CN116209770A - 用于调控基因组的改善的方法和组合物 - Google Patents
用于调控基因组的改善的方法和组合物Info
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Abstract
披露了用于调控靶基因组的方法和组合物。
Description
相关申请
本申请要求2020年3月4日提交的美国序列号62/985,264以及2020年6月5日提交的美国序列号63/035,674的优先权，将其中每个的全部内容通过引用并入本文。
背景
在没有专门的蛋白质来促进插入事件的情况下，目的核酸整合到基因组中的频率较低且位点特异性极低。一些现有的方法、例如CRISPR/Cas9更适合于小型编辑，并且在整合较长序列时效率较低。其他现有的方法、例如Cre/loxP需要第一步先将loxP位点插入基因组中，然后第二步将目的序列插入loxP位点中。在本领域中需要用于将目的序列插入基因组中的改进的蛋白质。
发明内容
本披露涉及用于体内或体外改变宿主细胞、组织或受试者中一个或多个位置处的基因组的新颖组合物、系统和方法。特别地，本发明的特征在于用于将外源遗传元件引入宿主基因组中的组合物、系统和方法。本披露还提供了用于改变目的基因组DNA序列的系统，例如，通过向目的序列中插入一个或多个核苷酸、使目的序列缺失一个或多个核苷酸或取代目的序列中的一个或多个核苷酸。
所述组合物或方法的特征可包括以下列举的实施例中的一个或多个。
1.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表Z1或表X中所列)和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X的元件的核酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
2.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表Z1或表X中所列)和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的核酸序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
3.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该异源对象序列编码治疗性多肽或编码哺乳动物(例如人)多肽或其片段或变体。
4.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该异源对象序列编码治疗性非编码RNA(例如，miRNA)。
5.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该异源对象序列包含调节序列(例如，启动子、增强子、内源调节组分的结合位点，例如，miRNA结合位点)，例如，其改变内源基因或非编码RNA的表达。
6.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该调节序列导致内源基因或非编码RNA的上调。
7.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该调节序列导致内源基因或非编码RNA的下调。
8.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的第二链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'靶同源结构域；
其中：
(i)该多肽包含与该靶位点中包含的序列特异性结合的异源靶向结构域(例如，在该DBD或该核酸内切酶结构域中)；和/或
(ii)该模板RNA包含与靶位点中包含的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性的异源同源序列。
9.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表Z1或表X中所列)和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
10.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11或表Z1或表X中所列)和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
11.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表Z1或表X中所列)和(ii)靶DNA结合结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X的元件的核酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
12.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表Z1或表X中所列)和(ii)靶DNA结合结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的核酸序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
13.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如，DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)来自除逆转录转座酶之外的蛋白质的逆转录酶结构域，例如来自逆转录病毒，例如如表Z1或Z2中所列的逆转录酶结构域，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；和(ii)核酸内切酶结构域和/或靶DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
14.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)来自除逆转录转座酶之外的蛋白质的逆转录酶结构域，例如来自逆转录病毒的逆转录酶结构域，例如表Z1或Z2中所列的逆转录酶结构域，或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列；和(ii)核酸内切酶结构域和/或靶DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
15.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表Z1或Z2中所列)和(ii)核酸内切酶结构域和/或靶DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)结合该多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中结合该多肽的模板RNA的序列与表10或表X的元件的序列的5’UTR或3’UTR具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
16.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表Z1或Z2中所列)和(ii)核酸内切酶结构域和/或靶DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)结合该多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中结合该多肽的模板RNA的序列与以下具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性：(i)相对于表10或表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的起始密码子位于5'的核苷酸，或(ii)相对于表10或表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的终止密码子位于3'的核苷酸。
17.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表Z1或Z2或表X中所列)和(ii)核酸内切酶结构域和/或靶DNA结合结构域；
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)结合该多肽的序列和(ii)异源对象序列，并且
(c)内含肽。
18.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含该内含肽。
19.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该内含肽是分裂型内含肽。
20.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列(例如CRISPR间隔子)，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域。
21.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域，
其中该RT结构域具有表3B、表10、表11或表X的氨基酸序列，或与其具有与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
22.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(etRNA)(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域，
其中该系统能够在该靶位点中产生至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸插入。
23.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域，
其中该异源对象序列长度是至少74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、120、140、160、180、200、500、或1,000nt。
24.如前述实施例中任一项所述的系统，其中一项或多项：该RT结构域与该DBD异源；该DBD与该核酸内切酶结构域异源；或该RT结构域与该核酸内切酶结构域异源。
25.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域，
其中该系统能够在靶位点中产生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个核苷酸缺失。
26.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域，
其中(a)(ii)和/或(a)(iii)包含TALE分子；锌指分子；或选自表1的CRISPR/Cas分子或其功能变体(例如，突变体)。
27.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列(例如CRISPR间隔子)，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域，
其中该核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域，切割该靶位点DNA的两条链，并且其中这些切割彼此分开至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30个核苷酸。
28.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)特异性结合该RT结构域的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域。
29.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA进一步包含结合(a)(ii)和/或(a)(iii)的序列。
30.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)第一多肽或编码该第一多肽的核酸，其中该第一多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域和(ii)任选地，DNA结合结构域，
(b)第二多肽或编码该第二多肽的核酸，其中该第二多肽包含(i)DNA结合结构域(DBD)；(ii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(c)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合该第二多肽(例如，结合(b)(i)和/或(b)(ii))的序列，(ii)任选地，结合该第一多肽(例如，特异性结合该RT结构域)的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域。
31.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，和(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；
(b)第一模板RNA(或编码该RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)结合该多肽(例如，结合(a)(ii)和/或(a)(iii))的序列和(ii)结合靶位点(例如，靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(例如，其中该第一RNA包含gRNA)；
(c)第二模板RNA(或编码该RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合该多肽(例如，特异性结合该RT结构域)的序列，(ii)异源对象序列，和(iii)3'同源结构域。
32.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该第二模板RNA包含(i)。
33.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该第一模板RNA包含第一缀合结构域并且该第二模板RNA包含第二缀合结构域。
34.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该第一和第二缀合结构域能够例如在严格条件下彼此杂交。
35.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该第一缀合结构域和该第二缀合结构域的相关联使该第一模板RNA和该第二模板RNA共定位。
36.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含(i)。
37.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含(ii)。
38.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含(i)和(ii)。
39.一种用于修饰DNA的系统，其包含：
(a)第一多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含逆转录酶(RT)结构域，其中该RT结构域具有表3B、表10、表11或表X的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和任选地，DNA结合结构域(DBD)(例如，第一DBD)；并且(b)第二多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)DBD(例如，第二DBD)；和(ii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域。
40.如前述实施例中任一项所述的系统，其中编码该第一多肽的核酸和编码该第二多肽的核酸是两个分开的核酸。
41.如前述实施例中任一项所述的系统，其中编码该第一多肽的核酸和编码该第二多肽的核酸是相同核酸分子的一部分，例如，存在于相同载体上。
42.如前述实施例中任一项所述的系统，其具有以下特征中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6或全部)：
i.所述异源对象序列编码蛋白质，例如酶(例如，溶酶体酶)或血液因子(例如，因子I、II、V、VII、X、XI、XII或XIII)；
ii.所述异源对象序列包含组织特异性启动子或增强子；
iii.该异源对象序列编码大于50、100、150、200、250、300、400、500或1,000个氨基酸，并且任选地多达7,500个氨基酸的多肽；
iv.所述异源对象序列编码哺乳动物基因的片段，但不编码完整的哺乳动物基因，例如，编码一个或多个外显子，但不编码全长蛋白质；
v.所述异源对象序列编码一个或多个内含子；
vi.该异源对象序列不同于GFP，例如，不同于荧光蛋白或不同于报道蛋白；或
vii.该异源对象序列仅包含非编码序列，例如调节元件。
43.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，其具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列。
44.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，其具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列。
45.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，其具有表3B、表10、表11或表X的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
46.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，其具有表3B、表10、表11或表X中的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列。
47.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽在37℃的活性不小于其在25℃在其他类似条件下的活性的70％、75％、80％、85％、90％、或95％。
48.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽来源于恒温生物，例如鸟类或哺乳动物。
49.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽源自以下中的一个或多个：CRE逆转录转座酶、NeSL逆转录转座酶、R4逆转录转座酶、R2逆转录转座酶、Hero逆转录转座酶、L1逆转录转座酶、RTE逆转录转座酶、I逆转录转座酶、Jockey逆转录转座酶、CR1逆转录转座酶、Rex1逆转录转座酶、RandI/Dualen逆转录转座酶、Penelope或Penelope样逆转录转座酶、Tx1逆转录转座酶、RTEX逆转录转座酶、Crack逆转录转座酶、Nimb逆转录转座酶、Proto1逆转录转座酶、Proto2逆转录转座酶、RTETP逆转录转座酶、L2逆转录转座酶、Tad1逆转录转座酶、Loa逆转录转座酶、Ingi逆转录转座酶、Outcast逆转录转座酶、R1逆转录转座酶、Daphne逆转录转座酶、L2A逆转录转座酶、L2B逆转录转座酶、Ambal逆转录转座酶、Vingi逆转录转座酶和/或Kiri逆转录转座酶。
50.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含来自转座元件的核酸内切酶结构域，例如限制酶样核酸内切酶(RLE)、无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶样核酸内切酶(APE)、GIY-YIG核酸内切酶。
51.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶结构域是完整的。
52.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶结构域是失活的。
53.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶对DNA切口。
54.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶产生双链断裂。
55.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含表3A或表3B或表10的序列(例如，表3A或表3B的第6列的5’非翻译区和表3A或3B的第7列的3’非翻译区中的一者或两者)，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
56.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含表3A或3B或11的序列(例如，表3A或3B的第6列的5'非翻译区和表3A或3B第7列的3'非翻译区中的一者或两者)，或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列。
57.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该系统具有以下特征中的一个或多个(例如，1、2、3或所有)：
i.编码所述多肽和所述模板RNA的核酸或编码所述模板RNA的核酸是分开的核酸；
ii.所述模板RNA不编码活性逆转录酶，例如，如实例1-2中所述包含失活的突变逆转录酶，或不包含逆转录酶序列；
iii.所述模板RNA不编码活性核酸内切酶，例如包含失活的核酸内切酶或不包含核酸内切酶；或
iv.所述模板RNA包含一个或多个化学修饰。
58.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)包含(i)结合该多肽的5’UTR序列，(ii)结合该多肽的3’UTR序列，(iii)异源对象序列，和(iv)与该异源对象序列可操作地连接的启动子，
其中所述启动子位于结合所述多肽的5'非翻译序列与所述异源序列之间，或
其中所述启动子位于结合所述多肽的3'非翻译序列与所述异源序列之间。
59.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)包含(i)结合该多肽的5’UTR序列，(ii)结合该多肽的3’UTR序列，以及(iii)异源对象序列，并且
其中所述异源对象序列包含在所述模板RNA上以5'至3'取向的开放阅读框(或其反向互补序列)；或
其中所述异源对象序列包含在所述模板RNA上3'至5'取向的开放阅读框(或其反向互补序列)。
60.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的5’UTR序列与表3B、表10或表X的元件的序列的5’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
61.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的5’UTR序列与相对于表3B、表10或表X的元件的序列(例如，包含逆转录转座酶结合区)的起始密码子位于5’的核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
62.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的5’UTR序列与表3B、表10或表X的元件的序列的5’UTR序列具有实质性结构相似性(例如，实质性二级结构相似性)。
63.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的5’UTR序列与表3A或表3B或表10的第6列的5’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
64.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的3’UTR序列与表3B、表10或表X的元件的序列的3’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
65.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的3’UTR序列与表3B、表10或表X的元件的序列的3’UTR序列具有实质性结构相似性(例如，实质性二级结构相似性)。
66.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的3’UTR序列与表10或表3A或表3B的第7列的3’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
67.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的3’UTR序列与相对于表3B、表10或表X的元件的序列(例如，包含逆转录转座酶结合区)的终止密码子位于3’的核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
68.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)的3’UTR的侧翼是同源结构域，例如如本文所述的同源结构域，例如具有与靶DNA链具有至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或100％)同一性的至少5、10、20、50或100个碱基的同源结构域，其中任选地，该同源结构域包含根据表11的3’同源臂的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
69.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该5’UTR的侧翼是同源结构域，例如如本文所述的同源结构域，例如具有与靶DNA链具有至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或100％)同一性的至少10、20、50或100个碱基的同源结构域，其中任选地，该同源结构域包含根据表11的5’同源臂的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
70.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该逆转录酶结构域、该核酸内切酶结构域或该靶DNA结合结构域中的至少一个是异源的，例如，相对于其他结构域而言是异源的。
71.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶结构域相对于该逆转录酶结构域和/或该靶DNA结合结构域是异源的。
72.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE)型非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列和(ii)与APE型非LTR逆转录转座子的核酸内切酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列。
73.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与Penelope样元件(PLE)型逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列和(ii)与PLE型逆转录转座子的核酸内切酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，例如，其中该PLE型逆转录转座子包含GIY-YIG核酸内切酶。
74.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该PLE型逆转录转座子不包含功能性核酸内切酶结构域。
75.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该PLE型逆转录转座酶包含天然缺乏核酸内切酶结构域的Penelope样元件(例如，Athena元件，例如，如Gladyshev和ArkhipovaPNAS 104,9352-9357(2007)中所述)。
76.如前述实施例中任一项所述的系统，其中缺少功能性核酸内切酶结构域的PLE型逆转录转座酶与Cas9融合，例如，其中与Cas9融合的PLE型逆转录转座酶具有DBD和/或核酸内切酶(例如切口酶)功能。
77.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与限制酶样核酸内切酶(RLE)型非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，(ii)与RLE型非LTR逆转录转座子的核酸内切酶结构域具有至少80％同一性(例如，85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，和(iii)与(i)和/或(ii)异源的靶DNA结合结构域(例如，异源锌指DNA结合结构域)。
78.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与限制酶样核酸内切酶(RLE)型非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，和(ii)异源核酸内切酶结构域和/或异源DNA结合结构域。
79.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE)型非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，(ii)与APE型非LTR逆转录转座子的核酸内切酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，和(iii)与(i)和/或(ii)异源的靶DNA结合结构域(例如，异源锌指DNA结合结构域)。
80.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE)型非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，和(ii)异源核酸内切酶结构域和/或异源DNA结合结构域。
81.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与Penelope样元件(PLE)型逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，(ii)与PLE型逆转录转座子的核酸内切酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，和(iii)与(i)和/或(ii)异源的靶DNA结合结构域(例如，异源锌指DNA结合结构域)。
82.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含(i)与Penelope样元件(PLE)型逆转录转座子的逆转录酶结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列，和(ii)异源核酸内切酶结构域和/或异源DNA结合结构域。
83.如前述实施例中任一项所述的系统，其中所述模板RNA包含(iii)可操作地连接至异源对象序列的启动子。
84.如前述实施例中任一项所述的系统，其中所述多肽进一步包含(iii)DNA结合结构域。
85.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该DNA结合结构域具有核酸内切酶活性。
86.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶结构域或核酸内切酶活性在DNA中形成双链断裂。
87.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶结构域或核酸内切酶活性对DNA切口。
88.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含与表3A或表3B的第7列中的序列具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列。
89.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含与表10、表11或表X中列出的元件的序列具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的序列。
90.如前述实施例中任一项所述的系统，其中编码所述多肽和所述模板RNA的核酸或编码所述模板RNA的核酸是共价连接的，例如是融合核酸的一部分。
91.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该融合核酸包含RNA。
92.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该融合核酸包含DNA。
93.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(b)包含模板RNA。
94.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA进一步包含核定位信号。
95.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)包含编码所述多肽的RNA。
96.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)的RNA和(b)的RNA是分开的RNA分子。
97.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)的RNA和(b)的RNA以100:1至10:1、10:1至5:1、5:1至2:1、2:1至1:1、1:1至1:2、1:2至1:5、1:5至1:10或1:10至1:100的比率存在。
98.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)的RNA不包含核定位信号。
99.如前述实施例中任一项所述的系统，其中所述多肽进一步包含核定位信号和/或核仁定位信号。
100.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)包含编码以下的RNA：(i)所述多肽和(ii)核定位信号和/或核仁定位信号。
101.如前述实施例中任一项所述的系统，其中所述RNA包含假结序列，例如异源对象序列的5’。
102.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该RNA包含假结序列的5’的茎环序列或螺旋。
103.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该RNA包含假结序列的3'，例如假结序列的3'和异源对象序列的5'的一个或多个(例如2、3或更多个)茎环序列或螺旋。
104.如前述实施例中任一项所述的系统，其中包含该假结的模板RNA具有催化活性，例如，RNA切割活性，例如，顺式-RNA切割活性。
105.如前述实施例中任一项所述的系统，其中所述RNA包含例如所述异源对象序列的3’的至少一个茎环序列或螺旋，例如1、2、3、4、5或更多个茎环序列、发夹或螺旋序列。
106.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该逆转录酶结构域具有图10中所列元件的逆转录酶结构域的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
107.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶结构域具有图10中列出的元件的核酸内切酶结构域的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
108.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该逆转录酶结构域具有如本文提供的R2NS-1_CSi、R4-1_PH、RTE-1_MD、L2-18_ACar、L2-2_DRe、Dong-1_MMa、CR1_AC_1、Vingi-1_Acar、SR2、R4-1_AC、DongAa、CR1-1_PH、RTE-2_LMi、CR1-10_AMi、RTE-2_OL、L1-1_Cho、BovB、Line1-2_ZM、RTE-1_Aip、CR1-3_IS、CR1-54_AAe、Tad1-65B_BG、TART-1_DWi或RTE_Ele2的逆转录酶结构域的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
109.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酸内切酶结构域具有如本文提供的R2NS-1_CSi、R4-1_PH、RTE-1_MD、L2-18_ACar、L2-2_DRe、Dong-1_MMa、CR1_AC_1、Vingi-1_Acar、SR2、R4-1_AC、DongAa、CR1-1_PH、RTE-2_LMi、CR1-10_AMi、RTE-2_OL、L1-1_Cho、BovB、Line1-2_ZM、RTE-1_Aip、CR1-3_IS、CR1-54_AAe、Tad1-65B_BG、TART-1_DWi或RTE_Ele2的核酸内切酶结构域的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
110.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽具有如本文提供的R2NS-1_CSi、R4-1_PH、RTE-1_MD、L2-18_ACar、L2-2_DRe、Dong-1_MMa、CR1_AC_1、Vingi-1_Acar、SR2、R4-1_AC、DongAa、CR1-1_PH、RTE-2_LMi、CR1-10_AMi、RTE-2_OL、L1-1_Cho、BovB、Line1-2_ZM、RTE-1_Aip、CR1-3_IS、CR1-54_AAe、Tad1-65B_BG、TART-1_DWi或RTE_Ele2的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
111.如前述实施例中任一项所述的系统，其中结合该多肽的该模板RNA的序列与如本文提供的5’UTR或R2NS-1_CSi、R4-1_PH、RTE-1_MD、L2-18_ACar、L2-2_DRe、Dong-1_MMa、CR1_AC_1、Vingi-1_Acar、SR2、R4-1_AC、DongAa、CR1-1_PH、RTE-2_LMi、CR1-10_AMi、RTE-2_OL、L1-1_Cho、BovB、Line1-2_ZM、RTE-1_Aip、CR1-3_IS、CR1-54_AAe、Tad1-65B_BG、TART-1_DWi或RTE_Ele2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
112.如前述实施例中任一项所述的系统，其中结合该多肽的该模板RNA的序列与如本文提供的3’UTR或R2NS-1_CSi、R4-1_PH、RTE-1_MD、L2-18_ACar、L2-2_DRe、Dong-1_MMa、CR1_AC_1、Vingi-1_Acar、SR2、R4-1_AC、DongAa、CR1-1_PH、RTE-2_LMi、CR1-10_AMi、RTE-2_OL、L1-1_Cho、BovB、Line1-2_ZM、RTE-1_Aip、CR1-3_IS、CR1-54_AAe、Tad1-65B_BG、TART-1_DWi或RTE_Ele2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
113.如前述实施例中任一项所述的系统，其中编码该多肽的核酸包含经密码子优化以在人细胞中表达的编码序列。
114.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含经密码子优化以在人细胞中表达的编码序列。
115.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该系统包含一个或多个环状RNA分子(circRNA)。
116.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该circRNA编码GeneWriter多肽。
117.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该circRNA包含模板RNA。
118.如前述实施例中任一项所述的系统，其中将circRNA递送至宿主细胞。
119.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该circRNA能够例如在宿主细胞中，例如在该宿主细胞的细胞核中被线性化。
120.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该circRNA包含切割位点。
121.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该circRNA进一步包含第二切割位点。
122.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该切割位点可被核酶，例如包含在该circRNA中的核酶切割(例如，通过自切割)。
123.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该circRNA包含核酶序列。
124.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶序列能够例如在宿主细胞中，例如在该宿主细胞的细胞核中自切割。
125.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶是诱导型核酶。
126.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶是蛋白反应性核酶，例如对核蛋白，例如基因组相互作用蛋白，例如表观遗传修饰物，例如EZH2有反应的核酶。
127.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶是核酸反应性核酶。
128.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶的催化活性(例如，自催化活性)在靶核酸分子(例如，RNA分子，例如，mRNA、miRNA、ncRNA、lncRNA、tRNA、snRNA、或mtRNA)存在下被激活。
129.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶对靶蛋白(例如MS2外壳蛋白)有反应。
130.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该靶蛋白定位于细胞质或定位于细胞核(例如，表观遗传修饰物或转录因子)。
131.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶包含B2或ALU逆转录转座子的核酶序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列。
132.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶包含烟草环斑病毒锤头状核酶的序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列。
133.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶包含丁型肝炎病毒(HDV)核酶的序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的核酸序列。
134.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶被在靶细胞或靶组织中表达的部分激活。
135.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶被在靶亚细胞区室(例如，细胞核、核仁、细胞质或线粒体)中表达的部分激活。
136.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核酶包含在环状RNA或线性RNA中。
137.一种系统，其包含编码Gene Writing系统的多肽的第一环状RNA；并且
包含基因Gene Writing系统的模板RNA的第二环状RNA。
138.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA，例如5’UTR，包含切割该模板RNA(例如，在5’UTR中)的核酶。
139.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含与(a)(i)(逆转录酶结构域)、(a)(ii)(核酸内切酶结构域)、(b)(i)(结合该多肽的模板RNA序列)或其组合异源的核酶。
140.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该异源核酶能够切割包含该核酶的RNA，例如在核酶的5'、核酶的3'或核酶内切割。
141.一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含如前述实施例中任一项所述的系统、多肽(或编码其的RNA)、核酸分子或编码该系统或多肽的DNA。
142.一种系统，其包含第一脂质纳米颗粒，该第一脂质纳米颗粒包含GeneWriting系统(例如，如本文所述)的多肽(或编码其的DNA或RNA)；并且
第二脂质纳米颗粒，该第二脂质纳米颗粒包含Gene Writing系统(例如，如本文所述)的核酸分子。
143.如前述实施例中任一项所述的系统或多肽，其中该系统、核酸分子、多肽和/或编码其的DNA被配制为脂质纳米颗粒(LNP)。
144.如前述实施例中任一项所述的LNP，其包含阳离子脂质。
145.如前述实施例中任一项所述的LNP，其中该阳离子脂质具有以下结构：
146.如前述实施例中任一项所述的LNP，其进一步包含一种或多种中性脂质，例如DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM，类固醇，例如胆固醇，和/或一种或多种聚合物缀合的脂质，例如聚乙二醇化脂质，例如PEG-DAG、PEG-PE、PEG-S-DAG、PEG-cer或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯。
147.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该系统、多肽和/或编码它们的DNA被配制为脂质纳米颗粒(LNP)。
148.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒(或包含多个脂质纳米颗粒的配制品)缺乏反应性杂质(例如醛)，或包含低于预选水平的反应性杂质(例如醛)。
149.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒(或包含多个该脂质纳米颗粒的配制品)缺乏醛，或包含低于预选水平的醛。
150.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒包含在包含多个这些脂质纳米颗粒的配制品中。
151.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品是使用一种或多种脂质试剂产生的，这些脂质试剂包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％总反应性杂质(例如，醛)含量。
152.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品是使用一种或多种脂质试剂产生的，些脂质试剂包含小于3％总反应性杂质(例如，醛)含量。
153.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品是使用一种或多种脂质试剂产生的，些脂质试剂包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％的任何单一反应性杂质(例如，醛)种类。
154.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品使用一种或多种脂质试剂产生，该一种或多种脂质试剂包含小于0.3％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
155.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品使用一种或多种脂质试剂产生，该一种或多种脂质试剂包含小于0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
156.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％总反应性杂质(例如，醛)含量。
157.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品包含小于3％的总反应性杂质(例如醛)含量。
158.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％的任何单一反应性杂质(例如，醛)种类。
159.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品包含小于0.3％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
160.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中该脂质纳米颗粒配制品包含小于0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
161.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中用于如本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％的总反应性杂质(例如醛)含量。
162.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中用于如本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含小于3％的总反应性杂质(例如醛)含量。
163.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中用于如本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
164.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中用于如本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含小于0.3％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
165.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中用于如本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含小于0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
166.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中总醛含量和/或任何单一反应性杂质(例如醛)种类的量通过液相色谱法(LC)，例如与串联质谱法(MS/MS)联用，例如根据实例7中所述的方法来测定。
167.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中总醛含量和/或反应性杂质(例如醛)种类的量通过检测与例如脂质试剂中反应性杂质(例如醛)的存在相关的核酸分子(例如，如本文所述)的一个或多个化学修饰来测定。
168.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中总醛含量和/或醛种类的量通过检测与例如这些脂质试剂中反应性杂质(例如醛)的存在相关的核苷酸或核苷(例如，核糖核苷酸或核糖核苷，例如包含在核酸分子中或从核酸分子分离，例如，如本文所述)的一个或多个化学修饰来测定，例如，如实例8中所述。
169.如前述实施例中任一项所述的系统、试剂盒或多肽，其中核酸分子、核苷酸或核苷的化学修饰通过测定一个或多个修饰的核苷酸或核苷的存在来检测，例如使用LC-MS/MS分析，例如，如实例8中所述。
170.任何前述编号的系统，其中该多肽包含至少50个氨基酸(例如，至少100，150，200，300，500个氨基酸)的序列，该序列与由表10、表11或表X的元件编码的多肽或其逆转录酶结构域或其核酸内切酶结构域的序列具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)。
171.任何前述编号的系统，其中该多肽包含至少50个氨基酸(例如，至少100、150、200、300、500个氨基酸)的序列，该序列与由表10、表11或表X的元件的序列编码的多肽或其逆转录酶结构域或核酸内切酶结构域的序列具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸差异。
172.任何前述编号的系统，其中该多肽包含至少50个氨基酸(例如，至少100、150、200、300、500个氨基酸)的序列，该序列与表3A或3B中所列多肽或其逆转录酶结构域、核酸内切酶结构域或DNA结合结构域的序列具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)。
173.任何前述编号的系统，其中该多肽包含至少50个氨基酸(例如，至少100、150、200、300、500个氨基酸)的序列，该序列与表3A或表3B中列出的多肽或其逆转录酶结构域、核酸内切酶结构域或DNA结合结构域的序列具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸差异。
174.任何前述编号的系统，其中该多肽包含至少50个氨基酸(例如，至少100、150、200、300、500个氨基酸)的序列，该序列与表3A或3B的第7列的氨基酸序列或其逆转录酶结构域、核酸内切酶结构域或DNA结合结构域具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)。
175.任何前述编号的系统，其中该多肽包含至少50个氨基酸(例如，至少100、150、200、300、500个氨基酸)的序列，该序列与表3A或3B的第7列的氨基酸序列或其逆转录酶结构域、核酸内切酶结构域或DNA结合结构域具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸差异。
176.任何前述编号的系统，其中该模板RNA包含表10或表X的元件的序列(例如，表X或表10的5’UTR和表X或表10的3’UTR中的一者或两者)，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
177.任何前述编号的系统，其中该模板RNA包含表10或表X的元件的序列(例如，表X或10的5’UTR和表X或10的3’UTR中的一者或两者)，或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列。
178.任何前述编号的系统，其中该模板RNA包含表3A或表3B的序列(例如，表3A或3B的第5列的5’UTR和表3A或3B的第6列的3’UTR中的一者或两者)，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
179.任何前述编号的系统，其中该模板RNA包含表3A或3B的序列(例如，表3A或3B的第5列的5’UTR和表3A或3B的第6列的3’UTR中的一者或两者)，或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列。
180.任何前述编号的系统，其中该模板RNA包含与以下具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列：(i)相对于表10或表X的元件的序列的起始密码子位于5'的核苷酸(例如，包含逆转录转座酶结合区)。
181.任何前述编号的系统，其中该模板RNA包含与以下具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列：(i)相对于表10或表X的元件的序列的终止密码子位于3'的核苷酸(例如，包含逆转录转座酶结合区)。
182.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含来自表10或11的3’UTR或表3A或3B的第6列的约100-125bp的序列，例如，其中该序列包含表3A或3B的第6列的3’UTR的核苷酸1-100、101-200或201-325，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
183.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA包含来自表10或11或表3A或3B第6列的3’UTR的约100-125bp的序列，例如，其中该序列包含表3A或3B的第6列的3’UTR的核苷酸1-100、101-200或201-325或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列。
184.任何以上编号的系统，其中(a)包含RNA，并且(b)包含RNA。
185.任何前述编号的系统，其仅包含RNA，或其包含的RNA多于DNA，RNA:DNA比率是至少为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
186.任何以上编号的系统，其不包含DNA或按质量或摩尔量计不包含超过10％、5％、4％、3％、2％或1％的DNA。
187.任何上述编号的系统，其能够通过插入所述异源对象序列来修饰DNA，而无需进行(b)的依赖于介入的DNA的RNA聚合。
188.任何前述编号的系统，其能够通过靶标引发的逆转录插入该异源对象序列来修饰DNA。
189.任何上述编号的系统，其能够在存在DNA修复途径抑制剂(例如SCR7，一种PARP抑制剂)的情况下，或在缺乏DNA修复途径的细胞系(例如，缺乏核苷酸切除修复途径或同源性指导的修复途径的细胞系)中通过插入异源对象序列来修饰DNA。
190.任何以上编号的系统，其不会引起在靶细胞中形成可检测水平的双链断裂。
191.任何以上编号的系统，其能够利用逆转录酶活性并任选地在没有同源重组活性的情况下修饰DNA。
192.任何前述编号的系统，其中该模板RNA已经被处理以减少二级结构，例如，加热至例如减少二级结构的温度，例如加热至至少70、75、80、85、90或95℃。
193.如前述实施例中任一项所述的系统，其中随后将该模板RNA冷却至例如允许二级结构的温度，例如至小于或等于37、30、25或20℃。
194.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)在该模板RNA的5’末端包含具有与靶DNA链具有100％同一性的至少5个或至少10个碱基的第一同源结构域，和在该模板RNA的3’末端包含具有与靶DNA链具有100％同一性的至少5个或至少10个碱基的第二同源结构域。
195.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)和(b)是同一核酸的一部分。
196.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)和(b)是分开的核酸。
197.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA在该模板RNA的5’末端包含与靶DNA链(例如，其中该靶DNA链是人DNA序列)具有100％同一性的至少5个或至少10个碱基。
198.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA在该模板RNA的3’末端包含与靶DNA链(例如，其中所述靶DNA链是人DNA序列)具有100％同一性的至少5个或至少10个碱基。
199.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含活性RNA酶H结构域。
200.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽不包含活性RNA酶H结构域。
201.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽的内源RNA酶H结构域被灭活。
202.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该转座酶多肽包含使核仁定位信号失活和/或缺失的突变。
203.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽不包含功能性核仁定位信号，例如，不包含核仁定位信号。
204.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该核仁定位信号的活性降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％。
205.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽包含核定位信号(NLS)，例如内源NLS或外源NLS。
206.如前述实施例中任一项所述的系统，其中：
该多肽包含(i)第一靶DNA结合结构域，例如，包含第一锌指结构域，(ii)逆转录酶结构域，(iii)核酸内切酶结构域，和(iv)第二靶DNA结合结构域，例如，包含与该第一靶DNA结合结构域异源的第二锌指结构域；并且
其中(a)在靶细胞中与跟仅包含该第一靶DNA结合结构域的类似多肽相比更少数量的靶DNA序列结合，例如，其中该第二靶DNA结合结构域在具有该第一DNA结合结构域的多肽中的存在相对于仅包含该第一靶DNA结合结构域的多肽的多肽靶序列特异性改进了多肽的靶序列特异性。
207.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(iii)包括(iv)。
208.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该第二靶DNA结合结构域与距该第一靶DNA结合结构域结合的基因组序列小于100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个核苷酸的基因组DNA序列结合。
209.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该第二靶DNA结合域与距该第一靶DNA结合结构域结合的基因组序列1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-5、5-100、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-100、40-90、40-80、40-70、40-60、40-50、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-100、60-90、60-80、60-70、70-100、70-90、70-80、80-100、80-90、或90-100个核苷酸的基因组DNA序列结合。
210.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该第一或第二靶DNA结合结构域包含CRISPR/Cas蛋白、TAL效应子结构域、锌指结构域或大范围核酸酶结构域。
211.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该系统能够切割该靶DNA的该第一链至少两次(例如两次)，并且
任选地，其中这些切割彼此距离至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或200个核苷酸(并且任选地彼此距离不超过500、400、300、200、或100个核苷酸)。
212.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该系统能够切割该靶DNA的该第一链和该第二链，并且
其中切割之间的距离与逆转录酶结构域(例如，当位于其内源多肽中时的逆转录酶结构域)所产生的切割之间的距离相同。
213.如前述实施例中任一项所述的系统，其中这些切割彼此距离1-500、1-400、1-300、1-200、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-5、5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、30-500、30-400、30-300、30-200、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-500、40-400、40-300、40-200、40-100、40-90、40-80、40-70、40-60、40-50、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-500、60-400、60-300、60-200、60-100、60-90、60-80、60-70、70-500、70-400、70-300、70-200、70-100、70-90、70-80、80-500、80-400、80-300、80-200、80-100、80-90、90-500、90-400、90-300、90-200、90-100、100-500、100-400、100-300、100-200、200-500、200-400、200-300、300-500、300-400、或400-500个核苷酸。
214.如前述实施例中任一项所述的系统，其中这些切割之间的距离与逆转录酶结构域，例如，当位于其内源多肽中时的逆转录酶结构域所产生的切割之间的距离相同。
215.如前述实施例中任一项所述的系统，其中这两个切割均由相同的核酸内切酶结构域(例如，CRISPR/Cas蛋白，例如，由例如位于该模板RNA中的多个gRNA指导)产生。
216.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该多肽进一步包含第二核酸内切酶结构域。
217.如前述实施例中任一项所述的系统，其中：
i)该第一核酸内切酶结构域(例如，切口酶)切割靶DNA的待编辑链，并且该第二核酸内切酶结构域(例如，切口酶)切割靶DNA的未编辑链，或
ii)该第一核酸内切酶结构域(例如，切口酶)对靶DNA的待编辑链进行两次切割，并且该第二核酸内切酶结构域(例如，切口酶)对该靶DNA的待编辑链进行另一次切割。
218.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)、(b)或(a)和(b)进一步包含可操作地连接到编码该多肽、该异源对象序列(例如，包含在该异源对象序列中的编码序列)或两者的序列的5’UTR和/或3’UTR。
219.如前述实施例中任一项所述的系统，其中相对于包含与该异源对象序列相关联的一个或多个内源UTR或最小5’UTR和最小3’UTR的在其他方面相似的核酸而言，该5’UTR和/或3’UTR使可操作地连接的一个或多个序列的表达增加至少10％、20％、30％、40％、50％、70％、70％、80％、90％、或100％。
220.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)包含(i)与该多肽结合的序列，(ii)异源对象序列，和(iii)对于(a)(i)、(a)(ii)、(b)(i)、或其组合是异源的核酶。
221.如前述实施例中任一项所述的系统，其中(a)、(b)或(a)和(b)包含增加该多肽、该异源对象序列(例如，位于该异源对象序列中的编码序列)或两者表达的内含子。
222.一种宿主细胞(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)，其包含任何前述编号的系统。
223.一种修饰细胞、组织或受试者中的靶DNA链的方法，所述方法包括对所述细胞、组织或受试者施用任何前述编号的系统，其中所述系统将所述模板RNA序列逆转录成所述靶DNA链，从而修饰所述靶DNA链。
224.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该细胞、组织或受试者是哺乳动物(例如人)细胞、组织或受试者。
225.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该组织是肝、肺、皮肤、血液、免疫或肌肉组织。
226.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
227.如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
228.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该细胞不是永生化的。
229.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)、和/或(iii)中的一个、两个或三个具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
230.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)和/或(iii)中的一个、两个或三个具有由与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
231.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)、和/或(iii)中的一个、两个或三个具有表3B、表10、表11或表X的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
232.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)和/或(iii)中的一个、两个或三个具有表3B、表10、表11或表X的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
233.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)结合该多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中结合该多肽的该模板RNA的序列与表3B、表10或表X的元件的序列的5’UTR序列或3’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
234.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)结合该多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中结合该多肽的模板RNA的序列与以下具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性：(i)相对于表3B、表10或表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的起始密码子位于5'的核苷酸，或(ii)相对于表3B、表10或表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的终止密码子位于3'的核苷酸。
235.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如，DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)来自除逆转录转座酶之外的蛋白质的逆转录酶结构域，例如来自逆转录病毒，例如如表Z1或Z2中所列的逆转录酶结构域，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；和(ii)核酸内切酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
236.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)来自除逆转录转座酶之外的蛋白质的逆转录酶结构域，例如来自逆转录病毒的逆转录酶结构域，例如表Z1或Z2中所列的逆转录酶结构域，或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列；和(ii)核酸内切酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
237.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)结合该多肽的序列和(ii)异源对象序列，并且
(c)内含肽。
238.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽包含该内含肽。
239.如前述实施例中任一项所述的系统，其中该内含肽是分裂型内含肽。
240.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽不包含靶DNA结合结构域。
241.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽衍生自APE型逆转录转座子逆转录酶。
242.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，其具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列。
243.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列。
244.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，其具有表3B、表10、表11或表X的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
245.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽进一步包含靶DNA结合结构域，例如，具有表3B、表10、表11或表X中的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列。
246.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)编码多肽的RNA，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)、和/或(iii)中的一个、两个或三个具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA，其包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法不包括使所述哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA。
247.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)编码多肽的RNA，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)和/或(iii)中的一个、两个或三个具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA，其包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法不包括使所述哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA。
248.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)编码多肽的RNA，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)、和/或(iii)中的一个、两个或三个具有表3B、表10、表11或表X的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；并且
(b)模板RNA，其包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法不包括使所述哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA。
249.一种修饰哺乳动物细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)编码多肽的RNA，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)和/或(iii)中的一个、两个或三个具有表3B、表10、表11或表X的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA，其包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法不包括使所述哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA。
250.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致向该哺乳动物细胞的基因组添加外源DNA序列的至少1，5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000或5,000个碱基对。
251.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致来自该哺乳动物细胞的基因组的DNA序列至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、或5,000个碱基对的缺失。
252.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致来自该哺乳动物细胞的基因组的DNA序列至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、或5,000个碱基对的改变。
253.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致向该哺乳动物细胞的基因组添加蛋白质编码序列。
254.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致该哺乳动物细胞的基因组的蛋白质编码序列的缺失。
255.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致该哺乳动物细胞的基因组的蛋白质编码序列的改变。
256.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致向该哺乳动物细胞的基因组添加非编码序列，例如，编码非编码RNA，例如miRNA。
257.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致该哺乳动物细胞的基因组的非编码序列(例如，编码非编码RNA，例如miRNA)的缺失。
258.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致该哺乳动物细胞的基因组的非编码序列(例如，编码非编码RNA，例如miRNA)的改变。
259.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致向该哺乳动物细胞的基因组添加调节序列，例如启动子、增强子、miRNA结合位点。
260.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致该哺乳动物细胞的基因组的调节序列(例如启动子、增强子、miRNA结合位点)的缺失。
261.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致该哺乳动物细胞的基因组的调节序列(例如启动子、增强子、miRNA结合位点)的改变。
262.如前述实施例中任一项所述的方法，其中对该哺乳动物细胞的基因组中调节序列的添加、缺失或改变导致该哺乳动物细胞的基因组中编码或非编码序列的表达增加。
263.如前述实施例中任一项所述的方法，其中对该哺乳动物细胞的基因组中调节序列的添加、缺失或改变导致该哺乳动物细胞的基因组中编码或非编码序列的表达降低。
264.一种将DNA插入哺乳动物细胞的基因组中的方法，该方法包括使该细胞与RNA组合物接触，其中该RNA组合物包含：
(a)指导模板RNA插入基因组的第一RNA，和
(b)包含异源序列的模板RNA，
其中该方法不包括使该哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA，
其中该方法导致向该哺乳动物细胞的基因组添加DNA(例如外源DNA)序列的至少1、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、或5,000个碱基对；并且
其中该第一RNA编码由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的多肽，其中该多肽指导该模板RNA插入该基因组。
265.一种将DNA插入哺乳动物细胞的基因组中的方法，该方法包括使该细胞与RNA组合物接触，其中该RNA组合物包含：
(a)指导模板RNA插入基因组的第一RNA，和
(b)包含异源序列的模板RNA，
其中该方法不包括使该哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA，
其中该方法导致向该哺乳动物细胞的基因组添加DNA(例如外源DNA)序列的至少1、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、或5,000个碱基对；并且
其中该第一RNA编码由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的多肽，其中该多肽指导该模板RNA插入该基因组。
266.一种将DNA插入哺乳动物细胞的基因组中的方法，该方法包括使该细胞与RNA组合物接触，其中该RNA组合物包含：
(a)指导模板RNA插入基因组的第一RNA，和
(b)包含异源序列的模板RNA，
其中该方法不包括使该哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA，
其中该方法导致向该哺乳动物细胞的基因组添加DNA(例如外源DNA)序列的至少5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000或5,000个碱基对；并且
其中该第一RNA编码表3B、表10、表11或表X的元件的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，其中该多肽指导该模板RNA插入该基因组。
267.一种将DNA插入哺乳动物细胞的基因组中的方法，该方法包括使该细胞与RNA组合物接触，其中该RNA组合物包含：
(a)指导模板RNA插入基因组的第一RNA，和
(b)包含异源序列的模板RNA，
其中该方法不包括使该哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％的DNA，
其中该方法导致向该哺乳动物细胞的基因组添加DNA(例如外源DNA)序列的至少5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000或5,000个碱基对；并且
