JP2023502473A - リコンビナーゼ組成物及び使用方法 - Google Patents

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Abstract

標的ゲノムを調節するための方法及び組成物が開示される。本開示は、例えば、インビボ又はインビトロで、細胞、組織若しくは対象におけるDNA配列内の1つ若しくは複数の位置で、DNA配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する(例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的DNA配列を挿入する)ための組成物、システム及び方法に関する。目的DNA配列は、例えば、コード配列、調節配列、遺伝子発現単位を含み得る。

Description

本開示は、宿主細胞、組織又は対象における1つ又は複数の位置のゲノムをインビボ又はインビトロで改変するための新規の組成物、システム及び方法に関する。特に、本発明は、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるように、例えばセリンリコンビナーゼ)を用いて、宿主ゲノムに外性遺伝因子を導入するための組成物、システム及び方法を特徴とする。
1.DNAを修飾するためのシステムであって、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸;及び
b)二本鎖挿入DNAであって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む二本鎖挿入DNA
を含むシステム。
2.DNAを修飾するためのシステムであって、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸;及び
b)挿入DNAであって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するヒト第1パラパリンドローム配列及びヒト第2パラパリンドローム配列であって、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、ヒト第1パラパリンドローム配列及びヒト第2パラパリンドローム配列と、
(ii)任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入DNA
を含むシステム。
2a.DNAを修飾するためのシステムであって、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸;及び
b)二本鎖挿入DNAであって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、任意選択で、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約30~70若しくは40~60ヌクレオチド或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む二本鎖挿入DNA
を含むシステム。
3.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
4.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
5.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
6.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
7.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
8.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
9.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
10.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
11.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
12.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
13.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1又は2に記載のシステム。
14.(a)及び(b)は、個別の容器内にある、実施形態1~13のいずれかに記載のシステム。
15.(a)及び(b)は、混合される、実施形態1~13のいずれかに記載のシステム。
15a.(b)は、線状二本鎖DNAを含む、実施形態1~15のいずれかに記載のシステム。
15b.(b)は、環状二本鎖DNAを含む、実施形態1~15のいずれかに記載のシステム。
15c.(b)は、
(iii)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合する第2DNA認識配列であって、第3パラパリンドローム配列及び第4パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第3及び第4パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第2DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第3及び第4パラパリンドローム配列間に位置する、第2DNA認識配列
を含む、実施形態15aに記載のシステム。
15d-a.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有する、実施形態15cに記載のシステム。
15d-b.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有さない(例えば、第2DNA認識配列は、第1DNA認識配列に対して少なくとも1つの置換、欠失又は挿入を含む)、実施形態15cに記載のシステム。
15d1.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態15d~bに記載のシステム。
15e.異種目的配列は、第1DNA認識配列及び第2DNA認識配列間に位置する、実施形態15c~15d1のいずれかに記載のシステム。
15f.Gene Writingシステムのポリペプチドをコードする第1環状RNAと、
Gene Writingシステムの鋳型核酸を含む第2環状RNAと
を含むシステム。
15g.DNAを修飾するためのシステムであって、
(a)ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、(i)逆転写酵素ドメイン、及び(ii)エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸;及び
(b)(i)ポリペプチドに結合する配列、(ii)異種目的配列、及び(iii)(a)(i)、(a)(ii)、(b)(i)又はそれらの組合せと異種であるリボザイムを含む鋳型核酸
を含むシステム。
15h.リボザイムは、(b)(i)と異種である、実施形態15gに記載のシステム。
15i.鋳型核酸は、(iv)例えば、(a)(i)、(a)(ii)、(b)(i)又はそれらの組合せに内在する第2リボザイムを含み、例えば、第2リボザイムは、(b)(i)に内在する、実施形態15g又は15hに記載のシステム。
15j.異種リボザイムは、(a)(i)、(a)(ii)、(b)(i)又はそれらの組合せに内在するリボザイムを置き換え、例えば、第2リボザイムは、(b)(i)に内在する、実施形態15g又は15hに記載のシステム。
15k.Gene WritingシステムのポリペプチドをコードするmRNAをさらに含む、実施形態15f~15jのいずれかに記載のシステム。
15l.Gene WritingシステムのポリペプチドをコードするDNAをさらに含む、実施形態15f~15kのいずれかに記載のシステム。
15m.Gene Writingシステムの挿入DNAを含むDNAをさらに含む、実施形態15f~15lのいずれかに記載のシステム。
15n.Gene Writingシステムの挿入DNA及びポリペプチドを含むDNAをさらに含む、実施形態15f~15mのいずれかに記載のシステム。
16.表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む細胞(例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞;又は原核生物細胞)。
16a.実施形態1~15eのいずれかに記載のシステムを含む細胞。
17.(i)リコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入DNAをさらに含む、実施形態16の細胞。
17a.(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、任意選択で、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約30~70若しくは40~60ヌクレオチド或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む、DNA認識配列と、
(ii)任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入DNAをさらに含む、実施形態16に記載の細胞。
18.細胞(例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞;又は原核生物細胞)であって、
(i)DNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む細胞(例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞;又は原核生物細胞)。
18a.染色体上において、
(i)約15~35又は20~30ヌクレオチドの第1パラパリンドローム配列であって、第1パラパリンドローム配列は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列或いは前記パラパリンドローム配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列内に存在する、第1パラパリンドローム配列と、
(ii)約15~35又は20~30ヌクレオチドの第2パラパリンドローム配列であって、第2パラパリンドローム配列は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列或いは前記パラパリンドローム配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列内に存在する、第2パラパリンドローム配列と、
(iii)(i)及び(ii)間に位置する異種目的配列と
を含む細胞(例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞;又は原核生物細胞)。
19a.DNA認識配列及び異種目的配列の両方は、染色体外核酸上に位置する、実施形態18に記載の細胞。
19.DNA認識配列は、異種目的配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90又は100ヌクレオチド以内にある、実施形態18又は19aのいずれかに記載の細胞。
19c.染色体外核酸は、
(iii)第2DNA認識配列であって、第3パラパリンドローム配列及び第4パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第3及び第4パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第2DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第3及び第4パラパリンドローム配列間に位置する、第2DNA認識配列
を含む、実施形態19a又は19のいずれかに記載の細胞。
19c1.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有する、実施形態19cに記載の細胞。
19c2.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有さない(例えば、第2DNA認識配列は、第1DNA認識配列に対して少なくとも1つの置換、欠失又は挿入を含む)、実施形態19cに記載の細胞。
19c3.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態19c2に記載の細胞。
19c4.染色体外核酸は、線状である、実施形態19c~19c3のいずれかに記載の細胞。
19c5.(iv)第3DNA認識配列であって、第5パラパリンドローム配列及び第6パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第5及び第6パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第3DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第5及び第6パラパリンドローム配列間に位置し、
第3DNA認識配列は、染色体上にある、第3DNA認識配列
を含む、実施形態19c~19c4のいずれかに記載の細胞。
19c6.第3DNA認識配列は、第1DNA認識配列、第2DNA認識配列又は第1及び第2DNA認識配列の両方と同じ配列を有さない(例えば、第3DNA認識配列は、第1及び/又は第2DNA認識配列に対して少なくとも1つの置換、欠失又は挿入を含む)、実施形態19c5に記載の細胞。
19c7.第3DNA認識配列は、第1DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態19c6に記載の細胞。
19c8.第3DNA認識配列は、第2DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態19c6又は19c7のいずれかに記載の細胞。
19c9.(v)第4DNA認識配列であって、第7パラパリンドローム配列及び第8パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第7及び第8パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又は前記パラパリンドローム領域に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第4DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第7及び第8パラパリンドローム配列間に位置し、
第4DNA認識配列は、第3DNA認識配列と同じ染色体上にある、第4DNA認識配列
を含む、実施形態19c5~19c8のいずれかに記載の細胞。
19c10.第4DNA認識配列は、第1DNA認識配列、第2DNA認識配列又は第1及び第2DNA認識配列の両方と同じ配列を有さない(例えば、第4DNA認識配列は、第1及び/又は第2DNA認識配列に対して少なくとも1つの置換、欠失又は挿入を含む)、実施形態19c9に記載の細胞。
19c11.第4DNA認識配列は、第1DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態19c10に記載の細胞。
19c12.第4DNA認識配列は、第2DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態19c10又は19c11のいずれかに記載の細胞。
19c13.第4DNA認識配列は、第3DNA認識配列と同じ配列を有する、実施形態19c9~19c12のいずれかに記載の細胞。
19c14.第4DNA認識配列は、第4DNA認識配列と同じ配列を有さない(例えば、第4DNA認識配列は、第3DNA認識配列に対して少なくとも1つの置換、欠失又は挿入を含む)、実施形態19c13に記載の細胞。
19c15.第4DNA認識配列は、第3DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態19c14に記載の細胞。
19c16.第3DNA認識配列及び第4DNA認識配列は、互いの5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800若しくは900塩基以内にあるか、又は染色体上の互いの1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10キロベース以内にある、実施形態19c10~19c15のいずれかに記載の細胞。
20.DNA認識配列は、染色体内にあり、異種目的配列は、染色体外核酸上にある、実施形態16a~18のいずれかに記載の細胞。
21.真核生物細胞である、実施形態16~20のいずれかに記載の細胞。
22.哺乳動物細胞である、実施形態21に記載の細胞。
23.ヒト細胞である、実施形態22に記載の細胞。
24.原核生物細胞(例えば、細菌細胞)である、実施形態16~20のいずれかに記載の細胞。
26.動物細胞(例えば、哺乳動物細胞)又は植物細胞である、実施形態25に記載の単離された真核生物細胞。
27.哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、実施形態26に記載の単離された真核生物細胞。
28.動物細胞は、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞又はシチメンチョウ細胞である、実施形態26に記載の単離された真核生物細胞。
29.植物細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞又はコメ細胞である、実施形態26に記載の単離された真核生物細胞。
30.真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)のゲノムを修飾する方法であって、細胞を、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸;及び
b)挿入DNAであって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む挿入DNA
と接触させるステップを含み、それにより真核生物細胞のゲノムを修飾する、方法。
30a.真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)のゲノムを修飾する方法であって、細胞を、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸;及び
b)挿入DNAであって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、任意選択で、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約30~70若しくは40~60ヌクレオチド或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む挿入DNA
と接触させるステップを含み、それにより真核生物細胞のゲノムを修飾する、方法。
31.真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、細胞を、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはポリペプチドをコードする核酸;及び
b)挿入DNAであって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む挿入DNA
と接触させるステップを含み、それにより、例えば実施例5のアッセイで測定されて、例えば真核生物細胞の集団の少なくとも約0.1%(例えば、少なくとも約0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の頻度で真核生物細胞のゲノムに異種目的配列を挿入する、方法。
31a.真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、細胞を、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはポリペプチドをコードする核酸;及び
b)挿入DNAであって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、任意選択で、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約30~70若しくは40~60ヌクレオチド或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む挿入DNA
と接触させるステップを含み、それにより、例えば実施例5のアッセイで測定されて、例えば真核生物細胞の集団の少なくとも約0.1%(例えば、少なくとも約0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の頻度で真核生物細胞のゲノムに異種目的配列を挿入する、方法。
32.(a)及び(b)は、個別又は一緒に投与される、実施形態30~31aのいずれかに記載の方法。
33.(a)は、(b)の投与前、それと同時又はその後に投与される、実施形態30~31aのいずれか1に記載の方法。
34.(a)は、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む、実施形態30~33のいずれかに記載の方法。
35.(a)の核酸と(b)の挿入DNAとは、同じ核酸分子上に位置する、例えば同じベクター上に位置する、実施形態34に記載の方法。
36.(a)の核酸と(b)の挿入DNAとは、別の核酸分子上に位置する、実施形態34に記載の方法。
37.細胞は、挿入DNAのDNA認識配列と適合性である唯一の内在性DNA認識配列を有する、実施形態30~36のいずれかに記載の方法。
38.細胞は、挿入DNAのDNA認識配列と適合性である2つ以上の内在性DNA認識配列を有する、実施形態30~36のいずれかに記載の方法。
38a.(b)の挿入DNAは、(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合する第2DNA認識配列を含み、
前記第2DNA認識配列は、第3パラパリンドローム配列及び第4パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第3及び第4パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第2DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第3及び第4パラパリンドローム配列間に位置する、実施形態30~38のいずれかに記載の方法。
38b.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有する、実施形態38aに記載の方法。
38c.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有さない(例えば、第2DNA認識配列は、第1DNA認識配列に対して少なくとも1つの置換、欠失又は挿入を含む)、実施形態38aに記載の方法。
38d.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態38cに記載の方法。
38e.異種目的配列は、第1DNA認識配列及び第2DNA認識配列間に位置する、実施形態38a~38dのいずれかに記載の方法。
38f.リコンビナーゼポリペプチドは、例えば、表30又は図1Aに列挙されるインテグラーゼを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
38g.リコンビナーゼポリペプチドは、表30に列挙されるインテグラーゼを含み、且つDNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列を含む、実施形態38fに記載の方法。
38h.リコンビナーゼポリペプチドは、Int101のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第475行又はアクセッションASN71805.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第475行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38i.リコンビナーゼポリペプチドは、Int78のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第371行又はアクセッションARW58518.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第371行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38j.リコンビナーゼポリペプチドは、Int79のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第360行又はアクセッションARW58461.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第360行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38k.リコンビナーゼポリペプチドは、Int30のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第436行又はアクセッションYP_009103095.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第436行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38l.リコンビナーゼポリペプチドは、Int3のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第1200行又はアクセッションYP_459991.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第1200行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38m.リコンビナーゼポリペプチドは、Int38のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第408行又はアクセッションYP_009223181.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第408行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38n.リコンビナーゼポリペプチドは、Int95のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第460行又はアクセッションAFV15398.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第460行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38o.リコンビナーゼポリペプチドは、Int51のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第159行又はアクセッションAOT24690.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第159行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
38p.リコンビナーゼポリペプチドは、Int18のアミノ酸配列(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第103行又はアクセッションAGR47239.1に対応する)を含み、任意選択で、DNA認識配列は、表2A、2B又は2Cの対応する行番号からの認識配列(例えば、第103行に列挙される)を含む、実施形態38f又は38gに記載の方法。
39.表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含む、単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
40.表3A、3B又は3Cのリコンビナーゼ配列に対して少なくとも1つの挿入、欠失又は置換を含む、実施形態39に記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
41.真核生物(例えば、哺乳動物、例えばヒト)ゲノム遺伝子座(例えば、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列に結合する、実施形態40に記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
41a.表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列に結合する、実施形態39又は40のいずれかに記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
42.表3A、3B又は3Cの対応する非修飾アミノ酸配列と比較して、ゲノム遺伝子座に対する親和性の少なくとも2、3、4又は5倍の増加を有する、実施形態40~41aのいずれかに記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
43.表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸。
44.表3A、3B又は3Cのリコンビナーゼポリペプチドと比較して、少なくとも1つの挿入、欠失又は置換を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、実施形態43に記載の単離された核酸。
45.アミノ酸配列のコドンは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞中の発現に関して改変されている(例えば、最適化されている)、実施形態43又は44に記載の単離された核酸配列。
46.異種プロモータ(例えば、哺乳動物プロモータ、例えば組織特異的プロモータ)、microRNA(例えば、組織特異的制限miRNA)、ポリアデニル化シグナル又は異種ペイロードをさらに含む、実施形態43~45のいずれかに記載の単離された核酸。
47.単離された核酸(例えば、DNA)であって、
(i)DNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む、単離された核酸(例えば、DNA)。
47a.単離された核酸(例えば、DNA)であって、
(i)(a)のリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、任意選択で、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約30~70若しくは40~60ヌクレオチド或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又は前記パラパリンドローム領域に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む、DNA認識配列と、
(ii)任意選択で、異種目的配列と
を含む単離された核酸(例えば、DNA)。
48.表3A、3B又は3Cのリコンビナーゼポリペプチドに結合する、実施形態47又は47aのいずれかに記載の単離された核酸。
48a.DNA認識配列(例えば、1つ又は複数のパラパリンドローム配列)は、表2A、2B又は左側領域又は右側領域列の配列に存在する認識配列(又はその一部)に対して少なくとも1つの挿入、欠失又は置換を含む、実施形態47~48のいずれかに記載の単離された核酸。
48b.DNA認識配列(例えば、パラパリンドローム領域)は、対応する非修飾DNA認識配列(例えば、パラパリンドローム領域)と比較して、リコンビナーゼポリペプチドに対する親和性の少なくとも2、3、4又は5倍の増加を有する、実施形態48aに記載の単離された核酸。
48c.リコンビナーゼポリペプチドは、対応する非修飾DNA認識配列(例えば、パラパリンドローム領域)と比較して、DNA認識配列(例えば、パラパリンドローム領域)でのリコンビナーゼ活性の少なくとも2、3、4又は5倍の増加を有する、実施形態48a又は48bのいずれかに記載の単離された核酸。
49.リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、及び
b)リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下において、細胞(例えば、本明細書に記載されるように、例えば真核生物細胞又は原核生物細胞)に核酸を導入するステップ
を含み、それによりリコンビナーゼポリペプチドを作製する、方法。
50.リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、
a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む細胞(例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞)を提供するステップ、及び
b)リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下において、細胞をインキュベートするステップ
を含み、それによりリコンビナーゼポリペプチドを作製する、方法。
51.DNA認識配列と異種配列とを含む挿入DNAを作製する方法であって、
a)核酸であって、
(i)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
(ii)異種目的配列と
を含む核酸を提供するステップ、及び
b)核酸の複製を可能にする条件下において、細胞(例えば、本明細書に記載されるように、例えば真核生物細胞又は原核生物細胞)に核酸を導入するステップ
を含み、それにより挿入DNAを作製する、方法。
51a.核酸は、
(iii)リコンビナーゼポリペプチドに結合する第2DNA認識配列であって、第3パラパリンドローム配列及び第4パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ第3及び第4パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第2DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第3及び第4パラパリンドローム配列間に位置する、第2DNA認識配列
を含む、実施形態51に記載の方法。
51b.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有する、実施形態51aに記載の方法。
51c.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と同じ配列を有さない(例えば、第2DNA認識配列は、第1DNA認識配列に対して少なくとも1つの置換、欠失又は挿入を含む)、実施形態51aに記載の方法。
51d.第1DNA認識配列は、第2DNA認識配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する、実施形態51cに記載の方法。
51e.異種目的配列は、第1DNA認識配列及び第2DNA認識配列間に位置する、実施形態51a~51dのいずれかに記載の方法。
51f.提供するステップは、クローニング技術(例えば、制限消化及び/又はライゲーション)を用いること、組換え技術を用いること又は核酸を取得すること(例えば、第三者提供者から)を含む、実施形態51~51eのいずれかに記載の方法。
52.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つの挿入、欠失又は置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
53.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのアミノ酸配列と比較して、N末端、C末端又はN及びC末端の両方に、切断を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
54.リコンビナーゼポリペプチドは、核局在化配列、例えば内在性核局在化配列又は異種核局在化配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
55.異種目的配列は、例えば、実施例5のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約0.1%(例えば、少なくとも約0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)の効率で細胞のゲノムに挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
56.異種目的配列は、例えば、実施例4のアッセイにより測定されて、挿入事象の少なくとも約1%(例えば、少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%若しくは100%)における細胞のゲノム内の部位(例えば、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む部位;及び/又は表3A、3B若しくは3Cに列挙されるリコンビナーゼの行番号に対応するもの)に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
57.細胞の集団(例えば、システムと接触させた)において、異種目的配列は、例えば、実施例5のアッセイにより測定されて、集団中の細胞の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%若しくは100%)における細胞のゲノム内の1~10、例えば1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、2~10、2~5、2~4、3~10、3~5若しくは5~10の部位(例えば、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む部位;及び/又は表3A、3B若しくは3Cに列挙されるリコンビナーゼの行番号に対応するもの)に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
58.システムと接触させた細胞の集団において、異種目的配列は、例えば、実施例4のアッセイにより測定されて、集団中の細胞の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%若しくは100%)における細胞のゲノム内の厳密に1つの部位(例えば、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む部位;及び/又は表3A、3B若しくは3Cに列挙されるリコンビナーゼの行番号に対応するもの)に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
59.異種目的配列は、例えば、実施例4のアッセイにより測定されて、細胞のゲノム内の1~10、例えば1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、2~10、2~5、2~4、3~10、3~5若しくは5~10の部位(例えば、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含む部位;及び/又は表3A、3B若しくは3Cに列挙されるリコンビナーゼの行に対応するもの)に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
60.リコンビナーゼポリペプチドは、挿入DNAに結合される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
61.リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を提供することにより提供される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
62.例えば、実施例5のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約0.1%(例えば、少なくとも約0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)のゲノム中への異種目的配列の挿入頻度をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
62a.例えば、実施例13のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約0.1%(例えば、少なくとも約0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)のゲノム中への異種目的配列の挿入頻度をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
62b.例えば、実施例7のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約0.1%(例えば、少なくとも約0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)のゲノム中への異種目的配列の挿入頻度をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
63.第1パラパリンドローム配列は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列に見出される配列に存在する15~35若しくは20~30ヌクレオチド、例えば13、14、15、16、17、18、19若しくは2015、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34若しくは35ヌクレオチドの第1配列又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
64.第2パラパリンドローム配列は、表2A、2B若しくは2C、13、14、15、16、17、18、19若しくは20の左側領域若しくは右側領域列に見出される配列に存在する15~35若しくは20~30ヌクレオチド、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34若しくは35ヌクレオチドの第2配列又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、実施形態63に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
65.挿入DNAは、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列に見出される第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する約2~20、例えば2~16ヌクレオチドを含むコア配列又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の置換、挿入若しくは欠失を有する配列をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
66.第1及び第2パラパリンドローム配列は、完全に回文の配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
67.第1及び/又は第2パラパリンドローム配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20の非回文位置を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
69.第1及び第2パラパリンドローム配列は、同じ長さである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
70.コア配列は、約2~20ヌクレオチド(例えば、2~16ヌクレオチド)長である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
71.コア配列、例えばコアジヌクレオチドは、ヒトゲノム中の対応する配列、例えばジヌクレオチド又はその逆相補鎖とハイブリダイズすることができる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
72.コア配列は、ヒトゲノム中の対応する配列と少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又は90%の同一性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
73.コア配列は、ヒトゲノム中の対応する配列に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15以下のミスマッチを有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
74.コア配列(例えば、コアジヌクレオチド)は、リコンビナーゼにより切断されると、粘着末端を形成し、これは、ヒトゲノム中の対応する配列とハイブリダイズすることができる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
75.異種目的配列は、真核生物遺伝子、例えば哺乳動物遺伝子、例えばヒト遺伝子、例えば血液因子(例えば、ゲノム因子I、II、V、VII、X、XI、XII若しくはXIII)又は酵素、例えばリソソーム酵素又は合成ヒト遺伝子(例えば、キメラ抗原受容体)を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
76.挿入DNAは、異種目的配列と、DNA認識配列とを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
77.挿入DNAは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
78.挿入DNAと、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、個別の核酸分子中に存在する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
79.挿入DNAと、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、同じ核酸分子中に存在する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
80.挿入DNAは、以下をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸:
(a)オープンリーディングフレーム、例えばポリペプチド、例えば酵素(例えば、リソソーム酵素)、血液因子、エキソンをコードする配列;
(b)非コード及び/又は調節配列、例えば転写モジュレーター、例えばプロモータ(例えば異種プロモータ)、エンハンサー、インシュレーターに結合する配列;
(c)スプライスアクセプター部位;
(d)ポリA部位;
(e)エピジェネティック修飾部位;
(f)遺伝子発現単位。
81.挿入DNAは、プラスミド、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター若しくはエピソームベクター)又は他の自己複製ベクターを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
82.細胞は、異種目的配列に含まれる内在性ヒト遺伝子を含まないか、又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
83.細胞は、異種目的配列により含まれる内在性ヒト遺伝子を含まない生物又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質を含まない生物に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
84.細胞は、内在性ヒトDNA認識配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
85.内在性ヒトDNA認識配列は、以下の基準:
(i)癌関連遺伝子から>300kbに位置すること;
(ii)miRNA/他の機能性小分子RNAから>300kbにあること;
(iii)5’遺伝子末端から>50kbにあること;
(iv)複製起点から>50kbにあること;
(v)任意の超保存エレメントから>50kbにあること;
(vi)低転写活性を有する(即ちmRNA+/-25kbがない);(vii)コピー数可変領域内ではないこと;
(viii)オープンクロマチン中にあること;及び/又は
(xi)例えば、ヒトゲノム中に1コピーを有し、ユニークであること
の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8又は9つを有するヒトゲノム内の部位に作動可能に連結しているか又はその中に位置する、実施形態84に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
85a.細胞は、第2内在性ヒトDNA認識配列を含む、実施形態84又は85のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
85b.第2内在性ヒトDNA認識配列は、以下の基準:
(i)癌関連遺伝子から>300kbに位置すること;
(ii)miRNA/他の機能性小分子RNAから>300kbにあること;
(iii)5’遺伝子末端から>50kbにあること;
(iv)複製起点から>50kbにあること;
(v)任意の超保存エレメントから>50kbにあること;
(vi)低転写活性を有する(即ちmRNA+/-25kbがない);(vii)コピー数可変領域内ではないこと;
(viii)オープンクロマチン中にあること;及び/又は
(xi)例えば、ヒトゲノム中に1コピーを有し、ユニークであること
の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8又は9つを有するヒトゲノム内の部位に作動可能に連結しており、例えばその中に位置する、実施形態85aに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
86.細胞は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
87.細胞は、植物細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
88.細胞は、遺伝子操作されていない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
89.細胞は、attB又はattP部位を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
89a.細胞(例えば、システムとの接触前)は、疑似認識配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
89b.細胞(例えば、システムとの接触前)は、厳密に1つの疑似認識配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
90.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cの単一アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
91.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cの複数のアミノ酸配列の全て又は一部を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
92.リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cの第1リコンビナーゼポリペプチド配列の一部からの第1アミノ酸配列と、表3A、3B又は3Cの異なる第2リコンビナーゼポリペプチド配列の一部からの第2アミノ酸配列とを含む、実施形態91に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
93.第1アミノ酸配列は、第1リコンビナーゼポリペプチドのドメイン(例えば、N-末端触媒ドメイン、リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン又はC-末端DNA結合ドメイン)に対応する、実施形態92に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
94.第2アミノ酸配列は、第2リコンビナーゼポリペプチドのドメイン(例えば、N-末端触媒ドメイン、リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン又はC-末端DNA結合ドメイン)、例えば第1アミノ酸配列のドメインと異なるドメインに対応する、実施形態92又は93のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
95.挿入DNAのコア配列の1つ又は複数は、ゲノムDNA中の標的認識配列のコアジヌクレオチドに一致するように(且つ任意選択でゲノムDNA中の非標的認識配列の少なくとも1つのコアジヌクレオチドに一致しないように)改変されたコアジヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
96.挿入DNAのコア配列の1つ又は複数は、表2A、2B又は2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する認識配列のコアジヌクレオチドに一致するように(且つ任意選択で表2A、2B又は2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する非標的認識配列の少なくとも1つのコアジヌクレオチドに一致しないように)改変されたコアジヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
100.リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクター、例えばAAVベクターである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
101.二本鎖挿入DNAは、ウイルスベクター、例えばAAVベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
102.リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、mRNAであり、任意選択で、mRNAは、LNP中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
103.二本鎖挿入DNAは、ウイルスベクターではなく、例えば、二本鎖挿入DNAは、トランスフェクション試薬中のネイキッドDNA又はDNAである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
104.リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、第1ウイルスベクター、例えば第1AAVベクター中にあり、及び
挿入DNAは、第2ウイルスベクター、例えば第2AAVベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
105.リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、mRNAであり、任意選択で、mRNAは、LNP中にあり、及び
挿入DNAは、ウイルスベクター、例えばAAVベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
106.リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、mRNAであり、
二本鎖挿入DNAは、ウイルスベクター中になく、例えば、二本鎖挿入DNAは、ネイキッドDNA又はトランスフェクション試薬中のDNAである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
107.挿入DNAは、少なくとも1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、20kb、30kb、40kb、50kb、60kb、70kb、80kb、90kb、100kb、110kb、120kb、130kb、140kb又は150kbの長さを有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
108.挿入DNAは、抗生物質耐性遺伝子又はいずれかの他の細菌遺伝子若しくは部分を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
R1.システムは、1つ又は複数の環状RNA分子(circRNA)を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R2.circRNAは、Gene Writerポリペプチドをコードする、実施形態R1に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R3.circRNAは、宿主細胞に送達される、実施形態R1~R2Aのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R4.circRNAは、例えば、宿主細胞中において、例えば宿主細胞の核中で線状化され得る、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R4A.circRNAは、切断部位を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R4A1.circRNAは、第2切断部位をさらに含む、任意の実施形態R4Aに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R4B.切断部位は、リボザイム、例えばcircRNA中に含まれるリボザイムにより(例えば、自己切断により)切断され得る、実施形態R4A又はR4A1に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R5.circRNAは、リボザイム配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R6.リボザイム配列は、例えば、宿主細胞中において、例えば宿主細胞の核中で自己切断することができる、実施形態R5に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R6A.リボザイムは、誘導性リボザイムである、実施形態R5~R6のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R7.リボザイムは、タンパク質応答性リボザイム、例えば核タンパク質、例えばゲノム相互作用タンパク質、例えばエピジェネティック修飾因子、例えばEZH2に対して応答性であるリボザイムである、実施形態R5~R6Aのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R8.リボザイムは、核酸応答性リボザイムである、実施形態R5~R7のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R8A.リボザイムの触媒活性(例えば、自己触媒活性)は、標的核酸分子(例えば、RNA分子、例えばmRNA、miRNA、ncRNA、lncRNA、tRNA、snRNA又はmtRNA)の存在下で活性化される、実施形態R8に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R9A.リボザイムは、標的タンパク質(例えば、MS2コートタンパク質)に対して応答性である、実施形態R5~R7のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R9B.標的タンパク質は、細胞質に局在するか又は核に局在する(例えば、エピジェネティック修飾因子又は転写因子)、実施形態R8Aに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R9C.リボザイムは、B2若しくはALUレトロトランスポゾンのリボザイム配列又はそれと少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態R5~R8のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R10A.リボザイムは、タバコ輪点ウイルスハンマーヘッドリボザイムの配列又はそれと少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態R5~R8のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R10B.リボザイムは、デルタ肝炎ウイルス(HDV)リボザイムの配列又はそれと少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態R5~R8のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R11.リボザイムは、標的細胞又は標的組織中で発現される部分により活性化される、実施形態R5~Xのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R12.リボザイムは、標的細胞内コンパートメント(例えば、核、核小体、細胞質又はミトコンドリア)中で発現される部分により活性化される、実施形態R5~Xのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
R4A.リボザイムは、環状RNA又は線状RNA中に含まれる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M1.システム、ポリペプチド及び/又はそれをコードするDNAは、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M2a.脂質ナノ粒子(又は複数の脂質ナノ粒子を含む製剤)は、反応性不純物(例えば、アルデヒド)を欠いているか、又は予め選択したレベル未満の反応性不純物(例えば、アルデヒド)を含む、実施形態M1に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M2.脂質ナノ粒子(又は複数の脂質ナノ粒子を含む製剤)は、アルデヒドを欠いているか、又は予め選択したレベル未満のアルデヒドを含む、実施形態M1に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M3.脂質ナノ粒子は、複数の脂質ナノ粒子を含む製剤中に含まれる、実施形態M1又はM2に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M4.脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む1つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態M3に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M5.脂質ナノ粒子製剤は、3%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む1つ又は複数の脂質試薬を用いて産生される、実施形態M4に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M6.脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む1つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態M3~M5のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M7.脂質ナノ粒子製剤は、0.3%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む1つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態M6に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M8.脂質ナノ粒子製剤は、0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む1つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態M6に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M9.脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む、実施形態M3~M8のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M10.脂質ナノ粒子製剤は、3%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む、実施形態M9に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M11.脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む、実施形態M3~M10のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M12.脂質ナノ粒子製剤は、0.3%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む、実施形態M11に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M13.脂質ナノ粒子製剤は、0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む、実施形態M11に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M14.本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む、実施形態M1~M13のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M15.本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、3%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む、実施形態M14に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M16.本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む、実施形態M1~M15のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M17.本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、0.3%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む、実施形態M16に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M18.本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む、実施形態M16に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M19.総アルデヒド含量及び/又は任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種の量は、例えば、タンデム質量分析(MS/MS)と連結した液体クロマトグラフィー(LC)により、例えば実施例26に記載される方法に従って決定される、実施形態M1~M18のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M20.総アルデヒド含量及び/又は反応性不純物(例えば、アルデヒド)種の量は、反応性不純物(例えば、アルデヒド)の存在に伴う核酸分子(例えば、本明細書に記載される)の1つ又は複数の化学修飾を例えば脂質試薬中で検出することにより決定される、実施形態M1~M18のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M21.総アルデヒド含量及び/又はアルデヒド種の量は、反応性不純物(例えば、アルデヒド)の存在に伴うヌクレオチド又はヌクレオシド(例えば、本明細書に記載されるように、例えば核酸分子中に含まれるか、又はそれから単離された例えばリボヌクレオチド又はリボヌクレオシド)の1つ又は複数の化学修飾を例えば脂質試薬中において、例えば実施例27に記載されるように検出することにより決定される、実施形態M1~M18のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
