CN111712248A - 使用ACE-tRNA经由遗传重分配拯救终止密码子的方法 - Google Patents

Abstract

在某些实施方案中，本发明提供了修饰的转移RNA（tRNA）及其使用方法，所述修饰的转移RNA包含T臂、D臂、反密码子臂和受体臂，其中所述T臂包含与延伸因子1α蛋白质相互作用的核苷酸。在某些实施方案中，本发明提供了修饰的转移RNA（tRNA），其包含T臂、D臂、反密码子臂和受体臂，（a）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'‑UCA‑3'并且识别TGA终止密码子，并且其中所述受体臂与精氨酸、色氨酸或甘氨酸可操作地连接；（b）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'‑UUA‑3'并且识别TAA终止密码子，并且其中所述受体臂与谷氨酰胺或谷氨酸可操作地连接；或（c）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'‑CUA‑3'并且识别TAG终止密码子，并且其中所述受体臂与色氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺可操作地连接。

Description

使用ACE-tRNA经由遗传重分配拯救终止密码子的方法

发明优先权

本申请要求于2017年11月2日提交的美国临时申请号62/580,887、以及于2018年6月19日提交的美国临时申请号62/687,015的优先权。上文提及的申请的全部内容在此引入本文作为参考。

关于联邦资助研究的声明

本发明在通过美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的R01GM106569下由政府支持完成。政府拥有本发明的某些权利。

背景

DNA分子以构成DNA聚合物的核苷酸碱基序列的形式携带遗传信息。DNA中仅利用四种核苷酸碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。以三个连续碱基的密码子形式的这种信息被转录成信使RNA（mRNA），然后通过转移RNA（tRNA）和核糖体进行翻译，以形成蛋白质。RNA中利用四种核苷酸碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。遗传密码是三联体密码子与特定氨基酸之间的关系。64种可能的密码子三联体形成遗传密码，其中三种终止（stop）（也称为终止（terminating））密码子对翻译机器（细胞核糖体）提供信号，以在特定密码子处终止蛋白质生产。密码中的其它61种三联体对应于20种标准氨基酸之一。参见图1。

DNA由核糖体翻译，根据DNA专门提供的遗传指令，使每个氨基酸一个一个地连接在一起形成多肽。当核糖体到达终止密码子时，蛋白质的延伸终止。三种终止密码子是UAG（琥珀）、UAA（赭石）和UGA（蛋白石）。将编码氨基酸的密码子改变为终止密码子的突变称为“无义突变”。这些无义突变可以导致多肽序列的显著截短/缩短，并且可以引起遗传表型中的深刻改变。因此，即使可能存在基因指导表达，也可能不产生关键蛋白质，因为当核糖体到达突变型终止信号时，它终止翻译，导致未完成的蛋白质。

转移RNA在核糖体上将mRNA翻译成蛋白质。每个tRNA都含有与mRNA上的互补密码子杂交的“反密码子”区域。携带其指定氨基酸的tRNA被称为“装载的”tRNA。如果tRNA是61种氨基酸相关的（即，不是终止信号相关的）tRNA之一，则它通常将其氨基酸附着至生长的肽。tRNA的结构基因长约72-90个核苷酸，并且折叠成三叶草结构。tRNA由RNA聚合酶III转录，并且含有其自身的基因内分裂启动子，其成为成熟tRNA编码序列的一部分（Sharp S.J.，Schaack J.，Coolen L.，Burke D. J.和Soll D.，"Structure and transcription ofeukaryotic tRNA genes"，Crit. Rev. Biochem，19：107-144（1985）；Geiduschek E. O.和Tocchini-Valentini，"Transcription by RNA polymerase III，Annu. Rev. Biochem.57：873-914（1988））。

“无义抑制基因”是含有改变的反密码子的tRNA基因的等位基因，使得代替触发“终止”信号，它们响应终止密码子而插入氨基酸。例如，赭石突变导致在mRNA中产生UAA密码子。赭石抑制基因产生具有AUU反密码子的tRNA，所述AUU反密码子在UAA位点处插入氨基酸，其允许mRNA的继续翻译，尽管通常触发翻译终止的密码子的存在。

在原核生物和真核生物如酵母和秀丽隐杆线虫（C. elegans）中已鉴定了许多无义抑制基因tRNA等位基因。不同的抑制基因tRNA在其抑制效率方面不同。在大肠杆菌（E. coli）和其它系统中，琥珀抑制基因相对更有效，赭石抑制基因较不有效，而蛋白石是最少效率的，这提示琥珀密码子很少用于终止蛋白质合成，而赭石密码子和蛋白石密码子更频繁地用作天然终止信号。

DNA蓝图中不希望有的错误可以引起疾病。例如，在蛋白质的中间而不是在蓝图结束时出现意外的“终止”信号，导致产生截短的或缩短的蛋白质，所述蛋白质具有改变的功能或完全没有功能。许多人类疾病，例如囊性纤维化、肌营养不良、β地中海贫血和利德尔氏综合征，起因于DNA读码框中对于蛋白质不希望有的终止信号，所述蛋白质分别对于适当的肺、血液、肌肉或肾功能是重要的。

因此，需要提供与相应的未修饰的无义抑制基因tRNA相比，稳定的新型修饰的无义抑制基因tRNA，以及具有增强的活性以抑制与囊性纤维化相关的基因的终止的无义抑制基因tRNA。

概述

在某些实施方案中，本发明提供了修饰的转移RNA（tRNA），其包含T臂、D臂、反密码子臂和受体臂，其中所述T臂包含具有与延伸因子1-α1（EF1α）相互作用的核苷酸的T茎。EF1α将氨酰tRNA召募至核糖体，并且保护tRNA免于脱酰。合理的核苷酸替换导致调谐的tRNA:EF1α相互作用，其增强tRNA递送至核糖体以及免于脱酰的保护。

在某些实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55的修饰的转移RNA（tRNA），其中胸苷被替换为尿嘧啶。

在某些实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：1-538中的任何一种的修饰的转移RNA（tRNA），其中胸苷被替换为尿嘧啶。

在某些实施方案中，修饰的tRNA是SEQ ID NO：56-60、62-66、84-86、90-111、113、128-143、147-149、153-156、161-174、176、178、181、184-186、192、196-197、199-201、205、213-240、246、255-256、258-285、299、305-312、314、318-332、335-344、346、350-354、357-360、362、365-370、372-383、388-390、392、394-401、403-407、414-416、418、422、425、428-433、437、444-445、452、455、459-463、470、472-474、476、487-492、525、530-539、545-550、553-555、561-563和567-579中的任何一种，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

在某些实施方案中，本发明提供了修饰的转移RNA（tRNA），其包含T茎、D茎、反密码子环和受体茎，其中（a）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'-UCA-3'并且识别TGA终止密码子，并且其中所述受体臂与精氨酸、色氨酸或甘氨酸可操作地连接；（b）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'-UUA-3'并且识别TAA终止密码子，并且其中所述受体臂与谷氨酰胺或谷氨酸可操作地连接；或（c）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'-CUA-3'并且识别TAG终止密码子，并且其中所述受体臂与色氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺可操作地连接。在某些实施方案中，T臂包含合理地改变的核苷酸序列，其调谐与EF1α的相互作用，增强其抑制活性，并从而增加其治疗潜力。与EF1α具有调谐的相互作用的tRNA具有增强的无义抑制作用，并且提供增强的治疗特性。

在某些实施方案中，本发明提供了编码如上所述的修饰的tRNA的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸具有小于150个核苷酸的总长度。在某些实施方案中，寡核苷酸是DNA。

在某些实施方案中，本发明提供了包含第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列的寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列独立地编码如上所述的修饰的tRNA，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸独立地具有小于150个核苷酸的总长度，并且其中两个序列是串联的。

在某些实施方案中，本发明提供了表达盒，其包含启动子和编码修饰的tRNA的核酸或如上所述的寡核苷酸。

在某些实施方案中，本发明提供了包含上述寡核苷酸或表达盒的载体。

在某些实施方案中，载体是病毒载体或质粒载体。

在某些实施方案中，本发明提供了组合物，其包含上述修饰的tRNA、寡核苷酸或载体，以及药学上可接受的载剂。

在某些实施方案中，载剂是脂质体。

在某些实施方案中，本发明提供了包含上述载体的细胞。

本发明提供了治疗终止密码子相关的遗传疾病的方法，其包括将上述修饰的tRNA组合物施用于有此需要的患者。

在某些实施方案中，与提前终止密码子相关的遗传疾病是囊性纤维化、肌营养不良、β地中海贫血或利德尔氏综合症。

在某些实施方案中，本发明提供了在细胞中恢复对包括无义突变的核苷酸序列的翻译的方法，其包括将上述组合物引入细胞中。

在某些实施方案中，本发明提供了通过使用萤光素酶包括NanoLuc中的无义密码子抑制的高通量克隆和筛选，来鉴定反密码子编辑（ACE）tRNA的方法。

附图简述

图1. 遗传密码表。

图2. tRNA具有一般的四臂结构，其包含T臂、D臂、反密码子臂和受体臂。这些臂在全文中也称为“环”。

图3. 用于无义抑制的ACE-tRNA（智人（H. sapiens）tRNA^Trp _TGA ）。

图4. 在用于鉴定功能性ACE tRNA序列的载体中编码的反密码子编辑（ACE）-tRNA。这个载体序列包括Nanoluciferase报告系统。所描绘的载体用于鉴定具有TGA抑制作用的ACE tRNA。TAA和TAG变体用于适当的tRNA筛选（参见图14到17）。

图5. 经由抑制基因tRNA，用终止密码子拯救蛋白质和离子通道的示意图。

图6A和6B. 用人ACE-tRNA的无义密码子拯救。图6A. 反密码子编辑（ACE）TrptRNA和cherry-TGA-eGFP-HA构建体的示意图。图6B. 通过ACE色氨酸tRNA #4的cherry TGAeGFP-HA构建体拯救。

图7. 在人类疾病中观察到的无义密码子原理和普遍性。二十种天然氨基酸密码子按其对人类疾病的贡献进行排序，其中深色交叉阴影线密码子是最普遍的（TGG、TAC、TAT、TCA和TTA），而点状密码子是最不普遍的。所有交叉阴影线的密码子序列都需要单个核苷酸突变，以从预期的氨基酸转换为终止密码子。右图，囊性纤维化跨膜传导调节物（CFTR）内最常见的致病性无义密码子。在本文中，已发现了用于修复所示突变的新型tRNA序列。

图8. 用于修复色氨酸-TGA和甘氨酸-TGA的tRNA序列的鉴定。左轴指示了超过萤光素酶活性的背景的倍数。具有突变型反密码子环的大多数tRNA缺乏拯救活性。

图9. 使用Trpchr17.trna39和Glychr19.trna2 ACE-tRNA的CFTR 1282x拯救。与指示的tRNA一起在HEK细胞中共表达的CFTR W1282X通道的生物化学蛋白质印迹数据。含有指示的tRNA的四个拷贝的表达载体展示CFTR蛋白的更高拯救。“C”条带指示了完全成熟的糖基化CFTR蛋白的拯救。使用的抗体是以1：1000稀释度的来自Cystic FibrosisTherapeutics的M3A7。

图10A和10B. ACE-tRNA_Trp和ACE-tRNA_Gly的表达导致同源氨基酸特异性掺入无义密码子内。图10A）模型蛋白质组氨醇脱氢酶（HDH）-His-Strep N94-TGA以及ACE-tRNA_Trp（左）和ACE-tRNA_Gly（右）的共表达，导致在亲和纯化后可通过银染色检测到的全长HDH蛋白质（星号）。图10B）WT HDH（上）、HDH-N94 + ACE-tRNA_Gly（中）和HDH-N94 + ACE-tRNA_Trp（下）的光谱。光谱突出显示了在位置N94处的氨基酸质量差异，其与甘氨酸（-57Da）和色氨酸（+72Da）特异性匹配，指示了ACE-tRNA同源氨基酸的插入。

图11. 用于构建tRNA文库的克隆工作流。

图12A-12B. t茎区内的核苷酸的靶向突变进一步增强了ACE-tRNA的拯救功能。图12A. Trpchr17.tRNA 39在t茎区内进行系统诱变。这些工作鉴定了ACE tRNA TS-10 52-62G-C（图12B）和图中的交叉阴影线条，其展示~250%增加的生物活性。

图13A-13F. ACE-tRNA对于无义密码子是选择性的，并且比氨基糖苷无义抑制更有效。图13A）ACE-tRNA_Trp#5和图13B）ACE-tRNA_Gly#16被克隆到含有TGA、TAA或TAG无义密码子的NanoLuc报告质粒内。在转染后，仅在NanoLuc-TGA构建体中测量到无义抑制。图13C和图13D）通过添加庆大霉素（40uM）和G418（150uM），以及与ACE-tRNA_Trp#5和ACE-tRNA_Gly#16的共转染的NanoLuc-TGA抑制，在HEK293细胞中在图13C）24小时和图13D）48小时进行测量。图13E和图13F）稳定表达NanoLuc-TGA的HEK293细胞用庆大霉素（40uM）和G418（150uM）进行处理，并且用ACE-tRNA_Trp#5和ACE-tRNA_Gly#16进行转染。在处理后图13E）24小时和图13F）48小时测量无义抑制。

图14. ACE-tRNA-Arg-TGA。用于修复精氨酸-TGA无义密码子的ACE-tRNA的鉴定。

图15. ACE-tRNA-Gln TAG。用于修复谷氨酰胺TAG无义密码子的ACE-tRNA的鉴定。

图16. ACE-tRNA-Gln TAA。用于修复谷氨酰胺TAA无义密码子的ACE-tRNA的鉴定。

图17. ACE-tRNA-Glu TAG。用于修复谷氨酸-TAG无义密码子的ACE-tRNA的鉴定。

图18. ACE-tRNA-Gln TAA。用于修复谷氨酸TAA无义密码子的ACE-tRNA的鉴定。

图19. ACE-tRNA-Trp TAG。用于修复色氨酸TAG无义密码子的ACE tRNA的鉴定。

图20A - 20D. ACE-tRNA作为小RNA的递送支持G542X和W1282X无义突变的稳固抑制。图20A）具有G542X或W1282X引起囊性纤维化的无义突变的CFTR cRNA分别与预折叠的ACE-tRNAGly和ACE-tRNATrp的系列稀释物一起在爪蟾卵母细胞中共注射。在36小时后执行CFTR Cl-电流的双电极电压钳记录。电流-电压关系示出了增加量的图20B）ACE-tRNATrp和图20C）ACE-tRNAGly预折叠的RNA导致在ACE-tRNAGly实验中实现的用WT CFTR增加的CFTR功能（测量的CFTR Cl-电流）。图20D）G542X ACE-tRNAGly（实心圆圈）和W1282X ACE-tRNATrp（空心正方形）拯救的剂量应答（在+40mV下引发的CFTR Cl-电流针对在+40mV下的WT CFTR Cl-电流进行标准化）。ACE-tRNAGly的剂量依赖性（EC50= ~20ng；希尔系数~1.4）显示了在WT CFTR水平上的明确饱和，而ACE-tRNATrp是右移的（EC50= ~94ng；Hill系数1.24）。

图21A-21B. 无义突变抑制筛选，以鉴定候选反密码子编辑tRNA（ACE-tRNA）。图21A，示意图示出了ACE-tRNA与翻译机器的必要相互作用。在递送之后，ACE-tRNA被内源性氨酰tRNA合成酶识别，并且装载有（氨酰化）其同源氨基酸。氨酰化ACE-tRNA被内源性延伸因子1-α识别，所述延伸因子1-α保护ACE-tRNA免于脱酰，并且将氨酰ACE-tRNA递送至核糖体，用于抑制提前终止密码子，在这种情况下为UGA。图21B，使用与CcdB阴性选择配对的Golden Gate，将各个ACE-tRNA克隆到高通量克隆无义报告质粒内。多合一质粒含有NLuc萤光素酶报告基因，伴随在酶促大比特（bit）和必需的C末端小比特之间的p.162处的UGA、UAG或UAA PTC。

图22用高通量克隆无义突变报告平台筛选ACE-tRNA基因家族。对于每个ACE-tRNA家族，测试了指示的反密码子编辑PTC序列，所述家族与内源性反密码子序列相距一个核苷酸，图25。对于每个类别鉴定了多重高性能抑制基因tRNA。数据根据标准化的NLuc发光以Log10标度显示。每个tRNA数据集一式三份获得，并且以SEM展示，具有在表2中的相应ANOVA统计分析。编码的标识和相应的tRNA序列分别显示于图26和表9中。

图23A-23C通过改造的tRNA的同源编码和高保真抑制。图23A，组氨醇脱氢酶（HDH）的胰蛋白酶片段，其中“X”指示了抑制的PTC密码子。关于WT（上）、N94G（中）和N94W（下）HDH，胰蛋白酶片段的MS/MS谱，具有指示的y和b离子的质量。b9离子质量与WT天冬酰胺平移了-57 Da和+72 Da的预测质量，指示了分别通过ACE-tRNA^Gly和ACE-tRNA^Trp编码同源氨基酸甘氨酸和色氨酸。图23B，ACE-TGA - tRNA^Gly（Glychr19.t2）在瞬时转染的HEK293细胞中选择性地抑制UGA终止密码子。图23C）在稳定表达NLuc-UGA的Hek293细胞中的48小时温育之后，ACE-tRNA^Gly转染优于庆大霉素（40uM）和G418（140uM）两者。

图24A-24B. 在全转录组3’UTR上ACE-tRNA的核糖体概况分析。图24A，如材料和方法中所述，将3’UTR上的核糖体足迹密度绘制为相对于对照（puc57GG空载体）的处理细胞读数的log2倍数变化。转录物按其内源性TAA、TAG和TGA终止密码子分组。每个点代表关于转录物的两次重复的平均值。误差条显示了log2倍数变化的平均值±SD。图24B，对于转录组（18,101个序列）的终止密码子周围-50至+50 nt的每个核苷酸，绘制了标准化的核糖体足迹占有率的平均log2倍数变化。该草图示出了从核糖体印迹的5'端到核糖体A位点中的终止密码子的第一个碱基位置的~15 nt偏移。