其中该第一RNA编码表3B、表10、表11或表X的元件的多肽或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列，其中该多肽指导该模板RNA插入该基因组。
268.一种将DNA插入哺乳动物细胞的基因组中的方法，该方法包括使该细胞与RNA组合物接触，其中该RNA组合物包含：
(a)指导模板RNA插入基因组的第一RNA，和
(b)模板RNA，其包含异源序列和(i)与表3B、表10或表X的元件的序列的5’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的侧翼序列，和/或(ii)与表3B、表10或表X的元件的序列的3’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的侧翼序列，
其中该方法不包括使该哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％DNA，
其中该方法导致向该哺乳动物细胞的基因组添加DNA(例如外源DNA)序列的至少1、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、或5,000个碱基对。
269.一种将DNA插入哺乳动物细胞的基因组中的方法，该方法包括使该细胞与RNA组合物接触，其中该RNA组合物包含：
(a)指导模板RNA插入基因组的第一RNA，和
(b)模板RNA，其包含异源序列和(i)与相对于表3B、表10或表X的元件的序列的起始密码子位于5’的核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的侧翼序列(例如，包含逆转录转座酶结合区)，和/或(ii)与相对于表3B、表10或表X的元件的序列的终止密码子位于3’的核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的侧翼序列(例如，包含逆转录转座酶结合区)，
其中该方法不包括使该哺乳动物细胞与DNA接触，或其中(a)和(b)的组合物不包含按核酸的质量或摩尔量计超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％DNA，
其中该方法导致向该哺乳动物细胞的基因组添加DNA(例如外源DNA)序列的至少1、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、或5,000个碱基对。
270.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该模板RNA进一步包含结合该多肽的序列；任选地其中结合该多肽的序列：
(a)与表3B、表10或表X的元件的序列的5’UTR序列或3’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性；或
(b)与以下具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性：(i)相对于表3B、表10或表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的起始密码子位于5'的核苷酸，或(ii)相对于表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的终止密码子位于3'的核苷酸。
271.如前述实施例中任一项所述的方法，其中将外源DNA的至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、1000bp添加到哺乳动物细胞的基因组中，而无需将DNA递送至该细胞。
272.如前述实施例中任一项所述的方法，其中将外源DNA的至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、1000bp添加到哺乳动物细胞的基因组中，
其中该方法不包括使该哺乳动物细胞与DNA接触，或其中该方法包括使该哺乳动物细胞与按核酸的质量或摩尔量计包含小于1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、或0.01％DNA的组合物接触。
273.如前述实施例中任一项所述的方法，其中将外源DNA的至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、1000bp添加到哺乳动物细胞的基因组中，其中仅RNA被递送到该哺乳动物细胞。
274.如前述实施例中任一项所述的方法，其中将外源DNA的至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、1000bp添加到哺乳动物细胞的基因组中，其中RNA和蛋白质被递送到该哺乳动物细胞。
275.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该模板RNA用作插入该外源DNA的模板。
276.如前述实施例中任一项所述的方法，其不包含外源DNA的DNA依赖性RNA聚合。
277.如前述实施例中任一项所述的方法，其导致将DNA的至少1、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000或5,000个碱基对添加到该哺乳动物细胞的基因组。
278.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)的RNA和(b)的RNA共价连接，例如是同一转录本的一部分。
279.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)的RNA和(b)的RNA是分开的RNA。
280.如前述实施例中任一项所述的方法，其不包括使该哺乳动物细胞与模板DNA接触。
281.一种修饰人细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)、和/或(iii)中的一个、两个或三个具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法导致将所述异源对象序列插入人细胞的基因组中，
其中该人细胞不显示任何DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因的上调，或其中没有DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因被上调超过50％、25％、10％、5％、2％、或1％，例如，其中通过RNA-seq测量上调。
282.一种修饰人细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)和/或(iii)中的一个、两个或三个具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法导致将所述异源对象序列插入人细胞的基因组中，
其中该人细胞不显示任何DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因的上调，或其中没有DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因被上调超过50％、25％、10％、5％、2％、或1％，例如，其中通过RNA-seq测量上调，例如，如PCT/US2019/048607(通过引用以其整体并入本文)的实例14中所述。
283.一种修饰人细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)、和/或(iii)中的一个、两个或三个具有表3B、表10、表11或表X的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法导致将所述异源对象序列插入人细胞的基因组中，
其中该人细胞不显示任何DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因的上调，或其中没有DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因被上调超过50％、25％、10％、5％、2％、或1％，例如，其中通过RNA-seq测量上调。
284.一种修饰人细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；其中(i)、(ii)和/或(iii)中的一个、两个或三个具有表3B、表10、表11或表X的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列，
其中所述方法导致将所述异源对象序列插入人细胞的基因组中，
其中该人细胞不显示任何DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因的上调，或其中没有DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因被上调超过50％、25％、10％、5％、2％、或1％，例如，其中通过RNA-seq测量上调。
285.一种修饰人细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)与该多肽结合的序列，其与表3B、表10、表11或表X的元件的序列的5’UTR序列或3’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性，以及(ii)异源对象序列，
其中所述方法导致将所述异源对象序列插入人细胞的基因组中，
其中该人细胞不显示任何DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因的上调，或其中没有DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因被上调超过50％、25％、10％、5％、2％、或1％，例如，其中通过RNA-seq测量上调。
286.一种修饰人细胞的基因组的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域(例如，如表3B、表10、表11、表X或表Z1或Z2中所列)，(ii)核酸内切酶结构域，和任选地(iii)DNA结合结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(i)与该多肽结合的序列，其与以下具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性：(i)表3B、表10或表X的元件的序列的由相对于起始密码子位于5'的核苷酸组成的部分，或(ii)表3B、表10或表X的元件的序列的由相对于终止密码子位于3'的核苷酸组成的部分，
其中所述方法导致将所述异源对象序列插入人细胞的基因组中，
其中该人细胞不显示任何DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因的上调，或其中没有DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因被上调超过50％、25％、10％、5％、2％、或1％，例如，其中通过RNA-seq测量上调。
287.一种向细胞(例如哺乳动物细胞)的基因组添加外源编码区的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：(i)包含该外源编码区的非编码链的RNA，其中任选地该RNA不包含该外源编码区的编码链，和(ii)包含表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列的多肽，其中任选地该递送包括非病毒递送。
288.一种向细胞(例如哺乳动物细胞)的基因组添加外源编码区的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：(i)包含该外源编码区的非编码链的RNA，其中任选地该RNA不包含该外源编码区的编码链，和(ii)多肽，其包含表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列，其中任选地递送包括非病毒递送。
289.一种在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达目的多肽的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：(i)RNA，其中该RNA包含非编码链，该非编码链是编码该目的多肽的序列的反向互补链，其中任选地该RNA不包含编码目的多肽的编码链，和(ii)逆转录转座酶多肽，其包含由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列，其中任选地该递送包括非病毒递送。
290.一种在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达目的多肽的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：(i)RNA，其中该RNA包含非编码链，该非编码链是编码该目的多肽的序列的反向互补链，其中任选地该RNA不包含编码该目的多肽的编码链，和(ii)逆转录转座酶多肽，其包含由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列，其中任选地递送包括非病毒递送。
291.一种在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达目的多肽的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：(i)RNA，其中该RNA包含非编码链，该非编码链是编码该目的多肽的序列的反向互补链，其中任选地该RNA不包含编码目的多肽的编码链，和(ii)和逆转录转座酶多肽，其包含由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列，其中任选地该递送包括非病毒递送。
292.一种在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达目的多肽的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：(i)RNA，其中该RNA包含非编码链，该非编码链是编码该目的多肽的序列的反向互补链，其中任选地该RNA不包含编码该目的多肽的编码链，和(ii)逆转录转座酶多肽，其包含由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列，其中任选地递送包括非病毒递送。
293.如前述实施例中任一项所述的方法，其中插入该哺乳动物基因组中的序列是对该哺乳动物基因组外源的序列。
294.如前述实施例中任一项所述的方法，其中插入该哺乳动物基因组的外源序列不天然存在于该哺乳动物基因组的别处。
295.如前述实施例中任一项所述的方法，其中插入该哺乳动物基因组中的外源序列天然存在于该哺乳动物基因组的别处。
296.如前述实施例中任一项所述的方法，其独立于DNA模板运行。
297.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该细胞是组织的一部分。
298.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该哺乳动物细胞是整倍体，没有被永生化，是生物体的一部分，是原代细胞，是非分裂的，是肝细胞或来自患有遗传性疾病的受试者。
299.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该哺乳动物细胞在没有疾病的受试者中，例如用于补充该受试者的基因组。
300.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该接触包括使该细胞与质粒、病毒、病毒样颗粒、病毒体、脂质体、囊泡、外来体、融合体或脂质纳米颗粒接触。
301.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该接触包括使用非病毒递送。
302.如前述实施例中任一项所述的方法，其包括使该细胞与该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)接触，其中该模板RNA包含外源编码区的非编码链，其中任选地，该模板RNA不包含该外源编码区的编码链，其中任选地，递送包括非病毒递送，从而将该外源编码区添加至该细胞的基因组。
303.如前述实施例中任一项所述的方法，其包括使该细胞与该模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)接触，其中该模板RNA包含非编码链，该非编码链是编码该多肽的序列的反向互补链，其中任选地，该模板RNA不包含编码该多肽的编码链，其中任选地递送包括非病毒递送，从而将该外源编码区添加到该细胞的基因组中并在该细胞中表达该多肽。
304.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该接触包括对受试者例如静脉内施用(a)和(b)。
305.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该接触包括至少两次向受试者施用(a)和(b)的剂量。
306.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多肽将该模板RNA序列逆转录成该靶DNA链，从而修饰该靶DNA链。
307.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)和(b)分开施用。
308.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)和(b)一起施用。
309.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)的核酸未整合到该宿主细胞的基因组中。
310.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该组织是肝、肺、皮肤、肌肉组织(例如骨骼肌)、眼或眼组织或中枢神经系统。
311.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该细胞是造血干细胞(HSC)、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
312.任何前述编号的方法，其中结合所述多肽的序列具有以下特征中的一个或多个：
(a)在所述模板RNA的3’末端；
(b)在所述模板RNA的5’末端；
(b)是非编码序列；
(c)是结构化的RNA；
(d)形成至少1个发夹环结构；和/或
(e)是指导RNA。
313.任何前述编号的方法，其中该模板RNA进一步包含含有与靶DNA链具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)的至少20个核苷酸的序列。
314.任何前述编号的方法，其中该模板RNA进一步包含含有与靶DNA链具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)同一性的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150个核苷酸的序列。
315.任何前述编号方法，其中包含与靶DNA链具有至少80％同一性的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150个核苷酸，或约：2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、10-100、或2-100个核苷酸的序列位于该模板RNA的3’末端。
316.任何前述编号的方法，其中该模板RNA进一步包含含有与靶DNA链具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)同一性的至少100个核苷酸的序列，例如在该模板RNA的3’末端。
317.如前述实施例中任一项所述的方法，其中与该序列具有至少80％同一性的该靶DNA链中的位点靠近被包含该核酸内切酶的多肽识别(例如结合和/或切割)的靶DNA链上的靶位点(例如，在靶位点的约：0-10、10-20、20-30、30-50或50-100个核苷酸内)。
318.任何前述编号的方法，其中该靶RNA包含同源结构域，该同源结构域包含根据表11的3’同源臂的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
319.任何前述编号的方法，其中该靶RNA包含同源结构域，该同源结构域包含根据表11的5’同源臂的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
320.任何前述编号方法，其中包含与靶DNA链具有至少80％同一性的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150个核苷酸，或约：2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、10-100、或2-100个核苷酸的序列位于该模板RNA的3’末端；
任选地，其中所述序列与其具有至少80％同一性的靶DNA链中的位点靠近被包含所述核酸内切酶的多肽识别(例如结合和/或切割)的靶DNA链上的靶位点(例如，在约：0-10、10-20或20-30个核苷酸内)。
321.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该靶位点是该人基因组中与包含该核酸内切酶的多肽的天然靶位点具有最接近同一性的位点，例如其中该人基因组中的靶位点具有至少约16、17、18、19或20个核苷酸与该天然靶位点相同。
322.任何前述编号的方法，其中该模板RNA具有与靶DNA链有100％同一性的至少3、4、5、6、7、8、9、或10个碱基。
323.任何前述编号的方法，其中与该靶DNA链具有100％同一性的至少3、4、5、6、7、8、9、或10个碱基位于该模板RNA的3’末端。
324.任何前述编号的方法，其中与该靶DNA链具有100％同一性的至少3、4、5、6、7、8、9、或10个碱基位于该模板RNA的5’末端。
325.任何前述编号的方法，其中该模板RNA在该模板RNA的5’末端包含与该靶DNA具有100％同一性的至少3、4、5、6、7、8、9或10个碱基并且在该模板RNA的3’末端包含与该靶DNA具有100％同一性的至少3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。
326.任何前述编号的方法，其中该异源对象序列在50-50,000个碱基对之间(例如，在50-40,000bp之间，在500-30,000bp之间，在500-20,000bp之间，在100-15,000bp之间，在500-10,000bp之间，在50-10,000bp之间，在50-5,000bp之间)。
327.任何前述编号的方法，其中该异源对象序列是至少1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600或700bp。
328.任何前述编号的方法，其中该异源对象序列是至少715、750、800、950、1,000、2,000、3,000或4,000bp。
329.任何前述编号的方法，其中该异源对象序列小于5,000、10,000、15,000、20,000、30,000或40,000bp。
330.任何前述编号的方法，其中该异源对象序列小于700、600、500、400、300、200、150或100bp。
331.任何前述编号的方法，其中该异源对象序列包含以下中一项或多项：
(a)开放阅读框，例如编码多肽的序列，例如酶(例如，溶酶体酶)、膜蛋白、血液因子、外显子、细胞内蛋白(例如，胞质蛋白、核蛋白、细胞器蛋白、例如线粒体蛋白或溶酶体蛋白)、细胞外蛋白、结构蛋白、信号传导蛋白、调节蛋白、转运蛋白、感觉蛋白、运动蛋白、防御蛋白、储存蛋白蛋白或免疫受体蛋白(例如嵌合抗原受体(CAR)蛋白、T细胞受体、B细胞受体)或抗体；
(b)非编码和/或调节序列，例如结合转录调控剂的序列，例如启动子、增强子、绝缘子；
(c)剪接受体位点；
(d)聚A位点；
(e)表观遗传修饰位点；或
(f)基因表达单元。
332.任何前述编号的方法，其中该靶DNA是基因组安全港(GSH)位点。
333.任何前述编号的方法，其中该靶DNA是基因组Natural HarborTM位点。
334.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列以至少0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4，0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4或5个拷贝/基因组的平均拷贝数插入该基因组。
335.任何前述编号的方法，其导致进入基因组中的靶位点中的整合子的约25-100％、50-100％、60-100％、70-100％、75-95％、80％-90％是未截短的，如通过本文所述的测定(例如PCT申请号PCT/US2019/048607的实例6的测定)测量。
336.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列在该细胞的基因组中的仅一个靶位点处插入。
337.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列插入细胞的靶位点中，该插入的异源序列相对于插入前的异源序列包含少于10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的突变(例如SNP或一个或多个缺失(例如截短或内部缺失))，例如，例如如通过PCT申请号PCT/US2019/048607的实例12的测定测量。
338.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列插入多个细胞的靶位点，其中该插入的异源序列的少于10％、5％、2％或1％的拷贝包含突变(例如，SNP或缺失，例如，截短或内部缺失)，例如如通过PCT申请号PCT/US2019/048607的实例12的测定测量。
339.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列插入靶细胞基因组，并且其中所述靶细胞不显示p53的上调，或显示p53上调少于50％、25％、10％、5％、2％或1％，例如其中p53的上调是通过p53蛋白水平，例如根据实例30中所述的方法，或通过在Ser15和Ser20磷酸化的p53的水平来测量。
340.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列插入靶细胞基因组中，并且其中该靶细胞不显示任何DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因的上调，或其中没有DNA修复基因和/或肿瘤抑制基因被上调超过50％、25％、10％、5％、2％、或1％，例如，其中通过RNA-seq测量上调。
341.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列插入与该系统接触的细胞群体中约1％-80％的细胞(例如约1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％或70％-80％的细胞)中的靶位点(例如，以1个插入或多于一个插入的拷贝数)，例如，如使用单细胞ddPCR所测量的，例如，如实例17中所述。
342.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列以1个插入的拷贝数插入与所述系统接触的细胞群体中约1％-80％的细胞(例如约1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％或70％-80％的细胞)中的靶位点，例如，如使用菌落分离和ddPCR所测量的，例如，如实例18中所述。
343.任何前述编号的方法，其导致该异源对象序列在细胞群体中以比插入非靶位点(脱靶插入)更高的速率插入靶位点(中靶插入)，其中中靶插入与脱靶插入的比率大于10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、500:1或1,000:1，例如，使用PCT申请号PCT/US2019/048607的实例11的测定。
344.任何上述编号的系统，其导致在存在DNA修复途径抑制剂(例如SCR7，一种PARP抑制剂)的情况下，或在缺乏DNA修复途径的细胞系(例如，缺乏核苷酸切除修复途径或同源性指导的修复途径的细胞系)中异源对象序列的插入。
345.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该细胞具有降低的Rad51修复途径活性、降低的Rad51或Rad51修复途径的组分的表达，或不包含功能性Rad51修复途径，例如，不包含功能性Rad51，例如，包含使Rad51基因或Rad51修复途径中的另一基因的一个或两个拷贝失活的突变(例如，缺失)。
346.任何前述编号的系统，其可配制成药物组合物。
347.任何前述编号的系统，将其置于药学上可接受的载剂(例如，囊泡、脂质体、天然或合成脂质双层、脂质纳米颗粒、外来体)中。
348.任何前述编号的方法，其导致异源对象序列在靶细胞基因组中的多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)插入。
349.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多个插入同时或顺序发生。
350.任何前述编号的方法，其导致异源对象序列在靶细胞基因组中的多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)缺失。
351.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多个缺失同时或顺序发生。
352.任何前述编号的方法，其导致异源对象序列在靶细胞基因组中的多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碱基变化。
353.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该多个碱基变化同时或顺序发生。
354.任何前述编号的方法，其包括使该细胞与多个不同的各自包含异源对象序列的模板RNA接触。
355.如前述实施例中任一项所述的方法，其中这些不同的模板RNA包含至少两个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)不同的异源对象序列。
356.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该至少两个不同的异源对象序列各自包含不同的载荷。
357.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该至少两个不同的异源对象序列各自包含相同的载荷。
358.任何前述编号的实施例，其中Gene Writing系统的靶细胞先前已在一个或多个基因座处被修饰。
359.任何前述编号的实施例，其中先前编辑的细胞是T细胞。
360.任何前述编号的实施例，其中该一个或多个先前修饰选自基因敲除，例如内源TCR(例如TRAC、TRBC)、HLA I类(B2M)、PD1、CD52、CTLA-4、TIM-3、LAG-3或DGK的基因敲除。
361.任何前述编号的实施例，其中该异源对象序列包含TCR或CAR。
362.一种制备用于修饰哺乳动物细胞基因组的系统的方法，所述方法包括：
a)提供模板RNA，其包含(i)结合包含逆转录酶结构域和核酸内切酶结构域的多肽的序列，该序列与表X的元件的序列的5’UTR序列或3’UTR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性；和(ii)异源对象序列。
363.如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括：
b)处理该模板RNA以减少二级结构，例如将该模板RNA加热至至少70、75、80、85、90或95℃，和/或c)随后将该模板RNA冷却至例如允许二级结构的温度，例如至小于或等于37、30、25或20℃。
364.一种制备用于修饰DNA(例如，如本文所述)的系统的方法，该方法包括：
(a)提供包含异源同源序列的模板核酸(例如，模板RNA或DNA)，该异源同源序列与靶DNA分子中包含的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性，和/或
(b)提供该系统的多肽(例如，包含DNA结合结构域(DBD)和/或核酸内切酶结构域)，其包含与该靶DNA分子中包含的序列特异性结合的异源靶向结构域。
365.如前述实施例中任一项所述的方法，其中：
(a)包括将异源同源序列引入该模板核酸(例如，模板RNA或DNA)，该异源同源序列与靶DNA分子中包含的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性，和/或
(b)包括向该系统的该多肽(例如，包含DNA结合结构域(DBD)和/或核酸内切酶结构域)中引入与该靶DNA分子中包含的序列特异性结合的异源靶向结构域。
366.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)的引入包括将该同源序列插入该模板核酸中。
367.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)的引入包括用该同源序列替换该模板核酸的区段。
368.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)的引入包括突变该模板核酸的一个或多个核苷酸(例如，至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸)，从而产生该模板核酸的具有该同源序列的序列的区段。
369.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(b)的引入包括将该靶向结构域的氨基酸序列插入该多肽的氨基酸序列中。
370.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(b)的引入包括将编码该靶向结构域的核酸序列插入该多肽的包含在核酸分子中的编码序列中。
371.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(b)的引入包括用该靶向结构域替换该多肽的至少一部分。
372.如前述实施例中任一项所述的方法，其中(a)的引入包括突变该多肽的一个或多个氨基酸(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500，或更多个氨基酸)。
373.一种用于修饰细胞中基因组DNA中的靶位点的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地，结合该靶位点(例如靶基因组中位点的第二链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'靶同源结构域，
其中：
(i)该多肽包含异源靶向结构域(例如，在该DBD或该核酸内切酶结构域中)，其特异性结合包含在该基因组DNA的靶位点中或附近的序列；和/或
(ii)该模板RNA包含异源同源序列，该异源同源序列与包含在该基因组DNA的靶位点中或邻近该靶位点的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性；
从而修饰细胞中基因组DNA中的靶位点。
374.一种制备用于修饰哺乳动物细胞基因组的系统的方法，所述方法包括：
a)提供模板RNA，其包含(i)结合包含逆转录酶结构域和核酸内切酶结构域的多肽的序列，该序列与以下具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性：(i)相对于表3B、表10或表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的起始密码子位于5'的核苷酸，或(ii)相对于表3B、表10或表X的元件(例如，包含逆转录转座酶结合区)的序列的终止密码子位于3'的核苷酸。
375.如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括：
b)处理该模板RNA以减少二级结构，例如将该模板RNA加热至至少70、75、80、85、90或95℃，和/或
c)随后将该模板RNA冷却至例如允许二级结构的温度，例如至小于或等于37、30、25或20℃。
376.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该系统是如前述实施例中任一项所述的系统。
377.如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括使该模板RNA与包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域的多肽，或与编码该多肽的核酸(例如，RNA)接触。
378.如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括使该模板RNA与细胞接触。
379.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列编码治疗性多肽。
380.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列编码哺乳动物(例如人)多肽或其片段或变体。
381.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中该异源对象序列编码酶(例如，溶酶体酶)，血液因子(例如，因子I、II、V、VII、X、XI、XII或XIII)、膜蛋白、外显子、细胞内蛋白(例如，胞质蛋白、核蛋白、细胞器蛋白、例如线粒体蛋白或溶酶体蛋白)、细胞外蛋白、结构蛋白、信号传导蛋白、调节蛋白、转运蛋白、感觉蛋白、运动蛋白、防御蛋白、储存蛋白、免疫受体蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)蛋白、T细胞受体、B细胞受体)或抗体。
382.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列包含组织特异性启动子或增强子。
383.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列编码大于250、300、400、500或1,000个氨基酸，并且任选地多达1300个氨基酸的多肽。
384.如前述实施例中任一项的系统或方法，其中所述异源对象序列编码哺乳动物基因的片段，但不编码完整的哺乳动物基因，例如，编码一个或多个外显子，但不编码全长蛋白质。
385.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列编码一个或多个内含子。
386.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列不同于GFP，例如，不同于荧光蛋白或不同于报道蛋白。
387.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述多肽在37℃下的活性不低于在25℃下在其他方面类似的条件下的活性的70％、75％、80％、85％、90％或95％。
388.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中编码所述多肽和所述模板RNA的核酸或编码所述模板RNA的核酸是分开的核酸。
389.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述模板RNA不编码活性逆转录酶，例如，如实例1或2中所述包含失活的突变逆转录酶，或不包含逆转录酶序列。
390.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述模板RNA包含一个或多个化学修饰。
391.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列位于所述启动子和结合所述多肽的序列之间。
392.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述启动子位于所述异源对象序列和结合所述多肽的序列之间。
393.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中该异源对象序列包含在该模板RNA上5'至3'取向的开放阅读框(或其反向互补序列)。
394.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述异源对象序列包含在所述模板RNA上3'至5'取向的开放阅读框(或其反向互补序列)。
395.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述多肽包含(a)逆转录酶结构域和(b)核酸内切酶结构域，其中(a)或(b)中的至少一个是异源的。
396.如前述实施例中任一项所述的系统或方法，其中所述多肽包含(a)靶DNA结合结构域，(b)逆转录酶结构域和(c)核酸内切酶结构域，其中(a)、(b)或(c)中的至少一个是异源的。
397.一种基本上纯的多肽，其包含(a)逆转录酶结构域和(b)异源核酸内切酶结构域；其中(a)或(b)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列。
398.一种基本上纯的多肽，其包含(a)逆转录酶结构域和(b)异源核酸内切酶结构域；其中(a)或(b)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列。
399.一种基本上纯的多肽，其包含(a)逆转录酶结构域和(b)异源核酸内切酶结构域；其中(a)或(b)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
400.一种基本上纯的多肽，其包含(a)逆转录酶结构域和(b)异源核酸内切酶结构域；其中(a)或(b)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列。
401.一种基本上纯的多肽，其包含(a)由表3B、表10、表11或表X中所列元件的第一序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的逆转录酶结构域，和(b)由表3B、表10、表11或表X中所列元件的第二序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的核酸内切酶结构域；其中该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行的元件。
402.一种基本上纯的多肽，包含(a)由表3B、表10、表11或表X中所列元件的第一序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列编码的逆转录酶结构域，和(b)由表3B、表10、表11或表X中列出的元件的第二序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列编码的核酸内切酶结构域；其中该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行的元件。
403.一种基本上纯的多肽，包含(a)表3B、表10、表11或表X中所列元件的第一序列的或与其或具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列的逆转录酶结构域，和(b)表3B、表10、表11或表X中所列元件的第二序列的或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列的核酸内切酶结构域；其中该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行的元件。
404.一种基本上纯的多肽，包含(a)表3B、表10、表11或表X中所列元件的第一序列的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的逆转录酶结构域，和(b)表3B、表10、表11或表X中列出的元件的第二序列的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的核酸内切酶结构域；其中该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行的元件。
405.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其进一步包含由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的靶DNA结合结构域。
406.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其进一步包含由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列编码的靶DNA结合结构域。
407.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其进一步包含表3B、表10、表11或表X的元件的靶DNA结合结构域或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
408.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其进一步包含表3B、表10、表11或表X的元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的靶DNA结合结构域。
409.一种基本上纯的多肽，其包含(a)逆转录酶结构域和(b)异源核酸内切酶结构域；其中(a)具有表3B、表10、表11或表Z1或Z2或表X中列出的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，任选地，其中(b)具有表3B、表10、表11或表X中列出的元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
410.一种基本上纯的多肽，其包含(a)逆转录酶结构域和(b)异源核酸内切酶结构域；其中(a)具有表3B、表10、表11或表Z1或Z2或表X中列出的氨基酸序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列，任选地，其中(b)具有表3B、表10、表11或表X中所列元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列。
411.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其进一步包含靶DNA结合结构域，该靶DNA结合结构域包含表3B、表10、表11或表X中所列元件的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
412.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其进一步包含靶DNA结合结构域，该靶DNA结合结构域包含表3B、表10、表11或表X中所列元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列。
413.一种基本上纯的多肽，其包含(a)由表3B、表10、表11或表X中列出的第一序列编码的靶DNA结合结构域，(b)由表3B、表10、表11或表X中列出的第二序列编码的逆转录酶结构域，和(c)由表3B、表10、表11或表X中列出的第三序列编码的核酸内切酶结构域；其中：
(i)该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(ii)该第一序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(iii)该第二序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；或
(iv)该第一序列、第二序列和第三序列分别选自表3B、表10、表11或表X的不同行。
414.一种基本上纯的多肽，其包含(a)表3B、表10、表11或表X中列出的第一序列的靶DNA结合结构域，(b)表3B、表10、表11或表X中列出的第二序列的逆转录酶结构域，和(c)表3B、表10、表11或表X中列出的第三序列的核酸内切酶结构域；其中：
(i)该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(ii)该第一序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(iii)该第二序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；或
(iv)该第一序列、第二序列和第三序列分别选自表3B、表10、表11或表X的不同行。
415.一种基本上纯的多肽，其包含(a)靶DNA结合结构域，例如，其包含表3B、表10、表11或表X中所列元件的第一氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，(b)逆转录酶结构域，其包含表Z1或Z2中所列的第二氨基酸序列与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，和(c)核酸内切酶结构域，其包含表3B、表10、表11或表X中所列的元件的第三氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列；
任选地，其中该第一氨基酸序列和该第三氨基酸序列的元件选自表3B、表10、表11或表X的不同行。
416.一种基本上纯的多肽，其包含(a)靶DNA结合结构域，例如，其包含表3B、表10、表11或表X中所列元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的第一氨基酸序列，(b)逆转录酶结构域，其包含表Z1或Z2中所列的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的第二氨基酸序列，和(c)核酸内切酶结构域，其包含表3B、表10、表11或表X中所列元件的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸差异的序列的第三氨基酸序列；
任选地，其中该第一氨基酸序列和该第三氨基酸序列的元件选自表3B、表10、表11或表X的不同行。
417.一种基本上纯的多肽，其包含(a)包含第一氨基酸序列的靶DNA结合结构域，(b)包含第二氨基酸序列的逆转录酶结构域，和(c)包含第三氨基酸序列的核酸内切酶结构域；其中该第一、第二和第三氨基酸序列各自由表3B、表10、表11或表X中所列的序列编码或包含表Z1中所列的氨基酸序列或表Z2中所列结构域的氨基酸序列。
418.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其中该第一氨基酸序列由表3B、表10、表11或表X中列出的序列编码。
419.该前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其中该第一氨基酸序列包含表Z1或Z2中列出的氨基酸序列。
420.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其中该第二氨基酸序列由表3B、表10、表11或表X中列出的序列编码。
421.该前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其中该第二氨基酸序列包含表Z1或Z2中列出的氨基酸序列。
422.如前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其中该第三氨基酸序列由表3B、表10、表11或表X中列出的序列编码。
423.该前述实施例中任一项所述的基本上纯的多肽，其中该第三氨基酸序列包含表Z1或Z2中列出的氨基酸序列。
424.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)逆转录酶结构域和(b)核酸内切酶结构域，其中(a)或(b)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列，并且其中(a)或(b)中的至少一个与另一个是异源的。
425.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)逆转录酶结构域和(b)核酸内切酶结构域，其中(a)或(b)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列，并且其中(a)或(b)中的至少一个与另一个是异源的。
426.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽是融合蛋白，该融合蛋白包含(a)由表3B、表10、表11或表X中所列元件的第一序列编码的逆转录酶结构域，和(b)由表3B、表10、表11或表X中所列元件的第二序列编码的核酸内切酶结构域；其中该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行的元件。
427.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)靶DNA结合结构域、(b)逆转录酶结构域和(c)核酸内切酶结构域，其中(a)、(b)或(c)中的至少一个(例如1、2个或所有)包含由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列编码的氨基酸序列，并且其中(a)、(b)或(c)中的至少一个与另一个异源。
428.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)靶DNA结合结构域、(b)逆转录酶结构域和(c)核酸内切酶结构域，其中(a)、(b)或(c)中的至少一个(例如1、2个或所有)包含由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列，并且其中(a)、(b)或(c)中的至少一个与另一个异源。
429.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽是融合蛋白，该融合蛋白包含(a)由表3B、表10、表11或表X中所列的第一序列编码的靶DNA结合结构域，(b)由表3B、表10、表11或表X中列出的第二序列编码的逆转录酶结构域，和(c)由表3B、表10、表11或表X中列出的第三序列编码的核酸内切酶结构域；其中：
(i)该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(ii)该第一序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(iii)该第二序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；或
(iv)该第一序列、第二序列和第三序列分别选自表3B、表10、表11或表X的不同行。
430.如前述实施例中任一项所述的任何多肽，其中该逆转录酶结构域与由表3B、表10、表11或表X的元件的序列编码的逆转录酶结构域具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性)同一性。
431.如前述实施例中任一项所述的任何多肽，其中该核酸内切酶结构域与由表3B、表10、表11或表X的元件的序列编码的核酸内切酶结构域具有至少80％同一性，例如至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性。
432.如前述实施例中任一项所述的任何多肽或方法，其中该DNA结合结构域与由表3B、表10、表11或表X的元件的序列编码的DNA结合结构域具有至少80％同一性，例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性。
433.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)逆转录酶结构域和(b)核酸内切酶结构域，其中(a)或(b)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X的元件的序列的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，并且其中(a)或(b)中的至少一个与另一个是异源的。
434.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)逆转录酶结构域和(b)核酸内切酶结构域，其中(a)或(b)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X中的元件的序列的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列，并且其中(a)或(b)中的至少一个与另一个是异源的。
435.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽是融合蛋白，该融合蛋白包含(a)表3B、表10、表11或表X中列出的第一序列的逆转录酶结构域，和(b)表3B、表10、表11或表X中列出的第二序列的核酸内切酶结构域；其中该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行。
436.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)靶DNA结合结构域、(b)逆转录酶结构域和(c)核酸内切酶结构域，其中(a)、(b)或(c)中的至少一个(例如1、2或全部)包含表3B、表10、表11或表X的元件的序列的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，并且其中(a)、(b)或(c)中的至少一个与另一个是异源的。
437.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(a)靶DNA结合结构域、(b)逆转录酶结构域和(c)核酸内切酶结构域，其中(a)、(b)或(c)中的至少一个(例如1、2个或所有)包含表3B、表10、表11或表X中的元件的序列的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列，并且其中(a)、(b)或(c)中的至少一个与另一个异源。
438.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽是融合蛋白，该融合蛋白包含(a)由表3B、表10、表11或表X中列出的第一序列编码的靶DNA结合结构域，(b)由表3B、表10、表11或表X中列出的第二序列编码的逆转录酶结构域，和(c)由表3B、表10、表11或表X中列出的第三序列编码的核酸内切酶结构域；其中：
(i)该第一序列和该第二序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(ii)该第一序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；
(iii)该第二序列和该第三序列选自表3B、表10、表11或表X的不同行；或
(iv)该第一序列、第二序列和第三序列分别选自表3B、表10、表11或表X的不同行。
439.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域，其中该RT结构域具有表3B、表10、表11或表X的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
440.如前述实施例中任一项所述的任何多肽，其中该逆转录酶结构域与表3B、表10、表11或表X的元件的序列的逆转录酶结构域具有至少80％同一性，例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性。
441.如前述实施例中任一项所述的任何多肽，其中该核酸内切酶结构域与表3B、表10、表11或表X的元件的序列的核酸内切酶结构域具有至少80％同一性，例如至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性。
442.如前述实施例中任一项所述的任何多肽或方法，其中该DNA结合结构域与表3B、表10、表11或表X的元件的序列的DNA结合结构域具有至少80％同一性，例如，至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同一性。
443.一种核酸，其编码如前述实施例中任一项所述的多肽。
444.一种载体，其包含如前述实施例中任一项所述的核酸。
445.一种宿主细胞，其包含如前述实施例中任一项所述的核酸。
446.一种宿主细胞，其包括如前述实施例中任一项所述的多肽。
447.一种宿主细胞，其包含如前述实施例中任一项所述的载体。
448.一种宿主细胞(例如人细胞)，其包含：
在染色体中的靶位点处的异源对象序列(例如，编码治疗性多肽的序列)，以及以下中的一者或两者：
(a)该异源对象序列一侧(例如上游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第5列的序列)以及该异源对象序列另一侧(例如下游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第6列的序列)中的一者或两者；和/或
(b)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X的元件的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列编码的氨基酸序列。
449.一种宿主细胞(例如人细胞)，其包含：
在染色体中的靶位点处的异源对象序列(例如，编码治疗性多肽的序列)，以及以下中的一者或两者：
(a)该异源对象序列一侧(例如上游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第5列的序列)以及该异源对象序列另一侧(例如下游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第6列的序列)中的一者或两者；和/或
(b)一种多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、表10、表11或表X中的元件的序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列。
450.一种宿主细胞(例如人细胞)，其包含：
在染色体中的靶位点处的异源对象序列(例如，编码治疗性多肽的序列)，以及以下中的一者或两者：
(a)该异源对象序列一侧(例如上游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第5列的序列)以及该异源对象序列另一侧(例如下游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第6列的序列)中的一者或两者；和/或
(b)多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X的元件的序列的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
451.一种宿主细胞(例如人细胞)，其包含：
在染色体中的靶位点处的异源对象序列(例如，编码治疗性多肽的序列)，以及以下中的一者或两者：
(a)该异源对象序列一侧(例如上游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第5列的序列)以及该异源对象序列另一侧(例如下游)的非翻译区(例如，逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第6列的序列)中的一者或两者；和/或
(b)一种多肽或编码多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有表3B、表10、表11或表X中的元件的序列的或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列的氨基酸序列。
452.如前述实施例中任一项所述的宿主细胞，其包含：(i)在染色体的靶位点处的异源对象序列(例如，编码治疗性多肽的序列)，其中所述靶位基因座是Natural HarborTM位点，例如本文表4的位点。
453.如前述实施例中任一项所述的宿主细胞，其进一步包含(ii)该异源对象序列的非翻译区5’和该异源对象序列的非翻译区3’中的一者或两者。
454.如前述实施例中任一项所述的宿主细胞，其进一步包含(ii)该异源对象序列一侧(例如上游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第5列的序列)以及该异源对象序列另一侧(例如下游)的非翻译区(例如逆转录转座子非翻译序列，例如表10或表3A或3B第6列的序列)中的一者或两者。
455.如前述实施例中任一项所述的宿主细胞，其仅在该靶位点包含异源对象序列。
456.一种药物组合物，其包含任何前述编号的系统、核酸、多肽或载体；和药学上可接受的赋形剂或载剂。
457.如前述实施例中任一项所述的药物组合物，其中该药学上可接受的赋形剂或载剂选自载体(例如病毒或质粒载体)，囊泡(例如脂质体、外来体、天然或合成脂质双层)、融合体、脂质纳米颗粒。
458.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步包含核定位序列。
459.一种模板RNA(或编码模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)任选地结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)任选地结合多肽的核酸内切酶和/或DNA结合结构域的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域。
460.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中该模板RNA包含(i)。
461.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中该模板RNA包含(ii)。
462.一种模板RNA(或编码模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)特异性结合多肽的RT结构域的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域。
463.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中该RT结构域包含选自表3B、表10、表11或表X的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
464.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其进一步包含(v)结合多肽(例如，包含该RT结构域的相同多肽)的核酸内切酶和/或DNA结合结构域的序列。
465.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中(ii)的序列特异性结合表3B、表10、表11或表X的RT结构域或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的RT结构域序列。
466.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中特异性结合该RT结构域的序列是表10、表11或表X、表3A或表3B的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
467.一种模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其从5'至3'包含：(ii)结合多肽的核酸内切酶和/或DNA结合结构域的序列，(i)结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3'同源结构域。
468.一种模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其从5'至3'包含：(iii)异源对象序列，(iv)3'同源结构域，(i)结合靶位点(例如，靶基因组中位点的未编辑链)的序列，和(ii)结合多肽的核酸内切酶和/或DNA结合结构域的序列。
469.如前述实施例中任一项所述的系统或模板RNA，其中该模板RNA、第一模板RNA或第二模板RNA包含特异性结合该RT结构域的序列。
470.如前述实施例中任一项所述的系统或模板RNA，其中特异性结合该RT结构域的序列位于(i)和(ii)之间。
471.如前述实施例中任一项所述的系统或模板RNA，其中特异性结合该RT结构域的序列位于(ii)和(iii)之间。
472.如前述实施例中任一项所述的系统或模板RNA，其中特异性结合该RT结构域的序列位于(iii)和(iv)之间。
473.如前述实施例中任一项所述的系统或模板RNA，其中特异性结合该RT结构域的序列位于(iv)和(i)之间。
474.如前述实施例中任一项所述的系统或模板RNA，其中特异性结合该RT结构域的序列位于(i)和(iii)之间。
475.一种用于修饰DNA的系统，其包含：
(a)第一模板RNA(或编码该第一模板RNA的DNA)，其包含(i)结合多肽的核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域和/或DNA结合结构域(DBD)的序列，和(ii)结合靶位点(例如，靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(例如，其中该第一RNA包含gRNA)；
(b)第二模板RNA(或编码该第二模板RNA的DNA)，其包含(i)特异性结合多肽(例如(a)的多肽)的逆转录酶(RT)结构域的序列，(ii)靶位点结合序列(TSBS)，和(iii)RT模板序列。
476.如前述实施例中任一项所述的系统，其中编码该第一模板RNA的核酸和编码该第二模板RNA的核酸是两个分开的核酸。
477.如前述实施例中任一项所述的系统，其中编码该第一模板RNA的核酸和编码该第二模板RNA的核酸是相同核酸分子的一部分，例如，存在于相同载体上。
478.一种修饰细胞、组织或受试者中的靶DNA链的方法，所述方法包括对所述细胞、组织或受试者施用任何前述编号的系统，从而修饰所述靶DNA链。
479.任何前述编号的实施例，其中表X的元件的序列选自Vingi-1EE、BovB、AviRTE_Brh、Penelope_SM和Utopia_Dyak逆转录转座酶。
480.任何前述编号的实施例，其中该模板RNA包含表3B、表10或表X的元件的相同序列的5’UTR和3’UTR。
481.任何前述编号的实施例，其中表X的元件的序列包含Vingi-1EE逆转录转座酶并且其中该模板RNA包含Vingi-1EE的5’UTR和3’UTR。
482.任何前述编号的实施例，其中表X的元件的序列属于限制性核酸内切酶样(RLE)进化枝。
483.任何前述编号的实施例，其中表X的元件的序列属于无嘌呤核酸内切酶样(APE)进化枝。
484.任何前述编号的实施例，其中表X的元件的序列属于Penelope样元件(PLE)进化枝，任选地其中表X的元件的序列包含GIY-YIG结构域(例如，GIY-YIG核酸内切酶结构域)。
485.任何前述编号的实施例，其中表X的元件的序列属于选自如下的进化枝：CRE、NeSL、R4、R2、Hero、L1、RTE(例如，AviRTE_Brh或BovB)、I、Jockey、CR1、Rex1、RandI/Dualen、Penelope(例如，Penelope_SM)、Tx1、RTEX、Crack、Nimb、Proto1、Proto2、RTETP、L2、Tad1、Loa、Ingi、Outcast、R1、Daphne、L2A、L2B、Ambal、Vingi(例如，Vingi-1_EE)、和Kiri进化枝。
486.任何前述编号的实施例，其中该靶DNA结合结构域相对于多肽的一个或多个其他结构域(例如逆转录酶结构域和/或核酸内切酶结构域)是异源的。
487.任何前述编号的实施例，其中该异源靶DNA结合结构域包含Cas9、Cas9切口酶、dCas9、锌指或TAL结构域。
488.任何前述编号的实施例，其中该异源靶DNA结合结构域包含根据表9或表37的Cas结构域，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
489.任何前述编号的实施例，其中该异源靶DNA结合结构域包含N末端dCas9结构域。
490.任何前述编号的实施例，其中该系统进一步包含指导RNA(例如，U6驱动的gRNA)，该指导RNA包含与靶DNA序列同源的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
491.任何前述编号的实施例，其中该模板RNA进一步包含gRNA区域，该gRNA区域包含与靶DNA序列同源的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
492.任何前述编号的实施例，其中该gRNA序列位于模板的5’末端。
493.任何前述编号的实施例，其中该gRNA序列位于模板的3’末端。
494.任何前述编号的实施例，其中该gRNA序列包含能够募集Cas9的支架。
495.任何前述编号的实施例，其中该gRNA序列包含例如如本文所述的同源结构域。
496.任何前述编号的实施例，其中该核酸内切酶结构域相对于该多肽的一个或多个其他结构域(例如逆转录酶结构域和/或靶DNA结合结构域)是异源的。
497.任何前述编号的实施例，其中该异源核酸内切酶结构域包含Cas9、Cas9切口酶或FokI结构域。
498.任何前述编号的实施例，其中该多肽包含RNA酶H结构域。
499.任何前述编号的实施例，其中该多肽不包含RNA酶H结构域或包含灭活的RNA酶H结构域。
500.任何前述编号的实施例，其中编码该多肽的核酸进一步包含第二开放阅读框。
501.任何前述编号的实施例，其中编码该多肽的核酸包含2A序列，例如，位于ORF1序列和ORF2序列之间，任选地其中该2A序列选自T2A(EGRGSLLTCGDVEENPGP)、P2A(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)、E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP)或F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)。
502.任何前述编号的实施例，其中该多肽包含内含肽。
503.任何前述编号的实施例，其中该系统包含内含肽(例如，包含在第二多肽中)。
504.任何前述编号的实施例，其中该多肽由两个或更多个单独的开放阅读框编码，每个开放阅读框编码多肽片段。
505.任何前述编号的实施例，其中该内含肽(例如，反式剪接内含肽)连接这两个或更多个多肽片段以形成该多肽。
506.任何前述编号的实施例，其中该系统包含：(i)包含逆转录酶结构域、核酸内切酶结构域和靶DNA结合结构域中的至少一个的第一多肽片段，和(ii)包含逆转录酶结构域、核酸内切酶结构域和靶DNA结合结构域中的至少一个的第二多肽片段，其中该第一多肽片段不包含与该第二多肽片段相同类型的结构域。
507.任何前述编号的实施例，其中：
(a)该第一多肽片段包含逆转录酶结构域并且该第二多肽片段包含核酸内切酶结构域，任选地其中该第一多肽片段进一步包含靶DNA结合结构域或其中该第二多肽片段进一步包含靶DNA结合结构域；
(b)该第一多肽片段包含逆转录酶结构域并且该第二多肽片段包含靶DNA结合结构域，任选地其中该第一多肽片段进一步包含核酸内切酶结构域或其中该第二多肽片段进一步包含核酸内切酶结构域；或
(a)该第一多肽片段包含核酸内切酶结构域并且该第二多肽片段包含靶DNA结合结构域，任选地其中该第一多肽片段进一步包含逆转录酶结构域或其中该第二多肽片段进一步包含逆转录酶结构域。
508.任何前述编号的实施例，其中该内含肽将该第一多肽片段与该第二多肽连接以形成该多肽。
509.任何前述编号的实施例，其中该内含肽诱导以下融合：
(i)逆转录酶结构域与核酸内切酶结构域，
(ii)逆转录酶结构域与靶DNA结合结构域，或
(iii)核酸内切酶结构域与靶DNA结合结构域。
510.任何前述编号的实施例，其中该内含肽相对于该逆转录酶结构域、该核酸内切酶结构域和该靶DNA结合结构域中的一个或多个(例如，1个、2个或所有)是异源的。
511.任何前述编号的实施例，其中该内含肽是分裂型内含肽。
512.前述实施例中的任一项，其中编码该多肽的DNA包含质粒、小环、DoggyboneDNA(dbDNA)或ceDNA。
513.前述实施例中的任一项，其中编码该多肽的RNA包含以下中的一种或多种：帽区域、聚A尾和/或化学修饰，例如一种或多种化学修饰的核苷酸。
514.前述实施例中的任一项，其中编码该多肽的RNA包含circRNA。
515.前述实施例中的任一项，其中编码该多肽的核酸包含在病毒(例如AAV、腺病毒或慢病毒，例如整合缺陷型慢病毒)中。
516.前述实施例中的任一项，其中编码该多肽的核酸包含在纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)、囊泡或融合体中。
517.任何前述编号的实施例，其中该多肽包含与表X的元件的序列编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。
518.任何前述编号的实施例，其中该逆转录酶结构域包含与表3B、表10、表11或表X的元件的序列编码的氨基酸序列的逆转录酶结构域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。
519.任何前述编号的实施例，其中该逆转录转座酶包含与表3B、表10、表11或表X的元件的序列编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
520.任何前述编号的实施例，其中该多肽包含与表3B、表10、表11或表X的元件的序列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
521.任何前述编号的实施例，其中该逆转录酶结构域包含与表3B、表10、表11或表X的元件的序列的氨基酸序列的逆转录酶结构域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。
522.任何前述编号的实施例，其中该逆转录转座酶包含与表3B、表10、表11或表X的元件的序列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
523.任何前述编号的实施例，其中该多肽包含与氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:1023)或GGGS(SEQ ID NO:1024)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
524.任何前述编号的实施例，其中该逆转录酶结构域包含与氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:1023)或GGGS(SEQ ID NO:1024)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
525.任何前述编号的实施例，其中该逆转录转座酶包含与氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:1023)或GGGS(SEQ ID NO:1024)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
526.任何前述编号的实施例，其中该多肽、逆转录酶结构域或逆转录转座酶包含接头，该接头包含与氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:1023)或GGGS(SEQ ID NO:1024)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
527.任何前述编号的实施例，其中该多肽包含通过接头共价连接到该多肽的其余部分的DNA结合结构域，该接头例如包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、300、400、或500个氨基酸。
528.任何前述编号的实施例，其中该接头在该DNA结合结构域、RNA结合结构域、逆转录酶结构域或核酸内切酶结构域(例如，如PCT申请号PCT/US2019/048607的图17A-17F中的任一个所示)中的位置处附接至该多肽的其余部分。
529.任何前述编号的实施例，其中该接头在该多肽的α螺旋区的N末端侧的位置处，例如在对应于如PCT申请号PCT/US2019/048607的实例26中所述的版本v1的位置处，附接至该多肽的其余部分。
530.任何前述编号的实施例，其中该接头在该多肽的α螺旋区的C末端侧的位置处，例如在RNA结合基序之前(例如，-1RNA结合基序)，例如，在对应于PCT申请号PCT/US2019/048607的实例26中所述的版本v2的位置处，附接至该多肽的其余部分。
531.任何前述编号的实施例，其中该接头在该多肽的随机卷曲区的C末端侧的位置处，例如，相对于DNA结合基序(例如c-myb DNA结合基序)的N末端，例如在对应于PCT申请号PCT/US2019/048607的实例26中所述的版本v3的位置处，附接至该多肽的其余部分。
532.任何前述编号的实施例，其中该接头包含与氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:1023)或GGGS(SEQ ID NO:1024)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
533.任何前述编号的实施例，其中包含来自该模板RNA序列的5’末端的至少约500、1000、2000、3000、3500、3600、3700、3800、3900或4000个连续核苷酸的多核苷酸序列被整合到靶细胞基因组中。
534.任何前述编号的实施例，其中包含来自该模板RNA序列的3’末端的至少约500、1000、2000、2500、2600、2700、2800、2900或3000个连续核苷酸的多核苷酸序列被整合到靶细胞基因组中。
535.任何前述编号的实施例，其中该模板RNA的核酸序列或其一部分(例如，包含至少约100、200、300、400、500、1000、2000、2500、3000、3500、或4000个核苷酸的部分)以至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0个整合子/基因组的拷贝数整合到靶细胞群体的基因组中。
536.任何前述编号的实施例，其中该模板RNA的核酸序列或其一部分(例如，包含至少约100、200、300、400、500、1000、2000、2500、3000、3500、或4000个核苷酸的部分)以至少约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.75、或0.1个整合子/基因组的拷贝数整合到靶细胞群体的基因组中。
537.任何前述编号的实施例，其中所述多肽包含功能性核酸内切酶结构域(例如，其中所述核酸内切酶结构域不包含消除核酸内切酶活性的突变，例如如本文所述)。
538.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞不会导致p53和/或p21蛋白水平的改变(例如上调)、H2AX磷酸化(例如γH2AX)、ATM磷酸化、ATR磷酸化、Chk1磷酸化、Chk2磷酸化和/或p53磷酸化。
539.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中p53蛋白水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的p53蛋白水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
540.任何前述编号的实施例，其中该p53蛋白水平根据实例30中描述的方法确定。