M22.核酸分子、ヌクレオチド又はヌクレオシドの化学修飾は、例えば、LC-MS/MS分析を用いて、例えば実施例27に記載されるように1つ又は複数の修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を決定することにより検出される、実施形態M21に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
T1.任意の先行する実施形態に記載のシステム、ポリペプチド(若しくはそれをコードするRNA)、核酸分子又はシステム若しくはポリペプチドをコードするDNAを含む脂質ナノ粒子(LNP)。
T2.Gene Writingシステム(例えば、本明細書に記載される)のポリペプチド(又はそれをコードするDNA若しくはRNA)を含む第1脂質ナノ粒子と、
Gene Writingシステム(例えば、本明細書に記載される)の核酸分子を含む第2脂質ナノ粒子と
を含むシステム。
T3.システム、核酸分子、ポリペプチド及び/又はそれをコードするDNAは、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化される、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
U1.セリンリコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼの少なくとも1つの活性部位シグネチャ、例えばcd00338、cd03767、cd03768、cd03769又はcd03770を含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
U2.セリンリコンビナーゼは、例えば、本明細書に記載されるように、公開データベース(例えば、InterPro、UniProt又は保存ドメインデータベース(Lu et al.Nucleic Acids Res 48、D265-268(2020);その全体は、参照により本明細書に組み込まれる)により記載される)から同定されたドメインを含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
U3.セリンリコンビナーゼは、例えば、本明細書に記載されるように、例えば予測ツール、例えばInterProScanを用いてセリンリコンビナーゼドメイン(例えば、本明細書に記載される)についての核酸配列のオープンリーディングフレーム又は全フレーム翻訳物を走査することにより同定されたドメインを含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
V0.異種目的配列は、細胞のゲノム中の標的部位中にあり(例えば、挿入され)、任意選択で、標的部位は、順に、(i)第1パラパリンドローム配列(例えば、attL部位)、(ii)異種目的配列、及び(iii)第2パラパリンドローム配列(例えば、attR部位)を含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞(例えば、本明細書の方法により作製された細胞)、方法又は反応混合物。
V1.細胞(例えば、本明細書の方法により作製された細胞)は、(i)第1パラパリンドローム配列と、(ii)異種目的配列との間の挿入若しくは欠失を含むか、又は細胞は、(ii)異種目的配列と、(iii)第2パラパリンドローム配列との間の挿入若しくは欠失を含む、実施形態V0に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V3.挿入又は欠失は、標的部位の核酸配列の20ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2未満又は1ヌクレオチド又は塩基対未満を含む、実施形態V1に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V4.挿入は、20ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2つ未満又は1ヌクレオチド又は塩基対未満を含む、実施形態V1に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V5.欠失は、標的部位の先行配列の20ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2未満又は1ヌクレオチド又は塩基対未満を含む、実施形態V1に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V6.標的部位の認識配列(例えば、表4Xに列挙される、例えばattB、attP又はその疑似部位)のコア領域(例えば、中央ジヌクレオチド)は、認識配列(挿入DNA上の、例えば表4Xに列挙される、例えばattP又はattB部位)のコア領域(例えば、中央ジヌクレオチド)と約95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を含む、実施形態V0~V5のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V7.標的部位中の挿入又は欠失の数は、同一性パーセントがより低い他の点で類似の細胞中の挿入又は欠失の数よりも少ない、実施形態V6に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V8.挿入又は欠失事象の数は、少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90倍又は少なくとも100倍低い、実施形態V7に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V9.標的部位は、複数の挿入(例えば、頭-尾又は頭-頭の2つ組)を含まない、実施形態V0~V8のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V9a.標的部位は、異種目的配列又はその断片の100、75、50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3又は2コピー未満を含む、実施形態V0~V9のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V10.標的部位は、異種目的配列又はその断片の単一コピーを含む、実施形態V0~V9aのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V11.(例えば、細胞の集団において)異種目的配列又はその断片の2コピー以上を示す標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも1コピーを含む標的部位の95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%又は1%未満である、実施形態V0~V10のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V12.(例えば、細胞の集団において)異種目的配列又はその断片の3コピー以上を示す標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも1コピーを含む標的部位の95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%又は1%未満である、実施形態V0~V11のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V13.(例えば、細胞の集団において)異種目的配列又はその断片の4コピー以上を示す標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも1コピーを含む標的部位の95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%又は1%未満である、実施形態V0~V12のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V14.標的部位は、1つ又は複数のITR(例えば、AAV ITR)、例えば1、2、3、4つ以上のITRを含み、例えば、1つ又は複数のITRは、(i)第1パラパリンドローム配列と、(iii)第2パラパリンドローム配列との間に位置する、実施形態V0~V13のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V15.(例えば、細胞の集団において)(i)第1パラパリンドローム配列と、(iii)第2パラパリンドローム配列との間のITR(例えば、AAV ITR)を含む標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも1コピーを含む標的部位の少なくとも1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又は90%である、実施形態V14に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V16.挿入部位は、異種目的配列又はその断片の1つ又は複数のコピーを含む、実施形態V14又はV15に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V17.標的部位は、順に、(i)第1パラパリンドローム配列、及び(ii)異種目的配列を含む、実施形態V0~V16のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V18.標的部位は、(iii)第2パラパリンドローム配列を含まない、実施形態V17に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V19.標的部位は、(iii)第2パラパリンドローム配列を含み、(ii)は、(i)及び(iii)間に位置する、実施形態V0~V17のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
V20.(例えば、細胞の集団において)(i)第1パラパリンドローム配列、及び(iii)第3パラパリンドローム配列の両方を含む標的部位は、1つ以下のパラパリンドローム配列(例えば、attL又はattP配列)を含む標的部位のパーセンテージと比較して高いパーセンテージの完全異種目的配列(例えば、少なくとも0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×、0.7×、0.8×、0.9×、1.0×、1.5×、2.0×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×以上のパーセントの完全異種目的配列)を含む、実施形態V0~V19のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
本開示は、以上の態様及び/又は実施形態のいずれか1つ又は複数のあらゆる組合せ並びに詳細な説明及び実施例に記載される実施形態のいずれか1つ又は複数との組合せを考慮する。
定義
約、およそ:「約」又は「およそ」は、1以上の目的の値に適用されるこの用語が本明細書に用いられる場合、記述される参照値と類似する値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別に記載がない限り又は特に文脈から明らかでない限り、記述される参照値のいずれかの方向(より多い又はより少ない)で15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%以下内に収まる値の範囲を指す(そのような数字が考えられる値の100%を超過する場合を除く)。
ドメイン:本明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の連続領域(例えば、連続配列)又は個別の非連続領域(例えば、非連続配列)を含み得る。タンパク質ドメインの例として、限定されないが、核局在化配列、リコンビナーゼドメイン、DNA認識ドメイン(例えば、本明細書に記載されるように、認識部位と結合するか若しくはそれと結合することができる)、リコンビナーゼN-末端ドメイン(触媒ドメインとも呼ばれる)、リコンビナーゼドメイン、C-末端ジンクリボンドメイン及び表4に列挙されるドメインが挙げられる。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、コイルド-コイル型モチーフをさらに含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメインは、まとめてC-末端ドメインと称される。一部の実施形態では、N-末端ドメインは、αEリンカー又はヘリックスによりC-末端ドメインに結合している。一部の実施形態では、N-末端ドメインは、50~250アミノ酸、又は100~200アミノ酸、又は130~170アミノ酸、例えば約150アミノ酸である。一部の実施形態では、C-末端ドメインは、200~800アミノ酸又は300~500アミノ酸である。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメインは、50~150アミノ酸である。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、30~100アミノ酸であり;核酸のドメインの一例は、調節ドメイン、例えば転写因子結合ドメイン、認識配列、認識配列のアーム(例えば、5’又は3’アーム)、コア配列又は目的配列(例えば、異種目的配列)である。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、表3A、3B又は3Cのポリペプチドの1つ若しくは複数のドメイン(例えば、リコンビナーゼドメイン若しくはDNA認識ドメイン)又はその断片若しくは変異体を含む。
外性:本明細書で使用されるように、用語「外性」とは、生体分子(例えば、核酸配列又はポリペプチドなど)に関して用いられる場合、生体分子が、人為的に、宿主ゲノム、細胞若しくは生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えDNA技術又は他の方法を用いて、既存のゲノム、細胞、組織若しくは対象に付加される核酸は、既存の核酸配列、細胞、組織若しくは対象に対して外性である。
ゲノムセーフハーバー部位(GSH部位):ゲノムセーフハーバー部位は、例えば、挿入された遺伝因子が、宿主細胞若しくは生物にリスクをもたらす宿主ゲノムの有意な改変を引き起こさないように、新たな遺伝物質の組込みを収容することができる宿主ゲノム内の部位である。GSH部位は、概して、以下の基準の1、2、3、4、5、6、7、8若しくは9を満たす:(i)癌関連遺伝子から>300kbに位置すること;(ii)miRNA/他の機能性低分子RNAから>300kbに位置すること;(iii)5’遺伝子末端から>50kbに位置すること;(iv)複製起点から>50kbに位置すること;(v)超保存エレメントから>50kb離れていること;(vi)低転写活性を有する(即ちmRNA+/-25kbがない)こと;(vii)コピー数可変領域内ではないこと;(viii)オープンクロマチン内であること;及び/又は(ix)ヒトゲノム内に1コピーを有し、ユニークであること。これらの基準のいくつか又は全部を満たすヒトゲノム内のGSH部位の例として、以下のものが挙げられる:(i)アデノウイルス部位1(AAVS1)、19番染色体上のAAVウイルスの天然に存在する組込み部位;(ii)ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体として知られるケモカイン受容体遺伝子;(iii)マウスRosa26遺伝子座のヒトオーソログ;(iv)rDNA遺伝子座。さらに別のGSH部位が知られており、例えばPellenz et al.epub August 20,2018(https://doi.org/10.1101/396390)に記載されている。
異種:用語「異種」は、第2要素に関して第1要素を表すために使用される場合、第1要素と第2要素が、記載されるような配置で天然に存在しないことを意味する。例えば、異種ポリペプチド、核酸分子、構築物若しくは配列は、(a)それが発現される細胞に対してネイティブではないポリペプチド、核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子配列の部分、(b)その天然の状態に対して改変若しくは突然変異したポリペプチド若しくは核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子の部分、或いは(c)類似の条件下でのネイティブ発現レベルと比較して改変された発現を有するポリペプチド又は核酸分子を指す。例えば、異種調節配列(例えば、プロモータ、エンハンサー)を用いて、遺伝子又は核酸分子が天然に通常発現されるものと異なる様式で、遺伝子又は核酸分子の発現を調節することができる。特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞ゲノム内に存在し得るが、改変された発現レベル若しくは異なる配列を有するか、又はその両方であり得る。他の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞又は宿主ゲノムに内在性ではなくてもよいが、代わりに、形質転換(例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション)により宿主細胞に導入され得、ここで、付加される分子は、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又は一過性(例えば、mRNA)若しくは2世代以上にわたって半安定的(例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド若しくは他の自己複製ベクター)のいずれかで染色体外遺伝材料として存在することができる。
突然変異又は突然変異型:用語「(突然)変異型」は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列内のヌクレオチドが、参照(例えば、天然)核酸配列に比して、挿入、欠失若しくは変更されている可能性があることを意味する。単一の改変が1遺伝子座でなされる(点変異)か、又は単一遺伝子座で複数のヌクレオチドが挿入、欠失若しくは変更される場合もある。加えて、1核酸配列内の任意の数の遺伝子座で、1つ若しくは複数の改変がなされる場合もある。核酸配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって突然変異させることができる。
核酸分子:核酸分子は、RNA及びDNA分子の両方を指し、限定しないが、cDNA、ゲノムDNA及びmRNAが挙げられ、本明細書に記載される通り、DNA鋳型のように、化学的に合成される又は組換えにより生成されるものなどの合成核酸分子も含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖、環状若しくは線状であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。別に記載のない限り、また、一般フォーマット「配列番号」として本明細書に記載される全ての配列の例として、「配列番号1」を含む核酸は、少なくともその一部が、(i)配列番号1の配列、又は(ii)配列番号1と相補的な配列のどちらかを有する核酸を指す。2つのどちらを選択するかは、配列番号1が使用される状況によって決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、2つの間の選択は、プローブが、所望の標的と相補的であるという要件によって決定される。本開示の核酸配列は、当業者には容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾され得るか、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。こうした修飾として、例えば、標識、メチル化、類似体による1つ若しくは複数の自然発生的なヌクレオチドの置換、無電荷結合(例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩など)、電荷結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)などのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分、(例えば、ポリペプチド)、挿入剤(例えば、アクリジン、ソラレンなど)、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合(例えば、α-アノマー核酸など)が挙げられる。また、水素結合及び他の化学的相互作用により指定配列と結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。こうした分子は、当技術分野において公知であり、例えば分子の骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合を使用するものがある。他の修飾として、例えば、リボース環が、架橋部分又は「ロックド」核酸に見出される修飾などの他の構造を含む類似体を挙げることができる。
遺伝子発現単位:遺伝子発現単位は、少なくとも1つのエフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも1つの調節核酸配列を含む核酸配列である。第1核酸配列は、第1核酸配列が、第2核酸配列と機能的に関連して配置されるとき、第2核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、プロモータ又はエンハンサーが、コード配列の転写若しくは発現に影響を及ぼす場合、コード配列と作動可能に連結している。作動可能に連結したDNA配列は、連続的又は非連続であり得る。2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、作動可能に連結した配列が同じリーディングフレーム内に存在し得る。
宿主:宿主ゲノム又は宿主細胞という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質及び/又は遺伝材料が導入された細胞及び/又はそのゲノムを指す。こうした用語は、特定の対象細胞及び/又はゲノムだけではなく、そのような細胞の子孫及び/又はそのような細胞の子孫のゲノムも指す。特定の修飾は、突然変異又は環境の影響により後の世代に起こり得ることから、こうした子孫は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、やはり本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれることを理解されたい。宿主ゲノム又は宿主細胞は、単離された細胞若しくは培養で増殖した細胞株又はそうした細胞若しくは細胞株から単離されたゲノム物質であり得るか、或いは生体組織若しくは生物を構成する宿主細胞又は宿主ゲノムであり得る。いくつかの事例では、宿主細胞は、例えば、本明細書で記載されるように、動物細胞又は植物細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞又はシチメンチョウ細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞又はコメ細胞であり得る。
リコンビナーゼポリペプチド:本明細書で使用されるように、リコンビナーゼポリペプチドは、核酸分子(例えば、DNA分子)の組換え反応を触媒する機能的能力を有するポリペプチドを指す。組換え反応は、例えば、1つ若しくは複数の核酸鎖切断(例えば、二本鎖切断)、続いて、2つの核酸鎖末端(例えば、粘着末端)の結合を含み得る。いくつかの事例では、組換え反応は、例えば、ゲノム又は構築物中の、例えば標的部位への挿入核酸の挿入を含む。いくつかの事例では、組換え反応は、例えば、ゲノム又は構築物中の核酸のフリッピング又は反転を含む。いくつかの事例では、組換え反応は、例えば、ゲノム又は構築物から核酸を除去することを含む。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、天然に存在するリコンビナーゼ(例えば、セリンリコンビナーゼ、例えばPhiC31リコンビナーゼ又はGinリコンビナーゼ)の1つ又は複数の構造エレメントを含む。特定の事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、本明細書に記載の(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される)リコンビナーゼと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、セリンリコンビナーゼ、例えばセリンインテグラーゼを含む。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼ、例えばセリンインテグラーゼは、リコンビナーゼドメイン、触媒ドメイン又はジンクリボンドメインの1つ又は複数(例えば、全て)を含む。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼ、例えばセリンインテグラーゼは、表4に列挙されるドメイン(例えば、リコンビナーゼドメイン、触媒ドメイン又はジンクリボンドメインの1つ又は複数に加えて又はその代わりに)を含む。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、天然に存在するリコンビナーゼ(例えば、セリンリコンビナーゼ、例えばPhiC31リコンビナーゼ又はGinリコンビナーゼ)の1つ若しくは複数の官能的特徴を有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、350~900アミノ酸又は425~700アミノ酸である。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、核酸分子中の認識配列(例えば、表2A、2B若しくは2Cの左側領域及び/若しくは右側領域列の配列に存在する認識配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列)を認識する(例えば、それと結合する)。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、第1認識配列(例えば、attB又は疑似attB)と、第2ゲノム認識配列(例えば、attP又は疑似attP)との間の組換えを促進し得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、単離されたモノマーとして活性ではない。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、1つ又は複数の他のリコンビナーゼポリペプチド(例えば、1回の組換え反応につき2又は4つのリコンビナーゼポリペプチド)と共同して組換え反応を触媒する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、ダイマーとして活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、認識配列でダイマーとしてアセンブリングする。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、テトラマーとして活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、認識配列でテトラマーとしてアセンブリングする。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、組換え(例えば、天然に存在しない)リコンビナーゼポリペプチドである。一部の実施形態では、組換えリコンビナーゼポリペプチドは、複数のリコンビナーゼポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む(例えば、組換えリコンビナーゼポリペプチドは、第1リコンビナーゼポリペプチドからの第1ドメインと第2リコンビナーゼポリペプチドからの第2ドメインとを含む)。
挿入核酸分子:本明細書に記載されるように、挿入核酸分子(例えば、挿入DNA)は、標的核酸分子(例えば、ゲノムDNA)内の標的部位に、少なくとも部分的に、挿入されるか又は挿入されることになる核酸分子(例えば、DNA分子)である。挿入核酸分子として、例えば、標的核酸分子(例えば、ゲノムDNA)に対して異種である核酸配列を挙げることができる。いくつかの事例では、挿入核酸分子は、目的配列(例えば、異種目的配列)を含む。いくつかの事例では、挿入核酸分子は、DNA認識配列、例えば標的核酸中に存在するDNAに対するコグネイトである。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、環状であり、一部の実施形態では、挿入核酸分子は、線状である。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、例えば、それぞれが標的核酸中に存在するDNA認識配列に対するコグネイトである2つ以上のDNA認識配列(例えば、2つのDNA認識配列)を含む。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、鋳型核酸分子(例えば、鋳型DNA)とも呼ばれる。
認識配列:認識配列(例えば、DNA認識配列)は、概して、例えば本明細書に記載されるリコンビナーゼポリペプチドにより認識される(例えば、それによって結合され得る)核酸(例えば、DNA)配列を指す。いくつかの事例では、認識配列は、2つの認識配列を含み、一方は組込み部位(核酸を組み込もうとする部位)中に位置され、他方は組込み部位に導入しようとする目的の核酸に隣接する。認識配列は、概して、attB及びattPと呼ばれる。認識配列は、ネイティブ配列であり得、ネイティブ配列に対して改変され得る。認識配列は、長さが変動し得るが、典型的には約20~約200nt、約30~90nt、より通常には30~70ヌクレオチドの範囲である。認識配列は、典型的には、以下のように配置される:attBは、5’から3’の相対順で、第1DNA配列attB5’、コア領域及び第2DNA配列attB3’、attB5’-コア領域-attB3’を含む。attPは、5’から3’の相対順で、第1DNA配列attP5’、コア領域及び第2DNA配列attP3’、attP5’-コア領域-attP3’を含む。一部の実施形態では、attB5’及びattB3’は、パラパリンドロームである(例えば、一方の配列は他方の配列に対して回文であるか、又は他の配列に対する回文と少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する)。一部の実施形態では、attP5’及びattP3’認識配列は、パラパリンドロームである(例えば、一方の配列は他方の配列に対して回文であるか、又は他方の配列に対する回文と少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する)。一部の実施形態では、attB5’及びattB3’認識配列は、互いにパラパリンドロームであり、attP5’及びattP3’認識配列は、互いにパラパリンドロームである。一部の実施形態では、attB5’及びattB3’並びにattP5’及びattP3’配列は類似するが、必ずしも同数のヌクレオチドでない。attB及びattPは異なる配列のため、組換えは、attB配列でもattP配列でもない核酸の区間(左右についてattL又はattRと呼ばれる)をもたらす。特定の理論に束縛されることは意図しないが、attL/attRとattB/attPとの間の非類似性は、おそらく、関連リコンビナーゼ酵素に対する組換え部位として認識不可能なattL及びattR部位を作製し、従って酵素が第1組換え反応を逆転させる第2組換え反応を触媒する確率を低下させる。認識配列は、典型的には、リコンビナーゼダイマーにより結合される。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドのαEヘリックス、リコンビナーゼドメイン、リンカードメイン及び/又はジンクリボンドメインの1つ又は複数が認識配列に接触する。いくつかの事例では、認識配列は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列の配列内に存在する核酸配列、例えば表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列の配列内の20~200nt配列、例えば表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列の配列内の30~70nt配列又はそれと少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、認識部位は、付着部位とも呼ばれる。一部の実施形態では、認識配列はゲノムに存在し、Gene Writing活性の部位である認識配列を記載する場合、標的配列又は標的部位と呼ばれる。
疑似認識配列:認識配列は、様々な生物のゲノム中に存在し、認識配列は、必ずしも野生型認識配列(所与のリコンビナーゼについて)と同一のヌクレオチド配列を有さず;しかし、そのようなネイティブ認識配列は、それにもかかわらず、リコンビナーゼにより媒介される組換えを促進するために十分である。そのような認識配列は、とりわけ、本明細書で「疑似認識配列」と呼ばれる。「疑似認識配列」は、リコンビナーゼ酵素により認識される(例えば、それにより結合され得る)認識配列を含むDNA配列であり、認識配列は、対応する野生型リコンビナーゼ認識配列と1つ若しくは複数のヌクレオチドが異なり、且つ/又はリコンビナーゼについての野生型認識配列が残留するゲノムの配列と異なるゲノム中の内在性配列として存在する。一部の実施形態では、所与のリコンビナーゼについて、疑似認識配列は、野生型組換え配列と機能的に同等であり、リコンビナーゼが天然に見出される生物以外の生物に存在し、野生型認識配列に対して配列変異を有し得る。「疑似attP部位」又は「疑似attB部位」は、例えば、ファージインテグラーゼ酵素、例えばファージPhiC31についての野生型ファージ(attP)又は細菌(attB)付着部位配列それぞれについての認識配列と類似する疑似認識配列を指す。一部の実施形態では、attP又は疑似attP部位は宿主細胞のゲノム中に存在する一方、attB又は疑似attB部位は、本明細書に記載されるシステムにおけるターゲティングベクター上に存在する。一部の実施形態では、attB又は疑似attB部位は宿主細胞のゲノム中に存在する一方、attP又は疑似attP部位は、本明細書に記載されるシステムにおけるターゲティングベクター上に存在する。「疑似att部位」は、疑似attP部位又は疑似attB部位のいずれかを指すことができるより一般的な用語である。att部位又は疑似att部位は、線状又は環状核酸分子上に存在し得る。疑似認識配列の同定は、例えば、配列アラインメント及び分析を用いることにより達成することができ、クエリ配列は、目的の認識配列(例えば、ファージ/細菌システムのattB及び/又はattP)である。例えば、attBクエリ配列を用いてゲノム認識配列が同定される場合、それは疑似attB部位と言われ;attPクエリ配列を用いてゲノム認識配列が同定される場合、それは疑似attP部位と言われる。一部の実施形態では、疑似認識配列は、リコンビナーゼにより認識される(例えば、それに結合することができる)野生型認識配列(例えば、Li H et al.,2018,J Mol Biol,430(21):4401-4418(参照により組み込まれる)に記載されるαEヘリックス、リコンビナーゼドメイン、リンカードメイン及び/又はジンクリボンドメインの1つ又は複数)と高い配列類似性を共有する。一部の実施形態では、疑似認識配列は、リコンビナーゼの野生型認識配列よりもリコンビナーゼにより強力に結合されるか又は作用される。疑似認識配列は、「疑似部位」とも呼ぶことができる。一部の実施形態では、疑似部位は、例えば、Thyagarajan et al Mol Cell Biol 21(12):3926-3934(2001)に記載されるように、親配列と完全に不一致であり得る。一部の実施形態では、本明細書で使用される疑似部位は、ネイティブ認識配列と70%未満、例えば70%、60%、50%、40%未満又は30%未満同一であり得る。一部の実施形態では、本明細書で使用される疑似部位は、ネイティブ認識配列と20%超、例えば20%、30%、40%、50%、60%超又は70%超同一であり得る。
ハイブリッド認識配列:本明細書で使用される「ハイブリッド認識配列」は、複数の認識配列、例えば野生型及び/又は疑似認識配列の一部から構築される認識配列を指す。一部の実施形態では、複数の認識配列は、同じリコンビナーゼの全ての認識配列(例えば、同じリコンビナーゼにより認識される野生型認識配列及び疑似認識配列)である。一部の実施形態では、コア配列の5’側の配列、例えばハイブリッド組換え部位のattB5’又はattP5’は疑似認識配列に一致し、コア配列の3’側の配列、例えばハイブリッド認識配列のattB3’又はattP3’は野生型認識配列に一致する。一部の実施形態では、コア配列の5’側の配列、例えばハイブリッド組換え部位のattB5’又はattP5’は野生型認識配列に一致し、コア配列の3’側の配列、例えばハイブリッド認識配列のattB3’又はattP3’は疑似認識配列に一致する。一部の実施形態では、コア配列の5’側の配列、例えばハイブリッド組換え部位のattB5’又はattP5’は疑似認識配列に一致し、コア配列の3’側の配列、例えばハイブリッド認識配列のattB3’又はattP3’は野生型認識配列に一致する。一部の実施形態では、ハイブリッド認識配列は、野生型attB部位からのコア配列の5’側の領域と、野生型attP認識配列からのコア配列の3’側の領域とから構成され得、その逆も同様である。このようなハイブリッド認識配列の他の組合せは、本明細書の教示を考慮して当業者に明らかである。一部の実施形態では、本明細書の使用に好適な認識配列は、ハイブリッド認識配列である。
コア配列:コア配列は、本明細書で使用される場合、認識配列の2つのアーム間、例えばパラパリンドローム配列のペア間に位置する核酸配列を指す。一部の実施形態では、コア配列は、attB5’とattB3’との間又はattP5’とattP3’との間に位置する。いくつかの事例では、コア配列は、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、2つのパラパリンドローム配列を含む認識配列を認識するリコンビナーゼポリペプチド)により切断されて、例えば粘着末端、例えば3’オーバーハングを形成することができる。一部の実施形態では、attB及びattPのコア配列は同一である。一部の実施形態では、attB及びattPのコア配列は同一でなく、例えば99、95、90、80、70、60、50、40、30又は20%未満の同一性を有する。一部の実施形態では、コア配列は、約2~20ヌクレオチド、例えば2~16ヌクレオチド、例えば約4ヌクレオチド長又は約2ヌクレオチド長(例えば、厳密に2ヌクレオチド長)である。一部の実施形態では、コア配列は、2つの隣接ヌクレオチドに対応するコアジヌクレオチドを含み、近くのパラパリンドローム配列を認識するリコンビナーゼがコアジヌクレオチドの片側のDNAを切断し得、例えば粘着末端を形成する。一部の実施形態では、attB及び/又はattP部位のコア配列のコアジヌクレオチドは、同一であり、例えば、attP及び/又はattB部位の切断は、適合性粘着末端を形成する。一部の実施形態では、コア配列は、表2A、2B又は2Cの左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸配列を含む。一部の実施形態では、コア配列は、表2A、2B又は2Cの左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在しない核酸配列を含む。
目的配列:本明細書で使用される場合、目的配列という用語は、例えば、本明細書に記載されるように、例えばリコンビナーゼポリペプチドにより、標的核酸分子に望ましく挿入され得る核酸セグメントを指す。一部の実施形態では、挿入DNAは、DNA認識配列と、DNA認識配列と異種の目的配列(一般に、本明細書では「異種目的配列」と呼ばれる)とを含む。目的配列は、いくつかの事例では、それが挿入される核酸分子に対して異種であり得る。いくつかの事例では、目的配列は、例えば、本明細書に記載されるように、遺伝子(例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト遺伝子)をコードする核酸配列又は目的の他のカーゴ(例えば、機能性RNA、例えばsiRNA若しくはmiRNAをコードする配列)を含む。特定の事例では、遺伝子は、ポリペプチド(例えば、血液因子又は酵素)をコードする。いくつかの事例では、目的配列は、選択マーカ(例えば、栄養要求性マーカ若しくは抗生物質マーカ)及び/又は核酸制御エレメント(例えば、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー若しくはインスレータ)をコードする核酸配列の1つ若しくは複数を含む。
パラパリンドローム:本明細書で使用される場合、「パラパリンドローム」という用語は、核酸配列の一方が、他方の核酸配列に対して回文であるか、或いは他方の核酸配列に対する回文と少なくとも30%(例えば、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%)、例えば少なくとも50%の配列同一性を有するか、又は他方の核酸配列に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列ミスマッチを有するかのいずれかである、一対の核酸配列の特性を指す。「パラパリンドローム配列」は、本明細書で使用される場合、互いに対してパラパリンドロームである一対の核酸配列の少なくとも1つを指す。「パラパリンドローム領域」は、本明細書で使用される場合、2つのパラパリンドローム配列を含む核酸配列又はその部分を指す。いくつかの事例では、パラパリンドローム領域は、核酸配列セグメント(例えば、コア配列を含む)とフランキングする2つのパラパリンドローム配列を含む。
ヒト細胞における10の例示的なセリンインテグラーゼの活性。インテグラーゼ発現プラスミド及び520bpのattP含有領域に続いて、CMVプロモータにより駆動されるEGFPリポータを有する鋳型プラスミドでHEK293T細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから21日後にフローサイトメトリーにより観察されたEGFP陽性細胞のパーセンテージが示される。 異なるAAVドナーフォーマットの組込み、安定性及び発現を評価するための戦略。単一attB又はattPドナーは、細胞核へのAAV形質導入後の二本鎖環状化DNAの形成を利用する。この構成は、組込み後にITR配列も含む。二重attB-attB又はattP-attPドナーは、AAV形質導入後の二本鎖環状化DNAの形成を要求しない。組込み安定性及び発現についてのリードアウトは、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)及びフローサイトメトリー(FLOW)を用いる。 AAV構築物の説明。第1行は、ITR、スタッファー(500)、attP、PEF1a、EGFP、WPRE、hGHpA、ITR;AAV2血清型を示す。第2行は、ITR、スタッファー(500)、attP、PEF1a、EGFP、WPRE、hGHpA、attP、スタッファー(500)、ITR;AAV2血清型を示す。第3行は、ITR、スタッファー(500)、attB、PEF1a、EGFP、WPRE、hGHpA、ITR;AAV2血清型を示す。第4行は、ITR、スタッファー(500)、attB、PEF1a、EGFP、WPRE、hGHpA、attB、スタッファー(500)、ITR;AAV2血清型を示す。第5行は、ITR、PEF1a、hcoBXB1、WPRE、hGHpA、ITR;AAV2血清型を示す。第6行は、ITR、PEF1a、mcoBXB1、WPRE、hGHpA、ITR;AAV6血清型を示す。 哺乳動物細胞へのセリンインテグラーゼ及び鋳型DNAの二重AAV送達。(A)実験の概略図。BXB1セリンリコンビナーゼ及び鋳型DNAを個別のAAVウイルスベクターとしてBXBランディングパッド細胞株に共送達する。(B)形質導入から3日及び7日後の、attP-attPランディングパッド細胞株へのBXB1セリンリコンビナーゼ及びトランスジーンの組込み(%CNV/ランディングパッド)を評価するためのドロップレットデジタルPCR(ddPCR)アッセイ。黒色点(灰色点の各ペアの右側)は、鋳型のみサンプルを示し、y軸上で0%に降下する。灰色点(黒色点の各ペアの左側)は、鋳型+BXB1インテグラーゼを示し、y軸上で1~6%降下する。 哺乳動物細胞へのBXB1インテグラーゼのmRNA送達及び鋳型DNAのAAV送達。(A)実験の概略図。BXB1ランディングパッド細胞株へのBXB1セリンリコンビナーゼのmRNA送達及び鋳型DNAのAAV送達。(B)mRNAトランスフェクション/AAV形質導入から3日後の、attP-attPランディングパッド細胞株へのBXB1セリンリコンビナーゼ及びトランスジーンの組込み(%CNV/ランディングパッド)を評価するためのドロップレットデジタルPCR(ddPCR)アッセイ。黒色点(灰色点の各ペアの右側)は、鋳型のみサンプルを示し、y軸上で0%に降下する。灰色点(黒色点の各ペアの左側)は、鋳型+BXB1インテグラーゼを示し、y軸上で0%超に降下する。 リコンビナーゼ認識部位の一般的構造並びに本明細書に開示される左側領域及び右側領域配列中の認識部位の存在。(A)認識配列の一般的特徴。本明細書に定義されるセリンリコンビナーゼは、概して、中央ジヌクレオチド、コア配列及び天然でパラパリンドロームであり得るフランキングアームを含む。Bxb1リコンビナーゼについてのattP及びattB認識配列(表3A、第204行)が本明細書に示される。これらの配列は、2つの部位間の組換えの成功に重要な、太字で示される中央ジヌクレオチドを共有する。黒色枠線により示される認識部位のアームは、様々な程度で回文配列を共有し得、従って本明細書で「パラパリンドローム」と呼ばれる。反対のアームに関して回文であるヌクレオチドは、下線付き文字により示される。さらに、認識配列は、灰色陰影によりここに示される、attP部位とattB部位との間で共通するコアを共有する。コア配列は、少なくとも中央ジヌクレオチドを含むが、追加の配列を含み得る。(B)表2の左側領域又は右側領域は、コグネイトリコンビナーゼについてのattP部位を含む。表2は、本明細書に記載される例示的なリコンビナーゼについての例示的な認識部位を含む。一例として、表1又は表3、例えば表1A又は表3AのリコンビナーゼについてのattP部位は、表2、例えば表2Aの左側領域又は右側領域に見出される。ここで、Bxb1インテグラーゼについてのattP部位(表1A及び表3A、第204行)は、表2Aの対応する行(第204行)に示される。Bxb1のattP部位は、左側領域配列中で下線付き及び太字文字として示される。 リコンビナーゼ認識部位の一般的構造並びに本明細書に開示される左側領域及び右側領域配列中の認識部位の存在。(A)認識配列の一般的特徴。本明細書に定義されるセリンリコンビナーゼは、概して、中央ジヌクレオチド、コア配列及び天然でパラパリンドロームであり得るフランキングアームを含む。Bxb1リコンビナーゼについてのattP及びattB認識配列(表3A、第204行)が本明細書に示される。これらの配列は、2つの部位間の組換えの成功に重要な、太字で示される中央ジヌクレオチドを共有する。黒色枠線により示される認識部位のアームは、様々な程度で回文配列を共有し得、従って本明細書で「パラパリンドローム」と呼ばれる。反対のアームに関して回文であるヌクレオチドは、下線付き文字により示される。さらに、認識配列は、灰色陰影によりここに示される、attP部位とattB部位との間で共通するコアを共有する。コア配列は、少なくとも中央ジヌクレオチドを含むが、追加の配列を含み得る。(B)表2の左側領域又は右側領域は、コグネイトリコンビナーゼについてのattP部位を含む。表2は、本明細書に記載される例示的なリコンビナーゼについての例示的な認識部位を含む。一例として、表1又は表3、例えば表1A又は表3AのリコンビナーゼについてのattP部位は、表2、例えば表2Aの左側領域又は右側領域に見出される。ここで、Bxb1インテグラーゼについてのattP部位(表1A及び表3A、第204行)は、表2Aの対応する行(第204行)に示される。Bxb1のattP部位は、左側領域配列中で下線付き及び太字文字として示される。
本開示は、例えば、インビボ又はインビトロで、細胞、組織若しくは対象におけるDNA配列内の1つ若しくは複数の位置で、DNA配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する(例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的DNA配列を挿入する)ための組成物、システム及び方法に関する。目的DNA配列は、例えば、コード配列、調節配列、遺伝子発現単位を含み得る。
Gene-writer(商標)遺伝子エディター
本発明は、例えば、リコンビナーゼポリペプチドが結合することができる、コグネイト認識配列を含む2つのDNA配列を組み換えることにより、DNA配列を修飾又は操作することができるリコンビナーゼポリペプチド(例えば、表3A、3B又は3Cに列挙される通り、例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド)を提供する。Gene Writer(商標)遺伝子エディターシステムは、一部の実施形態において、(A)ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸(ポリペプチドは、(i)リコンビナーゼ活性を有するドメインと、(ii)DNA結合機能性を有するドメイン(例えば、本明細書に記載される、例えば認識配列に結合するか又は結合することができる、例えばDNA認識配列を含む);及び(B)(i)ポリペプチドに結合する配列(例えば、本明細書に記載の認識配列)と、任意選択で(ii)目的配列(例えば、異種目的配列)と、を含む挿入DNAを含み得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼ活性を有するドメインと、DNA結合機能性を有するドメインは、同じドメインである。例えば、Gene Writerゲノムエディタータンパク質は、DNA結合ドメインと、リコンビナーゼドメインとを含み得る。特定の実施形態では、Gene Writer(商標)遺伝子エディターポリペプチドの要素は、例えば、本明細書に記載されるように、例えば表3A、3B又は3Cに列挙される、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、セリンリコンビナーゼ)の配列から得ることができる。一部の実施形態では、Gene Writerゲノムエディターを第2ポリペプチドと組み合わせる。一部の実施形態では、第2ポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるように、例えば表3A、3B又は3Cに列挙される、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、セリンリコンビナーゼ)から得られる。
Gene Writer遺伝子エディターシステムのリコンビナーゼポリペプチド成分
本明細書に記載されるシステム、細胞及び方法で使用することができるリコンビナーゼポリペプチドの例示的なファミリーとして、セリンリコンビナーゼが挙げられる。概して、セリンリコンビナーゼは、2つの認識配列間の部位特異的組換えを触媒する酵素である。2つの認識配列は、例えば、同じ核酸(例えば、DNA)分子上にあり得るか、又は2つの個別の核酸(例えば、DNA)分子上にあり得る。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼN-末端ドメイン(触媒ドメインとも呼ばれる)、リコンビナーゼドメイン及びC-末端ジンクリボンドメインを含む。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、コイルド-コイル型モチーフをさらに含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメインは、まとめてC-末端ドメインと呼ばれる。一部の実施形態では、N-末端ドメインは、50~250アミノ酸、又は100~200アミノ酸、又は130~170アミノ酸である。一部の実施形態では、C-末端ドメインは、200~800アミノ酸又は300~500アミノ酸である。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメインは、50~150アミノ酸である。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、30~100アミノ酸である。一部の実施形態では、N-末端ドメインは、長いヘリックス(αEヘリックス又はリンカーと呼ばれることもある)を介してリコンビナーゼドメインに結合している。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメインは、短いリンカーを介して連結している。セリンリコンビナーゼ及びリコンビナーゼポリペプチドの非限定的な例は、表3A、3B又は3Cに列挙される。
一部の実施形態では、組換えリコンビナーゼは、スワッピングドメインにより構築される。一部の実施形態では、リコンビナーゼN-末端ドメインは、異種リコンビナーゼC-末端ドメインと対合させることができる。一部の実施形態では、触媒ドメインは、異種リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン、αEヘリックス及び/又は短いリンカーと対合させることができる。一部の実施形態では、C-末端ドメインは、異種リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン、αEヘリックス及び/又は短いリンカーを含み得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドのDNA結合エレメントは、異種DNA結合エレメント、例えばジンクフィンガードメイン、TALドメイン又はワトソン・クリックベースターゲティングドメイン、例えばCRISPR/Casシステムにより修飾されるか又は置き換えられる。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、セリンリコンビナーゼは、認識配列の例である短い特異的DNA配列(例えば、attP及びattB)を利用する。組込み反応中、リコンビナーゼは、ダイマーとしてattP及びattBに結合し、部位の会合を媒介して、テトラマーシナプス複合体を形成し、鎖交換を触媒してDNAを組み込み、新たな認識配列部位、attL及びattRを形成する。新たな認識部位、attL及びattRは、例えば、5’から3’の順にattB5’-コア-attP3’及びattP5’-コア-attB3’を含む。特定の理論に束縛されることは意図しないが、attL及びattR配列間の部位特異的組換えによりDNAを切除する逆反応は、低減した頻度で生じるか、又は組換え方向性因子(RDF)の不存在下で生じない。これは、リコンビナーゼ媒介切除がほとんどないか又は検出可能でない安定的な組込み、即ち「単一方向性」である組換えをもたらす。
機序の記載により拘束されるものではないが、リコンビナーゼにより触媒される鎖交換は、典型的には、リコンビナーゼ酵素とDNA鎖との間で形成される共有結合タンパク質-DNA中間体が関与する(1)切断、及び(2)再結合の2つのステップで生じる。リコンビナーゼは、そのDNA基質にダイマーとして結合し、タンパク質-タンパク質相互作用により部位を一緒にしてテトラマーシナプス複合体を形成することにより作用する。4つのサブユニットの各々の求核セリンの活性化は、DNA切断をもたらして2nt3’オーバーハング及び陥凹5’末端への一過的なホスホセリル結合を生じさせる。DNA鎖交換は、サブユニット回転により生じる。陥凹5’塩基及び3’OHを有する3’ジヌクレオチドオーバーハング塩基対は、切断反応の逆でホスホセリル結合を攻撃して組換え半部位を結合させる。セリンリコンビナーゼの構造、活性及び生物学のさらなる詳細は、参照により組み込まれる以下の参照文献:Smith MCM.2014.Phage-encoded serine integrases and other large serine recombinases.Microbiol Spectrum 3(4):MDNA3-0059-2014;Rutherford K and Van Duyne G D.2014.The ins and outs of serine integrase site-specific recombination.Current Opinion in Structural Biology 24:125-131;Van Duyne G D and Rutherford K.2013.Large Serine Recombinase domain structure and attachment site binding.Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 48(5):471-491に記載されている。
当業者は、例えば、保存ドメイン解析のためのBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)又はCD-Searchのような常用の配列解析ツールを用いることにより、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、セリンリコンビナーゼ)の核酸及び対応するポリペプチド配列並びにそのドメインを決定することができる。他の配列解析ツールは周知であり、例えば、https://molbiol-tools.ca、例えばhttp://molbiol-tools.ca/Motifs.htmに見出すことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるセリンリコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼの少なくとも1つの公知の活性部位シグネチャ、例えばcd00338、cd03767、cd03768、cd03769又はcd03770を含む。これらのドメインを含有するタンパク質は、さらにタンパク質データベース、例えば、InterPro(Mitchell et al.Nucleic Acids Res 47,D351-360(2019))、UniProt(The UniProt Consortium Nucleic Acids Res 47,D506-515(2019))若しくは保存ドメインデータベース(Lu et al.Nucleic Acids Res 48,D265-268(2020))上でドメインを検索することによるか、又は予測ツール、例えば、InterProScanを用いてセリンリコンビナーゼドメインの核酸配列のオープンリーディングフレームワーク若しくは全フレーム翻訳物を走査することにより見出すことができる。
本開示は多くの特定のセリンリコンビナーゼ配列を提供する一方、本明細書に記載される方法、他のセリンリコンビナーゼも用いて実施することができることが理解される。例えば、本明細書に記載される組成物又は方法は、例えば、cd00338、cd03767、cd03768、cd03769又はcd03770から選択される活性部位シグネチャを有するセリンリコンビナーゼを含み得る。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼは、400アミノ酸長超(例えば、少なくとも400、500、600、700、800、900又は1000アミノ酸)を有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、表3A~3Cのいずれかに列挙される(例えば、表3A~3Cのいずれかの単一行に列挙される)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以上のドメインを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、表4に列挙される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以上のドメインを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼを同定する方法は、ポリペプチドが表3A~3Cのいずれかに列挙される(例えば、3A~3Cのいずれかの単一行に列挙される)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以上のドメインを含むか否かを決定することを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼを同定する方法は、ポリペプチドが表4に列挙される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以上のドメインを含むか否かを決定することを含む。
例示的なリコンビナーゼポリペプチド
一部の実施形態では、Gene Writer(商標)遺伝子エディターシステムは、例えば、本明細書に記載されるリコンビナーゼポリペプチド(例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド)を含む。一般に、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド)は、核酸認識配列に特異的に結合し、認識配列内の1部位(例えば、認識配列内のコア配列)で組換え反応を触媒する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、認識配列又はその一部(例えば、そのコア配列)と、別の核酸配列(例えば、コグネイト認識配列及び任意選択で目的配列、例えば異種目的配列を含む挿入DNA)との間の組換えを触媒する。例えば、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド)は、目的配列又はその一部の、別の核酸分子(例えば、ゲノムDNA分子、例えば染色体若しくはミトコンドリアDNA)への挿入をもたらす組換え反応を触媒する。
以下の表3A、3B又は3C(Protseq列参照)は、例示的なリコンビナーゼポリペプチド、例えばセリンリコンビナーゼ(例えば、セリンインテグラーゼ)又はその断片のアミノ酸配列を提供する。表2A、2B又は2Cは、起源の生物の例示的なセリンリコンビナーゼをコードする核酸配列のフランキング核酸配列を提供し(それぞれ、左側領域及び右側領域と標識された列参照);それらのフランキング核酸配列の一方又は両方が、対応するリコンビナーゼのネイティブ認識配列又はその一部を含む(例えば、attP部位又はその一部を含む)。表3A、3B又は3Cは、これまでセリンリコンビナーゼと同定されていないアミノ酸配列を含み、表2A、2B又は2Cは、DNA認識配列がこれまで不明であったセリンリコンビナーゼの対応するフランキング核酸配列(及びそれによりDNA認識配列)を含む。起源配列(表1A、1B又は1Cの記述列参照)、リコンビナーゼの起源の生物(表1A、1B又は1Cの生物列参照)、リコンビナーゼのアミノ酸配列の長さ(表1A、1B又は1Cのタンパク質配列長さ列参照)、リコンビナーゼをコードする核酸配列のゲノムアクセッション番号(表1A、1B又は1Cのゲノムアクセッション列)、リコンビナーゼのタンパク質アクセッション番号(表1A、1B又は1Cのタンパク質アクセッション列)及びリコンビナーゼコード配列のゲノム位置座標(示されるフランキング核酸配列を含む)(表1A、1B又は1CのG開始及びG終止列)の記載が以下に挙げられる。また、例示的なリコンビナーゼ配列中に存在すると同定されたドメインは、アミノ酸配列のInterPro分析に基づいて同定される(表3A、3B又は3Cのドメイン列参照)。例えば、http://omictools.com/interpro-tool参照。ドメイン命名法の簡単なキーは、表4に提供される。表1A、1B又は1Cの各アクセッション番号のアミノ酸配列及びゲノム配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。表2A、2B又は2Cに列挙されるフランキング核酸配列に存在するネイティブ認識配列又はその一部の各々は、(i)第1パラパリンドローム配列、(ii)コア配列、及び/又は(iii)第2パラパリンドローム配列の1つ、2つ又は3つを含み得、ここで、第1及び第2パラパリンドローム配列は、互いに対してパラパリンドロームである。
一部の実施形態では、パラパリンドローム配列のペアを選択する場合、本明細書に開示される表の使用者は、互いに同じ行番号を有する行に開示される配列に基づいて各配列を選択する。例えば、一部の実施形態では、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を含むDNA認識配列を含む細胞は、表2A、2B又は2Cの同じ行に開示される配列に関連する第1及び第2パラパリンドローム配列を含む。一部の実施形態では、例示的なリコンビナーゼポリペプチドとの使用のためにDNA認識配列(例えば、パラパリンドローム配列)を選択する場合、DNA認識配列(例えば、パラパリンドローム配列)は、例示的なリコンビナーゼポリペプチドと同じ行番号を有する行の配列から選択されるか又はそれに関連する。
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一部の実施形態では、表2Aの第329行の左側領域核酸配列を含む配列(例えば、配列番号290の核酸配列を含む配列)は、核酸配列:
Figure 2023502473000736
を含む。
一部の実施形態では、表2Aの第524行の左側領域核酸配列を含む配列(例えば、配列番号470の核酸配列を含む配列)は、核酸配列:
Figure 2023502473000737
を含む。
一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位(例えば、本明細書に記載される)は、attB配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位(例えば、本明細書に記載される)は、attP配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位(例えば、本明細書に記載される)は、attB配列及びattP配列を含む。複数の実施形態では、attB配列は、表4Xに列挙される配列から選択される。複数の実施形態では、attP配列は、表4Xに列挙される配列から選択される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位(例えば、本明細書に記載される)は、attB配列及びattP配列を含み、attB及びattP配列は各々、表4Xの単一行に列挙される配列を含む。
