JP2023502473A - リコンビナーゼ組成物及び使用方法 - Google Patents

リコンビナーゼ組成物及び使用方法 Download PDF

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Abstract

標的ゲノムを調節するための方法及び組成物が開示される。本開示は、例えば、インビボ又はインビトロで、細胞、組織若しくは対象におけるＤＮＡ配列内の１つ若しくは複数の位置で、ＤＮＡ配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する（例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的ＤＮＡ配列を挿入する）ための組成物、システム及び方法に関する。目的ＤＮＡ配列は、例えば、コード配列、調節配列、遺伝子発現単位を含み得る。

Description

本開示は、宿主細胞、組織又は対象における１つ又は複数の位置のゲノムをインビボ又はインビトロで改変するための新規の組成物、システム及び方法に関する。特に、本発明は、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、例えばセリンリコンビナーゼ）を用いて、宿主ゲノムに外性遺伝因子を導入するための組成物、システム及び方法を特徴とする。
１．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）二本鎖挿入ＤＮＡであって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む二本鎖挿入ＤＮＡ
を含むシステム。
２．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）挿入ＤＮＡであって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するヒト第１パラパリンドローム配列及びヒト第２パラパリンドローム配列であって、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ヒト第１パラパリンドローム配列及びヒト第２パラパリンドローム配列と、
（ｉｉ）任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
を含むシステム。
２ａ．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）二本鎖挿入ＤＮＡであって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、任意選択で、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約３０～７０若しくは４０～６０ヌクレオチド或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む二本鎖挿入ＤＮＡ
を含むシステム。
３．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
４．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
５．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
６．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
７．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
８．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
９．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１０．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１１．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１２．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１３．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のシステム。
１４．（ａ）及び（ｂ）は、個別の容器内にある、実施形態１～１３のいずれかに記載のシステム。
１５．（ａ）及び（ｂ）は、混合される、実施形態１～１３のいずれかに記載のシステム。
１５ａ．（ｂ）は、線状二本鎖ＤＮＡを含む、実施形態１～１５のいずれかに記載のシステム。
１５ｂ．（ｂ）は、環状二本鎖ＤＮＡを含む、実施形態１～１５のいずれかに記載のシステム。
１５ｃ．（ｂ）は、
（ｉｉｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合する第２ＤＮＡ認識配列であって、第３パラパリンドローム配列及び第４パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第３及び第４パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第２ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第３及び第４パラパリンドローム配列間に位置する、第２ＤＮＡ認識配列
を含む、実施形態１５ａに記載のシステム。
１５ｄ－ａ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有する、実施形態１５ｃに記載のシステム。
１５ｄ－ｂ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有さない（例えば、第２ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列に対して少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含む）、実施形態１５ｃに記載のシステム。
１５ｄ１．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態１５ｄ～ｂに記載のシステム。
１５ｅ．異種目的配列は、第１ＤＮＡ認識配列及び第２ＤＮＡ認識配列間に位置する、実施形態１５ｃ～１５ｄ１のいずれかに記載のシステム。
１５ｆ．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムのポリペプチドをコードする第１環状ＲＮＡと、
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの鋳型核酸を含む第２環状ＲＮＡと
を含むシステム。
１５ｇ．ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素ドメイン、及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸；及び
（ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列、（ｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｉｉ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）又はそれらの組合せと異種であるリボザイムを含む鋳型核酸
を含むシステム。
１５ｈ．リボザイムは、（ｂ）（ｉ）と異種である、実施形態１５ｇに記載のシステム。
１５ｉ．鋳型核酸は、（ｉｖ）例えば、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）又はそれらの組合せに内在する第２リボザイムを含み、例えば、第２リボザイムは、（ｂ）（ｉ）に内在する、実施形態１５ｇ又は１５ｈに記載のシステム。
１５ｊ．異種リボザイムは、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、（ｂ）（ｉ）又はそれらの組合せに内在するリボザイムを置き換え、例えば、第２リボザイムは、（ｂ）（ｉ）に内在する、実施形態１５ｇ又は１５ｈに記載のシステム。
１５ｋ．Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのポリペプチドをコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１５ｆ～１５ｊのいずれかに記載のシステム。
１５ｌ．Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、実施形態１５ｆ～１５ｋのいずれかに記載のシステム。
１５ｍ．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの挿入ＤＮＡを含むＤＮＡをさらに含む、実施形態１５ｆ～１５ｌのいずれかに記載のシステム。
１５ｎ．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの挿入ＤＮＡ及びポリペプチドを含むＤＮＡをさらに含む、実施形態１５ｆ～１５ｍのいずれかに記載のシステム。
１６．表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む細胞（例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞；又は原核生物細胞）。
１６ａ．実施形態１～１５ｅのいずれかに記載のシステムを含む細胞。
１７．（ｉ）リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡをさらに含む、実施形態１６の細胞。
１７ａ．（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、任意選択で、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約３０～７０若しくは４０～６０ヌクレオチド或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）任意選択で、異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡをさらに含む、実施形態１６に記載の細胞。
１８．細胞（例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞；又は原核生物細胞）であって、
（ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む細胞（例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞；又は原核生物細胞）。
１８ａ．染色体上において、
（ｉ）約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドの第１パラパリンドローム配列であって、第１パラパリンドローム配列は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列或いは前記パラパリンドローム配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列内に存在する、第１パラパリンドローム配列と、
（ｉｉ）約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドの第２パラパリンドローム配列であって、第２パラパリンドローム配列は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列或いは前記パラパリンドローム配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列内に存在する、第２パラパリンドローム配列と、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）間に位置する異種目的配列と
を含む細胞（例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞；又は原核生物細胞）。
１９ａ．ＤＮＡ認識配列及び異種目的配列の両方は、染色体外核酸上に位置する、実施形態１８に記載の細胞。
１９．ＤＮＡ認識配列は、異種目的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド以内にある、実施形態１８又は１９ａのいずれかに記載の細胞。
１９ｃ．染色体外核酸は、
（ｉｉｉ）第２ＤＮＡ認識配列であって、第３パラパリンドローム配列及び第４パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第３及び第４パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第２ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第３及び第４パラパリンドローム配列間に位置する、第２ＤＮＡ認識配列
を含む、実施形態１９ａ又は１９のいずれかに記載の細胞。
１９ｃ１．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有する、実施形態１９ｃに記載の細胞。
１９ｃ２．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有さない（例えば、第２ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列に対して少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含む）、実施形態１９ｃに記載の細胞。
１９ｃ３．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態１９ｃ２に記載の細胞。
１９ｃ４．染色体外核酸は、線状である、実施形態１９ｃ～１９ｃ３のいずれかに記載の細胞。
１９ｃ５．（ｉｖ）第３ＤＮＡ認識配列であって、第５パラパリンドローム配列及び第６パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第５及び第６パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第３ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第５及び第６パラパリンドローム配列間に位置し、
第３ＤＮＡ認識配列は、染色体上にある、第３ＤＮＡ認識配列
を含む、実施形態１９ｃ～１９ｃ４のいずれかに記載の細胞。
１９ｃ６．第３ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列、第２ＤＮＡ認識配列又は第１及び第２ＤＮＡ認識配列の両方と同じ配列を有さない（例えば、第３ＤＮＡ認識配列は、第１及び／又は第２ＤＮＡ認識配列に対して少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含む）、実施形態１９ｃ５に記載の細胞。
１９ｃ７．第３ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態１９ｃ６に記載の細胞。
１９ｃ８．第３ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態１９ｃ６又は１９ｃ７のいずれかに記載の細胞。
１９ｃ９．（ｖ）第４ＤＮＡ認識配列であって、第７パラパリンドローム配列及び第８パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第７及び第８パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又は前記パラパリンドローム領域に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第４ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第７及び第８パラパリンドローム配列間に位置し、
第４ＤＮＡ認識配列は、第３ＤＮＡ認識配列と同じ染色体上にある、第４ＤＮＡ認識配列
を含む、実施形態１９ｃ５～１９ｃ８のいずれかに記載の細胞。
１９ｃ１０．第４ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列、第２ＤＮＡ認識配列又は第１及び第２ＤＮＡ認識配列の両方と同じ配列を有さない（例えば、第４ＤＮＡ認識配列は、第１及び／又は第２ＤＮＡ認識配列に対して少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含む）、実施形態１９ｃ９に記載の細胞。
１９ｃ１１．第４ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態１９ｃ１０に記載の細胞。
１９ｃ１２．第４ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態１９ｃ１０又は１９ｃ１１のいずれかに記載の細胞。
１９ｃ１３．第４ＤＮＡ認識配列は、第３ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有する、実施形態１９ｃ９～１９ｃ１２のいずれかに記載の細胞。
１９ｃ１４．第４ＤＮＡ認識配列は、第４ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有さない（例えば、第４ＤＮＡ認識配列は、第３ＤＮＡ認識配列に対して少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含む）、実施形態１９ｃ１３に記載の細胞。
１９ｃ１５．第４ＤＮＡ認識配列は、第３ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態１９ｃ１４に記載の細胞。
１９ｃ１６．第３ＤＮＡ認識配列及び第４ＤＮＡ認識配列は、互いの５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００若しくは９００塩基以内にあるか、又は染色体上の互いの１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０キロベース以内にある、実施形態１９ｃ１０～１９ｃ１５のいずれかに記載の細胞。
２０．ＤＮＡ認識配列は、染色体内にあり、異種目的配列は、染色体外核酸上にある、実施形態１６ａ～１８のいずれかに記載の細胞。
２１．真核生物細胞である、実施形態１６～２０のいずれかに記載の細胞。
２２．哺乳動物細胞である、実施形態２１に記載の細胞。
２３．ヒト細胞である、実施形態２２に記載の細胞。
２４．原核生物細胞（例えば、細菌細胞）である、実施形態１６～２０のいずれかに記載の細胞。
２６．動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）又は植物細胞である、実施形態２５に記載の単離された真核生物細胞。
２７．哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、実施形態２６に記載の単離された真核生物細胞。
２８．動物細胞は、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞又はシチメンチョウ細胞である、実施形態２６に記載の単離された真核生物細胞。
２９．植物細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞又はコメ細胞である、実施形態２６に記載の単離された真核生物細胞。
３０．真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）のゲノムを修飾する方法であって、細胞を、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）挿入ＤＮＡであって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
と接触させるステップを含み、それにより真核生物細胞のゲノムを修飾する、方法。
３０ａ．真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）のゲノムを修飾する方法であって、細胞を、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）挿入ＤＮＡであって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、任意選択で、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約３０～７０若しくは４０～６０ヌクレオチド或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
と接触させるステップを含み、それにより真核生物細胞のゲノムを修飾する、方法。
３１．真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、細胞を、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）挿入ＤＮＡであって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
と接触させるステップを含み、それにより、例えば実施例５のアッセイで測定されて、例えば真核生物細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の頻度で真核生物細胞のゲノムに異種目的配列を挿入する、方法。
３１ａ．真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、細胞を、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いはポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ）挿入ＤＮＡであって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、任意選択で、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約３０～７０若しくは４０～６０ヌクレオチド或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む挿入ＤＮＡ
と接触させるステップを含み、それにより、例えば実施例５のアッセイで測定されて、例えば真核生物細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の頻度で真核生物細胞のゲノムに異種目的配列を挿入する、方法。
３２．（ａ）及び（ｂ）は、個別又は一緒に投与される、実施形態３０～３１ａのいずれかに記載の方法。
３３．（ａ）は、（ｂ）の投与前、それと同時又はその後に投与される、実施形態３０～３１ａのいずれか１に記載の方法。
３４．（ａ）は、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む、実施形態３０～３３のいずれかに記載の方法。
３５．（ａ）の核酸と（ｂ）の挿入ＤＮＡとは、同じ核酸分子上に位置する、例えば同じベクター上に位置する、実施形態３４に記載の方法。
３６．（ａ）の核酸と（ｂ）の挿入ＤＮＡとは、別の核酸分子上に位置する、実施形態３４に記載の方法。
３７．細胞は、挿入ＤＮＡのＤＮＡ認識配列と適合性である唯一の内在性ＤＮＡ認識配列を有する、実施形態３０～３６のいずれかに記載の方法。
３８．細胞は、挿入ＤＮＡのＤＮＡ認識配列と適合性である２つ以上の内在性ＤＮＡ認識配列を有する、実施形態３０～３６のいずれかに記載の方法。
３８ａ．（ｂ）の挿入ＤＮＡは、（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合する第２ＤＮＡ認識配列を含み、
前記第２ＤＮＡ認識配列は、第３パラパリンドローム配列及び第４パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第３及び第４パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第２ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第３及び第４パラパリンドローム配列間に位置する、実施形態３０～３８のいずれかに記載の方法。
３８ｂ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有する、実施形態３８ａに記載の方法。
３８ｃ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有さない（例えば、第２ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列に対して少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含む）、実施形態３８ａに記載の方法。
３８ｄ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態３８ｃに記載の方法。
３８ｅ．異種目的配列は、第１ＤＮＡ認識配列及び第２ＤＮＡ認識配列間に位置する、実施形態３８ａ～３８ｄのいずれかに記載の方法。
３８ｆ．リコンビナーゼポリペプチドは、例えば、表３０又は図１Ａに列挙されるインテグラーゼを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３８ｇ．リコンビナーゼポリペプチドは、表３０に列挙されるインテグラーゼを含み、且つＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列を含む、実施形態３８ｆに記載の方法。
３８ｈ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ１０１のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第４７５行又はアクセッションＡＳＮ７１８０５．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第４７５行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｉ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ７８のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第３７１行又はアクセッションＡＲＷ５８５１８．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第３７１行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｊ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ７９のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第３６０行又はアクセッションＡＲＷ５８４６１．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第３６０行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｋ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ３０のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第４３６行又はアクセッションＹＰ＿００９１０３０９５．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第４３６行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｌ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ３のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第１２００行又はアクセッションＹＰ＿４５９９９１．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第１２００行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｍ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ３８のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第４０８行又はアクセッションＹＰ＿００９２２３１８１．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第４０８行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｎ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ９５のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第４６０行又はアクセッションＡＦＶ１５３９８．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第４６０行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｏ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ５１のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第１５９行又はアクセッションＡＯＴ２４６９０．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第１５９行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３８ｐ．リコンビナーゼポリペプチドは、Ｉｎｔ１８のアミノ酸配列（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される対応するアミノ酸配列の配列、例えば第１０３行又はアクセッションＡＧＲ４７２３９．１に対応する）を含み、任意選択で、ＤＮＡ認識配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行番号からの認識配列（例えば、第１０３行に列挙される）を含む、実施形態３８ｆ又は３８ｇに記載の方法。
３９．表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４０．表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのリコンビナーゼ配列に対して少なくとも１つの挿入、欠失又は置換を含む、実施形態３９に記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４１．真核生物（例えば、哺乳動物、例えばヒト）ゲノム遺伝子座（例えば、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列に結合する、実施形態４０に記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４１ａ．表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列に結合する、実施形態３９又は４０のいずれかに記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４２．表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃの対応する非修飾アミノ酸配列と比較して、ゲノム遺伝子座に対する親和性の少なくとも２、３、４又は５倍の増加を有する、実施形態４０～４１ａのいずれかに記載の単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
４３．表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸。
４４．表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのリコンビナーゼポリペプチドと比較して、少なくとも１つの挿入、欠失又は置換を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、実施形態４３に記載の単離された核酸。
４５．アミノ酸配列のコドンは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞中の発現に関して改変されている（例えば、最適化されている）、実施形態４３又は４４に記載の単離された核酸配列。
４６．異種プロモータ（例えば、哺乳動物プロモータ、例えば組織特異的プロモータ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（例えば、組織特異的制限ｍｉＲＮＡ）、ポリアデニル化シグナル又は異種ペイロードをさらに含む、実施形態４３～４５のいずれかに記載の単離された核酸。
４７．単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）であって、
（ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む、単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）。
４７ａ．単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）であって、
（ｉ）（ａ）のリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、任意選択で、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列の約３０～７０若しくは４０～６０ヌクレオチド或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又は前記パラパリンドローム領域に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）任意選択で、異種目的配列と
を含む単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）。
４８．表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのリコンビナーゼポリペプチドに結合する、実施形態４７又は４７ａのいずれかに記載の単離された核酸。
４８ａ．ＤＮＡ認識配列（例えば、１つ又は複数のパラパリンドローム配列）は、表２Ａ、２Ｂ又は左側領域又は右側領域列の配列に存在する認識配列（又はその一部）に対して少なくとも１つの挿入、欠失又は置換を含む、実施形態４７～４８のいずれかに記載の単離された核酸。
４８ｂ．ＤＮＡ認識配列（例えば、パラパリンドローム領域）は、対応する非修飾ＤＮＡ認識配列（例えば、パラパリンドローム領域）と比較して、リコンビナーゼポリペプチドに対する親和性の少なくとも２、３、４又は５倍の増加を有する、実施形態４８ａに記載の単離された核酸。
４８ｃ．リコンビナーゼポリペプチドは、対応する非修飾ＤＮＡ認識配列（例えば、パラパリンドローム領域）と比較して、ＤＮＡ認識配列（例えば、パラパリンドローム領域）でのリコンビナーゼ活性の少なくとも２、３、４又は５倍の増加を有する、実施形態４８ａ又は４８ｂのいずれかに記載の単離された核酸。
４９．リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、及び
ｂ）リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下において、細胞（例えば、本明細書に記載されるように、例えば真核生物細胞又は原核生物細胞）に核酸を導入するステップ
を含み、それによりリコンビナーゼポリペプチドを作製する、方法。
５０．リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む細胞（例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞）を提供するステップ、及び
ｂ）リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下において、細胞をインキュベートするステップ
を含み、それによりリコンビナーゼポリペプチドを作製する、方法。
５１．ＤＮＡ認識配列と異種配列とを含む挿入ＤＮＡを作製する方法であって、
ａ）核酸であって、
（ｉ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
（ｉｉ）異種目的配列と
を含む核酸を提供するステップ、及び
ｂ）核酸の複製を可能にする条件下において、細胞（例えば、本明細書に記載されるように、例えば真核生物細胞又は原核生物細胞）に核酸を導入するステップ
を含み、それにより挿入ＤＮＡを作製する、方法。
５１ａ．核酸は、
（ｉｉｉ）リコンビナーゼポリペプチドに結合する第２ＤＮＡ認識配列であって、第３パラパリンドローム配列及び第４パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ第３及び第４パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
前記第２ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、コア配列は、第３及び第４パラパリンドローム配列間に位置する、第２ＤＮＡ認識配列
を含む、実施形態５１に記載の方法。
５１ｂ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有する、実施形態５１ａに記載の方法。
５１ｃ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と同じ配列を有さない（例えば、第２ＤＮＡ認識配列は、第１ＤＮＡ認識配列に対して少なくとも１つの置換、欠失又は挿入を含む）、実施形態５１ａに記載の方法。
５１ｄ．第１ＤＮＡ認識配列は、第２ＤＮＡ認識配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、実施形態５１ｃに記載の方法。
５１ｅ．異種目的配列は、第１ＤＮＡ認識配列及び第２ＤＮＡ認識配列間に位置する、実施形態５１ａ～５１ｄのいずれかに記載の方法。
５１ｆ．提供するステップは、クローニング技術（例えば、制限消化及び／又はライゲーション）を用いること、組換え技術を用いること又は核酸を取得すること（例えば、第三者提供者から）を含む、実施形態５１～５１ｅのいずれかに記載の方法。
５２．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つの挿入、欠失又は置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
５３．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端、Ｃ末端又はＮ及びＣ末端の両方に、切断を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
５４．リコンビナーゼポリペプチドは、核局在化配列、例えば内在性核局在化配列又は異種核局在化配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
５５．異種目的配列は、例えば、実施例５のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の効率で細胞のゲノムに挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
５６．異種目的配列は、例えば、実施例４のアッセイにより測定されて、挿入事象の少なくとも約１％（例えば、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％若しくは１００％）における細胞のゲノム内の部位（例えば、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む部位；及び／又は表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃに列挙されるリコンビナーゼの行番号に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
５７．細胞の集団（例えば、システムと接触させた）において、異種目的配列は、例えば、実施例５のアッセイにより測定されて、集団中の細胞の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％若しくは１００％）における細胞のゲノム内の１～１０、例えば１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２～１０、２～５、２～４、３～１０、３～５若しくは５～１０の部位（例えば、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む部位；及び／又は表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃに列挙されるリコンビナーゼの行番号に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
５８．システムと接触させた細胞の集団において、異種目的配列は、例えば、実施例４のアッセイにより測定されて、集団中の細胞の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％若しくは１００％）における細胞のゲノム内の厳密に１つの部位（例えば、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む部位；及び／又は表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃに列挙されるリコンビナーゼの行番号に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
５９．異種目的配列は、例えば、実施例４のアッセイにより測定されて、細胞のゲノム内の１～１０、例えば１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２～１０、２～５、２～４、３～１０、３～５若しくは５～１０の部位（例えば、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する配列或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含む部位；及び／又は表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃに列挙されるリコンビナーゼの行に対応するもの）に挿入される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６０．リコンビナーゼポリペプチドは、挿入ＤＮＡに結合される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６１．リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を提供することにより提供される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６２．例えば、実施例５のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）のゲノム中への異種目的配列の挿入頻度をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６２ａ．例えば、実施例１３のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）のゲノム中への異種目的配列の挿入頻度をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６２ｂ．例えば、実施例７のアッセイで測定されて、細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）のゲノム中への異種目的配列の挿入頻度をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６３．第１パラパリンドローム配列は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列に見出される配列に存在する１５～３５若しくは２０～３０ヌクレオチド、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４若しくは３５ヌクレオチドの第１配列又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６４．第２パラパリンドローム配列は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃ、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０の左側領域若しくは右側領域列に見出される配列に存在する１５～３５若しくは２０～３０ヌクレオチド、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４若しくは３５ヌクレオチドの第２配列又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、実施形態６３に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６５．挿入ＤＮＡは、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列に見出される第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する約２～２０、例えば２～１６ヌクレオチドを含むコア配列又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の置換、挿入若しくは欠失を有する配列をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６６．第１及び第２パラパリンドローム配列は、完全に回文の配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６７．第１及び／又は第２パラパリンドローム配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の非回文位置を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
６９．第１及び第２パラパリンドローム配列は、同じ長さである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７０．コア配列は、約２～２０ヌクレオチド（例えば、２～１６ヌクレオチド）長である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７１．コア配列、例えばコアジヌクレオチドは、ヒトゲノム中の対応する配列、例えばジヌクレオチド又はその逆相補鎖とハイブリダイズすることができる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７２．コア配列は、ヒトゲノム中の対応する配列と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７３．コア配列は、ヒトゲノム中の対応する配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５以下のミスマッチを有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７４．コア配列（例えば、コアジヌクレオチド）は、リコンビナーゼにより切断されると、粘着末端を形成し、これは、ヒトゲノム中の対応する配列とハイブリダイズすることができる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７５．異種目的配列は、真核生物遺伝子、例えば哺乳動物遺伝子、例えばヒト遺伝子、例えば血液因子（例えば、ゲノム因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ若しくはＸＩＩＩ）又は酵素、例えばリソソーム酵素又は合成ヒト遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７６．挿入ＤＮＡは、異種目的配列と、ＤＮＡ認識配列とを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７７．挿入ＤＮＡは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７８．挿入ＤＮＡと、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、個別の核酸分子中に存在する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
７９．挿入ＤＮＡと、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、同じ核酸分子中に存在する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８０．挿入ＤＮＡは、以下をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸：
（ａ）オープンリーディングフレーム、例えばポリペプチド、例えば酵素（例えば、リソソーム酵素）、血液因子、エキソンをコードする配列；
（ｂ）非コード及び／又は調節配列、例えば転写モジュレーター、例えばプロモータ（例えば異種プロモータ）、エンハンサー、インシュレーターに結合する配列；
（ｃ）スプライスアクセプター部位；
（ｄ）ポリＡ部位；
（ｅ）エピジェネティック修飾部位；
（ｆ）遺伝子発現単位。
８１．挿入ＤＮＡは、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター若しくはエピソームベクター）又は他の自己複製ベクターを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８２．細胞は、異種目的配列に含まれる内在性ヒト遺伝子を含まないか、又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８３．細胞は、異種目的配列により含まれる内在性ヒト遺伝子を含まない生物又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質を含まない生物に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８４．細胞は、内在性ヒトＤＮＡ認識配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８５．内在性ヒトＤＮＡ認識配列は、以下の基準：
（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置すること；
（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／他の機能性小分子ＲＮＡから＞３００ｋｂにあること；
（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂにあること；
（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂにあること；
（ｖ）任意の超保存エレメントから＞５０ｋｂにあること；
（ｖｉ）低転写活性を有する（即ちｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではないこと；
（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン中にあること；及び／又は
（ｘｉ）例えば、ヒトゲノム中に１コピーを有し、ユニークであること
の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又は９つを有するヒトゲノム内の部位に作動可能に連結しているか又はその中に位置する、実施形態８４に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８５ａ．細胞は、第２内在性ヒトＤＮＡ認識配列を含む、実施形態８４又は８５のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８５ｂ．第２内在性ヒトＤＮＡ認識配列は、以下の基準：
（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置すること；
（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／他の機能性小分子ＲＮＡから＞３００ｋｂにあること；
（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂにあること；
（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂにあること；
（ｖ）任意の超保存エレメントから＞５０ｋｂにあること；
（ｖｉ）低転写活性を有する（即ちｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではないこと；
（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン中にあること；及び／又は
（ｘｉ）例えば、ヒトゲノム中に１コピーを有し、ユニークであること
の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又は９つを有するヒトゲノム内の部位に作動可能に連結しており、例えばその中に位置する、実施形態８５ａに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８６．細胞は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８７．細胞は、植物細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８８．細胞は、遺伝子操作されていない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８９．細胞は、ａｔｔＢ又はａｔｔＰ部位を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８９ａ．細胞（例えば、システムとの接触前）は、疑似認識配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
８９ｂ．細胞（例えば、システムとの接触前）は、厳密に１つの疑似認識配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
９０．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃの単一アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
９１．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃの複数のアミノ酸配列の全て又は一部を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
９２．リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃの第１リコンビナーゼポリペプチド配列の一部からの第１アミノ酸配列と、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃの異なる第２リコンビナーゼポリペプチド配列の一部からの第２アミノ酸配列とを含む、実施形態９１に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
９３．第１アミノ酸配列は、第１リコンビナーゼポリペプチドのドメイン（例えば、Ｎ－末端触媒ドメイン、リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン又はＣ－末端ＤＮＡ結合ドメイン）に対応する、実施形態９２に記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
９４．第２アミノ酸配列は、第２リコンビナーゼポリペプチドのドメイン（例えば、Ｎ－末端触媒ドメイン、リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン又はＣ－末端ＤＮＡ結合ドメイン）、例えば第１アミノ酸配列のドメインと異なるドメインに対応する、実施形態９２又は９３のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
９５．挿入ＤＮＡのコア配列の１つ又は複数は、ゲノムＤＮＡ中の標的認識配列のコアジヌクレオチドに一致するように（且つ任意選択でゲノムＤＮＡ中の非標的認識配列の少なくとも１つのコアジヌクレオチドに一致しないように）改変されたコアジヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
９６．挿入ＤＮＡのコア配列の１つ又は複数は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する認識配列のコアジヌクレオチドに一致するように（且つ任意選択で表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する非標的認識配列の少なくとも１つのコアジヌクレオチドに一致しないように）改変されたコアジヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、細胞、方法、単離されたリコンビナーゼポリペプチド又は単離された核酸。
１００．リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０１．二本鎖挿入ＤＮＡは、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０２．リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡであり、任意選択で、ｍＲＮＡは、ＬＮＰ中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０３．二本鎖挿入ＤＮＡは、ウイルスベクターではなく、例えば、二本鎖挿入ＤＮＡは、トランスフェクション試薬中のネイキッドＤＮＡ又はＤＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０４．リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、第１ウイルスベクター、例えば第１ＡＡＶベクター中にあり、及び
挿入ＤＮＡは、第２ウイルスベクター、例えば第２ＡＡＶベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０５．リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡであり、任意選択で、ｍＲＮＡは、ＬＮＰ中にあり、及び
挿入ＤＮＡは、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター中にある、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０６．リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡであり、
二本鎖挿入ＤＮＡは、ウイルスベクター中になく、例えば、二本鎖挿入ＤＮＡは、ネイキッドＤＮＡ又はトランスフェクション試薬中のＤＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０７．挿入ＤＮＡは、少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ又は１５０ｋｂの長さを有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
１０８．挿入ＤＮＡは、抗生物質耐性遺伝子又はいずれかの他の細菌遺伝子若しくは部分を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
Ｒ１．システムは、１つ又は複数の環状ＲＮＡ分子（ｃｉｒｃＲＮＡ）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ２．ｃｉｒｃＲＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする、実施形態Ｒ１に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ３．ｃｉｒｃＲＮＡは、宿主細胞に送達される、実施形態Ｒ１～Ｒ２Ａのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ４．ｃｉｒｃＲＮＡは、例えば、宿主細胞中において、例えば宿主細胞の核中で線状化され得る、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ４Ａ．ｃｉｒｃＲＮＡは、切断部位を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ４Ａ１．ｃｉｒｃＲＮＡは、第２切断部位をさらに含む、任意の実施形態Ｒ４Ａに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ４Ｂ．切断部位は、リボザイム、例えばｃｉｒｃＲＮＡ中に含まれるリボザイムにより（例えば、自己切断により）切断され得る、実施形態Ｒ４Ａ又はＲ４Ａ１に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ５．ｃｉｒｃＲＮＡは、リボザイム配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ６．リボザイム配列は、例えば、宿主細胞中において、例えば宿主細胞の核中で自己切断することができる、実施形態Ｒ５に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ６Ａ．リボザイムは、誘導性リボザイムである、実施形態Ｒ５～Ｒ６のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ７．リボザイムは、タンパク質応答性リボザイム、例えば核タンパク質、例えばゲノム相互作用タンパク質、例えばエピジェネティック修飾因子、例えばＥＺＨ２に対して応答性であるリボザイムである、実施形態Ｒ５～Ｒ６Ａのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ８．リボザイムは、核酸応答性リボザイムである、実施形態Ｒ５～Ｒ７のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ８Ａ．リボザイムの触媒活性（例えば、自己触媒活性）は、標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｍｔＲＮＡ）の存在下で活性化される、実施形態Ｒ８に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ９Ａ．リボザイムは、標的タンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質）に対して応答性である、実施形態Ｒ５～Ｒ７のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ９Ｂ．標的タンパク質は、細胞質に局在するか又は核に局在する（例えば、エピジェネティック修飾因子又は転写因子）、実施形態Ｒ８Ａに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ９Ｃ．リボザイムは、Ｂ２若しくはＡＬＵレトロトランスポゾンのリボザイム配列又はそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態Ｒ５～Ｒ８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ１０Ａ．リボザイムは、タバコ輪点ウイルスハンマーヘッドリボザイムの配列又はそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態Ｒ５～Ｒ８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ１０Ｂ．リボザイムは、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムの配列又はそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態Ｒ５～Ｒ８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ１１．リボザイムは、標的細胞又は標的組織中で発現される部分により活性化される、実施形態Ｒ５～Ｘのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ１２．リボザイムは、標的細胞内コンパートメント（例えば、核、核小体、細胞質又はミトコンドリア）中で発現される部分により活性化される、実施形態Ｒ５～Ｘのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｒ４Ａ．リボザイムは、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ中に含まれる、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１．システム、ポリペプチド及び／又はそれをコードするＤＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ２ａ．脂質ナノ粒子（又は複数の脂質ナノ粒子を含む製剤）は、反応性不純物（例えば、アルデヒド）を欠いているか、又は予め選択したレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド）を含む、実施形態Ｍ１に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ２．脂質ナノ粒子（又は複数の脂質ナノ粒子を含む製剤）は、アルデヒドを欠いているか、又は予め選択したレベル未満のアルデヒドを含む、実施形態Ｍ１に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ３．脂質ナノ粒子は、複数の脂質ナノ粒子を含む製剤中に含まれる、実施形態Ｍ１又はＭ２に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ４．脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む１つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態Ｍ３に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ５．脂質ナノ粒子製剤は、３％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む１つ又は複数の脂質試薬を用いて産生される、実施形態Ｍ４に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ６．脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む１つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態Ｍ３～Ｍ５のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ７．脂質ナノ粒子製剤は、０．３％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む１つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態Ｍ６に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ８．脂質ナノ粒子製剤は、０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む１つ又は複数の脂質試薬を用いて生産される、実施形態Ｍ６に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ９．脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む、実施形態Ｍ３～Ｍ８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１０．脂質ナノ粒子製剤は、３％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む、実施形態Ｍ９に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１１．脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、実施形態Ｍ３～Ｍ１０のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１２．脂質ナノ粒子製剤は、０．３％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、実施形態Ｍ１１に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１３．脂質ナノ粒子製剤は、０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、実施形態Ｍ１１に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１４．本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１３のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１５．本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、３％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む、実施形態Ｍ１４に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１６．本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１５のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１７．本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、０．３％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、実施形態Ｍ１６に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１８．本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、実施形態Ｍ１６に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ１９．総アルデヒド含量及び／又は任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により、例えば実施例２６に記載される方法に従って決定される、実施形態Ｍ１～Ｍ１８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ２０．総アルデヒド含量及び／又は反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に伴う核酸分子（例えば、本明細書に記載される）の１つ又は複数の化学修飾を例えば脂質試薬中で検出することにより決定される、実施形態Ｍ１～Ｍ１８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ２１．総アルデヒド含量及び／又はアルデヒド種の量は、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に伴うヌクレオチド又はヌクレオシド（例えば、本明細書に記載されるように、例えば核酸分子中に含まれるか、又はそれから単離された例えばリボヌクレオチド又はリボヌクレオシド）の１つ又は複数の化学修飾を例えば脂質試薬中において、例えば実施例２７に記載されるように検出することにより決定される、実施形態Ｍ１～Ｍ１８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｍ２２．核酸分子、ヌクレオチド又はヌクレオシドの化学修飾は、例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、例えば実施例２７に記載されるように１つ又は複数の修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を決定することにより検出される、実施形態Ｍ２１に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｔ１．任意の先行する実施形態に記載のシステム、ポリペプチド（若しくはそれをコードするＲＮＡ）、核酸分子又はシステム若しくはポリペプチドをコードするＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