图25. 关于常见PTC的密码子使用。交叉阴影线指示了最常见的密码子和相应的氨基酸类型，其可以经由核苷酸取代转换为终止密码子。已对于每种类型开发了改造的tRNA。

图26. 编号参考的ACE-tRNA活性图。

图27. 甘氨酸tRNA序列的比对。21种tRNAGly人序列证实了在tRNA进化枝中的高序列同源性。tRNA图像中的图案对应于序列中的图案框。

图28. 在Nanoluciferase中的p.162处的侧链身份不影响活性。对于在位点处的每个突变指示了总发光活性。

图29A-29C. 来自多重物种的ACE-tRNA^Trp序列和抑制基因tRNA突变的分析。图29A-29B. 序列比对。图29C. NLuc-UGA + ACE-tRNA^Trp/NLuc-UGA。

图30A-30C. 组氨醇脱氢酶（HDH）His（8）-streptactin表达构建体允许有效一步分离来自HEK293细胞的蛋白质。图30A）HDH表达构建体的蛋白质序列。加下划线的序列指示了通过质谱法的覆盖率。粗体、加下划线的天冬酰胺（氨基酸位置94）是突变为TGA PTC的残基，用于测定ACE-tRNA保真性。双重亲和力标签以粗斜体指示。在用图30B）Trpchr17.trna39和图30C）Glychr19.trna2的PTC抑制之后，HDH蛋白的银染色。

图31. 终止密码子特异性对于ACE-tRNA^Trp得到维持。对于tRNA Trp^TGA Trpchr17.trna39（表现最佳的Trp^TGA抑制基因tRNA）的抑制活性36，图22。这种tRNA与指示的pNano-STOP质粒共表达。

图32A-32D. ACE-tRNA比氨基糖苷PTC抑制更有效。在稳定表达PTC报告物Nluc-UGA的HEK293细胞中，在添加庆大霉素（40uM）、G418（150uM），并且用Trpchr17.trna39和Glychr19.trna2转染之后24小时测量的图32A）原始发光和图32B）标准化发光。在HEK293细胞中添加庆大霉素（40uM）、G418（150uM），并且用Trpchr17.trna39和Glychr19.trna2共转染之后24小时测量的图32C）原始发光和图32D）标准化发光。

图33. 在作为RNA或cDNA递送之后，ACE-tRNA活性的时间过程的比较。ACE-tRNA被递送至稳定表达pNanoLuc-UGA的HEK293细胞，然而，仅将5µl反应混合物加入细胞中，以降低转染试剂对细胞生存力的作用。作为RNA（空心符号）递送的ACE-tRNA在拯救PTC报告物的表达方面比cDNA构建体（实心圆圈）更快速。然而，当由cDNA表达时，ACE-tRNA活性在48小时内持续升高，并且随着可递送的RNA而减少。

发明详述

多年来，研究人员已鉴定了数百种独特的点突变，其导致在人基因中建立的无义密码子。这些类型的突变导致例如肌营养不良、着色性干皮病、囊性纤维化、血友病、贫血、甲状腺功能减退、p53鳞状细胞癌、p53肝细胞癌、p53卵巢癌、食道癌、骨癌、卵巢癌、食道癌、肝细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、纤维组织细胞瘤、卵巢癌、SRY性逆转、磷酸丙糖异构酶贫血、糖尿病和佝偻病。与乳腺癌相关的BRACA-1和BRACA-2基因也具有相似的突变。

编码数百种人tRNA的核苷酸序列是已知的，并且对于本领域技术人员一般可通过来源如Genbank获得。tRNA的结构是高度保守的，并且tRNA经常跨越物种是有功能的。因此，细菌或其它真核tRNA序列也是用于本发明的稳定化tRNA的寡核苷酸的潜在来源。特定tRNA序列在所需哺乳动物细胞中是否有功能的测定可以通过例行实验来确定。可以如本文所述修饰仍未知的进一步的另外的潜在tRNA序列，以便通过例行实验得到稳定。

tRNA基因具有在所有细胞类型中都有活性的强启动子。关于真核tRNA基因的启动子包含在编码tRNA分子本身的结构序列内。尽管在5'上游区内存在调控转录活性的元件，但活性转录单位的长度可以显著小于500个碱基对，并且因此在递送载体内的适应是直接的。一旦它们已被转录且加工，tRNA就具有低降解率。最后，用无义抑制基因的基因疗法维持对含有无义密码子的靶基因的内源性生理控制。

无义突变

转移RNA（tRNA）是在将信使RNA（mRNA）序列解码成蛋白质中起作用的一类RNA分子。tRNA在翻译过程中在核糖体的特定位点处起作用，所述翻译从mRNA分子合成蛋白质。无义突变也称为提前终止密码子（PTC），占引起人类疾病的单碱基对突变的~10-15%，而囊性纤维化随之而来。（Peltz等人，Annu Rev Med.，64：407-25，2013）。一般而言，由于基因表达和活性的几乎完全丧失，以及具有截短产物的显性负效应的可能性，无义突变具有比错义突变更严重的后果。PTC通过无义介导的降解（NMD）途径，导致提前的翻译终止和加速的mRNA转录物降解。

目前的研究显示可以通过tRNA内的反密码子序列的分子编辑，来改变tRNA递送其氨基酸至的RNA转录物内的特异性位点。这种方法允许提前终止密码子（PTC）有效地且在治疗上回复成最初丢失的氨基酸。反密码子编辑tRNA（ACE-tRNA）构成了一类新的生物治疗剂。

改造的tRNA允许致病性无义密码子“重新编辑”为特异性氨基酸。这些改造的tRNA仅靶向一种类型的终止密码子，例如TGA超过TAC或TAA。这些tRNA分子的小尺寸使得其可顺应容易表达，因为tRNA +启动子仅为~300 bp。简言之，合成了包含在人细胞中有功能的tRNA基因的结构组分的寡核苷酸。这种寡核苷酸的序列基于已知序列进行设计，伴随在tRNA的反密码子区中进行的取代，引起特异性tRNA识别无义突变或其它特异性突变。

已执行了几次小分子筛选，以通过与核糖体的相互作用抑制无义终止密码子，最突出的分子是G418、庆大霉素和PTC124。作为用于囊性纤维化治疗剂的用途，PTC124或阿他卢仑最近已从3期临床试验中撤消。阿他卢仑和氨基糖苷通过输入将无义突变转变成错义突变的接近同源的氨基酸，促进了三个无义密码子各自的通读。（Roy等人，PNAS 2016 Nov1；113（44）：12508-12513）。

反密码子编辑tRNA（ACE-tRNA）

tRNA具有一般的四臂结构，其包含T臂、D臂、反密码子臂和受体臂（图2）。

T臂由“T茎”和“TΨC环”构成。在某些实施方案中，修饰T茎以增加tRNA的稳定性。在某些实施方案中，ACE-tRNA具有修饰的T茎，其相对于内源性T茎序列增加了生物学活性，以抑制终止位点。

在一个实施方案中，本发明包括包含稳定化tRNA的组合物，其可以以更高的有效性使用，以便治疗广泛多样的无义突变有关的疾病。表1-8中的下述序列被写为DNA，但作为RNA（转录的DNA），“T：胸苷”是“U：尿嘧啶”。因此，由下述序列转录的tRNA全都含有代替胸苷的尿嘧啶。

在某些实施方案中，tRNA具有下述序列（其中胸苷被替换为尿嘧啶）：

TS-36：

GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCAGAAGGtTGCGgGTTCAAATCcCGTCGGGGTCA（SEQ ID NO：1）

TS-37：

GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCAGAAGGtTaCGgGTTCAAATCcCGTCGGGGTCA（SEQ ID NO：2）

TS-38：

GGCCTCGTGGCGCAACGGTAGCGCGTCTGACTtCAGATCAGAAGGtTcCGgGTTCAAATCcCGgCGGGGTCA（SEQ ID NO：3）

在一个实施方案中，用于无义抑制的ACE-tRNA如图3中所描绘的（智人tRNA^Trp _TGA ）。

根据本发明，已设计了人UAA、UAG和UGA抑制基因tRNA。该筛选已鉴定了密码子编辑的tRNA，用于修复Trp-TGA、Trp-TAG、Arg-TGA、Gln-TAG、Gln-TA、Glu-TAG、Glu-TAA。tRNA为长度大约100个核苷酸，并且可以引入细胞中，以抑制野生型氨基酸应该存在的无义密码子突变。寡核苷酸可以直接引入接受者细胞中，或者可以串联连接以增加寡核苷酸的功效。

表达盒和载体

在某些实施方案中，ACT-tRNA由表达盒编码。在再一个实施方案中，可以通过载体的使用，使用标准的常规遗传改造技术，将本发明的抑制基因tRNA引入细胞中。由于tRNA编码序列的内部启动子序列，tRNA序列无需包括在分开的转录单元中，尽管可以提供一个转录单元。

在本发明的一个实施方案中，本发明的核苷酸表达系统被包括在适当的基因转移媒介物内，其随后被用于转导细胞以表达抑制基因tRNA。基因递送媒介物可以是本领域已知的任何递送媒介物，并且可以包括由受体和/或脂质介导的转染促进的裸露DNA，以及许多载体中的任一种。此类载体包括但不限于真核载体、原核载体（例如细菌载体）和病毒载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体（人和其它，包括猪科动物）、疱疹病毒载体、EB病毒载体、SV40病毒载体、痘病毒载体和假型病毒载体。

在某些实施方案中，ACT-tRNA（PTC）在载体中编码。图4。在某些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒或腺病毒载体。可以采用的逆转录病毒载体的实例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒，以及衍生自逆转录病毒的载体，所述逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。

逆转录病毒；逆转录病毒载体

术语“逆转录病毒”用于指在其复制周期过程中利用逆转录酶的RNA病毒。逆转录病毒基因组RNA通过逆转录酶转换成双链DNA。病毒的这种双链DNA形式能够整合到被感染细胞的染色体内；一旦整合，它就被称为“前病毒”。前病毒充当RNA聚合酶II的模板，并且指导RNA分子的表达，所述RNA分子编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶。在前病毒的每个端部处是称为“长末端重复”或“LTR”的结构。LTR含有众多调控信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号以及病毒基因组复制和整合所需的序列。在逆转录病毒科内存在几个属，包括池病毒A、肿瘤病毒A、肿瘤病毒B、肿瘤病毒C、肿瘤病毒D、慢病毒和泡沫病毒。一些逆转录病毒是致癌的（即，致瘤的），而其它的则不是。肿瘤病毒在易感物种中诱导肉瘤、白血病、淋巴瘤和乳癌。逆转录病毒感染广泛多样的物种，并且既可以水平传播，也可以垂直传播。它们被整合到宿主DNA内，并能够在细胞之间传递宿主DNA的序列。这已导致了逆转录病毒作为用于各种目的包括基因疗法的载体的开发。

逆转录病毒包括人泡沫病毒（HFV）和人免疫缺陷病毒（HIV）最近已受到许多关注，因为它们的靶细胞并不限于分裂细胞，而且它们有限的宿主细胞嗜性可以经由用水泡性口炎病毒G（VSV-G）包膜糖蛋白的假型化而容易地扩展（参见例如，J. C. Burns等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90：8033-8037 [1993]；A. M. L. Lever，Gene Therapy. 3：470-471 [1996]；以及D. Russell和A. D. Miller，J. Virol.，70：217-222 [1996]）。

载体系统一般具有DNA载体和包装细胞系，所述DNA载体含有逆转录病毒序列的一小部分（病毒长末端重复或"LTR"和包装或"psi"信号）。将待转移的基因插入DNA载体内。DNA载体上存在的病毒序列提供了对于将载体RNA插入或包装到病毒颗粒内、以及所插入基因的表达所需的信号。包装细胞系提供了颗粒装配所需的病毒蛋白（D. Markowitz等人，J.Virol.，62：1120 [1988]）。在本发明的一个实施方案中，使用了在293T细胞中采用三质粒转染生产方法的FIV系统（Johnston等人，J Virol. 1999 73：4991-5000）。已成功产生了无复制能力的病毒。

通过各种技术（例如，磷酸钙共沉淀、脂质转染、电穿孔）中的任一种，将载体DNA引入包装细胞内。由包装细胞产生的病毒蛋白介导以RNA形式的载体序列插入病毒颗粒内，所述病毒颗粒然后脱落到培养上清液内。

对于天然分裂或受生长因子刺激以分裂的细胞，简单的逆转录病毒如鼠白血病病毒（MLV）载体是合适的递送系统。然而，在基因转移中使用许多常用逆转录病毒载体的主要局限性是许多载体限于分裂细胞。如果非分裂细胞是靶细胞，则可以使用能够感染非分裂细胞的慢病毒。

如本文使用的，术语“慢病毒”指引起缓慢发展的疾病的逆转录病毒组（或属）。包括在这个组内的病毒包括HIV（人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型），人获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的病原体；维斯那-梅迪（visna-maedi），其在绵羊中引起脑炎（维斯那）或肺炎（梅迪）；山羊关节炎-脑炎病毒，其在山羊中引起免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒，其在马中引起自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒（FIV），其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒（BIV），其在牛中引起淋巴结病、淋巴细胞增多以及可能的中枢神经系统感染；以及猿猴免疫缺陷病毒（SIV），其在类人灵长类动物中引起免疫缺陷和脑病。由这些病毒引起的疾病的特征在于长潜伏期和迁延疗程。通常，病毒潜伏地感染单核细胞和巨噬细胞，它们从其传播到其它细胞。HIV、FIV和SIV也容易感染T淋巴细胞（即T细胞）。

慢病毒包括HIV、SIV、FIV和马传染性贫血病毒（EIAV），依赖于几种病毒调控基因加上简单的结构gag-pol-env基因（用于有效的细胞内复制）。因此，慢病毒使用比经典逆转录病毒更复杂的策略用于基因调控和病毒复制，其中包装信号显然遍布整个病毒基因组。这些另外的基因在慢病毒生命周期过程中展示一系列调控功能。例如，在HIV-1感染后，通过与LTR中的RNA靶（TAR）的相互作用，转录通过Tat的表达上调。然后，通过Rev的功能调控全长mRNA和剪接mRNA的表达，所述Rev与gag区和env区（RRE）中存在的RNA元件相互作用（S.Schwartz等人，J. Virol.，66：150-159 [1992]）。gag-pol和env mRNA的核输出取决于Rev功能。除这两种必需的调控基因之外，病毒基因组中还存在一系列辅助基因，包括vif、vpr、vpx、vpu和nef，并且其对有效病毒产生和感染性的作用已得到证实，尽管它们对于病毒复制不是绝对必需的（K.和F. Wong-Staal，Microbiol. Rev.，55：193-205（1991]；R. A.Subbramanian和E. A. Cohen，J. Virol. 68：6831-6835 [1994]；以及D. Trono，Cell 82：189-192 [1995]）。在美国专利号6,531,123中给出了示例性慢病毒HIV-1的结构的详细描述。

“来源”或“原始”逆转录病毒是假型化逆转录病毒由其衍生的野生型逆转录病毒，或在包装或转基因载体的构建过程中用作起点，用于制备载体的一种或多种遗传元件。遗传元件可以不加改变地采用，或者它可以进行突变（但不超过其中它与原始元件缺乏统计上显著的序列相似性的点）。载体可以具有多于一种来源逆转录病毒，而不同的来源逆转录病毒可以是例如MLV、FIV、HIV-1和HIV-2或HIV和SIV。术语“遗传元件”包括但不限于基因。

同源逆转录病毒是野生型逆转录病毒，所讨论的载体与之具有在核酸水平上的最大序列同一性百分比。通常，这将与来源逆转录病毒相同。然而，如果来源逆转录病毒是广泛突变的，则可设想该载体随后将更紧密地类似一些其它逆转录病毒。同源逆转录病毒不一定是用于构建的物理起点；可以选择直接合成遗传元件，尤其是突变元件，而不是首先获得原始元件，然后对其进行修饰。术语“同源”可以类似地应用于蛋白质、基因或遗传元件（例如，剪接供体位点或包装信号）。当提及同源蛋白时，序列同一性百分比在氨基酸水平上进行测定。

术语“同源”逆转录病毒在极端情况下可能难以解释，即，如果所有逆转录病毒遗传元件都已被替换为替代非慢病毒遗传元件。在这种情况下，先前提到的来源逆转录病毒株被任意地视为同源逆转录病毒。

如本文使用的，提及病毒或载体的术语“复制”并非指由于细胞繁殖导致前病毒DNA在染色体中的正常复制，也不指由于功能复制起点的存在导致质粒DNA的自主复制。相反，“复制”指完整的病毒生命周期的完成，其中含有病毒RNA的感染性病毒颗粒进入细胞，所述RNA被逆转录成DNA，所述DNA作为前病毒整合到宿主染色体内，受感染的细胞产生病毒粒子蛋白，并且将其与全长病毒基因组RNA一起组装成新的同等感染性颗粒。

术语“具有复制能力的”指野生型病毒或突变型病毒，其能够复制，使得病毒在受感染细胞中的复制导致感染性病毒粒子的产生，在感染另一个先前未感染的细胞后，所述感染性病毒粒子导致后面一种细胞同样地产生此类感染性病毒粒子。本发明考虑了复制缺陷型病毒的使用。

如本文使用的，术语“减毒病毒”指已进行修饰，使得它在预期受试者中的致病性基本上降低的任何病毒（例如，减毒慢病毒）。病毒可以被减毒至从临床观点来看它是非致病性的点，即，暴露于病毒的受试者相对于对照受试者并未显示出统计上显著增加的病理水平。

本发明考虑了修饰的逆转录病毒的制备和使用。在一些实施方案中，逆转录病毒是以下的突变型：鼠白血病病毒、人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、猫免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、维斯那-梅迪、山羊关节炎-脑炎病毒、马传染性贫血病毒和牛免疫缺陷病毒，或由多于一个逆转录病毒物种的一部分组成的病毒（例如，杂合体，由MLV、FIV、HIV-1和HIV-2、或HIV-1和/或SIV的一部分组成）。

