる。
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は、以下の構造
を有し得る。
脂質ナノ粒子に使用するのに好適な非カチオン性脂質の他の例としては、限定はされないが、非リン脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸セチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル酸ポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン性脂質が、内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は、オレイン酸又は全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書の式Ｉ、ＩＩ、若しくはＩＶの化合物である。非カチオン性脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質含量は、５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）の脂質ナノ粒子中に存在する総脂質である。実施形態において、イオン化可能な脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、又は８：１）の範囲である。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、任意のリン脂質を含まない。
いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、膜完全性を提供するためのステロールなどの成分をさらに含み得る。脂質ナノ粒子において使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、極性類似体、例えば、５ａ－コレスタノール、５３－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノール；非極性類似体、例えば、５ａ－コレスタン、コレステノン、５ａ－コレスタノン、５ｐ－コレスタノン、及びデカン酸コレステリル；並びにそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルである。例示的なコレステロール誘導体が、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１２７０６０及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書に記載され、これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、ステロールなどの、膜完全性を提供する成分は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～５０％（ｍｏｌ）（例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、又は４０～５０％）を含み得る。いくつかの実施形態において、このような成分は、脂質ナノ粒子の総脂質含量の２０～５０％（ｍｏｌ）３０～４０％（ｍｏｌ）である。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲート脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、及び／又は立体安定化を提供するために使用される。例示的なコンジュゲート脂質としては、限定はされないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、コンジュゲート脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－コンジュゲート脂質である。
例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、限定はされないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－ｌ，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセリン、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）、又はそれらの混合物が挙げられる。さらなる例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、例えば、米国特許第５，８８５，６１３号明細書、米国特許第６，２８７，５９１号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２号明細書、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書、米国特許出願第０９９８２３号明細書、これらの全ての内容は、全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書の式ＩＩＩ、ＩＩＩ－ａ－Ｉ、ＩＩＩ－ａ－２、ＩＩＩ－ｂ－１、ＩＩＩ－ｂ－２、又はＶの化合物である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、両方とも内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書の式ＩＩのものである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、
から選択される構造を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質も、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用され得る。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性ポリマー脂質（ＧＰＬ）コンジュゲートが、ＰＥＧ－脂質の代わりに又はそれに加えて使用され得る。
例示的なコンジュゲート脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート及びカチオン性ポリマー脂質が、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレットの表２に列挙されるＰＣＴ及びＬＩＳ特許出願並びに国際公開第２０２０１０６９４６Ａ１号パンフレット（これらの全ての内容は、全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、式（ｘｉｘ）の化合物、式（ｘｘｉ）の化合物及び式（ｘｘｖ）の化合物を含む。いくつかの実施形態において、式（ｘｉｘ）、式（ｘｘｉ）及び式（ｘｘｖ）の配合物を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ組成物を、肺又は肺細胞に送達するのに使用される。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０．５～１０％又は２～５％（ｍｏｌ）である。イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ／コンジュゲート脂質のモル比は、必要に応じて変化され得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル基準若しくは総重量基準で３０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で０～６０％のコレステロール、組成物のモル基準若しくは総重量基準で０～３０％の非カチオン性脂質及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で１～１０％のコンジュゲート脂質を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル基準若しくは総重量基準で３０～４０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で４０～５０％のコレステロール、及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で１０～２０％の非カチオン性脂質を含む。いくつかの他の実施形態において、組成物は、組成物のモル基準若しくは総重量基準で５０～７５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で２０～４０％のコレステロール、及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で５～１０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で１～１０％のコンジュゲート脂質である。組成物は、組成物のモル基準若しくは総重量基準で６０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で２５～３５％のコレステロール、及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で５～１０％の非カチオン性脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモル基準若しくは総重量基準で９０％以下のイオン化可能な脂質及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で２～１５％の非カチオン性脂質を含有し得る。配合物はまた、例えば、組成物のモル基準若しくは総重量基準で８～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で５～３０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で０～２０％のコレステロール；組成物のモル基準若しくは総重量基準で４～２５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で２～２５％のコレステロール、組成物のモル基準若しくは総重量基準で１０～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で５％のコレステロール；又は組成物のモル基準若しくは総重量基準で２～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモル基準若しくは総重量基準で１～１５％のコレステロール、組成物のモル基準若しくは総重量基準で２～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で１～２０％のコレステロール；又はさらには組成物のモル基準若しくは総重量基準で９０％以下のイオン化可能な脂質及び組成物のモル基準若しくは総重量基準で２～１０％の非カチオン性脂質、又はさらには組成物のモル基準若しくは総重量基準で１００％のカチオン性脂質を含む、脂質ナノ粒子配合物であり得る。いくつかの実施形態において、脂質粒子配合物は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。いくつかの他の実施形態において、脂質粒子配合物は、６０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えばリン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化可能な脂質について２０～７０モルパーセント（目標は４０～６０）の範囲であり、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０（目標は０～１５）の範囲であり、ステロールのモルパーセントは、２０～７０（目標は３０～５０）の範囲であり、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１～６（目標は２～５）の範囲である。
いくつかの実施形態において、脂質粒子は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲート脂質を含む。
一態様において、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子配合物を提供する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のさらなる化合物も含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得、又はさらなる化合物が、本発明の脂質ナノ粒子に含まれ得る。言い換えると、脂質ナノ粒子は、核酸又は第１の拡散と異なる少なくとも第２の核酸に加えて、他の化合物を含有し得る。限定はされないが、他のさらなる化合物が、小型又は大型の有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣薬、核酸、核酸類似体及び誘導体、生物材料から作製された抽出物、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子（又は脂質ナノ粒子を含む配合物）は、反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を欠き、又は予め選択されたレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を含む。理論によって制約されるのを望むものではないが、いくつかの実施形態において、脂質試薬が、脂質ナノ粒子配合物を作製するのに使用され、脂質試薬は、汚染反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を含み得る。脂質試薬が、予め選択されたレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を有することに基づいた製造のために選択され得る。理論に制約されるのを望むものではないが、いくつかの実施形態において、アルデヒドは、ＲＮＡの修飾及び損傷、例えば、塩基間の架橋及び／又はＲＮＡへの脂質の共有結合（例えば、脂質－ＲＮＡ付加物を形成する）を引き起こし得る。これは、ある場合に、逆転写酵素反応の失敗及び／又は、例えば、病変の部位における不適切な塩基の組み込み、例えば、新たに合成された標的ＤＮＡにおける突然変異をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子配合物は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む脂質試薬を用いて生成される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子配合物は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む脂質試薬を用いて生成される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子配合物は、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量；及び（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む脂質試薬を用いて生成される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子配合物は、複数の脂質試薬を用いて生成され、複数の各脂質試薬は、独立して、この段落に記載される１つ以上の基準を満たす。いくつかの実施形態において、複数の各脂質試薬は、同じ基準、例えば、この段落の基準を満たす。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子配合物は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子配合物は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子配合物は、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量；及び（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される脂質ナノ粒子に使用される脂質試薬又はその配合物の１つ以上、又は任意選択で全てが、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の全反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量；及び（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。
いくつかの実施形態において、総アルデヒド含量及び／又は任意の単一の反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量が、例えば、実施例３４に記載される方法にしたがって、例えば、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）と組み合わされた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって決定される。いくつかの実施形態において、反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量及び／又は反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量が、例えば、脂質試薬中の、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に関連する核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載されるような）の１つ以上の化学修飾を検出することによって決定される。いくつかの実施形態において、反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量及び／又は反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量が、例えば、実施例３５に記載されるように、例えば、脂質試薬中の、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に関連するヌクレオチド又はヌクレオシド（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、鋳型核酸に含まれるか又は鋳型核酸から単離される、例えば、リボヌクレオチド又はリボヌクレオシド）の１つ以上の化学修飾を検出することによって決定される。実施形態において、核酸分子、ヌクレオチド、又はヌクレオシドの化学修飾が、例えば、実施例３５に記載されるように、例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、１つ以上の修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を決定することによって検出される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする鋳型核酸又は核酸）は、アルデヒド修飾を含まないか、又は所定の量未満のアルデヒド修飾を含む。いくつかの実施形態において、平均して、核酸は、１０００ヌクレオチド当たり５０、２０、１０、５、２、又は１個未満のアルデヒド修飾を有し、例えば、ここで、２つのヌクレオチドの単一の架橋が、単一のアルデヒド修飾である。いくつかの実施形態において、アルデヒド修飾は、ＲＮＡ付加物（例えば、脂質－ＲＮＡ付加物）である。いくつかの実施形態において、アルデヒド－修飾ヌクレオチドは、塩基間の架橋である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ）は、ヌクレオチド間に５０、２０、１０、５、２、又は１個未満の架橋を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、標的化ドメインの付加によって特定の組織に指向される。例えば、生物学的リガンドは、同種受容体を提示する細胞との相互作用を強化するためにＬＮＰの表面上に提示され、したがって、細胞が受容体を発現する組織との結合及びそのような組織へのカーゴ送達を駆動し得る。いくつかの実施形態において、生物学的リガンドは、肝臓への送達を駆動するリガンドであり得、例えば、ＧａｌＮＡｃを提示するＬＮＰは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を提示する肝細胞への核酸カーゴの送達をもたらす。Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８（７）：１３５７－１３６４（２０１０）の論文は、観察可能なＬＮＰカーゴ効果のためのＡＳＧＰＲに依存するＬＮＰを得るための、ＰＥＧ－脂質への三価ＧａｌＮＡｃリガンドのコンジュゲーション（ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＤＳＧ）を教示する（例えば、図６を参照）。例えば、葉酸塩、トランスフェリン、又は抗体を組み込む他のリガンド提示ＬＮＰ配合物が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１７２２３１３５号パンフレットにおいて、その中で使用される参考文献、すなわち、Ｋｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７－２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８－１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６－２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１－６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８－２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９－３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７－１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５－１１６；Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７－５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３－６８；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ １０４：４０９５－４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９－３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８－２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７－６３０；及びＰｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７－１１３３に加えて記載される。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、イオン化可能カチオン性脂質、両親媒性リン脂質、コレステロール及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質などの従来の成分を含む配合物への、選択的器官標的化（ＳＯＲＴ）分子の付加によって、組織特異的活性について選択される。Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（４）：３１３－３２０（２０２０）の教示は、追加の「ＳＯＲＴ」成分の付加が、インビボＲＮＡ送達プロファイルを正確に改変し、組織特異的（例えば、肺、肝臓、脾臓）遺伝子送達並びにＳＯＲＴ分子のパーセンテージ及び生物物理的特性の関数としての編集を媒介することを実証している。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、生分解性の、イオン化可能な脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート）とも呼ばれる（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート、又は別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号パンフレット、国際公開第２０１７／１７３０５４号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、並びにその中に示される参考文献の脂質を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ脂質に関連するカチオン性及びイオン化可能という用語は、同義的であり、例えば、ここで、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じてカチオン性である。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの複数の成分が、単一のＬＮＰ配合物として調製され得、例えば、ＬＮＰ配合物は、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及びＲＮＡ鋳型を含む。核酸成分の比率は、治療薬の特性を最大化するように変化され得る。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対するＲＮＡ鋳型の比率は、モル比基準で、約１：１～１００：１、例えば、約１：１～２０：１、約２０：１～４０：１、約４０：１～６０：１、約６０：１～８０：１、又は約８０：１～１００：１である。他の実施形態において、複数の核酸のシステムは、別個の配合物、例えば、鋳型ＲＮＡを含む１つのＬＮＰ配合物及びＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む第２のＬＮＰ配合物によって調製され得る。いくつかの実施形態において、システムは、ＬＮＰ中に配合される３つ以上の核酸成分を含み得る。いくつかの実施形態において、システムは、タンパク質、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、及び少なくとも１つのＬＮＰ配合物中に配合される鋳型ＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ配合物の平均ＬＮＰ直径は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ配合物の平均ＬＮＰ直径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、又は１５０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ配合物の平均ＬＮＰ直径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ配合物の平均ＬＮＰ直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。特定の実施形態において、ＬＮＰ配合物の平均ＬＮＰ直径は、約８０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ配合物の平均ＬＮＰ直径は、約１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ配合物の平均ＬＮＰ直径は、約１ｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。
ＬＮＰは、ある場合に、比較的均一であり得る。多分散指数が、ＬＮＰの均一性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すのに使用され得る。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は、一般に、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５の多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
ＬＮＰのゼータ電位は、組成物の運動電位を示すのに使用され得る。いくつかの実施形態において、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。より高い電荷の種は、細胞、組織、及び身体内の他の要素と望ましくない方法で相互作用し得るため、比較的低い電荷（正電荷又は負電荷）を有する脂質ナノ粒子が、一般に、望ましい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、又は約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
タンパク質及び／又は核酸、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの封入の効率は、提供される初期の量と比べた、調製後にＬＮＰに封入されるか又は他の形でＬＮＰと結合されるタンパク質及び／又は核酸の量を表す。封入効率は、望ましくは高い（例えば、ほぼ１００％）。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒又は洗浄剤で脂質ナノ粒子を破壊する前及び後で、脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することによって測定され得る。アニオン交換樹脂が、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。蛍光が、溶液中の遊離タンパク質及び／又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。本明細書に記載される脂質ナノ粒子について、タンパク質及び／又は核酸の封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。いくつかの実施形態において、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。いくつかの実施形態において、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。いくつかの実施形態において、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。
ＬＮＰは、１つ以上のコーティングを任意選択で含み得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム、又は錠剤中で配合され得る。本明細書に記載される組成物を含むカプセル、フィルム、又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張り強さ、硬度又は密度を有し得る。
ＬＮＰのさらなる例示的な脂質、配合物、方法、及び特性評価が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００６１４５７号パンフレットによって教示される。
いくつかの実施形態において、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて行われる。特定の実施形態において、ＬＮＰは、ＧｅｎＶｏｙ＿ＩＬＭイオン化可能な脂質混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて配合される。特定の実施形態において、ＬＮＰは、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）又はジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）を用いて配合され、その配合物及びインビボ使用が、全体が参照により本明細書に援用されるＪａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（３４）：８５２９－８５３３（２０１２）において教示される。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの送達について最適化されたＬＮＰ配合物、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡが、国際公開第２０１９０６７９９２号パンフレット及び国際公開第２０１９０６７９１０号パンフレットに記載され、両方との参照により援用される。
核酸の送達に有用なさらなる特定のＬＮＰ配合物が、両方とも参照により援用される米国特許第８１５８６０１号明細書及び米国特許第８１６８７７５号明細書に記載され、これは、ＯＮＰＡＴＴＲＯという名称で販売される、パチシランに使用される配合物を含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＬＮＰの例示的な投与は、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、又は１００ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を含み得る。システムの１つ以上の構成要素をコードする核酸を含むＡＡＶの例示的な投与は、約１０１１、１０１２、１０１３、及び１０１４ｖｇ／ｋｇのＭＯＩを含み得る。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムの鋳型ＲＮＡ成分
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、標的プライム逆転写によって、ＲＮＡ配列鋳型を、宿主標的ＤＮＡ部位中に転写し得る。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、ＲＮＡ配列鋳型の逆転写を介してＤＮＡ配列を宿主ゲノムに直接的に書き込むことにより、（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムと異なり）外因性ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入する必要なく、目的配列を標的ゲノムに挿入できるとともに、外因性ＤＮＡ挿入ステップを除くことができる。従って、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、目的配列、例えば、異種遺伝子コーディング及び／又は機能情報を含む配列を含む、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型の使用のためのプラットフォームを提供する。
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、標的プライム逆転写によって、ＲＮＡ配列鋳型を、宿主標的ＤＮＡ部位中に転写し得る。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、ＲＮＡ配列鋳型の逆転写を介してＤＮＡ配列を宿主ゲノムに直接的に書き込むことにより、（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムと異なり）外因性ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入する必要なく、目的配列を標的ゲノムに挿入できるとともに、外因性ＤＮＡ挿入ステップを除くことができる。従って、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、目的配列、例えば、異種遺伝子コーディング及び／又は機能情報を含む配列を含む、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型の使用のためのプラットフォームを提供する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの鋳型ＲＮＡ成分の説明のために、鋳型ＲＮＡは、モジュール部分（図１８～１９）を含むことが想定され得る。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型は、示される部分の全て又はいくつかを含んでもよく、モジュールが、組み合わされ、再配置され、及び／又は取り外され得る。示されるモジュールは、鋳型に含まれる潜在的な要素に対して限定的であることが意図されず、さらなる成分、例えば、鋳型安定性を改善するための５’及び３’末端ドメインが、容易に想定され得る。
いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、異種対象配列を有するｃｉｓ型のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質をコードする。様々なｃｉｓ構築物が、例えば、Ｋｕｒｏｋｉ－Ｋａｍｉ ｅｔ ａｌ（２０１９）Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ １０：２３（全体が参照により本明細書に援用される）に記載され、本明細書に記載される実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、異種対象配列、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含むタンパク質）をコードする配列、５’非翻訳領域、及び３’非翻訳領域を含む。成分は、様々な順序で含まれ得る。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質及び異種対象配列は、例えば、Ｋｕｒｏｋｉ－Ｋａｍｉ ｅｔ ａｌ、Ｉｄの図３Ａに示される配置を用いて、異なる方向に（センス対アンチセンス）コードされる。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質及び異種対象配列は、同じ方向にコードされる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡをコードする核酸又は鋳型ＲＮＡをコードする核酸が、共有結合され、例えば、融合核酸の一部であり、及び／又は同じ転写産物の一部である。いくつかの実施形態において、融合核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする核酸は、ある場合に、異種対象配列の５’であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、５’から３’に、５’非翻訳領域、センスでコードされたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、センスでコードされた異種対象配列、及び３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、５’から３’に、５’非翻訳領域、センスでコードされたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、アンチセンスでコードされた異種対象配列、及び３’非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ＤＮＡ標的部位に対する相同性をさらに含む。
鋳型ＲＮＡが、オープンリーディングフレーム又はその逆相補体を含むことが記載される場合、いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、オープンリーディングフレームが転写及び翻訳され得る前に、（例えば、逆転写によって）二本鎖ＤＮＡへと変換されなければならないことが理解される。
特定の実施形態では、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型は、例えば、異種コード領域をゲノムに導入し；エクソンの構造／選択的スプライシングに影響するか若しくはそれを引き起こし；内因性遺伝子の破壊を引き起こし；内因性遺伝子の転写活性化を引き起こし；内因性ＤＮＡのエピジェネティック調節を引き起こし；作動可能に連結された遺伝子の上方若しくは下方制御を引き起こすことなどにより、宿主ゲノム機能を改変又は特定化する配列を含むように同定、設計、改変及び構築可能である。特定の実施形態では、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型は、エクソン及び／又は導入遺伝子をコードする配列を含むように、転写因子アクチベーター、リプレッサ、エンハンサーなどに対する結合部位を提供するように、及びそれらの組合せを意図して、改変され得る。他の実施形態では、コーディング配列は、スプライスアクセプター部位、ポリＡテールで更にカスタマイズされ得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ配列は、ＲＬＥトランスポザーゼに対して相同なＲＮＡ配列鋳型をコードする配列を含み得るか、異種コーディング配列を含むように改変され得るか、又はそれらの組合せであり得る。
鋳型ＲＮＡは、標的ＤＮＡに対するいくらかの相同性を有し得る。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において標的ＤＮＡに対する正確な相同性の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００又はそれ以上の塩基を有する。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、例えば、鋳型ＲＮＡの５’末端において、標的ＤＮＡに対する少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、１８０、又は２００又はそれ以上の塩基を有する。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載される非ＬＴＲレトロトランスポゾンに由来する３’非翻訳領域を有する。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載される非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、表１、２、又は３中の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの３’配列に対する少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００又はそれ以上の塩基の３’領域を有する。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載される非ＬＴＲレトロトランスポゾンに由来する５’非翻訳領域を有する。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載される非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、表２又は３に記載される非ＬＴＲレトロトランスポゾンの５’配列に対する少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の相同性の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、又は２００又はそれ以上の塩基の５’領域を有する。
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集システムの鋳型ＲＮＡ成分は、典型的に、システムのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合可能である。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合可能である３’領域を有する。結合領域、例えば３’領域は、システムのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合可能である、例えば、少なくとも１、２又は３つのヘアピンループを有する構造化ＲＮＡ領域であってもよい。
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集システムの鋳型ＲＮＡ成分は、典型的に、システムのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することが可能である。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することが可能な５’領域を有する。結合領域、例えば、５’領域は、システムのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することが可能な、例えば、少なくとも１、２又は３つのヘアピンループを有する構造化ＲＮＡ領域であり得る。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、シュードノット、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質に結合することが可能なシュードノットを含む。
いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、ステムループ配列を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、ヘアピンを含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、らせんを含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、シュードノットを含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、リボザイムを含む。いくつかの実施形態において、リボザイムは、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムと同様であり、例えば、ＨＤＶリボザイムのものと類似の二次構造を有し、及び／又はＨＤＶリボザイムの１つ以上の活性、例えば、自己切断活性を有する。例えば、Ｅｉｃｋｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，３１４２－３１５０を参照されたい。
いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、３’非翻訳領域）は、１つ以上のステムループ又はらせんを含む。Ｒ２ ３’ＵＴＲの例示的な構造が、例えば、Ｒｕｓｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｒ２ ＲＮＡ” ＲＮＡ．２００４ Ｊｕｎ；１０（６）：９７８－９８７、例えば、その中の図３、及びＥｉｋｂｕｓｈ ａｎｄ Ｅｉｋｂｕｓｈ、“Ｒ２ ａｎｄ Ｒ２／Ｒ１ｈｙｂｒｉｄ ｎｏｎ－ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｅｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｅｌｅｍｅｎｔｓ” Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ（２０１２）３：１０；例えば、その中の図３に示され、これらの文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される鋳型ＲＮＡは、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質に結合することが可能である配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質中のＭＳ２コートタンパク質配列に結合することが可能なＭＳ２ ＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、Ｂ－ボックス配列に結合することが可能なＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質中のｄＣａｓ配列に結合することが可能なＲＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ配列及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含む。いくつかの実施形態において、ＵＴＲに加えて又はその代わりに、鋳型ＲＮＡは、非ＲＮＡ ＵＴＲ、例えば、タンパク質又は小分子に（例えば、共有）結合される。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、３’末端にポリＡテールを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、３’末端にポリＡテールを有しない。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、５’領域の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００又はそれ以上の塩基の、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの５’配列に対する、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の相同性を有する。
システムの鋳型ＲＮＡは、典型的に、標的ＤＮＡへの挿入のための目的配列を含む。目的配列は、コーディング又はノンコーディングであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステム又は方法は、単一の鋳型ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステム又は方法は、複数の鋳型ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、鋳型をコードするＤＮＡは、Ｙａｎｔ ｅｌ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：９９０－１００５，２００２に記載されるように、活性を増加させるために、レコンビナーゼなどの酵素の活性によって環状化される。
一部の実施形態では、異種目的配列は、オープンリーディングフレームを含んでもよい。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、コザック配列を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、内部リボソーム進入部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ部位などの自己切断型ペプチドを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、開始コドンを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、スプライスアクセプター部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、スプライスドナー部位を有する。例示的なスプライスアクセプター及びスプライスドナー部位は、国際公開第２０１６０４４４１６号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例示的なスプライスアクセプター部位配列は、当業者に公知であり、あくまで例として、（ヒトＨＢＢ遺伝子からの）ＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＧ（配列番号１６２０）及び（ヒト免疫グロブリンγ遺伝子からの）ＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＣＡＡＧ（配列番号１６２１）を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、停止コドンの下流にｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、オープンリーディングフレームの停止コドンの下流にポリＡテールを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数のエクソンを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、真核生物転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、増強された翻訳エレメント又は翻訳増強エレメントを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＨＴＬＶ－１）Ｒ領域を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、核外輸送を増強する転写後調節配列、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）（ＨＰＲＥ）又はウッドチャック肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＷＰＲＥ）のものを含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ中で、異種対象配列は、ポリペプチドをコードし、５’及び３’ＵＴＲに対してアンチセンス方向にコードされる。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡ中で、異種対象配列は、ポリペプチドをコードし、５’及び３’ＵＴＲに対してセンス方向にコードされる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を用いて、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの標的細胞特異性を増加させる。例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位は、非標的細胞型内に存在するが、標的細胞型内に存在しない（又は非標的細胞と比較して低下したレベルで存在する）ｍｉＲＮＡによって認識されることに基づいて選択され得る。従って、鋳型ＲＮＡが非標的細胞内に存在する場合、それはｍｉＲＮＡによって結合されることになり、鋳型ＲＮＡが標的細胞内に存在する場合、それはｍｉＲＮＡによって結合されない（又は専ら非標的細胞と比較して低下したレベルで結合される）ことになる。特定の理論に束縛されることは意図しないが、ｍｉＲＮＡの鋳型ＲＮＡへの結合は、異種目的配列のゲノムへの挿入に干渉することがある。従って、この異種目的配列であれば、標的細胞のゲノムに、非標的細胞のゲノムに挿入されるよりも効率的に挿入されることになる。更に、鋳型ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ）中にｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有するシステムは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて使用され得、ここで、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの発現は、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、「Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ遺伝子エディターシステムのポリペプチド成分」という表題のセクションにおいて、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位によって調節される。一部の実施形態では、例えば、肝臓の適応症の場合、ｍｉＲＮＡは、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４から選択される。
一部の実施形態では、目的配列は、ノンコーディング配列を含んでもよい。例えば、鋳型ＲＮＡは、調節エレメント、例えば、プロモータ又はエンハンサー配列又はｍｉＲＮＡ結合部位を含んでもよい。一部の実施形態では、標的部位での目的配列の組み込みは、内因性遺伝子の上方制御をもたらすことになる。一部の実施形態では、標的部位での目的配列の組み込みは、内因性遺伝子の下方制御をもたらすことになる。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含み、その各々は、一方向又は二方向であり得る。一部の実施形態では、プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、プロモータは、ＴＡＴＡエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、Ｂ認識エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、転写因子のための１つ又は複数の結合部位を有する。いくつかの実施形態において、非コード配列は、５’及び３’ＵＴＲに対してアンチセンス方向に転写される。いくつかにおいて、非コード配列は、５’及び３’ＵＴＲに対してセンス方向に転写される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、プロモータ配列、例えば、組織特異的プロモータ配列を含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモータを用いて、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの標的細胞特異性を増加させる。例えば、このプロモータは、標的細胞型において活性があるが、非標的細胞型において活性がない（又はより低いレベルで活性がある）ことに基づいて選択され得る。従って、たとえプロモータが非標的細胞のゲノムに組み込まれても、それは、組み込まれた遺伝子の発現を駆動することはない（又は専ら低レベルの発現を駆動する）。更に、鋳型ＲＮＡ中に組織特異的プロモータ配列を有するシステムは、例えば、本明細書に記載のように、例えば、鋳型ＲＮＡ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質をコードする核酸において、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位と組み合わせて使用されてもよい。鋳型ＲＮＡ中に組織特異的プロモータ配列を有するシステムは、例えば、標的細胞内で、非標的細胞内よりも高いレベルのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質を得るため、組織特異的プロモータによって駆動される、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＤＮＡと組み合わせても使用され得る。一部の実施形態では、例えば、肝臓の適応症の場合、組織特異的プロモータは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３から選択される。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム、例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＤＮＡ、鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ、又は異種目的配列をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡは、１つ又は複数のエレメントが、組織特異的プロモータ、例えば、Ｔ細胞内で活性があるプロモータに作動可能に連結されるように設計される。更なる実施形態では、Ｔ細胞活性プロモータは、他の細胞型、例えば、Ｂ細胞、ＮＫ細胞において不活性である。一部の実施形態では、Ｔ細胞活性プロモータは、Ｔ細胞受容体の成分、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＴＲＧＣ、ＴＲＤＣをコードする遺伝子におけるプロモータに由来する。一部の実施形態では、Ｔ細胞活性プロモータは、Ｔ細胞に特異的な表面抗原分類タンパク質の成分、例えばＣＤ３、例えば、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚをコードする遺伝子におけるプロモータに由来する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒシステムにおけるＴ細胞に特異的なプロモータは、公的に利用可能な遺伝子発現データを細胞型にわたって比較し、Ｔ細胞内での発現が増強された遺伝子からプロモータを選択することによって発見される。一部の実施形態では、プロモータは、所望の発現幅に応じて選択され得、例として、Ｔ細胞内に限って活性があるプロモータ、ＮＫ細胞内に限って活性があるプロモータ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方において活性があるプロモータが挙げられる。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ配列、ガイドＲＮＡ配列、ｐｉｗｉ ＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、エピジェネティック修飾を配位する部位を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、エピジェネティックサイレンシングを阻害する、例えば、防止する要素を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、クロマチンインシュレーターを含む。例えば、鋳型ＲＮＡは、ＣＴＣＦ部位又はＤＮＡメチル化のために標的化された部位を含む。
より高いレベル又はより安定した遺伝子発現を促進するために、鋳型ＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを防止又は阻害する特徴を含み得る。いくつかの実施形態において、これらの特徴は、ＤＮＡメチル化を防止又は阻害する。いくつかの実施形態において、これらの特徴は、ＤＮＡ脱メチル化を促進する。いくつかの実施形態において、これらの特徴は、ヒストン脱アセチル化を防止又は阻害する。いくつかの実施形態において、これらの特徴は、ヒストンメチル化を防止又は阻害する。いくつかの実施形態において、これらの特徴は、ヒストンアセチル化を促進する。いくつかの実施形態において、これらの特徴は、ヒストン脱メチル化を促進する。いくつかの実施形態において、複数の特徴が、これらの修飾の１つ以上を促進するために鋳型ＲＮＡに組み込まれ得る。ＣｐＧジヌクレオチドが、宿主メチルトランスフェラーゼによってメチル化に供される。いくつかの実施形態において、鋳型ＲＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチドが減少され、例えば、ＣｐＧヌクレオチドを含まないか、又は対応する非改変配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、統合されたＤＮＡからの導入遺伝子発現を駆動するプロモーターは、ＣｐＧジヌクレオチドが減少される。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、エフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節領域からなる遺伝子発現ユニットを含む。エフェクター配列は、ＲＮＡに転写される配列（例えば、コーディング配列又はノンコーディング配列、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡをコードする配列）であってもよい。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、内因性イントロン中の標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、標的ゲノムに挿入され、それにより新しいエクソンとして作用する。一部の実施形態では、目的配列の標的ゲノムへの挿入は、天然のエクソンの置換又は天然のエクソンのスキッピングをもたらす。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、又はアルブミン遺伝子座などのゲノムセーフハーバー部位中の標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを用いて、ＣＡＲをＴ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座に組み込む（Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ５４３，１１３－１１７（２０１７））。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを用いて、ＣＡＲをＴ細胞受容体β定常（ＴＲＢＣ）遺伝子座に組み込む。多くの他のセーフハーバーが、コンピューター手法によって同定されており（Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ３０，８１４－８２８（２０１９））、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ媒介性組み込みに使用可能である。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、インタージェニック又はイントラジェニック領域内のゲノムに付加される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、内因性活性遺伝子の０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５、ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ以内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、内因性プロモータ又はエンハンサーの０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５、ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ以内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、例えば、５０～５０，０００塩基対（例えば、５０～４０，０００ｂｐ間、５００～３０，０００ｂｐ間 ５００～２０，０００ｂｐ間、１００～１５，０００ｂｐ間、５００～１０，０００ｂｐ間、５０～１０，０００ｂｐ間、５０～５，０００ｂｐ間であり得る。いくつかの実施形態において、異種対象配列は、１，０００、１，３００、１５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、又は７，５００ヌクレオチド長未満である。
いくつかの実施形態において、ゲノムセーフハーバー部位は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位である。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５Ｓ ｒＤＮＡ、１８Ｓ ｒＤＮＡ、５．８Ｓ ｒＤＮＡ、又は２８Ｓ ｒＤＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５Ｓ ｒＤＮＡ中のＭｕｔｓｕ部位である。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、２８Ｓ ｒＤＮＡ中のＲ２部位、Ｒ５部位、Ｒ６部位、Ｒ４部位、Ｒ１部位、Ｒ９部位、又はＲＴ部位である。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、１８Ｓ ｒＤＮＡ中のＲ８部位又はＲ７部位である。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、ｔＲＮＡ－Ａｓｐ又はｔＲＮＡ－ＧｌｕをコードするＤＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、スプライセオソームＲＮＡをコードするＤＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、Ｕ２ ｓｎＲＮＡなどの核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、異種対象配列をＮａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位中に挿入する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムを用いる、例えば、表１～３のいずれかのポリペプチド又はそれに対する配列類似性、例えば、それに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有するポリペプチドを用いることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、酵素、例えば、レトロトランスポザーゼを用いて、異種対象配列をＮａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位中に挿入することを含む。いくつかの態様において、本開示は、細胞のゲノム中のＮａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位に位置する異種対象配列（例えば、治療用ポリペプチドをコードする配列）を含む宿主ヒト細胞を提供する。いくつかの実施形態において、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、以下の表５に記載される部位である。いくつかの実施形態において、異種対象配列は、表５に示される配列の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、又は１０００塩基対以内に挿入される。いくつかの実施形態において、異種対象配列は、表５に示される配列０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５、ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、又は１００ｋｂ以内に挿入される。いくつかの実施形態において、異種対象配列は、表５に示される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する部位に挿入される。いくつかの実施形態において、異種対象配列は、表５に示される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する部位の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００塩基対以内、又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５、ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ以内に挿入される。いくつかの実施形態において、異種対象配列は、表５の列５に示される遺伝子内、又はこの遺伝子の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００塩基対以内、又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５、ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ以内に挿入される。
表５．Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位。列１は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位中に挿入されるレトロトランスポゾンを示す。列２は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位における遺伝子を示す。列３及び４は、挿入部位（例えば、２５０ｂｐ）の例示的なヒトゲノム配列５’及び３’を示す。列５及び６は、遺伝子記号の例及び対応する遺伝子ＩＤを列挙する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステム又は方法は、ヒトゲノム中の標的部位中への異種配列の挿入をもたらす。いくつかの実施形態において、ヒトゲノム中の標的部位は、それが天然である生物のゲノム中の対応する野生型レトロトランスポザーゼ（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒが由来するレトロトランスポザーゼ）の対応する標的部位に対する配列類似性を有する。例えば、いくつかの実施形態において、挿入部位を中心とするヒトゲノム配列の４０ヌクレオチドと、挿入部位を中心とする天然生物ゲノム配列の４０ヌクレオチドとの間の同一性は、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、若しくは５０％未満であるか、又は５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、若しくは９０～１００％である。いくつかの実施形態において、挿入部位を中心とするヒトゲノム配列の１００ヌクレオチドと、挿入部位を中心とする天然生物ゲノム配列の１００ヌクレオチドとの間の同一性は、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、若しくは５０％未満であるか、又は５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、若しくは９０～１００％である。いくつかの実施形態において、挿入部位を中心とするヒトゲノム配列の５００ヌクレオチドと、挿入部位を中心とする天然生物ゲノム配列の５００ヌクレオチドとの間の同一性は、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、若しくは５０％未満であるか、又は５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、若しくは９０～１００％である。
さらなる鋳型の特徴
いくつかの実施形態において、鋳型（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、例えば、インシリコで決定される特定の構造的特徴を含む。実施形態において、鋳型ＲＮＡは、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８：Ｄ２８０－２８２（２００９）（全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、例えば、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅによって測定される際、－２８０～－４８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ（例えば、－２８０～－３００、－３００～－３５０、－３５０～－４００、－４００～－４５０、又は－４５０～－４８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の最小エネルギー構造を有すると予測される。
いくつかの実施形態において、鋳型（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、例えば、インシリコで決定される特定の構造的特徴を含む。実施形態において、鋳型ＲＮＡは、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８：Ｄ２８０－２８２（２００９）（全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、例えば、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅによって測定される際、－２８０～－４８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ（例えば、－２８０～－３００、－３００～－３５０、－３５０～－４００、－４００～－４５０、又は－４５０～－４８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の最小エネルギー構造を有すると予測される。
いくつかの実施形態において、鋳型（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、例えば、インビトロで決定される特定の構造的特徴を含む。実施形態において、鋳型ＲＮＡは、例えば、ＳＨＡＰＥ－ＭａＰによって、例えば、インビトロで決定される二次構造を減少させるように最適化された配列であり（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＳｉｅｇｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：９５９－９６５（２０１４）に記載されるように）。いくつかの実施形態において、鋳型（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、例えば、細胞内で決定される特定の構造的特徴を含む。実施形態において、鋳型ＲＮＡは、例えば、ＤＭＳ－ＭａＰｓｅｑによって、例えば、細胞内で測定される二次構造を減少させるように最適化された配列である（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＺｕｂｒａｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：７５－８２（２０１７）に記載されるように）。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）の更なる機能的特徴
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、いくつかの事例において、１つ若しくは複数の機能的測定又は特徴によって特性決定され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、下記の機能特性の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、下記の機能特性の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによって結合された鋳型部位は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、いくつかの事例において、１つ若しくは複数の機能的測定又は特徴によって特性決定され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、下記の機能特性の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、下記の機能特性の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによって結合された鋳型部位は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド
ＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標準ＤＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。一部の実施形態では、標準ＤＮＡ結合ドメインは、Ｂ．モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のＲ２ ＢＭ由来のＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
ＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標準ＤＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。一部の実施形態では、標準ＤＮＡ結合ドメインは、Ｂ．モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のＲ２ ＢＭ由来のＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、熱泳動によりインビトロで測定される。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、約１００倍モル過剰のスクランブル配列競合ｄｓＤＮＡの存在下で、例えば、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で）により測定して、標的細胞、例えば、ヒト標的細胞のゲノム中のいずれか他の配列よりも高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、前掲したＨｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）に記載されているように、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で）により測定して、標的細胞中のいずれか他の配列より少なくとも５倍又は１０倍高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、例えば、野生型ポリペプチドと比べて、ＤＮＡ結合ドメインに対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、元のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列に対する付加、欠失、置換、又は修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、対象とする標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合する異種機能的ドメインを含むように修飾される。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、ポリペプチドの前のＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部（例えば、その全体）を置き換える。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、亜鉛フィンガー（例えば、対象とする標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合する亜鉛フィンガーを含む。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、Ｃａｓドメイン（例えば、対象とする標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合するＣａｓドメインを含む。実施形態において、Ｃａｓドメインは、Ｃａｓ９又はその突然変異体若しくは変異体（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。実施形態において、Ｃａｓドメインは、例えば、本明細書に記載されるようなガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結合される。実施形態において、Ｃａｓドメインは、ｇＲＮＡによって対象とする標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に指向される。実施形態において、Ｃａｓドメインは、ｇＲＮＡと同じ核酸（例えば、ＲＮＡ）分子中でコードされる。実施形態において、Ｃａｓドメインは、ｇＲＮＡと異なる核酸（例えば、ＲＮＡ）分子中でコードされる。
ＲＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、標準ＲＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、鋳型ＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡＤＮＡ結合ドメインは、Ｂ．モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のＲ２ ＢＭ由来のＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、鋳型ＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＲＮＡに対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、熱泳動によりインビトロで測定される。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＲＮＡに対する親和性は、細胞中で（例えば、ＦＲＥＴ又はＣＬＩＰ－Ｓｅｑにより）測定される。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、標準ＲＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、鋳型ＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡＤＮＡ結合ドメインは、Ｂ．モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のＲ２ ＢＭ由来のＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、鋳型ＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＲＮＡに対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、熱泳動によりインビトロで測定される。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＲＮＡに対する親和性は、細胞中で（例えば、ＦＲＥＴ又はＣＬＩＰ－Ｓｅｑにより）測定される。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、鋳型ＲＮＡと、インビトロでスクランブルＲＮＡよりも少なくとも約５倍又は約１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインと鋳型ＲＮＡ又はスクランブルＲＮＡの間の会合の頻度は、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７（１１）：５４９０－５５０１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣＬＩＰ－ｓｅｑによって測定される。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、細胞内（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内）の鋳型ＲＮＡと、スクランブルＲＮＡよりも少なくとも約５倍又は約１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインと鋳型ＲＮＡ又はスクランブルＲＮＡの間の会合の頻度は、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ（２０１９）、上記に記載のように、ＣＬＩＰ－ｓｅｑによって測定される。
エンドヌクレアーゼドメイン
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、標的ｄｓＤＮＡと、インビトロでスクランブルｄｓＤＮＡよりも少なくとも約５倍又は約１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）内で、標的ｄｓＤＮＡと、インビトロでスクランブルｄｓＤＮＡよりも少なくとも約５倍又は約１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡ又はスクランブルＤＮＡの間の会合の頻度は、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣｈＩＰ－ｓｅｑによって測定される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、標的ｄｓＤＮＡと、インビトロでスクランブルｄｓＤＮＡよりも少なくとも約５倍又は約１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）内で、標的ｄｓＤＮＡと、インビトロでスクランブルｄｓＤＮＡよりも少なくとも約５倍又は約１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡ又はスクランブルＤＮＡの間の会合の頻度は、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣｈＩＰ－ｓｅｑによって測定される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、標的配列でのニックの形成を、例えば、非標的配列と比較して（例えば、標的細胞のゲノム中の任意の他のゲノム配列と比較して）、少なくとも約５倍又は約１０倍の増加まで触媒し得る。一部の実施形態では、ニック形成のレベルは、例えば、Ｅｌａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／８６７９３７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＮｉｃｋＳｅｑを用いて測定される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、インビトロでのＤＮＡのニッキングが可能である。複数の実施形態では、ニックは、露出された塩基をもたらす。複数の実施形態では、露出された塩基は、例えば、Ｃｈａｕｄｈｒｙ ａｎｄ Ｗｅｉｎｆｅｌｄ（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３（１９）：３８０５－３８０９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ヌクレアーゼ感受性アッセイを用いて検出され得る。複数の実施形態では、（例えば、ヌクレアーゼ感受性アッセイによって検出された）露出された塩基のレベルは、参照エンドヌクレアーゼドメインと比較して、少なくとも１０％、５０％、若しくはそれ以上増加する。一部の実施形態では、参照エンドヌクレアーゼドメインは、カイコガ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のＲ２＿ＢＭからのエンドヌクレアーゼドメインである。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、細胞内のＤＮＡのニッキングが可能である。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＤＮＡのニッキングが可能である。複数の実施形態では、Ｒａｄ５１の非存在下で複製を受ける未修復のニックは、例えば、Ｂｏｔｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８：１３９０５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、例えば、Ｒａｄ５１阻害アッセイを用いることによって検出可能である、ニックの部位でのＮＨＥＪ率の増加をもたらす。複数の実施形態では、ＮＨＥＪ率は、０～５％超増加する。複数の実施形態では、ＮＨＥＪ率は、例えば、Ｒａｄ５１阻害時、２０～７０％（例えば、３０％～６０％又は４０～５０％の間）まで増加する。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、切断後、標的を放出する。一部の実施形態では、標的の放出は、例えば、Ｙｏｕｒｉｋ ａｔ ａｌ．ＲＮＡ ２５（１）：３５－４４（２０１９）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、また図２に示すように、酵素による複数のターンオーバーについて評価することによって間接的に示される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインのｋｅｘｐは、こうした方法による測定として、１×１０－３～１×１０－５分－１である。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、インビトロで約１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を有する。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、インビトロで約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、又は約１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率を有する。複数の実施形態では、触媒効率は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０（６３８７）：４３６－４３９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように決定される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、細胞内で約１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を有する。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、細胞内で約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、又は約１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率を有する。
いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、例えば、野生型ポリペプチドと比べて、エンドヌクレアーゼドメインに対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、元のエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列に対する付加、欠失、置換、又は修飾を含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、対象とする標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合し、及び／又は対象とする標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のエンドヌクレアーゼ切断を誘導する異種機能的ドメインを含むように修飾される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、亜鉛フィンガーを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９又はその突然変異体若しくは変異体）を含む。実施形態において、Ｃａｓドメインを含むエンドヌクレアーゼドメインは、例えば、本明細書に記載されるようなガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結合される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、特定の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を標的としない機能的ドメインを含むように修飾される。実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１ドメインを含む。
逆転写酵素ドメイン
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、インビトロで、参照逆転写酵素ドメインと比較してより低い確率で不十分な終結率（Ｐｏｆｆ）を有する。一部の実施形態では、参照逆転写酵素ドメインは、カイコガ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のＲ２＿ＢＭからの逆転写酵素ドメイン、又はウイルス逆転写酵素ドメイン、例えば、Ｍ－ＭＬＶからのＲＴドメインである。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、インビトロで、参照逆転写酵素ドメインと比較してより低い確率で不十分な終結率（Ｐｏｆｆ）を有する。一部の実施形態では、参照逆転写酵素ドメインは、カイコガ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のＲ２＿ＢＭからの逆転写酵素ドメイン、又はウイルス逆転写酵素ドメイン、例えば、Ｍ－ＭＬＶからのＲＴドメインである。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、１０９４ｎｔのＲＮＡでの測定によると、インビトロで、約５×１０－３／ｎｔ、約５×１０－４／ｎｔ、又は約５×１０－６／ｎｔ未満の、より低い確率での不十分な終結率（Ｐｏｆｆ）を有する。複数の実施形態では、インビトロでの不十分な終結率は、Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３８）：３４８３６－３４８４５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように決定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、細胞における組み込みの少なくとも約３０％又は約５０％を完了することができる。完全な組み込みのパーセントは、実質的に完全長の組み込み事象（例えば、予想された組み込み配列の少なくとも９８％を含むゲノム部位）の数を細胞集団内の（実質的に完全長及び部分を含む）全体の組み込み事象の数で除することによって測定され得る。複数の実施形態では、細胞における組み込みは、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ロングリードアンプリコン配列決定を用いて（例えば、組み込み部位を通じて）決定される。
複数の実施形態では、細胞における組み込みの定量化は、鋳型ＲＮＡ（例えば、少なくとも０．０５、０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、若しくは５ｋｂの長さ、例えば、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、１．０～１．２、１．２～１．４、１．４～１．６、１．６～１．８、１．８～２．０、２～３、３～４、若しくは４～５ｋｂの間の長さを有する鋳型ＲＮＡ）に対応するＤＮＡ配列の少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％を含む組み込みの割合を計数することを含む。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、インビトロでｄＮＴＰを重合可能である。複数の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、０．１～５０ｎｔ／秒の間（例えば、０．１～１、１～１０若しくは１０～５０ｎｔ／秒の間）の速度で、インビトロでｄＮＴＰを重合可能である。複数の実施形態では、逆転写酵素ドメインによるｄＮＴＰの重合は、例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｑｕａｋｅ（２００９）ＰＮＡＳ １０６（４８）：２０２９４－２０２９９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、単一分子アッセイによって測定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４９２（２）：１４７－１５３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、１×１０－３～１×１０－４又は１×１０－４～１×１０－５置換／ｎｔの間のインビトロエラー率（例えば、ヌクレオチドの誤取り込み）を有する。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、ロングリードアンプリコン配列決定により、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）内で１×１０－３～１×１０－４又は１×１０－４～１×１０－５置換／ｎｔの間のエラー率（例えば、ヌクレオチドの誤取り込み）を有する。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、インビトロで標的ＲＮＡの逆転写を実施することが可能である。一部の実施形態では、逆転写酵素は、鋳型の逆転写を開始するため、少なくとも３ｎｔのプライマーを必要とする。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの逆転写は、例えば、Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３８）：３４８３６－３４８４５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、（例として、例えば、３’末端に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０ｎｔを有する標的にアニールする、ｓｓＤＮＡプライマーが提供されるとき）標的ＲＮＡからのｃＤＮＡの検出によって判定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、そのＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換する場合、逆転写を、例えば、タンパク質結合モチーフ（例えば３’ＵＴＲ）が欠如したＲＮＡ鋳型と比較して、（例えば、ｃＤＮＡ生成により）少なくとも５倍又は１０倍より効率的に実施する。複数の実施形態では、逆転写の効率は、Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４９２（２）：１４７－１５３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように測定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）内で発現されるとき、任意の内因性細胞ＲＮＡより高い頻度（例えば、約５倍又は約１０倍より高い頻度）で、特定のＲＮＡ鋳型に特異的に結合する。複数の実施形態では、逆転写酵素ドメインと鋳型ＲＮＡの間の特異的結合の頻度は、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７（１１）：５４９０－５５０１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣＬＩＰ－ｓｅｑによって測定される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結合されるポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、鋳型核酸分子に含まれる。他の実施形態において、ｇＲＮＡは、鋳型核酸分子と別個である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡが、鋳型核酸分子に含まれる場合、鋳型核酸分子は、ｇＲＮＡスペーサー配列（例えば、その５’末端の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ヌクレオチドにおいて又はそれ以内に）をさらに含む。実施形態において、ｇＲＮＡスペーサーは、標的核酸分子に含まれる核酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態において、ｇＲＮＡスペーサーは、標的核酸分子に含まれる核酸配列においてＣａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９）活性を指向する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡが、鋳型核酸分子に含まれる場合、鋳型核酸分子は、プライマー結合部位（例えば、その３’末端の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ヌクレオチドにおいて又はそれ以内に）をさらに含む。実施形態において、プライマー結合部位は、標的核酸分子上のニック部位の５’末端（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、又は５０ヌクレオチド以内）に位置決めされる核酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む核酸配列を含む。実施形態において、標的核酸分子へのプライマー結合部位の結合は、ＴＰＲＴをプライミングするように動作する。
いくつかの実施形態において、逆転写酵素（ＲＴ）ドメインは、例えば、内因性ＲＴドメインと比べて、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）開始の強化されたストリンジェンシーを示す。いくつかの実施形態において、ＲＴドメインは、標的部位中の３ｎｔが、第１の鎖ニックの直ぐ上流にあるとき、ＴＰＲＴを開始させ、例えば、ＲＮＡ鋳型をプライミングするゲノムＤＮＡは、ＲＮＡ鋳型における３ｎｔの相同性に対して少なくとも６６％又は１００％相補性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＴドメインは、鋳型ＲＮＡ相同性と逆転写をプライミングする標的ＤＮＡとの間で５ｎｔ未満のミスマッチ（例えば、１、２、３、４、又は５ｎｔ未満のミスマッチ）が存在するとき、ＴＰＲＴを開始させる。いくつかの実施形態において、ＲＴドメインは、ＴＰＲＴ反応をプライミングするミスマッチのストリンジェンシーが増加されるように修飾され、例えば、ここで、ＲＴドメインは、野生型（例えば、非修飾）ＲＴドメインと比べて、プライミング領域におけるミスマッチを許容しないか又はより少ないミスマッチを許容する。いくつかの実施形態において、ＲＴドメインは、ＨＩＶ－１ ＲＴドメインを含む。実施形態において、ＨＩＶ－１ ＲＴドメインは、代替的なＲＴドメインと比べて、３つのヌクレオチドミスマッチを有しても、より低いレベルの合成を開始させる（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＪａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０７（５）：６６１－６７２（２０１１）によって記載されるように）。
標的部位
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ後、組み込まれた配列周囲の標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例として、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定による判定として、組み込み事象の約５０％又は約１０％未満において、限られた数の挿入又は欠失を含む。一部の実施形態では、標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定による判定として、複数の挿入事象、例えば、ヘッドトゥーテール又はヘッドトゥヘッド重複を示さない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに対応する組み込まれた配列を含む。一部の実施形態では、標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定による判定として、事象の約１％又は約１０％超において、内因性ＲＮＡから得られる挿入を含まない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに対応する組み込まれた配列を含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ後、組み込まれた配列周囲の標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例として、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定による判定として、組み込み事象の約５０％又は約１０％未満において、限られた数の挿入又は欠失を含む。一部の実施形態では、標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定による判定として、複数の挿入事象、例えば、ヘッドトゥーテール又はヘッドトゥヘッド重複を示さない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに対応する組み込まれた配列を含む。一部の実施形態では、標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定による判定として、事象の約１％又は約１０％超において、内因性ＲＮＡから得られる挿入を含まない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに対応する組み込まれた配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的部位は、鋳型ＲＮＡに対応する統合された配列を含む。実施形態において、標的部位は、例えば、標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシングによって決定される際、ＲＴ鋳型（例えば、ｇＲＮＡ骨格、ベクター骨格、及び／又はＩＴＲ）の外部に配列を含まない（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（２０２０）記載されるように）。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体
一部の実施形態では、本発明は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体を提供する。進化型変異体は、一部の実施形態では、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はそこに含まれる断片若しくはドメインの１つを突然変異誘発させることにより生産することができる。一部の実施形態では、ドメイン（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡ結合（例えば、配列誘導ＤＮＡ結合エレメントを含む）、ＲＮＡ結合又はエンドヌクレアーゼドメイン）の１つ又は複数が進化する。こうした進化型変異体ドメインの１つ又は複数は、一部の実施形態において、単独で、又は他のドメインと一緒に進化し得る。１つ又は複数の進化型変異体ドメインは、一部の実施形態では、非進化型コグネイト成分又はコグネイト成分の進化型変異体（例えば、平行若しくは連続様式で進化した可能性のあるもの）と組み合わせてもよい。
一部の実施形態では、本発明は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体を提供する。進化型変異体は、一部の実施形態では、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はそこに含まれる断片若しくはドメインの１つを突然変異誘発させることにより生産することができる。一部の実施形態では、ドメイン（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡ結合（例えば、配列誘導ＤＮＡ結合エレメントを含む）、ＲＮＡ結合又はエンドヌクレアーゼドメイン）の１つ又は複数が進化する。こうした進化型変異体ドメインの１つ又は複数は、一部の実施形態において、単独で、又は他のドメインと一緒に進化し得る。１つ又は複数の進化型変異体ドメインは、一部の実施形態では、非進化型コグネイト成分又はコグネイト成分の進化型変異体（例えば、平行若しくは連続様式で進化した可能性のあるもの）と組み合わせてもよい。
一部の実施形態では、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させるプロセスは、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させることを含む。複数の実施形態では、突然変異誘発は、例えば、本明細書に記載されるように、漸進的進化方法（例えば、ＰＡＣＥ）又は非漸進的進化方法（例えば、ＰＡＮＣＥ）を含む。一部の実施形態では、進化型Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインは、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインと比較して、そのアミノ酸配列に導入された１つ若しくは複数のアミノ酸変異を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列変異は、例えば、コーディング配列内のいずれか特定の位置のコドンの変化を招くｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒをコードするヌクレオチド配列内の変化、１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失（例えば、短縮タンパク質）、１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、又はそれらの任意の組合せの結果として、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒのアミノ酸配列内に１つ若しくは複数の変異残基（例えば、保存的置換、非保存的置換、又はそれらの組合せ）を含み得る。進化した変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの１つ又は複数の成分又はドメインにおける変異体（例えば、逆転写酵素ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、又はそれらの組合せに導入された変異体）を含んでもよい。
いくつかの態様では、本発明は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体を用いる、又はそれを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、システム、キット、及び方法を提供し、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体、又はＰＡＣＥ若しくはＰＡＮＣＥにより生産若しくは生産可能なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを使用する。複数の実施形態では、非進化型標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、本明細書に開示されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒである。
「ファージ支援型漸進的進化（ＰＡＣＥ）」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する漸進的進化を指す。ＰＡＣＥ技術の例は、例えば、以下：２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許第２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；並びに２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２７７９５号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
「ファージ支援型非漸進的進化（ＰＡＮＣＥ）」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する非漸進的進化を指す。ＰＡＮＣＥ技術の例は、例えば、以下：Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎ ｅｌｕｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１３（１２）：１２６１－１２６６（２０１７）に記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。手短には、ＰＡＮＣＥは、新鮮な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）全体に、進化させようとする目的の遺伝子を含有する、進化選択ファージ（ＳＰ）の連続フラスコ移入を用いる迅速なインビボ指向性進化のための技術である。ＳＰに含まれる遺伝子が漸進的に進化する間、宿主細胞内部の遺伝子を一定に保持することができる。ファージ増殖の後、感染した細胞のアリコートを用いて、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する次のフラスコをトランスフェクトすることができる。このプロセスは、所望の表現型が、例えば、所望されるだけの数の移入について進化するまで、反復及び／又は継続することができる。
ＰＡＣＥ及びＰＡＮＣＥをＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒに適用する方法は、とりわけ、前述の参照文献を参照することにより、当業者により容易に理解されるであろう。例えば、ファージ粒子を用いて、例えば、宿主細胞の集団中に、ゲノム修飾タンパク質若しくはシステムの漸進的進化を指令するための更なる例示的な方法を適用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはサブドメインの進化型変異体を作製することができる。こうした方法の非限定的な例は、例えば、以下：２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；２０１９年６月１４日に出願された国際出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／３７２１６号明細書、２０１９年１月３１日に公開された国際公開第２０１９／０２３６８０号パンフレット、２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２７７９５号明細書、並びに２０１９年８月２３日に出願された国際出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／４７９９６号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの非限定的な例示的実施形態では、進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメインの進化方法は、以下：（ａ）宿主細胞の集団を、目的の遺伝子を含むウイルスベクターの集団（出発Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメイン）と接触させるステップを含み、ここで、（１）宿主細胞は、ウイルスベクターによる感染に適しており；（２）宿主細胞は、ウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を発現し；（３）感染性ウイルス粒子の産生に必要な少なくとも１つのウイルス遺伝子の発現が、目的の遺伝子の機能に依存しており；及び／又は（４）ウイルスベクターが、宿主細胞でのタンパク質の発現を可能にし、且つ宿主細胞により複製されて、ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。一部の実施形態では、本方法は、（ｂ）変異速度を高める（例えば、変異プラスミド又は何らかのゲノム修飾－例えば、損傷ＤＮＡプルーフリーディングポリメラーゼ、ＳＯＳ遺伝子、例えば、ＵｍｕＣ、ＵｍｕＤ’、及び／又はＲｅｃＡ（それらの突然変異は、プラスミドと結合すると、誘導性プロモータの制御下となり得る）を輸送することにより或いはそれらの組合せで）突然変異を含む宿主細胞を用いて、変異原と宿主細胞を接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、（ｃ）ウイルス複製及びウイルス粒子の産生を可能にする条件下で、宿主細胞の集団をインキュベートするステップを含み、その際、宿主細胞を宿主細胞集団から除去し、新鮮で、非感染の宿主細胞を宿主細胞の集団に導入し、このようにして、宿主細胞の集団を補給すると共に、宿主細胞の流れを形成する。一部の実施形態では、目的の遺伝子が突然変異を取得する条件下で細胞をインキュベートする。一部の実施形態では、本方法は、更に（ｄ）宿主細胞の集団から、進化した遺伝子産物（例えば、進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、又はその断片若しくはドメイン）をコードするウイルスベクターの変異バージョンを単離するステップを含む。
当業者は、前述した枠組み内で使用可能な種々の特徴を理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、ウイルスベクター又はファージは、繊維状ファージ、例えば、Ｍ１３ファージ、例えば、Ｍ１３選択ファージである。特定の実施形態では、感染性ウイルス粒子の産生に必要な遺伝子は、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）である。複数の実施形態では、ファージは、機能性ｇＩＩＩを欠失している場合もあるが、代わりにｇＩ、ｇＩＩ、ｇＩＶ、ｇＶ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＩＸ及びｇＸを含む。一部の実施形態では、感染性ＶＳＶ粒子の世代は、エンベロープタンパク質ＶＳＶ－Ｇを含む。様々な実施形態で、異なるレトロウイルスベクター、例えば、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）ベクター、又はレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターが使用され得る。複数の実施形態では、レトロウイルスベクターは、例えば、ウイルスのネイティブエンベロープタンパク質の代替物としてＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を用いて、効率的にパッケージングすることができる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、好適な数のウイルス生活環、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも７５００、少なくとも１００００、又はそれ以上の連続したウイルス生活環に応じてインキュベートされ、ここで、Ｍ１３ファージの例示的且つ非限定的な例は、ウイルス生活環毎に１０～２０分である。同様に、宿主細胞が、宿主細胞の集団中に滞留する時間（例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１５０、又は約１８０分）を調整するために、条件を調節することができる。宿主細胞集団は、宿主細胞の密度、又は一部の実施形態では、流入中の宿主細胞密度、例えば、１０３細胞／ｍｌ、約１０４細胞／ｍｌ、約１０５細胞／ｍｌ、約５～１０５細胞／ｍｌ、約１０６細胞／ｍｌ、約５～１０６細胞／ｍｌ、約１０７細胞／ｍｌ、約５～１０７細胞／ｍｌ、約１０８細胞／ｍｌ、約５～１０８細胞／ｍｌ、約１０９細胞／ｍｌ、約５～１０９細胞／ｍｌ、約１０１０細胞／ｍｌ、又は約５～１０１０細胞／ｍｌにより、一部を制御することができる。
プロモータ
一部の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーを、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質をコードする核酸、又は例えば、異種目的配列の発現を制御する鋳型核酸と作動可能に連結する。特定の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーは、細胞型若しくは組織特異的エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータ又はエンハンサーは、同じであるか、又は異種目的配列の発現を天然で制御するプロモータ若しくはエンハンサーに由来する。例えば、オルニチントランスカルボミラーゼプロモータ及びエンハンサーを用いて、オルニチントランスカルボミラーゼ欠失を補正するために本発明により提供されるシステム若しくは方法におけるオルニチントランスカルボミラーゼ遺伝子の発現を制御することができる。一部の実施形態では、本発明における使用のためのプロモータは、例えば、参照遺伝子の対立遺伝子とともに、又はその他の実施形態における異種遺伝子とともに使用されてもよい、表９～２２のいずれか１つに記載の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、プロモータは、表３３のプロモータ又はその機能性断片若しくは変異体である。
一部の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーを、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質をコードする核酸、又は例えば、異種目的配列の発現を制御する鋳型核酸と作動可能に連結する。特定の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーは、細胞型若しくは組織特異的エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータ又はエンハンサーは、同じであるか、又は異種目的配列の発現を天然で制御するプロモータ若しくはエンハンサーに由来する。例えば、オルニチントランスカルボミラーゼプロモータ及びエンハンサーを用いて、オルニチントランスカルボミラーゼ欠失を補正するために本発明により提供されるシステム若しくは方法におけるオルニチントランスカルボミラーゼ遺伝子の発現を制御することができる。一部の実施形態では、本発明における使用のためのプロモータは、例えば、参照遺伝子の対立遺伝子とともに、又はその他の実施形態における異種遺伝子とともに使用されてもよい、表９～２２のいずれか１つに記載の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、プロモータは、表３３のプロモータ又はその機能性断片若しくは変異体である。
市販されている例示的な組織特異的プロモータは、例えば、ＵＲＬ（例えば、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）に見出すことができる。一部の実施形態では、プロモータは、ネイティブプロモータ又は最小プロモータ（例えば、所与の遺伝子の５’領域からの単一断片から構成されるもの）である。一部の実施形態では、ネイティブプロモータは、コアプロモータとその天然の５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、イントロンを含む。他の実施形態では、これらは、起源の異なるプロモータを組み合わせるか、又は同じ起源の最小プロモータと共に遠位エンハンサーをアセンブリングすることにより作製された複合プロモータを含む。
例示的な細胞又は組織特異的プロモータを以下の表に記載し、それらをコードする例示的な核酸は、当技術分野で公知であり、様々なリソース、例えば、ＲｅｆＳｅｑ．を含むＮＣＢＩデータベース、並びにＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ（／／ｅｐｄ．ｅｐｆｌ．ｃｈ／／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を用いて、容易に入手することができる。
使用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成性及び誘導性プロモータ、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、いくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれを発現ベクターに使用してもよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい；尚、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒをコードする核酸又は鋳型核酸は、制御エレメント、例えば、プロモータなどの転写制御エレメントと作動可能に連結される。転写制御エレメントは、一部の実施形態では、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞；又は原核生物細胞（例えば、細菌若しくは古細菌細胞）のいずれかで機能性であり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、原核生物細胞及び真核生物細胞の両方でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御エレメントと作動可能に連結される。
例示の目的のために、空間限定プロモータの例として、限定されないが、ニューロン特異的プロモータ、脂肪細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、平滑筋特異的プロモータ、光受容体特異的プロモータなどが挙げられる。ニューロン特異的空間限定プロモータとして、限定されないが、以下のものが挙げられる：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２，Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモータ、ニューロフィラメントプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ，Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ，Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ－１プロモータ（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７－１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１－１１６６を参照）；セロトニン受容体プロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモータ（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７；Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３－５９４を参照）；ＧｎＲＨプロモータ（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２－３４０６を参照）；Ｌ７プロモータ（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３－２２６を参照）；ＤＮＭＴプロモータ（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８－３６５２を参照）；エンケファリンプロモータ（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３－３８０５を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータ；Ｃａ２＋カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ－α（ＣａｍＫＩＩα）プロモータ（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子－βプロモータ（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２－６０を参照）；など。
脂肪細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ａＰ２遺伝子プロモータ／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の－５．４ｋｂから＋２１ｂｐまでの領域（例えば、Ｔｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：１６０４；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５９０；及びＰａｖｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９７を参照）；グルコーストランスポーター－４（ＧＬＵＴ４）プロモータ（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモータ（例えば、Ｋｕｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：１４７６；及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５７０３を参照）；ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ－１（ＳＣＤ１）プロモータ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０６０３）；レプチンプロモータ（例えば、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：１０１３；及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６２：１８７を参照）；アジドネクチンプロモータ（例えば、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３１：４８４；及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ （２０１０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１：２４０８を参照）；アジプシンプロモータ（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）；レジスチンプロモータ（例えば、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７：１５２２を参照）；など。
心筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下の遺伝子；ミオシン軽鎖－２、α－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、心臓アクチンなどに由来する制御配列が挙げられる。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６；Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４－５９１；Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８－６１７；及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７－４０５１。
平滑筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ＳＭ２２αプロモータ（例えば、Ａｋｙｕｅｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：９８３；及び米国特許第７，１６９，８７４号明細書を参照）；スムーセリンプロモータ（例えば、国際公開第２００１／０１８０４８号パンフレットを参照）；α－平滑筋アクチンプロモータ；など。例えば、ＳＭ２２αプロモータの０．４ｋｂ領域（その内部に２つのＣＡｒＧエレメントが位置する）は、血管の平滑筋細胞特異的発現を媒介することが明らかにされている（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６－２２７８；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２ ８４９－８５９；及びＭｏｅｓｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５－２４２５を参照）。
光受容体特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ロドプシンキナーゼプロモータ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）；網膜色素変性遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモータ（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）；など。
非限定的な例示的細胞特異的プロモータ
当技術分野で公知の細胞特異的プロモータを用いて、例えば、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質の発現を指令することができる。非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、特性決定されており、細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに使用されている。いくつかの非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、米国特許第９８４５４８１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されている。
当技術分野で公知の細胞特異的プロモータを用いて、例えば、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質の発現を指令することができる。非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、特性決定されており、細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに使用されている。いくつかの非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、米国特許第９８４５４８１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されている。
一部の実施形態では、細胞特異的プロモータは、植物で活性のプロモータである。多くの例示的な細胞特異的プロモータが当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，０９７，０２５号明細書；米国特許第５，７８３，３９３号明細書；米国特許第５，８８０，３３０号明細書；米国特許第５，９８１，７２７号明細書；米国特許第７，５５７，２６４号明細書；米国特許第６，２９１，６６６号明細書；米国特許第７，１３２，５２６号明細書；及び米国特許第７，３２３，６２２号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１０／０２６９２２６号明細書；米国特許出願公開第２００７／０１８０５８０号明細書；米国特許出願公開第２００５／００３４１９２号明細書；及び米国特許出願公開第２００５／００８６７１２号明細書（これらは、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、発現カセットを含む。「発現カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸分子の発現のために十分な核酸エレメントを含む核酸構築物を指す。典型的に、発現カセットは、プロモータ配列と作動可能に連結した本発明の核酸分子を含む。「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方の影響を受けるような、単一核酸断片上の２つ以上の核酸断片の会合を指す。例えば、プロモータは、それが、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コーディング配列と作動可能に連結している（例えば、コーディング配列は、プロモータの転写制御下にある）。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列と作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、プロモータは、異種プロモータである。「異種プロモータ」という用語は、本明細書で使用される場合、天然で所与のコーディング配列と作動可能に連結されていないことがわかっているプロモータを指す。特定の実施形態では、発現カセットは、別のエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ）応答エレメント（ＷＲＥ）、及び／又はコーディング配列の発現レベルに影響を及ぼすことがわかっている他のエレメントを含み得る。「プロモータ」は、典型的に、コーディング配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する。特定の実施形態では、プロモータ配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、更にエンハンサーエレメントも含み得る。「エンハンサー」は、典型的に、プロモータ活性を刺激することができ、プロモータの天然のエレメントであってもよいし、又はプロモータのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。特定の実施形態では、プロモータは、その全体がネイティブ遺伝子に由来する。特定の実施形態では、プロモータは、天然に存在する異なるプロモータ由来の様々なエレメントから構成される。特定の実施形態では、プロモータは、合成ヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、種々のプロモータが、様々な組織若しくは細胞型において、又は様々な発生段階において、又は様々な環境条件又は薬剤若しくは転写補因子の存在若しくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指令し得ることが理解されるであろう。ユビキタス、細胞型特異的、組織特異的、発生段階特異的、及び条件的プロモータ、例えば、薬剤応答性プロモータ（例えば、テトラサイクリン応答性プロモータ）は、当業者に周知である。プロモータの例として、限定されないが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモータ、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモータ（ＣＢＡ）及びウサギβグロビンイントロンの複合物）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシン若しくはＮｅｕＮプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモータ；アデノウイルス主要後期プロモータ（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモータ、例えば、ＣＭＶ最初期プロモータ領域（ＣＭＶＩＥ）、ＳＦＦＶプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）プロモータ、合成プロモータ、ハイブリダイゼーションプロモータなどが挙げられる。他のプロモータは、ヒト由来又はマウスをはじめとする他の種由来のものであり得る。一般的なプロモータとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の長い末端反復、［β］－アクチン、ラットインスリンプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータ、トランスサイレチンプロモータ、ＴＢＧプロモータ及び他の肝臓特異的プロモータ、デスミンプロモータ及び類似の筋肉特異的プロモータ、ＥＦ１－α－プロモータ、ＣＡＧプロモータ及び他の構成性プロモータ、多組織特異性を備えるハイブリッドプロモータ、シナプシン及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモータのようなニューロン特異的プロモータが挙げられ、これらは、全て当業者に周知であり、容易に入手可能であり、目的のコーディング配列の高レベルの発現を達成するために使用することができる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も本発明において有用であろう。こうしたプロモータ配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。更に別の例示的なプロモータ配列は、例えば、国際公開第２０１８２１３７８６Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、例えば、肝臓での発現を駆動するために、アポリポタンパク質Ｅエンハンサー（ＡｐｏＥ）又はその機能性断片を使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片の２コピーを使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片をプロモータ、例えば、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータと組み合わせて使用する。
一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。いくつかのケースでは、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。様々な組織特異的調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサーなど）が当技術分野で公知である。例示的な組織特異的調節配列として、限定されないが、以下の組織特異的プロモータが挙げられる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、インスリンプロモータ、グルカゴンプロモータ、ソマトスタチンプロモータ、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモータ、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモータ、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモータ、又は心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモータ。他の例示的なプロモータとしては、β－アクチンプロモータ、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモータ、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシンプロモータ（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質プロモータ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、ＣＤ２プロモータ（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖プロモータ；Ｔ細胞受容体α－鎖プロモータ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータなどのニューロンプロモータ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、並びにニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））などが挙げられる。別の例示的なプロモータ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、組織特異的調節エレメント、例えば、組織特異的プロモータは、例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ若しくはタンパク質発現データ、又はそれらの組合せにより測定して、所与の組織中で高度に発現される遺伝子と作動可能に連結していることがわかっているものから選択される。発現による組織特異性を分析する方法は、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３（２）：３９７－４０６ （２０１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、マルチシストロン性発現構築物である。マルチシストロン性発現構築物として、例えば、第１発現カセット（例えば、第１プロモータ及び第１コーディング核酸配列を含む）と、第２発現カセット（例えば、第２プロモータ及び第２コーディング核酸配列を含む）を有する構築物が挙げられる。こうしたマルチシストロン性発現構築物は、いくつかの事例では、ポリペプチド、例えば、ｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒ及びｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒ鋳型と一緒に、ヘアピンＲＮＡなどの非翻訳遺伝子産物の送達に、特に有用となり得る。一部の実施形態では、マルチシストロン性発現構築物は、例えば、プロモータ干渉、又は不適合性核酸エレメントの近接した存在のために、含まれる導入遺伝子の１つ若しくは複数の発現レベル低下を呈示し得る。マルチシストロン性発現構築物がウイルスベクターの一部である場合、自己相補性核酸配列の存在は、いくつかの事例において、ウイルスの増殖又はパッケージングに必要な構造の形成を妨害し得る。
一部の実施形態では、配列は、ヘアピンを有するＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、ヘアピンＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉｃｒｏＲＮＡである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、Ｕ６又はＨ１プロモータである。一部の実施形態では、核酸構築物は、ＡＡＶ構築物Ｂ１又はＢ２を含む。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、マルチシストロン性発現構築物は、ただ１つのシストロンを含む発現システムと比較して、最適な発現レベルを達成しないと考えられる。２つ以上のプロモータエレメントを含むマルチシストロン性発現構築物を用いて達成される発現レベル低下について示される原因の１つは、プロモータ干渉の現象である（例えば、Ｃｕｒｔｉｎ Ｊ Ａ，Ｄａｎｅ Ａ Ｐ，Ｓｗａｎｓｏｎ Ａ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｉ Ｅ，Ｇｉｎｎ Ｓ Ｌ．Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ａ ｌａｔｅ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｍａｒｃｈ；１５（５）：３８４－９０；及びＭａｒｔｉｎ－Ｄｕｑｕｅ Ｐ，Ｊｅｚｚａｒｄ Ｓ，Ｋａｆｔａｎｓｉｓ Ｌ，Ｖａｓｓａｕｘ Ｇ．Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１５（１０）：９９５－１００２を参照されたい；尚、いずれの参照文献も、プロモータ干渉現象の開示について、参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、プロモータ干渉の問題は、例えば、内部リボソーム進入部位により隔てられる複数のコーディング核酸配列の転写を駆動するただ１つのプロモータを含むマルチシストロン性発現構築物を生成することにより、又は転写インスレータエレメントを備えるそれ自身のプロモータを含むシストロンを分離することによって解消することができる。一部の実施形態では、単一プロモータにより駆動される多シストロンの発現は、シストロンの不均一な発現レベルを招き得る。一部の実施形態では、プロモータを効率的に分離することはできず、分離エレメントは、一部の遺伝子導入ベクター、例えば、一部のレトロウイルスベクターと適合性ではない場合がある。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ
ｍｉＲＮＡ及び他の低分子干渉核酸は、一般に、標的ＲＮＡ転写物切断／分解又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制によって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、いくつかの事例において、典型的に、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現され得る。ｍｉＲＮＡは、一般に、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介してその活性を呈示する。これらの内在性発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し得るが、これらは、後に、ｍｉＲＮＡデュープレックス、更には成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子にプロセシングされる。この成熟ｍｉＲＮＡは、一般に、多タンパク質複合体、ｍｉＲＩＳＣを誘導し、これは、成熟ｍｉＲＮＡに対するその相補性に基づいて標的ｍＲＮＡの標的３’ＵＴＲ領域を識別する。有用な導入遺伝子産物として、例えば、連結ポリペプチドの発現を調節するｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ結合部位を挙げることができる。ｍｉＲＮＡ遺伝子；これら遺伝子の産物及びその相同体の非限定的なリストは、導入遺伝子として、又は低分子干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の標的として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０３００１４６号明細書、２２：２５－２５：４８に列挙されるものなどの方法において有用である。一部の実施形態では、前述したｍｉＲＮＡの１つ又は複数に対する１つ若しくは複数の結合部位は、導入遺伝子、例えば、ｒＡＡＶベクターにより送達される導入遺伝子に組み込まれて、例えば、その導入遺伝子を保有する動物の１つ若しくは複数の組織中の導入遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、組織特異的に導入遺伝子の発現を制御するように、結合部位を選択してもよい。例えば、肝臓特異適ｍｉＲ－１２２に対する結合部位を導入遺伝子に組み込んで、肝臓中のその導入遺伝子の発現を阻害することができる。別の例示的なｍｉＲＮＡ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｍｉＲＮＡ及び他の低分子干渉核酸は、一般に、標的ＲＮＡ転写物切断／分解又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制によって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、いくつかの事例において、典型的に、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現され得る。ｍｉＲＮＡは、一般に、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介してその活性を呈示する。これらの内在性発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し得るが、これらは、後に、ｍｉＲＮＡデュープレックス、更には成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子にプロセシングされる。この成熟ｍｉＲＮＡは、一般に、多タンパク質複合体、ｍｉＲＩＳＣを誘導し、これは、成熟ｍｉＲＮＡに対するその相補性に基づいて標的ｍＲＮＡの標的３’ＵＴＲ領域を識別する。有用な導入遺伝子産物として、例えば、連結ポリペプチドの発現を調節するｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ結合部位を挙げることができる。ｍｉＲＮＡ遺伝子；これら遺伝子の産物及びその相同体の非限定的なリストは、導入遺伝子として、又は低分子干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の標的として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０３００１４６号明細書、２２：２５－２５：４８に列挙されるものなどの方法において有用である。一部の実施形態では、前述したｍｉＲＮＡの１つ又は複数に対する１つ若しくは複数の結合部位は、導入遺伝子、例えば、ｒＡＡＶベクターにより送達される導入遺伝子に組み込まれて、例えば、その導入遺伝子を保有する動物の１つ若しくは複数の組織中の導入遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、組織特異的に導入遺伝子の発現を制御するように、結合部位を選択してもよい。例えば、肝臓特異適ｍｉＲ－１２２に対する結合部位を導入遺伝子に組み込んで、肝臓中のその導入遺伝子の発現を阻害することができる。別の例示的なｍｉＲＮＡ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
しかし、肝臓特異的なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの場合、ｍｉＲ－１２２の過剰発現は、ｍｉＲ－１２２に特異的な分解を引き起こす結合部位を使用する代わりに使用されてもよい。このｍｉＲＮＡは、肝臓の分化及び成熟、並びに肝臓特異的遺伝子の増強された発現と正の関連を示す。従って、一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２２のコーディング配列は、肝臓特異的療法を増強するため、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの成分に付加されてもよい。
ｍｉＲ阻害剤又はｍｉＲＮＡ阻害剤は、概して、ｍｉＲＮＡ発現及び／又はプロセシングを阻止する薬剤である。こうした薬剤の例として、限定されないが、ｍｉｃｒｏＲＮＡアンタゴニスト、ｍｉｃｒｏＲＮＡ特異的アンチセンス、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ、及びｍｉｃｒｏＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖、ヘアピン、短いオリゴヌクレオチド）が挙げられ、これらは、Ｄｒｏｓｈａ複合体とのｍｉＲＮＡ相互作用を阻害する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤、例えば、ｍｉＲＮＡスポンジは、導入遺伝子から細胞に発現させることができる（例えば、Ｅｂｅｒｔ，Ｍ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｐｕｂ Ａｕｇ．１２，２００７に記載の通り；尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ、又は他のｍｉＲ阻害剤は、ＡＡＶと一緒に使用される。ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジは、一般に、相補的ヘプタマーシード配列を介して、ｍｉＲＮＡを特異的に阻害する。一部の実施形態では、単一のスポンジ配列を用いて、ｍｉＲＮＡのファミリー全体をサイレンシングすることができる。細胞中でｍｉＲＮＡ機能をサイレンシングする（ｍｉＲＮＡ標的の抑制解除）他の方法は、当業者に明らかであろう。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４に列挙される配列を含む。また、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットからの例示的なｍｉＲＮＡの一覧も参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、細胞の１部分におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの１つ又は複数の成分（例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型ＲＮＡ、又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの成功後にゲノムから発現される異種目的配列）を発現抑制することは有利である。一部の実施形態では、目的の組織内の細胞型を選択するため、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムのある成分の発現を制限することは有利である。
例えば、所与の組織内、例えば肝臓内の、マクロファージ及び免疫細胞、例えば、肝臓内のクッパー細胞が、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの１つ又は複数の成分における送達媒体の取り込みにおいて会合し得ることは知られている。一部の実施形態では、マクロファージ及び免疫細胞、例えば、クッパー細胞で高度に発現される少なくとも１つのｍｉＲＮＡにおける少なくとも１つの結合部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの少なくとも１つの成分、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドをコードする核酸又は導入遺伝子に含まれる。一部の実施形態では、１つ又は複数の結合部位を標的にするｍｉＲＮＡは、本明細書で参照される表に列記され、例えば、ｍｉＲ－１４２、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐが挙げられる。
一部の実施形態では、導入遺伝子のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ発現又は過剰発現が毒性効果を有し得るような細胞において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒレベル及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ活性を低下させることが有利であり得る。例えば、後根神経節ニューロンへの導入遺伝子過剰発現カセットの送達が遺伝子療法の毒性をもたらし得ることが明らかにされている（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５６９）：ｅａｂａ９１８８（２０２０）を参照されたい、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ニューロン、例えば、後根神経節ニューロンにおけるシステム成分の発現を低減するため、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位がＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの核酸成分に組み込まれてもよい。一部の実施形態では、ニューロンにおけるシステム成分の発現を低減するため、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの核酸成分に組み込まれる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１８２の結合部位、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－３ｐである。一部の実施形態では、ニューロンにおけるシステム成分の発現を低減するため、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの核酸成分に組み込まれる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１８３の結合部位、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－３ｐである。一部の実施形態では、目的の組織又は細胞型に対して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの１つ又は複数の成分の発現の制限を増強するため、ｍｉＲＮＡ結合部位の組合せが使用されてもよい。
表Ａ５は、例示的なｍｉＲＮＡ及び対応する発現細胞、例えば、一部の実施形態における、導入遺伝子又はポリペプチド核酸に結合部位（相補的配列）を組み込み、例えば、そのオフターゲット細胞内での発現を低減することが可能な場合のｍｉＲＮＡを提供する。
ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ活性を調節するための抗ｃｒｉｓｐｒシステム
Ｃａｓ分子活性を調節するための様々な手法は、本明細書に記載のシステム及び方法と組み合わせて使用されてもよい。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、Ｃａｓ分子又はＣａｓドメインを含むＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ）は、抗ｃｒｉｓｐｒ剤（例えば、抗ｃｒｉｓｐｒタンパク質又は抗ｃｒｉｓｐｒ小分子）を使用して調節され得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子又はＣａｓドメインは、例えば、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）応答性インテイン、ｉＣａｓ分子（例えば、ｉＣａｓ９）；４－ＨＴ応答性Ｃａｓ（例えば、アロステリック調節Ｃａｓ９（ａｒＣ９）又は不活性型Ｃａｓ９（ｄＣ９））などの応答性インテインを含む。本明細書に記載のシステム及び方法は、スプリットタンパク質断片の化学的に誘導された二量体化システム（例えば、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）のラパマイシン媒介性二量体化、アブシジン酸誘導性ＡＢＩ－ＰＹＬ１及びジベレリン誘導性ＧＩＤ１－ＧＡＩヘテロ二量体化ドメイン）；ＢＣＬ－ｘＬペプチド及びＢＨ３ペプチドの二量体、Ａ３８５３５８（Ａ３）小分子、デグロンシステム（例えば、ＦＫＢＰ－Ｃａｓ９不安定化システム、オーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＦＲデグロンシステム）、ｇＲＮＡと融合されたアプタマー又はアプタザイム（例えば、テトラサイクリン及びテオフィリン応答性バイオスイッチ）、ＡｃｒＩＩＡ２及びＡｃｒＩＩＡ４タンパク質、並びにＢＲＤ０５３９を使用することもできる。