Ｔ２．Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム（例えば、本明細書に記載される）のポリペプチド（又はそれをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を含む第１脂質ナノ粒子と、
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム（例えば、本明細書に記載される）の核酸分子を含む第２脂質ナノ粒子と
を含むシステム。
Ｔ３．システム、核酸分子、ポリペプチド及び／又はそれをコードするＤＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｕ１．セリンリコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼの少なくとも１つの活性部位シグネチャ、例えばｃｄ００３３８、ｃｄ０３７６７、ｃｄ０３７６８、ｃｄ０３７６９又はｃｄ０３７７０を含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｕ２．セリンリコンビナーゼは、例えば、本明細書に記載されるように、公開データベース（例えば、ＩｎｔｅｒＰｒｏ、ＵｎｉＰｒｏｔ又は保存ドメインデータベース（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４８、Ｄ２６５－２６８（２０２０）；その全体は、参照により本明細書に組み込まれる）により記載される）から同定されたドメインを含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｕ３．セリンリコンビナーゼは、例えば、本明細書に記載されるように、例えば予測ツール、例えばＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎを用いてセリンリコンビナーゼドメイン（例えば、本明細書に記載される）についての核酸配列のオープンリーディングフレーム又は全フレーム翻訳物を走査することにより同定されたドメインを含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド又は反応混合物。
Ｖ０．異種目的配列は、細胞のゲノム中の標的部位中にあり（例えば、挿入され）、任意選択で、標的部位は、順に、（ｉ）第１パラパリンドローム配列（例えば、ａｔｔＬ部位）、（ｉｉ）異種目的配列、及び（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列（例えば、ａｔｔＲ部位）を含む、任意の先行する実施形態に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞（例えば、本明細書の方法により作製された細胞）、方法又は反応混合物。
Ｖ１．細胞（例えば、本明細書の方法により作製された細胞）は、（ｉ）第１パラパリンドローム配列と、（ｉｉ）異種目的配列との間の挿入若しくは欠失を含むか、又は細胞は、（ｉｉ）異種目的配列と、（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列との間の挿入若しくは欠失を含む、実施形態Ｖ０に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ３．挿入又は欠失は、標的部位の核酸配列の２０ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満又は１ヌクレオチド又は塩基対未満を含む、実施形態Ｖ１に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ４．挿入は、２０ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２つ未満又は１ヌクレオチド又は塩基対未満を含む、実施形態Ｖ１に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ５．欠失は、標的部位の先行配列の２０ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満又は１ヌクレオチド又は塩基対未満を含む、実施形態Ｖ１に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ６．標的部位の認識配列（例えば、表４Ｘに列挙される、例えばａｔｔＢ、ａｔｔＰ又はその疑似部位）のコア領域（例えば、中央ジヌクレオチド）は、認識配列（挿入ＤＮＡ上の、例えば表４Ｘに列挙される、例えばａｔｔＰ又はａｔｔＢ部位）のコア領域（例えば、中央ジヌクレオチド）と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を含む、実施形態Ｖ０～Ｖ５のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ７．標的部位中の挿入又は欠失の数は、同一性パーセントがより低い他の点で類似の細胞中の挿入又は欠失の数よりも少ない、実施形態Ｖ６に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ８．挿入又は欠失事象の数は、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０倍又は少なくとも１００倍低い、実施形態Ｖ７に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ９．標的部位は、複数の挿入（例えば、頭－尾又は頭－頭の２つ組）を含まない、実施形態Ｖ０～Ｖ８のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ９ａ．標的部位は、異種目的配列又はその断片の１００、７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２コピー未満を含む、実施形態Ｖ０～Ｖ９のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１０．標的部位は、異種目的配列又はその断片の単一コピーを含む、実施形態Ｖ０～Ｖ９ａのいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１１．（例えば、細胞の集団において）異種目的配列又はその断片の２コピー以上を示す標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも１コピーを含む標的部位の９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％又は１％未満である、実施形態Ｖ０～Ｖ１０のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１２．（例えば、細胞の集団において）異種目的配列又はその断片の３コピー以上を示す標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも１コピーを含む標的部位の９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％又は１％未満である、実施形態Ｖ０～Ｖ１１のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１３．（例えば、細胞の集団において）異種目的配列又はその断片の４コピー以上を示す標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも１コピーを含む標的部位の９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％又は１％未満である、実施形態Ｖ０～Ｖ１２のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１４．標的部位は、１つ又は複数のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）、例えば１、２、３、４つ以上のＩＴＲを含み、例えば、１つ又は複数のＩＴＲは、（ｉ）第１パラパリンドローム配列と、（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列との間に位置する、実施形態Ｖ０～Ｖ１３のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１５．（例えば、細胞の集団において）（ｉ）第１パラパリンドローム配列と、（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列との間のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）を含む標的部位は、異種目的配列又はその断片の少なくとも１コピーを含む標的部位の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である、実施形態Ｖ１４に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１６．挿入部位は、異種目的配列又はその断片の１つ又は複数のコピーを含む、実施形態Ｖ１４又はＶ１５に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１７．標的部位は、順に、（ｉ）第１パラパリンドローム配列、及び（ｉｉ）異種目的配列を含む、実施形態Ｖ０～Ｖ１６のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１８．標的部位は、（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列を含まない、実施形態Ｖ１７に記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ１９．標的部位は、（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列を含み、（ｉｉ）は、（ｉ）及び（ｉｉｉ）間に位置する、実施形態Ｖ０～Ｖ１７のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
Ｖ２０．（例えば、細胞の集団において）（ｉ）第１パラパリンドローム配列、及び（ｉｉｉ）第３パラパリンドローム配列の両方を含む標的部位は、１つ以下のパラパリンドローム配列（例えば、ａｔｔＬ又はａｔｔＰ配列）を含む標的部位のパーセンテージと比較して高いパーセンテージの完全異種目的配列（例えば、少なくとも０．１×、０．２×、０．３×、０．４×、０．５×、０．６×、０．７×、０．８×、０．９×、１．０×、１．５×、２．０×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×以上のパーセントの完全異種目的配列）を含む、実施形態Ｖ０～Ｖ１９のいずれかに記載のシステム、キット、ポリペプチド、細胞、方法又は反応混合物。
本開示は、以上の態様及び／又は実施形態のいずれか１つ又は複数のあらゆる組合せ並びに詳細な説明及び実施例に記載される実施形態のいずれか１つ又は複数との組合せを考慮する。
定義
約、およそ：「約」又は「およそ」は、１以上の目的の値に適用されるこの用語が本明細書に用いられる場合、記述される参照値と類似する値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別に記載がない限り又は特に文脈から明らかでない限り、記述される参照値のいずれかの方向（より多い又はより少ない）で１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下内に収まる値の範囲を指す（そのような数字が考えられる値の１００％を超過する場合を除く）。
ドメイン：本明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の連続領域（例えば、連続配列）又は個別の非連続領域（例えば、非連続配列）を含み得る。タンパク質ドメインの例として、限定されないが、核局在化配列、リコンビナーゼドメイン、ＤＮＡ認識ドメイン（例えば、本明細書に記載されるように、認識部位と結合するか若しくはそれと結合することができる）、リコンビナーゼＮ－末端ドメイン（触媒ドメインとも呼ばれる）、リコンビナーゼドメイン、Ｃ－末端ジンクリボンドメイン及び表４に列挙されるドメインが挙げられる。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、コイルド－コイル型モチーフをさらに含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメインは、まとめてＣ－末端ドメインと称される。一部の実施形態では、Ｎ－末端ドメインは、αＥリンカー又はヘリックスによりＣ－末端ドメインに結合している。一部の実施形態では、Ｎ－末端ドメインは、５０～２５０アミノ酸、又は１００～２００アミノ酸、又は１３０～１７０アミノ酸、例えば約１５０アミノ酸である。一部の実施形態では、Ｃ－末端ドメインは、２００～８００アミノ酸又は３００～５００アミノ酸である。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメインは、５０～１５０アミノ酸である。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、３０～１００アミノ酸であり；核酸のドメインの一例は、調節ドメイン、例えば転写因子結合ドメイン、認識配列、認識配列のアーム（例えば、５’又は３’アーム）、コア配列又は目的配列（例えば、異種目的配列）である。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのポリペプチドの１つ若しくは複数のドメイン（例えば、リコンビナーゼドメイン若しくはＤＮＡ認識ドメイン）又はその断片若しくは変異体を含む。
外性：本明細書で使用されるように、用語「外性」とは、生体分子（例えば、核酸配列又はポリペプチドなど）に関して用いられる場合、生体分子が、人為的に、宿主ゲノム、細胞若しくは生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えＤＮＡ技術又は他の方法を用いて、既存のゲノム、細胞、組織若しくは対象に付加される核酸は、既存の核酸配列、細胞、組織若しくは対象に対して外性である。
ゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨ部位）：ゲノムセーフハーバー部位は、例えば、挿入された遺伝因子が、宿主細胞若しくは生物にリスクをもたらす宿主ゲノムの有意な改変を引き起こさないように、新たな遺伝物質の組込みを収容することができる宿主ゲノム内の部位である。ＧＳＨ部位は、概して、以下の基準の１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９を満たす：（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置すること；（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／他の機能性低分子ＲＮＡから＞３００ｋｂに位置すること；（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂに位置すること；（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂに位置すること；（ｖ）超保存エレメントから＞５０ｋｂ離れていること；（ｖｉ）低転写活性を有する（即ちｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）こと；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではないこと；（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン内であること；及び／又は（ｉｘ）ヒトゲノム内に１コピーを有し、ユニークであること。これらの基準のいくつか又は全部を満たすヒトゲノム内のＧＳＨ部位の例として、以下のものが挙げられる：（ｉ）アデノウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、１９番染色体上のＡＡＶウイルスの天然に存在する組込み部位；（ｉｉ）ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体として知られるケモカイン受容体遺伝子；（ｉｉｉ）マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオーソログ；（ｉｖ）ｒＤＮＡ遺伝子座。さらに別のＧＳＨ部位が知られており、例えばＰｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．ｅｐｕｂ Ａｕｇｕｓｔ ２０，２０１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３９６３９０）に記載されている。
異種：用語「異種」は、第２要素に関して第１要素を表すために使用される場合、第１要素と第２要素が、記載されるような配置で天然に存在しないことを意味する。例えば、異種ポリペプチド、核酸分子、構築物若しくは配列は、（ａ）それが発現される細胞に対してネイティブではないポリペプチド、核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子配列の部分、（ｂ）その天然の状態に対して改変若しくは突然変異したポリペプチド若しくは核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子の部分、或いは（ｃ）類似の条件下でのネイティブ発現レベルと比較して改変された発現を有するポリペプチド又は核酸分子を指す。例えば、異種調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）を用いて、遺伝子又は核酸分子が天然に通常発現されるものと異なる様式で、遺伝子又は核酸分子の発現を調節することができる。特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞ゲノム内に存在し得るが、改変された発現レベル若しくは異なる配列を有するか、又はその両方であり得る。他の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞又は宿主ゲノムに内在性ではなくてもよいが、代わりに、形質転換（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション）により宿主細胞に導入され得、ここで、付加される分子は、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又は一過性（例えば、ｍＲＮＡ）若しくは２世代以上にわたって半安定的（例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド若しくは他の自己複製ベクター）のいずれかで染色体外遺伝材料として存在することができる。
突然変異又は突然変異型：用語「（突然）変異型」は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列内のヌクレオチドが、参照（例えば、天然）核酸配列に比して、挿入、欠失若しくは変更されている可能性があることを意味する。単一の改変が１遺伝子座でなされる（点変異）か、又は単一遺伝子座で複数のヌクレオチドが挿入、欠失若しくは変更される場合もある。加えて、１核酸配列内の任意の数の遺伝子座で、１つ若しくは複数の改変がなされる場合もある。核酸配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって突然変異させることができる。
核酸分子：核酸分子は、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両方を指し、限定しないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡが挙げられ、本明細書に記載される通り、ＤＮＡ鋳型のように、化学的に合成される又は組換えにより生成されるものなどの合成核酸分子も含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖、環状若しくは線状であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。別に記載のない限り、また、一般フォーマット「配列番号」として本明細書に記載される全ての配列の例として、「配列番号１」を含む核酸は、少なくともその一部が、（ｉ）配列番号１の配列、又は（ｉｉ）配列番号１と相補的な配列のどちらかを有する核酸を指す。２つのどちらを選択するかは、配列番号１が使用される状況によって決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つの間の選択は、プローブが、所望の標的と相補的であるという要件によって決定される。本開示の核酸配列は、当業者には容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾され得るか、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。こうした修飾として、例えば、標識、メチル化、類似体による１つ若しくは複数の自然発生的なヌクレオチドの置換、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩など）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分、（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えば、α－アノマー核酸など）が挙げられる。また、水素結合及び他の化学的相互作用により指定配列と結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。こうした分子は、当技術分野において公知であり、例えば分子の骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合を使用するものがある。他の修飾として、例えば、リボース環が、架橋部分又は「ロックド」核酸に見出される修飾などの他の構造を含む類似体を挙げることができる。
遺伝子発現単位：遺伝子発現単位は、少なくとも１つのエフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節核酸配列を含む核酸配列である。第１核酸配列は、第１核酸配列が、第２核酸配列と機能的に関連して配置されるとき、第２核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、プロモータ又はエンハンサーが、コード配列の転写若しくは発現に影響を及ぼす場合、コード配列と作動可能に連結している。作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的又は非連続であり得る。２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、作動可能に連結した配列が同じリーディングフレーム内に存在し得る。
宿主：宿主ゲノム又は宿主細胞という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質及び／又は遺伝材料が導入された細胞及び／又はそのゲノムを指す。こうした用語は、特定の対象細胞及び／又はゲノムだけではなく、そのような細胞の子孫及び／又はそのような細胞の子孫のゲノムも指す。特定の修飾は、突然変異又は環境の影響により後の世代に起こり得ることから、こうした子孫は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、やはり本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれることを理解されたい。宿主ゲノム又は宿主細胞は、単離された細胞若しくは培養で増殖した細胞株又はそうした細胞若しくは細胞株から単離されたゲノム物質であり得るか、或いは生体組織若しくは生物を構成する宿主細胞又は宿主ゲノムであり得る。いくつかの事例では、宿主細胞は、例えば、本明細書で記載されるように、動物細胞又は植物細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞又はシチメンチョウ細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞又はコメ細胞であり得る。
リコンビナーゼポリペプチド：本明細書で使用されるように、リコンビナーゼポリペプチドは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の組換え反応を触媒する機能的能力を有するポリペプチドを指す。組換え反応は、例えば、１つ若しくは複数の核酸鎖切断（例えば、二本鎖切断）、続いて、２つの核酸鎖末端（例えば、粘着末端）の結合を含み得る。いくつかの事例では、組換え反応は、例えば、ゲノム又は構築物中の、例えば標的部位への挿入核酸の挿入を含む。いくつかの事例では、組換え反応は、例えば、ゲノム又は構築物中の核酸のフリッピング又は反転を含む。いくつかの事例では、組換え反応は、例えば、ゲノム又は構築物から核酸を除去することを含む。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、天然に存在するリコンビナーゼ（例えば、セリンリコンビナーゼ、例えばＰｈｉＣ３１リコンビナーゼ又はＧｉｎリコンビナーゼ）の１つ又は複数の構造エレメントを含む。特定の事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、本明細書に記載の（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される）リコンビナーゼと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、セリンリコンビナーゼ、例えばセリンインテグラーゼを含む。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼ、例えばセリンインテグラーゼは、リコンビナーゼドメイン、触媒ドメイン又はジンクリボンドメインの１つ又は複数（例えば、全て）を含む。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼ、例えばセリンインテグラーゼは、表４に列挙されるドメイン（例えば、リコンビナーゼドメイン、触媒ドメイン又はジンクリボンドメインの１つ又は複数に加えて又はその代わりに）を含む。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、天然に存在するリコンビナーゼ（例えば、セリンリコンビナーゼ、例えばＰｈｉＣ３１リコンビナーゼ又はＧｉｎリコンビナーゼ）の１つ若しくは複数の官能的特徴を有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、３５０～９００アミノ酸又は４２５～７００アミノ酸である。いくつかの事例では、リコンビナーゼポリペプチドは、核酸分子中の認識配列（例えば、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域及び／若しくは右側領域列の配列に存在する認識配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列）を認識する（例えば、それと結合する）。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、第１認識配列（例えば、ａｔｔＢ又は疑似ａｔｔＢ）と、第２ゲノム認識配列（例えば、ａｔｔＰ又は疑似ａｔｔＰ）との間の組換えを促進し得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、単離されたモノマーとして活性ではない。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、１つ又は複数の他のリコンビナーゼポリペプチド（例えば、１回の組換え反応につき２又は４つのリコンビナーゼポリペプチド）と共同して組換え反応を触媒する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、ダイマーとして活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、認識配列でダイマーとしてアセンブリングする。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、テトラマーとして活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、認識配列でテトラマーとしてアセンブリングする。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、組換え（例えば、天然に存在しない）リコンビナーゼポリペプチドである。一部の実施形態では、組換えリコンビナーゼポリペプチドは、複数のリコンビナーゼポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む（例えば、組換えリコンビナーゼポリペプチドは、第１リコンビナーゼポリペプチドからの第１ドメインと第２リコンビナーゼポリペプチドからの第２ドメインとを含む）。
挿入核酸分子：本明細書に記載されるように、挿入核酸分子（例えば、挿入ＤＮＡ）は、標的核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）内の標的部位に、少なくとも部分的に、挿入されるか又は挿入されることになる核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）である。挿入核酸分子として、例えば、標的核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）に対して異種である核酸配列を挙げることができる。いくつかの事例では、挿入核酸分子は、目的配列（例えば、異種目的配列）を含む。いくつかの事例では、挿入核酸分子は、ＤＮＡ認識配列、例えば標的核酸中に存在するＤＮＡに対するコグネイトである。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、環状であり、一部の実施形態では、挿入核酸分子は、線状である。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、例えば、それぞれが標的核酸中に存在するＤＮＡ認識配列に対するコグネイトである２つ以上のＤＮＡ認識配列（例えば、２つのＤＮＡ認識配列）を含む。一部の実施形態では、挿入核酸分子は、鋳型核酸分子（例えば、鋳型ＤＮＡ）とも呼ばれる。
認識配列：認識配列（例えば、ＤＮＡ認識配列）は、概して、例えば本明細書に記載されるリコンビナーゼポリペプチドにより認識される（例えば、それによって結合され得る）核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。いくつかの事例では、認識配列は、２つの認識配列を含み、一方は組込み部位（核酸を組み込もうとする部位）中に位置され、他方は組込み部位に導入しようとする目的の核酸に隣接する。認識配列は、概して、ａｔｔＢ及びａｔｔＰと呼ばれる。認識配列は、ネイティブ配列であり得、ネイティブ配列に対して改変され得る。認識配列は、長さが変動し得るが、典型的には約２０～約２００ｎｔ、約３０～９０ｎｔ、より通常には３０～７０ヌクレオチドの範囲である。認識配列は、典型的には、以下のように配置される：ａｔｔＢは、５’から３’の相対順で、第１ＤＮＡ配列ａｔｔＢ５’、コア領域及び第２ＤＮＡ配列ａｔｔＢ３’、ａｔｔＢ５’－コア領域－ａｔｔＢ３’を含む。ａｔｔＰは、５’から３’の相対順で、第１ＤＮＡ配列ａｔｔＰ５’、コア領域及び第２ＤＮＡ配列ａｔｔＰ３’、ａｔｔＰ５’－コア領域－ａｔｔＰ３’を含む。一部の実施形態では、ａｔｔＢ５’及びａｔｔＢ３’は、パラパリンドロームである（例えば、一方の配列は他方の配列に対して回文であるか、又は他の配列に対する回文と少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する）。一部の実施形態では、ａｔｔＰ５’及びａｔｔＰ３’認識配列は、パラパリンドロームである（例えば、一方の配列は他方の配列に対して回文であるか、又は他方の配列に対する回文と少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する）。一部の実施形態では、ａｔｔＢ５’及びａｔｔＢ３’認識配列は、互いにパラパリンドロームであり、ａｔｔＰ５’及びａｔｔＰ３’認識配列は、互いにパラパリンドロームである。一部の実施形態では、ａｔｔＢ５’及びａｔｔＢ３’並びにａｔｔＰ５’及びａｔｔＰ３’配列は類似するが、必ずしも同数のヌクレオチドでない。ａｔｔＢ及びａｔｔＰは異なる配列のため、組換えは、ａｔｔＢ配列でもａｔｔＰ配列でもない核酸の区間（左右についてａｔｔＬ又はａｔｔＲと呼ばれる）をもたらす。特定の理論に束縛されることは意図しないが、ａｔｔＬ／ａｔｔＲとａｔｔＢ／ａｔｔＰとの間の非類似性は、おそらく、関連リコンビナーゼ酵素に対する組換え部位として認識不可能なａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位を作製し、従って酵素が第１組換え反応を逆転させる第２組換え反応を触媒する確率を低下させる。認識配列は、典型的には、リコンビナーゼダイマーにより結合される。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドのαＥヘリックス、リコンビナーゼドメイン、リンカードメイン及び／又はジンクリボンドメインの１つ又は複数が認識配列に接触する。いくつかの事例では、認識配列は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列の配列内に存在する核酸配列、例えば表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列の配列内の２０～２００ｎｔ配列、例えば表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列の配列内の３０～７０ｎｔ配列又はそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、認識部位は、付着部位とも呼ばれる。一部の実施形態では、認識配列はゲノムに存在し、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ活性の部位である認識配列を記載する場合、標的配列又は標的部位と呼ばれる。
疑似認識配列：認識配列は、様々な生物のゲノム中に存在し、認識配列は、必ずしも野生型認識配列（所与のリコンビナーゼについて）と同一のヌクレオチド配列を有さず；しかし、そのようなネイティブ認識配列は、それにもかかわらず、リコンビナーゼにより媒介される組換えを促進するために十分である。そのような認識配列は、とりわけ、本明細書で「疑似認識配列」と呼ばれる。「疑似認識配列」は、リコンビナーゼ酵素により認識される（例えば、それにより結合され得る）認識配列を含むＤＮＡ配列であり、認識配列は、対応する野生型リコンビナーゼ認識配列と１つ若しくは複数のヌクレオチドが異なり、且つ／又はリコンビナーゼについての野生型認識配列が残留するゲノムの配列と異なるゲノム中の内在性配列として存在する。一部の実施形態では、所与のリコンビナーゼについて、疑似認識配列は、野生型組換え配列と機能的に同等であり、リコンビナーゼが天然に見出される生物以外の生物に存在し、野生型認識配列に対して配列変異を有し得る。「疑似ａｔｔＰ部位」又は「疑似ａｔｔＢ部位」は、例えば、ファージインテグラーゼ酵素、例えばファージＰｈｉＣ３１についての野生型ファージ（ａｔｔＰ）又は細菌（ａｔｔＢ）付着部位配列それぞれについての認識配列と類似する疑似認識配列を指す。一部の実施形態では、ａｔｔＰ又は疑似ａｔｔＰ部位は宿主細胞のゲノム中に存在する一方、ａｔｔＢ又は疑似ａｔｔＢ部位は、本明細書に記載されるシステムにおけるターゲティングベクター上に存在する。一部の実施形態では、ａｔｔＢ又は疑似ａｔｔＢ部位は宿主細胞のゲノム中に存在する一方、ａｔｔＰ又は疑似ａｔｔＰ部位は、本明細書に記載されるシステムにおけるターゲティングベクター上に存在する。「疑似ａｔｔ部位」は、疑似ａｔｔＰ部位又は疑似ａｔｔＢ部位のいずれかを指すことができるより一般的な用語である。ａｔｔ部位又は疑似ａｔｔ部位は、線状又は環状核酸分子上に存在し得る。疑似認識配列の同定は、例えば、配列アラインメント及び分析を用いることにより達成することができ、クエリ配列は、目的の認識配列（例えば、ファージ／細菌システムのａｔｔＢ及び／又はａｔｔＰ）である。例えば、ａｔｔＢクエリ配列を用いてゲノム認識配列が同定される場合、それは疑似ａｔｔＢ部位と言われ；ａｔｔＰクエリ配列を用いてゲノム認識配列が同定される場合、それは疑似ａｔｔＰ部位と言われる。一部の実施形態では、疑似認識配列は、リコンビナーゼにより認識される（例えば、それに結合することができる）野生型認識配列（例えば、Ｌｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，４３０（２１）：４４０１－４４１８（参照により組み込まれる）に記載されるαＥヘリックス、リコンビナーゼドメイン、リンカードメイン及び／又はジンクリボンドメインの１つ又は複数）と高い配列類似性を共有する。一部の実施形態では、疑似認識配列は、リコンビナーゼの野生型認識配列よりもリコンビナーゼにより強力に結合されるか又は作用される。疑似認識配列は、「疑似部位」とも呼ぶことができる。一部の実施形態では、疑似部位は、例えば、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１（１２）：３９２６－３９３４（２００１）に記載されるように、親配列と完全に不一致であり得る。一部の実施形態では、本明細書で使用される疑似部位は、ネイティブ認識配列と７０％未満、例えば７０％、６０％、５０％、４０％未満又は３０％未満同一であり得る。一部の実施形態では、本明細書で使用される疑似部位は、ネイティブ認識配列と２０％超、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％超又は７０％超同一であり得る。
ハイブリッド認識配列：本明細書で使用される「ハイブリッド認識配列」は、複数の認識配列、例えば野生型及び／又は疑似認識配列の一部から構築される認識配列を指す。一部の実施形態では、複数の認識配列は、同じリコンビナーゼの全ての認識配列（例えば、同じリコンビナーゼにより認識される野生型認識配列及び疑似認識配列）である。一部の実施形態では、コア配列の５’側の配列、例えばハイブリッド組換え部位のａｔｔＢ５’又はａｔｔＰ５’は疑似認識配列に一致し、コア配列の３’側の配列、例えばハイブリッド認識配列のａｔｔＢ３’又はａｔｔＰ３’は野生型認識配列に一致する。一部の実施形態では、コア配列の５’側の配列、例えばハイブリッド組換え部位のａｔｔＢ５’又はａｔｔＰ５’は野生型認識配列に一致し、コア配列の３’側の配列、例えばハイブリッド認識配列のａｔｔＢ３’又はａｔｔＰ３’は疑似認識配列に一致する。一部の実施形態では、コア配列の５’側の配列、例えばハイブリッド組換え部位のａｔｔＢ５’又はａｔｔＰ５’は疑似認識配列に一致し、コア配列の３’側の配列、例えばハイブリッド認識配列のａｔｔＢ３’又はａｔｔＰ３’は野生型認識配列に一致する。一部の実施形態では、ハイブリッド認識配列は、野生型ａｔｔＢ部位からのコア配列の５’側の領域と、野生型ａｔｔＰ認識配列からのコア配列の３’側の領域とから構成され得、その逆も同様である。このようなハイブリッド認識配列の他の組合せは、本明細書の教示を考慮して当業者に明らかである。一部の実施形態では、本明細書の使用に好適な認識配列は、ハイブリッド認識配列である。
コア配列：コア配列は、本明細書で使用される場合、認識配列の２つのアーム間、例えばパラパリンドローム配列のペア間に位置する核酸配列を指す。一部の実施形態では、コア配列は、ａｔｔＢ５’とａｔｔＢ３’との間又はａｔｔＰ５’とａｔｔＰ３’との間に位置する。いくつかの事例では、コア配列は、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、２つのパラパリンドローム配列を含む認識配列を認識するリコンビナーゼポリペプチド）により切断されて、例えば粘着末端、例えば３’オーバーハングを形成することができる。一部の実施形態では、ａｔｔＢ及びａｔｔＰのコア配列は同一である。一部の実施形態では、ａｔｔＢ及びａｔｔＰのコア配列は同一でなく、例えば９９、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０又は２０％未満の同一性を有する。一部の実施形態では、コア配列は、約２～２０ヌクレオチド、例えば２～１６ヌクレオチド、例えば約４ヌクレオチド長又は約２ヌクレオチド長（例えば、厳密に２ヌクレオチド長）である。一部の実施形態では、コア配列は、２つの隣接ヌクレオチドに対応するコアジヌクレオチドを含み、近くのパラパリンドローム配列を認識するリコンビナーゼがコアジヌクレオチドの片側のＤＮＡを切断し得、例えば粘着末端を形成する。一部の実施形態では、ａｔｔＢ及び／又はａｔｔＰ部位のコア配列のコアジヌクレオチドは、同一であり、例えば、ａｔｔＰ及び／又はａｔｔＢ部位の切断は、適合性粘着末端を形成する。一部の実施形態では、コア配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸配列を含む。一部の実施形態では、コア配列は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在しない核酸配列を含む。
目的配列：本明細書で使用される場合、目的配列という用語は、例えば、本明細書に記載されるように、例えばリコンビナーゼポリペプチドにより、標的核酸分子に望ましく挿入され得る核酸セグメントを指す。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、ＤＮＡ認識配列と、ＤＮＡ認識配列と異種の目的配列（一般に、本明細書では「異種目的配列」と呼ばれる）とを含む。目的配列は、いくつかの事例では、それが挿入される核酸分子に対して異種であり得る。いくつかの事例では、目的配列は、例えば、本明細書に記載されるように、遺伝子（例えば、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト遺伝子）をコードする核酸配列又は目的の他のカーゴ（例えば、機能性ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡをコードする配列）を含む。特定の事例では、遺伝子は、ポリペプチド（例えば、血液因子又は酵素）をコードする。いくつかの事例では、目的配列は、選択マーカ（例えば、栄養要求性マーカ若しくは抗生物質マーカ）及び／又は核酸制御エレメント（例えば、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー若しくはインスレータ）をコードする核酸配列の１つ若しくは複数を含む。
パラパリンドローム：本明細書で使用される場合、「パラパリンドローム」という用語は、核酸配列の一方が、他方の核酸配列に対して回文であるか、或いは他方の核酸配列に対する回文と少なくとも３０％（例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％）、例えば少なくとも５０％の配列同一性を有するか、又は他方の核酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列ミスマッチを有するかのいずれかである、一対の核酸配列の特性を指す。「パラパリンドローム配列」は、本明細書で使用される場合、互いに対してパラパリンドロームである一対の核酸配列の少なくとも１つを指す。「パラパリンドローム領域」は、本明細書で使用される場合、２つのパラパリンドローム配列を含む核酸配列又はその部分を指す。いくつかの事例では、パラパリンドローム領域は、核酸配列セグメント（例えば、コア配列を含む）とフランキングする２つのパラパリンドローム配列を含む。
ヒト細胞における１０の例示的なセリンインテグラーゼの活性。インテグラーゼ発現プラスミド及び５２０ｂｐのａｔｔＰ含有領域に続いて、ＣＭＶプロモータにより駆動されるＥＧＦＰリポータを有する鋳型プラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２１日後にフローサイトメトリーにより観察されたＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが示される。 異なるＡＡＶドナーフォーマットの組込み、安定性及び発現を評価するための戦略。単一ａｔｔＢ＊又はａｔｔＰ＊ドナーは、細胞核へのＡＡＶ形質導入後の二本鎖環状化ＤＮＡの形成を利用する。この構成は、組込み後にＩＴＲ配列も含む。二重ａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊又はａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊ドナーは、ＡＡＶ形質導入後の二本鎖環状化ＤＮＡの形成を要求しない。組込み安定性及び発現についてのリードアウトは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及びフローサイトメトリー（ＦＬＯＷ）を用いる。 ＡＡＶ構築物の説明。第１行は、ＩＴＲ、スタッファー（５００）、ａｔｔＰ＊、ＰＥＦ１ａ、ＥＧＦＰ、ＷＰＲＥ、ｈＧＨｐＡ、ＩＴＲ；ＡＡＶ２血清型を示す。第２行は、ＩＴＲ、スタッファー（５００）、ａｔｔＰ、ＰＥＦ１ａ、ＥＧＦＰ、ＷＰＲＥ、ｈＧＨｐＡ、ａｔｔＰ＊、スタッファー（５００）、ＩＴＲ；ＡＡＶ２血清型を示す。第３行は、ＩＴＲ、スタッファー（５００）、ａｔｔＢ＊、ＰＥＦ１ａ、ＥＧＦＰ、ＷＰＲＥ、ｈＧＨｐＡ、ＩＴＲ；ＡＡＶ２血清型を示す。第４行は、ＩＴＲ、スタッファー（５００）、ａｔｔＢ、ＰＥＦ１ａ、ＥＧＦＰ、ＷＰＲＥ、ｈＧＨｐＡ、ａｔｔＢ＊、スタッファー（５００）、ＩＴＲ；ＡＡＶ２血清型を示す。第５行は、ＩＴＲ、ＰＥＦ１ａ、ｈｃｏＢＸＢ１、ＷＰＲＥ、ｈＧＨｐＡ、ＩＴＲ；ＡＡＶ２血清型を示す。第６行は、ＩＴＲ、ＰＥＦ１ａ、ｍｃｏＢＸＢ１、ＷＰＲＥ、ｈＧＨｐＡ、ＩＴＲ；ＡＡＶ６血清型を示す。 哺乳動物細胞へのセリンインテグラーゼ及び鋳型ＤＮＡの二重ＡＡＶ送達。（Ａ）実験の概略図。ＢＸＢ１セリンリコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡを個別のＡＡＶウイルスベクターとしてＢＸＢランディングパッド細胞株に共送達する。（Ｂ）形質導入から３日及び７日後の、ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊ランディングパッド細胞株へのＢＸＢ１セリンリコンビナーゼ及びトランスジーンの組込み（％ＣＮＶ／ランディングパッド）を評価するためのドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ。黒色点（灰色点の各ペアの右側）は、鋳型のみサンプルを示し、ｙ軸上で０％に降下する。灰色点（黒色点の各ペアの左側）は、鋳型＋ＢＸＢ１インテグラーゼを示し、ｙ軸上で１～６％降下する。 哺乳動物細胞へのＢＸＢ１インテグラーゼのｍＲＮＡ送達及び鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達。（Ａ）実験の概略図。ＢＸＢ１ランディングパッド細胞株へのＢＸＢ１セリンリコンビナーゼのｍＲＮＡ送達及び鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達。（Ｂ）ｍＲＮＡトランスフェクション／ＡＡＶ形質導入から３日後の、ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊ランディングパッド細胞株へのＢＸＢ１セリンリコンビナーゼ及びトランスジーンの組込み（％ＣＮＶ／ランディングパッド）を評価するためのドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ。黒色点（灰色点の各ペアの右側）は、鋳型のみサンプルを示し、ｙ軸上で０％に降下する。灰色点（黒色点の各ペアの左側）は、鋳型＋ＢＸＢ１インテグラーゼを示し、ｙ軸上で０％超に降下する。 リコンビナーゼ認識部位の一般的構造並びに本明細書に開示される左側領域及び右側領域配列中の認識部位の存在。（Ａ）認識配列の一般的特徴。本明細書に定義されるセリンリコンビナーゼは、概して、中央ジヌクレオチド、コア配列及び天然でパラパリンドロームであり得るフランキングアームを含む。Ｂｘｂ１リコンビナーゼについてのａｔｔＰ及びａｔｔＢ認識配列（表３Ａ、第２０４行）が本明細書に示される。これらの配列は、２つの部位間の組換えの成功に重要な、太字で示される中央ジヌクレオチドを共有する。黒色枠線により示される認識部位のアームは、様々な程度で回文配列を共有し得、従って本明細書で「パラパリンドローム」と呼ばれる。反対のアームに関して回文であるヌクレオチドは、下線付き文字により示される。さらに、認識配列は、灰色陰影によりここに示される、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間で共通するコアを共有する。コア配列は、少なくとも中央ジヌクレオチドを含むが、追加の配列を含み得る。（Ｂ）表２の左側領域又は右側領域は、コグネイトリコンビナーゼについてのａｔｔＰ部位を含む。表２は、本明細書に記載される例示的なリコンビナーゼについての例示的な認識部位を含む。一例として、表１又は表３、例えば表１Ａ又は表３ＡのリコンビナーゼについてのａｔｔＰ部位は、表２、例えば表２Ａの左側領域又は右側領域に見出される。ここで、Ｂｘｂ１インテグラーゼについてのａｔｔＰ部位（表１Ａ及び表３Ａ、第２０４行）は、表２Ａの対応する行（第２０４行）に示される。Ｂｘｂ１のａｔｔＰ部位は、左側領域配列中で下線付き及び太字文字として示される。 リコンビナーゼ認識部位の一般的構造並びに本明細書に開示される左側領域及び右側領域配列中の認識部位の存在。（Ａ）認識配列の一般的特徴。本明細書に定義されるセリンリコンビナーゼは、概して、中央ジヌクレオチド、コア配列及び天然でパラパリンドロームであり得るフランキングアームを含む。Ｂｘｂ１リコンビナーゼについてのａｔｔＰ及びａｔｔＢ認識配列（表３Ａ、第２０４行）が本明細書に示される。これらの配列は、２つの部位間の組換えの成功に重要な、太字で示される中央ジヌクレオチドを共有する。黒色枠線により示される認識部位のアームは、様々な程度で回文配列を共有し得、従って本明細書で「パラパリンドローム」と呼ばれる。反対のアームに関して回文であるヌクレオチドは、下線付き文字により示される。さらに、認識配列は、灰色陰影によりここに示される、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間で共通するコアを共有する。コア配列は、少なくとも中央ジヌクレオチドを含むが、追加の配列を含み得る。（Ｂ）表２の左側領域又は右側領域は、コグネイトリコンビナーゼについてのａｔｔＰ部位を含む。表２は、本明細書に記載される例示的なリコンビナーゼについての例示的な認識部位を含む。一例として、表１又は表３、例えば表１Ａ又は表３ＡのリコンビナーゼについてのａｔｔＰ部位は、表２、例えば表２Ａの左側領域又は右側領域に見出される。ここで、Ｂｘｂ１インテグラーゼについてのａｔｔＰ部位（表１Ａ及び表３Ａ、第２０４行）は、表２Ａの対応する行（第２０４行）に示される。Ｂｘｂ１のａｔｔＰ部位は、左側領域配列中で下線付き及び太字文字として示される。
本開示は、例えば、インビボ又はインビトロで、細胞、組織若しくは対象におけるＤＮＡ配列内の１つ若しくは複数の位置で、ＤＮＡ配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する（例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的ＤＮＡ配列を挿入する）ための組成物、システム及び方法に関する。目的ＤＮＡ配列は、例えば、コード配列、調節配列、遺伝子発現単位を含み得る。
Ｇｅｎｅ－ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディター
本発明は、例えば、リコンビナーゼポリペプチドが結合することができる、コグネイト認識配列を含む２つのＤＮＡ配列を組み換えることにより、ＤＮＡ配列を修飾又は操作することができるリコンビナーゼポリペプチド（例えば、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される通り、例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド）を提供する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、一部の実施形態において、（Ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸（ポリペプチドは、（ｉ）リコンビナーゼ活性を有するドメインと、（ｉｉ）ＤＮＡ結合機能性を有するドメイン（例えば、本明細書に記載される、例えば認識配列に結合するか又は結合することができる、例えばＤＮＡ認識配列を含む）；及び（Ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列（例えば、本明細書に記載の認識配列）と、任意選択で（ｉｉ）目的配列（例えば、異種目的配列）と、を含む挿入ＤＮＡを含み得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼ活性を有するドメインと、ＤＮＡ結合機能性を有するドメインは、同じドメインである。例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタータンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインと、リコンビナーゼドメインとを含み得る。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターポリペプチドの要素は、例えば、本明細書に記載されるように、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、セリンリコンビナーゼ）の配列から得ることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターを第２ポリペプチドと組み合わせる。一部の実施形態では、第２ポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるように、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、セリンリコンビナーゼ）から得られる。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ遺伝子エディターシステムのリコンビナーゼポリペプチド成分
本明細書に記載されるシステム、細胞及び方法で使用することができるリコンビナーゼポリペプチドの例示的なファミリーとして、セリンリコンビナーゼが挙げられる。概して、セリンリコンビナーゼは、２つの認識配列間の部位特異的組換えを触媒する酵素である。２つの認識配列は、例えば、同じ核酸（例えば、ＤＮＡ）分子上にあり得るか、又は２つの個別の核酸（例えば、ＤＮＡ）分子上にあり得る。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼＮ－末端ドメイン（触媒ドメインとも呼ばれる）、リコンビナーゼドメイン及びＣ－末端ジンクリボンドメインを含む。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、コイルド－コイル型モチーフをさらに含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメインは、まとめてＣ－末端ドメインと呼ばれる。一部の実施形態では、Ｎ－末端ドメインは、５０～２５０アミノ酸、又は１００～２００アミノ酸、又は１３０～１７０アミノ酸である。一部の実施形態では、Ｃ－末端ドメインは、２００～８００アミノ酸又は３００～５００アミノ酸である。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメインは、５０～１５０アミノ酸である。一部の実施形態では、ジンクリボンドメインは、３０～１００アミノ酸である。一部の実施形態では、Ｎ－末端ドメインは、長いヘリックス（αＥヘリックス又はリンカーと呼ばれることもある）を介してリコンビナーゼドメインに結合している。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメインは、短いリンカーを介して連結している。セリンリコンビナーゼ及びリコンビナーゼポリペプチドの非限定的な例は、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙される。
一部の実施形態では、組換えリコンビナーゼは、スワッピングドメインにより構築される。一部の実施形態では、リコンビナーゼＮ－末端ドメインは、異種リコンビナーゼＣ－末端ドメインと対合させることができる。一部の実施形態では、触媒ドメインは、異種リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン、αＥヘリックス及び／又は短いリンカーと対合させることができる。一部の実施形態では、Ｃ－末端ドメインは、異種リコンビナーゼドメイン、ジンクリボンドメイン、αＥヘリックス及び／又は短いリンカーを含み得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドのＤＮＡ結合エレメントは、異種ＤＮＡ結合エレメント、例えばジンクフィンガードメイン、ＴＡＬドメイン又はワトソン・クリックベースターゲティングドメイン、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより修飾されるか又は置き換えられる。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、セリンリコンビナーゼは、認識配列の例である短い特異的ＤＮＡ配列（例えば、ａｔｔＰ及びａｔｔＢ）を利用する。組込み反応中、リコンビナーゼは、ダイマーとしてａｔｔＰ及びａｔｔＢに結合し、部位の会合を媒介して、テトラマーシナプス複合体を形成し、鎖交換を触媒してＤＮＡを組み込み、新たな認識配列部位、ａｔｔＬ及びａｔｔＲを形成する。新たな認識部位、ａｔｔＬ及びａｔｔＲは、例えば、５’から３’の順にａｔｔＢ５’－コア－ａｔｔＰ３’及びａｔｔＰ５’－コア－ａｔｔＢ３’を含む。特定の理論に束縛されることは意図しないが、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列間の部位特異的組換えによりＤＮＡを切除する逆反応は、低減した頻度で生じるか、又は組換え方向性因子（ＲＤＦ）の不存在下で生じない。これは、リコンビナーゼ媒介切除がほとんどないか又は検出可能でない安定的な組込み、即ち「単一方向性」である組換えをもたらす。
機序の記載により拘束されるものではないが、リコンビナーゼにより触媒される鎖交換は、典型的には、リコンビナーゼ酵素とＤＮＡ鎖との間で形成される共有結合タンパク質－ＤＮＡ中間体が関与する（１）切断、及び（２）再結合の２つのステップで生じる。リコンビナーゼは、そのＤＮＡ基質にダイマーとして結合し、タンパク質－タンパク質相互作用により部位を一緒にしてテトラマーシナプス複合体を形成することにより作用する。４つのサブユニットの各々の求核セリンの活性化は、ＤＮＡ切断をもたらして２ｎｔ３’オーバーハング及び陥凹５’末端への一過的なホスホセリル結合を生じさせる。ＤＮＡ鎖交換は、サブユニット回転により生じる。陥凹５’塩基及び３’ＯＨを有する３’ジヌクレオチドオーバーハング塩基対は、切断反応の逆でホスホセリル結合を攻撃して組換え半部位を結合させる。セリンリコンビナーゼの構造、活性及び生物学のさらなる詳細は、参照により組み込まれる以下の参照文献：Ｓｍｉｔｈ ＭＣＭ．２０１４．Ｐｈａｇｅ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｓｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌａｒｇｅ ｓｅｒｉｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ３（４）：ＭＤＮＡ３－００５９－２０１４；Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ Ｋ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｕｙｎｅ Ｇ Ｄ．２０１４．Ｔｈｅ ｉｎｓ ａｎｄ ｏｕｔｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：１２５－１３１；Ｖａｎ Ｄｕｙｎｅ Ｇ Ｄ ａｎｄ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ Ｋ．２０１３．Ｌａｒｇｅ Ｓｅｒｉｎｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８（５）：４７１－４９１に記載されている。
当業者は、例えば、保存ドメイン解析のためのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）又はＣＤ－Ｓｅａｒｃｈのような常用の配列解析ツールを用いることにより、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、セリンリコンビナーゼ）の核酸及び対応するポリペプチド配列並びにそのドメインを決定することができる。他の配列解析ツールは周知であり、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ－ｔｏｏｌｓ．ｃａ、例えばｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ－ｔｏｏｌｓ．ｃａ／Ｍｏｔｉｆｓ．ｈｔｍに見出すことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるセリンリコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼの少なくとも１つの公知の活性部位シグネチャ、例えばｃｄ００３３８、ｃｄ０３７６７、ｃｄ０３７６８、ｃｄ０３７６９又はｃｄ０３７７０を含む。これらのドメインを含有するタンパク質は、さらにタンパク質データベース、例えば、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ３５１－３６０（２０１９））、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７，Ｄ５０６－５１５（２０１９））若しくは保存ドメインデータベース（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４８，Ｄ２６５－２６８（２０２０））上でドメインを検索することによるか、又は予測ツール、例えば、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎを用いてセリンリコンビナーゼドメインの核酸配列のオープンリーディングフレームワーク若しくは全フレーム翻訳物を走査することにより見出すことができる。
本開示は多くの特定のセリンリコンビナーゼ配列を提供する一方、本明細書に記載される方法、他のセリンリコンビナーゼも用いて実施することができることが理解される。例えば、本明細書に記載される組成物又は方法は、例えば、ｃｄ００３３８、ｃｄ０３７６７、ｃｄ０３７６８、ｃｄ０３７６９又はｃｄ０３７７０から選択される活性部位シグネチャを有するセリンリコンビナーゼを含み得る。一部の実施形態では、セリンリコンビナーゼは、４００アミノ酸長超（例えば、少なくとも４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００アミノ酸）を有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、表３Ａ～３Ｃのいずれかに列挙される（例えば、表３Ａ～３Ｃのいずれかの単一行に列挙される）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のドメインを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、表４に列挙される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のドメインを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼを同定する方法は、ポリペプチドが表３Ａ～３Ｃのいずれかに列挙される（例えば、３Ａ～３Ｃのいずれかの単一行に列挙される）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のドメインを含むか否かを決定することを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼを同定する方法は、ポリペプチドが表４に列挙される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のドメインを含むか否かを決定することを含む。
例示的なリコンビナーゼポリペプチド
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、例えば、本明細書に記載されるリコンビナーゼポリペプチド（例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド）を含む。一般に、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド）は、核酸認識配列に特異的に結合し、認識配列内の１部位（例えば、認識配列内のコア配列）で組換え反応を触媒する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、認識配列又はその一部（例えば、そのコア配列）と、別の核酸配列（例えば、コグネイト認識配列及び任意選択で目的配列、例えば異種目的配列を含む挿入ＤＮＡ）との間の組換えを触媒する。例えば、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド）は、目的配列又はその一部の、別の核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子、例えば染色体若しくはミトコンドリアＤＮＡ）への挿入をもたらす組換え反応を触媒する。
以下の表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃ（Ｐｒｏｔｓｅｑ列参照）は、例示的なリコンビナーゼポリペプチド、例えばセリンリコンビナーゼ（例えば、セリンインテグラーゼ）又はその断片のアミノ酸配列を提供する。表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃは、起源の生物の例示的なセリンリコンビナーゼをコードする核酸配列のフランキング核酸配列を提供し（それぞれ、左側領域及び右側領域と標識された列参照）；それらのフランキング核酸配列の一方又は両方が、対応するリコンビナーゼのネイティブ認識配列又はその一部を含む（例えば、ａｔｔＰ部位又はその一部を含む）。表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃは、これまでセリンリコンビナーゼと同定されていないアミノ酸配列を含み、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃは、ＤＮＡ認識配列がこれまで不明であったセリンリコンビナーゼの対応するフランキング核酸配列（及びそれによりＤＮＡ認識配列）を含む。起源配列（表１Ａ、１Ｂ又は１Ｃの記述列参照）、リコンビナーゼの起源の生物（表１Ａ、１Ｂ又は１Ｃの生物列参照）、リコンビナーゼのアミノ酸配列の長さ（表１Ａ、１Ｂ又は１Ｃのタンパク質配列長さ列参照）、リコンビナーゼをコードする核酸配列のゲノムアクセッション番号（表１Ａ、１Ｂ又は１Ｃのゲノムアクセッション列）、リコンビナーゼのタンパク質アクセッション番号（表１Ａ、１Ｂ又は１Ｃのタンパク質アクセッション列）及びリコンビナーゼコード配列のゲノム位置座標（示されるフランキング核酸配列を含む）（表１Ａ、１Ｂ又は１ＣのＧ開始及びＧ終止列）の記載が以下に挙げられる。また、例示的なリコンビナーゼ配列中に存在すると同定されたドメインは、アミノ酸配列のＩｎｔｅｒＰｒｏ分析に基づいて同定される（表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのドメイン列参照）。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ－ｔｏｏｌ参照。ドメイン命名法の簡単なキーは、表４に提供される。表１Ａ、１Ｂ又は１Ｃの各アクセッション番号のアミノ酸配列及びゲノム配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃに列挙されるフランキング核酸配列に存在するネイティブ認識配列又はその一部の各々は、（ｉ）第１パラパリンドローム配列、（ｉｉ）コア配列、及び／又は（ｉｉｉ）第２パラパリンドローム配列の１つ、２つ又は３つを含み得、ここで、第１及び第２パラパリンドローム配列は、互いに対してパラパリンドロームである。
一部の実施形態では、パラパリンドローム配列のペアを選択する場合、本明細書に開示される表の使用者は、互いに同じ行番号を有する行に開示される配列に基づいて各配列を選択する。例えば、一部の実施形態では、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含むＤＮＡ認識配列を含む細胞は、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの同じ行に開示される配列に関連する第１及び第２パラパリンドローム配列を含む。一部の実施形態では、例示的なリコンビナーゼポリペプチドとの使用のためにＤＮＡ認識配列（例えば、パラパリンドローム配列）を選択する場合、ＤＮＡ認識配列（例えば、パラパリンドローム配列）は、例示的なリコンビナーゼポリペプチドと同じ行番号を有する行の配列から選択されるか又はそれに関連する。
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Figure 2023502473000735
一部の実施形態では、表２Ａの第３２９行の左側領域核酸配列を含む配列（例えば、配列番号２９０の核酸配列を含む配列）は、核酸配列：
Figure 2023502473000736
 を含む。
一部の実施形態では、表２Ａの第５２４行の左側領域核酸配列を含む配列（例えば、配列番号４７０の核酸配列を含む配列）は、核酸配列：
Figure 2023502473000737
 を含む。
一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＢ配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＰ配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＢ配列及びａｔｔＰ配列を含む。複数の実施形態では、ａｔｔＢ配列は、表４Ｘに列挙される配列から選択される。複数の実施形態では、ａｔｔＰ配列は、表４Ｘに列挙される配列から選択される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＢ配列及びａｔｔＰ配列を含み、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ配列は各々、表４Ｘの単一行に列挙される配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ認識配列（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＢ配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識配列（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＰ配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識配列（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＢ配列及びａｔｔＰ配列を含む。複数の実施形態では、ａｔｔＢ配列は、表４Ｘに列挙される配列から選択される。複数の実施形態では、ａｔｔＰ配列は、表４Ｘに列挙される配列から選択される。一部の実施形態では、ＤＮＡ認識配列（例えば、本明細書に記載される）は、ａｔｔＢ配列及びａｔｔＰ配列を含み、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ配列は各々、表４Ｘの単一行に列挙される配列を含む。