参考病毒是其基因组用于描述突变型病毒的组分的病毒。例如，突变型病毒的特定遗传元件可以被说成通过各种取代、缺失或插入而不同于参考病毒的同源元件。突变型病毒实际上不一定衍生自参考病毒。

优选的参考FIV序列在Talbott等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 86：5743-7；Genbank登录号NC_001482中找到。在某些实施方案中，三质粒瞬时转染方法可以用于产生无复制能力的假型化逆转录病毒（例如FIV）。一般方法在Wang等人，J Clin Invest.1999 104：R55-62以及Johnston等人，J Virol. 1999 73：4991-5000中描述。

逆转录病毒载体系统

本发明考虑了逆转录病毒基因扩增和转移系统，其包含转基因载体、一种或多种相容性包装载体、包膜载体和合适的宿主细胞。使用的载体可以衍生自逆转录病毒（例如，慢病毒）。逆转录病毒载体允许（1）将包装载体和包膜载体转染到宿主细胞内，以形成产生基本上不含包装载体-RNA的病毒颗粒的包装细胞系，（2）将转基因载体转染到包装细胞系内，（3）通过包装细胞系，将转基因载体RNA包装到感染性病毒颗粒内，并且（4）将颗粒施用于靶细胞，使得此类细胞被转导并随后表达转基因。

颗粒在体内直接施用于受试者，或者将受试者的细胞取出，在体外用颗粒感染，并且返回到受试者的体内。

本发明的包装载体和转基因载体将生成无复制能力的病毒。选择用于掺入本发明的给定载体系统内的载体是这样的，使得如果没有包装载体或转基因载体的进一步突变，共转染的细胞不能通过单独的包装载体和转基因载体的同源重组而生成具有复制能力的病毒。在本系统中使用的包膜蛋白可以是逆转录病毒包膜，合成或嵌合包膜，或来自非逆转录病毒包膜病毒（例如杆状病毒）的包膜。

包装信号

如本文使用的，术语“包装信号”或“包装序列”指位于逆转录病毒基因组或载体内的序列，其是将病毒或载体RNA插入病毒衣壳或颗粒内所需的，或至少促进将病毒或载体RNA插入病毒衣壳或颗粒内。RNA中的包装信号将RNA鉴定为待包装到病毒粒子内的RNA。为了方便起见，术语“包装信号”也用于指被转录成功能性包装信号的载体DNA序列。某些包装信号可能是基因的部分，但以RNA的形式而不是作为编码蛋白的肽部分被识别。

包装载体和转基因载体之间的关键区别在于在包装载体中，主要包装信号是失活的，而在转基因载体中，主要包装信号是有功能的。理想地，在包装载体中，所有包装信号都是失活的，而在转基因载体中，所有包装信号都是有功能的。然而，相反的考虑，例如使病毒滴度达到最大或抑制同源重组，可能使此类构建体是较不期望的。

包装系统；包装载体；包装细胞系

包装系统是一个或多个载体，其以可表达的形式共同提供产生病毒粒子所需的所有遗传信息，所述病毒粒子可以衣壳化合适的RNA，将其从产生病毒粒子的细胞中转运出来，将其传递给靶细胞，并且在靶细胞中，促使RNA以这样的方式被逆转录并整合到宿主基因组内，使得掺入上述RNA内的转基因可以被表达。然而，包装系统必须基本上不能包装其本身。相反，它包装分开的转基因载体。

在本发明中，包装载体将提供gag和pol基因的功能等价物（"GP"载体）。env基因将由包膜载体提供。理论上，如果愿意在分开的载体上构建不同的gag和pol基因，并且将其与不同的可调控启动子可操作地连接（或一个与可调控启动子可操作地连接，而另一个与组成型启动子可操作地连接），使得它们的相对表达水平可以适当地进行调整，则三载体系统（"G"、"P"和"E"载体）是可能的。

包装细胞系是通过包装系统转染的合适宿主细胞，所述包装系统在可达到的条件下产生病毒颗粒。如本文使用的，术语“包装细胞系”通常用于指表达病毒结构蛋白（例如gag、pol和env），但不包含包装信号的细胞系。例如，细胞系已进行遗传改造，以在其基因组内的一个染色体位点上携带缺乏功能性psi⁺序列（指定为Δ-psi）的5'-LTR-gag-pol-3'-LTR片段、以及位于另一个染色体位点处也是Δ-psi的5'-LTR-env-3'-LTR片段。尽管这两个片段均组成型转录，但由于缺少psi⁺区域且产生的病毒RNA分子小于完全尺寸，因此形成空病毒颗粒。

如果通过单独的包装载体转染宿主细胞，则它基本上仅产生病毒颗粒，而没有全长包装载体。在一个实例中，由包装细胞产生的少于10%的病毒颗粒含有全长包装载体衍生的RNA。然而，由于包装载体缺乏功能性引物结合位点，即使这些颗粒感染新细胞，包装载体RNA也不逆转录回DNA，并且因此新细胞不产生病毒粒子。因此，包装载体本身是无复制能力的病毒。

在一些实施方案中，包装细胞和/或细胞系含有转基因载体。包装细胞系将转基因载体包装到感染性颗粒内。此类细胞系在本文中称为“转基因病毒粒子生产细胞系”。

考虑包装可以是可诱导的，以及不可诱导的。在可诱导的包装细胞和包装细胞系中，响应至少一种诱导剂产生逆转录病毒颗粒。在不可诱导的包装细胞系和包装细胞中，不需要诱导剂以便使逆转录病毒颗粒产生发生。

由于同源野生型基因组的至少一个包装信号的失活，包装载体必然不同于野生型、具有复制能力的逆转录病毒基因组。多于一个包装信号可能是失活的。在一个实例中，仅由包装载体提供的逆转录病毒基因是编码结构蛋白或必需的调控蛋白的那些。

转基因载体

转基因载体是表达载体，其带有可表达的非逆转录病毒目的基因，并且包括至少一个功能性逆转录病毒包装信号，使得在转基因载体转染到包装细胞系内之后，转基因载体被转录成RNA，并且这种RNA被包装到感染性病毒颗粒内。这些颗粒依次又感染靶细胞，其RNA被逆转录成DNA，并且DNA作为前病毒元件被掺入宿主细胞基因组内，从而将目的基因传递给靶细胞。

如本文使用的，术语“转导”指借助于感染而不是通过转染，使用病毒载体或逆转录病毒载体的基因递送。在某些实施方案中，逆转录病毒载体是转导的。因此，“转导的基因”是已经由逆转录病毒或载体感染和前病毒整合被引入细胞内的基因。在某些实施方案中，病毒载体（例如“转基因载体”）将基因转导到“靶细胞”或宿主细胞内。本发明涵盖适用于本发明中的转基因载体，其与任何目的基因（或用于指示基因的感染或表达的“标记物基因”或“报告基因”）连接。

如本文使用的，术语“长期转导”指能够在宿主细胞或靶细胞中保持转导的时间段长于用其它载体观察到的那些的载体。例如，本发明提供了逆转录病毒载体，其能够保持转导至少120天、至少一年、或受试者的寿命或必要的治疗时间过程。表达的持续时间是启动子和靶细胞类型选择，而不是载体的选择的函数。

术语“稳定转导”或“稳定转导的”指将外源DNA引入并整合到转导细胞的基因组内。术语“稳定转导子”指已将外源DNA稳定整合到基因组DNA内的细胞。

术语“瞬时转导”或“瞬时转导的”指将外源DNA引入细胞内，其中所述外源DNA未能整合到转导细胞的基因组内。外源DNA在转导的细胞核中持续存在几天。在此期间，外源DNA受到控制染色体中的内源基因表达的调控控制。术语“瞬时转导子”指已摄取外源DNA但未能整合该DNA的细胞。

在一些实施方案中，本发明的靶和/或宿主细胞是“非分裂”细胞。这些细胞包括通常不分裂的细胞，例如神经元细胞。然而，并不预期将本发明限制于非分裂细胞（包括但不限于肌肉细胞、白血细胞、脾细胞、肝细胞、眼细胞、上皮细胞）。

在一些实施方案中，载体和载体后代能够转导多个靶细胞，以便实现至少10⁵cfu/ml的载体滴度。感染复数（MOI）可以是至少一（即，每个细胞平均一次命中），甚至至少二。

表达盒和载体

本发明还提供了包含编码ACE-tRNA的序列的表达盒。

在某些实施方案中，表达盒进一步包含启动子。在某些实施方案中，启动子是可调控启动子。在某些实施方案中，启动子是组成型启动子。在某些实施方案中，启动子是PGK、CMV、RSV、H1或U6启动子（Pol II和Pol III启动子）。

本发明提供了含有上述表达盒的载体。在某些实施方案中，载体是病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体是基于腺病毒、慢病毒、腺相关病毒（AAV）、脊髓灰质炎病毒、HSV或鼠莫洛尼（Maloney）的病毒载体。

如本文使用的，“表达盒”意指能够指导特定核苷酸序列在适当的宿主细胞中表达的核酸序列，其可以包括与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可以与终止信号可操作地连接。它还可以包括核苷酸序列的正确翻译所需的序列。编码区通常编码目的蛋白质。包括目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的。表达盒也可以是天然存在的，但已以可用于异源表达的重组形式获得的那种。表达盒中核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子或可调控启动子的控制下，所述可调控启动子仅在宿主细胞暴露于某些特定刺激下才起始转录。在多细胞生物的情况下，启动子也可以对特定的组织或器官或发育阶段是特异性的。

“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的结合，使得序列之一的功能受到另一个的影响。例如，如果两个序列位于这样的位置，使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达（即，编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制下），则调控DNA序列被说成与编码RNA或多肽的DNA序列“可操作地连接”或“结合”。编码序列可以以有义或反义取向与调控序列可操作地连接。

腺相关病毒（AAV）

腺相关病毒（AAV）是细小病毒科的小型非致病性病毒。AAV与该家族其它成员的不同之处在于，它依赖于辅助病毒用于复制。在不存在辅助病毒的情况下，AAV可能以基因座特异性的方式整合到19号染色体的q臂内。AAV的大约5 kb基因组由正或负极性的单链DNA的一个区段组成。基因组的末端是短的反向末端重复，其可以折叠成发夹结构，并且充当病毒DNA复制的起点。物理上，细小病毒颗粒是无包膜的，并且其二十面体衣壳为直径大约20nm。

迄今为止，已鉴定出众多血清学上不同的AAV，并且已从人或灵长类动物中分离出十几种。AAV2的基因组为长度4680个核苷酸，并且含有两个开放读码框（ORF）。左ORF编码非结构性Rep蛋白，Rep 40、Rep 52、Rep 68和Rep 78，除单链子代基因组的产生之外，所述Rep蛋白还涉及复制和转录的调控。此外，两种Rep蛋白已与AAV基因组优先整合到人19号染色体q臂的区域内有关。Rep68/78还已显示具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。Rep蛋白具有核定位信号以及几个潜在的磷酸化位点。这些激酶位点之一的突变导致复制活性的丧失。

基因组的端部是短的反向末端重复（ITR），其具有折叠成T形发夹结构的潜力，所述T形发夹结构充当病毒DNA复制的起点。在ITR区域内，已描述了对ITR的功能至关重要的两种元件：GAGC重复基序和末端解链位点（trs）。当ITR处于线性或发夹构型时，重复基序已显示结合Rep。这种结合作用于将Rep68/78定位用于在trs处的切割，所述切割以位点和链特异性方式发生。除其在复制中的作用之外，这两种元件似乎对病毒整合至关重要。19号染色体整合基因座内包含的是具有相邻trs的Rep结合位点。这些元件已显示是功能性的，并且对于基因座特异性整合是必需的。

AAV病毒粒子是直径大约25 nm的无包膜的二十面体颗粒，由称为VP1、VP2和VP3的三种相关蛋白组成。右ORF编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。这些蛋白质分别以1：1：10的比率发现，并且全部衍生自右侧ORF。衣壳蛋白通过使用可变剪接和罕见的起始密码子而彼此不同。缺失分析已显示，从可变剪接的信息翻译的VP1的去除或改变导致感染性颗粒的产率降低。VP3编码区内的突变导致无法产生任何单链后代DNA或感染性颗粒。AAV颗粒是包含AAV衣壳蛋白的病毒颗粒。AAV衣壳多肽可以编码整个VP1、VP2和VP3多肽。颗粒可以是包含AAV2和其它AAV衣壳蛋白的颗粒（即，嵌合蛋白，例如AAV1和AAV2）。本文考虑了AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列中的变化，只要所得到的包含AAV2衣壳的病毒颗粒在抗原或免疫学上保持不同于AAV1，如可以通过标准方法常规测定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹可以用于测定病毒颗粒在抗原或免疫学上是否不同于AAV1。此外，AAV2病毒颗粒优选保留不同于AAV1的组织嗜性。

AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。编码整个VP1、VP2和VP3多肽的AAV2衣壳多肽总体上可以与具有由NC_001401（编码AAV2衣壳蛋白的核苷酸序列）中所示的核苷酸编码的氨基酸序列的多肽具有至少约63%的同源性（或同一性）。衣壳蛋白可以与由NC_001401中所示的核苷酸序列编码的蛋白质具有约70%同源性、约75%同源性、80%同源性、85%同源性、90%同源性、95%同源性、98%同源性、99%同源性或甚至100%同源性。衣壳蛋白可以与由NC_001401中所示的核苷酸序列编码的蛋白质具有约70%同一性、约75%同一性、80%同一性、85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性、99%同一性或甚至100%同一性。颗粒可以是包含另一种AAV和AAV2衣壳蛋白的颗粒，即嵌合蛋白。本文考虑了AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列中的变化，只要所得到的包含AAV2衣壳的病毒颗粒在抗原或免疫学上保持不同于AAV4，如可以通过标准方法常规测定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹可以用于测定病毒颗粒在抗原或免疫学上是否不同于AAV1。此外，AAV2病毒颗粒优选保留不同于AAV1的组织嗜性，例如在本文的实施例中例证的那种，尽管包含至少一种AAV2外壳蛋白的AAV2嵌合颗粒可以具有与仅由AAV2外壳蛋白组成的AAV2颗粒不同的组织嗜性。

在某些实施方案中，本发明进一步提供了AAV2颗粒，其包含即衣壳化包含一对AAV2反向末端重复的载体。AAV2 ITR的核苷酸序列是本领域已知的。此外，颗粒可以是包含AAV1和AAV2衣壳蛋白两者的颗粒，即嵌合蛋白。此外，颗粒可以是衣壳化包含来自其它AAV（例如，AAV1-AAV9和AAVrh10）的一对AAV反向末端重复的载体的颗粒。在颗粒中衣壳化的载体可以进一步包含插入在反向末端重复之间的外源核酸。

AAV的下述特点已使其成为有吸引力的用于基因转移的载体。AAV载体已显示在体外稳定整合到细胞基因组内；具有广泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂细胞和非分裂细胞两者，并且维持转导基因的高表达水平。病毒颗粒是热稳定的，对溶剂、去污剂、pH中的变化、温度具有抗性，并且可以在CsCl梯度上或通过其它手段浓缩。本发明提供了施用AAV颗粒、重组AAV载体和重组AAV病毒粒子的方法。例如，AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒，或AAV1颗粒是包含AAV1衣壳蛋白的病毒颗粒。重组AAV2载体是包含AAV2的至少一种独特核酸的核酸构建体。重组AAV2病毒粒子是含有重组AAV2载体的颗粒。为了在术语"AAV2ITR"内加以考虑，核苷酸序列必须保留本文所述的区别AAV2 ITR与AAV1 ITR的一个或两个特点：（1）三个（而不是AAV1中的四个）"GAGC"重复，以及（2）在AAV2 ITR Rep结合位点中，前两个"GAGC"重复中的第四个核苷酸是C而不是T。

驱动编码待递送的tRNA的序列表达的启动子可以是任何所需的启动子，其通过已知的考虑加以选择，例如与启动子功能性连接的核酸的表达水平和载体待在其中使用的细胞类型。启动子可以是外源启动子或内源启动子。启动子可以包括例如已知的强启动子例如SV40，或诱导型金属硫蛋白启动子，或AAV启动子例如AAV p5启动子。启动子的另外实例包括衍生自以下的启动子：肌动蛋白基因、免疫球蛋白基因、巨细胞病毒（CMV）、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、腺病毒启动子例如腺病毒主要晚期启动子、诱导型热休克启动子、呼吸道合胞病毒、劳斯肉瘤病毒（RSV）等。另外的实例包括受调控的启动子。

AAV载体可以进一步包含与启动子功能性连接的外源（异源）核酸。“异源核酸”意指可以将任何异源或外源核酸插入载体内用于转移到细胞、组织或生物内。例如，核酸可以编码tRNA。如本领域已知的，“功能性连接”意指使得启动子可以促进异源核酸的表达，例如启动子相对于异源核酸的适当取向。此外，如本领域已知的，异源核酸优选具有用于核酸表达的所有适当序列，以在功能上编码，即允许核酸被表达。核酸可以包括例如表达控制序列，例如增强子。核酸可以编码多于一种基因产物，仅受可以包装的核酸大小限制。

AAV1颗粒是包含AAV1衣壳蛋白的病毒颗粒。本文考虑了AAV1衣壳蛋白的氨基酸序列中的变化，只要所得到的包含AAV1衣壳的病毒颗粒在抗原或免疫学上保持不同于其它AAV衣壳，如可以通过标准方法常规测定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹可以用于测定病毒颗粒在抗原或免疫学上是否不同于其它AAV血清型。

如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的聚合物，并且包括全长蛋白质及其片段。因此，“蛋白质”和“多肽”在本文中经常可互换使用。

本方法提供了将核酸递送至细胞的方法，其包括向细胞施用含有AAV颗粒的载体，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复之间的核酸，从而将核酸递送至细胞。可以通过任何手段完成向细胞的施用，包括简单地使任选地包含在所需液体例如组织培养基或缓冲盐水溶液中的颗粒与细胞接触。可以允许颗粒保持与细胞接触任何所需的时间长度，并且通常，施用颗粒并允许无限期地保持。对于此类体外方法，如本领域已知的和如本文例证的，可以通过标准病毒转导方法将病毒施用于细胞。施用的病毒滴度可以变化，特别取决于细胞类型，但一般而言是用于AAV转导的典型滴度。另外，可以利用本实施例中用于转导特定细胞的滴度。这些细胞可以包括人以及其它大型（非啮齿类）哺乳动物，例如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪和犬中的任何所需细胞。