Ｃａｓ分子活性を調節するための様々な手法は、本明細書に記載のシステム及び方法と組み合わせて使用されてもよい。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、Ｃａｓ分子又はＣａｓドメインを含むＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ）は、抗ｃｒｉｓｐｒ剤（例えば、抗ｃｒｉｓｐｒタンパク質又は抗ｃｒｉｓｐｒ小分子）を使用して調節され得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子又はＣａｓドメインは、例えば、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）応答性インテイン、ｉＣａｓ分子（例えば、ｉＣａｓ９）；４－ＨＴ応答性Ｃａｓ（例えば、アロステリック調節Ｃａｓ９（ａｒＣ９）又は不活性型Ｃａｓ９（ｄＣ９））などの応答性インテインを含む。本明細書に記載のシステム及び方法は、スプリットタンパク質断片の化学的に誘導された二量体化システム（例えば、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）のラパマイシン媒介性二量体化、アブシジン酸誘導性ＡＢＩ－ＰＹＬ１及びジベレリン誘導性ＧＩＤ１－ＧＡＩヘテロ二量体化ドメイン）；ＢＣＬ－ｘＬペプチド及びＢＨ３ペプチドの二量体、Ａ３８５３５８（Ａ３）小分子、デグロンシステム（例えば、ＦＫＢＰ－Ｃａｓ９不安定化システム、オーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＦＲデグロンシステム）、ｇＲＮＡと融合されたアプタマー又はアプタザイム（例えば、テトラサイクリン及びテオフィリン応答性バイオスイッチ）、ＡｃｒＩＩＡ２及びＡｃｒＩＩＡ４タンパク質、並びにＢＲＤ０５３９を使用することもできる。
一部の実施形態では、小分子応答性インテイン（例えば、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＨＴ）応答性インテイン）が、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９）中の特定部位に挿入される。一部の実施形態では、４ＨＴ応答性インテインの挿入は、Ｃａｓ９酵素活性を破壊する。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子（例えば、ｉＣａｓ９）は、エストロゲン受容体（ＥＲＴ２）のホルモン結合ドメインに融合される。一部の実施形態では、ヒトエストロゲン受容体αのリガンド結合ドメインは、例えば、２３１位でＣａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９又は不活性型Ｃａｓ９（ｄＣ９））に挿入されることで、４ＨＴ応答性抗ｃｒｉｓｐｒ Ｃａｓ９（例えば、ａｒＣ９又はｄＣ９）を生成し得る。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９機能の４－ＨＴ用量依存性抑制を提供し得る。一部の実施形態では、ａｒＣ９は、Ｃａｓ９機能の４－ＨＴ用量依存性制御を提供し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９）は、スプリットタンパク質断片に融合される。一部の実施形態では、スプリットタンパク質断片の化学的に誘導された二量体化（例えば、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）のラパマイシン媒介性二量体化）は、低レベルのＣａｓ９分子活性を誘導し得る。一部の実施形態では、化学的に誘導された二量体化システム（例えば、アブシジン酸誘導性ＡＢＩ－ＰＹＬ１及びジベレリン誘導性ＧＩＤ１－ＧＡＩのヘテロ二量体化ドメイン）は、Ｃａｓ９の用量依存性及び可逆的な転写活性化／抑制を誘導し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９誘導性システム（ｃｉＣａｓ９）は、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９）ＲＥＣ２ドメインのＢＣＬ－ｘｌペプチドとの置換及びＢＨ３ペプチドの修飾Ｃａｓ９．ＢＣＬのＮ及びＣ末端への結合を含む。一部の実施形態では、ＢＣＬ－ｘＬ及びＢＨ３ペプチド間の相互作用は、Ｃａｓ９を不活性状態で維持し得る。一部の実施形態では、小分子（例えば、Ａ－３８５３５８（Ａ３））は、ＢＬＣ－ｘｌ及びＢＨ３ペプチド間の相互作用を破壊し、Ｃａｓ９を活性化し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９誘導性システムは、ヌクレアーゼ活性の用量依存性制御を示し得る。一部の実施形態では、デグロンシステムは、外部因子（例えば、小分子リガンド、光、温度、又はタンパク質）による活性化又は非活性化時、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９）の分解を誘導し得る。一部の実施形態では、小分子ＢＲＤ０５３９は、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９）を可逆的に阻害する。抗ｃｒｉｓｐｒタンパク質又は抗ｃｒｉｓｐｒ小分子に関する更なる情報は、例えば、Ｇａｎｇｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄｌｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１９，Ｍａｊｉ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、及びＰａｗｌｕｋ Ａｎｔｉ－ＣＲＩＳＰＲ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １６，ｐａｇｅｓ１２－１７（２０１８）（それらの各々はその全体が参照により組み込まれる）に見出すことができる。
ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ活性を調節するための自己不活性化モジュール
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、自己不活性化モジュールを含む。自己不活性化モジュールは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型、又は両方の発現の減少を引き起こす。特定の理論に束縛されることは意図しないが、自己不活性化モジュールは、不活性化前にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの一時期にわたる発現を提供する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、標的部位でのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの活性により、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡに突然変異（例えば、置換、挿入、又は欠失）が導入され、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又は鋳型の発現の減少をもたらす。自己不活性化モジュールの一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドにおける標的部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡに含まれる。一部の実施形態では、標的部位の１、２、３、４、５、又はそれ以上のコピーは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡに含まれる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡにおける標的部位は、ゲノム上の標的部位と同じ標的部位である。一部の実施形態では、標的部位は、ゲノム上の標的部位と異なる標的部位である。一部の実施形態では、自己不活性化モジュールの標的部位は、ゲノム標的部位と同じ又は異なる鋳型ＲＮＡ又はガイドＲＮＡを用いる。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに基づく標的プライム逆転写を介して修飾される。一部の実施形態では、標的部位は、ニッキングされる。標的部位は、エンハンサー、プロモータ、非翻訳領域、エクソン、イントロン、オープンリーディングフレーム、又はスタッファー配列に組み込まれてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、自己不活性化モジュールを含む。自己不活性化モジュールは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型、又は両方の発現の減少を引き起こす。特定の理論に束縛されることは意図しないが、自己不活性化モジュールは、不活性化前にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの一時期にわたる発現を提供する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、標的部位でのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの活性により、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡに突然変異（例えば、置換、挿入、又は欠失）が導入され、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又は鋳型の発現の減少をもたらす。自己不活性化モジュールの一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドにおける標的部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡに含まれる。一部の実施形態では、標的部位の１、２、３、４、５、又はそれ以上のコピーは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡに含まれる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型をコードするＤＮＡにおける標的部位は、ゲノム上の標的部位と同じ標的部位である。一部の実施形態では、標的部位は、ゲノム上の標的部位と異なる標的部位である。一部の実施形態では、自己不活性化モジュールの標的部位は、ゲノム標的部位と同じ又は異なる鋳型ＲＮＡ又はガイドＲＮＡを用いる。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに基づく標的プライム逆転写を介して修飾される。一部の実施形態では、標的部位は、ニッキングされる。標的部位は、エンハンサー、プロモータ、非翻訳領域、エクソン、イントロン、オープンリーディングフレーム、又はスタッファー配列に組み込まれてもよい。
一部の実施形態では、不活性化時、発現の減少は、自己不活性化モジュールを含まないＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムよりも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、若しくはそれ以上低い。一部の実施形態では、自己不活性化モジュールを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、自己不活性化モジュールを含まないＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムと比較して、標的部位において、オフターゲット部位よりも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％９９％、若しくはそれ以上高い組み込み率を有する。自己不活性化モジュールを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、自己不活性化モジュールを含まないＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムと比較して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％９９％、若しくはそれ以上高い標的部位修飾の効率を有する。一部の実施形態では、自己不活性化モジュールは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドが、ＤＮＡとして、例えば、ウイルスベクターを介して送達される場合に含まれる。
自己不活性化モジュールは、ヌクレアーゼについて記載されている。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ Ａ Ｓｅｌｆ－Ｄｅｌｅｔｉｎｇ ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９ Ｍａｒ １５；１２：１１１－１２２，Ｐ．Ｓｉｎｇｈａｌ，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｃａｓ９：ウイルス送達されるＣａｓ９適用において有効性を維持しながら露出を低減するための方法（ｗｗｗ．ｅｄｉｔａｓｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１９／１０／ａｅｆ＿ａｓｇｃｔ＿ｐｏｓｔｅｒ＿２０１７＿ｆｉｎａｌ＿－＿ｐｒｅｓｅｎｔ＿５－１１－１７＿５１５ｐｍ１＿１４９４５３７３８７＿１４９４５５８４９５＿１４９７４６７４０３．ｐｄｆで入手可能）、及びＥｐｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｉ｜Ｖｏｌｕｍｅ ２４，ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴ １，Ｓ５０，Ｍａｙ ０１，２０１６、及び国際公開第２０１８１０６６９３Ａ１号パンフレットを参照されたい。
小分子
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド）は、小分子を介して制御可能である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、小分子を介して二量体化される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド）は、小分子を介して制御可能である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、小分子を介して二量体化される。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、小分子との二量体化の化学誘導（ＣＩＤ）を介して制御可能である。一般に、ＣＩＤを用いて、細胞生理学を変更するためのタンパク質機能のスイッチを作製する。例示的な高特異性の効率的な二量体化剤は、テールトゥテールに配列された２つの同一のタンパク質結合表面であって、各々がＦＫＢＰ１２の変異体：ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）（ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ＦＶ３６又はＦｖ）に対して高い親和性及び特異性を有するものを有する、リミドゥシド（ＡＰ１９０３）である。１つ又は複数のＦＶドメインの、通常はホモ二量体化に依存する１つ又は複数の細胞シグナル伝達分子への結合は、そのタンパク質をリミドゥシド対照に変換し得る。リミドゥシドでのホモ二量体化は、誘導性カスパーゼの安全性スイッチとの関連で使用される。この分子スイッチは、ヘテロ二量体化小分子、ラパマイシン、又はラパマイシン類似体（「ラパログ」）に基づき、異なる二量体化剤リガンドによって制御される。ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２、及びその変異体に結合し、ＦＫＢＰ１２に融合されたシグナル伝達ドメインのヘテロ二量体化を、ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含むポリペプチドの両方に結合することによって誘導し得る。本願の一部の実施形態では、治療適用のための薬剤として、ラパマイシン、ラパログ及びリミドゥシドの使用を大いに増強する分子スイッチが提供される。
二重スイッチ技術の一部の実施形態では、ＡＰ１９０３（リミドゥシド）などのホモ二量体化剤は、ＦＫＢＰ１２多量体化領域を含むポリペプチドの二量体化又は多量体化を直接的に誘導する。他の実施形態では、ＦＫＢＰ１２多量体化を含むポリペプチドは、多量体化され、又は例えばキメラ抗原受容体など、修飾細胞においても発現される、キメラポリペプチド上のＦＲＢ若しくはＦＲＢ変異体の多量体化領域にも結合する、ラパマイシン若しくはラパログなどのヘテロ二量体化剤に結合することによって凝集される。ラパマイシンは、高親和性（＜１ｎＭ）でＦＫＢＰ１２に結合し、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインとの高親和性の阻害性相互作用を一緒に開始させる、天然生成物のマクロライドである。ＦＲＢは、小さく（８９アミノ酸）、それにより、多数のタンパク質に付加されるとき、タンパク質「タグ」又は「ハンドル」として使用され得る。ＦＲＢ－融合タンパク質のＦＫＢＰ１２－融合タンパク質との共発現は、それらの接近をラパマイシン誘導性にする（１２－１６）。これは、低い治療量でｍＴＯＲを阻害しないが、代わりに、選択されたカスパーゼ－９－融合変異体ＦＲＢドメインと結合する、口内で利用可能なリガンド、ラパマイシン、又はラパマイシンの誘導体（ラパログ）によって調節される細胞安全性スイッチにおける基盤として役立つ。（Ｓａｂａｔｉｎｉ Ｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９４；７８（１）：３５－４３；Ｂｒｏｗｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９４；３６９（６４８３）：７５６－８；Ｃｈｅｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９５；９２（１１）：４９４７－５１；及びＣｈｏｉ Ｊ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７３（５２７２）：２３９－４２を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御の２つのレベルが治療細胞において提供される。実施形態では、制御の第１レベルは、調節可能であり得、すなわち、治療細胞の除去のレベルは、それが治療細胞の部分的除去をもたらすように制御され得る。一部の実施形態では、キメラ抗原ポリペプチドは、ラパマイシン、又はラパマイシン類似体に対する結合部位を含む。複数の実施形態では、治療細胞内に、自殺遺伝子、例えば、カスパーゼポリペプチドをコードするものなども存在する。この制御可能な第１レベルを用いて、継続療法の必要性は、一部の実施形態において、負の副作用のレベルを除去又は低減する必要性と平衡化することができる。一部の実施形態では、ラパマイシン類似体のラパログは、患者に投与され、次にカスパーゼポリペプチド及びキメラ抗原受容体の両方に結合し、それにより、カスパーゼポリペプチドをＣＡＲのその位置に動員し、カスパーゼポリペプチドを凝集させる。凝集時、カスパーゼポリペプチドは、アポトーシスを誘導する。患者に投与されるラパマイシン又はラパマイシン類似体の量は、可変であり得；副作用を低減しＣＡＲ療法を継続するためにアポトーシスによるより低いレベルの細胞の除去が所望される場合、より低いレベルのラパマイシン又はラパマイシンが患者に投与され得る。一部の実施形態では、第２レベルの制御は、最大レベルの細胞除去を達成するように設計されてもよい。この第２レベルは、例えば、リミドゥシド、又はＡＰ１９０３の使用に基づいてもよい。治療細胞の最大１００％を急速に除去することが求められる場合、ＡＰ１９０３が患者に投与されてもよい。多量体ＡＰ１９０３は、カスパーゼポリペプチドに結合し、カスパーゼポリペプチドの多量体化及びアポトーシスを引き起こす。特定の例では、第２レベルは、対象に投与されるＡＰ１９０３のレベルによって調節可能又は制御可能でもあり得る。
特定の実施形態では、例えば、米国特許第１０５８４３５１号明細書の４７：５３－５６：４７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、小分子を、例えば、米国特許第１０５８４３５１号明細書の５６：４８，ｅｔ ｓｅｑ．、及び米国特許第１００４６０４９号明細書の４３：２７－５２：２０（参照により組み込まれるとともに、そのような制御システムにおけるリガンドの説明は５２：２１，ｅｔ ｓｅｑ．）における、制御特性にとって好適なリガンドと一緒に用いて、遺伝子を制御することができる。
化学修飾核酸及び核酸末端の特性
本明細書に記載の核酸（例えば、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡ；又はＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ））は、非修飾又は修飾核酸塩基を含み得る。天然に存在するＲＮＡは、４つの塩基性リボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰから合成されるが、転写後修飾ヌクレオチドを含んでもよい。更に、ＲＮＡにおいて、約１００の異なるヌクレオシド修飾が同定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。ＲＮＡは、天然に存在しない、全体的に合成のヌクレオチドも含み得る。
本明細書に記載の核酸（例えば、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡ；又はＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ））は、非修飾又は修飾核酸塩基を含み得る。天然に存在するＲＮＡは、４つの塩基性リボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰから合成されるが、転写後修飾ヌクレオチドを含んでもよい。更に、ＲＮＡにおいて、約１００の異なるヌクレオシド修飾が同定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。ＲＮＡは、天然に存在しない、全体的に合成のヌクレオチドも含み得る。
一部の実施形態では、化学修飾は、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０３２４５４号明細書、米国特許出願公開第２００９０２８６８５２号明細書、国際出願の国際公開第２０１２／０１９１６８号パンフレット、国際公開第２０１２／０４５０７５号パンフレット、国際公開第２０１２／１３５８０５号パンフレット、国際公開第２０１２／１５８７３６号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９８５７号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９８６１号パンフレット、国際公開第２０１３／０５２５２３号パンフレット、国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット、国際公開第２０１３／０９６７０９号パンフレット、国際公開第２０１３／１０１６９０号パンフレット、国際公開第２０１３／１０６４９６号パンフレット、国際公開第２０１３／１３０１６１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１７３６号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７２号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６７号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１４／０２８４２９号パンフレット、国際公開第２０１４／０８１５０７号パンフレット、国際公開第２０１４／０９３９２４号パンフレット、国際公開第２０１４／０９３５７４号パンフレット、国際公開第２０１４／１１３０８９号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４７１１号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４７６７号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４０３９号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２５４０号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０３０号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０３１号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０２７号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２２１１号パンフレット、国際公開第２０１４／１５８７９５号パンフレット、国際公開第２０１４／１５９８１３号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４２５３号パンフレット、国際公開第２０１５／００６７４７号パンフレット、国際公開第２０１５／０３４９２８号パンフレット、国際公開第２０１５／０３４９２５号パンフレット、国際公開第２０１５／０３８８９２号パンフレット、国際公開第２０１５／０４８７４４号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１２１４号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１１７３号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１１６９号パンフレット、国際公開第２０１５／０５８０６９号パンフレット、国際公開第２０１５／０８５３１８号パンフレット、国際公開第２０１５／０８９５１１号パンフレット、国際公開第２０１５／１０５９２６号パンフレット、国際公開第２０１５／１６４６７４号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１３０号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１２８号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１１８号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１２２６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１２２２号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１３０６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４８４６号パンフレット、国際公開第２０１６／０２２９１４号パンフレット、国際公開第２０１６／０３６９０２号パンフレット、国際公開第２０１６／０７７１２５、又は国際公開第２０１６／０７７１２３（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるものである。化学修飾ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの組み込みが、ヌクレオチド中の修飾の位置に応じて、核酸塩基、バックボーン、又は両方に組み込まれている修飾を生じ得ることが理解される。一部の実施形態では、バックボーン修飾は、欧州特許第２８１３５７０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるものである。一部の実施形態では、修飾キャップは、米国特許出願公開第２００５０２８７５３９号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるものである。
一部の実施形態では、化学修飾核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＲＣＡ：アンチリバースキャップ類似体（ｍ２７．３’－ＯＧＰ３Ｇ）、ＧＰ３Ｇ（非メチル化キャップ類似体）、ｍ７ＧＰ３Ｇ（モノメチル化キャップ類似体）、ｍ３２．２．７ＧＰ３Ｇ（トリメチル化キャップ類似体）、ｍ５ＣＴＰ（５’－メチル－シチジン三リン酸）、ｍ６ＡＴＰ（Ｎ６－メチル－アデノシン５’－三リン酸）、ｓ２ＵＴＰ（２－チオ－ウリジン三リン酸）、及びΨ（プソイドウリジン三リン酸）の１つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、化学修飾核酸は、５’キャップ、例えば７－メチルグアノシンキャップ（例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップ）；過剰メチル化キャップ類似体；ＮＡＤ＋由来のキャップ類似体（例えば、Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８，４５４－４６４（２０１８）に記載のもの）；又は修飾、例えば、ビオチン化されたキャップ類似体（例えば、Ｂｅｄｎａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ３７３，２０１８０１６７（２０１８）に記載のもの）を含む。
一部の実施形態では、化学修飾核酸は、ポリＡテール；不対の５ヌクレオチドによって隣接された１６ヌクレオチド長のステムループ構造（例えば、Ｍａｎｎｉｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，９１１３－９１２６（１９８９）に記載のもの）；三重らせん構造（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０９，１９２０２－１９２０７（２０１２）に記載のもの）；ｔＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、若しくはヴォールトＲＮＡ構造（例えば、Ｌａｂｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８６３，３１２５－３１４７（２０１６）に記載のもの）；１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、２’Ｏ－メチル化ＮＴＰ、若しくはホスホロチオエート－ＮＴＰの組み込み；単一のヌクレオチド化学修飾（例えば、３’末端リボースの反応性アルデヒドへの酸化とその後のアルデヒド－反応性修飾ヌクレオチドのコンジュゲーション）；又は別の核酸分子への化学ライゲーションの１つ又は複数から選択される３’の特徴を含む。
一部の実施形態では、核酸（例えば、鋳型核酸）は、例えば、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、５’リン酸リボチミジン、２’－Ｏ－メチルリボチミジン、２’－Ｏ－エチルリボチミジン、２’－フルオロリボチミジン、Ｃ－５プロピニル－デオキシシチジン（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－デオキシウリジン（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－シチジン（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－ウリジン（ｐＵ）、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、５－メチルデオキシシチジン、５－メチルデオキシウリジンメトキシ、２，６－ジアミノプリン、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆ－シチジン（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｆＵ）、５－メチルｆ－シチジン、５－メチルｆ－ウリジン、Ｃ－５プロピニル－ｍ－シチジン（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｍＵ）、５－メチルｍ－シチジン、５－メチルｍ－ウリジン、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＭＧＢ（副溝結合剤）プソイドウリジン（Ψ）、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、又は５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）から選択される１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、核酸は、バックボーン修飾、例えば、バックボーン中の糖又はリン酸基に対する修飾を含む。一部の実施形態では、核酸は、核酸塩基修飾を含む。
一部の実施形態では、核酸は、表６の１つ又は複数の化学修飾ヌクレオチド、表７の１つ又は複数の化学バックボーン修飾、表８の１つ又は複数の化学修飾キャップを含む。例えば、一部の実施形態では、核酸は、２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれ以上）の異なるタイプの化学修飾を含む。例として、核酸は、例えば、本明細書に記載の、例えば、表６中の２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれ以上）の異なるタイプの修飾核酸塩基を含んでもよい。代替的に又は組み合わせて、核酸は、例えば、本明細書に記載の、例えば、表７中の２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれ以上）の異なるタイプのバックボーン修飾を含んでもよい。代替的に又は組み合わせて、核酸は、例えば、本明細書に記載の、例えば、表８中の１つ又は複数の修飾キャップを含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数のタイプの修飾核酸塩基及び１つ若しくは複数のタイプのバックボーン修飾；１つ若しくは複数のタイプの修飾核酸塩基及び１つ若しくは複数の修飾キャップ；１つ若しくは複数のタイプの修飾キャップ及び１つ若しくは複数のタイプのバックボーン修飾；又は１つ若しくは複数のタイプの修飾核酸塩基、１つ若しくは複数のタイプのバックボーン修飾、及び１つ若しくは複数のタイプの修飾キャップを含む。
一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上）の修飾核酸塩基を含む。一部の実施形態では、核酸の全ての核酸塩基が修飾される。一部の実施形態では、核酸は、バックボーン中の１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上）の位置で修飾される。一部の実施形態では、核酸の全てのバックボーン位置が修飾される。
組成物及びシステムの作製
当業者に理解されるように、核酸構築物及びタンパク質又はポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステム、構築物及びポリペプチド）を設計及び構築する方法は、当技術分野において常用的である。一般に、組換え法が使用され得る。概略については、Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。核酸組成物を設計、調製、評価、精製及び操作する方法は、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
当業者に理解されるように、核酸構築物及びタンパク質又はポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステム、構築物及びポリペプチド）を設計及び構築する方法は、当技術分野において常用的である。一般に、組換え法が使用され得る。概略については、Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。核酸組成物を設計、調製、評価、精製及び操作する方法は、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
本開示は、部分的に、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを、本明細書に記載の鋳型核酸、又は両方をコードする核酸、例えば、ベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、選択マーカ、例えば、抗生物質耐性マーカを含む。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、カナマイシン抵抗性マーカである。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、βラクタム抗生物質に耐性を付与しない。一部の実施形態では、ベクターは、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、ベクターは、カナマイシン耐性マーカを含み、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれる（例えば、標的細胞、組織、器官、又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官、又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）をコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官、又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、選択マーカは、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、ベクターの維持に関与する遺伝子又は配列（例えば、プラスミド維持遺伝子）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクター（例えば、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸、又はその両方をコードする）を標的細胞、組織、器官、又は対象へ投与することにより、前記標的細胞、組織、器官又は対象のゲノム中の１つ若しくは複数の標的部位へのベクターの１部分の組込みが起こる。一部の実施形態では、組み込まれた物質を含む標的部位の９９、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、若しくは１％未満（例えば、標的部位なし）が、ベクター由来の、選択マーカ（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）、又は両方を含む。
本明細書に記載の医薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下の昆虫細胞、酵母、細菌、又はその他の細胞を用いて、組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写因子、例えば、複製起点、好適なプロモータ、並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列、及び５’若しくは３’非転写配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０オリジン、アーリープロモータ、スプライス、及びポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供することができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
様々な哺乳動物細胞培養システムを使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現システムの例として、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬＡ、及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主細胞培養方法は、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載の組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み得る。一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。
タンパク質治療薬の精製については、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
一部の実施形態では、品質基準として、限定はしないが、以下が挙げられる：
（ｉ）ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡの長さ、例えば、ｍＲＮＡが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、３０００、４０００、又は５０００ヌクレオチド長を超えるか否か；
（ｉｉ）ｍＲＮＡ上のポリＡテールの存在、非存在、及び／又は長さ、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、ポリＡテール（例えば、長さが、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、１００ヌクレオチド長のポリＡテール）を含むか否か；
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ上の５’キャップの存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、５’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、７－メチルグアノシンキャップ、例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップであるか否か；
（ｉｖ）ｍＲＮＡ中の１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、又はロックドヌクレオチドから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か；
（ｖ）ｍＲＮＡの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、ｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後、インタクトなままである（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超える）か否か；又は
（ｖｉ）ＤＮＡの修飾に関するシステム中のｍＲＮＡの効力、例えば、ｍＲＮＡを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か。
（ｉ）ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡの長さ、例えば、ｍＲＮＡが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、３０００、４０００、又は５０００ヌクレオチド長を超えるか否か；
（ｉｉ）ｍＲＮＡ上のポリＡテールの存在、非存在、及び／又は長さ、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、ポリＡテール（例えば、長さが、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、１００ヌクレオチド長のポリＡテール）を含むか否か；
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ上の５’キャップの存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、５’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、７－メチルグアノシンキャップ、例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップであるか否か；
（ｉｖ）ｍＲＮＡ中の１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、又はロックドヌクレオチドから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か；
（ｖ）ｍＲＮＡの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、ｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後、インタクトなままである（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超える）か否か；又は
（ｖｉ）ＤＮＡの修飾に関するシステム中のｍＲＮＡの効力、例えば、ｍＲＮＡを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か。
キット、製品、及び医薬組成物
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）及び鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、キットは更に、細胞にシステムを導入するための試薬、例えば、トランスフェクション試薬、ＬＮＰなども含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに好適である。一部の実施形態では、キットは、製品内に配置されるような、１つ若しくは複数のエレメント、組成物（例えば、医薬組成物）、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム、又はその機能性断片若しくは成分を含む。一部の実施形態では、キットは、その使用説明書を含む。
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）及び鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、キットは更に、細胞にシステムを導入するための試薬、例えば、トランスフェクション試薬、ＬＮＰなども含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに好適である。一部の実施形態では、キットは、製品内に配置されるような、１つ若しくは複数のエレメント、組成物（例えば、医薬組成物）、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム、又はその機能性断片若しくは成分を含む。一部の実施形態では、キットは、その使用説明書を含む。
一態様では、本開示は、製品、例えば、その中に本明細書に記載のキット、又はその要素が配置される製品を提供する。
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を更に含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、以下の特徴の１つ又は複数（例えば、１、２、３、若しくは４つ）を有する：
（ａ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
（ａ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
化学、製造、及び制御（ＣＭＣ）
タンパク質治療薬の精製は、例えば、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
タンパク質治療薬の精製は、例えば、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により生産されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。従って、本開示は、いくつかの態様において、例えば、前記品質基準が検定される、特定の品質基準を満たすＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）を製造する方法に関する。本開示は、いくつかの態様において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）で前記品質基準を検定する方法にも関する。一部の実施形態では、品質基準として、限定はしないが、以下のうちの１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２）が挙げられる：
（ｉ）鋳型ＲＮＡの長さ、例えば、鋳型ＲＮＡが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超えるか否か；
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡ上のポリＡテールの存在、非存在、及び／又は長さ、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、ポリＡテールを含む（例えば、長さが、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、１００ヌクレオチド長のポリＡテール）を含むか否か；
（ｉｉｉ）鋳型ＲＮＡ上の５’キャップの存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、５’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、７－メチルグアノシンキャップ、例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップであるか否か；
（ｉｖ）鋳型ＲＮＡ中の１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、又はロックドヌクレオチドから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か；
（ｖ）鋳型ＲＮＡの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後、インタクトなままである（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超える）か否か；
（ｖｉ）ＤＮＡの修飾に関するシステム中の鋳型ＲＮＡの効力、例えば、鋳型ＲＮＡを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；
（ｖｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの長さ、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、若しくは６００アミノ酸長以下である）か否か；
（ｖｉｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドに対する翻訳後修飾の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、リン酸化、メチル化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、グリピヤチヨン（ｇｌｉｐｙａｔｙｏｎ）、若しくはリポイル化、又はそれらの任意の組合せを含むか否か；
（ｉｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチド中の１つ若しくは複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸（例えば、オルニチン、β－アラニン、ＧＡＢＡ、δ－アミノレブリン酸、ＰＡＢＡ、Ｄ－アミノ酸（例えば、Ｄ－アラニン若しくはＤ－グルタミン酸）、アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、シスタチオニン、ランチオニン、ジェンコル酸（Ｄｊｅｎｋｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ジアミノピメリン酸、ホモアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、ホモノルロイシン、ホモセリン、Ｏ－メチル－ホモセリン及びＯ－エチル－ホモセリン、エチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、セレノメチオニン、セレノエチオニン、テルロシステイン、若しくはテルロメチオニンから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸を含むか否か；
（ｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後に、インタクトなままである（例えば、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、若しくは６００アミノ酸長以下である））か否か；
（ｘｉ）ＤＮＡの修飾についてのシステム中のポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの効力、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；又は
（ｘｉｉ）パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在、及び／若しくはレベル、例えば、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか、若しくは実質的に含まないか否か。
（ｉ）鋳型ＲＮＡの長さ、例えば、鋳型ＲＮＡが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超えるか否か；
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡ上のポリＡテールの存在、非存在、及び／又は長さ、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、ポリＡテールを含む（例えば、長さが、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、１００ヌクレオチド長のポリＡテール）を含むか否か；
（ｉｉｉ）鋳型ＲＮＡ上の５’キャップの存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、５’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、７－メチルグアノシンキャップ、例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップであるか否か；
（ｉｖ）鋳型ＲＮＡ中の１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、又はロックドヌクレオチドから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か；
（ｖ）鋳型ＲＮＡの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、鋳型ＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後、インタクトなままである（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、若しくは２００ヌクレオチド長を超える）か否か；
（ｖｉ）ＤＮＡの修飾に関するシステム中の鋳型ＲＮＡの効力、例えば、鋳型ＲＮＡを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；
（ｖｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの長さ、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、若しくは６００アミノ酸長以下である）か否か；
（ｖｉｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドに対する翻訳後修飾の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、リン酸化、メチル化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、グリピヤチヨン（ｇｌｉｐｙａｔｙｏｎ）、若しくはリポイル化、又はそれらの任意の組合せを含むか否か；
（ｉｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチド中の１つ若しくは複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸（例えば、オルニチン、β－アラニン、ＧＡＢＡ、δ－アミノレブリン酸、ＰＡＢＡ、Ｄ－アミノ酸（例えば、Ｄ－アラニン若しくはＤ－グルタミン酸）、アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、シスタチオニン、ランチオニン、ジェンコル酸（Ｄｊｅｎｋｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ジアミノピメリン酸、ホモアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、ホモノルロイシン、ホモセリン、Ｏ－メチル－ホモセリン及びＯ－エチル－ホモセリン、エチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、セレノメチオニン、セレノエチオニン、テルロシステイン、若しくはテルロメチオニンから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、１つ若しくは複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸を含むか否か；
（ｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％が、安定性試験の後に、インタクトなままである（例えば、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、若しくは６００アミノ酸長以下である））か否か；
（ｘｉ）ＤＮＡの修飾についてのシステム中のポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドの効力、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド、又は第２ポリペプチドを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；又は
（ｘｉｉ）パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在、及び／若しくはレベル、例えば、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか、若しくは実質的に含まないか否か。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は医薬組成物は、エンドトキシンを含まない。
一部の実施形態では、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、及び／又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在、及び／若しくはレベルが決定される。複数の実施形態では、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、及び／又は宿主細胞タンパク質混入を含まない、若しくは実質的に含まないか否かが決定される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物又はシステムは、以下の特徴の１つ又は複数（例えば、１、２、３、若しくは４つ）を有する：
（ａ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
（ａ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％未満）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、若しくは０．１％）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
適用
本明細書に記載されるシステムを用いて、任意選択で、本明細書に記載される送達様式（ＡＡＶなどのウイルス送達様式を含む）のいずれかを用いて、本発明はまた、例えば、ヒトなどの哺乳動物対象を含む対象などの生物中の組織において、インビトロ、エクスビボ、インサイチュ、又はインビボのいずれかにかかわらず、ＤＮＡ分子、すなわち、細胞のゲノム中の核ＤＮＡなどを修飾するための適用（方法）を提供する。コード遺伝子をＲＮＡ配列鋳型中に統合することによって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、例えば、機能喪失型突然変異を有する個体における治療用導入遺伝子の発現を提供することによって、機能獲得型突然変異を正常な導入遺伝子で置き換えることによって、機能獲得型突然変異発現をなくすために調節配列を提供することによって、及び／又は動作可能に連結された遺伝子、導入遺伝子及びそのシステムの発現を制御することによって、治療必要性に対処し得る。特定の実施形態において、ＲＮＡ配列鋳型は、宿主細胞の治療必要性に特異的なプロモーター領域、例えば、組織特異的プロモーター又はエンハンサーをコードする。特定の実施形態において、鋳型核酸は、宿主細胞の治療必要性に特異的なプロモーター領域、例えば、組織特異的プロモーター又はエンハンサーをコードする。さらに他の実施形態において、プロモーターは、例えば、治療的介入のために、コード配列に動作可能に連結され得る。
本明細書に記載されるシステムを用いて、任意選択で、本明細書に記載される送達様式（ＡＡＶなどのウイルス送達様式を含む）のいずれかを用いて、本発明はまた、例えば、ヒトなどの哺乳動物対象を含む対象などの生物中の組織において、インビトロ、エクスビボ、インサイチュ、又はインビボのいずれかにかかわらず、ＤＮＡ分子、すなわち、細胞のゲノム中の核ＤＮＡなどを修飾するための適用（方法）を提供する。コード遺伝子をＲＮＡ配列鋳型中に統合することによって、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、例えば、機能喪失型突然変異を有する個体における治療用導入遺伝子の発現を提供することによって、機能獲得型突然変異を正常な導入遺伝子で置き換えることによって、機能獲得型突然変異発現をなくすために調節配列を提供することによって、及び／又は動作可能に連結された遺伝子、導入遺伝子及びそのシステムの発現を制御することによって、治療必要性に対処し得る。特定の実施形態において、ＲＮＡ配列鋳型は、宿主細胞の治療必要性に特異的なプロモーター領域、例えば、組織特異的プロモーター又はエンハンサーをコードする。特定の実施形態において、鋳型核酸は、宿主細胞の治療必要性に特異的なプロモーター領域、例えば、組織特異的プロモーター又はエンハンサーをコードする。さらに他の実施形態において、プロモーターは、例えば、治療的介入のために、コード配列に動作可能に連結され得る。
特定の態様において、本発明は、細胞、組織又は対象における標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法であって、本明細書に記載されるシステムを（任意選択で、本明細書に記載される様式によって）、細胞、組織又は対象に投与することを含み、ここで、システムが、異種対象配列を標的ＤＮＡ鎖中に挿入し、それによって、標的ＤＮＡ鎖を修飾する、方法を提供する。特定の実施形態において、したがって、異種対象配列が、細胞、組織、又は対象において発現される。いくつかの実施形態において、細胞、組織又は対象は、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞、組織又は対象である。このように修飾される例示的な細胞は、肝細胞、肺上皮細胞、イオノサイトを含む。このような細胞は、初代細胞であってもよく、又は不死化されていない。関連する態様において、本発明はまた、哺乳動物組織を治療する方法であって、本明細書に記載されるシステムを哺乳動物に投与し、それによって、組織を治療することを含み、ここで、組織が、異種対象配列を欠いている、方法を提供する。上記の態様及び実施形態のいずれかの特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、一時的に存在する核酸として提供される。
いくつかの実施形態において、本発明のシステムは、標的ＤＮＡ中に挿入、置換、欠失、又はそれらの組合せを生成することが可能である。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、遺伝子の発現（例えば転写又は翻訳）を増加又は減少させる。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、プロモーター又はエンハンサーにおける配列、例えば、転写因子に結合する配列を改変、付加、又は除去することによって、遺伝子の発現（例えば転写又は翻訳）を増加又は減少させる。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、遺伝子の翻訳を改変し（例えば、アミノ酸配列を改変する）、開始若しくは終止コドンを挿入又は除去し、遺伝子の翻訳フレームを改変又は固定する。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、例えば、スプライス受容又は供与部位を挿入、除去、又は改変することによって、遺伝子のスプライシングを改変する。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、転写産物又はタンパク質半減期を改変する。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、細胞内のタンパク質局在化を改変する（例えば、細胞質からミトコンドリアに、細胞質から細胞外空間中に（例えば、分泌タグを付加する））。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、タンパク質折り畳みを改変する（例えば、改善する）（例えば、異常な折り畳みのタンパク質の蓄積を防止するために）。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、遺伝子、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を改変、増加、減少させる。
複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、例えば、代用血液因子又は代用酵素、例えば、リソソーム酵素を発現する治療導入遺伝子を提供することができる。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、ファブリー病治療のためのアガルシダーゼアルファ又はベータ；ゴーシェ病のためのイミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ、又はアルグルセラーゼ；リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ウォルマン病／ＣＥＳＤ）のためのセベリパーゼアルファ；ムコ多糖症のためのラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、又はガルスルファーゼ；ポンペ病のためのアルグルコシダーゼアルファを発現するのに有用である。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、血液因子欠損症のための因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ又はＸＩＩＩを発現するのに有用である。
一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、オルガネラタンパク質、例えば、ミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質、又は膜タンパク質）をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、膜タンパク質、例えば、ＣＡＲ以外の膜タンパク質、及び／又は内因性ヒト膜タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞外タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、感覚タンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質をコードする。他のタンパク質は、免疫受容体タンパク質、例えば、合成免疫受容体タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体タンパク質（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、又は抗体を含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、免疫細胞を修飾してもよい。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、Ｔ細胞を修飾してもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の任意の亜集団、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、γ－δ、ナイーブＴ細胞、幹細胞記憶Ｔ細胞、中央記憶Ｔ細胞、又は亜集団の混合物を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、Ｔ細胞内のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を送達又は修飾してもよい。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞に送達してもよい。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムは、少なくとも１つのＣＡＲをナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に送達してもよい。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、少なくとも１つのＣＡＲをナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に送達してもよい。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、少なくとも１つのＣＡＲを前駆細胞、例えば、Ｔ、ＮＫ、又はＮＫＴ細胞の前駆細胞に送達してもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲで修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞、）、又は少なくとも１つのＣＡＲで修飾された細胞の組み合わせ（例えば、ＣＡＲ－ＮＫ／Ｔ細胞の混合物）を用いて、ＭａｃＫａｙ，ｅｔ ａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８，２３３－２４４（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）におけるＣＡＲ療法の標的化可能なランドスケープにおいて同定されたような病態を処置する。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＡＣｈＲ（胎児アセチルコリン受容体）、ＡＤＧＲＥ２、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＬＬＩ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６９、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ１、ＥＧＰ－２（上皮糖タンパク質２）、ＥＧＰ－４０（上皮糖タンパク質４０）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２、ヒト上皮成長因子受容体２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、Ｆｌｔ３受容体、葉酸受容体ａ、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＧＤ３（ガングリオシドＧ３）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＧＰＩ００、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン６受容体、ＩＬ１３Ｒａ２（インターロイキン１３受容体３０サブユニットアルファ２）、κ軽鎖、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＬｅＹ（ルイスＹ）、Ｌ１ＣＡＭ（ＬＩ細胞接着分子）、ＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２）、ＭＡＲＴＩ、ＭＡＧＥ－Ａ１（メラノーマ関連抗原Ａｌ）、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＵＣ１６（ムチン１６）、ＭＵＣＩムチンＩ）、ＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１（癌精巣抗原）、ＰＲＩ（プロテイナーゼ３）、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、ＴＦＭ－３、ＴＡＣＩ、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ｐ５３、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ｈＲＯＲｌ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ＶＥＧＦ－Ｒ２（血管内皮成長因子Ｒ２）、ＷＴ－１（ウィルムス腫瘍タンパク質）、及びＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ））、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ））、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ））の抗原からなる群から選択される腫瘍又は病原体抗原に特異的なＣＡＲを含む。
一部の実施形態では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、又は前駆細胞は、生体外で修飾され、次に患者に送達される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、本明細書に記載の方法の一つによって送達され、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、又は前駆細胞は、患者においてインビボで修飾される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、以下：大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、脳下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液、又はその他の細胞型若しくは組織からの組織若しくは細胞に送達される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、疾患、例えば、癌、炎症性疾患、感染症、遺伝子異常、又はその他の疾患を処置する。癌は、大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、脳下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液、又はその他の細胞若しくは組織型の癌であり得、複数の癌を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、経腸投与（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、又は頬側投与）により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、硬膜外、脳内、脳室内、皮膚上、鼻内、動脈内、関節内、海綿体内、眼内、骨髄内輸液、腹腔内、髄腔内、子宮内、膣内、膀胱内、血管周囲、又は経粘膜投与）により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、局所投与（例えば、経皮投与）により投与される。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、標的細胞に対して、複数の修飾を同時又は順次のいずれかによって作製することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、既に修飾された細胞を更に修飾することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、相補的技術によって編集された細胞、例えば、遺伝子編集細胞、例えば、１つ若しくは複数のＣＲＩＳＰＲノックアウトを有する細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、以前に編集された細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、以前の修飾は、Ｔ細胞、例えば、内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ）、ＨＬＡクラスＩ（Ｂ２Ｍ）、ＰＤ１、ＣＤ５２、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＤＧＫにおける遺伝子ノックアウトを含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、ＴＣＲ又はＣＡＲを、以前に修飾されているＴ細胞に挿入する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラマ、アルパカ、ラクダ、ヤク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、又はダチョウ）由来の細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞、又は真菌細胞を修飾するために、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを実験ツール若しくは研究ツールとして使用するか、又は実験方法若しくは研究方法に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、タンパク質、鋳型、若しくは異種目的配列を（例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞、又は真菌細胞において）発現させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、誘導性プロモータ（例えば、小分子誘導性プロモータ）の制御下で、タンパク質、鋳型、若しくは異種目的配列を発現させることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム又はそのペイロードを、例えば、誘導性プロモータの使用により、調整可能な制御のために設計する。例えば、目的の遺伝子を駆動するプロモータ、例えば、Ｔｅｔは、組込み時にサイレントであり得るが、いくつかの事例では、小分子誘導剤、例えば、ドキシサイクリンへの曝露時に活性化され得る。一部の実施形態では、調整可能な発現は、遺伝子（例えば、治療用遺伝子）の処置後制御を可能にし、例えば、小分子依存性投与効果を可能にする。複数の実施形態では、小分子依存性投与効果は、例えば、局所投与により、時間的及び／又は空間的に、遺伝子産物のレベルを変化させることを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムで使用されるプロモータは、誘導性、例えば、宿主の内在性分子及び／又はそこに投与された外因性小分子に対して応答性であってもよい。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、ノンコーディング及び／又は調節制御領域を改変し、例えば、内因性遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、遺伝子発現の上方制御又は下方制御を誘導する。一部の実施形態では、調節制御領域は、プロモータ、エンハンサー、ＵＴＲ、ＣＴＣＦ部位、及び／又は遺伝子発現制御領域の１つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用し、リピート伸長病（例えば、表２６の疾患）を治療又は予防、又はその重症度若しくは症状を低減し得る。一部の実施形態では、リピート伸長病は、トリヌクレオチドリピートの拡大を含む。一部の実施形態では、対象は、リピートの少なくとも１０、２０、３０、４０、若しくは５０コピーを有する。複数の実施形態では、リピート伸長病は、遺伝性疾患である。リピート伸長病の非限定的な例として、ハンチントン病（ＨＤ）及び筋緊張性ジストロフィーが挙げられる。例えば、健常者は、ＣＡＧトリヌクレオチドリピートの１０～３５の間のタンデムコピーを有することがある一方で、ハンチントン病患者は、＞４０コピーを有することが多く、例えば、伸長及び機能障害性ハンチンチンタンパク質をもたらし得る。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、例えば、リピート領域の末端のＤＮＡを認識し、一方の鎖に切れ目を入れることによってリピート拡大を修正する（図３０）。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの鋳型ＲＮＡ成分は、健常対象に特徴的ないくつかのリピート、例えば、約２０リピート（例えば、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、若しくは３５～４０の間のリピート）を有する領域を含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの鋳型ＲＮＡ成分は、ＴＰＲＴによって標的部位に複製される。一部の実施形態では、第２鎖ニック及び第２鎖合成が、次いで、（例えば、本明細書に記載のような）正確な数のリピートを含む新規に複製されたＤＮＡの組み込みをもたらす。一部の実施形態では、システムは、リピート領域の末端のＤＮＡを認識し、鋳型は、新たな数のリピートについての情報を運ぶ。実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、個体及び／又は個体細胞に存在するリピートの数にかかわらず、このようにして使用され得る。複数のリピートの存在のおかげで、代替的な非ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ治療（例えば、ＣＲＩＳＰＲに基づく相同組換え治療）が、一部の実施形態において、予測不能な修復挙動をもたらし得る。リピート伸長病及び原因リピートの更なる非限定的な例については、例えば、Ｌａ Ｓｐａｄａ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１（４）：２４７－２５８（２０１０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、例えば、予防的療法として、健常者を処置してもよい。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、一部の実施形態において、例えば、目的の疾患に対して保護的であることが示されている突然変異を作製するため、標的化され得る。こうした疾患及び保護的突然変異標的の例示的なリストは、表２２に見出すことができる。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムは、肝臓の適応症を治療するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）の治療的適用に好ましい肝疾患としては、限定はされないが、表１０Ａ～１０Ｄ又は１１Ａ～１１Ｇいずれか、又は参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表５のいずれかから選択される疾患が挙げられる。例示的な実施形態において、ＯＴＣ欠損症は、ＯＴＣ遺伝子の全て又はフラグメント、例えば、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表５に含まれるＯＴＣ遺伝子の全て又はフラグメントを送達することによって対処される。いくつかの実施形態において、ＯＴＣ欠損症は、完全なＯＴＣ遺伝子発現カセットを、突然変異遺伝子の機能を補完するゲノムに送達することによって対処される。いくつかの実施形態において、その内因性遺伝子座における病原性突然変異を置き換えるＯＴＣ遺伝子のフラグメントが使用される。他の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムは、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４の列１、以下の「肺疾患」の段落、又は表１０Ａ～１０Ｄ又は１１Ａ～１１Ｇのいずれかに示される対応する遺伝子をコードする遺伝子発現カセットの全て又はフラグメントを送達することによって、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４の列６、以下の「肺疾患」の段落、又は表１０Ａ～１０Ｄ又は１１Ａ～１１Ｇいずれかから選択される病態を対処するのに使用される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子発現カセットの全て又はフラグメントが、病原性突然変異の内因性遺伝子座に送達される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子発現カセットの全て又はフラグメントが、ゲノムの別個の遺伝子座において統合され、突然変異遺伝子の機能を補完する。