541.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中p53磷酸化水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的p53磷酸化水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
542.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中p21蛋白水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的p53蛋白水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
543.任何前述编号的实施例，其中该p21蛋白水平根据实例30中描述的方法确定。
544.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中H2AX磷酸化水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的H2AX磷酸化水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
545.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中ATM磷酸化水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的ATM磷酸化水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
546.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中ATR磷酸化水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的ATR磷酸化水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
547.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中Chk1磷酸化水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的Chk1磷酸化水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
548.任何前述编号的实施例，其中将所述系统引入靶细胞导致所述靶细胞中Chk2磷酸化水平上调至小于通过引入靶向与所述系统相同的基因组位点的位点特异性核酸酶(例如Cas9)诱导的Chk2磷酸化水平的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％的水平。
549.任何前述编号的实施例，其中该靶DNA结合结构域识别特定靶DNA序列。
550.任何前述编号的实施例，其中该靶DNA结合结构域结合多个(例如，随机的)靶DNA序列。
551.任何前述编号的实施例，其中该模板RNA包含指导RNA(例如，U6驱动的gRNA)。
552.任何前述编号的实施例，其中该靶DNA结合结构域包含如本文所述的逆转录转座酶(例如表X、10、11、3A或3B的元件的逆转录转座酶)的DNA结合结构域、Cas9、切口酶Cas9、dCas9、锌指、TAL、大范围核酸酶和/或转录因子中的一个或多个。
553.任何前述编号的实施例，其中该逆转录酶结构域包含如本文所述的逆转录转座酶(例如表X、10、11、Z1、Z2、3A或3B的元件的逆转录转座酶)的逆转录酶结构域。
554.任何前述编号的实施例，其中该核酸内切酶结构域包含如本文所述的逆转录转座酶(例如表X、10、11、3A或3B的元件的逆转录转座酶)的核酸内切酶结构域、Cas9、切口酶Cas9、II型限制酶(例如，FokI)、霍利迪(Holliday)连接解离酶、RLE核酸内切酶结构域、APE核酸内切酶结构域或GIY-YIG核酸内切酶结构域。
555.一种多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域；其中该DBD和/或该核酸内切酶结构域包含异源靶向结构域，其特异性结合靶DNA分子(例如基因组DNA)中包含的序列。
556.一种模板RNA(或编码模板RNA的DNA)，其包含特异性结合靶DNA分子(例如基因组DNA)中包含的序列的靶向结构域(例如异源靶向结构域)，特异性结合多肽的RT结构域的序列和异源对象序列。
557.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该多肽包含异源靶向结构域，其特异性结合靶DNA分子(例如基因组DNA)中包含的序列。
558.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源靶向结构域结合与未修饰的多肽不同的核酸序列。
559.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该多肽不包含功能性内源靶向结构域(例如，其中该多肽不包含内源靶向结构域)。
560.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源靶向结构域包含锌指(例如，特异性结合该靶DNA分子中包含的序列的锌指)。
561.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源靶向结构域包含Cas结构域(例如，Cas9结构域，或其突变体或变体，例如，特异性结合该靶DNA分子中包含的序列的Cas9结构域)。
562.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该Cas结构域与指导RNA(gRNA)相关联。
563.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源靶向结构域包含核酸内切酶结构域(例如，异源核酸内切酶结构域)。
564.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该核酸内切酶结构域包含Cas结构域(例如，Cas9或其突变体或变体)。
565.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该Cas结构域与指导RNA(gRNA)相关联。
566.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该核酸内切酶结构域包含Fok1结构域。
567.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该模板核酸分子包含至少一个(例如，一个或两个)异源同源序列，其与包含在靶DNA分子(例如，基因组DNA)中的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性。
568.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该至少一个异源同源序列之一位于该模板核酸分子5’末端的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个核苷酸处或内。
569.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该至少一个异源同源序列之一位于该模板核酸分子3’末端的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个核苷酸处或内。
570.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源同源序列在该靶DNA分子中的切口位点(例如，由切口酶产生，例如，如本文所述的核酸内切酶结构域)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内结合。
571.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源同源序列和与该模板RNA的未修饰形式的内源同源序列互补的核酸序列具有小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％的序列同一性。
572.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源同源序列与该靶DNA分子的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性，该靶DNA分子的序列与被内源同源序列结合的序列不同(例如，被异源同源序列替代)。
573.前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源同源序列包含与位于该靶DNA分子的切口位点(例如，被切口酶(例如本文所述的核酸酶内切结构域)切口的位点)的5’的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性的序列(例如在其3’末端)。
574.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源同源序列包含适合于引发靶标引发的逆转录(TPRT)起始的序列(例如，在其5’末端)。
575.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该异源同源序列与位于该靶DNA分子中的靶插入位点(例如，对于异源对象序列(例如，如本文所述))(例如，相对于其3’)的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个核苷酸内的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性。
576.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该模板核酸分子包含例如如本文所述的指导RNA(gRNA)。
577.如前述实施例中任一项所述的系统、方法或模板RNA，其中该模板核酸分子包含gRNA间隔子序列(例如，在其5’末端的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸处或内)。
578.一种模板RNA(或编码模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5'到3')(i)结合靶位点(例如靶基因组中位点的第二链)的序列，(ii)特异性结合多肽的RT结构域的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3’靶同源结构域。
579.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其进一步包含(v)结合多肽(例如，包含该RT结构域的相同多肽)的核酸内切酶和/或DNA结合结构域的序列。
580.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中该RT结构域包含选自表3B、表10、表11或表X的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
581.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中该RT结构域包含选自表3B、表10、表11或表X的序列，其中该RT结构域进一步包含相对于天然序列的多个取代，例如至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个取代。
582.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中(ii)的序列特异性结合该RT结构域。
583.如前述实施例中任一项所述的模板RNA，其中特异性结合该RT结构域的序列是表3B或表10的序列(例如，UTR序列)，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
584.一种模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其从5'至3'包含：(ii)结合多肽的核酸内切酶和/或DNA结合结构域的序列，(i)结合靶位点(例如靶基因组中位点的第二链)的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3’靶同源结构域。
585.一种模板RNA(或编码模板RNA的DNA)，其从5'至3'包含：(iii)异源对象序列，(iv)3’靶同源结构域，(i)结合靶位点(例如，靶基因组中位点的第二链)的序列，和(ii)结合多肽的核酸内切酶和/或DNA结合结构域的序列。
586.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中该系统的RNA(例如，模板RNA、编码(a)的多肽的RNA、或从整合到靶DNA中的异源对象序列表达的RNA)包含microRNA结合位点，例如在3’UTR中。
587.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中该微小RNA结合位点被非靶细胞类型中存在的miRNA识别，但在靶细胞类型中不存在(或相对于非靶细胞以降低的水平存在)。
588.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中该miRNA是miR-142，和/或其中该非靶细胞是枯否(Kupffer)细胞或血细胞，例如免疫细胞。
144.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中该miRNA是miR-182或miR-183，和/或其中该非靶细胞是背根神经节神经元。
588.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中该系统包含被第一miRNA(例如，miR-142)识别的第一miRNA结合位点，并且该系统进一步包含被第二miRNA(例如，miR-182或miR-183)识别的第二miRNA结合位点，其中该第一miRNA结合位点和该第二miRNA结合位点位于该系统的相同RNA或不同RNA上。
589.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中该模板RNA包含至少2、3或4个miRNA结合位点，例如，其中这些miRNA结合位点被相同或不同的miRNA识别。
590.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中编码(a)的多肽的RNA包含至少2、3或4个miRNA结合位点，例如，其中这些miRNA结合位点被相同或不同的miRNA识别。
591.如前述实施例中任一项所述的系统、方法、试剂盒、模板RNA或反应混合物，其中从整合到靶DNA中的异源对象序列表达的RNA包含至少2、3或4个miRNA结合位点，例如，其中这些miRNA结合位点被相同或不同的miRNA识别。
定义
结构域：如本文所用，术语“结构域”是指有助于生物分子的特定功能的生物分子的结构。结构域可以包含生物分子的连续区域(例如，连续序列)或不同的非连续区域(例如，非连续序列)。蛋白质结构域的实例包括但不限于核酸内切酶结构域、DNA结合结构域、逆转录结构域；核酸的结构域的实例是调节结构域，例如转录因子结合结构域。
外源的：如本文所用，术语外源的，当相对于生物分子(例如核酸序列或多肽)使用时，意指通过人工将生物分子引入宿主基因组、细胞或生物中。例如，使用重组DNA技术或其他方法添加到现有基因组、细胞、组织或受试者中的核酸对于现有核酸序列、细胞、组织或受试者而言是外源的。
基因组安全港位点(GSH位点)：基因组安全港位点是宿主基因组中的位点，该位点能够容纳新遗传材料的整合，例如，使得插入的遗传元件不会引起宿主基因组的显著改变对宿主细胞或生物构成风险。GSH位点通常满足以下标准中的1、2、3、4、5、6、7、8或9项：(i)距癌症相关基因>300kb；(ii)距miRNA/其他功能性小RNA>300kb；(iii)距5'基因末端>50kb；(iv)距复制起点>50kb；(v)距任何极保守元件>50kb；(vi)转录活性低(即无mRNA+/-25kb)；(vii)不在拷贝数可变区中；(viii)在开放染色质中；和/或(ix)是唯一的，在人基因组中有1个拷贝。满足一些或所有这些标准的人基因组中GSH位点的实例包括：(i)腺相关病毒位点1(AAVS1)，它是AAV病毒在19号染色体上整合的天然存在的位点；(ii)趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因，一种被称为HIV-1共同受体的趋化因子受体基因；(iii)小鼠Rosa26基因座的人直系同源物；(iv)rDNA基因座。另外的GSH位点是已知的，并且描述于例如Pellenz等人,2018年8月20日电子公开(https://doi.org/10.1101/396390)中。
异源的：当用于参考第二元件来描述第一元件时，术语异源的意指第一元件和第二元件在自然界中不以如所描述的布置存在。例如，异源多肽、核酸分子、构建体或序列是指(a)对于表达其的细胞而言不是天然的多肽、核酸分子或多肽或核酸分子序列的一部分，(b)相对于其天然状态已发生改变或突变的多肽或核酸分子或多肽或核酸分子的一部分，或(c)具有与在类似条件下的天然表达水平相比改变的表达的多肽或核酸分子。例如，异源调节序列(例如启动子、增强子)可以用于调节基因或核酸分子的表达，其方式不同于基因或核酸分子通常在自然界中表达的方式。在另一个实例中，多肽或核酸序列的异源结构域(例如，多肽的DNA结合结构域或编码多肽的DNA结合结构域的核酸)可以相对于其他结构域布置，或者可以是不同的序列或相对于多肽的其他结构域或部分或其编码核酸来自不同来源。在某些实施例中，异源核酸分子可以存在于天然宿主细胞基因组中，但是可以具有改变的表达水平或具有不同的序列或两者。在其他实施例中，异源核酸分子对于宿主细胞或宿主基因组可能不是内源的，而是通过转化(例如，转染、电穿孔)引入宿主细胞的，其中所添加的分子可以整合到宿主基因组中，或可以作为染色体外遗传材料短暂存在(例如，mRNA)或半稳定存在超过一代(例如，游离病毒载体、质粒或其他自我复制载体)。在一些实施例中，如果第一结构域不是天然包含在与另一个结构域相同的多肽中(例如，来自相同生物体的不同蛋白质的两个结构域之间的融合)，则一个结构域相对于另一个结构域是异源的。
突变或突变的：当应用于核酸序列时，术语“突变的”意指与参考(例如天然)核酸序列相比，核酸序列中的核苷酸可以被插入、缺失或改变。可以在基因座处进行单个改变(点突变)，或者可以在单个基因座处插入、缺失或改变多个核苷酸。另外，可以在核酸序列内的任何数目的基因座处进行一个或多个改变。核酸序列可以通过本领域已知的任何方法进行突变。在一些实施例中，突变天然发生。在一些实施例中，期望的突变可以由本文所述的系统产生。
核酸分子：核酸分子是指RNA和DNA分子两者，包括但不限于cDNA、基因组DNA和mRNA，并且还包括合成的核酸分子，例如化学合成或重组产生的核酸分子，例如如本文所述的RNA模板。核酸分子可以是双链或单链、环状或线性的。如果是单链，则核酸分子可以是有义链或反义链。除非另有说明，并且作为本文中以通用格式“SEQ.ID NO:”所述的所有序列的实例，“包含SEQ.ID NO:1的核酸”是指具有(i)SEQ.ID NO:1的序列或(ii)与SEQ.ID NO:1互补的序列的核酸、至少一部分。两者之间的选择取决于使用SEQ.ID NO:1的上下文。例如，如果将核酸用作探针，则两者之间的选择取决于探针与期望的靶互补的要求。如本领域技术人员将容易理解的，本披露的核酸序列可以被化学或生物化学修饰或可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标签，甲基化，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，侧链部分(例如，多肽)，嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷基化剂和经修饰的连接(例如，α异头核酸等等)。还包括合成的分子，它们模拟多核苷酸经由氢键和其他化学相互作用与指定序列结合的能力。此类分子是本领域已知的，并且包括例如其中肽键替代分子主链中的磷酸键的那些。其他修饰可以包括，例如，其中核糖环含有桥接部分或其他结构(例如在“锁定”核酸中发现的修饰)的类似物。
基因表达单元：基因表达单元是核酸序列，其包含与至少一个效应子序列可操作地连接的至少一个调节核酸序列。当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录或表达，则该启动子或增强子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以是连续的或非连续的。在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，可操作地连接的序列可以在同一阅读框中。
宿主：如本文所用，术语宿主基因组或宿主细胞是指已将蛋白质和/或遗传材料引入其中的细胞和/或其基因组。应当理解，此类术语不仅旨在指特定的受试者细胞和/或基因组，而且还指这种细胞的子代和/或这种细胞的子代的基因组。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这种子代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。宿主基因组或宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或者是从这种细胞或细胞系分离的基因组材料，或者可以是构成活组织或生物的宿主细胞或宿主基因组。在一些情况下，宿主细胞可以是动物细胞或植物细胞，例如，如本文所述。在某些情况下，宿主细胞可以是牛细胞、马细胞、猪细胞、山羊细胞、绵羊细胞、鸡细胞或火鸡细胞。在某些情况下，宿主细胞可以是玉米细胞、大豆细胞、小麦细胞或水稻细胞。
假结：如本文所用，“假结序列”序列是指具有带有合适的自身互补性以形成假结结构的序列的核酸(例如RNA)，例如具有：第一区段、第一区段和第三区段之间的第二区段，其中第三区段与第一区段互补，以及第四区段，其中第四区段与第二区段互补。假结可以任选地具有另外的二级结构，例如，布置在第二区段中的茎环，布置在第二区段和第三区段之间的茎环，在第一区段之前的序列或在第四区段之后的序列。假结可以在第一区段和第二区段之间，第二区段和第三区段之间或第三区段和第四区段之间具有另外的序列。在一些实施例中，所述区段的排列从5'到3'：第一、第二、第三和第四。在一些实施例中，第一和第三区段包含五个完全互补的碱基对。在一些实施例中，第二和第四区段包含10个碱基对，任选地具有一个或多个(例如，两个)凸起。在一些实施例中，第二区段包含一个或多个未配对的核苷酸，例如形成环。在一些实施例中，第三区段包含一个或多个未配对的核苷酸，例如形成环。
茎环序列：如本文所用，“茎环序列”是指具有足够的自身互补性以形成茎-环的核酸序列(例如，RNA序列)，例如，具有的茎包含至少两个(例如，3、4、5、6、7、8、9或10个)碱基对，以及具有的环具有至少三个(例如，四个)碱基对。茎可能包含不匹配或凸起。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局提供。
图1是Gene WritingTM基因组编辑系统的示意图。
图2是Gene WriterTM基因组编辑多肽的结构示意图。
图3是示例性Gene WriterTM模板RNA的结构示意图。
图4A和4B是显示使用衍生自多种来源的结构域时Gene Writer的配置实例的一系列图。如本文所述的Gene Writer可能包括或可能不包括所描述的所有结构域。例如，在一些情况下，GeneWrite可能缺少RNA结合结构域，或者可能具有实现多个结构域功能的单个结构域，例如用于DNA结合和核酸内切酶活性的Cas9结构域。可包含在GeneWriter多肽中的示例性结构域包括DNA结合结构域(例如，包含表X、Y、Z1、Z2、3A或3B中任一个中所列序列的元件的DNA结合结构域；锌指；TAL结构域；Cas9；dCas9；切口酶Cas9；转录因子或大范围核酸酶)、RNA结合结构域(例如，包含B-盒蛋白、MS2外壳蛋白、dCas或表X、Y、Z1、Z2、3A或3B中任一个中所列序列的元件的RNA结合结构域)、逆转录酶结构域(例如，包含在表X、Y、3A或3B中任一个中所列的序列的元件的逆转录酶结构域；其他逆转录转座酶(例如，如表Z1中所列)；包含逆转录酶结构域(例如，如表Z2中所列))和/或核酸内切酶结构域(例如，包含表X、Y、3A或3B中任一个中所列序列的元件的核酸内切酶结构域；Cas9；切口酶Cas9；限制酶(例如，II型限制酶，例如FokI)；大范围核酸酶；霍利迪连接解离酶；RLE逆转录酶；APE逆转录转座酶；或GIY-YIG逆转录转座酶)的肽。包含此类结构域的示例性组合的示例性GeneWriter多肽显示在底部分图中。
图5是显示示例性GeneWriter RNA模板的模块的图。示例性模板的各个模块可以组合、重新排列和/或省略，例如，以产生Gene Writer模板。A＝5'同源臂；B＝核酶；C＝5'UTR；D＝异源对象序列；E＝3’UTR；F＝3'同源臂。
图6是列出示例性Gene Writer RNA模板的模块的表。单个模块可以组合、重新排列和/或省略，例如，以产生Gene Writer模板。A＝5'同源臂；B＝核酶；C＝5'UTR；D＝异源对象序列；E＝3’UTR；F＝3'同源臂。
图7A和7B是显示示例性第二链切口过程的图。(A)Cas9切口酶与Gene Writer蛋白融合。Gene Writer蛋白通过其EN结构域在DNA链中引入切口(显示为*)，融合的Cas9切口酶在顶部或底部DNA链上引入切口(显示为X)。(B)Gene Writer通过其DNA结合结构域靶向DNA，并在其EN结构域中引入DNA切口(*)。然后使用Cas9切口酶在顶部或底部链、EN的上游或下游产生第二切口(X)。
图8表示用于人细胞中逆转录转座子介导的整合的筛选构建体设计。包含逆转录转座酶(Driver)表达盒的驱动质粒与包含逆转录转座子依赖性报告盒的模板质粒一起转染。由于反义内含子中断，模板质粒的表达导致非功能性GFP，模板分子从模板质粒的转录导致生成RNA，通过剪接去除内含子，然后可以由系统逆转录和整合。因此，报告盒的表达将仅从整合的报告盒(整合的gDNA，底部)发生，而不是从模板质粒发生。HA＝同源臂，适用时；CMV＝哺乳动物CMV启动子；HiBit＝HiBit标签，用于定量蛋白质表达；T7＝T7RNA聚合酶启动子；UTR＝非翻译序列，例如天然逆转录转座子UTR；pA＝聚A信号；SD-SA用于指示GFP编码序列中反义内含子的剪接供体和剪接受体位点。HA＝同源臂，适用时(例如，参见实例6)；CMV＝哺乳动物CMV启动子；HiBit＝HiBit标签，用于定量蛋白质表达；T7＝T7RNA聚合酶启动子；UTR＝非翻译序列，例如天然逆转录转座子UTR；pA＝聚A信号；SD-SA用于指示GFP编码序列中反义内含子的剪接供体和剪接受体位点
图9披露了候选逆转录转座子的筛选并鉴定了将反式载荷整合到人类细胞中的25个候选者。如实例4所述，测定了总共163个逆转录转座子系统在人细胞中的活性。ddPCR测量的整合显示为每个逆转录转座子驱动子/模板系统的拷贝/基因组。每个柱的高度表示两次重复的平均值。在实例4和5中进一步优化后，具有更高活性的构建体在图10中进一步突出显示。
图10：基于来自表3B的并在实例7、8和9中进一步改进的逆转录转座子命中的高活性Gene Writing配置。在测试给定系统的多种配置时，例如逆转录转座酶的替代编码序列(实例8)或同源臂的添加(实例9)，仅显示性能最高的配置。对于经改进超过表3B中列出并在实例7中评估的初始配置的系统，实例5(图11)和实例6(图12)中描述的改进在表11中详细说明。
图11逆转录转座子共有序列可以挽救或改进人细胞中的反式整合活性。显示了每个逆转录转座子驱动子/模板系统的如实例5中所述经由ddPCR通过拷贝/基因组测量的整合效率。每个柱的高度表示两次重复的平均值。空圆圈表示每个重复，柱表示原始序列(浅灰色)或新的共有产生的蛋白质序列(深灰色)。
图12显示共有基序产生的同源臂序列可以挽救或改进人细胞中的反式转座子反式整合活性。显示了每个Gene Writer驱动子/模板系统经由ddPCR(实例6)通过拷贝/基因组测量的整合效率。每个柱的高度表示两次重复的平均值。实心圆圈和白色柱表示没有同源臂的模板序列，未填充的圆圈和散列柱表示包含同源臂的设计。
图13A和B显示了原代细胞的萤光素酶活性测定。如根据实例12，分析根据实例11配制的LNP用于将货物递送至原代人(A)和小鼠(B)肝细胞。萤光素酶测定显示细胞裂解物中的剂量反应性萤光素酶活性，表明RNA成功递送至细胞并从mRNA货物中表达萤火虫萤光素酶。
图14披露了LNP介导的RNA货物向鼠肝脏的递送。配制含有萤火虫萤光素酶mRNA的LNP，并通过iv将其递送给小鼠，并在施用后6、24和48小时收集肝脏样品并测定萤光素酶活性。各种配制品的报告活性依次为LIPIDV005>LIPIDV004>LIPIDV003。RNA表达是短暂的，酶水平在48小时后恢复到接近媒剂背景。施用后。
具体实施方式
本披露涉及用于例如体内或体外靶向、编辑、修饰或操纵细胞、组织或受试者中DNA序列中的一个或多个位置处的DNA序列(例如，将异源对象DNA序列插入哺乳动物基因组的靶位点)的组合物、系统和方法。对象DNA序列可以包括例如编码序列、调节序列、基因表达单元。
更具体地，本公开提供了用于将目的序列插入基因组中的基于反转座子的系统。本披露部分地基于生物信息学分析以鉴定逆转座酶序列以及来自多种生物的相关的5’UTR和3’UTR(参见表3B、10、11和X)。逆转录转座子元件的其他实例列于例如PCT申请号PCT/US2019/048607的表1和2中，该申请通过引用以其整体并入本文。
在一些实施例中，相对于各种较早的系统，本文描述的系统可以具有许多优点。例如，本披露描述了能够将异源核酸的长序列插入基因组中的逆转录转座酶。另外，本文所述的逆转座酶可以将异源核酸插入基因组中的内源位点，例如rDNA基因座。这与Cre/loxP系统相反，Cre/loxP系统需要第一步将外源loxP位点插入，然后第二步将目的序列插入loxP位点。
Gene-writerTM基因组编辑器
非长末端重复(LTR)逆转录转座子是一种类型的在真核生物基因组中广泛分布的移动遗传元件。它们包括例如无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE)型、限制酶样核酸内切酶(RLE)型和Penelope样元件(PLE)型。APE类逆转录转座子由两个功能结构域构成：核酸内切酶/DNA结合结构域和逆转录酶结构域。APE-类逆转录转座子的实例可以在例如PCT申请号PCT/US2019/048607的表1中找到，该申请通过引用以其整体并入本文，包括其中表1中提及的序列表和序列。RLE类由三个功能结构域构成：DNA结合结构域、逆转录结构域和核酸内切酶结构域。RLE-类逆转录转座子的实例可以在例如PCT申请号PCT/US2019/048607的表2中找到，该申请通过引用以其整体并入本文，包括其中表2中提及的序列表和序列。非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域通过结合RNA序列模板并将其逆转录进入宿主基因组的靶DNA发挥功能。RNA序列模板具有与逆转录转座酶特异性结合的3’非翻译区和通常具有编码逆转录转座酶蛋白的一个或多个开放阅读框(“ORF”)的可变5’区。RNA序列模板还可以包含特异性结合逆转录转座酶的5'非翻译区。Penelope样元件(PLE)与LTR和非LTR逆转录转座子不同。PLE通常包含与APE和RLE元件不同但类似于端粒酶和II组内含子的逆转录酶结构域，以及任选的GIY-YIG核酸内切酶结构域。
逆转录转座子的其他示例性类别包括但不限于CRE、NeSL、R4、R2、Hero、L1、RTE(例如，AviRTE_Brh或BovB)、I、Jockey、CR1、Rex1、RandI/Dualen、Penelope或Penelope-样(PLE)(例如，Penelope_SM)、Tx1、RTEX、Crack、Nimb、Proto1、Proto2、RTETP、L2、Tad1、Loa、Ingi、Outcast、R1、Daphne、L2A、L2B、Ambal、Vingi(例如，Vingi-1_EE)和Kiri逆转录转座子。
如本文所述，此类逆转录转座子的元件可以在功能上被模块化和/或修饰以靶向，编辑，修饰或操纵靶DNA序列，例如以通过逆转录将对象(例如异源)核酸序列插入到靶基因组例如哺乳动物基因组中。这样的经模块化和修饰的核酸、多肽组合物和系统在本文中描述，并称为Gene WriterTM基因编辑器。Gene WriterTM基因编辑器系统包含：(A)多肽或编码多肽的核酸，其中所述多肽包含(i)逆转录酶结构域和(x)含有DNA结合功能的核酸内切酶结构域或(y)核酸内切酶结构域和单独的DNA结合结构域；和(B)模板RNA，其包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源插入序列。例如，GeneWriter基因组编辑器蛋白质可包含DNA结合结构域、逆转录酶结构域和核酸内切酶结构域。在其他实施例中，Gene Writer基因组编辑器蛋白质可包含逆转录酶结构域和核酸内切酶结构域。在某些实施例中，Gene WriterTM基因编辑器多肽的元件可以衍生自逆转录转座子(例如APE-型、RLE-型或PLE-型逆转录转座子或其部分或结构域)的序列。在一些实施例中，RLE型非LTR逆转录转座子来自R2、NeSL、HERO、R4或CRE进化枝。在一些实施例中，Gene Writer基因组编辑器衍生自在人基因组中发现的R4元件X4_Line。在一些实施例中，APE型非LTR逆转录转座子来自R1或Tx1进化枝。在一些实施例中，Gene Writer基因组编辑器衍生自在人基因组中发现的Tx1元件Mare6。GeneWriterTM基因编辑器系统的RNA模板元件通常与多肽元件异源，并提供要插入(逆转录)到宿主基因组中的对象序列。在一些实施例中，Gene Writer基因组编辑器蛋白能够靶向引发的逆转录。
在一些实施例中，Gene Writer基因组编辑器与第二多肽组合。在一些实施例中，第二多肽衍生自APE型非LTR逆转录转座子。在一些实施例中，第二多肽具有锌指节样基序。在一些实施例中，第二多肽是Gag蛋白的同源物。
在一些实施例中，Gene Writer基因组编辑器包含表X中列出的元件的逆转录转座酶序列。表X提供了一系列核酸和氨基酸序列(按Repbase基因名称和物种列出)，在可用时具有相关的GenBank登录号。表X中列出的元件的Repbase核酸和氨基酸序列通过引用以其整体并入本文。表X中所列元件的GenBank序列也通过引用以其整体并入本文。在一些情况下，表X的核酸序列包括编码多肽的序列(例如，开放阅读框)(例如，相应的Repbase条目的蛋白质编码序列，通过引用并入本文)。在一些情况下，表X的核酸序列包括5’UTR序列(例如，相应Repbase条目的5’UTR序列，通过引用并入本文)。在一些情况下，表X的核酸序列包括3’UTR序列(例如，相应Repbase条目的3’UTR序列，通过引用并入本文)。
在一些实施例中，氨基酸序列的开放阅读框(ORF)在Repbase中注释。在一些实施例中，氨基酸序列的ORF未在Repbase中注释。当ORF没有被注释时，它可以由本领域技术人员鉴定，例如，通过进行一种或多种翻译(例如，全框翻译)，并且任选地将翻译与逆转录酶序列或共有基序进行比较。在一些实施例中，表X的氨基酸序列，例如，如本文所用，是在相应Repbase条目中列出的氨基酸序列，或由相应Repbase条目中的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，由表X的元件编码的氨基酸序列是由表X中所列元件的全长序列编码的氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，表X中列出的元件的全长序列可包含如本文所述的逆转录转座子的5’UTR、多肽编码序列或3’UTR中的一个或多个(例如，全部)。在一些实施例中，表X的氨基酸序列是由表X中所列元件的全长序列编码的氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，表X的元件的5’UTR包含表X中所列元件的全长序列的5’UTR或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施例中，表X的元件的3’UTR包含表X中所列元件的全长序列的3’UTR或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。
表X中还指出了从中获得核酸序列的宿主生物和存在于由核酸序列的开放阅读框编码的多肽内的结构域的列表。表X中列出的结构域表示为结构域标识符，其对应于表Y中列出的InterPro结构域条目。因此，表X中列出的Repbase序列可以编码包括一个或多个结构域(在表X中由它们的结构域标识符表示)的多肽。与每个结构域标识符相关的特定结构域或结构域类型在表Y中更详细地描述。在一些实施例中，可以在核酸序列(例如，如表X中所列)中通过执行全框翻译和鉴定编码目的结构域的氨基酸序列来鉴定目的结构域(例如，如表Y中所列)。
逆转录转座子发现工具
由于随着时间的推移重复动员，基因组DNA中的转座因子通常以串联或散布重复的形式存在(Jurka Curr Opin Struct Biol[Jurka结构生物学最新观点]8,333-337(1998))。能够识别此类重复序列的工具可用于从基因组DNA中鉴定新元件并用于填充数据库，例如Repbase(Jurka等人Cytogenet Genome Res[细胞遗传学和基因组研究]110、462-467(2005))。一种用于鉴定可能包含转座元件的重复序列的工具是RepeatFinder(Volfovsky等人Genome Biol[基因组生物学]2(2001))，它分析基因组序列的重复性结构。可以使用其他工具进一步收集和分析重复序列，例如Censor(Kohany等人BMCBioinformatics[[BMC生物信息学]]7,474(2006))。Censor软件包获取基因组重复并使用各种BLAST方法针对已知的转座因子对其进行注释。可以使用全框翻译来生成用于比较的一个或多个ORF。
用于鉴定转座元件的其他示例性方法包括RepeatModeler2，它可以自动发现和注释基因组序列中的转座元件(Flynn等人bioRxiv(2019))。除了通过可用的软件包(如Censor)完成此任务外，人们还可以对给定的基因组或序列进行全框翻译，并使用InterProScan等蛋白质结构域工具进行注释，该工具使用InterPro数据库标记给定氨基酸序列的结构域(Mitchell等人Nucleic Acids Res[核酸研究]47,D351-360(2019))，允许鉴定包含与已知转座元件相关联的结构域(例如，表X中列出的元件的结构域)的潜在蛋白质。
可以使用诸如RTclass1的工具根据逆转录酶结构域进一步分类逆转录转座子(Kapitonov等人Gene[基因]448,207-213(2009))。
Gene Writer基因编辑器系统的多肽组分
RT结构域：
在本发明的某些方面，Gene Writer系统的逆转录酶结构域是基于APE型或RLE型非LTR逆转录转座子或PLE型逆转录转座子的逆转录酶结构域。APE-型、RLE-型或PLE-型逆转录转座子的野生型逆转录酶结构域可用于Gene Writer系统或可被修饰(例如，通过插入、缺失或取代一个或多个残基)以改变靶DNA序列的逆转录酶活性。在一些实施例中，逆转录酶从其天然序列改变为具有改变的密码子使用，例如，针对人细胞进行改善。在一些实施例中，逆转录酶结构域是来自不同逆转录病毒、逆转录子、产生多样性的逆转录元件、逆转录质粒、II组内含子、LTR-逆转录转座子、非LTR逆转录转座子或其他来源的异源逆转录酶，例如，如表Z1中所例示的或包含表Z2中列出的结构域。在某些实施例中，Gene Writer系统包括多肽，该多肽包含来自R2、NeSL、HERO、R4或CRE进化枝的RLE型非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域，来自L1、RTE、I、Jockey、CR1、Rex1、RandI/Dualen、T1、RTEX、Crack、Nimb、Proto1、Proto2、RTETP、L2、Tad1、Loa、Ingi、Outcast、R1、Daphne、L2A、L2B、Ambal、Vingi、或Kiri进化枝的APE型非LTR逆转录转座子的逆转录酶结构域，或PLE型逆转录转座子的逆转录酶结构域。在某些实施例中，Gene Writer系统包括多肽，该多肽包含表10、表11、表X、表Z1、表Z2或表3A或3B中所列的逆转录转座子的逆转录酶结构域。在实施例中，Gene Writer系统的逆转录酶结构域的氨基酸序列与表10、表11、表X、表Z1、表Z2或表3A或3B中所引用的DNA序列的逆转录转座子的逆转录酶结构域的氨基酸序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同。例如，可以使用常规工具如基本局部比对搜索工具(BLAST)基于与其他已知逆转录结构域的同源性来鉴定逆转录结构域。在一些实施例中，逆转录酶结构域被修饰，例如通过位点特异性突变。在一些实施例中，逆转录酶结构域被工程化以结合异源模板RNA。
在一些实施例中，多肽(例如，RT结构域)包含RNA结合结构域，例如，其特异性结合RNA序列。在一些实施例中，模板RNA包含由RNA结合结构域特异性结合的RNA序列。
在一些实施例中，RT结构域表现出靶引发的逆转录(TPRT)起始的增强的严格性，例如，相对于内源RT结构域。在一些实施例中，当靶位点中紧邻第一链切口上游的3nt，例如引发RNA模板的基因组DNA，与RNA模板中的同源3nt具有至少66％或100％的互补性时，RT结构域启动TPRT。在一些实施例中，当模板RNA同源性和靶DNA引发逆转录之间存在少于5nt错配(例如少于1、2、3、4或5nt错配)时，RT结构域启动TPRT。在一些实施例中，修饰RT结构域使得TPRT反应引发中的错配的严格性增加，例如，其中相对于野生型(例如，未修饰的)RT结构域，RT结构域不容许任何错配或容许引发区域中更少的错配。在一些实施例中，RT结构域包含HIV-1RT结构域。在实施例中，HIV-1RT结构域启动较低水平的合成，即使相对于替代RT结构域具有三个核苷酸错配(例如，如Jamburuthugoda和Eickbush J Mol Biol[分子生物学杂志]407(5):661-672(2011)所述；将其通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施例中，RT结构域形成二聚体(例如，异二聚体或同二聚体)。在一些实施例中，RT结构域是单体的。在一些实施例中，RT结构域，例如逆转录病毒RT结构域，天然地作为单体或二聚体(例如，异二聚体或同二聚体)起作用。在一些实施例中，RT结构域天然地作为单体起作用，例如，源自病毒，其中它作为单体起作用。示例性单体RT结构域、它们的病毒来源和与它们相关的RT特征可以在表30中找到，并且结构域特征的描述在表32中。在一些实施例中，本文所述系统的RT结构域包含表30的氨基酸序列，或其功能片段或变体，或与其具有至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。在实施例中，RT结构域选自鼠白血病病毒(MLV；有时称为MoMLV)(例如，P03355)、猪内源逆转录病毒(PERV)(例如，UniProt Q4VFZ2)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)(例如，UniProt P03365)、梅森辉瑞(Mason-Pfizer)猴病毒(MPMV)(例如，UniProt P07572)、牛白血病病毒(BLV)(例如，UniProtP03361)、人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)(例如UniProt P03362)、人泡沫病毒(HFV)(例如UniProt P14350)、猿泡沫病毒(SFV)(例如UniProt P23074)或牛泡沫/合胞病毒(BFV/BSV)(例如UniProt O41894)，或其功能片段或变体(例如，与其具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列)。在一些实施例中，RT结构域在其天然功能上是二聚体。示例性二聚体RT结构域、它们的病毒来源和与它们相关的RT特征可以在表31中找到，并且结构域特征的描述在表32中。在一些实施例中，本文所述系统的RT结构域包含表31的氨基酸序列，或其功能片段或变体，或与其具有至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。在一些实施例中，RT结构域来源于病毒，其中它作为二聚体起作用。在实施例中，RT结构域选自来自以下的RT结构域：禽肉瘤/白血病病毒(ASLV)(例如，UniProt A0A142BKH1)、劳斯肉瘤病毒(RSV)(例如，UniProt P03354)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)(例如，UniProtQ83133)、人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)(例如，UniProt P03369)、人免疫缺陷病毒II型(HIV-2)(例如，UniProt P15833)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)(例如，UniProt P05896)、牛免疫缺陷病毒(BIV)(例如，UniProt P19560)、马传染性贫血病毒(EIAV)(例如，UniProt P03371)或猫免疫缺陷病毒(FIV)(例如，UniProt P16088)(Herschhorn和Hizi Cell Mol Life Sci[细胞和分子生命科学]67(16):2717-2747(2010))，或其功能片段或变体(例如，与其具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列)。在一些实施例中，天然异二聚体RT结构域也可以作为同二聚体起作用。在一些实施例中，二聚体RT结构域被表达为融合蛋白，例如，同二聚体融合蛋白或异二聚体融合蛋白。在一些实施例中，系统的RT功能由多个RT结构域实现(例如，如本文所述)。在进一步的实施例中，多个RT结构域是融合的或分开的，例如，可以在相同的多肽上或在不同的多肽上。
在一些实施例中，本文所述的GeneWriter包含整合酶结构域，例如，其中整合酶结构域可以是RT结构域的一部分。在一些实施例中，RT结构域(例如，如本文所述)包含整合酶结构域。在一些实施例中，RT结构域(例如，如本文所述)缺少整合酶结构域，或包含已通过突变或缺失失活的整合酶结构域。在一些实施例中，本文所述的GeneWriter包含RNA酶H结构域，例如，其中RNA酶H结构域可以是RT结构域的一部分。在一些实施例中，RT结构域(例如，如本文所述)包含RNA酶H结构域，例如，内源RNA酶H结构域或异源RNA酶H结构域。在一些实施例中，RT结构域(例如，如本文所述)缺少RNA酶H结构域。在一些实施例中，RT结构域(例如，如本文所述)包含异源RNA酶H结构域的添加、缺失、突变或交换的RNA酶H结构域。在一些实施例中，RNA酶H结构域的突变产生表现出较低RNA酶活性的多肽，例如，如通过Kotewiczet al.Nucleic Acids Res 16(1):265-277(1988)(通过引用以其整体并入本文)描述的方法所确定的，例如与没有该突变的在其他方面类似结构域相比降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，RNA酶H活性被消除。
在一些实施例中，与没有突变的其他类似结构域相比，RT结构域被突变以增加保真度。例如，在一些实施例中，RT结构域(例如，逆转录酶中)中的YADD或YMDD基序被YVDD替换。在实施例中，替换YADD或YMDD或YVDD导致逆转录病毒逆转录酶活性的保真度更高(例如，如Jamburuthugoda和Eickbush J Mol Biol[分子生物学杂志]2011中所述；通过引用以其整体并入本文)。
逆转录酶的多样性(例如，包含RT结构域)已在以下中进行了描述但不限于此：原核生物使用的逆转录酶(Zimmerly等人Microbiol Spectr[微生物谱]3(2):MDNA3-0058-2014(2015)；Lampson B.C.(2007)ProkaryoticReverse Transcriptases.[原核生物逆转录酶]在：Polaina J.,MacCabe A.P.(编辑)Industrial Enzymes.[工业酶]斯普林格出版社(Springer),多德雷赫特(Dordrecht))、病毒使用的逆转录酶(Herschhorn等人Cell MolLife Sci[细胞和分子生命科学]67(16):2717-2747(2010)；Menéndez-Arias等人VirusRes[病毒研究]234:153-176(2017))、和可移动元件(Eickbush等人Virus Res[病毒研究]134(1-2):221-234(2008)；Craig等人Mobile DNA[可移动DNA]III第三版编辑.DOI:10.1128/9781555819217(2015))，其各自通过引用并入本文。
表30：示例性单体逆转录病毒逆转录酶及其RT结构域特征
表31：示例性二聚体逆转录病毒逆转录酶及其RT结构域特征
表32：表30(单体病毒RT)和表31(二聚体病毒RT)中逆转录酶中存在的特征的InterPro描述。
核酸内切酶结构域：
在一些实施例中，多肽包含核酸内切酶结构域(例如，异源核酸内切酶结构域)。在某些实施例中，在本文描述的Gene Writer系统中可以使用或可以修饰APE型逆转录转座子的核酸内切酶/DNA结合结构域、RLE型逆转录转座子的核酸内切酶结构域或PLE型逆转录转座子的核酸内切酶结构域(例如，通过插入、缺失或取代一个或多个残基)。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或核酸内切酶/DNA结合结构域被从其天然序列改变为具有改变的密码子使用，例如，针对人细胞进行改善。在一些实施例中，核酸内切酶元件是异源核酸内切酶元件，例如Fok1核酸酶、Cas9、Cas9切口酶、II型限制酶样核酸内切酶(RLE型核酸酶)或另一RLE型核酸内切酶(也称为REL)。在一些实施例中，异源核酸内切酶结构域切割两条DNA链并形成双链断裂。在一些实施例中，异源核酸内切酶活性具有切口酶活性，并且不形成双链断裂。本文描述的Gene Writer系统的核酸内切酶结构域的氨基酸序列可以与表X、Z1、Z2、3A或3B中所引用的DNA序列的逆转录转座子的核酸内切酶结构域的氨基酸序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同。例如，可以使用工具如基本局部比对搜索工具(BLAST)基于与其他已知核酸内切酶结构域的同源性来鉴定核酸内切酶结构域。在某些实施例中，异源核酸内切酶是Cas9或Cas9切口酶或其功能片段。在某些实施例中，异源核酸内切酶是Fok1或其功能片段。在某些实施例中，异源核酸内切酶是霍利迪(Holliday)连接解离酶或其同源物，例如来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)-Ssol Hje的霍利迪连接解离酶(Govindaraju等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]44:7,2016)。在某些实施例中，异源核酸内切酶是剪接体蛋白诸如Prp8的大片段的核酸内切酶(Mahbub等人,Mobile DNA[移动DNA]8:16,2017)。例如，本文所述的GeneWriter多肽可包含来自APE-、RLE-或PLE-型逆转录转座子的逆转录酶结构域和包含Fok1或其功能片段的核酸内切酶结构域。在其他实施例中，同源核酸内切酶结构域被修饰，例如通过位点特异性突变，以改变DNA核酸内切酶活性。在其他实施例中，核酸内切酶结构域被修饰以去除任何潜在的DNA序列特异性。
在一些实施例中，Gene Writer多肽具有通过核酸内切酶结构域切割DNA靶位点的功能。在一些实施例中，核酸内切酶结构域也是DNA结合结构域。在一些实施例中，核酸内切酶结构域也是模板核酸(例如，模板RNA)结合结构域。例如，在一些实施例中，多肽包含CRISPR相关的核酸内切酶结构域，其结合包含gRNA的模板RNA，结合靶DNA序列(例如，与gRNA的一部分互补)，并切割靶DNA序列。在某些实施例中，在本文描述的Gene Writer系统中可以使用或可以修饰APE型逆转录转座子的核酸内切酶/DNA结合结构域或RLE型逆转录转座子的核酸内切酶结构域(例如，通过插入、缺失或取代一个或多个残基)。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或核酸内切酶/DNA结合结构域被从其天然序列改变为具有改变的密码子使用，例如，针对人细胞进行改善。在一些实施例中，核酸内切酶元件是异源核酸内切酶元件，例如Fok1核酸酶，II型限制性l样核酸内切酶(RLE型核酸酶)或另一RLE型核酸内切酶(也称为REL)。在一些实施例中，异源核酸内切酶活性具有切口酶活性，并且不形成双链断裂。本文描述的Gene Writer系统的核酸内切酶结构域的氨基酸序列可以与表1、2、3A或3B中所引用的DNA序列的逆转录转座子的核酸内切酶结构域的氨基酸序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同。例如，可以使用工具例如基本局部比对搜索工具(BLAST)基于与其他已知核酸内切酶结构域的同源性来鉴定核酸内切酶结构域。在某些实施例中，异源核酸内切酶是Fok1或其功能片段。在某些实施例中，异源核酸内切酶是霍利迪(Holliday)连接解离酶或其同源物，例如来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)-Ssol Hje的霍利迪连接解离酶(Govindaraju等人,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]44:7,2016)。在某些实施例中，异源核酸内切酶是剪接体蛋白诸如Prp8的大片段的核酸内切酶(Mahbub等人,Mobile DNA[移动DNA]8:16,2017)。在某些实施例中，异源核酸内切酶来源于CRISPR相关蛋白，例如Cas9。在某些实施例中，异源核酸内切酶被工程改造为仅具有ssDNA切割活性，例如仅具有切口酶活性，例如是Cas9切口酶。例如，本文所述的Gene Writer多肽可包含来自APE或RLE型逆转录转座子的逆转录酶结构域和包含Fok1或其功能片段的核酸内切酶结构域。在其他实施例中，同源核酸内切酶结构域被修饰，例如通过位点特异性突变，以改变DNA核酸内切酶活性。在其他实施例中，核酸内切酶结构域被修饰以去除任何潜在的DNA序列特异性。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域具有切口酶活性并且不形成双链断裂。在一些实施例中，核酸内切酶结构域以比双链断裂更高的频率形成单链断裂，例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％的断裂是单链断裂，或少于10％、5％、4％、3％、2％、或1％的断裂是双链断裂。在一些实施例中，核酸内切酶基本上不形成双链断裂。在一些实施例中，核酸外切酶不形成可检测水平的双链断裂。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域具有对待编辑链的靶位点DNA进行切口的切口酶活性；例如，在一些实施例中，核酸内切酶切割基因组DNA的靶位点，该靶位点在将被书写(writing)结构域延伸的链上的改变位点附近。在一些实施例中，核酸内切酶结构域具有对待编辑链的靶位点DNA进行切口并且不对未编辑链的靶位点DNA进行切口的切割酶活性。例如，当多肽包含具有切口酶活性且不形成双链断裂的CRISPR相关核酸内切酶结构域时，在一些实施例中，所述CRISPR相关核酸内切酶结构域对含有PAM位点的靶位点DNA链进行切口(例如，并且不对不包含PAM位点的靶位点DNA链进行切口)。
在一些其他实施例中，核酸内切酶结构域具有切口酶活性，其对待编辑链和未编辑链的靶位点DNA进行切口。不希望受理论束缚，在本文该多肽的书写结构域(例如，RT结构域)从模板核酸(例如，模板RNA)的异源对象序列聚合(例如，逆转录)之后，细胞DNA修复机器必须修复待编辑的DNA链上的切口。靶位点DNA现在包含两个不同的待编辑DNA链序列：一个对应于原始基因组DNA，并且第二个对应于从异源对象序列聚合而来的那个。人们认为这两个不同的序列相互平衡，第一个与未编辑的链杂交，然后另一个，并且细胞DNA修复装置并入其修复的靶位点被认为是随机的。不希望受理论束缚，向未编辑的链引入另外的切口可能使细胞DNA修复机制偏向于比原始基因组序列更频繁地采用基于异源对象序列的序列。在一些实施例中，另外的切口位于靶位点修饰(例如，插入、缺失或取代)或待编辑链上的切口5’或3’的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、或150个核苷酸处。
可替代地或另外地，不希望受理论束缚，未编辑链的另外切口可促进第二链合成。在一些实施例中，当Gene Writer已插入或替换了经编辑的链的一部分时，需要合成对应于未编辑链中的插入/替换的新序列。
在一些实施例中，多肽包含具有核酸内切酶活性的单个结构域(例如，单个核酸内切酶结构域)并且所述结构域对待编辑链和未编辑链进行切口。例如，在这样的实施例中，核酸内切酶结构域可以是CRISPR相关核酸内切酶结构域，并且模板核酸(例如，模板RNA)包含指导对待编辑链进行切口的gRNA和指导对未编辑链进行切口的另外gRNA。在一些实施例中，多肽包含多个具有核酸内切酶活性的结构域，并且第一核酸内切酶结构域对待编辑链进行切口并且第二核酸内切酶结构域对未编辑链进行切口(任选地，第一核酸内切酶结构域不(例如，不能)对未编辑链进行切口，并且第二核酸内切酶结构域不(例如，不能)对待编辑链进行切口)。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域能够对第一链和第二链进行切口。在一些实施例中，第一和第二链切口出现在靶位点中的相同位置但在相对的链上。在一些实施例中，第二链切口出现在第一切口的交错位置，例如上游或下游。在一些实施例中，如果第二链切口在第一链切口的上游，则核酸内切酶结构域产生靶位点缺失。在一些实施例中，如果第二链切口在第一链切口的下游，则核酸内切酶结构域产生靶位点重复。在一些实施例中，如果第一和第二链切口出现在靶位点的相同位置，则核酸内切酶结构域不产生重复和/或缺失(例如，如Gladyshev和Arkhipova Gene[基因]2009中所述，通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，核酸酶内切结构域具有改变的活性，这取决于蛋白质构象或RNA结合状态，例如，这促进第一或第二链的切口(例如，如Christensen等人PNAS[美国国家科学院院刊]2006中所述；通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含大范围核酸酶或其功能片段。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含归巢核酸内切酶或其功能片段。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含来自LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒或PD-(D/E)XK家族的大范围核酸酶，或其功能片段或变体，例如，这些功能片段或变体具有例如如家族名称所示的保守氨基酸基序。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含大范围核酸酶或其片段，其选自例如I-SmaMI(Uniprot F7WD42)、I-SceI(Uniprot P03882)、I-AniI(Uniprot P03880)、I-DmoI(Uniprot P21505)、I-CreI(Uniprot P05725)、I-TevI(Uniprot P13299)、I-OnuI(UniprotQ4VWW5)、或I-BmoI(Uniprot Q9ANR6)。在一些实施例中，大范围核酸酶呈其功能形式时是天然单体，例如I-SceI、I-TevI，或二聚体，例如I-CreI。例如，具有单个LAGLIDADG基序拷贝的LAGLIDADG大范围核酸酶通常形成同二聚体，而具有两个LAGLIDADG基序拷贝的成员通常作为单体被发现。在一些实施例中，通常以二聚体形式形成的大范围核酸酶被表达为融合物，例如，两个亚基作为单个ORF表达并且任选地通过接头连接，例如I-CreI二聚体融合物(Rodriguez-Fornes等人Gene Therapy[基因疗法]2020；通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，改变大范围核酸酶或其功能片段以有利于双链DNA分子的一条链的切口酶活性，例如I-SceI(K122I和/或K223I)(Niu等人J Mol Biol[分子生物学杂志]2008)、I-AniI(K227M)(McConnell Smith等人PNAS[美国国家科学院院刊]2009)、I-DmoI(Q42A和/orK120M)(Molina等人J Biol Chem[生物化学杂志]2015)。在一些实施例中，具有这种对单链切割的偏好的大范围核酸酶或其功能片段被用作核酸内切酶结构域，例如，具有切口酶活性。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含大范围核酸酶或其功能片段，其天然靶向或经工程化以靶向安全港位点，例如靶向SH6位点的I-CreI(Rodriguez-Fornes等人、同上)。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含大范围核酸酶或其功能片段，其具有序列耐受催化结构域，例如，识别最小基序CNNNG的I-TevI(Kleinstiver等人PNAS[美国国家科学院院刊]2012)。在一些实施例中，将靶序列耐受性催化结构域融合至DNA结合结构域，例如以指导活性，例如通过将I-TevI融合至：(i)锌指以产生Tev-ZFE(Kleinstiver等人PNAS[美国国家科学院院刊]2012)，(ii)其他大范围核酸酶以产生MegaTevs(Wolfs等人Nucleic Acids Res[核酸研究]2014)，和/或(iii)Cas9以产生TevCas9(Wolfs等人PNAS[核酸研究]2016)。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含限制酶，例如，IIS型或IIP型限制酶。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含IIS型限制酶，例如FokI，或其片段或变体。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含IIP型限制酶，例如PvuII，或其片段或变体。在一些实施例中，二聚体限制酶表达为融合体，从而其作为单链发挥作用，例如，FokI二聚融合体(Minczuk等人Nucleic Acids Res[核酸研究]36(12):3926-3938(2008))。
例如，在Guha和Edgell Int J Mol Sci[国际分子科学杂志]18(22):2565(2017)中描述了另外的核酸内切酶结构域的使用，该文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域(例如，如本文所述)包含酿脓链球菌Cas9(SpCas9)或其功能片段或变体。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含经修饰的SpCas9。在实施例中，经修饰的SpCas9包含改变了原间隔子邻近基序(PAM)特异性的修饰。在实施例中，PAM对核酸序列5’-NGT-3’具有特异性。在实施例中，经修饰的SpCas9包含例如在位置L1111、D1135、G1218、E1219、A1322、或R1335中的一个或多个处的一个或多个氨基酸取代，例如，该一个或多个氨基酸取代选自L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、R1335V。在实施例中，经修饰的SpCas9包含氨基酸取代T1337R和一个或多个另外的氨基酸取代，例如，该一个或多个另外的氨基酸取代选自L1111、D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、R1335Q、T1337、T1337L、T1337Q、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337H、T1337Q、和T1337M，或其对应的氨基酸取代。在实施例中，经修饰的SpCas9包含：(i)一个或多个氨基酸取代，其选自D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、A1322R、R1335Q、和T1337；以及(ii)一个或多个氨基酸取代，其选自L1111R、G1218R、E1219F、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、T1337L、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337R、T1337H、T1337Q、和T1337M，或这些所列举氨基酸取代的对应的氨基酸取代。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域(例如，如本文所述)包含Cas结构域，例如，Cas9结构域。在实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含核酸酶活性Cas结构域、Cas切口酶(nCas)结构域或无核酸酶活性Cas(dCas)结构域。在实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含核酸酶活性Cas9结构域、Cas9切口酶(nCas9)结构域或无核酸酶活性Cas9(dCas9)结构域。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含Cas9的结构域Cas9(例如，dCas9和nCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、或Cas12i。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含Cas9(例如，dCas9和nCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、或Cas12i。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含酿脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，或其功能片段。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含Cas9序列，例如，如Chylinski、Rhun,和Charpentier(2013)RNA Biology[RNA生物学]10:5、726-737中所述；该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含Cas的HNH核酸酶亚结构域和/或RuvC1亚结构域，例如，如本文所述的Cas9，或其变体。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、或Cas12i。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含Cas多肽(例如酶)或其功能片段。在实施例中，Cas多肽(例如，酶)选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9(例如，Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csx11、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、II型Cas效应子蛋白、V型Cas效应子蛋白、VI型Cas效应子蛋白、CARF、DinG、Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、SpCas9(K855A)、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、超精确的Cas9变体(HypaCas9)、其同源物、其经修饰的或经工程化的版本、和/或其功能性片段。在实施例中，Cas9包含一种或多种取代，例如选自H840A、D10A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A,和D1127A。在实施例中，Cas9包含在选自以下的位置处的一个或多个突变：D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、和/或A987，例如，选自D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A、和/或D986A的一个或多个取代。在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含来自以下的Cas(例如，Cas9)序列或其片段或变体：溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、梅毒螺原体(Spiroplasma syrphidicola)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、台湾螺原体(Spiroplasma taiwanense)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、波罗的海贝尔氏菌(Belliella baltica)、扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域(例如，如本文所述)包含Cpf1结构域，例如，包含一个或多个取代，例如，在位置D917、E1006A、D1255或其任何组合，例如，选自D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A、和D917A/E1006A/D1255A。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域(例如，如本文所述)包含spCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9(sp)、saCas9、saCas9-KKH、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK或spCas9-LRVSQL。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域(例如，如本文所述)包含如下表37中所列的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。在一些实施例中，相对于本文所述的任何氨基酸序列，核酸内切酶结构域或DNA结合结构域包含具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个差异(例如，突变)的氨基酸序列。
表37.参考序列中的每一个通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，Gene Writing多肽具有包含Cas9切口酶例如Cas9H840A的核酸内切酶结构域。在实施例中，Cas9H840A具有以下氨基酸序列：
Cas9切口酶(H840A)：
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
在一些实施例中，Gene Writing多肽包含来自逆转录病毒逆转录酶的RT结构域，例如野生型M-MLV RT，例如，包含以下序列：
M-MLV(WT)：
TLNIEDEYRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI
在一些实施例中，Gene Writing多肽包含来自逆转录病毒逆转录酶的RT结构域，例如M-MLV RT，例如，包含以下序列：
TLNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLL
在一些实施例中，Gene Writing多肽包含来自逆转录病毒逆转录酶的RT结构域，该逆转录酶包含NP_057933的氨基酸659-1329的序列。在实施例中，Gene Writing多肽在NP_057933的氨基酸659-1329的序列的N末端进一步包含一个另外的氨基酸，例如，如下所示：
核心RT(粗体)，按上述注释
RNA酶H(下划线)，按上述注释
在实施例中，Gene Writing多肽在NP_057933的氨基酸659-1329序列的C末端进一步包含一个另外的氨基酸。在实施例中，Gene Writing多肽包含RNA酶H1结构域(例如，NP_057933的氨基酸1178-1318)。
在一些实施例中，逆转录病毒逆转录酶结构域，例如M-MLV RT，可以包含野生型序列的一个或多个突变，其可以改善RT的特征，例如热稳定性、持续合成能力和/或模板结合。在一些实施例中，M-MLV RT结构域相对于上述M-MLV(WT)序列包含一个或多个突变，例如选自D200N、L603W、T330P、T306K、W313F、D524G、E562Q、D583N、P51L、S67R、E67K、T197A、H204R、E302K、F309N、L435G、N454K、H594Q、D653N、R110S、K103L，例如突变的组合，例如D200N、L603W,和T330P，任选地进一步包括T306K和W313F。在一些实施例中，本文使用的M-MLV RT包含突变D200N、L603W、T330P、T306K和W313F。在实施例中，突变M-MLV RT包含以下氨基酸序列：
M-MLV(PE2)：
TLNIEDEYRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFNEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGKAGFCRLFIPGFAEMAAPLYPLTKPGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGWLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI
在一些实施例中，Gene Writer多肽可以包含接头，例如肽接头，例如表7中描述的接头。在一些实施例中，Gene Writer多肽包含在核酸内切酶和RT结构域之间的柔性接头，例如，包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS的接头。在一些实施例中，Gene Writer多肽的RT结构域可以位于核酸内切酶结构域的C末端。在一些实施例中，GeneWriter多肽的RT结构域可以位于核酸内切酶结构域的N末端。
表7示例性接头序列
在一些实施例中，Gene Writer多肽包含含有D10A和/或H840A突变的dCas9序列，例如，以下序列：
SMDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
在一些实施例中，用于该系统中的模板RNA分子从5'到3'包含(1)gRNA间隔子；(2)gRNA支架；(3)异源对象序列(4)3'同源结构域。在一些实施例中：
(1)是约18-22nt(例如，20nt)的Cas9间隔子。
(2)是包含一个或多个发夹环的gRNA支架，例如1、2、3个环，用于将模板与切口酶Cas9结构域相关联。在一些实施例中，gRNA支架携带从5'到3'的序列，
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCC。
(3)在一些实施例中，异源对象序列长度是例如7-74，例如10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、或70-80nt或80-90nt。在一些实施例中，序列的第一个(最5')碱基不是C。
(4)在一些实施例中，在切口发生后结合靶引发序列的3'同源结构域是例如3-20nt，例如7-15nt，例如12-14nt。在一些实施例中，3’同源结构域具有40％-60％的GC含量。
与系统相关联的第二gRNA可能有助于驱动完全整合。在一些实施例中，第二gRNA可以靶向距第一链切口0-200nt，例如距第一链切口0-50、50-100、100-200nt的位置。在一些实施例中，第二gRNA只能在进行编辑后结合其靶序列，例如，gRNA结合存在于异源对象序列中但不存在于初始靶序列中的序列。
在一些实施例中，本文所述的Gene Writing系统用于在HEK293、K562、U2OS、或HeLa细胞中进行编辑。在一些实施例中，Gene Writing系统用于在原代细胞(例如，来自E18.5小鼠的原代皮层神经元)中进行编辑。
在一些实施例中，逆转录酶或RT结构域(例如，如本文所述)包含MoMLV RT序列或其变体。在实施例中，MoMLV RT序列包含一种或多种选自以下的突变：D200N、L603W、T330P、T306K、W313F、D524G、E562Q、D583N、P51L、S67R、E67K、T197A、H204R、E302K、F309N、L435G、N454K、H594Q、D653N、R110S、和K103L。在实施例中，MoMLV RT序列包含突变(例如D200N、L603W和T330P)的组合，任选地还包括T306K和/或W313F。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域(例如，如本文所述)包含nCAS9，例如，包含H840A突变。
在一些实施例中，异源对象序列(例如，如本文所述的系统的)长度是约1-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000或更多个核苷酸。
在一些实施例中，RT和核酸内切酶结构域通过柔性接头连接，例如，包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域相对于RT结构域在N末端。在一些实施例中，核酸内切酶结构域相对于RT结构域在C末端。
在一些实施例中，该系统通过TPRT将异源对象序列掺入靶位点，例如，如本文所述。
在一些实施例中，本文所述的系统或方法涉及美国专利申请公开号20200063126、20190002889或20190002875(每一个通过引用以其整体并入本文)中描述的CRISPR DNA靶向酶或系统或其功能片段或变体。例如，在一些实施例中，本文所述的GeneWriter多肽或Cas核酸内切酶包含本段提及的任何申请的多肽序列，并且在一些实施例中，模板RNA或指导RNA包含在本段中提及的任何申请的核酸序列。
模板核酸结合结构域：
Gene Writer多肽通常包含能够与Gene Writer模板核酸(例如，模板RNA)相关联的区域。在一些实施例中，模板核酸结合结构域是RNA结合结构域。在一些实施例中，RNA结合结构域是可与含有特定特征(例如结构基序，例如存在于非LTR逆转录转座子中的3’UTR中的二级结构)的RNA分子相关联的模块结构域。在其他实施例中，模板核酸结合结构域(例如，RNA结合结构域)RNA结合结构域包含在逆转录结构域内，例如，逆转录酶衍生组分具有已知的RNA偏好特征，例如非LTR逆转录转座子3’UTR中存在的二级结构。在其他实施例中，模板核酸结合结构域(例如，RNA结合结构域)包含在DNA结合结构域内。例如，在一些实施例中，DNA结合结构域是识别包含gRNA的模板核酸(例如，模板RNA)的结构的CRISPR相关蛋白。在一些实施例中，gRNA是由参与CRISPR相关蛋白结合的支架序列和针对基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸的靶向序列构成的短合成RNA。Nishimasu等人Cell[细胞]156、第935-949页(2014)描述了完整gRNA的结构。gRNA(也称为单指导RNA的sgRNA)由crRNA和tracrRNA衍生的序列组成，这些序列通过人工四环连接。crRNA序列可分为指导区(20nt)和重复序列区(12nt)，而tracrRNA序列可分为抗重复序列区(14nt)和三个tracrRNA茎环(Nishimasu等人Cell[细胞]156,第935-949页(2014))。在实践中，指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸(例如19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可从商业上获得，用于设计有效的指导RNA。在一些实施例中，gRNA包含来自天然CRISPR系统的两种RNA组分，例如crRNA和tracrRNA。如本领域公知的，gRNA还可以包含嵌合的单指导RNA(sgRNA)，其含有来自tracrRNA(以结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶引导至被靶向进行编辑/结合的序列)的序列。化学修饰的sgRNA也已被证明可有效地与CRISPR相关蛋白一起使用；参见例如，Hendel等人(2015)Nature Biotechnol[自然生物技术].,985-991。在一些实施例中，gRNA包含与靶基因相关联的DNA序列互补的核酸序列。在一些实施例中，多肽包含DNA结合结构域，其包含与gRNA相关联的CRISPR相关蛋白，gRNA允许DNA结合结构域结合靶基因组DNA序列。在一些实施例中，gRNA包含在模板核酸(例如，模板RNA)内，因此DNA结合结构域也是模板核酸结合结构域。在一些实施例中，多肽在多个结构域中具有RNA结合功能，例如，可以结合CRISPR相关DNA结合结构域中的gRNA结构和非LTR逆转录转座子衍生的逆转录结构域中的3’UTR结构。
在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)包含3'靶同源结构域。在一些实施例中，3'靶同源结构域位于异源对象序列的3'并且与跟待由本文所述系统修饰的位点相邻的序列互补，或与跟待由系统/Gene WriterTM修饰的位点相邻的序列互补的序列包含不超过1、2、3、4或5个错配。在一些实施例中，3'靶同源结构域与靶位点退火，这提供了结合位点和3'羟基用于GeneWriter多肽启动TPRT。在一些实施例中，3'靶同源结构域长度是3-5、5-10、10-30、10-25、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-30、11-25、11-20、11-19、11-18、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-30、12-25、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-30、13-25、13-20、13-19、13-18、13-17、13-16、13-15、13-14、14-30、14-25、14-20、14-19、14-18、14-17、14-16、14-15、15-30、15-25、15-20、15-19、15-18、15-17、15-16、16-30、16-25、16-20、16-19、16-18、16-17、17-30、17-25、17-20、17-19、17-18、18-30、18-25、18-20、18-19、19-30、19-25、19-20、20-30、20-25、或25-30nt，例如，长度是10-17、12-16、或12-14nt。
在一些实施例中，模板核酸，例如，模板RNA，可以包含gRNA(例如，pegRNA)。在一些实施例中，模板核酸，例如，模板RNA，可以通过模板核酸的gRNA部分与模板核酸结合结构域(例如RNA结合结构域(例如，异源RNA结合结构域))的相互作用而结合至Gene WriterTM多肽。在一些实施例中，异源RNA结合结构域是CRISPR/Cas蛋白，例如Cas9。
在一些实施例中，包含gRNA的模板核酸(例如模板RNA)的区域采用结合到靶DNA的gRNA的下绕带状结构(例如以下所述：如Mulepati等人Science[科学]2014年9月19日:第345卷,第6203期,第1479-1484页)。不希望受理论束缚，这种非规范结构被认为是通过每六个核苷酸轮换出RNA-DNA杂合体来促进的。因此，在一些实施例中，包含gRNA的模板核酸(例如模板RNA)的区域可以耐受以某个间隔(例如每六个碱基)与靶位点增加的错配。在一些实施例中，包含与靶位点同源的gRNA的模板核酸(例如模板RNA)区域可以具有以规则间隔(例如每六个碱基)的摆动位置，其不需要与靶位点进行碱基配对。
具有诱导活性的gRNA