本发明进一步提供了将核酸递送至受试者中的细胞的方法，其包括向受试者施用包含插入在一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒，从而将所述核酸递送至受试者中的细胞。

本公开内容的某些实施方案提供了包含如本文所述的病毒载体的细胞。

AAV载体

在一个实施方案中，本公开内容的病毒载体是AAV载体。"AAV"载体指腺相关病毒，并且可以用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。该术语涵盖了所有亚型、血清型和假型，以及天然存在的形式和重组形式两者，除非另有要求。如本文使用的，术语“血清型”指这样的AAV，其基于与限定抗血清的衣壳蛋白反应性进行鉴定并且区别于其它AAV，例如，存在八种已知的灵长类动物AAV的血清型，AAV-1至AAV- 9和AAVrh10。例如，血清型AAV2用于指这样的AAV，其含有由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白、以及含有来自相同AAV2血清型的5'和3' ITR序列的基因组。如本文使用的，例如，rAAV1可以用于指具有来自相同血清型的衣壳蛋白和5'-3' ITR两者的AAV，或者它可以指具有来自一种血清型的衣壳蛋白、以及来自不同AAV血清型的5'-3' ITR，例如来自AAV血清型2的衣壳和来自AAV血清型5的ITR的AAV。对于本文所示的每个实例，载体设计和生产的描述描述了衣壳和5'-3' ITR序列的血清型。缩写"rAAV"指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体（或“rAAV载体”）。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白（优选野生型AAV的所有衣壳蛋白）和衣壳化的多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸（即，除野生型AAV基因组外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因），则它通常称为"rAAV"。

在一个实施方案中，使用已知技术构建AAV表达载体，以在转录方向上至少提供控制元件，包括转录起始区、目的DNA和转录终止区，作为可操作连接的组分。控制元件选择为在哺乳动物细胞中是有功能的。所得到的含有可操作地连接的组分的构建体侧翼（5'和3'）为功能性AAV ITR序列。

“腺相关病毒反向末端重复”或"AAV ITR"意指在AAV基因组的每个端部处发现的领域公认的区域，其以顺式一起作为DNA复制起点和病毒的包装信号起作用。AAV ITR连同AAV rep编码区一起，提供了插入两个侧翼ITR之间的核苷酸序列的有效切除和拯救，以及整合到哺乳动物细胞基因组内。

AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。如本文使用的，"AAV ITR"无需具有所描绘的野生型核苷酸序列，而是可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变。另外，AAV ITR可以衍生自几种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，在AAV载体中侧接所选择的核苷酸序列的5'和3' ITR不一定是等同的或衍生自相同的AAV血清型或分离株，只要它们如预期的起作用，即允许目的序列从宿主细胞基因组或载体中的切除和拯救，并且当细胞中存在AAV Rep基因产物时，允许异源序列整合到接受者细胞基因组内。

在一个实施方案中，AAV ITR可以衍生自几种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，在AAV表达载体中侧接所选择的核苷酸序列的5'和3' ITR不一定是等同的或衍生自相同的AAV血清型或分离株，只要它们如预期的起作用，即允许目的序列从宿主细胞基因组或载体中的切除和拯救，并且当细胞中存在AAVRep基因产物时，允许DNA分子整合到接受者细胞基因组内。

在一个实施方案中，AAV衣壳可以衍生自AAV2。用于AAV载体中的合适DNA分子在大小上小于约5千碱基（kb）、小于约4.5 kb、小于约4 kb、小于约3.5 kb、小于约3 kb、小于约2.5 kb，并且是本领域已知的。

在一个实施方案中，选择的核苷酸序列与控制元件可操作地连接，所述控制元件指导其在受试者体内的转录或表达。此类控制元件可以包含通常与所选基因相关的控制序列。可替代地，可以采用异源控制序列。有用的异源控制序列一般包括衍生自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子（Ad MLP）；单纯疱疹病毒（HSV）启动子，巨细胞病毒（CMV）启动子例如CMV立即早期启动子区域（CMVIE），劳斯肉瘤病毒（RSV）启动子，pol II启动子，pol III启动子，合成启动子，杂合启动子等等。另外，衍生自非病毒基因，例如鼠金属硫蛋白基因的序列也可在本文中使用。此类启动子序列从例如Stratagene（San Diego，Calif.）商购可得。

在一个实施方案中，异源启动子和其它控制元件，例如组织特异性和诱导型启动子、增强子等等，具有特定用途。异源启动子的实例包括CMV启动子。诱导型启动子的实例包括关于蜕皮激素、四环素、缺氧和aufin的DNA应答元件。

在一个实施方案中，可以通过将选择的序列直接插入AAV基因组内，来构建具有由AAV ITR结合的目的DNA分子的AAV表达载体，所述AAV基因组已具有从其中切除的主要AAV开放读码框（“ORF”）。AAV基因组的其它部分也可以被缺失，只要保留足够的ITR部分以允许复制和包装功能。可以使用本领域众所周知的技术来设计此类构建体。

可替代地，可以使用标准连接技术，从病毒基因组或含有与另一种载体中存在的所选核酸构建体相同且融合的5'和3'的AAV载体中切除AAV ITR。例如，可以在20 mM Tris-Cl pH 7.5，10 mM MgCl2，10 mM DTT，33 µg/ml BSA，10 mM-50 mM NaCl中以及在0℃下的40 µM ATP，0.01-0.02（Weiss）单位的T4 DNA连接酶（用于“粘端”连接），或在14℃下的1 mMATP，0.3-0.6（Weiss）单位的T4 DNA连接酶（用于“平端”连接）中完成连接。分子间“粘端”连接通常以30-100 µg/ml的总DNA浓度（5-100 nM的总端部浓度）执行。AAV载体包含ITR。

另外，嵌合基因可以合成产生，以包括排列在一个或多个所选核酸序列的5'和3'的AAV ITR序列。完整的嵌合序列由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装。

为了产生rAAV病毒粒子，使用已知技术，例如通过转染，将AAV表达载体引入合适的宿主细胞内。许多转染技术是本领域一般已知的。参见例如，Sambrook等人（1989）Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，NewYork。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀，直接显微注射到培养细胞内，电穿孔，脂质体介导的基因转移，脂质介导的转导和使用高速微弹的核酸递送。

在一个实施方案中，用于产生rAAV病毒粒子的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以是或已用作异源DNA分子的接受者。该术语包括已转染的原始细胞的后代。因此，如本文使用的，“宿主细胞”一般指已用外源DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系293（可通过例如美国典型培养物保藏中心（American TypeCulture Collection）以登录号ATCC CRL1573容易获得）的细胞可以用于本公开内容的实践中。特别地，人细胞系293是人胚肾细胞系，其已用5型腺病毒DNA片段进行转化，并且表达腺病毒E1a和E1b基因。293细胞系是容易转染的，并且提供了其中产生rAAV病毒粒子的特别方便的平台。

“AAV rep编码区”意指领域公认的AAV基因组的区域，其编码复制蛋白Rep 78、Rep68、Rep 52和Rep 40。这些Rep表达产物已显示具有许多功能，包括AAV的DNA复制起点的识别、结合和切口，DNA解旋酶活性，以及来自AAV（或其它异源）启动子的转录调制。Rep表达产物对于复制AAV基因组是共同需要的。AAV rep编码区的合适同源物包括人疱疹病毒6（HHV-6）rep基因，其也已知介导AAV-2 DNA复制。

“AAV cap编码区”指领域公认的AAV基因组区域，其编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能同源物。这些Cap表达产物提供包装功能，其对于包装病毒基因组是共同需要的。

在一个实施方案中，通过在AAV表达载体转染之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞，将AAV辅助功能引入宿主细胞内。AAV辅助构建体因此用于提供AAV rep和/或cap基因的至少瞬时表达，以补充缺失的生产性AAV感染所必需的AAV功能。AAV辅助构建体缺少AAV ITR，本身既不能复制也不能包装。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已描述了许多AAV辅助构建体，例如编码Rep和Cap表达产物两者的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。已描述了编码Rep和/或Cap表达产物的许多其它载体。

病毒载体的递送方法包括将AAV注射到受试者内。一般地，可以使用体内或体外转导技术，将rAAV病毒粒子引入细胞内。如果在体外转导，则将所需接受者细胞从受试者中取出，用rAAV病毒粒子转导并重新引入受试者内。可替代地，可以使用同基因细胞或异种细胞，其中那些细胞不在受试者中生成不适当的免疫应答。

用于将转导的细胞递送和引入受试者内的合适方法已得到描述。例如，可以通过例如在适当的培养基中将重组AAV病毒粒子与细胞组合，在体外转导细胞，并且可以使用常规技术（例如DNA印迹和/或PCR）、或通过使用可选择标记物，来筛选具有目的DNA的那些细胞。然后可以将转导的细胞配制成在下文中更全面地描述的药物组合物，并且可以通过各种技术，例如通过移植、肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射，将组合物引入受试者内。

在一个实施方案中，药物组合物包含产生治疗有效量的目的核酸的足够遗传材料，即，足以降低或改善所讨论的疾病状态的症状的量、或足以赋予所需益处的量。药物组合物还含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括任何药物试剂，其本身不诱导对接受该组合物的个体有害的抗体产生，并且可以施用而无过度毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇，Tween80和液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。另外，在此类媒介物中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。药学上可接受的赋形剂的详尽讨论在Remington'sPharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co.，N.J. 1991）中可获得。

应当理解，多于一种转基因可以由递送的病毒载体表达。可替代地，各自表达一种或多种不同转基因的单独的载体，也可以如本文所述递送至受试者。此外，还预期将通过本公开内容的方法递送的病毒载体与其它合适的组合物和疗法组合。

如对于本领域技术人员显而易见，鉴于本说明书的教导，可以凭经验确定必须添加的病毒载体的有效量。施用可以以一个剂量、在治疗过程自始至终连续地或间断地实现。确定最有效的施用手段和剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并且将随病毒载体、疗法的组成、靶细胞和待治疗的受试者而变。单次施用和多次施用可以用通过治疗医生选择的剂量水平和模式进行。

在某些实施方案中，以约0.3-2 ml 1x105 -1x1016vg/ml的剂量施用rAAV。在某些实施方案中，以约1-3 ml 1x107 -1x1014vg/ml的剂量施用rAAV。在某些实施方案中，以约1-2 ml 1x108 -1x1013vg/ml的剂量施用rAAV。

含有rAAV颗粒的制剂将含有在媒介物中的有效量的rAAV颗粒，所述有效量由本领域技术人员容易地确定。rAAV颗粒通常范围可以为组合物的约1%至约95%（w/w），或者适当时甚至更高或更低。待施用的数量取决于因素，如考虑用于治疗的动物或人受试者的年龄、体重和身体状况。本领域普通技术人员可以通过建立剂量应答曲线的常规试验来确定有效剂量。通过以一个或多个剂量施用rAAV颗粒来治疗受试者。可以根据需要施用多个剂量，以维持足够的酶活性。

媒介物，包括水、水性盐水、人造CSF或其它已知物质，可以与本发明一起采用。为了制备制剂，可以分离、冻干且稳定纯化的组合物。然后可以将组合物调整至适当的浓度，任选地与抗炎剂组合，并且包装用于使用。

本发明提供了通过以足以增加细胞中的靶蛋白水平的量，将蛋白质或编码上述蛋白质的核酸分子引入细胞内，来增加细胞中的靶蛋白水平的方法。在某些实施方案中，靶蛋白的积累增加了至少10%。靶蛋白的积累增加了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。

编码治疗剂的核酸

术语“核酸”指以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，其由含有糖、磷酸酯和其为嘌呤或嘧啶的碱基的单体（核苷酸）组成。除非特别限制，否则该术语涵盖了含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。

“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。术语多核苷酸序列的“基本同一性”意指多核苷酸包含这样的序列，使用标准参数描述的比对程序之一，与参考序列相比，所述序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%，或至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，或至少90%、91%、92%、93%或94%，或甚至至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

用于将遗传材料引入细胞内的方法

通过遗传转移方法，例如转染或转导，在体内将外源遗传材料（例如，编码一种或多种治疗性ACE-tRNA的DNA）引入细胞内，以提供遗传修饰细胞。各种表达载体（即，用于促进外源遗传材料递送到靶细胞内的媒介物）是本领域普通技术人员已知的。

如本文使用的，“细胞的转染”指细胞通过掺入添加的DNA而获得新的遗传材料。因此，转染指使用物理或化学方法将核酸插入细胞内。几种转染技术是本领域普通技术人员已知的，其包括：磷酸钙DNA共沉淀；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；以及钨颗粒促进的微弹轰击。磷酸锶DNA共沉淀是另一种可能的转染方法。

相比之下，“细胞的转导”指使用DNA或RNA病毒，将核酸转移到细胞内的过程。用于将核酸转移到细胞内的RNA病毒（即，逆转录病毒）在本文中被称为转导嵌合逆转录病毒。逆转录病毒内包含的外源遗传材料被掺入到转导细胞的基因组内。已用嵌合DNA病毒（例如，携带编码治疗剂的cDNA的腺病毒）转导的细胞，不具有掺入其基因组内的外源遗传材料，但能够在细胞内表达染色体外保留的外源遗传材料。

通常，外源遗传材料包括异源基因（通常为包含编码治疗蛋白质的外显子的cDNA形式），连同控制新基因转录的启动子。启动子特有地具有启动转录所必需的特定核苷酸序列。任选地，外源遗传材料进一步包括获得所需基因转录活性所需要的另外序列（即，增强子）。为了本论述的目的，“增强子”简单地是任何非翻译DNA序列，其与编码序列（顺式）邻接工作，以改变由启动子决定的基础转录水平。外源遗传材料可以在启动子的紧下游引入细胞基因组内，使得启动子和编码序列可操作地连接，以便允许编码序列的转录。逆转录病毒表达载体可以包括外源启动子元件，以控制插入的外源基因的转录。此类外源启动子包括组成型启动子和诱导型启动子两者。

天然存在的组成型启动子控制基本细胞功能的表达。结果，在组成型启动子控制下的基因在所有细胞生长条件下表达。示例性组成型启动子包括关于编码某些组成性或“管家”功能的下述基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）、二氢叶酸还原酶（DHFR）、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶（PGK）、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子、以及本领域技术人员已知的其它组成型启动子。另外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地起作用。这些尤其包括SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒和其它逆转录病毒的长末端重复（LTR）；以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。因此，任何上文提及的组成型启动子都可以用于控制异源基因插入物的转录。

在诱导型启动子控制下的基因仅在诱导剂的存在下表达或表达至更高的程度（例如，在金属硫蛋白启动子控制下的转录在某些金属离子的存在下极大地增加）。诱导型启动子包括当其诱导因子结合时刺激转录的应答元件（RE）。例如，存在关于血清因子、类固醇激素、视黄酸和环状AMP的RE。可以选择含有特定RE的启动子，以便获得可诱导的应答，并且在某些情况下，RE本身可以附着至不同的启动子，从而对重组基因赋予诱导性。因此，通过选择适当的启动子（组成型相对于诱导型；强相对于弱），能够控制遗传修饰细胞中的治疗剂的存在和表达水平两者。如果编码治疗剂的基因在诱导型启动子的控制下，则通过将遗传修饰细胞原位暴露于允许治疗剂转录的条件，例如通过腹膜内注射诱导型启动子的特异性诱导剂（其控制治疗剂的转录），来触发治疗剂的原位递送。例如，通过使遗传修饰细胞与含有适当的（即诱导）金属离子的溶液原位接触，来增强由在金属硫蛋白启动子控制下的基因编码的治疗剂通过遗传修饰细胞的原位表达。

因此，原位递送的治疗剂的量通过控制此类因素进行调控，如：（1）用于指导插入基因的转录的启动子的性质，（即，启动子是组成型还是诱导型，强还是弱）；（2）插入细胞内的外源基因的拷贝数；（3）施用于（例如植入）患者的转导/转染细胞的数目；（4）植入物（例如移植物或封装的表达系统）的大小；（5）植入物的数目；（6）转导/转染的细胞或植入物留在原处的时间长度；以及（7）通过遗传修饰细胞的治疗剂的生产率。考虑到上文公开的因素和患者的临床概况，用于递送治疗有效剂量的特定治疗剂的这些因素的选择和优化，被视为在本领域普通技能的范围内，而无需过度实验。

除至少一种启动子和编码治疗剂的至少一种异源核酸之外，表达载体还可以包括选择基因，例如新霉素抗性基因，用于促进已用表达载体转染或转导的细胞的选择。可替代地，用两种或更多种表达载体转染细胞，至少一种载体含有编码治疗剂的基因，另一种载体含有选择基因。合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列（下文描述）的选择被视为在本领域普通技能的范围内，而无需过度实验。

疾病状况和治疗方法

在一个实施方案中，本发明包括通过引入本发明的合成寡核苷酸抑制基因tRNA，通过逆转存在的与无义突变相关的突变的效应，用于治疗囊性纤维化的组合物和方法。

本公开内容的某些实施方案提供了治疗哺乳动物的疾病的方法，其包括向哺乳动物施用如本文所述的蛋白质或编码治疗剂（例如，修饰和/或稳定的ACE-tRNA）的载体。在某些实施方案中，哺乳动物是人。

本公开内容的某些实施方案提供了如本文所述的治疗剂或编码治疗剂的载体制备药剂的用途，所述药剂可用于治疗哺乳动物中的疾病。在某些实施方案中，疾病是囊性纤维化。

本公开内容还提供了含有本文所述的载体的哺乳动物细胞。细胞可以是人的。

本公开内容的某些方面涉及多核苷酸、多肽、载体和基因工程细胞（体内修饰的）、以及其用途。特别地，本公开内容涉及用于基因治疗的方法，其能够全身递送治疗有效剂量的治疗剂。

