JP2023525161A - ウイルスベクター産生 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ウイルスベクターを産生するための新規な方法を提供する。対応するウイルスベクター産生システムおよび使用も提供される。

Description

本発明は、ウイルスベクターを産生するための新規な方法を提供する。対応するウイルスベクター産生システムおよび使用も提供される。
ワクチンおよびヒト遺伝子治療に向けての過去数十年にわたるウイルスベクターの開発および製造は、科学誌および特許に十分に記載されてきた。治療効果を求めて導入遺伝子を導入するための操作されたウイルスの使用は多岐にわたる。γ－レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのＲＮＡウイルス（Muhlebach, M.D. et al., 2010, Retroviruses: Molecular Biology, Genomics and Pathogenesis, 13:347-370; Antoniou, M.N., Skipper, K.A. & Anakok, O., 2013, Hum. Gene Ther., 24:363-374）、ならびにアデノウイルス（Capasso, C. et al., 2014, Viruses, 6:832-855）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Kotterman, M.A. & Schaffer, D.V., 2014, Nat. Rev. Genet., 15:445-451）などのＤＮＡウイルスに基づく現代の遺伝子治療ベクターは、増加しつつあるヒト疾患の適応において有望であることが示されている。これには、血液学的状態に対する患者細胞のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）改変（Morgan, R.A. & Kakarla, S., 2014, Cancer J., 20:145-150; Touzot, F. et al., 2014, Expert Opin. Biol. Ther., 14:789-798）、ならびに眼（Balaggan, K.S. & Ali, R.R., 2012, Gene Ther., 19:145-153）、心血管（Katz, M.G. et al., 2013, Hum. Gene Ther., 24:914-927）、神経変性疾患（Coune, P.G., Schneider, B.L. & Aebischer, P., 2012, Cold Spring Harb. Perspect. Med., 4:a009431）および腫瘍療法（Pazarentzos, E. & Mazarakis, N.D., 2014, Adv. Exp. Med Biol., 818:255-280）のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）治療が含まれる。臨床試験におけるこれらのアプローチの成功が、規制当局の承認および商業化に向けて確立され始めるのに伴って、優良製造規範（ＧＭＰ）グレードのベクター材料の大量生産における新たなボトルネックに注目が集まっている（Van der Loo JCM, Wright JF., 2016, Human Molecular Genetics, 25(R1):R42-R52）。
この課題を克服する方法の１つは、ウイルスベクター産生中のタイターを最大化する新しい方法を見出すことである。ウイルスベクターの一般的な製造方法は、ベクターＤＮＡ構成要素による初代細胞または哺乳動物／昆虫細胞株のトランスフェクションの後に、限られた培養期間を経て、培養培地および／または細胞から粗ベクターを収集することを伴う（Merten, O-W., Schweizer, M., Chahal, P., & Kamen, A.A., 2014, Pharmaceutical Bioprocessing, 2:183-203）。他のケースでは、プロデューサー細胞株（ＰｒＣＬ；必要なベクター構成要素発現カセットのすべてが産生細胞ＤＮＡに安定に組み込まれている）が、トランスフェクションに依存しないアプローチに使用されており、これは規模が大きい場合に有利である。ウイルスベクター製造の効率は、典型的には、［１］採用されるウイルス血清型／シュードタイプ、［２］導入遺伝子配列の組成およびサイズ、［３］培地組成／通気／ｐＨ、［４］トランスフェクション試薬／過程、［５］化学誘導およびベクター収集のタイミング、［６］細胞の脆弱性／生存性、［７］バイオリアクターの剪断力、ならびに［８］不純物を含む、「上流相」のいくつかの要因による影響を受ける。明らかに、「下流」精製／濃縮相において考慮すべき他の要因もある（Merten, O-W. et al., 2014, Pharmaceutical Bioprocessing, 2:237-251）。
したがって、ＧＭＰグレードのベクター材料の大量生産にかかわる既知の問題に対処するのに役立つ代替的なウイルスベクター産生の方法を提供することには、当技術分野において需要がある。
本発明者らは、驚いたことに、ウイルスベクター産生中にＰＫＣアクチベーターを単独でまたはＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用することにより、ウイルスベクタータイターが著しく増加することを示した。したがって、本発明は、ＰＫＣアクチベーターの、ｉ）ウイルスベクター産生の誘導剤としてのそれ単独での、またはｉｉ）ＨＤＡＣ阻害剤によるウイルスベクター産生の誘導の増強剤としての、使用に関する。
本発明者らはまた、ＰＫＣアクチベーターで処理された細胞が高い細胞生存率を維持することを示しており、これはウイルスベクター産生中に有益である。
したがって、ウイルスベクターを産生するための方法であって、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞を、ＰＫＣアクチベーターを含む細胞培養培地中で培養することを含む方法が提供される。
好適には、ウイルスベクターは自己不活性化ウイルスベクターであり得る。
好適には、ＰＫＣアクチベーターは、プロストラチンまたはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、
ａ）プロストラチンは細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在することができ、プロストラチンは約０．５から約３２μＭの濃度で存在してもよく；または
ｂ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは細胞培養培地中に少なくとも約１ｎＭの濃度で存在することができ、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは約１から約３２ｎＭの濃度で存在してもよい。
好適には、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡはレンチウイルスベクター構成要素と共発現させることができ、前記改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合する。
好適には、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得、レンチウイルスベクターの主要スプライスドナー領域からのスプライシング活性が機能的に除去されていることがあり得る。
好適には、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得、レンチウイルスベクターゲノムは、主要スプライスドナー領域で突然変異しているか、または主要スプライスドナー領域および少なくとも１つの潜在的スプライスドナー領域で突然変異している。
好適には、細胞培養培地はＨＤＡＣ阻害剤をさらに含み得る。
好適には、ＨＤＡＣ阻害剤は、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤またはヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤であり得る。
好適には、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウムまたは吉草酸、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、ＰＫＣアクチベーターはプロストラチンであり得、ＨＤＡＣ阻害剤は酪酸ナトリウムであり得る。
好適には、ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤は、スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、
ａ）酪酸ナトリウムは細胞培養培地中に少なくとも約２．５ｍＭの濃度で存在することができ、酪酸ナトリウムは約２．５から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；