在一些实施例中，模板核酸，例如模板RNA，包含具有诱导活性的指导RNA(gRNA)。可通过模板核酸例如模板RNA实现诱导活性，该模板核酸(除gRNA之外)还包含阻断结构域，其中部分或全部阻断结构域的序列至少部分互补于gRNA的一部分或全部。因此，阻断结构域能够与gRNA的一部分或全部杂交或基本上杂交。在一些实施例中，阻断结构域和诱导活性gRNA布置在模板核酸例如模板RNA上，使得gRNA可以采用第一构象(其中阻断结构域与gRNA杂交或基本上杂交)和第二构象(其中阻断结构域不与gRNA杂交或基本上不杂交)。在一些实施例中，在第一构象中，gRNA不能结合Gene Writer多肽(例如，模板核酸结合结构域、DNA结合结构域或核酸内切酶结构域(例如，CRISPR/Cas蛋白))或以与缺乏阻断结构域的相似模板RNA相比亲和力显著降低的方式结合。在一些实施例中，在第二构象中，gRNA能够结合Gene Writer多肽(例如，模板核酸结合结构域、DNA结合结构域或核酸内切酶结构域(例如，CRISPR/Cas蛋白))。在一些实施例中，gRNA是处于第一构象还是第二构象可影响(例如Gene Writer多肽所包含的CRISPR/Cas蛋白的)Gene Writer多肽的DNA结合或核酸内切酶活性是否有活性。在一些实施例中，gRNA与阻断结构域的杂交可以使用开放分子破坏。在一些实施例中，开放分子包含与gRNA的部分或全部或阻断结构域结合并抑制gRNA与阻断结构域杂交的试剂。在一些实施例中，开放分子包含核酸，例如，包含与gRNA、阻断结构域或两者部分地或完全地互补的序列。通过选择或设计合适的开放分子，提供的开放分子可以促进gRNA构象的变化，使其可以与CRISPR/Cas蛋白相关联并提供CRISPR/Cas蛋白的相关功能(例如，DNA结合和/或核酸内切酶活性)。不希望受理论束缚，在选定的时间和/或位置提供开放分子可以允许对gRNA、CRISPR/Cas蛋白或包含它们的Gene Writer系统的活性进行空间和时间控制。在一些实施例中，Gene Writer可包含如表9或表37所列的Cas蛋白或其功能片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
表.9CRISPR/Cas蛋白、物种和突变
表9B提供了定义用于设计gRNA和/或模板RNA的必要组分的参数，以将表3A中列出的Cas变体应用于Gene Writing。如果它们可用于给定基因座处，则等级表示优选Cas变体。切割位点指示经验证或预测的前间隔子邻近基序(PAM)要求、经验证或预测的切割位点位置(相对于PAM位点的最上游碱基)。给定酶的gRNA可以通过连接crRNA、Tetraloop和tracrRNA序列，并进一步在间隔子(min)和间隔子(max)内添加长度与靶位点的前间隔子匹配的5'间隔子来组装。此外，ssDNA切口在靶标上的预测位置对于设计模板RNA的3'区域(其需要立即与切口5'的序列退火，以启动靶引发的逆转录)很重要。
表9B定义用于设计gRNA和/或模板RNA的必要组分的参数以将表9A中列出的Cas变体应用于Gene Writing
在一些实施例中，开放分子对于包含Gene Writer多肽和/或模板核酸的细胞是外源的。在一些实施例中，开放分子包含内源试剂(例如，对于包含Gene Writer多肽和/或模板核酸(其包含gRNA和封闭结构域)的细胞而言是内源的)。例如，可以选择诱导型gRNA、封闭结构域和开放分子，使得开放分子是在靶细胞或组织中表达的内源试剂，例如，从而确保Gene Writer系统在靶细胞或组织中的活性。作为另一个实例，可以选择诱导型gRNA、封闭结构域和开放分子，使得开放分子在一个或多个非靶细胞或组织中不存在或基本上不表达，例如，从而确保Gene Writer系统的活性在一种或多种非靶细胞或组织中不发生或基本上不发生，或与靶细胞或组织相比以降低的水平发生。示例性阻断结构域、开放分子及其用途在PCT申请公开WO2020044039A1(其通过引用以其整体并入本文)中描述。在一些实施例中，模板核酸，例如模板RNA，可以包含一个或多个UTR(例如来自R2型逆转录转座子)和gRNA。在一些实施例中，UTR促进模板核酸(例如，模板RNA)与Gene Writer多肽的书写结构域，例如逆转录酶结构域的相互作用。在一些实施例中，gRNA促进与多肽的模板核酸结合结构域(例如，RNA结合结构域)的相互作用。在一些实施例中，gRNA将多肽引导至匹配的靶序列，例如，在靶细胞基因组中。在一些实施例中，模板核酸可以仅包含逆转录酶结合基序(例如来自R2的3’UTR)，并且gRNA可以作为用于靶位点识别的第二核酸分子(例如第二RNA分子)提供。在一些实施例中，含有RT结合基序的模板核酸可以与gRNA存在于同一分子上，但通过切割活性(例如核酶)加工成两个RNA分子。
在一些实施例中，可以定制模板RNA以校正靶细胞基因组DNA中的给定突变(例如，离体或体内，例如在靶组织或器官中，例如在受试者中)。例如，突变可以是相对于野生型序列的疾病相关突变。不希望受理论束缚，经验参数组有助于确保模板RNA或其部分的最佳初始计算机模拟设计。作为非限制性说明性实例，对于选择的突变，可以采用以下设计参数。在一些实施例中，通过获取突变任一侧上大约500bp(例如，高达50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、或700bp并且任选地至少20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、或650bp)侧翼序列启动设计以作为靶区域。在一些实施例中，模板核酸包含gRNA。设计gRNA的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施例中，gRNA包含结合靶位点的序列(例如，CRISPR间隔区)。通过以下来选择结合靶位点的序列(例如CRISPR间隔子)用于将模板核酸靶向靶区域：考虑所使用的特定Gene Writer多肽(例如，核酸内切酶结构域或书写结构域，例如，包含CRISPR/Cas结构域)(例如，对于Cas9，紧邻20ntgRNA结合区3’的NGG的原间隔子邻近基序(PAM))。在一些实施例中，通过首先根据PAM是否将被Gene Writing诱导的编辑破坏来选择CRISPR间隔子。在一些实施例中，PAM的中断可以提高编辑效率。在一些实施例中，可以通过以下来破坏PAM：还在Gene Writing期间在靶位点中(例如，作为基因组DNA中靶位点的另一种修饰的一部分或除此之外再)引入沉默突变(例如，不改变由靶核酸序列编码的氨基酸残基的突变，如果有的话)。在一些实施例中，通过以下来选择CRISPR间隔子：根据其相应基因组位点与所期望编辑位置的接近程度对序列进行排序。在一些实施例中，gRNA包含gRNA支架。在一些实施例中，使用的gRNA支架可以是标准支架(例如，对于Cas9，5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCC-3’)，或者可以包含一个或多个核苷酸取代。在一些实施例中，异源对象序列与第一链切口3’的靶位点(例如，第一链切口的紧邻3’或第一链切口3’的多达1、2、3、4或5个核苷酸)具有至少90％的同一性，例如至少90％、95％、98％、99％或100％的同一性，或包含不超过1、2、3、4或5个非同一性位置，除了可由GeneWriter写入靶位点的任何插入、取代或缺失。在一些实施例中，3’靶同源结构域与第一链切口5’的靶位点(例如，第一链缺口的紧邻5’或第一链缺口3’的多达1、2、3、4或5个核苷酸)具有至少90％的同一性，例如，至少90％、95％、98％、99％或100％的同一性，或包含不超过1、2、3、4或5个非同一性位置。
在一些实施例中，模板RNA可以包含gRNA序列，例如，以将GeneWriter引导至目的靶位点。在一些实施例中，模板RNA包含(例如，从5'到3')(i)任选地结合靶位点(例如，靶基因组中位点的第二链)的序列(例如，CRISPR间隔子)，(ii)任选地结合本文该多肽(例如，GeneWriter或Cas多肽)的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)5'同源结构域和/或3'靶同源结构域。
在一些实施例中，模板核酸分子包含5'同源结构域和/或3'同源结构域。在一些实施例中，5'同源结构域包含与包含在靶核酸分子中的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核酸序列。在实施例中，靶核酸分子中的核酸序列在靶插入位点(例如，相对于靶插入位点在5’)的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个核苷酸内，例如，对于异源对象序列，例如，包含在模板核酸分子中。
在一些实施例中，3'同源结构域包含与包含在靶核酸分子中的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核酸序列。在实施例中，靶核酸分子中的核酸序列在靶插入位点(例如，相对于靶插入位点在3’)的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个核苷酸内，例如，对于异源对象序列，例如，包含在模板核酸分子中。在一些实施例中，5'同源结构域与模板核酸分子的其余部分是异源的。在一些实施例中，3'同源结构域与模板核酸分子的其余部分是异源的。
在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)包含3'靶同源结构域。在一些实施例中，3'靶同源结构域位于异源对象序列的3'并且与跟待由本文所述系统修饰的位点相邻的序列互补，或与跟待由系统/Gene WriterTM修饰的位点相邻的序列互补的序列包含不超过1、2、3、4或5个错配。在一些实施例中，3'同源结构域在靶核酸分子中切口位点的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内结合。在一些实施例中，3'同源结构域与靶核酸分子的结合允许启动靶引发的逆转录(TPRT)，例如，3'同源结构域充当TPRT的引物。
针对经修饰的RNA(例如gRNA或模板RNA)的方法和组合物
在一些实施例中，系统的RNA组分(例如，模板RNA或gRNA，例如，如本文所述)包含一个或多个核苷酸修饰。在一些实施例中，与未修饰或末端修饰的指导物相比，gRNA的修饰模式可显著影响体内活性(例如，如以下所示：来自Finn等人Cell Rep[细胞报道]22(9):2227-2235(2018)的图1D；通过引用以其整体并入本文)。不希望受理论束缚，该过程可能至少部分归因于修饰赋予的RNA稳定性。这种修饰的非限制性实例可以包括2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-0-(2-甲氧基乙基)(2'-0-MOE)、2'-氟(2'-F)、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键、G-C取代以及核苷酸及其等价物之间的反向无碱基连接。
在一些实施例中，模板RNA(例如，在其结合靶位点的部分)或指导RNA包含5'末端区域。在一些实施例中，模板RNA或指导RNA不包含5'末端区域。在一些实施例中，5'末端区包含CRISPR间隔子区，例如，如Briner AE等人、Molecular Cell[分子细胞]56:333-339(2014)中关于sgRNA所描述的(通过引用整体并入本文；适用于本文，例如，对于所有指导RNA)。在一些实施例中，5'末端区域包含5'末端修饰。在一些实施例中，具有或不具有间隔子的5'末端区域可以与crRNA、trRNA、sgRNA和/或dgRNA相关联。在一些情况下，CRISPR间隔子可以包含指导区、指导结构域或靶向结构域。在一些实施例中，靶结构域或靶序列可以包含指导区/结构域引导核酸酶切割的核酸序列。在一些实施例中，spyCas9蛋白可以通过存在于CRISPR间隔子中的核苷酸被指导区/结构域引导至靶核酸分子的靶序列。
在一些实施例中，模板RNA(例如，在其结合靶位点的部分处)或指导RNA，例如如本文所述，包含WO 2018107028A1(通过引用以其整体并入本文)的表4中所示的任何序列。在一些实施例中，当序列显示指导区和/或间隔子区时，组合物可以包含或不包含该区域。在一些实施例中，指导RNA包含WO 2018107028 A1的表4中所示的任何序列(例如，如其中由SEQ ID NO表示)的一个或多个修饰。在实施例中，核苷酸可以相同或不同，和/或所示的修饰模式可以与WO 2018107028 A1的表4中所示的指导序列的修饰模式相同或相似。在一些实施例中，修饰模式包括gRNA或gRNA区域(例如5'末端区域、下部茎区、凸起区、上部茎区、连结区、发夹1区、发夹2区，3'末端区域))的修饰的相对位置和同一性。在一些实施例中，修饰模式包含WO 2018107028 A1的表4的序列栏中所示的任一序列的修饰和/或在该序列的一个或多个区域上的修饰的至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。在一些实施例中，修饰模式与WO 2018107028 A1的表4的序列栏中所示的任一序列的修饰模式至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，修饰模式在WO 2018107028 A1的表4中所示序列的一个或多个区域(例如，在5’末端区域、下茎区域、凸起区域、上茎区域、连结区、发夹1区、发夹2区，和/或3’末端区域)上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同。在一些实施例中，修饰模式与5'末端区域上序列的修饰模式至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同。在一些实施例中，修饰模式在下茎上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同。在一些实施例中，修饰模式在凸起上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，修饰模式在上茎上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同。在一些实施例中，修饰模式在连结区上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同。在一些实施例中，修饰模式发夹1上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，修饰模式发夹2上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，修饰模式在3'端上至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同。在一些实施例中，修饰模式与WO2018107028 A1的表4的序列或这样的序列的区域(例如5'末端、下茎、凸起、上茎、连结、发夹1、发夹2、3'末端)的修饰模式例如在0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸处不同。在一些实施例中，gRNA包含修饰，这些修饰与WO 2018107028 A1的表4的序列的修饰例如在0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸处不同。在一些实施例中，gRNA包含修饰，这些修饰语WO2018107028 A1的表4的序列的区域(例如，5'末端、下茎、凸起、上茎、连结、发夹1、发夹2、3'末端)的修饰例如在0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸处不同。
在一些实施例中，模板RNA(例如，在其结合靶位点的部分)或gRNA包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施例中，gRNA包含2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修饰的核苷酸。在一些实施例中，gRNA包含2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施例中，gRNA包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施例中，gRNA包含5'末端修饰、3'末端修饰或5'和3'末端修饰。在一些实施例中，5'末端修饰包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施例中，5'末端修饰包含2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-MOE)和/或2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施例中，5'末端修饰包含至少一个硫代磷酸酯(PS)键和2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-MOE)和/或2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸中的一个或多个。末端修饰可以包含硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-MOE)和/或2'-氟(2'-F)修饰。等效的末端修饰也包含在本文所述的实施例中。在一些实施例中，模板RNA或gRNA包含末端修饰与模板RNA或gRNA的一个或多个区域的修饰组合。用于保护RNA(例如gRNA)的其他示例性修饰和方法及其式在WO2018126176 A1(其通过引用以其整体并入本文)中进行了描述。
在一些实施例中，结构指导的且系统的方法用于将修饰(例如，2′-OMe-RNA、2′-F-RNA、和PS修饰)引入模板RNA或指导RNA，例如，如在Mir等人Nat Commun[自然通讯]9:2641(2018)(通过引用整体并入本文)中描述。在一些实施例中，2'-F-RNA的掺入增加了RNA:RNA或RNA:DNA双链体的热稳定性和核酸酶稳定性，例如，同时对C3'-内糖褶皱的干扰最小。在一些实施例中，在2'-OH对RNA:DNA双链体稳定性很重要的位置，2'-F可能比2'-OMe具有更好的耐受性。在一些实施例中，crRNA包含一个或多个不降低Cas9活性的修饰，例如C10、C20或C21(完全修饰的)，例如，如Mir等人Nat Commun[自然通讯]9:2641(2018)(通过引用整体并入本文)的补充表1中所述。在一些实施例中，tracrRNA包含一个或多个不降低Cas9活性的修饰，例如Mir等人Nat Commun[自然通讯]9:2641(2018)的补充表1中所述的T2、T6、T7或T8(完全修饰的)。在一些实施例中，包含一个或多个修饰(例如，如本文所述)的crRNA可以与包含一个或多个修饰(例如C20和T2)的tracrRNA配对。在一些实施例中，gRNA包含例如crRNA和tracrRNA的嵌合体(例如，Jinek等人Science[科学]337(6096):816-821(2012))。在实施例中，来自crRNA和tracrRNA的修饰被映射到单指导嵌合体上，例如，以产生具有增强稳定性的经修饰的gRNA。
在一些实施例中，gRNA分子可以通过添加或减少天然存在的结构组分例如发夹来修饰。在一些实施例中，gRNA可包含缺失了一个或多个3'发夹元件的gRNA，例如，如WO2018106727(通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，gRNA可以包含添加的发夹结构，例如，在间隔子区中添加的发夹结构，其在Kocak等人Nat Biotechnol[自然生物技术]37(6):657-666(2019)的教导中显示增加CRISPR-Cas系统的特异性。其他修饰，包括缩短的gRNA和提高体内活性的特定修饰的实例可以在US20190316121(通过引用以其整体并入本文)中找到。
在一些实施例中，结构指导的且系统的方法(例如，如以下中所述：Mir等人NatCommun[自然通讯]9:2641(2018)；通过引用以其整体并入本文)用于寻找模板RNA的修饰。在实施例中，通过包含或排除模板RNA的指导区来鉴定修饰。在一些实施例中，与模板RNA结合的多肽结构用于确定RNA的非蛋白质接触核苷酸，然后可以选择这些核苷酸进行修饰，例如，其中破坏RNA与多肽结合的风险较低。模板RNA中的二级结构也可以通过软件工具在计算机上预测，例如RNAstructure工具可在以下获得：rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb(Bellaousov等人Nucleic Acids Res[核酸研究]41:W471-W474(2013)；通过引用以其整体并入本文)，例如，以确定用于选择修饰的二级结构，例如发夹、茎和/或凸起。
预期在靶细胞内的配制、递送或Gene Writing反应期间采用环状和/或线性RNA状态可能是有用的。因此，在本文所述的任何方面的一些实施例中，Gene Writing系统包含一个或多个环状RNA(circRNA)。在本文所述的任何方面的一些实施例中，Gene Writing系统包含一个或多个线性RNA。在一些实施例中，如本文所述的核酸(例如，模板核酸、编码GeneWriter多肽的核酸分子，或两者)是环状RNA。在一些实施例中，环状RNA分子编码GeneWriter多肽。在一些实施例中，将编码Gene Writer多肽的circRNA分子递送至宿主细胞。在一些实施例中，环状RNA分子编码重组酶，例如，如本文所述。在一些实施例中，将编码重组酶的circRNA分子递送至宿主细胞。在一些实施例中，编码Gene Writer多肽的circRNA分子在翻译之前被线性化(例如，在宿主细胞中，例如，在宿主细胞的细胞核中)。
已发现环状RNA(circRNA)天然存在于细胞中，并且已发现其具有不同的功能，包括在人类细胞中的非编码和蛋白编码作用。已显示，可以通过将自剪接内含子掺入到RNA分子(或编码RNA分子的DNA)中，导致RNA环化来工程化circRNA，并且工程化的circRNA可以具有增强的蛋白质产生和稳定性(Wesselhoeft等人Nature Communications[自然通讯]2018)。在一些实施例中，Gene WriterTM多肽被编码为circRNA。在某些实施例中，模板核酸是DNA，例如dsDNA或ssDNA。
在一些实施例中，circRNA包含一个或多个核酶序列。在一些实施例中，核酶序列被激活用于例如在宿主细胞中自切割，例如，从而导致circRNA的线性化。在一些实施例中，当镁的浓度达到例如在宿主细胞中切割的足够水平时，核酶被激活。在一些实施例中，circRNA在递送至宿主细胞之前保持在低镁环境中。在一些实施例中，核酶是蛋白反应性核酶。在一些实施例中，核酶是核酸反应性核酶。在一些实施例中，circRNA包含切割位点。在一些实施例中，circRNA包含第二切割位点。
在一些实施例中，circRNA在靶细胞的细胞核中被线性化。在一些实施例中，细胞核中circRNA的线性化涉及细胞核中存在的组分，例如以激活切割事件。例如，B2和ALU逆转录转座子含有自切割核酶，其活性通过与多梳蛋白EZH2相互作用而增强(Hernandez等人PNAS[美国国家科学院院刊]117(1):415-425(2020))。因此，在一些实施例中，将核酶(例如来自B2或ALU元件的核酶)掺入到例如Gene Writing系统的circRNA中，该核酶对核元件(例如核蛋白，例如基因组相互作用蛋白，例如表观遗传修饰剂，例如EZH2)有反应。在一些实施例中，circRNA的核定位导致核酶的自催化活性增加和circRNA的线性化。
在一些实施例中，核酶与Gene Writing系统的一种或多种其他组分是异源的。在一些实施例中，可诱导的核酶(例如，在本文所述的circRNA中)是合成产生的，例如，通过利用蛋白质配体反应性适体设计。已描述了利用烟草环斑病毒锤头状核酶的卫星RNA与MS2外壳蛋白适体的系统(Kennedy等人Nucleic Acids Res[核酸研究]42(19):12306-12321(2014)，其通过引用以其全文并入本文)，其在MS2外壳蛋白的存在下导致核酶活性的激活。在实施例中，这样的系统对定位于细胞质或细胞核的蛋白质配体产生反应。在一些实施例中，蛋白质配体不是MS2。已经描述了用于产生靶标配体的RNA适体的方法，例如，基于通过指数富集的配体系统进化(SELEX)(Tuerk和Gold,Science[科学]249(4968):505-510(1990)；Ellington和Szostak,Nature[自然]346(6287):818-822(1990)；每一个的方法通过引用并入本文)并且在某些情况下得到计算机模拟设计的帮助(Bell等人PNAS[美国国家科学院院刊]117(15):8486-8493，其方法通过引用并入本文)。因此，在一些实施例中，产生用于靶配体的适体并将其掺入合成核酶系统中，例如引发核酶介导的切割和circRNA线性化，例如在蛋白质配体存在下。在一些实施例中，circRNA线性化在细胞质中被引发，例如，使用与细胞质中的配体相关联的适体。在一些实施例中，circRNA线性化在细胞核中被引发，例如，使用与细胞核中的配体相关联的适体。在实施例中，核中的配体包含表观遗传修饰剂或转录因子。在一些实施例中，引发线性化的配体以高于脱靶细胞的水平存在于中靶细胞中。
还预期核酸反应性核酶系统可用于circRNA线性化。例如，在例如Penchovsky(Biotechnology Advances[生物技术进展]32(5):1015-1027(2014)，通过引用并入本文)中描述了感测确定的靶核酸分子以引发核酶激活的生物传感器。通过这些方法，核酶自然折叠成非活性状态，并且仅在存在确定的靶核酸分子(例如，RNA分子)的情况下才被激活。在一些实施例中，Gene Writing系统的circRNA包含核酸反应性核酶，其在存在确定的靶核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA、指导RNA、gRNA、sgRNA、ncRNA、lncRNA、tRNA、snRNA或mtRNA)的情况下被激活。在一些实施例中，引发线性化的核酸以高于脱靶细胞的水平存在于中靶细胞中。
在本文任何方面的一些实施例中，Gene Writing系统掺入一种或多种对目的靶组织或靶细胞具有可诱导特异性的核酶，例如，被目的靶组织或靶细胞中以较高水平存在的配体或核酸激活的核酶。在一些实施例中，Gene Writing系统掺入对亚细胞区室(例如细胞核、核仁、细胞质或线粒体)具有可诱导特异性的核酶。在一些实施例中，核酶被以较高水平存在于靶亚细胞区室中的配体或核酸激活。在一些实施例中，Gene Writing系统的RNA组分作为circRNA提供，例如通过线性化激活。在一些实施例中，编码Gene Writing多肽的circRNA的线性化激活分子进行翻译。在一些实施例中，激活Gene Writing系统的circRNA组分的信号以更高水平存在于中靶细胞或组织中，例如使得该系统在这些细胞中被特异性激活。
在一些实施例中，Gene Writing系统的RNA组分作为通过线性化失活的circRNA提供。在一些实施例中，编码Gene Writing多肽的circRNA通过切割和降解而失活。在一些实施例中，编码Gene Writing多肽的circRNA通过将翻译信号与多肽的编码序列分开的切割而失活。在一些实施例中，使Gene Writing系统的circRNA组分失活的信号以较高水平存在于脱靶细胞或组织中，使得该系统在这些细胞中被特异性失活。
这里还包括用于组装完整或部分模板RNA分子(例如，Gene Writing模板RNA分子，任选地包含gRNA，或单独的gRNA分子)的组合物和方法。在一些实施例中，RNA分子可以通过两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)RNA区段彼此连接来组装。在一个方面，本披露提供了用于产生核酸分子的方法，该方法包括在允许第一RNA区段的5'末端与第二RNA区段的3'末端共价连接的条件下使两个或更多个线性RNA区段彼此接触。在一些实施例中，连接分子可以在允许连接分子的5'末端与第三RNA区段的3'末端共价连接的条件下与第三RNA区段接触。在实施例中，该方法进一步包括将第四、第五或另外的RNA区段连接到伸长的分子。在某些情况下，这种组装形式可以允许快速有效地组装RNA分子。
本披露还提供用于crRNA分子和tracrRNA分子的连接(例如，共价连接)的组合物和方法。在一些实施例中，可以使用与靶位点特异性crRNA分子/区段连接的单个tracrRNA分子/区段产生对不同靶位点具有特异性的指导RNA分子(例如，如US 20160102322 A1的图10所示；通过引用以其整体并入本文)。例如，US 20160102322 A1的图10显示了具有不同crRNA分子的四个管，其中crRNA分子3连接到tracrRNA分子以形成指导RNA分子，从而描绘了两个RNA区段的示例性连接以形成产物RNA分子。
本披露还提供了用于产生对Gene Writer多肽和/或基因组靶位点具有特异性的模板RNA分子的组合物和方法。在一个方面，该方法包括：(1)靶位点的鉴定和对其的期望修饰，(2)RNA区段的产生，包括上游同源区段、异源对象序列区段、Gene Writer多肽结合基序和gRNA区段，和/或(3)将四个或更多个区段连接成至少一个分子，例如，连接成单个RNA分子。在一些实施例中，将(2)中包含的一些或所有模板RNA区段组装成模板RNA分子，例如列出的组分中的一种、两种、三种或四种。在一些实施例中，(2)中包含的区段段可以在另外的区段化分子中产生，例如，分成至少2个、至少3个、至少4个或至少5个或更多个子区段，它们例如随后例如通过本文所述的一种或多种方法组装。
在一些实施例中，RNA区段可以通过化学合成产生。在一些实施例中，RNA区段可以通过核酸模板的体外转录产生，例如通过提供RNA聚合酶以作用于DNA模板的同源启动子以产生RNA转录物。在一些实施例中，使用例如T7、T3、或SP6RNA聚合酶或其衍生物进行体外转录，该RNA聚合酶或其衍生物作用于DNA(例如，dsDNA、ssDNA、线性DNA、质粒DNA、线性DNA扩增子、线性化质粒DNA)，该DNA例如编码RNA区段，例如在同源启动子(例如，T7、T3或SP6启动子)的转录控制下。在一些实施例中，化学合成和体外转录的组合用于产生RNA区段以便组装。在实施例中，gRNA、上游靶同源性和Gene Writer多肽结合区段通过化学合成产生，并且异源对象序列区段通过体外转录产生。在不希望受理论约束的情况下，体外转录可能更适合于产生较长的RNA分子。在一些实施例中，可降低体外转录的反应温度，例如低于37℃(例如，在0-10℃、10-20℃或20-30℃之间)，以导致更高比例的全长转录物(Krieg NucleicAcids Res[核酸研究]18:6463(1990))。在一些实施例中，采用改进长转录物合成的方案来合成长模板RNA，例如大于5kb的模板RNA，例如使用可以在体外产生27kb转录物的T7RiboMAX表达(Thiel等人J Gen Virol[普通病毒学杂志]82(6):1273-1281(2001))。在一些实施例中，如本文所述对RNA分子的修饰可以在RNA区段合成期间(例如，通过包含经修饰的核苷酸或替代性的结合化学物质)、在通过化学或酶促过程合成RNA区段之后、在一个或多个RNA区段组装之后或其组合中掺入。
在一些实施例中，使用T7聚合酶介导的DNA依赖性RNA转录从线性化DNA模板体外合成系统的mRNA(例如，编码Gene Writer多肽的mRNA)，其中UTP任选地被1-甲基假UTP取代。在一些实施例中，转录物并入5'和3’UTR，例如GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC和UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA或其功能片段或变体，并且任选地包括聚A尾，其可以在DNA模板中编码或在转录后酶促添加。在一些实施例中，将供体甲基集团，例如S-腺苷甲硫氨酸添加到具有cap 0结构的甲基化加帽RNA以产生增加mRNA翻译效率的cap 1结构(Richner等人Cell[细胞]168(6):第1114-1125页(2017))。
在一些实施例中，来自T7启动子的转录物以GGG基序起始。在一些实施例中，来自T7启动子的转录物不以GGG基序起始。已经表明，在转录起始处的GGG基序尽管提供了更高的产率，但由于转录物在模板链的三个C残基上发生从+1到+3的滑移，转录起始处的GGG基序可能导致T7RNAP合成聚(G)产物的阶梯(Imburgio等人.Biochemistry[生物化学]39(34):10419-10430(2000))。对于调整转录水平和改变转录起始位点核苷酸以适应替代性的5’UTR，Davidson等人.Pac Symp Biocomput[Pac Symp生物计算]433-443(2010)的传授内容描述了满足这两个特征的T7启动子变体及其发现方法。
在一些实施例中，RNA区段可以通过共价偶联彼此连接。在一些实施例中，RNA连接酶(例如，T4RNA连接酶)可用于将两个或更多个RNA区段彼此连接。当使用诸如RNA连接酶的试剂时，5′末端典型地与3′末端连接。在一些实施例中，如果将两个区段连接，则可以形成两种可能的线性构建体(即，(1)5′-区段1-区段2-3′和(2)5′-区段2-区段1-3′)。在一些实施例中，还可以发生分子内环化。这两个问题可以例如通过阻断一个5′末端或一个3′末端以使RNA连接酶不能将末端连接到另一个末端来解决。在实施例中，如果需要构建体5′-区段1-区段2-3′，则将阻断基团置于区段1的5′端或区段2的3′端可导致仅形成正确的线性连接产物和/或防止分子内环化。用于共价连接两个核酸(例如，RNA)区段的组合物和方法连同包括使用RNA连接酶将两个单链RNA区段彼此定向连接的方法披露于例如US20160102322 A1(通过引用以其全文并入本文)中。
可以与例如T4RNA连接酶结合使用的末端阻断剂的一个实例是双脱氧终止子。T4RNA连接酶典型地催化5′-磷酸和3′-羟基末端之间磷酸二酯键的ATP依赖性连接。在一些实施例中，当使用T4RNA连接酶时，合适的末端必须存在于被连接的末端上。在末端阻断T4RNA连接酶的一种手段包括不具有正确的末端形式。通常，具有5-羟基或3'-磷酸的RNA区段的末端不会充当T4RNA连接酶的底物。
可用于连接RNA区段的另外的示例性方法是通过点击化学(例如，如美国专利号7,375,234和7,070,941以及美国专利公开号2013/0046084中所述，其中的全部披露通过引用并入本文)。例如，一种示例性的点击化学反应是在炔烃基团和叠氮化物基团之间进行(参见US 20160102322 A1的图11，其通过引用以其全文并入本文)。任何点击反应都有可能被用于连接RNA区段(例如，Cu-叠氮化物-炔烃、菌株促进的叠氮化物-炔烃、施陶丁格(Staudinger)连接、四嗪连接、光诱导的四唑-烯烃、硫醇-烯、NHS酯、环氧化物、异氰酸酯和醛-氨基氧基)。在一些实施例中，使用点击化学反应连接RNA分子是有利的，因为点击化学反应快速、模块化、高效，通常不产生有毒废产物，可以用水作为溶剂进行，和/或可以设置成具有立体特异性。
在一些实施例中，可以使用叠氮化物-炔烃胡伊斯根环加成(HuisgenCycloaddition)反应连接RNA区段，该反应典型地是叠氮化物与末端或内部炔烃之间的1,3-偶极环加成，其得到用于连接RNA区段的1,2,3-三唑。在不希望受理论约束的情况下，该连接方法的一个优点可以是该反应可以通过添加所需的Cu(I)离子来引发。RNA区段可以连接的其他示例性机制包括但不限于使用卤素(F-、Br-、I-)/炔烃加成反应、羰基/巯基/马来酰亚胺和羧基/胺连接。例如，可以在3′处用硫醇修饰一个RNA分子(使用二硫键亚酰胺和通用支持物或二硫化物修饰的支持物)，并且可以在5′处用acrydite修饰另一个RNA分子(使用丙烯酸亚磷酰胺)，然后可以通过迈克尔(Michael)加成反应将两个RNA分子连接。该策略也可以应用于逐步连接多个RNA分子。还提供了用于将多于两个(例如，三个、四个、五个、六个等)RNA分子彼此连接的方法。在不希望受理论约束的情况下，当所需的RNA分子长于约40个核苷酸时，这可能是有用的，例如，使得化学合成效率降低，例如，如US 20160102322A1(其通过引用以其全文并入本文)中所指明。
举例来说，tracrRNA的长度通常约为80个核苷酸。此类RNA分子可以例如通过诸如体外转录或化学合成的过程来产生。在一些实施例中，当化学合成用于产生此类RNA分子时，它们可以作为单一合成产物或通过将两个或更多个合成的RNA区段彼此连接来产生。在实施例中，当三个或更多个RNA区段彼此连接时，可以使用不同的方法将各个区段连接在一起。此外，RNA区段可以在一锅(例如，容器、器皿、孔、管、板或其他接受器)中、全部同时或在一锅中在不同时间或在不同锅中在不同时间彼此连接。在非限制性实例中，为了按数字顺序组装RNA区段1、2和3，可以首先将RNA区段1和2从5'到3'彼此连接。然后可以纯化反应产物的反应混合物组分(例如，通过色谱法)，然后放置在第二锅中，以便将3′末端与RNA区段3的5′末端连接。然后可以将最终反应产物与RNA区段3的5′末端连接。
在另一个非限制性实例中，RNA区段1(约30个核苷酸)是crRNA的靶基因座识别序列和发夹区1的部分。RNA区段2(约35个核苷酸)含有发夹区1的其余部分和发夹区1与发夹区2之间的一些线性tracrRNA。RNA区段3(约35个核苷酸)含有发夹区1与发夹区2之间的线性tracrRNA的其余部分以及全部的发夹区2。在该实例中，使用点击化学将RNA区段2和3从5′到3′连接。此外，反应产物的5′和3′末端均被磷酸化。然后使反应产物与具有3′末端羟基基团的RNA区段1和T4RNA连接酶接触以产生指导RNA分子。
许多另外的连接化学物质可以用于根据本发明的方法连接RNA区段。这些化学物质中的一些阐述于US 20160102322 A1的表6中，该文献通过引用以其全文并入本文。
DNA结合结构域：
在某些方面，选择、设计或构建本文所述的Gene Writer多肽的DNA结合结构域以结合期望的宿主DNA靶序列。在某些实施例中，工程化的逆转录转座子的DNA结合结构域是相对于天然逆转录转座子序列的异源DNA结合蛋白或结构域。在一些实施例中，异源DNA结合元件是锌指元件或TAL效应子元件，例如锌指或TAL多肽或其功能片段。在一些实施例中，异源DNA结合元件是序列指导的DNA结合元件，例如Cas9、Cpf1或其他已被改变为不具有核酸内切酶活性的CRISPR相关蛋白。在一些实施例中，异源DNA结合元件保留核酸内切酶活性。在一些实施例中，异源DNA结合元件替代多肽的核酸内切酶元件。在具体实施例中，异源DNA结合结构域可以是Cas9(例如，Cas9、Cas9切口酶、dCas9)、TAL结构域、锌指(ZF)结构域、Myb结构域、其组合或其多个中的任何一种或多种。在某些实施例中，异源DNA结合结构域是表X、表Z1、表Z2或表3A或3B中所述的逆转录转座子的DNA结合结构域。在一些实施例中，可以使用基本局部比对搜索工具(BLAST)等工具基于与其他已知DNA结合结构域的同源性来鉴定DNA结合结构域。在其他实施例中，例如通过位点特异性突变、增加或减少DNA结合元件(例如锌指的数量和/或特异性)等来修饰DNA结合结构域，以改变DNA结合特异性和亲和力。在一些实施例中，DNA结合结构域从其天然序列改变为具有改变的密码子使用，例如，针对人细胞进行改善。
在一些实施例中，DNA结合结构域包含大范围核酸酶结构域(例如，如本文所述，例如，在核酸内切酶结构域部分中)，或其功能片段。在一些实施例中，大范围核酸酶结构域具有核酸内切酶活性、例如双链切割和/或切口酶活性。在其他实施例中，大范围核酸酶结构域具有降低的活性，例如，缺乏核酸内切酶活性，例如，该大范围核酸酶无催化活性。在一些实施例中，无催化活性的大范围核酸酶用作DNA结合结构域，例如，如Fonfara等人NucleicAcids Res[核酸研究]40(2):847-860(2012)中所述，该文献通过引用以其全文并入本文。在实施例中，该DNA结合结构域相对于野生型DNA结合结构域包含一个或多个修饰、例如经由定向进化(例如，噬菌体辅助的连续进化(PACE))的修饰。
在本发明的某些方面，由Gene Writer系统整合的宿主DNA结合位点可以在基因中、内含子中、外显子中、ORF中、在任何基因的编码区之外、在调节子中、在基因的调节区域内、或在基因的调节区域外。在其他方面，工程化的逆转录转座子可以结合一个或多于一个宿主DNA序列。在其他方面，工程化的逆转录转座子可以具有低序列特异性，例如，结合多个序列或缺乏序列偏好。
在一些实施例中，Gene Writing系统用于编辑多个等位基因中的靶基因座。在一些实施例中，Gene Writing系统被设计为编辑特定等位基因。例如，Gene Writing多肽可以针对仅存在于一个等位基因上的特定序列，例如包含与靶等位基因(例如，gRNA或退火结构域)具有同源性的模板RNA，但不针对第二同源等位基因。在一些实施例中，Gene Writing系统可以改变单倍型特异性等位基因。在一些实施例中，靶向特定等位基因的Gene Writing系统优先靶向该等位基因，例如，对靶等位基因具有至少2、4、6、8或10倍的偏好。
在某些实施例中，Gene WriterTM基因编辑器系统RNA进一步包含细胞内定位序列，例如，核定位序列。核定位序列可以是促进RNA输入细胞核中的RNA序列。在某些实施例中，核定位信号位于模板RNA上。在某些实施例中，逆转录转座酶多肽被编码在第一RNA上，并且模板RNA是第二单独RNA，并且核定位信号位于模板RNA上而不是在编码逆转录转座酶多肽的RNA上。尽管不希望受到理论的束缚，但是在一些实施例中，编码逆转录转座酶的RNA主要靶向细胞质以促进其翻译，而模板RNA主要靶向核以促进其逆转座进入基因组。在一些实施例中，核定位信号在模板RNA的3’末端、5'末端或内部。在一些实施例中，核定位信号在异源序列的3’(例如，直接在异源序列的3’)或在异源序列的5’(例如，直接在异源序列的5’)。在一些实施例中，核定位信号被置于模板RNA的5’UTR之外或3’UTR之外。在一些实施例中，核定位信号放置在5’UTR和3’UTR之间，其中任选地，核定位信号不随转基因转录(例如，核定位信号是反义取向或在转录终止信号或聚腺苷酸化信号的下游)。在一些实施例中，核定位序列位于内含子内部。在一些实施例中，多个相同或不同的核定位信号在RNA中，例如在模板RNA中。在一些实施例中，核定位信号的长度小于5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000bp。可以使用各种RNA核定位序列。例如，Lubelsky和Ulitsky,Nature[自然]555(107-111),2018描述了RNA序列，其驱动RNA定位进入细胞核。在一些实施例中，核定位信号是SINE衍生的核RNA定位(SIRLOIN)信号。在一些实施例中，核定位信号结合核富集蛋白。在一些实施例中，核定位信号结合HNRNPK蛋白。在一些实施例中，核定位信号富含嘧啶，例如是富含C/T、富含C/U、富含C、富含T或富含U的区域。在一些实施例中，核定位信号衍生自长非编码RNA。在一些实施例中，核定位信号衍生自MALAT1长非编码RNA或是MALAT1的600个核苷酸的M区(在Miyagawa等人,RNA 18,(738-751),2012中描述)。在一些实施例中，核定位信号衍生自BORG长非编码RNA或为AGCCC基序(在Zhang等人,Molecular and Cellular Biology[分子和细胞生物学]34,2318-2329(2014)中描述。在一些实施例中，核定位序列在Shukla等人,The EMBO Journal[EMBO杂志]e98452(2018)中描述。在一些实施例中，核定位信号衍生自非LTR逆转录转座子、LTR逆转录转座子、逆转录病毒或内源逆转录病毒。
在一些实施例中，本文所述的多肽包含一个或多个(例如，2、3、4、5)核靶向序列，例如核定位序列(NLS)，例如如上所述。在一些实施例中，NLS是两组分NLS。在一些实施例中，NLS促进了包含NLS的蛋白质导入到细胞核中。在一些实施例中，将NLS与本文所述的Gene Writer的N末端融合。在一些实施例中，将NLS与Gene Writer的C末端融合。在一些实施例中，将NLS与Cas结构域的N末端或C末端融合。在一些实施例中，接头序列设置在NLS和Gene Writer的相邻结构域之间。
在一些实施例中，NLS包含氨基酸序列MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC、PKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV、RKSGKIAAIWKRPRKPKKKRKV KRTADGSEFESPKKKRKV、KKTELQTTNAENKTKKL、或KRGINDRNFWRGENGRKTR、KRPAATKKAGQAKKKK或其功能片段或变体。示例性NLS序列还描述于PCT/EP2000/011690中，该专利的内容针对其对示例性核定位序列的披露通过引用并入本文。在一些实施例中，NLS包含如表8中公开的氨基酸序列。该表的NLS可以与多肽的一个或多个拷贝在多肽中一个或多个位置使用，例如N末端结构域中、肽结构域之间、C末端结构域中或多个位置的组合中的1、2、3个或多个NLS拷贝，以改善细胞核的亚细胞定位。可以在单个多肽中使用多个独特的序列。序列可以是天然的单部分或二部分的，例如，具有一段或两段碱性氨基酸，或者可以用作嵌合二部分序列。序列参考对应于UniProt登录号，除非针对使用亚细胞定位预测算法挖掘的序列指示为SeqNLS(Lin等人BMCBioinformat[BMC生物信息学]13:157(2012)，通过引用以其整体并入本文)。
表8.用于Gene Writing系统的示例性核定位信号
在一些实施例中，NLS是两组分NLS。两组分NLS典型地包含由间隔子序列(其长度可以是例如约10个氨基酸)间隔开的两个碱性氨基酸簇。单组分NLS典型地缺乏间隔子。二部分NLS的实例是核质蛋白NLS，具有序列KR[PAATKKAGQA]KKKK，其中间隔子被括起来。另一个示例性二部分NLS具有序列PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV。示例性NLS描述于国际申请WO 2020051561中，该申请通过引用以其全文并入本文，包括其关于核定位序列的披露。
在某些实施例中，Gene WriterTM基因编辑器系统多肽进一步包含细胞内定位序列，例如，核定位序列和/或核仁定位序列。核定位序列和/或核仁定位序列可以是促进蛋白质输入到核和/或核仁中的氨基酸序列，其中它可以促进异源序列整合到基因组中。在某些实施例中，Gene Writer基因编辑器系统多肽(例如，逆转座酶，例如，根据本文表1、2、3A或3B中的任一项的多肽)进一步包含核仁定位序列。在某些实施例中，逆转录转座酶多肽编码在第一RNA上，模板RNA是第二单独RNA，并且核仁定位信号编码在编码逆转录转座酶多肽的RNA上，而不在模板RNA上。在一些实施例中，核仁定位信号位于多肽的N末端、C末端或内部。在一些实施例中，使用多个相同或不同的核仁定位信号。在一些实施例中，核定位信号的长度小于5、10、25、50、75或100个氨基酸。可以使用各种多肽核仁定位信号。例如，Yang等人,Journal of Biomedical Science[生物化学科学杂志]22,33(2015)描述了一种核定位信号，其也起着核仁定位信号的作用。在一些实施例中，核仁定位信号也可以是核定位信号。在一些实施例中，核仁定位信号可以与核定位信号重叠。在一些实施例中，核仁定位信号可包含碱性残基区段。在一些实施例中，核仁定位信号可以富含精氨酸和赖氨酸残基。在一些实施例中，核仁定位信号可以衍生自在核仁中富集的蛋白质。在一些实施例中，核仁定位信号可以衍生自在核糖体RNA基因座处富集的蛋白质。在一些实施例中，核仁定位信号可以衍生自结合rRNA的蛋白质。在一些实施例中，核仁定位信号可以衍生自MSP58。在一些实施例中，核仁定位信号可以是单组分基序。在一些实施例中，核仁定位信号可以是两组分基序。在一些实施例中，核仁定位信号可以由多个单组分或两组分基序组成。在一些实施例中，核仁定位信号可以由单组分和两组分基序的混合物组成。在一些实施例中，核仁定位信号可以是双重两组分基序。在一些实施例中，核仁定位基序可以是KRASSQALGTIPKRRSSSRFIKRKK(SEQ ID NO:1530)。在一些实施例中，核仁定位信号可以衍生自核因子-κB诱导激酶。在一些实施例中，核仁定位信号可以是RKKRKKK基序(SEQ ID NO:1531)(在Birbach等人,Journal of Cell Science[细胞科学杂志],117(3615-3624),2004中描述)。
在一些实施例中，本文所述的核酸(例如，编码GeneWriter多肽的RNA或编码该RNA的DNA)包含微小RNA结合位点。在一些实施例中，微小RNA结合位点用于增加GeneWriter系统的靶细胞特异性。例如，可以基于在非靶细胞类型中存在但在靶细胞类型中不存在(或相对于非靶细胞而言以降低的水平存在)的miRNA的识别来选择微小RNA结合位点。因此，当编码GeneWriter多肽的RNA存在于非靶细胞中时，它将与miRNA结合，而当编码GeneWriter多肽的RNA存在于靶细胞中时，它将不会与miRNA结合(或结合，但相对于非靶细胞而言以降低的水平结合)。尽管不希望受到理论的束缚，但是miRNA与编码GeneWriter多肽的RNA的结合可例如通过降解编码多肽的mRNA或通过干扰翻译来减少GeneWriter多肽的产生。因此，异源对象序列将比非靶细胞的基因组更有效地插入靶细胞的基因组中。也可以将在编码GeneWriter多肽的(或在编码RNA的DNA中编码的)RNA中具有微小RNA结合位点的系统与受第二微小RNA结合位点调节的模板RNA组合使用，例如，如本文标题为“Gene WriterTM基因编辑器系统的模板RNA组分”中所述。
基于表X、Z1、Z2、3A或3B中提供的登录号，可以确定每个逆转录转座子及其结构域的核酸和相应的多肽序列，例如，通过使用常规序列分析工具如基本局部比对搜索工具(BLAST)或CD-Search进行保守结构域分析。其他序列分析工具是已知的并且可以在以下中找到：例如https://molbiol-tools.ca,例如，https://molbiol-tools.ca/Motifs.htm。SEQ ID NO113-1015与表2的前903行比对。
本文的表X、3A和3B提供了示例性转座子的序列，包括逆转座酶的氨基酸序列，以及允许逆转座酶与模板RNA结合的5'和3'非翻译区的序列。在一些实施例中，表X、Z1、Z2、3A或3B中任一个的5’UTR允许逆转座酶结合模板RNA。在一些实施例中，表X、3A和3B中任一个的3’UTR允许逆转座酶结合模板RNA。因此，在一些实施例中，用于本文所述任何系统的多肽可以是本文表X、表3A和表3B中任何一个的多肽，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，该系统进一步包含本文表X、表3A和表3B中任一个的5’或3’非翻译区中的一者或两者(或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列)，例如来自与前一句中提及的多肽相同的逆转录转座子，如同一表的同一行中所示。在一些实施例中，系统包含本文表X、3A和3B中任一个的5'或3'非翻译区中的一个或两个，例如，完整逆转录转座子序列的区段(其编码能够结合逆转座酶的RNA)和/或标题列预测的5’UTR或预测的3’UTR列中提供的子序列。
在一些实施例中，用于本文描述的任何系统中的多肽可以是基于多个逆转录转座子的对齐的多肽序列的分子重建或遗传重建。在一些实施例中，用于本文描述的任何系统中的5'或3'非翻译区可以是基于多个逆转录转座子的对齐的5'或3'非翻译区的分子重建。基于本文提供的登录号可以例如通过使用常规序列分析工具如基本局部比对搜索工具(BLAST)或CD-Search用于保守结构域分析来比对多肽或核酸序列。可以基于共有序列创建分子重建，例如使用在Ivics等人,Cell[细胞]1997,501-510；Wagstaff等人,MolecularBiology and Evolution[分子生物学与进化]2013,88-99中描述的方法。在一些实施例中，如通过诸如Boissinot等人,Molecular Biology and Evolution[分子生物学与进化]2000,915-928中所述的系统发育方法所评估的，衍生出5'或3'非翻译区或多肽的逆转录转座子是年轻的或最近活跃的移动元件。
表Z1：来自不同类型来源的示例性逆转录酶结构域。
来源包括II组内含子、非LTR逆转录转座子、逆转录病毒、LTR逆转录转座子、产生多样性的逆转录元件、逆转录子、端粒酶、逆转录质粒和进化的DNA聚合酶。还包括来自InterPro、pfam和cd数据库的相关RT特征。尽管进化的聚合酶RTX可以进行RNA依赖性DNA聚合，但InterProScan没有鉴定出RT特征，因此替而包括聚合酶特征。
表Z2:截至2020年3月4日，表Z1中逆转录酶中存在的特征的InterPro描述。
表3A和3B(如下)显示了示例性的Gene Writer蛋白和来自使用数据挖掘鉴定的各种逆转座酶的相关序列。第1列表示逆转录转座子所属的家族。第2列列出了元件名称。第3列表示登录号(如果有)。第4列列出了在其中发现逆转录转座酶的生物。第5列列出了预测的5'非翻译区，第6列列出了预测的3'非翻译区；两者都是片段，预测其允许模板RNA结合第7列的逆转座酶。(应理解，第5-6列显示了DNA序列，并且根据第5-6列中的任何一个的RNA序列通常会包括尿嘧啶而不是胸苷)第7列列出了预测的逆转录转座酶氨基酸序列。对于表3B，第8列列出了基于序列分析存在的预测RT结构域，第9列列出了起始密码子位置，第10列列出了终止密码子位置。
Gene Writer，例如热稳定Gene Writer
尽管不希望受到理论的束缚，但在某些实施例中，在冷环境中进化的逆转录转座酶在人体温度下可能无法正常发挥作用。该申请提供了许多热稳定的Gene Writer，包括衍生自禽逆转录转座酶的蛋白质。
可以例如通过测试Gene Writer在高温(例如37℃)和低温(例如25℃)下体外聚合DNA的能力来测量热稳定性。用于测定体外DNA聚合活性(例如，可加工性)的合适条件描述于例如Bibillo和Eickbush,“High Processivity of the Reverse Transcriptase froma Non-long Terminal Repeat逆转录转座子[非长末端重复逆转录转座子的逆转录酶的高生产力]”(2002)JBC 277,34836-34845。在一些实施例中，热稳定的Gene Writer多肽在37℃时具有的活性例如DNA聚合活性不低于其在25℃时在其他方面相似的条件下的活性的70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些实施例中，GeneWriter多肽(例如表1、2、3A或3B的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99同一性的序列)在选自哺乳动物(例如人)或鸟的受试者中是稳定的。在一些实施例中，本文所述的GeneWriter多肽在37℃起作用。在一些实施例中，本文所述的GeneWriter多肽在37℃具有比在较低温度例如在30℃、25℃或20℃更高的活性。在一些实施例中，本文所述的GeneWriter多肽在人细胞中比在斑马鱼细胞中具有更高的活性。
在一些实施例中，GeneWriter多肽在37℃培养的人细胞中是有活性的，例如，使用PCT申请号PCT/US2019/048607(将其通过引用以其整体并入本文)的实例6或实例7的测定法。
在一些实施例中，所述测定包括以下步骤：(1)将HEK293T细胞以10,000个细胞/孔引入一个或多个直径为6.4mm的孔中，(2)将细胞在37℃下孵育24小时，(3)提供包含0.5μl的FuGENE
HD转染试剂和80ng DNA(其中DNA是质粒，其依顺序包含(a)CMV启动子，(b)与靶位点上游100bp同源的100bp序列，(c)编码与GeneWriter蛋白结合的5’非翻译区的序列，(d)编码GeneWriter蛋白的序列，(e)编码与GeneWriter蛋白结合的3’非翻译区的序列，(f)与靶位点下游100bp同源的100bp序列，和(g)BGH聚腺苷酸化序列)以及10μl Opti-MEM的转染混合物，并且在室温下孵育15分钟，(4)将转染混合物添加到细胞中，(5)将细胞孵育3天，以及(6)测定外源序列进入细胞基因组中的靶基因座(例如，rDNA)的整合，例如，其中如PCT申请号PCT/US2019/048607(将其通过引用以其整体并入本文)的实例6中所述执行前述步骤中的一个或多个。
在一些实施例中，Gene Writer系统能够在靶位点中产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个或更多个核苷酸取代。在一些实施例中，取代是转位突变。在一些实施例中，取代是颠换突变。在一些实施例中，取代将腺嘌呤转化为胸腺嘧啶，腺嘌呤转化为鸟嘌呤，腺嘌呤转化为胞嘧啶，鸟嘌呤转化为胸腺嘧啶，鸟嘌呤转化为胞嘧啶，鸟嘌呤转化为腺嘌呤，胸腺嘧啶转化为胞嘧啶，胸腺嘧啶转化为腺嘌呤，胸腺嘧啶转化为鸟嘌呤，胞嘧啶转化为腺嘌呤，胞嘧啶转化为鸟嘌呤，或胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
在一些实施例中，Gene Writer系统能够在靶位点中产生至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个核苷酸(并且任选地没有超过500、400、300、200或100个核苷酸)插入。在一些实施例中，Gene Writer系统能够在靶位点中产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个核苷酸(并且任选地不超过500、400、300、200或100个核苷酸)插入。在一些实施例中，Gene Writer系统能够在靶位点中产生至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千碱基(并且任选地不超过1、5、10或20千碱基)插入。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个核苷酸(并且任选地不超过500、400、300或200个核苷酸)缺失。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个核苷酸(并且任选地不超过500、400、300或200个核苷酸)缺失。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个核苷酸(并且任选不超过500、400、300或200个核苷酸)缺失。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千碱基(并且任选不超过1、5、10、或20千碱基)缺失。
在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合增加或减少基因的表达(例如转录或翻译)。在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合通过改变、添加或缺失启动子或增强子中的序列(例如结合转录因子的序列)来增加或减少基因的表达(例如转录或翻译)。在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合改变基因的翻译(例如改变氨基酸序列)，插入或缺失起始或终止密码子，改变或固定基因的翻译框架。在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合改变基因的剪接，例如通过插入、缺失或改变剪接受体或供体位点。在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合改变转录本或蛋白质半衰期。在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合改变细胞中的蛋白质定位(例如从细胞质到线粒体，从细胞质到细胞外空间(例如添加分泌标签))。在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合改变(例如改善)蛋白质折叠(例如以防止错误折叠蛋白质的积累)。在一些实施例中，插入、缺失、取代或其组合改变、增加、降低基因的活性，例如由基因编码的蛋白质的活性。
在一些实施例中，GeneWriter多肽导致异源对象序列(例如，GFP基因)以至少0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4或5个拷贝/基因组的平均拷贝数插入靶基因座(例如，rDNA)中。在一些实施例中，本文所述的细胞(例如，在靶插入位点包含异源序列的细胞)包含异源对象序列，其平均拷贝数是至少0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4，0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4或5个拷贝/基因组。
在一些实施例中，GeneWriter引起靶RNA中序列的整合，其中在末端具有相对少的截短事件。例如，在一些实施例中，Gene Writer蛋白(例如，SEQ ID NO:1016的蛋白)导致进入靶位点的整合子的约25％-100％，50％-100％，60％-100％，70％-100％，75％-95％，80％-90％或86.17％未被截短，如本文所述的测定(例如PCT申请号PCT/US2019/048607(将其通过引用以其整体并入本文)的实例6和图8的测定)所测量的。在一些实施例中，GeneWriter蛋白(例如，SEQ ID NO:1016的蛋白)导致进入靶位点的整合子的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％未被截短。如本文所述的测定所测量的。在一些实施例中，使用测定将整合子分为截短的和未被截短的，该测定包含扩增，该扩增使用包含距元件(例如，野生型逆转录转座子序列)的末端565bp的正向引物和位于靶插入位点的基因组DNA(例如rDNA)中的反向引物。在一些实施例中，靶插入位点中的全长整合子的数目大于靶插入位点中的被截短300-565个核苷酸的整合子的数目，例如，全长整合子的数目是截短的整合子的数目的至少1.1x、1.2x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x或10x，或全长整合子的数目是截短的整合子的数目的至少1.1x-10x、2x-10x、3x-10x或5x-10x。
在一些实施例中，本文描述的系统或方法导致异源对象序列在靶细胞的基因组中的仅一个靶位点处插入。可以例如使用例如如PCT申请号PCT/US2019/048607(将其通过引用以其整体并入本文)的实例8中所述的大于1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％的阈值来测量插入。在一些实施例中，本文所述的系统或方法导致异源对象序列的插入，其中少于1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的插入是在除靶位点以外的其他位点，例如使用本文所述的测定，例如PCT申请号PCT/US2019/048607(将其通过引用以其整体并入本文)的实例8的测定。
在一些实施例中，本文所述的系统或方法导致异源对象序列的“无痕”插入，而在一些实施例中，由于插入异源序列，靶位点可显示出内源DNA的缺失或重复。不同逆转录转座子的机制可能导致在宿主基因组中在逆转座过程中发生的在靶位点处的不同的复制或缺失模式。在一些实施例中，系统导致无痕插入，在周围的基因组DNA中没有重复或缺失。在一些实施例中，系统导致在插入上游缺失小于1、2、3、4、5、10、50或100bp的基因组DNA。在一些实施例中，系统导致在插入下游缺失小于1、2、3、4、5、10、50或100bp的基因组DNA。在一些实施例中，系统导致在插入上游重复小于1、2、3、4、5、10、50或100bp的基因组DNA。在一些实施例中，系统导致在插入下游重复小于1、2、3、4、5、10、50或100bp的基因组DNA。
在一些实施例中，本文所述的GeneWriter或其DNA结合结构域特异性结合其靶位点，例如如使用PCT申请号PCT/US2019/048607(将其通过引用以其整体并入本文)的实例21的测定所测量的。在一些实施例中，GeneWriter或其DNA结合结构域与其靶位点的结合以比与人基因组中任何其他结合位点的结合更强。例如，在一些实施例中，在PCT申请号PCT/US2019/048607的实例21(将其通过引用以其整体并入本文)的测定中，靶位点代表超过50％、60％、70％、80％、90％或95％的GeneWriter或其DNA结合结构域与人基因组DNA的结合事件。在一些实施例中，GeneWriter的DNA结合结构域与GeneWriter的其余部分是异源的，例如，使得GeneWriter靶向与跟GeneWriter的其余部分相关的内源DNA结合结构域不同的靶位点。
基因工程化，例如二聚化的GeneWriter
一些非LTR逆转录转座子利用两个亚基来完成逆转座(Christensen等人PNAS[美国国家科学院院刊]2006)。在一些实施例中，本文所述的逆转录转座酶包含两个连接的亚基作为单个多肽。例如，可以将两个野生型逆转座酶用接头连接起来以形成共价的“二聚化的”蛋白。在一些实施例中，编码逆转录转座酶的核酸编码作为单个多肽表达的两个逆转录转座酶亚基。在一些实施例中，亚基通过肽接头连接，如本文在标题为“接头”的部分中所描述的，以及例如在Chen等人Adv Drug Deliv Rev[先进药物输送评论]2013中所描述的。在一些实施例中，多肽中的两个亚基通过刚性接头连接。在一些实施例中，刚性接头由基序(EAAAK)n(SEQ ID NO:1534)组成。在其他实施例中，多肽中的两个亚基通过柔性接头连接。在一些实施例中，柔性接头由基序(Gly)n组成。在一些实施例中，柔性接头由基序(GGGGS)n(SEQ ID NO:1535)组成。在一些实施例中，刚性或柔性接头由长度1、2、3、4、5、10、15或更多个氨基酸组成，以使得能够进行逆转座。在一些实施例中，接头由刚性和柔性接头基序的组合组成。
基于机制，两个逆转录转座酶亚基并不需要全部功能。在一些实施例中，融合蛋白可以由完全功能性亚基和缺少一个或多个功能性结构域的第二亚基组成。在一些实施例中，一个亚基可缺少逆转录酶功能。在一些实施例中，一个亚基可缺少逆转录酶结构域。在一些实施例中，一个亚基可仅具有核酸内切酶活性。在一些实施例中，一个亚基可仅具有核酸内切酶结构域。在一些实施例中，构成单个多肽的两个亚基可以提供互补的功能。
在一些实施例中，一个亚基可缺少核酸内切酶功能。在一些实施例中，一个亚基可缺少核酸内切酶结构域。在一些实施例中，一个亚基可仅具有逆转录酶活性。在一些实施例中，一个亚基可仅具有逆转录酶结构域。在一些实施例中，一个亚基可仅具有DNA依赖性DNA合成功能。
接头：
在一些实施例中，本文所述的组合物和系统的结构域(例如，多肽的核酸内切酶和逆转录酶结构域或多肽的DNA结合结构域和逆转录酶结构域)可以通过接头连接。本文所述的包含接头元件的组合物具有S1-L-S2的一般形式，其中S1和S2可以相同或不同，并代表通过接头彼此相关联的两个结构域部分(例如，各自是多肽或核酸结构域)。在一些实施例中，接头可以连接两个多肽。在一些实施例中，接头可以连接两个核酸分子。在一些实施例中，接头可以连接多肽和核酸分子。接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。接头可以是柔性的、刚性的和/或可切割的。在一些实施例中，接头是肽接头。通常，肽接头的长度是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸，例如，长度是2-50个氨基酸，长度是2-30个氨基酸。
最常用的柔性接头具有的序列主要由Gly和Ser残基(“GS”接头)段组成。柔性接头可以有用于连接需要一定程度的移动或相互作用的结构域，并且可以包括小的、非极性的(例如Gly)或极性的(例如Ser或Thr)氨基酸。Ser或Thr的掺入还可以通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，且因此减少了接头与其他部分之间的不利相互作用。这样的接头的实例包括具有结构[GGS]≥1或[GGGS]≥1(SEQ ID NO:1536)的那些。刚性接头有用于保持各结构域之间的固定距离并维持它们的独立功能。当结构域的空间分离对于保持药剂中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可以是有用的。刚性接头可以具有α螺旋结构或富含脯氨酸的序列(Pro-rich序列)、(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。可切割接头可以在体内释放游离的功能性结构域。在一些实施例中，接头可以在特异性条件下(例如在还原剂或蛋白酶的存在下)切割。体内可切割接头可利用二硫键的可逆性质。一个实例包括两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(例如，PRS)。CPRSC(SEQ ID NO:1537)的体外凝血酶处理导致凝血酶敏感性序列的切割，而可逆的二硫键保持完整。此类接头是已知的，并且例如在Chen等人,2013.融合蛋白接头：特性、设计和功能。Adv Drug Deliv Rev.[先进药物输送评论]65(10):1357-1369中描述。本文所述组合物中接头的体内切割也可以通过蛋白酶进行，该蛋白酶在病理条件下(例如癌症或炎症)在体内、在特定细胞或组织中、或在受限的某些细胞区室内表达。许多蛋白酶的特异性在受限的区室中提供了对接头的较缓慢切割。
在一些实施例中，氨基酸接头是存在于天然多肽的此类结构域之间的内源氨基酸(或与之同源)。在一些实施例中，存在于此类结构域之间的内源氨基酸被取代，但是长度与天然长度没有变化。在一些实施例中，将另外的氨基酸残基添加至结构域之间的天然存在的氨基酸残基。
在一些实施例中，氨基酸接头被计算地设计或筛选以最大化蛋白质功能(Anad等人,FEBS Letters[FEBS通讯],587:19,2013)。
除了在单个转录本上完全编码之外，多肽还可以通过分别表达两个或多个重构全酶的多肽片段来产生。在一些实施例中，Gene Writer多肽是通过表达为通过工程化的蛋白质-蛋白质相互作用重新组装全酶的单独亚基而产生的。在一些实施例中，全酶的重构不涉及亚基之间的共价结合。肽还可以通过内含肽的反式-剪接融合在一起(Tornabene等人科学转化医学[Sci Transl Med]11，eaav4523(2019))。在一些实施例中，Gene Writer全酶被表达为单独的亚基，这些亚基被设计成通过亚基中分裂型内含肽(例如，如本文所述)的存在来产生融合蛋白。在一些实施例中，Gene Writer全酶通过在亚基之间形成共价键来重构。在一些实施例中，蛋白质亚基通过工程化的蛋白质-蛋白质结合配偶体重新组装，例如SpyTag和SpyCatcher(Zakeri等人PNAS[美国国家科学院院报]109，E690-E697(2012))。在一些实施例中，本文所述的另外的结构域，例如Cas9切口酶，被表达为单独的多肽，其通过如上所述的共价或非共价相互作用与Gene Writer多肽相关联。在一些实施例中，将GeneWriter多肽分解成亚基可以通过将编码每个部分的核酸保持在病毒递送载体(例如，AAV)的最佳包装限度内来帮助蛋白质的递送(Tornabene等人Sci Transl Med[科学转化医学]11,eaav4523(2019))。在一些实施例中，Gene Writer多肽被设计成通过使用如上所述的共价或非共价相互作用而二聚化。
内含肽
在一些实施例中，Gene Writer系统包含内含肽。通常，内含肽包含能够通过肽键将两个多肽或多肽片段连接在一起的多肽。在一些实施例中，内含肽是反式剪接内含肽，其可以连接两个多肽片段，例如以形成如本文所述的系统的多肽组分。在一些实施例中，内含肽可以在编码两个多肽片段的相同核酸分子上编码。在某些实施例中，可将内含肽翻译为较大多肽的一部分，该多肽依顺序包含例如第一多肽片段、内含肽和第二多肽片段。在实施例中，翻译的内含肽可能能够将其自身从较大的多肽中切除，例如，导致附接的多肽片段的分离。在实施例中，切除的内含肽可能能够通过肽键将两个多肽片段彼此直接连接。示例性内含肽在本文中描述，例如在表X中。
Gene WriterTM基因编辑器系统的模板RNA组分
本文所述的Gene Writer系统可通过靶引发的逆转录将RNA序列模板转录进入宿主靶DNA位点。通过将RNA序列模板直接逆转录到宿主基因组中来编写一个或多个DNA序列，Gene Writer系统可以将对象序列插入靶基因组中，而不需要将外源DNA序列引入宿主细胞中(不同于例如CRISPR系统)以及消除外源DNA插入步骤。因此，Gene Writer系统提供了使用定制的RNA序列模板的平台，所述模板包含对象序列，例如，包含异源基因编码和/或功能信息的序列。
在一些实施例中，模板RNA编码与异源对象序列处于顺式的Gene Writer蛋白。各种顺式构建体描述于例如Kuroki-Kami等人(2019)Mobile DNA[移动DNA]10:23(通过引用以其整体并入本文)，并且可以与本文所述的任何实施例组合使用。例如，在一些实施例中，模板RNA包含异源对象序列，编码Gene Writer蛋白的序列(例如，包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域的蛋白质，例如本文所述)，5'非翻译区和3'非翻译区。组件可以以各种顺序包括。在一些实施例中，例如使用Kuroki-Kami等人,同上的图3A中所示的布置，Gene Writer蛋白和异源对象序列以不同方向被编码(有义相比于反义)。在一些实施例中，Gene Writer蛋白和异源对象序列以相同方向被编码。在一些实施例中，编码多肽和模板RNA的核酸或编码模板RNA的核酸是共价连接的，例如是融合核酸的一部分和/或同一转录物的一部分。在一些实施例中，融合核酸包含RNA或DNA。
在某些情况下，编码Gene Writer多肽的核酸可以在异源对象序列的5'。例如，在一些实施例中，模板RNA从5'至3'包含5'非翻译区、有义编码的Gene Writer多肽、有义编码的异源对象序列和3'非翻译区。在一些实施例中，模板RNA从5'至3'包含5'非翻译区、有义编码的Gene Writer多肽、反义编码的异源对象序列和3'非翻译区。
在一些实施例中，RNA进一步包含与DNA靶位点的同源性。
应当理解，当将模板RNA描述为包含开放阅读框或其反向互补序列时，在一些实施例中，必须先将模板RNA转化成双链DNA(例如，通过逆转录)，然后开放阅读框可以被转录和翻译。
在某些实施例中，可以鉴定、设计、工程化和构建定制的RNA序列模板，以包含改变或指定宿主基因组功能的序列，例如通过将异源编码区引入基因组；影响或引起外显子结构/替代性剪接；引起内源基因的破坏；引起内源基因的转录激活；引起内源DNA的表观遗传调节；引起可操作地连接的基因上调或下调，等等。在某些实施例中，可以将定制的RNA序列模板工程化以包含编码外显子和/或转基因的序列，提供与转录因子激活剂、阻遏物、增强子等及其组合的结合位点。在其他实施例中，编码序列可以进一步用剪接受体位点、聚A尾定制。在某些实施例中，RNA序列可包含编码与逆转录转座酶同源的RNA序列模板的序列，经工程化以包含异源编码序列或其组合。
模板RNA可与靶DNA具有某些同源性。在一些实施例中，模板RNA具有在所述RNA的3’末端的与靶DNA完全同源的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200或更多个碱基。在一些实施例中，模板RNA具有例如在所述模板RNA的5’末端的与靶DNA至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同源的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、175、180或200或更多个碱基。在一些实施例中，模板RNA具有衍生自逆转录转座子(例如，本文所述的逆转录转座子)的3’非翻译区。在一些实施例中，模板RNA具有与逆转录转座子(例如本文所述的逆转录转座子，例如表X、Z1、Z2、3A或3B中的逆转录转座子)的3’序列至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同源的至少10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200或更多个碱基的3’区。在一些实施例中，模板RNA具有衍生自逆转录转座子(例如，本文所述的逆转录转座子)的5’非翻译区。在一些实施例中，模板RNA具有与逆转录转座子(例如本文所述的逆转录转座子，例如表X、Z1、Z2、3A或3B中的逆转录转座子)的5’序列至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高同源的至少10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180或200或更多个碱基的5’区。
本文所述的Gene Writer基因组编辑系统的模板RNA组分通常能够结合系统的Gene Writer基因组编辑蛋白。在一些实施例中，模板RNA具有3'区，其能够结合GeneWriter基因组编辑蛋白。结合区，例如3’区，可以是结构化的RNA区，例如具有至少1、2或3个发夹环，其能够结合系统的Gene Writer基因组编辑蛋白。
本文所述的Gene Writer基因组编辑系统的模板RNA组分通常能够结合系统的Gene Writer基因组编辑蛋白。在一些实施例中，模板RNA具有5’区，其能够结合GeneWriter基因组编辑蛋白。结合区，例如5’区，可以是结构化的RNA区，例如具有至少1、2或3个发夹环，其能够结合系统的Gene Writer基因组编辑蛋白。在一些实施例中，5’非翻译区包含假结，例如能够结合至Gene Writer蛋白的假结。
在一些实施例中，模板RNA(例如发夹RNA的非翻译区，例如5’非翻译区)包含茎环序列。在一些实施例中，模板RNA(例如发夹RNA的非翻译区，例如5’非翻译区)包含发夹。在一些实施例中，模板RNA(例如发夹RNA的非翻译区，例如5’非翻译区)包含螺旋。在一些实施例中，模板RNA(例如发夹RNA的非翻译区，例如5’非翻译区)包含假结。在一些实施例中，模板RNA包含核酶。在一些实施例中，核酶类似于丁型肝炎病毒(HDV)核酶，例如具有类似于HDV核酶的二级结构和/或具有HDV核酶的一种或多种活性，例如自我切割活性。参见，例如，Eickbush等人,Molecular and Cellular Biology[分子和细胞生物学],2010,3142-3150。
在一些实施例中，模板RNA(例如发夹RNA的非翻译区，例如3’非翻译区)包含一个或多个茎环或螺旋。R2 3’UTR的示例性结构显示在，例如，Ruschak等人“Secondarystructure models of the 3′untranslated regions of diverse R2RNAs[不同R2RNA的3′非翻译区的二级结构模型]”RNA.2004年6月；10(6):978-987，例如，在图3中，以及在Eikbush和Eikbush,“R2 and R2/R1hybrid non-autonomous retrotransposons derivedby internal deletions of full-length elements[R2和R2/R1杂合体非自主逆转录转座子源自全长元件的内部缺失]”Mobile DNA[移动DNA](2012)3:10；例如，在其中的图3处，将这些文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施例中，本文描述的模板RNA包含能够结合本文描述的GeneWriter蛋白的序列。例如，在一些实施例中，模板RNA包含能够与GeneWriter蛋白中的MS2外壳蛋白序列结合的MS2 RNA序列。在一些实施例中，模板RNA包含能够结合B盒序列的RNA序列。在一些实施例中，模板RNA包含能够与GeneWriter蛋白中的Cas9结构域结合的RNA序列(例如crRNA序列和/或tracrRNA序列、gRNA序列)。在一些实施例中，除了UTR或代替UTR，模板RNA(例如，共价地)连接至非RNA UTR，例如蛋白质或小分子。
在一些实施例中，模板RNA在3'末端具有聚A尾。在一些实施例中，模板RNA在3'末端不具有聚A尾。
在一些实施例中，模板RNA具有与逆转录转座子(例如本文所述的逆转录转座子)的5’序列至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高同源的至少10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200或更多个碱基的5’区。
系统的模板RNA通常包含用于插入靶DNA的对象序列。对象序列可以是编码的或非编码的。
在一些实施例中，本文所述的系统或方法包含单个模板RNA。在一些实施例中，本文所述的系统或方法包含多个模板RNA。
在一些实施例中，对象序列可以包含开放阅读框。在一些实施例中，模板RNA具有科扎克序列。在一些实施例中，模板RNA具有内部核糖体进入位点。在一些实施例中，模板RNA具有自切割肽，例如T2A或P2A位点。在一些实施例中，模板RNA具有起始密码子。在一些实施例中，模板RNA具有剪接受体位点。在一些实施例中，模板RNA具有剪接供体位点。示例性剪接受体和剪接供体位点在WO 2016044416中进行了描述，将其通过引用以其整体并入本文。示例性剪接受体位点序列是本领域技术人员已知的，并且仅作为示例包括CTGACCCTTCTCTCTCTCCCCCAGAG(来自人HBB基因)和TTTCTCTCCCACAAG(来自人免疫球蛋白-γ基因)。在一些实施例中，模板RNA在终止密码子的下游具有微小RNA结合位点。在一些实施例中，模板RNA在开放阅读框的终止密码子下游具有聚A尾。在一些实施例中，模板RNA包含一个或多个外显子。在一些实施例中，模板RNA包含一个或多个内含子。在一些实施例中，模板RNA包含真核转录终止子。在一些实施例中，模板RNA包含增强的翻译元件或翻译增强元件。在一些实施例中，RNA包含人T细胞白血病病毒(HTLV-1)R区。在一些实施例中，RNA包含增强核输出的转录后调节元件，例如乙型肝炎病毒(HPRE)或土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件。在一些实施例中，在模板RNA中，异源对象序列编码多肽，并相对于5’和3’UTR以反义方向编码。在一些实施例中，在模板RNA中，异源对象序列编码多肽，并相对于5’和3’UTR以有义方向编码。
在一些实施例中，本文所述的核酸(例如，模板RNA或编码模板RNA的DNA)包含微小RNA结合位点。在一些实施例中，微小RNA结合位点用于增加GeneWriter系统的靶细胞特异性。例如，可以基于在非靶细胞类型中存在但在靶细胞类型中不存在(或相对于非靶细胞而言以降低的水平存在)的miRNA的识别来选择微小RNA结合位点。因此，当模板RNA存在于非靶细胞中时，它将与miRNA结合，而当模板RNA存在于靶细胞中时，它将不会与miRNA结合(或结合，但相对于非靶细胞而言以降低的水平结合)。尽管不希望受到理论的束缚，但miRNA与模板RNA的结合可能会干扰异源对象序列插入基因组。因此，异源对象序列将比非靶细胞的基因组更有效地插入靶细胞的基因组中。在模板RNA(或编码它的DNA)中具有microRNA结合位点的系统也可以与编码GeneWriter多肽的核酸组合使用，其中GeneWriter多肽的表达受第二microRNA结合位点的调节，例如如本文所述，例如在标题为“Gene Writer基因编辑器系统的多肽组分”的部分中所述。
在一些实施例中，对象序列可以含有非编码序列。例如，模板RNA可以包含启动子或增强子序列。在一些实施例中，模板RNA包含组织特异性启动子或增强子，其中的每个可以是单向的或双向的。在一些实施例中，启动子是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子。在一些实施例中，启动子包含TATA元件。在一些实施例中，启动子包含B识别元件。在一些实施例中，启动子具有针对转录因子的一个或多个结合位点。在一些实施例中，相对于5’和3’UTR以反义方向转录非编码序列。在一些实施例中，相对于5’和3’UTR以有义方向转录非编码序列。
在一些实施例中，本文所述的核酸(例如，模板RNA或编码模板RNA的DNA)包含启动子序列，例如组织特异性启动子序列。在一些实施例中，组织特异性启动子用于增加GeneWriter系统的靶细胞特异性。例如，可以基于启动子在靶细胞类型中有活性但在非靶细胞类型中无活性(或在较低水平上有活性)来选择启动子。因此，即使启动子整合到非靶细胞的基因组中，它也不会驱动整合基因的表达(或仅驱动低水平表达)。如本文所述，在模板RNA中具有组织特异性启动子序列的系统也可与微小RNA结合位点(例如在模板RNA或编码GeneWriter蛋白的核酸中)组合使用。在模板RNA中具有组织特异性启动子序列的系统也可与由组织特异性启动子驱动的编码GeneWriter多肽的DNA组合使用，例如，以在靶细胞中获得比非靶细胞中更高水平的GeneWriter蛋白。
在一些实施例中，模板RNA(或编码模板RNA的DNA)所包含的异源对象序列与至少一个调节序列可操作地连接。在一些实施例中，异源对象序列可操作地连接至组织特异性启动子，使得异源对象序列例如治疗性蛋白质的表达在靶细胞中被上调，如上所述。在一些实施例中，异源对象序列可操作地连接至miRNA结合位点，使得异源对象序列例如治疗性蛋白质的表达在具有较高水平相应miRNA的细胞(例如非靶细胞)中被下调，如上所述。