特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４、又は以下の「肺疾患」の段落における遺伝子を含む異種対象配列を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムは、表１１Ａ～１１Ｇのいずれかの適応症を治療するのに使用される。例えば、いくつかの実施形態において、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムは、細胞内のゲノムＤＮＡ中の標的部位を修飾し、ここで、細胞は、例えば、表１１Ａ～１１Ｇのいずれかに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ａ～１１Ｇのいずれかの遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態において、標的部位は、ゲノム中のランダムな部位にある。いくつかの実施形態において、標的部位は、ＧＳＨ配列中にある。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、表１１Ａに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ａの遺伝子における突然変異を含む肝細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、表１１Ｂに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ｂの遺伝子における突然変異を含むＨＳＣである。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、表１１Ｃに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ｃの遺伝子における突然変異を含むＣＮＳ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、表１１Ｄに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ｄの遺伝子における突然変異を含む眼の細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、表１１Ｅに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ｅの遺伝子における突然変異を含む肺の細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、表１１Ｆに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ｆの遺伝子における突然変異を含む筋細胞（例えば、骨格筋細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、表１１Ｇに列挙される対応する適応症を有する対象における、表１１Ｇの遺伝子における突然変異を含む皮膚細胞である。
更なる好適な適応症
本明細書に提供されるシステム又は方法、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓを含むものによって処置することができる例示的な好適な疾患及び障害として、限定されないが：Ｂａｒａｉｔｓｅｒ－Ｗｉｎｔｅｒ症候群１型及び２型；視神経萎縮及び難聴を伴う糖尿病及び尿崩症；α１アンチトリプシン欠損症；ヘパリン補助因子ＩＩ欠損症；副腎白質ジストロフィー；ケッペン・ルビンスキー症候群；トリーチャー・コリンズ症候群１型；ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ（核２型、４型、又は８型）欠損症；ジストニア、多血球血症及び肝硬変を伴う高マンガン血症；腸のカルチノイド腫瘍；ラブドイド腫瘍素因症候群２型；ウィルソン病；高フェニルアラニン血症、ｂｈ４欠損症、ａ、部分ｐｔｓ欠損症、ＢＨ４欠損症、Ｄ、及び非ｐｋｕに起因；高インスリン性低血糖症、家族性３、４、及び５；毛包性角化症；口腔・顔面・指趾症候群；ＳｅＳＡＭＥ症候群；非症候性感音難聴、ミトコンドリア性；蛋白尿；インスリン依存性糖尿病性の分泌型下痢症候群；もやもや病５；ダイアモンド・ブラックファン貧血１、５、８、及び１０；偽性軟骨形成不全症脊椎骨端異形成症候群；脆弱角膜症候群２；ホモシスチン尿症を伴うメチルマロン酸血症、；アダムス・オリバー症候群５及び６；常染色体劣性無ガンマグロブリン血症２；皮膚形成異常症、後頭；熱性発作、家族性、１１；ムコ多糖症ＶＩ型、ＶＩ型（重度）、及びＶＩＩ型；マーデンウォーカー様症候群；偽性新生児副腎白質ジストロフィー；球状体ミオパチー；鎖骨頭蓋形成不全症；多発性皮膚粘膜静脈奇形；急性乳児肝不全；シトリン欠損症に起因する新生児肝内胆汁うっ滞；心室中隔欠損症１；眼歯指形成異常；ウィルムス腫瘍１；ワイル・マルケサニ様症候群；腎欠損症；白内障１、４、常染色体優性、常染色体優性、多発型、小角膜を伴う、コポック様、若年性、小角膜及び糖尿を伴う、及び核びまん性で非進行性；歯限局型低ホスファターゼ症；脳・眼・顔・骨格症候群；統合失調症１５；脳アミロイド血管症、ＡＰＰ関連；血球貪食性リンパ組織球症、家族性、３；ポルホビリノーゲンシンターゼ欠損症；発作性運動失調２型；鼻指節症候群３型；進行性家族性心ブロックＩＢ型；神経膠腫感受性１；リヒテンシュタイン・クノール症候群；無汗性Ｘ連鎖外胚葉性異形成症；バーター症候群３型、低カルシウム尿症を伴う３、及び４；炭酸脱水酵素ＶＡ欠損症、高アンモニア血症、心筋症に起因；腱性拘縮・ミオパチー・肺線維症を伴う遺伝性線維化多形皮膚萎縮症；複合型ｄ－２－及び１－２－ヒドロキシグルタル酸尿症；アルギナーゼ欠損症；錐体杆体ジストロフィー２及び６；スミス・レムリ・オピッツ症候群；ムコリピドーシスＩＩＩガンマ；ブラウ症候群；ウェルナー症候群；髄膜腫；ヨードチロシンのカップリング異常；デュビン・ジョンソン症候群；３－オキソ－５アルファ－ステロイドデルタ４－デヒドロゲナーゼ欠損症；バウチャー・ノイハウザー症候群；脳内鉄蓄積症；精神遅滞、Ｘ連鎖１０２及び症候性１３；家族性、下垂体腺腫の素因；脳梁低形成；高αリポタンパク質血症２；フェロキシダーゼの欠損症；免疫不全を伴う成長ホルモン非感受性；マリネスコ・シェーグレン症候群；マートソルフ症候群；注視麻痺、進行性脊柱側弯症を伴う家族性水平性；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｒｉｌｅｙ症候群；低カルシウム尿高カルシウム血症、家族性、１型及び３型；ルビンシュタイン・テイビ症候群；エプスタイン症候群；若年性網膜分離症；ベッカー型筋ジストロフィー；ロイス・ディーツ症候群１、２、３；先天性筋肥大－脳症候群；家族性若年性痛風；精子形成不全１１、３、及び８；口腔顔面裂１１及び７、口唇口蓋裂－外胚葉異形成症候群；精神遅滞、Ｘ連鎖、非特異的、症候性、ヘデラ型、及び症候性、ｗｕ型；複合型酸化的リン酸化欠損症１、３、４、１２、１５、及び２５；前頭側頭型認知症；クニースト異形成症；家族性心筋症；良性家族性血尿症；褐色細胞腫；アミノグリコシド誘導性難聴；γアミノ酪酸トランスアミナーゼ欠損症；眼皮膚白皮症ＩＢ型、３型、及び４型；腎コロボーマ症候群；中枢神経髄鞘低形成；Ｈｅｎｎｅｋａｍリンパ管拡張症－リンパ浮腫症候群２；片頭痛、家族性脳底；遠位脊髄性筋萎縮、Ｘ連鎖３；Ｘ連鎖脳室周囲異所性灰白質；小頭症；ムコ多糖症、ＭＰＳ－Ｉ－Ｈ／Ｓ、ＭＰＳ－ＩＩ、ＭＰＳ－ＩＩＩ－Ａ、ＭＰＳ－ＩＩＩ－Ｂ、ＭＰＳ－ＩＩＩ－Ｃ、ＭＰＳ－ＩＶ－Ａ、ＭＰＳ－ＩＶ－Ｂ；乳児パーキンソニズム・ジストニア；ＴＤＰ４３封入体を伴う前頭側頭型認知症、ＴＡＲＤＢＰ関連；遺伝性びまん性胃癌；シアリドーシスＩ型及びＩＩ型；小頭症－毛細血管異形成症候群；遺伝性乳癌卵巣癌症候群；出血を伴う脳小血管病；非ケトン性高グリシン血症；ナバホ神経肝障害；耳下顎関節頭症候群２；痙性対麻痺１５、２、３、３５、３９、４、常染色体優性、５５、常染色体劣性、及び５Ａ；常染色体劣性皮膚弛緩症ＩＡ型及びＩＢ型；溶血性貧血、非球状赤血球性、グルコースリン酸イソメラーゼ欠損症に起因；ハッチンソン・ギルフォード症候群；蕁麻疹及び難聴を伴う家族性アミロイド腎症；大動脈弁上狭窄症；びまん性掌蹠角化症、ボスニア型；ホルト・オーラム症候群；コフィン・シリス／知的能力障害；左右軸形成異常；パパディリーノ症候群；小眼球症２；頭蓋縫合早期癒合症及び歯異常；パラガングリオーマ１；シュナイダーロビンソン症候群；心室細動；活性化ＰＩ３Ｋデルタ症候群；ハウエル・エバンス症候群；ラーセン症候群、優性型；Ｖａｎ Ｍａｌｄｅｒｇｅｍ症候群２；ＭＹＨ関連ポリポーシス；６－ピルボイル－テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症；アラジール症候群１型及び２型；リンパ管筋腫症；筋・眼・脳病；ＷＦＳｌ関連障害；原発性肥大性骨関節症、常染色体劣性２；不妊；ネスター・ギラーモプロジェリア症候群；ミトコンドリア三機能タンパク質欠損症；左心低形成症候群２；原発性拡張型心筋症；網膜色素変性症；ヒルシュスプルング病３；アップショー・シュールマン症候群；Ｄｅｓｂｕｑｕｏｉｓ異形成症２；下痢症３（分泌型ナトリウム、先天性、症候性）及び５（タフティング腸症を伴う、先天性）；先天性爪肥厚症４及び２型；皮質下梗塞及び白質脳症を伴う脳常染色体優性及び劣性動脈症；Ｖｉ ｔｅｌ １ｉ型ジストロフィー（Ｖｉ ｔｅｌ １ｉ ｆｏｒｍ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）；ＩＩ型、ＩＶ型、ＩＶ（複合型肝・筋障害）、Ｖ型、及びＶＩ型；非定型レット症候群；房室中隔欠損症４；パピヨン・ルフェーヴル症候群；レーバー黒内障；Ｘ連鎖遺伝性運動感覚ニューロパチー；進行性硬化性ポリオジストロフィー；ゴールドマン・ファーブル症候群；腎肝膵異形成；パリスター・ホール症候群；アミロイド形成トランスサイレチンアミロイドーシス；メルニック・ニードルズ症候群；ハイパー免疫グロブリンＥ症候群；網膜色素変性症を伴う脊髄後索性失調症；点状軟骨異形成症１型、Ｘ連鎖劣性及び２Ｘ連鎖優性；偏位水晶体、孤立性常染色体劣性及び優性；家族性寒冷蕁麻疹ｌ；家族性大腸ポリポーシス１及び３；汗孔角化症８、播種性表在性光線型；ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長スペクトラム；脳海綿状奇形２；滲出性硝子体網膜症６；巨脳症－先天性血管拡張性大理石様皮膚；ＴＡＲＰ症候群；糖尿病、永続型新生児、神経学的特徴を伴う；多指症の有無とは無関係の短肋骨胸部異形成１１又は３；多毛性骨軟骨異形成症；βサラセミア；ニーマン・ピック病Ｃｌ型、Ｃ２型、Ａ型、及びＣｌ型、成体型；シャルコー・マリー・トゥース病ＩＢ型、２Ｂ２型、２Ｃ型、２Ｆ型、２１型、２Ｕ型（軸索）、１Ｃ（脱髄性）、優性中間体Ｃ、劣性中間体Ａ、２Ａ２、４Ｃ、４Ｄ、４Ｈ、ＩＦ、ＩＶＦ、及びＸ；チロシン血症Ｉ型；発作性心房細動；紫外線高感受性症候群；歯欠損症、選択的、３及び４；メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー；長鎖ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；先天性無虹彩症；左室緻密化障害５；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症；冠動脈心疾患；全爪甲白斑症；遠位関節拘縮症２Ｂ型；網膜色素変性症１０、１１、１２、１４、１５、１７、及び１９；ロビノー・ソラウフ症候群；テノリオ症候群；プロラクチノーマ；神経線維腫症、ランド型２；脳・眼異常を伴う先天性筋ジストロフィージストログリカノパチー、Ａ２型、Ａ７型、Ａ８型、Ａｌｌ型、及びＡ１４型；内臓逆位、内臓、２、４、及び６、常染色体；ヤンコビッチリベラ症候群；家族性部分リポジストロフィー、２型及び３型；ヘモグロビンＨ病、無欠損；多中心性骨溶解症、結節症及び関節症；甲状腺無形成；アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼファミリー、メンバー９欠損症；アレキサンダー病；フィタン酸貯蔵疾患；乳癌卵巣癌、家族性１、２、及び４；プロリンデヒドロゲナーゼ欠損症；小児低ホスファターゼ症；膵欠損及び先天性心疾患；ビタミンＤ依存性くる病、ｌ型及び２型；Ｉｒｉｄｏｇｏｎｉｏｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ優性型及び１型；常染色体劣性無汗性外胚葉形成不全症候群；精神遅滞、Ｘ連鎖、３、２１、３０、及び７２；遺伝性出血性末梢血管拡張症２型；眼瞼裂狭小・眼瞼下垂・逆内眼角贅皮；アデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症；発作、良性家族性乳児性、２；先端異骨症２、ホルモン抵抗性の有無とは無関係；ファロー四徴症；網膜色素変性症２、２０、２５、３５、３６、３８、３９、４、４０、４３、４５、４８、６６、７、７０、７２；リソソーム酸リパーゼ欠損症；アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー；ウォーカー・ワールブルグ先天性筋ジストロフィー；ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）；運動失調を伴う進行性ミオクローヌスてんかん；小児欠神てんかん２、１２（特発性全身性、それに対する感受性）５（夜間前頭葉）、夜間前頭葉１型、部分、多様な焦点を伴う、進行性ミオクローヌス３、及びＸ連鎖、多様な学習障害及び行動障害を伴う；ＱＴ延長症候群；ジカルボキシルアミノ酸尿症；短指症Ａ１型及びＡ２型；複数の凝固因子欠損症を伴う弾性線維性仮性黄色腫のような障害；多臓器平滑筋機能障害症候群；Ｃｅｎａｎｉ ｌｅｎｚ型合指症；ジュベール症候群１、６、７、９／１５（２遺伝子性）、１４、１６、及び１７、及び口顔面指症候群ｘｉｖ；Ｄｉｇｉｔｏｒｅｎｏｃｅｒｅｂｒａｌ症候群；網膜芽細胞腫；ジスキネジア、家族性、顔面痙攣を伴う；遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチーＩＩＢ型及びＩＩＡ型；家族性高インスリン症；皮質下嚢胞領域２ａを伴う大頭型白質脳症；オーセ症候群；ウィーデマン・スタイナー症候群；剥脱性魚鱗癬；先天性ミオトニー；肉芽腫性疾患、慢性、Ｘ連鎖、変異体；２－メチルブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；サルコイドーシス、早期発症型；緑内障、先天性及び緑内障、先天性、コロボーマ；乳癌、それに対する感受性；神経セロイドリポフスチン症２、６、７、及び１０；先天性全身性リポジストロフィー２型；フルクトースジホスファターゼ欠損症；先天性拘縮性くも指症；リンチ症候群Ｉ及びＩＩ；ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；バーン－マッキューン症候群；心筋梗塞１；色覚異常２及び７；網膜色素変性症７３；第１色覚異常；多小脳回症、非対称性、両側前頭頭頂；脊髄性筋萎縮、遠位、常染色体劣性、５；メチルマロニルＣｏＡムターゼ欠損症に起因するメチルマロン酸尿症；家族性孔脳症；ハーラー症候群；耳－口蓋－指趾症候群、Ｉ型及びＩＩ型；ソトス症候群１又は２；チトクロムｃオキシダーゼ欠損症に起因する心脳筋症、致死型乳児；Ｐａｒａｓｔｒｅｍｍａｔｉｃ低身長症；サイロトロピン放出ホルモン抵抗性、全身性；２型糖尿病、及びインスリン依存性、２０；胸部大動脈瘤及び大動脈解離；エストロゲン抵抗性；メープルシロップ尿症１Ａ型及び３型；尿道下裂１及び２、Ｘ連鎖；若年性異染性白質ジストロフィー、遅発乳児型、及び成人型；初期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病；神経障害、遺伝性感覚性、ＩＣ型；精神遅滞、常染色体優性３１；網膜色素変性症３９；乳癌、早期発症型；メイ・ヘグリン異常；ゴーシェ病、１型及び亜急性神経障害性；テムタミー症候群；脊髄性筋萎縮、下肢優性２、常染色体優性；ファンコニ貧血、相補グループＥ、Ｉ、Ｎ、及びＯ；
アルカプトン尿症；ヒルシュスプルング病；混合性マロン酸及びメチルマロン酸尿症；不整脈原性右室心筋症５型、８型、及び１０型；先天性脂肪腫性過成長、血管奇形、及び表皮母斑；チモシー症候群；グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ欠損症；筋クローヌス性ジストニア；神崎病；中性１アミノ酸輸送欠陥；神経下垂体性尿崩症；甲状腺ホルモン代謝、異常；心筋症を伴う良性肩甲腓骨型筋ジストロフィー；肝臓におけるグリコーゲン合成酵素欠損症を伴う低血糖症；肥大型心筋症；筋無力症候群、先天性、１１、アセチルコリン受容体欠損症に関連する；Ｘ連鎖症候性精神遅滞５；Ｓｔｏｒｍｏｒｋｅｎ症候群；再生不良性貧血；知的能力障害；正常カリウム血性周期性四肢麻痺、カリウム感受性；ダノン病；ネフロン癆１３、１５及び４；甲状腺中毒性周期性四肢麻痺及び甲状腺中毒性周期性四肢麻痺２；多尾性精子及び過剰なＤＮＡに関連する不妊症；緑内障、原発性開放隅角、若年発症型；無フィブリノゲン血症及び先天性無フィブリノゲン血症；多発性嚢胞腎疾患２、成人型、及び乳児型；家族性晩発性皮膚ポルフィリン症；小脳眼腎症候群（ネフロン癆、眼球運動失行及び小脳異常）；前頭側頭型認知症、染色体３連鎖及び前頭側頭型認知症、ユビキチン陽性；異栄養性異形成症（Ｍｅｔａｔｒｏｐｈｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）；免疫不全－動原体不安定性－顔面奇形症候群２；貧血、非球状赤血球溶血性、Ｇ６ＰＤ欠損症に起因；気管支拡張症、増加した汗塩化物３の有無とは無関係；筋繊維不均等症を伴う先天性ミオパチー；カーニー複合、１型；停留精巣、一側性又は両側性；ジーメンス型水疱性魚鱗癬；単独ルトロピン欠損症（Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｕｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ＤＦＮＡ２非症候性難聴；クライン・ワールデンブルグ症候群；灰色血小板症候群；胆汁酸合成異常、先天性、２；４６、ＸＹ性逆転、１、３、及び５型；急性間欠性ポルフィリン症；コルネリア・デランゲ症候群１及び５；グリシン尿症；錐体杆体ジストロフィー３；異常フィブリノゲン血症；カラク症候群；精神遅滞を伴わない先天性筋ジストロフィージストログリカノパシー、Ｂ５型；新生児眼振、Ｘ連鎖；先天性角化異常症、常染色体劣性、１、３、４、及び５；小頭症、網脈絡膜症、リンパ浮腫、又は精神遅滞の有無とは無関係；高リジン血症；バルデ・ビードル症候群１、１１、１６、及び１９；常染色体劣性中心核ミオパチー；フレイジャー症候群；尾部退行症候群；外眼筋線維症、先天性、１、２、３ａ（外眼障害の有無とは無関係）、３ｂ；プラダー・ウィリー様症候群；悪性黒色腫；ブルーム症候群；ダリエー病、分節性；多中心性骨溶解症・腎症；ヘモクロマトーシス１、２Ｂ、及び３型；進行性外眼筋麻痺を伴う乳児小脳性運動失調症、並びに小脳性運動失調症、精神遅滞、及び平衡障害症候群２；左心低形成症候群；てんかん、難聴、及び精神遅滞症候群；トランスフェリン血清レベル量的形質遺伝子座２；眼白子症、Ｉ型；マルファン症候群；脳眼奇形を伴う先天性筋ジストロフィージストログリカノパチー、Ａ１４及びＢ１４型；高アンモニア血症、ＩＩＩ型；潜在眼球症候群；先天性全身性脱毛症；成人低ホスファターゼ症；マンノース結合タンパク質欠損症；牛眼黄斑ジストロフィー；常染色体優性捻転ジストニア４；ネフローゼ症候群、３型、５型、眼球異常の有無とは無関係、７型、及び９型；発作、早期乳児てんかん性脳症７；新生児持続性高インスリン性低血糖症；血小板減少症、Ｘ連鎖；新生児筋緊張低下；Ｏｒｓｔａｖｉｋ Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ Ｓｏｌｂｅｒｇ症候群；肺高血圧症、原発性、１、遺伝性出血性末梢血管拡張症を伴う；下垂体依存性高コルチゾール症；疣贅状表皮発育異常症；表皮水疱症、接合部型、ｌｏｃａｌｉｓａｔａ変異体；チトクロムｃオキシダーゼｉ欠損症；キンドラー症候群；筋硬化症、常染色体劣性；総動脈幹；デュアン症候群２型；ＡＤＵＬＴ症候群；ツェルウェーガー症候群スペクトル；白質脳症、運動失調を伴う、脳幹及び脊髄の障害と乳酸上昇を伴う、白質消失を伴う、及び進行性で卵巣不全を伴う；アンチトロンビンＩＩＩ欠損症；全前脳胞症７；ロバーツＳＣアザラシ肢症症候群；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群３及び７、肝脳型、及び１３（脳ミオパチー型）；孔脳症２；小頭症、正常な知能及び免疫不全；巨大軸索ニューロパチー；スタージ・ウェーバー症候群、毛細血管奇形、先天性、１；ファブリー病及びファブリー病、心亜型；グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ欠損症；ファンコニ・ビッケル症候群；先端短肢異形成症；てんかん、特発性全身性、それに対する感受性、１２；大脳基底核石灰化、特発性、４；ポリグルコサン小体ミオパチー１、免疫不全の有無とは無関係；前立腺の悪性腫瘍；先天性顔面外胚葉異形成症；先天性心疾患；加齢性黄斑変性症３、６、１１、及び１２；先天性筋強直症、常染色体優性型及び劣性型；低マグネシウム血症１、腸；亜硫酸酸化酵素単独欠損症；ピック病；プラスミノーゲン欠損症、Ｉ型；合指症３型；錐体杆体ジストロフィー 遺伝性エナメル質形成不全症；偽原発性高アルドステロン症；末端骨異形成症；出生前バーター症候群２型；精神遅滞を伴う先天性筋ジストロフィージストログリカノパチー、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、及びＢ１５型；家族性小児筋無力症；リンパ増殖性症候群１、１（Ｘ連鎖）、及び２；高コレステロール血症及び高コレステロール血症、常染色体劣性；卵巣腫瘍；小児ＧＭ１ガングリオシドーシス；症候性Ｘ連鎖精神遅滞１６；リボース－５－リン酸イソメラーゼ欠損症；アルツハイマー病、１型、３型、及び４型；アンデルセン・タウィル症候群；多発性骨癒合症候群３；凍瘡状エリテマトーデス１；血球貪食性リンパ組織球症、家族性、２；アクセンフェルト・リーガー症候群３型；コアを伴う先天性ミオパチー；軽症の軟骨形成異常症を伴う変形性関節症；ペルオキシソーム形成異常症；重症先天性好中球減少症；遺伝性神経痛性筋萎縮症；掌蹠角化症、非表皮溶解性、限局性又はびまん性；異常プラスミノーゲン血症；家族性結腸直腸癌；痙性運動失調５、常染色体劣性、シャルルヴォア・サグネ１、１０、又は１１型、常染色体劣性；前頭骨幹端異形成症ランド３；遺伝性第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子欠損症；脊椎手掌異形成、エーラス・ダンロス症候群様、免疫調節異常を伴う、アグリカン型、先天性関節脱臼を伴う、短肢・手型、Ｓｅｄａｇｈａｔｉａｎ型、錐体杆体ジストロフィーを伴う、及びコズロースキー型；魚鱗癬未熟児症候群；スティックラー症候群１型；巣状分節性糸球体硬化症５；５－オキソプロリナーゼ欠損症；症候性小眼球症５、７、及び９；若年性ポリポーシス／遺伝性出血性毛細血管拡張症候群；ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；若年発症成人型糖尿病、２型；精神遅滞、症候性、クラウス・イェンセン型、Ｘ連鎖；難聴、蝸牛、近視及び知的障害を伴う、前庭障害を伴わない、常染色体優性、Ｘ連鎖２；脊椎手根骨足根骨癒合症候群；ＳＴＩＮＧ関連血管炎、乳児発症；ミオパチーを伴う中性脂質蓄積症；カルシウム流入障害２に起因するＴ細胞不活性化を伴う免疫機能障害；心臓・顔・皮膚症候群；コルチコステロンメチルオキシダーゼ２型欠損症；早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー；間質性腎炎、核巨大化；トリメチルアミン尿症；周期熱を伴う高グロブリンＤ血症；悪性高熱症感受性タイプ１；精神遅滞、低身長症及び網膜色素変性症を伴う長睫毛症；乳腺癌；Ｂ因子欠損症；ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー；左室心筋緻密化障害；魚眼病；フィンランド先天性ネフローゼ症候群；肢帯型筋ジストロフィー、ＩＢ、２Ａ、２Ｂ、２Ｄ、Ｃｌ、Ｃ５、Ｃ９、Ｃ１４型；特発性線維性肺胞炎、慢性型；原発性家族性肥大型心筋症；アンジオテンシンＩ変換酵素、良性血清増加性；ＣＤ８欠損症、家族性；プロテウス症候群；グルコース－６－リン酸輸送障害；ベルエソン－フォルスマン－レーマン症候群；ツェルウェーガー症候群；脊髄性筋萎縮、ＩＩ型；前立腺癌、遺伝性、２；血小板減少症、血小板機能異常、溶血、及び不均衡なグロビン合成；先天性疾患ｏｆグリコシル化ＩＢ型、ＩＤ型、１Ｇ型、１Ｈ型、１Ｊ型、ＩＫ型、ＩＮ型、ＩＰ型、２Ｃ型、２Ｊ型、２Ｋ型、Ｉｌｍ型；ヘルリッツ型接合型表皮水疱症；全般てんかん熱性けいれんプラス３、１型、２型；統合失調症４；冠動脈疾患、常染色体優性２；先天性角化異常症、常染色体優性、２及び５；皮質下帯状ヘテロトピア、Ｘ連鎖；アデニル化キナーゼ欠損症；Ｘ連鎖重症複合免疫不全；コプロポルフィリン症；アミロイド心筋症、トランスサイレチン関連；低カルシウム血症、常染色体優性１；ブルガダ症候群；先天性筋無力症候群、アセタゾラミド応答性；原発性低マグネシウム血症；硬結性骨化症；前頭側頭型認知症及び／又は筋萎縮性側索硬化症３及び４；メバロン酸尿症；神経鞘腫症２；視神経萎縮症を伴う遺伝性運動感覚性ニューロパチー；晩発性皮膚ポルフィリン症；離断性骨軟骨炎；発作、良性家族性新生児、１、及び／又はミオキミア；ＱＴ延長症候群、ＬＱＴ１亜類型；精神遅滞、上顎前方突出、及び斜視；乳児特発性高カルシウム血症；低ゴナドトロピン性性腺機能低下症１１、嗅覚脱失の有無とは無関係；硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症；原発性常染色体劣性小頭症１０、２、３、及び５；大動脈弓離断症；先天性無巨核球性血小板減少症；ヘルマンスキー・パドラック症候群１、３、４、及び６；ＱＴ延長症候群１、２、２／９、２／５、（２遺伝子性）、３、５及び５、後天性、それに対する感受性；アンダーマン症候群；網膜錐体ジストロフィー３Ｂ；骨髄性プロトポルフィリン症；セピアプテリン還元酵素欠損症；極長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；高フェリチン血症・白内障症候群；シルバー痙性対麻痺症候群；シャルコー・マリー・トゥース病；心房中隔欠損症２；カルネヴァーレ症候群；無汗症を伴う疼痛への遺伝的非感受性；カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍；低カリウム血性周期性四肢麻痺１及び２；乳幼児突然死症候群；鉄過剰症を伴う低色素性小球性貧血；グルコーストランスポーター１欠損症症候群２；白質ジストロフィー、ミエリン形成不全性、１１及び６；錐体一色覚；大理石骨病、常染色体優性１及び２型、劣性４、劣性１、劣性６；重症先天性好中球減少症３、常染色体劣性又は優性；メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ欠損症、常染色体優性；発作性家族性心室細動；赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症；骨盤異形成症；多形性心室頻拍；遠位型ミオパチーＭａｒｋｅｓｂｅｒｙ－Ｇｒｉｇｇｓｔｙｐｅ型；ＵＤＰグルコース－ヘキソース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ欠損症；心臓性突然死；Ｎｅｕ－Ｌａｘｏｖａ症候群１；無トランスフェリン血症；副甲状腺機能亢進症１及び２；皮膚悪性黒色腫１；指節癒合症、近位、ｌｂ；進行性偽リウマチ性異形成症；ウェルドニッヒ・ホフマン病；軟骨無発生症２型；全前脳症２、３、７、及び９；シンドラー病、１型；石灰化及び嚢胞を伴う大脳網膜微小血管症；内臓変位、臓側、Ｘ連鎖；結節硬化症候群；カルタゲナー症候群；甲状腺ホルモン抵抗性、全身性、常染色体優性；ベストロフィン症、常染色体劣性；爪障害、非症候性先天性、８；モーア－トラネジャーグ症候群；錐体杆体ジストロフィー１２；難聴；卵巣白質ジストロフィー；尿細管性アシドーシス、近位、眼球異常及び精神遅滞を伴う；ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症；発話障害を伴う焦点性てんかん、精神遅滞の有無とは無関係；運動失調末梢血管拡張症候群；Ｂｒｏｗｎ－Ｖｉａｌｅｔｔｏ－Ｖａｎ ｌａｅｒｅ症候群及びＢｒｏｗｎ－Ｖｉａｌｅｔｔｏ－Ｖａｎ Ｌａｅｒｅ症候群２；心筋症；脱髄型末梢神経障害、中枢性髄鞘形成不全症；角膜ジストロフィー、フックス内皮、４；カウデン症候群３；ジストニア２（捻転、常染色体劣性）、３（捻転、Ｘ連鎖）、５（ドパ反応性のタイプ）、１０、１２、１６、２５、２６（筋クローヌス性）；骨端骨異形成症、多発性、近視及び伝音難聴を伴う；心伝導障害、非特異性；鰓耳症候群２及び３；ペルオキシソーム生合成異常症１４Ｂ、２Ａ、４Ａ、５Ｂ、６Ａ、７Ａ、及び７Ｂ；家族性腎性糖尿；カンジダ症、
家族性、２、５、６、及び８；自己免疫疾患、多系統、乳児発症型；早期乳児てんかん性脳症２、４、７、９、１０、１１、１３、及び１４；瀬川症候群、常染色体劣性；難聴、常染色体優性３ａ、４、１２、１３、１５、常染色体優性無症候性感音性１７、２０、及び６５；先天性赤血球形成異常性貧血、Ｉ及びＩＩ型；Ｓ錐体増強症候群；成人型神経セロイドリポフスチン症；心房細動、家族性、１１、１２、１３、及び１６；ノルム病；骨肉腫；限局性白皮症；ビオチニダーゼ欠損症；肉芽腫を伴う混合性細胞性・液性免疫障害；アルパース脳症；ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症；若年発症成人型糖尿病、１型、２型、１１型、３型、及び９型；異型ポルフィリン症；乳児皮質過骨症；テストステロン１７－β－デヒドロゲナーゼ欠損症；Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症；チロシナーゼ陰性眼皮膚白皮症；原発性線毛機能不全症２４；橋小脳低形成４型；線毛機能不全、原発性、７、１１、１５、２０及び２２；特発性基底核石灰化症５；脳萎縮；頭蓋縫合早期癒合症１及び４；円錐角膜１；ＲＡＳ病；先天性副腎過形成及び先天性副腎低形成症、Ｘ連鎖；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群１１、１２（心筋症型）、２、４Ｂ（ＭＮＧＩＥ型）、８Ｂ（ＭＮＧＩＥ型）；高血圧を伴う短指症；扁平角膜２；アースコグ症候群；多発性骨端異形成症５又は優性；角膜内皮ジストロフィー２型；アミノアシラーゼ１欠損症；発話及び言語発達遅延；ニコライデスバライスター症候群；エンテロキナーゼ欠損症；欠指症、外胚葉異形成症、及び口唇裂／口蓋症候群３；先天性多発性関節拘縮症、遠位、Ｘ連鎖；Ｐｅｒｒａｕｌｔ症候群４；イェルベル・ランゲニールセン症候群２；遺伝性非ポリポーシス大腸癌；ロビノウ症候群、常染色体劣性、常染色体劣性、ｂｒａｃｈｙ－ｓｙｎ－ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌｙを伴う；神経線維肉腫；チトクロムｃ酸化酵素欠損症；膀胱尿管逆流８；ドーパミンβ－水酸化酵素欠損症；糖タンパク質糖鎖不全症候群Ｉ及びＩＩ型；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３；良性家族性新生児乳児発作；膵炎、慢性、それに対する感受性；根性点状軟骨異形成症２型及び３型；チトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ欠損に起因するステロイド合成障害；迷路無形成・小耳症及び小歯症（ＦＡＭＭ）を伴う難聴；ロスムンド・トムソン症候群；皮質異形成、複合型、他の脳奇形５及び６を伴う；筋無力症、家族性小児性、１；毛髪鼻指節異形成症Ｉ型；Ｗｏｒｔｈ病；脾臓低形成；モリブデン補助因子欠損症、相補群Ａ；セバスチャン症候群；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２及び３；ヴァイユ・マルケザーニ症候群１及び３；小頭骨異形成原発性小人症２型；サーファクタント代謝異常症、肺、２及び３；重度Ｘ連鎖筋細管ミオパチー；膵癌３；血小板型出血障害１５及び８；チロシナーゼ陽性眼皮膚白皮症；Ｂｏｒｒｏｎｅ Ｄｉ Ｒｏｃｃｏ Ｃｒｏｖａｔｏ症候群；ＡＴＲ－Ｘ症候群；スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症；補体成分４、その部分的欠損、機能障害性ｃｌ阻害剤に起因；先天性中枢性低換気症；乳児型低ホスファターゼ症；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１欠損症；悪性リンパ腫、非ホジキン；高オルニチン血症－高アンモニア血症－ホモシトルリン尿症症候群；シュワルツ・ヤンペル症候群１型；胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座１；ミオパチー、遠位、前脛骨発症を伴う；ヌーナン症候群１及び４、レオパード症候群１；緑内障１、開放隅角、ｅ、Ｆ、及びＧ；ケニー・キャフェイ症候群２型；ＰＴＥＮ過誤腫症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；インスリン抵抗性糖尿病及び黒色表皮腫；小眼球症、単独３、５、６、８、及びコロボーマ６を伴う；レイン症候群；早期卵巣機能不全４、５、７、及び９；アラン・ハーンドン・ダドリー症候群；シトルリン血症Ｉ型；アルツハイマー病、家族性、３、痙性対麻痺及び失行を伴う；家族性片麻痺性片頭痛１型及び２型；嚢胞性腎疾患を伴う脳室拡大；弾性線維性仮性黄色腫；ＭＴＨＦＲ欠損症、ＣＢＳ欠損症、及びホモシスチン尿症に起因するホモシスチン血症、ピリドキシン応答性；拡張型心筋症１Ａ、１ＡＡ、１Ｃ、１Ｇ、ＩＢＢ、１ＤＤ、ＩＦＦ、１ＨＨ、ＩＩ、ＩＫＫ、ＩＮ、ＩＳ、１Ｙ、及び３Ｂ；筋肉ＡＭＰグアニンオキシダーゼ欠損症（Ｍｕｓｃｌｅ ＡＭＰ ｇｕａｎｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；家族性乳癌；遺伝性鉄芽球性貧血；ミオグロビン尿症、急性再発性、常染色体劣性；神経フェリチン症；心不整脈；グルコーストランスポーター１欠損症症候群；全前脳症シークエンス；遺伝性血管障害、腎症、動脈瘤、及び筋痙攣を伴う；イソ吉草酸ＣｏＡ脱水素酵素欠損症；カルマン症候群１、２、及び６；新生児永続型糖尿病；先端脳梁症候群、Ｓｃｈｉｎｚｅｌ型；ゴードン症候群；ＭＹＨ９関連障害；ドンナイバロー症候群；重症先天性好中球減少症及び６、常染色体劣性；シャルコー・マリー・トゥース病、ＩＤ型及びＩＶＦ型；コフィン・ローリー症候群；ミトコンドリア３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症；低マグネシウム血症、発作、及び精神遅滞；坐骨膝蓋骨異形成症；坐骨膝蓋骨異形成症－筋緊張低下－けいれん症候群３；痙性対麻痺５０、常染色体劣性；非特異的な骨格異常を伴う低身長；乳児重症ミオクロニーてんかん；プロピオン酸アカデミア；思春期ネフロン癆；大頭症、巨人症、顔異形症候群；シュタルガルト病４；エーラス・ダンロス症候群７型（常染色体劣性）、古典型、２型（早老性）、ヒドロキシリジン欠損症、４型、４型変異体、及びテネイシンＸ欠損症に起因；近視６；扁平股；家族性寒冷自己炎症性症候群２；心臓・大血管の形成異常；フォン・ヴィルブランド病２Ｍ型及び３型；ガラクトキナーゼ欠損症；ブルガダ症候群１；ステリル・スルファターゼ欠損を伴うＸ連鎖魚鱗癬；先天性眼球欠損症；組織球症－リンパ節腫大プラス症候群；無虹彩症、小脳性運動失調、及び精神遅滞；左室緻密化障害３；筋萎縮性側索硬化症１型、６型、１５型（前頭側頭型認知症の有無とは無関係）、２２（前頭側頭型認知症の有無とは無関係）、及び１０；骨形成不全症１２型、５型、７型、８型、Ｉ型、ＩＩＩ型、正常な強膜を伴う、優性型、劣性出生時致死性；血液腫瘍；ソラマメ症、それに対する感受性；肺線維症及び／又は骨髄不全、テロメア関連、１及び３；優性遺伝性視神経萎縮症；優性栄養障害型表皮水疱症、皮膚の非存在下；筋ジストロフィー、先天性、巨大円錐型；多発性胃腸閉鎖；マキューン・オルブライト症候群；爪膝蓋骨症候群；マクラウド神経有棘赤血球症候群；分類不能型免疫不全症９；ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ部分欠損症；偽性低アルドステロン症１型常染色体優性及び劣性と２型；ウロカニン酸ヒドラターゼ欠損症；異所形成；メッケル症候群７型；チェディアック・東症候群、チェディアック・東症候群、成人型；ＡＤＡ欠損症に起因する重症複合免疫不全、小頭症を伴う、発達遅滞、及び電離放射線に対する感受性、非定型、常染色体劣性、Ｔ細胞陰性、Ｂ細胞陽性、ＮＫ陽性のＮＫ細胞陰性；インスリン抵抗性；ステロイド１１β－モノオキシゲナーゼの欠損；膝窩翼状片症候群；遺伝性出血性末梢血管拡張症に関連する肺動脈高血圧症；難聴、常染色体劣性１Ａ、２、３、６、８、９、１２、１５、１６、１８ｂ、２２、２８、３１、４４、４９、６３、７７、８６、及び８９；原発性高シュウ酸尿症、Ｉ型、型、及びＩＩＩ型；フォンオイレンブルグの先天性パラミオトニー；Ｄｅｓｂｕｑｕｏｉｓ症候群；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩ（遅発性）、及びＩＩ（乳児性）欠損症；続発性甲状腺機能低下症；下顎顔面形成異常、トリーチャー・コリンズ型、常染色体劣性；カウデン症候群１；リー・フラウメニ症候群１；アスパラギン合成酵素欠損症；マラッティア・レベンティネース；視神経萎縮症９；乳児痙攣及び発作性舞踏アテトーゼ、家族性；ビタミンＥ欠損症を伴う失調症；島細胞過形成；三好型筋ジストロフィー１；血栓性素因、遺伝性、プロテインＣ欠乏症に起因、常染色体優性及び劣性；フェクトナー症候群；プロペルジン欠損症、Ｘ連鎖；精神遅滞、常同運動、てんかん、及び／又は大脳奇形；クレアチン欠損症、Ｘ連鎖；石灰化上皮腫；チアノーゼ、一過性新生児及び非定型腎障害；眼球運動失行を伴う成人発症型失調症；血管腫、毛細血管乳児；ＰＣ－Ｋ６ａ；全身性優性栄養障害型表皮水疱症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ミオパチー、中心核、１、先天性、過剰な筋紡錘を伴う、遠位、１、乳酸アシドーシス、及び鉄芽球性貧血１、ミトコンドリア進行性、先天性白内障、難聴、及び発育遅延、及び管状凝集体を伴う、２；良性家族性新生児発作１及び２；原発性肺高血圧症；リンパ浮腫、原発性、脊髄形成異常症を伴う；先天性ＱＴ延長症候群；家族性滲出性硝子体網膜症、Ｘ連鎖；常染色体優性無汗性外胚葉形成不全；原始小人症；家族性肺毛細血管腫症；カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ欠損症；内臓筋症；家族性地中海熱及び家族性地中海熱、常染色体優性；複合型部分及び完全１７－αヒドロキシラーゼ／１７、２０－リアーゼ欠損症；耳・口蓋・指症候群、Ｉ型；腎結石症／骨粗鬆症、低リン血症性、２；家族性１及び３型高リポ蛋白血症；表現型；チャージ連合；Ｆｕｈｒｍａｎｎ症候群；乏毛症－リンパ浮腫－毛細血管拡張症症候群；軟骨異形成症Ｂｌｏｍｓｔｒａｎｄ型；アクロエリスロ角皮症（ａｃｒｏｅｒｙｔｈｒｏｋｅｒａｔｏｄｅｒｍａ）；神経伝導速度遅延、常染色体優性；遺伝性癌素因症候群；頭蓋骨幹異形成症、常染色体優性；常染色体劣性脊髄小脳失調症１及び１６；プロタンパク質転換酵素１／３欠損症；Ｄ－２ヒドログルタル酸尿症２；過剰驚愕症２及び遺伝性過剰驚愕症；セントラルコア病；オピッツＧ／ＢＢＢ症候群；嚢胞性線維症；Ｔｈｉｅｌ－Ｂｅｈｎｋｅ角膜ジストロフィー；ビスホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症；ミトコンドリア短鎖エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ１欠損症；外胚葉異形成皮膚脆弱性症候群；Ｗｏｌｆｒａｍ様症候群、常染色体優性；小球性貧血；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；白血球粘着欠損症Ｉ及びＩＩＩ型；多発性内分泌腫瘍症、ランド４型；新生児一過性表皮水疱症；プリムローズ症候群；非小細胞肺癌；先天性筋ジストロフィー；複合性リパーゼ欠損症；コール・カーペンター症候群２；房室中隔欠損症及び共通房室接合部；キサンチンオキシダーゼ欠損症；ワールデンブルグ症候群１、４Ｃ、及び２Ｅ型（神経性障害を伴う）；スティックラー症候群、ｌ型（非症候性眼性）及び４型；角膜脆弱性－球形角膜－青色強膜－関節過伸展性；小球状水晶体；Ｃｈｕｄｌｅｙ－ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ症候群；単純型表皮水疱症及び肢帯型筋ジストロフィー、斑状色素沈着を伴う単純型、幽門閉鎖を伴う単純型、単純型、常染色体劣性、及び幽門閉鎖を伴う；レット障害；神経細胞移動異常症；下垂体異常を伴う成長ホルモン欠損症；リー病；線状掌蹠角化症１；Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ－Ｚｗｅｙｍｕｌｌｅｒ症候群；中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ欠損症；自閉症に対する感受性、Ｘ連鎖３；裂孔原性網膜剥離、常染色体優性；家族性熱性発作８；尺骨及び腓骨欠損－重度四肢欠損症；左室緻密化障害６；染色体１、９及び１６のセントロメア不安定と免疫不全；神経スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症；クッシング症候群；ドーパミン受容体ｄ２、その脳密度低下；Ｃ様症候群；腎異形成、網膜色素性異栄養症、小脳失調症及び骨格異形成症；卵巣形成不全１；ピアソン症候群；多発ニューロパチー、難聴、失調症、網膜色素変性症、及び白内障；進行性肝内胆汁うっ滞；常染色体優性、常染色体劣性、及びＸ連鎖劣性アルポート症候群；アンジェルマン症候群；アーミッシュ小児てんかん症候群；自己免疫性リンパ増殖症候群、ｌａ型；水頭症；マルファン様体型；裸リンパ球症候群２型、相補群Ｅ；劣性栄養障害型表皮水疱症；第Ｈ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第ｖ因子及び第ｖｉｉｉ因子、複合欠損症、２、ｘｉｉｉ、サブユニット、欠損症；粉状層間白内障３；疣贅－低ガンマグロブリン血症－感染症－
骨髄性細胞貯留；良性遺伝性舞踏病；ヒアルロノグルコサミニダーゼ欠損症；小頭症、食道裂孔ヘルニア及びネフローゼ症候群；発達及び精神遅滞、下顎顔面形成異常、小頭症、及び口蓋裂；リンパ浮腫、遺伝性、ｉｄ；思春期遅発症；見かけの鉱質コルチコイド過剰；乳児全身性動脈石灰化２；メチルマロン酸尿症、ｍｕｔ（０）型；先天性心疾患、多発型、２；家族性低形成性、糸球体嚢胞腎；脳・眼・顔・骨格症候群２；シュタルガルト病１；精神遅滞、常染色体劣性１５、４４、４６、及び５；プロリダーゼ欠損症；メチルマロン酸尿症ｃｂｌＢ型、；小口病；内分泌－大脳骨異形成；滑脳症１、２（Ｘ連鎖）、３、６（小頭症を伴う）、Ｘ連鎖；成長ホルモン分泌腺腫；Ｇａｍｓｔｏｒｐ－Ｗｏｈｌｆａｒｔ症候群；脂質蛋白症；封入体ミオパチー２及び３；前庭水管拡大症候群；偽神経膠腫を伴う骨粗鬆症；後天性ＱＴ延長症候群；フェニルケトン尿症；チョップス症候群；全般的発達遅延；Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィー；ヌーナン症候群様障害、若年性骨髄単球性白血病の有無とは無関係；先天性赤血球生成性ポルフィリン症；遺伝性眼球萎縮；傍神経節腫３；ファンデルウーデ症候群；アロマターゼ欠損症；ＢｉｒｋＢａｒｅｌ精神遅滞形態異常症候群；筋萎縮性側索硬化症５型；メトヘモグロビン血症Ｉ１型及び２型；先天性停止性夜盲症、１Ａ、ＩＢ、１Ｃ、ＩＥ、ＩＦ、及び２Ａ型；発作；甲状腺癌、濾胞性；致死性先天性拘縮症候群６；遠位遺伝性運動ニューロン症２Ｂ型；性索間質性腫瘍；てんかん性脳症、小児発症型、早期乳児、１、１９、２３、２５、３０、及び３２；筋原線維ミオパチー１及びＺＡＳＰ関連；小脳失調症、乳児、進行性外眼筋麻痺；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症；前脳欠損；てんかん性脳症レノックス・ガストー型；肥満；４、左室緻密化障害１０；Ｖｅｒｈｅｉｊ症候群；モワット・ウィルソン症候群；Ｏｄｏｎｔｏｔｒｉｃｈｏｍｅｌｉｃ症候群；網膜色素上皮のパターン化ジストロフィー；Ｌｉｇ４症候群；バラカット症候群；ＩＲＡＫ４欠損症；成長ホルモン分泌腺腫；分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ欠損症；シスチン尿症；小脳虫部の家族性形成不全；スクシニルＣｏＡアセト酢酸トランスフェラーゼ欠損症；肩甲腓骨型脊髄性筋萎縮症；色素性網膜ジストロフィー；グランツマン血小板無力症；原発開放隅角緑内障若年発症型１；アイカルディ・グティエール症候群１、４、及び５；腎異形成；子宮内胎児発育遅延、骨幹端異形成症、先天性副腎低形成症、及び性器奇形；連珠毛；低身長、爪甲形成不全、顔異形、及び貧毛症；異染性白質ジストロフィー；コレスタノール貯蔵病；３－Ｍ症候群２；レーバー先天黒内障１１、１２、１３、１６、４、７、及び９；Ａ又はＢ型リポジストロフィーを伴う下顎骨異形成、非定型；マイヤー・ゴーリン症候群ランド４；貧毛症８及び１２；ＱＴ短縮症候群３；外胚葉異形成症ｌｉｂ；無爪症；偽性副甲状腺機能低下症１Ａ型、偽性副甲状腺機能低下症；レーバー視神経萎縮；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ－Ｒｏｐｅｒｓ症候群；ウィーバー症候群；低身長、耳道閉鎖症、小下顎症、骨格異常；αマンノシダーゼ欠損症；黄斑変性症、卵黄型、成人発症型；グルタル酸尿症、１型；ＧＭ１ガングリオシドーシス１型（心臓障害を伴う）３；下顎骨形成不全；遺伝性リンパ浮腫Ｉ型；心房静止２；歌舞伎メイクアップ症候群；ベスレムミオパチー及びベスレムミオパチー２；ミエロペルオキシダーゼ欠損症；斑状角膜ジストロフィー；遺伝性腸性肢端皮膚炎；低βリポ蛋白血症、家族性、ａｐｏｂ３２に関連する；コケイン症候群Ａ型、；副甲状腺機能亢進症、新生児重度；運動失調－毛細血管拡張症様障害；ペンドレッド症候群；Ｉ式血液型；家族性良性天疱瘡；内臓転位５、常染色体；腎性尿崩症、腎性尿崩症、Ｘ連鎖；外眼筋麻痺を伴うミニコアミオパチー；ペリー症候群；発汗低下／毛髪／歯型、常染色体劣性；遺伝性膵炎；精神遅滞及び小頭症、橋及び小脳形成不全を伴う；糖原貯蔵障害０（筋肉）、ＩＩ（成人型）、ＩＸａ２、ＩＸｃ、１Ａ型；頭蓋骨硬化症を伴う線条骨症；グルタチオンシンテターゼ欠損症；ブルガダ症候群及びブルガダ症候群４；子宮内膜癌；免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成不全；胆汁うっ滞、肝内、妊娠時３；ベルナール・スーリエ症候群、Ａ１型及びＡ２型（常染色体優性）；サラ病；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；ＰＴＥＮ過誤腫症候群；二重睫毛－リンパ浮腫症候群；コルチコステロイド結合グロブリン欠損症；成人型神経セロイドリポフスチン症；デジェリン・ソッタス病；テトラ・アメリア、常染色体劣性；セニオール・ローケン症候群４及び５，；グルタル酸血症ＩＩＡ及びＩＩＢ；大動脈瘤、家族性胸部４、６、及び９；精神遅滞症候群２、３、及び４を伴う過リン酸血症；Ｘ連鎖先天性角化異常症；関節拘縮症、腎機能障害、及び胆汁うっ滞２；バナヤン・ライリー・ルバルカバ症候群；３－メチルグルタコン酸尿症；単独１７，２０－リアーゼ欠損症；ゴーリン症候群；手足子宮症候群；テイ・サックス病、Ｂ１変異体、ＧＭ２ガングリオシドーシス（成人）、ＧＭ２ガングリオシドーシス（成人発症型）；ダウリング・デゴス病４；パーキンソン病１４、１５、１９（若年発症型）、２、２０（早期発症型）、６、（常染色体劣性早期発症型）、及び９；失調症、感覚性、常染色体優性；先天性微絨毛萎縮症；ミオクローヌスアトニーてんかん；タンジール病；２－メチル－３－ヒドロキシ酪酸尿症；家族性腎性低尿酸血症；裂脳症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群４Ｂ、ＭＮＧＩＥ型；ファインゴールド症候群１；腎カルニチン輸送障害；家族性高コレステロール血症；Ｔｏｗｎｅｓ－Ｂｒｏｃｋｓ鰓弓耳腎様症候群；グリセリ症候群３型；メッケル・グルーバー症候群；水疱性魚鱗癬様紅皮症；好中球免疫不全症候群；筋無力症候群、先天性、１７、２Ａ（スローチャネル）、４Ｂ（ファストチャネル）、及び管状凝集体を伴わない；糖尿病７の微小血管合併症；マキュージック・カウフマン症候群；慢性肉芽腫性疾患、常染色体劣性チトクロムｂ陽性、１型及び２型；アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症；ミトコンドリアリン酸輸送体及びピルビン酸輸送体欠損症；格子状角膜ジストロフィーＩＩＩ型；外胚葉形成不全－合指症候群１；ミエリン形成不全性白質ジストロフィー７；精神遅滞、常染色体優性１２、１３、１５、２４、３、３０、４、５、６、及び９；全般てんかん熱性けいれんプラス、１型及び２型；乾癬感受性２；Ｆｒａｎｋ Ｔｅｒ Ｈａａｒ症候群；胸部大動脈瘤及び大動脈解離；クルーゾン症候群；卵巣顆粒膜細胞腫；表皮剥離性掌蹠角化症；Ｌｅｒｉ Ｗｅｉｌｌ軟骨骨異形成症；３β水酸化ステロイド脱水素酵素欠損症；家族性拘束型心筋症１；ミトコンドリアＤＮＡ欠失１及び３を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺；性器奇形及びステロイド産生障害を伴うアントレー・ビクスラー症候群症候群；ハジュ・チーニー症候群症候群；色素性結節状副腎皮質病変、原発性、１；エピソード性疼痛症候群、家族性、３；デジェリン・ソッタス症候群、常染色体優性；ＦＧ症候群及びＦＧ症候群４；樹状細胞、単球、Ｂリンパ球、及びナチュラルキラーリンパ球欠損症；甲状腺機能低下症、先天性、非甲状腺腫性、１；ミラー症候群；ネマリンミオパチー３及び９；減歯症－大腸直腸癌症候群；寒冷誘発性発汗症候群１；Ｖａｎ Ｂｕｃｈｅｍ病２型；緑内障３、原発性先天性、ｄ；シトルリン血症Ｉ及びＩＩ型；埜中ミオパチー；部分的なＬＡＭＡ２欠損症に起因する先天性筋ジストロフィー；神経胃腸脳症症候群；ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症に起因するリー症候群；髄芽腫；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１アルファ欠損症；結腸癌；ナンス・ホーラン症候群；サンドホフ病、成人型及び乳児型；関節拘縮－腎機能障害－胆汁うっ滞症候群；常染色体劣性低リン血症性骨疾患；Ｄｏｙｎｅ蜂巣状網膜ジストロフィー；脊髄小脳失調症１４、２１、３５、４０、及び６；レビー小体病；ＲＲＭ２Ｂ関連ミトコンドリア病；ブロディミオパチー；巨脳－多小脳回－多指－水頭症候群２；アッシャー症候群、１型、ＩＢ型、ＩＤ型、１Ｇ型、２Ａ型、２Ｃ型、及び２Ｄ型；石灰化不全型及び未成熟型、ＩＩＡ１遺伝性エナメル質形成不全症；下垂体ホルモン欠乏症、複合型１、２、３、及び４；クッシング指節癒合症；腎尿細管性アシドーシス、遠位、常染色体劣性、遅発性感音難聴を伴う、又は溶血性貧血を伴う；乳児型ネフロン癆；若年性ポリポーシス症候群；感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、及び眼麻痺；３－ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；副甲状腺癌；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；巨赤芽球性貧血、チアミン応答性、糖尿病及び感音難聴を伴う；多種スルファターゼ欠損症；脳鉄蓄積４及び６を伴う神経変性；コレステロールモノオキシゲナーゼ（側鎖切断）欠損症；アデニロコハク酸リアーゼ欠損症に起因する溶血性貧血；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん；ピット・ホプキンス症候群；エスコバル型多発性翼状片症候群；コバラミン代謝異常に起因するホモシスチン尿症－巨赤芽球性貧血、ｃｂｌＥ相補型；胆嚢炎；球状赤血球症４型及び５型；多発性先天奇形；色素性乾皮症、相補群ｂ、Ｄ群、Ｅ群、及びＧ群；Ｌｅｉｎｅｒ病；Ｇｒｏｅｎｏｕｗ角膜ジストロフィーＩ型；コエンザイムＱ１０欠損症、原発性１、４、及び７；遠位型脊髄性筋萎縮症、先天性非進行性；ワールブルグ・ミクロ症候群２及び４；胆汁酸合成異常症、先天性、３；Ａｃｔｈ非依存性大結節性副腎皮質過形成２；肢端大腿骨頭異形成；骨パジェット病、家族性；小頭症を伴う新生児期発症重度脳症；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ－Ｌａｂａｎｄ症候群及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ－Ｌａｂａｎｄ症候群２；ライフェンスタイン症候群；家族性低カリウム血症－低マグネシウム血症；感光性トリコチオジストロフィー；成人接合部型表皮水疱症；肺癌；フリーマン・シェルドン症候群；高インスリン症－高アンモニア血症症候群；後極白内障２型；角膜硬化、常染色体劣性；若年性ＧＭ１ガングリオシドーシス；コーエン症候群、；遺伝性傍神経節腫－褐色細胞腫症候群；新生児インスリン依存性糖尿病；軟骨低発生症；フローティングハーバー症候群；骨ジストロフィー並びに重度の肺、胃腸、及び泌尿器異常を伴う皮膚弛緩症；四肢及び顔の先天性拘縮、筋緊張低下、及び発育遅延；先天性角化異常症、常染色体優性及び常染色体優性、３；組織球性髄質細網症；コステロ症候群；免疫不全１５、１６、１９、３０、３１Ｃ、３８、４０、８、ｃｄ３ゼータ欠損に起因、高ＩｇＭ １及び２型を伴う、Ｘ連鎖、マグネシウム欠損、エプスタイン・バーウイルス感染、及び腫瘍を伴う；心房中隔欠損症２、４、及び７（房室伝導障害の有無とは無関係）；ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ欠損症；内反尖足；ホスホグリセリン酸キナーゼ１欠損症；結節性硬化症１及び２；常染色体劣性先天性魚鱗癬１、２、３、４Ａ、及び４Ｂ；並びに家族性肥大型心筋症１、２、３、４、７、１０、２３及び２４が挙げられる。
本明細書に提供されるシステム又は方法、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓを含むものによって処置することができる例示的な好適な疾患及び障害として、限定されないが：Ｂａｒａｉｔｓｅｒ－Ｗｉｎｔｅｒ症候群１型及び２型；視神経萎縮及び難聴を伴う糖尿病及び尿崩症；α１アンチトリプシン欠損症；ヘパリン補助因子ＩＩ欠損症；副腎白質ジストロフィー；ケッペン・ルビンスキー症候群；トリーチャー・コリンズ症候群１型；ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ（核２型、４型、又は８型）欠損症；ジストニア、多血球血症及び肝硬変を伴う高マンガン血症；腸のカルチノイド腫瘍；ラブドイド腫瘍素因症候群２型；ウィルソン病；高フェニルアラニン血症、ｂｈ４欠損症、ａ、部分ｐｔｓ欠損症、ＢＨ４欠損症、Ｄ、及び非ｐｋｕに起因；高インスリン性低血糖症、家族性３、４、及び５；毛包性角化症；口腔・顔面・指趾症候群；ＳｅＳＡＭＥ症候群；非症候性感音難聴、ミトコンドリア性；蛋白尿；インスリン依存性糖尿病性の分泌型下痢症候群；もやもや病５；ダイアモンド・ブラックファン貧血１、５、８、及び１０；偽性軟骨形成不全症脊椎骨端異形成症候群；脆弱角膜症候群２；ホモシスチン尿症を伴うメチルマロン酸血症、；アダムス・オリバー症候群５及び６；常染色体劣性無ガンマグロブリン血症２；皮膚形成異常症、後頭；熱性発作、家族性、１１；ムコ多糖症ＶＩ型、ＶＩ型（重度）、及びＶＩＩ型；マーデンウォーカー様症候群；偽性新生児副腎白質ジストロフィー；球状体ミオパチー；鎖骨頭蓋形成不全症；多発性皮膚粘膜静脈奇形；急性乳児肝不全；シトリン欠損症に起因する新生児肝内胆汁うっ滞；心室中隔欠損症１；眼歯指形成異常；ウィルムス腫瘍１；ワイル・マルケサニ様症候群；腎欠損症；白内障１、４、常染色体優性、常染色体優性、多発型、小角膜を伴う、コポック様、若年性、小角膜及び糖尿を伴う、及び核びまん性で非進行性；歯限局型低ホスファターゼ症；脳・眼・顔・骨格症候群；統合失調症１５；脳アミロイド血管症、ＡＰＰ関連；血球貪食性リンパ組織球症、家族性、３；ポルホビリノーゲンシンターゼ欠損症；発作性運動失調２型；鼻指節症候群３型；進行性家族性心ブロックＩＢ型；神経膠腫感受性１；リヒテンシュタイン・クノール症候群；無汗性Ｘ連鎖外胚葉性異形成症；バーター症候群３型、低カルシウム尿症を伴う３、及び４；炭酸脱水酵素ＶＡ欠損症、高アンモニア血症、心筋症に起因；腱性拘縮・ミオパチー・肺線維症を伴う遺伝性線維化多形皮膚萎縮症；複合型ｄ－２－及び１－２－ヒドロキシグルタル酸尿症；アルギナーゼ欠損症；錐体杆体ジストロフィー２及び６；スミス・レムリ・オピッツ症候群；ムコリピドーシスＩＩＩガンマ；ブラウ症候群；ウェルナー症候群；髄膜腫；ヨードチロシンのカップリング異常；デュビン・ジョンソン症候群；３－オキソ－５アルファ－ステロイドデルタ４－デヒドロゲナーゼ欠損症；バウチャー・ノイハウザー症候群；脳内鉄蓄積症；精神遅滞、Ｘ連鎖１０２及び症候性１３；家族性、下垂体腺腫の素因；脳梁低形成；高αリポタンパク質血症２；フェロキシダーゼの欠損症；免疫不全を伴う成長ホルモン非感受性；マリネスコ・シェーグレン症候群；マートソルフ症候群；注視麻痺、進行性脊柱側弯症を伴う家族性水平性；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｒｉｌｅｙ症候群；低カルシウム尿高カルシウム血症、家族性、１型及び３型；ルビンシュタイン・テイビ症候群；エプスタイン症候群；若年性網膜分離症；ベッカー型筋ジストロフィー；ロイス・ディーツ症候群１、２、３；先天性筋肥大－脳症候群；家族性若年性痛風；精子形成不全１１、３、及び８；口腔顔面裂１１及び７、口唇口蓋裂－外胚葉異形成症候群；精神遅滞、Ｘ連鎖、非特異的、症候性、ヘデラ型、及び症候性、ｗｕ型；複合型酸化的リン酸化欠損症１、３、４、１２、１５、及び２５；前頭側頭型認知症；クニースト異形成症；家族性心筋症；良性家族性血尿症；褐色細胞腫；アミノグリコシド誘導性難聴；γアミノ酪酸トランスアミナーゼ欠損症；眼皮膚白皮症ＩＢ型、３型、及び４型；腎コロボーマ症候群；中枢神経髄鞘低形成；Ｈｅｎｎｅｋａｍリンパ管拡張症－リンパ浮腫症候群２；片頭痛、家族性脳底；遠位脊髄性筋萎縮、Ｘ連鎖３；Ｘ連鎖脳室周囲異所性灰白質；小頭症；ムコ多糖症、ＭＰＳ－Ｉ－Ｈ／Ｓ、ＭＰＳ－ＩＩ、ＭＰＳ－ＩＩＩ－Ａ、ＭＰＳ－ＩＩＩ－Ｂ、ＭＰＳ－ＩＩＩ－Ｃ、ＭＰＳ－ＩＶ－Ａ、ＭＰＳ－ＩＶ－Ｂ；乳児パーキンソニズム・ジストニア；ＴＤＰ４３封入体を伴う前頭側頭型認知症、ＴＡＲＤＢＰ関連；遺伝性びまん性胃癌；シアリドーシスＩ型及びＩＩ型；小頭症－毛細血管異形成症候群；遺伝性乳癌卵巣癌症候群；出血を伴う脳小血管病；非ケトン性高グリシン血症；ナバホ神経肝障害；耳下顎関節頭症候群２；痙性対麻痺１５、２、３、３５、３９、４、常染色体優性、５５、常染色体劣性、及び５Ａ；常染色体劣性皮膚弛緩症ＩＡ型及びＩＢ型；溶血性貧血、非球状赤血球性、グルコースリン酸イソメラーゼ欠損症に起因；ハッチンソン・ギルフォード症候群；蕁麻疹及び難聴を伴う家族性アミロイド腎症；大動脈弁上狭窄症；びまん性掌蹠角化症、ボスニア型；ホルト・オーラム症候群；コフィン・シリス／知的能力障害；左右軸形成異常；パパディリーノ症候群；小眼球症２；頭蓋縫合早期癒合症及び歯異常；パラガングリオーマ１；シュナイダーロビンソン症候群；心室細動；活性化ＰＩ３Ｋデルタ症候群；ハウエル・エバンス症候群；ラーセン症候群、優性型；Ｖａｎ Ｍａｌｄｅｒｇｅｍ症候群２；ＭＹＨ関連ポリポーシス；６－ピルボイル－テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症；アラジール症候群１型及び２型；リンパ管筋腫症；筋・眼・脳病；ＷＦＳｌ関連障害；原発性肥大性骨関節症、常染色体劣性２；不妊；ネスター・ギラーモプロジェリア症候群；ミトコンドリア三機能タンパク質欠損症；左心低形成症候群２；原発性拡張型心筋症；網膜色素変性症；ヒルシュスプルング病３；アップショー・シュールマン症候群；Ｄｅｓｂｕｑｕｏｉｓ異形成症２；下痢症３（分泌型ナトリウム、先天性、症候性）及び５（タフティング腸症を伴う、先天性）；先天性爪肥厚症４及び２型；皮質下梗塞及び白質脳症を伴う脳常染色体優性及び劣性動脈症；Ｖｉ ｔｅｌ １ｉ型ジストロフィー（Ｖｉ ｔｅｌ １ｉ ｆｏｒｍ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）；ＩＩ型、ＩＶ型、ＩＶ（複合型肝・筋障害）、Ｖ型、及びＶＩ型；非定型レット症候群；房室中隔欠損症４；パピヨン・ルフェーヴル症候群；レーバー黒内障；Ｘ連鎖遺伝性運動感覚ニューロパチー；進行性硬化性ポリオジストロフィー；ゴールドマン・ファーブル症候群；腎肝膵異形成；パリスター・ホール症候群；アミロイド形成トランスサイレチンアミロイドーシス；メルニック・ニードルズ症候群；ハイパー免疫グロブリンＥ症候群；網膜色素変性症を伴う脊髄後索性失調症；点状軟骨異形成症１型、Ｘ連鎖劣性及び２Ｘ連鎖優性；偏位水晶体、孤立性常染色体劣性及び優性；家族性寒冷蕁麻疹ｌ；家族性大腸ポリポーシス１及び３；汗孔角化症８、播種性表在性光線型；ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長スペクトラム；脳海綿状奇形２；滲出性硝子体網膜症６；巨脳症－先天性血管拡張性大理石様皮膚；ＴＡＲＰ症候群；糖尿病、永続型新生児、神経学的特徴を伴う；多指症の有無とは無関係の短肋骨胸部異形成１１又は３；多毛性骨軟骨異形成症；βサラセミア；ニーマン・ピック病Ｃｌ型、Ｃ２型、Ａ型、及びＣｌ型、成体型；シャルコー・マリー・トゥース病ＩＢ型、２Ｂ２型、２Ｃ型、２Ｆ型、２１型、２Ｕ型（軸索）、１Ｃ（脱髄性）、優性中間体Ｃ、劣性中間体Ａ、２Ａ２、４Ｃ、４Ｄ、４Ｈ、ＩＦ、ＩＶＦ、及びＸ；チロシン血症Ｉ型；発作性心房細動；紫外線高感受性症候群；歯欠損症、選択的、３及び４；メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー；長鎖ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；先天性無虹彩症；左室緻密化障害５；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症；冠動脈心疾患；全爪甲白斑症；遠位関節拘縮症２Ｂ型；網膜色素変性症１０、１１、１２、１４、１５、１７、及び１９；ロビノー・ソラウフ症候群；テノリオ症候群；プロラクチノーマ；神経線維腫症、ランド型２；脳・眼異常を伴う先天性筋ジストロフィージストログリカノパチー、Ａ２型、Ａ７型、Ａ８型、Ａｌｌ型、及びＡ１４型；内臓逆位、内臓、２、４、及び６、常染色体；ヤンコビッチリベラ症候群；家族性部分リポジストロフィー、２型及び３型；ヘモグロビンＨ病、無欠損；多中心性骨溶解症、結節症及び関節症；甲状腺無形成；アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼファミリー、メンバー９欠損症；アレキサンダー病；フィタン酸貯蔵疾患；乳癌卵巣癌、家族性１、２、及び４；プロリンデヒドロゲナーゼ欠損症；小児低ホスファターゼ症；膵欠損及び先天性心疾患；ビタミンＤ依存性くる病、ｌ型及び２型；Ｉｒｉｄｏｇｏｎｉｏｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ優性型及び１型；常染色体劣性無汗性外胚葉形成不全症候群；精神遅滞、Ｘ連鎖、３、２１、３０、及び７２；遺伝性出血性末梢血管拡張症２型；眼瞼裂狭小・眼瞼下垂・逆内眼角贅皮；アデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症；発作、良性家族性乳児性、２；先端異骨症２、ホルモン抵抗性の有無とは無関係；ファロー四徴症；網膜色素変性症２、２０、２５、３５、３６、３８、３９、４、４０、４３、４５、４８、６６、７、７０、７２；リソソーム酸リパーゼ欠損症；アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー；ウォーカー・ワールブルグ先天性筋ジストロフィー；ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）；運動失調を伴う進行性ミオクローヌスてんかん；小児欠神てんかん２、１２（特発性全身性、それに対する感受性）５（夜間前頭葉）、夜間前頭葉１型、部分、多様な焦点を伴う、進行性ミオクローヌス３、及びＸ連鎖、多様な学習障害及び行動障害を伴う；ＱＴ延長症候群；ジカルボキシルアミノ酸尿症；短指症Ａ１型及びＡ２型；複数の凝固因子欠損症を伴う弾性線維性仮性黄色腫のような障害；多臓器平滑筋機能障害症候群；Ｃｅｎａｎｉ ｌｅｎｚ型合指症；ジュベール症候群１、６、７、９／１５（２遺伝子性）、１４、１６、及び１７、及び口顔面指症候群ｘｉｖ；Ｄｉｇｉｔｏｒｅｎｏｃｅｒｅｂｒａｌ症候群；網膜芽細胞腫；ジスキネジア、家族性、顔面痙攣を伴う；遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチーＩＩＢ型及びＩＩＡ型；家族性高インスリン症；皮質下嚢胞領域２ａを伴う大頭型白質脳症；オーセ症候群；ウィーデマン・スタイナー症候群；剥脱性魚鱗癬；先天性ミオトニー；肉芽腫性疾患、慢性、Ｘ連鎖、変異体；２－メチルブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；サルコイドーシス、早期発症型；緑内障、先天性及び緑内障、先天性、コロボーマ；乳癌、それに対する感受性；神経セロイドリポフスチン症２、６、７、及び１０；先天性全身性リポジストロフィー２型；フルクトースジホスファターゼ欠損症；先天性拘縮性くも指症；リンチ症候群Ｉ及びＩＩ；ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ欠損症；バーン－マッキューン症候群；心筋梗塞１；色覚異常２及び７；網膜色素変性症７３；第１色覚異常；多小脳回症、非対称性、両側前頭頭頂；脊髄性筋萎縮、遠位、常染色体劣性、５；メチルマロニルＣｏＡムターゼ欠損症に起因するメチルマロン酸尿症；家族性孔脳症；ハーラー症候群；耳－口蓋－指趾症候群、Ｉ型及びＩＩ型；ソトス症候群１又は２；チトクロムｃオキシダーゼ欠損症に起因する心脳筋症、致死型乳児；Ｐａｒａｓｔｒｅｍｍａｔｉｃ低身長症；サイロトロピン放出ホルモン抵抗性、全身性；２型糖尿病、及びインスリン依存性、２０；胸部大動脈瘤及び大動脈解離；エストロゲン抵抗性；メープルシロップ尿症１Ａ型及び３型；尿道下裂１及び２、Ｘ連鎖；若年性異染性白質ジストロフィー、遅発乳児型、及び成人型；初期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病；神経障害、遺伝性感覚性、ＩＣ型；精神遅滞、常染色体優性３１；網膜色素変性症３９；乳癌、早期発症型；メイ・ヘグリン異常；ゴーシェ病、１型及び亜急性神経障害性；テムタミー症候群；脊髄性筋萎縮、下肢優性２、常染色体優性；ファンコニ貧血、相補グループＥ、Ｉ、Ｎ、及びＯ；
アルカプトン尿症；ヒルシュスプルング病；混合性マロン酸及びメチルマロン酸尿症；不整脈原性右室心筋症５型、８型、及び１０型；先天性脂肪腫性過成長、血管奇形、及び表皮母斑；チモシー症候群；グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ欠損症；筋クローヌス性ジストニア；神崎病；中性１アミノ酸輸送欠陥；神経下垂体性尿崩症；甲状腺ホルモン代謝、異常；心筋症を伴う良性肩甲腓骨型筋ジストロフィー；肝臓におけるグリコーゲン合成酵素欠損症を伴う低血糖症；肥大型心筋症；筋無力症候群、先天性、１１、アセチルコリン受容体欠損症に関連する；Ｘ連鎖症候性精神遅滞５；Ｓｔｏｒｍｏｒｋｅｎ症候群；再生不良性貧血；知的能力障害；正常カリウム血性周期性四肢麻痺、カリウム感受性；ダノン病；ネフロン癆１３、１５及び４；甲状腺中毒性周期性四肢麻痺及び甲状腺中毒性周期性四肢麻痺２；多尾性精子及び過剰なＤＮＡに関連する不妊症；緑内障、原発性開放隅角、若年発症型；無フィブリノゲン血症及び先天性無フィブリノゲン血症；多発性嚢胞腎疾患２、成人型、及び乳児型；家族性晩発性皮膚ポルフィリン症；小脳眼腎症候群（ネフロン癆、眼球運動失行及び小脳異常）；前頭側頭型認知症、染色体３連鎖及び前頭側頭型認知症、ユビキチン陽性；異栄養性異形成症（Ｍｅｔａｔｒｏｐｈｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）；免疫不全－動原体不安定性－顔面奇形症候群２；貧血、非球状赤血球溶血性、Ｇ６ＰＤ欠損症に起因；気管支拡張症、増加した汗塩化物３の有無とは無関係；筋繊維不均等症を伴う先天性ミオパチー；カーニー複合、１型；停留精巣、一側性又は両側性；ジーメンス型水疱性魚鱗癬；単独ルトロピン欠損症（Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｕｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ＤＦＮＡ２非症候性難聴；クライン・ワールデンブルグ症候群；灰色血小板症候群；胆汁酸合成異常、先天性、２；４６、ＸＹ性逆転、１、３、及び５型；急性間欠性ポルフィリン症；コルネリア・デランゲ症候群１及び５；グリシン尿症；錐体杆体ジストロフィー３；異常フィブリノゲン血症；カラク症候群；精神遅滞を伴わない先天性筋ジストロフィージストログリカノパシー、Ｂ５型；新生児眼振、Ｘ連鎖；先天性角化異常症、常染色体劣性、１、３、４、及び５；小頭症、網脈絡膜症、リンパ浮腫、又は精神遅滞の有無とは無関係；高リジン血症；バルデ・ビードル症候群１、１１、１６、及び１９；常染色体劣性中心核ミオパチー；フレイジャー症候群；尾部退行症候群；外眼筋線維症、先天性、１、２、３ａ（外眼障害の有無とは無関係）、３ｂ；プラダー・ウィリー様症候群；悪性黒色腫；ブルーム症候群；ダリエー病、分節性；多中心性骨溶解症・腎症；ヘモクロマトーシス１、２Ｂ、及び３型；進行性外眼筋麻痺を伴う乳児小脳性運動失調症、並びに小脳性運動失調症、精神遅滞、及び平衡障害症候群２；左心低形成症候群；てんかん、難聴、及び精神遅滞症候群；トランスフェリン血清レベル量的形質遺伝子座２；眼白子症、Ｉ型；マルファン症候群；脳眼奇形を伴う先天性筋ジストロフィージストログリカノパチー、Ａ１４及びＢ１４型；高アンモニア血症、ＩＩＩ型；潜在眼球症候群；先天性全身性脱毛症；成人低ホスファターゼ症；マンノース結合タンパク質欠損症；牛眼黄斑ジストロフィー；常染色体優性捻転ジストニア４；ネフローゼ症候群、３型、５型、眼球異常の有無とは無関係、７型、及び９型；発作、早期乳児てんかん性脳症７；新生児持続性高インスリン性低血糖症；血小板減少症、Ｘ連鎖；新生児筋緊張低下；Ｏｒｓｔａｖｉｋ Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ Ｓｏｌｂｅｒｇ症候群；肺高血圧症、原発性、１、遺伝性出血性末梢血管拡張症を伴う；下垂体依存性高コルチゾール症；疣贅状表皮発育異常症；表皮水疱症、接合部型、ｌｏｃａｌｉｓａｔａ変異体；チトクロムｃオキシダーゼｉ欠損症；キンドラー症候群；筋硬化症、常染色体劣性；総動脈幹；デュアン症候群２型；ＡＤＵＬＴ症候群；ツェルウェーガー症候群スペクトル；白質脳症、運動失調を伴う、脳幹及び脊髄の障害と乳酸上昇を伴う、白質消失を伴う、及び進行性で卵巣不全を伴う；アンチトロンビンＩＩＩ欠損症；全前脳胞症７；ロバーツＳＣアザラシ肢症症候群；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群３及び７、肝脳型、及び１３（脳ミオパチー型）；孔脳症２；小頭症、正常な知能及び免疫不全；巨大軸索ニューロパチー；スタージ・ウェーバー症候群、毛細血管奇形、先天性、１；ファブリー病及びファブリー病、心亜型；グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ欠損症；ファンコニ・ビッケル症候群；先端短肢異形成症；てんかん、特発性全身性、それに対する感受性、１２；大脳基底核石灰化、特発性、４；ポリグルコサン小体ミオパチー１、免疫不全の有無とは無関係；前立腺の悪性腫瘍；先天性顔面外胚葉異形成症；先天性心疾患；加齢性黄斑変性症３、６、１１、及び１２；先天性筋強直症、常染色体優性型及び劣性型；低マグネシウム血症１、腸；亜硫酸酸化酵素単独欠損症；ピック病；プラスミノーゲン欠損症、Ｉ型；合指症３型；錐体杆体ジストロフィー 遺伝性エナメル質形成不全症；偽原発性高アルドステロン症；末端骨異形成症；出生前バーター症候群２型；精神遅滞を伴う先天性筋ジストロフィージストログリカノパチー、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、及びＢ１５型；家族性小児筋無力症；リンパ増殖性症候群１、１（Ｘ連鎖）、及び２；高コレステロール血症及び高コレステロール血症、常染色体劣性；卵巣腫瘍；小児ＧＭ１ガングリオシドーシス；症候性Ｘ連鎖精神遅滞１６；リボース－５－リン酸イソメラーゼ欠損症；アルツハイマー病、１型、３型、及び４型；アンデルセン・タウィル症候群；多発性骨癒合症候群３；凍瘡状エリテマトーデス１；血球貪食性リンパ組織球症、家族性、２；アクセンフェルト・リーガー症候群３型；コアを伴う先天性ミオパチー；軽症の軟骨形成異常症を伴う変形性関節症；ペルオキシソーム形成異常症；重症先天性好中球減少症；遺伝性神経痛性筋萎縮症；掌蹠角化症、非表皮溶解性、限局性又はびまん性；異常プラスミノーゲン血症；家族性結腸直腸癌；痙性運動失調５、常染色体劣性、シャルルヴォア・サグネ１、１０、又は１１型、常染色体劣性；前頭骨幹端異形成症ランド３；遺伝性第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子欠損症；脊椎手掌異形成、エーラス・ダンロス症候群様、免疫調節異常を伴う、アグリカン型、先天性関節脱臼を伴う、短肢・手型、Ｓｅｄａｇｈａｔｉａｎ型、錐体杆体ジストロフィーを伴う、及びコズロースキー型；魚鱗癬未熟児症候群；スティックラー症候群１型；巣状分節性糸球体硬化症５；５－オキソプロリナーゼ欠損症；症候性小眼球症５、７、及び９；若年性ポリポーシス／遺伝性出血性毛細血管拡張症候群；ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症；若年発症成人型糖尿病、２型；精神遅滞、症候性、クラウス・イェンセン型、Ｘ連鎖；難聴、蝸牛、近視及び知的障害を伴う、前庭障害を伴わない、常染色体優性、Ｘ連鎖２；脊椎手根骨足根骨癒合症候群；ＳＴＩＮＧ関連血管炎、乳児発症；ミオパチーを伴う中性脂質蓄積症；カルシウム流入障害２に起因するＴ細胞不活性化を伴う免疫機能障害；心臓・顔・皮膚症候群；コルチコステロンメチルオキシダーゼ２型欠損症；早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー；間質性腎炎、核巨大化；トリメチルアミン尿症；周期熱を伴う高グロブリンＤ血症；悪性高熱症感受性タイプ１；精神遅滞、低身長症及び網膜色素変性症を伴う長睫毛症；乳腺癌；Ｂ因子欠損症；ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー；左室心筋緻密化障害；魚眼病；フィンランド先天性ネフローゼ症候群；肢帯型筋ジストロフィー、ＩＢ、２Ａ、２Ｂ、２Ｄ、Ｃｌ、Ｃ５、Ｃ９、Ｃ１４型；特発性線維性肺胞炎、慢性型；原発性家族性肥大型心筋症；アンジオテンシンＩ変換酵素、良性血清増加性；ＣＤ８欠損症、家族性；プロテウス症候群；グルコース－６－リン酸輸送障害；ベルエソン－フォルスマン－レーマン症候群；ツェルウェーガー症候群；脊髄性筋萎縮、ＩＩ型；前立腺癌、遺伝性、２；血小板減少症、血小板機能異常、溶血、及び不均衡なグロビン合成；先天性疾患ｏｆグリコシル化ＩＢ型、ＩＤ型、１Ｇ型、１Ｈ型、１Ｊ型、ＩＫ型、ＩＮ型、ＩＰ型、２Ｃ型、２Ｊ型、２Ｋ型、Ｉｌｍ型；ヘルリッツ型接合型表皮水疱症；全般てんかん熱性けいれんプラス３、１型、２型；統合失調症４；冠動脈疾患、常染色体優性２；先天性角化異常症、常染色体優性、２及び５；皮質下帯状ヘテロトピア、Ｘ連鎖；アデニル化キナーゼ欠損症；Ｘ連鎖重症複合免疫不全；コプロポルフィリン症；アミロイド心筋症、トランスサイレチン関連；低カルシウム血症、常染色体優性１；ブルガダ症候群；先天性筋無力症候群、アセタゾラミド応答性；原発性低マグネシウム血症；硬結性骨化症；前頭側頭型認知症及び／又は筋萎縮性側索硬化症３及び４；メバロン酸尿症；神経鞘腫症２；視神経萎縮症を伴う遺伝性運動感覚性ニューロパチー；晩発性皮膚ポルフィリン症；離断性骨軟骨炎；発作、良性家族性新生児、１、及び／又はミオキミア；ＱＴ延長症候群、ＬＱＴ１亜類型；精神遅滞、上顎前方突出、及び斜視；乳児特発性高カルシウム血症；低ゴナドトロピン性性腺機能低下症１１、嗅覚脱失の有無とは無関係；硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症；原発性常染色体劣性小頭症１０、２、３、及び５；大動脈弓離断症；先天性無巨核球性血小板減少症；ヘルマンスキー・パドラック症候群１、３、４、及び６；ＱＴ延長症候群１、２、２／９、２／５、（２遺伝子性）、３、５及び５、後天性、それに対する感受性；アンダーマン症候群；網膜錐体ジストロフィー３Ｂ；骨髄性プロトポルフィリン症；セピアプテリン還元酵素欠損症；極長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；高フェリチン血症・白内障症候群；シルバー痙性対麻痺症候群；シャルコー・マリー・トゥース病；心房中隔欠損症２；カルネヴァーレ症候群；無汗症を伴う疼痛への遺伝的非感受性；カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍；低カリウム血性周期性四肢麻痺１及び２；乳幼児突然死症候群；鉄過剰症を伴う低色素性小球性貧血；グルコーストランスポーター１欠損症症候群２；白質ジストロフィー、ミエリン形成不全性、１１及び６；錐体一色覚；大理石骨病、常染色体優性１及び２型、劣性４、劣性１、劣性６；重症先天性好中球減少症３、常染色体劣性又は優性；メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ欠損症、常染色体優性；発作性家族性心室細動；赤血球ピルビン酸キナーゼ欠損症；骨盤異形成症；多形性心室頻拍；遠位型ミオパチーＭａｒｋｅｓｂｅｒｙ－Ｇｒｉｇｇｓｔｙｐｅ型；ＵＤＰグルコース－ヘキソース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ欠損症；心臓性突然死；Ｎｅｕ－Ｌａｘｏｖａ症候群１；無トランスフェリン血症；副甲状腺機能亢進症１及び２；皮膚悪性黒色腫１；指節癒合症、近位、ｌｂ；進行性偽リウマチ性異形成症；ウェルドニッヒ・ホフマン病；軟骨無発生症２型；全前脳症２、３、７、及び９；シンドラー病、１型；石灰化及び嚢胞を伴う大脳網膜微小血管症；内臓変位、臓側、Ｘ連鎖；結節硬化症候群；カルタゲナー症候群；甲状腺ホルモン抵抗性、全身性、常染色体優性；ベストロフィン症、常染色体劣性；爪障害、非症候性先天性、８；モーア－トラネジャーグ症候群；錐体杆体ジストロフィー１２；難聴；卵巣白質ジストロフィー；尿細管性アシドーシス、近位、眼球異常及び精神遅滞を伴う；ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症；発話障害を伴う焦点性てんかん、精神遅滞の有無とは無関係；運動失調末梢血管拡張症候群；Ｂｒｏｗｎ－Ｖｉａｌｅｔｔｏ－Ｖａｎ ｌａｅｒｅ症候群及びＢｒｏｗｎ－Ｖｉａｌｅｔｔｏ－Ｖａｎ Ｌａｅｒｅ症候群２；心筋症；脱髄型末梢神経障害、中枢性髄鞘形成不全症；角膜ジストロフィー、フックス内皮、４；カウデン症候群３；ジストニア２（捻転、常染色体劣性）、３（捻転、Ｘ連鎖）、５（ドパ反応性のタイプ）、１０、１２、１６、２５、２６（筋クローヌス性）；骨端骨異形成症、多発性、近視及び伝音難聴を伴う；心伝導障害、非特異性；鰓耳症候群２及び３；ペルオキシソーム生合成異常症１４Ｂ、２Ａ、４Ａ、５Ｂ、６Ａ、７Ａ、及び７Ｂ；家族性腎性糖尿；カンジダ症、