一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる）は、表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃに列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる）又はその一部は、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃに列挙されるリコンビナーゼポリペプチドのリコンビナーゼドメイン、ＤＮＡ認識ドメイン（例えば、本明細書に記載されるように、例えば認識部位に結合するか又は結合することができる）、リコンビナーゼＮ－末端ドメイン（触媒ドメインとも呼ばれる）、ジンクリボンドメイン、ジンクリボンドメインのコイルドコイルモチーフ又はＣ－末端ドメイン（例えば、リコンビナーゼドメイン及びジンクリボンドメイン）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる）は、表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃに列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドのＤＮＡ結合活性及び／又はリコンビナーゼ活性の１つ又は複数を有する。
一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる）は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸認識配列或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる）は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する１つ又は複数の（例えば、両方の）パラパリンドローム配列或いは前記パラパリンドローム配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる）は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸認識配列のスペーサ（例えば、コア配列）或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有する核酸配列を含む。特定の実施形態では、挿入ＤＮＡは、異種目的配列をさらに含む。
一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されるシステム又は細胞に含まれる）は、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する核酸認識配列或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有する核酸配列を含み、それは疑似認識配列（例えば、ヒト認識配列）に対してコグネイトである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物又は方法で用いられる挿入ＤＮＡ又はリコンビナーゼポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７又は８つのセーフハーバースコアを有する位置への異種目的配列の挿入を指令する。
特定の実施形態では、挿入ＤＮＡとヒトＤＮＡ認識配列との間の組換えは、組み込まれた配列（例えば、異種目的配列）をフランキングする２つの認識配列を含む組み込まれた核酸分子の形成をもたらす。特定の理論に束縛されることは意図しないが、セリンリコンビナーゼは、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を含む認識配列間の組換えを促進し、組換えにより、例えば、組込み配列をフランキングするａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位を含む認識配列を形成する。セリンリコンビナーゼがａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位を認識し、例えば、それに結合し得る一方、セリンリコンビナーゼは、ａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位を用いる組換えをあまり促進しない（例えば、促進しない）（例えば、追加の因子の不存在下で）。ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位は、それらが作製されたａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位の組換え部分を含む。特定の実施形態では、組込み核酸分子の２つの組換え後認識配列の一方又は両方が、（ｉ）ネイティブ認識配列、（ｉｉ）挿入ＤＮＡ上の認識配列、及び／又は（ｉｉｉ）疑似認識配列（例えば、ヒトＤＮＡ認識配列）の１つ若しくは複数（例えば、１つ、２つ若しくは３つ全部）と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５以上のミスマッチを含む。複数の実施形態では、組込み核酸分子の２つの組換え後認識配列の一方又は両方が、ネイティブ認識配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５以上のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ミスマッチは、コア配列中に存在する。一部の実施形態では、組込み核酸分子の認識配列と、ネイティブ認識配列、挿入ＤＮＡ認識配列及び／又はヒトＤＮＡ認識配列との間のこれらの相違により、認識配列、ネイティブ認識配列、挿入ＤＮＡ認識配列及び／又はヒトＤＮＡ認識配列に対するリコンビナーゼの結合及び／又は活性と比較して、リコンビナーゼポリペプチドと組込み核酸分子の認識配列との間の結合親和性の低下及び／又は組込み核酸分子の認識配列に対するリコンビナーゼポリペプチドのリコンビナーゼ活性の低下（例えば、排除）が起こることが考慮される。
一部の実施形態では、疑似認識配列（例えば、ヒトＤＮＡ認識配列）は、ゲノムセーフハーバー部位又はその付近（例えば、その１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００又は１０，０００ヌクレオチド以内）に位置する。一部の実施形態では、疑似認識配列（例えば、ヒト認識配列）は、以下の基準の１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９つを満たすゲノム内の位置に位置する：（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置すること；（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／他の機能性小分子ＲＮＡから＞３００ｋｂにあること；（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂにあること；（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂにあること；（ｖ）任意の超保存エレメントから＞５０ｋｂにあること；（ｖｉ）低転写活性を有する（即ちｍＲＮＡ＋／－２５ｋｂがない）こと；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではないこと；（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン中にあること；及び／又は（ｉｘ）ヒトゲノム中に１コピーを有し、ユニークであること。
複数の実施形態では、本明細書に記載される細胞又はシステムは、以下の１つ又は複数（例えば、１、２又は３つ）を含む：（ｉ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃ若しくは３Ｂの行番号Ｘを有する行に列挙されるリコンビナーゼポリペプチド（Ｘは、表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのいずれかの数字１から最大行番号である）又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｉｉ）表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの行番号Ｘを有する行の左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するＤＮＡ認識配列を含む挿入ＤＮＡ或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有する核酸配列（任意選択で、挿入ＤＮＡは、目的配列（例えば、異種目的配列）をさらに含む）；及び／又は（ｉｉｉ）表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列の配列に存在する疑似認識配列（例えば、ヒト認識配列）配列を含むゲノム或いはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有する核酸配列。
一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位、例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位は、利用可能なソフトウェアツールにより予測することができる。一部の実施形態では、認識部位は、ファージ予測ツール、例えば、ＰｈｉＳｐｙ（Ａｋｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（１６）：ｅ１２６（２０１２））又はＰＨＡＳＴＥＲ（Ａｒｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４：Ｗ１６－Ｗ２１（２０１６））（参照により本明細書に組み込まれる）により予測可能であり得る。一部の実施形態では、天然状況、例えば、バクテリオファージゲノム、プラスミド又は細菌ゲノム中のインテグラーゼコード配列の近接領域、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域又は右側領域は、リコンビナーゼ酵素のネイティブ付着部位を含む。一部の実施形態では、最小付着部位は、産生組換え反応に十分な最小配列が発見されるまで、インテグラーゼ近接配列の断片、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域又は右側領域を試験することにより実験的に発見することができる。一部の実施形態では、インテグラーゼ近接配列、例えば表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域又はその断片を検定して、各ヌクレオチドの重要性を決定し、例えば、Ｂｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０：１９３７（２０１９）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）の方法に従いライブラリーフォーマットでプロファイリングする。一部の実施形態では、リコンビナーゼ又はリコンビナーゼ認識部位は、改変されたタンパク質－核酸相互作用特性についての進化プロセスを介して選択され、例えば、国際公開第２０１７０１５５４５号パンフレット（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムに用いられるリコンビナーゼが進化される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ及び／又はリコンビナーゼ認識部位は、例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（１２）：１２６１－１２６６（２０１４）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ネイティブ宿主ゲノム中に組み込まれるエレメント、例えば、組み込まれるバクテリオファージ又は組み込まれるプラスミドの末端の予測を介して発見される。
一部の実施形態では、ａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位はヒトゲノム中に存在し、鋳型ＤＮＡは、コグネイト部位を含み、例えば、鋳型は、ゲノムがａｔｔＬ配列を含む場合、ａｔｔＲ配列を含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムにおいてａｔｔＬ／Ｒ認識部位が用いられる場合、システムは、それらの部位の認識及び組換えを可能にするための組換え方向性因子（ＲＤＦ）も含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド及びコグネイトＲＤＦは、融合ポリペプチドとして提供される。例示的なリコンビナーゼ－ＲＤＦ融合物は、Ｏｌｏｒｕｎｎｉｊｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５（１４）：８６３５－８６４５（２０１７）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムのタンパク質成分は、鋳型（例えば、ＤＮＡ鋳型）と予め会合させることができる。例えば、一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドを最初にＤＮＡ鋳型と組み合わせて、デオキシリボ核タンパク質（ＤＮＰ）複合体を形成することができる。一部の実施形態では、ＤＮＰは、トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス、ベシクル、ＬＮＰ、エキソソーム、フソソームを介して細胞に送達することができる。一部の実施形態では、鋳型ＤＮＡは、最初にＤＮＡ屈曲因子、例えばＨＭＧＢ１と会合させて、続いてトランスポザーゼ成分と接触した場合に切除及び転位を促進することができる。ＤＮＰ送達の追加の説明は、例えば、Ｇｕｈａ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０２０）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１つ又は複数の（例えば、２、３、４、５）の核ターゲティング配列、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳである。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳを含むタンパク質の細胞核への移入を促進する。一部の実施形態では、ＮＬＳは、本明細書に記載のＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒのＮ末端と融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒのＣ末端と融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＣａｓドメインのＮ末端又はＣ末端と融合される。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＮＬＳと、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの隣接ドメインとの間に配置される。
一部の実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列：ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号３４３２）、ＰＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３４３３）、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＷＫＲＰＲＫＰＫＫＫＲＫＶ ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３４３４）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号３４３５）又はＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号３４３６）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３４３７）又はその機能性断片若しくは変異体を含む。例示的なＮＬＳ配列は、ＰＣＴ／欧州特許第２０００／０１１６９０号明細書にも記載されており、その内容は、その例示的な核局在化配列の開示について、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＮＬＳは、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳである。双節型ＮＬＳは、典型的に、スペーサ配列によって隔てられる２つの塩基性アミノ酸クラスター（例えば、約１０アミノ酸長であり得る）を含む。単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳは、典型的に、スペーサを欠いている。双節型ＮＬＳの例は、配列ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号３４３７）（括弧内はスペーサ）を有するヌクレオプラスミンＮＬＳである。別の例示的な双節型ＮＬＳは、配列：ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３４３８）を有する。例示的なＮＬＳは、国際公開第２０２００５１５６１号パンフレット（核局在化配列に関する開示を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステム又は細胞に含まれる）、例えばチロシンリコンビナーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン又は鋳型結合ドメイン）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のリコンビナーゼポリペプチドをヒトゲノム中の規定標的部位に対して向け直すことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のリコンビナーゼを、異種ドメイン、例えば異種ＤＮＡ結合ドメインに融合させ得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼを、異種ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガー、ＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、転写因子又は配列誘導ＤＮＡ結合エレメントからのＤＮＡ結合ドメインに融合し得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼを、配列誘導ＤＮＡ結合エレメント、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＤＮＡ結合エレメント、例えば、Ｃａｓ９からのＤＮＡ結合ドメインと融合させ得る。一部の実施形態では、リコンビナーゼドメインと融合したＤＮＡ結合エレメントは、他の触媒機能を不活性化する突然変異、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を不活性化する突然変異、例えば、不活性化メガヌクレアーゼを生成するか、又はＣａｓタンパク質を部分的若しくは完全に不活性化する突然変異、例えば、ニッカーゼＣａｓ９若しくは不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を生成する突然変異を含み得る。一例として、Ｓｔａｎｄａｇｅ－Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ Ｊ ２（４）：２０９－２２２（２０１９）は、ＨＥＫ２９３細胞のゲノムへのリポータシステムの配列特異的組込みの協調ターゲティングのための標的部位で適切な間隔の２つのモノマー融合タンパク質を用いるＴｎ３レゾルバーゼ（インテグラーゼＣａｓ９、ｉＣａｓ９）に融合しているｄＣａｓ９の使用を記載している。ＤＮＡ結合ドメインによるリコンビナーゼターゲティングの追加の例として、ジンクフィンガー融合物（ジンクフィンガーリコンビナーゼ、ＺＦＲ（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１（６）：３９３７－３９４６（２０１３））；ＲｅｃＺＦ（Ｇｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８（１２）：４１９８－４２０６（２０１０）））、ＴＡＬＥ融合物（ＴＡＬＥリコンビナーゼ、ＴＡＬＥＲ（Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（２１）：１１１６３－１１１７２（２０１２）））及びｄＣａｓ９融合物（リコンビナーゼＣａｓ９、ｒｅｃＣａｓ９（Ｃｈａｉｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４（２０）：９７５８－９７７０（２０１６））；インテグラーゼＣａｓ９、ｉＣａｓ９（Ｓｔａｎｄａｇｅ－Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ Ｊ ２（４）：２０９－２２２（２０１９）））（その全てが、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）又はその機能性断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、修飾ＳｐＣａｓ９を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサ－隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を改変する修飾を含む。複数の実施形態では、ＰＡＭは、核酸配列５’－ＮＧＴ－３’に対する特異性を有する。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、例えば、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２又はＲ１３３５の１つ若しくは複数の位置に、１つ若しくは複数のアミノ酸置換を含み、それは、例えば、Ｌ１１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｖから選択される。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、アミノ酸置換Ｔ１３３７Ｒと、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｔ１３３７、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｑ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ及びＴ１３３７Ｍ又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、（ｉ）Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ及びＴ１３３７から選択される１つ若しくは複数のアミノ酸置換；並びに（ｉｉ）Ｌ１１１１Ｒ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｒ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ及びＴ１３３７Ｍ又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓドメイン、例えばＣａｓ９ドメインを含む。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓドメイン、Ｃａｓニッカーゼ（ｎＣａｓ）ドメイン又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ（ｄＣａｓ）を含む。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９ドメイン、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９のＣａｓ９ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）若しくはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５，７２６－７３７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｃａｓ９配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ、例えば、本明細書に記載されるように、Ｃａｓ９又はその変異体のＨＮＨヌクレアーゼサブドメイン及び／又はＲｕｖＣ１サブドメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓポリペプチド（例えば、酵素）又はその機能性断片を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓポリペプチド（例えば酵素）は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（例えば、Ｃｓｎ１若しくはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、超精密（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９変異体（ＨｙｐａＣａｓ９）、それらの相同体、それらの修飾若しくは操作バージョン及び／又はそれらの機能性断片から選択される。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ及びＤ１１２７Ａから選択される１つ又は複数の置換を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６及び／又はＡ９８７から選択される位置に１つ若しくは複数の突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ及び／又はＤ９８６Ａから選択される１つ若しくは複数の置換を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）、ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）、サイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）、スタフィロコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）若しくは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）又はその機能性断片若しくは変異体に由来するＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、位置：Ｄ９１７、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５又はそれらの任意の組合せに、例えば、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ及びＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａから選択される、１つ若しくは複数の置換を含む、Ｃｐｆ１ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ、ｘＣａｓ９（ｓｐ）、ｓａＣａｓ９、ｓａＣａｓ９－ＫＫＨ、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、ｓｐＣａｓ９－ＬＲＫＩＱＫ又はｓｐＣａｓ９－ＬＲＶＳＱＬを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、以下の表３７に列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０以下の相違（例えば、突然変異）を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2023502473000738
Figure 2023502473000739
Figure 2023502473000740
一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン結合を指令するｇＲＮＡと結合する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、５’から３’に、（１）ｇＲＮＡスペーサ；（２）ｇＲＮＡスカフォールドを含む。一部の実施形態では：
（１）は、約１８～２２ｎｔのＣａｓ９スペーサであり、例えば、２０ｎｔである。
（２）は、鋳型をニッカーゼＣａｓ９ドメインと結合させるための１つ又は複数のループ、例えば、１、２若しくは３つのループを含むｇＲＮＡスカフォールドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスカフォールドは、５’から３’に、配列：
ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣ（配列番号３４４４）
を担持する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、Ｕ２ＯＳ又はＨｅＬａ細胞に編集を実施する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを使用して、初代細胞、例えば、Ｅ１８．５マウスからの初代皮質ニューロンに編集を実施する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステム又は方法は、米国特許出願公開第２０２０００６３１２６号明細書、米国特許出願公開第２０１９０００２８８９号明細書若しくは米国特許出願公開第２０１９０００２８７５号明細書（それらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡターゲティング酵素若しくはシステム又はその機能性断片若しくは変異体を含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチド又はＣａｓエンドヌクレアーゼは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載のポリペプチド配列を含み、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、本段落で挙げたいずれかの出願に記載の核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン又は鋳型結合ドメイン）は、メガヌクレアーゼドメイン又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼ活性、例えば、二本鎖切断及び／又はニッカーゼ活性を有する。他の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、低下した活性を有し、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を欠失しており、例えば、メガヌクレアーゼは、触媒活性が欠失している。一部の実施形態では、例えば、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（２）：８４７－８６０（２０１２）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、触媒活性が欠失したメガヌクレアーゼをＤＮＡ結合ドメインとして使用する。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、野生型ＤＮＡ結合ドメインに対して１つ又は複数の修飾、例えば、指向性方向進化、例えば、ファージ支援連続進化（ＰＡＣＥ）による修飾を含む。
インテイン
一部の実施形態では、以下にさらに詳しくされるように、インテイン－Ｎを、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド）のＮ－末端部分と、例えば、第１ドメインで、融合させることができる。複数の実施形態では、インテイン－Ｃを本明細書に記載されるポリペプチドのＣ－末端部分と（例えば、第２ドメインで）融合させて、例えば、Ｎ－末端部分をＣ－末端部分と連結し、それにより、第１ドメインと第２ドメインを連結することもできる。一部の実施形態では、第１ドメイン及び第２ドメインは、各々独立して、ＤＮＡ結合ドメイン及び触媒ドメイン、例えばリコンビナーゼドメインから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のインテイン戦略、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばｄＣａｓ９ドメインを用いて、単一ドメインを分断する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、例えば、フランキングするＮ－末端及びＣ－末端エクステイン（例えば、連結しようとする断片）を連結する、自己スプライシングタンパク質イントロン（例えば、ペプチド）であるインテインを含む。インテインは、いくつかの事例では、自動的に切除されて、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスで、残りの断片（エクステイン）をペプチド結合と連結させることができるタンパク質の断片を含み得る。インテインは、「タンパク質イノン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｏｎ）」とも呼ばれる。自動的に切除されて、タンパク質の残り部分を連結させるインテインのプロセスは、本明細書では、「タンパク質スプライシング」又は「インテイン媒介性タンパク質スプライシング」と称される。一部の実施形態では、前駆体タンパク質（インテイン媒介性タンパク質スプライシング前のインテイン含有タンパク質）のインテインは、２つの遺伝子に由来する。こうしたインテインは、本明細書において、スプリットインテイン（例えば、スプリットインテイン－Ｎ及びスプリットインテイン－Ｃ）と呼ばれる。例えば、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの触媒サブユニットであるＤｎａＥは、２つの個別の遺伝子、ｄｎａＥ－ｎ及びｄｎａＥ－ｃによってコードされる。ｄｎａＥ－ｎ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「インテイン－Ｎ」と呼ばれ得る。ｄｎａＥ－ｃ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では「インテイン－Ｃ」と呼ばれ得る。
異種タンパク質断片を連結するためのインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２－９（２０１４）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、個別のタンパク質断片に融合されると、インテインＩｎｔＮ及びＩｎｔＣは、互いを認識し、それ自体からスプライシングして、且つ／又は同時に、それらが融合されているタンパク質断片のＮ－及びＣ－末端エクステインを連結し、それにより、２つのタンパク質断片から完全長タンパク質を再構成することができる。
一部の実施形態では、ｄｎａＥインテイン、Ｃｆａ－Ｎ（例えば、スプリットインテイン－Ｎ）及びＣｆａ－Ｃ（例えば、スプリットインテイン－Ｃ）インテイン対に基づく合成インテインを使用する。こうしたインテインの例は、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１６ Ｆｅｂ．２４；１３８（７）：２１６２－５（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本開示に従って使用することができるインテイン対の非限定的な例として、Ｃｆａ ＤｎａＥインテイン、Ｓｓｐ ＧｙｒＢインテイン、Ｓｓｐ ＤｎａＸインテイン、Ｔｅｒ ＤｎａＥ３インテイン、Ｔｅｒ ＴｈｙＸインテイン、Ｒｍａ ＤｎａＢインテイン及びＣｎｅ Ｐｒｐ８インテイン（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３９４，６０４号明細書に記載されるような）が挙げられる。
一部の実施形態では、インテイン－Ｎ及びインテイン－Ｃは、スプリットＣａｓ９のＮ－末端部分とスプリットＣａｓ９のＣ－末端部分との連結のために、スプリットＣａｓ９のＮ－末端部分及びスプリットＣａｓ９のＣ－末端部分にそれぞれ融合し得る。例えば、一部の実施形態では、インテイン－ＮをスプリットＣａｓ９のＮ－末端部分のＣ－末端に融合させ、即ちＮ－［スプリットＣａｓ９のＮ－末端部分］－［インテイン－Ｎ］～Ｃの構造を形成する。一部の実施形態では、インテイン－ＣをスプリットＣａｓ９のＣ－末端部分のＮ－末端に融合させ、即ちＮ－［インテイン－Ｃ］～［スプリットＣａｓ９のＣ－末端部分］－Ｃの構造を形成する。インテインが連結したタンパク質（例えば、スプリットＣａｓ９）を連結させるためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０１４；５（ｌ）：４４６－４６ｌ（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。インテインを設計及び使用する方法は、例えば、国際公開第２０２００５１５６１号パンフレット、国際公開第２０１４００４３３６号パンフレット、国際公開第２０１７１３２５８０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５０３４４５４９号明細書及び米国特許出願公開第２０１８０１２７７８０号明細書（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、スプリットは、２つ以上の断片中の分割を指す。一部の実施形態では、スプリットＣａｓ９タンパク質又はスプリットＣａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質であり、これは、２つの個別のヌクレオチド配列によりコードされるＮ－末端断片及びＣ－末端断片として提供される。Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端部分及びＣ－末端部分に対応するポリペプチドはスプライシングされて、再構成Ｃａｓ９タンパク質を形成し得る。複数の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １５６，Ｉｓｓｕｅ ５，ｐｐ．９３５－９４９，２０１４に記載されているか、又はＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：８６７－８７１及びＰＤＢ ｆｉｌｅ：５Ｆ９Ｒに記載されている（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ように、タンパク質の変性領域内で２つの断片に分割される。変性領域は、当技術分野で公知の１つ又は複数のタンパク質構造決定技術により決定することができ、そうしたものとして、限定はしないが、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光法、電子顕微鏡法（例えば、ｃｒｙｏＥＭ）及び／又はインシリコタンパク質モデル化が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、アミノ酸Ａ２９２－Ｇ３６４、Ｆ４４５－Ｋ４８３若しくはＥ５６５－Ｔ６３７間のＳｐＣａｓ９の領域内の任意のＣ、Ｔ、Ａ若しくはＳ或いはいずれかの他のＣａｓ９、Ｃａｓ９変異体（例えば、ｎＣａｓ９、ｄＣａｓ９）又は他のｎａｐＤＮＡｂｐ内の対応する位置で、２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳｐＣａｓ９ Ｔ３１０、Ｔ３１３、Ａ４５６、Ｓ４６９又はＣ５７４で２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質を２つの断片に分割するプロセスは、タンパク質の分断と呼ばれる。
一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２～１０００アミノ酸（例えば、２～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００又は９００～１０００アミノ酸）の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約５～５００アミノ酸（例えば、５～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００又は４００～５００アミノ酸）の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２０～２００アミノ酸（例えば、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００又は１００～２００アミノ酸）の範囲である。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドの部分又は断片をインテインと融合させる。ヌクレアーゼをインテインのＮ－末端又はＣ－末端と融合させることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質の部分又は断片をインテインと融合させると共に、ＡＡＶカプシドタンパク質と融合させる。インテイン、ヌクレアーゼ及びカプシドタンパク質を、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で一緒に融合させることができる。一部の実施形態では、インテインのＮ－末端を融合タンパク質のＣ－末端と融合させ、インテインのＣ－末端をＡＡＶカプシドタンパク質のＮ－末端と融合させる。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、ニッカーゼＣａｓ９ドメインを含む）をインテイン－Ｎと融合させ、ポリメラーゼドメインを含むポリペプチドをインテイン－Ｃに融合させる。
インテインの例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下に記載する：
ＤｎａＥインテイン－Ｎ ＤＮＡ：
Figure 2023502473000741
ＤｎａＥインテイン－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号３４４６）
ＤｎａＥインテイン－Ｃ ＤＮＡ：
ＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴ（配列番号３４４７）
インテイン－Ｃ：
ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号３４４８）
Ｃｆａ－Ｎ ＤＮＡ：
Figure 2023502473000742
Ｃｆａ－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号３４５０）
Ｃｆａ－Ｃ ＤＮＡ：
Figure 2023502473000743
Ｃｆａ－Ｃタンパク質：
ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号３４５２）
ゲノムセーフハーバー部位
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ゲノムセーフハーバー部位をターゲティングする（例えば、異種目的配列の挿入を、少なくとも３、４、５、６、７若しくは８つのセーフハーバースコアを有する位置に向ける）。一部の実施形態では、ゲノムセーフハーバー部位は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、可動遺伝子エレメント、例えば、リコンビナーゼ、トランスポゾン、レトロトランスポゾン又はレトロウイルスのネイティブ標的に由来する。可動エレメントのネイティブ標的は、それらの進化的選択を考慮すると、ゲノム組込みのための理想的な位置として役立ち得る。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５ＳｒＤＮＡ、１８ＳｒＤＮＡ、５．８ＳｒＤＮＡ又は２８ＳｒＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５ＳｒＤＮＡ内のＭｕｔｓｕ部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、２８ＳｒＤＮＡ内のＲ２部位、Ｒ５部位、Ｒ６部位、Ｒ４部位、Ｒ１部位、Ｒ９部位又はＲＴ部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、１８ＳｒＤＮＡ内のＲ８部位又はＲ７部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、ｔＲＮＡ－Ａｓｐ又はｔＲＮＡ－ＧｌｕをコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、スプライソソームＲＮＡをコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、Ｕ２ｓｎＲＮＡなどの低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。
従って、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、異種目的配列をＮａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位に挿入することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、以下の表４Ａに記載する部位である。一部の実施形態では、異種目的配列は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００又は１０００塩基対内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位の０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ又は１００ｋｂ内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４Ａに示す配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する部位に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４Ａに示す配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する部位の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００若しくは１０００塩基対内又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ若しくは１００ｋｂ内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４Ａの第５列に示す遺伝子内又はその遺伝子の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００若しくは１０００塩基対内又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ若しくは１００ｋｂ内に挿入される。
Figure 2023502473000744
Figure 2023502473000745
Figure 2023502473000746
Figure 2023502473000747
Figure 2023502473000748
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）のさらなる機能的特徴
本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、いくつかの事例において、１つ若しくは複数の機能的測定又は特徴によって特性決定され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン）は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、鋳型（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによって改変された標的部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによる改変後、以下に記載する機能的特徴の１つ又は複数を有する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド
ＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標準ＤＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。一部の実施形態では、標準ＤＮＡ結合ドメインは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）バクテリオファージｐｈｉＣ３１由来のｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば熱泳動によりインビトロで測定される。
複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、モル過剰の、例えば、約１００倍モル過剰のスクランブル配列競合ｄｓＤＮＡの存在下において、例えば１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えばＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で）により測定して、標的細胞、例えばヒト標的細胞のゲノム中のいずれかの他の配列よりも高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、前掲したＨｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）に記載されているように、例えばＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で）により測定して、標的細胞のゲノム中のいずれかの他の配列より少なくとも５倍又は１０倍高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。
鋳型結合ドメイン
一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、標準ＤＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、鋳型ＤＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、標準ＤＮＡ結合ドメインは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）バクテリオファージｐｈｉＣ３１由来のｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、鋳型結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、鋳型ＤＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＤＮＡに対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば熱泳動によりインビトロで測定される。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＤＮＡに対する親和性は、細胞中で（例えば、ＦＲＥＴ又はＣｈＩＰ－Ｓｅｑにより）測定される。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４（２０）：９２３９－９２４７（２００４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、１０ｎＭ競合ＤＮＡの存在下で、少なくとも５０％鋳型ＤＮＡが結合した状態で、インビトロで鋳型ＤＮＡと会合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、スクランブルＤＮＡとの場合よりも、少なくとも約５倍又は１０倍高い頻度で、細胞中（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中）の鋳型ＤＮＡと会合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインと鋳型ＤＮＡ又はスクランブルＤＮＡとの会合の頻度は、例えば、前掲のＨｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）に記載されているように、ＣｈＩＰ－ｓｅｑにより測定される。
標的部位
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ後、組込み配列の周囲の標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシングにより決定して、例えば、約５０％若しくは１０％未満の組込み事象に、限定的な数の挿入又は欠失を含む。例えば、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１（１２）：３９２６－３９３４（２００１）（その教示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼによるヒトゲノム疑似部位への挿入ＤＮＡの組込み後にインデルが観察されている。一部の実施形態では、本発明のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、２０ｎｔ未満、例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満又は１ｎｔ未満のＤＮＡを含む標的部位（例えば、挿入ＤＮＡの組込みに隣接する、例えば挿入ＤＮＡ組込みの部位）のゲノム修飾（例えば、挿入又は欠失）をもたらし得る。一部の実施形態では、本発明のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、２０ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満又は１ヌクレオチド又は塩基対未満のＤＮＡを含む標的部位（例えば、挿入ＤＮＡの組込みに隣接する、例えば挿入ＤＮＡ組込みの部位）の挿入をもたらし得る。一部の実施形態では、本発明のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、２０ヌクレオチド又は塩基対未満、例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満又は１ヌクレオチド又は塩基対未満のゲノムＤＮＡを含む標的部位（例えば、挿入ＤＮＡの組込みに隣接する、例えば挿入ＤＮＡ組込みの部位）の欠失をもたらし得る。一部の実施形態では、挿入又は欠失事象の割合は、標的部位の認識配列、例えばａｔｔＢ、ａｔｔＰ又はその疑似部位のコア領域、例えば中央ジヌクレオチドが挿入ＤＮＡ上の認識配列、例えばａｔｔＰ又はａｔｔＢ部位のコア領域、例えば、中央ジヌクレオチドと１００％の同一性を含む場合により低い。一部の実施形態では、意図されない挿入又は欠失事象の割合は、標的部位の認識配列の中央ジヌクレオチドが挿入ＤＮＡ中の認識配列の中央ジヌクレオチドと同一である場合、標的ゲノム部位において、例えば少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は少なくとも１００倍、より低い。
一部の実施形態では、標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング（実施例２９）により決定して、多重挿入事象、例えば、頭－尾又は頭－頭重複を示さない。一部の実施形態では、標的部位は、標的部位で１００挿入コピー未満、例えば７５挿入コピー、５０挿入コピー、４５挿入コピー、４０挿入コピー、３５挿入コピー、３０挿入コピー、２５挿入コピー、２０挿入コピー、１５挿入コピー、１４挿入コピー、１３挿入コピー、１２挿入コピー、１１挿入コピー、１０挿入コピー、９挿入コピー、８挿入コピー、７挿入コピー、６挿入コピー、５挿入コピー、４挿入コピー、３挿入コピー、２挿入コピー又は単一挿入コピーを示す。一部の実施形態では、挿入配列の２コピー以上を示す標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング（実施例２９）により決定して、挿入物を含有する標的部位の９５％未満、例えば挿入物を含有する標的部位の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％未満又は１％未満に存在する。一部の実施形態では、挿入配列の３コピー以上を示す標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング（実施例２９）により決定して、挿入物を含有する標的部位の９５％未満、例えば挿入物を含有する標的部位の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％未満又は１％未満に存在する。一部の実施形態では、挿入配列の４コピー以上を示す標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング（実施例２９）により決定して、挿入物を含有する標的部位の９５％未満、例えば挿入物を含有する標的部位の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％未満又は１％未満に存在する。一部の実施形態では、標的部位は、１標的部位当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピー以上を示す。一部の実施形態では、挿入配列の複数のコピーを示す標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング（実施例２９）により決定して、挿入物を含有する標的部位の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上に存在する。一部の実施形態では、コピーは、コンカテマーであり、即ちコンカテマー化される。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＤＮＡ（例えば、プラスミド全体、ミニサークル又はウイルスベクターゲノム）に対応する組込み配列を含有する。一部の実施形態では、標的部位は、完全に組み込まれた鋳型分子を含有する。一部の実施形態では、標的部位は、ベクターＤＮＡ、例えばＡＡＶ ＩＴＲの成分を含有する。一部の実施形態では、標的部位は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＩＴＲを組込み後に含有する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲが組込み後に標的部位の少なくとも１％に存在し、例えば、組込み後に標的部位の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％に存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲが、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング（実施例２９）により決定して、組込み後に標的部位の５０％未満に存在し、例えば、組込み後に標的部位の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％未満又は１％未満に存在する。一部の実施形態では、複数のコピーは、頭－頭、尾－尾若しくは頭－尾配置又はそれらの混合で配置される。一部の実施形態では、例えば、組込み前の第１組換え事象により、鋳型ＤＮＡがウイルスベクター又はプラスミドから最初に切除される場合、標的部位は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えば標的部位のロングリードアンプリコンシーケンシング又は分子コーミング（実施例２９）により決定して、事象の約５０％超に、例えば、事象の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％超又は約１％超に、認識部位フランキングカセットに対して外性のＤＮＡを含む挿入物、例えばベクターＤＮＡ、例えばＡＡＶ ＩＴＲを含有しない。一部の実施形態では、組み込まれたＤＮＡは、いかなる細菌抗生物質耐性遺伝子も含まない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムにより標的部位で組み込まれるＤＮＡは、末端ハイブリッド認識配列（例えば、本明細書に記載されるように、例えば第１及び／又は第２パラパリンドローム配列）、例えば挿入ＤＮＡの認識部位間の組換えにより形成されるａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列、例えば挿入ＤＮＡのａｔｔＰ又はａｔｔＢ及び標的ＤＮＡ中の認識部位、例えば、ａｔｔＰ若しくはａｔｔＢ部位又はその疑似部位を含む。一部の実施形態では、組込みＤＮＡは、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲ配列間の１つ又は複数のＩＴＲ、例えば１、２、３、４つ以上のＩＴＲを含む。一部の実施形態では、組込みＤＮＡを有する標的部位の少なくとも１％、例えば、組込みＤＮＡの少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％が、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列間のＩＴＲを含む。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲ配列間のＩＴＲを含む組込みＤＮＡは、挿入ＤＮＡの単一コピーを含み、例えば、モノマー挿入物である。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列を含み、いかなる内部ＩＴＲも欠く。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列並びに単一の内部ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列並びに複数の内部ＩＴＲ、例えば、２つの内部ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列間のＩＴＲを含む組み込まれるＤＮＡは、挿入ＤＮＡの複数のコピーを含み、例えばコンカテマー挿入物である。一部の実施形態では、コンカテマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列並びに挿入ＤＮＡの少なくとも２コピー、例えば少なくとも２、３又は４コピーを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの少ないコピー数を含む、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列を含む挿入物は、挿入ＤＮＡのより多いコピー数を有するものと比較して高い頻度で存在し（例えば、１コピーを有する挿入物は２コピーを有する挿入物よりも高い頻度で存在し、２コピーを有する挿入物は３コピーを有する挿入物よりも高い頻度で存在するか、又は１コピーを有する挿入物は３コピーを有する挿入物よりも高い頻度で存在する）、より高い発生頻度を示し、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、モノマー挿入物は、ダイマー挿入物よりも高い頻度で存在し、例えば、ダイマー挿入物よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、ダイマー挿入物は、トリマー挿入物よりも高い頻度で存在し、例えば、トリマー挿入物よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、モノマーとダイマー挿入物は、コンカテマー挿入物（３つ以上の挿入物）よりも高い頻度で存在し、例えば、コンカテマー挿入物よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍以上頻度が高い。一部の実施形態では、コンカテマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列並びに１つ又は複数の内部リコンビナーゼ認識配列、例えば１、２、３、４つ以上の内部認識配列、例えばａｔｔＢ又はａｔｔＰ配列を含む。一部の実施形態では、コンカテマー挿入物は、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列並びに１つ又は複数の内部ＩＴＲ、例えば１、２、３、４、５、６つ以上の内部ＩＴＲを含む。本明細書に記載される挿入ＤＮＡのコピー数、認識配列及びＩＴＲ並びにそれらの成分の相対的位置決めは、実施例２９及びＫａｙｋｏｖ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：１９６３６（２０１６）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、分子コーミングを用いて決定することができる。
一部の実施形態では、組み込まれるＤＮＡが末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列を含まない挿入事象が生じ得る。一部の実施形態では、組み込まれるＤＮＡは、１つの末端認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲ配列を含み得る。一部の実施形態では、組み込まれるＤＮＡは、いかなる末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲも有しなくてよく、例えば組み込まれるＤＮＡのいずれの末端もハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲ配列を含まない。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲ配列を含まない組み込まれるＤＮＡは、挿入ＤＮＡの断片（例えば、不完全な挿入ＤＮＡ、例えば不完全なプロモータ、遺伝子又は異種目的配列を有する挿入ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲ配列を含まない組み込まれるＤＮＡは、不完全な複数の挿入ＤＮＡ配列を含み、例えば１未満、１超及び２未満、２超及び３未満、３超及び４未満又は完全挿入ＤＮＡの別の不完全な複数のコピーを含有する。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの使用後、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列を含む新たに組み込まれるＤＮＡは、本明細書に記載されるアッセイ、例えば、ロングリードシーケンシング又は分子コーミングにより測定して、細胞又は細胞の集団に高い頻度で存在し、例えば１つ又はいくつかの末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＲ配列を含む新たに組み込まれるＤＮＡと比較して総挿入事象の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．５％超又は９９．９％超を構成する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの使用後、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列を含む新たに組み込まれるＤＮＡは、１つ又はいくつかの末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＰ配列を含む組込み事象の平均挿入ＤＮＡコピー数と比較して、１挿入事象当たりの低い平均挿入ＤＮＡコピー数を含み、例えば平均で１挿入事象当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５又は２．０コピー少なく含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの使用後、末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列を含む新たに組み込まれるＤＮＡは、１つ又はいくつかの末端ハイブリッド認識配列、例えばａｔｔＬ又はａｔｔＰ配列を含む挿入ＤＮＡ配列のパーセンテージと比較して、高いパーセンテージの完全挿入ＤＮＡ配列を含み、例えば少なくとも０．１×、０．２×、０．３×、０．４×、０．５×、０．６×、０．７×、０．８×、０．９×、１．０×、１．５×、２．０×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×以上のパーセントの完全挿入ＤＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、標的ＤＮＡの部位特異的編集、例えば、標的ＤＮＡへの鋳型ＤＮＡの挿入が可能である。一部の実施形態では、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、編集、例えば、挿入を作製することができ、それは、そのゲノム中のいずれかの他の部位より高い頻度で標的部位に存在する。一部の実施形態では、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、ヒトゲノム中の全ての他の部位の頻度の少なくとも２、３、４、５、１０、５０、１００若しくは１０００倍の頻度で、標的部位に編集、例えば、挿入を作製することができる。一部の実施形態では、組込み部位の位置は、例えば、実施例１８におけるように、一方向シーケンシングにより決定される。ライブラリー調製に使用されるアダプター又はプライマーへのユニークな分子識別子（ＵＭＩ）の組込みにより、個別の挿入事象の定量が可能になり、それをオンターゲット挿入及び他全ての挿入間で比較して、規定標的部位に対する優先性を決定することができる。一部の実施形態では、インバースＰＣＲアプローチを用いて、例えば実施例３０におけるように、特定のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒによりターゲティングされる組込み部位を決定する。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、ヒトゲノム中の単一位置に存在する標的ＤＮＡ配列を編集する。一部の実施形態では、単一相同性染色体上のヒトゲノム中の単一位置に存在する標的ＤＮＡ配列を編集するために、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇが使用され、例えば、これは、ハロタイプ特異的である。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、２つの相同性染色体上のヒトゲノム中の単一位置に存在する標的ＤＮＡ配列を編集する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、ゲノム中の複数の位置、例えば、ゲノム中の少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１００００、１０００００、２０００００、５０００００、１００００００（例えば、Ａｌｕ元素）の位置に存在する、標的ＤＮＡ配列を編集する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、１つ又は複数の位置に存在し得るヒトゲノム中の単一標的配列で組込みを実施する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、ヒトゲノム中の少なくとも１回存在する複数の配列で組込みを実施し、例えば１超、例えば１、２、３、４、５、１０、２０、５０若しくは１００超の配列又はヒトゲノム中の少なくとも１回存在する１００未満、例えば１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０若しくは５未満の配列を認識する。従って、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、１細胞当たり少なくとも１コピー、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは少なくとも１０コピー又は１細胞当たり１０コピー未満、例えば１０、９、８、７、６、５、４、３未満若しくは２コピー未満で挿入ＤＮＡの組込みをもたらし得る。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、望ましくない突然変異を導入することなく、ゲノムを編集することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、鋳型、例えば、鋳型ＤＮＡをゲノムに挿入することにより、ゲノムを編集することができる。一部の実施形態では、ゲノム中に得られた修飾は、鋳型ＤＮＡ配列に対して最小限の突然変異を含む。一部の実施形態では、鋳型ＤＮＡと比較したゲノム挿入の平均誤り率は、１ヌクレオチド当たり１０－４、１０－５又は１０－６未満の突然変異である。一部の実施形態では、標的細胞に導入される鋳型ＤＮＡに対する突然変異の数は、平均して、１ゲノム当たり１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド未満である。一部の実施形態では、標的ゲノムにおける挿入の誤り率は、例えば、前掲のＫａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、既知標的部位にわたるロングリードアンプリコンシーケンシング後、鋳型ＤＮＡ配列と比較することにより決定される。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド欠失を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド挿入を含む。一部の実施形態では、この方法により計数される誤りは、鋳型配列に対するヌクレオチド置換、欠失又は挿入の１つ又は複数の組合せを含む。