根据一个方面，提供了用于在哺乳动物接受者中表达治疗剂的细胞表达系统。表达系统（在本文中也称为“遗传修饰细胞”）包含细胞和用于表达治疗剂的表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、以及用于将异源遗传材料递送至细胞的其它媒介物。因此，如本文使用的，术语“表达载体”指用于将异源遗传材料递送至细胞的媒介物。特别地，表达载体是重组腺病毒、腺相关病毒、或慢病毒或逆转录病毒载体。

表达载体进一步包括用于控制异源基因转录的启动子。启动子可以是诱导型启动子（本文所述的）。表达系统适合于施用于哺乳动物接受者。表达系统可以包含多种非永生的遗传修饰细胞，每种细胞含有编码至少一种治疗剂的至少一种重组基因。

细胞表达系统在体内形成。根据再一个方面，提供了用于在体内治疗哺乳动物接受者的方法。该方法包括例如经由静脉内施用，将用于表达异源基因产物的表达载体原位引入患者的细胞内。为了在体内形成表达系统，将用于表达治疗剂的表达载体在体内i.v引入哺乳动物接受者内。

根据再一个方面，提供了用于在体内治疗哺乳动物接受者的方法。该方法包括体内将靶治疗剂引入患者内。

用于表达异源基因的表达载体可以包括用于控制异源基因产物的转录的诱导型启动子。因此，通过将细胞原位暴露于诱导异源基因转录的条件，来控制治疗剂的原位递送。

本公开内容提供了通过向细胞或患者施用表达载体，来治疗哺乳动物中的疾病的方法。对于基因治疗方法，分子生物学和基因治疗领域的普通技术人员能够确定本公开内容的新型方法中使用的表达载体的适当剂量和施用途径，而无需过度实验。

根据一个实施方案，将细胞在体内转化或以其它方式进行遗传修饰。用含有外源遗传材料的载体在体内转化（即，转导或转染）来自哺乳动物接受者的细胞，所述外源遗传材料用于表达编码治疗剂的异源（例如，重组）基因，并且原位递送治疗剂。

如本文使用的，“外源遗传材料”指天然或合成的核酸或寡核苷酸，其并非细胞中天然发现的；或者如果它是细胞中天然发现的，则它并不通过细胞以生物学显著水平转录或表达。因此，“外源遗传材料”包括例如可以转录成tRNA的非天然存在的核酸。

上文公开的顺应基因治疗的治疗剂和病况仅是示例性的，并不预期限制本公开内容的范围。用于治疗已知病况的合适治疗剂的选择被视为在本领域普通技能的范围内，而无需过度实验。

在某些实施方案中，该疗法具有用于治疗/管理由提前终止密码子（PTC）引起的疾病的潜在用途，所述疾病包括但不限于囊性纤维化、肌营养不良、β地中海贫血和利德尔氏综合征。这种疗法的优点在于它提供了改善的终止密码子抑制特异性。本发明的治疗性ACE-tRNA靶向特异性终止密码子，例如TGA，因此降低了在与疾病无关的终止密码子处的脱靶效应。本疗法的优点还在于它提供了氨基酸特异性。表达的tRNA进行改造，以专门替换经由疾病终止密码子的插入而丢失的氨基酸，因此消除了对蛋白质稳定性、折叠和运输的任何虚假作用。

在某些实施方案中，本系统是模块化的，并且因此可以对每一种可能的疾病PTC进行“个体化”。例如，在人基因组中存在被Trp合成酶识别的九种个体色氨酸tRNA，所有这些都抑制mRNA UGG密码子。因此，这九种Trp tRNA各自提供了用于密码子重新编辑耐受性的机会（UGG → UGA）。另外，鉴于其在遗传密码中与终止密码子的接近，精氨酸密码子突变为PTC无义密码子在疾病中是常见的。存在可以对于密码子编辑耐受性和抑制功效进行测试的超过三十种Arg tRNA。

本发明的进一步优点在于它提供了简便的表达和细胞特异性的递送，因为整个系统（tRNA + 启动子序列）是紧凑的。

本发明的试剂的剂量、制剂和施用途径

施用本发明的试剂，以便导致与遗传疾病（例如，囊性纤维化）有关的至少一种症状的减少。施用的量将取决于各种因素而变，所述因素包括但不限于所选的组合物，特定疾病，哺乳动物的重量、身体状况和年龄，以及待实现预防还是治疗。此类因素可以通过临床医生采用动物模型或本领域众所周知的其它测试系统容易地确定。

本发明设想通过施用本发明的试剂，例如ACE-tRNA、表达载体或病毒颗粒，来治疗遗传疾病（例如囊性纤维化）。根据本发明的治疗剂的施用可以是连续的或间歇的，取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗还是预防、以及熟练从业者已知的其它因素。本发明的试剂的施用可以在预先选择的时间段内基本上是连续的，或者可以是一系列间隔的剂量。考虑了局部施用和全身施用两者。

具有本发明的治疗剂的一种或多种合适的单位剂型，其如下文讨论的，可以任选地配制用于持续释放（例如使用微囊化），可以通过各种途径施用，所述途径包括肠胃外，包括通过静脉内和肌内途径，以及通过直接注射到患病组织内。适当时，制剂可以方便地以离散的单位剂型呈现，并且可以通过药学众所周知的任何方法来制备。此类方法可以包括以下步骤：使治疗剂与液体载剂、固体基质、半固体载剂、细分的固体载剂或其组合结合，然后在需要时，将产物引入所需的递送系统内或成形为所需的递送系统。

当本发明的治疗剂制备用于施用时，它们可以与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合，以形成药物制剂或单位剂型。此类制剂中的总活性成分按重量计占制剂的0.1至99.9%。“药学上可接受的”是载剂、稀释剂、赋形剂和/或盐，其与制剂的其它成分相容，并且对其接受者无害。用于施用的活性成分可以作为粉末或颗粒；作为溶液、悬浮液或乳液呈现。

含有本发明的治疗剂的药物制剂可以通过本领域已知的程序，使用众所周知和容易获得的成分来制备。本发明的治疗剂还可以配制为适合于肠胃外施用的溶液，例如通过肌内、皮下或静脉内途径。

本发明的治疗剂的药物制剂还可以采取水性或无水溶液或分散体的形式，或者可替代地乳液或悬浮液的形式。

因此，治疗剂可以配制用于肠胃外施用（例如通过注射，例如推注或连续输注），并且可以以单位剂型存在于安瓿、预填充注射器、小容量输注容器或具有添加的防腐剂的多剂量容器中。活性成分可以采取此类形式如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，活性成分可以是通过无菌固体的无菌分离或通过从溶液冻干获得的粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如灭菌无热原水配制。

应了解，每个剂型的各个气溶胶剂量中包含的一种或多种活性成分的单位含量本身无需构成用于治疗特定适应症或疾病的有效量，因为可以通过施用多个剂量单位来达到必要的有效量。此外，可以个别地或以一系列施用，使用小于剂型中的剂量来获得有效量。

本发明的药物制剂可以包括药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂或乳化剂、以及本领域众所周知的类型的盐作为任选成分。可用于本发明的药物制剂中的载剂和/或稀释剂的具体非限制性实例包括水和生理学上可接受的缓冲盐水溶液，例如pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲盐水溶液和水。

定义

疾病状态：出于本发明的目的，“疾病状态”或“疾病表型”是哺乳动物细胞的特征，其起因于细胞内基因的编码区内的终止密码子（例如，起因于无义突变）。例如，越来越多的人遗传疾病被认为由无义突变引起（参见例如，Atkinson等人，Nuc. Acids Res. 22：1327，1994）。仅举几个例子，β地中海贫血、杜兴肌营养不良、着色性干皮病、范科尼氏贫血和囊性纤维化都可以由鉴定基因中的无义突变引起。

内源性tRNA合成酶：如果tRNA合成酶存在于根据本发明将tRNA引入其内的细胞中，则它被视为对于细胞是“内源性的”。如对于本领域普通技术人员显而易见的，出于这些目的，tRNA合成酶可以被视为内源性的，无论它是在相关类型的细胞中天然发现的，还是所讨论的特定细胞已进行改造或以其它方式人为操纵以含有或表达它。

抑制基因tRNA：“抑制基因tRNA”是其反密码子与密码子互补的那种，所述密码子否则将终止翻译，使得在实验的条件下发生可检测的通读。标准终止密码子是琥珀（UAG）、赭石（UAA）和蛋白石（UGA）密码子。然而，文献中也已采用了非标准的终止密码子（例如4-核苷酸密码子）（参见例如，Moore等人，J. Mol. Biol. 298：195，2000；Hohsaka等人，J. Am.Chem. Soc. 121：12194，1999）。

现在通过下述非限制性实施例说明本发明。

实施例1

遗传密码使用四种核苷酸，其依次又形成三联体密码子，所述三联体密码子构成了DNA到蛋白质翻译的基础。存在总共64种密码子，其中61种用于编码氨基酸，而其中三种（TAG、TGA和TAA）编码蛋白质末端“终止”或“无义”密码子。

5至10%的囊性纤维化病例由“无义”突变引起，所述突变导致囊性纤维化跨膜传导调节（CFTR）蛋白的过早截断。这种“1类”突变的实例是p.Trp1282X，引起导致CFTR功能丧失和严重的囊性纤维化表型的提前终止密码子（PTC）。某些化合物如阿他卢仑促进产生疾病的无义突变的终止通读，但由于许多警告，包括弱终止密码子特异性和在体内出乎意料的低效率密码子跳跃，作为治疗剂仅是适度成功的。然而，这些化合物的广泛使用和内源性终止密码子通读在后生动物中很普遍的发现提示，如果递送到细胞类型的子集，即气道上皮，则辅助抑制可能是可行的。然而，当治疗辅助终止密码子通读成功时，在无义密码子的位置处的氨基酸非选择性掺入具有影响蛋白质折叠、运输和功能的潜力（如CFTR 1282X的情况）；并且因此，需要另外的治疗干预。因此，存在理解疾病PTC的性质以及潜在的治疗抑制剂，以及一般地PTC疾病的更有效治疗的迫切的未满足的需要。

该实施例表征了用于CFTR p.Trp1282X通道拯救的反密码子编辑（ACE）Trp-tRNA。此类tRNA进行改造，以“抑制”引起疾病的TGA终止密码子，并且在p.Trp1282X CFTR处掺入原始氨基酸Trp，实际上，在遗传上重构野生型CFTR蛋白。数据证实这种一般方法（无义抑制）通过tRNA及其相应的合成酶在粘附细胞中的瞬时转染，或其基于病毒递送至更天然的气道细胞类型，例如A549气道细胞，产生携带框内终止密码子的转录物的稳固拯救。这种方法提供了超过现有策略的许多显著益处：1）改善的密码子特异性 – 表达的tRNA可以针对特异性终止密码子，因此降低了在与疾病无关的终止密码子处的脱靶效应。2）氨基酸特异性 – 表达的tRNA和/或合成酶可以进行改造，以替换经由疾病终止密码子的插入而丢失的氨基酸，因此消除了对CFTR稳定性、折叠和运输的任何虚假作用。3）可调谐性 – 理论上，该系统可以对于每种类型的tRNA和PTC突变进行个体化。4）简便表达 – 整个系统是紧凑的（<1kb），并且可以容易地包装，并且瞬时表达或经由tRNA的纳米颗粒递送而表达。5）对于一般策略的原理证明 – 框内终止密码子是人类疾病的主要原因，并且存在很少的治疗选项；此处对p.Trp1282X执行的实验预计导致对其它CFTR无义密码子机制的了解。

数据显示ACE-tRNA终止密码子抑制基因tRNA在“拯救”含有引入的终止位点的转录物方面是有效的（图6A和6B），提示此类tRNA具有干扰无义介导的降解（NMD）的潜力，所述NMD是疾病终止位点的治疗拯救中的主要生物学障碍。因此，打开了使用抑制基因tRNA以获得疾病中NMD的更多分子了解的可能性。

结果

我们怀疑是否有可能表达真核tRNA，其已进行反密码子编辑，以抑制终止位点例如TGA，而不是其指定的密码子。这在五种人色氨酸tRNA中对测试构建体进行测试，所述测试构建体由与eGFP序列在框内的荧光蛋白质（cherry）组成，所述eGFP序列通过含有TGA位点的接头分开。为了指示全长蛋白质的产生，将HA表位添加至eGFP读码框的C末端。这种测试系统是有用的，因为cherry信号的视觉外观指示质粒的递送和表达，并且与eGFP拯救组合显示TGA抑制。图6A和6B中的数据显示了，使用这种测试构建体测定五种反密码子编辑的Trp tRNA人抑制cherry和eGFP读码框之间的短接头中的TGA终止位点的能力的蛋白质印迹数据。在这些构建体中，候选物1、2、3和5在这方面显示了适度的活性。这可能是由于对突变的结构不耐受，或者甚至仅通过单个碱基改变反密码子的可能性，破坏了Trp合成酶识别和/或用色氨酸酰化tRNA的能力。然而，这些测试tRNA中的4号（tRNA #4）显示了TGA位点的显著抑制活性，产生了全长的cherry-eGFP-HA蛋白质（图6B）。进一步地，在不存在共表达的tRNA的情况下，最后一个泳道，未见通读，图6B。

方法

检查Trp tRNA的密码子编辑耐受性（TGG → TGA），以及它们在瞬时转染的串联荧光团（mCherry-TGA-GFP）和CFTR Trp1282X中抑制靶向TGA测试位点的能力。5/9 Trp tRNA的初步筛选发现了反密码子编辑的Trp-tRNA，其在HEK细胞中瞬时转染，并且具有“独立”功能性以拯救cherry-TGA-eGFP-HA测试构建体，图6B。HA表位的选择性存在指示成功的拯救，以及在单个细胞水平上cherry和eGFP荧光的共聚焦检查（未显示）。这个结果提供了数据的原理证明：a）一些ACE - tRNA可以耐受反密码子编辑，b）这些tRNA保留通过内源性色氨酸合成酶由Trp酰化的能力，并且c）这些tRNA可以抑制嵌入在开放蛋白质读码框中的TGA位点。

剩余四种Trp-tRNA在功能上检查从TAA到TGA抑制子的反密码子编辑耐受性。测试了这些反密码子编辑的tRNA拯救cherry-TGA-eGFPHA克隆的能力。获得了关于cherry和eGFP信号以及HA表位的生物化学（蛋白质印迹）数据。此处，cherry表达充当阳性转染对照。共聚焦成像在单个细胞水平上验证了cherry和eGFP荧光。

通过纯化的拯救的cherry-Trp-eGFPHA蛋白的胰蛋白酶片段的质谱分析，确定内源性Trp合成酶使ACE - Trp tRNA装载有色氨酸氨基酸的保真度。由cherry和eGFP读码框之间的接头生成的胰蛋白酶片段的预测质量为：KPINQWPANTHER，伴随1590.8135的预测质量；粗体W指示掺入位点，图10。因此，这代表无义密码子修复和替换为野生型氨基酸的首个实例，并且因此是超过现有方法例如治疗性阿他卢仑的显著进步。后面一种实例，该化合物促进了具有不正确氨基酸的无义密码子的通读，因此，提供严格修复的新tRNA序列的发现和鉴定是重要的。

通过标准生物化学方法对于B和C糖基化CFTR条带20的完全成熟，评价瞬时转染的CFTR 1282X通道通过上文鉴定的ACE – tRNA的拯救。因此，该通道已用野生型氨基酸修复，是完全功能的且成功运输到质膜。

下一步是使用电生理学方法（单细胞膜片钳和Ussing腔室）和生物化学方法，在功能上表征用上文鉴定的ACE - tRNA系统拯救的CFTR Trp1282X通道。表达的tRNA减少1282XmRNA的无义介导的降解（NMD）的功效用定量rtPCR进行评价。重编程的人气道细胞用于测试天然1282X CFTR通道的表达的密码子编辑的Trp-tRNA拯救。

已证实了反密码子编辑在鉴定的人Trp tRNA中是耐受的，并且这种75碱基对的转移RNA能够抑制测试构建体内的框内TGA密码子。这些实验推断了这一发现，以表征这种ACE– tRNA与CFTR 1282TGA mRNA相互作用，并且在模型细胞（FRT和A549）以及p. 1282X人重编程的气道细胞中产生功能性CFTR通道的能力。

瞬时表达的CFTR 1282X通道以及重编程的气道细胞中的拯救水平的生物化学测定。抗体M3A7用于识别拯救的CFTR（表位为aa 1370-1380），并且检测拯救和未拯救的所有CFTR，与N末端结合的抗体，例如可通过EMD Millipore获得的MM13-4（表位aa 25-36）。可替代地，L12B4（表位aa 386-412，EMD Millipore）或660（表位aa 576-585）可通过CysticFibrosis Foundation Therapeutics获得。

通过电生理方法、膜片钳和Ussing腔室记录检查表面功能性。通过来自瞬时表达细胞和重编程气道细胞的RNA提取物的定量rtPCR，测定1282X mRNA的稳定性和丰度。

来自人气道细胞的RNA转录组数据的生物信息学分析鉴定了含有TGA密码子的转录物的丰度、背景和身份。在ACE – tRNA表达之前和之后，使用TGA对于其正常的终止位点的前10种表达转录物用蛋白质生物化学在单个转录物的水平上进行跟踪。细胞凋亡的生物化学和免疫组织学探针也用于检查ACE-tRNA在细胞死亡中的影响。

总之，数据显示，具有框内终止位点的离子通道基因顺应这种类型的“拯救”（图9），并且系统的组分可以在气道细胞中进行病毒表达。进一步地，这种想法的高度简化形式，人起源的ACE-tRNA，证实了在哺乳动物细胞系中拯救框内CFTR TGA密码子的“独立”能力（图9）。这种方法具有超过现有的终止密码子策略的许多优势，并且在ACE-tRNA 1）取消无义介导的降解、2）在肺细胞制剂中起作用以及3）特异性拯救CFTR 1282X的能力方面，值得进一步检查。