一部の実施形態では、DNA認識配列(例えば、本明細書に記載される)は、attB配列を含む。一部の実施形態では、DNA認識配列(例えば、本明細書に記載される)は、attP配列を含む。一部の実施形態では、DNA認識配列(例えば、本明細書に記載される)は、attB配列及びattP配列を含む。複数の実施形態では、attB配列は、表4Xに列挙される配列から選択される。複数の実施形態では、attP配列は、表4Xに列挙される配列から選択される。一部の実施形態では、DNA認識配列(例えば、本明細書に記載される)は、attB配列及びattP配列を含み、attB及びattP配列は各々、表4Xの単一行に列挙される配列を含む。
一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる)は、表3A、3B若しくは3Cに列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる)又はその一部は、表3A、3B又は3Cに列挙されるリコンビナーゼポリペプチドのリコンビナーゼドメイン、DNA認識ドメイン(例えば、本明細書に記載されるように、例えば認識部位に結合するか又は結合することができる)、リコンビナーゼN-末端ドメイン(触媒ドメインとも呼ばれる)、ジンクリボンドメイン、ジンクリボンドメインのコイルドコイルモチーフ又はC-末端ドメイン(例えば、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメイン)のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる)は、表3A、3B若しくは3Cに列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドのDNA結合活性及び/又はリコンビナーゼ活性の1つ又は複数を有する。
一部の実施形態では、挿入DNA(例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる)は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸認識配列或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、挿入DNA(例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる)は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する1つ又は複数の(例えば、両方の)パラパリンドローム配列或いは前記パラパリンドローム配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、挿入DNA(例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる)は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸認識配列のスペーサ(例えば、コア配列)或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、挿入DNAは、異種目的配列をさらに含む。
一部の実施形態では、挿入DNA(例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる)は、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸認識配列或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有する核酸配列を含み、それは疑似認識配列(例えば、ヒト認識配列)に対してコグネイトである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物又は方法で用いられる挿入DNA又はリコンビナーゼポリペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7又は8つのセーフハーバースコアを有する位置への異種目的配列の挿入を指令する。
特定の実施形態では、挿入DNAとヒトDNA認識配列との間の組換えは、組み込まれた配列(例えば、異種目的配列)をフランキングする2つの認識配列を含む組み込まれた核酸分子の形成をもたらす。特定の理論に束縛されることは意図しないが、セリンリコンビナーゼは、attB及びattP部位を含む認識配列間の組換えを促進し、組換えにより、例えば、組込み配列をフランキングするattL及びattR部位を含む認識配列を形成する。セリンリコンビナーゼがattL又はattR部位を認識し、例えば、それに結合し得る一方、セリンリコンビナーゼは、attL又はattR部位を用いる組換えをあまり促進しない(例えば、促進しない)(例えば、追加の因子の不存在下で)。attL及びattR部位は、それらが作製されたattP及びattB部位の組換え部分を含む。特定の実施形態では、組込み核酸分子の2つの組換え後認識配列の一方又は両方が、(i)ネイティブ認識配列、(ii)挿入DNA上の認識配列、及び/又は(iii)疑似認識配列(例えば、ヒトDNA認識配列)の1つ若しくは複数(例えば、1つ、2つ若しくは3つ全部)と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35以上のミスマッチを含む。複数の実施形態では、組込み核酸分子の2つの組換え後認識配列の一方又は両方が、ネイティブ認識配列と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35以上のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ミスマッチは、コア配列中に存在する。一部の実施形態では、組込み核酸分子の認識配列と、ネイティブ認識配列、挿入DNA認識配列及び/又はヒトDNA認識配列との間のこれらの相違により、認識配列、ネイティブ認識配列、挿入DNA認識配列及び/又はヒトDNA認識配列に対するリコンビナーゼの結合及び/又は活性と比較して、リコンビナーゼポリペプチドと組込み核酸分子の認識配列との間の結合親和性の低下及び/又は組込み核酸分子の認識配列に対するリコンビナーゼポリペプチドのリコンビナーゼ活性の低下(例えば、排除)が起こることが考慮される。
一部の実施形態では、疑似認識配列(例えば、ヒトDNA認識配列)は、ゲノムセーフハーバー部位又はその付近(例えば、その1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000又は10,000ヌクレオチド以内)に位置する。一部の実施形態では、疑似認識配列(例えば、ヒト認識配列)は、以下の基準の1、2、3、4、5、6、7、8若しくは9つを満たすゲノム内の位置に位置する:(i)癌関連遺伝子から>300kbに位置すること;(ii)miRNA/他の機能性小分子RNAから>300kbにあること;(iii)5’遺伝子末端から>50kbにあること;(iv)複製起点から>50kbにあること;(v)任意の超保存エレメントから>50kbにあること;(vi)低転写活性を有する(即ちmRNA+/-25kbがない)こと;(vii)コピー数可変領域内ではないこと;(viii)オープンクロマチン中にあること;及び/又は(ix)ヒトゲノム中に1コピーを有し、ユニークであること。
複数の実施形態では、本明細書に記載される細胞又はシステムは、以下の1つ又は複数(例えば、1、2又は3つ)を含む:(i)表3A、3B若しくは3C若しくは3Bの行番号Xを有する行に列挙されるリコンビナーゼポリペプチド(Xは、表3A、3B若しくは3Cのいずれかの数字1から最大行番号である)又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列;(ii)表2A、2B若しくは2Cの行番号Xを有する行の左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するDNA認識配列を含む挿入DNA或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有する核酸配列(任意選択で、挿入DNAは、目的配列(例えば、異種目的配列)をさらに含む);及び/又は(iii)表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列の配列に存在する疑似認識配列(例えば、ヒト認識配列)配列を含むゲノム或いはそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有する核酸配列。
一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位、例えば、attB、attP、attL又はattR部位は、利用可能なソフトウェアツールにより予測することができる。一部の実施形態では、認識部位は、ファージ予測ツール、例えば、PhiSpy(Akhter et al.Nucleic Acids Res 40(16):e126(2012))又はPHASTER(Arndt et al.Nucleic Acids Res 44:W16-W21(2016))(参照により本明細書に組み込まれる)により予測可能であり得る。一部の実施形態では、天然状況、例えば、バクテリオファージゲノム、プラスミド又は細菌ゲノム中のインテグラーゼコード配列の近接領域、例えば、表2A、2B又は2Cの左側領域又は右側領域は、リコンビナーゼ酵素のネイティブ付着部位を含む。一部の実施形態では、最小付着部位は、産生組換え反応に十分な最小配列が発見されるまで、インテグラーゼ近接配列の断片、例えば、表2A、2B又は2Cの左側領域又は右側領域を試験することにより実験的に発見することができる。一部の実施形態では、インテグラーゼ近接配列、例えば表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域又はその断片を検定して、各ヌクレオチドの重要性を決定し、例えば、Bessen et al.Nat Commun 10:1937(2019)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)の方法に従いライブラリーフォーマットでプロファイリングする。一部の実施形態では、リコンビナーゼ又はリコンビナーゼ認識部位は、改変されたタンパク質-核酸相互作用特性についての進化プロセスを介して選択され、例えば、国際公開第2017015545号パンフレット(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、Gene Writerシステムに用いられるリコンビナーゼが進化される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ及び/又はリコンビナーゼ認識部位は、例えば、Yang et al.Nat Methods 11(12):1261-1266(2014)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、ネイティブ宿主ゲノム中に組み込まれるエレメント、例えば、組み込まれるバクテリオファージ又は組み込まれるプラスミドの末端の予測を介して発見される。
一部の実施形態では、attL又はattR部位はヒトゲノム中に存在し、鋳型DNAは、コグネイト部位を含み、例えば、鋳型は、ゲノムがattL配列を含む場合、attR配列を含む。一部の実施形態では、Gene WritingシステムにおいてattL/R認識部位が用いられる場合、システムは、それらの部位の認識及び組換えを可能にするための組換え方向性因子(RDF)も含む。一部の実施形態では、Gene Writerポリペプチド及びコグネイトRDFは、融合ポリペプチドとして提供される。例示的なリコンビナーゼ-RDF融合物は、Olorunniji et al.Nucleic Acids Res 45(14):8635-8645(2017)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writing(商標)システムのタンパク質成分は、鋳型(例えば、DNA鋳型)と予め会合させることができる。例えば、一部の実施形態では、Gene Writer(商標)ポリペプチドを最初にDNA鋳型と組み合わせて、デオキシリボ核タンパク質(DNP)複合体を形成することができる。一部の実施形態では、DNPは、トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス、ベシクル、LNP、エキソソーム、フソソームを介して細胞に送達することができる。一部の実施形態では、鋳型DNAは、最初にDNA屈曲因子、例えばHMGB1と会合させて、続いてトランスポザーゼ成分と接触した場合に切除及び転位を促進することができる。DNP送達の追加の説明は、例えば、Guha and Calos J Mol Biol(2020)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に見出される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、1つ又は複数の(例えば、2、3、4、5)の核ターゲティング配列、例えば核局在化配列(NLS)を含む。一部の実施形態では、NLSは、双節型NLSである。一部の実施形態では、NLSは、NLSを含むタンパク質の細胞核への移入を促進する。一部の実施形態では、NLSは、本明細書に記載のGene WriterのN末端と融合される。一部の実施形態では、NLSは、Gene WriterのC末端と融合される。一部の実施形態では、NLSは、CasドメインのN末端又はC末端と融合される。一部の実施形態では、リンカー配列は、NLSと、Gene Writerの隣接ドメインとの間に配置される。
一部の実施形態では、NLSは、アミノ酸配列:MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号3432)、PKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV(配列番号3433)、RKSGKIAAIWKRPRKPKKKRKV KRTADGSEFESPKKKRKV(配列番号3434)、KKTELQTTNAENKTKKL(配列番号3435)又はKRGINDRNFWRGENGRKTR(配列番号3436)、KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号3437)又はその機能性断片若しくは変異体を含む。例示的なNLS配列は、PCT/欧州特許第2000/011690号明細書にも記載されており、その内容は、その例示的な核局在化配列の開示について、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、NLSは、双節型(bipartite)NLSである。双節型NLSは、典型的に、スペーサ配列によって隔てられる2つの塩基性アミノ酸クラスター(例えば、約10アミノ酸長であり得る)を含む。単節型(monopartite)NLSは、典型的に、スペーサを欠いている。双節型NLSの例は、配列KR[PAATKKAGQA]KKKK(配列番号3437)(括弧内はスペーサ)を有するヌクレオプラスミンNLSである。別の例示的な双節型NLSは、配列:PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV(配列番号3438)を有する。例示的なNLSは、国際公開第2020051561号パンフレット(核局在化配列に関する開示を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
DNA結合ドメイン
一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、本明細書に記載のシステム又は細胞に含まれる)、例えばチロシンリコンビナーゼは、DNA結合ドメイン(例えば、標的結合ドメイン又は鋳型結合ドメイン)を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のリコンビナーゼポリペプチドをヒトゲノム中の規定標的部位に対して向け直すことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のリコンビナーゼを、異種ドメイン、例えば異種DNA結合ドメインに融合させ得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼを、異種DNA結合ドメイン、例えばジンクフィンガー、TAL、メガヌクレアーゼ、転写因子又は配列誘導DNA結合エレメントからのDNA結合ドメインに融合し得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼを、配列誘導DNA結合エレメント、例えば、CRISPR関連(Cas)DNA結合エレメント、例えば、Cas9からのDNA結合ドメインと融合させ得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメインと融合したDNA結合エレメントは、他の触媒機能を不活性化する突然変異、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を不活性化する突然変異、例えば、不活性化メガヌクレアーゼを生成するか、又はCasタンパク質を部分的若しくは完全に不活性化する突然変異、例えば、ニッカーゼCas9若しくは不活性型Cas9(dCas9)を生成する突然変異を含み得る。一例として、Standage-Beier et al.CRISPR J 2(4):209-222(2019)は、HEK293細胞のゲノムへのリポータシステムの配列特異的組込みの協調ターゲティングのための標的部位で適切な間隔の2つのモノマー融合タンパク質を用いるTn3レゾルバーゼ(インテグラーゼCas9、iCas9)に融合しているdCas9の使用を記載している。DNA結合ドメインによるリコンビナーゼターゲティングの追加の例として、ジンクフィンガー融合物(ジンクフィンガーリコンビナーゼ、ZFR(Gaj et al.Nucleic Acids Res 41(6):3937-3946(2013));RecZF(Gersbach et al.Nucleic Acids Res 38(12):4198-4206(2010)))、TALE融合物(TALEリコンビナーゼ、TALER(Mercer et al.Nucleic Acids Res 40(21):11163-11172(2012)))及びdCas9融合物(リコンビナーゼCas9、recCas9(Chaikind et al.Nucleic Acids Res 44(20):9758-9770(2016));インテグラーゼCas9、iCas9(Standage-Beier et al.CRISPR J 2(4):209-222(2019)))(その全てが、参照により本明細書に組み込まれる)が挙げられる。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、化膿性レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)又はその機能性断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、修飾SpCas9を含む。複数の実施形態では、修飾SpCas9は、プロトスペーサ-隣接モチーフ(PAM)特異性を改変する修飾を含む。複数の実施形態では、PAMは、核酸配列5’-NGT-3’に対する特異性を有する。複数の実施形態では、修飾SpCas9は、例えば、L1111、D1135、G1218、E1219、A1322又はR1335の1つ若しくは複数の位置に、1つ若しくは複数のアミノ酸置換を含み、それは、例えば、L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、R1335Vから選択される。複数の実施形態では、修飾SpCas9は、アミノ酸置換T1337Rと、L1111、D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、R1335Q、T1337、T1337L、T1337Q、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337H、T1337Q及びT1337M又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される1つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。複数の実施形態では、修飾SpCas9は、(i)D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、A1322R、R1335Q及びT1337から選択される1つ若しくは複数のアミノ酸置換;並びに(ii)L1111R、G1218R、E1219F、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、T1337L、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337R、T1337H、T1337Q及びT1337M又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される1つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、Casドメイン、例えばCas9ドメインを含む。複数の実施形態では、DNA結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Casドメイン、Casニッカーゼ(nCas)ドメイン又はヌクレアーゼ不活性Cas(dCas)を含む。複数の実施形態では、DNA結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Cas9ドメイン、Cas9ニッカーゼ(nCas9)ドメイン又はヌクレアーゼ不活性Cas9(dCas)を含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、Cas9のCas9ドメイン(例えば、dCas9及びnCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h又はCas12iを含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、Cas9(例えば、dCas9及びnCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h又はCas12iを含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、化膿性レンサ球菌(S.pyogenes)若しくはS.サーモフィラス(S.thermophilus)Cas9又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、例えば、Chylinski,Rhun,and Charpentier(2013)RNA Biology 10:5,726-737(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、Cas9配列を含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、Cas、例えば、本明細書に記載されるように、Cas9又はその変異体のHNHヌクレアーゼサブドメイン及び/又はRuvC1サブドメインを含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h又はCas12iを含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、Casポリペプチド(例えば、酵素)又はその機能性断片を含む。複数の実施形態では、Casポリペプチド(例えば酵素)は、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9(例えば、Csn1若しくはCsx12)、Cas10、Cas10d、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csx11、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、II型Casエフェクタータンパク質、V型Casエフェクタータンパク質、VI型Casエフェクタータンパク質、CARF、DinG、Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、SpCas9(K855A)、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、超精密(hyper accurate)Cas9変異体(HypaCas9)、それらの相同体、それらの修飾若しくは操作バージョン及び/又はそれらの機能性断片から選択される。複数の実施形態では、Cas9は、例えば、H840A、D10A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A及びD1127Aから選択される1つ又は複数の置換を含む。複数の実施形態では、Cas9は、D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986及び/又はA987から選択される位置に1つ若しくは複数の突然変異、例えば、D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A及び/又はD986Aから選択される1つ若しくは複数の置換を含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、コリネバクテリウム・ウルセランス(Corynebacterium ulcerans)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、スピロプラズマ・シルフィディコーラ(Spiroplasma syrphidicola)、プレボテーラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、スピロプラズマ・タイワネンス(Spiroplasma taiwanense)、ストレプトコッカス・イニエ(Streptococcus iniae)、ベルリエラ・バルティカ(Belliella baltica)、サイクロフレクサス・トークイス(Psychroflexus torquis)、スタフィロコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、化膿性レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)若しくは黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)又はその機能性断片若しくは変異体に由来するCas(例えば、Cas9)配列を含む。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、例えば、位置:D917、E1006A、D1255又はそれらの任意の組合せに、例えば、D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A及びD917A/E1006A/D1255Aから選択される、1つ若しくは複数の置換を含む、Cpf1ドメインを含む。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、spCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9(sp)、saCas9、saCas9-KKH、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK又はspCas9-LRVSQLを含む。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、以下の表37に列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50以下の相違(例えば、突然変異)を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2023502473000738
Figure 2023502473000739
Figure 2023502473000740
一部の実施形態では、Casポリペプチドは、DNA結合ドメイン結合を指令するgRNAと結合する。一部の実施形態では、gRNAは、例えば、5’から3’に、(1)gRNAスペーサ;(2)gRNAスカフォールドを含む。一部の実施形態では:
(1)は、約18~22ntのCas9スペーサであり、例えば、20ntである。
(2)は、鋳型をニッカーゼCas9ドメインと結合させるための1つ又は複数のループ、例えば、1、2若しくは3つのループを含むgRNAスカフォールドである。一部の実施形態では、gRNAスカフォールドは、5’から3’に、配列:
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCC(配列番号3444)
を担持する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writingシステムを使用して、HEK293、K562、U2OS又はHeLa細胞に編集を実施する。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを使用して、初代細胞、例えば、E18.5マウスからの初代皮質ニューロンに編集を実施する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステム又は方法は、米国特許出願公開第20200063126号明細書、米国特許出願公開第20190002889号明細書若しくは米国特許出願公開第20190002875号明細書(それらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるCRISPR DNAターゲティング酵素若しくはシステム又はその機能性断片若しくは変異体を含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるGeneWriterポリペプチド又はCasエンドヌクレアーゼは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載のポリペプチド配列を含み、一部の実施形態では、ガイドRNAは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載の核酸配列を含む。
一部の実施形態では、DNA結合ドメイン(例えば、標的結合ドメイン又は鋳型結合ドメイン)は、メガヌクレアーゼドメイン又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼ活性、例えば、二本鎖切断及び/又はニッカーゼ活性を有する。他の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、低下した活性を有し、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を欠失しており、例えば、メガヌクレアーゼは、触媒活性が欠失している。一部の実施形態では、例えば、Fonfara et al.Nucleic Acids Res 40(2):847-860(2012)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、触媒活性が欠失したメガヌクレアーゼをDNA結合ドメインとして使用する。複数の実施形態では、DNA結合ドメインは、野生型DNA結合ドメインに対して1つ又は複数の修飾、例えば、指向性方向進化、例えば、ファージ支援連続進化(PACE)による修飾を含む。
インテイン
一部の実施形態では、以下にさらに詳しくされるように、インテイン-Nを、本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、Gene Writerポリペプチド)のN-末端部分と、例えば、第1ドメインで、融合させることができる。複数の実施形態では、インテイン-Cを本明細書に記載されるポリペプチドのC-末端部分と(例えば、第2ドメインで)融合させて、例えば、N-末端部分をC-末端部分と連結し、それにより、第1ドメインと第2ドメインを連結することもできる。一部の実施形態では、第1ドメイン及び第2ドメインは、各々独立して、DNA結合ドメイン及び触媒ドメイン、例えばリコンビナーゼドメインから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のインテイン戦略、例えば、DNA結合ドメイン、例えばdCas9ドメインを用いて、単一ドメインを分断する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、例えば、フランキングするN-末端及びC-末端エクステイン(例えば、連結しようとする断片)を連結する、自己スプライシングタンパク質イントロン(例えば、ペプチド)であるインテインを含む。インテインは、いくつかの事例では、自動的に切除されて、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスで、残りの断片(エクステイン)をペプチド結合と連結させることができるタンパク質の断片を含み得る。インテインは、「タンパク質イノン(protein inon)」とも呼ばれる。自動的に切除されて、タンパク質の残り部分を連結させるインテインのプロセスは、本明細書では、「タンパク質スプライシング」又は「インテイン媒介性タンパク質スプライシング」と称される。一部の実施形態では、前駆体タンパク質(インテイン媒介性タンパク質スプライシング前のインテイン含有タンパク質)のインテインは、2つの遺伝子に由来する。こうしたインテインは、本明細書において、スプリットインテイン(例えば、スプリットインテイン-N及びスプリットインテイン-C)と呼ばれる。例えば、シアノバクテリア(cyanobacteria)では、DNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットであるDnaEは、2つの個別の遺伝子、dnaE-n及びdnaE-cによってコードされる。dnaE-n遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「インテイン-N」と呼ばれ得る。dnaE-c遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「インテイン-C」と呼ばれ得る。
異種タンパク質断片を連結するためのインテインの使用は、例えば、Wood et al.,J.Biol.Chem.289(21);14512-9(2014)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。例えば、個別のタンパク質断片に融合されると、インテインIntN及びIntCは、互いを認識し、それ自体からスプライシングして、且つ/又は同時に、それらが融合されているタンパク質断片のN-及びC-末端エクステインを連結し、それにより、2つのタンパク質断片から完全長タンパク質を再構成することができる。
一部の実施形態では、dnaEインテイン、Cfa-N(例えば、スプリットインテイン-N)及びCfa-C(例えば、スプリットインテイン-C)インテイン対に基づく合成インテインを使用する。こうしたインテインの例は、例えば、Stevens et al.,J Am Chem Soc.2016 Feb.24;138(7):2162-5(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。本開示に従って使用することができるインテイン対の非限定的な例として、Cfa DnaEインテイン、Ssp GyrBインテイン、Ssp DnaXインテイン、Ter DnaE3インテイン、Ter ThyXインテイン、Rma DnaBインテイン及びCne Prp8インテイン(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,394,604号明細書に記載されるような)が挙げられる。
一部の実施形態では、インテイン-N及びインテイン-Cは、スプリットCas9のN-末端部分とスプリットCas9のC-末端部分との連結のために、スプリットCas9のN-末端部分及びスプリットCas9のC-末端部分にそれぞれ融合し得る。例えば、一部の実施形態では、インテイン-NをスプリットCas9のN-末端部分のC-末端に融合させ、即ちN-[スプリットCas9のN-末端部分]-[インテイン-N]~Cの構造を形成する。一部の実施形態では、インテイン-CをスプリットCas9のC-末端部分のN-末端に融合させ、即ちN-[インテイン-C]~[スプリットCas9のC-末端部分]-Cの構造を形成する。インテインが連結したタンパク質(例えば、スプリットCas9)を連結させるためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、Shah et al.,Chem Sci.2014;5(l):446-46l(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。インテインを設計及び使用する方法は、例えば、国際公開第2020051561号パンフレット、国際公開第2014004336号パンフレット、国際公開第2017132580号パンフレット、米国特許出願公開第20150344549号明細書及び米国特許出願公開第20180127780号明細書(それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
一部の実施形態では、スプリットは、2つ以上の断片中の分割を指す。一部の実施形態では、スプリットCas9タンパク質又はスプリットCas9は、Cas9タンパク質であり、これは、2つの個別のヌクレオチド配列によりコードされるN-末端断片及びC-末端断片として提供される。Cas9タンパク質のN-末端部分及びC-末端部分に対応するポリペプチドはスプライシングされて、再構成Cas9タンパク質を形成し得る。複数の実施形態では、Cas9タンパク質は、Nishimasu et al.,Cell,Volume 156,Issue 5,pp.935-949,2014に記載されているか、又はJiang et al.(2016)Science 351:867-871及びPDB file:5F9Rに記載されている(それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)ように、タンパク質の変性領域内で2つの断片に分割される。変性領域は、当技術分野で公知の1つ又は複数のタンパク質構造決定技術により決定することができ、そうしたものとして、限定はしないが、X線結晶構造解析、NMR分光法、電子顕微鏡法(例えば、cryoEM)及び/又はインシリコタンパク質モデル化が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、アミノ酸A292-G364、F445-K483若しくはE565-T637間のSpCas9の領域内の任意のC、T、A若しくはS或いはいずれかの他のCas9、Cas9変異体(例えば、nCas9、dCas9)又は他のnapDNAbp内の対応する位置で、2つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質は、SpCas9 T310、T313、A456、S469又はC574で2つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質を2つの断片に分割するプロセスは、タンパク質の分断と呼ばれる。
一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約2~1000アミノ酸(例えば、2~10、10~50、50~100、100~200、200~300、300~400、400~500、500~600、600~700、700~800、800~900又は900~1000アミノ酸)の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約5~500アミノ酸(例えば、5~10、10~50、50~100、100~200、200~300、300~400又は400~500アミノ酸)の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約20~200アミノ酸(例えば、20~30、30~40、40~50、50~100又は100~200アミノ酸)の範囲である。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるGene Writerポリペプチドの部分又は断片をインテインと融合させる。ヌクレアーゼをインテインのN-末端又はC-末端と融合させることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質の部分又は断片をインテインと融合させると共に、AAVカプシドタンパク質と融合させる。インテイン、ヌクレアーゼ及びカプシドタンパク質を、任意の配置(例えば、ヌクレアーゼ-インテイン-カプシド、インテイン-ヌクレアーゼ-カプシド、カプシド-インテイン-ヌクレアーゼなど)で一緒に融合させることができる。一部の実施形態では、インテインのN-末端を融合タンパク質のC-末端と融合させ、インテインのC-末端をAAVカプシドタンパク質のN-末端と融合させる。
一部の実施形態では、Gene Writerポリペプチド(例えば、ニッカーゼCas9ドメインを含む)をインテイン-Nと融合させ、ポリメラーゼドメインを含むポリペプチドをインテイン-Cに融合させる。
インテインの例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下に記載する:
DnaEインテイン-N DNA:
Figure 2023502473000741
DnaEインテイン-Nタンパク質:
CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN(配列番号3446)
DnaEインテイン-C DNA:
ATGATCAAGATAGCTACAAGGAAGTATCTTGGCAAACAAAACGTTTATGATATTGGAGTCGAAAGAGATCACAACTTTGCTCTGAAGAACGGATTCATAGCTTCTAAT(配列番号3447)
インテイン-C:
MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN(配列番号3448)
Cfa-N DNA:
Figure 2023502473000742
Cfa-Nタンパク質:
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP(配列番号3450)
Cfa-C DNA:
Figure 2023502473000743
Cfa-Cタンパク質:
MKRTADGSEFESPKKKRKVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN(配列番号3452)
ゲノムセーフハーバー部位
一部の実施形態では、Gene Writerは、ゲノムセーフハーバー部位をターゲティングする(例えば、異種目的配列の挿入を、少なくとも3、4、5、6、7若しくは8つのセーフハーバースコアを有する位置に向ける)。一部の実施形態では、ゲノムセーフハーバー部位は、Natural Harbor(商標)部位である。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、可動遺伝子エレメント、例えば、リコンビナーゼ、トランスポゾン、レトロトランスポゾン又はレトロウイルスのネイティブ標的に由来する。可動エレメントのネイティブ標的は、それらの進化的選択を考慮すると、ゲノム組込みのための理想的な位置として役立ち得る。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、リボソームDNA(rDNA)である。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、5SrDNA、18SrDNA、5.8SrDNA又は28SrDNAである。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、5SrDNA内のMutsu部位である。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、28SrDNA内のR2部位、R5部位、R6部位、R4部位、R1部位、R9部位又はRT部位である。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、18SrDNA内のR8部位又はR7部位である。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、転移RNA(tRNA)をコードするDNAである。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、tRNA-Asp又はtRNA-GluをコードするDNAである。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、スプライソソームRNAをコードするDNAである。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、U2snRNAなどの低分子核RNA(snRNA)をコードするDNAである。
従って、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるGene Writerシステムを用いて、異種目的配列をNatural Harbor(商標)部位に挿入することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、Natural Harbor(商標)部位は、以下の表4Aに記載する部位である。一部の実施形態では、異種目的配列は、Natural Harbor(商標)部位の20、50、100、150、200、250、500又は1000塩基対内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、Natural Harbor(商標)部位の0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb又は100kb内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表4Aに示す配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する部位に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表4Aに示す配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する部位の20、50、100、150、200、250、500若しくは1000塩基対内又は0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb若しくは100kb内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表4Aの第5列に示す遺伝子内又はその遺伝子の20、50、100、150、200、250、500若しくは1000塩基対内又は0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb若しくは100kb内に挿入される。
Figure 2023502473000744
Figure 2023502473000745
Figure 2023502473000746
Figure 2023502473000747
Figure 2023502473000748
Gene Writer(商標)のさらなる機能的特徴
本明細書に記載されるGene Writerは、いくつかの事例において、1つ若しくは複数の機能的測定又は特徴によって特性決定され得る。一部の実施形態では、DNA結合ドメイン(例えば、標的結合ドメイン)は、以下に記載する機能的特徴の1つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、以下に記載する機能的特徴の1つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型(例えば、鋳型DNA)は、以下に記載する機能的特徴の1つ又は複数を有する。一部の実施形態では、Gene Writerによって改変された標的部位は、Gene Writerによる改変後、以下に記載する機能的特徴の1つ又は複数を有する。
Gene Writerポリペプチド
DNA結合ドメイン
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、標準DNA結合ドメインよりも高い親和性で、標的配列(例えば、dsDNA標的配列)に結合することができる。一部の実施形態では、標準DNA結合ドメインは、ストレプトマイセス(Streptomyces)バクテリオファージphiC31由来のphiC31リコンビナーゼ由来のDNA結合ドメインである。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、100pM~10nM(例えば、100pM~1nM又は1nM~10nM)の親和性で、標的配列(例えば、dsDNA標的配列)に結合することができる。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインの、その標的配列(例えば、dsDNA標的配列)に対する親和性は、例えば、Asmari et al.Methods 146:107-119(2018)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、例えば熱泳動によりインビトロで測定される。
複数の実施形態では、DNA結合ドメインは、モル過剰の、例えば、約100倍モル過剰のスクランブル配列競合dsDNAの存在下において、例えば100pM~10nM(例えば、100pM~1nM又は1nM~10nM)の親和性で、その標的配列(例えば、dsDNA標的配列)に結合することができる。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、例えば、He and Pu(2010)Curr.Protoc Mol Biol Chapter 21(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、例えばChIP-seq(例えば、HEK293T細胞中で)により測定して、標的細胞、例えばヒト標的細胞のゲノム中のいずれかの他の配列よりも高い頻度で、その標的配列(例えば、dsDNA標的配列)と結合していることが認められる。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、例えば、前掲したHe and Pu(2010)に記載されているように、例えばChIP-seq(例えば、HEK293T細胞中で)により測定して、標的細胞のゲノム中のいずれかの他の配列より少なくとも5倍又は10倍高い頻度で、その標的配列(例えば、dsDNA標的配列)と結合していることが認められる。
鋳型結合ドメイン
一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、標準DNA結合ドメインよりも高い親和性で、鋳型DNAに結合することができる。一部の実施形態では、標準DNA結合ドメインは、ストレプトマイセス(Streptomyces)バクテリオファージphiC31由来のphiC31リコンビナーゼ由来のDNA結合ドメインである。一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、100pM~10nM(例えば、100pM~1nM又は1nM~10nM)の親和性で、鋳型DNAに結合することができる。一部の実施形態では、DNA結合ドメインの、その鋳型DNAに対する親和性は、例えば、Asmari et al.Methods 146:107-119(2018)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、例えば熱泳動によりインビトロで測定される。一部の実施形態では、DNA結合ドメインの、その鋳型DNAに対する親和性は、細胞中で(例えば、FRET又はChIP-Seqにより)測定される。
一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、例えば、Yant et al.Mol Cell Biol 24(20):9239-9247(2004)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、10nM競合DNAの存在下で、少なくとも50%鋳型DNAが結合した状態で、インビトロで鋳型DNAと会合する。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、スクランブルDNAとの場合よりも、少なくとも約5倍又は10倍高い頻度で、細胞中(例えば、HEK293T細胞中)の鋳型DNAと会合する。一部の実施形態では、DNA結合ドメインと鋳型DNA又はスクランブルDNAとの会合の頻度は、例えば、前掲のHe and Pu(2010)に記載されているように、ChIP-seqにより測定される。
標的部位
一部の実施形態では、Gene Writing後、組込み配列の周囲の標的部位は、例えば、Karst et al.(2020)bioRxiv doi.org/10.1101/645903(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシングにより決定して、例えば、約50%若しくは10%未満の組込み事象に、限定的な数の挿入又は欠失を含む。例えば、Thyagarajan et al Mol Cell Biol 21(12):3926-3934(2001)(その教示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、phiC31インテグラーゼによるヒトゲノム疑似部位への挿入DNAの組込み後にインデルが観察されている。一部の実施形態では、本発明のGene Writingシステムは、20nt未満、例えば20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2未満又は1nt未満のDNAを含む標的部位(例えば、挿入DNAの組込みに隣接する、例えば挿入DNA組込みの部位)のゲノム修飾(例えば、挿入又は欠失)をもたらし得る。一部の実施形態では、本発明のGene Writingシステムは、20ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2未満又は1ヌクレオチド又は塩基対未満のDNAを含む標的部位(例えば、挿入DNAの組込みに隣接する、例えば挿入DNA組込みの部位)の挿入をもたらし得る。一部の実施形態では、本発明のGene Writingシステムは、20ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2未満又は1ヌクレオチド又は塩基対未満のゲノムDNAを含む標的部位(例えば、挿入DNAの組込みに隣接する、例えば挿入DNA組込みの部位)の欠失をもたらし得る。一部の実施形態では、挿入又は欠失事象の割合は、標的部位の認識配列、例えばattB、attP又はその疑似部位のコア領域、例えば中央ジヌクレオチドが挿入DNA上の認識配列、例えばattP又はattB部位のコア領域、例えば、中央ジヌクレオチドと100%の同一性を含む場合により低い。一部の実施形態では、意図されない挿入又は欠失事象の割合は、標的部位の認識配列の中央ジヌクレオチドが挿入DNA中の認識配列の中央ジヌクレオチドと同一である場合、標的ゲノム部位において、例えば少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は少なくとも100倍、より低い。
一部の実施形態では、標的部位は、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング(実施例29)により決定して、多重挿入事象、例えば、頭-尾又は頭-頭重複を示さない。一部の実施形態では、標的部位は、標的部位で100挿入コピー未満、例えば75挿入コピー、50挿入コピー、45挿入コピー、40挿入コピー、35挿入コピー、30挿入コピー、25挿入コピー、20挿入コピー、15挿入コピー、14挿入コピー、13挿入コピー、12挿入コピー、11挿入コピー、10挿入コピー、9挿入コピー、8挿入コピー、7挿入コピー、6挿入コピー、5挿入コピー、4挿入コピー、3挿入コピー、2挿入コピー又は単一挿入コピーを示す。一部の実施形態では、挿入配列の2コピー以上を示す標的部位は、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング(実施例29)により決定して、挿入物を含有する標的部位の95%未満、例えば挿入物を含有する標的部位の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%未満又は1%未満に存在する。一部の実施形態では、挿入配列の3コピー以上を示す標的部位は、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング(実施例29)により決定して、挿入物を含有する標的部位の95%未満、例えば挿入物を含有する標的部位の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%未満又は1%未満に存在する。一部の実施形態では、挿入配列の4コピー以上を示す標的部位は、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング(実施例29)により決定して、挿入物を含有する標的部位の95%未満、例えば挿入物を含有する標的部位の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%未満又は1%未満に存在する。一部の実施形態では、標的部位は、1標的部位当たり少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10コピー以上を示す。一部の実施形態では、挿入配列の複数のコピーを示す標的部位は、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング(実施例29)により決定して、挿入物を含有する標的部位の1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上に存在する。一部の実施形態では、コピーは、コンカテマーであり、即ちコンカテマー化される。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型DNA(例えば、プラスミド全体、ミニサークル又はウイルスベクターゲノム)に対応する組込み配列を含有する。一部の実施形態では、標的部位は、完全に組み込まれた鋳型分子を含有する。一部の実施形態では、標的部位は、ベクターDNA、例えばAAV ITRの成分を含有する。一部の実施形態では、標的部位は、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のITRを組込み後に含有する。一部の実施形態では、少なくとも1つのITRが組込み後に標的部位の少なくとも1%に存在し、例えば、組込み後に標的部位の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、60%、70%、80%、90、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%に存在する。一部の実施形態では、少なくとも1つのITRが、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング(実施例29)により決定して、組込み後に標的部位の50%未満に存在し、例えば、組込み後に標的部位の50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%未満又は1%未満に存在する。一部の実施形態では、複数のコピーは、頭-頭、尾-尾若しくは頭-尾配置又はそれらの混合で配置される。一部の実施形態では、例えば、組込み前の第1組換え事象により、鋳型DNAがウイルスベクター又はプラスミドから最初に切除される場合、標的部位は、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング(実施例29)により決定して、事象の約50%超に、例えば、事象の約50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、4%、4%、3%、2%超又は約1%超に、認識部位フランキングカセットに対して外性のDNAを含む挿入物、例えばベクターDNA、例えばAAV ITRを含有しない。一部の実施形態では、組み込まれたDNAは、いかなる細菌抗生物質耐性遺伝子も含まない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writingシステムにより標的部位で組み込まれるDNAは、末端ハイブリッド認識配列(例えば、本明細書に記載されるように、例えば第1及び/又は第2パラパリンドローム配列)、例えば挿入DNAの認識部位間の組換えにより形成されるattL及びattR配列、例えば挿入DNAのattP又はattB及び標的DNA中の認識部位、例えば、attP若しくはattB部位又はその疑似部位を含む。一部の実施形態では、組込みDNAは、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattR配列間の1つ又は複数のITR、例えば1、2、3、4つ以上のITRを含む。一部の実施形態では、組込みDNAを有する標的部位の少なくとも1%、例えば、組込みDNAの少なくとも1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又は少なくとも90%が、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列間のITRを含む。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattR配列間のITRを含む組込みDNAは、挿入DNAの単一コピーを含み、例えば、モノマー挿入物である。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列を含み、いかなる内部ITRも欠く。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列並びに単一の内部ITRを含む。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列並びに複数の内部ITR、例えば、2つの内部ITRを含む。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列間のITRを含む組み込まれるDNAは、挿入DNAの複数のコピーを含み、例えばコンカテマー挿入物である。一部の実施形態では、コンカテマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列並びに挿入DNAの少なくとも2コピー、例えば少なくとも2、3又は4コピーを含む。一部の実施形態では、挿入DNAの少ないコピー数を含む、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列を含む挿入物は、挿入DNAのより多いコピー数を有するものと比較して高い頻度で存在し(例えば、1コピーを有する挿入物は2コピーを有する挿入物よりも高い頻度で存在し、2コピーを有する挿入物は3コピーを有する挿入物よりも高い頻度で存在するか、又は1コピーを有する挿入物は3コピーを有する挿入物よりも高い頻度で存在する)、より高い発生頻度を示し、例えば、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、ダイマー挿入物よりも高い頻度で存在し、例えば、ダイマー挿入物よりも少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、ダイマー挿入物は、トリマー挿入物よりも高い頻度で存在し、例えば、トリマー挿入物よりも少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、モノマーとダイマー挿入物は、コンカテマー挿入物(3つ以上の挿入物)よりも高い頻度で存在し、例えば、コンカテマー挿入物よりも少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、コンカテマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列並びに1つ又は複数の内部リコンビナーゼ認識配列、例えば1、2、3、4つ以上の内部認識配列、例えばattB又はattP配列を含む。一部の実施形態では、コンカテマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列並びに1つ又は複数の内部ITR、例えば1、2、3、4、5、6つ以上の内部ITRを含む。本明細書に記載される挿入DNAのコピー数、認識配列及びITR並びにそれらの成分の相対的位置決めは、実施例29及びKaykov et al Sci Rep 6:19636(2016)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、分子コーミングを用いて決定することができる。
一部の実施形態では、組み込まれるDNAが末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列を含まない挿入事象が生じ得る。一部の実施形態では、組み込まれるDNAは、1つの末端認識配列、例えばattL又はattR配列を含み得る。一部の実施形態では、組み込まれるDNAは、いかなる末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattRも有しなくてよく、例えば組み込まれるDNAのいずれの末端もハイブリッド認識配列、例えばattL又はattR配列を含まない。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattR配列を含まない組み込まれるDNAは、挿入DNAの断片(例えば、不完全な挿入DNA、例えば不完全なプロモータ、遺伝子又は異種目的配列を有する挿入DNA)を含む。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattR配列を含まない組み込まれるDNAは、不完全な複数の挿入DNA配列を含み、例えば1未満、1超及び2未満、2超及び3未満、3超及び4未満又は完全挿入DNAの別の不完全な複数のコピーを含有する。