組込み事象の効率を、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムによる標的部位又は標的細胞の編集の尺度として使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、標的部位又は標的細胞の画分に異種目的配列を組み込むことができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、標的全体を増幅した後、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）に記載されているように、例えばロングリードアンプリコンシーケンシングにより解析した場合、編集物の検出により測定して、標的遺伝子座の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％を編集することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５）：１９７－２０８（２０１６）に記載の方法に従い、例えば、トランスジーン特異的プライマー－プローブセットを用いるｄｄＰＣＲにより決定した場合、細胞の集団全体で、標準遺伝子、例えばＲＰＰ３０に対して正規化して、１ゲノム当たり少なくとも０．１、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０若しくは１００コピーの平均コピー数で、細胞を編集することができる。
一部の実施形態では、１細胞当たりのコピー数は、例えば、Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ６：８－１６（２０１７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の方法に従い、単一細胞ｄｄＰＣＲ（ｓｃ－ｄｄＰＣＲ）により分析される。一部の実施形態では、トランスジーン特異的プライマー－プローブセットを用いたｓｃ－ｄｄＰＣＲにより評価して、標的細胞の少なくとも１％、例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％が、組込みについて陽性である。一部の実施形態では、平均コピー数は、トランスジーン特異的プライマー－プローブセットを用いたｓｃ－ｄｄＰＣＲにより測定して、１細胞当たり少なくとも０．１、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０又は１００コピーである。
一部の実施形態では、標的部位は、核酸配列のペアを含み、核酸配列の一方は他方の核酸配列に対して回文であるか、又は他方の核酸配列に対する回文と少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）、例えば少なくとも５０％の配列同一性を有するか、若しくは他方の核酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列ミスマッチを有する。
挿入ＤＮＡ
一部の実施形態では、本明細書に記載される挿入ＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるように、例えばリコンビナーゼポリペプチド（例えば、セリンリコンビナーゼポリペプチド）により、標的ＤＮＡ分子に組み込むことができる核酸配列を含む。挿入ＤＮＡは、典型的に、システムの１つ又は複数のリコンビナーゼポリペプチド（例えば、リコンビナーゼポリペプチドの複数のコピー）に結合することができる。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、リコンビナーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載の認識配列）に結合することができる領域を含む。
挿入ＤＮＡは、一部の実施形態では、標的ＤＮＡに挿入するための目的配列を含む。目的配列は、コーディング又はノンコーディングのいずれでもあり得る。一部の実施形態では、目的配列は、オープンリーディングフレームを含み得る。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、コザック配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、内部リボソーム進入部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ部位などの自己切断ペプチドを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、開始コドンを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、スプライスアクセプター部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、スプライスドナー部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、例えば、停止コドンの下流に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、例えば、オープンリーディングフレームの停止コドンの下流に、ポリＡテイルを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、１つ又は複数のエキソンを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、真核生物転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、増強された翻訳エレメント又は翻訳増強エレメントを含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ配列、ガイドＲＮＡ配列、ｐｉｗｉＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、エフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節領域から構成される遺伝子発現単位を含む。エフェクター配列は、ＲＮＡに転写される配列（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡをコードする配列などのコーディング配列又はノンコーディング配列）であり得る。一部の実施形態では、目的配列は、ノンコーディング配列を含み得る。例えば、挿入ＤＮＡは、プロモータ又はエンハンサー配列を含み得る。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含み、その各々は、一方向又は二方向であり得る。一部の実施形態では、プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、プロモータは、ＴＡＴＡエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、Ｂ認識エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、転写因子のための１つ又は複数の結合部位を有する。
一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、内在性イントロン中の標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、標的ゲノムに挿入され、それにより、新たなエキソンとして作用する。一部の実施形態では、標的ゲノムへの目的配列の挿入により、天然のエキソンの置換又は天然のエキソンのスキッピングが起こる。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５又はＲＯＳＡ２６などのゲノムセーフハーバー部位中の標的部位に挿入される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、遺伝子間又は遺伝子内領域内のゲノムに付加される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、内在性活性遺伝子から０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ若しくは１００ｋｂ内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、内在性プロモータ又はエンハンサーから０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ若しくは１００ｋｂ内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、例えば、５０～５０，０００塩基対（例えば、５０～４０，０００ｂｐ、５００～３０，０００ｂｐ、５００～２０，０００ｂｐ、１００～１５，０００ｂｐ、５００～１０，０００ｂｐ、５０～１０，０００ｂｐ、５０～５０，０００ｂｐであり得る。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡの目的配列は、１～５０塩基対）であり得る。
特定の実施形態では、挿入ＤＮＡは、例えば、異種コーディング領域をゲノム中に導入し；エキソン構造／選択的スプライシングに影響を与えるか若しくはそれをもたらし；内在性遺伝子の破壊を引き起こし；内在性遺伝子の転写活性化を引き起こし；内在性ＤＮＡのエピジェネティック調節をもたらし；作動可能に連結した遺伝子の上方若しくは下方制御をもたらすことにより、標的細胞若しくは標的生物のゲノム機能を改変又は規定する配列を含むように、同定、設計、操作及び構成することができる。特定の実施形態では、挿入ＤＮＡは、エキソン及び／又はトランスジーンをコードする配列を含み、転写因子アクチベータ、リプレッサー、エンハンサーなど、及びそれらの組合せに対する結合部位を賦与するように、操作することができる。他の実施形態では、コーディング配列を、スプライスアクセプター部位、ポリ－Ａテイルでさらにカスタマイズすることもできる。
挿入ＤＮＡは、標的ＤＮＡに対してある程度の相同性を有し得る。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、標的ＤＮＡ又はその部分に対して厳密な相同性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０以上の塩基を有する。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、標的ＤＮＡ又はその部分に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％相同性の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００以上の塩基を有する。
本明細書に記載される送達の他の方法に代わるものとして、一部の実施形態では、細胞に送達される核酸（例えば、リコンビナーゼをコードする核酸若しくは鋳型核酸又は両方）はミニサークルとして設計され、この場合、細胞への投与前に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）に関連しないプラスミドバックボーン配列を除去する。ミニサークルは、細菌部分（例えば、細菌の複製起点、抗生物質選択カセット）を含むバックボーンを有するプラスミドと比較して、より高いトランスフェクション効率及び遺伝子発現を達成することが証明されており、転位の効率を改善するために使用されている（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：Ｅ７４（２０１３））。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターは、ミニサークルとして送達される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）鋳型を含有するＤＮＡベクターは、ミニサークルとして送達される。核酸を送達するためのそうした代替手段の一部の実施形態では、細菌部分は、組換え部位、例えば、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ部位によってフランキングされる。一部の実施形態では、コグネイトリコンビナーゼの付加により、分子内組換え及び細菌部分の切除が起こる。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ部位は、ＦＬＰリコンビナーゼにより認識される。一部の実施形態では、ミニサークルは、細菌生産株、例えば、誘導性ミニサークルアセンブリング酵素を安定に発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えばＫａｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８（１２）：１２８７－１２８９（２０１０）に従う生産株中に生成される。ミニサークルＤＮＡベクター調製物及び生成の方法は、米国特許第９２３３１７４号明細書（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
プラスミドＤＮＡ以外にも、ウイルスバックボーン、例えばＡＡＶベクターから、所望の構築物、例えばリコンビナーゼ発現カセット又は治療用発現カセットを切除することにより、ミニサークルを作製することができる。これまでに、ウイルスバックボーンからのドナー配列の切除及び環状化が、トランスポザーゼ媒介性組込み効率にとって重要であり得ることが明らかにされている（Ｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０（１０）：９９９－１００５（２００２））。一部の実施形態では、まずミニサークルを製剤化し、次に、標的細胞に送達する。他の実施形態では、リコンビナーゼの同時送達により、リコンビナーゼ認識部位にフランキングする核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドをコードする核酸若しくはＤＮＡ鋳型又はその両方）の切除及び環状化を達成することにより、細胞内でＤＮＡベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ、ｒＡＡＶ、ｓｃＡＡＶ、ｃｅＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ）からミニサークルを形成する。一部の実施形態では、第１切除事象（例えば、分子内組換え）及び第２組込み（例えば、標的部位組込み）事象のために、同じリコンビナーゼを使用する。一部の実施形態では、切除された環状ＤＮＡ上の組換え部位（例えば、第１組換え事象、例えば分子内組換え後の）を、第２組換え（例えば、標的部位組換え）事象のための鋳型認識部位として使用する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるミニサークルＤＮＡはリコンビナーゼ切除事象により作製され、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、リコンビナーゼ組込み事象によりミニサークルＤＮＡを挿入するように機能する。一部の実施形態では、切除事象及び組込み事象は、同じ酵素により、例えば、同じセリンリコンビナーゼにより触媒される。一部の実施形態では、ベクターからの切除のためのカセットはａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位によりフランキングされ、切除事象は、コグネイトゲノムａｔｔＰ又はａｔｔＢ部位の組込みに用いられるａｔｔＢ又はａｔｔＰ部位の作製をもたらす。一部の実施形態では、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位が関与する切除事象は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒリコンビナーゼポリペプチドの切除の実行を可能にする組換え方向性因子（ＲＤＦ）の付加により触媒される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒリコンビナーゼポリペプチドは、ＲＤＦの不存在下で組込み事象を触媒するように機能する。
リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムのドメイン（例えば、本明細書に記載のリコンビナーゼポリペプチドのリコンビナーゼドメイン及び／又はＤＮＡ認識ドメイン）は、リンカーにより連結され得る。リンカーエレメントを含む本明細書に記載の組成物は、一般的形態Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有し、ここで、Ｓ１及びＳ２は、同じであるか又は異なり得、リンカーで互いに結合された２つの部分（例えば、各々、ポリペプチド又は核酸ドメイン）を呈示する。一部の実施形態では、リンカーは、２つのポリペプチドを連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、２つの核酸分子を連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドと核酸分子を連結し得る。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であり得る。リンカーは、柔軟、剛直及び／又は切断可能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。概して、ペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれを超えるアミノ酸長、例えば、２～５０アミノ酸長、２～３０アミノ酸長である。
最も一般的に使用される柔軟リンカーは、主としてＧｌｙ及びＳｅｒ残基の区間からなる配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。柔軟リンカーは、ある程度の移動又は相互作用を必要とするドメインの連結に有用であると考えられ、小さい無極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴｈｒの組込みは、水分子を用いて水素結合を形成することにより、水溶液中のリンカーの安定性を維持することもできるため、リンカーと他の部分との好ましくない相互作用を低減することができる。こうしたリンカーの例としては、構造［ＧＧＳ］≧１又は［ＧＧＧＳ］≧１（配列番号３４４１）を有するものが挙げられる。剛直リンカーは、ドメイン間の定距離を保持すると共に、それらの独立の機能を維持するのに有用である。剛直リンカーは、薬剤中の１つ若しくは複数の成分の安定性又は生物活性を保存するためにドメインの空間的分離が不可欠である場合にも有用となり得る。剛直リンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎを有し得る（Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ若しくはＧｌｕを指す）。切断可能なリンカーは、遊離機能性ドメインをインビボで放出し得る。一部の実施形態では、リンカーは、特定の条件下、例えば、還元剤又はプロテアーゼの存在下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を利用する場合がある。一例として、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）がある。ＣＰＲＳＣのインビトロトロンビン処理により、トロンビン感受性配列の切断が起こるのに対し、可逆性ジスルフィド結合はインタクトなままである。こうしたリンカーは、周知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。本明細書に記載の組成物中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞若しくは組織において、病状（例えば、癌若しくは炎症）下、インビボで発現されるか、又は特定の細胞コンパートメント内に拘束されたプロテアーゼによっても実施され得る。様々なプロテアーゼの特異性により、拘束されたコンパートメント内のリンカーの緩徐な切断が可能になる。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、天然のポリペプチド内のこうしたドメイン間に存在する内在性アミノ酸（又はそれらと相同性）である。一部の実施形態では、そのようなドメイン間に存在する内在性アミノ酸は、置換されているが、長さは天然の長さから不変である。一部の実施形態では、ドメイン間に天然に存在するアミノ酸残基に、追加のアミノ酸残基が付加される。
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、タンパク質機能を最大化するように、コンピューターにより設計されるか、又はスクリーニングされる（Ａｎａｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８７：１９，２０１３）。
さらなるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの特徴
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、内在性宿主因子を必要とすることなく、完全な書込み（ｗｒｉｔｉｎｇ）を達成し得る。一部の実施形態では、システムは、ＤＮＡ修復を必要とせずに、完全な書込みを達成し得る。一部の実施形態では、システムは、ＤＮＡ損傷応答を誘発することなく、完全な書込みを達成し得る。
一部の実施形態では、システムは、ＮＨＥＪ経路、相同組換え修復経路、塩基切除修復経路又はそれらの任意の組合せによるＤＮＡ修復を必要としない。ＤＮＡ修復経路による参加は、例えば、ＤＮＡ修復経路阻害剤又はＤＮＡ修復経路欠失細胞株の適用によってアッセイすることができる。例えば、ＤＮＡ修復経路阻害剤を適用する場合、まず、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存アッセイを実施して、阻害剤の毒性並びに何らかの正規化を適用すべきか否かを決定することができる。ＳＣＲ７は、ＮＨＥＪの阻害剤であり、これは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）送達中に連続希釈で適用することができる。ＰＡＲＰタンパク質は、一本鎖及び二本鎖切断の両方にホモ二量体として結合する核酵素である。従って、その阻害剤を、相同組換え修復経路及び塩基切除修復経路を含め、関連ＤＮＡ修復経路の試験に使用することができる。実験手順は、ＳＣＲ７のそれと同じである。ヌクレオチド切断修復（ＮＥＲ）経路のコアタンパク質が欠失した細胞株を使用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）に対するＮＥＲの効果を試験することができる。細胞へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの送達後、ｄｄＰＣＲを用いて、ＤＮＡ修復経路の阻害に関して、異種目的配列の挿入を評価することができる。また、シーケンシング解析を実施して、ＤＮＡ修復経路が特定の役割を果たしているか否かを評価することもできる。一部の実施形態では、ゲノムへのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）は、本明細書に記載のＤＮＡ修復経路のノックダウンによって低減されない。一部の実施形態では、ゲノムへのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）は、ＤＮＡ修復経路のノックダウンにより５０％以上低減されない。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムにおける環状ＲＮＡ
製剤化、送達又は標的細胞内のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ反応中に環状及び／又は線状ＲＮＡ状態を用いることが有益であり得ることが考慮される。従って、本明細書に記載される態様のいずれかの一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、１つ又は複数の環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を含む。本明細書に記載される態様のいずれかの一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、１つ又は複数の線状ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド又は両方をコードする核酸分子）は、ｃｉｒｃＲＮＡである。一部の実施形態では、環状ＲＮＡ分子は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子が宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、環状ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるリコンビナーゼをコードする。一部の実施形態では、リコンビナーゼをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子が宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、翻訳前に線状化される（例えば、宿主細胞中）。
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は細胞中で天然に存在することが見出されており、ヒト細胞においてノンコーディング及びタンパク質コーディング役割の両方を含む多様な機能を有することが見出されている。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡの環状化をもたらすＲＮＡ分子（又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ）に自己スプライシングイントロンを組み込むことにより操作することができることと、操作されたｃｉｒｃＲＮＡは増強されたタンパク質産生及び安定性を有し得ることとが示されている（Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８）。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ポリペプチドは、ｃｉｒｃＲＮＡとしてコードされる。特定の実施形態では、鋳型核酸は、ＤＮＡ、例えばｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡである。
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ又は複数のリボザイム配列を含む。一部の実施形態では、リボザイム配列は、例えば、宿主細胞中で自己切断のために活性され、例えば、それによりｃｉｒｃＲＮＡの線状化をもたらす。一部の実施形態では、リボザイムは、例えば、宿主細胞中でマグネシウムの濃度が切断に十分なレベルに達する時に活性化される。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、宿主細胞への送達前に低マグネシウム環境中で維持される。一部の実施形態では、リボザイムは、タンパク質応答性リボザイムである。一部の実施形態では、リボザイムは、核酸応答性リボザイムである。
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、標的細胞の核中で線状化される。一部の実施形態では、細胞の核中のｃｉｒｃＲＮＡの線状化は、例えば、切断事象を活性化するために細胞の核中に存在する成分を含む。例えば、Ｂ２及びＡＬＵレトロトランスポゾンは、活性がポリコームタンパク質、ＥＺＨ２との相互作用により増強される自己切断リボザイムを含有する（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１７（１）：４１５－４２５（２０２０））。従って、一部の実施形態では、リボザイム、例えば核エレメント、例えば核タンパク質、例えばゲノム相互作用タンパク質、例えばエピジェネティック修飾因子、例えばＥＺＨ２に対して応答性であるＢ２又はＡＬＵエレメント由来のリボザイムが、例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡに取り込まれる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの核局在化は、リボザイムの自己触媒活性の増加及びｃｉｒｃＲＮＡの線状化をもたらす。
一部の実施形態では、誘導性リボザイム（例えば、本明細書に記載されるｃｉｒｃＲＮＡ中）は、合成により、例えば、タンパク質リガンド応答性アプタマー設計を利用することにより作製される。ＭＳ２コートタンパク質アプタマーを用いてタバコ輪点ウイルスハンマーヘッドリボザイムのサテライトＲＮＡを利用するためのシステムは記載されており（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２（１９）：１２３０６－１２３２１（２０１４）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる））、それは、ＭＳ２コートタンパク質の存在下でリボザイム活性の活性化をもたらす。実施形態では、このようなシステムは、細胞質又は核に局在化されるタンパク質リガンドに対して応答する。一部の実施形態では、タンパク質リガンドは、ＭＳ２でない。例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（４９６８）：５０５－５１０（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ ３４６（６２８７）：８１８－８２２（１９９０）；（その各々の方法が、参照により本明細書に組み込まれる））に基づいてリガンドをターゲティングするためのＲＮＡアプタマーを作製する方法が記載されており、いくつかの事例では、インシリコ設計により支援されている（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１７（１５）：８４８６－８４９３（その方法が、参照により本明細書に組み込まれる））。従って、一部の実施形態では、標的リガンドについてのアプタマーは、例えば、タンパク質リガンドの存在下において、例えばリボザイム媒介切断及びｃｉｒｃＲＮＡ線状化をトリガーするために作製され、合成リボザイムシステムに取り込まれる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ線状化は、細胞質中において、例えば細胞質中でリガンドと会合するアプタマーを用いてトリガーされる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ線状化は、核中において、例えば核中でリガンドと会合するアプタマーを用いてトリガーされる。複数の実施形態では、核へのリガンドは、エピジェネティック修飾因子又は転写因子を含む。一部の実施形態では、線状化をトリガーするリガンドは、オフターゲット細胞よりもオンターゲット細胞中で高いレベルで存在する。
ｃｉｒｃＲＮＡ線状化に核酸応答性リボザイムシステムを用いることができることがさらに考慮される。例えば、リボザイム活性化をトリガーするための規定の標的核酸分子を検知するバイオセンサが、例えば、Ｐｅｎｃｈｏｖｓｋｙ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３２（５）：１０１５－１０２７（２０１４）（参照により本明細書に組み込まれる））に記載されている。これらの方法により、リボザイムは天然では不活性状態にフォールドし、規定の標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の存在下でのみ活性化される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡは、規定の標的核酸、例えばＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｍｔＲＮＡの存在下で活性化される核酸応答性リボザイムを含む。一部の実施形態では、線状化をトリガーする核酸は、オフターゲット細胞よりもオンターゲット細胞中で高いレベルで存在する。
本明細書の態様のいずれかの一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、目的の標的組織又は標的細胞に対する誘導性特異性を有する１つ又は複数のリボザイム、例えば目的の標的組織又は標的細胞中でより高いレベルで存在するリガンド又は核酸により活性化されるリボザイムを組み込む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、細胞内コンパートメント、例えば、核、核小体、細胞質又はミトコンドリアに対する誘導性特異性を有するリボザイムを組み込む。一部の実施形態では、リガンド又は核酸により活性化されるリボザイムは、標的細胞内コンパートメント中でより高いレベルで存在する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのＲＮＡ成分は、例えば、線状化により活性化されるｃｉｒｃＲＮＡとして提供される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡの線状化は、翻訳のための分子を活性化する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡ成分を活性化するシグナルは、例えば、システムがオンターゲット細胞中で特異的に活性化されるように、オンターゲット細胞又は組織中でより高いレベルで存在する。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのＲＮＡ成分は、線状化により不活性化されるｃｉｒｃＲＮＡとして提供される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡは、切断及び分解により不活性化される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡは、ポリペプチドのコード配列から翻訳シグナルを分離する切断により不活性化される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのｃｉｒｃＲＮＡ成分を不活性化するシグナルは、システムがオフターゲット細胞中で特異的に不活性化されるように、オフターゲット細胞又は組織中でより高いレベルで存在する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体
一部の実施形態では、本発明は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体を提供する。進化型変異体は、一部の実施形態では、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はそこに含まれる断片若しくはドメインの１つを突然変異誘発させることにより生産することができる。一部の実施形態では、ドメイン（例えば、触媒ドメイン又はＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的結合ドメイン若しくは鋳型結合ドメイン）、例えば配列誘導ＤＮＡ結合エレメントなど）の１つ若しくは複数が進化する。こうした進化型変異体ドメインの１つ又は複数は、一部の実施形態において、単独で又は他のドメインと一緒に進化し得る。１つ又は複数の進化型変異体ドメインは、一部の実施形態では、非進化型コグネイト成分又はコグネイト成分の進化型変異体（例えば、平行若しくは連続様式で進化した可能性のあるもの）と組み合わせされ得る。
一部の実施形態では、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させるプロセスは、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはドメインを突然変異誘発させることを含む。複数の実施形態では、突然変異誘発は、例えば、本明細書に記載されるように、漸進的進化方法（例えば、ＰＡＣＥ）又は非漸進的進化方法（例えば、ＰＡＮＣＥ）を含む。一部の実施形態では、進化型Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば標的結合ドメイン若しくは鋳型結合ドメイン）は、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはドメインと比較して、そのアミノ酸配列に導入された１つ若しくは複数のアミノ酸変異を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列変異は、例えば、コーディング配列内のいずれか特定の位置のコドンの変化を招くｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒをコードするヌクレオチド配列内の変化、１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失（例えば、短縮タンパク質）、１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入又はそれらの任意の組合せの結果として、標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒのアミノ酸配列内に１つ若しくは複数の変異残基（例えば、保存的置換、非保存的置換又はそれらの組合せ）を含み得る。進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの１つ若しくは複数の成分又はドメインに変異体（例えば、触媒ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン又はそれらの組合せに導入された変異体）を含み得る。
いくつかの態様では、本発明は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体を用いるか又はそれを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、システム、キット及び方法を提供し、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの進化型変異体又はＰＡＣＥ若しくはＰＡＮＣＥにより生産若しくは生産可能なＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを使用する。複数の実施形態では、非進化型標準Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、本明細書に開示されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒである。
「ファージ支援型漸進的進化（ＰＡＣＥ）」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する漸進的進化を指す。ＰＡＣＥ技術の例は、例えば、２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許第２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；並びに２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２７７９５号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
「ファージ支援型非漸進的進化（ＰＡＮＣＥ）」という用語は、本明細書において、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する非漸進的進化を指す。ＰＡＮＣＥ技術の例は、例えば、Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎ ｅｌｕｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１３（１２）：１２６１－１２６６（２０１７）に記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。手短には、ＰＡＮＣＥは、新鮮な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）全体に、進化させようとする目的の遺伝子を含有する、進化選択ファージ（ＳＰ）の連続フラスコ移入を用いる迅速なインビボ指向性進化のための技術である。ＳＰに含まれる遺伝子が漸進的に進化する間、宿主細胞内部の遺伝子を一定に保持することができる。ファージ増殖後、感染した細胞のアリコートを用いて、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する次のフラスコをトランスフェクトすることができる。このプロセスは、所望の表現型が、例えば、所望されるだけの数の移入について進化するまで、反復及び／又は継続することができる。
ＰＡＣＥ及びＰＡＮＣＥをＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒに適用する方法は、とりわけ、前述の参照文献を参照することにより、当業者により容易に理解されよう。例えば、ファージ粒子を用いて、例えば宿主細胞の集団中に、ゲノム修飾タンパク質若しくはシステムの漸進的進化を指令するためのさらなる例示的な方法を適用して、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはサブドメインの進化型変異体を作製することができる。こうした方法の非限定的な例は、例えば、２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；２０１９年６月１４日に出願された国際出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／３７２１６号明細書、２０１９年１月３１日に公開された国際公開第２０１９／０２３６８０号パンフレット、２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２７７９５号明細書並びに２０１９年８月２３日に出願された国際出願、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／４７９９６号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの非限定的な例示的実施形態では、進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはドメインの進化方法は、（ａ）宿主細胞の集団を、目的の遺伝子を含むウイルスベクターの集団（出発Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはドメイン）と接触させるステップを含み、ここで、（１）宿主細胞は、ウイルスベクターによる感染に適しており；（２）宿主細胞は、ウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を発現し；（３）感染性ウイルス粒子の産生に必要な少なくとも１つのウイルス遺伝子の発現が、目的の遺伝子の機能に依存しており；及び／又は（４）ウイルスベクターが、宿主細胞でのタンパク質の発現を可能にし、且つ宿主細胞により複製されて、ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。一部の実施形態では、本方法は、（ｂ）変異速度を高める（例えば、変異プラスミド又は何らかのゲノム修飾－例えば、損傷ＤＮＡ校正ポリメラーゼ、ＳＯＳ遺伝子、例えばＵｍｕＣ、ＵｍｕＤ’及び／又はＲｅｃＡ（それらの突然変異は、プラスミドと結合すると、誘導性プロモータの制御下となり得る）を輸送することにより或いはそれらの組合せで）突然変異を含む宿主細胞を用いて、変異原と宿主細胞を接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、（ｃ）ウイルス複製及びウイルス粒子の産生を可能にする条件下において、宿主細胞の集団をインキュベートするステップを含み、その際、宿主細胞を宿主細胞集団から除去し、新鮮で、非感染の宿主細胞を宿主細胞の集団に導入し、このようにして、宿主細胞の集団を補給すると共に、宿主細胞の流れを形成する。一部の実施形態では、目的の遺伝子が突然変異を取得する条件下で細胞をインキュベートする。一部の実施形態では、本方法は、さらに（ｄ）宿主細胞の集団から、進化した遺伝子産物（例えば、進化型変異体Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はその断片若しくはドメイン）をコードするウイルスベクターの変異バージョンを単離するステップを含む。
当業者は、前述した枠組み内で使用可能な種々の特徴を理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、ウイルスベクター又はファージは、繊維状ファージ、例えば、Ｍ１３ファージ、例えば、Ｍ１３選択ファージである。特定の実施形態では、感染性ウイルス粒子の産生に必要な遺伝子は、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）である。複数の実施形態では、ファージは、機能性ｇＩＩＩを欠失している場合もあるが、代わりに、ｇＩ、ｇＩＩ、ｇＩＶ、ｇＶ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＩＸ及びｇＸを含む。一部の実施形態では、感染性ＶＳＶ粒子の世代は、エンベロープタンパク質ＶＳＶ－Ｇを含む。様々な実施形態で、異なるレトロウイルスベクター、例えばマウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）ベクター又はレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターが使用され得る。複数の実施形態では、レトロウイルスベクターは、例えば、ウイルスのネイティブエンベロープタンパク質の代替物としてＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を用いて、効率的にパッケージングすることができる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、好適な数のウイルス生活環、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも７５００、少なくとも１００００又はそれを超える連続したウイルス生活環に応じてインキュベートされ、ここで、Ｍ１３ファージの例示的且つ非限定的な例は、ウイルス生活環毎に１０～２０分である。同様に、宿主細胞が、宿主細胞の集団中に滞留する時間（例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１５０又は約１８０分）を調整するために、条件を調節することができる。宿主細胞集団は、宿主細胞の密度又は一部の実施形態では、流入中の宿主細胞密度、例えば、１０３細胞／ｍｌ、約１０４細胞／ｍｌ、約１０５細胞／ｍｌ、約５～１０５細胞／ｍｌ、約１０６細胞／ｍｌ、約５～１０６細胞／ｍｌ、約１０７細胞／ｍｌ、約５～１０７細胞／ｍｌ、約１０８細胞／ｍｌ、約５～１０８細胞／ｍｌ、約１０９細胞／ｍｌ、約５～１０９細胞／ｍｌ、約１０１０細胞／ｍｌ又は約５～１０１０細胞／ｍｌにより、一部を制御することができる。
核酸
プロモータ
一部の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーを、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする核酸又は例えば異種目的配列の発現を制御する鋳型核酸と作動可能に連結する。特定の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーは、細胞型若しくは組織特異的エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータ又はエンハンサーは、同じであるか、或いは異種目的配列の発現を天然で制御するプロモータ又はエンハンサーに由来する。例えば、オルニチントランスカルボミラーゼプロモータ及びエンハンサーを用いて、オルニチントランスカルボミラーゼ欠失を補正するために本発明により提供されるシステム若しくは方法におけるオルニチントランスカルボミラーゼ遺伝子の発現を制御することができる。一部の実施形態では、プロモータは、表４Ｂのプロモータ又はその機能性断片若しくは変異体である。
市販されている例示的な組織特異的プロモータは、例えば、ＵＲＬ（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）に見出すことができる。一部の実施形態では、プロモータは、ネイティブプロモータ又は最小プロモータ（例えば、所与の遺伝子の５’領域からの単一断片から構成されるもの）である。一部の実施形態では、ネイティブプロモータは、コアプロモータとその天然の５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、イントロンを含む。他の実施形態では、これらは、起源の異なるプロモータを組み合わせるか、又は同じ起源の最小プロモータと共に遠位エンハンサーをアセンブリングすることにより作製された複合プロモータを含む。一部の実施形態では、組織特異的発現制御配列は、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表２又は表３の配列の１つ若しくは複数を含む。
例示的な細胞又は組織特異的プロモータを以下の表に記載し、それらをコードする例示的な核酸は、当技術分野で公知であり、様々なリソース、例えば、ＲｅｆＳｅｑ．を含むＮＣＢＩデータベース並びにＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｅｐｄ．ｅｐｆｌ．ｃｈ／／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を用いて、容易に入手することができる。
Figure 2023502473000749
Figure 2023502473000750
Figure 2023502473000751
Figure 2023502473000752
Figure 2023502473000753
使用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成性及び誘導性プロモータ、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、いくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれも発現ベクターに使用し得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい；尚、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒをコードする核酸又は鋳型核酸は、制御エレメント、例えば、プロモータなどの転写制御エレメントと作動可能に連結される。転写制御エレメントは、一部の実施形態では、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞；又は原核生物細胞（例えば、細菌若しくは古細菌細胞）のいずれかで機能性であり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、原核生物細胞及び真核生物細胞の両方でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御エレメントと作動可能に連結される。
例示の目的のために、空間限定プロモータの例として、限定されないが、ニューロン特異的プロモータ、脂肪細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、平滑筋特異的プロモータ、光受容体特異的プロモータなどが挙げられる。ニューロン特異的空間限定プロモータとして、限定されないが、以下のものが挙げられる：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２，Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモータ、ニューロフィラメントプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ，Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ，Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ－１プロモータ（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７－１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１－１１６６を参照）；セロトニン受容体プロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモータ（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７；Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３－５９４を参照）；ＧｎＲＨプロモータ（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２－３４０６を参照）；Ｌ７プロモータ（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３－２２６を参照）；ＤＮＭＴプロモータ（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８－３６５２を参照）；エンケファリンプロモータ（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３－３８０５を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータ；Ｃａ２＋カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ－α（ＣａｍＫＩＩα）プロモータ（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子－βプロモータ（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２－６０を参照）；など。
脂肪細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ａＰ２遺伝子プロモータ／エンハンサー、例えばヒトａＰ２遺伝子の－５．４ｋｂから＋２１ｂｐまでの領域（例えば、Ｔｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：１６０４；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５９０；及びＰａｖｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９７を参照）；グルコーストランスポータ－４（ＧＬＵＴ４）プロモータ（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモータ（例えば、Ｋｕｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：１４７６；及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５７０３を参照）；ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ－１（ＳＣＤ１）プロモータ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０６０３）；レプチンプロモータ（例えば、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：１０１３；及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６２：１８７を参照）；アジドネクチンプロモータ（例えば、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３１：４８４；及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ （２０１０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１：２４０８を参照）；アジプシンプロモータ（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）；レジスチンプロモータ（例えば、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７：１５２２を参照）；など。
心筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下の遺伝子；ミオシン軽鎖－２、α－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、心臓アクチンなどに由来する制御配列が挙げられる。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６；Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４－５９１；Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８－６１７；及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７－４０５１。
平滑筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ＳＭ２２αプロモータ（例えば、Ａｋｙｕｅｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：９８３；及び米国特許第７，１６９，８７４号明細書を参照）；スムーセリンプロモータ（例えば、国際公開第２００１／０１８０４８号パンフレットを参照）；α－平滑筋アクチンプロモータ；など。例えば、ＳＭ２２αプロモータの０．４ｋｂ領域（その内部に２つのＣＡｒＧエレメントが位置する）は、血管の平滑筋細胞特異的発現を媒介することが明らかにされている（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６－２２７８；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２ ８４９－８５９；及びＭｏｅｓｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５－２４２５を参照）。
光受容体特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ロドプシンキナーゼプロモータ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）；網膜色素変性遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモータ（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）；など。
非限定的な例示的細胞特異的プロモータ
当技術分野で公知の細胞特異的プロモータを用いて、例えば本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒタンパク質の発現を指令することができる。非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、特性決定されており、細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに使用されている。いくつかの非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、米国特許第９８４５４８１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されている。
一部の実施形態では、細胞特異的プロモータは、植物で活性のプロモータである。多くの例示的な細胞特異的プロモータが当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，０９７，０２５号明細書；米国特許第５，７８３，３９３号明細書；米国特許第５，８８０，３３０号明細書；米国特許第５，９８１，７２７号明細書；米国特許第７，５５７，２６４号明細書；米国特許第６，２９１，６６６号明細書；米国特許第７，１３２，５２６号明細書；及び米国特許第７，３２３，６２２号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１０／０２６９２２６号明細書；米国特許出願公開第２００７／０１８０５８０号明細書；米国特許出願公開第２００５／００３４１９２号明細書；及び米国特許出願公開第２００５／００８６７１２号明細書（これらは、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、発現カセットを含む。「発現カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸分子の発現のために十分な核酸エレメントを含む核酸構築物を指す。典型的に、発現カセットは、プロモータ配列と作動可能に連結した本発明の核酸分子を含む。「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方の影響を受けるような、単一核酸断片上の２つ以上の核酸断片の会合を指す。例えば、プロモータは、それが、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コーディング配列と作動可能に連結している（例えば、コーディング配列は、プロモータの転写制御下にある）。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列と作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、プロモータは、異種プロモータである。「異種プロモータ」という用語は、本明細書で使用される場合、天然で所与のコーディング配列と作動可能に連結されていないことがわかっているプロモータを指す。特定の実施形態では、発現カセットは、別のエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ）応答エレメント（ＷＲＥ）及び／又はコーディング配列の発現レベルに影響を及ぼすことがわかっている他のエレメントを含み得る。「プロモータ」は、典型的に、コーディング配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する。特定の実施形態では、プロモータ配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、さらにエンハンサーエレメントも含み得る。「エンハンサー」は、典型的に、プロモータ活性を刺激することができ、プロモータの天然のエレメントであり得るか、又はプロモータのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。特定の実施形態では、プロモータは、その全体がネイティブ遺伝子に由来する。特定の実施形態では、プロモータは、天然に存在する異なるプロモータ由来の様々なエレメントから構成される。特定の実施形態では、プロモータは、合成ヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、種々のプロモータが、様々な組織若しくは細胞型において又は様々な発生段階において、或いは様々な環境条件又は薬剤若しくは転写補因子の存在若しくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指令し得ることは理解されよう。ユビキタス、細胞型特異的、組織特異的、発生段階特異的及び条件的プロモータ、例えば薬剤応答性プロモータ（例えば、テトラサイクリン応答性プロモータ）は、当業者には周知である。プロモータの例として、限定されないが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモータ、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモータ（ＣＢＡ）及びウサギβグロビンイントロンの複合物）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシン若しくはＮｅｕＮプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモータ；アデノウイルス主要後期プロモータ（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモータ、例えばＣＭＶ最初期プロモータ領域（ＣＭＶＩＥ）、ＳＦＦＶプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）プロモータ、合成プロモータ、ハイブリダイゼーションプロモータなどが挙げられる。他のプロモータは、ヒト由来又はマウスをはじめとする他の種由来のものであり得る。一般的なプロモータとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の長い末端反復、［β］－アクチン、ラットインスリンプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータ、トランスサイレチンプロモータ、ＴＢＧプロモータ及び他の肝臓特異的プロモータ、デスミンプロモータ及び類似の筋肉特異的プロモータ、ＥＦ１－α－プロモータ、ＣＡＧプロモータ及び他の構成性プロモータ、多組織特異性を備えるハイブリッドプロモータ、シナプシン及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモータのようなニューロン特異的プロモータが挙げられ、これらは全て、当業者には周知であり、容易に入手可能であり、目的のコーディング配列の高レベルの発現を達成するために使用することができる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も本発明において有用であろう。こうしたプロモータ配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。さらに別の例示的なプロモータ配列は、例えば、国際公開第２０１８２１３７８６Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、例えば、肝臓での発現を駆動するために、アポリポタンパク質Ｅエンハンサー（ＡｐｏＥ）又はその機能性断片を使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片の２コピーを使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片をプロモータ、例えばヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータと組み合わせて使用する。
一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。いくつかのケースでは、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。様々な組織特異的調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサーなど）が当技術分野で公知である。例示的な組織特異的調節配列として、限定されないが、以下の組織特異的プロモータが挙げられる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、インスリンプロモータ、グルカゴンプロモータ、ソマトスタチンプロモータ、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモータ、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモータ、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモータ又は心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモータ。他の例示的なプロモータとしては、β－アクチンプロモータ、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモータ、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシンプロモータ（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質プロモータ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、ＣＤ２プロモータ（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖プロモータ；Ｔ細胞受容体α－鎖プロモータ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータなどのニューロンプロモータ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））並びにニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））などが挙げられる。別の例示的なプロモータ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、組織特異的調節エレメント、例えば、組織特異的プロモータは、例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ若しくはタンパク質発現データ又はそれらの組合せにより測定して、所与の組織中で高度に発現される遺伝子と作動可能に連結していることがわかっているものから選択される。発現による組織特異性を分析する方法は、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３（２）：３９７－４０６ （２０１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、マルチシストロン性発現構築物である。マルチシストロン性発現構築物として、例えば、第１発現カセット（例えば、第１プロモータ及び第１コーディング核酸配列を含む）と、第２発現カセット（例えば、第２プロモータ及び第２コーディング核酸配列を含む）を有する構築物が挙げられる。こうしたマルチシストロン性発現構築物は、いくつかの事例では、ポリペプチド、例えばｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒ及びｇｅｎｅ ｗｒｉｔｅｒ鋳型と一緒に、ヘアピンＲＮＡなどの非翻訳遺伝子産物の送達に、特に有用となり得る。一部の実施形態では、マルチシストロン性発現構築物は、例えば、プロモータ干渉又は不適合性核酸エレメントの近接した存在のために、含まれるトランスジーンの１つ若しくは複数の発現レベル低下を呈示し得る。マルチシストロン性発現構築物がウイルスベクターの一部である場合、自己相補性核酸配列の存在は、いくつかの事例において、ウイルスの増殖又はパッケージングに必要な構造の形成を妨害し得る。