实施例2

几种不同的无义突变引起CF，因此占所有CF疾病的大致10%。图7。这些病例集中在十个特异性遗传病变内：E60X、R75X、G542X、R553X、Q890X、Y1092X、R1158X、R1162X和W1282X。我们提议用正确的方法，就修饰和对反密码子编辑的耐受筛选现有的人tRNA序列应该是可行的。为此，大致144种ACE-tRNA是测试可以用于促进致病性无义密码子的修复和全长蛋白质表达的那些的候选物。具体地，使用图11中描述的方案，生成了tRNA文库，以鉴定编码ACEtRNA的新型tRNA序列，其具有修复顶端CF原因性无义突变的能力。具体地，将10ng编码ACE-tRNA的退火寡核苷酸与50ng NanoLuc报告质粒、1ul 10x CutSmart Buffer（NEB）、1ul T4连接酶（NEB）、10mM ATP和1ul BbsI（NEB）组合，并且在热循环仪中进行循环，如图11中所述。将1ul反应物转化到感受态大肠杆菌内，并且将转化体在氨苄青霉素琼脂板上铺平板。每块板挑选一个转化体，在氨苄青霉素选择下在1ml LB中生长，微量制备并验证序列。

首先执行筛选研究，以从色氨酸和甘氨酸中鉴定最佳的ACE-tRNA候选物。使用磷酸钙，将125ng序列验证的具有ACE-tRNA的NanoLuc报告质粒的微量制备cDNA转染到HEK细胞内。HEK细胞在前一天以4x10⁴在96孔板中铺平板。转染后24小时，将培养基替换为20ulPBS，并且添加15ul NanoGlo试剂（Promega）。在SpectraMax i3（Molecular Devices）上读取板。数据是3次或更多次的重复。图8。数据显示大多数tRNA证实弱密码子编辑耐受性。然而，出现来自筛选的明确的高性能tRNA，伴随ACE-Trp和ACE-Gly tRNA的鉴定，其证实了背景的20倍至130倍的含有无义密码子的蛋白质的拯救。

为了评价这些新型tRNA是否可以拯救具有无义密码子的CFTR通道，它们与CFTRW1282X cDNA质粒一起在哺乳动物HEK细胞中共表达。通过标准的生物化学方法，经由CFTR蛋白的蛋白质印迹评价来分析细胞制剂。这种方法对于这个目的是非常有利的，因为CFTR蛋白展示充分建立的多条带模式。具体地，“B”和“C”条带分别代表在细胞表面处的全长和完全成熟的、翻译后加工的CFTR蛋白。在这种情况下，用Trpchr17.trna39和Glychr19.trna2 ACT-tRNA的两种拯救均产生“B”和“C”CFTR免疫阳性（抗体MA37）条带的稳固群体，表明通过所述tRNA促进了全长、成功运输的离子通道蛋白。图9。

实施例3

T茎修饰显著改善了无义抑制。图10。在本文中，我们提议了tRNA的另外修饰，以进一步实现其用于抑制无义密码子和促进蛋白质表达目的的功能。该假设基于以下可能性：图10中所示的在tRNA“t茎”环内合理地引入的突变，将产生对于无义密码子抑制更稳定且功能上更有效的tRNA分子。为此，将单一突变和双重突变直接改造到tRNA Trpchr17.trna39(被鉴定具有拯救色氨酸TGA无义密码子的活性的ACE-tRNA)的t茎环内。因此生成了38种tRNA t茎变体，并且在用图4中所示的无义拯救报告构建体瞬时转染的HEK细胞中进行筛选。转染后24小时，测定了细胞的萤光素酶活性，如图10中所示。数据显示强变异并且鉴定了具有增强的抑制活性的具有不同t茎环序列的新型tRNA序列。值得注意的是，一种此类突变体TS-38 52-62 G-C将Trpchr17.trna39的抑制能力增强到大致250%（图12）。我们因此提议这是可泛化的修饰，即，通过实施例1和2鉴定的新tRNA序列的可泛化的修饰可以通过进一步的原理修饰更好地进行（关于其拯救无义密码子的能力）。此类方法有助于ACE-tRNA针对具有低丰度靶RNA或其中tRNA递送可能受限的组织类型的治疗效用。

实施例4

为了允许鉴定核苷酸组成和通过新型tRNA抑制无义密码子的功能能力，发明了用于高通量克隆的具有一锅克隆反应的多合一质粒，图11。这种方法允许在标准的96孔形式中，经由萤光素酶活性简便研究ACE-tRNA活性。简言之，将编码tRNA的合成核苷酸序列连接到NanoLuc Reporter质粒内，其中图11显示了TGA无义报告质粒变体的一个实例。TAA（蛋白石）和TAG（琥珀）终止密码子拯救载体已在图16-19中成功设计并实现。这种方法的益处在于，伴随限制性酶和连接酶的存在，编码tRNA文库的DNA寡核苷酸可以连接到NanoLuc报告质粒中，其中反应推进至tRNA插入物的几乎100%掺入（图11）- 因此“一锅”名称。将反应物转化到大肠杆菌内，其中所得的cDNA通过标准方法纯化。本发明方法的另一个益处在于，tRNA和报告基因位于单个表达盒内，因此降低了生物学变异性，并且改善了所得到的tRNA抑制活性筛选中获得的数据质量。然后通过推断的萤光素酶活性，在高通量96孔形式中，就其修复无义密码子的能力筛选纯化的cDNA质粒。该方法适合于数百种至数千种tRNA就新型治疗活性的高通量筛选。

图11中所述的“一锅”克隆和表达系统已成功用于鉴定独特的tRNA序列，用于修复色氨酸和甘氨酸ACE-tRNA（图13）、ACE-tRNA-Arg（图14）、ACE-tRNA-Gln TAG（图15）、ACE-tRNA-Gln TAA（图16）、ACE-tRNA-Glu TAG（图17）、ACE-tRNA-Gln TAA（图18）和ACE-tRNA-Trp TAG（图19）。图20A-20D显示了作为小RNA的ACE-tRNA的递送支持G542X和W1282X无义突变的稳固抑制。

实施例5

用于抑制提前终止密码子的改造的转移RNA

摘要

提前终止密码子（PTC）负责所有遗传疾病的10-15%。在翻译过程中的PTC抑制提供了治疗各种遗传病症的有希望的方法，然而，促进PTC通读的小分子在临床试验中已产生了混合性能。呈现了基于细胞的高通量测定，以鉴定可以有效抑制读框内PTC并忠实编码其同源氨基酸的反密码子改造的转移RNA（ACE-tRNA）。总之，ACE-tRNA被鉴定为具有靶向最常见的人致病性无义密码子的高度抑制活性。以修复PTC的水平表达ACE-tRNA的细胞的全基因组转录组核糖体概况分析，指示存在与翻译终止密码子有限的相互作用。这些ACE-tRNA在哺乳动物细胞、非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞和小鼠体内展示高抑制效力，在多种基因中产生PTC修复，所述基因包括在囊性纤维化跨膜传导调节物（CFTR）内的致病性突变。

引言

提前终止密码子（PTC）起于单核苷酸突变，其将规范的三联体核苷酸密码子转换成三种终止密码子之一，例如TAG、TGA或TAA。PTC经常比错义突变更有害，因为它们导致蛋白质表达的丧失。另外，mRNA丰度通过无义介导的降解（NMD）降低，并且在一些情况下，截短的蛋白质可能具有显性负功能^1-3。因此，PTC与许多严重的疾病表型相关并不令人惊讶，所述疾病表型包括囊性纤维化⁴、杜兴肌营养不良、脊髓性肌萎缩⁵、婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症⁶、β地中海贫血⁷、胱氨酸症⁸、X连锁性肾性尿崩症⁹、赫尔勒综合征¹⁰、乌谢尔综合征¹¹和多囊性肾病。另外，在肿瘤抑制基因p53和ATM内发生无义突变¹²，进一步暗示了其在疾病中的作用。最易受PTC转换影响的氨基酸密码子是具有来自终止密码子的单核苷酸取代的那些：色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸、精氨酸和甘氨酸（图25）。因此，PTC代表独特的疾病群，其影响全世界超过3000万人，占所有遗传疾病的10-15%¹³。

小分子，例如氨基糖苷¹⁴、二肽¹⁵和噁二唑¹⁶，促进无义突变的“通读”或“抑制”。这些化合物在模型生物^17、18、哺乳动物细胞系¹⁹和一些动物疾病模型^16、20中是有效的。然而，这种方法导致编码近同源氨基酸²¹，有效地生成在PTC处的错义突变，其本身可能对蛋白质折叠、运输和功能具有有害作用。此外，氨基糖苷是耳毒性和肾毒性的²²，而首创的噁二唑阿他卢仑在患者群体中展示出乎意料的低功效（ACT DMD 3期临床试验，NCT01826487；ACT CF，NCT02139306），因此限制了其作为PTC治疗剂的效用。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑中的最近和持续进展潜在地提供了用于起因于无义突变的疾病的永久解决方案。然而，这种技术的各方面对于其作为治疗剂的快速使用造成障碍^23、24。这并不限于基于每个患者的遗传变异性的背景，对于每个突变的“精确”或“个体化”诊断的要求。

鉴定了PTC修复方法，其展示小分子的多功能性和基因编辑的精确性。调查了满足这些标准的tRNA，其中它们的反密码子已经由诱变进行改造，以识别且抑制UGA、UAA或UAGPTC密码子。为了是有效的，反密码子编辑的tRNA，又名ACE-tRNA，仍然应该被内源性翻译细胞机器识别，所述机器包括用于使ACE-tRNA装载有其同源氨基酸的氨酰tRNA合成酶和用于将装载的tRNA递送至核糖体的真核延伸因子1a（eEF-1α），图21A。此类抑制基因tRNA已显示以有限的方式拯救与β地中海贫血²⁵、着色性干皮病²⁶和转基因PTC报告基因²⁷相关的框内终止密码子。

此处显示了反密码子编辑方法可泛化至多种tRNA基因家族，指示许多注释的tRNA是生物学可行的。进一步地，证实了反密码子编辑的抑制基因tRNA编码其同源氨基酸，缺乏与末端终止密码子显著的相互作用，并且在体内有效抑制PTC。总之，数据支持以下可能性：此类改造的tRNA满足了覆盖致病性PTC的广泛要求，并且因此代表了有希望的新的一类RNA治疗剂。

结果

这项研究的原理起源于以下观察：对于给定的同源氨基酸（同工受体），存在具有独特序列（同工解码器（isodecoder））的多种tRNA基因，导致在人基因组中注释的>400种tRNA（http：lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/）^28、29。首先，检查了tRNA基因，以鉴定在哺乳动物细胞中保留PTC的抑制功效的各个ACE-tRNA。为了使序列覆盖达到最大，生成了多合一cDNA质粒，其既支持ACE-tRNA的高通量克隆（HTC），又支持在递送至哺乳动物细胞之后，使用发光定量检测PTC抑制，图21B。使用与ccdB负选择³¹配对的Golden Gate克隆³⁰，将ACE-tRNA序列作为DNA寡核苷酸克隆到HTC质粒内。这种策略产生了~100%的克隆效率。使用96孔形式，从拆分NanoLuc萤光素酶（NLuc）NanoBiT平台中读出ACE-tRNA抑制效率，其中在大比特和小比特结构域之间的连接处框内引入目的PTC（UGA、UAA或UAG），图21B³²，并且对NLuc-PTC表达细胞中获得的背景标准化。首先就UGA PTC的抑制评估二十一种甘氨酸ACE-tRNA，图22，左上方，第1列（紫色）。大多数ACE-tRNA^Gly序列未能抑制UGA NLuc PTC，然而，鉴定了具有高抑制产率（背景的~100倍）的三种Gly-tRNA^UGA。鉴于对于反密码子耐受性筛选的Gly-tRNA中的高序列保守性（图27），难以从头预测哪种tRNA最顺应反密码子编辑。

接下来，对于可以产生致病性PTC的可能的单核苷酸突变中的每一种，对密码子编辑的tRNA执行筛选：Arg-tRNA^UGA、Gln-tRNA^UAA、Gln-tRNA^UAG Trp-tRNA^UGA、Trp-tRNA^UAG、Glu-tRNA^UAA、Glu-tRNA^UAG、Cys-tRNA^UGA、Tyr-tRNA^UAG、Tyr-tRNA^UAA、Ser-tRNAUAG、Leu-tRNA^UAG、Leu-tRNA^UAA、Lys-tRNA^UAG、Lys-tRNA^UGA和Ser-tRNA^UAG。NLuc的酶促活性并不显著受引入的氨基酸的影响（图28），因此归因于NLuc发光与ACE-tRNA抑制能力中的差异。该筛选对于每种氨基酸和终止密码子类型鉴定了多种ACE-tRNA，对于所有三种终止密码子具有抑制覆盖，图22。这些ACE-tRNA中的许多显示出强活性，具有背景的>100倍PTC抑制，其明显高于本研究中使用的氨基糖苷。有趣的是，一些ACE-tRNA对于特定的反密码子编辑展示明确的偏好，可能反映了与tRNA反密码子同工受体序列的改变的氨酰tRNA合成酶结合³³。例如，色氨酸转换为UAG抑制产生的拯救是相同ACE-tRNA^Trp的UGA编辑的十倍。然而，对于谷氨酰胺则相反，其中显示对于UAA超过UAG的明确偏好。值得注意的是，在每种情况下，鉴定了多种高性能抑制剂，并且这对于Arg^UGA（在人类疾病中起重大作用的PTC）尤为明显；其中鉴定了二十种有效的ACE-Arg^UGA抑制剂。在其它情况下，例如显示出功能的那些中的ACE-tRNA^Glu，抑制效率对于UAA和UAG大致相等。并且在ACE-tRNA^Lys中发现了类似的模式，其中经由UAG或UGA抑制的编码被强烈镜像。对于Gln-tRNA^UAA，抑制活性导致抑制信号是背景的>2,000倍。在筛选中鉴定的ACE-tRNA中，色氨酸tRNA基因家族展示对于UGA PTC最弱的抑制活性。只有6种独特的人ACE-tRNA^Trp序列可用于筛选，使用来自一系列物种的tRNA扩展了UGA抑制性ACE-tRNA^Trp文库。除错误编码的A9C tRNA^Trp和细菌Hirsh Trp抑制子之外^34-36，对于具有来自酵母、苍蝇、小鼠、大鼠、兔子和青蛙的独特序列的色氨酸tRNA基因，测试了UGA反密码子编辑耐受性，图29A-29B。这个努力未能成功鉴定超过人ACE Trp tRNA的ACE-tRNA^Trp UGA PTC抑制活性，图29C。总之，tRNA筛选鉴定了多种改造的tRNA（对于每种氨基酸和终止密码子类型），其展示有力的抑制，因此对反密码子编辑具有一般耐受性。

接下来，确定是否通过同源的氨酰tRNA合成酶，以氨酰化严格性为代价，对筛选中鉴定的ACE-tRNA进行功能化。为此，质谱法用于检查模型可溶蛋白质，组氨醇脱氢酶（HDH）中的PTC抑制，图23A。将TGA密码子引入天冬酰胺94（N94）处（图30A-C），并且与编码Glychr19.trna2或Trpchr17.trna39 ACE-tRNA（分别为性能最高的甘氨酸和色氨酸ACE-tRNA^UGA）的质粒串联在HEK293细胞中共表达。经由Strep-Tactin® C末端亲和标签纯化所得到的全长、抑制的HDH蛋白，并且通过质谱法进行分析，图23A（图28）。后续数据搜索鉴定了对于Trp chr17.trna39的Asn至Trp修饰（+72 Da）和对于Glychr19.trna2的修饰（-57Da），因此确认了对于每种ACE-tRNA类型的同源氨基酸的真实编码。重要的是，在每种情况下，在HDH p.N94X位点处鉴定的>98%的肽具有编码的同源色氨酸和甘氨酸。进一步地，两种ACE-tRNA均保留了对于UGA终止密码子超过UAA和UAG的选择性，图23B（ACE-tRNA^Gly）和图31（ACE-tRNA^Trp）。最后，当瞬时表达时，ACE-tRNA^Gly在其抑制HEK293细胞中稳定表达的NLuc-UGA的能力方面，优于常规的小分子抑制剂庆大霉素（40 µM）和G418（140 µM），图23C。甚至对于ACE-tRNA^Trp也是如此，其与G418相比具有较低的抑制效率，但超过的PTC拯救，图33A-D。

提出了一个问题，即显示提前终止密码子的有效抑制的ACE-tRNA是否也可以诱导天然终止密码子的总体通读。为了解决这种潜在的“脱靶”抑制，通过从表达外源性ACE-tRNA或对照模拟质粒（puc57GG）的HEK293细胞生成核糖体足迹文库，获得了在所有细胞转录物上主动参与的核糖体的全转录组的定量概况。从生长培养基中去除链霉素，以防止通读伪像。为了比较，在G418（150 µM，48小时）的存在或不存在下，也由细胞生成核糖体足迹文库。图24A显示了3'UTR区域上与对照比较（log2倍数变化）的G418和五种ACE-tRNA的核糖体足迹密度。仅包括在两个重复文库中编码序列的最小阈值为5 RPKM以及3'UTR中的最小阈值为0.5 RPKM的转录物，用于定量比较（G418中的254种转录物和ACE-tRNA中的495-748种转录物）。在该系统中，对于三个内源终止密码子组中的任一个，G418对全转录组的3'UTR核糖体密度没有可观察的作用。此处检查的ACE-tRNA没有检测到的3'UTR核糖体密度的改变，除了对于与ACE-tRNA反密码子互补的同源终止密码子，诱导3'UTR核糖体密度的大约2倍增加的ACE-tRNA Gln-UAA和Arg-UGA之外。理解蛋白质终止的2倍通读的生物学意义将需要进一步研究，但与相同ACE-tRNA对PTC的100至1000倍抑制相比，这种效应显著更低。