一部の実施形態では、Gene Writingシステムの使用後、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列を含む新たに組み込まれるDNAは、本明細書に記載されるアッセイ、例えば、ロングリードシーケンシング又は分子コーミングにより測定して、細胞又は細胞の集団に高い頻度で存在し、例えば1つ又はいくつかの末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattR配列を含む新たに組み込まれるDNAと比較して総挿入事象の50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、96%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超又は99.9%超を構成する。一部の実施形態では、Gene Writingシステムの使用後、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列を含む新たに組み込まれるDNAは、1つ又はいくつかの末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattP配列を含む組込み事象の平均挿入DNAコピー数と比較して、1挿入事象当たりの低い平均挿入DNAコピー数を含み、例えば平均で1挿入事象当たり少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5又は2.0コピー少なく含む。一部の実施形態では、Gene Writingシステムの使用後、末端ハイブリッド認識配列、例えばattL及びattR配列を含む新たに組み込まれるDNAは、1つ又はいくつかの末端ハイブリッド認識配列、例えばattL又はattP配列を含む挿入DNA配列のパーセンテージと比較して、高いパーセンテージの完全挿入DNA配列を含み、例えば少なくとも0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×、0.7×、0.8×、0.9×、1.0×、1.5×、2.0×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×以上のパーセントの完全挿入DNA配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writerは、標的DNAの部位特異的編集、例えば、標的DNAへの鋳型DNAの挿入が可能である。一部の実施形態では、部位特異的Gene Writerは、編集、例えば、挿入を作製することができ、それは、そのゲノム中のいずれかの他の部位より高い頻度で標的部位に存在する。一部の実施形態では、部位特異的Gene Writerは、ヒトゲノム中の全ての他の部位の頻度の少なくとも2、3、4、5、10、50、100若しくは1000倍の頻度で、標的部位に編集、例えば、挿入を作製することができる。一部の実施形態では、組込み部位の位置は、例えば、実施例18におけるように、一方向シーケンシングにより決定される。ライブラリー調製に使用されるアダプター又はプライマーへのユニークな分子識別子(UMI)の組込みにより、個別の挿入事象の定量が可能になり、それをオンターゲット挿入及び他全ての挿入間で比較して、規定標的部位に対する優先性を決定することができる。一部の実施形態では、インバースPCRアプローチを用いて、例えば実施例30におけるように、特定のGene Writerによりターゲティングされる組込み部位を決定する。
一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、ヒトゲノム中の単一位置に存在する標的DNA配列を編集する。一部の実施形態では、単一相同性染色体上のヒトゲノム中の単一位置に存在する標的DNA配列を編集するために、Gene Writingが使用され、例えば、これは、ハロタイプ特異的である。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、2つの相同性染色体上のヒトゲノム中の単一位置に存在する標的DNA配列を編集する。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、ゲノム中の複数の位置、例えば、ゲノム中の少なくとも2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000、5000、10000、100000、200000、500000、1000000(例えば、Alu元素)の位置に存在する、標的DNA配列を編集する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるGene Writingシステムは、1つ又は複数の位置に存在し得るヒトゲノム中の単一標的配列で組込みを実施する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるGene Writingシステムは、ヒトゲノム中の少なくとも1回存在する複数の配列で組込みを実施し、例えば1超、例えば1、2、3、4、5、10、20、50若しくは100超の配列又はヒトゲノム中の少なくとも1回存在する100未満、例えば100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15、10若しくは5未満の配列を認識する。従って、一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writerは、1細胞当たり少なくとも1コピー、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは少なくとも10コピー又は1細胞当たり10コピー未満、例えば10、9、8、7、6、5、4、3未満若しくは2コピー未満で挿入DNAの組込みをもたらし得る。
一部の実施形態では、Gene Writerシステムは、望ましくない突然変異を導入することなく、ゲノムを編集することができる。一部の実施形態では、Gene Writerシステムは、鋳型、例えば、鋳型DNAをゲノムに挿入することにより、ゲノムを編集することができる。一部の実施形態では、ゲノム中に得られた修飾は、鋳型DNA配列に対して最小限の突然変異を含む。一部の実施形態では、鋳型DNAと比較したゲノム挿入の平均誤り率は、1ヌクレオチド当たり10-4、10-5又は10-6未満の突然変異である。一部の実施形態では、標的細胞に導入される鋳型DNAに対する突然変異の数は、平均して、1ゲノム当たり1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100ヌクレオチド未満である。一部の実施形態では、標的ゲノムにおける挿入の誤り率は、例えば、前掲のKarst et al.(2020)に記載されているように、既知標的部位にわたるロングリードアンプリコンシーケンシング後、鋳型DNA配列と比較することにより決定される。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド欠失を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド挿入を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド置換、欠失又は挿入の1つ又は複数の組合せを含む。
組込み事象の効率を、Gene Writerシステムによる標的部位又は標的細胞の編集の尺度として使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writerシステムは、標的部位又は標的細胞の画分に異種目的配列を組み込むことができる。一部の実施形態では、Gene Writerシステムは、標的全体を増幅した後、例えば、Karst et al.(2020)に記載されているように、例えばロングリードアンプリコンシーケンシングにより解析した場合、編集物の検出により測定して、標的遺伝子座の少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%を編集することができる。一部の実施形態では、Gene Writerシステムは、例えば、Lin et al.Hum Gene Ther Methods 27(5):197-208(2016)に記載の方法に従い、例えば、トランスジーン特異的プライマー-プローブセットを用いるddPCRにより決定した場合、細胞の集団全体で、標準遺伝子、例えばRPP30に対して正規化して、1ゲノム当たり少なくとも0.1、例えば、少なくとも0.1、0.5、1、2、3、4、5、10若しくは100コピーの平均コピー数で、細胞を編集することができる。
一部の実施形態では、1細胞当たりのコピー数は、例えば、Igarashi et al.Mol Ther Methods Clin Dev 6:8-16(2017)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の方法に従い、単一細胞ddPCR(sc-ddPCR)により分析される。一部の実施形態では、トランスジーン特異的プライマー-プローブセットを用いたsc-ddPCRにより評価して、標的細胞の少なくとも1%、例えば、少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%が、組込みについて陽性である。一部の実施形態では、平均コピー数は、トランスジーン特異的プライマー-プローブセットを用いたsc-ddPCRにより測定して、1細胞当たり少なくとも0.1、例えば、少なくとも0.1、0.5、1、2、3、4、5、10又は100コピーである。
一部の実施形態では、標的部位は、核酸配列のペアを含み、核酸配列の一方は他方の核酸配列に対して回文であるか、又は他方の核酸配列に対する回文と少なくとも20%(例えば、少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)、例えば少なくとも50%の配列同一性を有するか、若しくは他方の核酸配列に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列ミスマッチを有する。
挿入DNA
一部の実施形態では、本明細書に記載される挿入DNAは、例えば、本明細書に記載されるように、例えばリコンビナーゼポリペプチド(例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド)により、標的DNA分子に組み込むことができる核酸配列を含む。挿入DNAは、典型的に、システムの1つ又は複数のリコンビナーゼポリペプチド(例えば、リコンビナーゼポリペプチドの複数のコピー)に結合することができる。一部の実施形態では、挿入DNAは、リコンビナーゼポリペプチド(例えば、本明細書に記載の認識配列)に結合することができる領域を含む。
挿入DNAは、一部の実施形態では、標的DNAに挿入するための目的配列を含む。目的配列は、コーディング又はノンコーディングのいずれでもあり得る。一部の実施形態では、目的配列は、オープンリーディングフレームを含み得る。一部の実施形態では、挿入DNAは、コザック配列を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、内部リボソーム進入部位を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、T2A又はP2A部位などの自己切断ペプチドを含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、開始コドンを含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、スプライスアクセプター部位を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、スプライスドナー部位を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、例えば、停止コドンの下流に、microRNA結合部位を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、例えば、オープンリーディングフレームの停止コドンの下流に、ポリAテイルを含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、1つ又は複数のエキソンを含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、1つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、真核生物転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、増強された翻訳エレメント又は翻訳増強エレメントを含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、microRNA配列、siRNA配列、ガイドRNA配列、piwiRNA配列を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、エフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも1つの調節領域から構成される遺伝子発現単位を含む。エフェクター配列は、RNAに転写される配列(例えば、microRNAをコードする配列などのコーディング配列又はノンコーディング配列)であり得る。一部の実施形態では、目的配列は、ノンコーディング配列を含み得る。例えば、挿入DNAは、プロモータ又はエンハンサー配列を含み得る。一部の実施形態では、挿入DNAは、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含み、その各々は、一方向又は二方向であり得る。一部の実施形態では、プロモータは、RNAポリメラーゼIプロモータ、RNAポリメラーゼIIプロモータ又はRNAポリメラーゼIIIプロモータである。一部の実施形態では、プロモータは、TATAエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、B認識エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、転写因子のための1つ又は複数の結合部位を有する。
一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、内在性イントロン中の標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、標的ゲノムに挿入され、それにより、新たなエキソンとして作用する。一部の実施形態では、標的ゲノムへの目的配列の挿入により、天然のエキソンの置換又は天然のエキソンのスキッピングが起こる。一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、AAVS1、CCR5又はROSA26などのゲノムセーフハーバー部位中の標的部位に挿入される。一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、遺伝子間又は遺伝子内領域内のゲノムに付加される。一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、内在性活性遺伝子から0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb若しくは100kb内のゲノム5’又は3’に付加される。一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、内在性プロモータ又はエンハンサーから0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb若しくは100kb内のゲノム5’又は3’に付加される。一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、例えば、50~50,000塩基対(例えば、50~40,000bp、500~30,000bp、500~20,000bp、100~15,000bp、500~10,000bp、50~10,000bp、50~50,000bpであり得る。一部の実施形態では、挿入DNAの目的配列は、1~50塩基対)であり得る。
特定の実施形態では、挿入DNAは、例えば、異種コーディング領域をゲノム中に導入し;エキソン構造/選択的スプライシングに影響を与えるか若しくはそれをもたらし;内在性遺伝子の破壊を引き起こし;内在性遺伝子の転写活性化を引き起こし;内在性DNAのエピジェネティック調節をもたらし;作動可能に連結した遺伝子の上方若しくは下方制御をもたらすことにより、標的細胞若しくは標的生物のゲノム機能を改変又は規定する配列を含むように、同定、設計、操作及び構成することができる。特定の実施形態では、挿入DNAは、エキソン及び/又はトランスジーンをコードする配列を含み、転写因子アクチベータ、リプレッサー、エンハンサーなど、及びそれらの組合せに対する結合部位を賦与するように、操作することができる。他の実施形態では、コーディング配列を、スプライスアクセプター部位、ポリ-Aテイルでさらにカスタマイズすることもできる。
挿入DNAは、標的DNAに対してある程度の相同性を有し得る。一部の実施形態では、挿入DNAは、標的DNA又はその部分に対して厳密な相同性の少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10以上の塩基を有する。一部の実施形態では、挿入DNAは、標的DNA又はその部分に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%若しくは100%相同性の少なくとも10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200以上の塩基を有する。
本明細書に記載される送達の他の方法に代わるものとして、一部の実施形態では、細胞に送達される核酸(例えば、リコンビナーゼをコードする核酸若しくは鋳型核酸又は両方)はミニサークルとして設計され、この場合、細胞への投与前に、Gene Writing(商標)に関連しないプラスミドバックボーン配列を除去する。ミニサークルは、細菌部分(例えば、細菌の複製起点、抗生物質選択カセット)を含むバックボーンを有するプラスミドと比較して、より高いトランスフェクション効率及び遺伝子発現を達成することが証明されており、転位の効率を改善するために使用されている(Sharma et al.Mol Ther Nucleic Acids 2:E74(2013))。一部の実施形態では、Gene Writer(商標)ポリペプチドをコードするDNAベクターは、ミニサークルとして送達される。一部の実施形態では、Gene Writer(商標)鋳型を含有するDNAベクターは、ミニサークルとして送達される。核酸を送達するためのそうした代替手段の一部の実施形態では、細菌部分は、組換え部位、例えば、attP/attB、loxP、FRT部位によってフランキングされる。一部の実施形態では、コグネイトリコンビナーゼの付加により、分子内組換え及び細菌部分の切除が起こる。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、phiC31リコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、Creリコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、FLPリコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、ミニサークルは、細菌生産株、例えば、誘導性ミニサークルアセンブリング酵素を安定に発現する大腸菌(E.coli)、例えばKay et al.Nat Biotechnol 28(12):1287-1289(2010)に従う生産株中に生成される。ミニサークルDNAベクター調製物及び生成の方法は、米国特許第9233174号明細書(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
プラスミドDNA以外にも、ウイルスバックボーン、例えばAAVベクターから、所望の構築物、例えばリコンビナーゼ発現カセット又は治療用発現カセットを切除することにより、ミニサークルを作製することができる。これまでに、ウイルスバックボーンからのドナー配列の切除及び環状化が、トランスポザーゼ媒介性組込み効率にとって重要であり得ることが明らかにされている(Yant et al.Nat Biotechnol 20(10):999-1005(2002))。一部の実施形態では、まずミニサークルを製剤化し、次に、標的細胞に送達する。他の実施形態では、リコンビナーゼの同時送達により、リコンビナーゼ認識部位にフランキングする核酸(例えば、Gene Writer(商標)ポリペプチドをコードする核酸若しくはDNA鋳型又はその両方)の切除及び環状化を達成することにより、細胞内でDNAベクター(例えば、プラスミドDNA、rAAV、scAAV、ceDNA、doggybone DNA)からミニサークルを形成する。一部の実施形態では、第1切除事象(例えば、分子内組換え)及び第2組込み(例えば、標的部位組込み)事象のために、同じリコンビナーゼを使用する。一部の実施形態では、切除された環状DNA上の組換え部位(例えば、第1組換え事象、例えば分子内組換え後の)を、第2組換え(例えば、標的部位組換え)事象のための鋳型認識部位として使用する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるミニサークルDNAはリコンビナーゼ切除事象により作製され、Gene Writerは、リコンビナーゼ組込み事象によりミニサークルDNAを挿入するように機能する。一部の実施形態では、切除事象及び組込み事象は、同じ酵素により、例えば、同じセリンリコンビナーゼにより触媒される。一部の実施形態では、ベクターからの切除のためのカセットはattL及びattR部位によりフランキングされ、切除事象は、コグネイトゲノムattP又はattB部位の組込みに用いられるattB又はattP部位の作製をもたらす。一部の実施形態では、attL及びattR部位が関与する切除事象は、Gene Writerリコンビナーゼポリペプチドの切除の実行を可能にする組換え方向性因子(RDF)の付加により触媒される。一部の実施形態では、Gene Writerリコンビナーゼポリペプチドは、RDFの不存在下で組込み事象を触媒するように機能する。
リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムのドメイン(例えば、本明細書に記載のリコンビナーゼポリペプチドのリコンビナーゼドメイン及び/又はDNA認識ドメイン)は、リンカーにより連結され得る。リンカーエレメントを含む本明細書に記載の組成物は、一般的形態S1-L-S2を有し、ここで、S1及びS2は、同じであるか又は異なり得、リンカーで互いに結合された2つの部分(例えば、各々、ポリペプチド又は核酸ドメイン)を呈示する。一部の実施形態では、リンカーは、2つのポリペプチドを連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、2つの核酸分子を連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドと核酸分子を連結し得る。リンカーは、化学結合、例えば、1つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であり得る。リンカーは、柔軟、剛直及び/又は切断可能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。概して、ペプチドリンカーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10若しくはそれを超えるアミノ酸長、例えば、2~50アミノ酸長、2~30アミノ酸長である。
最も一般的に使用される柔軟リンカーは、主としてGly及びSer残基の区間からなる配列を有する(「GS」リンカー)。柔軟リンカーは、ある程度の移動又は相互作用を必要とするドメインの連結に有用であると考えられ、小さい無極性(例えば、Gly)又は極性(例えば、Ser若しくはThr)アミノ酸を含み得る。Ser又はThrの組込みは、水分子を用いて水素結合を形成することにより、水溶液中のリンカーの安定性を維持することもできるため、リンカーと他の部分との好ましくない相互作用を低減することができる。こうしたリンカーの例としては、構造[GGS]≧1又は[GGGS]≧1(配列番号3441)を有するものが挙げられる。剛直リンカーは、ドメイン間の定距離を保持すると共に、それらの独立の機能を維持するのに有用である。剛直リンカーは、薬剤中の1つ若しくは複数の成分の安定性又は生物活性を保存するためにドメインの空間的分離が不可欠である場合にも有用となり得る。剛直リンカーは、αヘリックス構造又はProリッチ配列、(XP)nを有し得る(Xは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ala、Lys若しくはGluを指す)。切断可能なリンカーは、遊離機能性ドメインをインビボで放出し得る。一部の実施形態では、リンカーは、特定の条件下、例えば、還元剤又はプロテアーゼの存在下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を利用する場合がある。一例として、2つのCys残基間のトロンビン感受性配列(例えば、PRS)がある。CPRSCのインビトロトロンビン処理により、トロンビン感受性配列の切断が起こるのに対し、可逆性ジスルフィド結合はインタクトなままである。こうしたリンカーは、周知であり、例えば、Chen et al.2013.Fusion Protein Linkers:Property,Design and Functionality.Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369に記載されている。本明細書に記載の組成物中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞若しくは組織において、病状(例えば、癌若しくは炎症)下、インビボで発現されるか、又は特定の細胞コンパートメント内に拘束されたプロテアーゼによっても実施され得る。様々なプロテアーゼの特異性により、拘束されたコンパートメント内のリンカーの緩徐な切断が可能になる。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、天然のポリペプチド内のこうしたドメイン間に存在する内在性アミノ酸(又はそれらと相同性)である。一部の実施形態では、そのようなドメイン間に存在する内在性アミノ酸は、置換されているが、長さは天然の長さから不変である。一部の実施形態では、ドメイン間に天然に存在するアミノ酸残基に、追加のアミノ酸残基が付加される。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、タンパク質機能を最大化するように、コンピューターにより設計されるか、又はスクリーニングされる(Anad et al.,FEBS Letters,587:19,2013)。
さらなるGene Writerの特徴
一部の実施形態では、Gene Writerシステムは、内在性宿主因子を必要とすることなく、完全な書込み(writing)を達成し得る。一部の実施形態では、システムは、DNA修復を必要とせずに、完全な書込みを達成し得る。一部の実施形態では、システムは、DNA損傷応答を誘発することなく、完全な書込みを達成し得る。
一部の実施形態では、システムは、NHEJ経路、相同組換え修復経路、塩基切除修復経路又はそれらの任意の組合せによるDNA修復を必要としない。DNA修復経路による参加は、例えば、DNA修復経路阻害剤又はDNA修復経路欠失細胞株の適用によってアッセイすることができる。例えば、DNA修復経路阻害剤を適用する場合、まず、PrestoBlue細胞生存アッセイを実施して、阻害剤の毒性並びに何らかの正規化を適用すべきか否かを決定することができる。SCR7は、NHEJの阻害剤であり、これは、Gene Writer(商標)送達中に連続希釈で適用することができる。PARPタンパク質は、一本鎖及び二本鎖切断の両方にホモ二量体として結合する核酵素である。従って、その阻害剤を、相同組換え修復経路及び塩基切除修復経路を含め、関連DNA修復経路の試験に使用することができる。実験手順は、SCR7のそれと同じである。ヌクレオチド切断修復(NER)経路のコアタンパク質が欠失した細胞株を使用して、Gene Writing(商標)に対するNERの効果を試験することができる。細胞へのGene Writer(商標)システムの送達後、ddPCRを用いて、DNA修復経路の阻害に関して、異種目的配列の挿入を評価することができる。また、シーケンシング解析を実施して、DNA修復経路が特定の役割を果たしているか否かを評価することもできる。一部の実施形態では、ゲノムへのGene Writing(商標)は、本明細書に記載のDNA修復経路のノックダウンによって低減されない。一部の実施形態では、ゲノムへのGene Writing(商標)は、DNA修復経路のノックダウンにより50%以上低減されない。
Gene Writingシステムにおける環状RNA
製剤化、送達又は標的細胞内のGene Writing反応中に環状及び/又は線状RNA状態を用いることが有益であり得ることが考慮される。従って、本明細書に記載される態様のいずれかの一部の実施形態では、Gene Writingシステムは、1つ又は複数の環状RNA(circRNA)を含む。本明細書に記載される態様のいずれかの一部の実施形態では、Gene Writingシステムは、1つ又は複数の線状RNAを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸(例えば、Gene Writerポリペプチド又は両方をコードする核酸分子)は、circRNAである。一部の実施形態では、環状RNA分子は、Gene Writerポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、Gene WriterポリペプチドをコードするcircRNA分子が宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、環状RNA分子は、例えば、本明細書に記載されるリコンビナーゼをコードする。一部の実施形態では、リコンビナーゼをコードするcircRNA分子が宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、Gene WriterポリペプチドをコードするcircRNA分子は、翻訳前に線状化される(例えば、宿主細胞中)。
環状RNA(circRNA)は細胞中で天然に存在することが見出されており、ヒト細胞においてノンコーディング及びタンパク質コーディング役割の両方を含む多様な機能を有することが見出されている。circRNAは、RNAの環状化をもたらすRNA分子(又はRNA分子をコードするDNA)に自己スプライシングイントロンを組み込むことにより操作することができることと、操作されたcircRNAは増強されたタンパク質産生及び安定性を有し得ることとが示されている(Wesselhoeft et al.Nature Communications 2018)。一部の実施形態では、Gene Writer(商標)ポリペプチドは、circRNAとしてコードされる。特定の実施形態では、鋳型核酸は、DNA、例えばdsDNA又はssDNAである。
一部の実施形態では、circRNAは、1つ又は複数のリボザイム配列を含む。一部の実施形態では、リボザイム配列は、例えば、宿主細胞中で自己切断のために活性され、例えば、それによりcircRNAの線状化をもたらす。一部の実施形態では、リボザイムは、例えば、宿主細胞中でマグネシウムの濃度が切断に十分なレベルに達する時に活性化される。一部の実施形態では、circRNAは、宿主細胞への送達前に低マグネシウム環境中で維持される。一部の実施形態では、リボザイムは、タンパク質応答性リボザイムである。一部の実施形態では、リボザイムは、核酸応答性リボザイムである。
一部の実施形態では、circRNAは、標的細胞の核中で線状化される。一部の実施形態では、細胞の核中のcircRNAの線状化は、例えば、切断事象を活性化するために細胞の核中に存在する成分を含む。例えば、B2及びALUレトロトランスポゾンは、活性がポリコームタンパク質、EZH2との相互作用により増強される自己切断リボザイムを含有する(Hernandez et al.PNAS 117(1):415-425(2020))。従って、一部の実施形態では、リボザイム、例えば核エレメント、例えば核タンパク質、例えばゲノム相互作用タンパク質、例えばエピジェネティック修飾因子、例えばEZH2に対して応答性であるB2又はALUエレメント由来のリボザイムが、例えば、Gene WritingシステムのcircRNAに取り込まれる。一部の実施形態では、circRNAの核局在化は、リボザイムの自己触媒活性の増加及びcircRNAの線状化をもたらす。
一部の実施形態では、誘導性リボザイム(例えば、本明細書に記載されるcircRNA中)は、合成により、例えば、タンパク質リガンド応答性アプタマー設計を利用することにより作製される。MS2コートタンパク質アプタマーを用いてタバコ輪点ウイルスハンマーヘッドリボザイムのサテライトRNAを利用するためのシステムは記載されており(Kennedy et al.Nucleic Acids Res 42(19):12306-12321(2014)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる))、それは、MS2コートタンパク質の存在下でリボザイム活性の活性化をもたらす。実施形態では、このようなシステムは、細胞質又は核に局在化されるタンパク質リガンドに対して応答する。一部の実施形態では、タンパク質リガンドは、MS2でない。例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)(Tuerk and Gold,Science 249(4968):505-510(1990);Ellington and Szostak、Nature 346(6287):818-822(1990);(その各々の方法が、参照により本明細書に組み込まれる))に基づいてリガンドをターゲティングするためのRNAアプタマーを作製する方法が記載されており、いくつかの事例では、インシリコ設計により支援されている(Bell et al.PNAS 117(15):8486-8493(その方法が、参照により本明細書に組み込まれる))。従って、一部の実施形態では、標的リガンドについてのアプタマーは、例えば、タンパク質リガンドの存在下において、例えばリボザイム媒介切断及びcircRNA線状化をトリガーするために作製され、合成リボザイムシステムに取り込まれる。一部の実施形態では、circRNA線状化は、細胞質中において、例えば細胞質中でリガンドと会合するアプタマーを用いてトリガーされる。一部の実施形態では、circRNA線状化は、核中において、例えば核中でリガンドと会合するアプタマーを用いてトリガーされる。複数の実施形態では、核へのリガンドは、エピジェネティック修飾因子又は転写因子を含む。一部の実施形態では、線状化をトリガーするリガンドは、オフターゲット細胞よりもオンターゲット細胞中で高いレベルで存在する。
circRNA線状化に核酸応答性リボザイムシステムを用いることができることがさらに考慮される。例えば、リボザイム活性化をトリガーするための規定の標的核酸分子を検知するバイオセンサが、例えば、Penchovsky(Biotechnology Advances 32(5):1015-1027(2014)(参照により本明細書に組み込まれる))に記載されている。これらの方法により、リボザイムは天然では不活性状態にフォールドし、規定の標的核酸分子(例えば、RNA分子)の存在下でのみ活性化される。一部の実施形態では、Gene WritingシステムのcircRNAは、規定の標的核酸、例えばRNA、例えばmRNA、miRNA、ガイドRNA、gRNA、sgRNA、ncRNA、lncRNA、tRNA、snRNA又はmtRNAの存在下で活性化される核酸応答性リボザイムを含む。一部の実施形態では、線状化をトリガーする核酸は、オフターゲット細胞よりもオンターゲット細胞中で高いレベルで存在する。
本明細書の態様のいずれかの一部の実施形態では、Gene Writingシステムは、目的の標的組織又は標的細胞に対する誘導性特異性を有する1つ又は複数のリボザイム、例えば目的の標的組織又は標的細胞中でより高いレベルで存在するリガンド又は核酸により活性化されるリボザイムを組み込む。一部の実施形態では、Gene Writingシステムは、細胞内コンパートメント、例えば、核、核小体、細胞質又はミトコンドリアに対する誘導性特異性を有するリボザイムを組み込む。一部の実施形態では、リガンド又は核酸により活性化されるリボザイムは、標的細胞内コンパートメント中でより高いレベルで存在する。一部の実施形態では、Gene WritingシステムのRNA成分は、例えば、線状化により活性化されるcircRNAとして提供される。一部の実施形態では、Gene WritingポリペプチドをコードするcircRNAの線状化は、翻訳のための分子を活性化する。一部の実施形態では、Gene WritingシステムのcircRNA成分を活性化するシグナルは、例えば、システムがオンターゲット細胞中で特異的に活性化されるように、オンターゲット細胞又は組織中でより高いレベルで存在する。
一部の実施形態では、Gene WritingシステムのRNA成分は、線状化により不活性化されるcircRNAとして提供される。一部の実施形態では、Gene WriterポリペプチドをコードするcircRNAは、切断及び分解により不活性化される。一部の実施形態では、Gene WritingポリペプチドをコードするcircRNAは、ポリペプチドのコード配列から翻訳シグナルを分離する切断により不活性化される。一部の実施形態では、Gene WritingシステムのcircRNA成分を不活性化するシグナルは、システムがオフターゲット細胞中で特異的に不活性化されるように、オフターゲット細胞又は組織中でより高いレベルで存在する。
Gene Writerの進化型変異体
一部の実施形態では、本発明は、Gene Writerの進化型変異体を提供する。進化型変異体は、一部の実施形態では、標準Gene Writer又はそこに含まれる断片若しくはドメインの1つを突然変異誘発させることにより生産することができる。一部の実施形態では、ドメイン(例えば、触媒ドメイン又はDNA結合ドメイン(例えば、標的結合ドメイン若しくは鋳型結合ドメイン)、例えば配列誘導DNA結合エレメントなど)の1つ若しくは複数が進化する。こうした進化型変異体ドメインの1つ又は複数は、一部の実施形態において、単独で又は他のドメインと一緒に進化し得る。1つ又は複数の進化型変異体ドメインは、一部の実施形態では、非進化型コグネイト成分又はコグネイト成分の進化型変異体(例えば、平行若しくは連続様式で進化した可能性のあるもの)と組み合わせされ得る。
一部の実施形態では、標準Gene Writer又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させるプロセスは、標準Gene Writer又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させることを含む。複数の実施形態では、突然変異誘発は、例えば、本明細書に記載されるように、漸進的進化方法(例えば、PACE)又は非漸進的進化方法(例えば、PANCE)を含む。一部の実施形態では、進化型Gene Writer又はその断片若しくはドメイン(例えば、DNA結合ドメイン、例えば標的結合ドメイン若しくは鋳型結合ドメイン)は、標準Gene Writer又はその断片若しくはドメインと比較して、そのアミノ酸配列に導入された1つ若しくは複数のアミノ酸変異を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列変異は、例えば、コーディング配列内のいずれか特定の位置のコドンの変化を招くgene writerをコードするヌクレオチド配列内の変化、1つ若しくは複数のアミノ酸の欠失(例えば、短縮タンパク質)、1つ若しくは複数のアミノ酸の挿入又はそれらの任意の組合せの結果として、標準Gene Writerのアミノ酸配列内に1つ若しくは複数の変異残基(例えば、保存的置換、非保存的置換又はそれらの組合せ)を含み得る。進化型変異体Gene Writerは、Gene Writerの1つ若しくは複数の成分又はドメインに変異体(例えば、触媒ドメイン、DNA結合ドメイン又はそれらの組合せに導入された変異体)を含み得る。
いくつかの態様では、本発明は、Gene Writerの進化型変異体を用いるか又はそれを含むGene Writer、システム、キット及び方法を提供し、例えば、Gene Writerの進化型変異体又はPACE若しくはPANCEにより生産若しくは生産可能なGene Writerを使用する。複数の実施形態では、非進化型標準Gene Writerは、本明細書に開示されるGene Writerである。
「ファージ支援型漸進的進化(PACE)」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する漸進的進化を指す。PACE技術の例は、例えば、2009年9月8日に出願され、2010年3月11日に国際公開第2010/028347号パンフレットとして公開された、国際PCT出願番号PCT/米国特許出願公開第2009/056194号明細書;2011年12月22日に出願され、2012年6月28日に国際公開2012/088381号パンフレットとして公開された、国際PCT出願、PCT/米国特許出願公開第2011/066747号明細書;2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,594号明細書;2017年9月26日に発行された米国特許第9,771,574号明細書;2016年7月19日に発行された米国特許第9,394,537号明細書;2015年1月20日に出願され、2015年9月11日に国際公開第2015/134121号パンフレットとして公開された、国際PCT出願、PCT/米国特許第2015/012022号明細書;2019年1月15日に発行された米国特許第10,179,911号明細書;並びに2016年4月15日に出願され、2016年10月20日に国際公開第2016/168631号パンフレットとして公開された、国際PCT出願、PCT/米国特許出願公開第2016/027795号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
「ファージ支援型非漸進的進化(PANCE)」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する非漸進的進化を指す。PANCE技術の例は、例えば、Suzuki T.et al,Crystal structures reveal an elusive functional domain of pyrrolysyl-tRNA synthetase,Nat Chem Biol.13(12):1261-1266(2017)に記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。手短には、PANCEは、新鮮な宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli)細胞)全体に、進化させようとする目的の遺伝子を含有する、進化選択ファージ(SP)の連続フラスコ移入を用いる迅速なインビボ指向性進化のための技術である。SPに含まれる遺伝子が漸進的に進化する間、宿主細胞内部の遺伝子を一定に保持することができる。ファージ増殖後、感染した細胞のアリコートを用いて、宿主大腸菌(E.coli)を含有する次のフラスコをトランスフェクトすることができる。このプロセスは、所望の表現型が、例えば、所望されるだけの数の移入について進化するまで、反復及び/又は継続することができる。
PACE及びPANCEをGene Writerに適用する方法は、とりわけ、前述の参照文献を参照することにより、当業者により容易に理解されよう。例えば、ファージ粒子を用いて、例えば宿主細胞の集団中に、ゲノム修飾タンパク質若しくはシステムの漸進的進化を指令するためのさらなる例示的な方法を適用して、Gene Writer又はその断片若しくはサブドメインの進化型変異体を作製することができる。こうした方法の非限定的な例は、例えば、2009年9月8日に出願され、2010年3月11日に国際公開第2010/028347号パンフレットとして公開された、国際PCT出願、PCT/米国特許出願公開第2009/056194号明細書;2011年12月22日に出願され、2012年6月28日に国際公開2012/088381号パンフレットとして公開された、国際PCT出願、PCT/米国特許出願公開第2011/066747号明細書;2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,594号明細書;2017年9月26日に発行された米国特許第9,771,574号明細書;2016年7月19日に発行された米国特許第9,394,537号明細書;2015年1月20日に出願され、2015年9月11日に国際公開第2015/134121号パンフレットとして公開された、国際PCT出願、PCT/米国特許出願公開第2015/012022号明細書;2019年1月15日に発行された米国特許第10,179,911号明細書;2019年6月14日に出願された国際出願、PCT/米国特許出願公開第2019/37216号明細書、2019年1月31日に公開された国際公開第2019/023680号パンフレット、2016年4月15日に出願され、2016年10月20日に国際公開第2016/168631号パンフレットとして公開された、国際PCT出願、PCT/米国特許出願公開第2016/027795号明細書並びに2019年8月23日に出願された国際出願、PCT/米国特許出願公開第2019/47996号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの非限定的な例示的実施形態では、進化型変異体Gene Writer又はその断片若しくはドメインの進化方法は、(a)宿主細胞の集団を、目的の遺伝子を含むウイルスベクターの集団(出発Gene Writer又はその断片若しくはドメイン)と接触させるステップを含み、ここで、(1)宿主細胞は、ウイルスベクターによる感染に適しており;(2)宿主細胞は、ウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を発現し;(3)感染性ウイルス粒子の産生に必要な少なくとも1つのウイルス遺伝子の発現が、目的の遺伝子の機能に依存しており;及び/又は(4)ウイルスベクターが、宿主細胞でのタンパク質の発現を可能にし、且つ宿主細胞により複製されて、ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。一部の実施形態では、本方法は、(b)変異速度を高める(例えば、変異プラスミド又は何らかのゲノム修飾-例えば、損傷DNA校正ポリメラーゼ、SOS遺伝子、例えばUmuC、UmuD’及び/又はRecA(それらの突然変異は、プラスミドと結合すると、誘導性プロモータの制御下となり得る)を輸送することにより或いはそれらの組合せで)突然変異を含む宿主細胞を用いて、変異原と宿主細胞を接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、(c)ウイルス複製及びウイルス粒子の産生を可能にする条件下において、宿主細胞の集団をインキュベートするステップを含み、その際、宿主細胞を宿主細胞集団から除去し、新鮮で、非感染の宿主細胞を宿主細胞の集団に導入し、このようにして、宿主細胞の集団を補給すると共に、宿主細胞の流れを形成する。一部の実施形態では、目的の遺伝子が突然変異を取得する条件下で細胞をインキュベートする。一部の実施形態では、本方法は、さらに(d)宿主細胞の集団から、進化した遺伝子産物(例えば、進化型変異体Gene Writer又はその断片若しくはドメイン)をコードするウイルスベクターの変異バージョンを単離するステップを含む。
当業者は、前述した枠組み内で使用可能な種々の特徴を理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、ウイルスベクター又はファージは、繊維状ファージ、例えば、M13ファージ、例えば、M13選択ファージである。特定の実施形態では、感染性ウイルス粒子の産生に必要な遺伝子は、M13遺伝子III(gIII)である。複数の実施形態では、ファージは、機能性gIIIを欠失している場合もあるが、代わりに、gI、gII、gIV、gV、gVI、gVII、gVIII、gIX及びgXを含む。一部の実施形態では、感染性VSV粒子の世代は、エンベロープタンパク質VSV-Gを含む。様々な実施形態で、異なるレトロウイルスベクター、例えばマウス白血病ウイルス(Murine Leukemia Virus)ベクター又はレンチウイルス(Lentiviral)ベクターが使用され得る。複数の実施形態では、レトロウイルスベクターは、例えば、ウイルスのネイティブエンベロープタンパク質の代替物としてVSV-Gエンベロープタンパク質を用いて、効率的にパッケージングすることができる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、好適な数のウイルス生活環、例えば、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも4000、少なくとも5000、少なくとも7500、少なくとも10000又はそれを超える連続したウイルス生活環に応じてインキュベートされ、ここで、M13ファージの例示的且つ非限定的な例は、ウイルス生活環毎に10~20分である。同様に、宿主細胞が、宿主細胞の集団中に滞留する時間(例えば、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約70、約80、約90、約100、約120、約150又は約180分)を調整するために、条件を調節することができる。宿主細胞集団は、宿主細胞の密度又は一部の実施形態では、流入中の宿主細胞密度、例えば、10細胞/ml、約10細胞/ml、約10細胞/ml、約5~10細胞/ml、約10細胞/ml、約5~10細胞/ml、約10細胞/ml、約5~10細胞/ml、約10細胞/ml、約5~10細胞/ml、約10細胞/ml、約5~10細胞/ml、約1010細胞/ml又は約5~1010細胞/mlにより、一部を制御することができる。
核酸
プロモータ
一部の実施形態では、1つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーを、Gene Writerポリペプチドをコードする核酸又は例えば異種目的配列の発現を制御する鋳型核酸と作動可能に連結する。特定の実施形態では、1つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーは、細胞型若しくは組織特異的エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータ又はエンハンサーは、同じであるか、或いは異種目的配列の発現を天然で制御するプロモータ又はエンハンサーに由来する。例えば、オルニチントランスカルボミラーゼプロモータ及びエンハンサーを用いて、オルニチントランスカルボミラーゼ欠失を補正するために本発明により提供されるシステム若しくは方法におけるオルニチントランスカルボミラーゼ遺伝子の発現を制御することができる。一部の実施形態では、プロモータは、表4Bのプロモータ又はその機能性断片若しくは変異体である。
市販されている例示的な組織特異的プロモータは、例えば、URL(例えば、https://www.invivogen.com/tissue-specific-promoters)に見出すことができる。一部の実施形態では、プロモータは、ネイティブプロモータ又は最小プロモータ(例えば、所与の遺伝子の5’領域からの単一断片から構成されるもの)である。一部の実施形態では、ネイティブプロモータは、コアプロモータとその天然の5’UTRを含む。一部の実施形態では、5’UTRは、イントロンを含む。他の実施形態では、これらは、起源の異なるプロモータを組み合わせるか、又は同じ起源の最小プロモータと共に遠位エンハンサーをアセンブリングすることにより作製された複合プロモータを含む。一部の実施形態では、組織特異的発現制御配列は、国際公開第2020014209号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の表2又は表3の配列の1つ若しくは複数を含む。
例示的な細胞又は組織特異的プロモータを以下の表に記載し、それらをコードする例示的な核酸は、当技術分野で公知であり、様々なリソース、例えば、RefSeq.を含むNCBIデータベース並びにEukaryotic Promoter Database(http://epd.epfl.ch//index.php)を用いて、容易に入手することができる。
Figure 2023502473000749
Figure 2023502473000750
Figure 2023502473000751
Figure 2023502473000752
Figure 2023502473000753
使用される宿主/ベクターシステムに応じて、構成性及び誘導性プロモータ、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、いくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれも発現ベクターに使用し得る(例えば、Bitter et al.(1987)Methods in Enzymology,153:516-544を参照されたい;尚、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、Gene Writerをコードする核酸又は鋳型核酸は、制御エレメント、例えば、プロモータなどの転写制御エレメントと作動可能に連結される。転写制御エレメントは、一部の実施形態では、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞;又は原核生物細胞(例えば、細菌若しくは古細菌細胞)のいずれかで機能性であり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、原核生物細胞及び真核生物細胞の両方でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御エレメントと作動可能に連結される。
例示の目的のために、空間限定プロモータの例として、限定されないが、ニューロン特異的プロモータ、脂肪細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、平滑筋特異的プロモータ、光受容体特異的プロモータなどが挙げられる。ニューロン特異的空間限定プロモータとして、限定されないが、以下のものが挙げられる:ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモータ(例えば、EMBL HSENO2,X51956を参照);芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)プロモータ、ニューロフィラメントプロモータ(例えば、GenBank HUMNFL,L04147を参照);シナプシンプロモータ(例えば、GenBank HUMSYNIB,M55301を参照);thy-1プロモータ(例えば、Chen et al.(1987)Cell 51:7-19;及びLlewellyn,et al.(2010)Nat.Med.16(10):1161-1166を参照);セロトニン受容体プロモータ(例えば、GenBank S62283を参照);チロシンヒドロキシラーゼプロモータ(TH)(例えば、Oh et al.(2009)Gene Ther 16:437;Sasaoka et al.(1992)Mol.Brain Res.16:274;Boundy et al.(1998)J.Neurosci.18:9989;及びKaneda et al.(1991)Neuron 6:583-594を参照);GnRHプロモータ(例えば、Radovick et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3402-3406を参照);L7プロモータ(例えば、Oberdick et al.(1990)Science 248:223-226を参照);DNMTプロモータ(例えば、Bartge et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3648-3652を参照);エンケファリンプロモータ(例えば、Comb et al.(1988)EMBO J.17:3793-3805を参照);ミエリン塩基性タンパク質(MBP)プロモータ;Ca2+カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII-α(CamKIIα)プロモータ(例えば、Mayford et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13250;及びCasanova et al.(2001)Genesis 31:37を参照);CMVエンハンサー/血小板由来成長因子-βプロモータ(例えば、Liu et al.(2004)Gene Therapy 11:52-60を参照);など。
脂肪細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる:aP2遺伝子プロモータ/エンハンサー、例えばヒトaP2遺伝子の-5.4kbから+21bpまでの領域(例えば、Tozzo et al.(1997)Endocrinol.138:1604;Ross et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9590;及びPavjani et al.(2005)Nat.Med.11:797を参照);グルコーストランスポータ-4(GLUT4)プロモータ(例えば、Knight et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:14725を参照);脂肪酸トランスロカーゼ(FAT/CD36)プロモータ(例えば、Kuriki et al.(2002)Biol.Pharm.Bull.25:1476;及びSato et al.(2002)J.Biol.Chem.277:15703を参照);ステアロイル-CoAデサチュラーゼ-1(SCD1)プロモータ(Tabor et al.(1999)J.Biol.Chem.274:20603);レプチンプロモータ(例えば、Mason et al.(1998)Endocrinol.139:1013;及びChen et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Comm.262:187を参照);アジドネクチンプロモータ(例えば、Kita et al.(2005)Biochem.Biophys.Res.Comm.331:484;及びChakrabarti (2010)Endocrinol.151:2408を参照);アジプシンプロモータ(例えば、Platt et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7490を参照);レジスチンプロモータ(例えば、Seo et al.(2003)Molec.Endocrinol.17:1522を参照);など。
心筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下の遺伝子;ミオシン軽鎖-2、α-ミオシン重鎖、AE3、心臓トロポニンC、心臓アクチンなどに由来する制御配列が挙げられる。Franz et al.(1997)Cardiovasc.Res.35:560-566;Robbins et al.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752:492-505;Linn et al.(1995)Circ.Res.76:584-591;Parmacek et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14:1870-1885;Hunter et al.(1993)Hypertension 22:608-617;及びSartorelli et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047-4051。
平滑筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる:SM22αプロモータ(例えば、Akyuerek et al.(2000)Mol.Med.6:983;及び米国特許第7,169,874号明細書を参照);スムーセリンプロモータ(例えば、国際公開第2001/018048号パンフレットを参照);α-平滑筋アクチンプロモータ;など。例えば、SM22αプロモータの0.4kb領域(その内部に2つのCArGエレメントが位置する)は、血管の平滑筋細胞特異的発現を媒介することが明らかにされている(例えば、Kim,et al.(1997)Mol.Cell.Biol.17,2266-2278;Li,et al.,(1996)J.Cell Biol.132 849-859;及びMoessler,et al.(1996)Development 122,2415-2425を参照)。
光受容体特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる:ロドプシンキナーゼプロモータ(Young et al.(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076);βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモータ(Nicoud et al.(2007)J.Gene Med.9:1015);網膜色素変性遺伝子プロモータ(Nicoud et al.(2007)前掲);光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)遺伝子エンハンサー(Nicoud et al.(2007)前掲);IRBP遺伝子プロモータ(Yokoyama et al.(1992)Exp Eye Res.55:225);など。
非限定的な例示的細胞特異的プロモータ
当技術分野で公知の細胞特異的プロモータを用いて、例えば本明細書に記載されるGene Writerタンパク質の発現を指令することができる。非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、特性決定されており、細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウスに使用されている。いくつかの非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、米国特許第9845481号明細書(参照により本明細書に組み込まれる)の表1に列挙されている。
一部の実施形態では、細胞特異的プロモータは、植物で活性のプロモータである。多くの例示的な細胞特異的プロモータが当技術分野で知られている。例えば、米国特許第5,097,025号明細書;米国特許第5,783,393号明細書;米国特許第5,880,330号明細書;米国特許第5,981,727号明細書;米国特許第7,557,264号明細書;米国特許第6,291,666号明細書;米国特許第7,132,526号明細書;及び米国特許第7,323,622号明細書;並びに米国特許出願公開第2010/0269226号明細書;米国特許出願公開第2007/0180580号明細書;米国特許出願公開第2005/0034192号明細書;及び米国特許出願公開第2005/0086712号明細書(これらは、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、発現カセットを含む。「発現カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸分子の発現のために十分な核酸エレメントを含む核酸構築物を指す。典型的に、発現カセットは、プロモータ配列と作動可能に連結した本発明の核酸分子を含む。「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方の影響を受けるような、単一核酸断片上の2つ以上の核酸断片の会合を指す。例えば、プロモータは、それが、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コーディング配列と作動可能に連結している(例えば、コーディング配列は、プロモータの転写制御下にある)。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列と作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、プロモータは、異種プロモータである。「異種プロモータ」という用語は、本明細書で使用される場合、天然で所与のコーディング配列と作動可能に連結されていないことがわかっているプロモータを指す。特定の実施形態では、発現カセットは、別のエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック(woodchuck)応答エレメント(WRE)及び/又はコーディング配列の発現レベルに影響を及ぼすことがわかっている他のエレメントを含み得る。「プロモータ」は、典型的に、コーディング配列又は機能性RNAの発現を制御する。特定の実施形態では、プロモータ配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、さらにエンハンサーエレメントも含み得る。「エンハンサー」は、典型的に、プロモータ活性を刺激することができ、プロモータの天然のエレメントであり得るか、又はプロモータのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。特定の実施形態では、プロモータは、その全体がネイティブ遺伝子に由来する。特定の実施形態では、プロモータは、天然に存在する異なるプロモータ由来の様々なエレメントから構成される。特定の実施形態では、プロモータは、合成ヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、種々のプロモータが、様々な組織若しくは細胞型において又は様々な発生段階において、或いは様々な環境条件又は薬剤若しくは転写補因子の存在若しくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指令し得ることは理解されよう。ユビキタス、細胞型特異的、組織特異的、発生段階特異的及び条件的プロモータ、例えば薬剤応答性プロモータ(例えば、テトラサイクリン応答性プロモータ)は、当業者には周知である。プロモータの例として、限定されないが、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PKG)プロモータ、CAG(CMVエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモータ(CBA)及びウサギβグロビンイントロンの複合物)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、シナプシン若しくはNeuNプロモータ、SV40初期プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルスLTRプロモータ;アデノウイルス主要後期プロモータ(Ad MLP);単純ヘルペスウイルス(herpes simplex virus)(HSV)プロモータ、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)(CMV)プロモータ、例えばCMV最初期プロモータ領域(CMVIE)、SFFVプロモータ、ラウス肉腫ウイルス(rous sarcoma virus)(RSV)プロモータ、合成プロモータ、ハイブリダイゼーションプロモータなどが挙げられる。他のプロモータは、ヒト由来又はマウスをはじめとする他の種由来のものであり得る。一般的なプロモータとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス(cytomegalovirus)(CMV)最初期遺伝子プロモータ、SV40初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)の長い末端反復、[β]-アクチン、ラットインスリンプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ、ヒトα-1アンチトリプシン(hAAT)プロモータ、トランスサイレチンプロモータ、TBGプロモータ及び他の肝臓特異的プロモータ、デスミンプロモータ及び類似の筋肉特異的プロモータ、EF1-α-プロモータ、CAGプロモータ及び他の構成性プロモータ、多組織特異性を備えるハイブリッドプロモータ、シナプシン及びグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモータのようなニューロン特異的プロモータが挙げられ、これらは全て、当業者には周知であり、容易に入手可能であり、目的のコーディング配列の高レベルの発現を達成するために使用することができる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も本発明において有用であろう。こうしたプロモータ配列は、例えば、Stratagene(San Diego,CA)から市販されている。さらに別の例示的なプロモータ配列は、例えば、国際公開第2018213786A1号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