一部の実施形態では、配列は、ヘアピンを有するＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、ヘアピンＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉｃｒｏＲＮＡである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、Ｕ６又はＨ１プロモータである。一部の実施形態では、核酸構築物は、ＡＡＶ構築物Ｂ１又はＢ２を含む。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、マルチシストロン性発現構築物は、ただ１つのシストロンを含む発現系と比較して、最適な発現レベルを達成しないと考えられる。２つ以上のプロモータエレメントを含むマルチシストロン性発現構築物を用いて達成される発現レベル低下について示される原因の１つは、プロモータ干渉の現象である（例えば、Ｃｕｒｔｉｎ Ｊ Ａ，Ｄａｎｅ Ａ Ｐ，Ｓｗａｎｓｏｎ Ａ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｉ Ｅ，Ｇｉｎｎ Ｓ Ｌ．Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ａ ｌａｔｅ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｍａｒｃｈ；１５（５）：３８４－９０；及びＭａｒｔｉｎ－Ｄｕｑｕｅ Ｐ，Ｊｅｚｚａｒｄ Ｓ，Ｋａｆｔａｎｓｉｓ Ｌ，Ｖａｓｓａｕｘ Ｇ．Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１５（１０）：９９５－１００２を参照されたい；尚、いずれの参照文献も、プロモータ干渉現象の開示について、参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、プロモータ干渉の問題は、例えば、内部リボソーム進入部位により隔てられる複数のコーディング核酸配列の転写を駆動するただ１つのプロモータを含むマルチシストロン性発現構築物を生成することにより、又は転写インスレータエレメントを備えるそれ自身のプロモータを含むシストロンを分離することによって解消することができる。一部の実施形態では、単一プロモータにより駆動される多シストロンの発現は、シストロンの不均一な発現レベルを招き得る。一部の実施形態では、プロモータを効率的に分離することはできず、分離エレメントは、一部の遺伝子導入ベクター、例えば一部のレトロウイルスベクターと適合性ではない場合がある。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び他の低分子干渉核酸は、一般に、標的ＲＮＡ転写物切断／分解又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制によって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、いくつかの事例において、典型的に、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現され得る。ｍｉＲＮＡは、一般に、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介してその活性を呈示する。これらの内在性発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し得るが、これらは、後にｍｉＲＮＡデュープレックス、さらには成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子にプロセシングされる。この成熟ｍｉＲＮＡは、一般に、多タンパク質複合体、ｍｉＲＩＳＣを誘導し、これは、成熟ｍｉＲＮＡに対するその相補性に基づいて標的ｍＲＮＡの標的３’ＵＴＲ領域を識別する。有用なトランスジーン産物として、例えば、連結ポリペプチドの発現を調節するｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ結合部位を挙げることができる。ｍｉＲＮＡ遺伝子；これら遺伝子の産物及びその相同体の非限定的なリストは、トランスジーンとして又は低分子干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の標的として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０３００１４６号明細書、２２：２５－２５：４８に列挙されるものなどの方法において有用である。一部の実施形態では、前述したｍｉＲＮＡの１つ又は複数に対する１つ若しくは複数の結合部位は、トランスジーン、例えばｒＡＡＶベクターにより送達されるトランスジーンに組み込まれて、例えばそのトランスジーンを保有する動物の１つ若しくは複数の組織中のトランスジーンの発現を阻害する。一部の実施形態では、組織特異的にトランスジーンの発現を制御するように結合部位を選択し得る。例えば、肝臓特異適ｍｉＲ－１２２に対する結合部位をトランスジーンに組み込んで、肝臓中のそのトランスジーンの発現を阻害することができる。別の例示的なｍｉＲＮＡ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｍｉＲ阻害剤又はｍｉＲＮＡ阻害剤は、概して、ｍｉＲＮＡ発現及び／又はプロセシングを阻止する薬剤である。こうした薬剤の例として、限定されないが、ｍｉｃｒｏＲＮＡアンタゴニスト、ｍｉｃｒｏＲＮＡ特異的アンチセンス、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ及びｍｉｃｒｏＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖、ヘアピン、短いオリゴヌクレオチド）が挙げられ、これらは、Ｄｒｏｓｈａ複合体とのｍｉＲＮＡ相互作用を阻害する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤、例えば、ｍｉＲＮＡスポンジは、トランスジーンから細胞に発現させることができる（例えば、Ｅｂｅｒｔ，Ｍ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｐｕｂ Ａｕｇ．１２，２００７に記載の通り；尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ又は他のｍｉＲ阻害剤は、ＡＡＶと一緒に使用される。ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジは、一般に、相補的ヘプタマーシード配列を介して、ｍｉＲＮＡを特異的に阻害する。一部の実施形態では、単一のスポンジ配列を用いて、ｍｉＲＮＡのファミリー全体をサイレンシングすることができる。細胞中でｍｉＲＮＡ機能をサイレンシングする（ｍｉＲＮＡ標的の抑制解除）他の方法は、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表４に列挙される配列を含む。また、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットからの例示的なｍｉＲＮＡの一覧も参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、細胞の一部においてＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの成分（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする核酸、トランスジーンをコードする核酸）をサイレンシングすることが有利である。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの成分の発現を制限して目的の組織内の細胞タイプを選択することが有利である。
例えば、所与の組織、例えば、肝臓において、マクロファージ及び免疫細胞、例えば、肝臓中のクッパ細胞は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの１つ又は複数の成分のための送達ビヒクルの取込みに関与し得ることが公知である。一部の実施形態では、マクロファージ及び免疫細胞、例えば、クッパ細胞中で高度に発現される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについての少なくとも１つの結合部位は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの少なくとも１つの成分、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド又はトランスジーンをコードする核酸に含まれる。一部の実施形態では、１つ又は複数の結合部位をターゲティングするｍｉＲＮＡは、本明細書で参照される表に列挙され、例えば、ｍｉＲ－１４２、例えば成熟ｍｉＲＮＡ ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐである。
一部の実施形態では、トランスジーンのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ発現又は過剰発現が毒性効果を有し得る細胞中のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒレベル及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ活性を低減させることが有益であり得る。例えば、後根神経節ニューロンへのトランスジーン過剰発現カセットの送達は、遺伝子療法の毒性をもたらし得ることが示されている（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５６９）：ｅａｂａ９１８８（２０２０）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。一部の実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位をＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの核酸成分に取り込んで、ニューロン、例えば後根神経節ニューロン中のシステム成分の発現を低下させることができる。一部の実施形態では、ニューロン中のシステム成分の発現を低下させるためにＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの核酸成分に組み込まれる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１８２、例えば、熟ｍｉＲＮＡ ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－３ｐの結合部位である。一部の実施形態では、ニューロン中のシステム成分の発現を低下させるためにＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの核酸成分に取り込まれる少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１８３、例えば成熟ｍｉＲＮＡ ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－３ｐの結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位の組合せを用いて、目的の組織又は細胞タイプに対するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの１つ又は複数の成分の発現の制限を増強させることができる。
以下の表は、例示的なｍｉＲＮＡ及び対応する発現細胞、例えば、一部の実施形態では、例えば、そのオフターゲット細胞中の発現を低減させるためにトランスジーン又はポリペプチド核酸中で結合部位（相補的配列）を組み込むことができるｍｉＲＮＡを提供する。
Figure 2023502473000754
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、本明細書に記載される）をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸は、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲを含む。複数の実施形態では、タンパク質発現のための５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド若しくは異種目的配列のためのｍＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、最適化された発現配列を含む。一部の実施形態では、例えば、Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）（その配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、５’ＵＴＲは、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３４７５）を含み、及び／又は３’ＵＴＲは、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号３４７６）を含む。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのオープンリーディングフレーム、例えばＧｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（若しくはｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）のＯＲＦ又は異種目的配列のｍＲＮＡ（若しくはｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）の１つ若しくは複数のＯＲＦは、その発現を増強する、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）によりフランキングされている。一部の実施形態では、システムのｍＲＮＡ成分（又はＤＮＡ成分から産生された転写物）の５’ＵＴＲは、配列５’－ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ－３’（配列番号３４７５）を含む。一部の実施形態では、システムのｍＲＮＡ成分（又はＤＮＡ成分から産生された転写物）の３’ＵＴＲは、配列５’－ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ－３’（配列番号３４７６）を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのこの組合せは、Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）（その教示内容及び配列は、参照により本明細書に組み込まれる）により、作動可能に連結したＯＲＦの所望の発現をもたらすことが明らかにされている。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、転写物をコードするＤＮＡを含み、この場合、上記ＤＮＡは、上に挙げた配列中のＵをＴで置換した、対応する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、システムのＲＮＡ成分を生産するために用いられるＤＮＡベクターは、インビトロ転写を開始するために、５’ＵＴＲの上流にプロモータ、例えばＴ７、Ｔ３又はＳＰ６プロモータを含む。上記の５’ＵＴＲは、ＧＧＧで開始するが、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写を最適化するのに好適な開始である。代替５’ＵＴＲに適合するように、転写レベルを調整し、且つ転写開始部位ヌクレオチドを改変するために、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ ４３３－４４３（２０１０）の教示には、これらの特性の両方を満たすＴ７プロモータ変異体及びそれを見出す方法が記載されている。
ウイルスベクター及びその成分
ウイルスは、本明細書に記載の関連酵素又はドメインの供給源、例えば本発明で使用されるリコンビナーゼ及びＤＮＡ結合ドメイン、例えばＣｒｅリコンビナーゼ、λインテグラーゼ又はＡＡＶＲｅｐタンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインの供給源以外に、本明細書に記載のシステムのための送達ビヒクルの有用な供給源である。一部の酵素は、複数の活性を有し得る。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ送達システム又はその成分の供給源として使用されるウイルスは、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ ３５（３）：２３５－２４１（１９７１）により記載される一群から選択され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、Ｉ群ウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｄｓＤＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、Ｉ群ウイルスは、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）から選択される。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｓｓＤＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＩ群ウイルスは、例えば、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）は、ディペンドパルボウイルス属（ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、例えばアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ）である。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｄｓＲＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＩＩ群ウイルスは、例えば、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＶ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＶ群ウイルスは、例えば、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、Ｖ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（－）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＶ群ウイルスは、例えば、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（－）ゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｓｓＲＮＡ（－）を、宿主によって直接翻訳され得るｓｓＲＮＡ（＋）にコピーすることができる。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＶＩ群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＶＩ群ウイルスは、例えば、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、例えばＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶである。一部の実施形態では、レトロウイルスは、スプマウイルス（ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）、例えばフォーミーウイルス（ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）、例えばＨＦＶ、ＳＦＶ、ＢＦＶである。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（＋）は、まず逆転写され、コピーされて、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成し、そこからｍＲＮＡが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｓｓＲＮＡ（＋）をｄｓＤＮＡにコピーすることができ、このｄｓＤＮＡは、宿主によりｍＲＮＡに転写されて、翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＶＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であり、ｄｓＲＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＶＩＩ群ウイルスは、例えば、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、まず逆転写され、コピーされて、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成し、そこからｍＲＮＡが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｄｓＲＮＡをｄｓＤＮＡにコピーすることができ、このｄｓＤＮＡは、宿主によりｍＲＮＡに転写されて、翻訳され得る。
一部の実施形態では、本発明で核酸を送達するために用いられるビリオンは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇのプロセスに関与する酵素も担持し得る。例えば、ビリオンは、核酸と一緒に宿主細胞に送達されるリコンビナーゼドメインを含有し得る。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ビリオン内のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドを随伴し得、それにより、両方は、ウイルス粒子からの核酸の形質導入時に標的細胞に同時送達される。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、ＤＮＡ、例えば線状ｓｓＤＮＡ、線状ｄｓＤＮＡ、環状ｓｓＤＮＡ、環状ｄｓＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ｄｂＤＮＡ、ｃｅＤＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、ＲＮＡ、例えば線状ｓｓＲＮＡ、線状ｄｓＲＮＡ、環状ｓｓＲＮＡ、環状ｄｓＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞への形質導入時に環状化され得、例えば、線状ｓｓＲＮＡ分子は、共有結合を経て、環状ｓｓＲＮＡを形成することができ、線状ｄｓＲＮＡ分子は、共有結合を経て、環状ｄｓＲＮＡ又は１つ若しくは複数の環状ｓｓＲＮＡを形成し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞内でのローリングサークル複製により複製し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、単一核酸分子を含み得、例えば、非セグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、２つ以上の核酸分子を含み得、例えば、セグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は１つ若しくは複数のタンパク質を随伴し得る。一部の実施形態では、ビリオン内の１つ又は複数のタンパク質を、形質導入時に宿主細胞に送達することができる。一部の実施形態では、標的核酸に対するビリオンパッケージングシグナルの付加により、天然ウイルスを核酸の送達のために改変し得、その場合、宿主細胞を用いて、パッケージングシグナルを含有する標的核酸をパッケージングする。
一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、片利ヒトウイルスを含み得る。一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、アネロウイルス（ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）を含み得、その使用は、国際公開第２０１８２３２０１７Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
組成物及びシステムの作製
当業者には理解されるように、核酸構築物及びタンパク質又はポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステム、構築物及びポリペプチド）を設計及び構築する方法は、当技術分野において常用的である。一般に、組換え法が使用され得る。概略については、Ｓｍａｌｅｓ＆Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ＆Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。核酸組成物を設計、調製、評価、精製及び操作する方法は、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
本明細書に記載の医薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下の昆虫細胞、酵母、細菌又は他の細胞を用いて、組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写因子、例えば複製起点、好適なプロモータ並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列及び５’若しくは３’非転写配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０オリジン、アーリープロモータ、スプライス及びポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供することができる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現系の例として、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬＡ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主培養方法は、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載の組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えばレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み得る。一部の実施形態では、ベクター、例えばウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。
タンパク質治療薬の精製については、Ｆｒａｎｋｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
本開示は、部分的には、核酸及びアミノ酸配列と参照配列又は互いと比較して、前記配列間のミスマッチの％同一性又は数を決定することを対象とする。当業者は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ並びに２つの入力配列のグローバル配列アラインメントを実行するペアワイズアラインメントツール（例えば、ニードルマン・ブンシュアラインメントアルゴリズムを用いる）を含む、そのような決定を行うために多数の方法及び／又はツール、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅツールが利用可能であることを理解する。
ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ又はｍＲＮＡ、例えばＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードするｍＲＮＡ）も本明細書に記載されるように生産することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡセグメントは、化学合成により生産することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡセグメントは、核酸鋳型のインビトロ転写により、例えば、ＤＮＡ鋳型のコグネイトプロモータに作用して、ＲＮＡ転写物を産生するＲＮＡポリメラーゼを提供することにより、生産することができる。一部の実施形態では、例えば、コグネイトプロモータ、例えばＴ７、Ｔ３又はＳＰ６プロモータの転写制御下で、例えばＲＮＡセグメントをコードする、ＤＮＡ、例えばｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、線状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、線状ＤＮＡアンプリコン、線状化プラスミドＤＮＡに作用する、例えばＴ７、Ｔ３若しくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はその誘導体を用いて、インビトロ転写を実施する。一部の実施形態では、化学合成及びインビトロ転写の組合せを用いて、アセンブリーのためのＲＮＡセグメントを作製する。複数の実施形態では、化学合成によりｇＲＮＡを生産し、インビトロ転写により異種目的配列セグメントを生産する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、インビトロ転写は、より長いＲＮＡ分子の生産に、より適していると考えられる。一部の実施形態では、より高い割合の完全長転写物を得るために、インビトロ転写のための反応温度を低下させ、例えば、３７℃未満（例えば、０～１０℃、１０～２０℃又は２０～３０℃）にし得る（Ｋｒｉｅｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：６４６３（１９９０）を参照、尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、長い転写物の合成改善のためのプロトコルを使用して、長いＲＮＡ、例えば５ｋｂ超のＲＮＡを合成し、例えばＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して、２７ｋｂ転写物をインビトロで作製することができる（Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２（６）：１２７３－１２８１（２００１））。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に対する修飾は、ＲＮＡセグメントの合成中に組み込まれ得（例えば、修飾ヌクレオチドの含有又は別の結合化学によって）、その後、化学的若しくは酵素的プロセシングによるＲＮＡセグメントの合成、続いて、１つ若しくは複数のＲＮＡセグメントのアセンブリー又はそれらの組合せを実施する。
一部の実施形態では、線状化ＤＮＡ鋳型からのＴ７ポリメラーゼ媒介性ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写を用いて、システムのｍＲＮＡ（例えば、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）をインビトロで合成するが、この場合、ＵＴＰは、任意選択で１－メチルプソイドＵＴＰで置換されている。一部の実施形態では、転写物は、５’及び３’ＵＴＲ、例えば、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３４７５）及び
Figure 2023502473000755
 又はその機能性断片若しくは変異体を組み込み、任意選択で、ポリＡテイルを含み、これは、ＤＮＡ鋳型においてコードされるか、又は転写後、酵素により付加され得る。一部の実施形態では、ドナーメチル基、例えば、Ｓ－アデノシルメチオニンを、キャップ０構造を有するメチル化キャップＲＮＡに付加して、ｍＲＮＡ翻訳効率を高めるキャップ１構造を取得する（Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７））。
一部の実施形態では、Ｔ７プロモータからの転写物は、ＧＧＧモチーフで開始する。一部の実施形態では、Ｔ７プロモータからの転写物は、ＧＧＧモチーフで開始しない。転写開始地点のＧＧＧモチーフは、優れた収率を提供するにもかかわらず、鋳型鎖中の＋１から＋３の３つのＣ残基に対する転写物のずれ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）により、ポリ（Ｇ）産物のラダーを合成するＴ７ ＲＮＡＰをもたらす（Ｉｍｂｕｒｇｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（３４）：１０４１９－１０４３０（２０００）。別の５’ＵＴＲに合わせるための、転写レベルの調整及び転写開始部位ヌクレオチドの改変について、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ ４３３－４４３（２０１０）の教示には、これらの特性の両方を満たす、Ｔ７プロモータ変異体及びその発見方法が記載されている。
一部の実施形態では、共有結合によりＲＮＡセグメントを互いに結合し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、２つ以上のＲＮＡセグメントを互いに結合させることができる。ＲＮＡリガーゼなどの試薬を使用する場合、５’末端は、典型的に、３’末端に連結される。一部の実施形態では、２つのセグメントが結合されると、２つの線状構築物が形成される可能性がある（即ち（１）５’－セグメント１－セグメント２－３’及び（２）５’－セグメント２－セグメント１－３’）。一部の実施形態では、分子内環状化も起こり得る。これらの課題のいずれも、例えば、ＲＮＡリガーゼが、その末端を別の末端に連結することができないように、一方の５’末端又は一方の３’末端を遮断することにより対処することができる。複数の実施形態では、５’－セグメント１－セグメント２－３’の構築物が所望される場合、遮断基をセグメント１の５’末端又はセグメント２の３’末端に配置することにより、正しい線状連結産物のみの形成を達成し、且つ／又は分子内環状化を阻止することができる。２つの核酸（例えば、ＲＮＡ）セグメントの共有結合のための組成物及び方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に、２つの一本鎖ＲＮＡセグメントを互いに指向性連結させるためのＲＮＡリガーゼの使用を含む方法と一緒に、開示されている。
例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと一緒に使用され得る末端ブロッカーの一例は、ジデオキシターミネータである。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、典型的に、５’－リン酸及び３’－ヒドロキシル末端間のホスホジエステル結合のＡＴＰ依存性連結を触媒する。一部の実施形態では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いる場合、好適な末端が、連結される末端に存在しなければならない。末端上のＴ４ ＲＮＡリガーゼを遮断するための１つの手段は、正しい末端フォーマットを取得できないようにすることを含む。一般に、５－ヒドロキシル又は３’－リン酸を含むＲＮＡセグメントの末端は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの基質として作用しないであろう。
ＲＮＡセグメントを結合するために使用され得る別の例示的な方法は、クリック化学によるものである（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７５，２３４号明細書及び同第７，０７０，９４１号明細書並びに米国特許出願公開第２０１３／００４６０８４号明細書に記載される通り）。例えば、１つの例示的なクリック化学反応は、アルキン基とアジド基との間のものである（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書の図１１を参照）。ＲＮＡセグメントを連結するために、任意のクリック反応を使用することが可能である（例えば、Ｃｕ－アジド－アルキン、歪み促進型アジド－アルキン、シュタウディンガーライゲーション、テトラジン連結、光誘導型テトラゾール－アルケン、チオール－エン、ＮＨＳエステル、エポキシド、イソシアネート及びアルデヒド－アミノオキシ）。一部の実施形態では、クリック化学反応を用いるＲＮＡ分子の連結は、クリック化学反応が、高速で、モジュール式で、効率的であり、多くの場合、有毒な廃棄物を生成せず、溶媒として水を用いて実施することができ、且つ／又は立体特異的にセットアップすることができることから、有利である。
一部の実施形態では、アジド－アルキンヒュスゲン環化付加反応を用いて、ＲＮＡセグメントを結合し得、これは、典型的に、アジドと末端若しくは内部アルキンとの間の１，３－双極子環化付加反応であり、ＲＮＡセグメントの連結のための１，２，３－トリアゾールを付与する。特定の理論に束縛されることは意図しないが、この連結方法の１つの利点は、この反応が、必要なＣｕ（Ｉ）イオンの付加により開始され得ることであろう。ＲＮＡセグメントを結合することができる他の例示的な機構として、限定はしないが、ハロゲン（Ｆ－、Ｂｒ－、Ｉ－）／アルキン付加反応、カルボニル／スルフヒドリル／マレイミド及びカルボキシル／アミン連結の使用が挙げられる。例えば、一方のＲＮＡ分子を３’にてチオールで修飾し（ジスルフィドアミダイト及びユニバーサル支持体又はジスルフィド修飾支持体を用いて）、他方のＲＮＡ分子を５’にてアクリダイトで修飾し（アクリル酸ホスホロアミダイトを用いて）、次に２つのＲＮＡ分子をマイケル付加反応により結合することができる。この戦略は、複数のＲＮＡ分子を段階的に結合するのにも適用することができる。また、３つ以上（例えば、３、４、５、６つなど）のＲＮＡ分子を互いに連結するための方法も提供される。特定の理論に束縛されることは意図しないが、これは、所望のＲＮＡ分子が、約４０ヌクレオチドより長く、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に指摘されているように、化学合成の効率が低下するような場合に有意となり得る。
例示として、ｔｒａｃｒＲＮＡは、典型的に、約８０ヌクレオチド長である。こうしたＲＮＡ分子は、例えば、インビトロ転写又は化学合成などのプロセスにより生成され得る。一部の実施形態では、化学合成を用いて、このようなＲＮＡ分子を生成する場合、それらは、単一の合成生成物として生成されるか、又は２つ以上のＲＮＡセグメントを互いに連結することにより生成され得る。複数の実施形態では、３つ以上のＲＮＡセグメントを互いに連結する場合、異なる方法を用いて、個別のセグメントを互いに連結することができる。また、ＲＮＡセグメントを１つのポット（例えば、容器、ベッセル、ウェル、チューブ、プレート若しくは他の入れ物）内で、全て同時に、又は異なる時点で１つのポット内で、又は異なる時点で異なるポット内で互いに連結し得る。非限定的な例において、ＲＮＡセグメント１、２及び３を番号順にアセンブリングするために、まず初めにＲＮＡセグメント１及び２を５’から３’に互いに連結し得る。次に、反応生成物を反応混合物成分について（例えば、クロマトグラフィーにより）精製した後、３’末端とＲＮＡセグメント３の５’末端との結合のために、第２ポット内に配置することができる。続いて、最終反応生成物をＲＮＡセグメント３の５’末端に連結することができる。
別の非限定的な例では、ＲＮＡセグメント１（約３０ヌクレオチド）は、ｃｒＲＮＡとヘアピン領域１の１部分からなる標的遺伝子座認識配列である。ＲＮＡセグメント２（約３５ヌクレオチド）は、ヘアピン領域１の残り部分と、ヘアピン領域１及びヘアピン領域２間の線状ｔｒａｃｒＲＮＡの一部とを含む。ＲＮＡセグメント３（約３５ヌクレオチド）は、ヘアピン領域１及びヘアピン領域２間の線状ｔｒａｃｒＲＮＡの残り部分と、ヘアピン領域２の全部とを含む。この例では、ＲＮＡセグメント２及び３は、クリック化学を用いて、５’から３’に連結される。さらに、反応生成物の５’及び３’末端はいずれもリン酸化される。次に、３’末端ヒドロキシル基を有するＲＮＡセグメント１及びＴ４ ＲＮＡリガーゼと反応生成物を接触させて、ガイドＲＮＡ分子を生成する。
本発明の方法に従ってＲＮＡセグメントを結合するために、いくつかの別の連結化学を用い得る。そうした化学のいくつかは、米国特許出願公開第２０１６０１０２３２２Ａ１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表６に表示されている。
ベクター
本開示は、一部に、核酸、例えば本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸又はその両方を提供する。一部の実施形態では、ベクターは、選択マーカ、例えば、抗生物質耐性マーカを含む。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、カナマイシン耐性マーカである。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、βラクタム抗生物質に耐性を付与しない。一部の実施形態では、ベクターは、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、ベクターは、カナマイシン耐性マーカを含み、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれる（例えば、標的細胞、組織、器官又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）を含むベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、選択マーカは、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、ベクターの維持に関与する遺伝子又は配列（例えば、プラスミド維持遺伝子）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクター（例えば、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸又はその両方をコードする）を標的細胞、組織、器官又は対象へ投与することにより、前記標的細胞、組織、器官又は対象のゲノム中の１つ若しくは複数の標的部位へのベクターの１部分の組込みが起こる。一部の実施形態では、組み込まれた物質を含む標的部位の９９、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２若しくは１％未満（例えば、標的部位なし）が、ベクター由来の、選択マーカ（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）又は両方を含む。
ＡＡＶベクター
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、本明細書に記載の鋳型核酸又はその両方をコードするベクターは、例えば、ＡＡＶゲノムを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質及び３つのカプシドタンパク質をそれぞれコードする２つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、これらの遺伝子は、１４５ｂｐ逆位末端配列（ＩＴＲ）により両側がフランキングされている。一部の実施形態では、ビリオンは、例えば、１：１：１０の比で産生される、最大３つのカプシドタンパク質（Ｖｐ１、Ｖｐ２及び／又はＶｐ３）を含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレーム及び／又は異なるスプライシング（Ｖｐ１）並びに別の翻訳開始部位（それぞれ、Ｖｐ２及びＶｐ３）から産生される。一般に、Ｖｐ３は、ビリオン中で最も豊富なサブユニットであり、細胞表面での受容体認識に参加して、ウイルスの屈性を定める。一部の実施形態では、Ｖｐ１は、例えばＶｐ１のＮ末端において、ウイルスの感染力において機能するホスホリパーゼドメインを含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターのパッケージング能力は、ベクターにパッケージングされ得る塩基エディターのサイズを制限する。例えば、ＡＡＶのパッケージング能力は、例えば、１つ又は２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）、例えば１４５塩基ＩＴＲを含め、約４．５ｋｂ（例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５若しくは６．０ｋｂ）であり得る。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ベクタートランスジーンカセットをフランキングするシス作用性１４５ｂｐ ＩＴＲを含み、例えば、外来ＤＮＡのパッケージングのために最大４．５ｋｂを提供する。感染後、ｒＡＡＶは、いくつかの事例において、本明細書に記載のタンパク質を発現し、円形の頭－尾コンカテマー内にエピソームとして存在することにより、宿主ゲノムに組み込まれることなく存続する。ｒＡＡＶは、例えば、インビトロ及びインビボで使用することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ媒介遺伝子送達のために、遺伝子のコーディング配列の長さが野生型ＡＡＶゲノムと等しいか又はそれを超える必要がある。
上記サイズを超える遺伝子のＡＡＶ送達及び／又は大きい生理学的調節エレメントの使用は、例えば、送達しようとするタンパク質を２つ以上の断片に分割することにより、達成することができる。一部の実施形態では、Ｎ－末端断片をスプリットインテイン－Ｎと融合させる。一部の実施形態では、Ｃ－末端断片をスプリットインテイン－Ｃと融合させる。複数の実施形態では、上記断片を２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングする。
一部の実施形態では、大きいトランスジーン発現カセットを２つの個別の半分（５及び３末端又は頭及び尾）に分割することにより、デュアルＡＡＶベクターを作製し、例えば、カセットの各半分を単一のＡＡＶベクター（＜５ｋｂ）にパッケージングする。次に、一部の実施形態では、両方のデュアルＡＡＶベクターによる同じ細胞の同時感染時に、完全長トランスジーン発現カセットの再アセンブリーを達成することができる。一部の実施形態では、同時感染後、（１）５及び３ゲノム同士の相同組換え（ＨＲ）（デュアルＡＡＶ重複ベクター）；（２）ＩＴＲ媒介による５及び３ゲノムの尾－頭コンカテマー化（デュアルＡＡＶトランス－スプライシングベクター）；及び／又は（３）これら２つの機構の組合せ（デュアルＡＡＶハイブリッドベクター）の１つ若しくは複数が続く。一部の実施形態では、インビボでのデュアルＡＡＶベクターの使用により、完全長タンパク質の発現が達成される。一部の実施形態では、デュアルＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９又は５．０ｋｂ超のトランスジーンのための効率的且つ実行可能な遺伝子移入戦略を表している。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生産において、標的核酸で細胞を形質導入するために使用することもできる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、インビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい；尚、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。組換えＡＡＶベクターの構築については、いくつかの刊行物に記載されており、そうしたものとして、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（例えば、１つ若しくは複数のガイド核酸を含む又は含まない）は、ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド若しくはウイルスベクタータイプを用いて送達することができ、とりわけ、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）及び米国特許第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスに関係する臨床試験及びそうした臨床試験に関する刊行物から得られる製剤及び用量を用いて、送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書に記載される通り、且つＡＡＶに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書に記載される通り、且つアデノウイルスに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書に記載される通り、且つプラスミドに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）を基準とするか、又はそれに外挿し得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物について調節することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、健康全般、他の状態を含む通常の要因並びに対処しようとする具体的な病状又は症状に応じて、医学又は獣医療専門家（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。一部の実施形態では、ウイルスベクターを目的の組織に注射することができる。細胞型特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの場合、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及び任意選択のガイド核酸の発現は、一部の実施形態では、細胞型特異的プロモータによって駆動することができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法のために、低毒性を可能にする。一部の実施形態では、ＡＡＶは、例えば、それが実質的に宿主ゲノムに組み込まれないことから、挿入突然変異誘発を引き起こす低い可能性を可能にする。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、約４．４、４．５、４．６、４．７又は４．７５ｋｂのパッケージング範囲を有する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ、プロモータ及び転写ターミネーターは、単一のウイルスベクターに適合することができる。ＳｐＣａｓ９（４．１ｋｂ）は、いくつかの事例において、ＡＡＶにパッケージングするのが困難となり得る。そのため、一部の実施形態では、他のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又は塩基エディターよりも長さが短いＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを使用する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒは、約４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ又は１．５ｋｂ未満である。
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶの種類は、ターゲティングしようとする細胞に関して選択され；例えば、脳又はニューロン細胞をターゲティングするために、ＡＡＶ血清型１、２、５若しくはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せを選択することができるか；或いは心臓組織をターゲティングするためにＡＡＶ４を選択することができる。一部の実施形態では、肝臓への送達のために、ＡＡＶ８を選択する。これらの細胞に関する例示的なＡＡＶ血清型は、例えば、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、あらゆる血清型、サブタイプ及び天然に存在するＡＡＶ並びに組換えＡＡＶを指す。ＡＡＶが用いられるとき、ウイルス自体又はその誘導体を指す場合もある。一部の実施形態では、ＡＡＶとして、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ １２、ｒｈｌＯ及びそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ及びヒツジＡＡＶが挙げられる。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列並びにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。こうした配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公式データベースで見出すことができる。別の例示的なＡＡＶ血清型を表５に挙げる。
Figure 2023502473000756
一部の実施形態では、医薬組成物（例えば、本明細書に記載のＡＡＶを含む）は、１０％未満の空のカプシド、８％未満の空のカプシド、７％未満の空のカプシド、５％未満の空のカプシド、３％未満の空のカプシド又は１％未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、約５％未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、空のカプシドの数は、検出限界未満である。一部の実施形態では、例えば、空のカプシドは、有害な反応（例えば、免疫応答、炎症性応答、肝臓の反応及び／又は心臓の反応）を起こす恐れがあり、例えば、実質的な治療利益がほとんど若しくは全くないことから、医薬組成物は少量の空のカプシドを有するのが有利である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質（ｒＨＣＰ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１００ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ、例えば、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１～５０ｎｇ／ｍｌのｒＨＣＰである。一部の実施形態では、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０ｎｇ未満のｒＨＣＰ若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり５ｎｇ未満のｒＨＣＰ、１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ未満のｒＨＣＰ若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり３ｎｇ未満のｒＨＣＰ又はこれらの間の任意の濃度を含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌのｈｃＤＮＡである。一部の実施形態では、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ当たり５．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり２．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．０×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．９×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．８×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ又はこれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０５ｐｇ／ｍｌ以下、１×１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ又は１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留ＤＮＡプラスミドは、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり８．０×１０５ｐｇ未満又は１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ未満である。一部の実施形態では、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．５ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．３ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満又は任意の中間濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。複数の実施形態では、医薬組成物中のベンゾナーゼは、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．１ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０８ｎｇ未満又は任意の中間濃度である。複数の実施形態では、医薬組成物中のポロキサマー１８８は、約１０～１５０ｐｐｍ、約１５～１００ｐｐｍ又は約２０～８０ｐｐｍである。複数の実施形態では、医薬組成物中のセシウムは、５０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満若しくは２０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満又は任意の中間濃度である。
複数の実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又はそれらの間の任意のパーセンテージの総不純物を含む。複数の実施形態では、総不純物は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、９０％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、単一の不特定関連不純物はいずれも、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、５％超、４％超、３％超若しくは２％超又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、医薬組成物は、総カプシド（分析用超遠心により測定して、ピーク１＋ピーク２）に対して、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９１．９％超、９２％超、９３％超のパーセンテージ又はそれらの間の任意のパーセンテージの充填カプシドを含む。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク１で測定した充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２５～７５％、３０～７５％、３５～７５％又は３７．４～７０．３％である。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク２で測定した充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２０～７０％、２２～６５％、２４～６２％又は２４．９～６０．１％である。
一実施形態では、医薬組成物は、１．０～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．２～３．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を含む。一実施形態では、医薬組成物は、５ＣＦＵ／ｍＬ未満、４ＣＦＵ／ｍＬ未満、３ＣＦＵ／ｍＬ未満、２ＣＦＵ／ｍＬ未満若しくは１ＣＦＵ／ｍＬ未満又は任意の中間濃度の生物学的負荷を示す。複数の実施形態では、ＵＳＰ、例えば、ＵＳＰ＜８５＞（その全体が参照により組み込まれる）に従うエンドトキシンの量は、１．０ＥＵ／ｍＬ未満、０．８ＥＵ／ｍＬ未満又は０．７５ＥＵ／ｍＬ未満である。複数の実施形態では、ＵＳＰ、例えば、ＵＳＰ＜７８５＞（その全体が参照により組み込まれる）に従う医薬組成物の浸透圧は、３５０～４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３７０～４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ又は３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇである。複数の実施形態では、医薬組成物は、１容器当たり１２００個未満の２５μｍ超の粒子、１容器当たり１０００個未満の２５μｍ超の粒子、１容器当たり５００個未満の２５μｍ超の粒子又は任意の中間値を含有する。複数の実施形態では、医薬組成物は、１容器当たり１０，０００個未満の１０μｍ超の粒子、１容器当たり８０００個未満の１０μｍ超の粒子又は１容器当たり６００個未満の１０ｐｍ超の粒子を含有する。
一実施形態では、医薬組成物は、０．５～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．０～４．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．５～３．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を有する。一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、以下の１つ若しくは複数を含む：１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、約３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０～８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留ＤＮＡプラスミド、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、ｐＨ７．７～８．３、約３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、容器当たり約６００個未満の粒径＞２５μｍの粒子、容器当たり約６０００個未満の粒径＞１０μｍの粒子、約１．７×１０１３～２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８～８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００～３００ｐｇの総タンパク質、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターを用いたＡ７ＳＭＡマウスで＞２４日の平均生存期間、インビトロ細胞アッセイに基づき約７０～１３０％の相対効力及び／又は約５％未満の空のカプシド。様々な実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書で扱うウイルス粒子のいずれかを含み、参照基準の±２０％の間、±１５％の間、±１０％の間又は±５％の間の効力を保持する。一部の実施形態では、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて、効力を測定する。
ＡＡＶ粒子の別の調製、特性決定及び投与方法は、国際公開第２０１９０９４２５３号パンフレット（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
本発明と一致して使用することができる別のｒＡＡＶ構築物として、表１を含めて、／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７３－０１９－００１２－９で入手可能なＷａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１９（その全体が、参照により組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
キット、製品及び医薬組成物
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）及び鋳型ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、キットはさらに、細胞にシステムを導入するための試薬、例えば、トランスフェクション試薬、ＬＮＰなども含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに好適である。一部の実施形態では、キットは、製品内に配置されるような、１つ若しくは複数のエレメント、例えば、組成物（例えば、医薬組成物）、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ及び／又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム又はその機能性断片若しくは成分を含む。一部の実施形態では、キットは、その使用説明書を含む。
一態様では、本開示は、製品、例えば、その中に本明細書に記載のキット又はその要素が配置される製品を提供する。
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又はＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、鋳型ＤＮＡを含む。
化学、製造及び制御（ＣＭＣ）
タンパク質治療薬の精製は、例えば、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により生産されたＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＤＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。従って、本開示は、いくつかの態様において、例えば前記品質基準が検定される、特定の品質基準を満たすＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド及び／又は鋳型核酸を製造する方法に関する。本開示は、いくつかの態様において、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム、ポリペプチド及び／又は鋳型核酸で前記品質基準を検定する方法にも関する。一部の実施形態では、品質基準として、限定されないが、以下の１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）が挙げられる：
（ｉ）鋳型ＤＮＡ又はＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡの長さ、例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するＤＮＡ又はｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、１００、１２５、１５０、１７５若しくは２００ヌクレオチド長を超えるか否か；
（ｉｉ）ｍＲＮＡ上のポリＡテイルの存在、非存在及び／又は長さ、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、ポリＡテイルを含む（例えば、長さが、少なくとも５、１０（配列番号３５４０）、２０（配列番号３５４１）、３０（配列番号３５４２）、５０（配列番号３５４３）、７０（配列番号３５４４）、１００（配列番号３５４５）ヌクレオチド長のポリＡテイル）を含むか否か；
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ上の５’キャップの存在、非存在及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、５’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、７－メチルグアノシンキャップ、例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップであるか否か；
（ｉｖ）ｍＲＮＡ中の１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）又はロックドヌクレオチドから選択される）の存在、非存在及び／又は種類、例えば、存在するｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か；
（ｖ）鋳型ＤＮＡ又はｍＲＮＡの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えばＤＮＡ又はｍＲＮＡの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、安定性試験後、インタクトなままである（例えば、１００、１２５、１５０、１７５若しくは２００ヌクレオチド長を超える）か否か；
（ｖｉ）ＤＮＡの修飾に関するシステム中の鋳型ＤＮＡ又はｍＲＮＡの効力、例えばＤＮＡ又はｍＲＮＡを含むシステムを効力について検定した後、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；
（ｖｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドの長さ、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００若しくは６００アミノ酸長以下である）か否か；
（ｖｉｉｉ）ポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドに対する翻訳後修飾の存在、非存在及び／又は種類、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、リン酸化、メチル化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、グリピヤチヨン（ｇｌｉｐｙａｔｙｏｎ）若しくはリポイル化又はそれらの任意の組合せを含むか否か；
（ｉｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチド中の１つ若しくは複数の人工、合成又は非標準アミノ酸（例えば、オルニチン、β－アラニン、ＧＡＢＡ、δ－アミノレブリン酸、ＰＡＢＡ、Ｄ－アミノ酸（例えば、Ｄ－アラニン若しくはＤ－グルタミン酸）、アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、シスタチオニン、ランチオニン、ジェンコル酸（Ｄｊｅｎｋｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ジアミノピメリン酸、ホモアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、ホモノルロイシン、ホモセリン、Ｏ－メチル－ホモセリン及びＯ－エチル－ホモセリン、エチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、セレノメチオニン、セレノエチオニン、テルロシステイン若しくはテルロメチオニン）の存在、非存在及び／又は種類、例えば、ポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、１つ若しくは複数の人工、合成又は非標準アミノ酸を含むか否か；
（ｘ）ポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えばポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、安定性試験後、インタクトなままである（例えば、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００若しくは６００アミノ酸長以下である））か否か；
（ｘｉ）ＤＮＡの修飾についてのシステム中のポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドの効力、例えばポリペプチド、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドを含むシステムを効力について検定した後、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；又は
（ｘｉｉ）パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在及び／若しくはレベル、例えば、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか若しくは実質的に含まないか否か。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は医薬組成物は、エンドトキシンを含まない。
一部の実施形態では、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体及び／又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在及び／若しくはレベルを決定する。複数の実施形態では、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体及び／又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか若しくは実質的に含まないか否かを決定する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物又はシステムは、以下の特徴の１つ又は複数（例えば、１、２、３若しくは４つ）を有する：
（ａ）例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、ポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
例示的な異種目的配列
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列を含み、異種目的配列又はその逆相補的配列は、タンパク質（例えば、抗体）又はペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療法は、ＦＤＡなどの規制機関により承認されているものである。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、ＴＨＰｄｂデータベース（Ｕｓｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（７）：ｅ０１８１７４８（２０１７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表５Ｂに開示されるタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを含むもの）を用いて、表５Ｂからのタンパク質又はペプチドの発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主でのタンパク質又はペプチドの発現を可能にし得る。一部の実施形態では、表５Ｂの第１列中のタンパク質又はペプチドの配列は、表５Ｂの第３列に提供される特許又は出願（その全体が、参照により組み込まれる）に見出すことができる。
一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２７（１）：１（２０２０）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）の表１に開示される抗体である。一部の実施形態では、タンパク質又はペプチドは、表２９に開示される抗体である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム又は方法（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒを含むもの）を用いて、表２９からの抗体の発現カセットを宿主細胞に組み込んで、宿主での抗体の発現を可能にし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法を用いて、表２９の第２列の標的に結合する薬剤（例えば、表２９の第１列のモノクローナル抗体）を、表２９の第３列の適応症を有する対象に発現させる。
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用途
本明細書に記載されるシステムを用いて、任意選択で、本明細書に記載される送達方法
（ナノ粒子送達方法、例えば脂質ナノ粒子及びウイルス送達方法、例えばＡＡＶを含む）のいずれかを用いて、本発明は、ＤＮＡ分子、例えば核ＤＮＡ、即ち細胞のゲノム中のＤＮＡを、インビトロでも、エクスビボでも、インサイチュでも、インビボでも、例えば生物、例えば哺乳動物対象、例えばヒトを含む対象の組織中で修飾するための用途（方法）も提供する。コーディング遺伝子をＤＮＡ配列鋳型に組み込むことにより、例えば、機能喪失型変異を有する個体において治療トランスジーンの発現を提供することにより（例えば本明細書に記載されるような目的配列に含まれる）、機能獲得型変異を正常なトランスジーンで置換することにより、機能獲得型変異発現を排除するために調節配列を賦与することにより、且つ／又は作動可能に連結した遺伝子、トランスジーン及びそのシステムの発現を制御することにより、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、治療ニーズに対処することができる。特定の実施形態では、目的配列（例えば、異種目的配列）は、宿主細胞の治療ニーズに特異的な機能性エレメント（例えば、本明細書に記載される、例えばポリペプチド若しくはノンコーディングＲＮＡ）をコードするコーディング配列を含む。一部の実施形態では、目的配列（例えば、異種目的配列）は、プロモータ、例えば組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含む。ある実施形態では、プロモータは、コーディング配列と作動可能に連結させることができる。
特定の態様では、本発明は、細胞、組織又は対象中で標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法であって、本明細書に記載されるシステムを（任意選択で、本明細書に記載される方法により）細胞、組織又は対象に投与することを含み、上記システムは、異種目的配列を標的ＤＮＡ鎖に挿入し、それにより上記標的ＤＮＡ鎖を修飾する、方法を提供する。特定の実施形態では、従って、異種目的配列は細胞、組織又は対象中で発現される。一部の実施形態では、細胞、組織又は対象は、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞、組織又は対象である。このように修飾される例示的な細胞としては、肝細胞、肺上皮、塩類細胞が挙げられる。このような細胞は、初代細胞であり得るか、又は不死化されていなくてよい。関連態様では、本発明は、本明細書に記載されるシステムを哺乳動物に投与することを含み、それにより組織を処置する、哺乳動物組織を処置する方法であって、上記組織は、異種目的配列を欠損する方法も提供する。上記態様及び実施形態のいずれかの特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、一過的に存在する核酸として提供される。
一部の実施形態では、本発明のシステムは、標的ＤＮＡ中の挿入を生成することができる。本明細書に記載されるシステムは、外性非コード核酸、例えばｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ｇＲＮＡ若しくはｒＲＮＡの発現、タンパク質コード配列、例えば治療用タンパク質若しくは調節タンパク質の発現、調節エレメント、例えば、プロモータ、エンハンサー、転写因子結合部位、エピジェネティック修飾因子部位、ｍｉＲＮＡ結合部位、スプライスドナー若しくはアクセプター部位若しくはターミネーター配列の組込み又は他のＤＮＡ配列、例えばスペーサの組込みをもたらすことができることが確認される。挿入の含有物及び状況に応じて、外性タンパク質を発現させるか、又は内在性タンパク質若しくは細胞システムの発現を改変することがこうして可能である。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、挿入突然変異により、例えば、コード又は調節領域への挿入ＤＮＡの組込みにより内在性遺伝子をノックアウトすることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、内在性遺伝子又は遺伝子座へのトランスジーンカセットをコードする挿入ＤＮＡの組込みを媒介することにより、トランスジーンカセット、例えば、ＣＡＲの発現を同時にトリガーする一方、内在性遺伝子又は遺伝子座、例えば、ＴＲＡＣの発現を破壊することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、内在性アレルにトランスジーン発現カセットを組み込むことによりアレルを置換し、こうしてその発現を破壊することができる。
複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、例えば、代用血液因子又は代用酵素、例えばリソソーム酵素を発現する治療剤（例えば治療トランスジーン）を含む目的配列を提供することができる。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、ファブリー病治療のためのアガルシダーゼアルファ又はベータ；ゴーシェ病のためのイミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ又はアルグルセラーゼ；リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ウォルマン病／ＣＥＳＤ）のためのセベリパーゼアルファ；ムコ多糖症のためのラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ又はガルスルファーゼ；ポンペ病のためのアルグルコシダーゼを発現するのに有用である。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、血液因子欠損症のための因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ又はＸＩＩＩを発現するのに有用である。
一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、オルガネラタンパク質、例えばミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質又は膜タンパク質）をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、膜タンパク質、例えばＣＡＲ以外の膜タンパク質及び／又は内在性ヒト膜タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞外タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、酵素、構造タンパク質、シグナリングタンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサリータンパク質、運動タンパク質、防御タンパク質又は貯蔵タンパク質をコードする。他のタンパク質としては、免疫受容体タンパク質、例えば合成免疫受容体タンパク質、例えばキメラ抗原受容体タンパク質（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体又は抗体が挙げられる。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、免疫細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、Ｔ細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞としては、Ｔ細胞の任意の部分集団、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ガンマ－デルタ、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞又は部分集団の混合物を挙げることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、Ｔ細胞中でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を送達又は修飾することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞に送達することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、少なくとも１つのＣＡＲをナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に送達することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、少なくとも１つのＣＡＲをナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に送達することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）システムを用いて、少なくとも１つのＣＡＲを子孫細胞、例えば、Ｔ、ＮＫ又はＮＫＴ細胞の子孫細胞に送達することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲで修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）又は少なくとも１つのＣＡＲで修飾された細胞の組合せ（例えば、ＣＡＲ－ＮＫ／Ｔ細胞の混合物）を用いて、ＭａｃＫａｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８、２３３－２４４（２０２０）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）におけるＣＡＲ療法のターゲティング可能な背景で特定される病態を処置する。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＡＣｈＲ（胎児アセチルコリン受容体）、ＡＤＧＲＥ２、ＡＦＰ（アルファフェトプロテイン）、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＬＬＩ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６９、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ１、ＥＧＰ－２（上皮糖タンパク質－２）、ＥＧＰ－４０（上皮糖タンパク質－４０）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２、ヒト上皮成長因子受容体２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、Ｆｌｔ３受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＧＤ３（ガングリオシドＧ３）、ＧＰＣ３（グリピカン－３）、ＧＰＩ００、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン６受容体、ＩＬ１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体３０サブユニットアルファ－２）、カッパ軽鎖、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＬｅＹ（ルイスＹ）、Ｌ１ＣＡＭ（ＬＩ細胞接着分子）、ＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２）、ＭＡＲＴＩ、ＭＡＧＥ－Ａ１（黒色腫関連抗原Ａｌ）、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＵＣ１６（ムチン１６）、ＭＵＣＩ（ムチンＩ）、ＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１（癌精巣抗原）、ＰＲＩ（プロテイナーゼ３）、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、ＴＦＭ－３、ＴＡＣＩ、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ｐ５３、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ｈＲＯＲｌ、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ＶＥＧＦ－Ｒ２（血管内皮成長因子Ｒ２）、ＷＴ－１（ウィルムス腫瘍タンパク質）及びＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバールウイルス）、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）の抗原からなる群から選択される腫瘍又は病原体抗原に特異的なＣＡＲを含む。
一部の実施形態では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又は子孫細胞がエクスビボで修飾され、次いで患者に送達される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは本明細書で挙げた方法の１つにより送達され、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又は子孫細胞は、患者中においてインビボで修飾される。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、標的細胞の複数の修飾を同時に又は連続に作製することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、既に修飾された細胞をさらに修飾することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、相補的技術により編集された細胞、例えば、遺伝子編集細胞、例えば、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲノックアウトを有する細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、事前に編集された細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、事前の修飾は、Ｔ細胞中の遺伝子ノックアウト、例えば、内在性ＴＣＲ（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ）、ＨＬＡクラスＩ（Ｂ２Ｍ）、ＰＤ１、ＣＤ５２、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＤＧＫノックアウトを含む。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、事前に修飾されたＴ細胞にＴＣＲ又はＣＡＲを挿入する。
投与
本明細書に記載の組成物及びシステムは、インビトロ又はインビボで使用され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、例えば、インビトロ又はインビボで細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）に送達される。当業者であれば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの成分が、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びそれらの組合せの形態で送達され得ることは理解されよう。
複数の実施形態では、システム及び／又はシステムの成分は、核酸として送達される。例えば、リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの形態で送達され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分（例えば挿入ＤＮＡ及びリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸分子）は、１、２、３、４つ又はそれを超える個別の核酸分子上で送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びＲＮＡの組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドはタンパク質として送達される。
一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ベクターを用いて、細胞、例えば、哺乳動物細胞又はヒト細胞に送達される。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスであり得る。一部の実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ又はインサイチュである。一部の実施形態では、ウイルスは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスである。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ウイルス様粒子又はビロソームを用いて細胞に送達される。一部の実施形態では、送達には、ウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームを使用する。
一部の実施形態では、リコンビナーゼは、線状又は環状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ上で活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、ＤＮＡが細胞中で一本鎖から二本鎖に変換された後、ＤＮＡ上で活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、ＤＮＡが細胞中でコンカテマーを形成した後、ＤＮＡ上で活性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、挿入ＤＮＡが一本鎖から二本鎖に変換された後、細胞に送達されるか又は細胞中で発現される。
一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸の５’及び３’側に存在する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、適合性スペーサ領域及び中央ジヌクレオチドを有するａｔｔＢ及びａｔｔＰである。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、挿入ＤＮＡ上又はゲノム中の標的部位のリコンビナーゼ認識配列と異なるスペーサ領域及び／又は中央ジヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は、挿入ＤＮＡ上又はゲノム中のリコンビナーゼ認識部位と相互作用しない。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする核酸に直接隣接する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼの遺伝子発現単位に対して外性である。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列（例えば、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ）は、同じ５’から３’配向にある。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識配列（例えば、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ）は、反対の５’から３’配向にある。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチドは、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸の５’及び３’側にある認識配列を組み換え、リコンビナーゼ遺伝子発現の低減をもたらす。
一部の実施形態では、複数のリコンビナーゼ認識配列が挿入ＤＮＡ上に存在する。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、２つ以上の認識配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、３つ以上の認識配列を含む。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡは、互いに適合性である２つの認識配列（例えば、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ）、と、挿入ＤＮＡ上の他の認識配列と不適合性である第３認識配列（例えば、ａｔｔＢ又はａｔｔＰ）とを含む。一部の実施形態では、互いに適合性である挿入ＤＮＡ上の認識配列は、標的ゲノム中の認識配列と適合性でない。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ上の他の認識配列と不適合性である挿入ＤＮＡ上の認識配列は、標的ゲノム中の認識配列と適合性である。一部の実施形態では、互いに適合性である認識配列は、適合性スペーサ領域及び中央ジヌクレオチドを有し、不適合性である認識配列は、不適合性スペーサ領域及び中央ジヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、挿入ＤＮＡ上の適合性認識配列は、同じ５’から３’配向にある。一部の実施形態では、リコンビナーゼは、挿入ＤＮＡ上の適合性認識配列上で作用して環状ＤＮＡを形成する。一部の実施形態では、得られる環状ＤＮＡは、ａｔｔＬと、ａｔｔＲと、ａｔｔＰ又はａｔｔＢ配列のいずれかとを含み、ａｔｔＰ又はａｔｔＢ配列は、標的ゲノム中の認識配列と適合性である。一部の実施形態では、本明細書に記載される複数のリコンビナーゼ認識配列は、ウイルスベクターゲノム中に存在する。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムは、リポソーム又は他の類似の小胞体中に製剤化することができる。リポソームは、内部水性コンパートメントを取り囲む単層又は多重層脂質二重膜と、比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重膜から構成される球状の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、非中毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらのカーゴをプラズマ酵素による分解から保護すると共に、それらのロードを生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を介して輸送することができる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から製造することができるが；薬物担体としてリポソームを作製するためにリン脂質が最も一般的に使用される。多重層小胞脂質の調製方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照；多重層小胞脂質の調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置又は押出機を用いて振盪の形態で力を加えることにより、それを促進することもできる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７（押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、サイズ漸減フィルタを介した押出により調製することができる。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の医薬組成物のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体のもう１つの例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保持し、薬物安定性及び負荷容量を向上させると共に、薬物漏出を防ぐ、修飾固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的に対して薬物送達を効果的に指向し、薬物安定性及び薬物放出制御を改善する。また、脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）、即ちリポソーム及びポリマーを組み合わせた新しいタイプの担体を使用し得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの相補的利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは良好な生体適合性を賦与する。このように、２つの成分は、薬物封入効率を高め、表面修飾を促進すると共に、水溶性薬物の漏出を防ぐ。例えば、論評については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
また、本明細書に記載の組成物及びシステム用の薬物送達ビヒクルとしてエキソソームを使用することもできる。例えば、論評については、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムの少なくとも１つの成分は、フソソームを含む。フソソームは、標的細胞と相互作用して、それと融合することから、様々な分子の送達ビヒクルとして用いることができる。フソソームは、概して、管腔又は空洞を封入する両親媒性脂質の二重層及び両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンから構成される。フソゲン成分は、融合及びペイロード送達のための標的細胞特異性を付与し、プログラム可能な細胞特異性を備える送達ビヒクルの作製を可能にするために操作可能であることが明らかにされている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットにおけるフソソーム設計、調製及び使用に関するセクションを参照されたい）。
ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムを細胞、組織及び多細胞生物に導入することができる。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、機械的手段又は物理的手段を用いて、細胞に送達される。
タンパク質治療薬の製剤化は、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液又は他の細胞若しくは組織型からの組織若しくは細胞に送達される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、癌、炎症性疾患、感染症、遺伝子異常又は他の疾患などの疾患を処置する。癌は、大脳、小脳、副腎、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、乳房、脾臓、扁桃腺、胸腺、リンパ節、骨髄、肺、心筋、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、唾液腺、腎臓、前立腺、血液又は他の細胞若しくは組織型の癌であり得、複数の癌を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、経腸投与（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下又は口腔投与）により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、硬膜外、脳内、脳室内、皮膚上、鼻内、動脈内、関節内、海綿体内、眼内、骨髄内輸液、腹腔内、髄腔内、子宮内、膣内、膀胱内、血管周囲又は経粘膜投与）により投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムは、局所投与（例えば、経皮投与）により投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、動物細胞、植物細胞又は真菌細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラマ、アルパカ、ラクダ、ヤク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ又はダチョウ）由来の細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞又は真菌細胞を修飾するために、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを実験ツール若しくは研究ツールとして使用するか、又は実験方法若しくは研究方法に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、タンパク質、鋳型若しくは異種目的配列を（例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞又は真菌細胞において）発現させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いて、誘導性プロモータ（例えば、小分子誘導性プロモータ）の制御下で、タンパク質、鋳型若しくは異種目的配列を発現させることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステム又はそのペイロードを、例えば、誘導性プロモータの使用により、調整可能な制御のために設計する。例えば、目的の遺伝子を駆動するプロモータ、例えばＴｅｔは、組込み時にサイレントであり得るが、いくつかの事例では、小分子誘導剤、例えば、ドキシサイクリンへの曝露時に活性化され得る。一部の実施形態では、調整可能な発現は、遺伝子（例えば、治療用遺伝子）の処置後制御を可能にし、例えば、小分子依存性投与効果を可能にする。複数の実施形態では、小分子依存性投与効果は、例えば、局所投与により、時間的及び／又は空間的に、遺伝子産物のレベルを変化させることを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムで使用されるプロモータは、誘導性、例えば、宿主の内在性分子及び／又はそこに投与された外性小分子に対して応答性であり得る。
好適な適応症の処置
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは核酸）を用いて、疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分を用いて、表Ｘ１～Ｘ６のいずれかに列挙される疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表Ｘ１に列挙される造血幹細胞（ＨＳＣ）疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表Ｘ２に列挙される腎臓疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表Ｘ３に列挙される肝臓疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表Ｘ４に列挙される肺疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表Ｘ５に列挙される骨格筋疾患、障害又は病状を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム又はその成分若しくは部分を用いて、例えば表Ｘ６に列挙される皮膚疾患、障害又は病状を処置する。
表Ｘ１～Ｘ６：リコンビナーゼに使用されるトランスＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒに関して選択される適応症
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一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて健康な個体を、例えば、予防療法として処置することができる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、一部の実施形態では、目的の疾患に対して保護性であることが示されている突然変異、例えば、ノックアウト突然変異を作製するようにターゲティングすることができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて保護アレル、例えば、特定の疾患を発症するリスクを低下させるタンパク質の変異体を発現するトランスジーンをゲノムに挿入することができる。一部の実施形態では、トランスジーンの組込みを用いて、１つ又は複数の追加コピーを提供することにより内在性タンパク質のレベルを増加させる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて調節エレメント、例えば、プロモータ、エンハンサー、転写因子結合部位、ｍｉＲＮＡ結合部位又はエピジェネティック修飾部位を取り込んで、疾患リスクを低減させるか、又はその重症度を下げるように内在性遺伝子の発現を改変することができる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、疾患リスクを増加させるアレルを除去するか、又はアレルを、疾患保護を付与するものに改変するように内在性タンパク質の１つ又は複数のエキソンを置き換えることができる。
植物修飾方法
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを用いて、例えば植物の適応度を高めるために、植物又は植物部分（例えば、葉、根、花、果実若しくは種子）を修飾することができる。
Ａ．植物への送達
本明細書には、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物に送達する方法が提供される。植物又はその部分をＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムと接触させることにより、植物にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する方法が含まれる。これらの方法は、例えば、植物の適応度を高める目的で、植物を修飾するために有用である。
より具体的には、一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸）をベクター内でコードし得、例えば植物ベクター（例えば、ｐＨＵＣ４１１）中の植物プロモータ、例えばトウモロコシユビキチンプロモータ（ＺｍＵＢＩ）に隣接して挿入し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸を、アグロバクテリア（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を介して、植物（例えば、ジャポニカ米（ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ））又は植物の一部（例えば、植物のカルス）に導入する。一部の実施形態では、植物遺伝子（例えば、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））をヌルアレル（例えば、開始コドンに塩基置換を含む）で置換することにより、本明細書に記載のシステム及び方法を植物に使用することができる。植物ゲノムを修飾するためのシステム及び方法は、Ｘｕ ｅｔ．ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｒｉｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，２０２０，Ｐｌａｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓに記載されている。
一態様では、植物の適応度を高める方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置の植物（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達されていない植物）と比較して、植物の適応度を高めるために、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを（例えば、有効な量及び期間で）植物に送達するステップを含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、いくつかの方法で維持することができ、例えば、それにより、植物の生産改善、例えば、収率の向上、植物の成長力若しくは植物から収穫された産物の品質の向上、農業若しくは園芸に関して望ましいとみなされる収穫前後の特徴（例えば、味、外観、貯蔵寿命）の改善又はそれ以外にヒトに有益な特徴改善（例えば、アレルゲン生成の低減）が達成される。植物の収率改善は、同じ条件下であるが、本組成物の適用なしで生産された植物の同じ産物の収率に対して、或いは従来の植物修飾剤の適用と比較して、測定可能な量による、植物の産物の収率の増加（例えば、植物バイオマス、穀粒、種子若しくは果実収率、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積により測定可能な）に関する。例えば、収率は、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％又は１００％超増加し得る。いくつかの事例では、本方法は、非処置植物と比較して、収率を約２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍又は１００倍超増加するのに有効である。収率は、植物の重量若しくは体積又は何らかの基準に基づく植物の産物に関して表すことができる。基準は、時間、栽培面積、生産される植物の重量又は使用される原材料の量に関して表すことができる。例えば、こうした方法は、限定されないが、種子、果実、穀粒、実、塊茎、根及び葉などの植物組織の収率を増加し得る。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの送達の結果としての植物の適応度増大は、他の手段、例えば、同じ条件下であるが、本組成物の投与なしで又は従来の植物修飾剤を適用して、生産された植物の産物の同じ要因と比較して、測定可能若しくは認識可能な量による、成長力評価、群落（面積単位当たりの植物の数）、植物の高さ、茎の状況、茎の長さ、葉の数、葉のサイズ、林冠、外観（例えば、濃い緑色の葉の色など）、根評価、出芽、タンパク質含量、分けつ増加、葉のサイズの増加、葉の増加、根出葉の減少、より強い新芽、必要な肥料の減少、必要な種子の減少、より生産性の高い新芽、より早い開花、より早い穀粒若しくは種子成熟、植物の傾き（ｖｅｒｓｅ）（倒伏）の減少、シュートの成長増大、より早期の発芽又はこれらの要因の任意の組合せの増大若しくは改善によって測定することもできる。
従って、本明細書には、植物を修飾する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかを有効な量で植物に送達するステップを含み、ここで、上記方法は、植物を修飾し、それにより、非処置植物と比較して、植物に有益な特徴を導入するか、又はそれを（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加する。特に、本方法は、非処置植物と比較して、植物適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加し得る。
いくつかの事例では、植物適応度の増加は、疾患耐性、干ばつ耐性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草剤耐性、薬剤耐性、水使用効率、窒素利用、窒素ストレス耐性、窒素固定、害虫耐性、草食動物耐性、病原体耐性、収率、水制限条件下での収率、成長力、成長、光合成能力、栄養、タンパク質含量、炭水化物含量、油含量、バイオマス、シュート長さ、根長さ、根構造、種子重量又は収穫可能な産物の量の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超の）増加である。
いくつかの事例では、適応度の増加は、発育、成長、収率、非生物ストレス源に対する耐性又は生物ストレス源に対する耐性の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超の）増加である。非生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、干ばつストレス、塩ストレス、熱ストレス、低温ストレス及び低栄養ストレスが挙げられる。生物ストレスは、植物又は植物部分が被る環境ストレス条件を指し、例えば、線虫ストレス、草食昆虫ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス又はウイルス病原体ストレスが挙げられる。ストレスは、一過性、例えば、数時間、数日、数ヶ月の場合もあれば、又は永続的、例えば、植物の寿命にわたる場合もある。
一部では、植物から収穫された産物の品質の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）。例えば、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の商業的に好ましい特徴（例えば、味又は外観）の改善であり得る。他の事例では、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の貯蔵寿命の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。
代わりに、適応度の増加は、ヒト又は動物の健康に対して有益な特徴の改変、例えば、アレルゲン生成の低減であり得る。例えば、適応度の増加は、動物（例えば、ヒト）の免疫応答を刺激するアレルゲン（例えば、花粉）の生成の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）低減であり得る。
植物の修飾（例えば、適応度の増加）は、１つ又は複数の植物部分の修飾から起こり得る。例えば、植物は、植物の葉、種子、花粉、根、果実、シュート、花、細胞、プロトプラスト又は組織（例えば、分裂組織）を接触させることにより、修飾することができる。従って、別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の花粉を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加する。
また別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に開示のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物の種子を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加する。
また別の態様では、有効量の本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物のプロトプラストを接触させるステップを含む方法が本明細書に提供され、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加する。
さらに別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムのいずれかと植物の植物細胞を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の分裂組織を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加する。
別の態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、有効量の本明細書における植物修飾組成物のいずれかと植物の胚を接触させるステップを含み、この方法は、非処置植物と比較して、植物の適応度を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加する。
Ｂ．適用方法
本明細書に記載の植物は、組成物を植物に送達又は投与することを可能にする任意の好適な様式で、本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム組成物のいずれかに曝露することができる。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、単独で又は他の活性（例えば、肥料）若しくは非活性物質と組み合わせて送達され得、例えば、有効濃度の植物修飾組成物を送達するために製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、スプレー、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で、噴霧、注入（例えば、マイクロインジェクション）、植物を媒介して、注ぎ込む、浸漬することにより、適用することができる。本明細書に記載の組成物の適用のための量及び位置は、一般に、植物の生息地、植物修飾組成物により植物をターゲティングすることができる生活環段階、適用を実施しようとする部位並びに植物修飾組成物の物理的及び機能的特性により決定する。
いくつかの事例では、組成物は、例えば、バックパック噴霧、空中噴霧、作物噴霧／散布などにより、植物、例えば作物に直接噴霧する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物に送達する場合、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを受ける植物は、植物成長の任意の段階であり得る。例えば、製剤化された植物修飾組成物を植物成長の早期段階で種子コーティング若しくは根処理として又は作物サイクルの後期段階での全植物処理として適用することができる。いくつかの事例では、植物修飾組成物は、植物に対する局所薬剤として適用され得る。
さらに、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、植物の組織を通して吸収及び分布される浸透性薬剤として（例えば、植物が成長する土壌又は植物の水遣りに使用する水に）適用され得る。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを発現するように、植物又はえさ生物を遺伝子的に形質転換することもできる。
また、溶解性若しくは生体内分解性コーティング層、例えば、ゼラチンで、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム又は植物修飾組成物を含む組成物をコーティングすることにより、遅延又は連続的放出を達成することも可能であり、上記のコーティングは、使用環境内で溶解又は分解し、その後、植物修飾ｃｏｍ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム位置が利用可能になるか、或いは溶解性若しくは分解性マトリックス中に薬剤を分散することによっても達成することができる。こうした連続的放出及び／又は分散は、デバイスを有利に使用して、本明細書に記載の植物修飾組成物の１つ又は複数の有効濃度を一定に維持し得ることを意味する。
いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の一部、例えば、その葉、種子、花粉、根、果実、シュート、若しくは花、若しくは組織、細胞又はプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の細胞に送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物のプロトプラストに送達する。いくつかの事例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを、植物の組織に送達する。例えば、組成物を植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織又は介在分裂組織）に送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織（例えば、単組織（例えば、柔組織、厚角組織若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木部若しくは師部）に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚にＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する。
Ｃ．植物
本明細書に記載のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムで処置するために、多様な植物に送達することができる。本方法に従ってＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを送達する（即ち「処置する」）ことができる植物は、全植物及び植物部分を含み、そうしたものとして、限定されないが、シュート栄養器官／構造（例えば、葉、茎及び塊茎）、根、花及び花器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯及び胚珠）、種子（胚、胚乳、子葉及び種皮を含む）並びに果実（成熟卵胞）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）並びに細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）並びにそれらの子孫が挙げられる。植物部分は、さらに、シュート、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節間、樹皮、軟毛、新芽、根茎、葉状体、（イネ科植物の）葉、花粉、雄蕊などの植物の部分も指す。
本明細書に開示される方法で処置することができる植物のクラスは、高等及び下等植物のクラスを含み、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、ツクシ、古生マツバラン（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅ）、小葉植物、コケ植物及び藻類（例えば、多細胞又は単細胞藻類）が挙げられる。本方法に従って処置することができる植物はさらに、任意の維管束植物、例えば単子葉若しくは双子葉植物又は裸子植物を含み、限定されないが、以下のものが挙げられる：アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、カノーラ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、ハマナ（ｃｒａｍｂｅ）、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム（ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）、ヤマノイモ、ユーカリ、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、リリアセア（ｌｉｌｉａｃｅａ）、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライムギ、ライグラス、サフラワー、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、シバ、コムギ並びにレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物（ｃｕｃｕｒｂｉｓ）などの野菜作物；リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなどの果実及び堅果樹；ブドウ（例えば、ブドウ園）、キーウィ、ホップなどのつる植物；ラズベリー、ブラックベリー、グーズベリーなどの果実低木及びブランブル；トネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クリ、ポプラなどの森林樹；並びにアルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、ハマナ（ｃｒａｍｂｅ）、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、コメ、サフラワー、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト及びコムギ。本明細書に開示される方法に従って処置することができる植物は、あらゆる作物植物、例えば飼料作物、油糧種子作物、穀粒作物、果物作物、野菜作物、繊維作物、香辛料作物、ナッツ作物、芝土作物、糖料作物、飲料作物及び森林作物を含む。特定の事例では、本方法で処置される作物植物は、ダイズ植物である。他の特定の事例では、作物植物は、コムギである。他の特定の事例では、作物植物は、トウモロコシである。他の特定の事例では、作物植物は、綿である。特定の事例では、作物植物は、アルファルファである。特定の事例では、作物植物は、テンサイである。特定の事例では、作物植物は、コメである。特定の事例では、作物植物は、ジャガイモである。特定の事例では、作物植物は、トマトである。
特定の事例では、植物は、作物である。こうした作物植物の例として、限定されないが、単子葉及び双子葉植物が挙げられ、限定されないが、下記のものから選択される飼料若しくは飼い葉用マメ科植物、観賞植物、食用作物、樹木又は低木を含む：カエデ属種（Ａｃｅｒ ｓｐｐ．）、アリウム属種（Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、アマランサス属種（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、セロリ（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ラッカセイ属種（Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐｐ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．）（カノーラ、アブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ）、ナバナ（ｔｕｒｎｉｐ ｒａｐｅ））、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｌｉｖａ）、トウガラシ属種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、クリ属種（Ｃａｓｔａｎｅａ ｓｐｐ．）、エンダイブ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、シトラス属種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココス属種（Ｃｏｃｏｓ ｓｐｐ．）、コーヒーノキ属種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ハシバミ属種（Ｃｏｒｙｌｕｓ ｓｐｐ．）、クラタエグス属種（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｓｐｐ．）、カボチャ属種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐｐ．）、ククミス属種（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐｐ．）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ブナ属種（Ｆａｇｕｓ ｓｐｐ．）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、フラガリア属種（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｐ．）、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、ダイズ属種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ．）（例えば、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ソーヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ ｈｉｓｐｉｄａ）若しくはソーヤ・マックス（Ｓｏｊａ ｍａｘ））、リクチワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ヒマワリ属種（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ハイビスカス属種（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｐｐ．）、オオムギ属種（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、クルミ属種（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｐｐ．）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、レイシ（Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ミヤコグサ属種（Ｌｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、トカドヘチマ（Ｌｕｆｆａ ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）、ルピナス属種（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、トマト属種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．）（例えば、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｒｎ）、リコペルシコン・リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ））、リンゴ属種（Ｍａｌｕｓ ｓｐｐ．）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ハッカ属種（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｐ．）、ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロミグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）、バショウ種種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、タバコ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．）、オリーブ属種（Ｏｌｅａ ｓｐｐ．）、オリザ属種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｐ．）（例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・ラティフォリア（Ｏｒｙｚａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ））、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、イタリアンパセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ）、インゲンマメ属種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、マツ属種（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、ピスタチオ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）、エンドウ属種（Ｐｉｓｕｍ ｓｐｐ．）、イチゴツナギ属種（Ｐｏａ ｓｐｐ．）、ハコヤナギ属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、サクラ属種（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ．）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コナラ属種（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラディッシュ（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ショクヨウダイオウ（Ｒｈｅｕｍ ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ）、スグリ属種（Ｒｉｂｅｓ ｓｐｐ．）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、キイチゴ属種（Ｒｕｂｕｓ ｓｐｐ．）、サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、ヤナギ属種（Ｓａｌｉｘ ｓｐ．）、ニワトコ属種（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｐｐ．）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ゴマ属種（Ｓｅｓａｍｕｍ ｓｐｐ．）、シナピス属種（Ｓｉｎａｐｉｓ ｓｐｐ．）、ナス属種（Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ヒラナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ）若しくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ホウレンソウ属種（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｓｐｐ．）、タマリンディス・インディカ（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ ｉｎｄｉｃａ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、トリフォリウム属種（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、トリチコセケル・リンパウイ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｒｉｍｐａｕｉ）、コムギ属種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、デュラムコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、ベットコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、トリチカム・ヒベルナム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｈｙｂｅｒｎｕｍ）、トリチカム・マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍａｃｈａ）、トリチカム・サチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）若しくはリチカム・ブルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、スノキ属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐｐ．）、ソラマメ属種（Ｖｉｃｉａ ｓｐｐ．）、ササゲ属種（Ｖｉｇｎａ ｓｐｐ．）、ニオイスミレ（Ｖｉｏｌａ ｏｄｏｒａｔａ）、ブドウ属種（Ｖｉｔｉｓ ｓｐｐ．）並びにトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）。特定の実施形態では、作物植物は、コメ、アブラナ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ（トウモロコシ）、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ又はコムギである。
本発明で使用される植物又は植物部分は、植物発育のあらゆる段階の植物を含む。特定の事例では、送達は、発芽、苗成長、栄養成長及び生殖成長の段階中に行うことができる。特定の事例では、植物への送達は、栄養及び生直成長段階中に行う。いくつかの事例では、組成物は、植物の花粉に送達する。いくつかの事例では、植物の種子に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物のプロトプラストに組成物を送達する。いくつかの事例では、植物の組織に組成物を送達する。例えば、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側方分裂組織又は介在分裂組織）に組成物を送達することもできる。いくつかの事例では、植物の永久組織（例えば、単組織（例えば、柔組織、厚角組織若しくは厚膜組織）又は複合永久組織（例えば、木部若しくは師部）に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物胚に組成物を送達する。いくつかの事例では、植物細胞に組成物を送達する。栄養及び生殖成長の段階は、本明細書において、「成体」又は「成熟」植物とも呼ばれる。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物部分に送達する事例では、植物修飾剤により植物部分を修飾し得る。代わりに、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムを植物の他の部分に分布させ（例えば、植物の循環系によって）、その後、それらの部分を植物修飾剤により修飾する。
脂質ナノ粒子