多种框内终止密码子在基因的端部处频繁发现^37-39，并且可能引起对于ACE-tRNA和G418处理的总体3'UTR核糖体密度的微小差异。检查了在终止密码子下游60 nt区域内的3'UTR中的每个核苷酸处的核糖体占有率。图24B证实了相对于终止密码子的第一个核苷酸，在-35至+ 65 nt区域内的每个核苷酸围绕天然终止密码子的核糖体占有率。读数根据每百万个映射的读数进行标准化，与对照细胞比较，并且如小图A中记录为log2倍数变化。将多于5,200种转录物映射到目的区域中的至少1个足迹。ACE-tRNA Gln-UAA和Arg-UGA不仅显示了在早期区域中显著增加的核糖体占有率，而且还显示了特征性的3-nt周期性，其指示核糖体不是随机分布的，而是跟随逐个密码子的移动。即使在3’UTR的早期区域中，关于UGA-Trp、UGA-Gly和UAG-Glu的ACE-tRNA或G418也始终没有显示可观察到的核糖体占有率的改变。总之，核糖体概况数据认为通过ACE-tRNA的天然终止密码子抑制的效率一般很低，并且显著低于PTC抑制的水平。

讨论

PTC引起许多人类疾病，并且不存在建立的用于其治疗管理的治疗选项。本文报告了在真核细胞和小鼠骨骼肌中展示有效PTC逆转的反密码子编辑的tRNA的高通量克隆和鉴定、表征和功能分析。值得注意的是，该筛选总体鉴定了ACE-tRNA，其具有修复绝大多数已知的人致病性PTC的能力。改造的tRNA忠实地编码了其同源氨基酸，因此取消了对下游蛋白质稳定性、折叠和运输的虚假作用，并且因而消除了对于涉及蛋白质折叠或运输试剂的串联疗法的需要。当作为cDNA转染时，ACE-tRNA经由PTC抑制拯救了多种全长蛋白质；NLuc萤光素酶报告物、模型蛋白质HDH和CFTR中的两个疾病无义突变。小鼠骨骼肌中有效且稳定的体内PTC抑制通过ACE-tRNA^Arg cDNA展示，提示了对于ACE-tRNA活性的特别高水平的细胞耐受性。关于肌肉中的精氨酸的活性ACE-tRNA的鉴定与由无义突变引起的抗肌萎缩蛋白病（dystrophinopathies）的治疗有关。如同大多数遗传疾病，大于10%的抗肌萎缩蛋白病由无义突变引起⁴³，其中CGA->TGA突变是最普遍的⁴³。还用作为合成RNA转录物递送的ACE-tRNA实现了有效抑制，因此允许纳米颗粒制剂的开发。需要进一步的研究来评价对于每种组织和疾病类型的理想tRNA递送策略，其中努力很可能获益于迅速扩展的核酸递送技术。

抑制PTC的试剂具有也产生天然终止密码子的通读的潜力。本文呈现的RNA概况分析数据提示，这一般不是细胞中以及对于测试的密码子编辑的tRNA的情况。虽然用Arg-tRNA^UGA和Gln-tRNA^UAA发现了可检测的通读，但用Glu-tRNA^UAG、UGA-Gly-tRNA^UGA和Trp-tRNA^UGA没有测量到对总体翻译终止的显著作用。这种行为显然没有与终止密码子类型或tRNA固有的PTC抑制活性分开。ACE-tRNA无效地促进在真实终止密码子处的通读的一个潜在原因，可能是由于翻译末端附近的上下文序列格局⁴⁴。这种可能性受到在PTC处的终止复合物的组成不同于在天然终止处的那些的发现的支持^45、46。然而，在其中发生较低水平的通读的情况下，适当存在多重细胞机制来限制正常的终止通读及其破坏效应。多重框内终止密码子在基因的端部处频繁发现^37-39，并且已知专门的泛素连接酶⁴⁷和核糖体相关途径⁴⁸，以鉴定且降解具有错误翻译终止的蛋白质。然而，尽管此处在哺乳动物细胞中可见的有限影响，仍应该在对于ACE-tRNA的递送和表达所需的细胞或组织类型中执行相似的核糖体概况分析实验。

先前的研究已显示，周围的mRNA序列影响氨基糖苷和阿他卢仑PTC固有的终止密码子抑制功效^49-52，而ACE-tRNA也可能受到类似影响。进一步地，尽管在一些设置下，经由病毒或非病毒递送替换含有PTC的基因的基因添加策略已获得短期益处，但可能难以调控转基因表达水平。相比之下，经由ACE-tRNA抑制的大量蛋白质拯救与天然细胞RNA水平偶联，并且因此较高水平的表达受到固有地调控。生物学目的对于人基因组中的大多数可变同工受体tRNA序列仍是未知的，并且据推测这些基因中的几乎一半是转录沉默的假基因⁵³，然而，此处的数据提示许多注释的tRNA是可行的。与这种可能性一致，抑制方法已用于鉴定Ser和Leu同工受体家族内的功能同工解码器tRNA⁵⁴。此处呈现的数据进一步证实，当从基因组环境中取出时，大多数tRNA基因序列支持可行的活性，进一步加深了对于多种tRNA的生物学需要和密码子使用的奥秘。因此，此处描述的高通量抑制策略可用于鉴定具有独特抑制特性的新型tRNA序列，并且此类研究具有生产新的RNA试剂以及促进tRNA表达和抑制的分子理解的潜力。

材料和方法

无义报告物HTC质粒

使用的亲本质粒是pcDNA3.1（+）。编码pNLuc的cDNA被Gibson装配（New EnglandBiolabs，USA）到限制性位点HindIII和XhoI内。在cDNA pcr过程中，将甘氨酸（密码子gga）、色氨酸（tgc）、琥珀（tag）、蛋白石（tga）和赭石（taa）添加到氨基酸位置160。使用基于pcr的Gibson Assembly，对于无BbsI限制性位点的序列，替换pcDNA3.1（+）聚A序列。高通量ACE-tRNA Golden Gate克隆位点通过以下生成：首先插入人tRNA^Tyr基因的5'前导序列（粗体）与上游T7启动子序列（斜体）

（TAATACGACTCACTATAGAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC）

（Ye等人，2008），随后为两个BbsI限制性位点（粗体斜体）（TAGTCTTCGG（ccdB盒）AAGAAGACCG）和3'终止序列（粗体），随后为反向T3引物序列（斜体）

（GTCCTTTTTTTGCTTTAGTGAGGGTTAATT）。

ACE-tRNA文库的HTC

tRNA基因序列得自tRNA数据库tRNAscan-SE（http：//gtrnadb.ucsc.edu/index.html；PMID：26673694）。本研究中使用的所有tRNA基因的序列都在图26和表9中进行编号。tRNA序列以200pmol的规模以96孔形式作为互补Ultramer由Integrated DNA Technologies（IDT，USA）合成，其相应的反密码子适当地突变（UAG、UGA或UAA）。所有tRNA序列都分别在正向和反向寡核苷酸上以CGAC和GGAC突出端（注释为5’->3’）合成。Ultramer通过在退火缓冲液（100 mM乙酸钾；30 mM HEPES，pH 7.5）中重悬浮至100ng/µl进行退火，加热至96℃ 2分钟，并且在热循环仪中以1℃/分钟冷却至4℃。在96孔PCR板中，每个孔含有10ng具有适当PTC密码子的HTC质粒、2ng ACE-tRNA双链体、1mM ATP、10mM DTT、400单位T4 DNA连接酶和10单位BbsI-HF，用ddH₂O补足至10ul。96孔板如下进行循环（[在37℃下5分钟、在20℃下5分钟] x30个循环，在37℃下10分钟，在80℃下10分钟，并且在热循环仪中冷却至4℃）。在深孔的96孔板中，将1ul Golden Gate反应物添加到10ul DH5α化学感受态细胞（ThermoFisher，USA）中，在42℃下热休克30秒，然后重悬浮于100ul Super Optimal Broth（S.O.C.；Thermofisher，USA）。转化体在37℃下生长1小时，250 rpm，然后添加到2ml补充有100ug/ml羧苄青霉素的Luria-Bertani液体培养基（LB）中，并且在37℃下在覆盖的深48孔板中生长20小时，300 rpm。大肠杆菌生长在来自Enzyscreen（http：//www.enzyscreen.com）的深孔板和夹具中执行。将大肠杆菌悬浮培养物向下旋转（10分钟，在RT下4,000g），并且制备质粒DNA且稀释至125ng/μl（IBI scientific，USA）。对所有克隆进行序列验证。使用这种方法，达到100%的克隆效率。

ACE-tRNA文库的HTS

转染前一天，将HEK293细胞（<40次传代）以1.4 x 10⁴个细胞/孔在96孔细胞培养处理的板中的达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中铺平板，所述DMEM补充有10% FBS、1% Pen/Step和2mM L-谷氨酰胺（Thermofisher，USA）。使用Calfectin（Signagen，USA），一式三份/板转染具有ACE-tRNA基因的多合一无义报告物。转染后16小时，抽吸出培养基，并且向每个孔中加入20ul PBS。将15ul裂解性Nano-Glo® Luciferase Assay Reagent添加到每个孔中（1：50试剂与缓冲液；Promega，USA）。在旋转振荡后，使板温育2分钟，并且使用SpectraMax i3板阅读器（Molecular Devices，USA；整合时间，200ms；所有波长都以终点模式收集）读取。对于每个实验，将跨越三个孔的发光求平均值，并且以这种方式将所有ACE-tRNA重复>3次。每块板也含有用不含ACE-tRNA的多合一无义报告物转染的一式三份孔，以充当转染效率的对照和基线PTC通读。所有值都报告为ACE-tRNA发光与基线PTC通读发光的比± SEM。跨越给定氨基酸家族中的所有ACE-tRNA，用Tukey的事后分析执行单因素ANOVA。

CFTR、HDH-his-strep和4xACE-tRNA表达质粒

对于在哺乳动物细胞中的表达，使用KpnI和XbaI限制性酶，将人CFTR的编码区和3'非翻译区（UTR）的200个碱基对的cDNA连接到pcDNA3.1（+）（Promega，USA）内。使用QuickChange XL II（Stratagene，USA）引入了G542tga和W1282tga突变。对于在非洲爪蟾卵母细胞中的表达，将人CFTR的编码区以及5' UTR的140个碱基对和3' UTR的244个碱基对的cDNA连接到pGEM-HE（Promega，USA）内。使用QuickChange XL II引入了G542tga和W1282tga突变。编码大肠杆菌组氨醇脱氢酶的cDNA对于小家鼠（mus musculus）进行密码子优化，并且以c末端8xHis-Strep-标签合成（BioBasic Inc，加拿大），用于从哺乳动物细胞中的蛋白质纯化。使用EcoRI和XhoI限制性位点，将合成的cDNA连接到pcDNA3.1（+）内。使用QuickChange XL II引入了无义突变tag、taa和tga。为了生成多路化ACE-tRNA表达质粒，通过在EcoRI和HindIII限制性位点之间插入BbsI “多克隆位点”（5’-GAATTCTTCCCGAGACGTTCCAAGTCTTCATGAAGACTACAGGCGTCTCCCAGGAAGCT-3’；定向BbsI识别序列为斜体的，并且用于连接的独特的四碱基对突出端为粗体的），生成了新型亲本Golden Gate pUC57（amp）质粒。选择pUC57（amp）作为亲本质粒，因为它在尺寸方面相对较小，并且缺乏主链BbsI限制性位点以及T7和T3启动子序列。HTS质粒中包括的特点是侧接ACE-tRNA盒的T7和T3启动子序列，得到对于pcr扩增理想的、具有可比较的解链温度（T_m）的通用引物结合序列。使用NEBGolden Gate Assembly Tool（https：//goldengate.neb.com/editor），生成了pcr引物，其对T7和T3侧翼序列退火，并且在远侧BbsI识别序列的切割之后，产生了独特的四碱基对突出端。最终结果是使用通用pcr引物生成了四种ACE-tRNA pcr产物，所述引物可以通过互补的四碱基对突出端进行“菊花链连接（daisy-chained）”，并且使用一锅式Golden Gate反应连接到puc57 Golden Gate质粒内。所有克隆都进行序列验证。

细胞培养、蛋白质表达和蛋白质印迹

HEK293T细胞（ATCC，USA）在含有（以v/v计的%）10% FBS（HiClone，USA）、1% Pen Strep、1% L-Glut的标准生长培养基中，在高葡萄糖DMEM（Gibco，USA）中在37℃、5% CO2下生长。根据标准方案（SignaGen Laboratories，USA），使用Calfectin在75%的汇合下转染cDNA。36小时后，将细胞刮取并且在4℃下在PBS中以7,000g离心8分钟，所述PBS补充有0.5 µg/ml胃酶抑素、2.5 µg/ml抑肽酶、2.5 µg/ml亮抑酶肽、0.1 mM PMSF、0.75 mM苯甲脒。对于表达CFTR的细胞，将细胞团块在100mM蔗糖、150 mM NaCl、1mM DTT、0.5 µg/ml胃酶抑素、2.5 µg/ml抑肽酶、2.5 µg/ml亮抑酶肽、0.1 mM PMSF、0.75 mM苯甲脒、50 mM Tris-HCL ph 7.4中剧烈研磨，并且以100,000g离心，以将总膜与可溶性胞质蛋白质分开。将团块溶解于含有1%triton、250mM NaCl、50mM tris-HCl pH 7.4和0.5 µg/ml胃酶抑素、2.5 µg/ml抑肽酶、2.5µg/ml亮抑酶肽、0.1 mM PMSF、0.75 mM苯甲脒的缓冲液中。在1% 2-巯基乙醇的存在下，将等量的细胞裂解产物加载到具有4%浓缩胶的3-15%分离梯度SDS-page上，以55 V O/N分开，并且转移至0.45 µM LF PVDF（Bio-Rad，USA）。使用在2%脱脂乳中的抗CFTR抗体M3A7（1：1000；Millipore，USA），对PVDF进行免疫印迹，并且在LI-COR Odyssey Imaging System（LI-COR，USA）上进行成像。对于表达HDH-His-Strep的细胞，将细胞团块在100mM蔗糖、1mMDTT、1mM EDTA、20mM tris-HCl pH 8.0、0.5 µg/ml胃酶抑素、2.5 µg/ml抑肽酶、2.5 µg/ml亮抑酶肽、0.1 mM PMSF和0.75 mM苯甲脒中剧烈研磨匀浆化。将裂解产物在4℃下以100,000g离心30分钟。在1% 2-巯基乙醇的存在下，上清液（可溶性细胞蛋白质）在4-12% Bis-Tris SDS-page丙烯酰胺凝胶（ThermoFisher，USA）上分离，转移至0.22 µM LF PVDF（Bio-Rad，USA），并且使用在2%脱脂乳中的抗Strep抗体（1：5000；iba，德国）进行免疫印迹，并且在LI-COR Odyssey Imaging System（LI-COR，USA）上进行成像。

质谱法

在University of Iowa Proteomics Facility获得了关于纯化的HDH-His-Strep蛋白质的片段化数据。简言之，使来自高速旋转的可溶性级分的HDH-His-Strep蛋白质穿过StrepTrap HP柱（GE Healthcare，瑞典），并且用5柱体积的100mM蔗糖、1mM DTT、1mM EDTA、20mM tris-HCl pH 8.0、0.5 µg/ml胃酶抑素、2.5 µg/ml抑肽酶、2.5 µg/ml亮抑酶肽、0.1mM PMSF和0.75 mM苯甲脒进行洗涤。蛋白质在补充有10mM d-desthbiotin的洗涤缓冲液中洗脱，并且在30kDA截断的Amicon-Ultra过滤柱（Millipore，USA）中浓缩。将浓缩的蛋白质加载到NuPage 4-12% Bis-Tris预制凝胶（Invitrogen，USA）上，并且在150V下分离1.5小时。使用Pierce质谱相容性银染色试剂盒（ThermoFisher Scientific，USA），对凝胶进行染色。

凝胶中的胰蛋白酶消化。简言之，将来自SDS-PAGE凝胶的目标蛋白质条带手动切下，切割成1 mm3小片，并且分别在100 mM碳酸氢铵：乙腈（1：1，v/v）和25 mM碳酸氢铵/乙腈（1：1，v/v）中洗涤，以达到完全脱色。将凝胶小片进一步用ACN进行处理，并且经由speedvac进行干燥。在干燥后，将凝胶小片在56℃下在50 μl 10 mM DTT中还原60分钟，然后在室温下通过55 mM IAM烷基化30分钟。凝胶小片用25 mM碳酸氢铵：乙腈（1∶1，v/v）洗涤两次，以去除过量的DTT和IAM。在干燥后，将凝胶小片置于冰上的25 mM碳酸氢铵中以10 ng/μL的50 μL胰蛋白酶溶液中，并且在冰上温育60分钟。然后，消化在37℃下执行16小时。肽提取用100 µl 50%乙腈/0.2%甲酸执行两次，持续0.5小时。合并的提取物在Speed Vac中浓缩至~15 µl。

LC-MS/MS。质谱法数据使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪（Thermo FisherScientific，San Jose，CA）进行收集，所述质谱仪与Eksigent Ekspert™ nanoLC 425System（Sciex）联接。与1/16” 10端口Valco联接的Trap-Elute Jumper Chip（P/N：800-00389）指导通过梯度1泵执行的加载和最终洗脱（通过梯度2泵）。柱组件设计为安装在ekspert™ cHiPLC系统中的两个串联的75 μmx15cm柱（ChromXP C18-CL，3μm 120A，ABSCIEX的Eksigent分公司）。对于每次注射，加载估计0.5 µg的总消化物。使用由线性和静态区段组成的120分钟梯度，用质谱仪在线分离肽，其中缓冲液A为0.1%甲酸，而B为95% ACN、0.1%甲酸。梯度首先在4%处保持3分钟，然后进行下述转变（%B，分钟）：（26，48）、（35，58）、（35，64）、（50，72）、（50，78）、（94，84）、（94，96）、（4，100）、（4，120）。

LUMOS Orbitrap上的串联质谱法。扫描序列始于在Orbitrap Fusion Lumos质谱仪（Thermo）上，在离轴Orbitrap区段（MS1）中以60,000的分辨率获得的全面调查（m/z 350-1500）。在上述120分钟的梯度过程中，获得每3秒的梯度MS1扫描。在2.0E5阈值下，在2-8种电荷状态离子中选择了最丰富的前体。如果离子在之前的30秒内被靶向两次，则动态排除离子30秒。选择的离子用在m/z 2上的质量窗口通过多区段四极杆分离，然后分别在IT和离子定线多极杆中序贯地经受CID和HCD活化条件。关于CID的AGC靶是4.0E04、35%的碰撞能量、0.25的活化Q和100毫秒的最大填充时间。靶向的前体也在40%的碰撞能量和0.25的活化Q下，通过高能碰撞诱导解离（HCD）片段化。使用Orbitrap（AGC 1.2E05，最大注射时间110ms和在400 Th下设定为30,000的分辨率），分析HCD片段离子。两个MS2通道均记录为质心，而MS1调查扫描以概况模式记录。