一部の実施形態では、例えば、肝臓での発現を駆動するために、アポリポタンパク質Eエンハンサー(ApoE)又はその機能性断片を使用する。一部の実施形態では、ApoEエンハンサー又はその機能性断片の2コピーを使用する。一部の実施形態では、ApoEエンハンサー又はその機能性断片をプロモータ、例えばヒトα-1アンチトリプシン(hAAT)プロモータと組み合わせて使用する。
一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。いくつかのケースでは、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。様々な組織特異的調節配列(例えば、プロモータ、エンハンサーなど)が当技術分野で公知である。例示的な組織特異的調節配列として、限定されないが、以下の組織特異的プロモータが挙げられる:肝臓特異的チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモータ、インスリンプロモータ、グルカゴンプロモータ、ソマトスタチンプロモータ、膵ポリペプチド(PPY)プロモータ、シナプシン-1(Syn)プロモータ、クレアチンキナーゼ(MCK)プロモータ、哺乳動物デスミン(DES)プロモータ、α-ミオシン重鎖(a-MHC)プロモータ又は心臓トロポニンT(cTnT)プロモータ。他の例示的なプロモータとしては、β-アクチンプロモータ、B型肝炎ウイルスコアプロモータ、Sandig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996);α-フェトプロテイン(AFP)プロモータ、Arbuthnot et al.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))、骨オステオカルシンプロモータ(Stein et al.、Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997));骨シアロタンパク質プロモータ(Chen et al.,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996))、CD2プロモータ(Hansal et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998);免疫グロブリン重鎖プロモータ;T細胞受容体α-鎖プロモータ、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモータなどのニューロンプロモータ(Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモータ(Piccioli et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))並びにニューロン特異的vgf遺伝子プロモータ(Piccioli et al.,Neuron,15:373-84(1995))などが挙げられる。別の例示的なプロモータ配列は、例えば、米国特許第10300146号明細書(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。一部の実施形態では、組織特異的調節エレメント、例えば、組織特異的プロモータは、例えば、RNA-seq若しくはタンパク質発現データ又はそれらの組合せにより測定して、所与の組織中で高度に発現される遺伝子と作動可能に連結していることがわかっているものから選択される。発現による組織特異性を分析する方法は、Fagerberg et al.Mol Cell Proteomics 13(2):397-406 (2014)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に教示されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、マルチシストロン性発現構築物である。マルチシストロン性発現構築物として、例えば、第1発現カセット(例えば、第1プロモータ及び第1コーディング核酸配列を含む)と、第2発現カセット(例えば、第2プロモータ及び第2コーディング核酸配列を含む)を有する構築物が挙げられる。こうしたマルチシストロン性発現構築物は、いくつかの事例では、ポリペプチド、例えばgene writer及びgene writer鋳型と一緒に、ヘアピンRNAなどの非翻訳遺伝子産物の送達に、特に有用となり得る。一部の実施形態では、マルチシストロン性発現構築物は、例えば、プロモータ干渉又は不適合性核酸エレメントの近接した存在のために、含まれるトランスジーンの1つ若しくは複数の発現レベル低下を呈示し得る。マルチシストロン性発現構築物がウイルスベクターの一部である場合、自己相補性核酸配列の存在は、いくつかの事例において、ウイルスの増殖又はパッケージングに必要な構造の形成を妨害し得る。
一部の実施形態では、配列は、ヘアピンを有するRNAをコードする。一部の実施形態では、ヘアピンRNAは、ガイドRNA、鋳型RNA、shRNA又はmicroRNAである。一部の実施形態では、第1プロモータは、RNAポリメラーゼIプロモータである。一部の実施形態では、第1プロモータは、RNAポリメラーゼIIプロモータである。一部の実施形態では、第2プロモータは、RNAポリメラーゼIIIプロモータである。一部の実施形態では、第2プロモータは、U6又はH1プロモータである。一部の実施形態では、核酸構築物は、AAV構築物B1又はB2を含む。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、マルチシストロン性発現構築物は、ただ1つのシストロンを含む発現系と比較して、最適な発現レベルを達成しないと考えられる。2つ以上のプロモータエレメントを含むマルチシストロン性発現構築物を用いて達成される発現レベル低下について示される原因の1つは、プロモータ干渉の現象である(例えば、Curtin J A,Dane A P,Swanson A,Alexander I E,Ginn S L.Bidirectional promoter interference between two widely used internal heterologous promoters in a late-generation lentiviral construct.Gene Ther.2008 March;15(5):384-90;及びMartin-Duque P,Jezzard S,Kaftansis L,Vassaux G.Direct comparison of the insulating properties of two genetic elements in an adenoviral vector containing two different expression cassettes.Hum Gene Ther.2004 October;15(10):995-1002を参照されたい;尚、いずれの参照文献も、プロモータ干渉現象の開示について、参照により本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、プロモータ干渉の問題は、例えば、内部リボソーム進入部位により隔てられる複数のコーディング核酸配列の転写を駆動するただ1つのプロモータを含むマルチシストロン性発現構築物を生成することにより、又は転写インスレータエレメントを備えるそれ自身のプロモータを含むシストロンを分離することによって解消することができる。一部の実施形態では、単一プロモータにより駆動される多シストロンの発現は、シストロンの不均一な発現レベルを招き得る。一部の実施形態では、プロモータを効率的に分離することはできず、分離エレメントは、一部の遺伝子導入ベクター、例えば一部のレトロウイルスベクターと適合性ではない場合がある。
microRNA
microRNA(miRNA)及び他の低分子干渉核酸は、一般に、標的RNA転写物切断/分解又は標的メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳抑制によって遺伝子発現を調節する。miRNAは、いくつかの事例において、典型的に、最終的な19~25の非翻訳RNA産物として天然に発現され得る。miRNAは、一般に、標的mRNAの3’非翻訳領域(UTR)との配列特異的相互作用を介してその活性を呈示する。これらの内在性発現miRNAは、ヘアピン前駆体を形成し得るが、これらは、後にmiRNAデュープレックス、さらには成熟一本鎖miRNA分子にプロセシングされる。この成熟miRNAは、一般に、多タンパク質複合体、miRISCを誘導し、これは、成熟miRNAに対するその相補性に基づいて標的mRNAの標的3’UTR領域を識別する。有用なトランスジーン産物として、例えば、連結ポリペプチドの発現を調節するmiRNA又はmiRNA結合部位を挙げることができる。miRNA遺伝子;これら遺伝子の産物及びその相同体の非限定的なリストは、トランスジーンとして又は低分子干渉核酸(例えば、miRNAスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド)の標的として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第10300146号明細書、22:25-25:48に列挙されるものなどの方法において有用である。一部の実施形態では、前述したmiRNAの1つ又は複数に対する1つ若しくは複数の結合部位は、トランスジーン、例えばrAAVベクターにより送達されるトランスジーンに組み込まれて、例えばそのトランスジーンを保有する動物の1つ若しくは複数の組織中のトランスジーンの発現を阻害する。一部の実施形態では、組織特異的にトランスジーンの発現を制御するように結合部位を選択し得る。例えば、肝臓特異適miR-122に対する結合部位をトランスジーンに組み込んで、肝臓中のそのトランスジーンの発現を阻害することができる。別の例示的なmiRNA配列は、例えば、米国特許第10300146号明細書(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
miR阻害剤又はmiRNA阻害剤は、概して、miRNA発現及び/又はプロセシングを阻止する薬剤である。こうした薬剤の例として、限定されないが、microRNAアンタゴニスト、microRNA特異的アンチセンス、microRNAスポンジ及びmicroRNAオリゴヌクレオチド(二本鎖、ヘアピン、短いオリゴヌクレオチド)が挙げられ、これらは、Drosha複合体とのmiRNA相互作用を阻害する。microRNA阻害剤、例えば、miRNAスポンジは、トランスジーンから細胞に発現させることができる(例えば、Ebert,M.S.Nature Methods,Epub Aug.12,2007に記載の通り;尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、microRNAスポンジ又は他のmiR阻害剤は、AAVと一緒に使用される。microRNAスポンジは、一般に、相補的ヘプタマーシード配列を介して、miRNAを特異的に阻害する。一部の実施形態では、単一のスポンジ配列を用いて、miRNAのファミリー全体をサイレンシングすることができる。細胞中でmiRNA機能をサイレンシングする(miRNA標的の抑制解除)他の方法は、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるmiRNAは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2020014209号パンフレットの表4に列挙される配列を含む。また、国際公開第2020014209号パンフレットからの例示的なmiRNAの一覧も参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、細胞の一部においてGene Writingシステムの成分(例えば、Gene Writerポリペプチドをコードする核酸、トランスジーンをコードする核酸)をサイレンシングすることが有利である。一部の実施形態では、Gene Writingシステムの成分の発現を制限して目的の組織内の細胞タイプを選択することが有利である。
例えば、所与の組織、例えば、肝臓において、マクロファージ及び免疫細胞、例えば、肝臓中のクッパ細胞は、Gene Writingシステムの1つ又は複数の成分のための送達ビヒクルの取込みに関与し得ることが公知である。一部の実施形態では、マクロファージ及び免疫細胞、例えば、クッパ細胞中で高度に発現される少なくとも1つのmiRNAについての少なくとも1つの結合部位は、Gene Writingシステムの少なくとも1つの成分、例えば、Gene Writingポリペプチド又はトランスジーンをコードする核酸に含まれる。一部の実施形態では、1つ又は複数の結合部位をターゲティングするmiRNAは、本明細書で参照される表に列挙され、例えば、miR-142、例えば成熟miRNA hsa-miR-142-5p又はhsa-miR-142-3pである。
一部の実施形態では、トランスジーンのGene Writer発現又は過剰発現が毒性効果を有し得る細胞中のGene Writerレベル及び/又はGene Writer活性を低減させることが有益であり得る。例えば、後根神経節ニューロンへのトランスジーン過剰発現カセットの送達は、遺伝子療法の毒性をもたらし得ることが示されている(Hordeaux et al Sci Transl Med 12(569):eaba9188(2020)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)参照)。一部の実施形態では、少なくとも1つのmiRNA結合部位をGene Writingシステムの核酸成分に取り込んで、ニューロン、例えば後根神経節ニューロン中のシステム成分の発現を低下させることができる。一部の実施形態では、ニューロン中のシステム成分の発現を低下させるためにGene Writingシステムの核酸成分に組み込まれる少なくとも1つのmiRNA結合部位は、miR-182、例えば、熟miRNA hsa-miR-182-5p又はhsa-miR-182-3pの結合部位である。一部の実施形態では、ニューロン中のシステム成分の発現を低下させるためにGene Writingシステムの核酸成分に取り込まれる少なくとも1つのmiRNA結合部位は、miR-183、例えば成熟miRNA hsa-miR-183-5p又はhsa-miR-183-3pの結合部位である。一部の実施形態では、miRNA結合部位の組合せを用いて、目的の組織又は細胞タイプに対するGene Writingシステムの1つ又は複数の成分の発現の制限を増強させることができる。
以下の表は、例示的なmiRNA及び対応する発現細胞、例えば、一部の実施形態では、例えば、そのオフターゲット細胞中の発現を低減させるためにトランスジーン又はポリペプチド核酸中で結合部位(相補的配列)を組み込むことができるmiRNAを提供する。
Figure 2023502473000754
5’UTR及び3’UTR
特定の実施形態では、Gene Writerポリペプチド(例えば、本明細書に記載される)をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸は、5’UTR及び/又は3’UTRを含む。複数の実施形態では、タンパク質発現のための5’UTR及び3’UTR、例えば、Gene Writerポリペプチド若しくは異種目的配列のためのmRNA(又はRNAをコードするDNA)は、最適化された発現配列を含む。一部の実施形態では、例えば、Richner et al.Cell 168(6):P1114-1125(2017)(その配列は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、5’UTRは、GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3475)を含み、及び/又は3’UTRは、UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA(配列番号3476)を含む。
一部の実施形態では、Gene Writerシステムのオープンリーディングフレーム、例えばGene WriterポリペプチドをコードするmRNA(若しくはmRNAをコードするDNA)のORF又は異種目的配列のmRNA(若しくはmRNAをコードするDNA)の1つ若しくは複数のORFは、その発現を増強する、5’及び/又は3’非翻訳領域(UTR)によりフランキングされている。一部の実施形態では、システムのmRNA成分(又はDNA成分から産生された転写物)の5’UTRは、配列5’-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3’(配列番号3475)を含む。一部の実施形態では、システムのmRNA成分(又はDNA成分から産生された転写物)の3’UTRは、配列5’-UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA-3’(配列番号3476)を含む。5’UTR及び3’UTRのこの組合せは、Richner et al.Cell 168(6):P1114-1125(2017)(その教示内容及び配列は、参照により本明細書に組み込まれる)により、作動可能に連結したORFの所望の発現をもたらすことが明らかにされている。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、転写物をコードするDNAを含み、この場合、上記DNAは、上に挙げた配列中のUをTで置換した、対応する5’UTR及び3’UTRを含む。一部の実施形態では、システムのRNA成分を生産するために用いられるDNAベクターは、インビトロ転写を開始するために、5’UTRの上流にプロモータ、例えばT7、T3又はSP6プロモータを含む。上記の5’UTRは、GGGで開始するが、これは、T7 RNAポリメラーゼを用いた転写を最適化するのに好適な開始である。代替5’UTRに適合するように、転写レベルを調整し、且つ転写開始部位ヌクレオチドを改変するために、Davidson et al.Pac Symp Biocomput 433-443(2010)の教示には、これらの特性の両方を満たすT7プロモータ変異体及びそれを見出す方法が記載されている。
ウイルスベクター及びその成分
ウイルスは、本明細書に記載の関連酵素又はドメインの供給源、例えば本発明で使用されるリコンビナーゼ及びDNA結合ドメイン、例えばCreリコンビナーゼ、λインテグラーゼ又はAAVRepタンパク質由来のDNA結合ドメインの供給源以外に、本明細書に記載のシステムのための送達ビヒクルの有用な供給源である。一部の酵素は、複数の活性を有し得る。一部の実施形態では、Gene Writer送達システム又はその成分の供給源として使用されるウイルスは、Baltimore Bacteriol Rev 35(3):235-241(1971)により記載される一群から選択され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、I群ウイルスから選択され、例えば、DNAウイルスであり、dsDNAをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、I群ウイルスは、例えば、アデノウイルス(Adenovirus)、ヘルペスウイルス(Herpesvirus)、ポックスウイルス(Poxvirus)から選択される。
一部の実施形態では、ウイルスは、II群ウイルスから選択され、例えば、DNAウイルスであり、ssDNAをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、II群ウイルスは、例えば、パルボウイルス(Parvovirus)から選択される。一部の実施形態では、パルボウイルス(parvovirus)は、ディペンドパルボウイルス属(dependoparvovirus)、例えばアデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)(AAV)である。
一部の実施形態では、ウイルスは、III群ウイルスから選択され、例えば、RNAウイルスであり、dsRNAをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、III群ウイルスは、例えば、レオウイルス(Reovirus)から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるdsRNAの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にmRNAとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、IV群ウイルスから選択され、例えば、RNAウイルスであり、ssRNA(+)をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、IV群ウイルスは、例えば、コロナウイルス(Coronavirus)、ピコルナウイルス(Picornavirus)、トガウイルス(Togavirus)から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるssRNA(+)は、宿主細胞への形質導入時にmRNAとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、V群ウイルスから選択され、例えば、RNAウイルスであり、ssRNA(-)をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、IV群ウイルスは、例えば、オルトミクソウイルス(Orthomyxoviruses)、ラブドウイルス(Rhabdovirus)から選択される。一部の実施形態では、ssRNA(-)ゲノムを有するRNAウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素(例えば、RNA依存性RNAポリメラーゼ)も担持しており、これは、ssRNA(-)を、宿主によって直接翻訳され得るssRNA(+)にコピーすることができる。
一部の実施形態では、ウイルスは、VI群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス(retrovirus)であり、ssRNA(+)をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、VI群ウイルスは、例えば、レトロウイルス(Retrovirus)から選択される。一部の実施形態では、レトロウイルス(retrovirus)は、レンチウイルス(lentivirus)、例えばHIV-1、HIV-2、SIV、BIVである。一部の実施形態では、レトロウイルスは、スプマウイルス(spumavirus)、例えばフォーミーウイルス(foamy virus)、例えばHFV、SFV、BFVである。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるssRNA(+)は、宿主細胞への形質導入時にmRNAとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、ssRNA(+)は、まず逆転写され、コピーされて、dsDNAゲノム中間体を生成し、そこからmRNAが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、ssRNA(+)ゲノムを有するRNAウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素(例えば、RNA依存性DNAポリメラーゼ)も担持しており、これは、ssRNA(+)をdsDNAにコピーすることができ、このdsDNAは、宿主によりmRNAに転写されて、翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、VII群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス(retrovirus)であり、dsRNAをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、VII群ウイルスは、例えば、ヘパドナウイルス(Hepadnavirus)から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるdsRNAの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にmRNAとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるdsRNAの一方又は両方の鎖は、まず逆転写され、コピーされて、dsDNAゲノム中間体を生成し、そこからmRNAが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、dsRNAゲノムを有するRNAウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素(例えば、RNA依存性DNAポリメラーゼ)も担持しており、これは、dsRNAをdsDNAにコピーすることができ、このdsDNAは、宿主によりmRNAに転写されて、翻訳され得る。
一部の実施形態では、本発明で核酸を送達するために用いられるビリオンは、Gene Writingのプロセスに関与する酵素も担持し得る。例えば、ビリオンは、核酸と一緒に宿主細胞に送達されるリコンビナーゼドメインを含有し得る。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ビリオン内のGene Writerポリペプチドを随伴し得、それにより、両方は、ウイルス粒子からの核酸の形質導入時に標的細胞に同時送達される。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、DNA、例えば線状ssDNA、線状dsDNA、環状ssDNA、環状dsDNA、ミニサークルDNA、dbDNA、ceDNAを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、RNA、例えば線状ssRNA、線状dsRNA、環状ssRNA、環状dsRNAを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞への形質導入時に環状化され得、例えば、線状ssRNA分子は、共有結合を経て、環状ssRNAを形成することができ、線状dsRNA分子は、共有結合を経て、環状dsRNA又は1つ若しくは複数の環状ssRNAを形成し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞内でのローリングサークル複製により複製し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、単一核酸分子を含み得、例えば、非セグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、2つ以上の核酸分子を含み得、例えば、セグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は1つ若しくは複数のタンパク質を随伴し得る。一部の実施形態では、ビリオン内の1つ又は複数のタンパク質を、形質導入時に宿主細胞に送達することができる。一部の実施形態では、標的核酸に対するビリオンパッケージングシグナルの付加により、天然ウイルスを核酸の送達のために改変し得、その場合、宿主細胞を用いて、パッケージングシグナルを含有する標的核酸をパッケージングする。
一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、片利ヒトウイルスを含み得る。一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、アネロウイルス(anellovirus)を含み得、その使用は、国際公開第2018232017A1号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
組成物及びシステムの作製
当業者には理解されるように、核酸構築物及びタンパク質又はポリペプチド(例えば、本明細書に記載のシステム、構築物及びポリペプチド)を設計及び構築する方法は、当技術分野において常用的である。一般に、組換え法が使用され得る。概略については、Smales&James(Eds.),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2005);及びCrommelin,Sindelar&Meibohm(Eds.),Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications,Springer(2013)を参照されたい。核酸組成物を設計、調製、評価、精製及び操作する方法は、Green and Sambrook(Eds.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Fourth Edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)に記載されている。
本明細書に記載の医薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下の昆虫細胞、酵母、細菌又は他の細胞を用いて、組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写因子、例えば複製起点、好適なプロモータ並びに他の5’若しくは3’フランキング非転写配列及び5’若しくは3’非転写配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含み得る。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えばSV40オリジン、アーリープロモータ、スプライス及びポリアデニル化部位を使用して、異種DNA配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供することができる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Fourth Edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)に記載されている。
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現系の例として、CHO、COS、HEK293、HeLA及びBHK細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主培養方法は、Zhou and Kantardjieff(Eds.),Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),Springer(2014)に記載されている。本明細書に記載の組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えばレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み得る。一部の実施形態では、ベクター、例えばウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。
タンパク質治療薬の精製については、Franks, Protein Biotechnology: Isolation,Characterization,and Stabilization,Humana Press(2013);及びCutler,Protein Purification Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2010)に記載されている。
本開示は、部分的には、核酸及びアミノ酸配列と参照配列又は互いと比較して、前記配列間のミスマッチの%同一性又は数を決定することを対象とする。当業者は、NCBIのBLAST並びに2つの入力配列のグローバル配列アラインメントを実行するペアワイズアラインメントツール(例えば、ニードルマン・ブンシュアラインメントアルゴリズムを用いる)を含む、そのような決定を行うために多数の方法及び/又はツール、例えば、European Bioinformatics Institute(EBI)及びEuropean Molecular Biology Laboratory(EMBL)EMBOSS Needleツールが利用可能であることを理解する。
RNA(例えば、gRNA又はmRNA、例えばGeneWriterをコードするmRNA)も本明細書に記載されるように生産することができる。一部の実施形態では、RNAセグメントは、化学合成により生産することができる。一部の実施形態では、RNAセグメントは、核酸鋳型のインビトロ転写により、例えば、DNA鋳型のコグネイトプロモータに作用して、RNA転写物を産生するRNAポリメラーゼを提供することにより、生産することができる。一部の実施形態では、例えば、コグネイトプロモータ、例えばT7、T3又はSP6プロモータの転写制御下で、例えばRNAセグメントをコードする、DNA、例えばdsDNA、ssDNA、線状DNA、プラスミドDNA、線状DNAアンプリコン、線状化プラスミドDNAに作用する、例えばT7、T3若しくはSP6 RNAポリメラーゼ又はその誘導体を用いて、インビトロ転写を実施する。一部の実施形態では、化学合成及びインビトロ転写の組合せを用いて、アセンブリーのためのRNAセグメントを作製する。複数の実施形態では、化学合成によりgRNAを生産し、インビトロ転写により異種目的配列セグメントを生産する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、インビトロ転写は、より長いRNA分子の生産に、より適していると考えられる。一部の実施形態では、より高い割合の完全長転写物を得るために、インビトロ転写のための反応温度を低下させ、例えば、37℃未満(例えば、0~10℃、10~20℃又は20~30℃)にし得る(Krieg Nucleic Acids Res 18:6463(1990)を参照、尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、長い転写物の合成改善のためのプロトコルを使用して、長いRNA、例えば5kb超のRNAを合成し、例えばT7 RiboMAX Expressを使用して、27kb転写物をインビトロで作製することができる(Thiel et al.J Gen Virol 82(6):1273-1281(2001))。一部の実施形態では、本明細書に記載のRNA分子に対する修飾は、RNAセグメントの合成中に組み込まれ得(例えば、修飾ヌクレオチドの含有又は別の結合化学によって)、その後、化学的若しくは酵素的プロセシングによるRNAセグメントの合成、続いて、1つ若しくは複数のRNAセグメントのアセンブリー又はそれらの組合せを実施する。
一部の実施形態では、線状化DNA鋳型からのT7ポリメラーゼ媒介性DNA依存性RNA転写を用いて、システムのmRNA(例えば、Gene WriterポリペプチドをコードするmRNA)をインビトロで合成するが、この場合、UTPは、任意選択で1-メチルプソイドUTPで置換されている。一部の実施形態では、転写物は、5’及び3’UTR、例えば、GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3475)及び
Figure 2023502473000755
又はその機能性断片若しくは変異体を組み込み、任意選択で、ポリAテイルを含み、これは、DNA鋳型においてコードされるか、又は転写後、酵素により付加され得る。一部の実施形態では、ドナーメチル基、例えば、S-アデノシルメチオニンを、キャップ0構造を有するメチル化キャップRNAに付加して、mRNA翻訳効率を高めるキャップ1構造を取得する(Richner et al.Cell 168(6):P1114-1125(2017))。
一部の実施形態では、T7プロモータからの転写物は、GGGモチーフで開始する。一部の実施形態では、T7プロモータからの転写物は、GGGモチーフで開始しない。転写開始地点のGGGモチーフは、優れた収率を提供するにもかかわらず、鋳型鎖中の+1から+3の3つのC残基に対する転写物のずれ(slippage)により、ポリ(G)産物のラダーを合成するT7 RNAPをもたらす(Imburgio et al.Biochemistry 39(34):10419-10430(2000)。別の5’UTRに合わせるための、転写レベルの調整及び転写開始部位ヌクレオチドの改変について、Davidson et al.Pac Symp Biocomput 433-443(2010)の教示には、これらの特性の両方を満たす、T7プロモータ変異体及びその発見方法が記載されている。
一部の実施形態では、共有結合によりRNAセグメントを互いに結合し得る。一部の実施形態では、RNAリガーゼ、例えばT4 RNAリガーゼを用いて、2つ以上のRNAセグメントを互いに結合させることができる。RNAリガーゼなどの試薬を使用する場合、5’末端は、典型的に、3’末端に連結される。一部の実施形態では、2つのセグメントが結合されると、2つの線状構築物が形成される可能性がある(即ち(1)5’-セグメント1-セグメント2-3’及び(2)5’-セグメント2-セグメント1-3’)。一部の実施形態では、分子内環状化も起こり得る。これらの課題のいずれも、例えば、RNAリガーゼが、その末端を別の末端に連結することができないように、一方の5’末端又は一方の3’末端を遮断することにより対処することができる。複数の実施形態では、5’-セグメント1-セグメント2-3’の構築物が所望される場合、遮断基をセグメント1の5’末端又はセグメント2の3’末端に配置することにより、正しい線状連結産物のみの形成を達成し、且つ/又は分子内環状化を阻止することができる。2つの核酸(例えば、RNA)セグメントの共有結合のための組成物及び方法は、例えば、米国特許出願公開第20160102322A1号明細書(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に、2つの一本鎖RNAセグメントを互いに指向性連結させるためのRNAリガーゼの使用を含む方法と一緒に、開示されている。
例えば、T4 RNAリガーゼと一緒に使用され得る末端ブロッカーの一例は、ジデオキシターミネータである。T4 RNAリガーゼは、典型的に、5’-リン酸及び3’-ヒドロキシル末端間のホスホジエステル結合のATP依存性連結を触媒する。一部の実施形態では、T4 RNAリガーゼを用いる場合、好適な末端が、連結される末端に存在しなければならない。末端上のT4 RNAリガーゼを遮断するための1つの手段は、正しい末端フォーマットを取得できないようにすることを含む。一般に、5-ヒドロキシル又は3’-リン酸を含むRNAセグメントの末端は、T4 RNAリガーゼの基質として作用しないであろう。
RNAセグメントを結合するために使用され得る別の例示的な方法は、クリック化学によるものである(例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,375,234号明細書及び同第7,070,941号明細書並びに米国特許出願公開第2013/0046084号明細書に記載される通り)。例えば、1つの例示的なクリック化学反応は、アルキン基とアジド基との間のものである(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20160102322A1号明細書の図11を参照)。RNAセグメントを連結するために、任意のクリック反応を使用することが可能である(例えば、Cu-アジド-アルキン、歪み促進型アジド-アルキン、シュタウディンガーライゲーション、テトラジン連結、光誘導型テトラゾール-アルケン、チオール-エン、NHSエステル、エポキシド、イソシアネート及びアルデヒド-アミノオキシ)。一部の実施形態では、クリック化学反応を用いるRNA分子の連結は、クリック化学反応が、高速で、モジュール式で、効率的であり、多くの場合、有毒な廃棄物を生成せず、溶媒として水を用いて実施することができ、且つ/又は立体特異的にセットアップすることができることから、有利である。
一部の実施形態では、アジド-アルキンヒュスゲン環化付加反応を用いて、RNAセグメントを結合し得、これは、典型的に、アジドと末端若しくは内部アルキンとの間の1,3-双極子環化付加反応であり、RNAセグメントの連結のための1,2,3-トリアゾールを付与する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、この連結方法の1つの利点は、この反応が、必要なCu(I)イオンの付加により開始され得ることであろう。RNAセグメントを結合することができる他の例示的な機構として、限定はしないが、ハロゲン(F-、Br-、I-)/アルキン付加反応、カルボニル/スルフヒドリル/マレイミド及びカルボキシル/アミン連結の使用が挙げられる。例えば、一方のRNA分子を3’にてチオールで修飾し(ジスルフィドアミダイト及びユニバーサル支持体又はジスルフィド修飾支持体を用いて)、他方のRNA分子を5’にてアクリダイトで修飾し(アクリル酸ホスホロアミダイトを用いて)、次に2つのRNA分子をマイケル付加反応により結合することができる。この戦略は、複数のRNA分子を段階的に結合するのにも適用することができる。また、3つ以上(例えば、3、4、5、6つなど)のRNA分子を互いに連結するための方法も提供される。特定の理論に束縛されることは意図しないが、これは、所望のRNA分子が、約40ヌクレオチドより長く、例えば、米国特許出願公開第20160102322A1号明細書(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に指摘されているように、化学合成の効率が低下するような場合に有意となり得る。
例示として、tracrRNAは、典型的に、約80ヌクレオチド長である。こうしたRNA分子は、例えば、インビトロ転写又は化学合成などのプロセスにより生成され得る。一部の実施形態では、化学合成を用いて、このようなRNA分子を生成する場合、それらは、単一の合成生成物として生成されるか、又は2つ以上のRNAセグメントを互いに連結することにより生成され得る。複数の実施形態では、3つ以上のRNAセグメントを互いに連結する場合、異なる方法を用いて、個別のセグメントを互いに連結することができる。また、RNAセグメントを1つのポット(例えば、容器、ベッセル、ウェル、チューブ、プレート若しくは他の入れ物)内で、全て同時に、又は異なる時点で1つのポット内で、又は異なる時点で異なるポット内で互いに連結し得る。非限定的な例において、RNAセグメント1、2及び3を番号順にアセンブリングするために、まず初めにRNAセグメント1及び2を5’から3’に互いに連結し得る。次に、反応生成物を反応混合物成分について(例えば、クロマトグラフィーにより)精製した後、3’末端とRNAセグメント3の5’末端との結合のために、第2ポット内に配置することができる。続いて、最終反応生成物をRNAセグメント3の5’末端に連結することができる。
別の非限定的な例では、RNAセグメント1(約30ヌクレオチド)は、crRNAとヘアピン領域1の1部分からなる標的遺伝子座認識配列である。RNAセグメント2(約35ヌクレオチド)は、ヘアピン領域1の残り部分と、ヘアピン領域1及びヘアピン領域2間の線状tracrRNAの一部とを含む。RNAセグメント3(約35ヌクレオチド)は、ヘアピン領域1及びヘアピン領域2間の線状tracrRNAの残り部分と、ヘアピン領域2の全部とを含む。この例では、RNAセグメント2及び3は、クリック化学を用いて、5’から3’に連結される。さらに、反応生成物の5’及び3’末端はいずれもリン酸化される。次に、3’末端ヒドロキシル基を有するRNAセグメント1及びT4 RNAリガーゼと反応生成物を接触させて、ガイドRNA分子を生成する。
本発明の方法に従ってRNAセグメントを結合するために、いくつかの別の連結化学を用い得る。そうした化学のいくつかは、米国特許出願公開第20160102322A1号明細書(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の表6に表示されている。
ベクター
本開示は、一部に、核酸、例えば本明細書に記載のGene Writerポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸又はその両方を提供する。一部の実施形態では、ベクターは、選択マーカ、例えば、抗生物質耐性マーカを含む。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、カナマイシン耐性マーカである。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、βラクタム抗生物質に耐性を付与しない。一部の実施形態では、ベクターは、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、ベクターは、カナマイシン耐性マーカを含み、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、Gene Writerポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれる(例えば、標的細胞、組織、器官又は対象への投与時に)。一部の実施形態では、Gene Writerポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない(例えば、標的細胞、組織、器官又は対象への投与時に)。一部の実施形態では、鋳型核酸(例えば、鋳型DNA)を含むベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない(例えば、標的細胞、組織、器官又は対象への投与時に)。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、選択マーカは、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、ベクターの維持に関与する遺伝子又は配列(例えば、プラスミド維持遺伝子)は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、移入調節配列(例えば、AAV由来の、例えば、逆位末端配列)は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクター(例えば、本明細書に記載のGene Writerポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸又はその両方をコードする)を標的細胞、組織、器官又は対象へ投与することにより、前記標的細胞、組織、器官又は対象のゲノム中の1つ若しくは複数の標的部位へのベクターの1部分の組込みが起こる。一部の実施形態では、組み込まれた物質を含む標的部位の99、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2若しくは1%未満(例えば、標的部位なし)が、ベクター由来の、選択マーカ(例えば、抗生物質耐性遺伝子)、移入調節配列(例えば、AAV由来の、例えば、逆位末端配列)又は両方を含む。
AAVベクター
一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writerポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸又はその両方をコードするベクターは、例えば、AAVゲノムを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。一部の実施形態では、AAVゲノムは、4つの複製タンパク質及び3つのカプシドタンパク質をそれぞれコードする2つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、これらの遺伝子は、145bp逆位末端配列(ITR)により両側がフランキングされている。一部の実施形態では、ビリオンは、例えば、1:1:10の比で産生される、最大3つのカプシドタンパク質(Vp1、Vp2及び/又はVp3)を含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレーム及び/又は異なるスプライシング(Vp1)並びに別の翻訳開始部位(それぞれ、Vp2及びVp3)から産生される。一般に、Vp3は、ビリオン中で最も豊富なサブユニットであり、細胞表面での受容体認識に参加して、ウイルスの屈性を定める。一部の実施形態では、Vp1は、例えばVp1のN末端において、ウイルスの感染力において機能するホスホリパーゼドメインを含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターのパッケージング能力は、ベクターにパッケージングされ得る塩基エディターのサイズを制限する。例えば、AAVのパッケージング能力は、例えば、1つ又は2つの逆位末端配列(ITR)、例えば145塩基ITRを含め、約4.5kb(例えば、約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5若しくは6.0kb)であり得る。
一部の実施形態では、組換えAAV(rAAV)は、ベクタートランスジーンカセットをフランキングするシス作用性145bp ITRを含み、例えば、外来DNAのパッケージングのために最大4.5kbを提供する。感染後、rAAVは、いくつかの事例において、本明細書に記載のタンパク質を発現し、円形の頭-尾コンカテマー内にエピソームとして存在することにより、宿主ゲノムに組み込まれることなく存続する。rAAVは、例えば、インビトロ及びインビボで使用することができる。一部の実施形態では、AAV媒介遺伝子送達のために、遺伝子のコーディング配列の長さが野生型AAVゲノムと等しいか又はそれを超える必要がある。
上記サイズを超える遺伝子のAAV送達及び/又は大きい生理学的調節エレメントの使用は、例えば、送達しようとするタンパク質を2つ以上の断片に分割することにより、達成することができる。一部の実施形態では、N-末端断片をスプリットインテイン-Nと融合させる。一部の実施形態では、C-末端断片をスプリットインテイン-Cと融合させる。複数の実施形態では、上記断片を2つ以上のAAVベクターにパッケージングする。
一部の実施形態では、大きいトランスジーン発現カセットを2つの個別の半分(5及び3末端又は頭及び尾)に分割することにより、デュアルAAVベクターを作製し、例えば、カセットの各半分を単一のAAVベクター(<5kb)にパッケージングする。次に、一部の実施形態では、両方のデュアルAAVベクターによる同じ細胞の同時感染時に、完全長トランスジーン発現カセットの再アセンブリーを達成することができる。一部の実施形態では、同時感染後、(1)5及び3ゲノム同士の相同組換え(HR)(デュアルAAV重複ベクター);(2)ITR媒介による5及び3ゲノムの尾-頭コンカテマー化(デュアルAAVトランス-スプライシングベクター);及び/又は(3)これら2つの機構の組合せ(デュアルAAVハイブリッドベクター)の1つ若しくは複数が続く。一部の実施形態では、インビボでのデュアルAAVベクターの使用により、完全長タンパク質の発現が達成される。一部の実施形態では、デュアルAAVベクタープラットフォームの使用は、サイズが約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9又は5.0kb超のトランスジーンのための効率的且つ実行可能な遺伝子移入戦略を表している。一部の実施形態では、AAVベクターは、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生産において、標的核酸で細胞を形質導入するために使用することもできる。一部の実施形態では、AAVベクターは、インビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順に使用することができる(例えば、West et al.,Virology 160:38-47(1987);米国特許第4,797,368号明細書;国際公開第93/24641号パンフレット;Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994);Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)を参照されたい;尚、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。組換えAAVベクターの構築については、いくつかの刊行物に記載されており、そうしたものとして、米国特許第5,173,414号明細書;Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984);及びSamulski et al.,J.Virol.63:03822-3828(1989)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(例えば、1つ若しくは複数のガイド核酸を含む又は含まない)は、AAV、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド若しくはウイルスベクタータイプを用いて送達することができ、とりわけ、例えば、米国特許第8,454,972号明細書(アデノウイルス用の製剤、用量)、米国特許第8,404,658号明細書(AAV用の製剤、用量)及び米国特許第5,846,946号明細書(DNAプラスミド用の製剤、用量)並びにレンチウイルス、AAV及びアデノウイルスに関係する臨床試験及びそうした臨床試験に関する刊行物から得られる製剤及び用量を用いて、送達することができる。例えば、AAVの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,454,972号明細書に記載される通り、且つAAVに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,404,658号明細書に記載される通り、且つアデノウイルスに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第5,846,946号明細書に記載される通り、且つプラスミドに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。用量は、平均70kgの個体(例えば、成人男性)を基準とするか、又はそれに外挿し得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物について調節することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、健康全般、他の状態を含む通常の要因並びに対処しようとする具体的な病状又は症状に応じて、医学又は獣医療専門家(例えば、医師、獣医師)の範囲内である。一部の実施形態では、ウイルスベクターを目的の組織に注射することができる。細胞型特異的Gene Writingの場合、Gene Writer及び任意選択のガイド核酸の発現は、一部の実施形態では、細胞型特異的プロモータによって駆動することができる。
一部の実施形態では、AAVは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法のために、低毒性を可能にする。一部の実施形態では、AAVは、例えば、それが実質的に宿主ゲノムに組み込まれないことから、挿入突然変異誘発を引き起こす低い可能性を可能にする。
一部の実施形態では、AAVは、約4.4、4.5、4.6、4.7又は4.75kbのパッケージング範囲を有する。一部の実施形態では、Gene Writer、プロモータ及び転写ターミネーターは、単一のウイルスベクターに適合することができる。SpCas9(4.1kb)は、いくつかの事例において、AAVにパッケージングするのが困難となり得る。そのため、一部の実施形態では、他のGene Writer又は塩基エディターよりも長さが短いGene Writerを使用する。一部の実施形態では、Gene Writerは、約4.5kb、4.4kb、4.3kb、4.2kb、4.1kb、4kb、3.9kb、3.8kb、3.7kb、3.6kb、3.5kb、3.4kb、3.3kb、3.2kb、3.1kb、3kb、2.9kb、2.8kb、2.7kb、2.6kb、2.5kb、2kb又は1.5kb未満である。
AAVは、AAV1、AAV2、AAV5又はそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、AAVの種類は、ターゲティングしようとする細胞に関して選択され;例えば、脳又はニューロン細胞をターゲティングするために、AAV血清型1、2、5若しくはハイブリッドカプシドAAV1、AAV2、AAV5又はそれらの任意の組合せを選択することができるか;或いは心臓組織をターゲティングするためにAAV4を選択することができる。一部の実施形態では、肝臓への送達のために、AAV8を選択する。これらの細胞に関する例示的なAAV血清型は、例えば、Grimm,D.et al,J.Virol.82:5887-5911(2008)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。一部の実施形態では、AAVは、あらゆる血清型、サブタイプ及び天然に存在するAAV並びに組換えAAVを指す。AAVが用いられるとき、ウイルス自体又はその誘導体を指す場合もある。一部の実施形態では、AAVとして、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64Rl、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrhlO、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV 12、rhlO及びそれらのハイブリッド、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV及びヒツジAAVが挙げられる。AAVの様々な血清型のゲノム配列並びにネイティブ末端反復(TR)、Repタンパク質及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。こうした配列は、文献又はGenBankなどの公式データベースで見出すことができる。別の例示的なAAV血清型を表5に挙げる。
Figure 2023502473000756
一部の実施形態では、医薬組成物(例えば、本明細書に記載のAAVを含む)は、10%未満の空のカプシド、8%未満の空のカプシド、7%未満の空のカプシド、5%未満の空のカプシド、3%未満の空のカプシド又は1%未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、約5%未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、空のカプシドの数は、検出限界未満である。一部の実施形態では、例えば、空のカプシドは、有害な反応(例えば、免疫応答、炎症性応答、肝臓の反応及び/又は心臓の反応)を起こす恐れがあり、例えば、実質的な治療利益がほとんど若しくは全くないことから、医薬組成物は少量の空のカプシドを有するのが有利である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質(rHCP)は、1×1013vg/ml当たり100ng/ml以下のrHCP、例えば、1×1013vg/ml当たり40ng/ml以下のrHCP又は1×1013vg/ml当たり1~50ng/mlのrHCPである。一部の実施形態では、医薬組成物は、1.0×1013vg当たり10ng未満のrHCP若しくは1.0×1013vg当たり5ng未満のrHCP、1.0×1013vg当たり4ng未満のrHCP若しくは1.0×1013vg当たり3ng未満のrHCP又はこれらの間の任意の濃度を含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞DNA(hcDNA)は、1×1013vg/ml当たり5×10pg/ml以下のhcDNA、1×1013vg/ml当たり1.2×10pg/ml以下のhcDNA又は1×1013vg/ml当たり1×10pg/mlのhcDNAである。一部の実施形態では、前記医薬組成物中の残留宿主細胞DNAは、1×1013vg当たり5.0×10pg未満、1.0×1013vg当たり2.0×10pg未満、1.0×1013vg当たり1.1×10pg未満、1.0×1013vg当たり1.0×10pg未満のhcDNA、1.0×1013vg当たり0.9×10pg未満のhcDNA、1.0×1013vg当たり0.8×10pg未満のhcDNA又はこれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留プラスミドDNAは、1.0×1013vg/ml当たり1.7×10pg/ml以下、1×1.0×1013vg/ml当たり1×10pg/ml又は1.0×1013vg/ml当たり1.7×10pg/mlである。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留DNAプラスミドは、1.0×1013vg当たり10.0×10pg未満、1.0×1013vg当たり8.0×10pg未満又は1.0×1013vg当たり6.8×10pg未満である。一部の実施形態では、医薬組成物は、1.0×1013vg当たり0.5ng未満、1.0×1013vg当たり0.3ng未満、1.0×1013vg当たり0.22ng未満若しくは1.0×1013vg当たり0.2ng未満又は任意の中間濃度のウシ血清アルブミン(BSA)を含む。複数の実施形態では、医薬組成物中のベンゾナーゼは、1.0×1013vg当たり0.2ng未満、1.0×1013vg当たり0.1ng未満、1.0×1013vg当たり0.09ng未満、1.0×1013vg当たり0.08ng未満又は任意の中間濃度である。複数の実施形態では、医薬組成物中のポロキサマー188は、約10~150ppm、約15~100ppm又は約20~80ppmである。複数の実施形態では、医薬組成物中のセシウムは、50pg/g(ppm)未満、30pg/g(ppm)未満若しくは20pg/g(ppm)未満又は任意の中間濃度である。
複数の実施形態では、医薬組成物は、例えば、SDS-PAGEにより測定して、10%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満又はそれらの間の任意のパーセンテージの総不純物を含む。複数の実施形態では、総不純物は、例えば、SDS-PAGEにより測定して、90%超、92%超、93%超、94%超、95%超、96%超、97%超、98%超又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、単一の不特定関連不純物はいずれも、例えば、SDS-PAGEにより測定して、5%超、4%超、3%超若しくは2%超又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、医薬組成物は、総カプシド(分析用超遠心により測定して、ピーク1+ピーク2)に対して、85%超、86%超、87%超、88%超、89%超、90%超、91%超、91.9%超、92%超、93%超のパーセンテージ又はそれらの間の任意のパーセンテージの充填カプシドを含む。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク1で測定した充填カプシドのパーセンテージは、20~80%、25~75%、30~75%、35~75%又は37.4~70.3%である。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク2で測定した充填カプシドのパーセンテージは、20~80%、20~70%、22~65%、24~62%又は24.9~60.1%である。
一実施形態では、医薬組成物は、1.0~5.0×1013vg/mL、1.2~3.0×1013vg/mL又は1.7~2.3×1013vg/mlのゲノム力価を含む。一実施形態では、医薬組成物は、5CFU/mL未満、4CFU/mL未満、3CFU/mL未満、2CFU/mL未満若しくは1CFU/mL未満又は任意の中間濃度の生物学的負荷を示す。複数の実施形態では、USP、例えば、USP<85>(その全体が参照により組み込まれる)に従うエンドトキシンの量は、1.0EU/mL未満、0.8EU/mL未満又は0.75EU/mL未満である。複数の実施形態では、USP、例えば、USP<785>(その全体が参照により組み込まれる)に従う医薬組成物の浸透圧は、350~450mOsm/kg、370~440mOsm/kg又は390~430mOsm/kgである。複数の実施形態では、医薬組成物は、1容器当たり1200個未満の25μm超の粒子、1容器当たり1000個未満の25μm超の粒子、1容器当たり500個未満の25μm超の粒子又は任意の中間値を含有する。複数の実施形態では、医薬組成物は、1容器当たり10,000個未満の10μm超の粒子、1容器当たり8000個未満の10μm超の粒子又は1容器当たり600個未満の10pm超の粒子を含有する。
一実施形態では、医薬組成物は、0.5~5.0×1013vg/mL、1.0~4.0×1013vg/mL、1.5~3.0×1013vg/ml又は1.7~2.3×1013vg/mlのゲノム力価を有する。一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、以下の1つ若しくは複数を含む:1.0×1013vg当たり約0.09ng未満のベンゾナーゼ、約30pg/g(ppm)未満のセシウム、約20~80ppmのポロキサマー188、1.0×1013vg当たり約0.22ng未満のBSA、1.0×1013vg当たり約6.8×10pg未満の残留DNAプラスミド、1.0×1013vg当たり約1.1×10pg未満の残留hcDNA、1.0×1013vg当たり約4ng未満のrHCP、pH7.7~8.3、約390~430mOsm/kg、容器当たり約600個未満の粒径>25μmの粒子、容器当たり約6000個未満の粒径>10μmの粒子、約1.7×1013~2.3×1013vg/mLのゲノム力価、1.0×1013vg当たり約3.9×10~8.4×1010IUの感染力価、1.0×1013vg当たり約100~300pgの総タンパク質、約7.5×1013vg/kg用量のウイルスベクターを用いたA7SMAマウスで>24日の平均生存期間、インビトロ細胞アッセイに基づき約70~130%の相対効力及び/又は約5%未満の空のカプシド。様々な実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書で扱うウイルス粒子のいずれかを含み、参照基準の±20%の間、±15%の間、±10%の間又は±5%の間の効力を保持する。一部の実施形態では、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて、効力を測定する。
AAV粒子の別の調製、特性決定及び投与方法は、国際公開第2019094253号パンフレット(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)に教示されている。
本発明と一致して使用することができる別のrAAV構築物として、表1を含めて、//doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9で入手可能なWang et al 2019(その全体が、参照により組み込まれる)に記載されているものが挙げられる。
キット、製品及び医薬組成物
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Gene Writer又はGene Writingシステムを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、Gene Writerポリペプチド(又はポリペプチドをコードする核酸)及び鋳型DNAを含む。一部の実施形態では、キットはさらに、細胞にシステムを導入するための試薬、例えば、トランスフェクション試薬、LNPなども含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに好適である。一部の実施形態では、キットは、製品内に配置されるような、1つ若しくは複数のエレメント、例えば、組成物(例えば、医薬組成物)、Gene Writer及び/又はGene Writerシステム又はその機能性断片若しくは成分を含む。一部の実施形態では、キットは、その使用説明書を含む。
一態様では、本開示は、製品、例えば、その中に本明細書に記載のキット又はその要素が配置される製品を提供する。