家族性、２、５、６、及び８；自己免疫疾患、多系統、乳児発症型；早期乳児てんかん性脳症２、４、７、９、１０、１１、１３、及び１４；瀬川症候群、常染色体劣性；難聴、常染色体優性３ａ、４、１２、１３、１５、常染色体優性無症候性感音性１７、２０、及び６５；先天性赤血球形成異常性貧血、Ｉ及びＩＩ型；Ｓ錐体増強症候群；成人型神経セロイドリポフスチン症；心房細動、家族性、１１、１２、１３、及び１６；ノルム病；骨肉腫；限局性白皮症；ビオチニダーゼ欠損症；肉芽腫を伴う混合性細胞性・液性免疫障害；アルパース脳症；ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症；若年発症成人型糖尿病、１型、２型、１１型、３型、及び９型；異型ポルフィリン症；乳児皮質過骨症；テストステロン１７－β－デヒドロゲナーゼ欠損症；Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症；チロシナーゼ陰性眼皮膚白皮症；原発性線毛機能不全症２４；橋小脳低形成４型；線毛機能不全、原発性、７、１１、１５、２０及び２２；特発性基底核石灰化症５；脳萎縮；頭蓋縫合早期癒合症１及び４；円錐角膜１；ＲＡＳ病；先天性副腎過形成及び先天性副腎低形成症、Ｘ連鎖；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群１１、１２（心筋症型）、２、４Ｂ（ＭＮＧＩＥ型）、８Ｂ（ＭＮＧＩＥ型）；高血圧を伴う短指症；扁平角膜２；アースコグ症候群；多発性骨端異形成症５又は優性；角膜内皮ジストロフィー２型；アミノアシラーゼ１欠損症；発話及び言語発達遅延；ニコライデスバライスター症候群；エンテロキナーゼ欠損症；欠指症、外胚葉異形成症、及び口唇裂／口蓋症候群３；先天性多発性関節拘縮症、遠位、Ｘ連鎖；Ｐｅｒｒａｕｌｔ症候群４；イェルベル・ランゲニールセン症候群２；遺伝性非ポリポーシス大腸癌；ロビノウ症候群、常染色体劣性、常染色体劣性、ｂｒａｃｈｙ－ｓｙｎ－ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌｙを伴う；神経線維肉腫；チトクロムｃ酸化酵素欠損症；膀胱尿管逆流８；ドーパミンβ－水酸化酵素欠損症；糖タンパク質糖鎖不全症候群Ｉ及びＩＩ型；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３；良性家族性新生児乳児発作；膵炎、慢性、それに対する感受性；根性点状軟骨異形成症２型及び３型；チトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ欠損に起因するステロイド合成障害；迷路無形成・小耳症及び小歯症（ＦＡＭＭ）を伴う難聴；ロスムンド・トムソン症候群；皮質異形成、複合型、他の脳奇形５及び６を伴う；筋無力症、家族性小児性、１；毛髪鼻指節異形成症Ｉ型；Ｗｏｒｔｈ病；脾臓低形成；モリブデン補助因子欠損症、相補群Ａ；セバスチャン症候群；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２及び３；ヴァイユ・マルケザーニ症候群１及び３；小頭骨異形成原発性小人症２型；サーファクタント代謝異常症、肺、２及び３；重度Ｘ連鎖筋細管ミオパチー；膵癌３；血小板型出血障害１５及び８；チロシナーゼ陽性眼皮膚白皮症；Ｂｏｒｒｏｎｅ Ｄｉ Ｒｏｃｃｏ Ｃｒｏｖａｔｏ症候群；ＡＴＲ－Ｘ症候群；スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症；補体成分４、その部分的欠損、機能障害性ｃｌ阻害剤に起因；先天性中枢性低換気症；乳児型低ホスファターゼ症；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１欠損症；悪性リンパ腫、非ホジキン；高オルニチン血症－高アンモニア血症－ホモシトルリン尿症症候群；シュワルツ・ヤンペル症候群１型；胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座１；ミオパチー、遠位、前脛骨発症を伴う；ヌーナン症候群１及び４、レオパード症候群１；緑内障１、開放隅角、ｅ、Ｆ、及びＧ；ケニー・キャフェイ症候群２型；ＰＴＥＮ過誤腫症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；インスリン抵抗性糖尿病及び黒色表皮腫；小眼球症、単独３、５、６、８、及びコロボーマ６を伴う；レイン症候群；早期卵巣機能不全４、５、７、及び９；アラン・ハーンドン・ダドリー症候群；シトルリン血症Ｉ型；アルツハイマー病、家族性、３、痙性対麻痺及び失行を伴う；家族性片麻痺性片頭痛１型及び２型；嚢胞性腎疾患を伴う脳室拡大；弾性線維性仮性黄色腫；ＭＴＨＦＲ欠損症、ＣＢＳ欠損症、及びホモシスチン尿症に起因するホモシスチン血症、ピリドキシン応答性；拡張型心筋症１Ａ、１ＡＡ、１Ｃ、１Ｇ、ＩＢＢ、１ＤＤ、ＩＦＦ、１ＨＨ、ＩＩ、ＩＫＫ、ＩＮ、ＩＳ、１Ｙ、及び３Ｂ；筋肉ＡＭＰグアニンオキシダーゼ欠損症（Ｍｕｓｃｌｅ ＡＭＰ ｇｕａｎｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；家族性乳癌；遺伝性鉄芽球性貧血；ミオグロビン尿症、急性再発性、常染色体劣性；神経フェリチン症；心不整脈；グルコーストランスポーター１欠損症症候群；全前脳症シークエンス；遺伝性血管障害、腎症、動脈瘤、及び筋痙攣を伴う；イソ吉草酸ＣｏＡ脱水素酵素欠損症；カルマン症候群１、２、及び６；新生児永続型糖尿病；先端脳梁症候群、Ｓｃｈｉｎｚｅｌ型；ゴードン症候群；ＭＹＨ９関連障害；ドンナイバロー症候群；重症先天性好中球減少症及び６、常染色体劣性；シャルコー・マリー・トゥース病、ＩＤ型及びＩＶＦ型；コフィン・ローリー症候群；ミトコンドリア３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症；低マグネシウム血症、発作、及び精神遅滞；坐骨膝蓋骨異形成症；坐骨膝蓋骨異形成症－筋緊張低下－けいれん症候群３；痙性対麻痺５０、常染色体劣性；非特異的な骨格異常を伴う低身長；乳児重症ミオクロニーてんかん；プロピオン酸アカデミア；思春期ネフロン癆；大頭症、巨人症、顔異形症候群；シュタルガルト病４；エーラス・ダンロス症候群７型（常染色体劣性）、古典型、２型（早老性）、ヒドロキシリジン欠損症、４型、４型変異体、及びテネイシンＸ欠損症に起因；近視６；扁平股；家族性寒冷自己炎症性症候群２；心臓・大血管の形成異常；フォン・ヴィルブランド病２Ｍ型及び３型；ガラクトキナーゼ欠損症；ブルガダ症候群１；ステリル・スルファターゼ欠損を伴うＸ連鎖魚鱗癬；先天性眼球欠損症；組織球症－リンパ節腫大プラス症候群；無虹彩症、小脳性運動失調、及び精神遅滞；左室緻密化障害３；筋萎縮性側索硬化症１型、６型、１５型（前頭側頭型認知症の有無とは無関係）、２２（前頭側頭型認知症の有無とは無関係）、及び１０；骨形成不全症１２型、５型、７型、８型、Ｉ型、ＩＩＩ型、正常な強膜を伴う、優性型、劣性出生時致死性；血液腫瘍；ソラマメ症、それに対する感受性；肺線維症及び／又は骨髄不全、テロメア関連、１及び３；優性遺伝性視神経萎縮症；優性栄養障害型表皮水疱症、皮膚の非存在下；筋ジストロフィー、先天性、巨大円錐型；多発性胃腸閉鎖；マキューン・オルブライト症候群；爪膝蓋骨症候群；マクラウド神経有棘赤血球症候群；分類不能型免疫不全症９；ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ部分欠損症；偽性低アルドステロン症１型常染色体優性及び劣性と２型；ウロカニン酸ヒドラターゼ欠損症；異所形成；メッケル症候群７型；チェディアック・東症候群、チェディアック・東症候群、成人型；ＡＤＡ欠損症に起因する重症複合免疫不全、小頭症を伴う、発達遅滞、及び電離放射線に対する感受性、非定型、常染色体劣性、Ｔ細胞陰性、Ｂ細胞陽性、ＮＫ陽性のＮＫ細胞陰性；インスリン抵抗性；ステロイド１１β－モノオキシゲナーゼの欠損；膝窩翼状片症候群；遺伝性出血性末梢血管拡張症に関連する肺動脈高血圧症；難聴、常染色体劣性１Ａ、２、３、６、８、９、１２、１５、１６、１８ｂ、２２、２８、３１、４４、４９、６３、７７、８６、及び８９；原発性高シュウ酸尿症、Ｉ型、型、及びＩＩＩ型；フォンオイレンブルグの先天性パラミオトニー；Ｄｅｓｂｕｑｕｏｉｓ症候群；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩ（遅発性）、及びＩＩ（乳児性）欠損症；続発性甲状腺機能低下症；下顎顔面形成異常、トリーチャー・コリンズ型、常染色体劣性；カウデン症候群１；リー・フラウメニ症候群１；アスパラギン合成酵素欠損症；マラッティア・レベンティネース；視神経萎縮症９；乳児痙攣及び発作性舞踏アテトーゼ、家族性；ビタミンＥ欠損症を伴う失調症；島細胞過形成；三好型筋ジストロフィー１；血栓性素因、遺伝性、プロテインＣ欠乏症に起因、常染色体優性及び劣性；フェクトナー症候群；プロペルジン欠損症、Ｘ連鎖；精神遅滞、常同運動、てんかん、及び／又は大脳奇形；クレアチン欠損症、Ｘ連鎖；石灰化上皮腫；チアノーゼ、一過性新生児及び非定型腎障害；眼球運動失行を伴う成人発症型失調症；血管腫、毛細血管乳児；ＰＣ－Ｋ６ａ；全身性優性栄養障害型表皮水疱症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ミオパチー、中心核、１、先天性、過剰な筋紡錘を伴う、遠位、１、乳酸アシドーシス、及び鉄芽球性貧血１、ミトコンドリア進行性、先天性白内障、難聴、及び発育遅延、及び管状凝集体を伴う、２；良性家族性新生児発作１及び２；原発性肺高血圧症；リンパ浮腫、原発性、脊髄形成異常症を伴う；先天性ＱＴ延長症候群；家族性滲出性硝子体網膜症、Ｘ連鎖；常染色体優性無汗性外胚葉形成不全；原始小人症；家族性肺毛細血管腫症；カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ欠損症；内臓筋症；家族性地中海熱及び家族性地中海熱、常染色体優性；複合型部分及び完全１７－αヒドロキシラーゼ／１７、２０－リアーゼ欠損症；耳・口蓋・指症候群、Ｉ型；腎結石症／骨粗鬆症、低リン血症性、２；家族性１及び３型高リポ蛋白血症；表現型；チャージ連合；Ｆｕｈｒｍａｎｎ症候群；乏毛症－リンパ浮腫－毛細血管拡張症症候群；軟骨異形成症Ｂｌｏｍｓｔｒａｎｄ型；アクロエリスロ角皮症（ａｃｒｏｅｒｙｔｈｒｏｋｅｒａｔｏｄｅｒｍａ）；神経伝導速度遅延、常染色体優性；遺伝性癌素因症候群；頭蓋骨幹異形成症、常染色体優性；常染色体劣性脊髄小脳失調症１及び１６；プロタンパク質転換酵素１／３欠損症；Ｄ－２ヒドログルタル酸尿症２；過剰驚愕症２及び遺伝性過剰驚愕症；セントラルコア病；オピッツＧ／ＢＢＢ症候群；嚢胞性線維症；Ｔｈｉｅｌ－Ｂｅｈｎｋｅ角膜ジストロフィー；ビスホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症；ミトコンドリア短鎖エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ１欠損症；外胚葉異形成皮膚脆弱性症候群；Ｗｏｌｆｒａｍ様症候群、常染色体優性；小球性貧血；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；白血球粘着欠損症Ｉ及びＩＩＩ型；多発性内分泌腫瘍症、ランド４型；新生児一過性表皮水疱症；プリムローズ症候群；非小細胞肺癌；先天性筋ジストロフィー；複合性リパーゼ欠損症；コール・カーペンター症候群２；房室中隔欠損症及び共通房室接合部；キサンチンオキシダーゼ欠損症；ワールデンブルグ症候群１、４Ｃ、及び２Ｅ型（神経性障害を伴う）；スティックラー症候群、ｌ型（非症候性眼性）及び４型；角膜脆弱性－球形角膜－青色強膜－関節過伸展性；小球状水晶体；Ｃｈｕｄｌｅｙ－ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ症候群；単純型表皮水疱症及び肢帯型筋ジストロフィー、斑状色素沈着を伴う単純型、幽門閉鎖を伴う単純型、単純型、常染色体劣性、及び幽門閉鎖を伴う；レット障害；神経細胞移動異常症；下垂体異常を伴う成長ホルモン欠損症；リー病；線状掌蹠角化症１；Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ－Ｚｗｅｙｍｕｌｌｅｒ症候群；中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ欠損症；自閉症に対する感受性、Ｘ連鎖３；裂孔原性網膜剥離、常染色体優性；家族性熱性発作８；尺骨及び腓骨欠損－重度四肢欠損症；左室緻密化障害６；染色体１、９及び１６のセントロメア不安定と免疫不全；神経スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症；クッシング症候群；ドーパミン受容体ｄ２、その脳密度低下；Ｃ様症候群；腎異形成、網膜色素性異栄養症、小脳失調症及び骨格異形成症；卵巣形成不全１；ピアソン症候群；多発ニューロパチー、難聴、失調症、網膜色素変性症、及び白内障；進行性肝内胆汁うっ滞；常染色体優性、常染色体劣性、及びＸ連鎖劣性アルポート症候群；アンジェルマン症候群；アーミッシュ小児てんかん症候群；自己免疫性リンパ増殖症候群、ｌａ型；水頭症；マルファン様体型；裸リンパ球症候群２型、相補群Ｅ；劣性栄養障害型表皮水疱症；第Ｈ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第ｖ因子及び第ｖｉｉｉ因子、複合欠損症、２、ｘｉｉｉ、サブユニット、欠損症；粉状層間白内障３；疣贅－低ガンマグロブリン血症－感染症－
骨髄性細胞貯留；良性遺伝性舞踏病；ヒアルロノグルコサミニダーゼ欠損症；小頭症、食道裂孔ヘルニア及びネフローゼ症候群；発達及び精神遅滞、下顎顔面形成異常、小頭症、及び口蓋裂；リンパ浮腫、遺伝性、ｉｄ；思春期遅発症；見かけの鉱質コルチコイド過剰；乳児全身性動脈石灰化２；メチルマロン酸尿症、ｍｕｔ（０）型；先天性心疾患、多発型、２；家族性低形成性、糸球体嚢胞腎；脳・眼・顔・骨格症候群２；シュタルガルト病１；精神遅滞、常染色体劣性１５、４４、４６、及び５；プロリダーゼ欠損症；メチルマロン酸尿症ｃｂｌＢ型、；小口病；内分泌－大脳骨異形成；滑脳症１、２（Ｘ連鎖）、３、６（小頭症を伴う）、Ｘ連鎖；成長ホルモン分泌腺腫；Ｇａｍｓｔｏｒｐ－Ｗｏｈｌｆａｒｔ症候群；脂質蛋白症；封入体ミオパチー２及び３；前庭水管拡大症候群；偽神経膠腫を伴う骨粗鬆症；後天性ＱＴ延長症候群；フェニルケトン尿症；チョップス症候群；全般的発達遅延；Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィー；ヌーナン症候群様障害、若年性骨髄単球性白血病の有無とは無関係；先天性赤血球生成性ポルフィリン症；遺伝性眼球萎縮；傍神経節腫３；ファンデルウーデ症候群；アロマターゼ欠損症；ＢｉｒｋＢａｒｅｌ精神遅滞形態異常症候群；筋萎縮性側索硬化症５型；メトヘモグロビン血症Ｉ１型及び２型；先天性停止性夜盲症、１Ａ、ＩＢ、１Ｃ、ＩＥ、ＩＦ、及び２Ａ型；発作；甲状腺癌、濾胞性；致死性先天性拘縮症候群６；遠位遺伝性運動ニューロン症２Ｂ型；性索間質性腫瘍；てんかん性脳症、小児発症型、早期乳児、１、１９、２３、２５、３０、及び３２；筋原線維ミオパチー１及びＺＡＳＰ関連；小脳失調症、乳児、進行性外眼筋麻痺；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症；前脳欠損；てんかん性脳症レノックス・ガストー型；肥満；４、左室緻密化障害１０；Ｖｅｒｈｅｉｊ症候群；モワット・ウィルソン症候群；Ｏｄｏｎｔｏｔｒｉｃｈｏｍｅｌｉｃ症候群；網膜色素上皮のパターン化ジストロフィー；Ｌｉｇ４症候群；バラカット症候群；ＩＲＡＫ４欠損症；成長ホルモン分泌腺腫；分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ欠損症；シスチン尿症；小脳虫部の家族性形成不全；スクシニルＣｏＡアセト酢酸トランスフェラーゼ欠損症；肩甲腓骨型脊髄性筋萎縮症；色素性網膜ジストロフィー；グランツマン血小板無力症；原発開放隅角緑内障若年発症型１；アイカルディ・グティエール症候群１、４、及び５；腎異形成；子宮内胎児発育遅延、骨幹端異形成症、先天性副腎低形成症、及び性器奇形；連珠毛；低身長、爪甲形成不全、顔異形、及び貧毛症；異染性白質ジストロフィー；コレスタノール貯蔵病；３－Ｍ症候群２；レーバー先天黒内障１１、１２、１３、１６、４、７、及び９；Ａ又はＢ型リポジストロフィーを伴う下顎骨異形成、非定型；マイヤー・ゴーリン症候群ランド４；貧毛症８及び１２；ＱＴ短縮症候群３；外胚葉異形成症ｌｉｂ；無爪症；偽性副甲状腺機能低下症１Ａ型、偽性副甲状腺機能低下症；レーバー視神経萎縮；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ－Ｒｏｐｅｒｓ症候群；ウィーバー症候群；低身長、耳道閉鎖症、小下顎症、骨格異常；αマンノシダーゼ欠損症；黄斑変性症、卵黄型、成人発症型；グルタル酸尿症、１型；ＧＭ１ガングリオシドーシス１型（心臓障害を伴う）３；下顎骨形成不全；遺伝性リンパ浮腫Ｉ型；心房静止２；歌舞伎メイクアップ症候群；ベスレムミオパチー及びベスレムミオパチー２；ミエロペルオキシダーゼ欠損症；斑状角膜ジストロフィー；遺伝性腸性肢端皮膚炎；低βリポ蛋白血症、家族性、ａｐｏｂ３２に関連する；コケイン症候群Ａ型、；副甲状腺機能亢進症、新生児重度；運動失調－毛細血管拡張症様障害；ペンドレッド症候群；Ｉ式血液型；家族性良性天疱瘡；内臓転位５、常染色体；腎性尿崩症、腎性尿崩症、Ｘ連鎖；外眼筋麻痺を伴うミニコアミオパチー；ペリー症候群；発汗低下／毛髪／歯型、常染色体劣性；遺伝性膵炎；精神遅滞及び小頭症、橋及び小脳形成不全を伴う；糖原貯蔵障害０（筋肉）、ＩＩ（成人型）、ＩＸａ２、ＩＸｃ、１Ａ型；頭蓋骨硬化症を伴う線条骨症；グルタチオンシンテターゼ欠損症；ブルガダ症候群及びブルガダ症候群４；子宮内膜癌；免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成不全；胆汁うっ滞、肝内、妊娠時３；ベルナール・スーリエ症候群、Ａ１型及びＡ２型（常染色体優性）；サラ病；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；ＰＴＥＮ過誤腫症候群；二重睫毛－リンパ浮腫症候群；コルチコステロイド結合グロブリン欠損症；成人型神経セロイドリポフスチン症；デジェリン・ソッタス病；テトラ・アメリア、常染色体劣性；セニオール・ローケン症候群４及び５，；グルタル酸血症ＩＩＡ及びＩＩＢ；大動脈瘤、家族性胸部４、６、及び９；精神遅滞症候群２、３、及び４を伴う過リン酸血症；Ｘ連鎖先天性角化異常症；関節拘縮症、腎機能障害、及び胆汁うっ滞２；バナヤン・ライリー・ルバルカバ症候群；３－メチルグルタコン酸尿症；単独１７，２０－リアーゼ欠損症；ゴーリン症候群；手足子宮症候群；テイ・サックス病、Ｂ１変異体、ＧＭ２ガングリオシドーシス（成人）、ＧＭ２ガングリオシドーシス（成人発症型）；ダウリング・デゴス病４；パーキンソン病１４、１５、１９（若年発症型）、２、２０（早期発症型）、６、（常染色体劣性早期発症型）、及び９；失調症、感覚性、常染色体優性；先天性微絨毛萎縮症；ミオクローヌスアトニーてんかん；タンジール病；２－メチル－３－ヒドロキシ酪酸尿症；家族性腎性低尿酸血症；裂脳症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群４Ｂ、ＭＮＧＩＥ型；ファインゴールド症候群１；腎カルニチン輸送障害；家族性高コレステロール血症；Ｔｏｗｎｅｓ－Ｂｒｏｃｋｓ鰓弓耳腎様症候群；グリセリ症候群３型；メッケル・グルーバー症候群；水疱性魚鱗癬様紅皮症；好中球免疫不全症候群；筋無力症候群、先天性、１７、２Ａ（スローチャネル）、４Ｂ（ファストチャネル）、及び管状凝集体を伴わない；糖尿病７の微小血管合併症；マキュージック・カウフマン症候群；慢性肉芽腫性疾患、常染色体劣性チトクロムｂ陽性、１型及び２型；アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症；ミトコンドリアリン酸輸送体及びピルビン酸輸送体欠損症；格子状角膜ジストロフィーＩＩＩ型；外胚葉形成不全－合指症候群１；ミエリン形成不全性白質ジストロフィー７；精神遅滞、常染色体優性１２、１３、１５、２４、３、３０、４、５、６、及び９；全般てんかん熱性けいれんプラス、１型及び２型；乾癬感受性２；Ｆｒａｎｋ Ｔｅｒ Ｈａａｒ症候群；胸部大動脈瘤及び大動脈解離；クルーゾン症候群；卵巣顆粒膜細胞腫；表皮剥離性掌蹠角化症；Ｌｅｒｉ Ｗｅｉｌｌ軟骨骨異形成症；３β水酸化ステロイド脱水素酵素欠損症；家族性拘束型心筋症１；ミトコンドリアＤＮＡ欠失１及び３を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺；性器奇形及びステロイド産生障害を伴うアントレー・ビクスラー症候群症候群；ハジュ・チーニー症候群症候群；色素性結節状副腎皮質病変、原発性、１；エピソード性疼痛症候群、家族性、３；デジェリン・ソッタス症候群、常染色体優性；ＦＧ症候群及びＦＧ症候群４；樹状細胞、単球、Ｂリンパ球、及びナチュラルキラーリンパ球欠損症；甲状腺機能低下症、先天性、非甲状腺腫性、１；ミラー症候群；ネマリンミオパチー３及び９；減歯症－大腸直腸癌症候群；寒冷誘発性発汗症候群１；Ｖａｎ Ｂｕｃｈｅｍ病２型；緑内障３、原発性先天性、ｄ；シトルリン血症Ｉ及びＩＩ型；埜中ミオパチー；部分的なＬＡＭＡ２欠損症に起因する先天性筋ジストロフィー；神経胃腸脳症症候群；ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症に起因するリー症候群；髄芽腫；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１アルファ欠損症；結腸癌；ナンス・ホーラン症候群；サンドホフ病、成人型及び乳児型；関節拘縮－腎機能障害－胆汁うっ滞症候群；常染色体劣性低リン血症性骨疾患；Ｄｏｙｎｅ蜂巣状網膜ジストロフィー；脊髄小脳失調症１４、２１、３５、４０、及び６；レビー小体病；ＲＲＭ２Ｂ関連ミトコンドリア病；ブロディミオパチー；巨脳－多小脳回－多指－水頭症候群２；アッシャー症候群、１型、ＩＢ型、ＩＤ型、１Ｇ型、２Ａ型、２Ｃ型、及び２Ｄ型；石灰化不全型及び未成熟型、ＩＩＡ１遺伝性エナメル質形成不全症；下垂体ホルモン欠乏症、複合型１、２、３、及び４；クッシング指節癒合症；腎尿細管性アシドーシス、遠位、常染色体劣性、遅発性感音難聴を伴う、又は溶血性貧血を伴う；乳児型ネフロン癆；若年性ポリポーシス症候群；感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、及び眼麻痺；３－ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；副甲状腺癌；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；巨赤芽球性貧血、チアミン応答性、糖尿病及び感音難聴を伴う；多種スルファターゼ欠損症；脳鉄蓄積４及び６を伴う神経変性；コレステロールモノオキシゲナーゼ（側鎖切断）欠損症；アデニロコハク酸リアーゼ欠損症に起因する溶血性貧血；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん；ピット・ホプキンス症候群；エスコバル型多発性翼状片症候群；コバラミン代謝異常に起因するホモシスチン尿症－巨赤芽球性貧血、ｃｂｌＥ相補型；胆嚢炎；球状赤血球症４型及び５型；多発性先天奇形；色素性乾皮症、相補群ｂ、Ｄ群、Ｅ群、及びＧ群；Ｌｅｉｎｅｒ病；Ｇｒｏｅｎｏｕｗ角膜ジストロフィーＩ型；コエンザイムＱ１０欠損症、原発性１、４、及び７；遠位型脊髄性筋萎縮症、先天性非進行性；ワールブルグ・ミクロ症候群２及び４；胆汁酸合成異常症、先天性、３；Ａｃｔｈ非依存性大結節性副腎皮質過形成２；肢端大腿骨頭異形成；骨パジェット病、家族性；小頭症を伴う新生児期発症重度脳症；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ－Ｌａｂａｎｄ症候群及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ－Ｌａｂａｎｄ症候群２；ライフェンスタイン症候群；家族性低カリウム血症－低マグネシウム血症；感光性トリコチオジストロフィー；成人接合部型表皮水疱症；肺癌；フリーマン・シェルドン症候群；高インスリン症－高アンモニア血症症候群；後極白内障２型；角膜硬化、常染色体劣性；若年性ＧＭ１ガングリオシドーシス；コーエン症候群、；遺伝性傍神経節腫－褐色細胞腫症候群；新生児インスリン依存性糖尿病；軟骨低発生症；フローティングハーバー症候群；骨ジストロフィー並びに重度の肺、胃腸、及び泌尿器異常を伴う皮膚弛緩症；四肢及び顔の先天性拘縮、筋緊張低下、及び発育遅延；先天性角化異常症、常染色体優性及び常染色体優性、３；組織球性髄質細網症；コステロ症候群；免疫不全１５、１６、１９、３０、３１Ｃ、３８、４０、８、ｃｄ３ゼータ欠損に起因、高ＩｇＭ １及び２型を伴う、Ｘ連鎖、マグネシウム欠損、エプスタイン・バーウイルス感染、及び腫瘍を伴う；心房中隔欠損症２、４、及び７（房室伝導障害の有無とは無関係）；ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ欠損症；内反尖足；ホスホグリセリン酸キナーゼ１欠損症；結節性硬化症１及び２；常染色体劣性先天性魚鱗癬１、２、３、４Ａ、及び４Ｂ；並びに家族性肥大型心筋症１、２、３、４、７、１０、２３及び２４が挙げられる。
組織による適応症
本明細書に提供されるシステム及び方法によって処置され得る、更なる好適な疾患及び障害として、限定はしないが、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患（表１３における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、眼の疾患（表１４における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、心臓の疾患（表１５における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、造血幹細胞（ＨＳＣ）の疾患（表１６における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、腎臓の疾患（表１７における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、肝臓の疾患（表１８における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、肺の疾患（表１９における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、骨格筋の疾患（表２０における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、及び皮膚の疾患（表２１における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）が挙げられる。表２２は、指定疾患のリスクを低減する例示的な保護的突然変異を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、表１３～２１のいずれかの適応症を処置する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムは、細胞内のゲノムＤＮＡ中の標的部位を修飾し、ここで標的部位は、表１３～２１のいずれかの遺伝子中、例えば、表１３～２１のいずれかに列記される対応する適応症を有する対象中に存在する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、遺伝子中の突然変異を修正する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、（例えば、疾患を引き起こす突然変異を通じて）遺伝子から欠失されていた配列を挿入する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、（例えば、疾患を引き起こす突然変異を通じて）遺伝子中で重複されていた配列を欠失させる。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、突然変異（例えば、疾患を引き起こす突然変異）を対応する野生型配列と置換する。一部の実施形態では、突然変異は、置換、挿入、欠失、又は逆位である。
本明細書に提供されるシステム及び方法によって処置され得る、更なる好適な疾患及び障害として、限定はしないが、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患（表１３における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、眼の疾患（表１４における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、心臓の疾患（表１５における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、造血幹細胞（ＨＳＣ）の疾患（表１６における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、腎臓の疾患（表１７における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、肝臓の疾患（表１８における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、肺の疾患（表１９における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、骨格筋の疾患（表２０における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）、及び皮膚の疾患（表２１における例示的な疾患及び疾患遺伝子を参照されたい）が挙げられる。表２２は、指定疾患のリスクを低減する例示的な保護的突然変異を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、表１３～２１のいずれかの適応症を処置する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムは、細胞内のゲノムＤＮＡ中の標的部位を修飾し、ここで標的部位は、表１３～２１のいずれかの遺伝子中、例えば、表１３～２１のいずれかに列記される対応する適応症を有する対象中に存在する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、遺伝子中の突然変異を修正する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、（例えば、疾患を引き起こす突然変異を通じて）遺伝子から欠失されていた配列を挿入する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、（例えば、疾患を引き起こす突然変異を通じて）遺伝子中で重複されていた配列を欠失させる。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、突然変異（例えば、疾患を引き起こす突然変異）を対応する野生型配列と置換する。一部の実施形態では、突然変異は、置換、挿入、欠失、又は逆位である。
病原性突然変異
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、病原性突然変異を修正することができる。病原性突然変異は、特定の疾患又は障害に対する個体の感受性又は素因を増加させる遺伝子突然変異であり得る。一部の実施形態では、病原性突然変異は、疾患又は障害に関連する遺伝子中の疾患を引き起こす突然変異である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、病原性突然変異をその野生型対応物に復帰させることができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、病原性突然変異を疾患又は障害を引き起こさない配列に変化させることができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、病原性突然変異を修正することができる。病原性突然変異は、特定の疾患又は障害に対する個体の感受性又は素因を増加させる遺伝子突然変異であり得る。一部の実施形態では、病原性突然変異は、疾患又は障害に関連する遺伝子中の疾患を引き起こす突然変異である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、病原性突然変異をその野生型対応物に復帰させることができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、病原性突然変異を疾患又は障害を引き起こさない配列に変化させることができる。
表２３は、例示的な適応症（カラム１）、基礎遺伝子（カラム２）、及び本明細書に記載のシステム又は方法を用いて修正され得る病原性突然変異（カラム３）を提供する。
代償性編集（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｅｄｉｔｓ）
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、代償性編集を導入することができる。一部の実施形態では、代償性編集は、疾患を引き起こす突然変異の位置と異なる、疾患又は障害に関連する遺伝子の位置に存在する。一部の実施形態では、代償性突然変異は、原因突然変異を含む遺伝子中に存在しない。一部の実施形態では、代償性編集は、疾患を引き起こす突然変異を否定又は代償し得る。一部の実施形態では、代償性編集は、本明細書に提供されるシステム又は方法によって導入され、疾患を引き起こす突然変異の変異体の効果を抑制し、又は元に戻すことができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、代償性編集を導入することができる。一部の実施形態では、代償性編集は、疾患を引き起こす突然変異の位置と異なる、疾患又は障害に関連する遺伝子の位置に存在する。一部の実施形態では、代償性突然変異は、原因突然変異を含む遺伝子中に存在しない。一部の実施形態では、代償性編集は、疾患を引き起こす突然変異を否定又は代償し得る。一部の実施形態では、代償性編集は、本明細書に提供されるシステム又は方法によって導入され、疾患を引き起こす突然変異の変異体の効果を抑制し、又は元に戻すことができる。
表２４は、例示的な適応症（カラム１）、遺伝子（カラム２）、及び本明細書に記載のシステム又は方法を用いて導入され得る代償性編集（カラム３）を提供する。一部の実施形態では、表２４に提供される代償性編集を導入し、疾患を引き起こす突然変異の変異体の効果を抑制し、又は元に戻すことができる。
調節編集
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、調節編集を導入することができる。一部の実施形態では、調節編集は、遺伝子の調節配列、例えば、遺伝子プロモータ、遺伝子エンハンサー、遺伝子リプレッサ、又は遺伝子スプライシングを制御する配列に導入される。一部の実施形態では、調節編集は、標的遺伝子の発現レベルを増加又は減少させる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異を含む遺伝子と同じである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異を含む遺伝子と異なる。例えば、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、調節編集をＢＣＬ１１Ａのプロモータに導入することによって胎児ヘモグロビンの発現を上方制御し、それにより鎌状赤血球症を処置することができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、調節編集を導入することができる。一部の実施形態では、調節編集は、遺伝子の調節配列、例えば、遺伝子プロモータ、遺伝子エンハンサー、遺伝子リプレッサ、又は遺伝子スプライシングを制御する配列に導入される。一部の実施形態では、調節編集は、標的遺伝子の発現レベルを増加又は減少させる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異を含む遺伝子と同じである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異を含む遺伝子と異なる。例えば、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、調節編集をＢＣＬ１１Ａのプロモータに導入することによって胎児ヘモグロビンの発現を上方制御し、それにより鎌状赤血球症を処置することができる。
表２５は、例示的な適応症（カラム１）、遺伝子（カラム２）、及び本明細書に記載のシステム又は方法を用いて導入され得る調節編集（カラム３）を提供する。
リピート伸長病
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、リピート伸長病、例えば、表２６に提供されるリピート伸長病を処置することができる。表２６は、適応症（カラム１）、遺伝子（カラム２）、病態において拡大されるリピートの最小反復配列（カラム３）、及び各適応症について列記される遺伝子に対するリピートの位置（カラム４）を提供する。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓを含むものを用いて、カスタマイズされたＲＮＡ鋳型に従う遺伝子座でリピートの数をリセットすることにより、リピート伸長病を処置することができる例えば、実施例２４を参照されたい）。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法を用いて、リピート伸長病、例えば、表２６に提供されるリピート伸長病を処置することができる。表２６は、適応症（カラム１）、遺伝子（カラム２）、病態において拡大されるリピートの最小反復配列（カラム３）、及び各適応症について列記される遺伝子に対するリピートの位置（カラム４）を提供する。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓを含むものを用いて、カスタマイズされたＲＮＡ鋳型に従う遺伝子座でリピートの数をリセットすることにより、リピート伸長病を処置することができる例えば、実施例２４を参照されたい）。
例示的な鋳型
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法は、表２７に列記される鋳型配列を使用する。表２７は、指定の病原性突然変異（カラム４）を修正するため、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドと対合するように設計された、例示的な鋳型ＲＮＡ配列（カラム５）及び任意選択での第２ニックｇＲＮＡ配列（カラム６）を提供する。表２７中の全ての鋳型は、（１）第１鎖ニックに対する標的化ｇＲＮＡ、（２）ポリペプチド結合ドメイン、（３）異種目的配列、及び（４）第１鎖ニックでＴＰＲＴをセットアップするための標的相同性ドメインの全配列を例示することが意図される。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法は、表２７に列記される鋳型配列を使用する。表２７は、指定の病原性突然変異（カラム４）を修正するため、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドと対合するように設計された、例示的な鋳型ＲＮＡ配列（カラム５）及び任意選択での第２ニックｇＲＮＡ配列（カラム６）を提供する。表２７中の全ての鋳型は、（１）第１鎖ニックに対する標的化ｇＲＮＡ、（２）ポリペプチド結合ドメイン、（３）異種目的配列、及び（４）第１鎖ニックでＴＰＲＴをセットアップするための標的相同性ドメインの全配列を例示することが意図される。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるシステム又は方法は、表３５に列記される鋳型配列を使用する。表３５は、指定の病原性突然変異（カラム４）を修正するため、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドと対合するように設計された、例示的な鋳型ＲＮＡ配列（カラム５）及び任意選択での第２ニックｇＲＮＡ配列（カラム６）を提供する。表３５中の全ての鋳型は、（１）第１鎖ニックに対する標的化ｇＲＮＡ、（２）ポリペプチド結合ドメイン、（３）異種目的配列、及び（４）第１鎖ニックでＴＰＲＴをセットアップするための標的相同性ドメインの全配列を例示することが意図される。
例示的な異種目的配列
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列を含み、異種目的配列又はその逆相補的配列は、タンパク質（例えば、抗体）又はペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療法は、ＦＤＡなどの規制機関により承認されているものである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列を含み、異種目的配列又はその逆相補的配列は、タンパク質（例えば、抗体）又はペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療法は、ＦＤＡなどの規制機関により承認されているものである。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、ＴＨＰｄｂデータベース（Ｕｓｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（７）：ｅ０１８１７４８（２０１７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表２８に開示されるタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを含むもの）を用いて、表２８からのタンパク質又はペプチドの発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主でのタンパク質又はペプチドの発現を可能にし得る。一部の実施形態では、表２８の第１列中のタンパク質又はペプチドの配列は、表２８の第３列に提供される特許又は出願（その全体が、参照により組み込まれる）に見出すことができる。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２７（１）：１（２０２０）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）の表１に開示される抗体である。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表２９に開示される抗体である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを含むもの）を用いて、表２９からの抗体の発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主での抗体の発現を可能にし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法を用いて、表２９の第２列の標的に結合する薬剤（例えば、表２９の第１列のモノクローナル抗体）を、表２９の第３列の適応症を有する対象に発現させる。
植物修飾方法
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、例えば、植物の適応度を高めるために、植物又は植物部分（例えば、葉、根、花、果実、若しくは種子）を修飾することができる。
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、例えば、植物の適応度を高めるために、植物又は植物部分（例えば、葉、根、花、果実、若しくは種子）を修飾することができる。
Ａ．植物への送達
本明細書には、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物に送達する方法が提供される。植物、又はその部分をＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムと接触させることにより、植物にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する方法が含まれる。これらの方法は、例えば、植物の適応度を高める目的で、植物を修飾するために有用である。
本明細書には、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物に送達する方法が提供される。植物、又はその部分をＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムと接触させることにより、植物にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する方法が含まれる。これらの方法は、例えば、植物の適応度を高める目的で、植物を修飾するために有用である。
より具体的には、一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸）をベクター内でコードし得、例えば植物ベクター（例えば、ｐＨＵＣ４１１）中の植物プロモータ、例えばトウモロコシユビキチンプロモータ（ＺｍＵＢＩ）に隣接して挿入し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸を、アグロバクテリア（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を介して、植物（例えば、ジャポニカ米（ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ））又は植物の一部（例えば、植物のカルス）に導入する。一部の実施形態では、植物遺伝子（例えば、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））をヌルアレル（例えば、開始コドンに塩基置換を含む）で置換することにより、本明細書に記載のシステム及び方法を植物に使用することができる。植物ゲノムを修飾するためのシステム及び方法は、Ｘｕ ｅｔ．ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｒｉｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，２０２０，Ｐｌａｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓに記載されている。
一態様では、植物の適応度を高める方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置の植物（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達されていない植物）と比較して、植物の適応度を高めるために、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを（例えば、有効な量及び期間で）植物に送達するステップを含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、いくつかの方法で維持することができ、例えば、それにより、植物の生産改善、例えば、収率の向上、植物の成長力若しくは植物から収穫された産物の品質の向上、農業若しくは園芸に関して望ましいとみなされる収穫前後の特徴（例えば、味、外観、貯蔵寿命）の改善、又はそれ以外にヒトに有益な特徴改善（例えば、アレルゲン生成の低減）が達成される。植物の収率改善は、同じ条件下であるが、本組成物の適用なしで生産された植物の同じ産物の収率に対して又は従来の植物修飾剤の適用と比較して、測定可能な量による、植物の産物の収率の増加（例えば、植物バイオマス、穀粒、種子若しくは果実収率、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積により測定可能な）に関する。例えば、収率は、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、又は１００％超増加し得る。いくつかの事例では、本方法は、非処置植物と比較して、収率を約２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、又は１００倍超増加するのに有効である。収率は、植物の重量若しくは体積、又は何らかの基準に基づく植物の産物に関して表すことができる。基準は、時間、栽培面積、生産される植物の重量、又は使用される原材料の量に関して表すことができる。例えば、こうした方法は、限定されないが、以下：種子、果実、穀粒、実、塊茎、根、及び葉などの植物組織の収率を増加し得る。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、他の手段、例えば、同じ条件下であるが、本組成物の投与なしで、又は従来の植物修飾剤を適用して（例えば、ＰＭＰなしで送達される植物修飾剤）、生産された植物の産物の同じ要因と比較して、測定可能若しくは認識可能な量による、成長力評価、群落（面積単位当たりの植物の数）、植物の高さ、茎の状況、茎の長さ、葉の数、葉のサイズ、林冠、外観（例えば、濃い緑色の葉の色など）、根評価、出芽、タンパク質含量、分けつ増加、葉のサイズの増加、葉の増加、根出葉の減少、より強い新芽、必要な肥料の減少、必要な種子の減少、より生産性の高い新芽、より早い開花、より早い穀粒若しくは種子成熟、植物の傾き（ｖｅｒｓｅ）（倒伏）の減少、シュートの成長増大、より早期の発芽、又はこれらの要因の任意の組合せの増大若しくは改善によって測定することもできる。
従って、本明細書には、植物を修飾する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかを有効な量で植物に送達するステップを含み、ここで、上記方法は、植物を修飾し、それにより、非処置植物と比較して、植物に有益な特徴を導入するか、又はそれを（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。特に、本方法は、非処置植物と比較して、植物適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加し得る。
いくつかの事例では、植物適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水使用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、害虫耐性、草食動物耐性、病原体耐性、収率、水制限条件下での収率、成長力、成長、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、シュート長さ、根長さ、根構造、種子重量、又は収穫可能な産物の量の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、若しくは１００％超の）増加である。
いくつかの事例では、適応度の増加は、発育、成長、収率、非生物ストレス源に対する耐性、又は生物ストレス源に対する耐性の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、若しくは１００％超の）増加である。非生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、干ばつストレス、塩ストレス、熱ストレス、低温ストレス、及び低栄養ストレスが挙げられる。生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、線虫ストレス、草食昆虫ストレス、真菌病原体ストレス、細菌性病原体ストレス、又はウイルス病原体ストレスが挙げられる。ストレスは、一過性、例えば、数時間、数日、数ヶ月の場合もあれば、又は永続的、例えば、植物の寿命にわたる場合もある。
いくつかの事例では、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超の）増加である。例えば、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の商業的に好ましい特徴（例えば、味又は外観）の改善であり得る。他の事例では、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の貯蔵寿命の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超の）増加である。
代わりに、適応度の増加は、ヒト又は動物の健康に対して有益な特徴の改変、例えば、アレルゲン生成の低減であり得る。例えば、適応度の増加は、動物（例えば、ヒト）の免疫応答を刺激するアレルゲン（例えば、花粉）の生成の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超の）低減であり得る。
植物の修飾（例えば、適応度の増加）は、１つ又は複数の植物部分の修飾から起こり得る。例えば、植物は、植物の葉、種子、花粉、根、果実、シュート、花、細胞、プロトプラスト、又は組織（例えば、分裂組織）を接触させることにより、修飾することができる。従って、別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の花粉を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
また別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に開示のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物の種子を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
また別の態様では、有効量の本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物のプロトプラストを接触させるステップを含む方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
更に別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物の植物細胞を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の分裂組織を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の胚を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超）増加する。
Ｂ．適用方法
本明細書に記載の植物は、組成物を植物に送達又は投与することを可能にする任意の好適な様式で、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム組成物のいずれかに曝露することができる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、単独で、又は他の活性（例えば、肥料）若しくは非活性物質と組み合わせて送達され得、例えば有効濃度の植物修飾組成物を送達するために製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、スプレー、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態において、噴霧、注入（例えば、マイクロインジェクション）、植物を媒介して注ぎ込み、浸漬することにより、適用することができる。本明細書に記載の組成物の適用のための量及び位置は、一般に、植物の生息地、植物修飾組成物により植物をターゲティングすることができる生活環段階、適用を実施しようとする部位、並びに植物修飾組成物の物理的及び機能的特性により決定する。
本明細書に記載の植物は、組成物を植物に送達又は投与することを可能にする任意の好適な様式で、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム組成物のいずれかに曝露することができる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、単独で、又は他の活性（例えば、肥料）若しくは非活性物質と組み合わせて送達され得、例えば有効濃度の植物修飾組成物を送達するために製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、スプレー、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態において、噴霧、注入（例えば、マイクロインジェクション）、植物を媒介して注ぎ込み、浸漬することにより、適用することができる。本明細書に記載の組成物の適用のための量及び位置は、一般に、植物の生息地、植物修飾組成物により植物をターゲティングすることができる生活環段階、適用を実施しようとする部位、並びに植物修飾組成物の物理的及び機能的特性により決定する。
いくつかの事例では、組成物は、例えば、バックパック噴霧、空中噴霧、作物噴霧／散布などにより、植物、例えば、作物に直接噴霧する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物に送達する場合、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを受ける植物は、植物成長の任意の段階であってよい。例えば、製剤化された植物修飾組成物を植物成長の早期段階で種子コーティング若しくは根処理として、又は作物サイクルの後期段階での全植物処理として適用することができる。いくつかの事例では、植物修飾組成物は、植物に対する局所薬剤として適用してもよい。
更に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、植物の組織を通して吸収及び分布される浸透性薬剤として（例えば、植物が成長する土壌に、又は植物の水遣りに使用する水に）適用してもよい。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを発現するように、植物又はえさ生物を遺伝子的に形質転換することもできる。
また、溶解性若しくは生体内分解性コーティング層、例えば、ゼラチンで、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム又は植物修飾組成物を含む組成物をコーティングすることにより、遅延又は連続的放出を達成することも可能であり、上記のコーティングは、使用環境内で溶解又は分解し、その後、植物修飾ｃｏｍ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム位置が利用可能になるか、又は溶解性若しくは分解性マトリックス中に薬剤を分散することによっても達成することができる。こうした連続的放出及び／又は分散は、デバイスを有利に使用して、本明細書に記載の植物修飾組成物の１つ又は複数の有効濃度を一定に維持し得ることを意味する。
いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の一部、例えば、その葉、種子、花粉、根、果実、シュート、若しくは花、若しくは組織、細胞、又はプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の細胞に送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物のプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の組織に送達する。例えば、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織、又は介在分裂組織）に組成物を送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織（例えば、単組織（例えば、柔組織、厚角組織、若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木部若しくは師部））に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する。
Ｃ．植物
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムで処置するために、多様な植物に送達することができる。本方法に従ってＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する（すなわち、「処置する」）ことができる植物は、全植物及び植物部分を含み、そうしたものとして、限定されないが、シュート栄養器官／構造（例えば、葉、茎及び塊茎）、根、花及び花器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯及び胚珠）、種子（胚、胚乳、子葉、及び種皮を含む）並びに果実（成熟卵胞）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）並びに細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）、並びにそれらの子孫が挙げられる。植物部分は、更に、シュート、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節間、樹皮、軟毛、新芽、根茎、葉状体、（イネ科植物の）葉、花粉、雄蕊などの植物の部分も指す。
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムで処置するために、多様な植物に送達することができる。本方法に従ってＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する（すなわち、「処置する」）ことができる植物は、全植物及び植物部分を含み、そうしたものとして、限定されないが、シュート栄養器官／構造（例えば、葉、茎及び塊茎）、根、花及び花器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯及び胚珠）、種子（胚、胚乳、子葉、及び種皮を含む）並びに果実（成熟卵胞）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）並びに細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）、並びにそれらの子孫が挙げられる。植物部分は、更に、シュート、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節間、樹皮、軟毛、新芽、根茎、葉状体、（イネ科植物の）葉、花粉、雄蕊などの植物の部分も指す。
本明細書に開示される方法で処置することができる植物のクラスは、高等及び下等植物のクラスを含み、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、ツクシ、古生マツバラン（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅ）、小葉植物、コケ植物、及び藻類（例えば、多細胞又は単細胞藻類）が挙げられる。本方法に従って処置することができる植物は更に、任意の維管束植物、例えば、単子葉若しくは双子葉植物、又は裸子植物を含み、限定されないが、以下のものが挙げられる：アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、カノーラ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、ハマナ（ｃｒａｍｂｅ）、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム（ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）、ヤマノイモ、ユーカリ、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、リリアセア（ｌｉｌｉａｃｅａ）、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライムギ、ライグラス、サフラワー、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、シバ、コムギ、並びにレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物（ｃｕｃｕｒｂｉｓ）などの野菜作物；リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなどの果実及び堅果樹；ブドウ（例えば、ブドウ園）、キーウィ、ホップなどのつる植物；ラズベリー、ブラックベリー、グーズベリーなどの果実低木及びブランブル；トネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クリ、ポプラなどの森林樹；並びにアルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、ハマナ（ｃｒａｍｂｅ）、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、コメ、サフラワー、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト、及びコムギ。本明細書に開示される方法に従って処置することができる植物は、あらゆる作物植物、例えば、飼料作物、油糧種子作物、穀粒作物、果物作物、野菜作物、繊維作物、香辛料作物、ナッツ作物、芝土作物、糖料作物、飲料作物、及び森林作物を含む。特定の事例では、本方法で処置される作物植物は、ダイズ植物である。他の特定の事例では、作物植物は、コムギである。他の特定の事例では、作物植物は、トウモロコシである。他の特定の事例では、作物植物は、綿である。特定の事例では、作物植物は、アルファルファである。特定の事例では、作物植物は、テンサイである。特定の事例では、作物植物は、コメである。特定の事例では、作物植物は、ジャガイモである。特定の事例では、作物植物は、トマトである。
特定の事例では、植物は、作物である。こうした作物植物の例として、限定されないが、単子葉及び双子葉植物が挙げられ、限定されないが、下記のものから選択される飼料若しくは飼い葉用マメ科植物、観賞植物、食用作物、樹木、又は低木を含む：カエデ属種（Ａｃｅｒ ｓｐｐ．）、アリウム属種（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、アマランサス属種（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、セロリ（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ラッカセイ属種（Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐｐ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．）（カノーラ、アブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ）、ナバナ（ｔｕｒｎｉｐ ｒａｐｅ））、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｌｉｖａ）、トウガラシ属種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、クリ属種（Ｃａｓｔａｎｅａ ｓｐｐ．）、エンダイブ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、シトラス属種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココス属種（Ｃｏｃｏｓ ｓｐｐ．）、コーヒーノキ属種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ハシバミ属種（Ｃｏｒｙｌｕｓ ｓｐｐ．）、クラタエグス属種（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｓｐｐ．）、カボチャ属種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐｐ．）、ククミス属種（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐｐ．）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ブナ属種（Ｆａｇｕｓ ｓｐｐ．）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、フラガリア属種（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｐ．）、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、ダイズ属種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ．）（例えば、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ソーヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ ｈｉｓｐｉｄａ）若しくはソーヤ・マックス（Ｓｏｊａ ｍａｘ））、リクチワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ヒマワリ属種（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ハイビスカス属種（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｐｐ．）、オオムギ属種（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、クルミ属種（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｐｐ．）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、レイシ（Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ミヤコグサ属種（Ｌｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、トカドヘチマ（Ｌｕｆｆａ ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）、ルピナス属種（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、トマト属種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．）（例えば、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｒｎ）、リコペルシコン・リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ））、リンゴ属種（Ｍａｌｕｓ ｓｐｐ．）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ハッカ属種（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｐ．）、ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロミグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）、バショウ種種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、タバコ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．）、オリーブ属種（Ｏｌｅａ ｓｐｐ．）、オリザ属種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｐ．）（例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・ラティフォリア（Ｏｒｙｚａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ））、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、イタリアンパセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ）、インゲンマメ属種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、マツ属種（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、ピスタチオ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）、エンドウ属種（Ｐｉｓｕｍ ｓｐｐ．）、イチゴツナギ属種（Ｐｏａ ｓｐｐ．）、ハコヤナギ属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、サクラ属種（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ．）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コナラ属種（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラディッシュ（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ショクヨウダイオウ（Ｒｈｅｕｍ ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ）、スグリ属種（Ｒｉｂｅｓ ｓｐｐ．）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、キイチゴ属種（Ｒｕｂｕｓ ｓｐｐ．）、サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、ヤナギ属種（Ｓａｌｉｘ ｓｐ．）、ニワトコ属種（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｐｐ．）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ゴマ属種（Ｓｅｓａｍｕｍ ｓｐｐ．）、シナピス属種（Ｓｉｎａｐｉｓ ｓｐｐ．）、ナス属種（Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ヒラナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ）若しくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ホウレンソウ属種（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｓｐｐ．）、タマリンディス・インディカ（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ ｉｎｄｉｃａ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、トリフォリウム属種（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、トリチコセケル・リンパウイ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｒｉｍｐａｕｉ）、コムギ属種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、デュラムコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、ベットコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、トリチカム・ヒベルナム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｈｙｂｅｒｎｕｍ）、トリチカム・マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍａｃｈａ）、トリチカム・サチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）若しくはリチカム・ブルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、スノキ属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐｐ．）、ソラマメ属種（Ｖｉｃｉａ ｓｐｐ．）、ササゲ属種（Ｖｉｇｎａ ｓｐｐ．）、ニオイスミレ（Ｖｉｏｌａ ｏｄｏｒａｔａ）、ブドウ属種（Ｖｉｔｉｓ ｓｐｐ．）、並びにトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）。特定の実施形態では、作物植物は、コメ、アブラナ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ（トウモロコシ）、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ、又はコムギである。
本発明で使用される植物又は植物部分は、植物発育のあらゆる段階の植物を含む。特定の事例では、送達は、発芽、苗成長、栄養成長、及び生殖成長の段階中に行うことができる。特定の事例では、植物への送達は、栄養及び生直成長段階の間に行う。いくつかの事例では、組成物は、植物の花粉に送達する。いくつかの事例では、植物の種子に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物のプロトプラストに組成物を送達する。いくつかの事例では、植物の組織に組成物を送達する。例えば、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織、又は介在分裂組織）に組成物を送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織（例えば、単組織（例えば、柔組織、厚角組織、若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木部若しくは師部））に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物細胞に組成物を送達する。栄養及び生殖成長の段階は、本明細書において、「成体」又は「成熟」植物とも呼ばれる。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物部分に送達する事例では、植物修飾剤により植物部分を修飾してもよい。代わりに、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物の他の部分に分布させ（例えば、植物の循環系によって）、その後、それらの部分を植物修飾剤により修飾する。
投与及び送達様式
本発明によって提供される方法において使用される、本発明によって提供されるシステムの核酸要素は、様々な様式によって送達され得る。システムが２つの別個の核酸分子を含む（例えば、レトロトランスポザーゼ及び鋳型核酸が別個の分子である）実施形態において、２つの分子が、同じ様式によって送達され得る一方、他の実施形態において、２つの分子が、異なる様式によって送達される。本明細書に記載の組成物及びシステムは、インビトロ又はインビボで使用され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、例えば、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達される。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば、多細胞生物、例えば、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ）、鳥類（例えば、家禽類、ニワトリ、シチメンチョウ、又はアヒル）、又は魚類の細胞である。一部の実施形態では、細胞は非ヒト動物細胞（例えば、実験動物、家畜動物、又はコンパニオンアニマル）である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞（例えば、造血幹細胞）、線維芽細胞、又はＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は非分裂細胞、例えば、非分裂線維芽細胞又は非分裂Ｔ細胞である。当業者であれば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの成分が、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びそれらの組合せの形態で送達され得ることが理解されるであろう。
本発明によって提供される方法において使用される、本発明によって提供されるシステムの核酸要素は、様々な様式によって送達され得る。システムが２つの別個の核酸分子を含む（例えば、レトロトランスポザーゼ及び鋳型核酸が別個の分子である）実施形態において、２つの分子が、同じ様式によって送達され得る一方、他の実施形態において、２つの分子が、異なる様式によって送達される。本明細書に記載の組成物及びシステムは、インビトロ又はインビボで使用され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、例えば、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達される。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば、多細胞生物、例えば、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ）、鳥類（例えば、家禽類、ニワトリ、シチメンチョウ、又はアヒル）、又は魚類の細胞である。一部の実施形態では、細胞は非ヒト動物細胞（例えば、実験動物、家畜動物、又はコンパニオンアニマル）である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞（例えば、造血幹細胞）、線維芽細胞、又はＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は非分裂細胞、例えば、非分裂線維芽細胞又は非分裂Ｔ細胞である。当業者であれば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの成分が、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びそれらの組合せの形態で送達され得ることが理解されるであろう。
例えば、送達は、レトロトランスポザーゼ（例えば、レトロトランスポザーゼタンパク質をコードするＤＮＡとして、レトロトランスポザーゼタンパク質をコードするＲＮＡとして、又はタンパク質自体として）及び鋳型ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡをコードするＤＮＡとして、又はＲＮＡとして）を送達するために、以下の組み合わせのいずれかを使用することができる：
１．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ＤＮＡ
２．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ＤＮＡ
３．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ＲＮＡ
４．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ＲＮＡ
５．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ＤＮＡ
６．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ＲＮＡ
７．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ウイルス
８．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ＤＮＡ
９．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ＲＮＡ
１０．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ウイルス
１１．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ウイルス
１２．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ウイルス。
１．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ＤＮＡ
２．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ＤＮＡ
３．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ＲＮＡ
４．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ＲＮＡ
５．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ＤＮＡ
６．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ＲＮＡ
７．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ウイルス
８．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ＤＮＡ
９．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ＲＮＡ
１０．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ウイルス
１１．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ウイルス
１２．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ウイルス。
上記のように、一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは、ウイルスを使用して送達され、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、ウイルスを使用して送達される。
一実施形態では、システム及び／又はシステムの成分は、核酸として送達される。例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの形態で送達され得、鋳型ＲＮＡは、ＲＮＡ又はそのＲＮＡに転写される相補的ＤＮＡの形態で送達され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、１、２、３、４、又はそれ以上の個別の核酸分子上で送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びＲＮＡの組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集ポリペプチドは、タンパク質として送達される。