蛋白质组学搜索。使用Sequest HT，用Proteome Discoverer版本2.1.1.21（ThermoFisher Scientific，USA）执行初始光谱搜索。还用Byonic搜索引擎（ProteinMetrics）版本2.8.2搜索光谱。搜索数据库由2016年10月24日下载的含有92645个序列的关于物种9606（人）的Uniprot KB、以及2016年11月8日下载的含有10079个序列的关于分类学562（大肠杆菌）的Uniprot KB组成。对于Byonic搜索，将这两个数据库直接连接在一起。在任一搜索中，通过反转靶数据库中的原始条目，来创建并同时搜索相等数目的诱饵条目。

体外cRNA转录。G542X_UGA、W1282X_UGA和WT CFTR pGEMHE（Mense等人，2006；PMID：1703051）质粒通过10x过量的NheI-HF限制性酶（位点位于编码区的3'）（New EnglandBioLabs，USA）在37℃下线性化3小时，并且使用标准cDNA沉淀方法进行纯化。使用mMessagemMachine T7 Kit（ThermoFisher Scientific，USA）转录所有cRNA。来自转录反应的cRNA的纯化在来自RNeasy Mini Kit（Qiagen，德国）的柱上进行。通过在260 nm处的吸光度测量来测定浓度，并且在1%琼脂糖凝胶（无RNA酶）上确认质量。在使用前将所有cRNA都补足至1μg/ml，并且所有结果都由≥2个cRNA制备物生成。

体外tRNA转录。使用CellScript T7-Scribe Standard RNA IVT Kit（CELLSCRIPT，USA），在体外转录Trpchr17.trna39和Glychr19.trna2，性能最高的Trp和GlyACE-tRNA。将等摩尔浓度的T7寡核苷酸（5’-taatacgactcactata-3’）对ACE-tRNA PAGE纯化的Ultramer（20ug；Integrated DNA Technologies，Coralville，IA）进行退火，所述Ultramer编码ACE-tRNA并且之前为T7启动子（斜体）。重要的是，包括了含有CCA的三个末端核苷酸（粗体）。

Trpchr17.trna39（3’->5’）：TGGTGACCCCGACGTGATTTGAACACGCAACCTTCTGATCTGAAGTCAGACGCGCTACCGTTGCGCCACGAGGCCTATAGTGAGTCGTATTA

Glychr19.trna2（3’->5’）：TGGTGCGTTGGCCGGGAATCGAACCCGGGTCAATGCTTTGAAGGAGCTATGCTAACCATATACCACCAACGCTATAGTGAGTCGTATTA

将总反应体积调整至100 µl，并且以下述量添加试剂盒试剂：10 µl 10X T7-Scribe转录缓冲液、7.5 µl每种核苷酸（100 mM原液）、10 µl 100 mM二硫苏糖醇、2.5 µlScriptGuard RNase Inhibitor、10 µl T7-Scribe酶溶液。反应在37℃下温育4–5小时后，DNA模板用由试剂盒提供的5 µl DNA酶（1 U/µl）消化30–60分钟。ACE-tRNA用酸性苯酚氯仿（5：1，pH 4.5）从反应物中提取，并且用乙醇沉淀。将沉淀的ACE-tRNA离心，洗涤，干燥并重悬浮于100 µl DEPC处理的水中，并且用Chroma Spin-30柱（Clontech，USA）进一步纯化。该程序产生大致100 µl ~5 µg/µl ACE-tRNA。ACE-tRNA以20ug等分试样重新离心，洗涤，冻干并贮存于-80℃下直至使用。所有结果都由≥2个ACE-tRNA制备物生成。

核糖体足迹概况分析文库制备。在不存在Pen-Strep的情况下，用ACE-tRNA和对照质粒（puc57GG）瞬时转染的HEK293细胞在标准生长培养基中生长48小时。如描述⁵⁵的制备了文库，伴随少数修改。简言之，细胞通过加入冰冷的PBS迅速冷却，在裂解缓冲液（20 mMTris-HCl/pH7.4、150 mM NaCl、5 mM MgCl₂、1 mM DTT、1%（v/v）Triton X-100和25 U ml^-1Turbo DNA酶I）中在冰上裂解10分钟，然后通过26-G针研磨10次。通过在4℃下以16,000g离心10分钟的清除后，裂解产物在室温下用100 U RNA酶I（Ambion，USA）/A₂₆₀裂解产物消化45分钟，同时轻轻搅拌，然后加入200 U RiboLock RNase Inhibitor（Thermo Scientific）。然后通过将裂解产物加载到在改良的多核糖体缓冲液（20 mM Tris-HCl/pH7.4、150 mMNaCl、8.5 mM MgCl₂、0.5 mM DTT、20 U ml^-1 RiboLock RNase Inhibitor）中制备的1M蔗糖垫上，分离受核糖体保护的mRNA片段，并且使用Beckmen TLA-110转子，在4℃下以70,000rpm离心2小时。使用TRIzol提取含有mRNA足迹的核糖体团块，并且在含有8M尿素的变性12%聚丙烯酰胺凝胶上分开。从用SYBR Gold（Invitrogen）染色的凝胶中手动切下大小范围为26至34 nt的RNA片段，并且分离以生成受核糖体保护的片段文库。使用Ribo-Zero试剂盒（Illumina）耗尽污染性rRNA片段。如所述的⁵⁵，使用生物素化的rRNA耗尽寡核苷酸（表9）执行3'寡核苷酸衔接子连接、逆转录、环化和二次rRNA耗尽。在PCR扩增过程中，对于每个样品使用索引引物将文库加上条形码。然后将加上条形码的文库与3% PhiX（Illumina）合并，并且按照制造商方案，在Illumina NextSeq 500中进行测序，以通常生成18-27百万个读数/样品。

核糖体足迹数据分析。首先使用HISAT 2.0.3 ⁵⁶，将每个加上条形码的样品的数据文件（在3'端处减去衔接子序列）映射到四个rRNA序列（RNA5S1；NR_023363，RNA5-8SN5；NR_003285，RNA18SN5；NR_003286以及RNA28SN5；NR_003287），以消除rRNA污染物读数。剩余读数与每个人基因（UCSC RefSeq GRCh38）的最长转录物变体的有义链进行比对。3'UTR长度为至少75 nt的转录物（18,101个序列）用于子序列分析。在读数的5'端处的最多两个错配是允许的。所有多映射读数都被丢弃。长度在26到34 nt之间的片段读数被定义为核糖体印迹，并用于分析。注释来自每个足迹的5'端核苷酸，并且映射到每种转录物上。占据每个足迹的第16-18个核苷酸的核糖体A位点的位置^57、58用于推断核糖体在每个转录物上的位置。计算了每一各个转录物（18,101个序列）上的RPKM（足迹读数/千碱基的转录物/百万个映射的总读数）。仅包括在两个重复文库中编码序列的最小阈值为5 RPKM以及3'UTR区域的最小阈值为0.5 RPKM的转录物（G418中254个转录物和ACE-tRNA中495-748个转录物），用于图24A中的分析。对于图2B中的全转录组宏基因图，相对于终止密码子的第一个核苷酸，从-35到+65 nt区域内的每个核苷酸的足迹计数按照百万个映射的总读数进行标准化。所有的转录物（18,101个序列）都用于映射，并且多于5,200个转录物被映射到目的区域中的至少1个足迹。接下来，我们检查了ACE-tRNAs Glychr19.trna2和Trpchr17.trna39拯救PTC的体内生物活性。使用Galaxy平台分析测序数据⁵⁹。使用Prism 7（GraphPad软件）生成曲线。

稳定的NLuc报告细胞系的生成。使用Gibson Assembly（New England Biolabs，USA），将编码在氨基酸位置160处具有tag、taa和tga终止密码子的pNLuc的cDNA插入逆转录病毒载体pQCXIP（Clontech，USA）的多克隆位点内的AgeI和NotI限制性位点内。使用Calfectin（SignaGen Laboratories，USA），将PhoenixGP细胞（PMID：7690960）用pNLuc-STOP-pQCXIP和cmv-VSV-G（VSV-G包膜假型化）质粒共转染，并且置于33℃ CO₂受控（5%）的细胞培养箱中48小时。将含有逆转录病毒颗粒的培养基（20ml）冷却至4℃，并且以10,000g旋转以去除细胞碎片，并且通过0.45um MCE膜注射器式过滤器（Millipore，USA）过滤到用以30%汇合的低传代HEK293细胞接种的两个10cm皿上。细胞培养皿用Parafilm密封，并且以3,500g在24℃下旋转90分钟，并且置于37℃ CO₂受控（5%）的细胞培养箱中。24小时后用嘌呤霉素（1ug/ml）选择细胞，直到对照皿（无感染）显示完全的细胞死亡。使用FACS将细胞单分散到96孔板内，并且随后克隆群体。在实验期间不使用嘌呤霉素来维持选择的克隆，并且在所有研究中使用标准DMEM培养基（DMEM–达尔贝科改良伊格尔培养基-高葡萄糖，具有L-谷氨酰胺，补充有10% FBS、1% Pen/Step和2mM L-谷氨酰胺；ThermoFisher，USA）。

RNA转染。将稳定表达pNLuc-UGA的HEK293细胞以1.4 x 10⁴个细胞/孔在96孔细胞培养处理的板中的达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中铺平板，所述DMEM补充有10% FBS、1% Pen/Step和2mM L-谷氨酰胺（Thermofisher，USA）。16-24小时后，使用lipofectamine2000（ThermoFisher Scientific，USA），用ACE-tRNA转染细胞。简言之，将3μg ACE-tRNA悬浮于150μl OptiMEM中，并且将12μl的Lipofectamine 2000与150μl OptiMEM混合。将体积合并，充分混合并在RT下温育10分钟。将75ul转染复合物加入每个孔中。如上所述，定量了通过ACE-tRNA转录物的PTC抑制。

在非洲爪蟾卵母细胞中的表达。非洲爪蟾卵母细胞（V和VI期）购自Ecocyte（Austin，TX）。在注射之前，将每个ACE-tRNA团块重悬浮于2 µl ddH₂O中，并且碎片在21,000 x g、4℃下离心25分钟。为了确定ACE-tRNA对CFTR通道拯救的剂量应答，生成了用ddH₂O体积平衡的ACE-tRNA等分试样（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.562 ng/卵母细胞）的系列稀释物。在所有实验中，每个卵母细胞注射25ng CFTR cRNA，并且注射体积为50nl。ddH₂O用于无ACE-tRNA背景对照实验中。在注射后，将卵母细胞在18℃下在OR-3（50%Leibovitz培养基、250 mg/l庆大霉素、1 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES（pH 7.6））中保持36小时。

双电极电压钳（TEVC）记录。在最大CFTR活化混合物、福司可林（10µM；腺苷酸环化酶活化剂）和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（1mM；磷酸二酯酶抑制剂）的存在下，在含有（以mM计）以下的ND96浴液中记录CFTR Cl^-电流：96 NaCl、2 KCl、1 MgCl₂和5 HEPES（pH 7.5）。用3 MKCl回填的玻璃微电极具有0.5–2 MΩ的电阻。使用由pClamp 9.2软件（MolecularDevices，USA）控制的Digidata 1322A，在1 kHz处过滤数据并在10 kHz处数字化。使用OC-725C电压钳放大器（Warner Instruments，USA），使用从-60到+ 35mV的5mV电压阶跃引发CFTR电流。丢弃其中CFTR Cl^-电流反转-20mV为正的卵母细胞。Clampfit 9.2软件用于电流分析。所有值都呈现为平均值± SEM。

动物和体内成像。Nu/J小鼠购自Jackson实验室。动物实验得到在WistarInstitute的机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and UseCommittee）批准（方案编号：112762）。通过将重悬浮于30ul水中的10-20ug DNA注射到胫骨前肌内，随后为电穿孔来处理小鼠。将10ug pNano-TGA + 10ug Arg ACE-tRNA（右胫骨前肌）或10ug pNano-TGA + 10ug空pUC57（左胫骨前肌）注射到3只小鼠内。作为对照，用10ugpNano-WT（右胫骨前肌；阳性对照）或水（左胫骨前肌；阴性对照）注射另外3只小鼠。用333IU/ml的透明质酸酶（Sigma）配制DNA。DNA注射后1分钟，用CELLECTRA 3P装置（InovioPharmaceuticals）执行电穿孔。通过腹腔内注射100ul furimazine（Nano-Glo底物的40x稀释物），在小鼠中成像Nanoluciferase活性，并且在注射后5分钟，在IVIS Spectrum（PerkinElmer）上对小鼠进行成像。使用开放式滤光器成像，并且在40秒时采集图像。使用LivingImage Software（Perkin Elmer）分析图像。

表9. 就PTC抑制活性筛选的tRNA注释序列文库。每个序列的斜体文本显示了反密码子编辑的位置。粗体文本指示了具有背景5倍的抑制活性的tRNA。注意，在tRNA中，胸苷被替换为尿嘧啶。

实施例5参考文献

尽管前述说明书和实施例完全公开并实现了本发明，但它们并不预期限制本发明的范围，所述范围由与其附着的权利要求限定。

所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文。尽管在前述说明书中本发明已关于其某些实施方案进行描述，并且出于说明的目的已阐述了许多细节，但对于本领域技术人员显而易见的是，本发明易受另外实施方案的影响，并且本文描述的某些细节可以相当大地变化，而不脱离本发明的基本原理。

在描述本发明的上下文中，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“a”和“an”和“the”和类似指示物的使用应解释为覆盖单数和复数两者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语（即，意指“包括但不限于”）。除非本文另有说明，否则在本文中值范围的叙述仅仅预期充当个别地提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值均引入说明书内，如同它在本文中个别地叙述一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的次序执行。除非另有要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言（如，“例如”）的使用，仅仅预期更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围造成限制。说明书中的任何语言都不应该被解释为指示任何未请求保护的要素对于本发明的实践是必要的。

本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人已知的用于进行本发明的最佳模式。在阅读前述描述后，那些实施方案的变化对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用此类变化，并且本发明人预期本发明以不同于如本文具体描述的方式进行实践。因此，本发明包括如由适用法律所允许的对其附加的权利要求中所述主题的所有修改和等价物。此外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则上述要素以其所有可能变化的任何组合都由本发明涵盖。

Claims (25)

1.一种修饰的转移RNA（tRNA），其包含T臂、D臂、反密码子臂和受体臂，其中所述T臂包含具有与延伸因子1-α1（EF1α）相互作用的核苷酸的T茎。

2.一种修饰的转移RNA（tRNA），其由SEQ ID NO：1-538中的任何一种组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

3.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：4组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

4.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：16组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

5.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：24组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

6.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：33组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

7.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：38组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

8.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：44组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

9.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：48组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

10.权利要求2的修饰的转移RNA（tRNA），其中所述tRNA由SEQ ID NO：53组成，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

11.一种修饰的转移RNA（tRNA），其由以下中的任何一种组成：SEQ ID NO：56-60、62-66、84-86、90-111、113、128-143、147-149、153-156、161-174、176、178、181、184-186、192、196-197、199-201、205、213-240、246、255-256、258-285、299、305-312、314、318-332、335-344、346、350-354、357-360、362、365-370、372-383、388-390、392、394-401、403-407、414-416、418、422、425、428-433、437、444-445、452、455、459-463、470、472-474、476、487-492、525、530-539、545-550、553-555、561-563和567-579，其中胸苷被替换为尿嘧啶。

12.一种修饰的转移RNA（tRNA），其包含T臂、D臂、反密码子臂和受体臂，

（a）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'-UCA-3'并且识别TGA终止密码子，并且其中所述受体臂与精氨酸、色氨酸或甘氨酸可操作地连接；

（b）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'-UUA-3'并且识别TAA终止密码子，并且其中所述受体臂与谷氨酰胺或谷氨酸可操作地连接；或

（c）其中所述反密码子臂包含三核苷酸反密码子，其中所述反密码子是5'-CUA-3'并且识别TAG终止密码子，并且其中所述受体臂与色氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺可操作地连接。

13.权利要求12的修饰的tRNA，其中所述T臂包含合理的核苷酸替换，其增强或调谐与延伸因子1-α1（EF1α）的相互作用。

14.一种寡核苷酸序列，其编码权利要求1至13中任一项的修饰的tRNA，其中所述寡核苷酸具有小于150个核苷酸的总长度。

15.一种寡核苷酸，其包含第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列，其中所述第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列独立地编码权利要求1至13中任一项的修饰的tRNA，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸独立地具有小于150个核苷酸的总长度，并且其中两个序列是串联的。

16.权利要求15的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是DNA。

17.一种表达盒，其包含启动子和编码权利要求1至13中任一项的修饰的tRNA的核酸或权利要求14至16中任一项的寡核苷酸序列。

18.一种载体，其包含权利要求14至16中任一项的寡核苷酸或权利要求17的表达盒。

19.权利要求18的载体，其中所述载体是病毒载体或质粒载体。

20.一种组合物，其包含：

权利要求1至13中任一项的修饰的tRNA、权利要求14至16中任一项的寡核苷酸、或者权利要求18或19的载体，和

药学上可接受的载剂。

21.权利要求20的组合物，其中所述载剂是脂质体。

22.一种细胞，其包含权利要求18或19的载体。

23.一种治疗终止密码子相关的遗传疾病的方法，其包括将权利要求20或21的组合物施用于有此需要的患者。

24.权利要求23的方法，其中所述与提前终止密码子相关的遗传疾病是囊性纤维化、肌营养不良、β地中海贫血或利德尔氏综合症。

25.一种在细胞中恢复对包括无义突变的核苷酸序列的翻译的方法，其包括将权利要求20或21的组合物引入所述细胞中，其中修饰的tRNA恢复对包括无义突变的核苷酸序列的翻译。

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