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Gene Writer又はGene Writingシステムを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、鋳型DNAを含む。
化学、製造及び制御(CMC)
タンパク質治療薬の精製は、例えば、Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization,Humana Press(2013);及びCutler,Protein Purification Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2010)に記載されている。
一部の実施形態では、Gene Writer(商標)システム、ポリペプチド及び/又は鋳型核酸(例えば、鋳型DNA)は、特定の品質基準を満たす。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により生産されたGene Writer(商標)システム、ポリペプチド及び/又は鋳型核酸(例えば、鋳型DNA)は、特定の品質基準を満たす。従って、本開示は、いくつかの態様において、例えば前記品質基準が検定される、特定の品質基準を満たすGene Writer(商標)システム、ポリペプチド及び/又は鋳型核酸を製造する方法に関する。本開示は、いくつかの態様において、Gene Writer(商標)システム、ポリペプチド及び/又は鋳型核酸で前記品質基準を検定する方法にも関する。一部の実施形態では、品質基準として、限定されないが、以下の1つ若しくは複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12)が挙げられる:
(i)鋳型DNA又はGeneWriterポリペプチドをコードするmRNAの長さ、例えば、DNA又はmRNAが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するDNA又はmRNAの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、100、125、150、175若しくは200ヌクレオチド長を超えるか否か;
(ii)mRNA上のポリAテイルの存在、非存在及び/又は長さ、例えば、存在するmRNAの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、ポリAテイルを含む(例えば、長さが、少なくとも5、10(配列番号3540)、20(配列番号3541)、30(配列番号3542)、50(配列番号3543)、70(配列番号3544)、100(配列番号3545)ヌクレオチド長のポリAテイル)を含むか否か;
(iii)mRNA上の5’キャップの存在、非存在及び/又は種類、例えば、存在するmRNAの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、5’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、7-メチルグアノシンキャップ、例えば、O-Me-m7Gキャップであるか否か;
(iv)mRNA中の1つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド(例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、7-メチルグアノシン、1-N-メチルプソイドウリジン(1-Me-Ψ)、5-メトキシウリジン(5-MO-U)、5-メチルシチジン(5mC)又はロックドヌクレオチドから選択される)の存在、非存在及び/又は種類、例えば、存在するmRNAの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、1つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か;
(v)鋳型DNA又はmRNAの安定性(例えば、時間経過による及び/若しくは予め選択した条件下で)、例えばDNA又はmRNAの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、安定性試験後、インタクトなままである(例えば、100、125、150、175若しくは200ヌクレオチド長を超える)か否か;
(vi)DNAの修飾に関するシステム中の鋳型DNA又はmRNAの効力、例えばDNA又はmRNAを含むシステムを効力について検定した後、標的部位の少なくとも1%が修飾されているか否か;
(vii)ポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドの長さ、例えば、ポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900若しくは2000アミノ酸長を超える(且つ任意選択で2500、2000、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700若しくは600アミノ酸長以下である)か否か;
(viii)ポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドに対する翻訳後修飾の存在、非存在及び/又は種類、例えば、ポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、リン酸化、メチル化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、グリピヤチヨン(glipyatyon)若しくはリポイル化又はそれらの任意の組合せを含むか否か;
(ix)ポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチド中の1つ若しくは複数の人工、合成又は非標準アミノ酸(例えば、オルニチン、β-アラニン、GABA、δ-アミノレブリン酸、PABA、D-アミノ酸(例えば、D-アラニン若しくはD-グルタミン酸)、アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、シスタチオニン、ランチオニン、ジェンコル酸(Djenkolic acid)、ジアミノピメリン酸、ホモアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、ホモノルロイシン、ホモセリン、O-メチル-ホモセリン及びO-エチル-ホモセリン、エチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、セレノメチオニン、セレノエチオニン、テルロシステイン若しくはテルロメチオニン)の存在、非存在及び/又は種類、例えば、ポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、1つ若しくは複数の人工、合成又は非標準アミノ酸を含むか否か;
(x)ポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドの安定性(例えば、時間経過による及び/若しくは予め選択した条件下で)、例えばポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドの少なくとも80、85、90、95、96、97、98若しくは99%が、安定性試験後、インタクトなままである(例えば、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900若しくは2000アミノ酸長を超える(且つ任意選択で2500、2000、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700若しくは600アミノ酸長以下である))か否か;
(xi)DNAの修飾についてのシステム中のポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドの効力、例えばポリペプチド、第1ポリペプチド又は第2ポリペプチドを含むシステムを効力について検定した後、標的部位の少なくとも1%が修飾されているか否か;又は
(xii)パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体又は宿主細胞タンパク質の1つ又は複数の存在、非存在及び/若しくはレベル、例えば、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか若しくは実質的に含まないか否か。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は医薬組成物は、エンドトキシンを含まない。
一部の実施形態では、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体及び/又は宿主細胞タンパク質の1つ又は複数の存在、非存在及び/若しくはレベルを決定する。複数の実施形態では、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体及び/又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか若しくは実質的に含まないか否かを決定する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物又はシステムは、以下の特徴の1つ又は複数(例えば、1、2、3若しくは4つ)を有する:
(a)例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするRNAに対して、1%未満(例えば、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%若しくは0.1%)のDNA鋳型;
(b)例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするRNAに対して、1%未満(例えば、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%若しくは0.1%)の非キャップRNA;
(c)例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするRNAに対して、1%未満(例えば、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%若しくは0.1%)の部分長RNA;
(d)未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
例示的な異種目的配列
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列を含み、異種目的配列又はその逆相補的配列は、タンパク質(例えば、抗体)又はペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療法は、FDAなどの規制機関により承認されているものである。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、THPdbデータベース(Usmani et al.PLoS One 12(7):e0181748(2017)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)からのタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表5Bに開示されるタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法(例えば、Gene Writerを含むもの)を用いて、表5Bからのタンパク質又はペプチドの発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主でのタンパク質又はペプチドの発現を可能にし得る。一部の実施形態では、表5Bの第1列中のタンパク質又はペプチドの配列は、表5Bの第3列に提供される特許又は出願(その全体が、参照により組み込まれる)に見出すことができる。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、Lu et al.J Biomed Sci 27(1):1(2020)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)の表1に開示される抗体である。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表29に開示される抗体である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法(例えば、Gene Writerを含むもの)を用いて、表29からの抗体の発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主での抗体の発現を可能にし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法を用いて、表29の第2列の標的に結合する薬剤(例えば、表29の第1列のモノクローナル抗体)を、表29の第3列の適応症を有する対象に発現させる。
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用途
本明細書に記載されるシステムを用いて、任意選択で、本明細書に記載される送達方法
(ナノ粒子送達方法、例えば脂質ナノ粒子及びウイルス送達方法、例えばAAVを含む)のいずれかを用いて、本発明は、DNA分子、例えば核DNA、即ち細胞のゲノム中のDNAを、インビトロでも、エクスビボでも、インサイチュでも、インビボでも、例えば生物、例えば哺乳動物対象、例えばヒトを含む対象の組織中で修飾するための用途(方法)も提供する。コーディング遺伝子をDNA配列鋳型に組み込むことにより、例えば、機能喪失型変異を有する個体において治療トランスジーンの発現を提供することにより(例えば本明細書に記載されるような目的配列に含まれる)、機能獲得型変異を正常なトランスジーンで置換することにより、機能獲得型変異発現を排除するために調節配列を賦与することにより、且つ/又は作動可能に連結した遺伝子、トランスジーン及びそのシステムの発現を制御することにより、Gene Writerシステムは、治療ニーズに対処することができる。特定の実施形態では、目的配列(例えば、異種目的配列)は、宿主細胞の治療ニーズに特異的な機能性エレメント(例えば、本明細書に記載される、例えばポリペプチド若しくはノンコーディングRNA)をコードするコーディング配列を含む。一部の実施形態では、目的配列(例えば、異種目的配列)は、プロモータ、例えば組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含む。ある実施形態では、プロモータは、コーディング配列と作動可能に連結させることができる。
特定の態様では、本発明は、細胞、組織又は対象中で標的DNA鎖を修飾する方法であって、本明細書に記載されるシステムを(任意選択で、本明細書に記載される方法により)細胞、組織又は対象に投与することを含み、上記システムは、異種目的配列を標的DNA鎖に挿入し、それにより上記標的DNA鎖を修飾する、方法を提供する。特定の実施形態では、従って、異種目的配列は細胞、組織又は対象中で発現される。一部の実施形態では、細胞、組織又は対象は、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞、組織又は対象である。このように修飾される例示的な細胞としては、肝細胞、肺上皮、塩類細胞が挙げられる。このような細胞は、初代細胞であり得るか、又は不死化されていなくてよい。関連態様では、本発明は、本明細書に記載されるシステムを哺乳動物に投与することを含み、それにより組織を処置する、哺乳動物組織を処置する方法であって、上記組織は、異種目的配列を欠損する方法も提供する。上記態様及び実施形態のいずれかの特定の実施形態では、Gene Writerポリペプチドは、一過的に存在する核酸として提供される。
一部の実施形態では、本発明のシステムは、標的DNA中の挿入を生成することができる。本明細書に記載されるシステムは、外性非コード核酸、例えばmiRNA、lncRNA、shRNA、siRNA、tRNA、mtRNA、gRNA若しくはrRNAの発現、タンパク質コード配列、例えば治療用タンパク質若しくは調節タンパク質の発現、調節エレメント、例えば、プロモータ、エンハンサー、転写因子結合部位、エピジェネティック修飾因子部位、miRNA結合部位、スプライスドナー若しくはアクセプター部位若しくはターミネーター配列の組込み又は他のDNA配列、例えばスペーサの組込みをもたらすことができることが確認される。挿入の含有物及び状況に応じて、外性タンパク質を発現させるか、又は内在性タンパク質若しくは細胞システムの発現を改変することがこうして可能である。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、挿入突然変異により、例えば、コード又は調節領域への挿入DNAの組込みにより内在性遺伝子をノックアウトすることができる。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、内在性遺伝子又は遺伝子座へのトランスジーンカセットをコードする挿入DNAの組込みを媒介することにより、トランスジーンカセット、例えば、CARの発現を同時にトリガーする一方、内在性遺伝子又は遺伝子座、例えば、TRACの発現を破壊することができる。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、内在性アレルにトランスジーン発現カセットを組み込むことによりアレルを置換し、こうしてその発現を破壊することができる。
複数の実施形態では、Gene Writer(商標)遺伝子エディターシステムは、例えば、代用血液因子又は代用酵素、例えばリソソーム酵素を発現する治療剤(例えば治療トランスジーン)を含む目的配列を提供することができる。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、ファブリー病治療のためのアガルシダーゼアルファ又はベータ;ゴーシェ病のためのイミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ又はアルグルセラーゼ;リソソーム酸性リパーゼ欠損症(ウォルマン病/CESD)のためのセベリパーゼアルファ;ムコ多糖症のためのラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ又はガルスルファーゼ;ポンペ病のためのアルグルコシダーゼを発現するのに有用である。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、血液因子欠損症のための因子I、II、V、VII、X、XI、XII又はXIIIを発現するのに有用である。
一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞内タンパク質(例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、オルガネラタンパク質、例えばミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質又は膜タンパク質)をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、膜タンパク質、例えばCAR以外の膜タンパク質及び/又は内在性ヒト膜タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞外タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、酵素、構造タンパク質、シグナリングタンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサリータンパク質、運動タンパク質、防御タンパク質又は貯蔵タンパク質をコードする。他のタンパク質としては、免疫受容体タンパク質、例えば合成免疫受容体タンパク質、例えばキメラ抗原受容体タンパク質(CAR)、T細胞受容体、B細胞受容体又は抗体が挙げられる。
Gene Writing(商標)システムを用いて、免疫細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、Gene Writing(商標)システムを用いて、T細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、T細胞としては、T細胞の任意の部分集団、例えば、CD4+、CD8+、ガンマ-デルタ、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞又は部分集団の混合物を挙げることができる。一部の実施形態では、Gene Writing(商標)システムを用いて、T細胞中でT細胞受容体(TCR)を送達又は修飾することができる。一部の実施形態では、Gene Writing(商標)システムを用いて、少なくとも1つのキメラ抗原受容体(CAR)をT細胞に送達することができる。一部の実施形態では、Gene Writing(商標)システムを用いて、少なくとも1つのCARをナチュラルキラー(NK)細胞に送達することができる。一部の実施形態では、Gene Writing(商標)システムを用いて、少なくとも1つのCARをナチュラルキラーT(NKT)細胞に送達することができる。一部の実施形態では、Gene Writing(商標)システムを用いて、少なくとも1つのCARを子孫細胞、例えば、T、NK又はNKT細胞の子孫細胞に送達することができる。一部の実施形態では、少なくとも1つのCARで修飾された細胞(例えば、CAR-T細胞、CAR-NK細胞、CAR-NKT細胞)又は少なくとも1つのCARで修飾された細胞の組合せ(例えば、CAR-NK/T細胞の混合物)を用いて、MacKay,et al.Nat Biotechnol 38、233-244(2020)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)におけるCAR療法のターゲティング可能な背景で特定される病態を処置する。一部の実施形態では、免疫細胞は、AChR(胎児アセチルコリン受容体)、ADGRE2、AFP(アルファフェトプロテイン)、BAFF-R、BCMA、CAIX(炭酸脱水酵素IX)、CCR1、CCR4、CEA(癌胎児性抗原)、CD3、CD5、CD8、CD7、CD10、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CLLI、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD61、CD64、CD68、CD70、CD74、CD99、CD117、CD123、CD133、CD138、CD44v6、CD267、CD269、CDS、CLEC12A、CS1、EGP-2(上皮糖タンパク質-2)、EGP-40(上皮糖タンパク質-40)、EGFR(HER1)、EGFR-VIII、EpCAM(上皮細胞接着分子)、EphA2、ERBB2(HER2、ヒト上皮成長因子受容体2)、ERBB3、ERBB4、FBP(葉酸結合タンパク質)、Flt3受容体、葉酸受容体-a、GD2(ガングリオシドG2)、GD3(ガングリオシドG3)、GPC3(グリピカン-3)、GPI00、hTERT(ヒトテロメラーゼ逆転写酵素)、ICAM-1、インテグリンB7、インターロイキン6受容体、IL13Ra2(インターロイキン-13受容体30サブユニットアルファ-2)、カッパ軽鎖、KDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体)、LeY(ルイスY)、L1CAM(LI細胞接着分子)、LILRB2(白血球免疫グロブリン様受容体B2)、MARTI、MAGE-A1(黒色腫関連抗原Al)、MAGE-A3、MSLN(メソテリン)、MUC16(ムチン16)、MUCI(ムチンI)、KG2Dリガンド、NY-ESO-1(癌精巣抗原)、PRI(プロテイナーゼ3)、TRBCI、TRBC2、TFM-3、TACI、チロシナーゼ、サバイビン、hTERT、癌胎児性抗原(h5T4)、p53、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、hRORl、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質72)、VEGF-R2(血管内皮成長因子R2)、WT-1(ウィルムス腫瘍タンパク質)及びHIV(ヒト免疫不全ウイルス)、B型肝炎、C型肝炎、CMV(サイトメガロウイルス)、EBV(エプスタインバールウイルス)、HPV(ヒトパピローマウイルス)の抗原からなる群から選択される腫瘍又は病原体抗原に特異的なCARを含む。
一部の実施形態では、免疫細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞又は子孫細胞がエクスビボで修飾され、次いで患者に送達される。一部の実施形態では、Gene Writer(商標)システムは本明細書で挙げた方法の1つにより送達され、免疫細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞又は子孫細胞は、患者中においてインビボで修飾される。
一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、標的細胞の複数の修飾を同時に又は連続に作製することができる。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、既に修飾された細胞をさらに修飾することができる。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、相補的技術により編集された細胞、例えば、遺伝子編集細胞、例えば、1つ又は複数のCRISPRノックアウトを有する細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、事前に編集された細胞は、T細胞である。一部の実施形態では、事前の修飾は、T細胞中の遺伝子ノックアウト、例えば、内在性TCR(例えば、TRAC、TRBC)、HLAクラスI(B2M)、PD1、CD52、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、DGKノックアウトを含む。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、事前に修飾されたT細胞にTCR又はCARを挿入する。
投与
本明細書に記載の組成物及びシステムは、インビトロ又はインビボで使用され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、例えば、インビトロ又はインビボで細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)に送達される。当業者であれば、Gene Writerシステムの成分が、ポリペプチド、核酸(例えば、DNA、RNA)及びそれらの組合せの形態で送達され得ることは理解されよう。
複数の実施形態では、システム及び/又はシステムの成分は、核酸として送達される。例えば、リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードするDNA又はRNAの形態で送達され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分(例えば挿入DNA及びリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸分子)は、1、2、3、4つ又はそれを超える個別の核酸分子上で送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、DNA及びRNAの組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、DNA及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、RNA及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、RNA及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドはタンパク質として送達される。
一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ベクターを用いて、細胞、例えば、哺乳動物細胞又はヒト細胞に送達される。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスであり得る。一部の実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ又はインサイチュである。一部の実施形態では、ウイルスは、アデノ関連ウイルス(AAV)、レンチウイルス、アデノウイルスである。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ウイルス様粒子又はビロソームを用いて細胞に送達される。一部の実施形態では、送達には、ウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームを使用する。
一部の実施形態では、リコンビナーゼは、線状又は環状一本鎖又は二本鎖DNA上で活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、DNAが細胞中で一本鎖から二本鎖に変換された後、DNA上で活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、DNAが細胞中でコンカテマーを形成した後、DNA上で活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、挿入DNAが一本鎖から二本鎖に変換された後、細胞に送達されるか又は細胞中で発現される。
一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸の5’及び3’側に存在する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、適合性スペーサ領域及び中央ジヌクレオチドを有するattB及びattPである。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、挿入DNA上又はゲノム中の標的部位のリコンビナーゼ認識配列と異なるスペーサ領域及び/又は中央ジヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は、挿入DNA上又はゲノム中のリコンビナーゼ認識部位と相互作用しない。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする核酸に直接隣接する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼの遺伝子発現単位に対して外性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列(例えば、attB及びattP)は、同じ5’から3’配向にある。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列(例えば、attB及びattP)は、反対の5’から3’配向にある。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸の5’及び3’側にある認識配列を組み換え、リコンビナーゼ遺伝子発現の低減をもたらす。
一部の実施形態では、複数のリコンビナーゼ認識配列が挿入DNA上に存在する。一部の実施形態では、挿入DNAは、2つ以上の認識配列を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、3つ以上の認識配列を含む。一部の実施形態では、挿入DNAは、互いに適合性である2つの認識配列(例えば、attB及びattP)、と、挿入DNA上の他の認識配列と不適合性である第3認識配列(例えば、attB又はattP)とを含む。一部の実施形態では、互いに適合性である挿入DNA上の認識配列は、標的ゲノム中の認識配列と適合性でない。一部の実施形態では、挿入DNA上の他の認識配列と不適合性である挿入DNA上の認識配列は、標的ゲノム中の認識配列と適合性である。一部の実施形態では、互いに適合性である認識配列は、適合性スペーサ領域及び中央ジヌクレオチドを有し、不適合性である認識配列は、不適合性スペーサ領域及び中央ジヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、挿入DNA上の適合性認識配列は、同じ5’から3’配向にある。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、挿入DNA上の適合性認識配列上で作用して環状DNAを形成する。一部の実施形態では、得られる環状DNAは、attLと、attRと、attP又はattB配列のいずれかとを含み、attP又はattB配列は、標的ゲノム中の認識配列と適合性である。一部の実施形態では、本明細書に記載される複数のリコンビナーゼ認識配列は、ウイルスベクターゲノム中に存在する。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムは、リポソーム又は他の類似の小胞体中に製剤化することができる。リポソームは、内部水性コンパートメントを取り囲む単層又は多重層脂質二重膜と、比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重膜から構成される球状の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、非中毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらのカーゴをプラズマ酵素による分解から保護すると共に、それらのロードを生体膜及び血液脳関門(BBB)を介して輸送することができる(例えば、論評については、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照)。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から製造することができるが;薬物担体としてリポソームを作製するためにリン脂質が最も一般的に使用される。多重層小胞脂質の調製方法は、当技術分野で公知である(例えば、米国特許第6,693,086号明細書を参照;多重層小胞脂質の調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置又は押出機を用いて振盪の形態で力を加えることにより、それを促進することもできる(例えば、論評については、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照)。押出脂質は、Templeton et al.,Nature Biotech,15:647-652,1997(押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、サイズ漸減フィルタを介した押出により調製することができる。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の医薬組成物のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体のもう1つの例である。ナノ構造脂質担体(NLC)は、SLNの特徴を保持し、薬物安定性及び負荷容量を向上させると共に、薬物漏出を防ぐ、修飾固体脂質ナノ粒子(SLN)である。ポリマーナノ粒子(PNP)は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的に対して薬物送達を効果的に指向し、薬物安定性及び薬物放出制御を改善する。また、脂質-ポリマーナノ粒子(PLN)、即ちリポソーム及びポリマーを組み合わせた新しいタイプの担体を使用し得る。これらのナノ粒子は、PNP及びリポソームの相補的利点を有する。PLNは、コア-シェル構造から構成され;ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは良好な生体適合性を賦与する。このように、2つの成分は、薬物封入効率を高め、表面修飾を促進すると共に、水溶性薬物の漏出を防ぐ。例えば、論評については、Li et al.2017,Nanomaterials 7,122;doi:10.3390/nano7060122を参照されたい。
また、本明細書に記載の組成物及びシステム用の薬物送達ビヒクルとしてエキソソームを使用することもできる。例えば、論評については、Ha et al.July 2016.Acta Pharmaceutica Sinica B.Volume 6,Issue 4,Pages 287-296;https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムの少なくとも1つの成分は、フソソームを含む。フソソームは、標的細胞と相互作用して、それと融合することから、様々な分子の送達ビヒクルとして用いることができる。フソソームは、概して、管腔又は空洞を封入する両親媒性脂質の二重層及び両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンから構成される。フソゲン成分は、融合及びペイロード送達のための標的細胞特異性を付与し、プログラム可能な細胞特異性を備える送達ビヒクルの作製を可能にするために操作可能であることが明らかにされている(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2020014209号パンフレットにおけるフソソーム設計、調製及び使用に関するセクションを参照されたい)。
GeneWriterシステムを細胞、組織及び多細胞生物に導入することができる。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、機械的手段又は物理的手段を用いて、細胞に送達される。
タンパク質治療薬の製剤化は、Meyer(Ed.),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches to formulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic,Woodhead Publishing Series(2012)に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムは、大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液又は他の細胞若しくは組織型からの組織若しくは細胞に送達される。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムを用いて、癌、炎症性疾患、感染症、遺伝子異常又は他の疾患などの疾患を処置する。癌は、大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液又は他の細胞若しくは組織型の癌であり得、複数の癌を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムは、経腸投与(例えば、経口、胃腸、舌下、唇下又は口腔投与)により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムは、非経口投与(例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、硬膜外、脳内、脳室内、皮膚上、鼻内、動脈内、関節内、海綿体内、眼内、骨髄内輸液、腹腔内、髄腔内、子宮内、膣内、膀胱内、血管周囲又は経粘膜投与)により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムは、局所投与(例えば、経皮投与)により投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムを用いて、動物細胞、植物細胞又は真菌細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムを用いて、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムを用いて、家畜動物(例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラマ、アルパカ、ラクダ、ヤク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ又はダチョウ)由来の細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)、植物細胞又は真菌細胞を修飾するために、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムを実験ツール若しくは研究ツールとして使用するか、又は実験方法若しくは研究方法に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムを用いて、タンパク質、鋳型若しくは異種目的配列を(例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)、植物細胞又は真菌細胞において)発現させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システムを用いて、誘導性プロモータ(例えば、小分子誘導性プロモータ)の制御下で、タンパク質、鋳型若しくは異種目的配列を発現させることができる。一部の実施形態では、Gene Writingシステム又はそのペイロードを、例えば、誘導性プロモータの使用により、調整可能な制御のために設計する。例えば、目的の遺伝子を駆動するプロモータ、例えばTetは、組込み時にサイレントであり得るが、いくつかの事例では、小分子誘導剤、例えば、ドキシサイクリンへの曝露時に活性化され得る。一部の実施形態では、調整可能な発現は、遺伝子(例えば、治療用遺伝子)の処置後制御を可能にし、例えば、小分子依存性投与効果を可能にする。複数の実施形態では、小分子依存性投与効果は、例えば、局所投与により、時間的及び/又は空間的に、遺伝子産物のレベルを変化させることを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムで使用されるプロモータは、誘導性、例えば、宿主の内在性分子及び/又はそこに投与された外性小分子に対して応答性であり得る。
好適な適応症の処置
一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分(例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸)を用いて、疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分を用いて、表X1~X6のいずれかに列挙される疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表X1に列挙される造血幹細胞(HSC)疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表X2に列挙される腎臓疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表X3に列挙される肝臓疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表X4に列挙される肺疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表X5に列挙される骨格筋疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のGene Writer(商標)システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表X6に列挙される皮膚疾患、障害又は病状を処置する。
表X1~X6:リコンビナーゼに使用されるトランスGene Writerに関して選択される適応症
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一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて健康な個体を、例えば、予防療法として処置することができる。Gene Writingシステムは、一部の実施形態では、目的の疾患に対して保護性であることが示されている突然変異、例えば、ノックアウト突然変異を作製するようにターゲティングすることができる。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて保護アレル、例えば、特定の疾患を発症するリスクを低下させるタンパク質の変異体を発現するトランスジーンをゲノムに挿入することができる。一部の実施形態では、トランスジーンの組込みを用いて、1つ又は複数の追加コピーを提供することにより内在性タンパク質のレベルを増加させる。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて調節エレメント、例えば、プロモータ、エンハンサー、転写因子結合部位、miRNA結合部位又はエピジェネティック修飾部位を取り込んで、疾患リスクを低減させるか、又はその重症度を下げるように内在性遺伝子の発現を改変することができる。一部の実施形態では、Gene Writingシステムを用いて、疾患リスクを増加させるアレルを除去するか、又はアレルを、疾患保護を付与するものに改変するように内在性タンパク質の1つ又は複数のエキソンを置き換えることができる。
植物修飾方法
本明細書に記載のGene Writerシステムを用いて、例えば植物の適応度を高めるために、植物又は植物部分(例えば、葉、根、花、果実若しくは種子)を修飾することができる。
A.植物への送達
本明細書には、本明細書に記載のGene Writerシステムを植物に送達する方法が提供される。植物又はその部分をGene Writerシステムと接触させることにより、植物にGene Writerシステムを送達する方法が含まれる。これらの方法は、例えば、植物の適応度を高める目的で、植物を修飾するために有用である。
より具体的には、一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸(例えば、GeneWriterをコードする核酸)をベクター内でコードし得、例えば植物ベクター(例えば、pHUC411)中の植物プロモータ、例えばトウモロコシユビキチンプロモータ(ZmUBI)に隣接して挿入し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸を、アグロバクテリア(agrobacteria)を介して、植物(例えば、ジャポニカ米(japonica rice))又は植物の一部(例えば、植物のカルス)に導入する。一部の実施形態では、植物遺伝子(例えば、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT))をヌルアレル(例えば、開始コドンに塩基置換を含む)で置換することにより、本明細書に記載のシステム及び方法を植物に使用することができる。植物ゲノムを修飾するためのシステム及び方法は、Xu et.al.Development of plant prime-editing systems for precise genome editing,2020,Plant Communicationsに記載されている。
一態様では、植物の適応度を高める方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置の植物(例えば、Gene Writerシステムを送達されていない植物)と比較して、植物の適応度を高めるために、本明細書に記載のGene Writerシステムを(例えば、有効な量及び期間で)植物に送達するステップを含む。
Gene Writerシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、いくつかの方法で維持することができ、例えば、それにより、植物の生産改善、例えば、収率の向上、植物の成長力若しくは植物から収穫された産物の品質の向上、農業若しくは園芸に関して望ましいとみなされる収穫前後の特徴(例えば、味、外観、貯蔵寿命)の改善又はそれ以外にヒトに有益な特徴改善(例えば、アレルゲン生成の低減)が達成される。植物の収率改善は、同じ条件下であるが、本組成物の適用なしで生産された植物の同じ産物の収率に対して、或いは従来の植物修飾剤の適用と比較して、測定可能な量による、植物の産物の収率の増加(例えば、植物バイオマス、穀粒、種子若しくは果実収率、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積により測定可能な)に関する。例えば、収率は、少なくとも約0.5%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%又は100%超増加し得る。いくつかの事例では、本方法は、非処置植物と比較して、収率を約2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍又は100倍超増加するのに有効である。収率は、植物の重量若しくは体積又は何らかの基準に基づく植物の産物に関して表すことができる。基準は、時間、栽培面積、生産される植物の重量又は使用される原材料の量に関して表すことができる。例えば、こうした方法は、限定されないが、種子、果実、穀粒、実、塊茎、根及び葉などの植物組織の収率を増加し得る。
Gene Writerシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、他の手段、例えば、同じ条件下であるが、本組成物の投与なしで又は従来の植物修飾剤を適用して、生産された植物の産物の同じ要因と比較して、測定可能若しくは認識可能な量による、成長力評価、群落(面積単位当たりの植物の数)、植物の高さ、茎の状況、茎の長さ、葉の数、葉のサイズ、林冠、外観(例えば、濃い緑色の葉の色など)、根評価、出芽、タンパク質含量、分けつ増加、葉のサイズの増加、葉の増加、根出葉の減少、より強い新芽、必要な肥料の減少、必要な種子の減少、より生産性の高い新芽、より早い開花、より早い穀粒若しくは種子成熟、植物の傾き(verse)(倒伏)の減少、シュートの成長増大、より早期の発芽又はこれらの要因の任意の組合せの増大若しくは改善によって測定することもできる。
従って、本明細書には、植物を修飾する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるGene Writerシステムのいずれかを有効な量で植物に送達するステップを含み、ここで、上記方法は、植物を修飾し、それにより、非処置植物と比較して、植物に有益な特徴を導入するか、又はそれを(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加する。特に、本方法は、非処置植物と比較して、植物適応度を(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加し得る。
いくつかの事例では、植物適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水使用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、害虫耐性、草食動物耐性、病原体耐性、収率、水制限条件下での収率、成長力、成長、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、シュート長さ、根長さ、根構造、種子重量又は収穫可能な産物の量の(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%若しくは100%超の)増加である。
いくつかの事例では、適応度の増加は、発育、成長、収率、非生物ストレス源に対する耐性又は生物ストレス源に対する耐性の(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%若しくは100%超の)増加である。非生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、干ばつストレス、塩ストレス、熱ストレス、低温ストレス及び低栄養ストレスが挙げられる。生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、線虫ストレス、草食昆虫ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス又はウイルス病原体ストレスが挙げられる。ストレスは、一過性、例えば、数時間、数日、数ヶ月の場合もあれば、又は永続的、例えば、植物の寿命にわたる場合もある。
一部では、植物から収穫された産物の品質の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)。例えば、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の商業的に好ましい特徴(例えば、味又は外観)の改善であり得る。他の事例では、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の貯蔵寿命の(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超の)増加である。
代わりに、適応度の増加は、ヒト又は動物の健康に対して有益な特徴の改変、例えば、アレルゲン生成の低減であり得る。例えば、適応度の増加は、動物(例えば、ヒト)の免疫応答を刺激するアレルゲン(例えば、花粉)の生成の(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超の)低減であり得る。
植物の修飾(例えば、適応度の増加)は、1つ又は複数の植物部分の修飾から起こり得る。例えば、植物は、植物の葉、種子、花粉、根、果実、シュート、花、細胞、プロトプラスト又は組織(例えば、分裂組織)を接触させることにより、修飾することができる。従って、別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の花粉を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加する。
また別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に開示のGene Writerシステムのいずれかと植物の種子を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加する。
また別の態様では、有効量の本明細書に記載のGene Writerシステムのいずれかと植物のプロトプラストを接触させるステップを含む方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加する。
さらに別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に記載のGene Writerシステムのいずれかと植物の植物細胞を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の分裂組織を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の胚を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を(例えば、約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又は100%超)増加する。
B.適用方法
本明細書に記載の植物は、組成物を植物に送達又は投与することを可能にする任意の好適な様式で、本明細書に記載のGene Writerシステム組成物のいずれかに曝露することができる。Gene Writerシステムは、単独で又は他の活性(例えば、肥料)若しくは非活性物質と組み合わせて送達され得、例えば、有効濃度の植物修飾組成物を送達するために製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、スプレー、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で、噴霧、注入(例えば、マイクロインジェクション)、植物を媒介して、注ぎ込む、浸漬することにより、適用することができる。本明細書に記載の組成物の適用のための量及び位置は、一般に、植物の生息地、植物修飾組成物により植物をターゲティングすることができる生活環段階、適用を実施しようとする部位並びに植物修飾組成物の物理的及び機能的特性により決定する。
いくつかの事例では、組成物は、例えば、バックパック噴霧、空中噴霧、作物噴霧/散布などにより、植物、例えば作物に直接噴霧する。Gene Writerシステムを植物に送達する場合、Gene Writerシステムを受ける植物は、植物成長の任意の段階であり得る。例えば、製剤化された植物修飾組成物を植物成長の早期段階で種子コーティング若しくは根処理として又は作物サイクルの後期段階での全植物処理として適用することができる。いくつかの事例では、植物修飾組成物は、植物に対する局所薬剤として適用され得る。
さらに、Gene Writerシステムは、植物の組織を通して吸収及び分布される浸透性薬剤として(例えば、植物が成長する土壌又は植物の水遣りに使用する水に)適用され得る。いくつかの事例では、Gene Writerシステムを発現するように、植物又はえさ生物を遺伝子的に形質転換することもできる。
また、溶解性若しくは生体内分解性コーティング層、例えば、ゼラチンで、Gene Writerシステム又は植物修飾組成物を含む組成物をコーティングすることにより、遅延又は連続的放出を達成することも可能であり、上記のコーティングは、使用環境内で溶解又は分解し、その後、植物修飾com Gene Writerシステム位置が利用可能になるか、或いは溶解性若しくは分解性マトリックス中に薬剤を分散することによっても達成することができる。こうした連続的放出及び/又は分散は、デバイスを有利に使用して、本明細書に記載の植物修飾組成物の1つ又は複数の有効濃度を一定に維持し得ることを意味する。
いくつかの事例では、Gene Writerシステムを、植物の一部、例えば、その葉、種子、花粉、根、果実、シュート、若しくは花、若しくは組織、細胞又はプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Gene Writerシステムを、植物の細胞に送達する。いくつかの事例では、Gene Writerシステムを、植物のプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Gene Writerシステムを、植物の組織に送達する。例えば、組成物を植物の分裂組織(例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織又は介在分裂組織)に送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織(例えば、単組織(例えば、柔組織、厚角組織若しくは厚膜組織)又は複合永久組織(例えば、木部若しくは師部)に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚にGene Writerシステムを送達する。
C.植物
本明細書に記載のGene Writerシステムで処置するために、多様な植物に送達することができる。本方法に従ってGene Writerシステムを送達する(即ち「処置する」)ことができる植物は、全植物及び植物部分を含み、そうしたものとして、限定されないが、シュート栄養器官/構造(例えば、葉、茎及び塊茎)、根、花及び花器官/構造(例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯及び胚珠)、種子(胚、胚乳、子葉及び種皮を含む)並びに果実(成熟卵胞)、植物組織(例えば、維管束組織、基本組織など)並びに細胞(例えば、孔辺細胞、卵細胞など)並びにそれらの子孫が挙げられる。植物部分は、さらに、シュート、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節間、樹皮、軟毛、新芽、根茎、葉状体、(イネ科植物の)葉、花粉、雄蕊などの植物の部分も指す。
本明細書に開示される方法で処置することができる植物のクラスは、高等及び下等植物のクラスを含み、被子植物(単子葉及び双子葉植物)、裸子植物、シダ、ツクシ、古生マツバラン(psilophyte)、小葉植物、コケ植物及び藻類(例えば、多細胞又は単細胞藻類)が挙げられる。本方法に従って処置することができる植物はさらに、任意の維管束植物、例えば単子葉若しくは双子葉植物又は裸子植物を含み、限定されないが、以下のものが挙げられる:アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、バナナ、カノーラ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、ハマナ(crambe)、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム(dendrobium)、ヤマノイモ、ユーカリ、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、リリアセア(liliacea)、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ(Phaseolus)、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライムギ、ライグラス、サフラワー、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、シバ、コムギ並びにレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物(cucurbis)などの野菜作物;リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなどの果実及び堅果樹;ブドウ(例えば、ブドウ園)、キーウィ、ホップなどのつる植物;ラズベリー、ブラックベリー、グーズベリーなどの果実低木及びブランブル;トネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クリ、ポプラなどの森林樹;並びにアルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、ハマナ(crambe)、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、コメ、サフラワー、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト及びコムギ。本明細書に開示される方法に従って処置することができる植物は、あらゆる作物植物、例えば飼料作物、油糧種子作物、穀粒作物、果物作物、野菜作物、繊維作物、香辛料作物、ナッツ作物、芝土作物、糖料作物、飲料作物及び森林作物を含む。特定の事例では、本方法で処置される作物植物は、ダイズ植物である。他の特定の事例では、作物植物は、コムギである。他の特定の事例では、作物植物は、トウモロコシである。他の特定の事例では、作物植物は、綿である。特定の事例では、作物植物は、アルファルファである。特定の事例では、作物植物は、テンサイである。特定の事例では、作物植物は、コメである。特定の事例では、作物植物は、ジャガイモである。特定の事例では、作物植物は、トマトである。
特定の事例では、植物は、作物である。こうした作物植物の例として、限定されないが、単子葉及び双子葉植物が挙げられ、限定されないが、下記のものから選択される飼料若しくは飼い葉用マメ科植物、観賞植物、食用作物、樹木又は低木を含む:カエデ属種(Acer spp.)、アリウム属種(Allium spp.)、アマランサス属種(Amaranthus spp.)、パイナップル(Ananas comosus)、セロリ(Apium graveolens)、ラッカセイ属種(Arachis spp)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、サトウダイコン(Beta vulgaris)、アブラナ属種(Brassica spp.)(例えば、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、ブラッシカ・ラパ種(Brassica rapa ssp.)(カノーラ、アブラナ(oilseed rape)、ナバナ(turnip rape))、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)、ダンドク(Canna indica)、アサ(Cannabis saliva)、トウガラシ属種(Capsicum spp.)、クリ属種(Castanea spp.)、エンダイブ(Cichorium endivia)、スイカ(Citrullus lanatus)、シトラス属種(Citrus spp.)、ココス属種(Cocos spp.)、コーヒーノキ属種(Coffea spp.)、コリアンダー(Coriandrum sativum)、ハシバミ属種(Corylus spp.)、クラタエグス属種(Crataegus spp.)、カボチャ属種(Cucurbita spp.)、ククミス属種(Cucumis spp.)、ニンジン(Daucus carota)、ブナ属種(Fagus spp.)、イチジク(Ficus carica)、フラガリア属種(Fragaria spp.)、イチョウ(Ginkgo biloba)、ダイズ属種(Glycine spp.)(例えば、グリシン・マックス(Glycine max)、ソーヤ・ヒスピダ(Soja hispida)若しくはソーヤ・マックス(Soja max))、リクチワタ(Gossypium hirsutum)、ヒマワリ属種(Helianthus spp.)(例えば、ヒマワリ(Helianthus annuus))、ハイビスカス属種(Hibiscus spp.)、オオムギ属種(Hordeum spp.)(例えば、オオムギ(Hordeum vulgare))、サツマイモ(Ipomoea batatas)、クルミ属種(Juglans spp.)、レタス(Lactuca sativa)、アマ(Linum usitatissimum)、レイシ(Litchi chinensis)、ミヤコグサ属種(Lotus spp.)、トカドヘチマ(Luffa acutangula)、ルピナス属種(Lupinus spp.)、トマト属種(Lycopersicon spp.)(例えば、トマト(Lycopersicon esculenturn)、リコペルシコン・リコペルシカム(Lycopersicon lycopersicum)、リコペルシコン・ピリフォルメ(Lycopersicon pyriforme))、リンゴ属種(Malus spp.)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、ハッカ属種(Mentha spp.)、ススキ(Miscanthus sinensis)、クロミグワ(Morus nigra)、バショウ種種(Musa spp.)、タバコ属種(Nicotiana spp.)、オリーブ属種(Olea spp.)、オリザ属種(Oryza spp.)(例えば、イネ(Oryza sativa)、オリザ・ラティフォリア(Oryza latifolia))、キビ(Panicum miliaceum)、スイッチグラス(Panicum virgatum)、パッションフルーツ(Passiflora edulis)、イタリアンパセリ(Petroselinum crispum)、インゲンマメ属種(Phaseolus spp.)、マツ属種(Pinus spp.)、ピスタチオ(Pistacia vera)、エンドウ属種(Pisum spp.)、イチゴツナギ属種(Poa spp.)、ハコヤナギ属種(Populus spp.)、サクラ属種(Prunus spp.)、セイヨウナシ(Pyrus communis)、コナラ属種(Quercus spp.)、ラディッシュ(Raphanus sativus)、ショクヨウダイオウ(Rheum rhabarbarum)、スグリ属種(Ribes spp.)、トウゴマ(Ricinus communis)、キイチゴ属種(Rubus spp.)、サトウキビ属種(Saccharum spp.)、ヤナギ属種(Salix sp.)、ニワトコ属種(Sambucus spp.)、ライムギ(Secale cereale)、ゴマ属種(Sesamum spp.)、シナピス属種(Sinapis spp.)、ナス属種(Solanum spp.)(例えば、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ヒラナス(Solanum integrifolium)若しくはトマト(Solanum lycopersicum))、モロコシ(Sorghum bicolor)、セイバンモロコシ(Sorghum halepense)、ホウレンソウ属種(Spinacia spp.)、タマリンディス・インディカ(Tamarindus indica)、テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)、トリフォリウム属種(Trifolium spp.)、トリチコセケル・リンパウイ(Triticosecale rimpaui)、コムギ属種(Triticum spp.)(例えば、コムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(Triticum durum)、ベットコムギ(Triticum turgidum)、トリチカム・ヒベルナム(Triticum hybernum)、トリチカム・マチャ(Triticum macha)、トリチカム・サチバム(Triticum sativum)若しくはリチカム・ブルガレ(Triticum vulgare))、スノキ属種(Vaccinium spp.)、ソラマメ属種(Vicia spp.)、ササゲ属種(Vigna spp.)、ニオイスミレ(Viola odorata)、ブドウ属種(Vitis spp.)並びにトウモロコシ(Zea mays)。特定の実施形態では、作物植物は、コメ、アブラナ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ(トウモロコシ)、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ又はコムギである。