在一些实施例中，模板RNA包含微小RNA序列、siRNA序列、指导RNA序列、piwi RNA序列。
在一些实施例中，模板RNA包含非编码异源对象序列，例如调节序列。在一些实施例中，异源对象序列的整合因此改变了内源基因的表达。在一些实施例中，异源对象序列的整合上调内源基因的表达。在一些实施例中，异源对象序列的整合下调内源基因的表达。
在一些实施例中，模板RNA包含协调表观遗传修饰的位点。在一些实施例中，模板RNA包含抑制例如防止表观遗传沉默的元件。在一些实施例中，模板RNA包含染色质绝缘子。例如，模板RNA包含CTCF位点或靶向用于DNA甲基化的位点。
为了促进更高水平或更稳定的基因表达，模板RNA可以包括防止或抑制基因沉默的特征。在一些实施例中，这些特征防止或抑制DNA甲基化。在一些实施例中，这些特征促进DNA去甲基化。在一些实施例中，这些特征防止或抑制组蛋白脱乙酰化。在一些实施例中，这些特征防止或抑制组蛋白甲基化。在一些实施例中，这些特征促进组蛋白乙酰化。在一些实施例中，这些特征促进组蛋白去甲基化。在一些实施例中，可以将多种特征掺入模板RNA中以促进这些修饰中的一种或多种。CpG二核苷酸通过宿主甲基转移酶进行甲基化。在一些实施例中，模板RNA缺乏CpG二核苷酸，例如，与相应的未改变的序列相比，其不包含CpG核苷酸或包含减少数量的CpG二核苷酸。在一些实施例中，从整合的DNA驱动转基因表达的启动子缺乏CpG二核苷酸。
在一些实施例中，模板RNA包含由至少一个可操作地连接至效应子序列的调节区构成的基因表达单元。效应子序列可以是转录成RNA的序列(例如，编码序列或非编码序列，例如编码微小RNA的序列)。
在一些实施例中，将模板RNA的对象序列插入靶基因组的内源内含子中。在一些实施例中，将模板RNA的对象序列插入靶基因组中，从而充当新的外显子。在一些实施例中，将对象序列插入靶基因组导致天然外显子的替换或天然外显子的跳过。
在一些实施例中，将模板RNA的对象序列插入靶基因组的基因组安全港位点中，例如AAVS1、CCR5或ROSA26中。在一些实施例中，将模板RNA的对象序列插入到白蛋白基因座中。在一些实施例中，将模板RNA的对象序列插入TRAC基因座中。在一些实施例中，将模板RNA的对象序列添加到基因组的基因间或基因内区域中。在一些实施例中，将模板RNA的对象序列添加到基因组的内源活性基因的5’或3’的0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75，kb，1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb或100kb之内。在一些实施例中，将模板RNA的对象序列添加到基因组的内源启动子或增强子的5’或3’的0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75，kb，1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb或100kb之内。在一些实施例中，模板RNA的对象序列可以是例如在50-50,000个碱基对之间(例如，在50-40,000bp之间，在500-30,000bp之间，在500-20,000bp之间，在100-15,000bp之间，在500-10,000bp之间，在50-10,000bp之间，在50-5,000bp之间。在一些实施例中，异源对象序列的长度小于1,000、1,300、1500、2,000、3,000、4,000、5,000或7,500个核苷酸。
在一些实施例中，基因组安全港位点是Natural HarborTM位点。在一些实施例中，Natural HarborTM位点是核糖体DNA(rDNA)。在一些实施例中，Natural Harbor TM位点是5SrDNA、18S rDNA、5.8S rDNA或28S rDNA。在一些实施例中，Natural Harbor TM位点是5SrDNA中的Mutsu位点。在一些实施例中，Natural HarborTM位点是28S rDNA中的R2位点、R5位点、R6位点、R4位点、R1位点、R9位点或RT位点。在一些实施例中，Natural HarborTM位点是18S rDNA中的R8位点或R7位点。在一些实施例中，Natural HarborTM位点是编码转移RNA(tRNA)的DNA。在一些实施例中，Natural HarborTM位点是编码tRNA-Asp或tRNA-Glu的DNA。在一些实施例中，Natural HarborTM位点是编码剪接体RNA的DNA。在一些实施例中，NaturalHarborTM位点是编码小核RNA(snRNA)例如U2 snRNA的DNA。
因此，在一些方面，本公开提供了将异源对象序列插入Natural HarborTM位点的方法。在一些实施例中，所述方法包括使用本文所述的GeneWriter系统，例如，使用表X、Z1、Z2、3A、或3B中任一项的多肽或与其具有序列相似性，例如与其具有至少80％、85％、90％或95％同一性的多肽。在一些实施例中，所述方法包括使用酶，例如逆转录转座酶，将异源对象序列插入Natural HarborTM位点。在一些方面，本披露提供了宿主人细胞，其包含位于细胞基因组中的Natural HarborTM位点的异源对象序列(例如，编码治疗性多肽的序列)。在一些实施例中，Natural HarborTM位点是在下表4中描述的位点。在一些实施例中，将异源对象序列插入表4所示序列的20、50、100、150、200、250、500或1000个碱基对内。在一些实施例中，将异源对象序列插入表4所示序列的0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75，kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb或100kb内。在一些实施例中，将异源对象序列插入与表4所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的位点。在一些实施例中，将异源对象序列插入与表4所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的位点的20、50、100、150、200、250、500或1000个碱基对内，或0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75，kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb或100kb内。在一些实施例中，将异源对象序列插入表4第5列所示的基因内，或所述基因的20、50、100、150、200、250、500或1000个碱基对内，或0.1kb、0.25kb、0.5kb、0.75，kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、7.5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、50、75kb或100kb内。
表4.Natural HarborTM位点。第1列指示插入Natural HarborTM位点的逆转录转座子。第2列指示在Natural HarborTM位点处的基因。第3列和第4列显示了插入位点5'和3'的示例性人基因组序列(例如，250bp)。第5列和第6列列出了示例基因符号和对应的基因ID。
在一些实施例中，本文所述的系统或方法导致异源序列插入人基因组中的靶位点。在一些实施例中，人基因组中的靶位点与天然的生物体基因组中的相应野生型逆转录转座酶(例如GeneWriter从其衍生的逆转录转座酶)的相应靶位点具有序列相似性。例如，在一些实施例中，以插入位点为中心的人基因组序列的40个核苷酸与以插入位点为中心的天然生物体基因组序列的40个核苷酸之间的同一性小于99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％或50％、或50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90-100％。在一些实施例中，以插入位点为中心的人基因组序列的100个核苷酸与以插入位点为中心的天然生物体基因组序列的100个核苷酸之间的同一性小于99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％或50％、或50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90-100％。在一些实施例中，以插入位点为中心的人基因组序列的500个核苷酸与以插入位点为中心的天然生物体基因组序列的500个核苷酸之间的同一性小于99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％或50％、或50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90-100％。
本文所述的Gene Writer基因组编辑系统的模板核酸(例如，模板RNA)组分通常能够结合系统的Gene Writer基因组编辑蛋白。在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)具有3'区，其能够结合Gene Writer基因组编辑蛋白。结合区，例如3’区，可以是结构化的RNA区，例如具有至少1、2或3个发夹环，其能够结合系统的Gene Writer基因组编辑蛋白。结合区可以将模板核酸(例如，模板RNA)与任何多肽模块相关联。在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)的结合区可以与多肽中的RNA结合结构域相关联。在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)的结合区可以与多肽的逆转录结构域相关联(例如，特异性结合RT结构域)。例如，当逆转录结构域来源于非LTR逆转录转座子时，模板核酸(例如模板RNA)可以包含来源于非LTR逆转录转座子的结合区，例如来自非LTR逆转录转座子的3’UTR。在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)可以与多肽的DNA结合结构域相关联，例如，gRNA与Cas9来源的DNA结合结构域相关联。在一些实施例中，结合区还可以提供DNA靶识别，例如gRNA与靶DNA序列杂交并结合多肽，例如Cas9结构域。在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)可以与多肽的多个组分(例如，DNA结合结构域和逆转录结构域)相关联。例如，模板核酸(例如，模板RNA)可以包含与源自Cas9的DNA结合结构域相关联的gRNA区域和来自与源自非LTR反转录转座子的逆转录结构域相关联的非LTR逆转录转座子的3’UTR。
在一些实施例中，本文所述的系统或方法包含单个模板核酸(例如，模板RNA)。在一些实施例中，本文所述的系统或方法包含多个模板核酸(例如，模板RNA)。例如，本文描述的系统包含第一RNA和第二RNA(例如，模板RNA)，该第一RNA包含(例如，从5'到3')结合GeneWriter多肽的序列(例如，DNA结合结构域和/或核酸内切酶结构域，例如，gRNA)和结合靶位点(例如，靶基因组中位点的未编辑链)的序列，该第二RNA包含(例如，从5'到3')任选的结合Gene Writer多肽(例如，特异性结合RT结构域)的序列、异源对象序列和3'同源结构域。在一些实施例中，当系统包含多个核酸时，每个核酸包含缀合结构域。在一些实施例中，缀合结构域使得核酸分子能够相关联，例如，通过互补序列的杂交。
在一些实施例中，模板核酸还可包含gRNA。在一些实施例中，模板核酸可以通过模板核酸的gRNA部分与异源RNA结合结构域的相互作用与Gene Writer多肽结合。在一些实施例中，异源RNA结合结构域是Cas9。
在一些实施例中，模板核酸可以包含一个或多个UTR(例如，5’UTR或3’UTR，例如，来自R2型逆转录转座子)和gRNA。在一些实施例中，UTR促进模板与多肽的逆转录酶结构域的相互作用。在一些实施例中，gRNA促进与多肽的结合结构域的相互作用。在一些实施例中，gRNA将多肽引导至匹配的靶序列。在一些实施例中，模板可以仅包含逆转录酶结合基序(例如，来自R2的3’UTR)，并且gRNA可以作为用于靶位点识别的第二RNA分子提供。在一些实施例中，含有RT结合基序的模板可以与gRNA存在于同一分子上，但通过切割活性(例如核酶)加工成两个RNA分子。
在一些实施例中，模板具有一个或多个有助于模板与Gene Writer多肽结合的序列。在一些实施例中，这些序列可以源自逆转录转座子UTR。在一些实施例中，UTR可以位于所期望插入序列的侧翼。在一些实施例中，具有靶位点同源性的序列可以位于一个或两个UTR之外。在一些实施例中，具有靶位点同源性的序列可以与靶序列退火以引发逆转录。在一些实施例中，5’和/或3’UTR可以位于靶位点同源序列的末端，例如，使得靶引发的逆转录排除5’和/或3’UTR的逆转录。在一些实施例中，Gene Writer系统可导致插入所期望的载荷而无需任何额外的序列(例如，没有用于结合Gene Writer蛋白的UTR的基因表达单元)。
模板核酸(例如，模板RNA)可以设计成在靶DNA基因座处产生插入、突变或缺失。在一些实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)可被设计成导致插入靶DNA。例如，模板核酸(例如，模板RNA)可以含有异源序列，其中逆转录将导致异源序列插入靶DNA中。在其他实施例中，RNA模板可以设计为将缺失写入靶DNA。例如，模板核酸(例如，模板RNA)可以在所期望缺失的上游和下游匹配靶DNA，其中逆转录将导致从模板核酸(例如模板RNA)上游和下游序列的复制，而没有间插序列，例如导致间插序列的缺失。在其他实施例中，模板核酸(例如，模板RNA)可被设计为将编辑写入靶DNA。例如，模板RNA可以在一个或多个核苷酸除外的情况下匹配靶DNA序列，其中逆转录将导致这些编辑复制到靶DNA中，例如导致突变，例如转位或颠换突变。
在一些实施例中，Gene Writer系统能够在靶位点中产生至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个核苷酸(并且任选地没有超过500、400、300、200或100个核苷酸)插入。在一些实施例中，Gene Writer系统能够在靶位点中产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个核苷酸(并且任选地不超过500、400、300、200或100个核苷酸)插入。在一些实施例中，Gene Writer系统能够在靶位点中产生至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千碱基(并且任选地不超过1、5、10或20千碱基)插入。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个核苷酸(并且任选地不超过500、400、300或200个核苷酸)缺失。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少81、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个核苷酸(并且任选地不超过500、400、300或200个核苷酸)缺失。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200个核苷酸(并且任选不超过500、400、300或200个核苷酸)缺失。在一些实施例中，Gene Writer系统能够产生至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10千碱基(并且任选不超过1、5、10、或20千碱基)缺失。
另外的模板功能
在一些实施例中，模板(例如，模板RNA)包含某些结构特征，例如，计算机确定的结构特征。在实施例中，模板RNA预计具有的最小能量结构是-280至-480kcal/mol(例如，-280至-300、-300至-350、-350至-400、-400至-450、或-450至-480kcal/mol)，例如，通过RNAstructure测量，如Turner和Mathews Nucleic Acids Res[核酸研究]38：D280-282(2009)中所述(将其通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施例中，模板(例如，模板RNA)包含某些结构特征，例如，体外确定的结构特征。在实施例中，模板RNA是序列优化的，例如，以减少二级结构，如体外确定的，例如，通过SHAPE-MaP(例如，如Siegfried等人Nat Methods[自然方法学]11:959-965(2014)中所述；将其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，模板(例如，模板RNA)包含某些结构特征，例如，细胞中确定的结构特征。在实施例中，模板RNA是序列优化的，例如以减少在细胞中测量的二级结构，例如通过DMS-MaPseq(例如，如Zubradt等人Nat Methods[自然方法学]14:75-82(2017)中所述；将其通过引用以其整体并入本文)。
Gene WritersTM的另外的功能性特征
在一些情况下，如本文所述的Gene Writer可以由一个或多个功能性测量值或特征来表征。在一些实施例中，DNA结合结构域具有下述功能特征中的一种或多种。在一些实施例中，RNA结合结构域具有下述功能特征中的一种或多种。在一些实施例中，核酸内切酶结构域具有下述功能特征中的一种或多种。在一些实施例中，逆转录酶结构域具有下述功能特征中的一种或多种。在一些实施例中，模板(例如，模板RNA)具有下述功能特征中的一种或多种。在一些实施例中，由Gene Writer结合的靶位点具有下述功能特征中的一种或多种。
在实施例中，本披露提供了用于重新靶向的核酸分子或系统，例如Gene Writer多肽或核酸分子，或如本文所述的系统。(例如，Gene Writer多肽或核酸分子，或如本文所述的系统的)重新靶向通常包括：(i)引导多肽在靶位点结合和切割；和/或(ii)将模板RNA设计为与靶序列具有互补性。在一些实施例中，模板RNA与第一链切口的靶序列5'具有互补性，例如，使得模板RNA的3'末端退火并且靶位点的5'末端用作引物，例如,用于靶引发的逆转录(TPRT)。在一些实施例中，多肽的核酸内切酶结构域和RNA模板的5’末端也如所述被修饰。
Gene Writer多肽
DNA结合结构域
在一些实施例中，DNA结合结构域能够以比参考DNA结合结构域更大的亲和力结合靶序列(例如，dsDNA靶序列)。在一些实施例中，参考DNA结合结构域是来自家蚕的R2_BM的DNA结合结构域。在一些实施例中，DNA结合结构域能够以100pM-10nM之间(例如，100pM-1nM或1nM-10nM之间)的亲和力结合靶序列(例如，dsDNA靶序列)。
在一些实施例中，DNA结合结构域对其靶序列(例如，dsDNA靶序列)的亲和力在体外测量，例如，通过热泳法，例如，如Asmari等人Methods[方法]146:107-119(2018)(通过引用以其全文并入本文)中所述。
在实施例中，在例如约100倍摩尔过量的摩尔过量的乱序序列竞争者dsDNA存在的情况下，DNA结合结构域能够例如以100pM-10nM之间(例如，100pM-1nM或1nM-10nM之间)的亲和力结合其靶序列(例如，dsDNA靶序列)。
在一些实施例中，发现DNA结合结构域与其靶序列(例如，dsDNA靶序列)相关联的频率高于靶细胞(例如，人靶细胞)基因组中的任何其他序列，例如，如通过ChIP-seq测量的(例如，在HEK293T细胞中)，例如，如He和Pu(2010)Curr.Protoc Mol Biol[分子生物学最新方案]第21章(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，发现DNA结合结构域与其靶序列(例如，dsDNA靶序列)以比靶细胞的基因组中任何其他序列更频繁至少约5倍或10倍的频率相关联，例如，如通过ChIP-seq(例如，在HEK293T细胞中)测量的，例如，如He和Pu(2010),同上中所述。
在一些实施例中，Gene Writer多肽包含对DNA结合结构域的修饰，例如，相对于野生型多肽。在一些实施例中，DNA结合结构域包含对原始DNA结合结构域的氨基酸序列的添加、缺失、替换或修饰。在一些实施例中，DNA结合结构域被修饰以包括特异性结合目的靶核酸(例如DNA)序列的异源功能结构域。在一些实施例中，功能结构域替换多肽的先前DNA结合结构域的至少一部分(例如，全部)。在一些实施例中，功能结构域包含锌指(例如，特异性结合目的靶核酸(例如，DNA)序列的锌指)。在一些实施例中，功能结构域包含Cas结构域(例如，特异性结合目的靶核酸(例如，DNA)序列的Cas结构域。在实施例中，Cas结构域包含Cas9或其突变体或变体(例如，如本文所述)。在实施例中，Cas结构域与指导RNA(gRNA)相关联，例如，如本文所述。在实施例中，Cas结构域被gRNA导向目的靶核酸(例如，DNA)序列。在实施例中，Cas结构域与gRNA在相同的核酸(例如，RNA)分子中编码。在实施例中，Cas结构域与gRNA在不同的核酸(例如，RNA)分子中编码。
在一些实施例中，Gene Writer多肽包含对核酸内切酶结构域的修饰，例如，相对于野生型多肽。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含对原始核酸内切酶结构域的氨基酸序列的添加、缺失、替换或修饰。在一些实施例中，核酸内切酶结构域被修饰以包括异源功能结构域，其特异性结合和/或诱导目的靶核酸(例如，DNA)序列的核酸内切酶切割。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含锌指。在一些实施例中，核酸内切酶结构域包含Cas结构域(例如，Cas9或其突变体或变体)。在实施例中，包含Cas结构域的核酸内切酶结构域与例如如本文所述的指导RNA(gRNA)相关联。在一些实施例中，核酸内切酶结构域被修饰以包括不靶向特定靶核酸(例如，DNA)序列的功能结构域。在实施例中，核酸内切酶结构域包含Fok1结构域。
在一些实施例中，逆转录酶(RT)结构域表现出靶引发的逆转录(TPRT)起始的增强的严格性，例如，相对于内源RT结构域。在一些实施例中，当靶位点中紧邻第一链切口上游的3nt，例如引发RNA模板的基因组DNA，与RNA模板中的同源3nt具有至少66％或100％的互补性时，RT结构域启动TPRT。在一些实施例中，当模板RNA同源性和靶DNA引发逆转录之间存在少于5nt错配(例如少于1、2、3、4或5nt错配)时，RT结构域启动TPRT。在一些实施例中，修饰RT结构域使得TPRT反应引发中的错配的严格性增加，例如，其中相对于野生型(例如，未修饰的)RT结构域，RT结构域不容许任何错配或容许引发区域中更少的错配。在一些实施例中，RT结构域包含HIV-1RT结构域。在实施例中，HIV-1RT结构域启动较低水平的合成，即使相对于替代RT结构域具有三个核苷酸错配(例如，如Jamburuthugoda和Eickbush J MolBiol[分子生物学杂志]407(5):661-672(2011)所述；将其通过引用以其整体并入本文)。
RNA结合结构域
在一些实施例中，RNA结合结构域能够以比参考RNA结合结构域更大的亲和力结合模板RNA。在一些实施例中，参考RNA结合结构域是来自家蚕的R2_BM的RNA结合结构域。在一些实施例中，RNA结合结构域能够以100pM-10nM(例如，100pM-1nM或1nM-10nM)的亲和力结合模板RNA。在一些实施例中，RNA结合结构域对其模板RNA的亲和力在体外测量，例如通过热泳，例如，如Asmari等人Methods[方法]146:107-119(2018)(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，RNA结合结构域对其模板RNA的亲和力在细胞中测量(例如，通过FRET或CLIP-Seq)。
在一些实施例中，RNA结合结构域与模板RNA在体外以比乱序RNA高至少约5倍或10倍的频率相关联。在一些实施例中，RNA结合结构域与模板RNA或乱序RNA之间的关联频率通过CLIP-seq测量，例如，如Lin和Miles(2019)Nucleic Acids Res[核酸研究]47(11):5490-5501(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，RNA结合结构域与模板RNA在细胞(例如，HEK293T细胞)中以比乱序RNA高至少约5倍或10倍的频率相关联。在一些实施例中，RNA结合结构域与模板RNA或乱序RNA之间的关联频率通过CLIP-seq测量，例如，如Lin和Miles(2019)同上中所述。
核酸内切酶结构域
在一些实施例中，核酸内切酶结构域与靶dsDNA在体外以比乱序dsDNA高至少约5倍或10倍的频率相关联。在一些实施例中，核酸内切酶结构域与靶dsDNA在体外以比乱序dsDNA高至少约5倍或10倍的频率相关联，例如在细胞(例如，HEK293T细胞)中。在一些实施例中，核酸内切酶结构域与靶DNA或乱序DNA之间的关联频率通过ChIP-seq测量，例如，如He和Pu(2010)Curr.Protoc Mol Biol[分子生物学最新方案]第21章(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域可以催化在靶序列处形成切口，例如相对于非靶序列(例如，相对于靶细胞基因组中的任何其他基因组序列)增加至少约5倍或10倍。在一些实施例中，使用NickSeq确定切口形成的水平，例如，如Elacqua等人(2019)bioRxivdoi.org/10.1101/867937(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域能够在体外对DNA进行切口。在实施例中，切口导致暴露的碱基。在实施例中，暴露的碱基可以使用核酸酶敏感性测定来检测，例如，如Chaudhry和Weinfeld(1995)Nucleic Acids Res[核酸研究]23(19):3805-3809(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在实施例中，暴露的碱基的水平(例如，通过核酸酶敏感性测定检测)相对于参考核酸内切酶结构域增加至少10％、50％或更多。在一些实施例中，参考核酸内切酶结构域是来自家蚕的R2_BM的核酸内切酶结构域。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域能够在细胞中对DNA进行切口。在实施例中，核酸内切酶结构域能够在HEK293T细胞中对DNA进行切口。在实施例中，在没有Rad51的情况下经历复制的未修复的切口导致切口部位的NHEJ率增加，这可以例如通过使用Rad51抑制测定来检测，例如，如Bothmer等人(2017)Nat Commun[自然通讯]8:13905(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在实施例中，NHEJ率增加至0-5％以上。在实施例中，例如在Rad51抑制后，NHEJ率增加至20％-70％(例如，在30％-60％或40％-50％)。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域在切割后释放靶标。在一些实施例中，通过评估酶的多次周转间接指示靶标的释放，例如，如Yourik等人RNA25(1):35-44(2019)(将其通过引用以其整体并入本文)中所述并如图2所示。在一些实施例中，如通过此类方法测量的，核酸内切酶结构域的kexp为1x 10-3-1x 10-5min-1。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域在体外具有大于约1x 108s-1M-1的催化效率(kcat/Km)。在实施例中，核酸内切酶结构域的催化效率在体外大于约1x 105、1x 106、1x 107或1x 108,s-1M-1。在实施例中，催化效率如Chen等人(2018)Science[科学]360(6387):436-439(将其通过引用以其整体并入本文)所述确定。在一些实施例中，核酸内切酶结构域在细胞中具有大于约1x 108s-1M-1的催化效率(kcat/Km)。在实施例中，核酸内切酶结构域的催化效率在细胞中大于约1x 105、1x 106、1x 107或1x 108s-1M-1。
逆转录酶结构域
在一些实施例中，相对于参考逆转录酶结构域，逆转录酶结构域在体外具有较低的过早终止率概率(Poff)。在一些实施例中，参考逆转录酶结构域是来自家蚕的R2_BM的逆转录酶结构域或病毒逆转录酶结构域，例如来自M-MLV的RT结构域。
在一些实施例中，逆转录酶结构域具有低于约5x 10-3/nt、5x 10-4/nt或5x 10-6/nt的体外过早终止率(Poff)的较低概率，例如如在1094nt RNA上测量。在实施例中，体外过早终止率如Bibillo和Eickbush(2002)J Biol Chem[生物化学杂志]277(38):34836-34845(将其通过引用以其整体并入本文)中所述确定。
在一些实施例中，逆转录酶结构域能够在细胞中完成至少约30％或50％的整合。完全整合的百分比可以通过将基本上全长整合事件(例如，包含至少98％的预期整合序列的基因组位点)的数量除以细胞群体中总(包括基本上全长和部分)整合事件的数量来测量。在实施例中，使用长读段扩增子测序确定细胞中的整合(例如，跨整合位点)，例如，如Karst等人(2020)bioRxivdoi.org/10.1101/645903(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。
在实施例中，定量细胞中的整合包括计数包含至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的对应于模板RNA(例如长度至少为0.05、0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4或5kb的模板RNA，例如长度在0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、1.0-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2.0、2-3、3-4或4-5kb)的DNA序列的整合部分。
在一些实施例中，逆转录酶结构域能够在体外聚合dNTP。在实施例中，逆转录酶结构域能够以0.1-50nt/sec(例如0.1-1、1-10或10-50nt/sec)的速率在体外聚合dNTP。在实施例中，通过单分子测定法测量逆转录酶结构域对dNTP的聚合，例如，如Schwartz和Quake(2009)PNAS106(48):20294-20299(将其通过引用以其整体并入)中所述。
在一些实施例中，逆转录酶结构域的体外错误率(例如，核苷酸的错误掺入)是1x10-3-1x 10-4或1x 10-4-1x 10-5个取代/nt，例如，如Yasukawa等人(2017)Biochem BiophysRes Commun[生物化学与生物物理研究通讯]492(2):147-153(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，逆转录酶结构域在细胞(例如，HEK293T细胞)中具有的错误率(例如，核苷酸的错误掺入)是1x 10-3-1x 10-4或1x 10-4-1x 10-5个取代/nt，例如，通过长读段扩增子测序，例如，如Karst等人(2020)bioRxiv doi.org/10.1101/645903(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。
在一些实施例中，逆转录酶结构域能够在体外进行靶RNA的逆转录。在一些实施例中，逆转录酶需要至少3nt的引物来启动模板的逆转录。在一些实施例中，通过检测来自靶RNA的cDNA来确定靶RNA的逆转录(例如，当提供有ssDNA引物时，例如，其与靶在3'末端退火至少3、4、5、6、7、8、9或10nt)，例如，如Bibillo和Eickbush(2002)J Biol Chem[生物化学杂志]277(38):34836-34845(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。
在一些实施例中，与缺乏蛋白质结合基序(例如，3'UTR)的RNA模板相比，例如当将其RNA模板转化为cDNA时，逆转录酶结构域执行逆转录的效率至少高5或10倍(例如，通过cDNA产生)。在实施例中，逆转录效率如Yasukawa等人(2017)Biochem Biophys Res Commun[生物化学与生物物理研究通讯]492(2):147-153(将其通过引用以其整体并入本文)中所述测量。
在一些实施例中，逆转录酶结构域以比任何内源细胞RNA(例如，当在细胞(例如，HEK293T细胞)中表达时)更高的频率(例如，高约5或10倍的频率)特异性结合特定的RNA模板。在实施例中，通过CLIP-seq测量逆转录酶结构域和模板RNA之间的特异性结合频率，例如，如Lin和Miles(2019)Nucleic Acids Res[核酸研究]47(11):5490-5501(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。
靶位点
在一些实施例中，在Gene Writing后，例如在少于约50％或10％的整合事件中整合序列周围的靶位点包含有限数量的插入或缺失，例如如通过靶位点的长读段扩增子确定，例如，如Karst等人(2020)bioRxiv doi.org/10.1101/645903(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，靶位点不显示多个插入事件，例如头对尾或头对头重复，例如，如通过靶位点的长读段扩增子测序确定的，例如，如Karst等人bioRxiv doi.org/10.1101/645903(2020)(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，靶位点包含对应于模板RNA的整合序列。在一些实施例中，靶位点在超过约1％或10％的事件中不包含由内源RNA产生的插入，例如，如通过靶位点的长读段扩增子测序所确定的，例如，如Karst等人bioRxiv doi.org/10.1101/645903(2020)(将其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，靶位点包含对应于模板RNA的整合序列。
在一些实施例中，靶位点包含对应于模板RNA的整合序列。在实施例中，靶位点不包含RT模板之外的序列(例如，gRNA支架、载体主链和/或ITR)，例如，如通过靶位点的长读段扩增子测序所确定的(例如，如在Karst等人bioRxiv doi.org/10.1101/645903(2020)中所述；将其通过引用以其整体并入本文)。
Gene Writer的进化变体
在一些实施例中，本发明提供了Gene Writer的进化变体。在一些实施例中，进化变体可以通过对参考Gene Writer或其中包含的片段或结构域之一进行诱变处理而产生。在一些实施例中，一个或多个结构域(例如逆转录酶、DNA结合(包括例如序列指导的DNA结合元件)、RNA结合或核酸内切酶结构域)进化。在一些实施例中，可以使一个或多个此类进化变体结构域单独进化或与其他结构域一起进化。在一些实施例中，可以将一个或多个进化变体结构域与一个或多个未进化的同源组分或一个或多个同源组分的进化的变体组合，例如，该一个或多个同源组分的进化的变体能以并行或连续方式进化。
在一些实施例中，对参考Gene Writer或其片段或结构域进行诱变处理的过程包括对该参考Gene Writer或其片段或结构域进行诱变处理。在实施例中，诱变包括连续进化方法(例如，PACE)或非连续进化方法(例如，PANCE)，例如如本文所述。在一些实施例中，进化的Gene Writer或其片段或结构域包含相对于参考Gene Writer或其片段或结构域的氨基酸序列引入其氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异。在实施例中，氨基酸序列变异可以包括参考Gene Writer的氨基酸序列内的一个或多个突变的残基(例如，保守取代、非保守取代、或其组合)，例如，该一个或多个突变的残基是由于编码gene writer的核苷酸序列的变化(例如，该编码序列中任何特定位置处密码子的变化)，该变化引起一个或多个氨基酸(例如，截短的蛋白质)的缺失、一个或多个氨基酸的插入或前述内容的任何组合。进化的变体Gene Writer可以包括Gene Writer的一个或多个组分或结构域中的变体(例如，引入逆转录酶结构域、核酸内切酶结构域、DNA结合结构域、RNA结合结构域或其组合的变体)。
在一些方面，本文明提供了使用或包含Gene Writer的进化变体的Gene Writer、系统、试剂盒和方法，例如，采用了Gene Writer的进化的变体或由PACE或PANCE生产或可由其生产的Gene Writer。在实施例中，未进化的参考Gene Writer是如本文披露的GeneWriter。
如本文所用，术语“噬菌体辅助的连续进化(PACE)”通常是指采用噬菌体作为病毒载体的连续进化。PACE技术的实例已描述于例如以下中：2009年9月8日提交的国际PCT申请号PCT/US 2009/056194，其于2010年3月11日公开为WO 2010/028347；2011年12月22日提交的国际PCT申请PCT/US 2011/066747，其于2012年6月28日公开为WO 2012/088381；2015年5月5日发布的美国专利号9,023,594；2017年9月26日发布的美国专利号9,771,574；2016年7月19日发布的美国专利号9,394,537；2015年1月20日提交的国际PCT申请PCT/US 2015/012022，其于2015年9月11日公开为WO 2015/134121；2019年1月15日发布的美国专利号10,179,911；以及2016年4月15日提交的国际PCT申请PCT/US 2016/027795，其于2016年10月20日公开为WO 2016/168631，其中每个的全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“噬菌体辅助的非连续进化(PANCE)”通常是指使用噬菌体作为病毒载体的非连续进化。PANCE技术的实例已描述于例如Suzuki T.等人,Crystalstructures reveal an elusive functional domain of pyrrolysyl-tRNA synthetase[晶体结构揭示了吡咯赖氨酰tRNA合成酶的难以捉摸的功能性结构域],Nat Chem Biol.[自然化学生物学]13(12):1261-1266(2017)中，该文献通过引用以其全文并入本文。简言之，PANCE是一种使用进化中的选择噬菌体(SP)的连续烧瓶转移进行快速体内定向进化的技术，其中含有要在新鲜宿主细胞(例如，大肠杆菌细胞)中进化的目的基因。宿主细胞内的基因可能保持不变，而SP中含有的基因则连续进化。在噬菌体生长之后，可以使用等分的受感染细胞转染随后的含有宿主大肠杆菌的烧瓶。这一过程可以重复和/或继续，直到期望的表型实现进化，例如，持续所需的转移次数。
本领域技术人员通过参考(尤其是)前述参考文献可以容易地理解将PACE和PANCE应用于Gene Writer的方法。用于例如使用噬菌体颗粒例如在宿主细胞群体中引导基因组修饰蛋白或系统的连续进化的另外的示例性方法可用于产生Gene Writer或其片段或亚结构域的进化变体。此类方法的非限制性实例描述于以下中：2009年9月8日提交的国际PCT申请PCT/US2009/056194，其于2010年3月11日公开为WO 2010/028347；2011年12月22日提交的国际PCT申请PCT/US 2011/066747，其于2012年6月28日公开为WO 2012/088381；2015年5月5日发布的美国专利号9,023,594；2017年9月26日发布的美国专利号9,771,574；2016年7月19日发布的美国专利号9,394,537；2015年1月20日提交的国际PCT申请PCT/US 2015/012022，其于2015年9月11日公开为WO 2015/134121；2019年1月15日发布的美国专利号10,179,911；2019年6月14日提交的国际申请号PCT/US2019/37216；2019年1月31日公开的国际专利公开WO 2019/023680；2016年4月15日提交的国际PCT申请PCT/US 2016/027795，其于2016年10月20日公开为WO 2016/168631；以及2019年8月23日提交的国际专利公开号PCT/US 2019/47996；其中每个通过引用以其全文并入本文。
在一些非限制性说明性实施例中，进化变体Gene Writer、或其片段或结构域的进化方法包括：(a)使宿主细胞群体与包含目的基因(起始Gene Writer或其片段或结构域)的病毒载体群体接触，其中：(1)宿主细胞易于被病毒载体感染；(2)宿主细胞对产生病毒颗粒所需的病毒基因进行表达；(3)产生感染性病毒颗粒所需的至少一种病毒基因的表达取决于目的基因的功能；和/或(4)病毒载体允许蛋白质在宿主细胞中表达，并且可以被宿主细胞复制和包装成病毒颗粒。在一些实施例中，该方法包括(b)使宿主细胞与诱变剂接触，其使用具有提高突变率的突变的宿主细胞(例如，通过携带突变质粒或某种基因组修饰—例如，校对受损的DNA聚合酶、SOS基因，例如UmuC、UmuD'、和/或RecA，如果与质粒结合，这些突变可能在诱导型启动子的控制下)或其组合。在一些实施例中，该方法包括(c)在允许病毒复制和产生病毒颗粒的条件下孵育宿主细胞群体，其中从宿主细胞群体中去除宿主细胞，并将新鲜的、未感染的宿主细胞引入到宿主细胞群体中，从而补充宿主细胞群体并产生宿主细胞流。在一些实施例中，将细胞在允许目的基因获得突变的条件下孵育。在一些实施例中，该方法进一步包括(d)从宿主细胞群体中分离病毒载体的突变版本，该突变版本编码进化基因产物(例如，进化变体Gene Writer、或其片段或结构域)。
本领域技术人员将理解在上述框架内可采用的各种特征。例如，在一些实施例中，病毒载体或噬菌体是丝状噬菌体，例如M13噬菌体，例如M13选择噬菌体。在某些实施例中，产生感染性病毒颗粒所需的基因是M13基因III(gIII)。在实施例中，噬菌体可以缺乏功能性gIll，但另外包含gI、gII、gIV、gV、gVI、gVII、gVIII、gIX、和gX。在一些实施例中，感染性VSV颗粒的产生涉及包膜蛋白VSV-G。各种实施例可以使用不同的逆转录病毒载体，例如鼠白血病病毒载体或慢病毒载体。在实施例中，利用VSV-G包膜蛋白(例如，作为病毒的天然包膜蛋白的替代物)可以有效包装逆转录病毒载体。
在一些实施例中，根据合适数量的病毒生命周期孵育宿主细胞，例如至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少7500、至少10000或更多个连续的病毒生命周期，在M13噬菌体的说明性和非限制性实例中，每个病毒生命周期为10-20分钟。类似地，可以调节条件以调整宿主细胞在宿主细胞群体中保留的时间，例如约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约150、或约180分钟。可以部分地通过宿主细胞的密度来控制宿主细胞群体，或者在一些实施例中，流入物中的宿主细胞密度为例如103个细胞/ml、约104个细胞/ml、约105个细胞/ml、约5-105个细胞/ml、约106个细胞/ml、约5-106个细胞/ml、约107个细胞/ml、约5-107个细胞/ml、约108个细胞/ml、约5-108个细胞/ml、约109个细胞/ml、约5·109个细胞/ml、约1010个细胞/ml、或约5·1010个细胞/ml。
启动子
在一些实施例中，一种或多种启动子或增强子元件可操作地连接至编码GeneWriter蛋白的核酸或模板核酸，例如，其控制异源对象序列的表达。在某些实施例中，该一个或多个启动子或增强子元件包含细胞类型或组织特异性元件。在一些实施例中，启动子或增强子是相同的或源自天然地控制异源对象序列表达的启动子或增强子。例如，鸟氨酸转氨甲酰酶启动子和增强子可用于在本发明提供的系统或方法中控制鸟氨酸转氨甲酰酶基因的表达以便纠正鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷。在一些实施例中，用于本发明的启动子是针对表9-22中任一个中描述的基因，例如，其可以与参考基因的等位基因一起使用，或者在其他实施例中，与异源基因一起使用。在一些实施例中，启动子是表33中的启动子或其功能性片段或变体。
例如，可在统一资源定位器(例如，https://www.invivogen.com/tissue- specific-promoters)中找到可商购的示例性组织特异性启动子。在一些实施例中，启动子是天然启动子或最小启动子，例如，其由来自给定基因的5’区的单个片段组成。在一些实施例中，天然启动子包含核心启动子及其天然5’UTR。在一些实施例中，5’UTR包含内含子。在其他实施例中，这些包括复合型启动子，这些复合型启动子组合了起点不同的启动子元件，或由远端增强子与起点相同的最小启动子组装而产生。
示例性细胞或组织特异性启动子在下表中提供，并且编码它们的示例性核酸序列是本领域已知的并且可以使用多种资源容易地获得，例如NCBI数据库，包括RefSeq，以及真核启动子数据库(//epd.epfl.ch//index.php)。
表33.示例性细胞或组织特异性启动子
| 启动子 | 靶细胞 |
| B29启动子 | B细胞 |
| CD14启动子 | 单核细胞 |
| CD43启动子 | 白细胞和血小板 |
| CD45启动子 | 造血细胞 |
| CD68启动子 | 巨噬细胞 |
| 结蛋白启动子 | 肌肉细胞 |
| 弹性蛋白酶-1启动子 | 胰腺腺泡细胞 |
| 内皮糖蛋白启动子 | 内皮细胞 |
| 纤连蛋白启动子 | 分化细胞、愈合组织 |
| Flt-1启动子 | 内皮细胞 |
| GFAP启动子 | 星形胶质细胞 |
| GPIIB启动子 | 巨核细胞 |
| ICAM-2启动子 | 内皮细胞 |
| INF-β启动子 | 造血细胞 |
| Mb启动子 | 肌肉细胞 |
| Nphs1启动子 | 足细胞 |
| OG-2启动子 | 成骨细胞、成牙本质细胞 |
| SP-B启动子 | 肺 |
| Syn1启动子 | 神经元 |
| WASP启动子 | 造血细胞 |
| SV40/bAlb启动子 | 肝脏 |
| SV40/bAlb启动子 | 肝脏 |
| SV40/Cd3启动子 | 白细胞和血小板 |
| SV40/CD45启动子 | 造血细胞 |
| NSE/RU5'启动子 | 成熟神经元 |
表34.另外的示例性细胞或组织特异性启动子
取决于所利用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见例如，Bitter等人(1987)Methods in Enzymology[酶学方法]，153:516-544；将其通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施例中，编码Gene Writer的核酸或模板核酸与控制元件(例如，转录控制元件，例如启动子)可操作地连接。在一些实施例中，转录控制元件可以在以下中起作用：真核细胞例如哺乳动物细胞；或原核细胞(例如细菌或古细菌细胞)。在一些实施例中，编码多肽的核苷酸序列与例如允许该编码多肽的核苷酸序列在原核和真核细胞中表达的多个控制元件可操作地连接。
出于说明目的，空间上受限的启动子的实例包括但不限于神经元特异性启动子、脂肪细胞特异性启动子、心肌细胞特异性启动子、平滑肌特异性启动子、光感受器特异性启动子等。神经元特异性空间上受限的启动子包括但不限于神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(参见例如EMBL HSENO2、X51956)；芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)启动子、神经丝启动子(参见例如，GenBank HUMNFL，L04147)；突触蛋白启动子(参见例如，GenBank HUMSYNIB，M55301)；thy-1启动子(参见例如，Chen等人(1987)Cell[细胞]51:7-19；以及Llewellyn,等人(2010)Nat.Med.[自然·医学]16(10):1161-1166)；5-羟色胺受体启动子(参见例如，GenBank S62283)；酪氨酸羟化酶启动子(TH)(参见例如，Oh等人(2009)Gene Ther[基因治疗]16:437；Sasaoka等人(1992)Mol.Brain Res.[分子脑研究]16:274；Boundy等人(1998)J.Neurosci.[神经科学杂志]18:9989；以及Kaneda等人(1991)Neuron[神经元]6:583-594)；GnRH启动子(参见例如，Radovick等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA [美国国家科学院院刊]88:3402-3406)；L7启动子(参见例如，Oberdick等人(1990)Science[科学]248:223-226)；DNMT启动子(参见例如，Bartge等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:3648-3652)；脑啡肽启动子(参见例如，Comb等人(1988)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]17:3793-3805)；髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子；Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-α(CamKIIα)启动子(参见例如，Mayford等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:13250；以及Casanova等人(2001)Genesis[遗传]31:37)；CMV增强子/血小板源性生长因子-β启动子(参见例如，Liu等人(2004)Gene Therapy[基因治疗]11:52-60)；等。
脂肪细胞特异性的空间上受限的启动子包括但不限于：aP2基因启动子/增强子，例如，人aP2基因的-5.4kb至+21bp区域(参见例如，Tozzo等人(1997)Endocrinol[内分泌学].138:1604；Ross等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:9590；以及Pavjani等人(2005)Nat.Med.[自然·医学]11:797)；葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)启动子(参见例如，Knight等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]100:14725)；脂肪酸转位酶((FAT/CD36)启动子(参见例如Kuriki等人(2002)Biol.Pharm.Bull.[生物和医药学报]25:1476；以及Sato等人(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:15703)；硬脂酰基-辅酶A去饱和酶-1(SCD1)启动子(Tabor等人(1999)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]274:20603)；瘦素启动子(参见例如，Mason等人(1998)Endocrinol.[内分泌学]139:1013；以及Chen等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]262:187)；脂连蛋白启动子(参见例如，Kita等人(2005)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]331:484；以及Chakrabarti(2010)Endocrinol.[内分泌学]151:2408)；降脂蛋白启动子(参见例如，Platt等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:7490)；抗胰岛素蛋白启动子(参见例如，Seo等人(2003)Molec.Endocrinol.[分子内分泌学]17:1522)；等。
心肌细胞特异性的空间上受限的启动子包括但不限于源自以下基因的控制序列：肌球蛋白轻链-2、α-肌球蛋白重链、AE3、心肌肌钙蛋白C、心肌肌动蛋白等。Franz等人(1997)Cardiovasc.Res.[心血管研究]35:560-566；Robbins等人(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年鉴]752:492-505；Linn等人(1995)Circ.Res.[循环研究]76:584-591；Parmacek等人(1994)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]14:1870-1885；Hunter等人(1993)Hypertension[高血压]22:608-617；以及Sartorelli等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:4047-4051。
平滑肌特异性空间受限启动子包括但不限于SM22α启动子(参见，例如，Akyürek等人(2000)Mol.Med.[分子医学]6:983；和美国专利号7,169,874)；平滑肌细胞分化特异性抗原(smoothelin)启动子(参见例如，WO 2001/018048)；α-平滑肌肌动蛋白启动子；等。例如，已显示SM22α启动子的0.4kb区域(其中包含两个CArG元件)介导血管平滑肌细胞特异性表达(参见，例如，Kim,等人(1997)Mol.Cell.Biol.[分子与细胞生物学]17,2266-2278；Li,等人，(1996)J.Cell Biol.[细胞生物学杂志]132,849-859；和Moessler,等人(1996)Development[发育]122,2415-2425)。
光感受器特异性的空间上受限的启动子包括但不限于视紫红质启动子；视紫红质激酶启动子(Young等人(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.[眼科和视觉科学]44:4076)；β磷酸二酯酶基因启动子(Nicoud等人(2007)J.Gene Med.[基因医学杂志]9:1015)；视网膜色素变性基因启动子(Nicoud等人(2007)同上)；光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)基因增强子(Nicoud等人(2007)同上)；IRBP基因启动子(Yokoyama等人(1992)Exp Eye Res.[实验眼科研究杂志]55:225)；等。
非限制性示例性细胞特异性启动子
本领域已知的细胞特异性启动子可用于引导Gene Writer蛋白的表达，例如，如本文所述。非限制性示例性哺乳动物细胞特异性启动子已被表征并用于以细胞特异性方式表达Cre重组酶的小鼠。某些非限制性示例性哺乳动物细胞特异性启动子列于US 9845481的表1中，该文献通过引用并入本文。
在一些实施例中，细胞特异性启动子是在植物中具有活性的启动子。许多示例性的细胞特异性植物启动子是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,097,025；5,783,393；5,880,330；5,981,727；7,557,264；6,291,666；7,132,526；以及7,323,622；以及美国公开号2010/0269226；2007/0180580；2005/0034192；以及2005/0086712，出于任何目的这些均通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，如本文所述的载体包含表达盒。如本文所用，术语“表达盒”是指包含足以表达本发明的核酸分子的核酸元件的核酸构建体。典型地，表达盒包含本发明的与启动子序列可操作地连接的核酸分子。术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸片段在单个核酸片段上的相关联，这样使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，则该启动子与该编码序列可操作地连接(例如，该编码序列在该启动子的转录控制之下)。编码序列能以有义或反义取向与调节序列可操作地连接。在某些实施例中，启动子是异源启动子。如本文所用，术语“异源启动子”是指未发现在自然界中与给定编码序列可操作地连接的启动子。在某些实施例中，表达盒可以包含另外的元件，例如，内含子、增强子、聚腺苷酸化位点、土拨鼠反应元件(WRE)和/或已知影响编码序列表达水平的其他元件“启动子”通常控制编码序列或功能性RNA的表达。在某些实施例中，启动子序列包含近端和更远端上游元件，并可以进一步包含增强子元件。“增强子”典型地可以刺激启动子的活性，且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。在某些实施例中，启动子整体源自天然基因。在某些实施例中，启动子由源自不同天然存在的启动子的不同元件构成。在某些实施例中，启动子包含合成的核苷酸序列。本领域技术人员将理解，不同的启动子将引导基因在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或应答于不同的环境条件或应答于药物或转录辅助因子的存在或不存在的表达。遍在的、细胞类型特异性的、组织特异性的、发育阶段特异性的和条件型的启动子，例如，药物反应性启动子(例如，四环素反应性启动子)是本领域技术人员熟知的。启动子的实例包括但不限于：磷酸甘油酸激酶(PKG)启动子、CAG(CMV增强子、鸡β肌动蛋白启动子(CBA)和兔β珠蛋白内含子的复合物)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、突触蛋白或NeuN启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、SFFV启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。其他启动子可以是人类来源的或来自其他物种(包括来自小鼠)。常见的启动子包括例如：人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、[β]-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子、磷酸甘油酸激酶启动子、人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、甲状腺素转运蛋白启动子、TBG启动子和其他肝脏特异性启动子、结蛋白启动子和类似的肌肉特异性启动子、EF1-α启动子、CAG启动子和其他组成型启动子、具有多组织特异性的杂合启动子、对神经元特异的启动子(如突触蛋白)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，所有这些都是本领域技术人员熟知且容易获得的启动子，可用于获得目的编码序列的高水平表达。另外，源自非病毒基因(如鼠金属硫蛋白基因)的序列也将在本文找到用途。此类启动子序列可商购自例如Stratagene公司(Stratagene)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))。另外的示例性启动子序列描述于例如WO 2018213786A1(其通过引用以其全文并入本文)中。
在一些实施例中，载脂蛋白E增强子(ApoE)或其功能性片段用于例如促使在肝脏中的表达。在一些实施例中，使用两个拷贝的ApoE增强子或其功能性片段。在一些实施例中，ApoE增强子或其功能性片段与启动子(例如，人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子)组合使用。
在一些实施例中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。各种组织特异性调节序列(例如，启动子、增强子等)是本领域已知的。示例性组织特异性调节序列包括但不限于以下组织特异性启动子：肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、α-肌球蛋白重链(a-MHC)启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括：β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,Gene Ther.[基因治疗],3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.[人类基因治疗],7:1503-14(1996))，骨钙素启动子(Stein等人,Mol.Biol.Rep.[分子生物学报告],24:185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen等人,J.Bone Miner.Res.[骨与矿物质研究杂志]11:654-64(1996))，CD2启动子(Hansal等人,J.Immunol.[免疫学杂志],161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α链启动子，神经元例如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等人Cell.Mol.Neurobiol.[细胞和分子神经生物学],13:503-15(1993))，神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],88:5611-5(1991))，和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人,Neuron[神经元],15:373-84(1995))，以及其他。另外的示例性启动子序列描述于例如美国专利号10300146(其通过引用以其全文并入本文)中。在一些实施例中，组织特异性调节元件(例如，组织特异性启动子)选自已知与在给定组织中高度表达的基因可操作地连接的一种，例如，如通过RNA-seq或蛋白质表达数据、或其组合所测量的。用于通过表达分析组织特异性的方法教授于Fagerberg等人MolCell Proteomics[分子与细胞蛋白质组学]13(2):397-406(2014)中，该文献通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，本文所述的载体是多顺反子表达构建体。多顺反子表达构建体包括例如携带第一表达盒和第二表达盒的构建体，该第一表达盒例如包含第一启动子和第一编码核酸序列，该第二表达盒例如包含第二启动子和第二编码核酸序列。在一些情况下，此类多顺反子表达构建体可特别用于递送非翻译基因产物(例如发夹RNA)以及多肽(例如，gene writer和gene writer模板)。在一些实施例中，多顺反子表达构建体可以表现出一种或多种所包括的转基因的降低的表达水平，例如，这是因为启动子干扰或存在非常接近的不相容的核酸元件。如果多顺反子表达构建体是病毒载体的一部分，则在一些情况下，自我互补核酸序列的存在可能会干扰病毒繁殖或包装所需结构的形成。
在一些实施例中，序列编码含发夹的RNA。在一些实施例中，发夹RNA是指导RNA、模板RNA、shRNA或微小RNA。在一些实施例中，第一启动子是RNA聚合酶I启动子。在一些实施例中，第一启动子是RNA聚合酶II启动子。在一些实施例中，第二启动子是RNA聚合酶III启动子。在一些实施例中，第二启动子是U6或H1启动子。在一些实施例中，核酸构建体包含AAV构建体B1或B2的结构。
在不希望受理论约束的情况下，与含有仅一个顺反子的表达系统相比，多顺反子表达构建体可能无法实现最佳的表达水平。使用包含两个或更多个启动子元件的多顺反子表达构建体实现的较低表达水平的建议原因之一是启动子干扰现象(参见，例如，Curtin JA,Dane A P,Swanson A,Alexander I E,Ginn S L.Bidirectional promoterinterference between two widely used internal heterologous promoters in alate-generation lentiviral construct.[晚期慢病毒构建体中两个广泛使用的内部异源启动子之间的双向启动子干扰].Gene Ther [基因治疗].2008年3月；15(5):384-90；和Martin-Duque P,Jezzard S,Kaftansis L,Vassaux G.Direct comparison of theinsulating properties of two genetic elements in an adenoviral vectorcontaining two different expression cassettes[在含有两个不同表达盒的腺病毒载体中对两个遗传元件的绝缘特性的直接比较].Hum Gene Ther[人类基因疗法].2004年10月；15(10):995-1002；两个参考文献均通过引用并入本文以披露启动子干扰现象)。在一些实施例中，可以通过以下克服启动子干扰的问题，例如通过产生包含仅一个启动子的多顺反子表达构建体，该启动子促进由内部核糖体进入位点分开的多个编码核酸序列的转录；或通过将包含具有转录绝缘子元件的自身启动子的顺反子分开。在一些实施例中，多个顺反子的单启动子驱动的表达可能导致顺反子的不均匀表达水平。在一些实施例中，不能有效地分离启动子并且分离元件可能与一些基因转移载体(例如，一些逆转录病毒载体)不相容。
微小RNA
miRNA和其他小干扰核酸通常通过靶RNA转录本切割/降解或靶信使RNA(mRNA)的翻译抑制来调节基因表达。在一些情况下，miRNA可以天然表达，通常作为最终的19-25非翻译RNA产物。miRNA通常通过与靶mRNA的3'非翻译区(UTR)的序列特异性相互作用来表现出它们的活性。这些内源表达的miRNA可以形成发夹前体，这些发夹前体随后被加工成miRNA双链体，并进一步加工成成熟的单链miRNA分子。这种成熟的miRNA通常指导多蛋白复合物miRISC，miRISC基于其与成熟miRNA的互补性来识别靶mRNA的靶3′UTR区。有用的转基因产物可以包括例如调节连接的多肽表达的miRNA或miRNA结合位点。miRNA基因的非限制性列表；例如，在如US 10300146,22:25-25:48(其通过引用并入)中所列的那些方法的方法中，这些基因及其同源物的产物可用作转基因或用作小干扰核酸(例如，miRNA海绵、反义寡核苷酸)的靶标。在一些实施例中，将一个或多个前述miRNA的一个或多个结合位点掺入转基因(例如，由rAAV载体递送的转基因)中，例如以抑制转基因在携带该转基因的动物的一种或多种组织中的表达。在一些实施例中，可以选择结合位点以以组织特异性方式控制转基因的表达。例如，可以将肝脏特异性miR-122的结合位点掺入转基因中以抑制该转基因在肝脏中的表达。另外的示例性miRNA序列描述于例如美国专利号10300146(其通过引用以其全文并入本文)中。然而，对于肝脏特异性Gene Writing，可以利用miR-122的过表达而不是使用结合位点来影响miR-122特异性降解。该miRNA与肝脏分化和成熟以及肝脏特异性基因的增强表达呈正相关。因此，在一些实施例中，可以将miR-122的编码序列添加到Gene Writer系统的组分中以增强肝脏定向疗法。
miR抑制剂或miRNA抑制剂通常是阻断miRNA表达和/或加工的药剂。此类药剂的实例包括但不限于：抑制miRNA与Drosha复合物相互作用的微小RNA拮抗剂、微小RNA特异性反义、微小RNA海绵和微小RNA寡核苷酸(双链、发夹、短寡核苷酸)。MicroRNA抑制剂，例如miRNA海绵，可以在细胞中从转基因表达(例如，如Ebert,M.S.Nature Methods[自然方法],2007年8月12日电子出版中所述；将其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，微小RNA海绵或其他miR抑制剂与AAV一起使用。微小RNA海绵通常通过互补七聚体种子序列特异性抑制miRNA。在一些实施例中，可以使用单个海绵序列沉默整个miRNA家族。其他用于在细胞中沉默miRNA功能(miRNA靶标的去阻抑)的方法对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
在一些实施例中，如本文所述的miRNA包含PCT公开号WO 2020014209的表4中所列的序列，该PCT公开通过引用并入本文。还通过引用并入本文的是来自WO 2020014209的示例性miRNA序列的列表。
在一些实施例中，在细胞的一部分中使Gene Writer系统的一种或多种组分(例如，编码Gene Writer多肽的mRNA、Gene Writer模板RNA或在成功的Gene Writing后从基因组表达的异源对象序列)沉默是有利的。在一些实施例中，限制Gene Writing系统的组分的表达以选择目的组织内的细胞类型是有利的。
例如，已知在给定组织(例如肝脏)中，巨噬细胞和免疫细胞(例如肝脏中的枯否细胞)可参与Gene Writing系统的一种或多种组分的递送媒介物的摄取。在一些实施例中，在巨噬细胞和免疫细胞例如枯否细胞中高度表达的至少一种miRNA的至少一个结合位点包括在Gene Writing系统的至少一种组分中，例如编码Gene Writing多肽或转基因的核酸。在一些实施例中，靶向一个或多个结合位点的miRNA列于本文参考的表中，例如miR-142，例如成熟miRNA hsa-miR-142-5p或hsa-miR-142-3p。
在一些实施例中，在转基因的Gene Writer表达或过表达可能具有毒性作用的细胞中降低Gene Writer水平和/或Gene Writer活性可能是有益的。例如，已经表明将转基因过表达盒递送到背根神经节神经元可能导致基因治疗的毒性(参见Hordeaux等人SciTransl Med[科学转化医学]12(569)；eaba9188(2020)，将其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，可将至少一个miRNA结合位点掺入Gene Writing系统的核酸组分中以降低系统组分在神经元例如背根神经节神经元中的表达。在一些实施例中，掺入GeneWriting系统的核酸组分中以降低系统组分在神经元中的表达的至少一个miRNA结合位点是miR-182的结合位点，例如成熟miRNA hsa-miR-182-5p或hsa-miR-182-3p。在一些实施例中，掺入Gene Writing系统的核酸组分中以减少神经元中系统组分的表达的至少一个miRNA结合位点是miR-183的结合位点，例如成熟miRNA hsa-miR-183-5p或hsa-miR-183-3p。在一些实施例中，miRNA结合位点的组合可用于增强Gene Writing系统的一种或多种组分对目的组织或细胞类型的表达的限制。
下面的表A5提供了示例性的miRNA和相应的表达细胞，例如以下miRNA，在一些实施例中，可以针对该miRNA在转基因或多肽核酸中掺入结合位点(互补序列)，例如，以降低在该脱靶细胞中的表达。
表A5：来自脱靶细胞和组织的示例性miRNA
用于调节GeneWriter活性的抗crispr系统
用于调节Cas分子活性的各种方法可以与本文所述的系统和方法结合使用。例如，在一些实施例中，本文描述的多肽(例如，包含Cas结构域的Cas分子或GeneWriter)可以使用抗crispr剂(例如，抗crispr蛋白或抗crispr小分子)来调节。在一些实施例中，Cas分子或Cas结构域包含响应性内含肽，例如4-羟基三苯氧胺(4-HT)-响应性内含肽、iCas分子(例如iCas9)；4-HT反应性Cas(例如，变构调节的Cas9(arC9)或死Cas9(dC9))。本文所述的系统和方法还可以利用化学诱导的分裂型蛋白片段二聚化系统(例如，雷帕霉素介导的FK506结合蛋白12(FKBP)和FKBP雷帕霉素结合结构域(FRB)(脱落酸诱导的ABI-PYL1和赤霉素诱导的GID1-GAI异二聚化结构域)的二聚化；BCL-xL肽和BH3肽的二聚体、A385358(A3)小分子、degron系统(例如，FKBP-Cas9不稳定系统、生长素诱导degron(AID)或大肠杆菌DHFRdegron系统)、与gRNA(例如，四环素-和茶碱-响应性生物开关)、AcrIIA2和AcrIIA4蛋白以及BRD0539融合的适体或适体酶。
在一些实施例中，将小分子响应性内含肽(例如，4-羟基三苯氧胺(4-HT)-响应性内含肽)插入Cas分子(例如，Cas9)内的特定位点。在一些实施例中，4HT响应性内含肽的插入破坏了Cas9酶活性。在一些实施例中，Cas分子(例如，iCas9)融合到雌激素受体(ERT2)的激素结合结构域。在一些实施例中，人雌激素受体-α的配体结合结构域可以插入到Cas分子(例如，Cas9或死Cas9(dC9))中，例如，在位置231，产生4HT-响应性抗crispr Cas9(例如，arC9或dC9)。在一些实施例中，dCas9可以提供Cas9功能的4-HT剂量依赖性抑制。在一些实施例中，arC9可以提供对Cas9功能的4-HT剂量依赖性控制。在一些实施例中，Cas分子(例如，Cas9)被融合以分裂蛋白质片段。在一些实施例中，化学诱导的分裂型蛋白片段的二聚化(例如，雷帕霉素介导的FK506结合蛋白12(FKBP)和FKBP雷帕霉素结合结构域(FRB)的二聚化)可以诱导低水平的Cas9分子活性。在一些实施例中，化学诱导的二聚化系统(例如，脱落酸诱导型ABI-PYL1和赤霉素诱导型GID1-GAI异二聚化结构域)可以诱导Cas9的剂量依赖性和逆转录激活/抑制。在一些实施例中，Cas9诱导系统(ciCas9)包括用BCL-xl肽替换Cas分子(例如，Cas9)REC2结构域和将BH3肽连接至经修饰的Cas9.BCL的N末端和C末端。在一些实施例中，BCL-xL和BH3肽之间的相互作用可以使Cas9保持在非活性状态。在一些实施例中，小分子(例如，A-385358(A3))可以破坏BLC-xl和BH3肽之间的相互作用以激活Cas9。在一些实施例中，Cas9诱导系统可以表现出对核酸酶活性的剂量依赖性控制。在一些实施例中，degron系统可以在被外部因素(例如，小分子配体、光、温度或蛋白质)激活或失活后诱导Cas分子(例如，Cas9)的降解。在一些实施例中，小分子BRD0539可逆地抑制Cas分子(例如，Cas9)。可以在以下中找到有关抗crispr蛋白或抗crispr小分子的其他信息：例如Gangopadhyay,S.A.等人Precision control of CRISPR-Cas9[CRISPR-Cas9的精确控制]，Biochemistry[生物化学],2019(使用小分子和光),Maji,B.等人A high-throughputplatform to identify small molecule inhibitors of CRISPR-Cas9[用于鉴定CRISPR-Cas9的小分子抑制剂的高通量平台]和Pawluk Anti-CRISPR:discovery,mechanism andfunction[抗CRISPR：发现、机制和功能]Nature Reviews Microbiology[自然微生物学综述]第16卷，第12-17页(2018)，将其中每个通过引用以其整体并入本文。
用于调节GeneWriter活性的自失活模块
在一些实施例中，本文所述的Gene Writer系统包括自失活模块。自失活模块导致Gene Writer多肽、Gene Writer模板或两者的表达降低。不希望受理论束缚，自失活模块在失活之前提供短期Gene Writer表达。不希望受理论束缚，Gene Writer多肽在靶位点的活性将突变(例如取代、插入或缺失)引入编码Gene Writer多肽或Gene Writer模板的DNA中，这导致减少Gene Writer多肽或模板表达。在自失活模块的一些实施例中，Gene Writer多肽的靶位点包括在编码Gene Writer多肽或Gene Writer模板的DNA中。在一些实施例中，靶位点的一个、两个、三个、四个、五个或更多个拷贝包含在编码Gene Writer多肽或GeneWriter模板的DNA中。在一些实施例中，编码Gene Writer多肽或Gene Writer模板的DNA中的靶位点与基因组上的靶位点是相同的靶位点。在一些实施例中，靶位点是与基因组上的靶位点不同的靶位点。在一些实施例中，自失活模块靶位点使用与基因组靶位点相同或不同的模板RNA或指导RNA。在一些实施例中，通过基于模板RNA的靶引发的逆转录来修饰靶位点。在一些实施例中，靶标侧被切口。靶位点可以掺入增强子、启动子、非翻译区、外显子、内含子、开放阅读框或填充序列中。
在一些实施例中，在失活后，表达的降低比不包含自失活模块的Gene Writer系统低25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或更多。在一些实施例中，与不包含自失活模块的Gene Writer系统相比，包含自失活模块的Gene Writer系统在靶位点比脱靶位点具有5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更高的整合率。与不包含自失活模块的Gene Writer系统相比，包含自失活模块的Gene Writer系统具有10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％99％、或更高的靶位点修饰效率。在一些实施例中，当Gene Writer多肽作为DNA(例如通过病毒载体)递送时，包括自失活模块。
已经描述了核酸酶的自失活模块。参见，例如在Li等人A Self-Deleting AAV-CRISPR System for In Vivo Genome Editing[用于体内基因组编辑的自缺失AAV-CRISPR系统],Mol Ther Methods Clin Dev.[分子治疗方法和临床发展]2019年3月15日；12:111-122,P.Singhal,Self-Inactivating Cas9:a method for reducing exposure whilemaintaining efficacy in virally delivered Cas9 applications[自失活Cas9：一种在病毒递送的Cas9应用中减少暴露同时保持功效的方法](可在www.editasmedicine.com/wp-content/uploads/2019/10/aef_asgct_poster_2017_final_-_present_5-11-17_515pm1_1494537387_1494558495_1497467403.pdf获得)，和Epstein与SchafferEngineering a Self-Inactivating CRISPR System for AAV Vectors Targeted GenomeEditing[为AAV载体靶向基因组编辑工程化自失活CRISPR系统I]|第24卷,增补1,S50,2016年5月1日，和WO 2018106693A1。
小分子
在一些实施例中，本文所述的多肽(例如，Gene Writer多肽)是可通过小分子控制的。在一些实施例中，多肽通过小分子二聚化。
在一些实施例中，多肽可通过小分子的化学诱导二聚化(CID)来控制。CID通常用于产生蛋白质功能的开关以改变细胞生理。示例性的高特异性、高效二聚体是rimiducid(AP1903)，它具有两个尾对尾排列的相同蛋白质结合表面，各自对FKBP12的突变体：FKBP12(F36V)(FKBP12v36，FV36或Fv)具有高亲和力和特异性，一个或多个FV结构域与一个或多个通常依赖同二聚化的细胞信号传导分子的附接可以将该蛋白转化为rimiducid控制。与rimiducid的同二聚化用于诱导型半胱天冬酶安全性开关的上下文中。这种分子开关基于异二聚化小分子、雷帕霉素或雷帕霉素类似物(“rapalog”)由不同的二聚体配体控制。雷帕霉素与FKBP12及其变体结合，并且可以通过与FKBP12和包含mTOR的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域的多肽结合来诱导与FKBP12融合的信号传导结构域的异二聚化。在本申请的一些实施例中提供了分子开关，其极大地增大了雷帕霉素、雷帕霉素类似物和rimiducid作为治疗应用的药剂的使用。
在双开关技术的一些实施例中，同二聚体，例如AP1903(rimiducid)，直接诱导包含FKBP12多聚化区域的多肽的二聚化或多聚化。在其他实施例中，包含FKBP12多聚化的多肽是多聚化的，或通过与异二聚体(例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物)结合而聚集，该异二聚体也与嵌合多肽上的FRB或FRB变体多聚化区结合，也在经修饰的细胞中表达例如嵌合抗原受体。雷帕霉素是天然产物大环内酯，以高亲和力(<1nM)与FKBP12结合，并共同启动与mTOR的FKBP-雷帕霉素-结合(FRB)结构域的高亲和力、抑制性相互作用。FRB很小(89个氨基酸)，并且因此当附加到许多蛋白质上时，可以用作蛋白质“标签”或“手柄”。FRB融合蛋白与FKBP12融合蛋白的共表达使其近似为雷帕霉素诱导型(12-16)。这可以作为细胞安全性开关的基础，由可口服的配体雷帕霉素或雷帕霉素衍生物(rapalogs)(其在低治疗剂量时不抑制mTOR，而是结合选定的半胱天冬酶-9融合突变FRB结构域)调节。(参见Sabatini D M,等人，Cell.[细胞]1994；78(1):35-43；Brown E J,等人，Nature.[自然]1994；369(6483):756-8；Chen J,等人,Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]1995；92(11):4947-51；和Choi J，Science[科学].1996；273(5272):239-42)。
在一些实施例中，在治疗细胞中提供了两个控制水平。在实施例中，第一控制水平可以是可调的，即治疗性细胞的去除水平可以被控制，从而导致治疗性细胞的部分去除。在一些实施例中，嵌合抗原多肽包含雷帕霉素或雷帕霉素类似物的结合位点。在实施例中，治疗性细胞中还存在自杀基因，例如编码半胱天冬酶多肽的基因。使用这种可控的第一水平，在一些实施例中，对持续治疗的需要可以与消除或降低负面副作用水平的需要相平衡。在一些实施例中，将雷帕霉素类似物rapalog施用于患者，然后其与半胱天冬酶多肽和嵌合抗原受体两者结合，从而将半胱天冬酶多肽募集到CAR的位置，并聚集半胱天冬酶多肽。聚集后，半胱天冬酶多肽诱导细胞凋亡。施用给患者的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的量可能不同；如果需要通过细胞凋亡去除较低水平的细胞以减少副作用并继续CAR治疗，则可以向患者施用较低水平的雷帕霉素或雷帕霉素。在一些实施例中，可以设计第二控制水平以实现最大程度的细胞消除。该第二水平可以基于例如rimiducid或AP1903的使用。如果需要快速消除高达100％的治疗性细胞，则可以将AP1903施用于患者。多聚体AP1903与半胱天冬酶多肽结合，导致半胱天冬酶多肽的多聚化和细胞凋亡。在某些实例中，第二水平也可以通过施用于受试者的AP1903的水平来调节或控制。
在某些实施例中，小分子可用于控制基因，如例如在US 10584351中在47:53-56:47(将其通过引用以其整体并入本文)处描述的，以及用于控制特征的合适配体，例如在US10584351中在56:48及其后处和在U10046049中在43:27-52:20(将其通过引用并入)处描述，以及在52:21及其后处对此类控制系统的配体的描述。
化学修饰的核酸和核酸末端特征
本文所述的核酸(例如模板核酸，例如模板RNA；或编码GeneWriter的核酸(例如，mRNA))可以包含未修饰或经修饰的核碱基。天然存在的RNA从四种基本核糖核苷酸合成：ATP、CTP、UTP和GTP，但可以含有转录后修饰的核苷酸。此外，已经在RNA中鉴定了大约一百种不同的核苷修饰(Rozenski,J,Crain,P,和McCloskey,J.(1999).The RNA ModificationDatabase:1999update.[RNA修饰数据库:1999年更新]Nucl Acids Res[核酸研究]27:196-197)。RNA还可包含自然界中不存在的完全合成核苷酸。