一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ベクターを用いて、細胞、例えば、哺乳動物細胞又はヒト細胞に送達される。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスであってもよい。一部の実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、又はインサイチュである。一部の実施形態では、ウイルスは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスである。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ウイルス様粒子又はビロソームを用いて細胞に送達される。一部の実施形態では、送達には、ウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームを使用する。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムは、リポソーム又は他の類似の小胞体中に製剤化することができる。リポソームは、内部水性コンパートメントを取り囲む単層又は多重層脂質二重膜と、比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重膜から構成される球状の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、生体適合性、非中毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらのカーゴをプラズマ酵素による分解から保護すると共に、それらのロードを生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を介して輸送することができる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から製造することができるが；薬物担体としてリポソームを作製するためにはリン脂質が最も一般的に使用される。多重層小胞脂質の調製方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照；多重層小胞脂質の調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置、又は押出機を用いて振盪の形態で力を加えることにより、それを促進することもできる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７（押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、サイズ漸減フィルターを介した押出により調製することができる。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の医薬組成物のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体の別の例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保持し、薬物安定性及び負荷容量を向上させると共に、薬物漏出を防ぐ、修飾固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的に対して薬物送達を効果的に指向し、薬物安定性及び薬物放出制御を改善する。また、脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）、すなわちリポソーム及びポリマーを組み合わせた新しいタイプの担体を使用してもよい。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの相補的利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは良好な生体適合性を賦与する。このように、２つの成分は、薬物封入効率を高め、表面修飾を促進すると共に、水溶性薬物の漏出を防ぐ。例えば、論評については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
また、本明細書に記載の組成物及びシステム用の薬物送達ビヒクルとしてエクソソームを使用することもできる。例えば、論評については、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを細胞、組織及び多細胞生物に導入することができる。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、機械的手段又は物理的手段を用いて、細胞に送達される。
タンパク質治療薬の製剤化は、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許、並びに他の出版物及び参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書に、例えば本明細書の任意の表に参照として掲載されるＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚは全て、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示されない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、２０２０年３月４日現在で最新のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質に複数の配列アクセッション番号が付いている場合、これら配列変異体の全てが包含される。
本発明を以下の実施例により更に説明する。これらの実施例は、説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１：タンパク質ドメインのモジュール性を示す内部Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ欠失
この実施例は、機能を保持し、更にＤＮＡ結合ドメインのモジュール性を示す、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの欠失を説明する。
この実施例は、機能を保持し、更にＤＮＡ結合ドメインのモジュール性を示す、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの欠失を説明する。
この実施例では、一連の実験を実施して、様々な変異型レトロトランスポザーゼの活性を試験し、タンパク質のモジュール性に関する構造的知識を得た。この実験では、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のｃ－ｍｙｂモチーフの後のポリペプチドストレッチを除去し、それを柔軟リンカーに置換することを試験した（図１ａ）。除去されたポリペプチドストレッチは、ＤＮＡ結合モチーフとＲＮＡ結合ドメインの間の介在領域であるため、「天然リンカー」と呼ばれる。除去されたポリペプチド領域は、次の範囲：位置Ａ（ｃ－ｍｙｂモチーフに続く予測ランダムコイル）又は位置Ｂ（ｃ－ｍｙｂモチーフの一部を含む予測アルファヘリックスの末端）のいずれかのＮ末端側に及び、除去された領域は、位置ｖ１（予測－１ＲＮＡ結合モチーフに先行するＲ２Ｔｇのアルファヘリックス領域）又は位置ｖ２（予測－１ＲＮＡ結合モチーフに先行するＲ２Ｔｇのアルファヘリックス領域のＣ末端側）のいずれかで終了する。除去されたポリペプチドストレッチの代わりに、「天然リンカー」は、２つのリンカー（リンカーＡ、ＸＴＥＮ：ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）、及びリンカーＢ、３ＧＳ：ＧＧＧＳ（配列番号１０２４））のいずれかである。異なる除去領域（位置Ａ－ｖ１、位置Ａ－ｖ２、位置Ｂ－ｖ１、又は位置Ｂ－ｖ２）を含むこれらの変異型レトロトランスポザーゼのそれぞれについて、これらは、Ｒ２Ｔｇを発現するプラスミドに対するＰＣＲによってリンカーＡ又はリンカーＢのいずれかで置換され、それにより、以下の表Ｅ１に示すように、以下の配列が得られた：３ＧＳリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＡ－ｖ１、３ＧＳリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＡ－ｖ２、ＸＴＥＮリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＡ－ｖ１、ＸＴＥＮリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＡ－ｖ２、３ＧＳリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＢ－ｖ１、３ＧＳリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＢ－ｖ２、ＸＴＥＮリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＢ－ｖ１、ＸＴＥＮリンカーで置換されたｃ－ｍｙｂＢ－ｖ２。リンカーの挿入は、サンガー配列決定法によって確認され、トランスフェクションのためにＤＮＡプラスミドが精製された。
（実施例）
（実施例）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｒ２Ｔｇ（野生型）、Ｒ２エンドヌクレアーゼ変異体、及び天然リンカー変異体を発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造者の推奨に従ってＦｕｇｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬を使用して実施され、各ウェルに８０ｎｇのプラスミドＤＮＡ及び０．５μＬのトランスフェクション試薬を加えた。全てのトランスフェクションは二重に実施し、ゲノムＤＮＡ抽出の前に細胞を７２時間インキュベートした。
変異体の活性は、３’接合部アンプリコンの数を測定することによってＲ２Ｔｇ組込みのコピー数を定量化するｄｄＰＣＲアッセイによって測定された（図１ｂ）。
ｃ－ｍｙｂ ＤＮＡ結合モチーフ（位置Ａ、ｃ－ｍｙｂＡ）に続くランダムコイルの後に始まる欠失は、野生型Ｒ２Ｔｇに近い組込み活性で十分に許容される。天然リンカー領域の欠失終点は、位置ｖ１（－１ＲＮＡ結合モチーフに先行するαヘリックスのＮ末端）又はｖ２（－１ＲＮＡ結合モチーフに先行するαヘリックスのＣ末端）のいずれかでほぼ同じである。位置Ａで開始し、位置ｖ１又はｖ２で終了する欠失については、このポリペプチドストレッチのＸＴＥＮリンカー（配列番号１０２３）による置換が最も多くの活性を保持しているように見えるが、３ＧＳリンカー（配列番号１０２４）による置換は組込み活性が約５０％減少している。位置Ｂ（ｃ－ｍｙｂＢ）で始まる天然リンカー欠失の場合、これらの配置は、野生型又は位置Ａ（ｃ－ｍｙｂＡ）と比較した場合、組込み活性のより顕著な減少を示す。活性の違いは、リンカーの位置、リンカーの長さ、又は位置Ｂを位置ｖ１又はｖ２に接続するのに最適ではないリンカーのアミノ酸の組み合わせにより、レトロトランスポザーゼの非最適な三次元構造を生成する欠失の位置に基づくタンパク質の構造に関連している可能性がある。Ｎ末端の天然リンカー欠失開始位置ｍｙｂＢは準最適であるが、欠失のＣ末端は、３ＧＳ又はＸＴＥＮリンカーのｖ２で最も許容され、ＲＢＤ－１領域に先行するポリペプチドを有するのに優先的な位置であるように見える。
実施例２：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒエンドヌクレアーゼドメインの標的特異性の決定
この実施例では、ヒト細胞でカスタムゲノムランディングパッドを使用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムによる標的切断とその後の組込みに配列要件があるか否かを判断することを説明する。
この実施例では、ヒト細胞でカスタムゲノムランディングパッドを使用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムによる標的切断とその後の組込みに配列要件があるか否かを判断することを説明する。
この実施例では、細胞株は、Ｒ２レトロトランスポザーゼがレトロトランスポジションの標的とするＲ２位置を含むｒＤＮＡの領域を模倣する「ランディングパッド」又は安定した組込みを有するように生成された（図２を参照）。組込み体又はランディングパッドは、ｒＤＮＡに見出されるＲ２部位及びその周辺に野生型領域配列、Ｒ２切断部位及びその周辺に１２ｂｐの配列変異、又はＲ２切断部位及びその周辺に７５ｂｐの配列変異を有するように設計された（表Ｅ２）。これらの異なるランディングパッドのＤＮＡは、化学的に合成され、ｐＬｅｎｔｉ－Ｎ－ｔＧＦＰベクターにクローニングされた。レンチウイルス発現ベクターへクローン化されたランディングパッドが確認され、ランディングパッドのサンガー配列決定法によって配列が検証された。レンチウイルスパッケージングミックス（９μｇ、Ｂｉｏｓｅｔｔｉａから取得）と一緒に配列確認済みのプラスミド（９μｇ）を製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）を使用してパッケージング細胞株、ＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間（２４時間での１回の培地交換を含む）インキュベートし、培地を含むウイルス粒子を細胞培養皿から収集した。収集した培地を０．２μｍフィルターで濾過して細胞破片を除去し、Ｕ２ＯＳ細胞の形質導入の準備をした。ウイルス含有培地をＤＭＥＭで希釈し、ポリブレンと混合して、ポリブレンの最終濃度が８μｇ／ｍｌであるＵ２ＯＳ細胞の形質導入用の希釈系列を調製した。Ｕ２ＯＳ細胞をウイルス含有培地で４８時間増殖させた後、新鮮な培地で分割した。分割した細胞をコンフルエンスまで増殖させ、異なる希釈のウイルスの形質導入効率を、フローサイトメトリーによるＧＦＰ発現と、ＧＦＰ及び異なるｒＤＮＡランディングパッドを含むゲノム組込みレンチウイルスのｄｄＰＣＲ検出によって測定した（ＷＴ、１２ｂｐ変異、又は７５ｂｐ変異）。１：１０ウイルス培地希釈（＞９９％ ＧＦＰ＋）からのＧＦＰ陽性細胞株を、その後の実験のために選択し、凍結保存した。
Ｒ２切断位置及びその周辺の変異がＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム活性に影響を与えるか否かを試験するために、Ｒ２Ｔｇ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＤｒｉｖｅｒとＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ導入遺伝子分子を発現するプラスミドを異なるランディングパッド細胞株にエレクトロポレーションした。切断部位内及びその周辺の配列が組み込むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド配列活性に影響を与えるか否かを試験するために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子の相同性アームは、各ランディングパッドの切断位置の左に１００ｂｐ（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ分子モジュールＡ）及び右に１００ｂｐ（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ分子モジュールＦ）で１００％の相同性を有するように設計された。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子発現プラスミドの相同性アームへの変更は、ＰＣＲによって導入され、サンガー配列決定法によって確認された。７３ｎｇのＷＴ Ｒ２Ｔｇ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ Ｄｒｉｖｅｒ又はエンドヌクレアーゼドメイン変異体Ｒ２Ｔｇ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ Ｄｒｉｖｅｒ発現プラスミドのいずれかを、ヌクレオフェクションプログラムＤＮ１００を使用して、異なるＵ２ＯＳランディングパッド細胞株（ＷＴ、１２ｂｐ変異体、又は７５ｂｐ変異体）のそれぞれに、ＷＴランディングパッド、１２ｂｐ変異体ランディングパッド、又は７５ｂｐ変異体ランディングパッドのいずれかと１００％の相同性を有するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子を発現する１７７ｎｇのプラスミドで同時ヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞を３７℃、１０％ＣＯ２で３日間増殖させ、その後、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出を行った。抽出されたｇＤＮＡは、ｄｄＰＣＲによってランディングパッド部位でのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子組込みについて測定された。ＤＮＡニッキング活性は、ｇＤＮＡで見出されたランディングパッドから生成されたアンプリコンの次世代配列分析を通じて、ランディングパッドでの挿入、削除、及び／又は挿入と削除の両方の組み合わせの検出によって測定された。
Ｒ２Ｔｇ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの組込み活性は、１２ｂｐ又は７５ｂｐランディングパッド細胞株のいずれにもＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子の組込みがない切断領域が変異すると大幅に低下する（図３ａ）。更に、組込みは、１２ｂｐ又は７５ｂｐ変異ランディングパッドのいずれかに対応する相同性アームを有するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子では検出されない。失われた組込み活性が不適合な相同性アームによるものであることを除外するために、ランディングパッドのＮＧＳ分析によってＤＮＡニッキング活性を測定した。ＷＴ Ｒ２Ｔｇ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒドライバーは、ＷＴ、１２ｂｐ変異体、又は７５ｂｐ変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子と同等のインデルをＷＴランディングパッドに有していたため、ニッキング活性はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子とは無関係である（図３ｂ）。１２ｂｐ及び７５ｂｐランディングパッドは、ＷＴ Ｒ２Ｔｇ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒと同時ヌクレオフェクトされたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子にかかわらず、インデルを含むバックグラウンドを超えるリードを示さなかった。インデルのレベルは、エンドヌクレアーゼ変異を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型ドライバーと同様であった。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、エンドヌクレアーゼドメインにあるレベルの標的配列特異性を有するレトロトランスポザーゼに由来する。従って、エンドヌクレアーゼ認識モチーフ（ＥＲＭ）と呼ばれる、エンドヌクレアーゼドメインによって認識される天然標的配列と相同性を有するゲノム内の位置にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを再標的化することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、このサブ標的配列は、ニック部位を取り囲む領域に含まれ得る。特定の実施形態では、Ｒ２要素、例えばＲ２Ｔｇのニック部位に基づく１３ｎｔ配列（ＴＡＡＧＧＴＡＧＣＣＡＡＡ）（配列番号１６６１）を使用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを再ターゲティングするのに適した位置を求めてヒトゲノムを検索し、ここで、異種ＤＮＡ結合ドメインは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを内因性ＥＲＭに局在化して、エンドヌクレアーゼ活性及びその後の鋳型ＲＮＡのレトロトランスポジションを指示するように設計されている。一部の実施形態では、ヒトゲノム部位は、１３ｎｔモチーフ中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３のヌクレオチドに対して１００％の同一性を有する。更なる実施形態では、ＥＲＭを含むヒトゲノム部位は表Ｅ３から選択され、ＤＮＡ結合ドメイン融合、例えば、カスタムｇＲＮＡとのＺＦ、ＴＡＬ、又はｄＣａｓ９は、ポリペプチドをその部位に局在化するように設計される（例えば、例３を参照）。好ましい実施形態では、ゲノム部位は、Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３０，８１４－２８２（２０１９）で定義され、表Ｅ３に示されるように、少なくとも５、６、７、８のセーフハーバースコアを保有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、相同性アームが、新しい標的で予想されるニック部位を取り囲む隣接ゲノム配列と一致するように設計される。
実施例３：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒのゲノムセーフハーバー部位への再ターゲティング
この実施例では、その活性をゲノムのセーフハーバー部位に向け直す異種ＤＮＡ結合ドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを説明する。
この実施例では、その活性をゲノムのセーフハーバー部位に向け直す異種ＤＮＡ結合ドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを説明する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド配列は、その天然ＤＮＡ結合ドメインが置換、変異／不活性化、及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムをその内因性又は天然結合部位ではない別のゲノム位置に向け直すことができる別のポリペプチド配列と結合する位置に変更される。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを非天然ゲノム位置に向け直すポリペプチド配列も、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド配列の任意のモジュールに結合及び／又は挿入することができる。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを非天然ゲノム標的に向け直すために使用されるポリペプチド配列は、ジンクフィンガー、一連の隣接する、規則的又は不規則な間隔のジンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、一連の隣接する、規則的又は不規則な間隔の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、Ｃａｓ９、二本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を不活性化する触媒残基への変異を伴うＣａｓ９（触媒死（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ－ｄｅａｄ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と呼ばれる）、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡの１つの鎖のみを切断できるようにするために、単一の触媒ドメインに１つ又は複数の点変異を伴うＣａｓ９（Ｃａｓ９ニッカーゼと呼ばれる）をコードする（図５参照）。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを向け直すために使用されるポリペプチド配列は、ゲノムセーフハーバー位置（例えば、ヒト第１９染色体上のＡＡＶＳ１部位）を標的とする（Ｐｅｌｌｅｎｚ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３０（７），８１４－８２８，２０１９）。図４及び６を参照されたい。更なる実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド配列を向け直すために使用されるポリペプチド配列は、ゲノムセーフハーバー位置を標的とする核酸と一緒に使用される（例えば、第１９染色体のＡＡＶＳ１部位を標的とするシングルガイドＲＮＡと共に、触媒死Ｃａｓ９のポリペプチド配列）。
実施例４：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒにおける内因性核小体局在化シグナルの不活性化
この実施例は、核小体へのタンパク質の細胞内ターゲティングを減少させるために、内因性核小体局在化シグナルが不活性化されているＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを説明する。
この実施例は、核小体へのタンパク質の細胞内ターゲティングを減少させるために、内因性核小体局在化シグナルが不活性化されているＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを説明する。
この実施例では、レトロトランスポザーゼの核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）は、核小体に局在する確認済みのタンパク質で訓練された公開アルゴリズムを使用して、コンピューターで予測される（Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（２１），７３８８－７３９９（２０１０））。予測ＮｏＬＳ配列は、アミノ酸配列、アミノ酸配列のコンテキスト、及びレトロトランスポザーゼの予測される二次構造の両方に基づく。同定された配列は、典型的には、塩基性アミノ酸が豊富であり（Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（２１），７３８８－７３９９（２０１０））、これらの残基が単純な側鎖の非塩基性アミノ酸に変異するか、又はレトロトランスポザーゼポリペプチド鎖から除去されると、核小体への局在化を防ぐことができる（Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２（１），１－１５．（２０１５）、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｕｓ，６（４），３１４－３２５（２０１５））。一部の実施形態では、ＮｏＬＳ配列は、逆転写酵素ポリメラーゼモチーフと制限様エンドヌクレアーゼモチーフとの間にあるレトロトランスポザーゼのアミノ酸領域に位置する。予測ＮｏＬＳ領域は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及び／又はグルタミンアミノ酸を含み、これらの残基の１つ又は複数をアラニンアミノ酸残基に変異させることによって核小体局在化が不活性化されているか、及び／又はこれらのアミノ酸の１つ又は複数がレトロトランスポザーゼのポリペプチド鎖から除去されている。一部の実施形態では、ＲＬＥの上流に見出されるＲ２ＴｇのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒドライバーのアミノ酸配列は、リジン（Ｋ）がアラニン（Ａ）に置換されるように変異され、例えば、Ｒ２Ｔｇ（ポリペプチド配列のアミノ酸１，１２８～１，１５４）、（ＡＰＴＱＫＤＫＦＰＫＰＣＮＷＲＫＮＥＦＫＫＷＴＫＬＡＳ（配列番号１６８５））の予測ＮｏＬＳは、１、２、３、４、５、６、又は７残基で変異されて、不活性化ＮｏＬＳ
を産生する。
実施例５：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおける第２鎖ニッキングの適用
この実施例は、組込み事象の効率を高めるために、レトロトランスポジションが標的の第２鎖ニッキング活性と対をなすＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを説明する。第２鎖ニックは、（１）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムに融合したＣａｓ９ニッカーゼ（ここで、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒはそのエンドヌクレアーゼドメイン（ＥＮ）を介して１つのニックを導入し、融合したニッカーゼＣａｓ９はトップ及びボトムＤＮＡ鎖のいずれかに別のニックを配置する（図７Ａ））、又は（２）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム（ここで、活性ＥＮドメインがニックを導入し、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ誘導ニックの上流又は下流で、Ｃａｓ９ニッカーゼがＤＮＡのトップ又はボトム鎖のいずれかに２番目のニックを導入する（図７Ｂ））によって達成できる。
この実施例は、組込み事象の効率を高めるために、レトロトランスポジションが標的の第２鎖ニッキング活性と対をなすＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを説明する。第２鎖ニックは、（１）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムに融合したＣａｓ９ニッカーゼ（ここで、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒはそのエンドヌクレアーゼドメイン（ＥＮ）を介して１つのニックを導入し、融合したニッカーゼＣａｓ９はトップ及びボトムＤＮＡ鎖のいずれかに別のニックを配置する（図７Ａ））、又は（２）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム（ここで、活性ＥＮドメインがニックを導入し、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ誘導ニックの上流又は下流で、Ｃａｓ９ニッカーゼがＤＮＡのトップ又はボトム鎖のいずれかに２番目のニックを導入する（図７Ｂ））によって達成できる。
この実施例の第１部分では、Ｃａｓ９ニッカーゼがＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質に融合されている（図７Ａ）。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡを介してＤＮＡ配列にターゲティングされる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質は、そのＥＮドメインを介してＤＮＡニックを導入し、ニッカーゼＣａｓ９活性を介して追加のニックが生成される。この追加のニックは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ導入ニックを取り囲むＤＮＡのトップ鎖又はボトム鎖を標的とすることができる（図１Ａ）。設計及び試験された構築物には以下が含まれる（概略的な図８Ａを参照）：
・Ｃａｓ９－Ｎ８６３Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）
・ｄＣａｓ９－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）。
・Ｃａｓ９－Ｎ８６３Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）
・ｄＣａｓ９－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）。
ＤＮＡ結合ドメインは、ｇＲＮＡを介してＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ分子をＤＮＡ標的に向かわせるニッカーゼＣａｓ９である。この一連のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ構築物中のＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）は、点変異（ＲＢＤ＊）で不活性化されている。挿入のためのドナーとして、Ｒ２Ｔｇ ＲＮＡ結合ドメインが不活性である構築物は、ゲノム修飾のためのドナー配列を含むようにその３’末端で伸長されたｇＲＮＡを使用する（図８Ｂ）。これらの修飾には、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、及びヌクレオチド挿入が含まれる。この最初の一連の実験では、上記の構築物－Ｒ２Ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）、及びＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とする３’伸長ｇＲＮＡ鋳型とのｄＣａｓ９－Ｒ２Ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）融合物は、プログラムＤＮ１００を使用したＳＥバッファーでのヌクレオフェクションを介して、Ｕ２ＯＳ細胞に送達される。使用されるｇＲＮＡには、ＤＮＡのボトム鎖又はトップ鎖を標的とする各構築物のｇＲＮＡが含まれる。ヌクレオフェクション後、細胞を完全培地で３日間培養する。ｇＤＮＡは３日目に採取され、アンプリコンシーケンシング、続いてＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（ｉｎｄｅｌ分析ツール）を使用したコンピューター解析が実施される。３’伸長ｇＲＮＡ媒介性の挿入、欠失、又はヌクレオチド置換は、ｄＣａｓ９－Ｒ２Ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）の送達時に観察され、ニッカーゼ－Ｃａｓ９－Ｒ２Ｔｇ（ＲＢＤ＊、ＲＴ、ＥＮ）構築物を送達するときに頻度が増加する。
この実施例の第２部分では、Ｃａｓ９ニッカーゼがＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質に融合されている（図７Ａ）。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡを介してＤＮＡ配列にターゲティングされる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質は、そのＥＮドメインを介してＤＮＡニックを導入し、ニッカーゼＣａｓ９活性を介して追加のニックが生成される。この追加のニックは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ導入ニックを取り囲むＤＮＡのトップ鎖又はボトム鎖を標的とすることができる（図７Ａ）。上に挙げた構築物とは対照的に、Ｒ２ＴｇのＲＮＡ結合ドメインは活性であり（図９Ａ）、ゲノム改変に使用される鋳型はＵＴＲが隣接する導入遺伝子である（図９Ｂ）。構築物には以下が含まれる（概略的な図９Ａ参照）：
・Ｃａｓ９－Ｎ８６３Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）
・ｄＣａｓ９－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）。
・Ｃａｓ９－Ｎ８６３Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）
・Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）
・ｄＣａｓ９－Ｒ２ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）。
ＵＴＲが隣接する導入遺伝子は、ニッキング部位に相同性アームを要する。ドナー導入遺伝子ＤＮＡの相同性アームを正確に設計するためのニッキング部位を決定するために、パルスコードＤＮ１００を使用してＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを用いて、前に列挙した構築物を２００ｋ Ｕ２ＯＳ細胞にヌクレオフェクトする。ヌクレオフェクション後、細胞を完全培地で３日間培養する。ｇＤＮＡは３日目に採取され、アンプリコンシーケンシング、続いてｉｎｄｅｌ分析ツールとしてＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏを使用したコンピューター解析が実施される。ＥＮドメインのニッキング部位は、ＥＮドメインがＡＡＶＳ１部位で産生するインデルから識別される。ＥＮニッキング部位に隣接する１００ｂｐの相同性アームを設計し、導入遺伝子に含める（導入遺伝子の相同性アームの位置について図９及び１０を参照）。ゲノム修飾を達成するために、ＡＡＶＳ１遺伝子座のトップ又はボトム鎖のいずれかを標的とするｇＲＮＡ、及び以前に決定されたニッキング部位との相同性を保有する適切な導入遺伝子と共に、前に列挙したＣａｓ９－Ｒ２Ｔｇ融合構築物をＵ２ＯＳ細胞にヌクレオフェクトする。ヌクレオフェクション後、細胞を完全培地で３日間培養する。ｇＤＮＡを３日目に採取し、ｄｄＰＣＲを実施してＡＡＶＳ１部位での導入遺伝子組込みを検出する。組込みは、ｄＣａｓ９－Ｒ２Ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）の送達時に観察され、ニッカーゼ－Ｃａｓ９－Ｒ２Ｔｇ（ＲＢＤ、ＲＴ、ＥＮ）構築物を送達するときに頻度が増加する。
別の実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質は、そのＤＮＡ結合ドメインを介してＤＮＡを標的とする（図７Ｂ）。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質は、ＤＮＡ鎖にＤＮＡニックを導入する。更に、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して、第１ニックの上流又は下流で、ＤＮＡのトップ鎖又はボトム鎖に第２ニックを生成する。この実施例において、ＡＡＶＳ１部位を標的とし（図１０Ａ）、ＡＡＶＳ１部位と相同性を有するＵＴＲ隣接導入遺伝子を有する（図１０Ｂ）Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒプラスミドは、パルスコードＤＮ１００を使用して２００ｋ Ｕ２ＯＳ細胞にヌクレオフェクトされる。次のＣａｓ９構築物は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒプラスミドと一緒にトランスフェクトされる（図１０Ｃ）：
・Ｃａｓ９－Ｎ８６３Ａ
・Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ
・Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ
・ｄＣａｓ９。
・Ｃａｓ９－Ｎ８６３Ａ
・Ｃａｓ９－Ｈ８４０Ａ
・Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ
・ｄＣａｓ９。
全てのＣａｓ９構築物は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ導入ニックの上流又は下流のトップ鎖又はボトム鎖のいずれかでＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするｇＲＮＡと共ヌクレオフェクトされる。ヌクレオフェクション後、細胞を完全培地で３日間培養する。ｇＤＮＡを３日目に採取し、ｄｄＰＣＲを実施してＡＡＶＳ１部位での導入遺伝子組込みを検出する。組込みは、ｄＣａｓ９の送達時に観察され、ニッカーゼ－Ｃａｓ９構築物を送達するときに頻度が増加する。
実施例６：異種ＵＴＲによるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの発現改善
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの細胞内発現を増強するための異種ＵＴＲの使用を記載する。
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの細胞内発現を増強するための異種ＵＴＲの使用を記載する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドはｍＲＮＡから発現された（図１１）。ｍＲＮＡ産生用のプラスミド鋳型では、ネイティブレトロトランスポゾンＵＴＲが、タンパク質発現用に最適化されたＵＴＲに置換された（Ａｓｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ １５，７５６－７６２（２０１８）のＣ３ ５’ＵＴＲ及びＯＲＭ ３’ ＵＴＲ、又はＲｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６８，１１１４－１１２５（２０１７）の５’及び３’ＵＴＲ）。プラスミドは、Ｔ７プロモータに続いて、５’ＵＴＲ、レトロトランスポゾンコード配列、３’ＵＴＲ、３ＧＳリンカー（配列番号１０２４）、ＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）、ＸＴＥＮリンカー、ＨｉＢｉｔ配列及び９６～１００ヌクレオチド長ポリ（Ａ）テール（配列番号１６８７）を含んでいた。プラスミドは、ポリ（Ａ）テールの下流に、平滑末端又は５’オーバーハングを生じる酵素制限により線状化され、Ｔ７ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いるインビトロ転写（ＩＶＴ）のために使用された。ＩＶＴステップの後、ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（ＮＥＢ）で処理した。バッファー交換ステップの後、ＧＴＰ及びＳＡＭ（ＮＥＢ）の存在下で、ワクシニアキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｃａｐｐｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）（ＮＥＢ）及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、酵素キャッピング反応を実施した。キャップＲＮＡを濃縮し、バッファーを交換した。５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（１パルスあたり１１５０Ｖ、１パルスあたり２０ミリ秒、９６ウェルフォーマットの１０μＬチップで２パルス）を使用して、１：１のモル比で、ＲＮＡ鋳型の存在下又は非存在下で、０．５μｇのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ｍＲＮＡをトランスフェクトした。ＲＮＡ鋳型は、実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるように、プラスミドからインビトロで転写された。
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５時間増殖させ、その後、標準プロトコルｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／－／ｍｅｄｉａ／ｆｉｌｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｍａｎｕａｌｓ／５００／ｎａｎｏ－ｇｌｏ－ｈｉｂｉｔ－ｌｙｔｉｃ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍ－ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｍａｎｕａｌ．ｐｄｆ？ｌａ＝ｅｎを使用してＨｉＢｉｔタグ発現を調べることにより、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ発現をアッセイした。タンパク質発現は、Ｒ２ＴｇからのネイティブＵＴＲを使用する場合と比較して、Ｃ３－ＯＲＭからの５’及び３’ＵＴＲｅｘｐを使用することによって大幅に改善されることが見出された（図１１）。ゲノム組込みは、トランスフェクションの３日後に３’ｄｄＰＣＲを使用してアッセイした（図１２）。
実施例７：混合ＲＮＡ及びＤＮＡ送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善
この実施例は、プラスミドＤＮＡ上にコードされたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型と共に使用された場合に発現を増強し、レトロトランスポジションの効率を高めることが可能である、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡ分子の改善を説明する。
この実施例は、プラスミドＤＮＡ上にコードされたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型と共に使用された場合に発現を増強し、レトロトランスポジションの効率を高めることが可能である、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡ分子の改善を説明する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムのポリペプチド成分は、実施例６（異種ＵＴＲによるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの発現改善）に記載されるｍＲＮＡから発現される。プラスミド鋳型は、リポータ遺伝子（ｅＧＦＰ）がＲ２Ｔｇ非翻訳領域（ＵＴＲ）及びそのｒＤＮＡ標的との１００ｂｐの相同性に隣接するように合成された。鋳型（ｔｅｍｐａｔｅ）発現は、哺乳動物ＣＭＶプロモータによって駆動された。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬を使用して、プラスミドをＨＥＫ３９３Ｔ細胞に導入した。トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで接種した。トランスフェクションの日に、０．５μｌのトランスフェクション試薬と８０ｎｇのＤＮＡを１０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合し、室温で１５分間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を接種細胞の培地に添加した。細胞を剥離し、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムを使用して、ウェルあたり０．５μｇのｍＲＮＡのエレクトロポレーションに使用した（１パルスあたり１１５０Ｖ、１パルスあたり２０ミリ秒、９６ウェルフォーマットの１０μＬチップで２パルス）。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトされた：
１．前述のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
２．前述の鋳型ＲＮＡをコードするプラスミド
３．１と２の組合せ。前述のように、ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間前に、プラスミドをプレリポフェクションした。
１．前述のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
２．前述の鋳型ＲＮＡをコードするプラスミド
３．１と２の組合せ。前述のように、ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間前に、プラスミドをプレリポフェクションした。
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１～３日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定した。ゲノムＤＮＡを各群のＨＥＫ２９３細胞から単離した。
ｄｄＰＣＲを実施して、組込みを確認し、組込み効率を評価した。Ｔａｑｍａｎプローブ及びプライマーは、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／０４８６０７号明細書に記載されているように設計され、組込み接合部の５’末端及び３’末端にわたって予想産物が増幅された。ｄｄＰＣＲコピー数分析の結果（参照遺伝子ＲＰＰ３０との比較）を図１３に示す。ｍＲＮＡ及び鋳型プラスミドの存在下でのゲノム組込みは、３’接合部を標的とする場合には０．６８３組込み体／ゲノム、５’接合部をターゲットとする場合には０．２４９組込み体／ゲノムの平均コピー数を達成した。プラスミドのみのトランスフェクションの０．０００４組込み体／ゲノムと比較して、ｍＲＮＡのみのトランスフェクションは、０．００２組込み体／ゲノムの平均コピー数を生じた。
実施例８：ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＲＮＡ鋳型と同時送達された場合に発現を増強し、レトロトランスポジションの効率を高めることが可能である、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡ分子の改善を説明する。
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＲＮＡ鋳型と同時送達された場合に発現を増強し、レトロトランスポジションの効率を高めることが可能である、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡ分子の改善を説明する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムのポリペプチド成分は、実施例６（異種ＵＴＲによるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの発現改善）に記載されるｍＲＮＡから発現される。ＲＮＡ鋳型産生用のプラスミド鋳型は、Ｒ２Ｔｇ非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接するＩＲＥＳ発現リポータ遺伝子（ｅＧＦＰ）が続くＴ７プロモータ、及びそのｒＤＮＡ標的に対する１００ｂｐの相同性を含んでいた。プラスミド鋳型は、ＲＮＡ鋳型配列の下流に、平滑末端又は５’オーバーハングを生じる酵素制限により線状化され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いるインビトロ転写（ＩＶＴ）のために使用される。ＩＶＴステップの後、ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（ＮＥＢ）で処理し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）によって酵素的にポリアデニル化したか又はしなかった。バッファー交換ステップの後、ＧＴＰ及びＳＡＭ（ＮＥＢ）の存在下で、ワクシニアキャッピング酵素（ＮＥＢ）及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、酵素キャッピング反応を実施した。キャップＲＮＡを濃縮し、バッファーを交換した。５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、０．５～１μｇのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ｍＲＮＡとＲＮＡ鋳型を１：４～１：１２のモル比で同時トランスフェクトした。ＲＮＡトランスフェクションにはＮｅｏｎトランスフェクションシステムを使用した（１パルスあたり１１５０Ｖ、１パルスあたり２０ミリ秒、９６ウェルフォーマットの１０μＬチップで２パルス）。
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも１日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定した。ゲノムＤＮＡを各群のＨＥＫ２９３細胞から単離した。
ｄｄＰＣＲを実施して、組込みを確認し、組込み効率を評価した。Ｔａｑｍａｎプローブ及びプライマーは、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／０４８６０７号明細書に記載されているように設計され、組込み接合部の５’末端及び３’末端にわたって予想産物が増幅された。ＲＮＡ鋳型が酵素的にポリアデニル化された場合、ＲＮＡ導入遺伝子がポリアデニル化されていない場合の０．０３１組込み体／ゲノムと比較して、０．５μｇのｍＲＮＡ、及び１：８のモル比のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ｍＲＮＡとＲＮＡ鋳型の存在下で、０．４９８組込み体／ゲノムの平均コピー数が達成された。
実施例９：イントロンを含む遺伝子カーゴを送達するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ
この実施例では、ＲＮＡベースの送達を使用して、新しく導入されたゲノム遺伝子座からの目的の遺伝子の発現を調整することにより、イントロンを含む遺伝子カーゴを組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を説明する。
この実施例では、ＲＮＡベースの送達を使用して、新しく導入されたゲノム遺伝子座からの目的の遺伝子の発現を調整することにより、イントロンを含む遺伝子カーゴを組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を説明する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ技術は、ネイティブ又は非ネイティブのイントロンを含む目的のタンパク質をコードするＲＮＡ鋳型を使用する。例えば、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子のイントロン６（Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、これらの実験で非ネイティブイントロンの１つとして使用される。
遺伝子のゲノムコピーにおけるイントロンの存在及びスプライシングによるその除去は、その転写率、ｍＲＮＡプロセシング、輸出、細胞局在化、翻訳及び減衰を含む、遺伝子発現のほぼ全ての側面に影響を与えることが報告されている（Ｓｈａｕｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９１Ｂ，１４５－１５５（２０１７）に論評）。イントロンはＲＮＡ鋳型の異なる部分に挿入でき（図１５）、イントロンの位置によって遺伝子発現におけるその役割が異なり得る。
転写開始部位に近い５’ＵＴＲｅｘｐのイントロンは、活性化クロマチン修飾を導入し（Ｂｉｅｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，６２－６８（２０１２））、転写開始部位認識の精度を向上させ、ＰｏｌＩＩ動員を促進し（Ｌａｘａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １７２，３１３－３２７（２０１６））、転写開始率（Ｋｗｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９，８００－８０５（２００２））及び伸長率（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５，８１９－８２６（２００８））を増加させ、アンチセンス配向と比較してセンスの生産的伸長を改善する（Ａｌｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９９，３６０－３６３（２０１３））。
３’ＵＴＲｅｘｐのイントロンは、ｍＲＮＡ発現をｍＲＮＡあたり１つのタンパク質分子に制限する。停止コドンの下流のスプライソソームによって残されたエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）は、ナンセンス媒介性減衰（ＮＭＤ）機構によって認識されるため、ｍＲＮＡは、翻訳の先駆的ラウンドの終わりに欠失についてマークされる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ４，８０１－８１５（１９９８））。
しかし、治療用遺伝子にイントロンを使用する能力は、鋳型の組込み前に起こるスプライシングによって制限され得る。例えば、フォワード配向のイントロンは、ＲＮＡ鋳型がコードされＤＮＡプラスミド上に送達されると、スプライシングされる。これは、同じ方向に転写すると、組込み前にスプライシングされ得る鋳型ＲＮＡが生じ得るため、イントロンをゲノムに組み込むことができないためである。更に、導入遺伝子を送達するように設計されたレンチウイルス構築物は、逆配向のイントロンを含む配列をコードする必要がある。これは、ウイルスパッケージングプロセスにより、イントロンスプライシング、及びパッケージングされたウイルス粒子におけるイントロンの非存在を生じ得るためである（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２，４３３７－４５（１９８８））。しかし、逆配向はウイルス力価及び形質導入の低下を生じるとも考えられている（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０，４４７９（２０１９））。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型はインビトロ転写によって生成され、ＲＮＡとして直接送達され得るため、所望のイントロンの組込み前スプライシングの問題を回避できることは注目に値する。従って、一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型は、ＩＶＴによって生成され、ＲＮＡとして標的細胞に送達される転写物と同じセンス配向で１つ又は複数のイントロンを含み得る。
図１５に示す任意の位置のイントロンは、ｍＲＮＡを中途切断及びポリアデニル化から保護するＵ１ ｓｎＲＮＰを動員する（Ｋａｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６８ ６６４－６８１（２０１０）；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５０，５３－６４（２０１２））。更に、ＥＪＣは、ＴＲＥＸ（転写－輸出）複合体の成分と相互作用し、核から細胞質へのｍＲＮＡ輸出の速度を、イントロンを欠く構築物と比較して６～１０倍増加させる（Ｖａｌｅｎｃｉａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５，３３８６－３３９１（２００８））。スプライシング調節タンパク質であるポリピリミジントラクト結合タンパク質の結合が、スプライシングされた転写物の半減期の有意な増加を媒介することも示された（Ｌｕ ＆ Ｃｕｌｌｅｎ，ＲＮＡ ９，６１８－６３０（２００３）；Ｍｉｌｌｅｖｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７，４６７２－４６８３（２００９））。ｍＲＮＡ翻訳の効率は、ＳＲタンパク質（ＲＮＡスプライシングに関与するセリン－アルギニンに富むタンパク質）（Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８，７５５－７６８（２００４）；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２９，２５５－２６２（２００８））並びにＥＪＣタンパク質及びその周辺因子（Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８，２１０－２２２（２００４））の存在によって増加することが示された。
この実施例では、実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるように、１つ又は複数のイントロンを保有する鋳型ＲＮＡとＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドとの両方が、インビトロで転写されたキャップＲＮＡとして細胞に送達される。トランスフェクションの１～３日後に、ＧＯＩ発現及びゲノム組込みをアッセイする。一部の実施形態では、イントロン含有ＲＮＡ鋳型について、ゲノム組込み及び／又はタンパク質発現がより高くなる。
実施例１０：組込み効率を改善するためのレトロトランスポゾン５’ＵＴＲの操作
この実施例では、組込み効率を高めるためのレトロトランスポゾンの５’ＵＴＲの欠失、置換、又は変異を説明する。
この実施例では、組込み効率を高めるためのレトロトランスポゾンの５’ＵＴＲの欠失、置換、又は変異を説明する。
非ＬＴＲレトロトランスポゾンの５’ＵＴＲ領域には、自己切断リボザイム活性を含む複数の機能があり、これは特定のエレメントで示され、更なるレトロトランスポゾンで予測される（図２６～２７のモジュールＢ及びＣを参照）（Ｒｕｍｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６，４１２８６－４１２９５（２０１１））。リボザイム活性は、５’ＵＴＲ内又はその上流でＲＮＡを切断すると予測される。この活性及び５’ＵＴＲの構造成分を増加又は制限すると、レトロトランスポジション効率に有益である可能性がある。Ｒ２Ｔｇのリボザイム構造の予測を図２８に提供する。
５’ＵＴＲの操作を評価するために、これらの活動を増強又は減少させるように構築物を設計した（図１４）。ケース（Ａ）では、Ｒ２Ｔｇの天然５’ＵＴＲを使用して、前述の実験のようにトランスで組み込む。ケース（Ｂ）は、５’ＵＴＲの欠失を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、元の種からの５’ＵＴＲ（このケースではＴ．ｇｕｔｔａｔａからのＲ２Ｔｇ）が別の種のレトロトランスポゾンからの５’ＵＴＲで置換されたケースを表す。ケース（Ｃ）は、Ａ．ｍａｒｉｔｉｍａ Ｒ２からの５’ＵＴＲがＲ２Ｔｇの５’ＵＴＲに置換された例を提供する。（Ｄ）は、Ｂ．ｍｏｒｉ、Ｄ．ａｎａｎａｓｓｅ、Ｆ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｌ．ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ、Ｎ．ｇｉｒａｕｌｔｉ、若しくはＯ．ｌａｔｉｐｅｓから、又は本明細書の表、若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／０４８６０７号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表１～３のいずれかから選択されるレトロトランスポゾンからのものなど、更なる種からのＵＴＲが置換され得る一般的なケース（「Ｒｘ」）を表す。ケース（Ｅ）は、ハンマーヘッドリボザイムなどのリボザイム、例えば、ＲｉｂｏＪの置換を表す（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，１１３７－１１４２（２０１２））。ケース（Ｆ）は、点変異によるＲ２Ｔｇの５’ＵＴＲの不活性化を表す（例えば、５’ＵＴＲの７５Ｃ＞Ｔ）（図１４．Ｂ、影付きボックスで示される位置）。５’ＵＴＲ配列は、レトロトランスポゾンによって媒介される任意の挿入配列に対してモジュラーであると予想される。
各ケースは、前の実施例のように、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドプラスミドを鋳型プラスミドでトランスフェクションし、ｄｄＰＣＲを介して組込み頻度を評価することによって評価される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲの置換又は変異は、組込み効率の増加を生じる。
実施例１１：ＲＮＡ安定性を向上させるためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＲＮＡ成分の５’及び３’末端の修飾
この実施例では、哺乳動物細胞の安定性を改善するために、ＲＮＡの５’及び３’末端に非コード配列を付加する方法を説明する。
この実施例では、哺乳動物細胞の安定性を改善するために、ＲＮＡの５’及び３’末端に非コード配列を付加する方法を説明する。
細胞内での真核生物ＲＮＡの崩壊は、主にエキソリボヌクレアーゼによって行われる。この実施例では、ＲＮＡの半減期は、５’及び３’末端に保護配列及び／又は修飾を導入することによって延長される。ＲＮＡ末端を保護する最も一般的で自然な方法は、５’キャップ構造及び３’ポリ（Ａ）テールの導入である。この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムのポリペプチド成分は、実施例６（異種ＵＴＲによるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの発現改善）に記載されるｍＲＮＡから発現される。ＲＮＡ鋳型産生用のプラスミド鋳型は、Ｒ２Ｔｇ非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接するＩＲＥＳ発現リポータ遺伝子（ｅＧＦＰ）が続くＴ７プロモータ、及びそのｒＤＮＡ標的に対する１００ｂｐの相同性を含んでいた。プラスミド鋳型は、ＲＮＡ鋳型配列の下流に、平滑末端又は５’オーバーハングを生じる酵素制限により線状化され、Ｔ７ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いるインビトロ転写（ＩＶＴ）のために使用される。ＩＶＴステップの後、ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（ＮＥＢ）で処理し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）によって酵素的にポリアデニル化したか又はしなかった。バッファー交換ステップの後、キャップ１構造を生じる酵素的キャッピング反応を、実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるように実施したか、又は実施しなかった。鋳型ＲＮＡを濃縮し、バッファーを交換した。５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（１パルスあたり１１５０Ｖ、１パルスあたり２０ミリ秒、９６ウェルフォーマットの１０μＬチップで２パルス）を使用して、０．５μｇのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ｍＲＮＡ及びＲＮＡ鋳型を１：１～１：８のモル比で同時トランスフェクトした。
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１～３日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定した。ゲノムＤＮＡを各群のＨＥＫ２９３細胞から単離した。
ｄｄＰＣＲを実施して、組込みを確認し、組込み効率を評価した。Ｔａｑｍａｎプローブ及びプライマーは、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／０４８６０７号明細書に記載されているように設計され、組込み接合部の３’末端にわたって予想産物が増幅された。酵素的にキャップされたポリ（Ａ）テール鋳型を使用すると、ゲノム組込みが改善された（図１６）。
ＲＮＡ鋳型が酵素的にポリアデニル化された場合、ＲＮＡ導入遺伝子が酵素的にポリアデニル化されていない場合の０．０３１組込み体／ゲノムと比較して、０．５μｇのｍＲＮＡ、及び１：８のモル比のｍＲＮＡ：ＲＮＡ鋳型の存在下で、０．４９８組込み体／ゲノムの平均コピー数が達成された。
ＲＮＡの３’末端修飾。
１５～２０ｎｔよりも短いポリ（Ａ）テールとポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）の間の相互作用が不安定になり、ＲＮＡの急速な分解が起こることが報告されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５３，１０４４－１０５２（２０１４）；Ｓｕｂｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０８，６６－７１（２０１４））。鋳型ＲＮＡのポリ（Ａ）テールの適切な長さを決定するために、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００ヌクレオチドの長さを試験する。ＩＶＴ鋳型は、上記の長さのポリ（Ａ）テールをコードするリバースプライマーを使用したＰＣＲによって産生される。ＩＶＴ、ＤＮａｓｅ Ｉ処理、並びにＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及びＲＮＡ鋳型のキャッピングは、実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるように実施される。トランスフェクションの１～３日後に、ゲノム組込みをアッセイする。一部の実施形態では、ゲノム組込みは、適切な長さのポリ（Ａ）テールでテールされたＲＮＡ鋳型についてより高くなる。
１５～２０ｎｔよりも短いポリ（Ａ）テールとポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）の間の相互作用が不安定になり、ＲＮＡの急速な分解が起こることが報告されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５３，１０４４－１０５２（２０１４）；Ｓｕｂｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０８，６６－７１（２０１４））。鋳型ＲＮＡのポリ（Ａ）テールの適切な長さを決定するために、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００ヌクレオチドの長さを試験する。ＩＶＴ鋳型は、上記の長さのポリ（Ａ）テールをコードするリバースプライマーを使用したＰＣＲによって産生される。ＩＶＴ、ＤＮａｓｅ Ｉ処理、並びにＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及びＲＮＡ鋳型のキャッピングは、実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるように実施される。トランスフェクションの１～３日後に、ゲノム組込みをアッセイする。一部の実施形態では、ゲノム組込みは、適切な長さのポリ（Ａ）テールでテールされたＲＮＡ鋳型についてより高くなる。
細胞内では、デアデニラーゼによってそのポリ（Ａ）テールが短縮されることにより、ＲＮＡ分解が開始される。デアデニラーゼはポリ（Ａ）ストレッチに有利な３’－５’エキソリボヌクレアーゼであるため、多くのｍＲＮＡの天然ポリ（Ａ）テールで検出される末端ウリジン、シチジン、及び最も頻繁にはグアニンは、その短縮からポリ（Ａ）テールを保護するために提案された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５３，１０４４－１０５２（２０１４））。本発明者らは、前述のとおり、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及び末端Ｇ又はＣ、又は間欠的なＧ又はＣ（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６１，７０１－７０４（２０１８）で使用されているものと同様）を有するコード化ポリ（Ａ）テールを有する鋳型ＲＮＡをアッセイする。
一部のＲＮＡは、その３’末端を保護する別の方法を進化させると説明されてきた。両側に不対５ヌクレオチドが隣接する特定の１６ヌクレオチド長ステムループ構造が、Ｈ２ａ．ＸヒストンをコードするｍＲＮＡの３’末端を保護することが報告されている（Ｍａｎｎｉｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，９１１３－９１２６（１９８９））。ヒストンステムループ構造で終わる異種ｍＲＮＡが細胞周期調節されることが示されている（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１，２４１６－２４２４（１９９１）；Ｓｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ５，３２９７－３３０３（１９８６））。ステムループ構造は、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって認識及び保護される。タンパク質は、細胞がＳ期に入る直前に蓄積し、Ｓ期の終わりに急速に分解される（Ｗｈｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０，４１８８－４１９８（２０００））。ステムループエレメントは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ｍＲＮＡ及びＲＮＡ鋳型の３’末端に挿入され、前述のように試験されて、細胞周期特異的ゲノム組込み事象が誘導される。
一部のウイルス及び長い非コードＲＮＡは、三重らせん構造でその３’末端を保護するように進化した（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０９，１９２０２－１９２０７（２０１２））。更に、ｔＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ヴォールトＲＮＡの構造エレメント（Ｌａｂｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８６３，３１２５－３１４７（２０１６）で論評）は、これらの非コードＲＮＡの半減期を延長することが報告されている。ＲＮＡ鋳型の３’末端を保護する構造を挿入し、前述のようにＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムでの効率を調べる。
最後に、ｄＮＴＰ、２’Ｏ－メチル化ＮＴＰ、又はホスホロチオエートＮＴＰをＲＮＡ導入遺伝子の３’に組み込み、ＲＮＡの３’末端をエキソリボヌクレアーゼから保護することにより、これらの分子の半減期を延長する。本発明者らは、修飾ヌクレオチドを追加することでＲＮＡ配列を伸長できるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノウ断片）によってＲＮＡの３’末端を伸長することにより、単一の修飾ヌクレオチド又はそれらのストレッチを組み込む（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ ＆ Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ３，２８８－３０２（２００８））。
ＲＮＡの３’末端の一塩基化学修飾は、最初にリボース糖の３’末端を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して反応性アルデヒドを形成し、続いてアルデヒド反応性修飾ヌクレオチドを共役させることによって行うことができる。
代わりに、Ｔ４ ＤＮＡ又はＴ４ ＲＮＡリガーゼを、ＲＮＡの３’末端への修飾ヌクレオチドのストレッチのスプリント連結に使用できる（Ｍｏｏｒｅ ＆ Ｑｕｅｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３１７，１０９－１２３（２０００））。
２つの断片の化学的連結も可能である。２つのＲＮＡ基質間のホスホジエステル結合は、反応性イミダゾリドを使用してホスホモノエステル基を活性化するか、又は臭化シアンなどの縮合試薬を使用することによって形成できる。化学的連結の欠点は、所望の３’－５’ホスホジエステル結合とともに、２’－５’ホスホジエステル結合も生成される可能性があることである。
ＲＮＡの５’末端修飾
実施例（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるキャップ１構造に加えて、他の５’末端保護基が探索される。特に、本発明者らは、同時転写キャッピングのために、高メチル化（Ｗｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４２，８６６３－８６７７（２０１４））、ホスホロチオエート（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７，９６１－９７１（２０１０））、ＮＡＤ＋由来（Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８，４５４－４６４（２０１８））及び修飾（例えば、ビオチン化：Ｂｅｄｎａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ３７３，２０１８０１６７（２０１８））キャップ類似体を使用する。
実施例（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるキャップ１構造に加えて、他の５’末端保護基が探索される。特に、本発明者らは、同時転写キャッピングのために、高メチル化（Ｗｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４２，８６６３－８６７７（２０１４））、ホスホロチオエート（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７，９６１－９７１（２０１０））、ＮＡＤ＋由来（Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８，４５４－４６４（２０１８））及び修飾（例えば、ビオチン化：Ｂｅｄｎａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ３７３，２０１８０１６７（２０１８））キャップ類似体を使用する。
また、本発明者らは、ＲＮＡの５’を５’－［γ－チオ］三リン酸で標識して反応性硫黄基を生成し、修飾基のハロアセトアミド誘導体を使用して保護修飾で５’末端を化学修飾する。
ＲＮＡの３’及び５’末端を保護するために提案される修飾は、ＲＮＡ鋳型及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ｍＲＮＡ（翻訳と適合性である場合）に導入される。ＲＮＡのゲノム組込み効率は、実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるように試験される。
実施例１２：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムにおける修飾ＲＮＡ塩基の使用
この実施例は、システムの特徴を潜在的に改善する（例えば、組込み効率の増加、外来核酸に対する細胞応答の減少）ための修飾ＲＮＡ塩基を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを説明する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドについて、コード領域に関係する提案された修飾は、翻訳と適合性である。ＲＮＡ鋳型について、提案された修飾は逆転写と適合性がある。
この実施例は、システムの特徴を潜在的に改善する（例えば、組込み効率の増加、外来核酸に対する細胞応答の減少）ための修飾ＲＮＡ塩基を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを説明する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドについて、コード領域に関係する提案された修飾は、翻訳と適合性である。ＲＮＡ鋳型について、提案された修飾は逆転写と適合性がある。
この実施例では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、対応するｒＮＴＰを次の修飾ｒＮＴＰのうち１つに１００％置換してインビトロ転写した：シュードウリジン（Ψ）、１－Ｎ－メチルシュードウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）又は５－メチルシチジン（５ｍＣ）。そうでなければ、ＲＮＡ調製、精製及び細胞トランスフェクションは、実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されているように実施した。修飾ｍＲＮＡの遺伝子組込み能力を、全てのポリペプチドｍＲＮＡを非修飾鋳型ＲＮＡと対にして、ｄｄＰＣＲを使用して非修飾ｍＲＮＡ（Ｇ０）と比較した（図１７）。ポリペプチドが各修飾ｒＮＴＰを使用してコードされた場合に組込みが検出され、最高のシグナルは５－ＭＯ－Ｕから生じ、最低のシグナルは５ｍＣから生じた。これは、修飾塩基を含むｍＲＮＡから発現された場合、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド成分が機能的であることを示す。
更に、この実施例は、図１９に列挙され、図１８に示されている例示的なモジュールの全て又はサブセットで構成される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子のモジュール性を説明している。個々のモジュールは、連続核酸分子として、又は後で一緒に組み合わされる別々の断片として、化学合成又はインビトロ合成によって産生することができる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子の個々のモジュールは、化学修飾された核酸であり得、一部又は全部が非核酸から構成され得、順番に再配置され得、及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子を形成するために省略され得る。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子（全モジュール、Ａ～Ｆ）は、対応するｒＮＴＰ（アデノシン、シチジン、グアノシン、及び／又はウリジン）の０～１００％置換が１つ又は複数の修飾ｒＮＴＰ（塩基又はリボース修飾）、例えば、５’ヒドロキシル、５’リン酸、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－フルオロ、リボチミジン、Ｃ－５プロピニル－ｄＣ（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｄＵ（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－Ｃ（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－Ｕ（ｐＵ）、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＵメトキシ、（２，６－ジアミノプリン）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆＣ（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｆＵ）、５－メチルｆＣ、５－メチルｆＵ、Ｃ－５プロピニル－ｍＣ（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｍＵ）、５－メチルｍＣ、５－メチルｍＵ、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＭＧＢ（小溝結合剤）シュードウリジン（Ψ）、１－Ｎ－メチルシュードウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）を伴うインビトロ転写によって合成される。この実施形態における修飾ヌクレオチドは、インビトロで作製されるＲＮＡ転写物に修飾ヌクレオチドを容易に組み込むＲＮＡポリメラーゼの天然又は変異ポリペプチド配列を利用する転写反応による組込みに依存する（Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（２４），１３８ｅ－１３８，２００２；Ｉｂａｃｈ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６７（３），２８７－２９５，２０１３；Ｍｅｙｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（１５），７４８０－７４８８，２０１５）。修飾Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子は、典型的には、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド配列の逆転写酵素活性と全体的又は部分的に適合性である。逆転写の鋳型として使用されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子のモジュール又はモジュールの一部については、逆転写に適合性である修飾が優先される（Ｍｏｔｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４２５ ２１－５３，２００７；Ｍａｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１６，２４０７５－２４０８３，２０１９）。修飾ｒＮＴＰを含む鋳型分子を有するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、前述及び実施例８（ＲＮＡベースの送達のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ成分改善）に記載されるように試験する。