本発明で使用される植物又は植物部分は、植物発育のあらゆる段階の植物を含む。特定の事例では、送達は、発芽、苗成長、栄養成長及び生殖成長の段階中に行うことができる。特定の事例では、植物への送達は、栄養及び生直成長段階中に行う。いくつかの事例では、組成物は、植物の花粉に送達する。いくつかの事例では、植物の種子に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物のプロトプラストに組成物を送達する。いくつかの事例では、植物の組織に組成物を送達する。例えば、植物の分裂組織(例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織又は介在分裂組織)に組成物を送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織(例えば、単組織(例えば、柔組織、厚角組織若しくは厚膜組織)又は複合永久組織(例えば、木部若しくは師部)に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物細胞に組成物を送達する。栄養及び生殖成長の段階は、本明細書において、「成体」又は「成熟」植物とも呼ばれる。
Gene Writerシステムを植物部分に送達する事例では、植物修飾剤により植物部分を修飾し得る。代わりに、Gene Writerシステムを植物の他の部分に分布させ(例えば、植物の循環系によって)、その後、それらの部分を植物修飾剤により修飾する。
脂質ナノ粒子
本発明により提供される方法及びシステムは、特定の実施形態では、脂質ナノ粒子(LNP)を含む任意の好適な担体又は送達方法を含み得る。脂質ナノ粒子は、一部の実施形態において、1つ若しくは複数のイオン脂質、例えば非カチオン脂質(例えば、中性若しくはアニオン又は双性イオン脂質);1つ若しくは複数の共役脂質(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2019217941号パンフレットの表5に記載される、PEG共役脂質又はポリマーと共役した脂質など);1つ若しくは複数のステロール(例えば、コレステロール);並びに任意選択で1つ若しくは複数のターゲティング分子(例えば、共役受容体、受容体リガンド、抗体);又はこれらの組合せを含む。
ナノ粒子形成(例えば、脂質ナノ粒子)に使用することができる脂質として、例えば、国際公開第2019217941号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の表4に記載されるものが挙げられ、例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第2019217941号パンフレットの表4に示される脂質の1つ又は複数を含み得る。脂質ナノ粒子は、ポリマー、例えば国際公開第2019217941号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の表5に記載されるポリマーなどの別の要素を含み得る。
一部の実施形態では、共役脂質は、存在する場合、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)(例えば、1-(モノメトキシ-ポリエチレングリコール)-2,3-ジミリストイルグリセロール(PEG-DMG))、PEG-ジアルキルオキシプロピル(DAA)、PEG-リン脂質、PEG-セラミド(Cer)、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)、PEG-コハク酸ジアシルグリセロール(PEGS-DAG)(例えば、4-0-(2’,3’-ジ(テトラデカノイルオキシ)プロピル-1-0-(w-メトキシ(ポリエトキシ)エチル)ブタンジオエート(PEG-S-DMG))、PEGジアルコキシプロピルカルバム、N-(カルボニル-1-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩及び国際公開第2019051289号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)並びにこれらの組合せの1つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込むことができるステロールは、コレステロール又はこれらのコレステロール誘導体、例えば、国際公開第2009/127060号パンフレット又は米国特許出願公開第2010/0130588号明細書(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものなどを含む。別の例示的なステロールとして、フィトステロールが挙げられ、Eygeris et al(2020),dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものを含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質、粒子の凝集を阻害する共役脂質及びステロールを含む。これらの成分の量は、独立して、且つ所望の特性を達成するように変動し得る。例えば、一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、総脂質の約20mol%~約90mol%の量のイオン化性脂質(他の実施形態では、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の20~70%(mol)、30~60%(mol)若しくは40~50%(mol);約50mol%~約90mol%であり得る)、総脂質の約5mol%~約30mol%の量の非カチオン脂質、総脂質の約0.5mol%~約20mol%の量の共役脂質及び総脂質の約20mol%~約50mol%の量のステロールを含む。核酸(例えば、Gene Writer又は鋳型核酸をコードする)に対する総脂質の比は、要望に応じて変動し得る。例えば、核酸に対する総脂質(質量又は重量)は、約10:1~約30:1であり得る。
一部の実施形態では、脂質と核酸の比(質量/質量比;w/w比)は、約1:1~約25:1、約10:1~約14:1、約3:1~約15:1、約4:1~約10:1、約5:1~約9:1又は約6:1~約9:1の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のN/P比、例えば、3、4、5、6、7、8、9又は10以上のN/P比を提供するように、調節することができる。一般に、脂質ナノ粒子製剤の総脂質含量は、約5mg/ml~約30mg/mlであり得る。
脂質ナノ粒子製剤に使用することができる例示的なイオン化性脂質は、限定されないが、国際公開第2019051289号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の表1に列挙されるものを含む。別の例示的な脂質として、限定されないが、以下の式の1つ若しくは複数が挙げられる:米国特許出願公開第2016/0311759号明細書のX;米国特許出願公開第20150376115号又は米国特許第2016/0376224号明細書のI;米国特許出願公開第20160151284号明細書のI、II又はIII;米国特許出願公開第20170210967号明細書のI、IA、II又はIIA;米国特許第20150140070号明細書のI-c;米国特許出願公開第2013/0178541号明細書のA;米国特許出願公開第2013/0303587号又は米国特許第2013/0123338号明細書のI;米国特許出願公開第2015/0141678号明細書のI;米国特許出願公開第2015/0239926号明細書のII、III、IV又はV;米国特許出願公開第2017/0119904号明細書のI;国際公開第2017/117528号パンフレットのI又はII;米国特許出願公開第2012/0149894号明細書のA;米国特許出願公開第2015/0057373号明細書のA;国際公開第2013/116126号パンフレットのA;米国特許出願公開第2013/0090372号明細書のA;米国特許出願公開第2013/0274523号明細書のA;米国特許出願公開第2013/0274504号明細書のA;米国特許出願公開第2013/0053572号明細書のA;国際公開第2013/016058号パンフレットのA;国際公開第2012/162210号パンフレットのA;米国特許出願公開第2008/042973号明細書のI;米国特許出願公開第2012/01287670号明細書のI、II、III又はIV;米国特許出願公開第2014/0200257号明細書のI又はII;米国特許出願公開第2015/0203446号明細書のI、II又はIII;米国特許出願公開第2015/0005363号明細書のI又はIII;米国特許出願公開第2014/0308304号明細書のI、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID又はIII-XXIV;米国特許出願公開第2013/0338210号明細書のもの;国際公開第2009/132131号パンフレットのI、II、III又はIV;米国特許出願公開第2012/01011478号明細書のA;米国特許出願公開第2012/0027796号明細書のI又はXXXV;米国特許出願公開第2012/0058144号明細書のXIV又はXVII;米国特許出願公開第2013/0323269号明細書のもの;米国特許出願公開第2011/0117125号明細書のI;米国特許出願公開第2011/0256175号明細書のI、II又はIII;米国特許出願公開第2012/0202871号明細書のI、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII;米国特許出願公開第2011/0076335号明細書のI、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV又はXVI;米国特許出願公開第2006/008378号明細書のI又はII;米国特許出願公開第2013/0123338号明細書のI;米国特許出願公開第2015/0064242号明細書のI又はX-A-Y-Z;米国特許出願公開第2013/0022649号明細書のXVI、XVII又はXVIII;米国特許出願公開第2013/0116307号明細書のI、II又はIII;米国特許出願公開第2013/0116307号明細書のI、II又はIII;米国特許出願公開第2010/0062967号明細書のI又はII;米国特許出願公開第2013/0189351号明細書のI~X;米国特許出願公開第2014/0039032号明細書のI;米国特許出願公開第2018/0028664号明細書のV;米国特許出願公開第2016/0317458号明細書のI;米国特許出願公開第2013/0195920号明細書のI。
一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第2019051289A9号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例9に記載されているように、MC3(6Z,9Z,28Z,3 lZ)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,3,l-テトラエン-l9-イル-4-(ジメチルペンチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA又はMC3)である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第2019051289A9号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例10に記載されているように、脂質ATX-002である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第2019051289A9号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例11に記載されているように、(l3Z,l6Z)-A,A-ジメチル-3-ノニルドコサ-l3、l6-ジエン-1-アミン(化合物32)である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第2019051289A9号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例12に記載されているように、化合物6又は化合物22である。
例示的な非カチオン脂質として、限定されないが、以下のものが挙げられる:ジステアロイル-sn-グリセロ-ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、4-(N-マレイミドメチル
)-シクロヘキサン-1-カルボン酸ジオレオイル-ホスホエタノールアミン(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジパルミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン(例えば、16-O-モノメチルPE)、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン(例えば、16-O-ジメチルPE)、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-1-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS)、スフィンゴミエリン(SM)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジエルコイルホスファチジルコリン(DEPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、ジエライドイル-ホスファチジルエタノールアミン(DEPE)、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン(ESM)、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン又はそれらの混合物。さらに、他のジアセチルホスファチジルコリン及びジアセチルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用できることは理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、C10~24炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル又はオレオイルである。特定の実施形態における別の例示的な脂質として、限定しないが、Kim et al.(2020)dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものが挙げられる。こうした脂質には、一部の実施形態では、mRNAを用いた肝トランスフェクションを改善することが判明している植物脂質(例えば、DGTS)が含まれる。
脂質ナノ粒子での使用に適した非カチオン脂質の他の例として、限定しないが、無リン脂質、例えばステアリルアミン、ドデエイルアミン、ヘキサアデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル-アリール硫酸塩ポリエトキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウム臭化物、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン脂質は、国際公開第2017/099823号パンフレット又は米国特許出願公開第2018/0028664号明細書に記載されており、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、非カチオン脂質は、米国特許出願公開第2018/0028664号明細書(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の式I、II若しくはIVのオレイン酸又は化合物である。非カチオン脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の0~30%(mol)を占め得る。一部の実施形態では、非カチオン脂質含有率は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の5~20%(mol)又は10~15%(mol)である。複数の実施形態では、イオン化性脂質と中性脂質のモル比は、約2:1~約8:1(例えば、約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1又は8:1)の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を一切含まない。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、膜完全性を賦与するために、ステロールなどの成分をさらに含み得る。脂質ナノ粒子に使用することができるステロールの一例は、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例として、5a-コレスタノール、53-コプロスタノール、コレステリル-(2-ヒドロキシ)-エチルエーテル、コレステリル-(4’-ヒドロキシ)-ブチルエーテル及び6-ケトコレスタノールなどの極性類似体;5a-コレスタン、コレステノン、5a-コレスタノン、5p-コレスタノン及びデカン酸コレステリルなどの非極性類似体;並びにそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル-(4’-ヒドロキシ)-ブチルエステルである。例示的なコレステロール誘導体は、国際公開第2009/127060号パンフレット及び米国特許出願公開第2010/0130588号明細書(これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
一部の実施形態では、膜完全性を賦与する成分、例えば、ステロールなどは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の0~50%(mol)(例えば、0~10%、10~20%、20~30%、30~40%又は40~50%)を含む。一部の実施形態では、こうした成分は、脂質ナノ粒子の総脂質の20~50%(mol)、30~40%(mol)である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール(PEG)又は共役脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、且つ/又は立体安定化をもたらす。例示的な共役脂質として、限定されないが、PEG-脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン(POZ)-脂質コンジュゲート、ポリアミド-脂質コンジュゲート(例えば、ATTA-脂質コンジュゲート)、カチオンポリマー脂質(CPL)コンジュゲート及びそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、共役脂質分子は、PEG-脂質コンジュゲート、例えば、(メトキシポリエチレングリコール)共役脂質である。
例示的なPEG-脂質コンジュゲートとして、限定されないが、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)(例えば、1-(モノメトキシ-ポリエチレングリコール)-2,3-ジミリストイルグリセロール(PEG-DMG))、PEG-ジアルキルオキシプロピル(DAA)、PEG-リン脂質、PEG-セラミド(Cer)、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)、PEGコハク酸ジアシルグリセロール(PEGS-DAG)(例えば、4-0-(2’,3’-ジ(テトラデカノイルオキシ)プロピル-1-0-(w-メトキシ(ポリエトキシ)エチル)ブタンジオエート(PEG-S-DMG))、PEGジアルコキシプロピルカルバム、N-(カルボニル-1-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩又はそれらの混合物が挙げられる。別の例示的なPEG-脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第5,885,6l3号明細書、米国特許第6,287,59l号明細書、米国特許出願公開第2003/0077829号明細書、米国特許出願公開第2003/0077829号明細書、米国特許出願公開第2005/0175682号明細書、米国特許出願公開第2008/0020058号明細書、米国特許出願公開第2011/0117125号明細書、米国特許出願公開第2010/0130588号明細書、米国特許出願公開第2016/0376224号明細書、米国特許出願公開第2017/0119904号明細書及び米国特許出願公開第/099823号明細書に記載されており、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、PEG-脂質は、米国特許出願公開第2018/0028664号明細書(その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる)の式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2の化合物である。一部の実施形態では、PEG-脂質は、米国特許出願公開第20150376115号明細書又は米国特許出願公開第2016/0376224号明細書(いずれの内容も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の式IIのものである。一部の実施形態では、PEG-DAAコンジュゲートは、例えば、PEG-ジラウロイルオキシプロピル、PEG-ジミリスチルオキシプロピル、PEG-ジパルミチルオキシプロピル又はPEG-ジステアリルオキシプロピルであり得る。PEG-脂質は、PEG-DMG、PEG-ジラウリルグリセロール、PEG-ジパルミトイルグリセロール、PEG-ジステリルグリセロール、PEG-ジラウリルグリカミド、PEG-ジミリスチルグリカミド、PEG-ジパルミトイルグリカミド、PEG-ジステリルグリカミド、PEG-コレステロール(l-[8’-(コレスト-5-エン-3[β]-オキシ)カルボキサミド-3’,6’-ジオキサオクタニル]カルバモイル-[ω]-メチル-ポリ(エチレングリコール)、PEG-DMB(3,4-ジテトラデコキシルベンジル-[ω]-メチル-ポリ(エチレングリコール)エーテル)及び1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]の1つ若しくは複数であり得る。一部の実施形態では、PEG-脂質は、PEG-DMG、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]を含む。一部の実施形態では、PEG-脂質は、
Figure 2023502473000776
から選択される構造を含む。
一部の実施形態では、PEG-脂質の代わりに、PEG以外の分子と共役した脂質を使用することもできる。例えば、PEG-脂質の代わりに、ポリオキサゾリン(POZ)-脂質コンジュゲート、ポリアミド-脂質コンジュゲート(例えば、ATTA-脂質コンジュゲート)及びカチオンポリマー脂質(GPL)コンジュゲートを使用することができる。
例示的な共役脂質、即ちPEG-脂質、(POZ)-脂質コンジュゲート、ATTA-脂質コンジュゲート及びカチオンポリマー脂質は、国際公開第2019051289A9号パンフレットの表2に列挙されるPCT及びLIS特許出願に記載されており、これらの内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、PEG又は共役脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の0~20%(mol)を占め得る。一部の実施形態では、PEG又は共役脂質の含有率は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の0.5~10%又は2~5%(mol)である。イオン化性脂質、非カチオン脂質、ステロール及びPEG/共役脂質のモル比は、必要に応じて変動し得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル又は総重量当たり30~70%のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり0~60%のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり0~30%の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり1~10%の共役脂質と、を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり30~40%のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり40~50%のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり10~20%の非カチオン脂質と、を含む。一部の実施形態では、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり50~75%のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり20~40%のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり5~10%の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり1~10%の共役脂質である。組成物は、組成物のモル又は総重量当たり60~70%のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり25~35%のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり5~10%の非カチオン脂質と、を含み得る。組成物はまた、組成物のモル又は総重量当たり最大90%のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり2~15%の非カチオン脂質とを含み得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル若しくは総重量当たり8~30%のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり5~30%の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり0~20%のコレステロールと;組成物のモル若しくは総重量当たり4~25%のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり4~25%の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり2~25%のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり10~35%の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり5%のコレステロール;又は組成物のモル若しくは総重量当たり2~30%のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり2~30%の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり1~15%のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり2~35%の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり1~20%のコレステロール;或いはまた組成物のモル若しくは総重量当たり最大90%のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり2~10%の非カチオン脂質と、又は組成物のモル若しくは総重量当たり100%のカチオン脂質であり得る。一部の実施形態では、脂質粒子製剤は、50:10:38.5:1.5のモル比で、イオン化性脂質、リン脂質、コレステロール及びPEG化脂質を含む。一部の他の実施形態では、脂質粒子製剤は、60:38.5:1.5のモル比で、イオン化性脂質、コレステロール及びPEG化脂質を含む。
一部の実施形態では、脂質粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質(例えば、リン脂質)、ステロール(例えば、コレステロール)及びPEG化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化性脂質の場合、20~70モル%の範囲で、目標は40~60であり、非カチオン脂質のモルパーセントは、0~30の範囲で、目標は0~15、ステロールのモルパーセントは、20~70の範囲で、目標は30~50、PEG化脂質のモルパーセントは、1~6の範囲で、目標は2~5である。
一部の実施形態では、脂質粒子は、50:10:38.5:1.5のモル比で、イオン化性脂質/非カチオン脂質/ステロール/共役脂質を含む。
一態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
一部の実施形態では、1つ又は複数の別の化合物を含有させることができる。そうした化合物は個別に投与することもできるか、又は追加的化合物を本発明の脂質ナノ粒子に含有させることができる。換言すれば、脂質ナノ粒子は、核酸又は最初の核酸と異なる少なくとも1つの第2核酸に加えて、他の化合物を含有することができる。限定はしないが、他の追加的化合物は、小若しくは大有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体及びその誘導体、生体材料から調製された抽出物又はそれらの任意の組合せから選択することができる。
一部の実施形態では、ターゲティングドメインの付加により、LNPを特定の組織に指向させる。例えば、生物学的リガンドをLNPの表面に展示して、同種受容体を展示する細胞との相互作用を増強し、それにより、上記受容体との結合並びに細胞が受容体を発現する組織へのカーゴ送達を駆動することができる。一部の実施形態では、生物学的リガンドは、肝臓への送達を駆動するリガンドであり得、例えば、GalNAcを展示するLNPは、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)を展示する肝細胞に対する核酸カーゴの送達を達成する。Akinc et al.Mol Ther 18(7):1357-1364 2010)の論文は、観察可能なLNPカーゴ効果(例えば、Akinc et al.2010,前掲の図6を参照)についてASGPRに依存的なLNPを取得するためのPEG-脂質に対する三価GalNAcリガンド(GalNAc-PEG-DSG)の共役を教示している。例えば、葉酸塩、トランスフェリン又は抗体を含む他のリガンド展示LNP製剤は、国際公開第2017223135号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)、さらには、そこで使用される参照文献、即ちKolhatkar et al.,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197-206;Musacchio and Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388-1412;Yu et al.,Mol Membr Biol.2010 27:286-298;Patil et al.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1-61;Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714;Zhao et al.,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309-319;Akinc et al.,Mol Ther.2010 18:1357-1364;Srinivasan et al.,Methods Mol Biol.2012 820:105-116;Ben-Arie et al.,Methods Mol Biol.2012 757:497-507;Peer 2010 J Control Release.20:63-68; Peer et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:4095-4100;Kim et al.,Methods Mol Biol.2011 721:339-353;Subramanya et al.,Mol Ther.2010 18:2028-2037;Song et al.,Nat Biotechnol. 2005 23:709-717;Peer et al.,Science.2008 319:627-630;及びPeer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133で論じられている。
一部の実施形態では、イオン化性脂質、両性リン脂質、コレステロール及びポリ(エチレングリコール)(PEG)脂質などの伝統的成分を含む製剤に対するSelective ORgan Targeting(SORT)分子の添加により、組織特異的活性についてLNPを選択する。Cheng et al.Nat Nanotechnol 15(4):313-320(2020)の教示は、補足的「SORT」成分の添加により、インビボRNA送達プロファイルを厳密に改変し、SORT分子のパーセンテージ及び生物物理学的特性に応じて組織特異的(例えば、肺、肝臓、脾臓)遺伝子送達を媒介することを実証している。
一部の実施形態では、LNPは、生分解性、イオン化性脂質を含む。一部の実施形態では、LNPは、オクタデカ-9,12-ジエン酸(9Z,l2Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルを含み、これは、(9Z,l2Z)-オクタデカ-9,12-ジエン酸)3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルとも呼ばれる。例えば、国際公開第2019/067992号パンフレット、国際公開第2017/173054号パンフレット、国際公開第2015/095340号パンフレット及び国際公開第2014/136086号パンフレット並びにそこに記載される参照文献に記載の脂質を参照されたい。一部の実施形態では、LNP脂質に関して、カチオン(性)及びイオン化性という用語は互換可能であり、例えば、イオン化性脂質は、pHによってはカチオン性である。
一部の実施形態では、Gene Writerシステムの複数の構成要素を単一のLNP製剤として調製し得、例えば、LNP製剤は、Gene WriterポリペプチドコードするmRNA及びRNA鋳型を含む。核酸成分の比は、治療薬の特性を最大にするために変動させ得る。一部の実施形態では、RNA鋳型と、Gene WriterポリペプチドコードするmRNAの比は、モル比で約1:1~100:1、例えば、約1:1~20:1、約20:1~40:1、約40:1~60:1、約60:1~80:1又は約80:1~100:1である。他の実施形態では、複数の核酸のシステムは、個別の製剤、例えば、鋳型RNAを含む1つのLNP製剤と、Gene WriterポリペプチドコードするmRNAを含む第2LNP製剤により調製され得る。一部の実施形態では、システムは、LNPに製剤化された3つ以上の核酸成分を含み得る。一部の実施形態では、システムは、少なくとも1つのLNPに製剤化された、タンパク質、例えばGene Writerシステム及び鋳型RNAを含み得る。
一部の実施形態では、LNP製剤の平均LNP径は、例えば、動的光散乱法(DLS)により測定して、数10nm~数100nmであり得る。一部の実施形態では、LNP製剤の平均LNP径は、約40nm~約150nm、例えば、約40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm又は150nmであり得る。一部の実施形態では、LNP製剤の平均LNP径は、約50nm~約100nm、約50nm~約90nm、約50nm~約80nm、約50nm~約70nm、約50nm~約60nm、約60nm~約100nm、約60nm~約90nm、約60nm~約80nm、約60nm~約70nm、約70nm~約100nm、約70nm~約90nm、約70nm~約80nm、約80nm~約100nm、約80nm~約90nm又は約90nm~約100nmであり得る。一部の実施形態では、LNP製剤の平均LNP径は、約70nm~約100nmであり得る。一部の実施形態では、LNP製剤の平均LNP径は、約80nmであり得る。一部の実施形態では、LNP製剤の平均LNP径は、約100nmであり得る。一部の実施形態では、LNP製剤の平均LNP径は、約1mm~約500mm、約5mm~約200mm、約10mm~約100mm、約20mm~約80mm、約25mm~約60mm、約30mm~約55mm、約35mm~約50mm又は約38mm~約42mmの範囲である。
LNPは、いくつかの事例では、比較的均質であり得る。多分散指数を用いて、LNPの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すことができる。低い(例えば、0.3未満の)多分散指数は、概して、狭い粒度分布を示す。LNPは、約0~約0.25、例えば、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24又は0.25の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、LNPの多分散指数は、約0.10~約0.20であり得る。
LNPのゼータ電位を用いて、組成物の界面動電位を示すことができる。一部の実施形態では、ゼータ電位は、LNPの表面電荷を表し得る。高度に荷電された種は、身体内の細胞、組織及び他の要素と不必要に相互作用する可能性があるため、正又は負の比較的低い電荷を持つ脂質ナノ粒子が一般的に望ましい。一部の実施形態では、LNPのゼータ電位は、約-10mV~約+20mV、約-10mV~約+15mV、約-10mV~約+10mV、約-10mV~約+5mV、約-10mV~約0mV、約-10mV~約-5mV、約-5mV~約+20mV、約-5mV~約+15mV、約-5mV~約+10mV、約-5mV~約+5mV、約-5mV~約0mV、約0mV~約+20mV、約0mV~約+15mV、約0mV~約+10mV、約0mV~約+5mV、約+5mV~約20mV、約+5mV~約15mV又は約+5mV~約10mVであり得る。
タンパク質及び/又は核酸、例えばGene Writerポリペプチド若しくはポリペプチドをコードするmRNAの封入の効率は、提供される初期量と比較して、封入されるか、若しくは調製後にLNPと結合されるタンパク質及び/又は核酸の量を表す。封入効率は、高い(例えば、100%近く)のが望ましい。封入効率は、例えば、1若しくは複数種の溶媒又はデタージェントで脂質ナノ粒子を分解する前及び後に、脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することにより測定することができる。アニオン交換樹脂を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸(例えば、RNA)の量を測定することができる。蛍光を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸(例えば、RNA)の量を測定することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子の場合、タンパク質及び/又は核酸の封入効率は、少なくとも50%、例えば50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも80%であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも90%であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも95%であり得る。
LNPは、任意選択で、1つ又は複数のコーティングを含み得る。一部の実施形態では、LNPは、コーティングを有するカプセル、フィルム又は錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載の組成物を含むカプセル、フィルム又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度若しくは密度を有し得る。
LNPのさらに別の例示的な脂質、製剤、方法及び特性決定は、国際公開第2020061457号パンフレットに教示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Lipofectamine MessengerMax(Thermo Fisher)又はTransIT-mRNA Transfection Reagent(Mirus Bio)を用いて、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションを実施する。特定の実施形態では、GenVoy_ILM ionizable lipid mix(Precision NanoSystems)を用いて、LNPを製剤化する。特定の実施形態では、LNPは、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2‐DMA)又はジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノ酪酸塩(DLin-MC3-DMA若しくはMC3)を用いて、LNPを製剤化するが、その製剤及びインビボでの使用については、Jayaraman et al.Angew Chem Int Ed Engl 51(34):8529-8533(2012)に教示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
CRISPR-Casシステム、例えばCas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9 mRNAの送達のために最適化されたLNP製剤は、国際公開第2019067992号パンフレット及び国際公開第2019067910号パンフレットに記載されており、そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
核酸の送達に有用な別の具体的なLNP製剤は、米国特許第8158601号明細書及び米国特許第8168775号明細書(そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる)に記載されており、これは、ONPATTROの名称で販売されているパチシランに使用される製剤を含む。
Gene Writer LNPの例示的な用量としては、約0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10又は100mg/kg(RNA)を挙げることができる。システムの1つ若しくは複数の成分をコードする核酸を含むAAVの例示的な用量としては、約1011、1012、1013及び1014vg/kgのMOIを挙げることができる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子(又は脂質ナノ粒子を含む製剤)は、反応性不純物(例えば、アルデヒド若しくはケトン)を欠くか、又は予め選択したレベル未満の反応性不純物(例えば、アルデヒド若しくはケトン)を含む。特定の理論に束縛されることは意図しないが、一部の実施形態では、脂質試薬を使用して脂質ナノ粒子製剤を作製し、脂質試薬は、混入反応性不純物(例えば、アルデヒド又はケトン)を含み得る。脂質試薬は、予め選択したレベル未満の反応性不純物(例えば、アルデヒド又はケトン)を有することに基づいて製造のために選択することができる。特定の理論に束縛されることは意図しないが、一部の実施形態では、アルデヒドは、RNAの修飾及び損傷、例えば塩基間の架橋及び/又はRNAへの脂質の共有結合共役を引き起こし得る(例えば、脂質-RNAアダクトを形成する)。これは、いくつかの事例では、逆転写酵素反応の不成功及び/又は例えば病変の部位の不適切な塩基の組込み、例えば、新たに合成される標的DNA中の突然変異を引き起こし得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む脂質試薬を用いて生産される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む脂質試薬を用いて生産される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、(i)5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物と、(ii)5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種とを含む脂質試薬を用いて生産される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、複数の脂質試薬を用いて生産され、複数の各脂質試薬は、独立して、本段落に記載される1つ又は複数の基準を満たす。一部の実施形態では、複数の各脂質試薬は、同じ基準、例えば、本段落の基準を満たす。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、(i)5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物と、(ii)5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の1つ若しくは複数又は任意選択で全ては、(i)5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の総反応性不純物(例えば、アルデヒド)含有物と、(ii)5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%又は0.1%未満の任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種とを含む。
一部の実施形態では、総アルデヒド含量及び/又は任意の単一反応性不純物(例えば、アルデヒド)種の量は、例えば、実施例26に記載される方法に従って、例えば、タンデム質量分析(MS/MS)と連結した液体クロマトグラフィー(LC)により決定される。一部の実施形態では、反応性不純物(例えば、アルデヒド)含量及び/又は反応性不純物(例えば、アルデヒド)種の量は、例えば、脂質試薬中の、反応性不純物(例えば、アルデヒド)の存在に伴う核酸分子(例えば、本明細書に記載される、例えばRNA分子)の1つ又は複数の化学修飾を検出することにより決定される。一部の実施形態では、反応性不純物(例えば、アルデヒド)含量及び/又は反応性不純物(例えば、アルデヒド)種の量は、例えば、実施例27に記載されているように、例えば脂質試薬中の、反応性不純物(例えば、アルデヒド)の存在に伴うヌクレオチド又はヌクレオシド(例えば、本明細書に記載される、例えば鋳型核酸中に含まれるか又はそれから単離された例えばリボヌクレオチド又はリボヌクレオシド)の1つ又は複数の化学修飾を検出することにより決定される。複数の実施形態では、核酸分子、ヌクレオチド又はヌクレオシドの化学修飾は、例えば、実施例27に記載されているように、例えばLC-MS/MS分析を用いて1つ又は複数の修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を決定することにより検出される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸(例えば、RNA)(例えば、鋳型核酸又はGeneWriterをコードする核酸)は、アルデヒド修飾を含まないか、又は予め選択した量未満のアルデヒド修飾を含む。一部の実施形態では、平均で、核酸は、1000ヌクレオチド当たり50、20、10、5、2又は1つ未満のアルデヒド修飾を有し、例えば、2つのヌクレオチドの単一架橋は、単一アルデヒド修飾である。一部の実施形態では、アルデヒド修飾は、RNAアダクト(例えば、脂質-RNAアダクト)である。一部の実施形態では、アルデヒド修飾ヌクレオチドは、塩基間の架橋である。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸(例えば、RNA)は、ヌクレオチド間の50、20、10、5、2又は1つ未満の架橋を含む。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許並びに他の出版物及び参照文献(例えば、配列データベース参照番号)は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書に、例えば本明細書の任意の表に参照として掲載されるGenBank、Unigene及びEntrezは全て、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示されない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、2019年7月19日現在で最新のデータベースエントリーを指す。1つの遺伝子又はタンパク質に複数の配列アクセッション番号が付いている場合、これら配列変異体の全てが包含される。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例1:哺乳動物細胞へのGene Writer(商標)システムの送達
この実施例では、哺乳動物細胞ゲノムへの外因性DNAの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるGene Writer(商標)ゲノム編集システムを説明する。
この実施例では、Gene Writer(商標)システムのポリペプチド成分は表3A、3B又は3Cから選択されるリコンビナーゼタンパク質であり、鋳型DNA成分は、標的組換え部位、例えば、表2A、2B又は2Cの対応する行の左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する認識配列を含むプラスミドDNAである。
HEK293T細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする:
1.スクランブルDNA対照
2.前述のポリペプチドをコードするDNA
3.前述の鋳型DNA
4.2と3の組合せ
トランスフェクション後、HEK293T細胞を少なくとも4日間培養し、部位特異的ゲノム編集について検定する。ゲノムDNAを各群のHEK293細胞から単離する。適切な配列又はゲノム遺伝子座と隣接するプライマーを用いて、PCRを実施する。PCR産物をアガロースゲル上に泳動させて、増幅したDNAの長さを測定する。
DNAプラスミド鋳型を標的ゲノムに挿入するGene Writing(商標)ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのPCR産物は、上の群4の完全Gene Writer(商標)システムでトランスフェクトした細胞のみに観察される。
実施例2:Gene Writer(商標)システムを用いた哺乳動物細胞への遺伝子発現単位の標的送達
この実施例では、哺乳動物ゲノムに異種遺伝子発現単位を挿入するためのGene Writerゲノムエディターの作製及び使用を説明する。
この実施例では、リコンビナーゼタンパク質は、表3A、3B又は3Cから選択される。リコンビナーゼタンパク質は、DNA組込みのためのリコンビナーゼポリペプチドの認識配列の適切なゲノムコピーをターゲティングする。鋳型DNA成分は、標的組換え部位(表2A、2B又は2Cの対応する行の左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する認識配列)と遺伝子発現単位とを含むプラスミドDNAである。遺伝子発現単位は、少なくとも1つのコーディング配列と作動可能に連結した少なくとも1つの調節配列を含む。この実施例では、調節配列は、CMVプロモータ及びエンハンサー、増強された翻訳エレメント及びWPREを含む。コーディング配列は、GFPオープンリーディングフレームである。
HEK293細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする:
1.スクランブルDNA対照
2.前述のポリペプチドをコードするDNA
3.前述の鋳型DNA
4.2と3の組み合わせ
トランスフェクション後、HEK293細胞を少なくとも4日間培養し、部位特異的Gene Writingゲノム編集について検定する。ゲノムDNAをHEK293細胞から単離し、ゲノム中の標的組込み部位とフランキングするプライマーを用いて、PCRを実施する。PCR産物をアガロースゲル上に泳動させて、DNAの長さを測定する。Gene Writing(商標)ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのPCR産物は、群4の試験物質(完全Gene Writer(商標)システム)でトランスフェクトした細胞に検出される。
トランスフェクトした細胞をさらに10日間培養し、複数の細胞培養継代後、GFP発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からGFP陽性の細胞のパーセントを算出する。GFP陽性細胞は、群4の試験物質でトランスフェクトしたHEK293細胞の集団に検出され、これは、Gene Writingゲノム編集により哺乳動物細胞ゲノムに付加された遺伝子発現単位が発現されることを立証するものである。
実施例3:Gene Writer(商標)システムを用いた哺乳動物細胞へのスプライスアクセプター単位の標的送達。
この実施例では、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、異種配列をイントロン領域に付加するためのGene Writingゲノム編集システムの作製及び使用を説明する。第1イントロンへの、5’末端にスプライスアクセプター部位を、また3’末端にポリAテイルを含む新しいエキソンのスプライシングにより、新たなエキソンにスプライシングされた天然遺伝子座の第1天然エキソンを含有する成熟mRNAが得られる。
この実施例では、リコンビナーゼタンパク質は、表3A、3B又は3Cから選択される。リコンビナーゼタンパク質は、DNA組込みのために、ゲノム、例えばHEK293ゲノム中の適合性認識部位をターゲティングする。鋳型DNAは、成熟GFP(開始コドンは除去される)の第1アミノ酸の5’側に隣接してスプライスアクセプター部位を備え、且つ停止コドンの下流に3’ポリAテイルを備えるGFPをコードする。
HEK293細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする:
1.スクランブルDNA対照
2.前述のポリペプチドをコードするDNA
3.前述の鋳型DNA
4.2と3の組合せ
トランスフェクション後、HEK293細胞を少なくとも4日間培養し、部位特異的Gene Writingゲノム編集及び適切なmRNAプロセシングについて検定する。ゲノムDNAをHEK293細胞から単離する。逆転写-PCRを実施して、標的遺伝子座の第1天然エキソンと、新しいエキソンとを含む成熟mRNAを測定する。RT-PCR反応は、標的遺伝子座(例えば、標的遺伝子座の第1天然エキソン)に結合するフォワードプライマー及びGFPに結合するリバースプライマーを用いて実施する。RT-PCR産物をアガロースゲル上に泳動させて、DNAの長さを測定する。Gene Writingゲノム編集事象の成功及びスプライス事象の成功を示す、予想長さのPCR産物は、群4の試験物質でトランスフェクトした細胞に検出される。この結果は、Gene Writingゲノム編集システムが、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、或る遺伝子をコードする異種配列を標的遺伝子座、例えば、イントロン領域に付加することができることを立証するものである。
トランスフェクトした細胞をさらに10日間培養し、複数の細胞培養継代後、GFP発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からGFP陽性の細胞のパーセントを算出する。GFP陽性細胞は、群4の試験物質でトランスフェクトしたHEK293T細胞の集団に検出され、これは、Gene Writingゲノム編集を介して哺乳動物細胞ゲノムに付加される遺伝子発現単位が発現されることを立証するものである。
実施例4:哺乳動物細胞におけるGene Writingの特異性
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性DNAの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるGene Writer(商標)ゲノムシステム及び部位特異的挿入の特異性の測定を記載する。
この実施例では、先行する実施例のいずれかに記載されるように、Gene WritingをHEK293T細胞中に構築する。トランスフェクション後、HEK293T細胞を少なくとも4日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定する。隣接ゲノムDNAを増幅する鋳型DNAに対して特異的なフォワードプライマーを用いて、Schmidt et al.Nature Methods 4,1051-1057(2007)に記載されているように、線状増幅PCRを実施する。次に、MiSeq装置での次世代シーケンシング技術を用いて、増幅PCR産物を配列決定する。MiSeqリードをHEK293Tゲノムにマッピングして、ゲノム内の組込み部位を特定する。
標的ゲノム部位にマッピングで対応するLAM-PCRシーケンシングリードのパーセントが、Gene Writingの特異性である。
LAM-PCRシーケンシングリードが対応する総ゲノム部位の数は、組換え部位の総数である。
実施例5:哺乳動物細胞におけるGene Writingの効率
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性DNAの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるGene Writer(商標)ゲノムシステム及び部位特異的挿入の特異性の測定を記載する。
この実施例では、先行する実施例のいずれかに記載されるように、Gene WritingをHEK293T細胞中に構築する。トランスフェクション後、HEK293T細胞を少なくとも4日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定する。Lin et al.,Human Gene Therapy Methods 27(5),197-208,2016に記載されているように、デジタルドロップレットPCRを実施する。フォワードプライマーは、鋳型DNAに結合し、リバースプライマーは、適切なゲノム組込み部位の片側に結合するため、PCR増幅は、標的DNAの組込み時にのみ予測される。標的部位に対するプローブは、FAM蛍光色素を含有し、ゲノム中の標的DNAのコピー数を計測するために使用される。ハウスキーピング遺伝子(例えば、RPP30)に対して特異的なプライマー及びHEX-蛍光色素プローブを用いて、1ドロップレット当たりのゲノムDNAのコピーを計測する。
1ドロップレット当たりのハウスキーピングDNAのコピー数に対して正規化された1ドロップレット当たりの標的DNAのコピー数が、Gene Writerの効率である。
実施例6:細胞中のリコンビナーゼのコピー数の決定
以下の実施例は、細胞を基準とするリコンビナーゼの絶対定量を記載する。この測定は、AQUA質量分析法に基づく方法を用いて実施され、こうした方法は、例えば、下記URL
(URL):https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202304002087?via%3Dihub
で入手可能である。
細胞にリコンビナーゼ及びDNA鋳型を送達してから、組換えを24時間進行させた後、細胞を定量し、次に、このMS方法により定量する。この方法は、2段階を含む。
第1段階で、リコンビナーゼのアミノ酸配列を検査し、分析のために代表的なトリプシンペプチドを選択する。次に、タンパク質分解の過程で生成された対応するネイティブペプチドを厳密に模倣するアミノ酸配列を用いて、AQUAペプチドを合成する。しかし、質量分析計が、被検物質と内部標準を識別することができるように、安定した同位体を1つの残基に組み込む。合成ペプチドとネイティブペプチドは、クロマトグラフィー共溶出、イオン化効率及びフラグメントイオンの相対分布を含め、同じ物理化学的特性を共有するが、それらの質量の相違により、質量分析計では差次的に検出される。次に、合成ペプチドをLC-MS/MS技術により分析して、ペプチドの保持時間を確認し、フラグメントイオン強度を決定し、SRM分析のためのイオンを選択する。このようなSRM実験では、トリプル四重極質量分析を、第1走査四極子、即ちQ1中の予測前駆体イオンを選択するように指令する。この1つの質量電荷(m/z)比を有するイオンのみが、衝突室(Q2)に向けられて、フラグメント化される。得られた生成物イオンを第3四極子(Q3)に通過させ、そこで、単一フラグメントのm/z比を、狭いm/zウィンドウを介してモニターする。
第2段階は、細胞又は組織溶解物からのリコンビナーゼの定量を含む。定量された細胞数又は組織の質量を用いて、反応を開始し、それを用いて、定量を細胞基準に対して正規化する。細胞溶解物を分離した後、SDS-PAGEによるアッセイのダイナミックレンジを増大するためのタンパク質分解に付し、続いて、リコンビナーゼが泳動するゲルの領域の切除を実施する。ゲル内消化を実施して、ネイティブトリプシンペプチドを取得する。ゲル内消化は、AQUAペプチドの存在下で実施するが、これは、消化過程中にゲル片に添加する。タンパク質分解後、重いペプチドと軽いペプチドの両方を含有する複合ペプチド混合物を、第1段階で決定したパラメータを用いて、LC-SRM試験で分析する。
質量分析に基づく定量の結果を、ロードされたタンパク質の数に変換して、1細胞当たりのリコンビナーゼの数を決定する。
実施例7:細胞内部のDNAのコピー数
Q-FISH
以下の実施例は、細胞基準での送達されたDNA鋳型の定量を記載する。この実施例において、リコンビナーゼが組み込むことになるDNAは、DNA-プローブ結合部位を含有する。リコンビナーゼ及びDNA鋳型を細胞に送達したら、組換えを24時間進行させた後、細胞を定量し、定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(Q-FISH)のために調製する。Q-FISHは、Alex Fluor 555色素(ThermoFisher カタログ番号F32948)と共に、FISH Tag DNA Orange Kitを用いて実施する。手短には、キットマニュアルに記載されるニック翻訳、色素標識及び精製の手順により、DNA鋳型上のDNA-プローブ結合部位に結合するDNAプローブを作製する。次に、キットマニュアルに記載されるように、細胞をDNAプローブで標識する。37℃及び5%CO2に維持しながら、63×油浸対物レンズを用いるZeiss LSM 710共焦点顕微鏡で細胞を撮像する。DNAプローブを555nmレーザ励起に付して、Alexa Flourを刺激する。MATLAB(登録商標)スクリプトを書き込んで、既知量のDNAを用いて作製した標準と比較して、Alexa Fluor強度を測定する。この方法を用いて、細胞に送達された鋳型DNAの量を決定する。
qPCR
以下の施例は、細胞基準での送達されたDNA鋳型の定量を記載する。この実施例において、リコンビナーゼが組み込むことになるDNAは、DNA-プローブ結合部位を含有する。リコンビナーゼ及びDNA鋳型を細胞に送達したら、組換えを24時間進行させた後、細胞を定量し、定量的PCR(qPCR)のために細胞を調製する。qPCRは、このプロトコルのための標準的キット、例えば、ThermoFisher TaqMan product(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays-search.html)を用いて実施する。手短には、送達された鋳型DNAの領域と、特定のアンプリコンに対するプローブを特異的に増幅するプライマーを設計する。定量した純粋な鋳型DNAの段階希釈を用いて、閾値Ct数をDNA鋳型の数と相関させることにより、標準曲線を作成する。次に、製造者の指示に従い、分析対象の細胞からDNAを抽出して、全ての追加成分と一緒にqPCR反応に投入する。続いて、サンプルを適切なqPCR装置で分析して、Ct数を決定し、次に、これを絶対定量のために標準曲線にマッピングする。この方法を用いて、細胞に送達された鋳型DNAの量を決定する。
実施例8:DNA:リコンビナーゼの細胞内比
以下の実施例は、標的細胞中のリコンビナーゼタンパク質と鋳型DNAの比の決定を記載する。リコンビナーゼ及びDNA鋳型を細胞に送達してから、組換えを24時間進行させた後、細胞を定量し、前述した実施例に概説したように、リコンビナーゼ及び鋳型DNAの定量のために細胞を調製する。これらの2つの値(1細胞当たりのリコンビナーゼ及び1細胞当たりの鋳型DNA)を除算(1細胞当たりのリコンビナーゼ/1細胞当たりの鋳型DNA)して、これらの量のバルク平均比を決定する。この方法を用いて、細胞に送達されたリコンビナーゼと鋳型DNAの比を決定する。
実施例9:DNA損傷応答阻害剤の存在下での活性-NHEJ阻害剤の存在下での活性
以下の実施例は、リコンビナーゼの活性についてこれらの経路に関与するタンパク質の発現に対する依存性がないことを明示するために、非相同末端結合の阻害剤の存在下での、リコンビナーゼタンパク質の活性の検定を記載する。手短には、上の実施例で概説したリコンビナーゼ活性の効率を決定するために概説されるアッセイを実施する。しかし、この場合、2つの個別の実験を実施する。