在一些实施例中，化学修饰是在以下中提供的化学修饰：PCT/US2016/032454、美国专利公开号20090286852、国际申请号WO/2012/019168、WO/2012/045075、WO/2012/135805、WO/2012/158736、WO/2013/039857、WO/2013/039861、WO/2013/052523、WO/2013/090648、WO/2013/096709、WO/2013/101690、WO/2013/106496、WO/2013/130161、WO/2013/151669、WO/2013/151736、WO/2013/151672、WO/2013/151664、WO/2013/151665、WO/2013/151668、WO/2013/151671、WO/2013/151667、WO/2013/151670、WO/2013/151666、WO/2013/151663、WO/2014/028429、WO/2014/081507、WO/2014/093924、WO/2014/093574、WO/2014/113089、WO/2014/144711、WO/2014/144767、WO/2014/144039、WO/2014/152540、WO/2014/152030、WO/2014/152031、WO/2014/152027、WO/2014/152211、WO/2014/158795、WO/2014/159813、WO/2014/164253、WO/2015/006747、WO/2015/034928、WO/2015/034925、WO/2015/038892、WO/2015/048744、WO/2015/051214、WO/2015/051173、WO/2015/051169、WO/2015/058069、WO/2015/085318、WO/2015/089511、WO/2015/105926、WO/2015/164674、WO/2015/196130、WO/2015/196128、WO/2015/196118、WO/2016/011226、WO/2016/011222、WO/2016/011306、WO/2016/014846、WO/2016/022914、WO/2016/036902、WO/2016/077125、或WO/2016/077123，将其中每个通过引用以其整体并入本文。应当理解，将化学修饰的核苷酸掺入多核苷酸可以导致将修饰掺入核碱基、主链或二者，这取决于该修饰在核苷酸中的位置。在一些实施例中，主链修饰是EP 2813570中提供的一种，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，经修饰的帽是美国专利公开20050287539(将其通过引用以其整体并入本文)中提供的帽。
在一些实施例中，化学修饰的核酸(例如，RNA，例如，mRNA)包含一种或多种ARCA：抗反向帽类似物(m27.3'-OGP3G)、GP3G(未甲基化帽类似物)、m7GP3G(单甲基化帽类似物)、m32.2.7GP3G(三甲基化帽类似物)、m5CTP(5'-甲基-胞苷三磷酸)、m6ATP(N6-甲基-腺苷-5'-三磷酸)、s2UTP(2-硫代-尿苷三磷酸和ψ(假尿苷三磷酸)。
在一些实施例中，化学修饰的核酸包含5’帽，例如：7-甲基鸟苷帽(例如，O-Me-m7G帽)；超甲基化帽类似物；NAD+衍生的帽类似物(例如，如Kiledjian,Trends in CellBiology[细胞生物学趋势]28,454-464(2018)中所述)；或经修饰的，例如生物素化的帽类似物(例如，Bednarek等人,Phil Trans R Soc B[伦敦皇家学会哲学汇刊b辑-生物科学]373,20180167(2018))中所述)。
在一些实施例中，化学修饰的核酸包含选自以下中的一种或多种的3’特征：聚A尾；16个核苷酸长的茎环结构，其两侧为未配对的5个核苷酸(例如，Mannironi等人,Nucleic Acid Research[核酸研究]17,9113-9126(1989)中所述)；三螺旋结构(例如，Brown等人，PNAS[美国国家科学院院报]109,19202-19207(2012)所述)；tRNA、Y RNA或穹窿RNA结构(例如，如Labno等人，Biochemica et Biophysica Acta[生物化学和生物物理学报]1863,3125-3147(2016)所述)；掺入一个或多个脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、2'O-甲基化NTP或硫代磷酸酯-NTP；单核苷酸化学修饰(例如，将3'末端核糖氧化为反应性醛，然后缀合醛反应性修饰的核苷酸)；或化学连接到另一个核酸分子。
在一些实施例中，核酸(例如，模板核酸)包含一个或多个经修饰的核苷酸，例如选自二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、5-甲基胞苷(5mC)、5'磷酸核糖胸核苷、2'-O-甲基核糖胸核苷、2'-O-乙基核糖胸核苷、2'-氟核糖胸核苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷(pdC)、C-5丙炔基-脱氧尿苷(pdU)、C-5丙炔基胞苷(pC)、C-5丙炔基尿苷(pU)、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、5-甲基脱氧胞苷、5-甲基脱氧尿苷甲氧基、2,6-二氨基嘌呤、5'-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2'-脱氧胞苷、C-5丙炔基-f-胞苷(pfC)、C-5丙炔基-f-尿苷(pfU)、5-甲基f-胞苷、5-甲基f-尿苷、C-5丙炔基-m-胞苷(pmC)、C-5丙炔基-f-尿苷(pmU)、5-甲基m-胞苷、5-甲基m-尿苷、LNA(锁核酸)、MGB(小沟结合剂)假尿苷(Ψ)、1-N-甲基假尿苷(1-Me-Ψ)、或5-甲氧基尿苷(5-MO-U)。
在一些实施例中，核酸包含主链修饰，例如对主链中的糖或磷酸基团的修饰。在一些实施例中，核酸包含核碱基修饰。
在一些实施例中，核酸包含表M1的一个或多个化学修饰的核苷酸、表M2的一个或多个化学主链修饰、表M3的一个或多个化学修饰的帽。例如，在一些实施例中，核酸包含两个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)不同类型的化学修饰。例如，核酸可以包含两个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)不同类型的经修饰的核碱基，例如，如本文所述，例如表M1中所述。可替代地或组合地，核酸可包含两个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)不同类型的主链修饰，例如，如本文所述，例如表M2中所述。可替代地或组合地，核酸可包含一个或多个经修饰的帽，例如，如本文所述，例如表M3中所述。例如，在一些实施例中，核酸包含一种或多种类型的经修饰的核碱基和一种或多种类型的主链修饰；一种或多种类型的经修饰的核碱基和一个或多个经修饰的帽；一种或多种类型的经修饰的帽和一种或多种类型的主链修饰；或一种或多种类型的经修饰的核碱基、一种或多种类型的主链修饰和一种或多种类型的经修饰的帽。
在一些实施例中，核酸包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、或更多个)经修饰的核碱基。在一些实施例中，核酸的所有核碱基都被修饰。在一些实施例中，在主链中的一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000或更多个)位置修饰核酸。在一些实施例中，核酸的所有主链位置都被修饰。
表M1.修饰的核苷酸
表M2.主链修饰
表M3.修饰的帽
组合物和系统的产生
设计和构建核酸构建体和蛋白质或多肽(例如本文所述的系统、构建体和多肽)的方法是已知的。通常，可以使用重组方法。通常，参见Smales和James(编辑)，TherapeuticProteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods in MolecularBiology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2005)；以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑)，Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals andApplications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。设计、制备、评估、纯化和操纵核酸组合物的方法描述于Green和Sambrook(编辑),MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第四版)，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。
本披露部分地提供了编码本文所述的Gene Writer多肽、本文所述的模板核酸、或两者的核酸(例如，载体)。在一些实施例中，载体包含选择性标志物，例如，抗生素抗性标志物。在一些实施例中，抗生素抗性标志物是卡那霉素抗性标志物。在一些实施例中，抗生素抗性标志物不赋予对β-内酰胺抗生素的抗性。在一些实施例中，载体不包含氨苄西林抗性标志物。在一些实施例中，载体包含卡那霉素抗性标志物而不包含氨苄西林抗性标志物。在一些实施例中，将编码Gene Writer多肽的载体整合到靶细胞基因组中(例如，在施用于靶细胞、组织、器官或受试者后)。在一些实施例中，不将编码Gene Writer多肽的载体整合到靶细胞基因组中(例如，在施用于靶细胞、组织、器官或受试者后)。在一些实施例中，编码模板核酸(例如，模板RNA)的载体没有整合到靶细胞基因组中(例如，在施用于靶细胞、组织、器官或受试者后)。在一些实施例中，如果将载体整合到靶细胞基因组中的靶位点中，则不将选择性标志物整合到基因组中。在一些实施例中，如果将载体整合到靶细胞基因组中的靶位点中，则不将参与载体维持的基因或序列(例如，质粒维持基因)整合到基因组中。在一些实施例中，如果将载体整合到靶细胞基因组中的靶位点中，则不将转移调节序列(例如，反向末端重复序列，例如，来自AAV)整合到基因组中。在一些实施例中，向靶细胞、组织、器官或受试者施用载体(例如，编码本文所述的Gene Writer多肽、本文所述的模板核酸、或两者的载体)可使载体的部分整合到所述靶细胞、组织、器官或受试者的一个或多个基因组中的一个或多个靶位点中。在一些实施例中，包含整合材料的少于99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％的靶位点(例如，没有靶位点)包含来自载体的选择性标志物(例如，抗生素抗性基因)、转移调节序列(例如，反向末端重复序列，例如，来自AAV)、或两者。
用于产生本文所述的治疗性药物蛋白质或多肽的示例性方法涉及在哺乳动物细胞中表达，尽管也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌、或其他细胞，在适当的启动子控制下，产生重组蛋白。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，如复制起点、合适的启动子、以及其他5'或3’侧翼非转录序列；以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体：Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第四版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。
各种哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括CHO、COS、HEK293、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于生产蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程：Zhou和Kantardjieff(编辑)，Mammalian Cell Cultures forBiologics Manufacturing[用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展]),Springer[斯普林格出版社](2014)。本文所述的组合物可包括载体，例如编码重组蛋白的病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施例中，载体，例如病毒载体，可以包含编码重组蛋白的核酸。
在以下文献中描述了蛋白治疗剂的纯化：Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler,Protein PurificationProtocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),HumanaPress[胡玛纳出版社](2010)。
在一些实施例中，质量标准包括但不限于：
(i)编码GeneWriter多肽的mRNA的长度，例如，mRNA的长度是否大于参考长度或在参考长度范围内，例如是否存在的mRNA中的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的长度大于3000、4000或5000个核苷酸；
(ii)mRNA上聚A尾的存在、不存在和/或长度，例如是否存在的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的mRNA含有聚A尾(例如，长度为至少5、10、20、30、50、70、100个核苷酸的聚A尾)；
(iii)mRNA上5’帽的存在、不存在和/或类型，例如是否存在的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的mRNA含有5’帽，例如该帽是否是7-甲基鸟苷帽，例如O-Me-m7G帽；
(iv)mRNA中一种或多种经修饰的核苷酸(例如，选自假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、1-N-甲基假尿苷(1-Me-Ψ)、5-甲氧基尿苷(5-MO-U)、5-甲基胞苷(5mC)或锁定的核苷酸)的存在、不存在和/或类型，例如是否存在的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的mRNA含有一种或多种经修饰的核苷酸；
(v)mRNA的稳定性(例如，随着时间的推移和/或在预先选择的条件下)，例如是否至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的mRNA在稳定性测试后保持完整(例如，长度大于100、125、150、175或200个核苷酸)；或
(vi)mRNA在用于修饰DNA的系统中的效力，例如，在测定包含该mRNA的系统的效力之后，是否至少1％的靶位点被修饰。
试剂盒、制品和药物组合物
在一个方面，本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包含Gene Writer或GeneWriting系统，例如，如本文所述。在一些实施例中，试剂盒包含Gene Writer多肽(或编码多肽的核酸)和模板RNA(或编码模板RNA的DNA)。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含用于将系统引入细胞的试剂，例如转染试剂、LNP等。在一些实施例中，该试剂盒适用于本文所述的任何方法。在一些实施例中，该试剂盒包含一种或多种元件、组合物(例如，药物组合物)、Gene Writer和/或Gene Writer系统，或其功能性片段或组分，它们例如布置在制品中。在一些实施例中，该试剂盒包含其使用说明书。
在一个方面，本披露提供了一种制品，例如，其中布置有本文所述的试剂盒或其组分。
在一个方面，本披露提供了一种药物组合物，该药物组合物包含Gene Writer或Gene Writing系统，例如，如本文所述。在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，药物组合物包含模板RNA和/或编码多肽的RNA。在实施例中，药物组合物具有以下特征中的一个或多个(例如，1、2、3或4个)：
(a)相对于模板RNA和/或编码多肽的RNA少于1％(例如少于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的DNA模板，例如，以摩尔计；
(b)相对于模板RNA和/或编码多肽的RNA少于1％(例如少于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的未加帽RNA，例如，以摩尔计；
(c)相对于模板RNA和/或编码多肽的RNA少于1％(例如少于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的部分长度RNA，例如，以摩尔计；
(d)基本上缺乏未反应的帽二核苷酸。
化学、制造和控制(CMC)
在例如以下文献中描述了蛋白治疗剂的纯化：Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler,Protein PurificationProtocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),HumanaPress[胡玛纳出版社](2010)。
在一些实施例中，Gene WriterTM系统、多肽和/或模板核酸(例如，模板RNA)符合某些质量标准。在一些实施例中，通过本文所述的方法产生的Gene WriterTM系统、多肽和/或模板核酸(例如，模板RNA)符合某些质量标准。因此，在一些方面，本披露涉及制造符合某些质量标准的Gene WriterTM系统、多肽和/或模板核酸(例如，模板RNA)的方法，例如，其中所述质量标准已测定。在一些方面，本披露内容还涉及在Gene WriterTM系统、多肽和/或模板核酸(例如，模板RNA)中测定所述质量标准的方法。在一些实施例中，质量标准包括但不限于以下中的一项或多项(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12项)：
(i)模板RNA的长度，例如，模板RNA的长度是否大于参考长度或在参考长度范围内，例如是否存在的模板RNA中的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的长度大于100、125、150、175或200个核苷酸；
(ii)模板RNA上聚A尾的存在、不存在和/或长度，例如，是否存在的模板RNA中的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％含有聚A尾(例如，长度为至少5、10、20、30、50、70、100个核苷酸的聚A尾)；
(iii)模板RNA上5’帽的存在、不存在和/或类型，例如，是否存在的模板RNA中的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％含有5’帽，例如，该帽是否是7-甲基鸟苷帽，例如O-Me-m7G帽；
(iv)模板RNA中一个或多个经修饰核苷酸(例如，选自假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、1-N-甲基假尿苷(1-Me-Ψ)、5-甲氧基尿苷(5-MO-U)、5-甲基胞苷(5mC)或锁核苷酸)的存在、不存在和/或类型，例如，是否存在的模板RNA中的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％含有一个或多个经修饰核苷酸；
(v)模板RNA的稳定性(例如，随着时间的推移和/或在预先选择的条件下)，例如是否至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的模板RNA在稳定性测试后保持完整(例如，长度大于100、125、150、175或200个核苷酸)；
(vi)模板RNA在用于修饰DNA的系统中的效力，例如，在测定包含该模板RNA的系统的效力之后，是否至少1％的靶位点被修饰；
(vii)多肽、第一多肽或第二多肽的长度，例如，该多肽、第一多肽或第二多肽的长度是否超出参考长度或在参考长度范围内，例如是否存在的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的多肽、第一多肽或第二多肽的长度大于600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、或2000个氨基酸(并且任选地，长度不超过2500、2000、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、或600个氨基酸)；
(viii)多肽、第一多肽或第二多肽上翻译后修饰的存在、不存在和/或类型，例如是否至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的多肽、第一多肽或第二多肽含有磷酸化、甲基化、乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、glipyatyon或脂酰化，或其任何组合；
(ix)多肽、第一多肽或第二多肽中一种或多种人工、合成或非典型氨基酸(例如，选自鸟氨酸、β-丙氨酸、GABA、δ-氨基乙酰丙酸、PABA、D-氨基酸(例如，D-丙氨酸或D-谷氨酸)、氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、胱硫醚、羊毛硫氨酸、甲烯胱氨酸、二氨基庚二酸、高丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、高正亮氨酸(Homonorleucine)、高丝氨酸、O-甲基-高丝氨酸和O-乙基-高丝氨酸、乙硫氨酸、硒代半胱氨酸、硒代高半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代乙硫氨酸、碲代半胱氨酸或碲代甲硫氨酸)的存在、不存在和/或类型，例如是否存在的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的多肽、第一多肽或第二多肽含有一个或多个人工、合成或非典型氨基酸；
(x)多肽、第一多肽或第二多肽的稳定性(例如，随着时间的推移和/或在预选条件下)，例如是否至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的多肽、第一多肽或第二多肽在稳定性测试后保持完整(例如，长度大于600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、或2000个氨基酸(并且任选地，长度不超过2500、2000、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、或600个氨基酸))；
(xi)多肽、第一多肽或第二多肽在用于修饰DNA的系统中的效力，例如在测定了包含多肽、第一多肽或第二多肽的系统的效力之后是否至少1％的靶位点被修饰；或
(xii)热原、病毒、真菌、细菌病原体或宿主细胞蛋白中的一种或多种的存在、不存在、和/或水平，例如，系统是否不含或基本上不含热原、病毒、真菌、细菌病原体或宿主细胞蛋白污染。
在一些实施例中，本文所述的系统或药物组合物不含内毒素。
在一些实施例中，确定热原、病毒、真菌、细菌病原体和/或宿主细胞蛋白中的一种或多种的存在、不存在和/或水平。在实施例中，对系统是否不含或基本上不含热原、病毒、真菌、细菌病原体和/或宿主细胞蛋白污染进行确定。
在一些实施例中，如本文所述的药物组合物或系统具有以下特征中的一项或多项(例如，1、2、3或4项)：
(a)相对于模板RNA和/或编码多肽的RNA少于1％(例如少于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的DNA模板，例如，以摩尔计；
(b)相对于模板RNA和/或编码多肽的RNA少于1％(例如少于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的未加帽RNA，例如，以摩尔计；
(c)相对于模板RNA和/或编码多肽的RNA少于1％(例如少于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的部分长度RNA，例如，以摩尔计；
(d)基本上缺乏未反应的帽二核苷酸。
应用
通过将编码基因整合到RNA序列模板中，Gene Writer系统可以满足治疗需求，例如，通过在具有功能丧失性突变的个体中提供治疗性转基因的表达，通过以正常转基因代替功能获得性突变，通过提供调节序列以消除功能获得性突变表达，和/或通过控制可操作地连接的基因、转基因及其系统的表达。在某些实施例中，RNA序列模板编码对宿主细胞的治疗需要具有特异性的启动子区，例如组织特异性启动子或增强子。在又其他实施例中，启动子可以可操作地连接至编码序列。
在实施例中，Gene WriterTM基因编辑器系统可以提供治疗性转基因，其表达例如替换型血液因子或替换型酶例如溶酶体酶。例如，本文所述的组合物、系统和方法可用于在靶人基因组中表达半乳糖苷酶α或β以治疗法布里病(Fabry Disease)；针对戈谢病(Gaucher Disease)的伊米苷酶、塔格苷酶(taliglucerase)α、维拉苷酶(velaglucerase)α或阿糖脑苷酶；针对溶酶体酸性脂肪酶缺乏症(沃尔曼病(Wolman disease)/CESD)的塞贝脂酶α；针对黏多醣贮积症的拉罗尼酶、艾度硫酸酯酶、依罗硫酸酯酶α、或加硫酶；针对庞贝病的阿糖苷酶α。例如，本文所述的组合物、系统和方法可用于在靶人基因组中表达因子I、II、V、VII、X、XI、XII或XIII，以改善血液因子缺陷。
在一些实施例中，异源对象序列编码细胞内蛋白(例如，细胞质蛋白、核蛋白、细胞器蛋白如线粒体蛋白或溶酶体蛋白或膜蛋白)。在一些实施例中，异源对象序列编码膜蛋白，例如除CAR以外的膜蛋白和/或内源人膜蛋白。在一些实施例中，异源对象序列编码细胞外蛋白。在一些实施例中，异源对象序列编码酶，结构蛋白，信号传导蛋白、调节蛋白、转运蛋白、感觉蛋白、运动蛋白、防御蛋白或储存蛋白。可由异源对象序列编码的其他示例性蛋白包括但不限于免疫受体蛋白，例如合成的免疫受体蛋白，例如嵌合抗原受体蛋白(CAR)、T细胞受体、B细胞受体或抗体。
给予
本文所述的组合物和系统可以在体外或体内使用。在一些实施例中，例如在体外或体内将系统或系统的组分递送至细胞(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)。在一些实施例中，细胞是真核细胞，例如多细胞生物的细胞，例如动物，例如哺乳动物(例如人、猪、牛)、鸟(例如家禽，例如鸡、火鸡、或鸭)或鱼。在一些实施例中，细胞是非人动物细胞(例如，实验动物、牲畜或伴侣动物)。在一些实施例中，细胞是干细胞(例如，造血干细胞)、成纤维细胞或T细胞。在一些实施例中，细胞是非分裂细胞，例如非分裂成纤维细胞或非分裂T细胞。在一些实施例中，细胞是HSC，并且p53没有被上调或被上调例如少于10％、5％、2％或1％，例如，如根据PCT申请号PCT/US 2019/048607(将其通过引用以其整体并入本文)的实例30中描述的方法确定的。在一些情况下，Gene Writer系统的组分可以以多肽、核酸(例如，DNA、RNA)及其组合的形式递送。
例如，递送可以使用以下任何组合来递送逆转录转座酶(例如，作为编码逆转录转座酶蛋白的DNA，作为编码逆转录转座酶蛋白的RNA或作为蛋白本身)和模板RNA(例如，作为编码RNA的DNA，或作为RNA)：
1.逆转录转座酶DNA+模板DNA
2.逆转录转座酶RNA+模板DNA
3.逆转录转座酶DNA+模板RNA
4.逆转录转座酶RNA+模板RNA
5.逆转录转座酶蛋白+模板DNA
6.逆转录转座酶蛋白+模板RNA
7.逆转录转座酶病毒+模板病毒
8.逆转录转座酶病毒+模板DNA
9.逆转录转座酶病毒+模板RNA
10.逆转录转座酶DNA+模板病毒
11.逆转录转座酶RNA+模板病毒
12.逆转录转座酶蛋白+模板病毒
如上所述，在一些实施例中，使用病毒递送编码逆转录转座酶蛋白的DNA或RNA，并且在一些实施例中，使用病毒递送模板RNA(或编码模板RNA的DNA)。
在一个实施例中，系统和/或系统的组分以核酸的形式递送。例如，Gene Writer多肽可以以编码所述多肽的DNA或RNA的形式递送，并且模板RNA可以以RNA或其有待转录成RNA的互补DNA的形式递送。在一些实施例中，系统或系统的组分在1、2、3、4或更多个不同的核酸分子上递送。在一些实施例中，系统或系统的组分作为DNA和RNA的组合递送。在一些实施例中，系统或系统的组分作为DNA和蛋白质的组合递送。在一些实施例中，系统或系统的组分作为RNA和蛋白质的组合递送。在一些实施例中，Gene Writer基因组编辑器多肽作为蛋白质递送。
在一些实施例中，使用载体将系统或系统的组分递送至细胞，例如哺乳动物细胞或人细胞。载体可以是例如质粒或病毒。在一些实施例中，递送是体内、体外、离体或原位的。在一些实施例中，病毒是腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒。在一些实施例中，系统或系统的组分与病毒样颗粒或病毒体一起被递送至细胞。在一些实施例中，递送使用一种以上的病毒、病毒样颗粒或病毒体。
在一些实施例中，递送至细胞的核酸(例如，编码多肽或模板DNA，或两者)是共价闭合的线性DNA，或所谓的“doggybone”DNA。在其生命周期中，噬菌体N15使用原核端粒酶(protelomerase)将其基因组从环状质粒DNA转化为线性质粒DNA(Ravin等人J Mol Biol[分子生物学杂志]2001)。该方法已适用于体外生产共价闭合的线性DNA(参见，例如，WO2010086626A1)。在一些实施例中，将原核端粒酶与含有一个或多个原核端粒酶识别位点的DNA接触，其中原核端粒酶导致在一个或多个位点处的切割和随后DNA互补链的连接，导致互补链之间的共价连接。在一些实施例中，核酸(例如，编码转座酶，或模板DNA，或两者)首先作为含有单个原核端粒酶识别位点的环状质粒DNA生成，然后其与原核端粒酶接触以产生共价闭合的线性DNA。在一些实施例中，使质粒或线性DNA上侧翼为原核端粒酶识别位点的核酸(例如，编码转座酶或模板DNA，或两者)与原核端粒酶接触，以产生仅含有包含在蛋白酶识别位点之间的DNA的共价闭合线性DNA。在一些实施例中，通过原核端粒酶识别位点侧接所期望核酸序列的方法导致共价闭合环状DNA缺乏用于细菌克隆和维持的质粒元件。在一些实施例中，包含核酸和一个或多个原核端粒酶识别位点的质粒或线性DNA任选在原核端粒酶反应之前被扩增，例如通过滚环扩增或PCR。
在一个实施例中，本文所述的组合物和系统可以配制在脂质体或其他类似的囊泡中。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并将其装载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(关于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载剂。用于制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的传授内容通过引用并入本文)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡的形成是自发的，但也可以通过使用均质器、超声仪或挤压装置以振荡的形式施加力来加快囊泡的形成(关于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,NatureBiotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，该文献关于挤出脂质制备的传授内容通过引用并入本文。
脂质纳米颗粒是为本文所述的药物组合物提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。纳米结构化的脂质载剂(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，这些经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了SLN的特征、改善了药物稳定性和负载能力、并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送引导至特定靶标并且改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(PLN)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，并且磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分增加了药物包封效率、促进了表面修饰、并且防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。
外泌体也可用作本文所述的组合物和系统的药物递送媒介物。对于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报B]第6卷第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
融合体与靶细胞相互作用并融合，并因此可用作多种分子的递送媒介物。它们通常由封闭管腔或腔的两亲性脂质双层和与两亲性脂质双层相互作用的融合原组成。融合剂组分已被证明是可工程化的，以便为融合和载荷递送赋予靶细胞特异性，从而允许创建具有可编程细胞特异性的递送媒剂(例如，参见PCT公开号WO/2020014209(将其通过引用以其整体并入本文)中与融合体设计、制备和使用相关的内容)。
可以将Gene Writer系统引入细胞、组织和多细胞生物中。在一些实施例中，系统或系统的组分经由机械手段或物理手段递送至细胞。
以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品：Meyer(编辑),Therapeutic ProteinDrug Products:Practical Approaches to formulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic[治疗性蛋白药物产品：实验室、制造和临床中配制品的实践方法],Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列](2012)。
组织特异性活性/施用
在一些实施例中，本文所述的系统、模板RNA或多肽被施用至靶组织(例如第一组织)或在靶组织(例如第一组织)中具有活性(例如，在其中更具活性)。在一些实施例中，系统、模板RNA或多肽未施用于非靶组织或在非靶组织中活性较低(例如，在其中不具有活性)。在一些实施例中，本文所述的系统、模板RNA或多肽可用于修饰靶组织(例如第一组织)中的DNA(例如，并且不修饰非靶组织中的DNA)。
在一些实施例中，系统包含(a)本文所述的多肽或编码其的核酸，(b)本文所述的模板核酸(例如，模板RNA)，和(c)对靶组织特异性的一个或多个第一组织特异性表达控制序列，其中对靶组织特异性的一个或多个第一组织特异性表达控制序列与(a)、(b)、或(a)和(b)可操作地关联，其中，当与(a)关联时，(a)包含编码多肽的核酸。
在一些实施例中，(b)中的核酸包含RNA。
在一些实施例中，(b)中的核酸包含DNA。
在一些实施例中，(b)中的核酸：(i)是单链区段或包含单链区段，例如，是单链DNA或包含单链区段和一个或多个双链区段；(ii)具有倒置的末端重复；或(iii)(i)和(ii)两者。
在一些实施例中，(b)中的核酸是双链区段或包含双链区段。
在一些实施例中，(a)包含编码多肽的核酸。
在一些实施例中，(a)中的核酸包含RNA。
在一些实施例中，(a)中的核酸包含DNA。
在一些实施例中，(a)中的核酸：(i)是单链区段或包含单链区段，例如，是单链DNA或包含单链区段和一个或多个双链区段；(ii)具有倒置的末端重复；或(iii)(i)和(ii)两者。
在一些实施例中，(a)中的核酸是双链区段或包含双链区段。
在一些实施例中，(a)、(b)、或(a)和(b)中的核酸是线性的。
在一些实施例中，(a)、(b)、或(a)和(b)中的核酸是环状的，例如质粒或小环。
在一些实施例中，异源对象序列与第一启动子可操作地关联。
在一些实施例中，一个或多个第一组织特异性表达控制序列包含组织特异性启动子。
在一些实施例中，组织特异性启动子包含与以下可操作地关联的第一启动子：i.异源对象序列，ii.编码转座酶的核酸，或iii.(i)和(ii)。
在一些实施例中，一个或多个第一组织特异性表达控制序列包含与以下可操作地关联的组织特异性微小RNA识别序列：i.异源对象序列，ii.编码转座酶的核酸，或iii.(i)和(ii)。
在一些实施例中，系统包含组织特异性启动子，并且该系统还包含一种或多种组织特异性微小RNA识别序列，其中：i.组织特异性启动子与以下可操作地关联：I.异源对象序列，II.编码转座酶的核酸，或III.(I)和(II)；和/或ii.一种或多种组织特异性微小RNA识别序列与以下可操作地关联：I.异源对象序列，II.编码转座酶的核酸，或III.(I)和(II)。
在一些实施例中，其中(a)包含编码多肽的核酸，该核酸包含与编码多肽的核酸可操作地关联的启动子。
在一些实施例中，编码多肽的核酸包含对靶组织具有特异性的、与多肽编码序列可操作地关联的一个或多个第二组织特异性表达控制序列。
在一些实施例中，一个或多个第二组织特异性表达控制序列包含组织特异性启动子。
在一些实施例中，组织特异性启动子是与编码多肽的核酸可操作地关联的启动子。
在一些实施例中，一个或多个第二组织特异性表达控制序列包含组织特异性微RNA识别序列。
在一些实施例中，与编码多肽的核酸可操作地关联的启动子是组织特异性启动子，该系统进一步包含一个或多个组织特异性微小RNA识别序列。
在一些实施例中，本文所述的Gene WriterTM系统被递送至来自大脑、小脑、肾上腺、卵巢、胰腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、甲状腺、乳房、脾脏、扁桃体、胸腺、淋巴结、骨髓、肺、心肌、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、唾液腺、肾脏、前列腺、血液、或其他细胞或组织类型的组织或细胞。在一些实施例中，本文所述的Gene WriterTM系统用于治疗疾病，例如癌症、炎性疾病、传染病、遗传缺陷或其他疾病。癌症可以是大脑、小脑、肾上腺、卵巢、胰腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、甲状腺、乳房、脾脏、扁桃体、胸腺、淋巴结、骨髓、肺、心肌、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、唾液腺、肾脏、前列腺、血液、或其他细胞或组织类型的癌症，并且可以包括多种癌症。
在一些实施例中，本文所述的Gene WriterTM系统通过肠内施用(例如口服、直肠、胃肠、舌下、唇下或颊部施用)来施用。在一些实施例中，本文所述的Gene WriterTM系统通过肠胃外施用(例如，静脉内、肌内、皮下、皮内、硬膜外、脑内、脑室内、表皮、经鼻、动脉内、关节内、海绵窦内、眼内、骨内输注、腹膜内、鞘内、宫内、阴道内、膀胱内、血管周围或经粘膜施用)来施用。在一些实施例中，本文所述的Gene WriterTM系统通过局部施用(例如，透皮施用)来施用。
在一些实施例中，如本文所述的Gene WriterTM系统可用于修饰动物细胞、植物细胞或真菌细胞。在一些实施例中，如本文所述的Gene WriterTM系统可用于修饰哺乳动物细胞(例如，人细胞)。在一些实施例中，如本文所述的Gene WriterTM系统可用于修饰来自家畜动物(例如，牛、马、绵羊、山羊、猪、美洲驼、羊驼、骆驼、牦牛、鸡、鸭、鹅或鸵鸟)的细胞。在一些实施例中，如本文所述的Gene WriterTM系统可用作实验室工具或研究工具，或用于实验室方法或研究方法中，例如以修饰动物细胞例如哺乳动物细胞(例如，人细胞)、植物细胞或真菌细胞。
在一些实施例中，如本文所述的Gene WriterTM系统可用于表达蛋白质、模板或异源对象序列(例如，在动物细胞例如哺乳动物细胞(例如，人细胞)、植物细胞中、或真菌细胞中)。在一些实施例中，如本文所述的Gene WriterTM系统可用于在诱导型启动子(例如，小分子诱导型启动子)的控制下表达蛋白质、模板或异源对象序列。在一些实施例中，GeneWriting系统或其有效负载被设计用于例如通过使用诱导型启动子的可调控制。例如，驱动目的基因的启动子(例如，Tet)在整合时可能是沉默的，但在一些情况下，可能在暴露于小分子诱导剂(例如，强力霉素)时被激活。在一些实施例中，可调表达允许基因(例如，治疗性基因)的治疗后控制，例如，允许小分子依赖性给药效果。在实施例中，小分子依赖性给药效果包括在时间和/或空间上改变基因产物的水平，例如，通过局部施用。在一些实施例中，本文所述的系统中使用的启动子可以是诱导型的，例如应答于宿主的内源分子和/或对其施用的外源小分子。
在一些实施例中，Gene Writer系统用于改变非编码区和/或调节控制区，例如，以调节内源基因的表达。在一些实施例中，Gene Writer系统用于诱导基因表达的上调或下调。在一些实施例中，调节控制区包含启动子、增强子、UTR、CTCF位点和/或基因表达控制区中的一种或多种。
在一些实施例中，Gene Writer系统可用于治疗或预防重复序列扩增疾病(例如，表26的疾病)，或降低其严重性或症状。在一些实施例中，重复序列扩增疾病包括三核苷酸重复序列的扩增。在一些实施例中，受试者具有重复序列的至少10、20、30、40或50个拷贝。在实施例中，重复序列扩增疾病是遗传性疾病。重复序列扩增疾病的非限制性实例包括亨廷顿病(HD)和强直性营养不良。例如，健康个体可能拥有CAG三核苷酸重复序列的10到35个串联拷贝，而亨廷顿病患者通常拥有>40个拷贝，这可能导致例如拉长和功能失调的亨廷顿蛋白。在一些实施例中，Gene Writer校正重复扩增，例如，通过识别重复序列区域末端的DNA并对一条链进行切口(图30)。在一些实施例中，Gene Writer的模板RNA组分包含具有健康受试者特征性的重复序列数量的区域，例如约20个重复序列(例如，5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、或35-40个重复序列)。在一些实施例中，Gene Writer的模板RNA组分通过TPRT复制到靶位点中。在一些实施例中，第二链切口和第二链合成然后导致新复制的包含正确数量重复序列的DNA的整合(例如，如本文所述)。在一些实施例中，系统识别重复序列区域末端的DNA，并且模板携带新重复序列数量的信息。在实施例中，可以以这种方式使用Gene Writer，而不管个体和/或个体细胞中存在的重复序列数量。由于存在多个重复序列，在一些实施例中，替代的非GeneWriter治疗剂(例如，基于CRISPR的同源重组治疗剂)可能导致不可预测的修复行为。重复序列扩增疾病和致病性重复序列的其他非限制性实例可以在例如La Spada和Taylor Nat Rev Genet[自然综述遗传学]11(4):247-258(2010)(将其通过引用以其整体并入本文)中找到。
在一些实施例中，Gene Writing系统可用于治疗健康个体，例如作为预防性疗法。在一些实施例中，Gene Writer系统可以靶向产生突变，例如，已显示对目的的疾病具有保护作用的突变。此类疾病和保护性突变靶标的示例性列表可在表22中找到。
在一些实施例中，本发明提供的系统的核酸组分序列(例如，编码多肽或包含异源对象序列)的侧翼是修饰蛋白质表达水平的非翻译区(UTR)。各种5'和3’UTR会影响蛋白质表达。例如，在一些实施例中，编码序列之前可以是修饰RNA稳定性或蛋白质翻译的5’UTR。在一些实施例中，序列之后可以是修饰RNA稳定性或翻译的3’UTR。在一些实施例中，序列之前可以是5’UTR，然后是修饰RNA稳定性或翻译的3’UTR。在一些实施例中，5’和/或3’UTR可选自补体因子3(C3)(cactcctccccatcctctccctctgtccctctgtccctctgaccctgcactgtcccagcacc)或血清类黏蛋白1(ORM1)(caggacacagccttggatcaggacagagacttgggggccatcctgcccctccaacccgacatgtgtacctcagctttttccctcacttgcatcaataaagcttctgtgtttggaacagctaa)的5’和3’UTR(Asrani等人RNA Biology[核糖核酸学]2018)。在某些实施例中，5’UTR是来自C3的5’UTR并且3’UTR是来自ORM1的3’UTR。
在某些实施例中，用于蛋白质表达(例如Gene Writer多肽或异源对象序列的mRNA(或编码RNA的DNA))的5’UTR和3’UTR包含优化的表达序列。在一些实施例中，5’UTR包含GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC和/或3’UTR包含UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA，例如，如Richner等人Cell[细胞]168(6):P1114-1125(2017)中所述，其中的序列通过引用并入本文。
在一些实施例中，可以选择5'和/或3’UTR以增强蛋白质表达。在一些实施例中，可以选择5'和/或3’UTR来修饰蛋白质表达，从而使过度生产抑制最小化。在一些实施例中，UTR在编码序列周围，例如在编码序列之外以及在其他实施例中靠近编码序列。在一些实施例中，另外的调控元件(例如，miRNA结合位点、顺式调节位点)包含在UTR中。
在一些实施例中，Gene Writer系统的开放阅读框(ORF)，例如编码Gene Writer多肽的mRNA(或编码mRNA的DNA)的ORF或异源对象序列的mRNA(或编码mRNA的DNA)的一个或多个ORF的侧翼为增强其表达的5'和/或3'非翻译区(UTR)。在一些实施例中，系统的mRNA组分(或从DNA组分产生的转录本)的5’UTR包含序列5’-GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC-3’。在一些实施例中，系统的mRNA组分(或从DNA组分产生的转录本)的3’UTR包含序列5’-UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA-3’。已经由以下证明5’UTR和3’UTR的组合可导致可操作地连接的ORF的期望表达：Richner等人Cell[细胞]168(6):P1114-1125(2017)，其教导和序列通过引用并入本文。在一些实施例中，本文所述的系统包含编码转录物的DNA，其中该DNA包含对应的5’UTR和3’UTR序列，其中T取代以上所列的序列中的U。在一些实施例中，用于产生系统的RNA组分的DNA载体进一步包含用于启动体外转录的5’UTR上游的启动子，例如T7、T3、或SP6启动子。以上5’UTR以GGG开头，这对于使用T7RNA聚合酶优化转录是合适的开始。对于调整转录水平和改变转录起始位点核苷酸以适应替代性的5’UTR，Davidson等人.Pac Symp Biocomput[Pac Symp生物计算]433-443(2010)的传授内容描述了满足这两个特征的T7启动子变体及其发现方法。
病毒载体及其组分
除了本文所述的相关酶或结构域的来源，例如作为本文使用的聚合酶和聚合酶功能(例如DNA-依赖性DNA聚合酶、RNA-依赖性RNA聚合酶、RNA-依赖性DNA聚合酶、DNA-依赖性RNA聚合酶、逆转录酶)的来源，病毒还是本文所述系统的有用的递送媒剂来源。一些酶，例如逆转录酶，可能具有多种活性，例如能够进行RNA-依赖性DNA聚合和DNA-依赖性DNA聚合，例如第一和第二链合成。在一些实施例中，用作Gene Writer递送系统或其组分来源的病毒可选自如Baltimore Bacteriol Rev[细菌综述]35(3):235-241(1971)所述的组。
在一些实施例中，病毒选自组I病毒，例如，该病毒是DNA病毒并将dsDNA包装成病毒体。在一些实施例中，I组病毒选自例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒。
在一些实施例中，病毒选自组II病毒，例如，该病毒是DNA病毒并将ssDNA包装成病毒体。在一些实施例中，组II病毒选自例如细小病毒。在一些实施例中，细小病毒是依赖性细小病毒，例如腺相关病毒(AAV)。
在一些实施例中，病毒选自组III病毒，例如，该病毒是RNA病毒并将dsRNA包装成病毒体。在一些实施例中，组III病毒选自例如呼肠孤病毒。在一些实施例中，包含在此类病毒体中的dsRNA的一条或两条链是编码分子，在转导至宿主细胞后能够直接用作mRNA，例如，在转导至宿主细胞后可以直接翻译成蛋白质而不需要任何干预性核酸复制或聚合步骤。
在一些实施例中，病毒选自组IV病毒，例如，该病毒是RNA病毒并将ssRNA(+)包装成病毒体。在一些实施例中，组IV病毒选自例如冠状病毒、小RNA病毒、披膜病毒。在一些实施例中，包含在此类病毒体中的ssRNA(+)是编码分子，在转导至宿主细胞后能够直接用作mRNA，例如，在转导至宿主细胞后可以直接翻译成蛋白质而不需要任何干预性核酸复制或聚合步骤。
在一些实施例中，病毒选自组V病毒，例如，该病毒是RNA病毒并将ssRNA(-)包装成病毒体。在一些实施例中，组V病毒选自例如正黏病毒、弹状病毒。在一些实施例中，具有ssRNA(-)基因组的RNA病毒还在病毒体内携带酶，该酶被转导至具有病毒基因组的宿主细胞，例如RNA依赖性RNA聚合酶，能够将ssRNA(-)拷贝到可以由宿主直接翻译的ssRNA(+)。
在一些实施例中，病毒选自组VI病毒，例如，该病毒是逆转录病毒并将ssRNA(+)包装成病毒体。在一些实施例中，组VI病毒选自例如逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是慢病毒，例如，HIV-1、HIV-2、SIV、BIV。在一些实施例中，逆转录病毒是泡沫病毒属(spumavirus)，例如泡沫病毒(foamy virus)，例如HFV、SFV、BFV。在一些实施例中，包含在此类病毒体中的ssRNA(+)是编码分子，在转导至宿主细胞后能够直接用作mRNA，例如，在转导至宿主细胞后可以直接翻译成蛋白质而不需要任何干预性核酸复制或聚合步骤。在一些实施例中，ssRNA(+)首先被逆转录并拷贝以产生dsDNA基因组中间体，mRNA可以由该基因组中间体在宿主细胞中得以转录。在一些实施例中，具有ssRNA(+)基因组的RNA病毒还在病毒体内携带酶，该酶被转导至具有病毒基因组的宿主细胞，例如RNA依赖性DNA聚合酶，能够将ssRNA(+)拷贝到可以转录为mRNA并由宿主翻译的dsDNA。在一些实施例中，来自VI组逆转录病毒的逆转录酶作为Gene Writer多肽的逆转录酶结构域并入。
在一些实施例中，病毒选自组VII病毒，例如，该病毒是逆转录病毒并将dsRNA包装成病毒体。在一些实施例中，组VII病毒选自例如嗜肝DNA病毒。在一些实施例中，包含在此类病毒体中的dsRNA的一条或两条链是编码分子，在转导至宿主细胞后能够直接用作mRNA，例如，在转导至宿主细胞后可以直接翻译成蛋白质而不需要任何干预性核酸复制或聚合步骤。在一些实施例中，包含在此类病毒体中的dsRNA的一条或两条链首先被逆转录并拷贝以产生dsDNA基因组中间体，mRNA可以由该基因组中间体在宿主细胞中得以转录。在一些实施例中，具有dsRNA基因组的RNA病毒还在病毒体内携带酶，该酶被转导至具有病毒基因组的宿主细胞，例如RNA依赖性DNA聚合酶，能够将dsRNA拷贝到可以转录为mRNA并由宿主翻译的dsDNA。在一些实施例中，来自VII组逆转录病毒的逆转录酶作为GeneWriter多肽的逆转录酶结构域并入。
在一些实施例中，本发明中用于递送核酸的病毒体还可以携带参与GeneWriting过程的酶。例如，逆转录病毒病毒体可以包含与核酸一起被递送到宿主细胞中的逆转录酶结构域。在一些实施例中，RNA模板可以与病毒体内的Gene Writer多肽相关联，从而在从病毒颗粒转导核酸后两者共同递送至靶细胞。在一些实施例中，病毒体中的核酸可以包含DNA，例如线性ssDNA、线性dsDNA、环状ssDNA、环状dsDNA、微环DNA、dbDNA、ceDNA。在一些实施例中，病毒体中的核酸可以包含RNA，例如线性ssRNA、线性dsRNA、环状ssRNA、环状dsRNA。在一些实施例中，病毒基因组可以在转导至宿主细胞后环化，例如，线性ssRNA分子可以经历共价连接以形成环状ssRNA，线性dsRNA分子可以经历共价连接以形成环状dsRNA或一个或多个环状ssRNA。在一些实施例中，病毒基因组可以通过在宿主细胞中的滚环复制来复制。在一些实施例中，病毒基因组可以包含单个核酸分子，例如，包含非分段基因组。在一些实施例中，病毒基因组可以包含两个或更多个核酸分子，例如，包含分段基因组。在一些实施例中，病毒体中的核酸可以与一种或多种蛋白质相关联。在一些实施例中，病毒体中的一种或多种蛋白质可在转导后被递送至宿主细胞。在一些实施例中，可通过向靶核酸添加病毒体包装信号而使天然病毒适于核酸递送，其中宿主细胞用于包装含有包装信号的靶核酸。
在一些实施例中，用作递送媒介物的病毒体可以包含共生人类病毒。在一些实施例中，用作递送媒介物的病毒体可以包含指环病毒，其用途描述于WO 2018232017A1中，该文献通过引用以其全文并入本文。
腺相关病毒
在一些实施例中，病毒是腺相关病毒(AAV)。在一些实施例中，AAV基因组包含分别编码四种复制蛋白和三种衣壳蛋白的两个基因。在一些实施例中，基因的侧翼中任何一侧有145-bp的反向末端重复序列(ITR)。在一些实施例中，病毒体包含例如以1:1:10比率产生的多达三种衣壳蛋白(Vp1、Vp2、和/或Vp3)。在一些实施例中，衣壳蛋白产生自相同的开放阅读框和/或差异剪接(Vp1)和替代性的翻译起始位点(分别为Vp2和Vp3)。通常，Vp3是病毒体中最丰富的亚基，并参与细胞表面的受体识别，从而定义了病毒的嗜性。在一些实施例中，Vp1在Vp1的N末端包含例如在病毒感染性方面起作用的磷脂酶结构域。
在一些实施例中，病毒载体的包装能力限制了可以包装到载体中的碱基编辑器的大小。例如，AAV的包装能力可以是约4.5kb(例如，约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、或6.0kb)，例如，包括一个或两个反向末端重复序列(ITR)，例如，145个碱基ITR。
在一些实施例中，重组AAV(rAAV)包含在载体转基因盒侧翼的顺式作用145-bpITR，例如，提供高达4.5kb用于外源DNA的包装。感染后，在一些情况下，rAAV可以表达本发明的融合蛋白，并且通过以环状头对尾多联体的附加体形式持续存在而不整合到宿主基因组中。rAAV可例如在体外和体内使用。在一些实施例中，AAV介导的基因递送要求基因的编码序列的长度在大小上等于或大于野生型AAV基因组。
超过该大小的基因的AAV递送和/或大的生理调节元件的使用可以例如通过将要递送的一种或多种蛋白质分成两个或更多个片段来完成。在一些实施例中，N末端片段与分裂型内含肽-N融合。在一些实施例中，C末端片段与分裂型内含肽-C融合。在实施例中，片段被包装到两个或更多个AAV载体中。
在一些实施例中，通过将大的转基因表达盒分成两个单独的半部分(5端和3端，或头和尾)来产生双重AAV载体，例如，其中盒的每一半被包装在单个AAV载体中(其<5kb)。在一些实施例中，然后可以在通过两个双重AAV载体对同一细胞进行的共感染后实现全长转基因表达盒的重新组装。在一些实施例中，共感染之后是以下中的一项或多项：(1)5和3基因组之间的同源重组(HR)(双重AAV重叠载体)；(2)5和3基因组的ITR介导的尾对头连环化(双重AAV反式剪接载体)；和/或(3)这两种机制的组合(双重AAV杂合载体)。在一些实施例中，体内使用双重AAV载体导致全长蛋白质的表达。在一些实施例中，双AAV载体平台的使用代表了用于大于约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、或5.0kb的转基因的有效且可行的基因转移策略。在一些实施例中，AAV载体还可用于用靶核酸转导细胞，例如在核酸和肽的体外生产中。在一些实施例中，AAV载体可用于体内和离体基因疗法程序(参见，例如，West等人,Virology[病毒学]160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy[人基因疗法]5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.[临床研究期刊]94:1351(1994)；其各自通过引用以其整体并入本文)。重组AAV载体的构建描述于许多公开物中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:3251-3260(1985)；Tratschin,等人,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]4:2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka,PNAS[美国国家科学院院刊]81:6466-6470(1984)；以及Samulski等人,J.Virol.[病毒学杂志]63:03822-3828(1989)(其通过引用以其全文并入本文)。
在一些实施例中，本文所述的Gene Writer(例如，具有或不具有一种或多种指导核酸)可以使用AAV、慢病毒、腺病毒或其他质粒或病毒载体类型进行递送，特别是使用来自以下文献的配制品和剂量：例如，美国专利号8,454,972(针对腺病毒的配制品、剂量)、美国专利号8,404,658(针对AAV的配制品、剂量)和美国专利号5,846,946(针对DNA质粒的配制品、剂量)以及来自临床试验和关于涉及慢病毒、AAV和腺病毒的临床试验的公开物。例如，对于AAV，施用途径、配制品和剂量可如美国专利号8,454,972和涉及AAV的临床试验中所述。对于腺病毒，施用途径、配制品和剂量可如美国专利号8,404,658和涉及腺病毒的临床试验中所述。对于质粒递送，施用途径、配制品和剂量可如美国专利号5,846,946和涉及质粒的临床研究中所述。剂量可以基于或外推为平均70kg的个体(例如男性成人)，并且可以针对患者、受试者、不同重量和物种的哺乳动物进行调整。施用频率在医学或兽医学从业者(例如医师、兽医师)的范围之内，其取决于常规因素，包括患者或受试者的年龄、性别、一般健康状况、其他状况以及着手解决的特定病症或症状。在一些实施例中，可以将病毒载体注射到目的组织中。对于细胞类型特异性Gene Writing，在一些实施例中，Gene Writer和任选的指导核酸的表达可以由细胞类型特异性启动子驱动。
在一些实施例中，例如，由于纯化方法不需要可以激活免疫反应的细胞颗粒的超速离心，AAV允许低毒性。在一些实施例中，AAV允许引起插入诱变的可能性低，原因是例如它基本上不整合到宿主基因组中。
在一些实施例中，AAV具有约4.4、4.5、4.6、4.7、或4.75kb的包装限制。在一些实施例中，Gene Writer、启动子和转录终止子可以配合在单个病毒载体中。在一些情况下，SpCas9(4.1kb)可能难以包装成AAV。因此，在一些实施例中，使用长度比其他Gene Writer或碱基编辑器短的Gene Writer。在一些实施例中，Gene Writer小于约4.5kb、4.4kb、4.3kb、4.2kb、4.1kb、4kb、3.9kb、3.8kb、3.7kb、3.6kb、3.5kb、3.4kb、3.3kb、3.2kb、3.1kb、3kb、2.9kb、2.8kb、2.7kb、2.6kb、2.5kb、2kb、或1.5kb。
AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合。在一些实施例中，AAV的类型是根据要靶向的细胞来选择的；例如，可选择AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合用于靶向脑或神经元细胞；或者可以选择AAV4用于靶向心脏组织。在一些实施例中，选择AAV8用于递送至肝脏。关于这些细胞的示例性AAV血清型描述于例如Grimm,D.等人,J.Virol.[病毒学杂志]82:5887-5911(2008)(其通过引用以其全文并入本文)中。在一些实施例中，AAV是指所有血清型、亚型和天然存在的AAV以及重组AAV。AAV可用于指代病毒本身或其衍生物。在一些实施例中，AAV包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64Rl、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrhlO、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV 12、rhlO、和其杂合体，禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV、和羊AAV。各种AAV血清型的基因组序列，以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可在文献或公共数据库如GenBank中找到。其他示例性AAV血清型列于表36中。
表36.示例性AAV血清型。
在一些实施例中，药物组合物(例如，包含本文所述的AAV)具有少于10％的空衣壳、少于8％的空衣壳、少于7％的空衣壳、少于5％的空衣壳、少于3％的空衣壳、或少于1％的空衣壳。在一些实施例中，药物组合物具有少于约5％的空衣壳。在一些实施例中，空衣壳的数量低于检测限。在一些实施例中，药物组合物具有少量空衣壳是有利的，原因是例如空衣壳可能产生例如很少或没有实质性的治疗益处的不良应答(例如，免疫应答、炎性应答、肝脏应答和/或心脏应答)。
在一些实施例中，药物组合物中的残余宿主细胞蛋白(rHCP)少于或等于100ng/mlrHCP/1x 1013vg/ml，例如，少于或等于40ng/ml rHCP/1x 1013vg/ml或1-50ng/ml rHCP/1x1013vg/ml。在一些实施例中，药物组合物包含少于10ng rHCP/l.0x 1013vg、或少于5ngrHCP/1.0x 1013vg、少于4ngrHCP/1.0x 1013vg、或少于3ng rHCP/1.0x 1013vg，或介于之间的任何浓度。在一些实施例中，药物组合物中的残余宿主细胞DNA(hcDNA)少于或等于5x106pg/ml hcDNA/1x 1013vg/ml、少于或等于1.2x 106pg/ml hcDNA/1x1013vg/ml、或1x105pg/ml hcDNA/1x 1013vg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞DNA少于5.0x 105pg/1x 1013vg、少于2.0x 105pg/l.0x 1013vg、少于1.1x 105pg/1.0x 1013vg、少于1.0x 105pg hcDNA/1.0x1013vg、少于0.9x 105pg hcDNA/1.0x 1013vg、少于0.8x 105pghcDNA/1.0x1013vg，或介于之间的任何浓度。
在一些实施例中，药物组合物中的残余质粒DNA少于或等于1.7x 105pg/ml/1.0x1013vg/ml、或1x 105pg/ml/1x 1.0x 1013vg/ml、或1.7x 106pg/ml/1.0x 1013vg/ml。在一些实施例中，药物组合物中的残余DNA质粒少于10.0x 105pg/1.0x 1013vg、少于8.0x 105pg/1.0x 1013vg或少于6.8x 105pg/1.0x 1013vg。在实施例中，药物组合物包含少于0.5ng/1.0x1013vg、少于0.3ng/1.0x 1013vg、少于0.22ng/1.0x 1013vg或少于0.2ng/1.0x 1013vg或任何中间浓度的牛血清白蛋白(BSA)。在实施例中，药物组合物中的全能核酸酶(benzonase)为少于0.2ng/1.0x 1013vg、少于0.1ng/1.0x 1013vg、少于0.09ng/1.0x 1013vg、少于0.08ng/1.0x 1013vg或任何中间浓度。在实施例中，药物组合物中的泊洛沙姆188(Poloxamer 188)为约10至150ppm、约15至100ppm或约20至80ppm。在实施例中，药物组合物中的铯为少于50pg/g(ppm)、少于30pg/g(ppm)或少于20pg/g(ppm)或任何中间浓度。
在实施例中，药物组合物包含少于10％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或介于之间的任何百分比的总杂质，例如，如通过SDS-PAGE测定。在实施例中，例如，如通过SDS-PAGE测定的总纯度为大于90％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、或介于之间的任何百分比。在实施例中，例如，如通过SDS-PAGE测量的，没有单一的未命名相关杂质多于5％、多于4％、多于3％或多于2％、或介于之间的任何百分比。在实施例中，药物组合物包含的填充的衣壳相对于总衣壳(例如，如通过分析型超速离心测量的峰1+峰2)的百分比为大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于91.9％、大于92％、大于93％，或介于之间的任何百分比。在药物组合物的实施例中，通过分析超速离心在峰1中测量的填充的衣壳的百分比为20-80％、25-75％、30-75％、35-75％或37.4-70.3％。在药物组合物的实施例中，通过分析型超速离心在峰2中测量的填充的衣壳的百分比为20％-80％、20％-70％、22％-65％、24％-62％、或24.9％-60.1％。
在一个实施例中，药物组合物包含1.0至5.0x 1013vg/mL、1.2至3.0x1013vg/mL或1.7至2.3x 1013vg/ml的基因组效价。在一个实施例中，药物组合物显示出小于5CFU/mL、小于4CFU/mL、小于3CFU/mL、小于2CFU/mL或小于1CFU/mL或任何中间浓度的生物负载。在实施例中，根据USP，例如USP<85>(通过引用以其全文并入)的内毒素的量少于1.0EU/mL、少于0.8EU/mL或少于0.75EU/mL。在实施例中，根据USP，例如USP<785>(通过引用以其全文并入)的药物组合物的渗透压摩尔浓度为350至450mOsm/kg、370至440mOsm/kg或390至430mOsm/kg。在实施例中，药物组合物含有少于1200个大于25μm的颗粒/容器、少于1000个大于25μm的颗粒/容器、少于500个大于25μm的颗粒/容器或任何中间值。在实施例中，药物组合物含有少于10,000个大于10μm的颗粒/容器、少于8000个大于10μm的颗粒/容器、或少于600个大于10pm的颗粒/容器。
在一个实施例中，药物组合物具有0.5至5.0x 1013vg/mL、1.0至4.0x 1013vg/mL、1.5至3.0x 1013vg/ml或1.7至2.3x 1013vg/ml的基因组效价。在一个实施例中，本文所述的药物组合物包含以下中的一项或多项：小于约0.09ng全能核酸酶/1.0x 1013vg，小于约30pg/g(ppm)的铯，约20至80ppm泊洛沙姆188，小于约0.22ng BSA/1.0x 1013vg，小于约6.8x105pg的残余DNA质粒/1.0x 1013vg，小于约1.1x 105pg的残余hcDNA/1.0x 1013vg，小于约4ng的rHCP/1.0x 1013vg，pH 7.7至8.3，约390至430mOsm/kg，小于约600个大小>25μm的颗粒/容器，小于约6000个大小>10μm的颗粒/容器，约1.7x 1013-2.3x 1013vg/mL基因组效价，约3.9x 108至8.4x 1010IU/1.0x 1013vg的感染效价，约100-300pg/1.0x 1013vg的总蛋白，在约7.5x 1013vg/kg剂量的病毒载体情况下A7SMA小鼠>24天的平均存活，根据基于体外细胞的测定的约70％至130％相对效力和/或小于约5％空衣壳。在各种实施例中，本文所述的药物组合物包含本文讨论的任何病毒颗粒，该药物组合物保留了参考标准品的±20％之间、±15％之间、±10％之间、或±5％内的效力。在一些实施例中，使用合适的体外细胞测定或体内动物模型来测量效力。
WO 2019094253中传授了制备、表征和给予AAV颗粒的另外的方法，该文献通过引用以其全文并入本文。
可与本发明一致使用的其他rAAV构建体包括Wang等人2019中描述的那些，可在以下网址获得：//doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9，包括其表1，将该文献通过引用以其整体并入本文。
AAV施用
在一些实施例中，腺相关病毒(AAV)与本文所述的系统、模板核酸和/或多肽联合使用。在一些实施例中，AAV用于递送、施用或包装本文所述的系统、模板核酸和/或多肽。在一些实施例中，AAV是重组AAV(rAAV)。
在一些实施例中，系统包含(a)本文所述的多肽或编码其的核酸，(b)本文所述的模板核酸(例如，模板RNA)，和(c)对靶组织特异性的一个或多个第一组织特异性表达控制序列，其中对靶组织特异性的一个或多个第一组织特异性表达控制序列与(a)、(b)、或(a)和(b)可操作地关联，其中，当与(a)关联时，(a)包含编码多肽的核酸。
在一些实施例中，本文所述的系统还包含第一重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白；其中(a)或(b)中的至少一个与第一rAAV衣壳蛋白相关联，其中(a)或(b)中的至少一个侧翼为AAV反向末端重复序列(ITR)。
在一些实施例中，(a)和(b)与第一rAAV衣壳蛋白相关联。
在一些实施例中，(a)和(b)在单个核酸上。
在一些实施例中，该系统进一步包含第二rAAV衣壳蛋白，其中(a)或(b)中的至少一个与第二rAAV衣壳蛋白相关联，并且其中与第二rAAV衣壳蛋白相关联的(a)或(b)中的至少一个和与第一rAAV衣壳蛋白相关联的(a)或(b)中的至少一个不同。
在一些实施例中，(a)或(b)中的至少一个与第一或第二rAAV衣壳蛋白相关联分散在第一或第二rAAV衣壳蛋白的内部，该第一或第二rAAV衣壳蛋白是以AAV衣壳颗粒的形式。
在一些实施例中，该系统还包含纳米颗粒，其中该纳米颗粒与(a)或(b)中的至少一个相关联。
在一些实施例中，(a)和(b)分别与以下相关联：a)第一rAAV衣壳蛋白和第二rAAV衣壳蛋白；b)纳米颗粒和第一rAAV衣壳蛋白；c)第一rAAV衣壳蛋白；d)第一腺病毒衣壳蛋白；e)第一纳米颗粒和第二纳米颗粒；或f)第一纳米颗粒。
病毒载体可用于递送本发明提供的系统的全部或部分，例如用于本发明提供的方法中。衍生自不同病毒的系统已被用于递送多肽、核酸或转座子；例如：整合酶缺陷型慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒和杆状病毒(在HHodge等人Hum Gene Ther[人基因疗法]2017；Narayanavari等人Crit Rev Biochem Mol Biol[生物化学和分子生物学评论]2017；Boehme等人Curr Gene Ther[当今基因疗法]2015)中进行了综述。
腺病毒是常见的病毒，由于具有明确的生物学特性、遗传稳定性、高转导效率并易于大规模生产，其已被用作基因递送媒剂(例如，参见Lee等人Genes&Diseases[基因与疾病]2017中的综述)。它们具有线性dsDNA基因组，并有多种血清型，在组织和细胞嗜性方面有所不同。为了防止感染性病毒在受体细胞中复制，用于包装的腺病毒基因组被缺失了一些或全部内源病毒蛋白，这些内源病毒蛋白在病毒生产细胞中以反式形式提供。这使得基因组依赖于辅助功能，这意味着它们只能在所谓的辅助功能提供的缺失组分存在的情况下被复制并包装成病毒颗粒。去除所有病毒ORF的辅助依赖性腺病毒系统可与包装高达约37kb的外源DNA兼容(Parks等人J Virol[病毒学杂志]1997)。在一些实施例中，腺病毒载体用于递送对应于Gene WritingTM系统的多肽或模板组分的DNA，或两者都包含在单独或相同的腺病毒载体上。在一些实施例中，腺病毒是不能自我包装的辅助依赖性腺病毒(HD-AdV)。在一些实施例中，腺病毒是高容量腺病毒(HC-AdV)，其已缺失了全部或大部分内源病毒ORF，同时保留了包装成腺病毒颗粒所需的序列组分。对于这种类型的载体，基因组包装所需的唯一腺病毒序列是非编码序列：两端的反向末端重复(ITR)和5’末端的包装信号(Jager等人NatProtoc[自然实验手册]2009)。在一些实施例中，腺病毒基因组还包含填充DNA以满足用于最佳生产和稳定性的最小基因组大小(参见，例如，Hausl等人Mol Ther[分子疗法]2010)。腺病毒已在本领域中用于将转座子递送至各种组织。在一些实施例中，腺病毒用于将Gene WritingTM系统递送至肝脏。
在一些实施例中，腺病毒用于将Gene WritingTM系统递送至HSC，例如HDAd5/35++。HDAd5/35++是具有经修饰的血清型35纤维(其将载体从肝脏去靶向)的腺病毒(Wang等人Blood Adv[血液研究进展]2019)。在一些实施例中，将Gene WritingTM系统递送至HSC的腺病毒利用在原始HSC上特异性表达的受体，例如，CD46。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，更具体地构成依赖细小病毒属。AAV基因组由单链DNA分子构成，所述单链DNA分子包含约4.7千碱基(kb)并且由两个主要的开放阅读框(ORF)(编码非结构Rep(复制)和结构Cap(衣壳)蛋白)组成。cap基因内的第二ORF被鉴定为编码组装激活蛋白(AAP)。AAV编码区两侧的DNA是两个顺式作用反向末端重复(ITR)序列，长度约为145个核苷酸，具有间断的回文序列，这些回文序列可折叠成能量稳定的发夹结构，这些发夹结构用作DNA复制的引物。除了它们在DNA复制中的作用外，ITR序列已被证明与病毒DNA整合到细胞基因组中、从宿主基因组或质粒中拯救以及将病毒核酸包裹到成熟病毒体中有关(Muzyczka,(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.[当前微生物学和免疫学]158:97-129)。在一些实施例中，一种或多种Gene WritingTM核酸组分的侧翼是源自AAV的ITR，用于病毒包装。参见，例如，WO 2019113310。
在一些实施例中，Gene WritingTM系统的一种或多种组分通过至少一种AAV载体携带。在一些实施例中，针对特定细胞、组织、生物体的嗜性选择至少一种AAV载体。在一些实施例中，AAV载体是假型的，例如AAV2/8，其中AAV2描述了构建体的设计，但衣壳蛋白被来自AAV8的蛋白替换。应当理解，任何所述载体可以是假型衍生物，其中用于包装AAV基因组的衣壳蛋白是衍生自不同AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，用于Gene WritingTM的AAV可针对新的细胞或组织嗜性进行进化，如文献中已证明的(例如，Davidsson等人Proc NatlAcad Sci U S A[美国国家科学院院刊]2019)。
在一些实施例中，AAV递送载体是具有两个AAV反向末端重复(ITR)和目的核苷酸序列(例如，编码Gene WriterTM多肽或DNA模板，或两者的序列)的载体，所述ITR中的每个具有中断(或非连续)回文序列，即由三个片段构成的序列：第一个区段和最后一个片段在5'→3'读取时是相同的，但在彼此相对放置时会杂交，以及一个不同的区段将相同的区段分开。这样的序列，特别是ITR，形成发夹结构。参见，例如，WO 2012123430。
通常，通过引入一个或多个编码rAAV或scAAV基因组、Rep蛋白和Cap蛋白的质粒来产生带有衣壳的AAV病毒体(Grimm等人,1998)。在反式引入这些辅助质粒后，AAV基因组从宿主基因组中被“拯救”(即释放并随后回收)，并进一步包裹以产生感染性AAV。在一些实施例中，通过将侧翼为ITR的核酸与辅助功能一起引入包装细胞中，将一种或多种GeneWritingTM核酸包装到AAV颗粒中。
在一些实施例中，AAV基因组是所谓的自我互补基因组(称为scAAV)，使得位于ITR之间的序列包含所期望的核酸序列(例如，编码Gene WriterTM多肽或模板的DNA，或两者)以及所期望的核酸序列的反向互补序列，使得这两种组分可以折叠和自杂交。在一些实施例中，自我互补模块由允许DNA自身折叠的间插序列分开，例如，形成茎环。scAAV的优势在于在进入细胞核后准备好进行转录，而不是首先依赖ITR引发和第二链合成来形成dsDNA。在一些实施例中，一种或多种Gene WritingTM组分被设计为scAAV，其中AAV ITR之间的序列包含两个反向互补模块，它们可以自杂交以产生dsDNA。
在一些实施例中，递送至细胞的核酸(例如，编码多肽或模板，或两者)是封闭末端的线性双链体DNA(CELiD DNA或ceDNA)。在一些实施例中，ceDNA源自AAV基因组的复制形式(Li等人PLoS One[公共科学图书馆·综合]2013)。在一些实施例中，核酸(例如，编码多肽或模板DNA，或两者)的侧翼为ITR，例如AAV ITR，其中至少一个ITR包含末端解离位点和复制蛋白结合位点(有时称为复制型蛋白结合位点)。在一些实施例中，ITR源自腺相关病毒，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或其组合。在一些实施例中，ITR是对称的。在一些实施例中，ITR是不对称的。在一些实施例中，提供至少一种Rep蛋白以使构建体能够复制。在一些实施例中，至少一种Rep蛋白源自腺相关病毒，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或其组合。在一些实施例中，通过向生产细胞提供(i)侧翼为ITR(例如AAV ITR)的DNA，和(ii)ITR依赖性复制所需的组分，例如AAV蛋白Rep78和Rep52(或编码蛋白的核酸)来产生ceDNA。在一些实施例中，ceDNA不含任何衣壳蛋白，例如，未包装到感染性AAV颗粒中。在一些实施例中，ceDNA被配制成LNP(参见例如WO 2019051289A1)。
在一些实施例中，ceDNA载体由两个自身互补序列组成，例如本文定义的不对称或对称或基本对称的ITR，位于所述表达盒的侧翼，其中ceDNA载体不与衣壳蛋白相关联。在一些实施例中，ceDNA载体包含在AAV基因组中发现的两个自互补序列，其中至少一个ITR包含AAV的可操作的Rep结合元件(RBE)(在本文中有时也称为“RBS”)和末端解离位点(trs)或RBE的功能变体。参见，例如，WO 2019113310。
内含肽
在一些实施例中，如下文更详细描述的，内含肽-N可融合至本文所述的第一结构域的N末端部分，并且内含肽-C可融合至本文所述的第二结构域的C末端部分用于将N末端部分连接到C末端部分，从而连接第一和第二结构域。在一些实施例中，第一和第二结构域各自独立地选自DNA结合结构域、RNA结合结构域、RT结构域和核酸内切酶结构域。
如本文所用，“内含肽”是指自剪接蛋白内含子(例如肽)，例如，其连接侧翼N末端和C末端外显子(例如，待连接的片段)。在一些情况下，内含肽可以包含蛋白质的片段，该片段能够在称为蛋白质剪接的过程中自我切除并将剩余的片段(外显肽)与肽键连接。内含肽也称为“蛋白质内含子”。本文将内含肽自我切除并将蛋白质的剩余部分连接的过程称为“蛋白质剪接”或“内含肽介导的蛋白质剪接”。在一些实施例中，前体蛋白(在内含肽介导的蛋白质剪接之前的含内含肽的蛋白质)的内含肽来自两个基因。这种内含肽在本文称为断裂内含肽(例如，断裂内含肽-N和断裂内含肽-C)。例如，在蓝细菌中，DNA聚合酶III的催化亚基a(即DnaE)由两个分开的基因dnaE-n和dnaE-c编码。由dnaE-n基因编码的内含肽在本文可以称为“内含肽-N”。由dnaE-c基因编码的内含肽在本文可以称为“内含肽-C”。
以下中描述了使用内含肽连接异源蛋白质片段：例如，Wood等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]289(21)；14512-9(2014)(将其通过引用以其整体并入本文)。例如，当与分开的蛋白质片段融合时，内含肽IntN和IntC可以彼此识别，自我剪除，和/或同时连接它们所融合的蛋白质片段的侧翼N末端和C末端外显肽，从而从两个蛋白质片段重构全长蛋白质。
在一些实施例中，使用基于dnaE内含肽的合成内含肽，即Cfa-N(例如，断裂内含肽-N)和Cfa-C(例如，断裂内含肽-C)内含肽对。此类内含肽的实例已在以下中进行了描述：例如Stevens等人,J Am Chem Soc.[美国化学学会杂志]2016年2月24日；138(7):2162-5(将其通过引用以其整体并入本文)。根据本披露可以使用的内含肽对的非限制性实例包括：Cfa DnaE内含肽、Ssp GyrB内含肽、Ssp DnaX内含肽、Ter DnaE3内含肽、Ter ThyX内含肽、Rma DnaB内含肽和Cne Prp8内含肽(例如，如美国专利号8,394,604中所述，该专利通过引用并入本文)。
在一些实施例中，可以将内含肽-N和内含肽-C分别与断裂Cas9的N末端部分和断裂Cas9的C末端部分融合，以便将断裂Cas9的N末端部分和断裂Cas9的C末端部分连接。例如，在一些实施例中，内含肽-N融合至分裂型Cas9的N末端部分的C末端，即形成N—[分裂型Cas9的N末端部分]-[内含肽-N]～C的结构。在一些实施例中，内含肽-C融合到分裂型Cas9的C末端部分的N末端，即，形成N-[内含肽-C]～[分裂型Cas9的C末端部分]-C的结构。用于连接与内含肽融合的蛋白质(例如，分裂型Cas9)的内含肽介导的蛋白质剪接机制在以下中进行描述：Shah等人,Chem Sci.[化学科学]2014；5(l):446-46l，其通过引用并入本文。用于设计和使用内含肽的方法在本领域已知，并且例如由WO 2020051561、W0 2014004336、WO2017132580、US 20150344549、和US 20180127780进行了描述，其中每个通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，断裂是指分成两个或更多个片段。在一些实施例中，断裂Cas9蛋白或断裂Cas9包含Cas9蛋白，该蛋白作为由两个分开的核苷酸序列编码的N末端片段和C末端片段来提供。可以对与Cas9蛋白的N末端部分和C末端部分对应的多肽进行剪接以形成重构的Cas9蛋白。在实施例中，Cas9蛋白质在蛋白质的无序区域内被分成两个片段，例如，如以下中描述：Nishimasu等人,Cell[细胞],第156卷,第5期,第935-949页,2014，或Jiang等人(2016)Science[科学]351:867-871和PDB文件：5F9R(将其各自通过引用以其整体并入本文)。无序区域可通过本领域已知的一种或多种蛋白质结构测定技术测定，包括但不限于X射线晶体学、NMR光谱学、电子显微术(例如，cryoEM)和/或计算机模拟蛋白质建模。在一些实施例中，将蛋白质在例如氨基酸A292-G364、F445-K483、或E565-T637之间的SpCas9的区域内的任何C、T、A、或S处，或在任何其他Cas9、Cas9变体(例如，nCas9、dCas9)或其他napDNAbp中的对应位置处分成两个片段。在其他实施例中，将蛋白质在SpCas9T310、T313、A456、S469、或C574处分成两个片段。在一些实施例中，将蛋白质分成两个片段的过程称为对蛋白质的断裂。
在一些实施例中，蛋白质片段的长度范围为约2-1000个氨基酸(例如，2-10、10-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、或900-1000个之间的氨基酸)。在一些实施例中，蛋白质片段的长度范围为约5-500个氨基酸(例如，5-10、10-50、50-100、100-200、200-300、300-400、或400-500个之间的氨基酸)。在一些实施例中，蛋白质片段的长度范围为约20-200个氨基酸(例如，20-30、30-40、40-50、50-100、或100-200个之间的氨基酸)。
在一些实施例中，将Gene Writer(例如，Cas9-R2Tg)的一部分或片段与内含肽融合。可以将核酸酶与内含肽的N末端或C末端融合。在一些实施例中，将融合蛋白的部分或片段与内含肽融合并与AAV衣壳蛋白融合。可以将内含肽、核酸酶和衣壳蛋白以任何排列方式(例如，核酸酶-内含肽-衣壳、内含肽-核酸酶-衣壳、衣壳-内含肽-核酸酶等)融合在一起。在一些实施例中，将内含肽的N末端与融合蛋白的C末端融合，并将内含肽的C末端与AAV衣壳蛋白的N末端融合。
在一些实施例中，核酸内切酶结构域(例如，切口酶Cas9结构域)与内含肽-N融合，并且包含RT结构域的多肽与内含肽-C融合。
以下提供了内含肽的示例性核苷酸和氨基酸序列：
DnaE内含肽-N DNA：
TGCCTGTCATACGAAACCGAGATACTGACAGTAGAATATGGCCTTCTGCCAATCGGGAAGATTGTGGAGAAACGGATAGAATGCACAGTTTACTCTGTCGATAACAATGGTAACATTTATACTCAGCCAGTTGCCCAGTGGCACGACCGGGGAGAGCAGGAAGTATTCGAATACTGTCTGGAGGATGGAAGTCTCATTAGGGCCACTAAGGACCACAAATTTATGACAGTCGATGGCCAGATGCTGCCTATAGACGAAATCTTTGAGCGAGAGTTGGACCTCATGCGAGTTGACAACCTTCCTAAT
DnaE内含肽-N蛋白质：
CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN
DnaE内含肽-C DNA：
ATGATCAAGATAGCTACAAGGAAGTATCTTGGCAAACAAAACGTTTATGATATTGGAGTCGAAAGAGATCACAACTTTGCTCTGAAGAACGGATTCATAGCTTCTAAT内含肽-C：
MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN
Cfa-N DNA：
TGCCTGTCTTATGATACCGAGATACTTACCGTTGAATATGGCTTCTTGCCTATTGGAAAGATTGTCGAAGAGAGAATTGAATGCACAGTATATACTGTAGACAAGAATGGTTTCGTTTACACACAGCCCATTGCTCAATGGCACAATCGCGGCGAACAAGAAGTATTTGAGTACTGTCTCGAGGATGGAAGCATCATACGAGCAACTAAAGATCATAAATTCATGACCACTGACGGGCAGATGTTGCCAATAGATGAGATATTCGAGCGGGGCTTGGATCTCAAACAAGTGGATGGATTG CCA
Cfa-N蛋白质：
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
Cfa-C DNA：
ATGAAGAGGACTGCCGATGGATCAGAGTTTGAATCTCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTAAAGATAATATCTCGAAAAAGTCTTGGTACCCAAAATGTCTATGATATTGGAGTGGAGAAAGATCACAACTTCCTTCTCAAGAACGGTCTCGTAGCCAGCAAC
Cfa-C蛋白质：
MKRTADGSEFESPKKKRKVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN
脂质纳米颗粒
本发明提供的方法和系统可以采用任何合适的载剂或递送形式，在某些实施例中包括脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种离子脂质，诸如非阳离子脂质(例如，中性或阴离子或两性离子脂质)；一种或多种缀合的脂质(诸如WO2019217941的表5中描述的PEG缀合的脂质或缀合至聚合物的脂质；其通过引用以其全文并入本文)；一种或多种固醇(例如，胆固醇)；以及，任选地，一种或多种靶向分子(例如，缀合的受体、受体配体、抗体)；或前述内容的组合。
可用于形成纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质包括例如WO 2019217941的表4中描述的那些，其通过引用并入—例如，含脂质的纳米颗粒可包含WO 2019217941的表4中的一种或多种脂质。脂质纳米颗粒可以包括另外的元件，例如聚合物，例如WO 2019217941(通过引用并入)的表5中描述的聚合物。
在一些实施例中，缀合的脂质，当存在时，可以包括以下的一种或多种：PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些(通过引用并入)和前述的组合。
在一些实施例中，可掺入脂质纳米颗粒中的固醇包括胆固醇或胆固醇衍生物中的一种或多种，诸如通过引用并入的W0 2009/127060或US2010/0130588中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括通过引用并入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。
在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质和固醇。这些组分的量可以独立地变化，以获得所需特性。例如，在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含：可电离脂质，其量是总脂质的约20mol％至约90mol％(在其他实施例中，它可以是存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的20-70％(mol)、30-60％(mol)或40-50％(mol)；约50mol％至约90mol％)；非阳离子脂质，其量是总脂质的约5mol％至约30mol％；缀合脂质，其量是总脂质的约0.5mol％至约20mol％，以及甾醇，其量是总脂质的约20mol％至约50mol％。总脂质与核酸(例如，编码Gene Writer或模板核酸)的比率可以根据需要而变化。例如，总脂质与核酸(质量或重量)的比率可为约10:1至约30:1。
在一些实施例中，可电离脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质，例如可以根据pH以带正电荷的形式或中性形式存在的阳离子脂质，或可以容易地质子化的含胺脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是例如在生理条件下能够带正电的脂质。示例性的阳离子脂质包括一个或多个带有正电荷的胺基。在一些实施例中，脂质颗粒包含阳离子脂质与中性脂质、可电离含胺脂质、生物可降解炔烃脂质、类固醇、包括多不饱和脂质的磷脂、结构脂质(例如甾醇)、PEG、胆固醇和聚合物缀合脂质一起配制。在一些实施例中，阳离子脂质可以是可电离的阳离子脂质。如本文所披露的示例性阳离子脂质可具有超过6.0的有效pKa。在实施例中，脂质纳米颗粒可包含具有与第一阳离子脂质不同的有效pKa(例如，大于第一有效pKa)的第二阳离子脂质。脂质纳米颗粒可包含40mol％至60mol％的阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合脂质和治疗剂，例如本文所述的核酸(例如RNA)(例如模板核酸或编码Gene Writer的核酸)，包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒相关联。在一些实施例中，核酸与阳离子脂质共同配制。核酸可以吸附到LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)的表面。在一些实施例中，核酸可以包封在LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)中。在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含靶向部分，例如用靶向剂包被的靶向部分。在实施例中，LNP配制品是生物可降解的。在一些实施例中，包含一种或多种本文所述的脂质(例如式(i)、(ii)、(ii)、(vii)和/或(ix))的脂质纳米颗粒包封至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或100％的RNA分子，例如，模板RNA和/或编码Gene Writer多肽的mRNA。
在一些实施例中，脂质与核酸的比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在以下范围中：约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1。可以调节脂质和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂质纳米颗粒配制品的总脂质含量可在约5mg/ml至约30mg/mL的范围内。
可用于脂质纳米颗粒配制品中的示例性可电离脂质包括但不限于通过引用并入本文的WO 2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂质包括但不限于下式中的一种或多种：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；W0 2013/016058的A；W0 2012/162210的A；US2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210；W0 2009/132131的I、II、III或IV；US2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269的；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US10,221,127的5、6或10；WO2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人(2020)的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人(2017)的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO2020/106946的I；WO 2020/106946的I。
在一些实施例中，可电离脂质是MC3(6Z,9Z,28Z,3lZ)-三十七烷-6,9,28,3l-四烯-l9-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)，例如，如WO 2019051289A9(通过引用以其全文并入本文)的实例9中所述。在一些实施例中，可电离脂质是脂质ATX-002，例如，如WO 2019051289A9(通过引用以其全文并入本文)的实例10中所述。在一些实施例中，可电离脂质是(l3Z,l6Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-l3,l6-二烯-l-胺(化合物32)，例如，如WO 2019051289A9(通过引用以其全文并入本文)的实例11中所述。在一些实施例中，可电离脂质是化合物6或化合物22，例如，如WO2019051289A9(通过引用以其全文并入本文)的实例12中所述。在一些实施例中，可电离脂质是十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM-102)；例如，如US9,867,888(将其通过引用以其整体并入本文)的实例1中所述。在一些实施例中，可电离脂质是9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛基氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯(LP01)，例如，如WO 2015/095340(将其通过引用以其整体并入本文)的实例13中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，例如如US2012/0027803(将其通过引用以其整体并入本文)的实例7、实例8或实例9中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)，例如，如WO 2010/053572(将其通过引用以其整体并入本文)的实例14和实例16中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是；咪唑胆固醇酯(ICE)脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如来自WO 2020/106946(将其通过引用以其整体并入本文)的结构(I)。
可用于(例如，与其他脂质组分组合)形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA)(例如，模板核酸或编码GeneWriter的核酸)的脂质纳米颗粒的脂质化合物的一些非限制性实例包括：
在一些实施例中，包含式(i)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(ii)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(iii)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(v)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(vi)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(viii)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(ix)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
其中
X1是O、NR1或直接键，X2是C2-5亚烷基，X3是C(＝0)或直接键，R1是H或Me，R3是Ci-3烷基，R2是Ci-3烷基，或R2与它所附接的氮原子和X2的1-3个碳原子一起形成4元、5元或6元环，或X1是NR1，R1和R2与它们所附接的氮原子一起形成5元或6元环，或R2与R3和它们所附接的氮原子一起形成5元、6元或7元环，Y1是C2-12亚烷基，Y2选自
n是0至3，R4是Ci-15烷基，Z1是Ci-6亚烷基或直接键，
(在任一取向上)或不存在，条件是如果Z1是直接键，则Z2不存在；
R5是C5-9烷基或C6-10烷氧基，R6是C5-9烷基或C6-10烷氧基，W是亚甲基或直接键，并且R7是H或Me，或其盐，条件是如果R3和R2是C2烷基，X1是O，X2是直链C3亚烷基，X3是C(＝0)，Y1是直链Ce亚烷基，(Y2)n-R4是
，R4是直链C5烷基，Z1是C2亚烷基，Z2不存在，W是亚甲基，并且R7是H，则R5和R6不是Cx烷氧基。
在一些实施例中，包含式(xii)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(xi)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，LNP包含式(xiii)的化合物和式(xiv)的化合物。
在一些实施例中，包含式(xv)的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肝脏和/或肝细胞。
在一些实施例中，包含式(xvi)的配制品的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肺内皮细胞。
在一些实施例中，用于形成用于递送本文所述组合物(例如本文所述的核酸(例如，RNA)(例如模板核酸或编码GeneWriter的核酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物通过以下反应之一制备：
示例性的非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-加酸盐(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(例如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(例如16-O-二甲基PE)、l8-l-反式PE,l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥子酰磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反油酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、或其混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基基团优选为源自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基基团，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。在某些实施例中，另外的示例性脂质包括但不限于通过引用并入本文的Kim等人(2020)dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。在一些实施例中，此类脂质包括发现会改善用mRNA进行肝脏转染的植物脂质(例如，DGTS。在一些实施例中，非阳离子脂质可具有以下结构，
适合用于脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质的其他实例包括但不限于非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。其他非阳离子脂质在WO2017/099823或美国专利公开US 2018/0028664中描述，其内容通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，非阳离子脂质是油酸或通过引用以其全文并入的US2018/0028664的式I、II或IV的化合物。非阳离子脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的例如0-30％(摩尔)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5％-20％(摩尔)或10％-15％(摩尔)。在实施例中，可电离脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1(例如，约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1)。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。
在一些方面，脂质纳米颗粒可进一步包含诸如固醇的组分以提供膜完整性。可用于脂质纳米颗粒中的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5a-胆甾烷醇、53-粪甾烷醇、胆甾醇基-(2,-羟基)-乙基醚、胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5a-胆甾烷、胆甾烯酮、5a-胆甾烷酮、5p-胆甾烷酮和胆甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，例如，胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚。示例性的胆固醇衍生物在PCT公开W02009/127060和美国专利公开US 2010/0130588中描述，其中每个通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，提供膜完整性的组分，诸如固醇，可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-50％(摩尔)(例如，0-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％或40％-50％)。在一些实施例中，此类组分是脂质纳米颗粒的总脂质含量的20％-50％(摩尔)、30％-40％(摩尔)。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混合物。在一些实施例中，缀合脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合脂质。
示例性的PEG-脂质缀合物包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰基氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物例如在US5,885,6l3、US 6,287,59l、US2003/0077829、US 2003/0077829、US2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US2016/0376224、US 2017/0119904和US/099823中描述，所有这些的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-脂质是US 2018/0028664的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物，其内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-脂质具有US 20150376115或US2016/0376224的式II，两者的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕榈基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂质可以是以下的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂酰胺、PEG-二棕榈酰甘油脂酰胺、PEG-二硬脂基甘油脂酰胺、PEG-胆固醇(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包含PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包含选自以下的结构：
在一些实施例中，与PEG以外的分子缀合的脂质也可用于代替PEG-脂质。例如，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(GPL)缀合物可用于代替PEG-脂质或与PEG-脂质一起使用。
示例性缀合脂质，即PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质在WO 2019051289A9和WO 2020106946A1的表2中列出的PCT和LIS专利申请中描述，所有这些的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施例中，LNP包含式(xix)化合物、式(xxi)化合物和式(xxv)化合物。在一些实施例中，包含式(xix)、式(xxi)和式(xxv)的配制品的LNP用于将本文所述的GeneWriter组合物递送至肺或肺细胞。
在一些实施例中，PEG或缀合脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-20％(摩尔)。在一些实施例中，PEG或缀合脂质的含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.5％-10％或2％-5％(摩尔)。可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG/缀合脂质的摩尔比可以根据需要变化。例如，脂质颗粒可包含按组合物的摩尔或总重量计30％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计0-60％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计0-30％的非阳离子脂质和按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。优选地，组合物包含按组合物的摩尔或总重量计30％-40％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计40％-50％的胆固醇，和按组合物的摩尔或总重量计10％-20％的非阳离子脂质。在一些其他实施例中，该组合物是按组合物的摩尔或总重量计50％-75％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计20％-40％的胆固醇和按组合物的摩尔或总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。该组合物可以含有按组合物的摩尔或总重量计60％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计25％-35％的胆固醇，以及按组合物的摩尔或总重量计5％-10％的非阳离子脂质。该组合物还可含有按组合物的摩尔或总重量计至多90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％至15％的非阳离子脂质。配制品也可以是脂质纳米颗粒配制品，例如包含按组合物的摩尔或总重量计8％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计5％-30％的非阳离子脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计0-20％的胆固醇；按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％至25％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计10％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计5％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计1％至15％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计2％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计1％-20％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计甚至高达90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％-10％的非阳离子脂质，或按组合物的摩尔或总重量计甚至100％的阳离子脂质。在一些实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。在一些其他实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为60:38.5:1.5的可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。
在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质(例如磷脂)、固醇(例如胆固醇)和聚乙二醇化脂质，其中可电离脂质的脂质摩尔比在20至70摩尔％的范围内，目标为40-60，非阳离子脂质的摩尔百分比在0至30的范围内，目标为0至15，固醇的摩尔百分比在20至70的范围内，目标为30至50，并且聚乙二醇化脂质的摩尔百分比在1至6的范围内，目标为2至5。
在一些实施例中，脂质颗粒包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/缀合脂质。
在一个方面，本披露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒配制品。
在一些实施例中，还可以包括一种或多种另外的化合物。那些化合物可以单独施用，或者另外的化合物可以包括在本发明的脂质纳米颗粒中。换言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂质纳米颗粒可含有不同于第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以选自由以下组成的组：小的或大的有机分子或无机分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、其肽类似物和衍生物、肽模拟物、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物，或其任何组合。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒(或包含脂质纳米颗粒的配制品)缺乏反应性杂质(例如，醛或酮)，或包含低于预选水平的反应性杂质(例如，醛或酮)。虽然不希望受理论约束，但在一些实施例中，脂质试剂用于制备脂质纳米颗粒配制品，并且脂质试剂可包含污染性反应性杂质(例如，醛或酮)。可以基于具有低于预选水平的反应性杂质(例如，醛或酮)来选择用于制造的脂质试剂。在不希望受理论约束的情况下，在一些实施例中，醛可引起RNA的修饰和损伤，例如，碱基之间的交联和/或脂质与RNA的共价缀合(例如，形成脂质-RNA加合物)。在一些情况下，这可能导致逆转录酶反应失败和/或例如在一个或多个病变的一个或多个位点掺入不适当的碱基，例如新合成的靶DNA中的突变。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒配制品使用包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的总反应性杂质(例如醛)含量的脂质试剂产生。在一些实施例中，脂质纳米颗粒配制品使用包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类的脂质试剂产生。在一些实施例中，脂质纳米颗粒配制品使用脂质试剂产生，该脂质试剂包含：(i)小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的总反应性杂质(例如醛)含量；和(ii)小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。在一些实施例中，脂质纳米颗粒配制品使用多种脂质试剂产生，并且多种脂质试剂中的每一种独立地满足本段落中所述的一个或多个标准。在一些实施例中，多种脂质试剂中的每一种满足相同的标准，例如本段落的标准。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒配制品包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的总反应性杂质(例如醛)含量。在一些实施例中，脂质纳米颗粒配制品包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。在一些实施例中，脂质纳米颗粒配制品包含：(i)小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的总反应性杂质(例如醛)含量；和(ii)小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
在一些实施例中，用于如本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的总反应性杂质(例如醛)含量。在一些实施例中，用于如本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。在一些实施例中，用于本文所述的脂质纳米颗粒或其配制品的一种或多种或任选地所有脂质试剂包含：(i)小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的总反应性杂质(例如醛)含量；和(ii)小于5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的任何单一反应性杂质(例如醛)种类。
在一些实施例中，总醛含量和/或任何单一反应性杂质(例如醛)种类的量通过液相色谱法(LC)，例如与串联质谱法(MS/MS)联用，例如根据实例34中所述的方法来测定。在一些实施例中，反应性杂质(例如醛)含量和/或反应性杂质(例如醛)种类的量通过检测与例如脂质试剂中反应性杂质(例如醛)的存在相关的核酸分子(例如RNA分子，例如如本文所述)的一个或多个化学修饰来确定。在一些实施例中，反应性杂质(例如醛)含量和/或反应性杂质(例如醛)种类的量通过检测例如脂质试剂中与反应性杂质(例如醛)的存在相关联的核苷酸或核苷(例如核糖核苷酸或核糖核苷，例如包含在如本文所述的模板核酸中或从其分离)的一个或多个化学修饰来确定，例如，如实例7中所述。在实施例中，核酸分子、核苷酸或核苷的化学修饰通过测定一个或多个修饰的核苷酸或核苷的存在来检测，例如使用LC-MS/MS分析，例如，如实例7中所述。
在一些实施例中，本文所述的核酸(例如，RNA)(例如，模板核酸或编码GeneWriter的核酸)不包含醛修饰，或包含少于预选量的醛修饰。在一些实施例中，平均每1000个核苷酸，核酸具有少于50、20、10、5、2或1个醛修饰，例如，其中两个核苷酸的单个交联是单个醛修饰。在一些实施例中，醛修饰是RNA加合物(例如脂质-RNA加合物)。在一些实施例中，醛修饰的核苷酸在碱基之间交联。在一些实施例中，本文所述的核酸(例如RNA)在核苷酸之间包含少于50、20、10、5、2或1个交联。
在一些实施例中，通过添加靶向结构域将LNP定向至特定组织。例如，可以将生物配体展示在LNP的表面，以增强与展示同源受体的细胞的相互作用，从而推动与细胞表达受体的组织的相关联和向其中的载物递送。在一些实施例中，生物配体可以是驱动递送至肝脏的配体，例如展示GalNAc的LNP促使核酸载物递送至展示无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的肝细胞。Akinc等人Mol Ther[分子治疗]18(7):1357-1364(2010)的工作传授了将三价GalNAc配体与PEG-脂质缀合(GalNAc-PEG-DSG)以产生依赖于ASGPR的LNP以获得可观察的LNP载物效应(参见，例如，图6)。其他展示配体的LNP配制品，例如掺入叶酸、转铁蛋白或抗体的配制品，在WO 2017223135中进行了讨论，其通过引用以其全文并入本文，此外还有在其中使用的参考文献也并入本文：即，Kolhatkar等人,Curr Drug Discov Technol[当代药物发现技术].2011 8:197-206；Musacchio和Torchilin,Front Biosci.[生物科学前沿]2011 16:1388-1412；Yu等人,Mol Membr Biol.[分子膜生物学]201027:286-298；Patil等人,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst[治疗性药物载剂系统的重要评论].2008 25:1-61；Benoit等人,Biomacromolecules[生物大分子].2011 12:2708-2714；Zhao等人,ExpertOpin Drug Deliv[药物递送专家观点].2008 5:309-319；Akinc等人,Mol Ther[分子治疗].2010 18:1357-1364；Srinivasan等人,Methods Mol Biol[分子生物学方法].2012820:105-116；Ben-Arie等人,Methods Mol Biol[分子生物学方法].2012 757:497-507；Peer 2010 J Control Release[控释杂志].20:63-68；Peer等人,Proc Natl Acad Sci US A.[美国国家科学院院刊]2007 104:4095-4100；Kim等人,Methods Mol Biol.[分子生物学方法]2011 721:339-353；Subramanya等人,Mol Ther[分子治疗].2010 18:2028-2037；Song等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]200523:709-717；Peer等人,Science[科学].2008 319:627-630；以及Peer和Lieberman,Gene Ther[基因治疗].2011 18:1127-1133。
在一些实施例中，通过将选择性器官靶向(Selective ORgan Targeting，SORT)分子添加至包含传统组分(例如可电离的阳离子脂质、两亲性磷脂、胆固醇和聚(乙二醇)(PEG))的配制品中来针对组织特异性活性对LNP进行选择。Cheng等人Nat Nanotechnol[自然纳米技术]15(4):313-320(2020)的传授内容证明，添加补充的“SORT”组分可根据SORT分子的百分比和生物物理特性精确地改变体内RNA递送谱并介导组织特异性(例如，肺、肝脏、脾脏)基因递送和编辑。
在一些实施例中，LNP包含生物可降解的可电离脂质。在一些实施例中，LNP包含(9Z,l2Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也称为3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一种可电离脂质。参见，例如WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086，以及其中提供的参考文献的脂质。在一些实施例中，在LNP脂质的上下文中术语阳离子和可电离是可互换的，例如，其中可电离脂质根据pH是阳离子的。
在一些实施例中，可以将Gene Writer系统的多个组分制备为单一LNP配制品，例如，LNP配制品包含编码Gene Writer多肽的mRNA和RNA模板。可以改变核酸组分的比率以便最大化治疗剂的特性。在一些实施例中，RNA模板与编码Gene Writer多肽的mRNA的比率为按摩尔比计约1:1至100:1，例如约1:1至20:1、约20:1至40:1、约40:1至60:1、约60:1至80:1、或约80:1至100:1。在其他实施例中，可以由单独的配制品制备多种核酸的系统，例如，包含模板RNA的一种LNP配制品和包含编码Gene Writer多肽的mRNA的第二LNP配制品。在一些实施例中，该系统可以包含配制到LNP中的多于两种核酸组分。在一些实施例中，该系统可以包含蛋白质(例如，Gene Writer多肽)以及配制到至少一种LNP配制品中的模板RNA。
在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以在数十nm和数百nm之间，例如通过动态光散射(DLS)测量的。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约70nm至约100nm。在特定实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约80nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径范围为约1mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm、或约38mm至约42mm。
在一些情况下，LNP可以是相对均质的。多分散性指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。LNP的多分散性指数可为约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施例中，LNP的多分散性指数可为约0.10至约0.20。
LNP的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。在一些实施例中，ζ电位可以描述LNP的表面电荷。具有相对低电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒通常是期望的，因为更高电荷的物质可能不理想地与体内的细胞、组织和其他元素相互作用。在一些实施例中，LNP的ζ电位可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
蛋白质和/或核酸(例如，Gene Writer多肽或编码该多肽的mRNA)的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备后被包封或以其他方式与LNP相关联的蛋白质和/或核酸的量。包封效率理想的是较高(例如，接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎脂质纳米颗粒之前和之后含有脂质纳米颗粒的溶液中蛋白质或核酸的量来测量。阴离子交换树脂可用于测量溶液中游离蛋白质或核酸(例如RNA)的量。荧光可用于测量溶液中游离蛋白质和/或核酸(例如RNA)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，蛋白质和/或核酸的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，包封效率可以是至少80％。在一些实施例中，包封效率可以是至少90％。在一些实施例中，包封效率可以是至少95％。
LNP可以任选地包含一层或多层包衣。在一些实施例中，LNP可以配制在具有包衣的胶囊、膜或片剂中。包含本文所述的组合物的胶囊、膜或片剂可具有任何可用的尺寸、拉伸强度、硬度或密度。
另外的示例性脂质、配制品、方法和LNP表征由WO 2020061457传授，其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔(ThermoFisher))或TransIT-mRNA转染试剂(米卢斯生物(Mirus Bio))进行体外或离体细胞脂质转染。在某些实施例中，使用GenVoy_ILM可电离脂质混合物(精密纳米系统(PrecisionNanoSystems))配制LNP。在某些实施例中，使用2,2‐二亚油烯基‐4‐二甲基氨基乙基‐[1,3]‐二氧戊环(DLin‐KC2‐DMA)或二亚油烯基甲基‐4‐二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)配制LNP，其配制和体内用途在Jayaraman等人Angew Chem Int Ed Engl[德国应用化学]51(34):8529-8533(2012)中传授，其通过引用以其全文并入本文。
优化用于递送CRISPR-Cas系统(例如Cas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9mRNA)的LNP配制品在两者均通过引用并入的WO 2019067992和WO2019067910中描述。
可用于递送核酸的另外的特定LNP配制品在两者均通过引用并入的US8158601和US 8168775中描述，其包括帕替西兰(patisiran)中使用的以名称ONPATTRO销售的配制品。
Gene Writer LNP的示例性给药可包括约0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100mg/kg(RNA)。包含编码系统的一种或多种组分的核酸的AAV的示例性给药可包括约1011、1012、1013和1014vg/kg的MOI。
适用适应症
可以通过本文提供的系统或方法(例如包含Gene Writer的那些)治疗的示例性合适的疾病和障碍包括但不限于：Baraitser-Winter综合征1和2；糖尿病和尿崩症伴视神经萎缩和耳聋；α-1-抗胰蛋白酶缺乏症；肝素辅因子II缺乏症；肾上腺脑白质营养不良；Keppen-Lubinsky综合征；特里奇·柯林斯(Treacher collins)综合征1；线粒体复合物I、II、III、III(核2、4或8型)缺乏症；高锰血症伴肌张力障碍、红细胞增多症和肝硬化；肠类癌；横纹肌样肿瘤易感性综合征2；威尔逊(Wilson)病；高苯丙氨酸血症，bh4缺乏，a，由于部分pts缺乏，BH4缺乏，D，和非pku；高胰岛素性低血糠症家族3、4和5；毛囊角化病；口-面-指综合征；SeSAME综合征；耳聋，非综合征性感觉神经，线粒体；蛋白尿；胰岛素依赖型糖尿病分泌性腹泻综合征；烟雾病5；先天性再生障碍性贫血1、5、8和10；假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良综合征；角膜脆弱综合征2；甲基丙二酸血症伴合并高胱氨酸尿症；亚当斯-奥利弗综合征5和6；常染色体隐性无丙种球蛋白血症2；皮质畸形，枕骨；高热惊厥，家族性，11；粘多糖贮积症VI型、VI型(严重)和VII型；马登·沃克(Marden Walker)样综合征；伪新生儿肾上腺脑白质营养不良；球状体肌病；颅锁骨发育不全；多发性皮肤和粘膜静脉畸形；急性婴儿肝衰竭；柑桔素缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症；室间隔缺损1；眼齿指发育不良；威尔姆斯(Wilms)瘤1；类Weill-Marchesani综合征；肾发育不良；白内障1、4型，常染色体显性，常染色体显性，多型，有小角膜，科普克(coppock)样，幼年型，有小角膜和糖尿，核弥漫性非进行性；牙齿型低碱性磷酸酯酶症；脑-眼-面-骨骼综合征；精神分裂症15；脑淀粉样血管病，APP相关；家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症3；卟啉胆素原合酶缺乏；2型发作性共济失调；3型毛发-鼻-指综合征；进展型家族性心脏传导阻滞IB型；胶质瘤易感性1；利希滕斯坦-克罗(Lichtenstein-Knorr)综合征；X连锁少汗性外胚层发育不良；巴特综合征3型、3型低钙尿症和4型；碳酸酐酶VA缺乏，高氨血症所致；心肌病；皮肤异色症，遗传性纤维化，伴有肌腱挛缩、肌病和肺纤维化；联合d-2-和1-2-羟基戊二酸尿症；精氨酸酶缺乏症；锥体杆体营养不良2和6；斯-李-奥(Smith-Lemli-Opitz)综合征；粘脂贮积病IIIγ；布劳(Blau)综合征；韦默(Wemer)综合征；脑膜瘤；碘酪氨酰偶联缺陷；杜宾–约翰逊(Dubin-Johnson)综合征；3-Oxo-5α-类固醇δ4-脱氢酶缺乏症；鲍彻纽豪斯(Boucher Neuhauser)综合征；大脑内铁沉积；智力低下，X-连锁102和综合征13；家族性垂体腺瘤易感性；胼胝体发育不良；高α脂蛋白血症2；亚铁氧化酶缺乏症；有免疫缺陷的生长激素不敏感；共济失调-白内障综合征(Marinesco-Sj\xc3\xb6gren syndrome)；马尔慈奥夫(Martsolf)综合征；家族性水平注视麻痹伴进行性脊柱侧弯；米切尔-莱利(Mitchell-Riley)综合征；低尿钙高钙血症，家族性，1型和3型；鲁宾斯坦-泰比(Rubinstein-Taybi)综合征；肾炎及耳聋综合征；青少年视网膜劈裂症；贝克(Becker)肌营养不良；洛伊迪茨(Loeys-Dietz)综合征1、2、3；先天性肌肉肥大-脑综合征；家族性幼年型痛风；精子生成障碍11、3和8；唇腭裂11和7，唇裂/腭裂-外胚层发育不良综合征；智力低下，X连锁，非特异性，综合征，Hedera型和综合征，wu型；联合氧化磷酸化缺陷1、3、4、12、15和25；额颞叶痴呆；Kniest发育不良；家族性心肌病；良性家族性血尿；嗜铬细胞瘤；氨基糖苷类引起的耳聋；γ-氨基丁酸转氨酶缺乏症；眼皮肤白化病IB型、3型和4型；肾缺损综合征；中枢神经系统髓鞘减少；Hennekam淋巴管扩张症-淋巴水肿综合征2；偏头痛，家族性基底动脉；X连锁3型远端脊髓性肌萎缩；X-连锁脑室旁异位；小头畸形；粘多糖贮积症、MPS-I-H/S、MPS-II、MPS-III-A、MPS-III-B、MPS-III-C、MPS-IV-A、MPS-IV-B；婴儿帕金森(Parkinsonism)-肌张力障碍；伴有TDP43包涵体的额颞叶痴呆，TARDBP相关；遗传性弥漫性胃癌；I型和II型唾液酸沉积症；小头畸形-毛细血管畸形综合征；遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征；脑小血管病伴出血；非酮性高甘氨酸血症；纳瓦霍(Navajo)神经肝病；耳髁状突综合征2；痉挛性截瘫15、2、3、35、39、4、常染色体显性、55、常染色体隐性和5A；常染色体隐性皮肤松弛型IA和IB；由于葡萄糖磷酸异构酶缺乏引起的溶血性贫血，非球形红细胞性贫血；早年衰老综合征；伴有荨麻疹和耳聋的家族性淀粉样肾病；主动脉瓣上狭窄；弥漫性掌跖角化病，Bothnian型；心手综合征；Coffin Siris/智障；左右轴畸形；拉帕迪利诺(Rapadilino)综合征；真性小眼球2；颅缝早闭和牙齿变异；副神经节瘤1；斯奈德罗宾逊(Snyder Robinson)综合征；心室纤维性颤动；激活型PI3K-δ综合征；豪威尔-埃文斯(Howel-Evans)综合征；扁脸关节脱位足异常综合征，显性型；Van Maldergem综合征2；MYH相关性息肉；6-丙酮酰-四氢蝶呤合成酶缺乏症；阿拉杰里综合征1和2；淋巴管肌瘤病；肌-眼-脑病；WFSl相关障碍；原发性肥大性骨关节病，常染色体隐性遗传2；不孕不育；Nestor-Guillermo(内斯特-桂奈维尔)早衰综合征；线粒体三功能蛋白缺乏症；左心发育不全综合征2；原发性扩张型心肌病；色素性视网膜炎；先天性巨结肠3；遗传性血栓性血小板减少性紫癜；狄布寇斯(Desbuquois)发育不良2；腹泻3(分泌性钠，先天性，综合征)和5(先天性簇绒肠病)；先天性厚甲症4型和2型；伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性和隐性脑动脉病；卵黄样黄斑营养不良(Vi tel 1i form dystrophy)；II型、IV型、IV型(肝肌病联合)、V型和VI型；非典型雷特(Rett)综合征；房室间隔缺损4；掌跖角化牙周破坏综合征(Papillon-Lef\xc3\xa8vre syndrome)；莱伯氏(Leber)先天性黑蒙；X连锁遗传性运动和感觉神经病；进行性硬化性脊髓灰质炎；Goldmann-Favre综合征；肾-肝-胰腺发育不良；霍-帕二氏综合征；淀粉样变甲状腺素蛋白淀粉样变性；梅-尼二氏综合征；高免疫球蛋白E综合征；后索性共济失调与视网膜色素变性；点状软骨发育不良1，X连锁隐性和2X连锁显性；晶状体异位，孤立的常染色体隐性和显性；家族性寒冷性荨麻疹；家族性腺瘤性息肉病1和3；汗孔角化症8，播散浅表光化型；PIK3CA相关过度生长谱；颅内海绵状血管瘤2；渗出性玻璃体视网膜病变6；先天性巨脑畸形毛细血管扩张症；TARP综合征；糖尿病，永久性新生儿，具有神经系统特征；短肋胸椎发育异常11或3伴有或不伴有多指畸形；多毛性骨软骨发育不良；β地中海贫血；尼曼-匹克氏(Niemann-Pick)病Cl、C2型、A型和Cl型、成人型；夏科-马里-图思(Charcot-Marie-Tooth)病类型IB、2B2、2C、2F、21、2U(轴突)、1C(脱髓鞘)、显性中间C、隐性中间A、2A2、4C、4D、4H、IF、IVF和X；I型酪氨酸血症；阵发性心房颤动；UV敏感综合征；牙齿缺失，选择性，3和4；美罗辛(Merosin)缺乏症先天性肌肉萎缩症；长链3-羟酰基-CoA脱氢酶缺乏症；先天性无虹膜；左心室致密化不全5；芳香族-L-氨基酸脱羧酶缺乏；冠状动脉心脏疾病；全白甲；远端关节挛缩2B型；色素性视网膜炎10、11、12、14、15、17和19；罗宾索劳夫(Robinow Sorauf)综合征；特诺里奥(Tenorio)综合征；泌乳素瘤；神经纤维瘤病，蓝德(land)型2型；伴有脑和眼异常的先天性肌营养不良-抗肌萎缩相关糖蛋白病，A2、A7、A8、Al l和A14型；内脏异位，内脏，2、4和6，常染色体；扬科维奇里维拉(Jankovic Rivera)综合征；脂肪代谢障碍，家族性的部分的，2型和3型；血红蛋白H病，非缺失；多中心性骨质溶解结节病和关节病；甲状腺发育不全；酰基辅酶A脱氢酶家族成员9缺乏；亚历山大(Alexander)病；植烷酸贮积病；乳腺癌-卵巢癌，家族性1、2和4；脯氨酸脱氢酶缺乏症；儿童低磷酸酯酶症；胰腺发育不全和先天性心脏病；维生素D依赖性佝偻病，类型蓝德(land)2；虹膜前房角发育不全显性型和1型；常染色体隐性少汗性外胚层发育不良综合征；智力低下，X连锁，3、21、30和72；2型遗传性出血性毛细血管扩张症；眼睑裂缝(睑口)狭小、上睑下垂和内眦赘皮；腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症；癫痫发作，良性家族性婴儿，2；肢端发育不全2，有或无激素抵抗；法洛(Fallot)四联症；色素性视网膜炎2、20、25、35、36、38、39、4、40、43、45、48、66、7、70、72；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；Eichsfeld型先天性肌营养不良症；沃克-沃伯格(Walker-Warburg)先天性肌营养不良症；TNF受体相关周期性发热综合征(TRAPS)；进行性肌阵挛性癫痫伴共济失调；癫痫，儿童失神癫痫2、12(特发性全面性癫痫，易感性)5(夜间额叶癫痫)，夜间额叶癫痫1型，部分性，具有可变病灶，进行性肌阵挛癫痫3，和X连锁，具有可变的学习障碍和行为障碍；长QT综合征；二羧基氨基酸尿；A1和A2型短指症；具有多种凝血因子缺乏的弹性假黄瘤样障碍；多系统平滑肌功能障碍综合征；并指Cenani Lenz型；朱伯特(Joubert)综合征1、6、7、9/15(双基因)、14、16和17，以及口颌面指综合征xiv；指头脑综合征；视网膜母细胞瘤；家族性运动障碍，伴有面部肌纤维颤搐；遗传性感觉和自主神经病IIB和IIA；家族性高胰岛素血症；伴有皮层下囊肿的巨脑白质脑病蓝德(land)2a；阿瑟(Aase)综合征；Wiedemann-Steiner综合征；剥脱性鱼鳞癣；先天性肌强直；肉芽肿病，慢性，X连锁，变异；2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症；结节病，早发；青光眼，先天性和青光眼，先天性，缺损；乳腺癌，易感性；神经元蜡样脂褐质沉积症2、6、7和10；先天性全身性脂肪营养不良2型；果糖-双磷酸酶缺乏症；先天性挛缩性蛛脚样指趾；林奇(Lynch)综合征I和II；磷酸甘油酸脱氢酶缺乏症；Burn-Mckeown综合征；心肌梗死1；色盲2和7；色素性视网膜炎73；红色盲基因缺陷；多小脑回畸形，不对称，双侧额顶；脊髓性肌萎缩，远端，常染色体隐性遗传，5；由于甲基丙二酰辅酶A变位酶缺乏引起的甲基丙二酸尿症；家族性脑穿通畸形；赫勒氏(Hurler)综合征；耳腭指综合征，I型和II型；小儿巨脑畸形综合征1或2；心脑肌病，致命性小儿，由于细胞色素c氧化酶缺乏症；类扭伤性侏儒；促甲状腺素释放激素抵抗，全身性；糖尿病，2型和胰岛素依赖型，20；胸主动脉瘤和主动脉夹层；雌激素抵抗；枫糖尿病1A型和3型；尿道下裂1和2，X连锁；异染性脑白质营养不良青少年型、晚期婴儿型和成人型；早期T细胞祖细胞急性淋巴细胞白血病；遗传性感觉神经病，IC型；智力低下，常染色体显性遗传31；色素性视网膜炎39；乳腺癌，早发性；May-Hegglin异常；戈谢(Gaucher)病1型和亚急性神经元病；特诺里奥(Temtamy)综合征；脊髓性肌萎缩，下肢显性2，常染色体显性；范科尼(Fanconi)贫血，互补组E、I、N和O；黑酸尿症；巨结肠病；联合丙二酸和甲基丙二酸尿症；致心律失常性右心室心肌病5、8和10型；先天性脂肪瘤过度生长、血管畸形和表皮痣；提摩西(Timothy)综合征；胍乙酸甲基转移酶缺乏；肌阵挛性肌张力障碍；川崎(Kanzaki)病；中性1氨基酸转运缺陷；神经垂体糖尿病尿崩症；甲状腺激素代谢异常；伴有心肌病的良性肩腓肌营养不良营养不良症；肝脏缺乏糖原合成酶的低血糖症；肥厚型心肌病；与乙酰胆碱受体缺乏相关的先天性肌无力综合征，11；智力低下X连锁综合征5；斯托莫肯(Stormorken)综合征；再生障碍性贫血；智力障碍；周期性正常血钾性麻痹，钾敏感；达农病(Danon disease)；肾痨13、15和4；甲状腺毒性周期性麻痹和甲状腺毒性周期性麻痹2；与多尾精子和过多DNA相关的不孕症；青光眼，原发性开角，青少年发病；无纤维蛋白原血症和先天性无纤维蛋白原血症；多囊肾病2，成人型，婴儿型；家族性迟发性皮肤卟啉病；眼脑肾综合征(肾痨、动眼神经失用和小脑异常)；额颞叶痴呆3染色体连锁和额颞叶痴呆泛素阳性；异型增生；免疫缺陷-着丝粒不稳定-面部异常综合征2；贫血，非球形细胞溶血性，由于G6PD缺乏；伴有或不伴有汗液氯化物3升高的支气管扩张；先天性肌病伴纤维型不均衡；卡尼(Carney)综合征，1型；隐睾，单侧或双侧；西门子大疱性鱼鳞病；孤立性促黄体素缺乏；DFNA2非综合征性听力损失；克莱因-沃登伯格(Klein-Waardenberg)综合征；灰色血小板综合征；胆汁酸合成缺陷，先天性，2；46，XY性逆转，1、3、5型；急性间歇性卟啉症；德朗热综合征(Cornelia deFange syndrome)1和5；高甘氨酸尿症；锥体杆体营养不良3；异常纤维蛋白原血症；卡拉克(Karak)综合征；先天性肌营养不良症-无智力障碍的抗肌萎缩相关糖蛋白病，B5型；婴幼儿眼震，X连锁；先天性角化不良，常染色体隐性遗传，1、3、4和5；伴有或不伴有脉络膜视网膜病变、淋巴水肿或智力低下的小头畸形；高赖氨酸血症；巴德-毕德氏(Bardet-Biedl)综合征1、11、16和19；常染色体隐性中央核肌病；弗雷泽(Frasier)综合征；尾部退化综合征；先天性眼外肌纤维化，1、2、3a(有或没有眼外受累)，3b；普拉德-威利(Prader-Willi)样综合征；恶性黑色素瘤；布卢姆氏(Bloom)综合症；毛囊角化病，节段性；多中心溶骨性肾病；1型、2B型和3型血色素沉着症；伴有进行性眼外肌麻痹的婴儿小脑性共济失调和小脑性共济失调、智力低下和失衡综合征2；左心发育不全综合征；癫痫、听力损失和智力低下综合征；转铁蛋白血清水平定量性状基因座2；眼白化病，I型；马凡(Marfan)综合征；伴有脑和眼异常的先天性肌营养不良-抗肌萎缩相关糖蛋白病，A14和B14型；高氨血症，III型；隐眼综合征；先天性普秃；成人低磷酸酯酶症；甘露糖结合蛋白缺乏症；牛眼样黄斑营养不良；常染色体显性扭转性肌张力障碍4；肾病综合征，3型，5型，有或没有眼部异常，7型和9型；癫痫发作，早期婴儿型癫痫性脑病7；持续性幼儿型胰岛素过度分泌低血糖症；血小板减少症，X连锁；新生儿张力减退；奥斯塔维克林德曼索伯格(Orstavik Lindemann Solberg)综合征；肺动脉高压，原发性，1，遗传性出血性毛细血管扩张症；垂体依赖性皮质醇增多症；疣状表皮发育不良；局灶性变异型交界性大疱性表皮松解症；细胞色素c氧化酶i缺乏症；金德勒(Kindler)综合征；肌硬化，常染色体隐性遗传；动脉干；眼球后退综合征2型；ADULT综合征；齐薇格(Zellweger)综合征谱；脑白质病伴共济失调，脑干和脊髓受累以及乳酸升高，白质消融且进行性，卵巢功能衰竭；抗凝血酶III缺乏症；全前脑畸形7；罗伯茨(Roberts)-SC-光眼病综合征；线粒体DNA耗竭综合征3和7，肝脑型和13(脑肌病型)；脑穿通畸形2；头小畸型、正常智力和免疫缺陷；巨轴突神经病；斯特奇-韦伯(Sturge-Weber)综合征，毛细血管畸形，先天性，1；法布里病和法布里病心脏变异型；谷氨酸亚胺基甲基转移酶缺乏；范可尼毕克尔(Fanconi-Bickel)综合征；指端细小型发育不良；癫痫，特发性全身性，易感性，12；基底节钙化，特发性，4；多糖体肌病1伴或不伴免疫缺陷；前列腺恶性肿瘤；面部先天性外胚层发育不良；先天性心脏病；年龄相关性黄斑变性3、6、11和12；先天性肌强直，常染色体显性和隐性形式；低镁血症1，肠道；亚硫酸氧化酶缺乏症，孤立性；皮克(Pick)病；I型血纤维蛋白溶酶原缺乏症；并指3型；锥杆营养不良牙釉质发育不全；假性原发性醛固酮增多症；终末骨发育不良；新生儿型巴特综合征2型；伴有智力低下的先天性肌营养不良-抗肌萎缩相关糖蛋白病，B2型、B3型、B5型和B15型；家族性婴儿型肌无力；淋巴增生综合征1、1(X连锁)和2；高胆固醇血症和常染色体隐性高胆固醇血症；卵巢恶性肿瘤；婴儿GM1神经节苷脂沉积症；综合征型X连锁智力低下16；5-磷酸核糖异构酶缺乏症；阿尔茨海默病，1型、3型和4型；安徒生-泰维勒(Andersen Tawil)综合征；多发性关节突综合征3；冻疮样狼疮1；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症，家族性，2；阿克森费尔德-里格尔(Axenfeld-Rieger)综合征3型；肌病，先天性核心；轻度软骨发育不良的骨关节炎；过氧化物酶体生物发生障碍；重症先天性中性粒细胞缺乏症；遗传性神经痛性肌萎缩；局灶性非表皮松解性掌跖角化病；异常纤溶酶原血症；家族性结直肠癌；痉挛性共济失调5，常染色体隐性遗传，Charlevoix-Saguenay型，1、10或11，常染色体隐性遗传；额干骺端发育不良蓝德(land)3；遗传因子II、IX、VIII缺乏症；脊柱关节发育不良，埃勒斯-当洛(Ehlers-Danlos)综合征样，免疫失调，蛋白聚糖型，先天性关节脱位，短肢手型，Sedaghatian型，锥杆营养不良，Kozlowski型；鱼鳞病早产综合症；斯蒂克勒(Stickler)综合征1型；局灶性节段性肾小球硬化5；5-羟脯氨酸酶缺乏症；综合征性小眼畸形5、7和9；幼年性息肉病/遗传性出血性毛细血管扩张综合征；丁酰辅酶A脱氢酶缺乏；青年人中的成人发病型糖尿病，2型；智力低下，综合征，Claes-Jensen型，X连锁；耳聋，耳蜗，近视和智力障碍，无前庭受累，常染色体显性遗传，X连锁2；脊椎腕关节融合综合征；STING相关幼年发病性血管病变；中性脂肪沉积症伴肌病；钙进入缺陷导致T细胞失活的免疫功能障碍2；心面皮肤综合征；皮质酮甲基氧化酶2型缺乏症；遗传性肌病伴早期呼吸衰竭；间质性肾炎，巨核症；三甲基胺尿症；高免疫球蛋白D伴有周期性发热；恶性高热易感性1型；伴有智力低下、侏儒症和视网膜色素变性的多毛病；乳腺腺癌；补体B因子缺乏症；乌尔里希(Ullrich)型先天性肌营养不良；左心室致密化不全心肌病；鱼眼病；费氏(Finnish)先天性肾变病综合征；肢带型肌营养不良，IB型、2A型、2B型、2D型、Cl型、C5型、C9型、C14型；特发性纤维化肺泡炎，慢性形式；原发性家族性肥厚性心肌病；血管紧张素转化酶，良性血清升高；Cd8缺乏症，家族性；普罗特斯(Proteus)综合征；葡萄糖-6-磷酸转运缺陷；伯-福-萊(Borjeson-Forssman-Lehmann)三氏综合征；齐薇格(Zellweger)综合征；脊肌萎缩症，II型；前列腺癌，遗传性，2；血小板减少症、血小板功能障碍、溶血和珠蛋白合成不平衡；先天性糖基化障碍IB、ID、1G、1H、1J、IK、IN、IP、2C、2J、2K、Ilm型；交界型大疱性表皮松解症Herlitz型；全面性癫痫伴热性惊厥附加症3、1型、2型；精神分裂症4；冠状动脉疾病，常染色体显性遗传2；先天性角化不良，常染色体显性遗传，2和5；皮层下层流异位，X-连锁；腺苷酸激酶缺乏症；X连锁严重联合免疫缺陷；粪卟啉症；转甲状腺素蛋白相关的淀粉样蛋白心肌病；低血钙症，常染色体显性遗传1；布鲁加达(Brugada)综合征；先天性肌无力综合征，乙酰唑胺反应性；原发性低镁血症；硬化性骨化病；额颞叶痴呆和/或肌萎缩侧索硬化症3和4；甲羟戊酸尿症；神经鞘瘤病2；伴有视神经萎缩的遗传性运动和感觉神经病；迟发性皮肤卟啉病；剥脱性骨软骨炎；癫痫发作，良性家族性新生儿，1，和/或肌运动；长QT综合征，LQT1亚型；智力低下、上颌前突、斜视；婴儿特发性高钙血症；低促性腺激素性腺机能减退11伴或不伴嗅觉丧失；伴有硬化性白质脑病的多囊性脂膜性骨发育不良；原发性常染色体隐性小头畸形10、2、3和5；主动脉弓断离；先天性无巨核细胞的血小板过低症；赫曼斯基-普德拉克(Hermansky-Pudlak)综合征1、3、4和6；长QT综合征1、2、2/9、2/5、(双基因)、3、5和5，获得性，易感性；安德曼(Andermann)综合征；视锥细胞营养不良3B；红细胞生成性原卟啉症；墨蝶呤(Sepiapterin)还原酶缺乏症；极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症；高铁蛋白血症白内障综合征；Silver痉挛性截瘫综合征；夏-马-图(Charcot-Marie-Tooth)三氏病；心房间隔缺损2；卡内瓦尔综合征；遗传性疼痛不敏感伴无汗症；儿茶酚胺敏感性室速；低钾性周期性麻痹1和2；婴儿猝死综合症；伴有铁超载的低色素性小细胞性贫血；GLUT1缺乏综合征2；脑白质营养不良伴髓鞘发育不良，11和6；锥体全色盲；骨硬化症常染色体显性1型和2型、隐性4型、隐性1型、隐性6型；重症先天性中性粒细胞缺乏症3，常染色体隐性或显性；蛋氨酸腺苷转移酶缺乏症，常染色体显性遗传；阵发性家族性心室纤维性颤动；红细胞丙酮酸激酶缺乏症；新生儿致命的软骨发育不良；尖端扭转型室性心动过速；远端肌病Markesbery-Griggs型；缺乏UDP葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；心源性猝死；Neu-Laxova综合征1；无转铁蛋白血症；甲状旁腺功能亢进1和2；皮肤恶性黑色素瘤1；交感神经，近端，lb；进行性假性类风湿性发育不良；韦德尼希-霍夫曼综合征；2型软骨形成不良；全前脑畸形2、3、7和9；辛德勒病1型；伴有钙化和囊肿的脑视网膜微血管病；异质性、内脏性、X-连锁；结节性硬化综合征；卡塔格内综合征；甲状腺激素抵抗，全身性，常染色体显性遗传；常染色体隐性遗传斑萎；指甲障碍，非综合征性先天性，8型；Mohr-Tranebjaerg综合征；锥体杆体营养不良12；听力受损；卵巢性白质营养不良；近端肾小管酸中毒，伴有眼部异常和智力低下；二氢蝶啶还原酶缺乏症；伴有或不伴有智力低下的语言障碍的病灶性癫痫；共济失调-毛细血管扩张综合征；Brown-Vialetto-VanLaere综合征和Brown-Vialetto-VanLaere综合征2；心肌病；外周脱髓鞘性神经病，中枢性髓鞘发育不良；角膜营养不良，Fuchs内皮，4；考登(Cowden)综合征3；肌张力障碍2(扭转，常染色体隐性)、3(扭转，X连锁)、5(多巴反应型)、10、12、16、25、26(肌阵挛)；骨骺发育不良、多发、伴有近视和传导性耳聋；心脏传导缺陷，非特异性；鳃耳综合征2和3；过氧化物酶体生物发生障碍14B、2A、4A、5B、6A、7A和7B；家族性肾性糖尿；念珠菌病，家族性，2、5、6和8；自身免疫性疾病，多系统，婴儿发病；婴儿早期癫痫性脑病2、4、7、9、10、11、13和14；Segawa综合征，常染色体隐性遗传；耳聋，常染色体显性遗传3a、4、12、13、15，常染色体显性非综合征性感觉神经性17、20和65；先天性红细胞生成异常性贫血，I型和II型；增强的s锥综合征；成人神经元蜡样脂褐质沉积症；心房颤动，家族性，11、12、13和16；诺卢姆(Norum)病；骨肉瘤；部分白化病；生物素酶缺乏症；细胞和体液免疫复合缺陷伴肉芽肿；阿佩尔氏(Alpers)脑病；全羧化酶合成酶缺乏症；青少年、1型、2型、11型、3型和9型的成熟期糖尿病；变异性卟啉症；婴儿性骨皮质增生症；睾酮17-β-脱氢酶缺乏症；L-2-羟基戊二酸尿症；酪氨酸酶阴性眼皮肤白化病；原发性纤毛运动障碍24；4型脑桥小脑发育不全；睫状体运动障碍，原发性、7、11、15、20和22；基底核钙化症5；脑萎缩；颅缝早闭1和4；圆锥角膜1；皮肤病；先天性肾上腺增生和先天性肾上腺发育不良，X连锁；线粒体DNA耗竭综合征11、12(心肌病型)、2、4B(MNGIE型)、8B(MNGIE型)；患有高血压的短指；扁平角膜2；阿斯科格(Aarskog)综合征；多发性骨骺发育不良5或显性；角膜内皮营养不良2型；氨基酰化酶1缺乏症；言语和语言发育迟缓；Nicolaides-Baraitser综合征；肠激酶缺乏症；先天性缺指、外胚层发育不良和唇裂/腭裂综合征3；先天性多发性关节挛缩症，远端，X连锁；波瑞特(Perrault)综合征4；耶-兰(Jervell和Lange-Nielsen)综合征2；遗传性非息肉病性结直肠肿瘤；胎儿面容综合征，常染色体隐性遗传，常染色体隐性遗传，伴有短距先天性并(多)指(趾)；神经纤维肉瘤；细胞色素-c氧化酶缺乏症；膀胱输尿管反流8；多巴胺β羟化酶缺乏症；I型和II型碳水化合物缺乏糖蛋白综合征；进行性家族性肝内胆汁淤积3；良性家族性新生儿-婴儿癫痫发作；胰腺炎，慢性，易感；肢近端型点状软骨发育不良2型和3型；由于细胞色素p450氧化还原酶缺乏导致的类固醇生成紊乱；耳聋伴膜迷路发育不全和小齿畸形耳聋(FAMM)；罗斯蒙德-汤姆森(Rothmund-Thomson)综合征；皮层发育不良、复杂型、伴有其他脑部畸形5和6；肌无力，家族性婴儿型，1；I型毛发鼻指骨发育不良；Worth疾病；脾发育不全；钼辅因子缺乏，互补组A；塞巴斯蒂安(Sebastian)综合征；进行性家族性肝内胆汁淤积2和3；韦尔-马切萨尼(Weill-Marchesani)综合征1和3；2型小头骨发育不良原始侏儒症；肺部表面活性剂代谢功能障碍2和3；重型X连锁肌管性肌病；胰腺癌3；血小板型出血性障碍15和8；酪氨酸酶阳性眼皮肤白化病；Borrone Di Rocco Crovato综合征；ATR-X综合征；蔗糖酶-异麦芽糖酶缺乏症；补体成分4，部分缺乏，由于cl抑制剂功能失调；先天性中枢性通气不足；婴儿低磷酸酯酶症；纤溶酶原激活物抑制剂1型缺乏症；非霍奇金恶性淋巴瘤；高鸟氨酸血症-高氨血症-同型瓜氨酸尿综合征；施詹二氏(Schwartz Jampel)综合征1型；胎儿血红蛋白数量性状基因座1；远端肌病伴胫骨前部发病；努南(Noonan)综合征1和4，豹皮综合征1；青光眼1，开角型，e、F和G；肯尼-卡菲(Kenny-Caffey)综合征2型；PTEN错构瘤综合征；杜氏(Duchenne)肌营养不良；胰岛素抵抗性糖尿病和黑棘皮病；小眼炎，孤立的3、5、6、8和伴缺损6；莱恩(Raine)综合征；卵巢早衰4、5、7和9；艾伦-赫恩登-达得利(Allan-Hemdon-Dudley)综合征；I型瓜氨酸血症；阿尔茨海默病，家族性，3，伴有痉挛性下肢轻瘫和失用症；家族性偏瘫偏头痛1型和2型；伴有囊性肾病的心包肿大；弹性假黄瘤；由于MTHFR缺乏、CBS缺乏和同型半胱氨酸尿症引起的同型半胱氨酸血症，吡哆醇反应性；扩张型心肌病1A、1AA、1C、1G、IBB、1DD、IFF、1HH、II、IKK、IN、IS、1Y、和3B；肌肉AMP鸟嘌呤氧化酶缺乏症；家族性乳腺癌；遗传性铁粒幼细胞性贫血；肌红蛋白尿，急性复发性，常染色体隐性遗传；神经铁蛋白病；心律失常；葡萄糖转运蛋白1型缺乏综合征；前脑无裂序列征；血管病，遗传性，伴有肾病、动脉瘤和肌肉痉挛；异戊酰辅酶A脱氢酶缺乏症；卡尔曼(Kallmann)综合征1、2和6；永久性新生儿糖尿病；肢端胼胝体综合征，Schinzel型；戈登(Gordon)综合征；MYH9相关障碍；唐纳-巴罗(Donnai Barrow)综合征；重度先天性中性粒细胞缺乏症6，常染色体隐性；夏科-马里-图思(Charcot-Marie-Tooth)病，ID型和IVF型；科-勒(Coffin-Lowry)综合征；线粒体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶缺乏症；低镁血症、癫痫发作和智力低下；坐骨髌骨发育不良；多发性先天性异常-张力减退-癫痫发作综合征3；痉挛性截瘫50，常染色体隐性遗传；具有非特异性骨骼异常的身材矮小；婴儿重症肌阵挛性癫痫；丙酸血症；青少年肾单位肾痨；大头畸形、巨大儿、面部畸形综合征；斯特格(Stargardt)病4；埃勒斯-当洛综合征7型(常染色体隐性遗传)、经典型、2型(早衰症)、羟赖氨酸缺陷型、4型、4型变异型，以及由于生腱蛋白-X缺乏所致；近视眼6；扁平髋；家族性感冒自身炎症综合征2；心脏和大血管畸形；血管假性血友病2M型和3型；半乳糖激酶缺乏症；布鲁加达(Brugada)综合征1；X-连锁鱼鳞病伴甾醇硫酸酯酶缺乏症；先天性眼缺损；组织细胞增多症-淋巴结病综合征；无虹膜、小脑共济失调和智力低下；左室心肌致密化不全3；肌萎缩侧索硬化1、6、15型(伴有或不伴有额颞叶痴呆)、22型(伴有或不伴有额颞叶痴呆)和10型；成骨不全12型、5型、7型、8型、I型、III型，巩膜正常，显性型，隐性围产期致死；血液系统肿瘤；蚕豆病，易感性；肺纤维化和/或骨髓衰竭，端粒相关，1和3；显性遗传性视神经萎缩；显性营养不良性大疱性表皮松解症，无皮肤；肌营养不良，先天性，巨锥型；多发性胃肠道闭锁；奥尔布赖特(McCune-Albright)综合征；指甲髌骨综合征；麦克劳德(McLeod)神经棘红细胞增多症综合征；普通变化型免疫缺陷病9；部分次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症；假性醛固酮减少症1型常染色体显性和隐性遗传和2型；尿苷酸水合酶缺乏症；异位；麦克(Meckel)综合征7型；小儿先天性白细胞颗粒异常综合征(Ch\xc3\xa9diak-Higashi syndrome)，契-东(Chediak-Higashi)综合征，成人型；ADA缺乏导致的严重联合免疫缺陷，伴有小头畸形、生长迟缓、对电离辐射敏感、非典型、常染色体隐性遗传、T细胞阴性、B细胞阳性、NK细胞阴性或NK阳性；胰岛素抵抗性；类固醇11-β-单加氧酶缺乏；腘翼状胬肉综合征；与遗传性出血性毛细血管扩张症相关的肺动脉高压；耳聋，常染色体隐性遗传1A、2、3、6、8、9、12、15、16、18b、22、28、31、44、49、63、77、86、和89；原发性高草酸尿症，I型，类型和III型；冯·尤伦伯格(von Eulenburg)先天性副肌强直；狄布寇斯(Desbuquois)综合征；肉毒碱脂酰转移酶I、II、II(迟发性)和II(婴儿)缺乏症；继发性甲状腺功能减退症；下颌面骨发育不全，特雷彻·柯林斯(Treacher Collins)型，常染色体隐性遗传；考登(Cowden)综合征1；李-佛美尼(Li-Fraumeni)综合征1；天冬酰胺合成酶缺乏症；Malattialeventines；视神经萎缩9；婴儿惊厥和阵发性舞蹈手足徐动症，家族性；缺乏维生素E的共济失调；胰岛细胞增生；三好氏(Miyoshi)肌营养不良1；血栓形成倾向，遗传性，由于蛋白C缺乏，常染色体显性和隐性；费希特纳(Fechtner)综合征；备解素缺乏，X连锁；智力低下、刻板运动、癫痫和/或脑畸形；肌酸缺乏，X连锁；毛母质瘤；发绀，短暂性新生儿和非典型肾病；成人发作性动眼不能共济失调综合征；血管瘤，毛细血管瘤；PC-K6a；全身性显性营养不良性大疱性表皮松解症；佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher)；肌病，中心核，1，先天性，肌梭过多，远端，1，乳酸酸中毒和铁粒幼细胞性贫血1，线粒体进行性伴先天性白内障，听力损失和发育迟缓，管状聚集，2；良性家族性新生儿惊厥1和2；原发性肺动脉高压；原发性淋巴水肿伴骨髓增生异常；先天性长QT综合征；家族性渗出性玻璃体视网膜病变，X连锁；常染色体显性少汗性外胚层发育不良；原始侏儒症；家族性肺毛细血管瘤病；肉碱酰基肉碱转氨酶缺乏症；内脏肌病；家族性地中海热和家族性地中海热病，常染色体显性遗传；合并部分和完全17-α-羟化酶/17,20-裂解酶；耳腭指综合征，I型；肾结石/骨质疏松症，低磷血症，2；家族性1型和3型高脂蛋白血症；表型；CHARGE联合畸形；福尔曼(Fuhrmann)综合征；稀发症-淋巴水肿-毛细血管扩张综合征；软骨发育不良Blomstrand型；Acroerythrokeratoderma；神经传导速度减慢，常染色体显性遗传；遗传性癌症易感综合征；颅骨干发育不良，常染色体显性遗传；脊髓小脑性共济失调常染色体隐性遗传1和16；蛋白质原转换酶1/3缺乏症；D-2-羟基戊二酸尿症2；惊跳症2和遗传性惊跳症；中央轴突症；Opitz G/BBB综合征；囊性纤维化；蜂窝状角膜营养不良；双磷酸甘油酸变位酶缺乏；线粒体短链烯酰辅酶A水合酶1缺乏症；外胚层发育不良皮肤脆性综合征；沃尔弗拉姆(Wolfram)样综合征，常染色体显性遗传；小细胞性贫血；丙酮酸羧化酶缺乏症；白血球黏着不足I型和III型；多发性内分泌腺瘤，类型4；新生儿暂时性大疱性皮肤松解症；Primrose综合征；非小细胞肺癌；先天性肌营养不良症；混合型酯酶缺陷症；科尔卡彭特(COLE-CARPENTER)综合征2；房室间隔缺损和普通房室交界处；黄嘌呤氧化酶缺乏；瓦登伯革氏(Waardenburg)综合征1、4C和2E型(伴有神经系统受累)；斯蒂克勒(Stickler)综合征，l型(非综合征眼)和4型；角膜脆性角膜球、蓝色巩膜和关节活动过度；小球形晶状体；Chudley-McCullough综合征；单纯型大疱性表皮松解症和肢带型肌营养不良症，单纯性斑驳色素沉着，单纯性有幽门闭锁，单纯性，常染色体隐性遗传，有幽门闭锁；雷特(Rett)障碍；神经元迁移异常；垂体异常的生长激素缺乏症；亚急性坏死性脑脊髓病；掌跖角化症纹状体1；魏森巴赫-茨威穆勒(Weissenbacher-Zweymuller)综合征；中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症；UDP葡糖-4-差向异构酶缺乏症；自闭症易感性，X连锁3；孔源性视网膜脱离，常染色体显性遗传；家族性热性惊厥8；尺骨和腓骨缺乏严重肢体缺陷；左室心肌致密化不全6；染色体1,9和16的着丝粒不稳定性和免疫缺陷；具有球状体的遗传性弥漫性白质脑病；库欣(Cushing)综合征；多巴胺受体d2，脑密度降低；C样综合征；肾发育不良、视网膜色素营养不良、小脑共济失调和骨骼发育不良；卵巢发育不全1；皮尔森(Pierson)综合征；多发性神经病、听力损失、共济失调、色素性视网膜炎和白内障；进行性肝内胆汁淤积；常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁隐性奥尔波特(Alport)综合征；安格尔曼(Angelman)综合征；阿米什(Amish)婴儿癫痫综合征；自身免疫性淋巴增生综合征，la型；脑积水；类马方氏综合征(Marfanoid habitus)；巴尔(Bare)淋巴细胞综合征2型，互补组E；隐性营养不良性大疱性表皮松解症；因子H、VII、X、v和因子viii，2、xiii、亚基的联合缺乏；板层粉状白内障3；疣、低丙种球蛋白血症、感染和骨髓增生异常；良性遗传性舞蹈病；透明质酸葡糖胺酶缺乏；小头畸形、裂孔疝和肾病综合征；生长发育与智力低下、下颌面部发育不良、小头畸形和腭裂；淋巴水肿，遗传性，id；青春期延迟；表征性盐皮质激素增多症；婴儿期全身动脉钙化2；甲基丙二酸尿症，mut(0)型；先天性心脏病，多种类型，2个；家族性发育不全，肾小球囊肿性肾病；脑-眼-面-骨骼综合征2；斯特格(Stargardt)病1；智力低下，常染色体隐性遗传15、44、46和5；脯肽酶缺乏症；甲基丙二酸尿症cblB型，；小口氏病；内分泌-脑骨发育异常；无脑畸形1、2(X连锁)、3、6(小头畸形)、X连锁；生长激素细胞腺瘤；Gamstorp-Wohlfart综合征；脂质蛋白沉积症；包涵体肌病2和3；前庭导水管扩大综合征；骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征；获得性长QT综合征；苯丙酮尿症；CHOPS综合征；整体发育迟缓症；结晶样视网膜变性；伴有或不伴有幼年型粒单核细胞白血病的努南(Noonan)综合征样疾病；先天性生血性卟啉症；遗传性眼球萎缩；副神经节瘤3；唇腭裂综合征；芳香环转化酵素缺乏症；Birk Barel智力障碍性畸形综合征；5型肌萎缩侧索硬化症；高铁血红蛋白症I型1和2；先天性静止性夜盲症，1A型、IB型、1C型、IE型、IF型和2A型；癫痫发作；甲状腺癌，滤泡性；致死性先天性挛缩综合征6；远端遗传性运动神经元病2B型；性索-间质肿瘤；癫痫性脑病，儿童期发病，婴儿早期，1、19、23、25、30和32；肌原纤维肌病1和ZASP相关；婴儿小脑性共济失调伴进行性眼外肌麻痹；嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症；前脑缺陷；年龄依赖性癫痫性脑病；肥胖；4、左心室致密化不全10；Verheij综合征；Mowat-Wilson综合征；Odontotrichomelic综合征；视网膜色素上皮的斑状营养不良；Lig4综合征；巴拉卡特(Barakat)综合征；IRAK4缺乏；生长激素细胞腺瘤；支链酮酸脱氢酶激酶缺乏症；胱氨酸尿症；家族性蚓发育不良；琥珀酰-辅酶A乙酰乙酸转移酶缺乏症；肩腓型脊髓性肌萎缩；色素性视网膜变性；格兰兹曼(Glanzmann)血小板无力症；青少年原发性开角型青光眼1；Aicardi Goutieres综合征1、4和5；肾发育不良；宫内发育迟缓、干骺端发育不良、先天性肾上腺发育不全、生殖器异常；念珠状毛；身材矮小、趾甲发育不良、面部畸形和稀发症；异染性脑白质营养不良；胆甾烷醇贮积病；三M综合征2；莱伯氏(Leber)先天性黑蒙症11、12、13、16、4、7、9；下颌骨发育不良伴A型或B型脂肪营养不良，非典型；美尔戈林(Meier-Gorlin)综合征4；稀发症8和12；短QT综合征3；外胚层发育不良l ib；无甲症；1A型假性甲状旁腺功能减退症，假性甲状旁腺功能减退症；莱伯(Leber)视神经萎缩；班布里奇-罗珀斯(Bainbridge-Ropers)综合征；韦弗(Weaver)综合征；身材矮小、耳道闭锁、下颌骨发育不良、骨骼异常；缺乏α-甘露糖苷酶；黄斑营养不良，卵黄状，成人发病；戊二酸尿症，1型；神经节苷脂沉着症GM1型(心脏受累)3；下颌骨发育不良；I型遗传性淋巴水肿；心房静止2；歌舞伎面谱综合征；Bethlem(伯利恒)肌病和Bethlem(伯利恒)肌病2；髓过氧化物酶缺乏症；斑点状角膜营养不良；遗传性肠病性肢端皮炎；与apob32相关的家族性低β脂蛋白血症；科凯恩(Cockayne)综合征A型，；甲状旁腺功能亢进，新生儿重症；共济失调-毛细血管扩张样障碍；彭德莱(Pendred)综合征；I血型系统；家族性良性天疱疮；内脏异位5，常染色体；肾性尿崩症，肾性尿崩症，X连锁；伴有眼外肌麻痹的小核肌病；佩里(Perry)综合征；少汗/头发/牙齿型，常染色体隐性遗传；遗传性胰腺炎；智力低下和小头畸形伴脑桥和小脑发育不全；糖原贮积病0(肌肉)、II(成人型)、IXa2、IXc、1A型；颅骨硬化纹状骨病；谷胱甘肽合成酶缺乏症；布鲁格达氏(Brugada)综合征和布鲁格达氏(Brugada)综合征4；子宫内膜癌；伴有免疫缺陷的少汗性外胚层发育不良；胆汁淤积，肝内，妊娠3；伯-苏氏(Bemard-Soulier)综合征，A1和A2型(常染色体显性遗传)；唾液酸贮积病；鸟氨酸氨基转移酶缺乏症；PTEN错构瘤综合征；Distichiasis-淋巴水肿综合征；皮质类固醇结合球蛋白缺乏症；成人神经元蜡样脂褐质沉积症；德热里纳-索塔斯(Dejerine-Sottas)病；先天性四肢切断综合征(Tetraamelia)，常染色体隐性遗传；赛尼奥-洛肯(Senior-Loken)综合征4和5，；戊二酸血症IIA和IIB；主动脉瘤，家族性胸4、6和9；伴有精神发育迟滞综合征2、3和4的高磷酸盐血症；X连锁先天性角化不良；关节挛缩症、肾功能不全和胆汁淤积2；斑纳扬—赖利—鲁瓦尔卡巴(Bannayan-Riley-Ruvalcaba)综合征；3-甲基戊二酸尿症；孤立的17,20-裂解缺乏症；戈林(Gorlin)综合征；手足子宫综合征；泰赛二氏(Tay-Sachs)病，B1变异，Gm2-神经节苷脂沉积症(成人)，Gm2-神经节苷脂沉积症(成人发病)；道林-德戈斯(Dowling-degos)病4；帕金森病14、15、19(青少年发病)、2、20(早发)、6、(常染色体隐性早发)和9；感觉共济失调，常染色体显性遗传；先天性微绒毛萎缩；肌阵挛-失张力性癫痫；丹吉尔(Tangier)病；2-甲基-3-羟基丁酸尿症；家族性肾性低尿酸血症；脑裂畸形；线粒体DNA耗竭综合征4B，MNGIE型；芬戈尔德(Feingold)综合征1；肾性肉毒碱转运缺陷；家族性高胆固醇血症；Townes-Brocks-branchiootorenal样综合征；格里瑟里(Griscelli)综合征3型；梅克尔–格鲁贝尔(Meckel-Gruber)综合征；大疱性鱼鳞病样红皮病；中性粒细胞免疫缺陷综合征；肌无力综合征，先天性，17、2A(慢通道)、4B(快通道)，无管状聚集体；糖尿病的微血管并发症7；McKusickKaufman综合征；慢性肉芽肿病，常染色体隐性遗传细胞色素b阳性，1型和2型；精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症；线粒体磷酸盐载体和丙酮酸载体缺乏；晶格状角膜营养不良III型；外胚层发育不良-并指综合征1；低髓性脑白质营养不良7；智力低下，常染色体显性遗传12、13、15、24、3、30、4、5、6和9；全身性癫痫伴热性惊厥加，1型和2型；银屑病易感性2；弗兰克·特哈尔(Frank Ter Haar)综合征；胸主动脉瘤和主动脉夹层；克鲁宗(Crouzon)综合征；卵巢粒层细胞瘤；表皮松解性掌跖角化病；勒里-威尔(Leri Weill)软骨发育不良；3β-羟基类固醇脱氢酶缺乏症；家族性限制性心肌病1；具有线粒体DNA缺失1和3的常染色体显性进行性眼外肌麻痹；伴有生殖器异常和类固醇生成紊乱的比克斯勒综合征(Antley-Bixler)综合征；遗传性骨发育不良并肢端溶骨症；色素性结节性肾上腺皮质疾病，原发性，1；发作性疼痛综合征，家族性，3；德热里纳-索塔斯(Dejerine-Sottas)综合征，常染色体显性；FG综合征和FG综合征4；树突状细胞、单核细胞、B淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞缺乏症；甲状腺功能减退，先天性，非甲状腺肿，1；米勒(Miller)综合征；线状体肌病3和9；少齿-结直肠癌综合征；寒性出汗综合征1；Van Buchem病2型；青光眼3，原发性先天性，d；I型和II型瓜氨酸血症；Nonaka肌病；由于部分LAMA2缺乏导致的先天性肌营养不良症；神经性胃肠道脑病综合征；由于线粒体复合物I缺乏导致的亚急性坏死性脑脊髓病；髓母细胞瘤；丙酮酸脱氢酶El-α缺乏症；结肠癌；南斯-霍兰(Nance-Horan)综合征；桑霍夫(Sandhoff)病，成人和婴儿型；关节挛缩症肾功能不全胆汁淤积综合征；常染色体隐性遗传性低磷性骨病；多英蜂窝状视网膜营养不良；脊髓小脑性共济失调14、21、35、40和6；路易体痴呆；RRM2B相关的线粒体疾病；布罗迪氏(Brody)病；巨脑-多小脑回-多指-脑积水综合征2；乌谢尔(Usher)综合征，1型、IB、ID、1G、2A、2C、和2D；钙化不全型和成熟不足型，IIA1牙釉质发育不全；垂体激素缺乏，联合1、2、3和4；库欣(Cushing)共生主义；肾小管酸中毒，远端，常染色体隐性遗传，迟发性感觉神经性听力损失，或溶血性贫血；婴儿肾单位肾痨；幼年性息肉病综合征；感觉共济失调性神经病、构音障碍和眼肌瘫痪；3-羟酰基-辅酶A脱氢酶缺乏症；甲状旁腺癌；X连锁无丙种球蛋白血症；巨幼细胞性贫血，硫胺素反应性，糖尿病和感觉神经性耳聋；多发性硫酸酯酶缺乏症；伴有大脑内铁沉积4和6的神经变性；胆固醇单加氧酶(侧链切割)缺乏症；腺苷酸基琥珀酸裂解酶缺乏引起的溶血性贫血；伴有参差不齐的红色纤维的癫痫肌阵挛；皮特-霍普金斯(Pitt-Hopkins)综合征；多发性翼状胬肉综合征Escobar型；同型半胱氨酸尿症-由于钴胺素代谢缺陷导致的巨幼细胞性贫血，cblE互补型；胆囊炎；4型和5型球形红细胞增多症；多种先天性异常；色素性干皮病，互补组b、组D、组E和组G；雷纳(Leiner)综合征；Groenouw角膜营养不良I型；辅酶Q10缺乏，原发性1、4和7；远端脊髓性肌萎缩，先天性非进行性；华宝(Warburg)微综合征2和4；胆汁酸合成缺陷，先天性，3；ACTH非依赖性肾上腺大结节样增生2；顶股骨发育不良；家族性佩吉特(Paget)骨病；严重的新生儿脑病伴小头畸形；齐默尔曼-拉班德(Zimmermann-Laband)综合征和齐默尔曼-拉班德(Zimmermann-Laband)综合征2；赖芬斯坦(Reifenstein)综合征；家族性低钾血症-低镁血症；光敏性毛发硫营养不良；成人结合部大疱性表皮松解症；肺癌；弗里曼-谢尔顿(Freeman-Sheldon)综合征；高胰岛素血症-高氨血症综合征；2型后极性白内障；巩膜化角膜，常染色体隐性遗传；幼年GM>1<神经节苷脂沉积症；科恩(Cohen)综合征，；遗传性副神经节瘤-嗜铬细胞瘤综合征；新生儿胰岛素依赖型糖尿病；软骨发育不良；浮港(Floating-Harbor)综合征；患有骨营养不良和严重的肺部、胃肠道和泌尿系统异常的皮肤松弛；四肢和面部的先天性挛缩、肌张力减退和发育迟缓；先天性角化不良常染色体显性遗传和常染色体显性遗传，3；组织细胞性髓质网状组织增生症；克斯提洛氏(Costello)弹性蛋白缺陷症；免疫缺陷15、16、19、30、31C、38、40、8，由于cd3-zeta缺陷，1型和2型高IgM，以及X连锁，镁缺陷，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染和瘤形成；房间隔缺损2、4和7(伴有或不伴有房室传导缺陷)；GTP环水解酶I缺乏症；马蹄内翻足；磷酸甘油酸激酶1缺乏症；结节性硬化症1和2；常染色体隐性先天性鱼鳞病1、2、3、4A和4B；和家族性肥厚型心肌病1、2、3、4、7、10、23和24。