一部の実施形態では、個々のモジュールは、修飾ヌクレオチド、例えば、５’ヒドロキシル、５’リン酸、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－フルオロ、リボチミジン、Ｃ－５プロピニル－ｄＣ（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｄＵ（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－Ｃ（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－Ｕ（ｐＵ）、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＵメトキシ、（２，６－ジアミノプリン）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆＣ（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｆＵ）、５－メチルｆＣ、５－メチルｆＵ、Ｃ－５プロピニル－ｍＣ（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｍＵ）、５－メチルｍＣ、５－メチルｍＵ、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＭＧＢ（小溝結合剤）シュードウリジン（Ψ）、１－Ｎ－メチルシュードウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）を含んで化学的に合成され、ここで、個々のモジュールは、次に、酵素（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用したスプリント連結、Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｊ．，＆ Ｑｕｅｒｙ，Ｃ．Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３１７，１０９－１２３，２０００）又は化学的プロセス（例えば、Ｆｅｄｏｒｏｖａ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１５（６），１１３７－１１４７，１９９６）によって連結されて、完全なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子を形成する。
修飾Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子の例は、モジュールＡ及びＦが、それぞれ２’－Ｏ－メチルリボース修飾を含むシチジン及びウリジンヌクレオチドを含む、１００ｎｔの化学合成ＲＮＡであり、モジュールＡが、５’末端の最初の３つのヌクレオチド間に（３）ホスホロチオエート結合を含み、モジュールＦが、モジュールの３’末端の最後の３つのヌクレオチド間に（３）ホスホロチオエート結合を含む場合である。モジュールＢ～Ｅは、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）、例えば、Ｔ７ ＲＮＡＰ、Ｔ３ ＲＮＡＰ、若しくはＳＰ６ ＲＮＡＰ（ＮＥＢ）、又は強化された特性、例えば、忠実度の増加、処理能力の増加、若しくは修飾ヌクレオチドの組込み効率の増加を有するそれらの誘導体を用いた、インビトロ転写によって合成される。モジュールＡはインビトロで転写されたモジュールＢ～Ｅ分子の５’末端に連結され、モジュールＦはインビトロで転写されたモジュールＢ～Ｅ分子の３’末端に連結される（Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｊ．，＆ Ｑｕｅｒｙ，Ｃ．Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３１７，１０９－１２３，２０００に記載）。次に、この完全にアセンブリングされた鋳型ＲＮＡ（全モジュール、Ａ～Ｆ）を標的細胞内のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）と共に使用して、前の実施例のようにゲノム組込みを評価する。一部の実施形態では、ＲＮＡ修飾は、例えば、ｄｄＰＣＲによって測定されるように、５０％を超えて組込み効率を低下させない。一部の実施形態では、ＲＮＡ修飾は、例えば、ｄｄＰＣＲによって測定されるように、組込みの効率を改善する。一部の実施形態では、ＲＮＡ修飾は、逆転写反応を改善し、例えば、組込み事象のシーケンシングによって測定される処理能力又は忠実度を改善する。
実施例１３：ＵＴＲを組み込まないＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型
この実施例は、レトロトランスポジションで使用されるこれらの領域が宿主細胞に組み込まれないように、ＵＴＲの排除をもたらすＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子の配置を説明する。
この実施例は、レトロトランスポジションで使用されるこれらの領域が宿主細胞に組み込まれないように、ＵＴＲの排除をもたらすＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子の配置を説明する。
本発明者らは、この実施例で、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒドライバーがＵＴＲモジュールをレトロトランスポジションの一部としてゲノムに組み込まないようにするための、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子（図１８及び１９）のＵＴＲモジュールの配置、省略、及び／又は置換を説明する。一部の実施形態では、５’及び３’ＵＴＲのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子モジュール（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子のモジュールＢ＋Ｃ及びＥ）は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒドライバーと相互作用する機能は変化しないが、相同性アームは相同性アームの相補性が逆転写のプライマーとして作用する異種目的配列（モジュールＤ）に隣接して配置されるように、分子の末端に移動される。いくつかのケースでは、モジュールＢ及び／又はＣがＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子から省略され、モジュールＦの後にモジュールＥが続く。
ＵＴＲをゲノムに組み込まない更なる例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子からモジュールＢ及びＣを除去し、モジュールＦ（３’相同性アーム）を再配置してモジュールＤ（異種目的配列）をフォローし、モジュールＥをビオチンなどの結合リガンドで置換することである。ここで、このＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子は、モジュールＡ（５’相同性アーム）－モジュールＤ（異種目的配列）－モジュールＦ（３’相同性アーム）－ビオチンで構成されるモジュールＥからなる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒドライバーポリペプチド配列は、単量体ストレプトアビジンのアミノ酸配列を組み込むように修飾され得る。この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型分子のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒドライバーポリペプチド配列との非核酸媒介性会合を媒介することの有用性を示す。
実施例１４：ホモロジーアーム長さが、レトロトランスポジション効率に影響を与える
この実施例は、関連するレトロトランスポジション事象の頻度を増加させるために、導入遺伝子に隣接するホモロジーアーム（ＨＡ）の調節を記載する。
この実施例は、関連するレトロトランスポジション事象の頻度を増加させるために、導入遺伝子に隣接するホモロジーアーム（ＨＡ）の調節を記載する。
レトロトランスポジションは、統合された導入遺伝子の３’側で事象をプライミングすることによって媒介されると考えられる。ニックされた宿主ゲノムＤＮＡによる導入遺伝子ＲＮＡのプライミングは、導入遺伝子ＲＮＡの３’末端と、宿主ニックに対して３’側のゲノムＤＮＡとの間の相同性を必要とする。レトロトランスポジションの５’解離の方法は不明であるが、この解離はまた、宿主媒介性修復経路を介して相同性から利益が得られ得る。さらに、導入遺伝子ＲＮＡの５’末端の処理は、すなわち、５’ＵＴＲの上流のリボザイム切断によって、レトロトランスポジションに影響を与え得る。したがって、ペイロード導入遺伝子の隣接する相同性を、レトロトランスポジションを最適化するために調節した。
プラスミドトランスフェクションを、ｔｒａｎｓで統合の効率に対する導入遺伝子相同性の影響を試験するために行った。突然変異を不活性化するエンドヌクレアーゼを用いてＲ２Ｔｇ又は対照Ｒ２Ｔｇを発現するプラスミドを、異なる長さの標的相同性及び任意選択のランダムＤＮＡスタッファー配列を含む導入遺伝子プラスミドと共送達した（以下の表Ｅ５、図２０）。スタッファー配列を用いて、レトロトランスポジションに対する転写産物長さの影響について制御した。ドライバー：導入遺伝子プラスミドの１：４モル比における合計で５００ｎｇのプラスミドを、プログラムＤＳ－１５０を用いてＬｏｎｚａ ４Ｄ ｓｈｕｔｔｌｅを介して２ｅ５ ２９３Ｔ細胞中にヌクレオフェクトした。３日後、細胞のゲノムＤＮＡを単離した。ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、予想されるｒＤＮＡ遺伝子座においてプライマーと組み合わされる導入遺伝子に特異的なプライマー及びＴａｑｍａｎプローブを用いて、各接合物にわたって行った。見られる江コピー数は、導入遺伝子の３’又は５’末端における統合の効率を表す。
結果が、図２１に示される。最も長い相同性（両側で１００ｂｐ）を有する試験される構築物は、最も高い統合効率を実証した。
実施例１５：ホモロジーアーム耐性及び特異性が、レトロトランスポジション効率に影響を与える
この実施例は、レトロトランスポジション中のニック位置を有するホモロジーアーム設計の正確な整列の必要性を記載する。
この実施例は、レトロトランスポジション中のニック位置を有するホモロジーアーム設計の正確な整列の必要性を記載する。
上記の実施例１４からのデータが、効率的なレトロトランスポジションのためのホモロジーアームの重要性を強調する。多くの場合、所与のレトロトランスポゾンのニッキング位置は、不十分に特性評価され得る。これらの場合、設計されたホモロジーアームは、ゲノムＤＮＡのニック部位に隣接して開始することができない。レトロトランスポジション効率に対するホモロジーアーム位置決めの依存性を評価するために、本発明者らは、Ｒ２Ｔｇの公知の切断部位に対していくつかの塩基だけ変化された３’ホモロジーアームを有する構築物を設計した（以下の表Ｅ６、図２２）。３’ホモロジーアームが切断部位（＋）から３’変化された場合、ホモロジーアームは有効に縮小された。３’ホモロジーアームが切断部位から５’変化された場合、相同な塩基を、５’アームから付加した。
ドライバー及び導入遺伝子プラスミドを、上記の実施例のように、２９３Ｔ細胞内に共トランスフェクトした。３日目に、ゲノムＤＮＡを抽出した。統合頻度を、ｄｄＰＣＲによって上記のように測定した。統合頻度の著しい低下が、ＷＴニック部位に対するいずれかの位置において変化した３’ホモロジーアームにより示された（図２３）。
実施例１６：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、相同性指向の修復経路とは独立して遺伝子カーゴを組み込むことができる
この実施例は、相同組換え修復経路が阻害されるヒト細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。
この実施例は、相同組換え修復経路が阻害されるヒト細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。
この実施例では、Ｕ２ＯＳ細胞を３０ｐｍｏｌ（１．５μＭ）の非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ）又は相同組換え修復経路のコア成分であるＲａｄ５１に対するｓｉＲＮＡで処理した。ｓｉＲＮＡは、トランスでＲ２Ｔｇドライバー及び導入遺伝子プラスミドと共に同時送達された（ドライバー及び導入遺伝子配置の概略図については図２４を参照）。具体的には、Ｒ２Ｔｇ、ＲＴドメインに変異を有する対照Ｒ２Ｔｇ、又はエンドヌクレアーゼ不活性化変異を有する対照Ｒ２Ｔｇを発現するプラスミドを、導入遺伝子と一緒に使用する（図２５Ａ、Ｂ）。ドライバーと導入遺伝子のモル比が１：４の合計２５０ｎｇのＤＮＡプラスミドを、３０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡと共に、パルスコードＤＮ１００を使用して、２０μＬのヌクレオフェクションバッファーＳＥに再懸濁した２００ｋ Ｕ２ＯＳ細胞にヌクレオフェクトした。３日目に収集されたタンパク質溶解物は、ｓｉＲａｄ５１処理条件においてＲａｄ５１の非存在を示した（図２４Ｃ）。３日目にｇＤＮＡを抽出し、ｒＤＮＡ遺伝子座での導入遺伝子組込みを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイを実施した。ｄｄＰＣＲコピー数分析の結果（参照遺伝子ＲＰＰ３０との比較）を図２５に示す。Ｒａｄ５１の非存在により、ｒＤＮＡ遺伝子座での３’及び５’接合部の両方でのＲ２Ｔｇ媒介性導入遺伝子組込みが約２０％減少し（図２５）、これは、Ｒ２ＴＧ媒介性導入遺伝子挿入が、同種組換え経路の存在に完全に依存するわけではなく、内因性ＨＲ経路の非存在下で発生し得ることを示す。一部の実施形態では、ＨＲ非依存性により、内因的に低レベルのＨＲを有する細胞及び組織、例えば、肝臓、脳、網膜、筋肉、骨、神経、Ｇ０又はＧ１期の細胞、非分裂細胞、老化細胞、最終分化細胞で、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇが機能することが可能になる。一部の実施形態では、ＨＲ非依存性により、ＨＲ経路に関与する遺伝子、例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｐ５３、ＲＡＤ５１に変異を有する細胞、又は細胞を含む患者又は組織において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇが機能することが可能になる。
実施例１７：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｓは、一本鎖鋳型修復経路とは独立して遺伝子カーゴを組み込むことができる
この実施例は、一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）経路が阻害されるヒト細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。
この実施例は、一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）経路が阻害されるヒト細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。
この実施例では、経路のコア成分であるＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＵＳＰ１に対するｓｉＲＮＡを使用して、ＳＳＴＲ経路を阻害する。非標的対照の対照ｓｉＲＮＡも含まれる。２００ｋ Ｕ２ＯＳ細胞は、３０ｐｍｏｌ（１．５μＭ）のｓｉＲＮＡ、並びにＲ２Ｔｇドライバー及び導入遺伝子プラスミド（トランス配置）でヌクレオフェクトされる。具体的には、Ｒ２Ｔｇ、ＲＴドメインに変異を有する対照Ｒ２Ｔｇ、又はエンドヌクレアーゼ不活性化変異を有する対照Ｒ２Ｔｇを発現する、２５０ｎｇのプラスミドを、１：４のモル比（ドライバー対導入遺伝子）で導入遺伝子と一緒に使用する。Ｕ２ＯＳ細胞のトランスフェクションは、プログラムＤＮ１００を使用してＳＥバッファーで実施する。ヌクレオフェクション後、細胞を完全培地で３日間培養する。ｇＤＮＡを３日目に採取し、ｄｄＰＣＲを実施してｒＤＮＡ部位での組込みを評価する。ｒＤＮＡでの導入遺伝子組込みは、コアＳＳＴＲ経路成分の非存在下で検出される。
実施例１８：標的細胞と非標的細胞の活性が増強されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム
この実施例では、非標的細胞での組込み活性を低下させるための、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムへの調節配列の組込みを説明する。
この実施例では、非標的細胞での組込み活性を低下させるための、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムへの調節配列の組込みを説明する。
この実施例では、遺伝子調節は、（ｉ）組織特異的プロモータを使用して、成分発現及び標的細胞への組込みをアップレギュレートすること、及び（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位を使用して、対応するｍｉＲＮＡの内因性レベルが増加した非標的細胞での組込みを減少させることによって達成される。使用される標的細胞はヒト肝細胞であり、非標的細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ここでの組込みのドライバーは、異なるプロモータによって駆動されコード配列の後にスクランブル又は特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を有する、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポザーゼ）をコードするプラスミドである。組込みのための鋳型は、転写が相同性及びＵＴＲに隣接する異種目的配列を生じるように、プラスミドＤＮＡ上にコードされる。異種目的配列は、異なるプロモータによって駆動され、コード配列の後にスクランブルされた又は特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を有するリポータ遺伝子を含み得る。ここで使用される対照プロモータはＣＭＶであり、ｍｉＲＮＡ結合部位の対照は、ｍｉＲ－１４２の結合部位をランダムにスクランブルしたバージョンである。ここで使用される標的組織特異的プロモータは、肝細胞で発現されるＡｐｏＥ．ＨＣＲ．ｈＡＡＴであり、オフターゲット組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＨＳＣに発現するｍｉＲ－１４２（ｕｇｕａｇｕｇｕｕｕｃｃｕａｃｕｕｕａｕｇｇａ（配列番号１６８８））に相補的である。
標的細胞及び非標的細胞は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（１）及び以下から選択される鋳型（２）の組み合わせでヌクレオフェクトされる：
（ＨＥＫ２９３Ｔ対ｍｉＲＮＡを有するＨＥＫ２９３Ｔ？）
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド構築物（１）：
ａ．非特異的ドライバー：ＣＭＶ－Ｒ２Ｔｇ
ｂ．非特異的不活性化ドライバー：ＣＭＶ－Ｒ２Ｔｇ（ＥＮ＊）
ｃ．組織特異的ドライバー：ＡｐｏＥ．ＨＣＲ．ｈＡＡＴ－Ｒ２Ｔｇ－ｍｉＲ１４２
ｄ．組織特異的不活性化ドライバー：ＡｐｏＥ．ＨＣＲ．ｈＡＡＴ－Ｒ２Ｔｇ（ＥＮ＊）－ｍｉＲ１４２。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型構築物（２）：
ａ．非特異的導入遺伝子：ＣＭＶ－ｇｆｐ
ｂ．組織特異的導入遺伝子：ＡｐｏＥ．ＨＣＲ．ｈＡＡＴ－ｇｆｐ－ｍｉＲ１４２。
細胞を少なくとも３日間インキュベートした後、組込み効率及びリポータ発現を評価する。組込み効率について、ｄｄＰＣＲを実施して、各サンプルのゲノムあたりの組込みの平均数を定量化する。一部の実施形態では、組織特異的ドライバー（１ａ）対非特異的ドライバー（１ｃ）と対になった鋳型を使用する場合、標的細胞及び非標的細胞における組込み効率間の比率はより高い。リポータ発現を評価するために、細胞をフローサイトメトリーで分析してＧＦＰ蛍光を検出し、ＲＴ－ｑＰＣＲで転写を検出する。一部の実施形態では、組織特異的導入遺伝子カセット（２ｂ）対非特異的導入遺伝子カセット（２ａ）と対になったドライバーを使用する場合、標的細胞及び非標的細胞における蛍光間の比率はより高い。一部の実施形態では、組織特異的導入遺伝子カセット（２ｂ）対非特異的導入遺伝子カセット（２ａ）と対になったドライバーを使用する場合、標的細胞及び非標的細胞における転写レベル間の比率はより高い。一部の実施形態では、組織特異的ドライバー（１ａ）と組織特異的導入遺伝子カセット（２ｂ）との組み合わせは、標的細胞と非標的細胞との間の転写又は発現の最高の比率をもたらす。
（ＨＥＫ２９３Ｔ対ｍｉＲＮＡを有するＨＥＫ２９３Ｔ？）
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド構築物（１）：
ａ．非特異的ドライバー：ＣＭＶ－Ｒ２Ｔｇ
ｂ．非特異的不活性化ドライバー：ＣＭＶ－Ｒ２Ｔｇ（ＥＮ＊）
ｃ．組織特異的ドライバー：ＡｐｏＥ．ＨＣＲ．ｈＡＡＴ－Ｒ２Ｔｇ－ｍｉＲ１４２
ｄ．組織特異的不活性化ドライバー：ＡｐｏＥ．ＨＣＲ．ｈＡＡＴ－Ｒ２Ｔｇ（ＥＮ＊）－ｍｉＲ１４２。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型構築物（２）：
ａ．非特異的導入遺伝子：ＣＭＶ－ｇｆｐ
ｂ．組織特異的導入遺伝子：ＡｐｏＥ．ＨＣＲ．ｈＡＡＴ－ｇｆｐ－ｍｉＲ１４２。
細胞を少なくとも３日間インキュベートした後、組込み効率及びリポータ発現を評価する。組込み効率について、ｄｄＰＣＲを実施して、各サンプルのゲノムあたりの組込みの平均数を定量化する。一部の実施形態では、組織特異的ドライバー（１ａ）対非特異的ドライバー（１ｃ）と対になった鋳型を使用する場合、標的細胞及び非標的細胞における組込み効率間の比率はより高い。リポータ発現を評価するために、細胞をフローサイトメトリーで分析してＧＦＰ蛍光を検出し、ＲＴ－ｑＰＣＲで転写を検出する。一部の実施形態では、組織特異的導入遺伝子カセット（２ｂ）対非特異的導入遺伝子カセット（２ａ）と対になったドライバーを使用する場合、標的細胞及び非標的細胞における蛍光間の比率はより高い。一部の実施形態では、組織特異的導入遺伝子カセット（２ｂ）対非特異的導入遺伝子カセット（２ａ）と対になったドライバーを使用する場合、標的細胞及び非標的細胞における転写レベル間の比率はより高い。一部の実施形態では、組織特異的ドライバー（１ａ）と組織特異的導入遺伝子カセット（２ｂ）との組み合わせは、標的細胞と非標的細胞との間の転写又は発現の最高の比率をもたらす。
実施例１９：ヒトキメラ肝臓マウスモデルにおいて、治療用遺伝子を肝臓に送達するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの適用。
この実施例は、遺伝的ペイロードの統合及び安定した発現のためにインビボで肝臓に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを記載する。発現制御のためのプロモーター及びｍｉＲＮＡ認識配列並びに治療用遺伝子は、手法を例示することが意図され、参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表２、並びに国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３及び４のそれぞれから選択される。
この実施例は、遺伝的ペイロードの統合及び安定した発現のためにインビボで肝臓に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを記載する。発現制御のためのプロモーター及びｍｉＲＮＡ認識配列並びに治療用遺伝子は、手法を例示することが意図され、参照により本明細書に援用される国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表２、並びに国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３及び４のそれぞれから選択される。
この実施例において、ＯＴＣ欠損症を有する患者に由来するヒト肝細胞が、マウスモデル（Ｇｉｎｎ ｅｔ ａｌ ＪＨＥＰ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１９）に移植され、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムが、肝細胞中への統合のためのＯＴＣ発現カセットを送達するのに使用される。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド成分は、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポザーゼのための発現カセット（表３）を含み、鋳型成分は、Ｒ２Ｔｇによる結合及びレトロトランスポジションに必要なＵＴＲ配列（表３）によって隣接され、及びリボソームＤＮＡ中の標的部位に対して１００ｎｔの相同性によってさらに隣接されるヒトＯＴＣ遺伝子（国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表５）のための発現カセットを含む。この実施例において、トランスポザーゼ及び鋳型発現カセットは両方とも、肝細胞特異的発現のためのｈＡＡＴプロモーター（国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３）及び造血細胞内の発現を下方制御するためのｍｉＲ－１４２のシード配列に相補的なｍｉＲＮＡ認識配列（国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４）をさらに含む。
１．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド成分：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．Ｒ２Ｔｇ
２．エンドヌクレアーゼ突然変異Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．Ｒ２ＴｇＥＮ＊
３．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．ＯＴＣ
４．レポーターＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．ＧＦＰ
８～１２週齢雌Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒｇ－／－（ＦＲＧ）マウスに、小児ドナーから単離され、又はＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入された、ヒト肝細胞を既に記載されるように移植する（Ａｚｕｍａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７）。移植されたマウスに、飲料水中の２－（２－ニトロ－４－トリフルオロ－メチルベンゾイル）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）のサイクルをオン及びオフして、肝臓再増殖を促進する。血液を、２週間置きに及び実験の最後に採取して、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）によって血清中の移植のレベルを推定するためのマーカーとして使用される、ヒトアルブミンのレベルを測定する。移植の１１週間後、マウスを、ＮＰ５９中に包装されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）、高度にヒト肝臓指向性のＡＡＶカプシドで処置する。以下のベクターを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって投与する：
・治療用の有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（３）
・レポーターの有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（４）
・統合不活性化治療対照：（２）及び（３）
・統合不活性化レポーター対照：（２）及び（４）
ベクター注入の後、マウスを、さらに５週間にわたってＮＴＢＣのサイクルにかけてから、安楽死させる。続いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを、標準的な方法によって、肝臓溶解物から抽出する。続いて、ＯＴＣ発現を、配列特異的プライマーを用いて、単離されたＲＮＡサンプルにおいてＲＴ－ｑＰＣＲを行うことによって評価する。構築物の統合を確認し、ゲノム位置を分析するために、ＭｉＳｅｑにおいて周囲のゲノム配列に読み出すために、挿入された遺伝子にアニールする特異的プライマーを用いることによって、一方向シーケンシングを、ゲノムＤＮＡサンプルにおいて行う。
１．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド成分：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．Ｒ２Ｔｇ
２．エンドヌクレアーゼ突然変異Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．Ｒ２ＴｇＥＮ＊
３．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．ＯＴＣ
４．レポーターＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／ＮＰ５９．ｈＡＡＴ．ＧＦＰ
８～１２週齢雌Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒｇ－／－（ＦＲＧ）マウスに、小児ドナーから単離され、又はＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入された、ヒト肝細胞を既に記載されるように移植する（Ａｚｕｍａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７）。移植されたマウスに、飲料水中の２－（２－ニトロ－４－トリフルオロ－メチルベンゾイル）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）のサイクルをオン及びオフして、肝臓再増殖を促進する。血液を、２週間置きに及び実験の最後に採取して、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）によって血清中の移植のレベルを推定するためのマーカーとして使用される、ヒトアルブミンのレベルを測定する。移植の１１週間後、マウスを、ＮＰ５９中に包装されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）、高度にヒト肝臓指向性のＡＡＶカプシドで処置する。以下のベクターを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって投与する：
・治療用の有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（３）
・レポーターの有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（４）
・統合不活性化治療対照：（２）及び（３）
・統合不活性化レポーター対照：（２）及び（４）
ベクター注入の後、マウスを、さらに５週間にわたってＮＴＢＣのサイクルにかけてから、安楽死させる。続いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを、標準的な方法によって、肝臓溶解物から抽出する。続いて、ＯＴＣ発現を、配列特異的プライマーを用いて、単離されたＲＮＡサンプルにおいてＲＴ－ｑＰＣＲを行うことによって評価する。構築物の統合を確認し、ゲノム位置を分析するために、ＭｉＳｅｑにおいて周囲のゲノム配列に読み出すために、挿入された遺伝子にアニールする特異的プライマーを用いることによって、一方向シーケンシングを、ゲノムＤＮＡサンプルにおいて行う。
実施例２０：未成熟又は成熟マウス疾患モデルにおいて、治療用遺伝子を肝臓に送達するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの適用。
この実施例は、遺伝的ペイロードの統合及び安定した発現のためにインビボで肝臓に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを記載する。発現制御のためのプロモーター及びｍｉＲＮＡ認識配列並びに治療用遺伝子は、手法を例示することが意図され、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表２、３、及び４のそれぞれから選択される。
この実施例は、遺伝的ペイロードの統合及び安定した発現のためにインビボで肝臓に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを記載する。発現制御のためのプロモーター及びｍｉＲＮＡ認識配列並びに治療用遺伝子は、手法を例示することが意図され、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表２、３、及び４のそれぞれから選択される。
この実施例において、ＯＴＣ欠損マウスモデルが、肝細胞中への統合のためにＯＴＣ発現カセットを送達するように設計されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを評価するのに使用される。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド成分は、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポザーゼのための発現カセット（表３）を含み、鋳型成分は、Ｒ２Ｔｇによる結合及びレトロトランスポジションに必要とされるＵＴＲ配列（表３）によって隣接され、及びリボソームＤＮＡ中の標的部位に対する１００ｎｔの相同性によってさらに隣接される、ヒトＯＴＣ遺伝子のための発現カセット（国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表５）を含む。この実施例において、トランスポザーゼ及び鋳型発現カセットは両方とも、肝細胞特異的発現のためのｈＡＡＴプロモーター（国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３）及び造血細胞内の発現を下方制御するためのｍｉＲ－１４２のシード配列に相補的なｍｉＲＮＡ認識配列（国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４）をさらに含む。
１．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド成分：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．Ｒ２Ｔｇ
２．エンドヌクレアーゼ突然変異Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．Ｒ２ＴｇＥＮ＊
３．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．ＯＴＣ
４．レポーターＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．ＧＦＰ
１～２日齢又は８～１２週齢のいずれかの雌Ｏｔｃ欠損Ｓｐｆａｓｈマウス（Ｃ５７ＢＬ／６／Ｃ３Ｈ－Ｆ１バックグラウンド）を、ＡＡＶ８中に包装されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）、肝臓指向性ＡＡＶカプシドで処置する。以下のベクターを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって投与する：
・治療用の有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（３）
・レポーターの有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（４）
・統合不活性化治療対照：（２）及び（３）
・統合不活性化レポーター対照：（２）及び（４）
５週間後、続いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを、標準的な方法によって、肝臓溶解物から抽出する。続いて、ＯＴＣ発現を、配列特異的プライマーを用いて、単離されたＲＮＡサンプルにおいてＲＴ－ｑＰＣＲを行うことによって評価する。構築物の統合を確認し、ゲノム位置を分析するために、ＭｉＳｅｑにおいて周囲のゲノム配列に読み出すために、挿入された遺伝子にアニールする特異的プライマーを用いることによって、一方向シーケンシングを、ゲノムＤＮＡサンプルにおいて行う
１．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド成分：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．Ｒ２Ｔｇ
２．エンドヌクレアーゼ突然変異Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．Ｒ２ＴｇＥＮ＊
３．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．ＯＴＣ
４．レポーターＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型成分：ｒＡＡＶ２／８．ｈＡＡＴ．ＧＦＰ
１～２日齢又は８～１２週齢のいずれかの雌Ｏｔｃ欠損Ｓｐｆａｓｈマウス（Ｃ５７ＢＬ／６／Ｃ３Ｈ－Ｆ１バックグラウンド）を、ＡＡＶ８中に包装されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）、肝臓指向性ＡＡＶカプシドで処置する。以下のベクターを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって投与する：
・治療用の有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（３）
・レポーターの有効なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）：（１）及び（４）
・統合不活性化治療対照：（２）及び（３）
・統合不活性化レポーター対照：（２）及び（４）
５週間後、続いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを、標準的な方法によって、肝臓溶解物から抽出する。続いて、ＯＴＣ発現を、配列特異的プライマーを用いて、単離されたＲＮＡサンプルにおいてＲＴ－ｑＰＣＲを行うことによって評価する。構築物の統合を確認し、ゲノム位置を分析するために、ＭｉＳｅｑにおいて周囲のゲノム配列に読み出すために、挿入された遺伝子にアニールする特異的プライマーを用いることによって、一方向シーケンシングを、ゲノムＤＮＡサンプルにおいて行う
実施例２１：再標的化部位におけるリボザイム及びホモロジーアーム配列適合性
この実施例は、その天然ゲノム標的部位の外部にあるゲノム位置を標的とする突然変異遺伝子書き込みポリペプチド配列とともに使用される遺伝子書き込み鋳型分子を記載する。レトロトランスポゾンＲＮＡの内因性配列は、それらのＲＮＡの５’末端にリボザイムを含み、これは、ＲＮＡが、適切な二次構造又はＲＮＡの折り畳みを形成する場合にのみ活性である（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０（１３），３１４２－３１５０，２０１０；Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（９），１－１６，２０１３；Ｒｕｍｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８６（４８），４１２８６－４１２９５，２０１１）。レトロトランスポゾンリボザイムの活性形態が、適切な構造を形成するために、いくつかのレトロトランスポゾンのＲＮＡは、リボザイムのＰ１ステムの適切な二次構造が形成されるために、２８ＳリボソームＲＮＡの一部を含まなければならない（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（９），１－１６，２０１３）。
この実施例は、その天然ゲノム標的部位の外部にあるゲノム位置を標的とする突然変異遺伝子書き込みポリペプチド配列とともに使用される遺伝子書き込み鋳型分子を記載する。レトロトランスポゾンＲＮＡの内因性配列は、それらのＲＮＡの５’末端にリボザイムを含み、これは、ＲＮＡが、適切な二次構造又はＲＮＡの折り畳みを形成する場合にのみ活性である（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０（１３），３１４２－３１５０，２０１０；Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（９），１－１６，２０１３；Ｒｕｍｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８６（４８），４１２８６－４１２９５，２０１１）。レトロトランスポゾンリボザイムの活性形態が、適切な構造を形成するために、いくつかのレトロトランスポゾンのＲＮＡは、リボザイムのＰ１ステムの適切な二次構造が形成されるために、２８ＳリボソームＲＮＡの一部を含まなければならない（Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（９），１－１６，２０１３）。
レトロトランスポゾンＲＮＡの５’ＵＴＲと相互作用する２８ＳリボソームＲＮＡである内因性レトロトランスポゾンＲＮＡの部分は、遺伝子書き込み鋳型分子（図１８のモジュール性）に類似しており、ここで、モジュールＡ中の配列の一部が、遺伝子書き込み鋳型分子のモジュールＢの配列の一部と相互作用する。モジュールＢが活性リボザイムであるために、それは、適切な二次構造に折り畳まれる必要があり、モジュールＢに見られるリボザイムのＰ１’部分は、モジュールＡに見られるリボザイムのＰ１配列に対するいくらかの相補性と相互作用する。いくつかの実施形態において、遺伝子書き込み鋳型分子の５’ホモロジーアーム（モジュールＡ）が、活性リボザイム（モジュールＢ）を有するとともに統合活性のために必要とされる場合、モジュールＢに見られるリボザイムのＰ１’配列の配列が、Ｐ１配列が存在するモジュールＡに見られる配列に対するいくらかの相補性を有するように変化される。モジュールＡに見られるＰ１配列と、モジュールＢのＰ１’配列との間の相補性のヌクレオチド長さは、０～１００ヌクレオチドで変化し得る。いくつかの実施形態において、再標的化遺伝子書き込みポリペプチド配列が、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ）由来のＲ２要素に基づいている場合、遺伝子書き込み鋳型分子のモジュールＢのヌクレオチド４９～５４は、モジュールＡの最後の２８ヌクレオチドに対して完全な又は部分的な相補性によって相互作用し、ここで、モジュールＡは、モジュールＡが相補性を有するゲノム領域を標的とする突然変異Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド配列と適合するゲノム位置に対する相補性を有するホモロジーアームである（図２８の予測されるリボザイム）。
実施例２２：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇが、特定の鋳型配列を統合する。
この実施例は、標的部位への非鋳型ＲＮＡ、例えば、細胞内因性ＲＮＡの一方向の組み込みについて評価するために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムによって完成される挿入を分析することを記載する。
この実施例は、標的部位への非鋳型ＲＮＡ、例えば、細胞内因性ＲＮＡの一方向の組み込みについて評価するために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムによって完成される挿入を分析することを記載する。
この実施例において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムが、ＨＥＫ２９３細胞内の標的部位中に鋳型ＲＮＡを統合するために、前の実施例に記載されるように使用される。ＨＥＫ２９３が、以下の試薬でトランスフェクトされる：
１．Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
２．不活性化Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、Ｒ２Ｔｇ逆転写酵素突然変異体）をコードするｍＲＮＡ
３．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＲＮＡ鋳型（例えば、５’－３’：５’ＨＡ－５’ＵＴＲ－ＧＦＰカセット－３’ＵＴＲ－３’ＨＡを含む）
４．結合モチーフなしのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＲＮＡ鋳型（例えば、５’－３’：５’ＨＡ－ＧＦＰカセット－３’ＨＡを含む）
３日間のインキュベーションの後、ゲノムＤＮＡを、抽出し、本明細書の他の箇所に記載されるように、ｄｄＰＣＲによって、挿入頻度について分析する。いくつかの実施形態において、（１）及び（２）の組合せは、鋳型の統合をもたらす。いくつかの実施形態において、（１）及び（４）の組合せは、鋳型の検出可能な統合をもたらさないが、これは、鋳型（４）が、ポリペプチド結合モチーフ、例えば、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポゾンからの３’ＵＴＲを有さないためである。いくつかの実施形態において、（１）及び（４）は、（１）及び（２）との統合の頻度より少ない統合頻度をもたらし、例えば、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．０５％、又は０．０１％未満である。
１．Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
２．不活性化Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、Ｒ２Ｔｇ逆転写酵素突然変異体）をコードするｍＲＮＡ
３．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＲＮＡ鋳型（例えば、５’－３’：５’ＨＡ－５’ＵＴＲ－ＧＦＰカセット－３’ＵＴＲ－３’ＨＡを含む）
４．結合モチーフなしのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＲＮＡ鋳型（例えば、５’－３’：５’ＨＡ－ＧＦＰカセット－３’ＨＡを含む）
３日間のインキュベーションの後、ゲノムＤＮＡを、抽出し、本明細書の他の箇所に記載されるように、ｄｄＰＣＲによって、挿入頻度について分析する。いくつかの実施形態において、（１）及び（２）の組合せは、鋳型の統合をもたらす。いくつかの実施形態において、（１）及び（４）の組合せは、鋳型の検出可能な統合をもたらさないが、これは、鋳型（４）が、ポリペプチド結合モチーフ、例えば、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポゾンからの３’ＵＴＲを有さないためである。いくつかの実施形態において、（１）及び（４）は、（１）及び（２）との統合の頻度より少ない統合頻度をもたらし、例えば、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．０５％、又は０．０１％未満である。
全ての組み込まれた配列をさらに分析するために、アンプリコン－ｓｅｑが、標的部位の接合部にわたって増幅するためにＰＣＲを用いることによって、（１）及び（２）をトランスフェクトすることから得られる細胞において行われる。任意選択で、非編集標的部位に対する陰性選択が、シグナルを改善するために、非編集標的部位（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒのニック部位）の接合部において特異的に消化することによって行われ得る。アンプリコンが、既に記載されるように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑにおいて次世代シーケンシングのために処理される。意図されない組み込みが、鋳型ＲＮＡにマッピングされない新たなＤＮＡの挿入された配列、例えば、少なくとも１００ｎｔを含むリードを探すことによって発見される。任意選択で、挿入が、標的部位に意図せず組み込まれた何らかの転写産物の供給源を決定するために、トランスクリプトームと比較される。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ鋳型ＲＮＡでない標的部位にいずれの鋳型も組み込まないであろう。いくつかの実施形態において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、全挿入の１％を超えるレベルでＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ鋳型ＲＮＡでない標的部位にいずれの鋳型も組み込まないであろう。
実施例２３：ヒト細胞におけるα－１アンチトリプシン欠損突然変異を補正するためにゲノムＤＮＡにおけるヌクレオチド置換を可能にするＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）
この実施例は、単一のヌクレオチドにおいてゲノム配列を改変するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を記載する。
この実施例は、単一のヌクレオチドにおいてゲノム配列を改変するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を記載する。
この実施例において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド及び書き込み鋳型が、ＰｉＺ遺伝子型（Ｅ３４２Ｋ）、α－１アンチトリプシン欠損症に関連する一般的な対立遺伝子を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされたＤＮＡとして提供される。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドは、ＤＮＡ結合及びエンドヌクレアーゼ機能の両方のためにＣａｓ９ニッカーゼを使用する。鋳型ＲＮＡの逆転写が、置換を含む新たなＤＮＡ鎖をもたらすように、書き込み鋳型が、所望の位置においてさらなるヌクレオチドを組み込みながら、標的配列に対する相同性を有するように設計される。
健康な患者においてグルタメートをコードするＧＡＧ三重線を回復する、罹患したヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子におけるトランスバージョンを生成するために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドは、ポリペプチド結合のためのｇＲＮＡ骨格、ポリペプチドホーミングのためのスペーサー、ＴＰＲＴを設定するための標的ホモロジードメイン、及び必要とされる置換を含む逆転写のための鋳型配列をコードする特定の鋳型核酸とともに使用される。例示的な鋳型ＲＮＡは、配列
を有し、ここで、番号は、（５’－３’）の順序で（１）ｇＲＮＡスペーサー、（２）ｇＲＮＡ骨格、（３）異種対象配列、（４）ドメインをプライミングする３’ホモロジーにおける鋳型のモジュールを説明するために使用され、小文字「ｃ」は、Ｅ３４２Ｋ突然変異を補正するために標的部位に書き込まれるヌクレオチド置換を有する鋳型における位置を示す。このシステムの実施形態に記載されるように第２のニックを提供するための例示的なｇＲＮＡは、スペーサー配列ＴＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＣＴＣＧＧ（配列番号１６２５）を含み。標的部位の第２の鎖を同種の領域内でニックするようにＣａｓ９ニッカーゼを指向する。いくつかの実施形態において、この第２のニックは、編集の効率を改善する。トランスフェクションの後、細胞が、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムの発現及びゲノムＤＮＡ標的の変換を可能にするために、３日間にわたってインキュベートされ、ゲノムＤＮＡが、細胞から抽出される。次に、ゲノムＤＮＡが、部位特異的プライマーを用いたＰＣＲベースの増幅に供され、アンプリコンが、製造業者のプロトコルにしたがってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑにおいてシーケンシングされる。次に、配列解析が、所望の編集を含むリードの頻度を決定するために行われる。
実施例２４：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを含む脂質ナノ粒子を使用したα－１アンチトリプシン欠損症の補正
この実施例は、インビボで単一ヌクレオチドのゲノム配列を変更するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。より具体的には、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド及び書込み鋳型が脂質ナノ粒子を介してマウス肝細胞に送達されて、α－１アンチトリプシン欠損症を引き起こすＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺ変異を補正する。
この実施例は、インビボで単一ヌクレオチドのゲノム配列を変更するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。より具体的には、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド及び書込み鋳型が脂質ナノ粒子を介してマウス肝細胞に送達されて、α－１アンチトリプシン欠損症を引き起こすＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺ変異を補正する。
Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを担持するＬＮＰ（ＬＮＰ－ＩＮＴ０１システム）を用いたマウスモデルの製剤化及び処理は、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：２２２７－２２３５（２０１８）によって教示されている（その方法は参照により本明細書に組み込まれる）。
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むキャップポリアデニル化Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドｍＲＮＡは、線状プラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成される。製造者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って、ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔを使用して、ポリペプチドｍＲＮＡを酵素及びヌクレオチドから精製する。転写物の濃度は、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定され（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物は、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析される。変異補正配列を含む鋳型ＲＮＡも、同様の方法を用いたインビトロ転写及び翻訳によって調製される。この実施例では、鋳型ＲＮＡは、実施例１で例示された配列を含む。
ＬＮＰは、アミン対リン酸ＲＮＡ（Ｎ：Ｐ）比４．５で製剤化されている。脂質ナノ粒子成分は、次のモル比で１００％エタノールに溶解する：４５ｍｏｌ％ＬＰ０１脂質、４４ｍｏｌ％コレステロール、９ｍｏｌ％ＤＳＰＣ、及び２ｍｏｌ％ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ。ＲＮＡカーゴ（ポリペプチドｍＲＮＡ：鋳型ＲＮＡのモル比１：４０）を５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４．５）に溶解し、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得る。ＬＮＰは、製造者のプロトコルに従って、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、脂質及びＲＮＡ溶液のマイクロ流体混合によって形成される。混合後、ＬＮＰｓを収集し、ＰＢＳで希釈し（約１：１）、次に、残りのバッファーを、１０ｋＤａのＳｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して穏やかに攪拌しながら、４℃で一晩ＰＢＳ（サンプル量の１００倍過剰）に交換する。次に、得られた混合物を、０．２ｍｍ滅菌フィルターを使用して濾過する。濾液は２Ｃ～８Ｃで保存される。複数用量製剤は、２５ｍＭクエン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌカーゴバッファー（ｐＨ５）、及びＴＦＦによってトリス－生理食塩水スクロースバッファー（ＴＳＳ）で交換されたバッファー（５％スクロース、４５ｍＭ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ）を使用して製剤化され得る。製剤化されたＬＮＰの平均サイズは１０５ｎｍである。封入効率は、リボグリーンアッセイによって決定される（Ｌｅｕｎｇｅｔａｌ．，２０１２）。粒径及び多分散性は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＤＬＳ装置を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。
ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺ対立遺伝子（Ｅ３４２Ｋ）を持つＮＳＧ－ＰｉＺマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得される。インビボで変異対立遺伝子を編集するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの能力を評価するために、ＬＮＰは、動物あたり０．２ｍＬの体積で、３ｍｇ／ｋｇで外側尾静脈を介して投与される。賦形剤で処置された動物は、全ての研究の陰性対照として使用される。イソフルラン麻酔下での心臓穿刺による放血により、動物を様々な時点で安楽死させる。一部の実施形態では、動物は、処置後１週間で安楽死させられ、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇについて分析される。肝臓組織は、ＤＮＡ抽出及び分析のために、各動物の中央又は左側葉から収集される。
編集効率のＮＧＳ解析では、標的部位の周囲にＰＣＲプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡから目的の領域を増幅する。更なるＰＣＲは、製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って実施して、シーケンシングに適切な化学物質を追加し、次に、アンプリコンはＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングされる。シーケンシングリードは、品質スコアの低いものを排除した後、マウス参照ゲノムにアラインされる。読み取りを含む結果のファイルは、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングされる。ここで、目的の標的領域とオーバーラップするリードが選択され、鋳型ＲＮＡ中にコードされたＳＥＲＰＩＮＡ１復帰変異を含むリードの数に対する野生型リードの数が計算される。編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」又は「編集率」）は、配列リードの総数に対する復帰配列リードの総数として定義される。
一部の実施形態では、この実施例は、追加のマウス群で反復され、システムの用量対効果特性を分析するために再投与レジメンが使用される。これらの実験では、マウスは、毎週実施される本明細書に記載の安楽死及び組織分析により、最大４週間までの毎週投与の群に割り当てられる。一部の実施形態では、より多くの用量のＬＮＰ製剤を投与されたマウスは、シーケンシングによってより高いＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ効率を示し、例えば、３週目に分析される１週間間隔で２回投与を受けたマウスは、単回投与を受けて３週目に分析したマウスと比較して、肝臓組織サンプルのＮＧＳによる遺伝子補正読み取りのより高い割合を示す。適用において、この方法での投与は、１回又は複数回の投与に対する患者の応答を評価した後に治療的介入の調整を可能にし得る。
実施例２５：反復増殖疾患に対処するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの使用
この実施例では、通常の数の反復を遺伝子座に書き換えることにより、反復増殖疾患を処置するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。より具体的には、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド及び書込み鋳型がＡＡＶを介してマウスＣＮＳに送達され、カスタム鋳型ＲＮＡに従ってＨＴＴのＣＡＧリピートがリセットされて、ハンチントン病が治癒する。健康なヒトは、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）内に１０～３５のＣＡＧリピートを担持する傾向があるが、ハンチントン病の人は３６～１２０超のリピートを有し得る。
この実施例では、通常の数の反復を遺伝子座に書き換えることにより、反復増殖疾患を処置するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。より具体的には、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド及び書込み鋳型がＡＡＶを介してマウスＣＮＳに送達され、カスタム鋳型ＲＮＡに従ってＨＴＴのＣＡＧリピートがリセットされて、ハンチントン病が治癒する。健康なヒトは、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）内に１０～３５のＣＡＧリピートを担持する傾向があるが、ハンチントン病の人は３６～１２０超のリピートを有し得る。
この実施例では、鋳型ＲＮＡは、１０のそのようなリピートを有する配列及び隣接する標的配列との相同性をコードして、標的遺伝子座にわたって完全に書きこむことにより、ＨＴＴ遺伝子のＣＡＧリピート領域を補正するように設計されている。このような鋳型ＲＮＡの複数の例は、ＤＮＡにコードされた、例示的な鋳型ＲＮＡを使用して設計でき、これは、配列
を含み、ここで、番号を使用して、鋳型のモジュールを（５’－３’）（１）ｇＲＮＡスペーサー、（２）ｇＲＮＡスカフォールド、（３）異種目的配列、（４）３’相同性プライミングドメイン（（３）でコードされた反復補正を伴う）の順序で表す。ＣＡＧリピート領域の後には、１１個のプロリン残基をコードする短いリピート領域が続く（８個の残基はＣＣＧトリプレットによってコードされる）。特定の理論に束縛されることは意図しないが、この領域は（３）に含まれ、ミスプライミングを防ぐために（４）をより独特な領域に配置する。このシステムの実施形態に記載される第２ニックを提供するための例示的なｇＲＮＡは、スペーサー配列ＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＴＴ（配列番号１６４７）を含み、相同領域内の標的部位の第２鎖にニックを入れるようにＣａｓ９ニッカーゼに指示する。一部の実施形態では、この第２ニックは編集の効率を改善する。
完全なＧｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムをＣＮＳに送達するために、この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを、スプリットインテイン対のインテイン－Ｎに融合したニッカーゼＣａｓ９ドメインをコードする第１（ＤｎａＥインテイン－Ｎ：ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号１６１３））及びスプリットインテイン対のインテイン－Ｃに融合したＲＴドメインをコードする第２（ＤｎａＥインテイン－Ｃ：ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号１６１５））の２つのＡＡＶゲノム、及び鋳型ＲＮＡにわたって分割する。２つのポリペプチド成分は、ポリメラーゼＩＩプロモータ、例えば、本明細書に記載の神経細胞特異的プロモータから発現され、第２ニックを提供するための鋳型ＲＮＡ及びｇＲＮＡは、ポリメラーゼＩＩＩプロモータ、例えばＵ６プロモータから発現される。細胞を同時感染させると、２つのポリペプチド成分がＮ末端Ｃａｓ９及びＣ末端ＲＴを有する完全なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを再構成し、鋳型ＲＮＡが発現し、標的遺伝子座に逆転写される。ＣＮＳの細胞（具体的には尾状核（ｃｌａｕｄａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）及び基底核の被殻）のための送達を達成するために、ここでは、シュードタイプ化されたシステムｒＡＡＶ２／１が使用され、ここで、ＡＡＶ２ＩＴＲを使用して、記載の核酸を、ＡＡＶ１カプシドを含む粒子にパッケージングする。ここで使用されるＡＡＶ調製及びマウス注射及び採取のプロトコルは、Ｍｏｎｔｅｙｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５（１）：１２－２３（２０１７）の教示に従う。
ＦＶＢ－Ｔｇ（ＹＡＣ１２８）５３Ｈａｙ／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得される。これらのトランスジェニックマウスは、約１１８のグルタミンリピート（ＣＡＧトリヌクレオチドリピート）を有する完全長ヒトハンチンチンタンパク質を発現し、３ヶ月齢で多動を発症する。８週齢で、１：１のｒＡＡＶ２／１－Ｃａｓ９ウイルスとｒＡＡＶ－ＭＭＬＶ＿ＲＴ／ｈＵ６鋳型ＲＮＡウイルスの組み合わせでマウスを処置する。ｒＡＡＶ注射の場合、マウスをイソフルランで麻酔し、５μＬのｒＡＡＶ混合物を０．２μＬ／分で右線条体に片側注射する。３週間後、マウスを屠殺し、ゲノムＤＮＡ抽出とＮＧＳ分析のために脳組織を採取する。
編集効率のＮＧＳ解析では、標的部位の隣接するＰＣＲプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡから目的の領域を増幅する。更なるＰＣＲは、製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って実施して、シーケンシングに必要な化学物質を追加し、次に、アンプリコンはＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングされる。シーケンシングリードは、品質スコアの低いものを排除した後、マウス参照ゲノムにアラインされる。読み取りを含む結果のファイルは、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングされる。ここで、目的の標的領域とオーバーラップするリードが選択され、疾患対立遺伝子の数（＞３５ＣＡＧリピート）のリードと修復対立遺伝子の数（１０～３５ＣＡＧリピート）のリードが計算される。編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」又は「編集率」）は、上記で定義したように、配列リードの総数に対する修復リードの総数として定義される。
実施例２６：ＬＮＰ及びＡＡＶビヒクルによるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの送達
この実施例は、インビボで単一ヌクレオチドのゲノム配列を変更するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。より具体的には、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド及び書込み鋳型が脂質ナノ粒子（ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）とＡＡＶ（ＲＮＡ鋳型をコードするＤＮＡ）の組み合わせを介してマウス肝細胞に送達されて、α－１アンチトリプシン欠損症を引き起こすＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺ変異を補正する。
この実施例は、インビボで単一ヌクレオチドのゲノム配列を変更するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。より具体的には、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド及び書込み鋳型が脂質ナノ粒子（ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）とＡＡＶ（ＲＮＡ鋳型をコードするＤＮＡ）の組み合わせを介してマウス肝細胞に送達されて、α－１アンチトリプシン欠損症を引き起こすＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺ変異を補正する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするキャップ及びテールｍＲＮＡをインビトロ転写によって調製し、実施例２３に記載されるようにＬＮＰ－ＩＮＴ０１に製剤化するが、鋳型ＲＮＡ同時製剤化は行わない。
この実施例では、鋳型ＲＮＡはＤＮＡとしてコードされ、ＡＡＶを介して送達される。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６（６）：１０８１－１０８８（２００８）の教示は、幼若マウス肝臓でカーゴの発現を効果的に形質導入及び駆動するための、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータ及びアポリポタンパク質Ｅエンハンサー（ＡｐｏＥ）の肝臓制御領域の２つのコピーを含む、ｒＡＡＶ２／８の使用を説明する。従って、本明細書に記載のｒＡＡＶ２／８．ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴ．ＰｉＺ（ｒＡＡＶ２／８．ＰｉＺ）は、Ｕ６プロモータによって駆動される第２ニック指向ｇＲＮＡ（実施例１で前述したＲＮＡ配列）に加え、ＰｉＺ変異を補正するためのＲＮＡ鋳型の発現を駆動する上述のＡＡＶ及びプロモーターシステムを含む。
ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺ対立遺伝子（Ｅ３４２Ｋ）を持つＮＧＳ－ＰｉＺマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得される。インビボで変異対立遺伝子を編集するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの活性を評価するために、８週齢のマウスに約１０１１ｖｇのｒＡＡＶ２／８．ＰｉＺを用いてｉ．ｐ．投与して、鋳型ＲＮＡを発現させ、外側尾静脈を介して、動物あたり０．２ｍＬの体積で３ｍｇ／ｋｇの製剤化ＬＮＰによってＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを発現させる。イソフルラン麻酔下での心臓穿刺による放血により、動物を様々な時点で安楽死させる。一部の実施形態では、動物は、処置後１週間で安楽死させられ、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇについて分析される。肝臓組織は、ＤＮＡ抽出及び分析のために、各動物の中央又は左側葉から収集される。
編集効率のＮＧＳ解析では、標的部位の周囲にＰＣＲプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡから目的の領域を増幅する。更なるＰＣＲは、製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って実施して、シーケンシングに必要な化学物質を追加し、次に、アンプリコンはＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングされる。シーケンシングリードは、品質スコアの低いものを排除した後、マウス参照ゲノムにアラインされる。読み取りを含む結果のファイルは、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングされる。ここで、目的の標的領域とオーバーラップするリードが選択され、鋳型ＲＮＡ中にコードされたＳＥＲＰＩＮＡ１復帰変異を含むリードの数に対する野生型リードの数が計算される。編集パーセンテージは、配列リードの総数に対する復帰配列リードの総数として定義される。
実施例２７：ヒトキメラ肝臓マウスモデルの肝臓に治療用遺伝子を送達するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの適用
この実施例は、遺伝子ペイロードの組込み及び安定した発現のためにインビボで肝臓に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。具体的には、完全なＯＴＣ発現カセットを組み込むことができるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達するためにＬＮＰを使用して、ＯＴＣ欠損症のヒト化マウスモデルを処置する。
この実施例は、遺伝子ペイロードの組込み及び安定した発現のためにインビボで肝臓に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。具体的には、完全なＯＴＣ発現カセットを組み込むことができるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達するためにＬＮＰを使用して、ＯＴＣ欠損症のヒト化マウスモデルを処置する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、ＯＴＣ欠損症のヒト化マウスモデルを処置し、ここで、ＯＴＣ欠損症の患者に由来するヒト肝細胞がマウスモデルに移植される（Ｇｉｎｎ ｅｔ ａｌ ＪＨＥＰ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１９）。大きいペイロード組込みのための例示的なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、進行性の高い逆転写酵素、例えばＭａｒａｔｈｏｎＲＴを利用する、Ｃａｓ９に向けた逆転写酵素システムを含む。例示的な鋳型ＲＮＡ成分は、５’から３’まで、（１）ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位との相同性を有するｇＲＮＡスペーサー、（２）ｇＲＮＡスカフォールド、（３）異種目的配列、及び（４）異種目的配列のＴＰＲＴをプライミングするために第１鎖ニックのすぐ上流でゲノムＤＮＡにアニーリングするための３’標的相同性領域を含む。（１）の例示的な配列は、ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１６９１）である。領域（２）は、本出願に記載されるｇＲＮＡスカフォールドを担持し、一般に、配列ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣ（配列番号１６０３）を含む。この実施例では、（３）は完全なＯＴＣ発現カセットを含み、ここで、ヒトＯＴＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ００４８０）をコードする肝臓コドン最適化配列は、実施例２５に記載されるようにＡｐｏＥ．ｈＡＡＴプロモーターシステムと機能的に関連している。（４）の例示的な配列は、ＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧＴＧ（配列番号１６９２）である。組込みの効率を改善するために第２鎖ニックを生成するための更なるｇＲＮＡスペーサーの例示的な配列は、ＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡ（配列番号１６９３）である。
以前に説明されたように、８～１２週齢の雌Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒｇ－／－（ＦＲＧ）マウスに、小児ドナーから単離するか、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入したヒト肝細胞を移植する（Ａｚｕｍａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７）。移植マウスは、肝臓の再増殖を促進するために飲用水中の２－（２－ニトロ－４－トリフルオロ－メチルベンゾイル）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）のオンとオフのサイクルに付す。２週間ごと及び実験の最後に血液を収集して、酵素結合免疫吸着アッセイにより、血清中の生着レベルを推定するためのマーカとして使用されるヒトアルブミンのレベルを測定する（ＥＬＩＳＡ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）。移植から１１週間後、実施例２３のように製剤化されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）でマウスを処置する。処置のために、ＬＮＰは、動物あたり０．２ｍＬの体積で、３ｍｇ／ｋｇで外側尾静脈を介して送達される。
ベクター注入後、安楽死させる前にマウスを更に５週間ＮＴＢＣでサイクルに付す。その後、標準的な方法で肝臓溶解物からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出する。ＯＴＣ発現は、その後、配列特異的プライマーを使用して単離されたＲＮＡサンプルに対してＲＴ－ｑＰＣＲを実施することによってアッセイされる。ヒトＯＴＣのレベルは、製造者の推奨プロトコルに従い、注射後－７、０、２、４、７、１４、２１、２８、及び３５日目の血清でヒトＯＴＣ ＥＬＩＳＡキット（例えば、Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＯＴＣ ＥＬＩＳＡキット（ヒト）（ＯＫＣＤ０７４３７））を使用することにより、実験を通しても測定される。
編集効率を分析するために、組込みの５’接合部又は３’接合部のいずれかにわたってアニーリングする一対のプライマーを使用してｄｄＰＣＲアッセイを実施する。各セットの１つのプライマーは異種目的配列にアニーリングし、他方のプライマーはゲノム上のＡＡＶＳ１部位の適切な領域にアニーリングする。アッセイは、ゲノムあたりの標的部位組込みの数を定量化するために、参照遺伝子に対して正規化される。
標的部位での組込みを分析するために、組込み部位にわたるロングリードシーケンシングを実施する。標的部位の隣接するＰＣＲプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡから目的の領域を増幅する。更なるＰＣＲは、製造者のプロトコル（ＰａｃＢｉｏ）に従って実施して、シーケンシングに必要な化学物質を追加し、次に、アンプリコンはＰａｃＢｉｏによってシーケンシングされる。シーケンシングリードは、品質スコアの低いものを排除した後、マウス参照ゲノムにアラインされる。読み取りを含む結果のファイルは、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングされる。ここで、参照ゲノムに関連する挿入配列を含むリードが、組込みの完全性を判断するための更なる分析のために選択され、この実施例では、ＯＴＣの完全なプロモータ及びコード配列を含むと定義されている。
実施例２８：エクスビボでＴ細胞にＣＡＲを組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ
この実施例は、遺伝子ペイロードの組込み及び安定した発現のためのエクスビボでのＴ細胞へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムの送達を説明する。具体的には、ＬＮＰが、Ｂ細胞リンパ腫を処置するためのＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子座に組み込むことのできるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達するために使用される。
この実施例は、遺伝子ペイロードの組込み及び安定した発現のためのエクスビボでのＴ細胞へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムの送達を説明する。具体的には、ＬＮＰが、Ｂ細胞リンパ腫を処置するためのＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子座に組み込むことのできるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達するために使用される。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるニッカーゼＣａｓ９及びＲ２Ｔｇ逆転写酵素ドメイン、ニッカーゼ活性を標的遺伝子座に向けるためのｇＲＮＡ、並びに５’から３’に
（１）第１鎖ニックの標的部位３’と１００ｎｔの相同性
（２）Ｒ２Ｔｇからの５’ＵＴＲ
（３）異種目的配列
（４）Ｒ２Ｔｇからの３’ＵＴＲ
（５）第１鎖ニックの標的部位５’と１００ｎｔの相同性
を含む鋳型ＲＮＡを含み、ここで、（３）は、ＣＤ１９特異的Ｈｕ１９－ＣＤ８２８Ｚ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＮ６９８６４２；Ｂｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：２７０－２８０（２０２０））ＣＡＲ分子のコード配列を含む。この実施例のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（２０１７）による教示のとおり、内因性ＴＣＲを破壊しつつ、その遺伝子座からの内因性発現制御下にカーゴを配置するために、標的ｇＲＮＡ、例えば、ＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴ（配列番号１６９４）を使用して、ＴＲＡＣの第１エクソンの５’末端にガイドされる。これらの３つの成分（ポリペプチド、ｇＲＮＡ、及び鋳型）は全て、インビトロ転写（例えば、ポリペプチドｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ）又は化学合成（ｇＲＮＡ）によって合成されるＲＮＡを含む。
（１）第１鎖ニックの標的部位３’と１００ｎｔの相同性
（２）Ｒ２Ｔｇからの５’ＵＴＲ
（３）異種目的配列
（４）Ｒ２Ｔｇからの３’ＵＴＲ
（５）第１鎖ニックの標的部位５’と１００ｎｔの相同性