本発明により提供される方法及びシステムは、特定の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達方法を含み得る。脂質ナノ粒子は、一部の実施形態において、１つ若しくは複数のイオン脂質、例えば非カチオン脂質（例えば、中性若しくはアニオン又は双性イオン脂質）；１つ若しくは複数の共役脂質（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載される、ＰＥＧ共役脂質又はポリマーと共役した脂質など）；１つ若しくは複数のステロール（例えば、コレステロール）；並びに任意選択で１つ若しくは複数のターゲティング分子（例えば、共役受容体、受容体リガンド、抗体）；又はこれらの組合せを含む。
ナノ粒子形成（例えば、脂質ナノ粒子）に使用することができる脂質として、例えば、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表４に記載されるものが挙げられ、例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に示される脂質の１つ又は複数を含み得る。脂質ナノ粒子は、ポリマー、例えば国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表５に記載されるポリマーなどの別の要素を含み得る。
一部の実施形態では、共役脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－コハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（例えば、４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－１－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）並びにこれらの組合せの１つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込むことができるステロールは、コレステロール又はこれらのコレステロール誘導体、例えば、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものなどを含む。別の例示的なステロールとして、フィトステロールが挙げられ、Ｅｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２０２０），ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質、粒子の凝集を阻害する共役脂質及びステロールを含む。これらの成分の量は、独立して、且つ所望の特性を達成するように変動し得る。例えば、一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、総脂質の約２０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の量のイオン化性脂質（他の実施形態では、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）若しくは４０～５０％（ｍｏｌ）；約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％であり得る）、総脂質の約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン脂質、総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量の共役脂質及び総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。核酸（例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ又は鋳型核酸をコードする）に対する総脂質の比は、要望に応じて変動し得る。例えば、核酸に対する総脂質（質量又は重量）は、約１０：１～約３０：１であり得る。
一部の実施形態では、脂質と核酸の比（質量／質量比；ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のＮ／Ｐ比、例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上のＮ／Ｐ比を提供するように、調節することができる。一般に、脂質ナノ粒子製剤の総脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌであり得る。
脂質ナノ粒子製剤に使用することができる例示的なイオン化性脂質は、限定されないが、国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されるものを含む。別の例示的な脂質として、限定されないが、以下の式の１つ若しくは複数が挙げられる：米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号又は米国特許第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ又はＩＩＡ；米国特許第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０３０３５８７号又は米国特許第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ又はＩＩＩ－ＸＸＩＶ；米国特許出願公開第２０１３／０３３８２１０号明細書のもの；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ又はＸＸＸＶ；米国特許出願公開第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ又はＸＶＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２６９号明細書のもの；米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ又はＸＶＩ；米国特許出願公開第２００６／００８３７８号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ又はＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願公開第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ又はＸＶＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ～Ｘ；米国特許出願公開第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願公開第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ。
一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９に記載されているように、ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３，ｌ－テトラエン－ｌ９－イル－４－（ジメチルペンチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１０に記載されているように、脂質ＡＴＸ－００２である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１１に記載されているように、（ｌ３Ｚ，ｌ６Ｚ）－Ａ，Ａ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３、ｌ６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１２に記載されているように、化合物６又は化合物２２である。
例示的な非カチオン脂質として、限定されないが、以下のものが挙げられる：ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル
）－シクロヘキサン－１－カルボン酸ジオレオイル－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－１－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン又はそれらの混合物。さらに、他のジアセチルホスファチジルコリン及びジアセチルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用できることは理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～２４炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル又はオレオイルである。特定の実施形態における別の例示的な脂質として、限定しないが、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。こうした脂質には、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを用いた肝トランスフェクションを改善することが判明している植物脂質（例えば、ＤＧＴＳ）が含まれる。
脂質ナノ粒子での使用に適した非カチオン脂質の他の例として、限定しないが、無リン脂質、例えばステアリルアミン、ドデエイルアミン、ヘキサアデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリール硫酸塩ポリエトキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウム臭化物、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン脂質は、国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書に記載されており、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、非カチオン脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式Ｉ、ＩＩ若しくはＩＶのオレイン酸又は化合物である。非カチオン脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を占め得る。一部の実施形態では、非カチオン脂質含有率は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。複数の実施形態では、イオン化性脂質と中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１又は８：１）の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を一切含まない。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、膜完全性を賦与するために、ステロールなどの成分をさらに含み得る。脂質ナノ粒子に使用することができるステロールの一例は、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例として、５ａ－コレスタノール、５３－コプロスタノール、コレステリル－（２－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体；５ａ－コレスタン、コレステノン、５ａ－コレスタノン、５ｐ－コレスタノン及びデカン酸コレステリルなどの非極性類似体；並びにそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエステルである。例示的なコレステロール誘導体は、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、膜完全性を賦与する成分、例えば、ステロールなどは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～５０％（ｍｏｌ）（例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％又は４０～５０％）を含む。一部の実施形態では、こうした成分は、脂質ナノ粒子の総脂質の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は共役脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、且つ／又は立体安定化をもたらす。例示的な共役脂質として、限定されないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、カチオンポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート及びそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、共役脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）共役脂質である。
例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとして、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（例えば、４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－１－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩又はそれらの混合物が挙げられる。別の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８８５，６ｌ３号明細書、米国特許第６，２８７，５９ｌ号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２号明細書、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書及び米国特許出願公開第／０９９８２３号明細書に記載されており、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式ＩＩＩ、ＩＩＩ－ａ－Ｉ、ＩＩＩ－ａ－２、ＩＩＩ－ｂ－１、ＩＩＩ－ｂ－２の化合物である。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書（いずれの内容も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式ＩＩのものである。一部の実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウロイルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］の１つ若しくは複数であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、
Figure 2023502473000776
 から選択される構造を含む。
一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質の代わりに、ＰＥＧ以外の分子と共役した脂質を使用することもできる。例えば、ＰＥＧ－脂質の代わりに、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）及びカチオンポリマー脂質（ＧＰＬ）コンジュゲートを使用することができる。
例示的な共役脂質、即ちＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート及びカチオンポリマー脂質は、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレットの表２に列挙されるＰＣＴ及びＬＩＳ特許出願に記載されており、これらの内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＰＥＧ又は共役脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を占め得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ又は共役脂質の含有率は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０．５～１０％又は２～５％（ｍｏｌ）である。イオン化性脂質、非カチオン脂質、ステロール及びＰＥＧ／共役脂質のモル比は、必要に応じて変動し得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル又は総重量当たり３０～７０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり０～６０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり０～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり１～１０％の共役脂質と、を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり３０～４０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり４０～５０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり１０～２０％の非カチオン脂質と、を含む。一部の実施形態では、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり５０～７５％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２０～４０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり１～１０％の共役脂質である。組成物は、組成物のモル又は総重量当たり６０～７０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２５～３５％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン脂質と、を含み得る。組成物はまた、組成物のモル又は総重量当たり最大９０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２～１５％の非カチオン脂質とを含み得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル若しくは総重量当たり８～３０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり５～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり０～２０％のコレステロールと；組成物のモル若しくは総重量当たり４～２５％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり４～２５％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～２５％のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり１０～３５％の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり５％のコレステロール；又は組成物のモル若しくは総重量当たり２～３０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり１～１５％のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり２～３５％の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり１～２０％のコレステロール；或いはまた組成物のモル若しくは総重量当たり最大９０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～１０％の非カチオン脂質と、又は組成物のモル若しくは総重量当たり１００％のカチオン脂質であり得る。一部の実施形態では、脂質粒子製剤は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。一部の他の実施形態では、脂質粒子製剤は、６０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。
一部の実施形態では、脂質粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化性脂質の場合、２０～７０モル％の範囲で、目標は４０～６０であり、非カチオン脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲で、目標は０～１５、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲で、目標は３０～５０、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１～６の範囲で、目標は２～５である。
一部の実施形態では、脂質粒子は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質／非カチオン脂質／ステロール／共役脂質を含む。
一態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
一部の実施形態では、１つ又は複数の別の化合物を含有させることができる。そうした化合物は個別に投与することもできるか、又は追加的化合物を本発明の脂質ナノ粒子に含有させることができる。換言すれば、脂質ナノ粒子は、核酸又は最初の核酸と異なる少なくとも１つの第２核酸に加えて、他の化合物を含有することができる。限定はしないが、他の追加的化合物は、小若しくは大有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体及びその誘導体、生体材料から調製された抽出物又はそれらの任意の組合せから選択することができる。
一部の実施形態では、ターゲティングドメインの付加により、ＬＮＰを特定の組織に指向させる。例えば、生物学的リガンドをＬＮＰの表面に展示して、同種受容体を展示する細胞との相互作用を増強し、それにより、上記受容体との結合並びに細胞が受容体を発現する組織へのカーゴ送達を駆動することができる。一部の実施形態では、生物学的リガンドは、肝臓への送達を駆動するリガンドであり得、例えば、ＧａｌＮＡｃを展示するＬＮＰは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を展示する肝細胞に対する核酸カーゴの送達を達成する。Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８（７）：１３５７－１３６４ ２０１０）の論文は、観察可能なＬＮＰカーゴ効果（例えば、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．２０１０，前掲の図６を参照）についてＡＳＧＰＲに依存的なＬＮＰを取得するためのＰＥＧ－脂質に対する三価ＧａｌＮＡｃリガンド（ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＤＳＧ）の共役を教示している。例えば、葉酸塩、トランスフェリン又は抗体を含む他のリガンド展示ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１７２２３１３５号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）、さらには、そこで使用される参照文献、即ちＫｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７－２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８－１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６－２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１－６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８－２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９－３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７－１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５－１１６；Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７－５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３－６８； Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ １０４：４０９５－４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９－３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８－２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ ２３：７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７－６３０；及びＰｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７－１１３３で論じられている。
一部の実施形態では、イオン化性脂質、両性リン脂質、コレステロール及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質などの伝統的成分を含む製剤に対するＳｅｌｅｃｔｉｖｅ ＯＲｇａｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＳＯＲＴ）分子の添加により、組織特異的活性についてＬＮＰを選択する。Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（４）：３１３－３２０（２０２０）の教示は、補足的「ＳＯＲＴ」成分の添加により、インビボＲＮＡ送達プロファイルを厳密に改変し、ＳＯＲＴ分子のパーセンテージ及び生物物理学的特性に応じて組織特異的（例えば、肺、肝臓、脾臓）遺伝子送達を媒介することを実証している。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、生分解性、イオン化性脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、オクタデカ－９，１２－ジエン酸（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルを含み、これは、（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン酸）３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルとも呼ばれる。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号パンフレット、国際公開第２０１７／１７３０５４号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット及び国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット並びにそこに記載される参照文献に記載の脂質を参照されたい。一部の実施形態では、ＬＮＰ脂質に関して、カチオン（性）及びイオン化性という用語は互換可能であり、例えば、イオン化性脂質は、ｐＨによってはカチオン性である。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの複数の構成要素を単一のＬＮＰ製剤として調製し得、例えば、ＬＮＰ製剤は、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドコードするｍＲＮＡ及びＲＮＡ鋳型を含む。核酸成分の比は、治療薬の特性を最大にするために変動させ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ鋳型と、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドコードするｍＲＮＡの比は、モル比で約１：１～１００：１、例えば、約１：１～２０：１、約２０：１～４０：１、約４０：１～６０：１、約６０：１～８０：１又は約８０：１～１００：１である。他の実施形態では、複数の核酸のシステムは、個別の製剤、例えば、鋳型ＲＮＡを含む１つのＬＮＰ製剤と、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドコードするｍＲＮＡを含む第２ＬＮＰ製剤により調製され得る。一部の実施形態では、システムは、ＬＮＰに製剤化された３つ以上の核酸成分を含み得る。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つのＬＮＰに製剤化された、タンパク質、例えばＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステム及び鋳型ＲＮＡを含み得る。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定して、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ又は１５０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約８０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１ｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ又は約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。
ＬＮＰは、いくつかの事例では、比較的均質であり得る。多分散指数を用いて、ＬＮＰの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すことができる。低い（例えば、０．３未満の）多分散指数は、概して、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４又は０．２５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
ＬＮＰのゼータ電位を用いて、組成物の界面動電位を示すことができる。一部の実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。高度に荷電された種は、身体内の細胞、組織及び他の要素と不必要に相互作用する可能性があるため、正又は負の比較的低い電荷を持つ脂質ナノ粒子が一般的に望ましい。一部の実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約１５ｍＶ又は約＋５ｍＶ～約１０ｍＶであり得る。
タンパク質及び／又は核酸、例えばＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド若しくはポリペプチドをコードするｍＲＮＡの封入の効率は、提供される初期量と比較して、封入されるか、若しくは調製後にＬＮＰと結合されるタンパク質及び／又は核酸の量を表す。封入効率は、高い（例えば、１００％近く）のが望ましい。封入効率は、例えば、１若しくは複数種の溶媒又はデタージェントで脂質ナノ粒子を分解する前及び後に、脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することにより測定することができる。アニオン交換樹脂を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。蛍光を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子の場合、タンパク質及び／又は核酸の封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。
ＬＮＰは、任意選択で、１つ又は複数のコーティングを含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム又は錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載の組成物を含むカプセル、フィルム又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度若しくは密度を有し得る。
ＬＮＰのさらに別の例示的な脂質、製剤、方法及び特性決定は、国際公開第２０２００６１４５７号パンフレットに教示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションを実施する。特定の実施形態では、ＧｅｎＶｏｙ＿ＩＬＭ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ ｍｉｘ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＬＮＰを製剤化する。特定の実施形態では、ＬＮＰは、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２‐ＤＭＡ）又はジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノ酪酸塩（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ若しくはＭＣ３）を用いて、ＬＮＰを製剤化するが、その製剤及びインビボでの使用については、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（３４）：８５２９－８５３３（２０１２）に教示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばＣａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達のために最適化されたＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１９０６７９９２号パンフレット及び国際公開第２０１９０６７９１０号パンフレットに記載されており、そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
核酸の送達に有用な別の具体的なＬＮＰ製剤は、米国特許第８１５８６０１号明細書及び米国特許第８１６８７７５号明細書（そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、これは、ＯＮＰＡＴＴＲＯの名称で販売されているパチシランに使用される製剤を含む。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ ＬＮＰの例示的な用量としては、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０又は１００ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を挙げることができる。システムの１つ若しくは複数の成分をコードする核酸を含むＡＡＶの例示的な用量としては、約１０１１、１０１２、１０１３及び１０１４ｖｇ／ｋｇのＭＯＩを挙げることができる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（又は脂質ナノ粒子を含む製剤）は、反応性不純物（例えば、アルデヒド若しくはケトン）を欠くか、又は予め選択したレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド若しくはケトン）を含む。特定の理論に束縛されることは意図しないが、一部の実施形態では、脂質試薬を使用して脂質ナノ粒子製剤を作製し、脂質試薬は、混入反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を含み得る。脂質試薬は、予め選択したレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を有することに基づいて製造のために選択することができる。特定の理論に束縛されることは意図しないが、一部の実施形態では、アルデヒドは、ＲＮＡの修飾及び損傷、例えば塩基間の架橋及び／又はＲＮＡへの脂質の共有結合共役を引き起こし得る（例えば、脂質－ＲＮＡアダクトを形成する）。これは、いくつかの事例では、逆転写酵素反応の不成功及び／又は例えば病変の部位の不適切な塩基の組込み、例えば、新たに合成される標的ＤＮＡ中の突然変異を引き起こし得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む脂質試薬を用いて生産される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む脂質試薬を用いて生産される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物と、（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種とを含む脂質試薬を用いて生産される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、複数の脂質試薬を用いて生産され、複数の各脂質試薬は、独立して、本段落に記載される１つ又は複数の基準を満たす。一部の実施形態では、複数の各脂質試薬は、同じ基準、例えば、本段落の基準を満たす。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物と、（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子又はその製剤に用いられる脂質試薬の１つ若しくは複数又は任意選択で全ては、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有物と、（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種とを含む。
一部の実施形態では、総アルデヒド含量及び／又は任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、例えば、実施例２６に記載される方法に従って、例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により決定される。一部の実施形態では、反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量及び／又は反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、例えば、脂質試薬中の、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に伴う核酸分子（例えば、本明細書に記載される、例えばＲＮＡ分子）の１つ又は複数の化学修飾を検出することにより決定される。一部の実施形態では、反応性不純物（例えば、アルデヒド）含量及び／又は反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、例えば、実施例２７に記載されているように、例えば脂質試薬中の、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に伴うヌクレオチド又はヌクレオシド（例えば、本明細書に記載される、例えば鋳型核酸中に含まれるか又はそれから単離された例えばリボヌクレオチド又はリボヌクレオシド）の１つ又は複数の化学修飾を検出することにより決定される。複数の実施形態では、核酸分子、ヌクレオチド又はヌクレオシドの化学修飾は、例えば、実施例２７に記載されているように、例えばＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて１つ又は複数の修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を決定することにより検出される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、鋳型核酸又はＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸）は、アルデヒド修飾を含まないか、又は予め選択した量未満のアルデヒド修飾を含む。一部の実施形態では、平均で、核酸は、１０００ヌクレオチド当たり５０、２０、１０、５、２又は１つ未満のアルデヒド修飾を有し、例えば、２つのヌクレオチドの単一架橋は、単一アルデヒド修飾である。一部の実施形態では、アルデヒド修飾は、ＲＮＡアダクト（例えば、脂質－ＲＮＡアダクト）である。一部の実施形態では、アルデヒド修飾ヌクレオチドは、塩基間の架橋である。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ）は、ヌクレオチド間の５０、２０、１０、５、２又は１つ未満の架橋を含む。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許並びに他の出版物及び参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書に、例えば本明細書の任意の表に参照として掲載されるＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ及びＥｎｔｒｅｚは全て、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示されない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、２０１９年７月１９日現在で最新のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質に複数の配列アクセッション番号が付いている場合、これら配列変異体の全てが包含される。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１：哺乳動物細胞へのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの送達
この実施例では、哺乳動物細胞ゲノムへの外因性ＤＮＡの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムのポリペプチド成分は表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃから選択されるリコンビナーゼタンパク質であり、鋳型ＤＮＡ成分は、標的組換え部位、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行の左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する認識配列を含むプラスミドＤＮＡである。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＤＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＤＮＡ
３．前述の鋳型ＤＮＡ
４．２と３の組合せ
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的ゲノム編集について検定する。ゲノムＤＮＡを各群のＨＥＫ２９３細胞から単離する。適切な配列又はゲノム遺伝子座と隣接するプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、増幅したＤＮＡの長さを測定する。
ＤＮＡプラスミド鋳型を標的ゲノムに挿入するＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、上の群４の完全Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムでトランスフェクトした細胞のみに観察される。
実施例２：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いた哺乳動物細胞への遺伝子発現単位の標的送達
この実施例では、哺乳動物ゲノムに異種遺伝子発現単位を挿入するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターの作製及び使用を説明する。
この実施例では、リコンビナーゼタンパク質は、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃから選択される。リコンビナーゼタンパク質は、ＤＮＡ組込みのためのリコンビナーゼポリペプチドの認識配列の適切なゲノムコピーをターゲティングする。鋳型ＤＮＡ成分は、標的組換え部位（表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの対応する行の左側領域又は右側領域列のヌクレオチド配列内に存在する認識配列）と遺伝子発現単位とを含むプラスミドＤＮＡである。遺伝子発現単位は、少なくとも１つのコーディング配列と作動可能に連結した少なくとも１つの調節配列を含む。この実施例では、調節配列は、ＣＭＶプロモータ及びエンハンサー、増強された翻訳エレメント及びＷＰＲＥを含む。コーディング配列は、ＧＦＰオープンリーディングフレームである。
ＨＥＫ２９３細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＤＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＤＮＡ
３．前述の鋳型ＤＮＡ
４．２と３の組み合わせ
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集について検定する。ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞から単離し、ゲノム中の標的組込み部位とフランキングするプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、群４の試験物質（完全Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム）でトランスフェクトした細胞に検出される。
トランスフェクトした細胞をさらに１０日間培養し、複数の細胞培養継代後、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からＧＦＰ陽性の細胞のパーセントを算出する。ＧＦＰ陽性細胞は、群４の試験物質でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の集団に検出され、これは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集により哺乳動物細胞ゲノムに付加された遺伝子発現単位が発現されることを立証するものである。
実施例３：Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いた哺乳動物細胞へのスプライスアクセプター単位の標的送達。
この実施例では、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、異種配列をイントロン領域に付加するためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムの作製及び使用を説明する。第１イントロンへの、５’末端にスプライスアクセプター部位を、また３’末端にポリＡテイルを含む新しいエキソンのスプライシングにより、新たなエキソンにスプライシングされた天然遺伝子座の第１天然エキソンを含有する成熟ｍＲＮＡが得られる。
この実施例では、リコンビナーゼタンパク質は、表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃから選択される。リコンビナーゼタンパク質は、ＤＮＡ組込みのために、ゲノム、例えばＨＥＫ２９３ゲノム中の適合性認識部位をターゲティングする。鋳型ＤＮＡは、成熟ＧＦＰ（開始コドンは除去される）の第１アミノ酸の５’側に隣接してスプライスアクセプター部位を備え、且つ停止コドンの下流に３’ポリＡテイルを備えるＧＦＰをコードする。
ＨＥＫ２９３細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＤＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＤＮＡ
３．前述の鋳型ＤＮＡ
４．２と３の組合せ
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集及び適切なｍＲＮＡプロセシングについて検定する。ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞から単離する。逆転写－ＰＣＲを実施して、標的遺伝子座の第１天然エキソンと、新しいエキソンとを含む成熟ｍＲＮＡを測定する。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、標的遺伝子座（例えば、標的遺伝子座の第１天然エキソン）に結合するフォワードプライマー及びＧＦＰに結合するリバースプライマーを用いて実施する。ＲＴ－ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集事象の成功及びスプライス事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、群４の試験物質でトランスフェクトした細胞に検出される。この結果は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムが、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、或る遺伝子をコードする異種配列を標的遺伝子座、例えば、イントロン領域に付加することができることを立証するものである。
トランスフェクトした細胞をさらに１０日間培養し、複数の細胞培養継代後、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からＧＦＰ陽性の細胞のパーセントを算出する。ＧＦＰ陽性細胞は、群４の試験物質でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の集団に検出され、これは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集を介して哺乳動物細胞ゲノムに付加される遺伝子発現単位が発現されることを立証するものである。
実施例４：哺乳動物細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの特異性
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性ＤＮＡの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムシステム及び部位特異的挿入の特異性の測定を記載する。
この実施例では、先行する実施例のいずれかに記載されるように、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に構築する。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定する。隣接ゲノムＤＮＡを増幅する鋳型ＤＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを用いて、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，１０５１－１０５７（２００７）に記載されているように、線状増幅ＰＣＲを実施する。次に、ＭｉＳｅｑ装置での次世代シーケンシング技術を用いて、増幅ＰＣＲ産物を配列決定する。ＭｉＳｅｑリードをＨＥＫ２９３Ｔゲノムにマッピングして、ゲノム内の組込み部位を特定する。
標的ゲノム部位にマッピングで対応するＬＡＭ－ＰＣＲシーケンシングリードのパーセントが、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの特異性である。
ＬＡＭ－ＰＣＲシーケンシングリードが対応する総ゲノム部位の数は、組換え部位の総数である。
実施例５：哺乳動物細胞におけるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの効率
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性ＤＮＡの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムシステム及び部位特異的挿入の特異性の測定を記載する。
この実施例では、先行する実施例のいずれかに記載されるように、Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に構築する。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養してから、部位特異的ゲノム編集について検定する。Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５），１９７－２０８，２０１６に記載されているように、デジタルドロップレットＰＣＲを実施する。フォワードプライマーは、鋳型ＤＮＡに結合し、リバースプライマーは、適切なゲノム組込み部位の片側に結合するため、ＰＣＲ増幅は、標的ＤＮＡの組込み時にのみ予測される。標的部位に対するプローブは、ＦＡＭ蛍光色素を含有し、ゲノム中の標的ＤＮＡのコピー数を計測するために使用される。ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＲＰＰ３０）に対して特異的なプライマー及びＨＥＸ－蛍光色素プローブを用いて、１ドロップレット当たりのゲノムＤＮＡのコピーを計測する。
１ドロップレット当たりのハウスキーピングＤＮＡのコピー数に対して正規化された１ドロップレット当たりの標的ＤＮＡのコピー数が、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒの効率である。
実施例６：細胞中のリコンビナーゼのコピー数の決定
以下の実施例は、細胞を基準とするリコンビナーゼの絶対定量を記載する。この測定は、ＡＱＵＡ質量分析法に基づく方法を用いて実施され、こうした方法は、例えば、下記ＵＲＬ
（ＵＲＬ）：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ１０４６２０２３０４００２０８７？ｖｉａ％３Ｄｉｈｕｂ
で入手可能である。
細胞にリコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を送達してから、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、次に、このＭＳ方法により定量する。この方法は、２段階を含む。
第１段階で、リコンビナーゼのアミノ酸配列を検査し、分析のために代表的なトリプシンペプチドを選択する。次に、タンパク質分解の過程で生成された対応するネイティブペプチドを厳密に模倣するアミノ酸配列を用いて、ＡＱＵＡペプチドを合成する。しかし、質量分析計が、被検物質と内部標準を識別することができるように、安定した同位体を１つの残基に組み込む。合成ペプチドとネイティブペプチドは、クロマトグラフィー共溶出、イオン化効率及びフラグメントイオンの相対分布を含め、同じ物理化学的特性を共有するが、それらの質量の相違により、質量分析計では差次的に検出される。次に、合成ペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ技術により分析して、ペプチドの保持時間を確認し、フラグメントイオン強度を決定し、ＳＲＭ分析のためのイオンを選択する。このようなＳＲＭ実験では、トリプル四重極質量分析を、第１走査四極子、即ちＱ１中の予測前駆体イオンを選択するように指令する。この１つの質量電荷（ｍ／ｚ）比を有するイオンのみが、衝突室（Ｑ２）に向けられて、フラグメント化される。得られた生成物イオンを第３四極子（Ｑ３）に通過させ、そこで、単一フラグメントのｍ／ｚ比を、狭いｍ／ｚウィンドウを介してモニターする。
第２段階は、細胞又は組織溶解物からのリコンビナーゼの定量を含む。定量された細胞数又は組織の質量を用いて、反応を開始し、それを用いて、定量を細胞基準に対して正規化する。細胞溶解物を分離した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるアッセイのダイナミックレンジを増大するためのタンパク質分解に付し、続いて、リコンビナーゼが泳動するゲルの領域の切除を実施する。ゲル内消化を実施して、ネイティブトリプシンペプチドを取得する。ゲル内消化は、ＡＱＵＡペプチドの存在下で実施するが、これは、消化過程中にゲル片に添加する。タンパク質分解後、重いペプチドと軽いペプチドの両方を含有する複合ペプチド混合物を、第１段階で決定したパラメータを用いて、ＬＣ－ＳＲＭ試験で分析する。
質量分析に基づく定量の結果を、ロードされたタンパク質の数に変換して、１細胞当たりのリコンビナーゼの数を決定する。
実施例７：細胞内部のＤＮＡのコピー数
Ｑ－ＦＩＳＨ
以下の実施例は、細胞基準での送達されたＤＮＡ鋳型の定量を記載する。この実施例において、リコンビナーゼが組み込むことになるＤＮＡは、ＤＮＡ－プローブ結合部位を含有する。リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達したら、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、定量的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｑ－ＦＩＳＨ）のために調製する。Ｑ－ＦＩＳＨは、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ５５５色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｆ３２９４８）と共に、ＦＩＳＨ Ｔａｇ ＤＮＡ Ｏｒａｎｇｅ Ｋｉｔを用いて実施する。手短には、キットマニュアルに記載されるニック翻訳、色素標識及び精製の手順により、ＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ－プローブ結合部位に結合するＤＮＡプローブを作製する。次に、キットマニュアルに記載されるように、細胞をＤＮＡプローブで標識する。３７℃及び５％ＣＯ２に維持しながら、６３×油浸対物レンズを用いるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で細胞を撮像する。ＤＮＡプローブを５５５ｎｍレーザ励起に付して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒを刺激する。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを書き込んで、既知量のＤＮＡを用いて作製した標準と比較して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ強度を測定する。この方法を用いて、細胞に送達された鋳型ＤＮＡの量を決定する。
ｑＰＣＲ
以下の施例は、細胞基準での送達されたＤＮＡ鋳型の定量を記載する。この実施例において、リコンビナーゼが組み込むことになるＤＮＡは、ＤＮＡ－プローブ結合部位を含有する。リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達したら、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために細胞を調製する。ｑＰＣＲは、このプロトコルのための標準的キット、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｄｕｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｃｒ／ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ－ｐｃｒ／ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ－ｐｃｒ－ａｓｓａｙｓ－ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）を用いて実施する。手短には、送達された鋳型ＤＮＡの領域と、特定のアンプリコンに対するプローブを特異的に増幅するプライマーを設計する。定量した純粋な鋳型ＤＮＡの段階希釈を用いて、閾値Ｃｔ数をＤＮＡ鋳型の数と相関させることにより、標準曲線を作成する。次に、製造者の指示に従い、分析対象の細胞からＤＮＡを抽出して、全ての追加成分と一緒にｑＰＣＲ反応に投入する。続いて、サンプルを適切なｑＰＣＲ装置で分析して、Ｃｔ数を決定し、次に、これを絶対定量のために標準曲線にマッピングする。この方法を用いて、細胞に送達された鋳型ＤＮＡの量を決定する。
実施例８：ＤＮＡ：リコンビナーゼの細胞内比
以下の実施例は、標的細胞中のリコンビナーゼタンパク質と鋳型ＤＮＡの比の決定を記載する。リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達してから、組換えを２４時間進行させた後、細胞を定量し、前述した実施例に概説したように、リコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡの定量のために細胞を調製する。これらの２つの値（１細胞当たりのリコンビナーゼ及び１細胞当たりの鋳型ＤＮＡ）を除算（１細胞当たりのリコンビナーゼ／１細胞当たりの鋳型ＤＮＡ）して、これらの量のバルク平均比を決定する。この方法を用いて、細胞に送達されたリコンビナーゼと鋳型ＤＮＡの比を決定する。
実施例９：ＤＮＡ損傷応答阻害剤の存在下での活性－ＮＨＥＪ阻害剤の存在下での活性
以下の実施例は、リコンビナーゼの活性についてこれらの経路に関与するタンパク質の発現に対する依存性がないことを明示するために、非相同末端結合の阻害剤の存在下での、リコンビナーゼタンパク質の活性の検定を記載する。手短には、上の実施例で概説したリコンビナーゼ活性の効率を決定するために概説されるアッセイを実施する。しかし、この場合、２つの個別の実験を実施する。
実験１では、リコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡの送達から２４時間後、１μＭのＮＨＥＪ阻害剤Ｓｃｒ７（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｓｍｌ１５４６？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳ）を細胞増殖培地に添加して、この経路を阻害する。プロトコルの他の全ての要素は同じである。
実験２では、細胞は、実験１と同じように操作するが、培地に阻害剤を添加しない。いずれの実験も上の実施例に従って効率について分析した後、非阻害活性と比較した％阻害活性を決定する。
実施例１０：ＤＮＡ損傷応答阻害剤の存在下での活性－ＨＤＲ阻害剤の存在下での活性
以下の実施例は、リコンビナーゼの活性についてこれらの経路に関与するタンパク質の発現に対する依存性がないことを明示するために、相同組換えの阻害剤の存在下での、リコンビナーゼタンパク質の活性の検定を記載する。手短には、上の実施例で概説したリコンビナーゼの効率を決定するために概説されるアッセイを実施する。しかし、この場合、２つの個別の実験を実施する。
実験１では、リコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡの送達から２４時間後、１μＭのＨＲ阻害剤Ｂ０２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂ０２．ｈｔｍｌ）を細胞増殖培地に添加して、この経路を阻害する。プロトコルの他の全ての要素は同じである。
実験２では、細胞は、実験１と同じように操作するが、培地に阻害剤を添加しない。いずれの実験も上の実施例に従って効率について分析した後、非阻害活性と比較した％阻害活性を決定する。
実施例１１：核リコンビナーゼ対細胞質リコンビナーゼのパーセンテージ
以下の実施例は、標的細胞の核対細胞質中のリコンビナーゼタンパク質の比の決定を記載する。本明細書に記載のように、リコンビナーゼ及びＤＮＡ鋳型を細胞に送達してから１２時間後に細胞を定量し、分析のために調製する。下記の標準キットを用い、製造者の指示：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＮＥ－ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎに従って、細胞を核画分及び細胞質画分に分割する。核画分及び細胞質画分の両方を維持した後、上の実施例で概説した質量分析法に基づくリコンビナーゼ定量アッセイに付す。この方法を用いて、細胞中の核リコンビナーゼと細胞質リコンビナーゼの比を決定する。
実施例１２：植物細胞への送達
この実施例は、少なくとも１つのリコンビナーゼを植物細胞に送達する方法を説明し、この場合、植物細胞は、植物又は植物部分中に位置する。より具体的には、この実施例は、切除したダイズ胚の生殖系列細胞中の内在性植物遺伝子（即ちフィトエン不飽和化酵素、ＰＤＳ）を編集する目的で、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇリコンビナーゼ及びその鋳型ＤＮＡの送達を記載する。この実施例は、複数の障壁（例えば、複数の細胞層、種皮、細胞壁、原形質膜）を介して送達されたトランスジーンをコードするポリヌクレオチドをダイズ生殖系列細胞に直接送達し、それにより、標的ヌクレオチド配列、ＰＤＳの遺伝的改変をもたらすことを説明する。記載される方法は、細菌により媒介される形質転換（例えば、アグロバクテリウム種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）による）又はバイオリステック法の一般的技術を使用しない。
ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））中の内在性フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）をターゲティングするリコンビナーゼ及び単一鋳型ＤＮＡの送達のためにプラスミドを設計する。当業者には、他のリコンビナーゼ及び鋳型ＤＮＡ配列をコードするために類似のプラスミドが容易に設計され、これは、任意選択で、異なるエレメント（例えば、異なるプロモータ、ターミネーター、選択若しくは検出可能なマーカ、細胞浸透性ペプチド、核局在化シグナル、葉緑体通過ペプチド又はミトコンドリアターゲティングペプチドなど）を含み、同様に使用されることは明らかであろう。
第１シリーズの実験では、送達剤及びエレクトロポレーションの組合せを用いて、これらのベクターをダイズ胚中の非表皮植物細胞に送達する。成熟した乾燥ダイズ種子（ｃｖ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２）を以下のように表面滅菌する。乾燥ダイズ種子を、１００ｍｌの５％塩酸ナトリウム溶液を含むビーカーを保持する密閉チャンバー内に４時間維持し、溶液には４ｍｌの塩酸を新しく添加する。この滅菌処理後、種子は乾燥状態で維持する。カミソリの刃を手で用いて、滅菌済種子を半分に割り、子葉から胚を手で分離する。各試験又は対照の処理を２０の切除した胚に対して実施する。次に、以下の一連の実験を実施する。
実験１：滅菌濾過ｍｉｌｌｉＱ水中０．０１％ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、第４級アンモニウム界面活性剤）中にベクター（各プラスミドの１マイクロリットル当たり１００ナノグラム）を含有する送達溶液を調製する。各溶液を４℃に冷却し、５００マイクロリットルを胚に直接添加した後、直ちにこれを真空チャンバー内の氷上に配置し、陰圧（２×１０”３ミリバール）処理に１５分付す。冷却／陰圧処理後、下記パラメータ：５０Ｖ、２５ミリ秒パルス長、９９パルスにわたり７５ミリ秒パルス間隔で設定されたＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ ＥＣＭ－８３０エレクトロポレーションを用いて、胚を電流で処理する。
実験２：送達溶液との初期接触及び陰圧処理を室温で実施する以外は、実験１と同じ条件。
実験３：送達溶液が、ＣＴＡＢなしで調製されるが、０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７（商標）（ＣＡＳ番号２７３０６－７８－１、Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎ．Ｙから入手可能）を含む以外は、実験１と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうちの１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験４：いくつかの送達溶液が調製され、この場合、各々が、カタログ番号７０４１１３、７５０５３０、７２４７７７及び８０５０３３（全て、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）のものから選択される単層カーボンナノチューブ調製物を２０マイクログラム／ｍｌで含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうちの１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験５：送達溶液が、トリエトキシプロピルアミノシラン－官能化シリカナノ粒子（カタログ番号７９１３３４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２０マイクログラム／ｍｌでさらに含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうちの１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験６：送達溶液が、分岐ポリエチレンイミン、分子量－２５，０００（ＣＡＳ番号９００２－９８－６、カタログ番号４０８７２７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を９マイクログラム／ｍｌで又は分岐ポリエチレンイミン、分子量－８００（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ２５９８７－０６－８、カタログ番号４０８７１９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を９マイクログラム／ｍｌでさらに含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうちの１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験７：送達溶液が、２０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、カタログ番号Ｄ４５４０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をさらに含む以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうちの１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験８：送達溶液が、５０マイクロモルのｎｏｎｏ－アルギン（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号３４７７）をさらに含有する以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうちの１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験９：真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０又は２０分遠心分離する以外は、実験３と同じ条件。各処理を受けた胚の半分（２０のうちの１０）をエレクトロポレーションに付すが、残りの半分の胚は付さない。
実験１０：真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０又は２０分遠心分離する以外は、実験３と同じ条件。
実験１１：真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０又は２０分遠心分離する以外は、実験４と同じ条件。
実験１２：真空処理後、胚及び処理溶液を微量遠心チューブに移し、４０００×ｇで２、５、１０若しくは２０分遠心分離する以外は、実験５と同じ条件。