组织适应症
可以通过本文提供的系统和方法治疗的其他合适的疾病和障碍包括但不限于中枢神经系统(CNS)疾病(参见表13中的示例性疾病和受影响的基因)、眼睛疾病(参见表14中的示例性疾病和受影响的基因)、心脏疾病(参见表15中的示例性疾病和受影响的基因)，造血干细胞疾病(HSC)(参见表16中的示例性疾病和受影响的基因)、肾脏疾病(参见表17中的示例性疾病和受影响的基因)、肝脏疾病(参见表18中的示例性疾病和受影响的基因)、肺部疾病(参见表19中的示例性疾病和受影响的基因)、骨骼肌疾病(参见表20中的示例性疾病和受影响的基因)和皮肤疾病(参见表21中的示例性疾病和受影响的基因)。表22提供了降低指定疾病风险的示例性保护性突变。在一些实施例中，本文描述的Gene Writer系统用于治疗表13-21中任一个的适应症。在一些实施例中，GeneWriter系统修饰细胞中基因组DNA中的靶位点，其中靶位点在表13-21中任一个的基因中，例如在具有表13-21中任一个中列出的相应适应症的受试者中的基因。在一些实施例中，GeneWriter校正基因中的突变。在一些实施例中，GeneWriter插入已经从基因中缺失(例如，通过引起疾病的突变)的序列。在一些实施例中，GeneWriter缺失已在基因中复制(例如，通过引起疾病的突变)的序列。在一些实施例中，GeneWriter用相应的野生型序列替换突变(例如，引起疾病的突变)。在一些实施例中，突变是取代、插入、缺失或倒位。
表13.受到影响的中枢神经系统疾病和基因。
表14.受到影响的眼部疾病和基因。
| 疾病 | 受影响的基因 |
| 色盲 | CNGB3 |
| 先天性黑蒙(LCA1) | GUCY2D |
| 先天性黑蒙(LCA10) | CEP290 |
| 先天性黑蒙(LCA2) | RPE65 |
| 先天性黑蒙(LCA8) | CRB1 |
| 无脉络膜血症 | CHM |
| 锥体杆体营养不良(ABCA4) | ABCA4 |
| 锥体杆体营养不良(CRX) | CRX |
| 锥体杆体营养不良(GUCY2D) | GUCY2D |
| 非肾病性胱氨酸眼病 | CTNS |
| 晶格状角膜营养不良I型 | TGFBI |
| 斑点状角膜营养不良(MCD) | CHST6 |
| 视神经萎缩 | OPA1 |
| 色素性视网膜炎(AR) | USH2A |
| 色素性视网膜炎(AD) | RHO |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 |
| 卵黄状黄斑营养不良 | BEST1；PRPH2 |
表15.受到影响的心脏病和基因。
表16.受到影响的HSC疾病和基因。
表17.受影响的肾脏疾病和基因。
| 疾病 | 受影响的基因 |
| 奥尔波特(Alport)综合征 | COL4A5 |
| 常染色体显性多囊肾病(PKD1) | PKD1 |
| 常染色体显性多囊肾病(PKD2) | PDK2 |
| 常染色体显性肾小管间质性肾病(MUC1) | MUC1 |
| 常染色体显性肾小管间质性肾病(UMOD) | UMOD |
| 常染色体隐性多囊肾病 | PKHD1 |
| 先天性肾病综合征 | NPHS2 |
| 胱氨酸病 | CTNS |
表18.受影响的肝脏疾病和基因。
表19.受影响的肺部疾病和基因。
表20.受到影响的骨骼肌疾病和基因。
| 疾病 | 受影响的基因 |
| 贝克肌营养不良 | DMD |
| 贝克肌强直 | CLCN1 |
| 贝特莱姆肌病(Bethlem myopathy) | COL6A2 |
| 中央核肌病，X连锁(肌管型) | MTM1 |
| 先天性肌无力综合征 | CHRNE |
| 进行性假肥大性肌营养不良 | DMD |
| 埃默里-德赖弗斯肌营养不良，AD | LMNA |
| 面肩肱型肌营养不良 | DUX4-D4Z4染色体区域 |
| 高钾性周期性麻痹 | SCN4A |
| 低钾性周期性麻痹 | CACNA1S |
| 肢带肌营养不良2A | CAPN3 |
| 肢带型肌营养不良2B | DYSF |
| 肢带肌营养不良，2D型 | SGCA |
| 三好氏肌营养不良1 | DYSF |
| 先天性副肌强直 | SCN4A |
| 汤姆森(Thomsen)肌强直 | CLCN1 |
| VCP肌病(IBMPFD)1 | VCP |
表21.受影响的皮肤病和基因。
表22.降低疾病风险的示例性保护性突变。
致病突变
在一些实施例中，本文提供的系统或方法可用于校正致病突变。致病突变可以是增加个体对某种疾病或病症的易感性或易染性的基因突变。在一些实施例中，致病突变是与疾病或障碍相关的基因中的引起疾病的突变。在一些实施例中，本文提供的系统或方法可用于将致病突变恢复为其野生型对应物。在一些实施例中，本文提供的系统或方法可用于将致病突变改变为不引起疾病或障碍的序列。
表23提供了示例性适应症(第1栏)、潜在基因(第2栏)和可以使用本文所述系统或方法校正的致病突变(第3栏)。
表23.适应症、基因和致病突变。
| 疾病 | 基因 | 致病突变# |
| 色盲 | CNGB3 | 1148delC |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | E342K |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | E342K |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | R48C(R79C) |
| 先天性黑蒙(LCA10) | CEP290 | 2991+1655A>G |
| 安徒生-泰维勒(Andersen-Tawil)综合征 | KCNJ2 | R218W |
| 致心律失常性右心室心肌病(ARVC) | PKP2 | c.235C>T |
| 与先天性因子XI缺乏有关 | F11 | E117* |
| 与先天性因子XI缺乏有关 | F11 | F283L |
| ATTR淀粉样变性 | TTR | V50M/N30M |
| 常染色体显性耳聋 | COCH | G88E |
| 常染色体显性耳聋 | TECTA | Y1870C |
| 常染色体显性帕金森病 | SNCA | A53T |
| 常染色体显性帕金森病 | SNCA | A30P |
| 常染色体显性佝偻病 | FGF23 | R176Q |
| 常染色体隐性耳聋 | CX30 | T5M |
| 常染色体隐性耳聋 | DFNB59 | R183W |
| 常染色体隐性耳聋 | TMC1 | Y182C |
| 常染色体隐性高胆固醇血症 | ARH | Q136* |
| 布-戴二氏贫血(Blackfan-Diamond) | RPS19 | R62Q |
| 蓝锥单色性 | OPN1LW | C203R |
| 布鲁加达(Brugada)综合征 | SCN5A | E1784K |
| CADASIL综合征 | NOTCH3基因 | R90C |
| CADASIL综合征 | NOTCH3基因 | R141C |
| 卡纳万(Canavan)病 | ASPA | E285A |
| 卡纳万(Canavan)病 | ASPA | Y231X |
| 卡纳万(Canavan)病 | ASPA | A305E |
| 肉毒碱脂酰转移酶II缺乏症 | CPT2 | S113L |
| 无脉络膜血症 | CHM | R293* |
| 无脉络膜血症 | CHM | R270* |
| 无脉络膜血症 | CHM | A117A |
| I型瓜氨酸血症 | ASS | G390R |
| 经典半乳糖血症 | GALT | Q188R |
| 典型的同型半胱氨酸尿症 | CBS | T191M |
| 疾病 | 基因 | 致病突变# |
| 典型的同型半胱氨酸尿症 | CBS | G307S |
| CLN2疾病 | TPP1 | c.509-1G>C |
| CLN2疾病 | TPP1 | c.622C>T |
| CLN2疾病 | TPP1 | c.851G>T |
| 锥体杆体营养不良 | GUCY2D | R838C |
| 先天性V因子缺乏症 | F5 | R506Q |
| 先天性V因子缺乏症 | F5 | R534Q |
| 先天性VII因子缺乏症 | F7 | A294V |
| 先天性VII因子缺乏症 | F7 | C310F |
| 先天性VII因子缺乏症 | F7 | R304Q |
| 先天性VII因子缺乏症 | F7 | QI00R |
| 克雅氏病(CJD) | PRNP | E200K |
| 克雅氏病(CJD) | PRNP | M129V |
| 克雅氏病(CJD) | PRNP | P102L |
| 克雅氏病(CJD) | PRNP | D178N |
| 囊性纤维化 | CFTR | G551D |
| 囊性纤维化 | CFTR | W1282* |
| 囊性纤维化 | CFTR | R553* |
| 囊性纤维化 | CFTR | R117H |
| 囊性纤维化 | CFTR | δF508 |
| 胱氨酸病 | CTNS | W138* |
| 达里耶(Darier)病 | ATP2A2 | N767S |
| 达里耶(Darier)病 | ATP2A2 | N767S |
| 达里耶(Darier)病 | ATP2A2 | N767S |
| 交界型大疱性表皮松解症 | LAMB3 | R42X |
| 交界型大疱性表皮松解症 | LAMB3 | R635X |
| 家族性肌萎缩侧索硬化症(ALS) | SOD1 | A4V |
| 家族性肌萎缩侧索硬化症(ALS) | SOD1 | H46R |
| 家族性肌萎缩侧索硬化症(ALS) | SOD1 | G37R |
| 戈谢病 | GBA | N370S |
| 戈谢病 | GBA | N370S |
| 戈谢病 | GBA | L444P |
| 戈谢病 | GBA | L444P |
| 戈谢病 | GBA | L483P |
| 疾病 | 基因 | 致病突变# |
| 戊二酰辅酶A脱氢酶缺乏症 | GCDH | R138G |
| 戊二酰辅酶A脱氢酶缺乏症 | GCDH | M263V |
| 戊二酰辅酶A脱氢酶缺乏症 | GCDH | R402W |
| 甘氨酸脑病 | GLDC | A389V |
| 甘氨酸脑病 | GLDC | G771R |
| 甘氨酸脑病 | GLDC | T269M |
| 血友病A | F8 | R2178C |
| 血友病A | F8 | R550C |
| 血友病A | F8 | R2169H |
| 血友病A | F8 | R1985Q |
| 血友病B | F9 | T342M |
| 血友病B | F9 | R294Q |
| 血友病B | F9 | R43Q |
| 血友病B | F9 | R191H |
| 血友病B | F9 | G106S |
| 血友病B | F9 | A279T |
| 血友病B | F9 | R75* |
| 血友病B | F9 | R294* |
| 血友病B | F9 | R379Q |
| 遗传性抗凝血酶缺乏症I型 | SERPINCI | R48C(R79C) |
| 遗传性慢性胰腺炎 | PRSS1 | R122H |
| 亨特综合征 | IDS | R88C |
| 亨特综合征 | IDS | G374G |
| 胡尔勒(Hurler)综合征(MPS1) | IDUA | Q70* |
| 胡尔勒(Hurler)综合征(MPS1) | IDUA | W402* |
| 高钾性周期性麻痹 | SCN4A | T704M |
| 高钾性周期性麻痹 | SCN4A | M1592V |
| 高钾性周期性麻痹 | CACNA1S | p.Arg528X |
| 高钾性周期性麻痹 | CACNA1S | p.Arg1239 |
| 间歇性卟啉症 | HMBS | Rl73W |
| 孤立性无丙种球蛋白血症 | E47 | E555K |
| 晶格状角膜营养不良I型 | TGFBI | Arg124Cys |
| LCHAD缺乏症 | HADHA | Glu474Gln |
| 莱伯氏先天性黑蒙症2 | RPE65 | R44* |
| 疾病 | 基因 | 致病突变# |
| 莱伯氏先天性黑蒙症2 | RPE65 | IVS1 |
| 莱伯氏先天性黑蒙症2 | RPE65 | G-A,+5 |
| 莱施-奈恩综合征 | HPRTI | R51* |
| 莱施-奈恩综合征 | HPRTI | R170* |
| 肢带肌营养不良，2D型 | SGCA | Arg77Cys |
| 粘多糖沉积病Ⅵ型综合征(MSPVI) | ARSB | Y210C |
| 地中海G6PD缺乏症 | G6PD | S188D |
| 中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 | ACADM | K329E |
| 中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 | ACADM | K329E |
| 中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 | ACADM | K329E |
| Meesmann角膜上皮营养不良 | KRT12 | L132P |
| 异染性脑白质营养不良 | ARSA | P426L |
| 异染性脑白质营养不良 | ARSA | c.459+1G>A |
| 莫基奥(Morquio)综合征(MPSIVA) | GALNS | R386C |
| 粘脂贮积病IV型 | MCOLN1 | 406-2A>G |
| 粘脂贮积病IV型 | MCOLN1 | 511_6943del |
| 尼曼-匹克氏(Neimann-Pick)病A型 | SMPDI | L302P |
| 神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL) | CLN2 | R208* |
| 神经元蜡样脂褐质沉积症1 | PPT1 | R151* |
| 帕金森氏病 | LRRK2 | G2019S |
| 彭德莱(Pendred)综合征 | PDS | T461P |
| 彭德莱(Pendred)综合征 | PDS | L236P |
| 彭德莱(Pendred)综合征 | PDS | c.1001+1G>A |
| 彭德莱(Pendred)综合征 | PDS | IVS8,+1G>A, |
| 苯丙酮尿症 | PAH | R408W |
| 苯丙酮尿症 | PAH | I65T |
| 苯丙酮尿症 | PAH | R261Q |
| 苯丙酮尿症 | PAH | IVS10-11G>A |
| 苯丙酮尿症 | PCDH15 | R245* |
| 苯丙酮尿症 | PCDH15 | R245* |
| 庞贝病 | GAA | c.-32-13T>G |
| 原发性纤毛运动不良症 | DNAI1 | IVS1+2_3insT |
| 原发性纤毛运动不良症 | DNAH5 | 10815delT |
| 原发性低氧血症 | AGXT | G170R |
| 疾病 | 基因 | 致病突变# |
| 镰状细胞病 | HBB | E26K |
| 镰状细胞病 | HBB | E7K |
| 镰状细胞病 | HBB | c.-138C>T |
| 镰状细胞病 | HBB | IVS2 |
| 镰状细胞病 | HBB | 654C>T |
| 史莱氏(Sly)症(MPSVII) | GUSB | L175F |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | A1038V |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | A1038V |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | L541P |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | G1961E |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | G1961E |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | G1961E |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | G1961E |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | c.2588G>C |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | c.5461-10T>C |
| 斯特格(Stargardt)病 | ABCA4 | c.5714+5G>A |
| 泰-萨二氏 | HEXA | InsTATC1278 |
| 1型酪氨酸血症 | FAH | P261L |
| 亚瑟综合征1F型 | PCDH15 | R245* |
| 变异性卟啉症 | PPOX | R59W |
| VCP肌病(IBMPFD)1 | VCP | R1555X |
| 方基盖氏病 | G6PC | Q347* |
| 方基盖氏病 | G6PC | Q347* |
| 方基盖氏病 | G6PC | Q347* |
| 方基盖氏病 | G6PC | R83C |
| 威尔逊氏病(Wilson’s disease) | ATP7B | E297G |
| X连锁肌管性肌病 | MTMI | c.1261-10A>G |
| X连锁视网膜劈裂 | RS1 | R102W |
| X连锁视网膜劈裂 | RS1 | R141C |
#:参见J T den Dunnen和S E Antonarakis,Hum Mutat.[人突变]2000；15(1):7-12，将其通过引用以其整体并入本文，以了解基因突变的命名法的细节。*表示终止密码子。
补偿性编辑
在一些实施例中，本文提供的系统或方法可用于引入补偿性编辑。在一些实施例中，补偿性编辑位于与疾病或障碍相关的基因的位置，该位置不同于引起疾病的突变的位置。在一些实施例中，补偿性突变不在包含致病突变的基因中。在一些实施例中，补偿性编辑可以取消或补偿引起疾病的突变。在一些实施例中，可以通过本文提供的系统或方法引入补偿性编辑以抑制或逆转引起疾病的突变的突变效应。
表24提供了示例性适应症(第1列)、基因(第2列)和可以使用本文所述的系统或方法引入的补偿性编辑(第3列)。在一些实施例中，可以引入表24中提供的补偿性编辑以抑制或逆转引起疾病的突变的突变效应。
表24.适应症、基因、补偿性编辑和示例性设计特征。
| 疾病 | 基因 | 核苷酸变化# |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | F51L |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | M374I |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | A348V/A347V |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | K387R |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | T59A |
| α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | SERPINAI | T68A |
| ATTR淀粉样变性 | TTR | Al08V |
| ATTR淀粉样变性 | TTR | Rl04H |
| ATTR淀粉样变性 | TTR | T119M |
| 囊性纤维化 | CFTR | R555K |
| 囊性纤维化 | CFTR | F409L |
| 囊性纤维化 | CFTR | F433L |
| 囊性纤维化 | CFTR | H667R |
| 囊性纤维化 | CFTR | Rl070W |
| 囊性纤维化 | CFTR | R29K |
| 囊性纤维化 | CFTR | R553Q |
| 囊性纤维化 | CFTR | 1539T |
| 囊性纤维化 | CFTR | G550E |
| 囊性纤维化 | CFTR | F429S |
| 囊性纤维化 | CFTR | Q637R |
| 镰状细胞疾病 | HBB | A70T |
| 镰状细胞疾病 | HBB | A70V |
| 疾病 | 基因 | 核苷酸变化# |
| 镰状细胞疾病 | HBB | L88P |
| 镰状细胞疾病 | HBB | F85L和/或F85P |
| 镰状细胞疾病 | HBB | E22G |
| 镰状细胞疾病 | HBB | G16D和/或G16N |
#:参见J T den Dunnen和S E Antonarakis,Hum Mutat.[人突变]2000；15(1):7-12，将其通过引用以其整体并入本文，以了解基因突变的命名法的细节。
调节性编辑
在一些实施例中，本文提供的系统或方法可用于引入调节性编辑。在一些实施例中，将调节性编辑引入基因的调节序列，例如基因启动子、基因增强子、基因阻遏物或调节基因剪接的序列。在一些实施例中，调节性编辑增加或降低靶基因的表达水平。在一些实施例中，靶基因与含有引起疾病的突变的基因相同。在一些实施例中，靶基因不同于含有引起疾病的突变的基因。例如，本文提供的系统或方法可用于通过在bcl11a的启动子处引入调节性编辑来上调胎儿血红蛋白的表达，从而治疗镰状细胞病。
表25提供了示例性适应症(第1列)、基因(第2列)和可以使用本文所述的系统或方法引入的调节性编辑(第3列)。
表25.适应症、基因和补偿性调节性编辑。
| 疾病 | 基因 | 核苷酸变化# |
| 纯合子家族性高胆固醇血症 | LDLR | c.81C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.3G>A |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.2T>C |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.46C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.91C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.91C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.226C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.226C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.226C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.229C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.247C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.247C>T |
| 疾病 | 基因 | 核苷酸变化# |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.250C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.250C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.340C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.340C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.349C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.391C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.391C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.403C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.403C>T |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+1G>A |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+1G>A |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+1G>A |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+1G>A |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+2T>C |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+2T>C |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+2T>C |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.199+2T>C |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.200-2A>G |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.427+1G>A |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.427+2T>C |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.1165+1G>A |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.1165+2T>C |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.1166-lA>G |
| 卟啉症 | ALAS1 | c.133l-2A>G |
| 镰状细胞病 | BCL11A | c.386-24278G>A |
| 镰状细胞病 | BCL11A | c.386-24983T>C |
| 镰状细胞病 | HBG1 | c.-167C>T |
| 镰状细胞病 | HBG1 | c.-170G>A |
| 镰状细胞病 | HBG1 | c.-249C>T |
| 镰状细胞病 | HBG2 | c.-211C>T |
| 镰状细胞病 | HBG2 | c.-228T>C |
| 镰状细胞病 | HBG1/2 | C.-198T>C |
| 镰状细胞病 | HBG1/2 | C.-198T>C |
#:参见J T den Dunnen和S E Antonarakis,Hum Mutat.[人突变]2000；15(1):7-12，将其通过引用以其整体并入本文，以了解基因突变的命名法的细节。
重复序列扩增疾病
在一些实施例中，本文提供的系统或方法可用于重复序列扩增疾病，例如表26中提供的重复序列扩增疾病。表26提供了适应症(第1列)、基因(第2列)、在该条件下扩增的重复序列的最小重复序列(第3列)，以及每个适应症中重复序列相对于所列基因的位置(第4列)。在一些实施例中，本文提供的系统或方法，例如包含Gene Writer的系统或方法，可用于通过根据定制的RNA模板重置基因座处的重复序列数量来治疗重复序列扩增疾病(参见，例如，实例24)。
表26.示例性重复序列扩增疾病、基因、因果重复序列和重复序列位置。
示例性模板
在一些实施例中，本文提供的系统或方法使用表27中列出的模板序列。表27提供了示例性模板RNA序列(第5列)和任选的第二切口gRNA序列(第6列)，这些序列被设计为与Gene Writing多肽配对以校正指定的致病突变(第4列)。表27中的所有模板旨在举例说明以下各项的总序列：(1)针对第一链缺口的gRNA，(2)多肽结合结构域，(3)异源对象序列，和(4)用于在第一链缺口建立TPRT的靶向同源结构域。
表27.示例性疾病、组织、基因、致病突变、模板RNA序列和第二缺口gRNA序列。
在一些实施例中，本文提供的系统或方法使用表35中列出的模板序列。表35提供了示例性模板RNA序列(第5列)和任选的第二切口gRNA序列(第6列)，这些序列被设计为与Gene Writing多肽配对以校正指定的致病突变(第4列)。表35中的所有模板旨在举例说明以下各项的总序列：(1)针对第一链缺口的gRNA，(2)多肽结合结构域，(3)异源对象序列，和(4)用于在第一链缺口建立TPRT的靶向同源结构域。
表35.用于校正示例性重复序列扩增疾病的示例性Gene Writing模板和第二缺口gRNA序列。跨越一个或多个重复序列的模板区域以小写字母表示。
示例性异源对象序列
在一些实施例中，本文提供的系统或方法包含异源对象序列，其中该异源对象序列或其反向互补序列编码蛋白质(例如，抗体)或肽。在一些实施例中，疗法是由监管机构例如FDA批准的疗法。
在一些实施例中，蛋白质或肽是来自THPdb数据库的蛋白质或肽(Usmani等人PLoSOne[公共科学图书馆·综合]12(7):e0181748(2017)，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，蛋白质或肽是表28中披露的蛋白质或肽。在一些实施例中，本文披露的系统或方法，例如包含Gene Writer的系统或方法，可用于将表28中的蛋白质或肽的表达盒整合到宿主细胞中，以使蛋白质或肽能够在宿主中表达。在一些实施例中，表28第一列中的蛋白质或肽的序列可以在表28第三列中提供的专利或申请(通过引用以其整体并入)中找到。
在一些实施例中，蛋白质或肽是Lu等人J Biomed Sci[生物医学科学杂志]27(1):1(2020)的表1中披露的抗体，该文献通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，蛋白质或肽是表29中披露的抗体。在一些实施例中，本文披露的系统或方法，例如包含GeneWriter的系统或方法，可用于将表29中的抗体的表达盒整合到宿主细胞中，以使抗体能够在宿主中表达。在一些实施例中，本文所述的系统或方法用于表达药剂，该药剂在具有表29第3列的适应症的受试者中结合表29第2列的靶(例如，表29第1列的单克隆抗体)。
表28.示例性蛋白质和肽治疗剂。
| 治疗性肽 | 分类 | 专利号 |
| 来匹卢定(Lepirudin) | 抗凝血酶和纤维蛋白溶解剂 | CA1339104 |
| 塞妥昔单抗 | 抗肿瘤剂 | CA1340417 |
| α脱氧核糖核酸酶 | 酶 | CA2184581 |
| 地尼白介素 | 抗肿瘤剂 | |
| 依那西普 | 免疫抑制剂 | CA2476934 |
| 比伐卢定 | 抗凝血酶 | US7582727 |
| 亮丙瑞林 | 抗肿瘤剂 | |
| 聚乙二醇干扰素α-2a | 免疫抑制剂 | CA2203480 |
| 阿替普酶 | 血栓溶解剂 | |
| 干扰素α-n1 | 抗病毒剂 | |
| 达依泊汀α | 抗贫血剂 | CA2165694 |
| 瑞替普酶 | 纤维蛋白溶解剂 | CA2107476 |
| 依泊汀α | 补血药 | CA1339047 |
| 鲑降钙素 | 骨密度保护剂 | US6440392 |
| 干扰素α-n3 | 免疫抑制剂 | |
| 聚乙二醇非格司亭 | 免疫抑制剂 | CA1341537 |
| 沙格司亭 | 免疫抑制剂 | CA1341150 |
| 胰泌素 | 诊断性剂 | |
| 聚乙二醇干扰素α-2b | 免疫抑制剂 | CA1341567 |
| 天冬酰胺酶 | 抗肿瘤剂 | |
| 促甲状腺素α | 诊断性剂 | US5840566 |
| 抗血友病因子 | 凝血剂和血栓性剂 | CA2124690 |
| A kinra | 抗风湿药 | CA2141953 |
| 短杆菌肽D | 抗细菌剂 |
植物修饰方法
本文所述的Gene Writer系统可用于修饰植物或植物部分(例如，叶、根、花、果实或种子)例如以增加植物的适应度。
A.向植物的递送
本文提供了将本文所述的Gene Writer系统递送至植物的方法。包括用于通过使植物或其一部分与Gene Writer系统接触而将Gene Writer系统递送至植物的方法。这些方法可用于修饰植物以例如增加植物的适应度。
更特别地，在一些实施例中，本文所述的核酸(例如，编码GeneWriter的核酸)可以在载体中编码，例如邻近植物启动子(例如，植物载体(例如，pHUC411)中的玉蜀黍泛素启动子(ZmUBI))而插入。在一些实施例中，本文所述的核酸通过农杆菌被引入植物(例如，粳稻)或植物的一部分(例如，植物的愈伤组织)中。在一些实施例中，本文所述的系统和方法可以通过用无效等位基因(例如，在起始密码子处含有碱基取代)替换植物基因(例如，潮霉素磷酸转移酶(HPT))而用于植物。以下中描述了用于修饰植物基因组的系统和方法：Xu等人Development of plant prime-editing systems for precise genome editing[开发用于精确基因组编辑的植物先导编辑系统],2020,Plant Communications[植物通讯]。
在一方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送本文所述的Gene Writer系统(例如，以有效的量和持续时间)以相对于未经处理的植物(例如，未递送该Gene Writer系统的植物)增加该植物的适应度。
由于递送Gene Writer系统而产生的植物适应度的增加能以多种方式表现出来，例如，从而导致植物的更好的生产，例如改善的产率，改善的植物活力或从植物中收获的产物的质量，农业或园艺业所希望的收获前或收获后的性状(例如，味道、外观、货架期)的改善，或在其他方面使人类受益的性状(例如，减少变应原产生)的改善。改善的植物产率涉及相对于在相同条件下但不应用本发明组合物而生产的植物的相同产品的产率或与应用常规植物修饰剂相比，按可测量量计植物的产品的产率的增加(例如，如通过植物生物质、谷物、种子或果实产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积测量的)。例如，产率可以增加至少约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、或大于100％。在一些情况下，相对于未处理的植物，该方法有效地将产率增加约2x倍、5x倍、10x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍。产率可以以在某种基础上植物或植物的产品的重量或体积计的量来表示。基础可以以时间、生长面积、生产的植物的重量、或所用原材料的量来表示。例如，此类方法可以增加植物组织的产率，这些植物组织包括但不限于：种子、果实、仁、圆荚、块茎、根和叶。
作为递送Gene Writer系统的结果而导致的植物适应度的增加也可以通过其他手段来测量，诸如相对于在相同条件下但不施用本发明组合物或施用常规植物修饰剂(例如，在没有PMP情况下递送的植物修饰剂)而生产的植物的活力等级、植株密度(stand)(植物数量/单位面积)、植物高度、秆围、秆长、叶数量、叶尺寸、植物冠层、视觉外观(诸如更绿的叶颜色)、根等级、出苗、蛋白质含量、增加的分蘖、更大的叶、更多的叶、更少的死的基生叶、更强的分蘖、更少的所需肥料、更少的所需种子、更多产的分蘖、更早开花、提早的谷粒或种子成熟度、更少的植物节(verse)(倒伏)、增加的芽生长、更早萌发、或这些因素的任何组合，按可测量或可察觉的量计相同因素的增加或改进。
因此，本文提供了一种修饰植物的方法，该方法包括向植物递送有效量的本文提供的Gene Writer系统中的任一种，其中该方法修饰该植物并由此相对于未经处理的植物引入或增加该植物中的有益性状(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％，70％、80％、90％、100％或大于100％)。特别地，该方法相对于未经处理的植物可以增加植物的适应度(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在一些情况下，植物适应度的增加是以下方面的增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)：抗病性、耐旱性、耐热性、耐寒性、耐盐性、金属耐受性、除草剂耐受性、化学耐受性、水分利用效率、氮利用、对氮胁迫的抗性、固氮、有害生物抗性、草食动物抗性、病原体抗性、产率、限水条件下的产率、活力、生长、光合能力、营养、蛋白质含量、碳水化合物含量、油含量、生物质、芽长、根长、根结构、种子重量、或可收获产物的量。
在一些情况下，适应度的增加是发育、生长、产率、对非生物胁迫源的抗性或对生物胁迫源的抗性增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。非生物胁迫是指植物或植物部分所经受的环境胁迫条件，包括例如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫、冷胁迫和低营养胁迫。生物胁迫是指植物或植物部分所经受的环境胁迫条件，包括例如线虫胁迫、食草昆虫胁迫、真菌病原体胁迫、细菌病原体胁迫或病毒病原体胁迫。胁迫可以是暂时的，例如几个小时，几天，几个月或永久的，例如持续植物的一生。
在一些情况下，植物适应度的增加是从植物收获的产物质量增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。例如，植物适应度的增加可以是从植物收获的产物的商业上有利的特征(例如，味道或外观)的改善。在其他情况下，植物适应度的增加是从植物收获的产物的货架期的增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
可替代地，适应度的增加可以是对人类或动物健康有益的性状的改变，例如变应原产生的减少。例如，适应度的增加可以是刺激动物(例如人)中免疫应答的变应原(例如花粉)的产生减少(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
植物的修饰(例如，适应度的增加)可能来自一个或多个植物部分的修饰。例如，可以通过接触植物的叶、种子、花粉、根、果实、芽、花、细胞，原生质体或组织(例如分生组织)来修饰植物。因此，在另一方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的花粉与有效量的本文中植物修饰组合物中的任一种接触，其中相对于未经处理的植物，该方法使植物的适应度增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在又另一方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的种子与有效量的本文披露的Gene Writer系统中的任一种接触，其中相对于未经处理的植物，该方法使植物的适应度增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在另一方面，本文提供了一种包括使植物的原生质体与有效量的本文所述的GeneWriter系统中的任一种接触的方法，其中相对于未经处理的植物，该方法使植物的适应度增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在另外的方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的植物细胞与有效量的本文所述的Gene Writer系统中的任一种接触，其中相对于未经处理的植物，该方法使植物的适应度增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在另一方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的分生组织与有效量的本文的植物修饰组合物中的任一种接触，其中相对于未经处理的植物，该方法使植物的适应度增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
在另一方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括使植物的胚与有效量的本文的植物修饰组合物中的任一种接触，其中相对于未经处理的植物，该方法使植物的适应度增加(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或大于100％)。
B.应用方法
本文所述的植物可以以允许将组合物递送或施用于植物的任何合适方式暴露于本文所述的任何Gene Writer系统组合物。Gene Writer系统可以单独递送或与其他活性(例如，肥料剂)或非活性物质组合递送，并且可以通过例如喷雾、注射(例如显微注射)、通过植物、倾倒、浸渍，以浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉剂、丸剂、块剂、砖剂等(配制成递送有效浓度的植物修饰组合物)的形式来应用。应用本文所述的组合物的量和位置通常取决于植物的习性、植物可被植物修饰组合物靶向的生命周期阶段、将施用的位置、以及植物修饰组合物的物理和功能特征。
在一些情况下，通过例如背包喷雾、空中喷雾、作物喷雾/尘剂等将组合物直接喷雾到植物(例如作物)上。在将Gene Writer系统递送至植物的情况下，接受Gene Writer系统的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如，配制的植物修饰组合物可以在植物生长的早期阶段以种子包衣或根处理剂的形式或在作物周期的后期阶段以总植物处理剂的形式来应用。在一些情况下，植物修饰组合物可以作为局部剂应用于植物。
此外，可以将Gene Writer系统(例如，在植物生长的土壤中，或在用于浇灌植物的水中)作为通过植物的组织而吸收和分布的内吸剂(systemic agent)应用。在一些情况下，植物或食物生物可以经遗传转化以表达Gene Writer系统。
延迟释放或持续释放也可以通过以下方式完成：向Gene Writer系统或具有一种或多种植物修饰组合物的组合物包覆可溶解或生物可侵蚀的包衣层(诸如明胶)，该包衣层在使用环境中溶解或侵蚀，从而然后使植物修饰组合物Gene Writer系统位置可用，或者通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中。此类持续释放和/或分配方式装置可有利地用于始终维持本文所述的一种或多种植物修饰组合物的有效浓度。
在一些情况下，将Gene Writer系统递送至植物的一部分，例如叶、种子、花粉、根、果实、芽、或花，或其组织、细胞或原生质体。在一些情况下，将Gene Writer系统递送至植物的细胞。在一些情况下，将Gene Writer系统递送至植物的原生质体。在一些情况下，将GeneWriter系统递送至植物的组织。例如，可以将组合物递送至植物的分生组织(例如，顶端分生组织、侧生分生组织或间生分生组织)。在一些情况下，将组合物递送至植物的永久组织(例如，简单组织(例如，薄壁组织、厚角组织或厚壁组织)或复杂的永久组织(例如，木质部或韧皮部))。在一些情况下，将Gene Writer系统递送至植物胚。
C.植物
可以将多种植物递送至本文所述的Gene Writer系统或用其处理。可以根据本发明方法递送Gene Writer系统(即，“处理的”)的植物包括整株植物及其部分，包括但不限于芽营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳、子叶、和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)及其子代。植物部分可以进一步指如以下的植物部分：芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞片、枝、叶柄、节间、树皮、短柔毛、分蘖、根茎、叶状体(frond)、叶片、花粉、雄蕊等。
可以在本文披露的方法中处理的植物的类别包括高等植物和低等植物类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓植物、和藻类(例如，多细胞藻类或单细胞藻类)。可以根据本发明方法处理的植物进一步包括任何维管植物，例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物，包括但不限于苜蓿、苹果、拟南芥属、香蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻籽、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦和蔬菜作物(如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦)；水果树和坚果树，如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，如葡萄(例如，葡萄园)、猕猴桃、蛇麻子(hop)；水果灌木和悬钩子，如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular)；与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、和小麦。可以根据本发明的方法处理的植物包括任何作物植物，例如，草料作物、油籽作物、谷物作物、水果作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草皮作物、糖作物、饮料作物、和森林作物。在某些情况下，在该方法中处理的作物植物是大豆植物。在其他某些情况下，作物植物是小麦。在某些情况下，作物植物是玉米。在某些情况下，作物植物是棉花。在某些情况下，作物植物是苜蓿。在某些情况下，作物植物是甜菜。在某些情况下，作物植物是水稻。在某些情况下，作物植物是马铃薯。在某些情况下，作物植物是番茄。
在某些情况下，植物是作物。此类作物植物的实例包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，包括但不限于饲养料或草料豆类、观赏植物、食物作物、树木、或灌木，选自枫属物种(Acer spp.)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananascomosus)、旱芹(Apium graveolens)、花生属物种(Arachis spp)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如，欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa ssp.)(卡诺拉油菜、油菜、白菜型油菜(turniprape))、野茶树(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis saliva)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、栗属物种(Castanea spp.)、栽培菊苣(Cichoriumendivia)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、黄瓜属物种(Cucumis spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、水青冈属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficuscarica)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属违章(Glycinespp.)(例如，大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如，向日葵)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(例如，大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、胡桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、莲属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、蕃茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如，番茄(Lycopersicon esculenturn))、圣女果(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、苹果属物种(Malus spp.)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、稻属物种(Oryzaspp.)(例如，稻(Oryza sativa))、宽叶野生稻(Oryza latifolia)、黍稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、西番莲(Passiflora edulis)、欧芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、李属物种(Prunus spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis spp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如，马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅(Sorghum halepense)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、罗晃子(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、三叶草属物种(Trifolium spp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(例如，普通小麦(Triticum aestivum))、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、Triticum sativum或Triticum vulgare)、越橘属物种(Vaccinium spp.)、蚕豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、和玉米(Zea mays)。在某些实施例中，作物植物是水稻、油菜、卡诺拉油菜、大豆、玉米(玉蜀黍(maize))、棉花、甘蔗、苜蓿、高粱、或小麦。
用于本发明的植物或植物部分包括任何植物发育阶段的植物。在某些情况下，可以在萌发、幼苗生长、营养生长、和繁殖生长的阶段进行递送。在某些情况下，向植物的递送在营养生长和繁殖生长阶段期间进行。在一些情况下，将组合物递送至植物的花粉。在一些情况下，将组合物递送至植物的种子。在一些情况下，将组合物递送至植物的原生质体。在一些情况下，将组合物递送至植物的组织。例如，可以将组合物递送至植物的分生组织(例如，顶端分生组织、侧生分生组织或间生分生组织)。在一些情况下，将组合物递送至植物的永久组织(例如，简单组织(例如，薄壁组织、厚角组织或厚壁组织)或复杂的永久组织(例如，木质部或韧皮部))。在一些情况下，将组合物递送至植物胚。在一些情况下，将组合物递送至植物细胞。营养生长和繁殖生长阶段在本文中也称为“成株”或“成熟”植物。
在将Gene Writer系统递送至植物部分的情况下，可以通过植物修饰剂对植物部分进行修饰。可替代地，Gene Writer系统可以被分布到植物的其他部分(例如，通过植物的循环系统)，其他部分随后被植物修饰剂修饰。
所有的公开物、专利申请、专利、以及本文引用的其他公开物和参考文献(例如，序列数据库参考号)通过引用以其全文并入本文。例如，本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如，在本文的任一表中)均通过引用而结合。除非另有说明，本文中指定的序列(例如，通过RepBase中的基因名称或通过登录号)，包括在本文中的任何表中的序列，是指截至2020年3月4日的当前数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。
实例
本发明进一步通过以下实例说明。提供这些实例仅出于说明目的，而不应以任何方式解释为限制本发明的范围或内容。
实例1：将Gene Writer系统递送至哺乳动物细胞
该实例描述了将Gene Writer基因组编辑系统递送至哺乳动物细胞，用于将外源DNA插入哺乳动物细胞基因组中。Gene Writer组成部分来源于逆转录转座子，例如表X中列出的逆转录转座子。
在该实例中，Gene WriterTM系统的多肽组分是来自欧洲刺猬(Erinaceuseuropaeus)的Vingi_1_EE逆转录转座酶，其在质粒中被编码并且其表达由CMV启动子驱动。模板组分包含质粒，该质粒在来自Vingi_1_EE逆转录转座子的5’UTR和3’UTR之间具有异源对象序列，所有这些都由CMV启动子转录。异源对象序列是EF1a驱动的GFP报告盒，其相对于CMV驱动的模板转录本处于反义方向。此外，GFP基因被正向内含子打断，因此RNA的剪接仅在从CMV启动子转录时发生，而当从EF1a启动子以相反方向转录时内含子仍然存在。因此，GFP ORF仅在首先从CMV启动子发生转录时才完整，然后剪接的转录本被逆转录并整合到基因组中，从而允许随后由EF1a驱动的转录产生编码功能性GFP的mRNA。
用以下测试试剂对U2OS细胞进行核转染：
1.编码上述多肽的DNA
2.编码上述具有核酸内切酶失活突变的多肽的DNA
3.编码上述模板RNA的DNA
4.1和3的组合
5.2和3的组合
转染后，将U2OS细胞培养至少3天，然后测定基因组插入。为了检测表达，通过流式细胞仪测定细胞以测量GFP的水平，GFP只能在成功整合事件后产生。对于分子读出，对从每组U2OS细胞中分离的基因组DNA样品进行单向测序以确定插入位点的数量和身份。为了进行单向测序，首先提取基因组DNA，然后进行片段化。衔接子与片段连接，并使用衔接子引物和Gene Writer模板特异的引物进行PCR。设计用于跨越内含子连接的引物(因此引物仅与整合的GFP结合)用于减少模板质粒中存在的未剪接GFP的背景读数。然后对第一轮扩增子进行第二轮PCR以放大信号，随后在MiSeq上进行分析以确定成功整合事件的基因组位置。将不同的条形码并入引物中允许估计整合事件的数量。逆转录转座酶介导的Gene Writing由上述条件(4)中富集的整合事件的存在指示。
实例2：将逆转录转座子引导至人细胞中的特定位点
该实例描述了将Gene Writer基因组编辑系统递送至哺乳动物细胞，用于在预定位点将外源DNA插入哺乳动物细胞基因组中。Gene Writer组成部分来源于逆转录转座子，例如表X中列出的逆转录转座子，并且另外包含异源DNA结合结构域。
在该实例中，Gene WriterTM系统的多肽组分是来自欧洲刺猬(Erinaceuseuropaeus)的Vingi_1_EE逆转录转座酶，其在质粒中被编码并且其表达由CMV启动子驱动。Vingi_1_EE逆转录转座酶还包括N末端dCas9结构域。通过添加与AAVS1位点具有20nt同源性的U6驱动型gRNA来指导Gene Writer多肽，因此dCas9结构域与gRNA组合提供了异源DNA结合活性，以将多肽引导至AAVS1位点以进行模板的程序性逆转录转座。模板组分包含质粒，该质粒在来自Vingi_1_EE逆转录转座子的5’UTR和3’UTR之间具有异源对象序列，所有这些都由CMV启动子转录。异源对象序列是EF1a驱动的GFP报告盒，其相对于CMV驱动的模板转录本处于反义方向。此外，GFP基因被正向内含子打断，因此RNA的剪接仅在从CMV启动子转录时发生，而当从EF1a启动子以相反方向转录时内含子仍然存在。因此，GFPORF仅在首先从CMV启动子发生转录时才完整，然后剪接的转录本被逆转录并整合到基因组中，从而允许随后由EF1a驱动的转录产生编码功能性GFP的mRNA。
用以下测试试剂对U2OS细胞进行核转染：
1.编码上述多肽和gRNA的DNA
2.编码上述具有核酸内切酶失活突变的多肽和gRNA的DNA
3.编码上述多肽的DNA，但缺少gRNA
4.编码上述模板RNA的DNA
5.1和4的组合
6.2和4的组合
7.3和4的组合
转染后，将U2OS细胞培养至少3天，然后测定基因组插入。为了检测表达，通过流式细胞仪测定细胞以测量GFP的水平，GFP只能在成功整合事件后产生。对于分子读数，从每组U2OS细胞中分离的基因组DNA样品进行ddPCR以确定AAVS1位点的插入频率。与模板3'末端退火的引物与在基因组中AAVS1插入位点下游退火的引物和位于该引物对之间的探针配对。因此，当AAVS1位点发生整合并且引物可以在整合连接的每一侧退火时，就会发生扩增事件。通过这种设计，ddPCR测定中的信号(归一化为标准RPP30参考)表明AAVS1位点的整合事件的拷贝数。逆转录转座酶介导的Gene Writing由上述条件(5)中整合信号的富集指示。与条件(7)相比，其中系统缺乏gRNA驱动多肽的靶向特异性，条件(5)表明通过ddPCR测量的在AAVS1位点处的整合效率增加至少五倍。
实例3：Gene WriterTM使基因组DNA中的核苷酸取代能够校正α-1抗胰蛋白酶缺乏
Gene Writer系统可用于通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变靶DNA，例如基因组DNA。不希望限于单一方法，该实例描述了使用Gene WriterTM基因编辑系统在单个核苷酸处改变基因组序列。
在该实例中，Gene WriterTM多肽和书写模板作为转染入HEK293T细胞(其具有PiZ基因型(E342L)，一种与α-1抗胰蛋白酶缺乏相关的常见等位基因)的DNA的提供。GeneWriterTM多肽使用Cas9切口酶来实现DNA结合和核酸内切酶功能。书写模板被设计为与靶序列具有同源性，同时在所期望位置处掺入另外的核苷酸，这样模板RNA的逆转录导致产生包含取代的新DNA链。
为了在受影响的人SERPINA1基因中产生颠换(这恢复健康患者中编码谷氨酸的GAG三联体)，将Gene WriterTM多肽与特定模板一起使用，该模板编码用于多肽归巢的间隔子、用于建立TPRT的靶同源结构域和用于逆转录的模板序列(其包括G取代)。
转染后，将细胞孵育三天，以允许Gene WritingTM系统的表达和基因组DNA靶标的转变。孵育期后，从细胞中提取基因组DNA。然后使用位点特异性引物对基因组DNA进行基于PCR的扩增，并根据制造商的方案在Illumina MiSeq上对扩增子进行测序。然后进行序列分析以确定包含所期望的编辑的读段的频率。
实例4：检测人细胞中逆转录转座酶介导的整合
该实例描述了在人细胞中展示功能性的逆转录转座子的鉴定。通过测定天然或经修饰的逆转录转座子的整合活性，该实例展示了一种选择包含蛋白质结构域的逆转录转座酶的方法，该蛋白质结构域可用于以其天然结构域组成来重建逆转录转座酶，或作为嵌合或合成Gene Writer的组分用于工程化人基因组细胞。例如，成功产生整合信号的逆转录转座子预期包括功能性DNA结合、核酸内切酶、逆转录酶和任选的第二链合成活性。在一些实施例中，已显示证明如该实例中所述的活性的来自逆转录转座子的逆转录酶结构域用于在Gene Writer多肽中提供逆转录酶活性，例如作为Cas-RT融合多肽的RT，例如，如表9中所披露的。此处描述的筛选采用包含逆转录转座子多肽和灭活报告模板的双质粒系统的核转染进入人细胞，以表征计算机选择的逆转录转座子的RT依赖性逆转录转座效率。
在该实例中，使用了双质粒系统，其包含：1)逆转录转座子编码的蛋白质表达驱动子质粒，例如编码来自表3B的逆转录转座酶多肽的质粒，其包含与用于检测蛋白表达的HiBit标签融合并由哺乳动物CMV启动子驱动的人密码子优化的逆转录转座酶编码序列，和2)模板质粒，例如包含以下的质粒：(i)用于在哺乳动物细胞中表达以驱动RNA模板分子转录的启动子，例如CMV启动子，其中模板分子进一步包含(ii)报告盒，其在质粒衍生表达的情况下是无活性的，例如，EGFP表达盒，其编码序列被相反方向编码的内含子(GFPai)破坏，两侧是(iii)天然包含(1)的逆转录转座酶的天然逆转录转座子的非翻译区(UTR)(参见图8)。在这里，GFP报告子在没有驱动其表达的启动子的情况下进行编码，以避免由于GFP毒性导致的任何信号丢失(参见图8)。
为了将双质粒系统递送进入U2OS细胞，按照制造商的说明，使用LonzaSE细胞系96孔NucleofectorTM试剂盒，用88.3ng驱动质粒(1)和161.7ng模板质粒(2)对约400,000个细胞进行核转染。核转染后三天，使用ddPCR测量整合效率以确定每个基因组的整合拷贝数。通过使用如下所述的利用反义内含子的ddPCR方法测量逆转录依赖性逆转录转座活性。通过基于HiBit的生物发光测定法测量驱动子蛋白的表达。
当在模板质粒的报告盒(例如，此处描述的GFPai系统)中使用包含内含子序列的反义内含子报告子时，内含子存在于质粒中，但在转录过程中被剪接，因此只有通过反向从转录本获得的报告子DNA转录将缺少内含子序列(图8)。为了将检测限制在仅源自逆转录的事件，ddPCR Taqman探针被设计为跨越剪接点以与缺少内含子的DNA杂交，但不与仍含有完整内含子的质粒DNA杂交。正向和反向引物设计在探针的上游和下游以及GFP序列内。这种设计避免了模板质粒在没有第一转录步骤的情况下直接重组到基因组中的可能背景，或者来自完整模板质粒污染gDNA提取样品的可能背景。
源自表3B中逆转录转座酶的Gene Writing系统按照该实例进行测定，以确定在人细胞中的活性。ddPCR对163个候选逆转录转座子系统的整合效率的分析如图9所示。根据该实例中描述的测定，25个逆转录转座酶候选者证明逆转录转座子UTR侧翼模板序列以平均大于0.01个拷贝/基因组的成功反式整合(参见图10)。
在一些实施例中，候选系统被进一步优化，如本申请中别处所述。在一些实施例中，基于不同的共有方法为一个逆转录转座子系统设计了两个驱动子质粒(参见，例如，实例8)。在一些实施例中，驱动子质粒针对人密码子偏好进行密码子优化。在一些实施例中，RNA模板分子被设计为进一步包含位于逆转录转座子UTR侧翼的序列以促进整合，例如，同源臂(其与内源基因组背景下的反转录转座子的上游和下游区域或人基因组中的靶DNA序列具有序列同一性)(参见，例如，实例9)。
实例5：人细胞中活性提高的逆转录转座酶氨基酸序列的共有基因组图谱
该实例描述了使用基因组挖掘共有方法来工程化改善的逆转录转座子活性。鉴于逆转录转座子可能存在于基因组内的许多拷贝中，所有拷贝的比较可用于重新构建祖先序列或预期在宿主内具有最高活性的序列。
在该实例中，来自表3B的逆转录转座子在其宿主基因组中被计算机鉴定。鉴定出基因组核苷酸序列，这些基因组核苷酸序列与每个逆转录转座子末端高度匹配以及与完整元件至少80％的整体核苷酸同一性。与靶逆转录转座子的每个成对比对的预测编码序列被翻译并用于生成由宿主基因组内所有拷贝所获知的相应逆转录转座酶的共有氨基酸序列。
为了产生用于共有重新衍生的逆转录转座酶的构建体，每个氨基酸序列被反向翻译并进行人优化并克隆到如实例7中的驱动子质粒中。然后将共有产生的逆转录转座酶与第一代逆转录转座酶序列针对整合活性进行比较。对于每个逆转录转座子系统，使用实例7中描述的双质粒系统比较由共有产生的逆转录转座酶和原始逆转录转座酶驱动的整合效率。将相同的模板质粒与两种驱动子中的一种共核转染到U2OS细胞中。根据制造商的方案，使用Lonza SE细胞系96孔Nucleofector试剂盒，用88.3ng驱动子质粒和161.7ng模板质粒对约400,000个细胞进行核转染。如实例7中所述，在核转染后3天提取基因组DNA以通过ddPCR量化整合效率。
根据ddPCR整合读出，几个逆转录转座子显示出挽救的或改善的活性。具体来说，CR1-3_IS、CR-10_Ami、CR1-54_AAe和TART-1_DWi的共有产生的序列仅在共有产生的驱动子情况下整合到人细胞中(图11)。此外，使用共有产生的序列，L2-18_ACar和RTE-2_LMi显示出显著改善的活性。显著的序列如表11所示。
实例6：添加衍生自天然宿主的内源整合位点的同源臂改善了Gene Writer模板在人细胞中的整合
该实例描述了使用基因组挖掘基序方法来工程化改善的Gene Writing活性。
更具体地说，来自表3B的逆转录转座子在其宿主基因组中被计算机鉴定。鉴定出基因组核苷酸序列，这些基因组核苷酸序列与每个天然逆转录转座子末端高度匹配以及与完整元件至少80％的整体核苷酸同一性。从给定元件的每次鉴定的出现中提取来自宿主基因组的3’和5’邻近序列，并产生对应于3’和5’末端的基序。接下来将共有基序与人基因组(组装hg38)比对，并根据与每个基序的最佳匹配设计与人序列具有同一性的同源臂。此处使用的人特异性同源臂如表11所示。
为了生成新的模板质粒，如实例4所述，将上述3'和5'同源臂插入3'和5'逆转录转座子UTR序列的最近下游和上游。如实例4所述用匹配的驱动子质粒转染包含或缺乏同源臂的模板质粒，并且比较两种模板版本的性能以表征活性的任何变化。具体而言，根据制造商的方案，使用Lonza SE细胞系96孔Nucleofector试剂盒，用88.3ng驱动子质粒和161.7ng模板质粒对约400,000个U2OS细胞进行核转染。如实例4中所述，核转染后3天提取gDNA以通过ddPCR量化每个系统的整合效率。
几个具有添加的同源臂的Gene Writing模板基于ddPCR整合读出显示出改善的或挽救的活性。具体来说，同源臂设计和添加改善了L2-18_ACar、Dong-1_MMa、L2-2_Dre、CR1_AC_1和RTE-1_Aip的整合(图12)。与缺乏同源臂的设计(其中信号在以前是无法检测的)相比，同源臂添加挽救了Tad1-65B_BG的整合。
实例7：具有降低的醛含量的脂质试剂的选择
在该实例中，选择脂质用于含有一种或多种Gene Writing组分核酸的脂质纳米颗粒配制品的下游使用，并且至少部分基于不存在污染醛或低水平的污染醛来选择脂质。脂质试剂中的反应性醛基可在LNP配制期间引起对一种或多种组分核酸(例如RNA，例如模板RNA)的化学修饰。因此，在一些实施例中，脂质试剂的醛含量被最小化。
液相色谱(LC)与串联质谱法(MS/MS)联用可用于分离、表征和定量试剂的醛含量，例如，如Zurek等人.The Analyst[分析家]124(9):1291-1295(1999)所述，通过引用并入本文。在此，将每种脂质试剂进行LC-MS/MS分析。LC/MS-MS方法首先用C8HPLC柱分离脂质和一种或多种杂质，然后用质谱仪对这些分子进行检测和结构测定。如果醛存在于脂质试剂中，则使用结构上与醛相同但由于C13和N15标记而较重的稳定同位素标记(SIL)标准对其进行定量。将适量的SIL标准掺加到脂质试剂中。然后将混合物进行LC-MS/MS分析。通过将SIL标准的量乘以峰比(未知/SIL)来测定污染醛的量。如所述定量脂质试剂中的任何一个或多个鉴定的醛。在一些实施例中，发现选择用于LNP配制品的脂质原料不包含高于选定水平的任何污染性醛含量。在一些实施例中，用于配制的一种或多种且任选地所有脂质试剂包含小于3％的总醛含量。在一些实施例中，用于配制的一种或多种且任选地所有脂质试剂包含少于0.3％的任何单一醛种类。在一些实施例中，配制中使用的一种或多种且任选地所有脂质试剂包含少于0.3％的任何单一醛种类和少于3％的总醛含量。
实例8：在配制期间由醛引起的RNA修饰的定量
在该实例中，在配制后分析RNA分子以确定在配制过程中可能发生的任何修饰的程度，例如，以检测由脂质试剂的醛污染引起的化学修饰(参见，例如，实例7)。
RNA修饰可以通过分析核糖核苷来检测，例如根据Su等人Nature Protocols[自然实验手册]9:828-841(2014)的方法，其通过引用以其全文并入本文。在该方法中，将RNA消化成核苷混合物，然后进行LC-MS/MS分析。配制后RNA包含在LNP中，并且其必须首先通过在80％异丙醇中与GlycoBlue共沉淀而从脂质中分离。离心后，将含有RNA的沉淀小心地转移到新的Eppendorf管中，向其中添加酶混合物(全能核酸酶、1型磷酸二酯酶、磷酸酶)以将RNA消化成核苷。将Eppendorf管置于37℃下预热的Thermomixer上1小时。将所得核苷混合物通过LC-MS/MS方法直接分析，该方法首先用C18柱分离核苷和修饰的核苷，然后用质谱检测它们。
如果脂质试剂中的一个或多个醛引起了化学修饰，则数据分析将使一个或多个修饰的核苷与一个或多个醛相关联。可以使用SIL标准定量修饰的核苷，SIL标准在结构上与天然核苷相同，不同之处在于由于C13和N15标记而更重。将适当量的SIL标准掺加到核苷消化物中，然后对其进行LC-MS/MS分析。通过将SIL标准的量乘以峰比(未知/SIL)获得修饰核苷的量。LC-MS/MS能够同时定量所有靶标分子。在一些实施例中，与在脂质纳米颗粒配制过程中使用较高纯度的脂质试剂作为材料相比，使用具有较高杂质醛含量的脂质试剂导致较高水平的RNA修饰。因此，在优选的实施例中，使用较高纯度的脂质试剂，其导致RNA修饰低于可接受的水平。
实例9：Gene WriterTM实现在基因组DNA中的大插入
该实例描述了使用Gene WriterTM基因编辑系统通过插入一大串核苷酸来改变基因组序列。
在该实例中，Gene WriterTM多肽、gRNA和书写模板作为转染到HEK293T细胞中的DNA提供。Gene WriterTM多肽使用Cas9切口酶来实现DNA结合和核酸内切酶功能。逆转录酶功能衍生自R2逆转录转座酶的高度进行性RT结构域。书写模板被设计为与靶序列具有同源性，同时在所期望位置并入遗传载荷，这样模板RNA的逆转录导致产生包含所期望插入的新DNA链。
为了在人HEK293T细胞DNA中产生大插入，Gene WriterTM多肽与特定gRNA(其将含有Cas9的Gene WriterTM靶向靶基因座)和用于逆转录的模板RNA(其包含用于与逆转录酶相关联的RT结合基序(来自R2元件的3’UTR)、用于引发逆转录的靶位点同源区域和遗传载荷(GFP表达单元))联合使用。该复合物对靶位点进行切口，然后在模板上执行TPRT，通过使用模板上与紧邻切口位点的序列互补的引发区域来引发反应，并将GFP载荷复制到基因组DNA中。
转染后，将细胞孵育三天，以允许Gene WritingTM系统的表达和基因组DNA靶标的转变。孵育期后，从细胞中提取基因组DNA。然后使用位点特异性引物对基因组DNA进行基于PCR的扩增，并根据制造商的方案在Illumina MiSeq上对扩增子进行测序。然后进行序列分析以确定包含所期望的编辑的读段的频率。
实例10：Gene Writer可以独立于单链模板修复途径整合基因货物
该实例描述了在单链模板修复(SSTR)途径被抑制的人细胞中使用Gene Writer系统。
在该实例中将使用针对SSTR途径的核心组分的siRNA抑制该途径：FANCA、FANCD2、FANCE、USP1。还将包括非靶标对照的对照siRNA。用30pmol(1.5μM)siRNA以及R2Tg驱动子和转基因质粒(反式构型)对200k U2OS细胞进行核转染。具体来说，250ng表达R2Tg的质粒、在RT结构域中具有突变的对照R2Tg或具有核酸内切酶失活突变的对照R2Tg以1:4的摩尔比(驱动子与转基因)与转基因联合使用。使用程序DN100在SE缓冲液中进行U2OS细胞的转染。核转染后，将细胞在完全培养基中生长3天。在第3天收获gDNA，并进行ddPCR以评估rDNA位点的整合。在没有核心SSTR途径组分的情况下检测到rDNA上的转基因整合。
实例11：封装萤火虫萤光素酶mRNA的脂质纳米颗粒的配制
在该实例中，将编码萤火虫萤光素酶的报告子mRNA配制成包含不同可电离脂质的脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒(LNP)组分(可电离脂质、辅助脂质、甾醇、PEG)与脂质组分一起溶解在100％乙醇中。然后分别使用可电离脂质LIPIDV004或LIPIDV005(表A1)、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000以50:10:38.5:1.5的摩尔比制备这些。分别使用LIPIDV003、DSPC、胆固醇和DMG-PEG 2000以45:9:44:2的摩尔比制备含有可电离脂质LIPIDV003(表A1)的萤火虫萤光素酶mRNA-LNP。这些配制品中使用的萤火虫萤光素酶mRNA是通过体外转录产生的，并编码萤火虫萤光素酶蛋白，进一步包含5'帽、5'和3’UTR以及聚A尾。mRNA是在T7RNA聚合酶体外转录的标准条件下合成的，具有共转录加帽，但在反应中，核苷酸三磷酸UTP 100％被N1-甲基-假尿苷三磷酸取代。将纯化的mRNA溶解在25mM柠檬酸钠中，pH 4，浓度为0.1mg/mL。
萤火虫萤光素酶mRNA被配制成LNP，其中脂质胺与RNA磷酸(N:P)的摩尔比为6。使用精密纳米系统NanoAssemblrTM台式仪器，使用制造商推荐的设置，通过微流体混合脂质和RNA溶液形成LNP。在使用不同流速的混合过程中，水溶剂与有机溶剂的比例保持为3:1。混合后，收集LNP，并在15mM Tris、5％蔗糖缓冲液中在4℃透析过夜。通过使用Amicon 10kDa离心过滤器(密理博公司(Millipore))离心来浓缩萤火虫萤光素酶mRNA-LNP配制品。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。最终的LNP储存在-80℃直至进一步使用。
表A1：实例11中使用的可电离脂质(式(ix)、(vii)和(iii))
分析制备的LNP的尺寸、均匀性和％RNA封装。使用Malvern Zetasizer DLS仪器(马尔文分析公司(Malvern Panalytical))通过动态光散射进行尺寸和均匀性测量。在通过DLS测量之前在PBS中稀释LNP以确定平均粒径(纳米，nm)和多分散指数(pdi)。萤火虫萤光素mRNA-LNP的粒径显示在表A2中。
表A2：LNP粒径和均匀性
| LNP ID | 可电离脂质 | 粒径(nm) | pdi |
| LNPV019-002 | LIPIDV005 | 77 | 0.04 |
| LNPV006-006 | LIPIDV004 | 71 | 0.08 |
| LNPV011-003 | LIPIDV003 | 87 | 0.08 |
通过基于荧光的RNA定量测定Ribogreen(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))测量萤光素酶mRNA的封装百分比。在1×TE缓冲液中稀释LNP样品，并按照制造商的建议与Ribogreen试剂混合，并在i3SpectraMax分光光度计(分子仪器公司(Molecular Devices))上使用644nm激发和673nm发射波长进行测量。为了确定封装百分比，使用利用完整LNP和破坏的LNP的Ribogreen测定法测量LNP，其中将颗粒与含有0.2％(w/w)Triton-X100的1×TE缓冲液一起孵育以破坏颗粒以允许封装的RNA与Ribogreen试剂相互作用。再次在i3 SpectraMax分光光度计上测量样品以确定RNA的总量。当LNP完整时，从检测到的RNA量中减去总RNA以确定封装的部分。将值乘以100以确定封装百分比。由Ribogreen测量的萤火虫萤光素酶mRNA-LNP和RNA封装百分比报告在表A3中。
表A3：LNP配制后的RNA封装
| LNP ID | 可电离脂质 | ％mRNA封装 |
| LNPV019-002 | LIPIDV005 | 98 |
| LNPV006-006 | LIPIDV004 | 92 |
| LNPV011-003 | LIPIDV003 | 97 |
实例12：原代肝细胞中mRNA-LNP的体外活性测试
在该实例中，包含萤光素酶报告子mRNA的LNP用于将RNA货物递送到培养细胞中。将原代小鼠或原代人肝细胞解冻并以每孔30,000或50,000个细胞的密度分别接种在胶原蛋白包被的96孔组织培养板中。将细胞铺板于不含酚红的1x William培养基E中，并在37℃和5％CO2下孵育。4小时后，将培养基更换为维持培养基(1x William培养基E，不含苯酚，含肝细胞维持补充剂包(赛默飞世尔科技公司))，并且将细胞在37℃和5％CO2下培养过夜。将萤火虫萤光素酶mRNA-LNP在4℃解冻并轻轻混合。在含有7.5％胎牛血清的维持培养基中将LNP稀释至适当浓度。将LNP在37℃孵育5分钟，然后添加到铺板的原代肝细胞中。为了评估RNA货物向细胞的递送，将LNP与原代肝细胞孵育24小时，然后收获细胞并裂解以进行萤光素酶活性测定。简而言之，从每个孔中吸出培养基，然后用1x PBS洗涤。从每个孔中吸出PBS，并将200μL被动裂解缓冲液(PLB)(普洛麦格公司(Promega))添加回每个孔中，然后放置在板振荡器上10分钟。将PLB中的裂解细胞冷冻并储存在-80℃，直到进行萤光素酶活性测定。
为了进行萤光素酶活性测定，将被动裂解缓冲液中的细胞裂解物解冻，转移到圆底96孔微量滴定板中，并在4℃以15,000g离心3分钟以去除细胞碎片。根据制造商的说明，使用PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测量每个样品的蛋白质浓度。蛋白质浓度用于标准化细胞数量并确定用于萤光素酶测定的裂解物的适当稀释度。根据制造商的说明，使用萤光素酶测定试剂(普洛麦格公司)在白壁96孔微量滴定板中进行萤光素酶活性测定，并使用i3X SpectraMax读板器(分子仪器公司)测量发光。萤火虫mRNA-LNP介导的萤火虫萤光素酶活性的剂量反应结果如图13所示并且表明RNA向培养中的原代细胞中的成功的LNP介导的递送。如图13A所示，如根据实例12，分析根据实例11配制的LNP用于将货物递送至原代人(A)和小鼠(B)肝细胞。萤光素酶测定显示细胞裂解物中的剂量反应性萤光素酶活性，表明RNA成功递送至细胞并从mRNA货物中表达萤火虫萤光素酶。
实例13：LNP介导的RNA向小鼠肝脏的递送。
为了测量LNP介导的将含有萤火虫萤光素酶的颗粒递送至肝脏的有效性，如实例11中所述配制和表征LNP，并在施用至小鼠之前(实例12)进行体外测试。大约8周龄的C57BL/6雄性小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Labs))通过静脉内(i.v.)途径以1mg/kg的剂量被给予LNP。媒剂对照动物静脉内给予300μL磷酸盐缓冲盐水。在注射LNP前30分钟，通过腹膜内途径给小鼠注射5mg/kg的地塞米松。在LNP施用后或6、24、48小时尸检时收集组织，每个时间点每组5只小鼠。收集肝脏和其他组织样品，在液氮中速冻，并储存在-80℃直至分析。
在干冰上将冷冻的肝脏样品粉碎并转移到含有裂解基质D珠(MP生物医药公司(MPBiomedical))的均质管中。将冰冷的1x萤光素酶细胞培养裂解试剂(CCLR)(普洛麦格公司)添加到每个试管中，并将样品在Fast Prep-245G匀浆器(MP生物医药公司)中以6m/s匀浆40秒。将样品转移到干净的微量离心管中并通过离心澄清。在萤光素酶活性测定之前，根据制造商的说明，使用PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)确定每个样品的蛋白质浓度。根据制造商的说明，使用i3X SpectraMax读板器(分子仪器公司)，使用萤光素酶测定试剂(普洛麦格公司)用200μg(总蛋白)肝脏匀浆测量萤光素酶活性。肝样品显示所有脂质配制品成功递送mRNA，其中报告子活性按照LIPIDV005>LIPIDV004>LIPIDV003的排序(图14)。如图14所示，配制含有萤火虫萤光素酶mRNA的LNP，并通过iv将其递送给小鼠，并在施用后6、24和48小时收集肝脏样品并测定萤光素酶活性。各种配制品的报告子活性依次为LIPIDV005>LIPIDV004>LIPIDV003。RNA表达是短暂的，酶水平在48小时后恢复到接近媒剂背景。施用后。该测定验证了这些可电离脂质及其各自配制品对于RNA系统而言用于递送至肝脏的用途。
不希望受实例限制，该实例中描述的脂质和配制品支持报告子mRNA以外的其他RNA分子体内递送的功效。全RNA Gene Writing系统可以通过本文所述的配制品递送。例如，描述了使用Gene Writer多肽mRNA、模板RNA和任选的第二切口gRNA的全RNA系统，用于通过核转染、通过使用修饰的核苷酸、通过脂转染体外编辑基因组，以及编辑细胞，例如，原代T细胞。如本申请所述，这些全RNA系统在细胞免疫原性和毒性方面具有许多独特的优势，这在处理更敏感的原代细胞，尤其是免疫细胞(例如T细胞)时非常重要，与永生化细胞培养细胞系不同。此外，考虑到这些全RNA系统可以使用如本文中提及的新型脂质递送系统靶向替代组织和细胞类型，例如，用于递送至肝、肺、肌肉、免疫细胞等，条件是Gene Writing系统的功能已经在体外的多种细胞类型中得到验证，并且用靶向LNP递送的其他RNA系统的功能是本领域已知的。Gene Writing系统的体内递送可能在许多治疗领域产生巨大影响，例如校正致病突变、滴注保护性变体和增强身体内源性细胞，例如T细胞。考虑到适当的配制品，全RNA Gene Writing被认为能够制造基于细胞的患者中原位治疗剂。
Claims (4)
1.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如，DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、10或11的元件的核酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
2.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如，DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)核酸内切酶结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、10或11的元件的核酸序列或与其具有不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸差异的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
3.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码多肽的核酸(例如，DNA或mRNA)，其中该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)靶DNA结合结构域，其中(i)或(ii)中的一者或两者具有由表3B、10或11的元件的核酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列编码的氨基酸序列；并且
(b)模板RNA(或编码所述模板RNA的DNA)，所述模板RNA包含(i)结合所述多肽的序列和(ii)异源对象序列。
4.一种用于修饰DNA的系统，该系统包含：
(a)多肽或编码该多肽的核酸，其中该多肽包含(i)逆转录酶(RT)结构域，(ii)DNA结合结构域(DBD)；和(iii)核酸内切酶结构域，例如切口酶结构域；并且
(b)模板RNA(或编码该模板RNA的DNA)，其包含(例如，从5′到3′)(i)任选地，结合靶位点(例如靶基因组中位点的未编辑链)的序列，(ii)任选地，结合该多肽的序列，(iii)异源对象序列，和(iv)3′同源结构域，
其中该RT结构域具有表3B、10或11的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
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