を含む鋳型ＲＮＡを含み、ここで、（３）は、ＣＤ１９特異的Ｈｕ１９－ＣＤ８２８Ｚ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＮ６９８６４２；Ｂｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：２７０－２８０（２０２０））ＣＡＲ分子のコード配列を含む。この実施例のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（２０１７）による教示のとおり、内因性ＴＣＲを破壊しつつ、その遺伝子座からの内因性発現制御下にカーゴを配置するために、標的ｇＲＮＡ、例えば、ＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴ（配列番号１６９４）を使用して、ＴＲＡＣの第１エクソンの５’末端にガイドされる。これらの３つの成分（ポリペプチド、ｇＲＮＡ、及び鋳型）は全て、インビトロ転写（例えば、ポリペプチドｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ）又は化学合成（ｇＲＮＡ）によって合成されるＲＮＡを含む。
この実施例で使用されるＬＮＰ製剤は、エクスビボでのＴ細胞への送達についてスクリーニング及び検証され、Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０（３）：１５７８－１５８９（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。具体的には、コレステロール、リン脂質、脂質アンカーＰＥＧ、及びイオン化性脂質Ｃ１４－４を含むＬＮＰ製剤Ｃ１４－４（Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０（３）：１５７８－１５８９（２０２０）の図２Ｃ）を使用して、約１：４０：４０のポリペプチドｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ：鋳型ＲＮＡのモル比で３つ全てのＲＮＡ成分を封入する。
コグネイト標的に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を改善するために、Ｔ細胞に対して更なる編集を実施することができる。一部の実施形態では、記載されるＣ１４－４の第２ＬＮＰ製剤は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ事前形成ＲＮＰ複合体を含み、ここで、ｇＲＮＡは、ＰＤ－１不活性化のためにＰｄｃｄ１エクソン１を標的とし、これは、破壊しなければ細胞の抑制を誘発し得るこの阻害性チェックポイントを破壊することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を高めることができる（Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：７３７（２０１７）参照）。従って、両方のナノ粒子製剤の適用により、抗ＣＤ１９カーゴを提供することでリンパ腫ターゲティングが可能になり、同時にＰＤ－１チェックポイント阻害剤をノックアウトすることで有効性が高まる。一部の実施形態では、細胞をナノ粒子で同時に処理してもよい。一部の実施形態では、細胞は、別個のステップにおいてナノ粒子で処理され得、例えば最初にＰＤ－１ノックアウトを生成するためにＲＮＰを送達し、続いて抗ＣＤ１９ ＣＡＲを担持するナノ粒子で細胞を処理する。一部の実施形態では、Ｔ細胞の有効性を改善するシステムの第２成分は、ＰＤ－１、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ－４、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、ＣＳ１、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ３、ＦＡＳ、ＰＤＣ１、ＣＩＳＨ、ＴＲＡＣ、又はそれらの組み合わせのノックアウトを生じ得る。一部の実施形態では、ＰＤ－１、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ－４、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、ＣＳ１、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ３、ＦＡＳ、ＰＤＣ１、ＣＩＳＨ、又はＴＲＡＣのノックダウンは、例えば、ＰＤ－１を標的とするｓｉＲＮＡを使用することが好ましい可能性がある。一部の実施形態では、Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６（６）：１４８２－１４９３（２０１８）及び国際公開第２０１００３３２４７号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＰＤ－１を標的とするｓｉＲＮＡは、自己送達ＲＮＡｉを使用して達成され得る。ここで、ｓｉＲＮＡの広範な化学修飾により、結果として得られる疎水性修飾ｓｉＲＮＡ分子に、エクスビボ及びインビボで全ての細胞型に浸透する能力が付与され、更なる送達製剤及び技術なしで長期にわたる特定の標的遺伝子のノックダウンを達成する。一部の実施形態では、システムの１つ以上の成分は、他の方法、例えば、エレクトロポレーションによって送達され得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞及びＮＫ細胞媒介性免疫応答及びマクロファージ貪食を制御するために、過剰発現につき追加の制御因子、例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１６（２１）：１０４４１－１０４４６（２０１９））が細胞にノックインされる。ノックインは、１つ又は複数のそのような因子（３）の発現カセットを担持する鋳型を使用して、更なるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを適用し、例えば、ｇＲＮＡ ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴを使用してＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをＡＡＶＳ１にターゲティングすることにより、セーフハーバー遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１にターゲティングすることによって達成され得る。
ＬＮＰは、４５０ｎｇ／μＬの総ｍＲＮＡ濃度で、１：１のＣＤ４＋：ＣＤ８＋比で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓによって活性化された初代Ｔ細胞を処理するために使用される。得られたＴ細胞集団は、組込み、発現、及び効果について分析される。組込みを評価するために、ｄｄＰＣＲは、組み込まれたＣＡＲ内から隣接ゲノムＴＲＡＣ配列に及ぶアンプリコンを生成するプライマーと共に使用される。シグナルを参照遺伝子（例えｂ、ＲＰＰ３０）と比較することで、ゲノムあたりの平均コピー数及び組込み効率を定量化できる。発現を分析するために、免疫学的プローブを用いたフローサイトメトリーを使用して、表面ＣＡＲ発現を示す細胞のレベル及び割合を評価する。ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を分析するために、処理された細胞は、同時プレーティングされた癌細胞殺傷アッセイによって評価される。ルシフェラーゼを発現するようにＮａｌｍ６ ＡＬＬ細胞を操作することにより、癌細胞死滅は、Ｎａｌｍ６細胞単独からのシグナルと比較して、ＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養後の発光の変化によって評価できる（Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０（３）：１５７８－１５８９（２０２０））．従って、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、所望の細胞傷害活性を備えたＣＡＲ－Ｔ細胞をエクスビボで生成できる。
実施例２９：インビボでＴ細胞にＣＡＲを組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ
この実施例は、遺伝子ペイロードの組込み及び安定した発現のためにインビボでＴ細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。具体的には、標的ナノ粒子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットをマウスＲｏｓａ２６遺伝子座に組み込んでマウスモデルでＣＡＲ－Ｔ細胞を生成できる、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達するために使用される。
この実施例は、遺伝子ペイロードの組込み及び安定した発現のためにインビボでＴ細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。具体的には、標的ナノ粒子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットをマウスＲｏｓａ２６遺伝子座に組み込んでマウスモデルでＣＡＲ－Ｔ細胞を生成できる、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達するために使用される。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるニッカーゼＣａｓ９及びＲ２Ｔｇ逆転写酵素ドメイン、ニッカーゼ活性を標的遺伝子座に向けるためのｇＲＮＡ、並びに５’から３’に
（１）第１鎖ニックの標的部位３’と１００ｎｔの相同性
（２）Ｒ２Ｔｇからの５’ＵＴＲ
（３）異種目的配列
（４）Ｒ２Ｔｇからの３’ＵＴＲ
（５）第１鎖ニックの標的部位５’と１００ｎｔの相同性
を含む鋳型ＲＮＡを含み、ここで、（３）は、ＥＦ１ａプロモータによって駆動されるＣＤ１９特異的ｍ１９４－１ＢＢｚ ＣＡＲのコード配列を含む（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２（８）：８１３－８２０（２０１７））。この実施例のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ｇＲＮＡ、例えば、ＡＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡ（配列番号１６９５）を使用して、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座に誘導される（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３（５）：５４３－５４８（２０１５））。ＲＮＡ分子の産生は、本明細書で提供される例に従って、例えば、インビトロ転写（例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ）及び化学合成（例えば、ｇＲＮＡ）による。システムのＲＮＡ成分への修飾は、他所に記載されるとおりである。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｍ ＲＮＡについて、配列は更に、５’ＵＴＲ（例えば、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１６０４））及び３’ＵＴＲ（例えば、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号１６０５））を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのこの組合せは、作動可能に連結したＯＲＦの良好な発現をもたらすことが明らかにされている（Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７））。
（１）第１鎖ニックの標的部位３’と１００ｎｔの相同性
（２）Ｒ２Ｔｇからの５’ＵＴＲ
（３）異種目的配列
（４）Ｒ２Ｔｇからの３’ＵＴＲ
（５）第１鎖ニックの標的部位５’と１００ｎｔの相同性
を含む鋳型ＲＮＡを含み、ここで、（３）は、ＥＦ１ａプロモータによって駆動されるＣＤ１９特異的ｍ１９４－１ＢＢｚ ＣＡＲのコード配列を含む（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２（８）：８１３－８２０（２０１７））。この実施例のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ｇＲＮＡ、例えば、ＡＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡ（配列番号１６９５）を使用して、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座に誘導される（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３（５）：５４３－５４８（２０１５））。ＲＮＡ分子の産生は、本明細書で提供される例に従って、例えば、インビトロ転写（例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ）及び化学合成（例えば、ｇＲＮＡ）による。システムのＲＮＡ成分への修飾は、他所に記載されるとおりである。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒｍ ＲＮＡについて、配列は更に、５’ＵＴＲ（例えば、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１６０４））及び３’ＵＴＲ（例えば、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号１６０５））を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのこの組合せは、作動可能に連結したＯＲＦの良好な発現をもたらすことが明らかにされている（Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７））。
Ｔ細胞への特異的な送達を達成するために、ＣＤ４に対する共役ｍＡｂを輸送する標的ＬＮＰ（ｔＬＮＰ）が生成される。例えば、Ｒａｍｉｓｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（７）：６７０６－６７１６（２０１５）を参照されたい。代わりに、ＣＤ３に対するｍＡｂの共役を使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を標的とすることができる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２（８）：８１３－８２０（２０１７））。他の実施形態では、インビボでＴ細胞に送達するために使用されるナノ粒子は、Ｌｏｋｕｇａｍａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ ３１（４１）：ｅ１９０２２５１（２０１９）によって教示されるような、ターゲティングリガンドを欠く拘束されたナノ粒子である。
ｔＬＮＰは、まず、核酸ミックス（例えば、１：４０：４０のポリペプチドｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ：鋳型ＲＮＡのモル比）と、脂質の混合物（コレステロール、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マレイミド）を調製し、次に、所望のＤＴＴ還元ｍＡｂ（例えば、抗ＣＤ４、例えば、クローンＹＴＳ．１７７）をＬＮＰ上のマレイミド官能基に化学共役させることによって作製することができる。Ｒａｍｉｓｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（７）：６７０６－６７１６（２０１５）を参照されたい。
６～８週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、製剤化されたＬＮＰを１ｍｇ ＲＮＡ／ｋｇ体重の用量で静脈内注射する。投与後１日目及び３日目に血液をヘパリンコーティング収集チューブに採取し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して密度遠心分離により白血球を単離する。投与の５日後、動物を安楽死させ、Ｔ細胞分析のために血液及び器官（脾臓、リンパ節、骨髄細胞）を採取する。抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現は、特定の免疫学的選別を使用したＦＡＣＳによって検出される。陽性細胞は、選別された集団でのｄｄＰＣＲによる組込みについて確認され、ここで、組込み接合部に隣接するプライマーが使用される。例えば、組み込まれたカーゴにアニーリングする対の一方のプライマーと、Ｒｏｓａ２６標的部位からのゲノムＤＮＡにアニーリングするもう一方のプライマーが使用される。
実施例３０：レトロトランスポザーゼのＤＮＡ結合モチーフの突然変異が、その天然部位における統合を防止する
この実施例において、レトロトランスポゾンベースのＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインの内因性ＤＮＡ結合特性が、領域の突然変異誘発又は切断によって分析される。この突然変異体の生成及び低下した活性の検出が、ＤＮＡ標的化の決定因子を理解するため、並びに異種ＤＮＡ結合ドメインによって可能になる融合のための骨格としてその後使用され得る、低下した又は除去された機能を有する突然変異体誘導体を生成するために有用である。ここで、Ｃ末端亜鉛フィンガードメイン、並びにｃ－ｍｙｂドメインにおける突然変異が、その天然認識配列におけるＲ２Ｔｇレトロトランスポザーゼの酵素活性に対する顕著な影響を有することが示される。
この実施例において、レトロトランスポゾンベースのＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインの内因性ＤＮＡ結合特性が、領域の突然変異誘発又は切断によって分析される。この突然変異体の生成及び低下した活性の検出が、ＤＮＡ標的化の決定因子を理解するため、並びに異種ＤＮＡ結合ドメインによって可能になる融合のための骨格としてその後使用され得る、低下した又は除去された機能を有する突然変異体誘導体を生成するために有用である。ここで、Ｃ末端亜鉛フィンガードメイン、並びにｃ－ｍｙｂドメインにおける突然変異が、その天然認識配列におけるＲ２Ｔｇレトロトランスポザーゼの酵素活性に対する顕著な影響を有することが示される。
Ｒ２Ｔｇ ＤＮＡ結合突然変異体が、除去されたＤＮＡ結合活性をもたらしたかどうかを試験するために、例示的な突然変異体を構築し、標的ＤＮＡ結合活性の下流の読み取りとして天然ｒＤＮＡ標的部位における統合活性について評価した。この実施例において、親及び突然変異（＊）ドメインが、以下のように命名され、設計された：
これらのドメインの一般的な構造が、図３０Ａに示される。ここで、突然変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型内でコードし、これは、本発明に記載されるように、ポリペプチドコード配列が、Ｒ２Ｔｇ由来の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ及び天然標的部位に対する１００ｎｔの相同性によってさらに隣接されたことを意味する。
Ｒ２Ｔｇ ＤＮＡ結合ドメインにおける突然変異が、Ｒ２Ｔｇ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ機能に影響を与えたかどうかを試験するために、親Ｒ２Ｔｇポリペプチド、エンドヌクレアーゼ不活性化突然変異体（Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ活性のための陰性対照）、各単一のＤＢＤ突然変異、又は全ての３つのＤＢＤ突然変異を含む２５０ｎｇのプラスミドを、製造業者のプロトコルにしたがって、プログラムＤＳ１５０とともにＬｏｎｚａ Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６ Ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの後、細胞を、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出の前に３日間にわたって３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。抽出されたｇＤＮＡを、ｄｄＰＣＲによって天然ｒＤＮＡ部位においてＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ鋳型統合について測定した。ここで、ＺＦ１、ＺＦ２、又はｃ－ｍｙｂドメインにおける突然変異が、統合を阻害したことが観察され、ここで、効果の程度は、ＺＦ２＞ｃ－ｍｙｂ＞ＺＦ１であった（図３０Ｂ）。
実施例３１：インデルシグネチャによるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒのエンドヌクレアーゼドメインの切断部位の決定
この実施例は、ゲノムＤＮＡ標的上にエンドヌクレアーゼ（ＥＮ）ドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの切断活性の部位を決定するための細胞ベースのアッセイを記載する。具体的には、レトロトランスポザーゼの活性が、標的ニックの宿主ＤＮＡ修復に起因する可能性が高い低いレベルの標的部位修飾を生成し得ることが示される。非常に高感度の標的化されたアンプリコンシーケンシングアッセイを用いることによって、このシグネチャは、切断の部位を限局することが評価され得る。関連するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムにおける初期の工程を迅速に評価する能力が、システムの他の特性によって影響され得る完全な統合に依存せずに、酵素のＤＮＡ特異性、例えば、配列特異的ＤＮＡ結合又は配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を理解及び操作するためのアッセイを可能にする。
この実施例は、ゲノムＤＮＡ標的上にエンドヌクレアーゼ（ＥＮ）ドメインを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの切断活性の部位を決定するための細胞ベースのアッセイを記載する。具体的には、レトロトランスポザーゼの活性が、標的ニックの宿主ＤＮＡ修復に起因する可能性が高い低いレベルの標的部位修飾を生成し得ることが示される。非常に高感度の標的化されたアンプリコンシーケンシングアッセイを用いることによって、このシグネチャは、切断の部位を限局することが評価され得る。関連するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムにおける初期の工程を迅速に評価する能力が、システムの他の特性によって影響され得る完全な統合に依存せずに、酵素のＤＮＡ特異性、例えば、配列特異的ＤＮＡ結合又は配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を理解及び操作するためのアッセイを可能にする。
切断部位プロファイルを生成するために、アッセイが、レトロトランスポザーゼＲ２Ｔｇの予測される切断部位におけるゲノム配列修飾を分析するために作成された。予測されるＤＮＡ結合領域及びエンドヌクレアーゼ切断の予想される部位を示すＲ２Ｔｇの標的配列の概略図が、図３１Ａに示される。Ｒ２Ｔｇエンドヌクレアーゼ活性が、予測される標的部位の周りで検出され得るかどうかを決定するために、７３ｎｇのＲ２Ｔｇ発現プラスミドを、製造業者の説明書にしたがって、プログラムＤＮ１００及びＡｍａｘａ Ｌｏｎｚａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒの緩衝液ＳＥを用いて、２００，０００個のＵ２ＯＳ細胞中にヌクレオフェクトした。細胞を、ゲノムＤＮＡの抽出の前に、ヌクレオフェクション後の３日間にわたって１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。アンプリコンを、ｒＤＮＡ標的部位（５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴａｇｇｇｇａａｔｃｃｇａｃｔｇｔｔｔａａｔｔａ－３’及び５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴｃａｃｃｔｃｔｃａｔｇｔｃｔｃｔｔｃａｃｃｇ－３’）に隣接するプライマーを用いて生成した。アンプリコンシーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いて行い、結果を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いて分析して、標的部位における突然変異シグネチャを決定した（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７（３）：２２４－２２６（２０１９））。挿入及び欠失が、予測されるＧＧ切断部位において及び周囲で見られ、ここで、挿入シグネチャのピークは、予測されるＲ２Ｔｇ切断部位に直接存在する（図３１Ｂ）。これらのデータは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムにおけるエンドヌクレアーゼ活性の検出及び局在化のためのインデルシグネチャアッセイの使用を実証した。
実施例３２：レトロトランスポザーゼエンドヌクレアーゼドメインの配列特異性の改良
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムに関連するエンドヌクレアーゼ活性の配列特異性を説明するための実験を記載する。具体的には、エンドヌクレアーゼ活性のために重要なＤＮＡ標的配列情報が、切断の部位における又はその周囲の様々なサイズの領域の標的化突然変異誘発によって説明される。ここで、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポザーゼの天然エンドヌクレアーゼドメインの配列特異性が、標的のこのライブラリーの切断活性を決定するために、天然又は改変Ｒ２Ｔｇ標的配列を有するゲノムランディングパッドを含む細胞におけるインデルシグネチャアッセイ（実施例３１を参照）を適用することによって概説される。
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムに関連するエンドヌクレアーゼ活性の配列特異性を説明するための実験を記載する。具体的には、エンドヌクレアーゼ活性のために重要なＤＮＡ標的配列情報が、切断の部位における又はその周囲の様々なサイズの領域の標的化突然変異誘発によって説明される。ここで、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポザーゼの天然エンドヌクレアーゼドメインの配列特異性が、標的のこのライブラリーの切断活性を決定するために、天然又は改変Ｒ２Ｔｇ標的配列を有するゲノムランディングパッドを含む細胞におけるインデルシグネチャアッセイ（実施例３１を参照）を適用することによって概説される。
この実施例において、細胞株を、Ｒ２クラスレトロトランスポゾンシステムがレトロトランスポジションを促進する天然標的部位に対応するｒＤＮＡ由来の配列を含むランディングパッドの安定した統合により生成した。これらのランディングパッドを、（１）ｒＤＮＡのＲ２領域からのｒＤＮＡ由来の配列を含む野生型標的配列；（２）Ｒ２切断部位における及びその周囲の１２－ｂｐの配列突然変異を伴う（１）からのランディングパッド；又は（３）実施例２に記載される１２ｂｐコンテキスト内で最小配列要件をさらに規定する（２）からの１２－ｂｐ配列内の一連の突然変異のいずれかを有するように設計した。ランディングパッドの完全なリストが、ＬａｎｄｉｎｇＰａｄｓの表に見出され、図３２Ｂに示される。これらの細胞株を生成するために、異なるランディングパッドのためのＤＮＡを合成し、ＧＦＰレポーターの下流のレンチウイルス遺伝子発現ベクターへとクローニングした（図３２Ａ）。ランディングパッドレンチウイルスベクターを、ランディングパッドのＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。形質導入のためのレンチウイルス粒子を生成するために、９μｇの配列確認プラスミド及び９μｇのレンチウイルスパッケージング混合物（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を、レンチウイルスパッケージング細胞株ＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、４８時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートし（２４時間の時点で１回の培地交換を含む）、ウイルス粒子含有培地を収集した。収集された培地を、０．２μｍのフィルタに通してろ過して、細胞残屑を除去し、Ｕ２ＯＳ細胞の形質導入に備えた。ウイルス含有ろ液を、ＤＭＥＭ中で希釈し、ポリブレンと混合して、８μｇ／ｍＬのポリブレンの最終濃度で、細胞形質導入のための希釈系列を用意した。レシピエントＵ２ＯＳ細胞を、４８時間にわたってウイルス含有培地中で増殖させ、次に、新鮮な培地と分割し、コンフルエンスまで増殖させた。異なる希釈のウイルスの形質導入効率を、フローサイトメトリーによるＧＦＰ発現及びｄｄＰＣＲによって測定して、統合されたレンチウイルスランディングパッドの平均コピー数を決定した。
Ｒ２切断位置において及びその周囲に様々な突然変異を有する標的部位に対してエンドヌクレアーゼ活性を示すＲ２Ｔｇレトロトランスポザーゼの能力を、インデルプロファイリングを用いて評価した（実施例３１）。具体的には、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポザーゼを含む７３ｎｇのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド発現ベクターを、製造業者の説明書にしたがって、ヌクレオフェクションプログラムＤＮ１００とともにＬｏｎｚａ Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６ Ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅシステムを用いて、異なるＵ２ＯＳランディングパッド細胞株中にヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの後、細胞を、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出の前に、３日間にわたって３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。ランディングパッド配列（５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴｇｃｔｃａｃａｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇ－３’及び５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴｇｇａｔｇｔｇｃｔｇｃａａｇｇｃｇａｔｔ－３’）に特異的なプライマーを用いて、領域を増幅し、精製されたアンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑにおいてシーケンシングした。標的部位におけるエンドヌクレアーゼ活性のシグネチャを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いて、ランディングパッドにおける挿入及び欠失の検出によって分析した（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７（３）：２２４－２２６（２０１９））。実施例３１に示されたように、Ｒ２Ｔｇエンドヌクレアーゼ活性は、ＧＧ切断部位において存在する（図３１Ａ及びＢ）。一連のランディングパッドを用いて、試験されるポリペプチドのエンドヌクレアーゼ活性のために重要な最小配列が、このＧＧジヌクレオチド及び直ぐ上流に位置するさらなるＡＡジヌクレオチドを含み、天然標的配列内のエンドヌクレアーゼ活性のために重要な５’－ＡＡＧＧ－３’モチーフを画定することが分かった（図３２Ｂ）。いくつかの実施形態において、レトロトランスポザーゼベースのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを再標的化するためのヒトゲノム中の部位における天然エンドヌクレアーゼ特異的モチーフを見出すことが望ましいことがある。いくつかの実施形態において、ゲノム中の天然ＡＡＧＧ配列が、Ｒ２レトロトランスポザーゼベースのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを再標的化するためのシードとして使用され、ここで、新たな標的部位へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの結合が、エンドヌクレアーゼ活性を可能にするためのＡＡＧＧモチーフへのエンドヌクレアーゼドメインの適切な位置決めをもたらすように、ＤＮＡ結合ドメインが、突然変異され、又は異種ＤＮＡ結合ドメインで置換される。
表４１：実施例３２に記載されるような、野生型又は突然変異標的配列を含むランディングパッド。配列を、安定した統合のためにレンチウイルスベクターシステムを用いてゲノムに組み込んだ。表中の配列は、５’から３’配向で提供され、ここで、下線を引かれたテキストは、天然ｒＤＮＡ配列を示し、太字のテキストは、天然ｒＤＮＡ配列由来の突然変異を示す。
実施例３３：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを再標的化するための配列特異性の決定
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのポリペプチド成分を、その天然認識配列からヒトゲノムにおける新たな位置へと向け直すことを記載する。本開示に記載されるように、レトロトランスポザーゼベースのシステムが、異種ＤＮＡ結合ドメイン単独での付加又は内因性ＤＮＡ結合ドメインの突然変異誘発を伴う付加によって新たなＤＮＡ配列を認識するように指向され得る。ここで、天然ヒトＡＡＶＳ１部位を標的化することが可能な亜鉛フィンガーが、ＡＡＶＳ１配列の認識を与えるために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドに融合される。
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのポリペプチド成分を、その天然認識配列からヒトゲノムにおける新たな位置へと向け直すことを記載する。本開示に記載されるように、レトロトランスポザーゼベースのシステムが、異種ＤＮＡ結合ドメイン単独での付加又は内因性ＤＮＡ結合ドメインの突然変異誘発を伴う付加によって新たなＤＮＡ配列を認識するように指向され得る。ここで、天然ヒトＡＡＶＳ１部位を標的化することが可能な亜鉛フィンガーが、ＡＡＶＳ１配列の認識を与えるために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドに融合される。
Ｒ２Ｔｇレトロトランスポザーゼを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを、その天然ｒＤＮＡ標的配列と異なるＤＮＡ配列に指向するために、ヒトＡＡＶＳ１部位を標的化する亜鉛フィンガー（ＺＦ）ドメインを、ポリペプチドのＮ末端に融合した。実施例３２と同様の手法を用いて、ＺＦによって認識されるＡＡＶＳ１配列及びＲ２レトロトランスポザーゼによって認識される天然ｒＤＮＡ標的配列の様々な組合せを表すゲノムランディングパッドの様々な組成物を含む細胞を生成した。全体で、ライブラリーは、異なる長さのｒＤＮＡ配列とともにＡＡＶＳ１配列を含む４６０の個別のランディングパッドからなり、これは、２つの配列間の距離及び配向を変化させることによってさらに多様化される（図３３）。この実施例において、全てのランディングパッドを、ＡＡＶＳ１ ＺＦ結合部位を含むヒトＡＡＶＳ１ゲノム配列を含むように設計した。さらに、Ｒ２Ｔｇエンドヌクレアーゼ活性のために重要な最小ＡＡＧＧ配列を含むｒＤＮＡ配列（実施例３２を参照）を、以下のパラメータにしたがって、ＡＡＶＳ１配列に付加した：（１）ｒＤＮＡ配列は、ＡＡＧＧテトラヌクレオチドの直ぐ３’側に位置する１２、２２、３２、４２、５２、６２、若しくは７２ｎｔのｒＤＮＡ配列を含み；又は（２）ｒＤＮＡ配列は、ＡＡＧＧ切断部位の直ぐ３’及び５’側の１２、２２、３２、若しくは４２ｎｔを含み、２４、４４、６４、若しくは８４ｎｔの全ｒＤＮＡ長さをもたらす。異なるｒＤＮＡ配列を、組成物を、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５ｎｔの距離を含む、ＡＡＶＳ１ ＺＦ結合部位から様々な距離にさらに配置した。設計検討事項が、ＰＣＲ増幅中のバイアスを防ぐために、アッセイプライマー間のランディングパッド部位の全長を一定に保持するために含まれ、例えば、より長いｒＤＮＡ配列は、より短いｒＤＮＡ配列と、ＡＡＶＳ１部位から同じ距離で配置することはできない。最終体な変動として、上述されるｒＤＮＡ配列組成物が、順配向又は逆配向のいずれかで、ＡＡＶＳ１部位の上流又は下流のいずれかに配置されるように、２つの部位間の配向が変化された。これらのパラメータを用いて、完全長ｒＤＮＡ配列及びＡＡＶＳ１配列（陽性）又はｒＤＮＡ配列なし（陰性）の様々な組合せを含む対照とともに、４５４ ＡＡＶＳ１－ｒＤＮＡハイブリッドランディングパッドのライブラリーが設計された。ランディングパッド設計手法の例示的な図が、図３３に示され、特定の組成物を示す例示的なランディングパッド配列の短いリストが、表４２に示される。
上述されるレンチウイルス構築物ライブラリーを、配列解析のための３’バーコードを用いて合成し、レンチウイルス遺伝子発現ベクター中にクローニングした。次に、レンチウイルスシステムを用いて、実施例３２に記載されるように、統合されたランディングパッドを用いてＵ２ＯＳ細胞株を生成した。成功したライブラリー生成を実証するために、Ｕ２ＯＳランディングパッド細胞株プールを、ランディングパッド図について分析した。保存ランディングパッド配列に特異的なプライマー（実施例３２を参照）を用いて、構築物特異的バーコードを含む標的領域にわたって増幅した。各ランディングパッド中に存在するバーコードを、計算的に逆多重化し、ソートし、ここで、ランディングパッドの約９４％が、少なくとも１０，０００リードによって表される（図３４）。
ライブラリーの実証の後、Ｕ２ＯＳランディングパッド細胞を用いて、Ｒ２ＴｇレトロトランスポザーゼベースのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを再標的化するための最小配列決定因子を決定した。２つの再標的化構築物を、完全長Ｒ２Ｔｇ（配列番号１６７２）（ＺＦ－Ｒ２Ｔｇ、図３５Ａ）又はＤＮＡ結合ドメイン切断Ｒ２Ｔｇ配列番号１６６３）（ＺＦ－Ｒ２Ｔｇ（ｎｏＤＢＤ）、図３６Ａ）のいずれかへのＺＦ－ＡＡＶＳ１のコード配列の融合によって生成し、対応する発現プラスミドを、Ｕ２ＯＳプールされたランディングパッド細胞中に電気穿孔した。具体的には、４００ｎｇのＺＦ－Ｒ２Ｔｇ又はＺＦ－Ｒ２Ｔｇ（ｎｏＤＢＤ）のいずれかを、製造業者の説明書にしたがって、ヌクレオフェクションプログラムＤＮ１００とともにＬｏｎｚａ Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６ Ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅシステムを用いて、細胞に送達した。ヌクレオフェクションの後、細胞を、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出の前に、３日間にわたって３７℃、５％のＣＯ２で増殖させた。上記のライブラリーの実証と同様に、ランディングパッド配列に特異的なプライマーを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いてアンプリコンシーケンシングのための標的領域を増幅した。ランディングパッド変異体に対するシーケンシングリードを、関連するバーコードを用いてまず逆多重化し、次に、標的部位におけるエンドヌクレアーゼ活性のシグネチャを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いて、挿入及び欠失の検出によって分析した（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７（３）：２２４－２２６（２０１９））。
ＺＦ－Ｒ２Ｔｇ構築物が、完全長Ｒ２Ｔｇタンパク質を含むことを考慮すると、このポリペプチドが、その天然標的配列を認識する能力をまだ保持するであろうことが予測された。ＧＧ標的部位における挿入頻度を計算し、各ランディングパッドについてプロットした（図３５Ａ）。２００ｎｔのｒＤＮＡ配列を含む陽性対照ランディングパッドが、実施例３１にあるように、ＧＧ切断部位において挿入シグネチャを含むことが分かった。ｒＤＮＡ配列を欠く陰性対照ランディングパッドは、挿入を有することが認められなかった。ここで、標的切断部位におけるＺＦ－Ｒ２Ｔｇエンドヌクレアーゼ活性から得られる挿入シグネチャが、４４、６４、及び８４ｎｔの天然ｒＤＮＡ標的配列を含むランディングパッドにおいて検出されたが、わずか２４ｎｔの天然ｒＤＮＡ標的配列を含むものでは検出されなかった（図３５Ａ及びＢ）。試験で陽性になるこれらのｒＤＮＡ配列長さは、ＡＡＶＳ１配列からの異なる距離を有するランディングパッドにわたって陽性であることが示された。
次に、その内因性ＤＮＡ結合ドメインを欠き、標的結合及び活性についてＺＦに依存すると予測されるＺＦ－Ｒ２Ｔｇ（ｎｏＤＢＤ）構築物を、同様に評価した。ＧＧ標的部位における挿入頻度を計算し、各ランディングパッドについてプロットした（図３６Ａ）。ｒＤＮＡ配列を欠く陰性対照ランディングパッドは、挿入を有することが認められなかった。この構築物中のＲ２Ｔｇタンパク質が、かなりの欠失を含んでいたことを考慮すると、活性を確認するための陽性対照ランディングパッド構成はなかった。この実験において、２つの異なるランディングパッド構成が、ＧＧ標的部位におけるインデルシグネチャを示した。両方のヒットが、同じ４４ｎｔのｒＤＮＡ配列を含んでいたが、ＡＡＶＳ１部位に対して異なって位置決めされ、ここで、一方は、ＡＡＶＳ１部位の５５ｎｔ上流の距離でｒＤＮＡ標的を有し、他方は、ＡＡＶＳ１部位の２０ｎｔ下流の距離で及び逆相補配向であった（図３６Ａ及びＢ）。異なる組成を有するにもかかわらず、これらの２つのヒットは、ヒトゲノム中の天然遺伝子座を標的とすることが知られている異種ＤＮＡ結合ドメイン融合とともに、欠失した内因性ドメインを補うことによって、Ｒ２レトロトランスポザーゼＤＮＡ結合ドメイン突然変異体の活性の回復を示した。さらに、この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを、ヒトゲノム中の別の配列に再標的化するための要件のさらなる精緻化のための方法を確立する。
表４２は、Ｒ２ＴｇレトロトランスポザーゼへのＡＡＶＳ１亜鉛フィンガー融合を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを試験するように設計された例示的なランディングパッド標的配列の選択を提供し、これは、本明細書、例えば、この実施例に示される。含まれるのは、１）ＡＡＶＳ１亜鉛フィンガー認識配列及びＲ２切断部位を中心とするｒＤＮＡからの完全な２００ｎｔ領域を含む陽性対照；２）ｒＤＮＡ配列を欠く陰性対照；３）ＡＡＶＳ１配列の上流に位置する４４ｎｔのｒＤＮＡ配列；及び４）ＡＡＶＳ１配列の下流に及び逆配向で位置する４４ｎｔのｒＤＮＡ配列である。本明細書に含まれる２つの実験的ランディングパッドは、その内因性Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体Ｒ２Ｔｇに融合された亜鉛フィンガーを用いてＡＡＧＧコア配列の切断を可能にすることが示されており、例えば、この実施例を参照されたい。リボソームＤＮＡ配列は、下線を引かれたテキストによって示され、ＡＡＧＧコアは、括弧によって示され、ＡＡＶＳ１亜鉛フィンガーの結合配列は、小文字のテキストによって示される。
実施例３４：アルデヒド含有量を低減した脂質試薬の選択
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ成分核酸を含む脂質ナノ粒子製剤における下流での使用のために脂質が選択され、脂質は、混入アルデヒドの非存在又は低レベルであることに少なくとも部分的に基づいて選択される。脂質試薬中の反応性アルデヒド基は、ＬＮＰ製剤化中に、成分核酸、例えばＲＮＡ、例えば鋳型ＲＮＡに化学修飾を引き起こし得る。従って、一部の実施形態では、脂質試薬のアルデヒド含有量が最小限に抑えられる。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ成分核酸を含む脂質ナノ粒子製剤における下流での使用のために脂質が選択され、脂質は、混入アルデヒドの非存在又は低レベルであることに少なくとも部分的に基づいて選択される。脂質試薬中の反応性アルデヒド基は、ＬＮＰ製剤化中に、成分核酸、例えばＲＮＡ、例えば鋳型ＲＮＡに化学修飾を引き起こし得る。従って、一部の実施形態では、脂質試薬のアルデヒド含有量が最小限に抑えられる。
タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を使用して、例えば、Ｚｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １２４（９）：１２９１－１２９５（１９９９）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、試薬のアルデヒド含有量を分離、特性決定、定量化できる。ここでは、各脂質試薬をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付す。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ法では、最初に脂質と１つ又は複数の不純物をＣ８ ＨＰＬＣカラムで分離し、続いて質量分析計でこれらの分子の検出及び構造決定を行う。アルデヒドが脂質試薬に存在する場合、アルデヒドと構造的に同一であるが、Ｃ１３及びＮ１５標識のためにより重いステープル同位体標識（ＳＩＬ）標準を使用して定量化される。適切な量のＳＩＬ標準を脂質試薬にスパイクする。次に、混合物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付す。混入アルデヒドの量は、ＳＩＬ標準の量とピーク比（未知／ＳＩＬ）を掛けることによって決定される。脂質試薬中の同定されたアルデヒドは、記載されているように定量化される。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤用に選択された脂質原料は、選択されたレベルを超える混入アルデヒド含有量を含まないことが見出される。一部の実施形態では、製剤化に使用される１つ又は複数、及び任意選択で全ての脂質試薬は、３％未満の総アルデヒド含有量を含む。一部の実施形態では、製剤化に使用される１つ又は複数、及び任意選択で全ての脂質試薬は、０．３％未満の任意の単一アルデヒド種を含む。一部の実施形態では、製剤に使用される１つ又は複数、及び任意選択で全ての脂質試薬は、０．３％未満の任意の単一アルデヒド種及び３％未満の総アルデヒド含有量を含む。
実施例３５：製剤中にアルデヒドによって引き起こされるＲＮＡ修飾の定量化
この実施例では、例えば、脂質試薬のアルデヒド混入によって引き起こされた化学修飾を検出するために、製剤化プロセス中に生じた可能性のある修飾の程度を決定するために、製剤化後にＲＮＡ分子を分析する（例えば、実施例３４を参照）。
この実施例では、例えば、脂質試薬のアルデヒド混入によって引き起こされた化学修飾を検出するために、製剤化プロセス中に生じた可能性のある修飾の程度を決定するために、製剤化後にＲＮＡ分子を分析する（例えば、実施例３４を参照）。
ＲＮＡ修飾は、例えば、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９：８２８－８４１（２０１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の方法に従って、リボヌクレオシドの分析によって検出することができる。このプロセスでは、ＲＮＡはヌクレオシドの混合物に消化され、次に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付される。調製後のＲＮＡはＬＮＰに含まれており、最初に８０％イソプロパノール中のＧｌｙｃｏＢｌｕｅと共沈させて脂質から分離する必要がある。遠心分離後、ＲＮＡを含むペレットを新しいエッペンドルフチューブに慎重に移し、そこに酵素のカクテル（ベンゾナーゼ、ホスホジエステラーゼ１型、ホスファターゼ）を加えて、ＲＮＡをヌクレオシドに消化する。エッペンドルフチューブを予熱したサーモミキサーに３７℃で１時間置く。得られたヌクレオシド混合物は、最初にＣ１８カラムでヌクレオシドと修飾ヌクレオシドを分離し、次にそれらを質量分析で検出するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって直接分析される。
脂質試薬中のアルデヒドが化学修飾を引き起こした場合、データ分析により、修飾ヌクレオシドがアルデヒドと関連付けられる。修飾ヌクレオシドは、Ｃ１３及びＮ１５標識のためにより重いことを除いてネイティブヌクレオシドと構造的に同一であるＳＩＬ標準を使用して定量化できる。適切な量のＳＩＬ標準をヌクレオシド消化物にスパイクし、それをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付す。修飾されたヌクレオシドの量は、ＳＩＬ標準の量とピーク比（未知／ＳＩＬ）を掛けることによって得られる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、全ての標的分子を同時に定量化できる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤化プロセス中の材料としてのより高純度の脂質試薬の使用と比較して、より高い混入アルデヒド含有量を有する脂質試薬の使用は、より高いレベルのＲＮＡ修飾を生じる。従って、好ましい実施形態では、許容レベル未満のＲＮＡ修飾を生じる高純度の脂質試薬が使用される。
実施例３６：ゲノムＤＮＡへの大きい挿入を可能にするＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）
この実施例は、ヌクレオチドの大きいストリングの挿入によりゲノム配列を変更するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。
この実施例は、ヌクレオチドの大きいストリングの挿入によりゲノム配列を変更するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子編集システムの使用を説明する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチド、ｇＲＮＡ、及び書込み鋳型は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされたＤＮＡとして提供される。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドは、ＤＮＡ結合機能及びエンドヌクレアーゼ機能の両方にＣａｓ９ニッカーゼを使用する。逆転写酵素機能は、Ｒ２レトロトランスポザーゼの進行性の高いＲＴドメインに由来する。書込み鋳型は、鋳型ＲＮＡの逆転写により、所望の挿入を含む新しいＤＮＡ鎖が生成されるように、所望の位置に遺伝子ペイロードを組み込みながら、標的配列と相同性を有するように設計されている。
ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞ＤＮＡに大きい挿入を生成するために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドを、Ｃａｓ９を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）を標的遺伝子座にターゲティングする特定のｇＲＮＡ、及び逆転写酵素と会合するためのＲＴ結合モチーフ（Ｒ２エレメントからの３’ＵＴＲ）を含む逆転写用の鋳型ＲＮＡ、逆転写をプライミングするための標的部位との相同性を有する領域、及び遺伝子ペイロード（ＧＦＰ発現ユニット）と一緒に使用する。この複合体は標的部位にニックを入れ、鋳型上でＴＰＲＴを実施し、ニックの部位にすぐ隣接する配列に相補的な鋳型上のプライミング領域を使用して反応を開始し、ＧＦＰペイロードをゲノムＤＮＡにコピーする。
トランスフェクション後、細胞を３日間インキュベートして、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを発現させ、ゲノムＤＮＡ標的を変換する。インキュベーション期間の後、ゲノムＤＮＡが細胞から抽出される。次に、ゲノムＤＮＡは、部位特異的プライマーを使用したＰＣＲベースの増幅に付され、アンプリコンは、製造者のプロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングされる。次に、配列分析を実施して、所望の編集を含むリードの頻度を決定する。
実施例３７：ゲノムＤＮＡへの大きな挿入を可能にするＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）
この実施例は、一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）経路が阻害されるヒト細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。
この実施例は、一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）経路が阻害されるヒト細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。
この実施例では、経路のコア成分であるＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＵＳＰ１に対するｓｉＲＮＡを使用して、ＳＳＴＲ経路を阻害する。非標的対照の対照ｓｉＲＮＡも含まれる。２００ｋ Ｕ２ＯＳ細胞は、３０ｐｍｏｌ（１．５μＭ）のｓｉＲＮＡ、並びにＲ２Ｔｇドライバー及び導入遺伝子プラスミド（トランス配置）でヌクレオフェクトされる。具体的には、Ｒ２Ｔｇ、ＲＴドメインに変異を有する対照Ｒ２Ｔｇ、又はエンドヌクレアーゼ不活性化変異を有する対照Ｒ２Ｔｇを発現する、２５０ｎｇのプラスミドを、１：４のモル比（ドライバー対導入遺伝子）で導入遺伝子と一緒に使用する。Ｕ２ＯＳ細胞のトランスフェクションは、プログラムＤＮ１００を使用してＳＥバッファーで実施する。ヌクレオフェクション後、細胞を完全培地で３日間培養する。ｇＤＮＡを３日目に採取し、ｄｄＰＣＲを実施してｒＤＮＡ部位での組込みを評価する。ｒＤＮＡでの導入遺伝子組込みは、コアＳＳＴＲ経路成分の非存在下で検出される。
実施例３８：ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子の製剤化
この実施例では、ホタルルシフェラーゼをコードするリポータｍＲＮＡを、異なるイオン化性脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分（イオン化性脂質、ヘルパー脂質、ステロール、ＰＥＧ）を脂質成分とともに１００％エタノールに溶解した。次に、イオン化性脂質ＬＩＰＩＤＶ００４又はＬＩＰＩＤＶ００５（表Ａ１）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００をそれぞれ使用して、これらを５０：１０：３８．５：１．５のモル比で調製した。イオン化性脂質ＬＩＰＩＤＶ００３（表Ａ１）を含むホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰは、それぞれＬＩＰＩＤＶ００３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用して、４５：９：４４：２のモル比で調製された。これらの製剤で使用されるホタルルシフェラーゼｍＲＮＡは、インビトロ転写によって産生され、ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードし、更に５’キャップ、５’及び３’ＵＴＲ、及びポリＡテールを含む。ｍＲＮＡは、同時転写キャッピングを用いたＴ７ＲＮＡポリメラーゼのインビトロ転写の標準条件下で合成されたが、ヌクレオチド三リン酸ＵＴＰは、反応においてＮ１－メチル－シュードウリジン三リン酸で１００％置換された。精製したｍＲＮＡを２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４に溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度にした。
この実施例では、ホタルルシフェラーゼをコードするリポータｍＲＮＡを、異なるイオン化性脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分（イオン化性脂質、ヘルパー脂質、ステロール、ＰＥＧ）を脂質成分とともに１００％エタノールに溶解した。次に、イオン化性脂質ＬＩＰＩＤＶ００４又はＬＩＰＩＤＶ００５（表Ａ１）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００をそれぞれ使用して、これらを５０：１０：３８．５：１．５のモル比で調製した。イオン化性脂質ＬＩＰＩＤＶ００３（表Ａ１）を含むホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰは、それぞれＬＩＰＩＤＶ００３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を使用して、４５：９：４４：２のモル比で調製された。これらの製剤で使用されるホタルルシフェラーゼｍＲＮＡは、インビトロ転写によって産生され、ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードし、更に５’キャップ、５’及び３’ＵＴＲ、及びポリＡテールを含む。ｍＲＮＡは、同時転写キャッピングを用いたＴ７ＲＮＡポリメラーゼのインビトロ転写の標準条件下で合成されたが、ヌクレオチド三リン酸ＵＴＰは、反応においてＮ１－メチル－シュードウリジン三リン酸で１００％置換された。精製したｍＲＮＡを２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４に溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度にした。
ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡは、脂質アミンとリン酸ＲＮＡ（Ｎ：Ｐ）のモル比が６のＬＮＰに製剤化された。ＬＮＰは、製造者の推奨設定を使用して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、脂質及びＲＮＡ溶液のマイクロ流体混合によって形成された。異なる流量を使用して、混合中、水性溶媒と有機溶媒の比率を３：１に維持した。混合後、ＬＮＰを収集し、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％スクロースバッファー中、４℃で一晩透析した。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、Ａｍｉｃｏｎ１０ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による遠心分離によって濃縮した。次に、得られた混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰは、更なる使用まで－８０℃で保存した。
調製されたＬＮＰは、サイズ、均一性、及び％ＲＮＡ封入について分析された。サイズ及び均一性の測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＤＬＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して、動的光散乱によって実施した。ＬＮＰは、平均粒子サイズ（ナノメートル、ｎｍ）及び多分散指数（ｐｄｉ）を決定するためにＤＬＳによって測定される前にＰＢＳで希釈された。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰの粒子サイズを表Ａ２に示す。
ルシフェラーゼｍＲＮＡの封入率は、蛍光ベースのＲＮＡ定量化アッセイＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定された。ＬＮＰサンプルを１×ＴＥバッファーで希釈し、製造者の推奨に従ってＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬と混合し、６４４ｎｍの励起波長及び６７３ｎｍの発光波長を使用して、ｉ３ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。封入率を決定するために、ＬＮＰは、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを使用して、インタクトなＬＮＰ及び破壊されたＬＮＰで測定された。ここで、粒子は、０．２％（ｗ／ｗ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む１×ＴＥバッファーでインキュベートして、粒子を破壊し、封入されたＲＮＡがリボグリーン試薬と相互作用できるようになった。サンプルをｉ３ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計で再度測定して、存在するＲＮＡの総量を決定した。ＬＮＰがインタクトであったときに検出されたＲＮＡの量から総ＲＮＡを差し引いて、封入された画分を決定した。値に１００を掛けて、封入率を決定した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎによって測定されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰ及びＲＮＡ封入率を表Ａ３に示す。
実施例３９：初代肝細胞におけるｍＲＮＡ－ＬＮＰのインビトロ活性試験
この実施例では、ルシフェラーゼリポータｍＲＮＡを含むＬＮＰを使用して、培養中の細胞にＲＮＡカーゴを送達した。初代マウス又は初代ヒト肝細胞を解凍し、コラーゲンでコーティングした９６ウェル組織培養プレートに、それぞれウェルあたり３０，０００又は５０，０００細胞の密度でプレーティングした。フェノールレッドを含まない１ｘウィリアム培地Ｅに細胞をプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。４時間後、培地を維持培地（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、フェノールを含まない１ｘウィリアム培地Ｅ）に交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰを４℃で解凍し、穏やかに混合した。ＬＮＰは、７．５％ウシ胎児血清を含有する維持培地で適切な濃度に希釈された。ＬＮＰを３７℃で５分間インキュベートした後、プレーティングした初代肝細胞に加えた。細胞へのＲＮＡカーゴの送達を評価するために、ＬＮＰを初代肝細胞と２４時間インキュベートし、次に、細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性アッセイのために溶解した。手短には、各ウェルから培地を吸引した後、１ｘＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを各ウェルから吸引し、２００μＬの受動溶解バッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＬＢ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに戻し、プレートシェーカー上に１０分間置いた。ＰＬＢ中に溶解した細胞を凍結し、ルシフェラーゼ活性アッセイを実施するまで－８０℃で保存した。
この実施例では、ルシフェラーゼリポータｍＲＮＡを含むＬＮＰを使用して、培養中の細胞にＲＮＡカーゴを送達した。初代マウス又は初代ヒト肝細胞を解凍し、コラーゲンでコーティングした９６ウェル組織培養プレートに、それぞれウェルあたり３０，０００又は５０，０００細胞の密度でプレーティングした。フェノールレッドを含まない１ｘウィリアム培地Ｅに細胞をプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。４時間後、培地を維持培地（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、フェノールを含まない１ｘウィリアム培地Ｅ）に交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ－ＬＮＰを４℃で解凍し、穏やかに混合した。ＬＮＰは、７．５％ウシ胎児血清を含有する維持培地で適切な濃度に希釈された。ＬＮＰを３７℃で５分間インキュベートした後、プレーティングした初代肝細胞に加えた。細胞へのＲＮＡカーゴの送達を評価するために、ＬＮＰを初代肝細胞と２４時間インキュベートし、次に、細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性アッセイのために溶解した。手短には、各ウェルから培地を吸引した後、１ｘＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを各ウェルから吸引し、２００μＬの受動溶解バッファー（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＬＢ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに戻し、プレートシェーカー上に１０分間置いた。ＰＬＢ中に溶解した細胞を凍結し、ルシフェラーゼ活性アッセイを実施するまで－８０℃で保存した。
ルシフェラーゼ活性アッセイを実施するために、パッシブ溶解バッファー中の細胞溶解物を解凍し、丸底９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、１５，０００ｇ、４℃で３分間遠心分離して細胞破片を除去した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従って使用して、各サンプルのタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度を使用して、細胞数を正規化し、ルシフェラーゼアッセイ用の溶解物の適切な希釈を決定した。ルシフェラーゼ活性アッセイは、製造者の指示に従ってルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、白壁９６ウェルマイクロタイタープレートで実施され、発光はｉ３Ｘ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定された。ホタルｍＲＮＡ－ＬＮＰによって媒介されるホタルルシフェラーゼ活性の用量応答の結果を図３７に示し、これは、培養中の初代細胞へのＲＮＡの成功したＬＮＰ媒介性送達を示す。図３７Ａに示されるように、実施例３８に従って製剤化されたＬＮＰは、実施例３９に従って、初代ヒト（Ａ）及びマウス（Ｂ）肝細胞へのカーゴの送達について分析された。ルシフェラーゼアッセイにより、細胞溶解物からの用量応答性ルシフェラーゼ活性が明らかになり、細胞へのＲＮＡの送達が成功し、ｍＲＮＡカーゴからホタルルシフェラーゼが発現したことが示された。
実施例４０：ＬＮＰを介したマウス肝臓へのＲＮＡ送達。
ホタルルシフェラーゼ含有粒子の肝臓へのＬＮＰ媒介性送達の有効性を測定するために、実施例６０に記載されるようにＬＮＰを製剤化し、特性決定し、マウスへの投与前（実施例３９）にインビトロで試験した。約８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）に、１ｍｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ．）経路を介してＬＮＰを投与した。ビヒクル対照動物には３００μＬリン酸緩衝生理食塩水を静脈内投与した。ＬＮＰの注射の３０分前に、５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンをマウスに腹腔内経路で注射した。組織は、ＬＮＰ投与後６、２４、４８時間の剖検で、１時点あたり５匹のマウス群サイズで収集した。肝臓及び他の組織サンプルを収集し、液体窒素で瞬間凍結し、分析まで－８０℃で保存した。
ホタルルシフェラーゼ含有粒子の肝臓へのＬＮＰ媒介性送達の有効性を測定するために、実施例６０に記載されるようにＬＮＰを製剤化し、特性決定し、マウスへの投与前（実施例３９）にインビトロで試験した。約８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）に、１ｍｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ．）経路を介してＬＮＰを投与した。ビヒクル対照動物には３００μＬリン酸緩衝生理食塩水を静脈内投与した。ＬＮＰの注射の３０分前に、５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンをマウスに腹腔内経路で注射した。組織は、ＬＮＰ投与後６、２４、４８時間の剖検で、１時点あたり５匹のマウス群サイズで収集した。肝臓及び他の組織サンプルを収集し、液体窒素で瞬間凍結し、分析まで－８０℃で保存した。
凍結肝臓サンプルをドライアイス上で粉砕し、溶解マトリックスＤビーズ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を含むホモジナイゼーションチューブに移した。氷冷１×ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（ＣＣＬＲ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各チューブに加え、サンプルをＦａｓｔＰｒｅｐ－２４ ５Ｇホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）中、６ｍ／ｓで４０秒間ホモジナイズした。サンプルを清潔な微量遠心チューブに移し、遠心分離によって清澄化した。ルシフェラーゼ活性アッセイの前に、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従って使用して、各サンプルにつき肝臓ホモジネートのタンパク質濃度を測定した。ルシフェラーゼ活性は、ｉ３Ｘ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して製造者の指示に従って、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して２００μｇ（総タンパク質）の肝臓ホモジネートで測定された。肝臓サンプルは、ＬＩＰＩＤＶ００５＞ＬＩＰＩＤＶ００４＞ＬＩＰＩＤＶ００３の順位に従ったリポータ活性で、全ての脂質製剤によるｍＲＮＡの送達の成功を明らかにした（図３８）。図３８に示すように、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ含有ＬＮＰを製剤化し、ｉｖによりマウスに送達し、肝臓サンプルを採取し、投与後６、２４、及び４８時間でルシフェラーゼ活性についてアッセイした。様々な製剤によるリポータ活性は、ＬＩＰＩＤＶ００５＞ＬＩＰＩＤＶ００４＞ＬＩＰＩＤＶ００３の順位に従った。ＲＮＡ発現は一過性で、酵素レベルは４８時間までにビヒクルのバックグラウンド近くに戻った。投与後。このアッセイは、これらのイオン化性脂質の使用と、肝臓への送達のためのＲＮＡシステム用のそれぞれの製剤を検証した。
例に限定されることは意図しないが、この実施例に記載された脂質及び製剤は、リポータｍＲＮＡを超えて他のＲＮＡ分子のインビボ送達の有効性をサポートする。全ＲＮＡ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、本明細書に記載の製剤によって送達することができる。例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、及び任意選択の第２のニックｇＲＮＡを用いる全ＲＮＡシステムが、ヌクレオフェクションによってゲノムをインビトロで編集することについて、修飾ヌクレオチドを用いて、リポフェクションによって、及び初代Ｔ細胞を編集することについて記載される。本出願に記載されるように、これらの全ＲＮＡシステムは、細胞免疫原性及び毒性における多くの独自の利点を有し、これは、不死化細胞培養細胞株と対照的に、より感受性の高い初代細胞、特に、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を扱うときに重要である。さらに、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの機能が、本明細書においてインビトロで複数の細胞型において実証され、標的化ＬＮＰとともに送達される他のＲＮＡシステムの機能が、当該技術分野において公知であることを考慮すると、これらの全てのＲＮＡシステムは、例えば、肝臓、肺、筋肉、免疫細胞、及びその他の送達のための本明細書において言及される新規な脂質送達システムを用いて、別の組織及び細胞型に標的化され得ると考えられる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムのインビボ送達は、例えば、病原性突然変異を補正する、多くの治療分野における大きな影響の可能性を有し）、保護的な変異体を導入し、身体に対して内因性の細胞、例えば、Ｔ細胞を強化する。適切な配合物を考慮すると、全ＲＮＡ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇは、患者においてインサイチュで細胞ベースの治療法の製造を可能にすると考えられる。
実施例４１：リンカー選択によるＣａｓ－ＲＴ融合の発現の改善
この実施例は、哺乳類細胞内のタンパク質発現を改善するためのＣａｓ－ＲＴ融合の最適化を実証する。新たな機能的ドメインの単純な置換による新規なＣａｓ－ＲＴ融合の構築は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの低い又は中程度の発現をもたらし得る。したがって、融合の修飾された形態が、様々なドメインに関して有利であり得ることが本明細書において考えられる。例によって限定されることを望むものではないが、新たな融合の発現及び安定性を改善するための１つのこのような手法は、リンカーライブラリーの使用による。ここで、Ｃａｓ－ＲＴ融合のＣａｓ及びＲＴドメイン間のペプチドリンカー配列は、リンカー配列のライブラリーを用いて変化される。より詳細には、表３８Ｂからのリンカーを用いて、低いタンパク質発現を以前に実証し、改善したＣａｓ－ＲＴタンパク質発現についてスクリーニングされるヒト細胞に送達されるＣａｓ９－ＲＴ融合構築物の新たな変異体を生成した。
この実施例は、哺乳類細胞内のタンパク質発現を改善するためのＣａｓ－ＲＴ融合の最適化を実証する。新たな機能的ドメインの単純な置換による新規なＣａｓ－ＲＴ融合の構築は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの低い又は中程度の発現をもたらし得る。したがって、融合の修飾された形態が、様々なドメインに関して有利であり得ることが本明細書において考えられる。例によって限定されることを望むものではないが、新たな融合の発現及び安定性を改善するための１つのこのような手法は、リンカーライブラリーの使用による。ここで、Ｃａｓ－ＲＴ融合のＣａｓ及びＲＴドメイン間のペプチドリンカー配列は、リンカー配列のライブラリーを用いて変化される。より詳細には、表３８Ｂからのリンカーを用いて、低いタンパク質発現を以前に実証し、改善したＣａｓ－ＲＴタンパク質発現についてスクリーニングされるヒト細胞に送達されるＣａｓ９－ＲＴ融合構築物の新たな変異体を生成した。
様々な程度の長さ、柔軟性、疎水性、及び二次構造を有する一連の２２のペプチドリンカー（表３８Ｂ）をまず用いて、元のリンカー（配列番号４８０）の置換によってＣａｓ－ＲＴ融合タンパク質の変異体を生成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２００ｎｇの単一ガイドＲＮＡプラスミドとともに約８００ｎｇの各Ｃａｓ９－ＲＴ融合プラスミドを用いて、２５０，０００個の細胞／ウェルのエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。Ｃａｓ９－ＲＴ融合の発現レベルを評価するために、細胞溶解物を、トランスフェクションの２日後の時点で収集し、Ｃａｓ９に対する一次抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。表３８Ｂに列挙されるリンカー１０（配列番号４６８）は、Ｃａｓ－ＲＴ融合発現（図３９）を有意に改善し、Ｃａｓ－ＲＴ発現に対するペプチドリンカー配列の潜在的に大きな影響を実証する。
例によって限定されることを望むものではないが、この実施例に記載される脂質及び配合物は、レポーターｍＲＮＡを超える、他のＲＮＡ分子のインビボ送達の有効性を裏付ける。全ＲＮＡ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、本明細書に記載される配合物によって送達され得る。例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、及び任意選択の第２のニックｇＲＮＡを用いる全ＲＮＡシステムは、ヌクレオフェクションによってゲノムインビトロを編集することについて、修飾ヌクレオチドを用いて、リポフェクションによって、及び初代Ｔ細胞を編集することについて記載される。本出願に記載されているように、これらの全ＲＮＡシステムには、細胞の免疫原性及び毒性において多くの特有な利点があり、これは、不死化細胞培養細胞株とは対照的に、より感受性の高い初代細胞、特に免疫細胞、例えばＴ細胞を扱う場合に重要である。更に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの機能がインビトロで複数の細胞型において検証されていること、及び標的ＬＮＰと共に送達される他のＲＮＡ系の機能が当技術分野で公知であることを考慮すると、これらの全ＲＮＡシステムは、例えば、肝臓、肺、筋肉、免疫細胞、及びその他への送達のために、本明細書で参照される新規脂質送達システムを使用して、別の組織及び細胞型が標的とされ得ることが企図される。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムのインビボ送達は、多くの治療分野（例えば、病原性変異の補正、保護バリアントの注入、及び体内の内因性細胞、例えば、Ｔ細胞の強化）で大きい影響を与える可能性がある。適切な製剤化があれば、全ＲＮＡ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇは、患者のインサイチュでの細胞ベースの治療剤の製造を可能にすると考えられている。
「約」、「少なくとも」、「未満」、及び「より多い」などの、本出願における一部のパラメータを表す全ての数値的境界について、この記載は、記載される値によって境界付けられる任意の範囲も必然的に包含することが理解されるべきである。したがって、例えば、「少なくとも１、２、３、４、又は５」という記載は、特に、範囲１～２、１～３、１～４、１～５、２～３、２～４、２～５、３～４、３～５、及び４～５なども表す。
非特許文献及び参照配列情報などの、本明細書に引用される全ての特許、出願、又は他の参考文献について、それら全体が、あらゆる目的のために並びに引用される提案のために参照により援用されることが理解されるべきである。参照により援用される文献と本出願との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先される。本出願に開示される参照遺伝子配列に関連する全ての情報、例えば、ゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能的注釈、対立遺伝子多型、及び参照ｍＲＮＡ（例えば、エキソン境界又は応答要素を含む）及びタンパク質配列（保存ドメイン構造など）を含む遺伝子ＩＤ又は受託番号（典型的に、ＮＣＢＩ受託番号を示す）、並びに化学物質参照番号（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ化合物、ＰｕｂＣｈｅｍ物質、又はＰｕｂＣｈｅｍ Ｂｉｏａｓｓａｙエントリ（その中の注釈を含む）、例えば、構造及びアッセイなど）は、全体が参照により本明細書に援用される。
本出願において使用される見出しは、便宜上のものであるに過ぎず、本出願の解釈に影響を与えるものではない。
Claims (4)
- ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
前記ポリペプチドが、核小体局在化シグナルを不活性化及び／又は欠失する突然変異を含む、システム。 - ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）例えば、第１のＺｎフィンガードメインを含む第１の標的ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）逆転写酵素ドメイン、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、及び（ｉｖ）前記第１の標的ＤＮＡ結合ドメインに対して異種である、例えば、第２のＺｎフィンガードメインを含む第２の標的ＤＮＡ結合ドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、（ａ）が、前記第１の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含む同様のポリペプチドより、標的細胞内のより少ない数の標的ＤＮＡ配列に結合し、例えば、ここで、前記第１のＤＮＡ結合ドメインとともに前記ポリペプチド中の前記第２の標的ＤＮＡ結合ドメインの存在が、前記第１の標的ＤＮＡ結合ドメインのみを含む前記ポリペプチドのポリペプチド標的配列特異性に対する、前記ポリペプチドの標的配列特異性を改善する、システム。 - ＤＮＡを調節するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
任意選択で、（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
前記システムが、前記標的ＤＮＡの第１の鎖を、少なくとも２回（例えば、２回）切断することが可能であり、
任意選択で、ここで、前記切断が、互いに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００ヌクレオチド離れている（及び任意選択で、互いに５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド以下離れている）、システム。 - 細胞、組織又は対象における標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法であって、システムを細胞に投与することを含み、前記システムが、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；並びに
（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列及び（ｉｉ）異種対象配列を含む鋳型ＲＮＡ（又は前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含み、
ここで、前記システムが、前記鋳型ＲＮＡ配列を、前記標的ＤＮＡ鎖中に逆転写し、それによって、前記標的ＤＮＡ鎖を修飾し、
ここで、前記細胞が、Ｒａｄ５１修復経路活性を低下させ、Ｒａｄ５１若しくは前記Ｒａｄ５１修復経路の構成要素の発現を低下させ、又は機能的Ｒａｄ５１修復経路を含まず、例えば、機能的Ｒａｄ５１遺伝子を含まず、例えば、前記Ｒａｄ５１遺伝子又は前記Ｒａｄ５１修復経路中の別の遺伝子の１つ又は両方のコピーを不活性化する突然変異（例えば、欠失）を含む、方法。
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