実験1では、リコンビナーゼ及び鋳型DNAの送達から24時間後、1μMのNHEJ阻害剤Scr7(https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sml1546?lang=en&region=US)を細胞増殖培地に添加して、この経路を阻害する。プロトコルの他の全ての要素は同じである。
実験2では、細胞は、実験1と同じように操作するが、培地に阻害剤を添加しない。いずれの実験も上の実施例に従って効率について分析した後、非阻害活性と比較した%阻害活性を決定する。
実施例10:DNA損傷応答阻害剤の存在下での活性-HDR阻害剤の存在下での活性
以下の実施例は、リコンビナーゼの活性についてこれらの経路に関与するタンパク質の発現に対する依存性がないことを明示するために、相同組換えの阻害剤の存在下での、リコンビナーゼタンパク質の活性の検定を記載する。手短には、上の実施例で概説したリコンビナーゼの効率を決定するために概説されるアッセイを実施する。しかし、この場合、2つの個別の実験を実施する。
実験1では、リコンビナーゼ及び鋳型DNAの送達から24時間後、1μMのHR阻害剤B02(https://www.selleckchem.com/products/b02.html)を細胞増殖培地に添加して、この経路を阻害する。プロトコルの他の全ての要素は同じである。
実験2では、細胞は、実験1と同じように操作するが、培地に阻害剤を添加しない。いずれの実験も上の実施例に従って効率について分析した後、非阻害活性と比較した%阻害活性を決定する。
実施例11:核リコンビナーゼ対細胞質リコンビナーゼのパーセンテージ
以下の実施例は、標的細胞の核対細胞質中のリコンビナーゼタンパク質の比の決定を記載する。本明細書に記載のように、リコンビナーゼ及びDNA鋳型を細胞に送達してから12時間後に細胞を定量し、分析のために調製する。下記の標準キットを用い、製造者の指示:ThermoFisherによるNE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extractionに従って、細胞を核画分及び細胞質画分に分割する。核画分及び細胞質画分の両方を維持した後、上の実施例で概説した質量分析法に基づくリコンビナーゼ定量アッセイに付す。この方法を用いて、細胞中の核リコンビナーゼと細胞質リコンビナーゼの比を決定する。
実施例12:植物細胞への送達
この実施例は、少なくとも1つのリコンビナーゼを植物細胞に送達する方法を説明し、この場合、植物細胞は、植物又は植物部分中に位置する。より具体的には、この実施例は、切除したダイズ胚の生殖系列細胞中の内在性植物遺伝子(即ちフィトエン不飽和化酵素、PDS)を編集する目的で、Gene Writingリコンビナーゼ及びその鋳型DNAの送達を記載する。この実施例は、複数の障壁(例えば、複数の細胞層、種皮、細胞壁、原形質膜)を介して送達されたトランスジーンをコードするポリヌクレオチドをダイズ生殖系列細胞に直接送達し、それにより、標的ヌクレオチド配列、PDSの遺伝的改変をもたらすことを説明する。記載される方法は、細菌により媒介される形質転換(例えば、アグロバクテリウム種(Agrobacterium sp.)による)又はバイオリステック法の一般的技術を使用しない。
ダイズ(グリシン・マックス(Glycine max))中の内在性フィトエン不飽和化酵素(PDS)をターゲティングするリコンビナーゼ及び単一鋳型DNAの送達のためにプラスミドを設計する。当業者には、他のリコンビナーゼ及び鋳型DNA配列をコードするために類似のプラスミドが容易に設計され、これは、任意選択で、異なるエレメント(例えば、異なるプロモータ、ターミネーター、選択若しくは検出可能なマーカ、細胞浸透性ペプチド、核局在化シグナル、葉緑体通過ペプチド又はミトコンドリアターゲティングペプチドなど)を含み、同様に使用されることは明らかであろう。
第1シリーズの実験では、送達剤及びエレクトロポレーションの組合せを用いて、これらのベクターをダイズ胚中の非表皮植物細胞に送達する。成熟した乾燥ダイズ種子(cv.Williams 82)を以下のように表面滅菌する。乾燥ダイズ種子を、100mlの5%塩酸ナトリウム溶液を含むビーカーを保持する密閉チャンバー内に4時間維持し、溶液には4mlの塩酸を新しく添加する。この滅菌処理後、種子は乾燥状態で維持する。カミソリの刃を手で用いて、滅菌済種子を半分に割り、子葉から胚を手で分離する。各試験又は対照の処理を20の切除した胚に対して実施する。次に、以下の一連の実験を実施する。
実験1:滅菌濾過milliQ水中0.01%CTAB(臭化セチルトリメチルアンモニウム)、第4級アンモニウム界面活性剤)中にベクター(各プラスミドの1マイクロリットル当たり100ナノグラム)を含有する送達溶液を調製する。各溶液を4℃に冷却し、500マイクロリットルを胚に直接添加した後、直ちにこれを真空チャンバー内の氷上に配置し、陰圧(2×10”3ミリバール)処理に15分付す。冷却/陰圧処理後、下記パラメータ:50V、25ミリ秒パルス長、99パルスにわたり75ミリ秒パルス間隔で設定されたBTX-Harvard ECM-830エレクトロポレーションを用いて、胚を電流で処理する。
実験2:送達溶液との初期接触及び陰圧処理を室温で実施する以外は、実験1と同じ条件。
実験3:送達溶液が、CTABなしで調製されるが、0.1%Silwet L-77(商標)(CAS番号27306-78-1、Momentive Performance Materials,Albany,N.Yから入手可能)を含む以外は、実験1と同じ条件。各処理を受けた胚の半分(20のうちの10)をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験4:いくつかの送達溶液が調製され、この場合、各々が、カタログ番号704113、750530、724777及び805033(全て、Sigma-Aldrich,St.Louis,MOから入手可能)のものから選択される単層カーボンナノチューブ調製物を20マイクログラム/mlで含む以外は、実験3と同じ条件。各処理を受けた胚の半分(20のうちの10)をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験5:送達溶液が、トリエトキシプロピルアミノシラン-官能化シリカナノ粒子(カタログ番号791334、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)を20マイクログラム/mlでさらに含む以外は、実験3と同じ条件。各処理を受けた胚の半分(20のうちの10)をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験6:送達溶液が、分岐ポリエチレンイミン、分子量-25,000(CAS番号9002-98-6、カタログ番号408727、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)を9マイクログラム/mlで又は分岐ポリエチレンイミン、分子量-800(CAS Number 25987-06-8、カタログ番号408719、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)を9マイクログラム/mlでさらに含む以外は、実験3と同じ条件。各処理を受けた胚の半分(20のうちの10)をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験7:送達溶液が、20%v/vのジメチルスルホキシド(DMSO、カタログ番号D4540、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)をさらに含む以外は、実験3と同じ条件。各処理を受けた胚の半分(20のうちの10)をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験8:送達溶液が、50マイクロモルのnono-アルギン(RRRRRRRRR、配列番号3477)をさらに含有する以外は、実験3と同じ条件。各処理を受けた胚の半分(20のうちの10)をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験9:真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、4000×gで2、5、10又は20分遠心分離する以外は、実験3と同じ条件。各処理を受けた胚の半分(20のうちの10)をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験10:真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、4000×gで2、5、10又は20分遠心分離する以外は、実験3と同じ条件。
実験11:真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、4000×gで2、5、10又は20分遠心分離する以外は、実験4と同じ条件。
実験12:真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、4000×gで2、5、10若しくは20分遠心分離する以外は、実験5と同じ条件。
送達処理後、各処理群の胚を滅菌水で5回洗浄し、1/2MS固体培地(2.165gのムラシゲ・スクーグ培地塩、カタログ番号MSP0501、Caisson Laboratories, Smithfield,UT)、10gのスクロース及び8gのBactoアガー、蒸留水中に1.00リットルまで製造)を含有するペトリ皿に移し、25℃に設定した組織培養インキュベータ内に配置する。胚が伸長し、根を発生し、真の葉が現れたら、苗を土壌に移して、成長させる。内在性PDS対立遺伝子の修飾により、クロロフィルを生成することができず、且つ明らかな漂白表現型を有する植物が得られる。全ての内在性PDS対立遺伝子の画分の修飾により、クロロフィルを依然として生成することができる植物が得られ;改変されたPDS遺伝子についてヘテロ接合型の植物を成長させて、種子を採取し、遺伝性ゲノム修飾の効率を子孫種子の分子解析により決定する。
実施例13:ヒト細胞中のリコンビナーゼ媒介プラスミド組込み
この実施例は、ヒトゲノムへの鋳型DNAの標的組込みのためのセリンリコンビナーゼベースGene Writerシステムの使用を記載する。より具体的には、この実施例は、例えば、ヒト細胞中の組込み活性について新たなGene Writingポリペプチドを評価する手段としてのインビトロGene WritingのためのHEK293T細胞への2つのプラスミドシステムのトランスフェクションを記載する。
手短には、1)哺乳動物CMVプロモータにより駆動されるインテグラーゼ発現プラスミド、例えばヒトコドン最適化セリンインテグラーゼ、例えば表3A、表3B又は表3Cからのセリンインテグラーゼをコードするプラスミドと、2)鋳型プラスミド、例えば(i)セリンインテグラーゼの認識部位を含む配列、例えばセリンインテグラーゼの内在性フランキング領域からの約500bp配列、例えば表2A、表2B又は表3Cの対応する行からの配列;(ii)哺乳動物細胞中の発現のためのプロモータ、例えばCMVプロモータ;(iii)発現が(ii)により制御されるリポータ遺伝子、例えばEGFP遺伝子;(iv)自己切断ポリペプチド、例えばT2Aペプチド;(v)哺乳動物細胞中の選択を可能にするマーカ、例えばピューロマイシン耐性遺伝子;及び(vi)終結シグナル、例えば、ポリAテイルを含むプラスミドとを含む2つのプラスミドシステムを設計した。特定の理論に束縛されることは意図しないが、鋳型プラスミドの一部の実施形態は、配向(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)で存在するエレメントを含み得る。
Gene WriterシステムをHEK293T細胞に送達するため、約120,000個の細胞を(1)50ngの鋳型プラスミド及び225ngのトランスフェクションバランスプラスミド(鋳型のみの対照);又は(2)50ngの鋳型プラスミド、25ngのインテグラーゼ発現プラスミド及び225ngのトランスフェクションバランスプラスミドのいずれかで、TransIT-293 Reagent(Mirusbio)を製造者の説明書に従って用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後、フローサイトメトリーを用いて送達の効率を測定してGFP陽性細胞のパーセンテージを決定した。細胞をタイムコース実験の3日目と13日目との間で分けた。13日目と27日目との間、分けたトランスフェクト細胞を2つの条件の一方で維持した:1)細胞のサブセットを通常細胞培養培地中で維持し、フローサイトメトリーを3~4日ごとに実施して良好に組み込まれた鋳型からのGFP発現を決定した;2)細胞のサブセットを、1μg/mLのピューロマイシンが補給された培地中で維持し、そこでピューロマイシン耐性細胞を選択の約2週間後に採取した。いくつかの事例では、ヒト細胞において活性を立証したGene Writerシステムは、21日目に細胞の少なくとも3%において検出可能なリポータ発現、例えば、フローサイトメトリーにより決定されたように、細胞の少なくとも3%においてGFPの検出可能な発現をもたらした。いくつかの事例では、ヒト細胞において活性を立証したGene Writerシステムは、鋳型のみの対照を用いて立証されたものよりも多い、例えば、トランスフェクション条件(1)と比較して高い、例えば、鋳型のみの対照と比較して少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は1000倍高いパーセンテージの細胞において検出可能なリポータ発現をもたらした。
活性Gene Writerにより使用される組込み部位を決定するため、ピューロマイシン選択下で維持される並行培養物をゲノム単離のために採取し、実施例18に本明細書に記載されるように、一方向配列決定アッセイにより分析した。
以下の表30に示されるように、Gene Writerポリペプチド、例えば表3A、表3B又は表3Cからのセリンリコンビナーゼを、ヒト細胞における、GFP発現カセット及び認識配列、例えば表2A、表2B又は表2Cの対応する行からの認識配列を含む鋳型DNAの組込みについて検定した(実施例13参照)。
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個別のポリペプチド及びコグネイト認識配列を、第1列にそれらの行番号(表1A、1B、1C、2A、2B、2C、3A、3B、3Cの行番号に対応する)を有する表30に示し、それらに第3列のインテグラーゼ識別名(「Int ID」)を割り当てた。組込み効率を第4列に、トランスフェクションから21日後に抗生物質選択の不存在下でフローサイトメトリーにより測定された、GFPを発現する細胞のパーセント(「%GFP+」)として示す。
さらなる実施例では、HEK293T細胞をインテグラーゼ発現プラスミドと、520bpのattP含有領域に続いて、CMVプロモータにより駆動されるEGFPリポータを有する鋳型プラスミドとでトランスフェクトした。トランスフェクションから21日後のEGFP陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより分析した。図1Aに示されるように、9つのインテグラーゼのうちの9つが、293T細胞において陽性対照インテグラーゼPhiC31と比較して高い組込み効率を達成した。示されるインテグラーゼについてのデータは、2つ超のレプリケートを含んだ。
実施例14:哺乳動物細胞へのセリンインテグラーゼ及び鋳型DNAの二重AAV送達
この実施例は、ヒトゲノムへの鋳型DNAの標的組込みを目的とする、セリンリコンビナーゼベースのGene Writerシステムの使用を記載する。より具体的には、リコンビナーゼ、例えば表3A、3B又は3Cからのアミノ酸配列を有するインテグラーゼ、例えばBxb1リコンビナーゼタンパク質(表3A第204行)と、関連付着部位、例えば、表2A、2B又は2Cの左側領域又は右側領域、例えば、表2A第204行からの左側領域からの配列を含む鋳型DNAを、個別のAAVウイルスベクターとして、HEK293T細胞に共送達して、対応するBxb1付着ランディングパッド部位を含む哺乳動物細胞ゲノム中に挿入DNAを正確且つ効率的に挿入する。
2つのトランスジーン配列を評価して、異なるAAVドナーフォーマット(図1B):1)細胞核へのAAV形質導入後の二本鎖環状化DNAの形成を利用する、attP又はattBを含む鋳型;又は2)細胞核へのAAV形質導入後のDNAの二本鎖環状化から独立して哺乳動物ゲノムに組み込むことができる、二重付着部位、attP-attP又はattB-attBを含む鋳型を用いた組込み、安定性及び発現を決定する。
鋳型のBxb1媒介ゲノム組込みのためのHEK293T細胞を調製するため、Bxb1 attP-attP又はBxb1 attB-attB部位を含有するHEK293Tランディングパッド細胞株を作製した。HEK293T細胞を10cmプレート(5×10個の細胞)中で接種後、レンチウイルストランスフェクションを行った。Lenti-X Packaging Single Shots(VSV-G、Takara Bio)を用いたレンチウイルス形質導入を、レンチウイルスベクタープラスミドDNA(attP-attP又はattB-attBを含有する)を用いて翌日実施した。レンチウイルス力価測定を実施し、0.22μmフィルタを用いてウイルスを濾過し、1mLのレンチウイルスアリコートを作製し、-80℃で貯蔵した。HEK293T細胞を1×10個の細胞/ウェルで4×6-ウェルプレート中で接種した。次に、HEK293T細胞をattP-attP又はattB-attBレンチウイルスで形質導入し、48時間培養してからピューロマイシン選択(1μg/mL)を開始した。細胞をピューロマイシン選択下で少なくとも7日間保持し、次に150mm培養プレートにスケールアップした。次に、細胞をゲノムDNA(gDNA)のために採取し、レンチウイルス組込みコピー数についてddPCRにより検定した。
Bxb1インテグラーゼを含有するアデノ随伴ウイルスベクター又は対応するBxb1 attP/attP-attPドナー若しくはBxb1 attB/attB-attBドナーは、pAAV-CMV-EGFP-WPRE-pAウイルスバックボーン(Sirion Biotech)に基づいて作製されたが、CMVプロモータの代わりにEF1aプロモータを用いた。pAAV-Ef1a-BXB1-WPRE-pAは、ヒトコドン最適化Bxb1(GenScript)を用いて作製した。pAAV-スタッファー-attP(Bxb1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA及びpAAV-スタッファー-attB(Bxb1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA鋳型構築物は、5’AAV2ITR配列とEf1aプロモータとの間の500bpスタッファー配列を含有した。pAAV-スタッファー-attP(Bxb1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA-attP(Bxb1)-スタッファー及びpAAV-スタッファー-attB(Bxb1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA-attB(Bxb1)-スタッファードナー構築物は、AAV2ITR配列とEf1aプロモータとの間の500bpスタッファー配列及び3’attP/attB付着部位と3’AAV2ITR配列との間の500bpスタッファー配列を含有した(図2)。上に挙げたAAVベクターは、113総vgスケールで、AAV2血清型(Sirion Biotech)にパッケージングした:AAV2-Ef1a-BXB1-WPRE-pA、AAV2-スタッファー-attP(BXB1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA、AAV2-スタッファー-attB(BXB1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA、AAV2-スタッファー-attP(BXB1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA-attP(BXB1)-スタッファー、AAV2-スタッファー-attB(BXB1)-Ef1a-EGFP-WPRE-pA-attB(BXB1)-スタッファー。
attP-attP又はattB-attBランディングパッド部位のいずれかを含有するHEK293Tランディングパッド細胞を48ウェルプレートフォーマット中に40,000細胞/ウェルで接種した。24h後、以下の条件を試験した:1)AAV2-Ef1a-BXB1インテグラーゼを含む又は含まないAAV2-attP-Ef1a-EGFP、2)AAV2-Ef1a-BXB1インテグラーゼを含む又は含まないAAV2-attP-attP-Ef1a-EGFPドナー、3)AAV2-Ef1a-BXB1インテグラーゼを含む又は含まないAAV2-attB-Ef1a-EGFP、4)AAV2-Ef1a-BXB1インテグラーゼを含む又は含まないAAV2-attB-attB-Ef1a-EGFPでの二重AAV形質導入(図3A)。インテグラーゼを含むAAVを約25,000のMOIで投与し、鋳型を含むAAVを約75,000のMOIで投与した。セリンインテグラーゼと、インテグラーゼをヒトゲノムに組み込むためのその認識部位を含む鋳型との二重AAV送達の効率を評価するため、ddPCRを実施して組込み事象(%CNV/ランディングパッド)を形質導入から3及び7日後に定量した。attP-attPランディングパッド細胞株へのattBドナーを用いて約5%の組込みが検出され、この組込みは両方の時点で安定的且つ一貫しており(図3B)、二重AAV送達システムによるDNA Gene Writingの成功を示した。
実施例15:ヒト細胞への部位特異的組込みを目的とする、Gene Writingポリペプチド及び鋳型DNAのインビトロ組合せmRNA及びAAV送達
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性DNAの部位特異的挿入のためのGene Writerシステムの使用を立証する。より具体的には、リコンビナーゼ、例えば表3A、3B又は3Cからのアミノ酸配列を有するインテグラーゼ、例えばBxb1リコンビナーゼタンパク質(表3A第204行)と、関連付着部位、例えば、表2A、2B又は2Cから左側領域又は右側領域、例えば、表2Aの第204行からの左側領域からの配列を含む鋳型DNAを、HEK293Tランディングパッド細胞株に導入する。この実施例では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼをコードするmRNAとして送達し、鋳型DNAは、AAVにより送達する。
attP-attP又はattB-attBランディングパッド部位のいずれかを含有するHEK293Tランディングパッド細胞(実施例14参照)を48ウェルプレートフォーマットに40,000細胞/ウェルで接種した。24h後、以下の条件を試験した:1)BXB1インテグラーゼをコードするmRNAを含む又は含まないAAV2-attP-Ef1a-EGFP;2)BXB1インテグラーゼをコードするmRNAを含む又は含まないAAV2-attP-attP-Ef1a-EGFPドナー;3)BXB1インテグラーゼをコードするmRNAを含む又は含まないAAV2-attB-Ef1a-EGFP;及び4)BXB1インテグラーゼをコードするmRNAを含む又は含まないAAV2-attB-attB-Ef1a-EGFP(図4A)。インテグラーゼをコードするmRNAを約1μgで投与し、鋳型を含むAAVを約75,000のMOIで投与した。以下の条件により送達のタイミングも評価した:1)同じ日にBXB1インテグラーゼのmRNA送達及び鋳型DNAのAAV送達、2)BXB1インテグラーゼのmRNA送達の24h後に鋳型DNAのAAV送達、3)鋳型DNAのAAV送達の24h後にBXB1インテグラーゼのmRNA送達。ddPCRを実施して、セリンインテグラーゼのmRNA送達及びその付着を含む鋳型のAAV送達を介して媒介された組込みを評価し、ddPCRを実施してmRNAのトランスフェクション及びAAVの形質導入から3日後に組込み(%CNV/ランディングパッド)について検定した。attB-attBランディングパッド293T細胞株へのattPドナーを用いて、約2~4%の組込みが検出された(図4B)。付着部位ドナーのAAV送達の24h後のBXB1インテグラーゼのmRNA送達は、約4%の最大%CNV/ランディングパッドを達成した(図3B)。これらの結果は、セリンインテグラーゼのmRNA送達及びそのそれぞれの部位特異的付着部位のAAV送達により媒介される、部位特異的であるAAV送達DNA断片を挿入するDNA Gene Writingゲノム編集事象の成功を示す。
実施例16:βサラセミア及び鎌状赤血球症の処置を目的とする、HSCへのGene Writingポリペプチド及び鋳型DNAのエクスビボ組合せmRNA及びAAV送達
この実施例は、βサラセミア及び鎌状赤血球症を引き起こす遺伝子突然変異を処置するために、活発に発現されるγ-グロビン遺伝子カセットを書き込むことを目的とする、C34+細胞(造血幹細胞及び子孫細胞)へのインテグラーゼをコードするmRNA及びAAV鋳型DNAの送達を記載する。
この実施例では、AAV6を用いて、鋳型DNAを送達する。より具体的には、AAV6鋳型DNAは、順に、5’ITR、インテグラーゼ付着部位、例えば、attP又はattB、例えば、表2A、2B又は2Cからの左側領域又は右側領域、polIIプロモータ、例えばヒトβ-グロビンプロモータ、ヒト胎児γ-グロビンコード配列、ポリAテイル及び3’ITRを含む。エレクトロポレーション試薬の最大量限度を考慮して、様々な条件、例えば、:1)AAV6鋳型及びインテグラーゼmRNAの同時エレクトロポレーション;2)インテグラーゼmRNAのエレクトロポレーションの15分後、AAV6ドナーの形質導入で、インテグラーゼmRNA及びAAV6鋳型をCD34細胞に共送達する。
エレクトロポレーション/形質導入後、細胞をCD34維持培地中で2日間インキュベートする。次に、処理細胞の約10%をゲノムDNA単離のために採取して、組込み効率を決定する。残りの細胞を赤血球増殖及び分化培地に移す。約20日の分化後、3つのアッセイを実施して、赤血球分化後のγ-グロビンの組込みを決定する:1)細胞のサブセットをNucRed(Thermo Fisher Scientific)で染色して、除核率を決定する;2)細胞のサブセットを蛍光イソチオシアネート(FITC)共役抗γ-グロビン抗体(Santa Cruz)で染色して、胎児ヘモグロビン陽性細胞のパーセンテージを決定する;3)細胞のサブセットをHPLCのために採取して、γ-グロビン鎖発現を決定する。
実施例17:CAR-T細胞の作製を目的とする、Gene Writerポリペプチド及び環状DNA鋳型のエクスビボ送達
この実施例では、CAR-T細胞、例えば、B細胞リンパ腫の処置のためのCAR-T細胞の作製を目的として、Gene Writingシステムをデオキシリボ核タンパク質(DNP)としてヒト初代T細胞にエクスビボで送達する。
Gene Writerポリペプチド、例えばインテグラーゼ、例えば表3A、3B又は3Cからの配列を有するインテグラーゼを、その活性タンパク質形態で直接使用するために調製し、精製する。鋳型成分については、プラスミドバックボーン及び細菌配列が欠失したミニサークルDNAプラスミドをこの実施例で使用し、例えば、Chen et al.Mol Ther 8(3):495-500(2003)の方法に従って調製し、この場合、初めに組換え事象を使用して、これらの外来プラスミド維持機能を切除することにより、プラスミドサイズ及び細胞応答を最小限にする。鋳型DNAミニサークルは、順に、インテグラーゼ付着部位、例えば(attP又はattB)、例えば表2A、2B又は2Cからの左側領域又は右側領域、polIIプロモータ、例えばEF-1、ヒトコドン最適化キメラ抗原受容体(細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む)、例えばCD19特異的Hu19-CD828Z(Genbank MN698642;Brudno et al.Nat Med 26:270-280(2020))CAR分子及びポリAテイルを含む。鋳型DNAをまず精製インテグラーゼタンパク質と混合し、室温で15~30分インキュベートして、DNP複合体を形成する。次に、DNP複合体を活性化T細胞にヌクレオフェクトする。Gene Writerシステムによる組込みは、分子定量のためのddPCRを用いて検定し、CAR発現は、フローサイトメトリーにより測定する。
実施例18:組込み部位決定のための単一方向シーケンシングアッセイ
この実施例では、ゲノムレベルでの特異性の不偏プロフィールを備える未知の組込み部位の配列を決定するための単一方向シーケンシングを実施する。
組込み実験は、インテグラーゼと挿入のための鋳型DNAとを含むGene Writingシステムを用いて、前述の実施例と同様に実施する。インテグラーゼ及びドナープラスミドを293T細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションから72時間後にゲノムDNAを抽出し、以下の方法に従って、単一方向シーケンシングに付す。最初に、ゲノムDNAのフラグメント化、エンドリペア及びアダプター連結により、次世代ライブラリーを作製する。次に、鋳型特異的配列に結合するフォワードプライマーと、シーケンシングアダプターに結合するリバースプライマーを用いる2ステップネステッドPCRにより、鋳型DNA組込み事象を有する断片化ゲノムDNAを増幅する。PCR産物をキャピラリーゲル電気泳動装置で視覚化し、精製した後、Qubit(ThermoFisher)により定量する。最終ライブラリーを、300bpペアエンドリードを用いるMiSeq(Illumina)でシーケンシングする。挿入物とフランキングするDNAを検出し、その配列をヒトゲノム配列、例えばhg38に対してマッピングすることにより、データ解析を実施する。
実施例19:Gene WriterポリペプチドをコードするmRNAの生産
この実施例では、インテグラーゼをmRNAからのインビトロ転写により発現させる。mRNA鋳型プラスミドは、T7プロモータに続いて、5’UTR、リコンビナーゼコード配列、3’UTR及び約100ヌクレオチド長のポリ(A)テイルを含んだ。プラスミドは、ポリ(A)テイルの下流に、平滑末端又は5’オーバーハングを生じる酵素制限により線状化され、T7ポリメラーゼ(NEB)を用いるインビトロ転写(IVT)のために使用される。IVT後、RNAをDNaseI(NEB)で処理する。バッファー交換後、GTP及びSAM(NEB)の存在下で、ワクシニアキャッピング酵素(NEB)及び2’-O-メチルトランスフェラーゼ(NEB)を用いて、酵素キャッピングを実施する。シリカカラム(例えば、Monarch(商標登録)RNA Cleanup kit)を用いて、キャップRNAを精製及び濃縮した後、2mMクエン酸ナトリウムpH6.5により中和する。
実施例20:CFTRマウスモデルにおける嚢胞性線維症の処置のための二重AAVベクターの使用
この実施例では、疾患のマウスモデルにおける嚢胞性線維症の処置のための二重AAVベクターとしてGene Writingシステムを送達する。嚢胞性線維症は、CTFR遺伝子中の突然変異に起因する肺疾患であり、肺細胞、例えば、呼吸細気管支に存在する細胞及び終末細気管支中の円柱上皮無線毛細胞などのゲノムに、野生型CTFR遺伝子を挿入することにより、処置することができる。
例えば、表3A、3B又3Cの配列を含むGene Writingポリペプチドと、コグネイト付着部位、例えばattB又はattP部位、例えば表2A、2B又2Cの左側領域又は右側領域配列を含む鋳型DNAとを、CAGプロモータにより駆動されるポリペプチドの発現を有するAAV6カプシド中にパッケージングするが、それらの組合せは、Halbert et al.Hum Gene Ther 18(4):344-354(2007)の教示によれば、マウス呼吸器上皮細胞における高レベルの形質導入及び発現のために有効であることが明らかにされている。
AAV調製物は、以前記載されている(Santry et al.BMC Biotechnol 17:43(2017))ように、改変された鼻内投与を用いて、CFTR遺伝子ノックアウト(Cftrtm1Unc)マウス(The Jackson Labs)に共送達する。手短には、インテグラーゼ又は鋳型DNAのいずれかを有し、pol IIプロモータ、例えばGAGプロモータの制御下のCFTR遺伝子と、コグネイト付着部位とを含むAAVをパッケージングし、精製した後、濃縮する。一部の実施形態では、CFTR発現カセットは、インテグラーゼ付着部位によりフランキングされる。CFTRノックアウトマウスに対する修飾鼻内投与を用いて、1×1010~1×1012vg/マウスの範囲の用量で調製AAVを各々送達する。1週間後、肺細胞を採取して、ゲノム抽出及び組織分析のために使用する。組込み効率を測定するために、ddPCRを用いて、CFTR遺伝子組込みを定量して、挿入物を含む又は含まない細胞及び標的部位の割合を決定する。組込みが成功したCFTRからの発現をアッセイするために、免疫組織学により組織を分析して、発現及び病状を決定する。
実施例21:一過性発現されたインテグラーゼの導入によりオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置する方法
オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症は、窒素の効率的な分解がないために、アンモニアの蓄積を引き起こす稀有な遺伝性障害である。アンモニアの蓄積は、衰弱させ、重篤な場合には致死的となり得る高アンモニア血症を引き起こす。この実施例は、組込みのための鋳型DNAを賦与するAAVの送達と一緒に、Gene Writerポリペプチド、例えば表3A、3B又は3Cからのインテグラーゼ配列をコードするmRNAの送達及び発現によるOTC欠損症の処置を記載する。AAV鋳型は、polIIプロモータ、例えばApoE.hAATの制御下のヒトOTC遺伝子の野生型コピーと、コグネイト付着部位、例えばattB又はattP部位、例えば表2A、2B又は2Cからの左側領域又は右側領域配列とを含む。例えば、一部の実施形態では、OTC発現カセットは、インテグラーゼ付着部位によりフランキングされる。
この実施例では、インテグラーゼmRNAのLNP製剤化は、LNP-INT-01の製剤化(参照により本明細書に組み込まれる、Finn et al.Cell Reports 22:2227-2235(2018)により教示される方法)に従い、鋳型DNAは、AAV2/8に製剤化される(参照により本明細書に組み込まれる、Ginn et al.JHEP Reports(2019)により教示される方法)。手短には、OTC欠損症は、インテグラーゼmRNAと、鋳型DNAを含有するAAV(1×1010~1×1012vg/マウス)とを含むLNP製剤(1~3mg/kg)を、浅側頭顔面静脈を介して注射する(Lampe et al.J Vis Exp 93:e52037(2014))ことにより、新生Spfashマウス(The Jackson Lab)を処置することによって回復する。Spfashマウスは、幾分の残留マウスOTC活性を有し、一部の実施形態では、以前記載されている(Cunningham et al.Mol Ther 19(5):854-859(2011)、その方法は、参照により本明細書に組み込まれる)ように、マウスOTCに対してshRNAを発現するAAVの投与によりサイレンシングされる。OTC酵素活性、アンモニアレベル及びオロト酸は、以前記載されている(Cunningham et al.Mol Ther 19(5):854-859 (2011))通りに測定する。1週間後、マウスの肝臓を採取して、gDNA抽出及び組織分析のために使用する。抽出したgDNAに対するddPCRにより、hOTCの組込み効率を測定する。マウス肝臓組織を免疫組織学により分析して、hOTC発現を確認する。
実施例22:大きいペイロードをヒト細胞に組み込むためのGene Writingの使用
この実施例は、インビトロでのヒト細胞への大きいペイロードのインテグラーゼ媒介性組込みについて記載する。
この実施例では、Gene Writerポリペプチド成分は、インテグラーゼ、例えば表3A、3B又は3Cのインテグラーゼ配列をコードするmRNAと、コグネイト付着部位、例えば、attB又はattP部位、例えば、表2A、2B又は2Cの左側領域又は右側領域;GFP発現カセット、例えば、EGFPに作動可能に連結したCMVプロモータ;及び総プラスミドサイズを約20kbにするスタッファー配列を含む鋳型DNAと、を含む。
手短には、インテグラーゼmRNA及び大きい鋳型DNAによるHEK293T細胞の同時エレクトロポレーションを実施する。3日後、組込み効率及び特異性を測定する。組込み効率を測定するために、組込みの接合部にわたって増幅するプライマー-プローブセット、例えば、組込み事象のみが定量されるように、一方のプライマーが鋳型DNAにアニーリングし、他方がゲノムの適切なフランキング領域にアニーリングするセットを用いて、例えばLin et al.Hum Gene Ther Methods 27(5):197-208(2016)により記載されているように、ゲノムDNAに対して、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)を実施する。データを内部標準遺伝子、例えばRPP30に対して正規化し、細胞の集団全体にわたる1ゲノム当たりの平均組込み事象として効率を表す。特異性を測定するために、単一方向シーケンシングによりゲノムDNAへの組込み事象を評価して、実施例18に記載のように、ゲノム座標を決定する。
実施例23:細菌人工染色体をヒト胚幹細胞にエクスビボで組み込むためのGene Writingの使用
この実施例は、ヒト胚幹細胞(hESC)への細菌人工染色体(BAC)のインテグラーゼ媒介性組込みについて記載する。
BACベクターは、極めて大きい(>100kb)DNAペイロードを維持することができ、従って、細胞操作において有用となり得る多くの遺伝子又は複合体を担持することができる。hESCへのそれらの組込みの実証はある(Rostovskaya et al.Nucleic Acids Res 40(19):e150(2012))が、これは、それらの組込みパターンに配列特異性を欠いたトランスポゾンを用いて達成された。この実施例は、大きい構築物の配列特異的組換えを記載する。
この実施例では、所望のペイロードを輸送するように操作されたBACは、Gene Writerポリペプチド、例えばインテグラーゼ、例えば表3A、3B又は3Cの配列を有するインテグラーゼによる認識を可能にする付着部位、例えば、attB又はattP部位、例えば、表2A、2B又は2Cからの左側領域又は右側領域をさらに含む。Rostovskaya et al.Nucleic Acids Res 40(19):e150(2012)の教示に従うエレクトロポレーション又はリポフェクションにより、約150kbのBACをhESCに導入する。3日後、組込み効率及び特異性を測定する。組込み効率を測定するために、組込みの接合部にわたって増幅するプライマー-プローブセット、例えば、組込み事象のみが定量されるように、一方のプライマーが鋳型DNAにアニーリングし、他方がゲノムの適切なフランキング領域にアニーリングするセットを用いて、例えばLin et al.Hum Gene Ther Methods 27(5):197-208(2016)により記載されているように、ゲノムDNAに対して、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)を実施する。データを内部標準遺伝子、例えばRPP30に対して正規化し、細胞の集団全体にわたる1ゲノム当たりの平均組込み事象として効率を表す。特異性を測定するために、単一方向シーケンシングによりゲノムDNAへの組込み事象を評価して、実施例18に記載のように、ゲノム座標を決定する。
実施例24:インテグラーゼランディングパッド部位を含有するマウスモデルにトランスジーンを組み込むための二重AAVベクターの使用
インテグラーゼタンパク質はバクテリオファージに天然に見出され、ファージゲノムの配列(attP)を利用してそのゲノムの一部を細菌のゲノムに特異的配列(attB)で組み込む。インテグラーゼタンパク質は、適切な認識配列(例えば、attP又はattB)を担持する挿入DNAを輸送するドナーベクターが供給され、標的又は宿主ゲノムが対応する認識配列(例えば、attB又はattP)を担持する場合、DNAをゲノムに組み込むためのドライバーとして利用することができる。効率的な組込みを有するための宿主ゲノムに見出そうとする特異的配列についてのこの要求は、トランスジーンをマウスのゲノムに挿入するためのインテグラーゼの使用及び/又は効力を限定し得、それによりマウスモデルを作製すること又はマウス遺伝性疾患モデルの背景に見出される疾患を処置することが困難になる。この実施例では、attP認識部位(例えば、Bxb1インテグラーゼについてのattP配列)をゲノム中に有するように操作されたマウスを用いて、1)目的の配列を担持し、attB認識部位(例えば、Bxb1インテグラーゼについてのattB配列)をさらに含む挿入DNA及び2)ゲノムattP部位への挿入DNAの組込みを触媒するインテグラーゼ(例えば、Bxb1インテグラーゼ)の送達による標的組込みを立証する。さらに、この実施例では、使用されるBxb1特異的attP及びattB認識配列は、GTからGAに変化した中央ジヌクレオチドを有する。いくつかの例では、目的のDNA配列は、RNAポリメラーゼIIプロモータ配列(例えば、ヒトチロキシン結合グロブリン、TBG)と、治療用タンパク質又はリポータ遺伝子(例えば、ウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼ)のDNAコード領域とを含む異種目的配列である。
手短には、インテグラーゼタンパク質(例えば、Bxb1)をコードするDNAを含むか、又は挿入DNA(例えば、TBGプロモータの制御下のウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼ及び記載されるattB配列)を含む構築物のいずれかでAAV(例えば、AAV-DJ)をパッケージングし、精製し、濃縮する。attP認識配列の安定的組込みを有するマウスに、腹腔内注射を介して2つのAAVウイルスの1つ又は両方を1マウス当たり1ウイルス当たり1×1010~1×1013vgの範囲の用量で共投与する。組込みを、以前記載されているように、いくつかの臓器の中で特に肝臓の一方向配列決定により経時的にモニタリングする。ルシフェラーゼ発現の生存イメージングを以前記載されているようにモニタリングする(Bhaumik,S.,&Gambhir,S.S.,PNAS 2002,https://doi.org/10.1073/pnas.012611099)。
実施例25:複数の遺伝子を組み込む単一組成物での複数の疾患の処置
オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症及びシトルリン血症I型は、異なる遺伝子(それぞれOTC及びASS1)中の突然変異により引き起こされる個別の疾患であり、それは両方とも尿素サイクルの破壊をもたらし、最終的に血液中の窒素(アンモニアとして)の蓄積を引き起こす。アンモニアの蓄積は高アンモニア血症を引き起こし、それは最終的に組織及び神経毒性を引き起こし、衰弱させ、潜在的に致死的な結果となり得る。
この実施例は、2つ以上の疾患の処置を提供することができる単一Gene Writingシステムの設計及び使用を記載する。より具体的には、この実施例は、Gene Writerポリペプチド、例えば表3A、表3B又は表3Cからのインテグラーゼ配列をコードするmRNAと、組込みのための鋳型DNAを含むAAVとの送達及び発現によるOTC欠損症又はシトルリン血症1型の処置を記載する。この実施例の鋳型DNAは、polIIプロモータ、例えばApoE.hAATの制御下の自己切断ペプチド(例えば、2A)により隔てられるヒトOTC及びASS1遺伝子の両方の機能性コピーと、コグネイト付着部位、例えばattB又はattP部位、例えば表2A、表2B又は表2Cの左側領域又は右側領域配列とを含む。一部の実施形態では、OTC及びASS1の両方を含む発現カセットは、インテグラーゼ付着部位によりフランキングされる。記載される組成物を用いて、OTC又はシトルリン血症1型のいずれかを処置する。
この実施例では、インテグラーゼmRNAのLNP製剤化は、LNP-INT-01の製剤化(参照により本明細書に組み込まれる、Finn et al.Cell Reports 22:2227-2235(2018)により教示される方法)に従い、鋳型DNAは、AAV2/8にパッケージングされる(参照により本明細書に組み込まれる、Ginn et al.JHEP Reports(2019)により教示される方法)。手短には、OTC欠損症は、インテグラーゼmRNAと、鋳型DNAを含有するAAV(1×1010~1×1012vg/マウス)とを含むLNP製剤(1~3mg/kg)を、浅側頭顔面静脈を介して注射する(Lampe et al.J Vis Exp 93:e52037(2014))ことにより、新生Spfashマウス(The Jackson Lab)を処置することによって回復する。Spfashマウスは、幾分の残留マウスOTC活性を有し、一部の実施形態では、以前記載されている(Cunningham et al.Mol Ther 19(5):854-859(2011)、その方法は、参照により本明細書に組み込まれる)ように、マウスOTCに対してshRNAを発現するAAVの投与によりサイレンシングされる。OTC酵素活性、アンモニアレベル及びオロト酸は、以前記載されている(Cunningham et al.Mol Ther 19(5):854-859(2011))通りに測定する。1週間後、マウスの肝臓を採取して、gDNA抽出及び組織分析のために使用する。抽出したgDNAに対するddPCRにより、hOTCの組込み効率を測定する。マウス肝臓組織を免疫組織化学により分析して、hOTC発現を確認する。
一部の実施形態では、上記OTC欠損症のモデルを処置するために記載及び使用される同じ組成物を用いて、シトルリン血症1型を処置することもできる。手短には、ASS1欠損症は、記載されるLNP及びAAVを用いて新生致死アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS)ノックアウトマウスモデル(Cindy Y Kok et al,Mol Ther.21(10):1823-1831(2013)(その方法の全体が、参照により本明細書に組み込まれる))を処置することにより回復する。具体的には、ASSノックアウトマウスに、インテグラーゼmRNAと、鋳型DNAを含有するAAV(1×1010~1×1012vg/マウス)とを含むLNP製剤(1~3mg/kg)を、浅側頭顔面静脈を介して注射する(Lampe et al.J Vis Exp 93:e52037(2014))。アンモニアレベル、オロト酸及びマウス全生存率は、以前記載されている(Cindy Y Kok et al,Mol Ther.21(10):1823-1831(2013))通りに測定する。2-4-8週間後、マウスの肝臓を採取して、gDNA抽出及び組織分析のために使用する。抽出したgDNAに対するddPCRにより、hASS1の組込み効率を測定する。マウス肝臓組織を免疫組織化学により分析して、hASS1発現を確認する。
一部の実施形態では、Gene Writingシステムは、OTC-ASS1発現カセットをOTC欠損症及びASS1ノックアウトマウスモデルに組み込む。従って、この同じシステムは、両方のモデルにおいて健康な尿素回路を回復する。一部の実施形態では、血中アンモニアレベルは高アンモニア血症レベルから正常レベルに低下し、例えば、Gene Writingシステムで処置されたOTC欠損症又はASS1ノックアウトマウスは、対照マウスに対して血中アンモニアレベルの少なくとも2、5、10、50倍又は少なくとも100倍の低下を示す。一部の実施形態では、オロト酸レベルは上昇レベルから正常レベルに低下し、例えば、Gene Writingシステムで処置されたOTC欠損症又はASS1ノックアウトマウスは、対照マウスに対してオロト酸レベルの少なくとも2、5、10、50倍又は少なくとも100倍の低下を示す。
実施例26:低下したアルデヒド含有率を有する脂質試薬の選択
この実施例では、GeneWriting成分核酸を含有する脂質ナノ粒子製剤における下流使用のために脂質を選択し、少なくとも部分的に混入アルデヒドを有さないか又は低レベルで有することに基づいて脂質を選択する。脂質試薬中の反応性アルデヒド基は、LNP製剤化中に成分核酸、例えばRNA、例えば鋳型RNAの化学修飾を引き起こし得る。従って、一部の実施形態では、脂質試薬のアルデヒド含有率を最小化する。
例えば、Zurek et al.The Analyst 124(9):1291-1295(1999)(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、タンデム質量分析(MS/MS)と連結した液体クロマトグラフィー(LC)を用いて、試薬のアルデヒド含有物を分離し、特性決定し、定量することができる。ここで、各脂質試薬をLC-MS/MS分析に付す。LC/MS-MS法は、最初に脂質及び1つ又は複数の不純物をC8HPLCカラムで分離し、続いてそれらの分子を質量分析計で検出及び構造決定する。アルデヒドが脂質試薬中に存在する場合、それは、アルデヒドと構造的に同一であるが、C13及びN15標識に起因して重い安定同位体標識(SIL)標準を用いて定量される。適切量のSIL標準を脂質試薬にスパイクする。次に、混合物をLC-MS/MS分析に付す。SIL標準の量及びピーク比(不明/SIL)を乗じることにより混入アルデヒドの量を決定する。脂質試薬中の任意の同定アルデヒドは、記載されているように定量する。一部の実施形態では、LNP製剤化のために選択される脂質原料は、選択レベルを超えるいかなる混入アルデヒド含有物も含有しないと見出される。一部の実施形態では、製剤化に使用される1つ又は複数、任意選択で全ての脂質試薬は、3%未満の総アルデヒド含有物を含む。一部の実施形態では、製剤化に使用される1つ又は複数、任意選択で全ての脂質試薬は、0.3%未満の任意の単一アルデヒド種を含む。一部の実施形態では、製剤化に使用される1つ又は複数、任意選択で全ての脂質試薬は、0.3%未満の任意の単一アルデヒド種及び3%未満の総アルデヒド含有物を含む。
実施例27:製剤化中にアルデヒドにより引き起こされるRNA修飾の定量
この実施例では、RNA分子を製剤化後に分析して製剤化プロセス中に起こり得た任意の修飾の程度を決定し、例えば、脂質試薬のアルデヒド混入により引き起こされる化学修飾を検出する(例えば、実施例26参照)。
RNA修飾は、例えば、Su et al.Nature Protocols 9:828-841(2014)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)の方法に従ってリボヌクレオシドの分析により検出することができる。このプロセスでは、RNAをヌクレオシドの混合物に消化し、次いでLC-MS/MS分析に付す。製剤化後RNAはLNP中に含有され、最初に脂質から80%イソプロパノール中のGlycoBlueとの共沈により分離しなければならない。遠心分離後、RNAを含有するペレットを新たなEppendorfチューブに慎重に移し、それに酵素のカクテル(ベンゾナーゼ、ホスホジエステラーゼ1型、ホスファターゼ)を添加してRNAをヌクレオシドに消化する。Eppendorfチューブを予熱したThermomixer上に37℃で1時間置く。最初にヌクレオシド及び修飾ヌクレオシドをC18カラムで分離し、次にそれらを質量分析で検出するLC-MS/MS法により、得られたヌクレオシド混合物を直接分析する。
脂質試薬中のアルデヒドが化学修飾を引き起こした場合、データ分析は修飾ヌクレオシドをそのアルデヒドと関連付ける。修飾ヌクレオシドは、C13及びN15標識に起因してより重いことを除きネイティブヌクレオシドと構造的に同一であるSIL標準を用いて定量することができる。適切量のSIL標準をヌクレオシド消化物にスパイクし、次にそれをLC-MS/MS分析に付す。SIL標準の量及びピーク比(不明/SIL)を乗じることにより、修飾ヌクレオシドの量を得る。LC-MS/MSは、全ての標的分子を同時に定量することができる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤化プロセス間の材料としての、より高い混入アルデヒド含有率を有する脂質試薬の使用は、より高純度の脂質試薬の使用と比較して高レベルのRNA修飾をもたらす。従って、好ましい実施形態では、許容可能レベル未満のRNA修飾をもたらすより高純度の脂質試薬を用いる。
実施例28:インビボでのT細胞中のCARの組込みを目的とする、Gene Writer
この実施例は、インビボでT細胞に遺伝子ペイロードの組込み及び安定的発現のために送達されるGene Writer(商標)ゲノム編集システムを記載する。具体的には、標的ナノ粒子を用いて、キメラ抗原受容体(CAR)発現カセットをT細胞のゲノムに組み込むことができるGene Writingシステムを送達して、マウスモデルにおいてCAR-T細胞を作製する。
この実施例では、Gene Writingシステムは、Gene Writingポリペプチド、例えば本明細書に記載されるリコンビナーゼ酵素をコードするmRNAと、リコンビナーゼ認識部位及びトランスジーンカセットを含む挿入DNAとを含み、トランスジーンカセットは、EF1aプロモータにより駆動されるCD19特異的m194-1BBz CARについてのコード配列を含む(Smith et al.Nat Nanotechnol 12(8):813-820(2017))。T細胞への特異的送達を達成するため、CD4に対する共役mAbを輸送する標的LNP(tLNP)を作製する。例えば、Ramishetti et al.ACS Nano 9(7):6706-6716(2015)参照。代わりに、CD3に対するmAbの共役を用いて、CD4及びCD8T細胞の両方をターゲティングすることができる(Smith et al.Nat Nanotechnol 12(8):813-820(2017))。他の実施形態では、インビボでT細胞に送達するために用いられるナノ粒子は、Lokugamage et al.Adv Mater 31(41):e1902251(2019)により教示されるターゲティングリガンドを欠く拘束ナノ粒子である。
tLNPは、最初に、脂質の混合物(コレステロール、DSPC、PEG-DMG、Dlin-MC3-DMA及びDSPE-PEG-マレイミド)と共に核酸混合物(例えば、ポリペプチドmRNA:鋳型DNAモル比1:40)を調製し、次に所望のDTT還元mAb(例えば、抗CD4、例えば、クローンYTS.177)をLNP上のマレイミド官能基に化学的に共役させることにより作製することができる。Ramishetti et al.ACS Nano 9(7):6706-6716(2015)参照。
6~8週齢C57BL6/Jマウスに、製剤化LNPを1mgのRNA/kg体重の用量で静脈内注射する。血液を投与から1日及び3日後にヘパリンコート回収チューブに回収し、Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)を用いる密度遠心分離により白血球を単離する。投与から5日後、動物を安楽死させ、血液及び臓器(脾臓、リンパ節、骨髄細胞)をT細胞分析のために採取する。特異的免疫学的ソーティングを用いるFACSにより、抗CD19 CARの発現を検出する。本明細書に記載される方法、例えば、分子コーミング又はQ-FISHにより、組込みについて陽性細胞を確認する。
実施例29:分子コーミングによる組込み部位の特性決定
AAVゲノムは、細胞への送達後に分子内及び分子間組換えの複数の機序を受けることが公知である(McCarty et al Annu Rev Genet 38:819-45(2004))。挿入DNAはAAVベクターを介して送達することができるため、この状況では、分子の一部がコンカテマーとして存在し得、Gene Writingのための基質として用いる場合、それらのコンカテマー挿入DNA分子は元の挿入DNAの2コピー以上の組込みをもたらし得ることが考えられる。従って、鋳型DNAの単一挿入とコンカテマー挿入をもたらす組込み事象の割合、1組込み部位当たりの平均コピー数及びコンカテマー分子の配向、例えば、頭-頭又は頭-尾立体構造の頻度を分析することが有用であり得る。この実施例は、ヒト細胞におけるGene WritingシステムのAAV媒介送達後の組込み部位の構成を決定するための分子コーミング技術の使用を記載する。
Bxb1リコンビナーゼ(表3A第204行)は、適切な認識部位をゲノム中に含有するように修飾されたヒト細胞にDNAを組み込むために用いられている酵素であり、ここで本明細書に開示されるリコンビナーゼシステムの代表例として用いる。この実施例では、BXB1 attP-attP部位を含有するレンチウイルスベクターでの単一コピー感染によりHEK293Tランディングパッド細胞株を作製する。リコンビナーゼ媒介組込みを実施するため、単一コピーランディングパッド細胞を最初に48ウェルプレートに約40,000個の細胞/ウェルで接種する。接種から約24時間後、BXB1 attBドナー(ランディングパッド中のattP部位に対するコグネイト認識部位)を含有するアデノ随伴ウイルスベクターを、挿入DNAを含有するAAVで、Bxb1インテグラーゼのコード配列を含む第2AAVの存在又は不存在下で形質導入する。形質導入から2週間後、AAV形質導入細胞の約10%を採取し、ランディングパッド部位に特異的なddPCRアッセイを用いてgDNAを分析して、組込み(%CNV/ランディングパッド)を確認する。分子コーミングの方法は、Kaykov et al Sci Rep 6:19636(2016)(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)のアプローチに従う。手短には、各形質導入サンプルからの約300,000個の形質導入細胞を高分子量ゲノムDNAについてアガロースプラグに抽出する。次に、ゲノムDNA分子を機械的に引っ張り、ガラス表面上で制御及び一定の様式でアラインし、DNA繊維の長さに沿う正確且つ直接的な測定を可能にする。組込み部位構成分析のための可視化を可能にする予備標識DNAプローブを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを実施する。Bxb1 attP-attPランディングパッド(標的部位)、AAV Bxb1 attBドナー配列(挿入DNA)及び基準遺伝子RPP30のプローブを、各プローブからのシグナルを区別するために3つの個別の色を用いて標識する。ハイブリダイゼーション後、蛍光シグナルを取得し、定量する。この方法により、互いに対する個別の蛍光シグナルの数及び位置は、挿入コピー数及び組込みDNA内の配向の見解を提供する。
実施例30:インバースPCRによる組込み部位の決定
この実施例は、Gene Writingシステムについての組込み部位の特性決定を記載する。一部の実施形態では、Gene Writerシステムは、単一標的部位又は標的配列についての優秀な特異性を示し得る。他の実施形態では、Gene Writerシステムは、より緩和した特異性を有し、ゲノム中の様々な位置で挿入DNAの組込みを触媒し得る。従って、任意の所与のGene Writerについて、その組込みプロファイルの幅を決定することが有用である。
この実施例では、Gene Writingシステムを用いて、上記実施例のいずれかに記載されているよう、HEK293T細胞のゲノムを修飾する。トランスフェクション後、HEK293T細胞を少なくとも4日間培養し、次に部位特異的ゲノム編集について検定する。不適合粘着末端を作製し、挿入DNA中で少なくとも1回切断する制限酵素のペアでゲノムDNAを最初に消化し、次に自己ライゲートして理想的には挿入DNA及びフランキングゲノムDNAの両方を含む環状DNAを作製する。隣接ゲノムDNAの増幅をもたらす挿入DNAに対して特異的なフォワード及びリバースプライマーを用いて、Olivares et al Nat Biotechnol 20:1124-1128(2002)(その方法の全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、インバーテッドPCR増幅を実施する。次に、MiSeq装置での次世代シーケンシング技術を用いて、増幅PCR産物を配列決定する。配列分析のため、MiSeqリードをHEK293Tゲノムに対してマッピングして、組込みの位置を特定する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writerシステムは、単一部位での検出可能な組込みをもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writerシステムは、限定数の部位、例えば、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3つ未満又は2つ未満の部位での検出可能な組込みをもたらす。他の実施形態では、本明細書に記載されるGene Writerシステムは、100超の部位での検出可能な組込みをもたらす。

Claims (10)

  1. DNAを修飾するためのシステムであって、
    a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸;及び
    b)二本鎖挿入DNAであって、
    (i)(a)の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ前記第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
    前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
    (ii)異種目的配列と
    を含む二本鎖挿入DNA
    を含むシステム。
  2. 表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)。
  3. 真核生物細胞(例えば、哺乳細胞動物、例えばヒト細胞)であって、
    (i)DNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を含み、
    各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ前記第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
    (ii)異種目的配列と
    を含む真核生物細胞(例えば、哺乳細胞動物、例えばヒト細胞)。
  4. 真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)のゲノムを修飾する方法であって、前記細胞を、
    a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸;及び
    b)挿入DNAであって、
    (i)(a)の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ前記第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
    (ii)異種目的配列と
    を含む挿入DNA
    と接触させるステップを含み、それにより前記真核生物細胞の前記ゲノムを修飾する、方法。
  5. 真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、前記細胞を、
    a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記ポリペプチドをコードする核酸;及び
    b)挿入DNAであって、
    (i)(a)の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ前記第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
    (ii)異種目的配列と
    を含む挿入DNA
    と接触させるステップを含み、それにより、例えば実施例5のアッセイで測定されて、例えば前記真核生物細胞の集団の少なくとも約0.1%(例えば、少なくとも約0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)の頻度で前記真核生物細胞の前記ゲノムに前記異種目的配列を挿入する、方法。
  6. 表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含む、単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
  7. 表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  8. 単離された核酸(例えば、DNA)であって、
    (i)DNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ前記第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
    前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
    (ii)異種目的配列と
    を含む、単離された核酸(例えば、DNA)。
  9. リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、
    a)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、及び
    b)前記リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下において、真核生物細胞に前記核酸を導入するステップ
    を含み、それにより前記リコンビナーゼポリペプチドを作製する、方法。
  10. DNA認識配列と異種配列とを含む挿入DNAを作製する方法であって、
    a)核酸であって、
    (i)表3A、3B若しくは3Cのアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドに結合するDNA認識配列であって、第1パラパリンドローム配列及び第2パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約15~35又は20~30ヌクレオチドであり、且つ前記第1及び第2パラパリンドローム配列は、一緒に、表2A、2B若しくは2Cの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するか、又はそれに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20以下の配列改変(例えば、置換、挿入若しくは欠失)を有するヌクレオチド配列を含み、及び
    前記DNA認識配列は、約2~20ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第1及び第2パラパリンドローム配列間に位置する、DNA認識配列と、
    (ii)異種目的配列と
    を含む核酸を提供するステップ、及び
    b)前記核酸の複製を可能にする条件下において、細胞(例えば、本明細書に記載されるように、例えば真核生物細胞又は原核生物細胞)に前記核酸を導入するステップ
    を含み、それにより前記挿入DNAを作製する、方法。
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FR2850668B1 (fr) * 2003-01-31 2005-04-08 Centre Nat Rech Scient Elements genetiques mobiles appartenant a la famille mariner chez les eucaryotes hydrothermaux
WO2008100424A2 (en) * 2007-02-09 2008-08-21 University Of Hawaii Animals and cells with genomic target sites for transposase-mediated transgenesis
EP2527448A1 (en) * 2011-05-23 2012-11-28 Novozymes A/S Simultaneous site-specific integrations of multiple gene-copies in filamentous fungi
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