送達処理後、各処理群の胚を滅菌水で５回洗浄し、１／２ＭＳ固体培地（２．１６５ｇのムラシゲ・スクーグ培地塩、カタログ番号ＭＳＰ０５０１、Ｃａｉｓｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｍｉｔｈｆｉｅｌｄ，ＵＴ）、１０ｇのスクロース及び８ｇのＢａｃｔｏアガー、蒸留水中に１．００リットルまで製造）を含有するペトリ皿に移し、２５℃に設定した組織培養インキュベータ内に配置する。胚が伸長し、根を発生し、真の葉が現れたら、苗を土壌に移して、成長させる。内在性ＰＤＳ対立遺伝子の修飾により、クロロフィルを生成することができず、且つ明らかな漂白表現型を有する植物が得られる。全ての内在性ＰＤＳ対立遺伝子の画分の修飾により、クロロフィルを依然として生成することができる植物が得られ；改変されたＰＤＳ遺伝子についてヘテロ接合型の植物を成長させて、種子を採取し、遺伝性ゲノム修飾の効率を子孫種子の分子解析により決定する。
実施例１３：ヒト細胞中のリコンビナーゼ媒介プラスミド組込み
この実施例は、ヒトゲノムへの鋳型ＤＮＡの標的組込みのためのセリンリコンビナーゼベースＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。より具体的には、この実施例は、例えば、ヒト細胞中の組込み活性について新たなＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドを評価する手段としてのインビトロＧｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇのためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への２つのプラスミドシステムのトランスフェクションを記載する。
手短には、１）哺乳動物ＣＭＶプロモータにより駆動されるインテグラーゼ発現プラスミド、例えばヒトコドン最適化セリンインテグラーゼ、例えば表３Ａ、表３Ｂ又は表３Ｃからのセリンインテグラーゼをコードするプラスミドと、２）鋳型プラスミド、例えば（ｉ）セリンインテグラーゼの認識部位を含む配列、例えばセリンインテグラーゼの内在性フランキング領域からの約５００ｂｐ配列、例えば表２Ａ、表２Ｂ又は表３Ｃの対応する行からの配列；（ｉｉ）哺乳動物細胞中の発現のためのプロモータ、例えばＣＭＶプロモータ；（ｉｉｉ）発現が（ｉｉ）により制御されるリポータ遺伝子、例えばＥＧＦＰ遺伝子；（ｉｖ）自己切断ポリペプチド、例えばＴ２Ａペプチド；（ｖ）哺乳動物細胞中の選択を可能にするマーカ、例えばピューロマイシン耐性遺伝子；及び（ｖｉ）終結シグナル、例えば、ポリＡテイルを含むプラスミドとを含む２つのプラスミドシステムを設計した。特定の理論に束縛されることは意図しないが、鋳型プラスミドの一部の実施形態は、配向（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）で存在するエレメントを含み得る。
Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒシステムをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達するため、約１２０，０００個の細胞を（１）５０ｎｇの鋳型プラスミド及び２２５ｎｇのトランスフェクションバランスプラスミド（鋳型のみの対照）；又は（２）５０ｎｇの鋳型プラスミド、２５ｎｇのインテグラーゼ発現プラスミド及び２２５ｎｇのトランスフェクションバランスプラスミドのいずれかで、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ）を製造者の説明書に従って用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、フローサイトメトリーを用いて送達の効率を測定してＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定した。細胞をタイムコース実験の３日目と１３日目との間で分けた。１３日目と２７日目との間、分けたトランスフェクト細胞を２つの条件の一方で維持した：１）細胞のサブセットを通常細胞培養培地中で維持し、フローサイトメトリーを３～４日ごとに実施して良好に組み込まれた鋳型からのＧＦＰ発現を決定した；２）細胞のサブセットを、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンが補給された培地中で維持し、そこでピューロマイシン耐性細胞を選択の約２週間後に採取した。いくつかの事例では、ヒト細胞において活性を立証したＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、２１日目に細胞の少なくとも３％において検出可能なリポータ発現、例えば、フローサイトメトリーにより決定されたように、細胞の少なくとも３％においてＧＦＰの検出可能な発現をもたらした。いくつかの事例では、ヒト細胞において活性を立証したＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、鋳型のみの対照を用いて立証されたものよりも多い、例えば、トランスフェクション条件（１）と比較して高い、例えば、鋳型のみの対照と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００倍高いパーセンテージの細胞において検出可能なリポータ発現をもたらした。
活性Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒにより使用される組込み部位を決定するため、ピューロマイシン選択下で維持される並行培養物をゲノム単離のために採取し、実施例１８に本明細書に記載されるように、一方向配列決定アッセイにより分析した。
以下の表３０に示されるように、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えば表３Ａ、表３Ｂ又は表３Ｃからのセリンリコンビナーゼを、ヒト細胞における、ＧＦＰ発現カセット及び認識配列、例えば表２Ａ、表２Ｂ又は表２Ｃの対応する行からの認識配列を含む鋳型ＤＮＡの組込みについて検定した（実施例１３参照）。
Figure 2023502473000777
Figure 2023502473000778
Figure 2023502473000779
Figure 2023502473000780
Figure 2023502473000781
Figure 2023502473000782
Figure 2023502473000783
Figure 2023502473000784
Figure 2023502473000785
Figure 2023502473000786
Figure 2023502473000787
Figure 2023502473000788
Figure 2023502473000789
個別のポリペプチド及びコグネイト認識配列を、第１列にそれらの行番号（表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃの行番号に対応する）を有する表３０に示し、それらに第３列のインテグラーゼ識別名（「Ｉｎｔ ＩＤ」）を割り当てた。組込み効率を第４列に、トランスフェクションから２１日後に抗生物質選択の不存在下でフローサイトメトリーにより測定された、ＧＦＰを発現する細胞のパーセント（「％ＧＦＰ＋」）として示す。
さらなる実施例では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をインテグラーゼ発現プラスミドと、５２０ｂｐのａｔｔＰ含有領域に続いて、ＣＭＶプロモータにより駆動されるＥＧＦＰリポータを有する鋳型プラスミドとでトランスフェクトした。トランスフェクションから２１日後のＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより分析した。図１Ａに示されるように、９つのインテグラーゼのうちの９つが、２９３Ｔ細胞において陽性対照インテグラーゼＰｈｉＣ３１と比較して高い組込み効率を達成した。示されるインテグラーゼについてのデータは、２つ超のレプリケートを含んだ。
実施例１４：哺乳動物細胞へのセリンインテグラーゼ及び鋳型ＤＮＡの二重ＡＡＶ送達
この実施例は、ヒトゲノムへの鋳型ＤＮＡの標的組込みを目的とする、セリンリコンビナーゼベースのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を記載する。より具体的には、リコンビナーゼ、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃからのアミノ酸配列を有するインテグラーゼ、例えばＢｘｂ１リコンビナーゼタンパク質（表３Ａ第２０４行）と、関連付着部位、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域又は右側領域、例えば、表２Ａ第２０４行からの左側領域からの配列を含む鋳型ＤＮＡを、個別のＡＡＶウイルスベクターとして、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共送達して、対応するＢｘｂ１付着ランディングパッド部位を含む哺乳動物細胞ゲノム中に挿入ＤＮＡを正確且つ効率的に挿入する。
２つのトランスジーン配列を評価して、異なるＡＡＶドナーフォーマット（図１Ｂ）：１）細胞核へのＡＡＶ形質導入後の二本鎖環状化ＤＮＡの形成を利用する、ａｔｔＰ＊又はａｔｔＢ＊を含む鋳型；又は２）細胞核へのＡＡＶ形質導入後のＤＮＡの二本鎖環状化から独立して哺乳動物ゲノムに組み込むことができる、二重付着部位、ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊又はａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊を含む鋳型を用いた組込み、安定性及び発現を決定する。
鋳型のＢｘｂ１媒介ゲノム組込みのためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を調製するため、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊又はＢｘｂ１ ａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊部位を含有するＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞株を作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍプレート（５×１０６個の細胞）中で接種後、レンチウイルストランスフェクションを行った。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｈｏｔｓ（ＶＳＶ－Ｇ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いたレンチウイルス形質導入を、レンチウイルスベクタープラスミドＤＮＡ（ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊又はａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊を含有する）を用いて翌日実施した。レンチウイルス力価測定を実施し、０．２２μｍフィルタを用いてウイルスを濾過し、１ｍＬのレンチウイルスアリコートを作製し、－８０℃で貯蔵した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０５個の細胞／ウェルで４×６－ウェルプレート中で接種した。次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊又はａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊レンチウイルスで形質導入し、４８時間培養してからピューロマイシン選択（１μｇ／ｍＬ）を開始した。細胞をピューロマイシン選択下で少なくとも７日間保持し、次に１５０ｍｍ培養プレートにスケールアップした。次に、細胞をゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のために採取し、レンチウイルス組込みコピー数についてｄｄＰＣＲにより検定した。
Ｂｘｂ１インテグラーゼを含有するアデノ随伴ウイルスベクター又は対応するＢｘｂ１ ａｔｔＰ＊／ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊ドナー若しくはＢｘｂ１ ａｔｔＢ＊／ａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊ドナーは、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡウイルスバックボーン（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に基づいて作製されたが、ＣＭＶプロモータの代わりにＥＦ１ａプロモータを用いた。ｐＡＡＶ－Ｅｆ１ａ－ＢＸＢ１－ＷＰＲＥ－ｐＡは、ヒトコドン最適化Ｂｘｂ１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を用いて作製した。ｐＡＡＶ－スタッファー－ａｔｔＰ＊（Ｂｘｂ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ及びｐＡＡＶ－スタッファー－ａｔｔＢ＊（Ｂｘｂ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ鋳型構築物は、５’ＡＡＶ２ＩＴＲ配列とＥｆ１ａプロモータとの間の５００ｂｐスタッファー配列を含有した。ｐＡＡＶ－スタッファー－ａｔｔＰ（Ｂｘｂ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ－ａｔｔＰ＊（Ｂｘｂ１）－スタッファー及びｐＡＡＶ－スタッファー－ａｔｔＢ（Ｂｘｂ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ－ａｔｔＢ＊（Ｂｘｂ１）－スタッファードナー構築物は、ＡＡＶ２ＩＴＲ配列とＥｆ１ａプロモータとの間の５００ｂｐスタッファー配列及び３’ａｔｔＰ＊／ａｔｔＢ＊付着部位と３’ＡＡＶ２ＩＴＲ配列との間の５００ｂｐスタッファー配列を含有した（図２）。上に挙げたＡＡＶベクターは、１１３総ｖｇスケールで、ＡＡＶ２血清型（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にパッケージングした：ＡＡＶ２－Ｅｆ１ａ－ＢＸＢ１－ＷＰＲＥ－ｐＡ、ＡＡＶ２－スタッファー－ａｔｔＰ＊（ＢＸＢ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ、ＡＡＶ２－スタッファー－ａｔｔＢ＊（ＢＸＢ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ、ＡＡＶ２－スタッファー－ａｔｔＰ（ＢＸＢ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ－ａｔｔＰ＊（ＢＸＢ１）－スタッファー、ＡＡＶ２－スタッファー－ａｔｔＢ（ＢＸＢ１）－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ－ａｔｔＢ＊（ＢＸＢ１）－スタッファー。
ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊又はａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊ランディングパッド部位のいずれかを含有するＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞を４８ウェルプレートフォーマット中に４０，０００細胞／ウェルで接種した。２４ｈ後、以下の条件を試験した：１）ＡＡＶ２－Ｅｆ１ａ－ＢＸＢ１インテグラーゼを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＰ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ、２）ＡＡＶ２－Ｅｆ１ａ－ＢＸＢ１インテグラーゼを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰドナー、３）ＡＡＶ２－Ｅｆ１ａ－ＢＸＢ１インテグラーゼを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＢ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ、４）ＡＡＶ２－Ｅｆ１ａ－ＢＸＢ１インテグラーゼを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰでの二重ＡＡＶ形質導入（図３Ａ）。インテグラーゼを含むＡＡＶを約２５，０００のＭＯＩで投与し、鋳型を含むＡＡＶを約７５，０００のＭＯＩで投与した。セリンインテグラーゼと、インテグラーゼをヒトゲノムに組み込むためのその認識部位を含む鋳型との二重ＡＡＶ送達の効率を評価するため、ｄｄＰＣＲを実施して組込み事象（％ＣＮＶ／ランディングパッド）を形質導入から３及び７日後に定量した。ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊ランディングパッド細胞株へのａｔｔＢ＊ドナーを用いて約５％の組込みが検出され、この組込みは両方の時点で安定的且つ一貫しており（図３Ｂ）、二重ＡＡＶ送達システムによるＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの成功を示した。
実施例１５：ヒト細胞への部位特異的組込みを目的とする、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド及び鋳型ＤＮＡのインビトロ組合せｍＲＮＡ及びＡＡＶ送達
この実施例は、哺乳動物細胞ゲノムへの外性ＤＮＡの部位特異的挿入のためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムの使用を立証する。より具体的には、リコンビナーゼ、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃからのアミノ酸配列を有するインテグラーゼ、例えばＢｘｂ１リコンビナーゼタンパク質（表３Ａ第２０４行）と、関連付着部位、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃから左側領域又は右側領域、例えば、表２Ａの第２０４行からの左側領域からの配列を含む鋳型ＤＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞株に導入する。この実施例では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡとして送達し、鋳型ＤＮＡは、ＡＡＶにより送達する。
ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊又はａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊ランディングパッド部位のいずれかを含有するＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞（実施例１４参照）を４８ウェルプレートフォーマットに４０，０００細胞／ウェルで接種した。２４ｈ後、以下の条件を試験した：１）ＢＸＢ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＰ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ；２）ＢＸＢ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰドナー；３）ＢＸＢ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＢ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ；及び４）ＢＸＢ１インテグラーゼをコードするｍＲＮＡを含む又は含まないＡＡＶ２－ａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊－Ｅｆ１ａ－ＥＧＦＰ（図４Ａ）。インテグラーゼをコードするｍＲＮＡを約１μｇで投与し、鋳型を含むＡＡＶを約７５，０００のＭＯＩで投与した。以下の条件により送達のタイミングも評価した：１）同じ日にＢＸＢ１インテグラーゼのｍＲＮＡ送達及び鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達、２）ＢＸＢ１インテグラーゼのｍＲＮＡ送達の２４ｈ後に鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達、３）鋳型ＤＮＡのＡＡＶ送達の２４ｈ後にＢＸＢ１インテグラーゼのｍＲＮＡ送達。ｄｄＰＣＲを実施して、セリンインテグラーゼのｍＲＮＡ送達及びその付着を含む鋳型のＡＡＶ送達を介して媒介された組込みを評価し、ｄｄＰＣＲを実施してｍＲＮＡのトランスフェクション及びＡＡＶの形質導入から３日後に組込み（％ＣＮＶ／ランディングパッド）について検定した。ａｔｔＢ－ａｔｔＢ＊ランディングパッド２９３Ｔ細胞株へのａｔｔＰ＊ドナーを用いて、約２～４％の組込みが検出された（図４Ｂ）。付着部位ドナーのＡＡＶ送達の２４ｈ後のＢＸＢ１インテグラーゼのｍＲＮＡ送達は、約４％の最大％ＣＮＶ／ランディングパッドを達成した（図３Ｂ）。これらの結果は、セリンインテグラーゼのｍＲＮＡ送達及びそのそれぞれの部位特異的付着部位のＡＡＶ送達により媒介される、部位特異的であるＡＡＶ送達ＤＮＡ断片を挿入するＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集事象の成功を示す。
実施例１６：βサラセミア及び鎌状赤血球症の処置を目的とする、ＨＳＣへのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド及び鋳型ＤＮＡのエクスビボ組合せｍＲＮＡ及びＡＡＶ送達
この実施例は、βサラセミア及び鎌状赤血球症を引き起こす遺伝子突然変異を処置するために、活発に発現されるγ－グロビン遺伝子カセットを書き込むことを目的とする、Ｃ３４＋細胞（造血幹細胞及び子孫細胞）へのインテグラーゼをコードするｍＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型ＤＮＡの送達を記載する。
この実施例では、ＡＡＶ６を用いて、鋳型ＤＮＡを送達する。より具体的には、ＡＡＶ６鋳型ＤＮＡは、順に、５’ＩＴＲ、インテグラーゼ付着部位、例えば、ａｔｔＰ又はａｔｔＢ、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃからの左側領域又は右側領域、ｐｏｌＩＩプロモータ、例えばヒトβ－グロビンプロモータ、ヒト胎児γ－グロビンコード配列、ポリＡテイル及び３’ＩＴＲを含む。エレクトロポレーション試薬の最大量限度を考慮して、様々な条件、例えば、：１）ＡＡＶ６鋳型及びインテグラーゼｍＲＮＡの同時エレクトロポレーション；２）インテグラーゼｍＲＮＡのエレクトロポレーションの１５分後、ＡＡＶ６ドナーの形質導入で、インテグラーゼｍＲＮＡ及びＡＡＶ６鋳型をＣＤ３４細胞に共送達する。
エレクトロポレーション／形質導入後、細胞をＣＤ３４維持培地中で２日間インキュベートする。次に、処理細胞の約１０％をゲノムＤＮＡ単離のために採取して、組込み効率を決定する。残りの細胞を赤血球増殖及び分化培地に移す。約２０日の分化後、３つのアッセイを実施して、赤血球分化後のγ－グロビンの組込みを決定する：１）細胞のサブセットをＮｕｃＲｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色して、除核率を決定する；２）細胞のサブセットを蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗γ－グロビン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で染色して、胎児ヘモグロビン陽性細胞のパーセンテージを決定する；３）細胞のサブセットをＨＰＬＣのために採取して、γ－グロビン鎖発現を決定する。
実施例１７：ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を目的とする、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド及び環状ＤＮＡ鋳型のエクスビボ送達
この実施例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、Ｂ細胞リンパ腫の処置のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を目的として、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムをデオキシリボ核タンパク質（ＤＮＰ）としてヒト初代Ｔ細胞にエクスビボで送達する。
Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えばインテグラーゼ、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃからの配列を有するインテグラーゼを、その活性タンパク質形態で直接使用するために調製し、精製する。鋳型成分については、プラスミドバックボーン及び細菌配列が欠失したミニサークルＤＮＡプラスミドをこの実施例で使用し、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ８（３）：４９５－５００（２００３）の方法に従って調製し、この場合、初めに組換え事象を使用して、これらの外来プラスミド維持機能を切除することにより、プラスミドサイズ及び細胞応答を最小限にする。鋳型ＤＮＡミニサークルは、順に、インテグラーゼ付着部位、例えば（ａｔｔＰ又はａｔｔＢ）、例えば表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃからの左側領域又は右側領域、ｐｏｌＩＩプロモータ、例えばＥＦ－１、ヒトコドン最適化キメラ抗原受容体（細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む）、例えばＣＤ１９特異的Ｈｕ１９－ＣＤ８２８Ｚ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＮ６９８６４２；Ｂｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：２７０－２８０（２０２０））ＣＡＲ分子及びポリＡテイルを含む。鋳型ＤＮＡをまず精製インテグラーゼタンパク質と混合し、室温で１５～３０分インキュベートして、ＤＮＰ複合体を形成する。次に、ＤＮＰ複合体を活性化Ｔ細胞にヌクレオフェクトする。Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムによる組込みは、分子定量のためのｄｄＰＣＲを用いて検定し、ＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーにより測定する。
実施例１８：組込み部位決定のための単一方向シーケンシングアッセイ
この実施例では、ゲノムレベルでの特異性の不偏プロフィールを備える未知の組込み部位の配列を決定するための単一方向シーケンシングを実施する。
組込み実験は、インテグラーゼと挿入のための鋳型ＤＮＡとを含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、前述の実施例と同様に実施する。インテグラーゼ及びドナープラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションから７２時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、以下の方法に従って、単一方向シーケンシングに付す。最初に、ゲノムＤＮＡのフラグメント化、エンドリペア及びアダプター連結により、次世代ライブラリーを作製する。次に、鋳型特異的配列に結合するフォワードプライマーと、シーケンシングアダプターに結合するリバースプライマーを用いる２ステップネステッドＰＣＲにより、鋳型ＤＮＡ組込み事象を有する断片化ゲノムＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ産物をキャピラリーゲル電気泳動装置で視覚化し、精製した後、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により定量する。最終ライブラリーを、３００ｂｐペアエンドリードを用いるＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングする。挿入物とフランキングするＤＮＡを検出し、その配列をヒトゲノム配列、例えばｈｇ３８に対してマッピングすることにより、データ解析を実施する。
実施例１９：Ｇｅｎｅ ＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生産
この実施例では、インテグラーゼをｍＲＮＡからのインビトロ転写により発現させる。ｍＲＮＡ鋳型プラスミドは、Ｔ７プロモータに続いて、５’ＵＴＲ、リコンビナーゼコード配列、３’ＵＴＲ及び約１００ヌクレオチド長のポリ（Ａ）テイルを含んだ。プラスミドは、ポリ（Ａ）テイルの下流に、平滑末端又は５’オーバーハングを生じる酵素制限により線状化され、Ｔ７ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いるインビトロ転写（ＩＶＴ）のために使用される。ＩＶＴ後、ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（ＮＥＢ）で処理する。バッファー交換後、ＧＴＰ及びＳＡＭ（ＮＥＢ）の存在下で、ワクシニアキャッピング酵素（ＮＥＢ）及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、酵素キャッピングを実施する。シリカカラム（例えば、Ｍｏｎａｒｃｈ（商標登録）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ）を用いて、キャップＲＮＡを精製及び濃縮した後、２ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．５により中和する。
実施例２０：ＣＦＴＲマウスモデルにおける嚢胞性線維症の処置のための二重ＡＡＶベクターの使用
この実施例では、疾患のマウスモデルにおける嚢胞性線維症の処置のための二重ＡＡＶベクターとしてＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達する。嚢胞性線維症は、ＣＴＦＲ遺伝子中の突然変異に起因する肺疾患であり、肺細胞、例えば、呼吸細気管支に存在する細胞及び終末細気管支中の円柱上皮無線毛細胞などのゲノムに、野生型ＣＴＦＲ遺伝子を挿入することにより、処置することができる。
例えば、表３Ａ、３Ｂ又３Ｃの配列を含むＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチドと、コグネイト付着部位、例えばａｔｔＢ又はａｔｔＰ部位、例えば表２Ａ、２Ｂ又２Ｃの左側領域又は右側領域配列を含む鋳型ＤＮＡとを、ＣＡＧプロモータにより駆動されるポリペプチドの発現を有するＡＡＶ６カプシド中にパッケージングするが、それらの組合せは、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８（４）：３４４－３５４（２００７）の教示によれば、マウス呼吸器上皮細胞における高レベルの形質導入及び発現のために有効であることが明らかにされている。
ＡＡＶ調製物は、以前記載されている（Ｓａｎｔｒｙ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：４３（２０１７））ように、改変された鼻内投与を用いて、ＣＦＴＲ遺伝子ノックアウト（Ｃｆｔｒｔｍ１Ｕｎｃ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に共送達する。手短には、インテグラーゼ又は鋳型ＤＮＡのいずれかを有し、ｐｏｌ ＩＩプロモータ、例えばＧＡＧプロモータの制御下のＣＦＴＲ遺伝子と、コグネイト付着部位とを含むＡＡＶをパッケージングし、精製した後、濃縮する。一部の実施形態では、ＣＦＴＲ発現カセットは、インテグラーゼ付着部位によりフランキングされる。ＣＦＴＲノックアウトマウスに対する修飾鼻内投与を用いて、１×１０１０～１×１０１２ｖｇ／マウスの範囲の用量で調製ＡＡＶを各々送達する。１週間後、肺細胞を採取して、ゲノム抽出及び組織分析のために使用する。組込み効率を測定するために、ｄｄＰＣＲを用いて、ＣＦＴＲ遺伝子組込みを定量して、挿入物を含む又は含まない細胞及び標的部位の割合を決定する。組込みが成功したＣＦＴＲからの発現をアッセイするために、免疫組織学により組織を分析して、発現及び病状を決定する。
実施例２１：一過性発現されたインテグラーゼの導入によりオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置する方法
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症は、窒素の効率的な分解がないために、アンモニアの蓄積を引き起こす稀有な遺伝性障害である。アンモニアの蓄積は、衰弱させ、重篤な場合には致死的となり得る高アンモニア血症を引き起こす。この実施例は、組込みのための鋳型ＤＮＡを賦与するＡＡＶの送達と一緒に、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃからのインテグラーゼ配列をコードするｍＲＮＡの送達及び発現によるＯＴＣ欠損症の処置を記載する。ＡＡＶ鋳型は、ｐｏｌＩＩプロモータ、例えばＡｐｏＥ．ｈＡＡＴの制御下のヒトＯＴＣ遺伝子の野生型コピーと、コグネイト付着部位、例えばａｔｔＢ又はａｔｔＰ部位、例えば表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃからの左側領域又は右側領域配列とを含む。例えば、一部の実施形態では、ＯＴＣ発現カセットは、インテグラーゼ付着部位によりフランキングされる。
この実施例では、インテグラーゼｍＲＮＡのＬＮＰ製剤化は、ＬＮＰ－ＩＮＴ－０１の製剤化（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：２２２７－２２３５（２０１８）により教示される方法）に従い、鋳型ＤＮＡは、ＡＡＶ２／８に製剤化される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｎｎ ｅｔ ａｌ．ＪＨＥＰ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）により教示される方法）。手短には、ＯＴＣ欠損症は、インテグラーゼｍＲＮＡと、鋳型ＤＮＡを含有するＡＡＶ（１×１０１０～１×１０１２ｖｇ／マウス）とを含むＬＮＰ製剤（１～３ｍｇ／ｋｇ）を、浅側頭顔面静脈を介して注射する（Ｌａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ９３：ｅ５２０３７（２０１４））ことにより、新生Ｓｐｆａｓｈマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を処置することによって回復する。Ｓｐｆａｓｈマウスは、幾分の残留マウスＯＴＣ活性を有し、一部の実施形態では、以前記載されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９（５）：８５４－８５９（２０１１）、その方法は、参照により本明細書に組み込まれる）ように、マウスＯＴＣに対してｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶの投与によりサイレンシングされる。ＯＴＣ酵素活性、アンモニアレベル及びオロト酸は、以前記載されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９（５）：８５４－８５９ （２０１１））通りに測定する。１週間後、マウスの肝臓を採取して、ｇＤＮＡ抽出及び組織分析のために使用する。抽出したｇＤＮＡに対するｄｄＰＣＲにより、ｈＯＴＣの組込み効率を測定する。マウス肝臓組織を免疫組織学により分析して、ｈＯＴＣ発現を確認する。
実施例２２：大きいペイロードをヒト細胞に組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの使用
この実施例は、インビトロでのヒト細胞への大きいペイロードのインテグラーゼ媒介性組込みについて記載する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド成分は、インテグラーゼ、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃのインテグラーゼ配列をコードするｍＲＮＡと、コグネイト付着部位、例えば、ａｔｔＢ又はａｔｔＰ部位、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃの左側領域又は右側領域；ＧＦＰ発現カセット、例えば、ＥＧＦＰに作動可能に連結したＣＭＶプロモータ；及び総プラスミドサイズを約２０ｋｂにするスタッファー配列を含む鋳型ＤＮＡと、を含む。
手短には、インテグラーゼｍＲＮＡ及び大きい鋳型ＤＮＡによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時エレクトロポレーションを実施する。３日後、組込み効率及び特異性を測定する。組込み効率を測定するために、組込みの接合部にわたって増幅するプライマー－プローブセット、例えば、組込み事象のみが定量されるように、一方のプライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングし、他方がゲノムの適切なフランキング領域にアニーリングするセットを用いて、例えばＬｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５）：１９７－２０８（２０１６）により記載されているように、ゲノムＤＮＡに対して、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実施する。データを内部標準遺伝子、例えばＲＰＰ３０に対して正規化し、細胞の集団全体にわたる１ゲノム当たりの平均組込み事象として効率を表す。特異性を測定するために、単一方向シーケンシングによりゲノムＤＮＡへの組込み事象を評価して、実施例１８に記載のように、ゲノム座標を決定する。
実施例２３：細菌人工染色体をヒト胚幹細胞にエクスビボで組み込むためのＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇの使用
この実施例は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）への細菌人工染色体（ＢＡＣ）のインテグラーゼ媒介性組込みについて記載する。
ＢＡＣベクターは、極めて大きい（＞１００ｋｂ）ＤＮＡペイロードを維持することができ、従って、細胞操作において有用となり得る多くの遺伝子又は複合体を担持することができる。ｈＥＳＣへのそれらの組込みの実証はある（Ｒｏｓｔｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（１９）：ｅ１５０（２０１２））が、これは、それらの組込みパターンに配列特異性を欠いたトランスポゾンを用いて達成された。この実施例は、大きい構築物の配列特異的組換えを記載する。
この実施例では、所望のペイロードを輸送するように操作されたＢＡＣは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えばインテグラーゼ、例えば表３Ａ、３Ｂ又は３Ｃの配列を有するインテグラーゼによる認識を可能にする付着部位、例えば、ａｔｔＢ又はａｔｔＰ部位、例えば、表２Ａ、２Ｂ又は２Ｃからの左側領域又は右側領域をさらに含む。Ｒｏｓｔｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（１９）：ｅ１５０（２０１２）の教示に従うエレクトロポレーション又はリポフェクションにより、約１５０ｋｂのＢＡＣをｈＥＳＣに導入する。３日後、組込み効率及び特異性を測定する。組込み効率を測定するために、組込みの接合部にわたって増幅するプライマー－プローブセット、例えば、組込み事象のみが定量されるように、一方のプライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングし、他方がゲノムの適切なフランキング領域にアニーリングするセットを用いて、例えばＬｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７（５）：１９７－２０８（２０１６）により記載されているように、ゲノムＤＮＡに対して、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実施する。データを内部標準遺伝子、例えばＲＰＰ３０に対して正規化し、細胞の集団全体にわたる１ゲノム当たりの平均組込み事象として効率を表す。特異性を測定するために、単一方向シーケンシングによりゲノムＤＮＡへの組込み事象を評価して、実施例１８に記載のように、ゲノム座標を決定する。
実施例２４：インテグラーゼランディングパッド部位を含有するマウスモデルにトランスジーンを組み込むための二重ＡＡＶベクターの使用
インテグラーゼタンパク質はバクテリオファージに天然に見出され、ファージゲノムの配列（ａｔｔＰ）を利用してそのゲノムの一部を細菌のゲノムに特異的配列（ａｔｔＢ）で組み込む。インテグラーゼタンパク質は、適切な認識配列（例えば、ａｔｔＰ又はａｔｔＢ）を担持する挿入ＤＮＡを輸送するドナーベクターが供給され、標的又は宿主ゲノムが対応する認識配列（例えば、ａｔｔＢ又はａｔｔＰ）を担持する場合、ＤＮＡをゲノムに組み込むためのドライバーとして利用することができる。効率的な組込みを有するための宿主ゲノムに見出そうとする特異的配列についてのこの要求は、トランスジーンをマウスのゲノムに挿入するためのインテグラーゼの使用及び／又は効力を限定し得、それによりマウスモデルを作製すること又はマウス遺伝性疾患モデルの背景に見出される疾患を処置することが困難になる。この実施例では、ａｔｔＰ認識部位（例えば、Ｂｘｂ１インテグラーゼについてのａｔｔＰ配列）をゲノム中に有するように操作されたマウスを用いて、１）目的の配列を担持し、ａｔｔＢ認識部位（例えば、Ｂｘｂ１インテグラーゼについてのａｔｔＢ配列）をさらに含む挿入ＤＮＡ及び２）ゲノムａｔｔＰ部位への挿入ＤＮＡの組込みを触媒するインテグラーゼ（例えば、Ｂｘｂ１インテグラーゼ）の送達による標的組込みを立証する。さらに、この実施例では、使用されるＢｘｂ１特異的ａｔｔＰ及びａｔｔＢ認識配列は、ＧＴからＧＡに変化した中央ジヌクレオチドを有する。いくつかの例では、目的のＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ配列（例えば、ヒトチロキシン結合グロブリン、ＴＢＧ）と、治療用タンパク質又はリポータ遺伝子（例えば、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ）のＤＮＡコード領域とを含む異種目的配列である。
手短には、インテグラーゼタンパク質（例えば、Ｂｘｂ１）をコードするＤＮＡを含むか、又は挿入ＤＮＡ（例えば、ＴＢＧプロモータの制御下のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ及び記載されるａｔｔＢ配列）を含む構築物のいずれかでＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ）をパッケージングし、精製し、濃縮する。ａｔｔＰ認識配列の安定的組込みを有するマウスに、腹腔内注射を介して２つのＡＡＶウイルスの１つ又は両方を１マウス当たり１ウイルス当たり１×１０１０～１×１０１３ｖｇの範囲の用量で共投与する。組込みを、以前記載されているように、いくつかの臓器の中で特に肝臓の一方向配列決定により経時的にモニタリングする。ルシフェラーゼ発現の生存イメージングを以前記載されているようにモニタリングする（Ｂｈａｕｍｉｋ，Ｓ．，＆Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｓ．Ｓ．，ＰＮＡＳ ２００２，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０１２６１１０９９）。
実施例２５：複数の遺伝子を組み込む単一組成物での複数の疾患の処置
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症及びシトルリン血症Ｉ型は、異なる遺伝子（それぞれＯＴＣ及びＡＳＳ１）中の突然変異により引き起こされる個別の疾患であり、それは両方とも尿素サイクルの破壊をもたらし、最終的に血液中の窒素（アンモニアとして）の蓄積を引き起こす。アンモニアの蓄積は高アンモニア血症を引き起こし、それは最終的に組織及び神経毒性を引き起こし、衰弱させ、潜在的に致死的な結果となり得る。
この実施例は、２つ以上の疾患の処置を提供することができる単一Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムの設計及び使用を記載する。より具体的には、この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、例えば表３Ａ、表３Ｂ又は表３Ｃからのインテグラーゼ配列をコードするｍＲＮＡと、組込みのための鋳型ＤＮＡを含むＡＡＶとの送達及び発現によるＯＴＣ欠損症又はシトルリン血症１型の処置を記載する。この実施例の鋳型ＤＮＡは、ｐｏｌＩＩプロモータ、例えばＡｐｏＥ．ｈＡＡＴの制御下の自己切断ペプチド（例えば、２Ａ）により隔てられるヒトＯＴＣ及びＡＳＳ１遺伝子の両方の機能性コピーと、コグネイト付着部位、例えばａｔｔＢ又はａｔｔＰ部位、例えば表２Ａ、表２Ｂ又は表２Ｃの左側領域又は右側領域配列とを含む。一部の実施形態では、ＯＴＣ及びＡＳＳ１の両方を含む発現カセットは、インテグラーゼ付着部位によりフランキングされる。記載される組成物を用いて、ＯＴＣ又はシトルリン血症１型のいずれかを処置する。
この実施例では、インテグラーゼｍＲＮＡのＬＮＰ製剤化は、ＬＮＰ－ＩＮＴ－０１の製剤化（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：２２２７－２２３５（２０１８）により教示される方法）に従い、鋳型ＤＮＡは、ＡＡＶ２／８にパッケージングされる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｎｎ ｅｔ ａｌ．ＪＨＥＰ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）により教示される方法）。手短には、ＯＴＣ欠損症は、インテグラーゼｍＲＮＡと、鋳型ＤＮＡを含有するＡＡＶ（１×１０１０～１×１０１２ｖｇ／マウス）とを含むＬＮＰ製剤（１～３ｍｇ／ｋｇ）を、浅側頭顔面静脈を介して注射する（Ｌａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ９３：ｅ５２０３７（２０１４））ことにより、新生Ｓｐｆａｓｈマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を処置することによって回復する。Ｓｐｆａｓｈマウスは、幾分の残留マウスＯＴＣ活性を有し、一部の実施形態では、以前記載されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９（５）：８５４－８５９（２０１１）、その方法は、参照により本明細書に組み込まれる）ように、マウスＯＴＣに対してｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶの投与によりサイレンシングされる。ＯＴＣ酵素活性、アンモニアレベル及びオロト酸は、以前記載されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９（５）：８５４－８５９（２０１１））通りに測定する。１週間後、マウスの肝臓を採取して、ｇＤＮＡ抽出及び組織分析のために使用する。抽出したｇＤＮＡに対するｄｄＰＣＲにより、ｈＯＴＣの組込み効率を測定する。マウス肝臓組織を免疫組織化学により分析して、ｈＯＴＣ発現を確認する。
一部の実施形態では、上記ＯＴＣ欠損症のモデルを処置するために記載及び使用される同じ組成物を用いて、シトルリン血症１型を処置することもできる。手短には、ＡＳＳ１欠損症は、記載されるＬＮＰ及びＡＡＶを用いて新生致死アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）ノックアウトマウスモデル（Ｃｉｎｄｙ Ｙ Ｋｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２１（１０）：１８２３－１８３１（２０１３）（その方法の全体が、参照により本明細書に組み込まれる））を処置することにより回復する。具体的には、ＡＳＳノックアウトマウスに、インテグラーゼｍＲＮＡと、鋳型ＤＮＡを含有するＡＡＶ（１×１０１０～１×１０１２ｖｇ／マウス）とを含むＬＮＰ製剤（１～３ｍｇ／ｋｇ）を、浅側頭顔面静脈を介して注射する（Ｌａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ９３：ｅ５２０３７（２０１４））。アンモニアレベル、オロト酸及びマウス全生存率は、以前記載されている（Ｃｉｎｄｙ Ｙ Ｋｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２１（１０）：１８２３－１８３１（２０１３））通りに測定する。２－４－８週間後、マウスの肝臓を採取して、ｇＤＮＡ抽出及び組織分析のために使用する。抽出したｇＤＮＡに対するｄｄＰＣＲにより、ｈＡＳＳ１の組込み効率を測定する。マウス肝臓組織を免疫組織化学により分析して、ｈＡＳＳ１発現を確認する。
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、ＯＴＣ－ＡＳＳ１発現カセットをＯＴＣ欠損症及びＡＳＳ１ノックアウトマウスモデルに組み込む。従って、この同じシステムは、両方のモデルにおいて健康な尿素回路を回復する。一部の実施形態では、血中アンモニアレベルは高アンモニア血症レベルから正常レベルに低下し、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムで処置されたＯＴＣ欠損症又はＡＳＳ１ノックアウトマウスは、対照マウスに対して血中アンモニアレベルの少なくとも２、５、１０、５０倍又は少なくとも１００倍の低下を示す。一部の実施形態では、オロト酸レベルは上昇レベルから正常レベルに低下し、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムで処置されたＯＴＣ欠損症又はＡＳＳ１ノックアウトマウスは、対照マウスに対してオロト酸レベルの少なくとも２、５、１０、５０倍又は少なくとも１００倍の低下を示す。
実施例２６：低下したアルデヒド含有率を有する脂質試薬の選択
この実施例では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｉｎｇ成分核酸を含有する脂質ナノ粒子製剤における下流使用のために脂質を選択し、少なくとも部分的に混入アルデヒドを有さないか又は低レベルで有することに基づいて脂質を選択する。脂質試薬中の反応性アルデヒド基は、ＬＮＰ製剤化中に成分核酸、例えばＲＮＡ、例えば鋳型ＲＮＡの化学修飾を引き起こし得る。従って、一部の実施形態では、脂質試薬のアルデヒド含有率を最小化する。
例えば、Ｚｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １２４（９）：１２９１－１２９５（１９９９）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いて、試薬のアルデヒド含有物を分離し、特性決定し、定量することができる。ここで、各脂質試薬をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付す。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ法は、最初に脂質及び１つ又は複数の不純物をＣ８ＨＰＬＣカラムで分離し、続いてそれらの分子を質量分析計で検出及び構造決定する。アルデヒドが脂質試薬中に存在する場合、それは、アルデヒドと構造的に同一であるが、Ｃ１３及びＮ１５標識に起因して重い安定同位体標識（ＳＩＬ）標準を用いて定量される。適切量のＳＩＬ標準を脂質試薬にスパイクする。次に、混合物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付す。ＳＩＬ標準の量及びピーク比（不明／ＳＩＬ）を乗じることにより混入アルデヒドの量を決定する。脂質試薬中の任意の同定アルデヒドは、記載されているように定量する。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤化のために選択される脂質原料は、選択レベルを超えるいかなる混入アルデヒド含有物も含有しないと見出される。一部の実施形態では、製剤化に使用される１つ又は複数、任意選択で全ての脂質試薬は、３％未満の総アルデヒド含有物を含む。一部の実施形態では、製剤化に使用される１つ又は複数、任意選択で全ての脂質試薬は、０．３％未満の任意の単一アルデヒド種を含む。一部の実施形態では、製剤化に使用される１つ又は複数、任意選択で全ての脂質試薬は、０．３％未満の任意の単一アルデヒド種及び３％未満の総アルデヒド含有物を含む。
実施例２７：製剤化中にアルデヒドにより引き起こされるＲＮＡ修飾の定量
この実施例では、ＲＮＡ分子を製剤化後に分析して製剤化プロセス中に起こり得た任意の修飾の程度を決定し、例えば、脂質試薬のアルデヒド混入により引き起こされる化学修飾を検出する（例えば、実施例２６参照）。
ＲＮＡ修飾は、例えば、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ９：８２８－８４１（２０１４）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）の方法に従ってリボヌクレオシドの分析により検出することができる。このプロセスでは、ＲＮＡをヌクレオシドの混合物に消化し、次いでＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付す。製剤化後ＲＮＡはＬＮＰ中に含有され、最初に脂質から８０％イソプロパノール中のＧｌｙｃｏＢｌｕｅとの共沈により分離しなければならない。遠心分離後、ＲＮＡを含有するペレットを新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに慎重に移し、それに酵素のカクテル（ベンゾナーゼ、ホスホジエステラーゼ１型、ホスファターゼ）を添加してＲＮＡをヌクレオシドに消化する。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブを予熱したＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上に３７℃で１時間置く。最初にヌクレオシド及び修飾ヌクレオシドをＣ１８カラムで分離し、次にそれらを質量分析で検出するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法により、得られたヌクレオシド混合物を直接分析する。
脂質試薬中のアルデヒドが化学修飾を引き起こした場合、データ分析は修飾ヌクレオシドをそのアルデヒドと関連付ける。修飾ヌクレオシドは、Ｃ１３及びＮ１５標識に起因してより重いことを除きネイティブヌクレオシドと構造的に同一であるＳＩＬ標準を用いて定量することができる。適切量のＳＩＬ標準をヌクレオシド消化物にスパイクし、次にそれをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に付す。ＳＩＬ標準の量及びピーク比（不明／ＳＩＬ）を乗じることにより、修飾ヌクレオシドの量を得る。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、全ての標的分子を同時に定量することができる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤化プロセス間の材料としての、より高い混入アルデヒド含有率を有する脂質試薬の使用は、より高純度の脂質試薬の使用と比較して高レベルのＲＮＡ修飾をもたらす。従って、好ましい実施形態では、許容可能レベル未満のＲＮＡ修飾をもたらすより高純度の脂質試薬を用いる。
実施例２８：インビボでのＴ細胞中のＣＡＲの組込みを目的とする、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ
この実施例は、インビボでＴ細胞に遺伝子ペイロードの組込み及び安定的発現のために送達されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを記載する。具体的には、標的ナノ粒子を用いて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットをＴ細胞のゲノムに組み込むことができるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを送達して、マウスモデルにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムは、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇポリペプチド、例えば本明細書に記載されるリコンビナーゼ酵素をコードするｍＲＮＡと、リコンビナーゼ認識部位及びトランスジーンカセットを含む挿入ＤＮＡとを含み、トランスジーンカセットは、ＥＦ１ａプロモータにより駆動されるＣＤ１９特異的ｍ１９４－１ＢＢｚ ＣＡＲについてのコード配列を含む（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２（８）：８１３－８２０（２０１７））。Ｔ細胞への特異的送達を達成するため、ＣＤ４に対する共役ｍＡｂを輸送する標的ＬＮＰ（ｔＬＮＰ）を作製する。例えば、Ｒａｍｉｓｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（７）：６７０６－６７１６（２０１５）参照。代わりに、ＣＤ３に対するｍＡｂの共役を用いて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方をターゲティングすることができる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２（８）：８１３－８２０（２０１７））。他の実施形態では、インビボでＴ細胞に送達するために用いられるナノ粒子は、Ｌｏｋｕｇａｍａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ ３１（４１）：ｅ１９０２２５１（２０１９）により教示されるターゲティングリガンドを欠く拘束ナノ粒子である。
ｔＬＮＰは、最初に、脂質の混合物（コレステロール、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マレイミド）と共に核酸混合物（例えば、ポリペプチドｍＲＮＡ：鋳型ＤＮＡモル比１：４０）を調製し、次に所望のＤＴＴ還元ｍＡｂ（例えば、抗ＣＤ４、例えば、クローンＹＴＳ．１７７）をＬＮＰ上のマレイミド官能基に化学的に共役させることにより作製することができる。Ｒａｍｉｓｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（７）：６７０６－６７１６（２０１５）参照。
６～８週齢Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、製剤化ＬＮＰを１ｍｇのＲＮＡ／ｋｇ体重の用量で静脈内注射する。血液を投与から１日及び３日後にヘパリンコート回収チューブに回収し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる密度遠心分離により白血球を単離する。投与から５日後、動物を安楽死させ、血液及び臓器（脾臓、リンパ節、骨髄細胞）をＴ細胞分析のために採取する。特異的免疫学的ソーティングを用いるＦＡＣＳにより、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を検出する。本明細書に記載される方法、例えば、分子コーミング又はＱ－ＦＩＳＨにより、組込みについて陽性細胞を確認する。
実施例２９：分子コーミングによる組込み部位の特性決定
ＡＡＶゲノムは、細胞への送達後に分子内及び分子間組換えの複数の機序を受けることが公知である（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ３８：８１９－４５（２００４））。挿入ＤＮＡはＡＡＶベクターを介して送達することができるため、この状況では、分子の一部がコンカテマーとして存在し得、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇのための基質として用いる場合、それらのコンカテマー挿入ＤＮＡ分子は元の挿入ＤＮＡの２コピー以上の組込みをもたらし得ることが考えられる。従って、鋳型ＤＮＡの単一挿入とコンカテマー挿入をもたらす組込み事象の割合、１組込み部位当たりの平均コピー数及びコンカテマー分子の配向、例えば、頭－頭又は頭－尾立体構造の頻度を分析することが有用であり得る。この実施例は、ヒト細胞におけるＧｅｎｅ ＷｒｉｔｉｎｇシステムのＡＡＶ媒介送達後の組込み部位の構成を決定するための分子コーミング技術の使用を記載する。
Ｂｘｂ１リコンビナーゼ（表３Ａ第２０４行）は、適切な認識部位をゲノム中に含有するように修飾されたヒト細胞にＤＮＡを組み込むために用いられている酵素であり、ここで本明細書に開示されるリコンビナーゼシステムの代表例として用いる。この実施例では、ＢＸＢ１ ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊部位を含有するレンチウイルスベクターでの単一コピー感染によりＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞株を作製する。リコンビナーゼ媒介組込みを実施するため、単一コピーランディングパッド細胞を最初に４８ウェルプレートに約４０，０００個の細胞／ウェルで接種する。接種から約２４時間後、ＢＸＢ１ ａｔｔＢ＊ドナー（ランディングパッド中のａｔｔＰ＊部位に対するコグネイト認識部位）を含有するアデノ随伴ウイルスベクターを、挿入ＤＮＡを含有するＡＡＶで、Ｂｘｂ１インテグラーゼのコード配列を含む第２ＡＡＶの存在又は不存在下で形質導入する。形質導入から２週間後、ＡＡＶ形質導入細胞の約１０％を採取し、ランディングパッド部位に特異的なｄｄＰＣＲアッセイを用いてｇＤＮＡを分析して、組込み（％ＣＮＶ／ランディングパッド）を確認する。分子コーミングの方法は、Ｋａｙｋｏｖ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：１９６３６（２０１６）（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）のアプローチに従う。手短には、各形質導入サンプルからの約３００，０００個の形質導入細胞を高分子量ゲノムＤＮＡについてアガロースプラグに抽出する。次に、ゲノムＤＮＡ分子を機械的に引っ張り、ガラス表面上で制御及び一定の様式でアラインし、ＤＮＡ繊維の長さに沿う正確且つ直接的な測定を可能にする。組込み部位構成分析のための可視化を可能にする予備標識ＤＮＡプローブを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを実施する。Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ－ａｔｔＰ＊ランディングパッド（標的部位）、ＡＡＶ Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ＊ドナー配列（挿入ＤＮＡ）及び基準遺伝子ＲＰＰ３０のプローブを、各プローブからのシグナルを区別するために３つの個別の色を用いて標識する。ハイブリダイゼーション後、蛍光シグナルを取得し、定量する。この方法により、互いに対する個別の蛍光シグナルの数及び位置は、挿入コピー数及び組込みＤＮＡ内の配向の見解を提供する。
実施例３０：インバースＰＣＲによる組込み部位の決定
この実施例は、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムについての組込み部位の特性決定を記載する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、単一標的部位又は標的配列についての優秀な特異性を示し得る。他の実施形態では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、より緩和した特異性を有し、ゲノム中の様々な位置で挿入ＤＮＡの組込みを触媒し得る。従って、任意の所与のＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒについて、その組込みプロファイルの幅を決定することが有用である。
この実施例では、Ｇｅｎｅ Ｗｒｉｔｉｎｇシステムを用いて、上記実施例のいずれかに記載されているよう、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノムを修飾する。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養し、次に部位特異的ゲノム編集について検定する。不適合粘着末端を作製し、挿入ＤＮＡ中で少なくとも１回切断する制限酵素のペアでゲノムＤＮＡを最初に消化し、次に自己ライゲートして理想的には挿入ＤＮＡ及びフランキングゲノムＤＮＡの両方を含む環状ＤＮＡを作製する。隣接ゲノムＤＮＡの増幅をもたらす挿入ＤＮＡに対して特異的なフォワード及びリバースプライマーを用いて、Ｏｌｉｖａｒｅｓ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：１１２４－１１２８（２００２）（その方法の全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、インバーテッドＰＣＲ増幅を実施する。次に、ＭｉＳｅｑ装置での次世代シーケンシング技術を用いて、増幅ＰＣＲ産物を配列決定する。配列分析のため、ＭｉＳｅｑリードをＨＥＫ２９３Ｔゲノムに対してマッピングして、組込みの位置を特定する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、単一部位での検出可能な組込みをもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、限定数の部位、例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３つ未満又は２つ未満の部位での検出可能な組込みをもたらす。他の実施形態では、本明細書に記載されるＧｅｎｅ Ｗｒｉｔｅｒシステムは、１００超の部位での検出可能な組込みをもたらす。

Claims (10)

  1. ＤＮＡを修飾するためのシステムであって、
    ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
    ｂ）二本鎖挿入ＤＮＡであって、
    （ｉ）（ａ）の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ前記第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
    前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む二本鎖挿入ＤＮＡ
    を含むシステム。
  2. 表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）。
  3. 真核生物細胞（例えば、哺乳細胞動物、例えばヒト細胞）であって、
    （ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を含み、
    各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ前記第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む真核生物細胞（例えば、哺乳細胞動物、例えばヒト細胞）。
  4. 真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）のゲノムを修飾する方法であって、前記細胞を、
    ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸；及び
    ｂ）挿入ＤＮＡであって、
    （ｉ）（ａ）の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ前記第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む挿入ＤＮＡ
    と接触させるステップを含み、それにより前記真核生物細胞の前記ゲノムを修飾する、方法。
  5. 真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）のゲノムに異種目的配列を挿入する方法であって、前記細胞を、
    ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチド或いは前記ポリペプチドをコードする核酸；及び
    ｂ）挿入ＤＮＡであって、
    （ｉ）（ａ）の前記リコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ前記第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、
    前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む挿入ＤＮＡ
    と接触させるステップを含み、それにより、例えば実施例５のアッセイで測定されて、例えば前記真核生物細胞の集団の少なくとも約０．１％（例えば、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の頻度で前記真核生物細胞の前記ゲノムに前記異種目的配列を挿入する、方法。
  6. 表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、単離されたリコンビナーゼポリペプチド。
  7. 表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  8. 単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）であって、
    （ｉ）ＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ前記第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
    前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む、単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）。
  9. リコンビナーゼポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、及び
    ｂ）前記リコンビナーゼポリペプチドの産生を可能にする条件下において、真核生物細胞に前記核酸を導入するステップ
    を含み、それにより前記リコンビナーゼポリペプチドを作製する、方法。
  10. ＤＮＡ認識配列と異種配列とを含む挿入ＤＮＡを作製する方法であって、
    ａ）核酸であって、
    （ｉ）表３Ａ、３Ｂ若しくは３Ｃのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むリコンビナーゼポリペプチドに結合するＤＮＡ認識配列であって、第１パラパリンドローム配列及び第２パラパリンドローム配列を有し、各パラパリンドローム配列は、約１５～３５又は２０～３０ヌクレオチドであり、且つ前記第１及び第２パラパリンドローム配列は、一緒に、表２Ａ、２Ｂ若しくは２Ｃの左側領域若しくは右側領域列のヌクレオチド配列内に存在するパラパリンドローム領域或いは前記パラパリンドローム領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０以下の配列改変（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を有するヌクレオチド配列を含み、及び
    前記ＤＮＡ認識配列は、約２～２０ヌクレオチドのコア配列をさらに含み、前記コア配列は、前記第１及び第２パラパリンドローム配列間に位置する、ＤＮＡ認識配列と、
    （ｉｉ）異種目的配列と
    を含む核酸を提供するステップ、及び
    ｂ）前記核酸の複製を可能にする条件下において、細胞（例えば、本明細書に記載されるように、例えば真核生物細胞又は原核生物細胞）に前記核酸を導入するステップ
    を含み、それにより前記挿入ＤＮＡを作製する、方法。
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