ｂ）バルプロ酸ナトリウムは細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在することができ、バルプロ酸ナトリウムは約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；
ｃ）吉草酸は細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在することができ、吉草酸は約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；または
ｄ）スベルアニロヒドロキサム酸は細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在することができ、スベルアニロヒドロキサム酸は約０．５から約１６μＭの濃度で存在してもよい。
好適には、細胞は一過性にトランスフェクトされた産生細胞であり得る。この文脈において、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列は、産生細胞に一過性に導入される。
好適には、細胞は安定したプロデューサー細胞であり得る。この文脈において、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列は、プロデューサー細胞に安定に組み込まれる。
好適には、細胞は真核細胞であり得る。
好適には、細胞は哺乳動物細胞であり得る。
好適には、細胞はヒト細胞であり得る。
好適には、細胞は接着性であり得る。
細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、またはその派生物であり得る。
好適には、ＨＥＫ２９３産生細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり得る。
好適には、細胞は浮遊状態にあり得る。
好適には、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択され得る。
好適には、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。
好適には、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびビスナレンチウイルスベクターからなる群から選択され得る。
好適には、ウイルスベクターは、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含み得る。
好適には、細胞培養培地は、容量が少なくとも約５リットルの培地で構成され得る。
好適には、細胞培養培地は無血清であり得る。
好適には、ウイルスベクター構成要素をコードする少なくとも１つの核酸配列は、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結することができ、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択されてもよい。
ｉ）ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞；および
ｉｉ）ＰＫＣアクチベーターを含む細胞培養培地
を含むウイルスベクター産生システムも提供される。
好適には、ウイルスベクターは自己不活性化ウイルスベクターであり得る。
好適には、ＰＫＣアクチベーターは、プロストラチンまたはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、
ａ）プロストラチンは細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在することができ、プロストラチンは約０．５から約３２μＭの濃度で存在してもよく；または
ｂ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは細胞培養培地中に少なくとも約１ｎＭの濃度で存在することができ、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは約１から約３２ｎＭの濃度で存在してもよい。
好適には、ウイルスベクター産生システムは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする核酸配列をさらに含むことができ、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合する。
好適には、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得、レンチウイルスベクターゲノムの主要スプライスドナー領域からのスプライシング活性が機能的に除去されている。
好適には、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得、レンチウイルスベクターゲノムは、主要スプライスドナー領域で突然変異しているか、または主要スプライスドナー領域および少なくとも１つの潜在的スプライスドナー領域で突然変異している。
好適には、細胞培養培地はＨＤＡＣ阻害剤をさらに含み得る。
好適には、ＨＤＡＣ阻害剤は、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤またはヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤であり得る。
好適には、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウムまたは吉草酸、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、ＰＫＣアクチベーターはプロストラチンであり得、ＨＤＡＣ阻害剤は酪酸ナトリウムであり得る。
好適には、ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤は、スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、
ａ）酪酸ナトリウムは細胞培養培地中に少なくとも約２．５ｍＭの濃度で存在することができ、酪酸ナトリウムは約２．５から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；
ｂ）バルプロ酸ナトリウムは細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在することができ、バルプロ酸ナトリウムは約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；
ｃ）吉草酸は細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在することができ、吉草酸は約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；または
ｄ）スベルアニロヒドロキサム酸は細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在することができ、スベルアニロヒドロキサム酸は約０．５から約１６μＭの濃度で存在してもよい。
好適には、細胞は一過性にトランスフェクトされた産生細胞であり得る。
好適には、細胞は安定したプロデューサー細胞であり得る。
好適には、細胞は真核細胞であり得る。
好適には、細胞は哺乳動物細胞であり得る。
好適には、細胞はヒト細胞であり得る。
好適には、細胞は接着性であり得る。
好適には、細胞はＨＥＫ２９３細胞、またはその派生物であり得る。
好適には、ＨＥＫ２９３産生細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり得る。
好適には、細胞は浮遊状態にあり得る。
好適には、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択され得る。
好適には、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。
好適には、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびビスナレンチウイルスベクターからなる群から選択され得る。
好適には、ウイルスベクターは、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含み得る。
好適には、細胞培養培地は無血清であり得る。
好適には、ウイルスベクター構成要素をコードする少なくとも１つの核酸配列は、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結することができ、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択されてもよい。
本明細書に記載される方法またはウイルスベクター産生システムの文脈において、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列は、レンチウイルスベクターの産生に必要なウイルスベクター構成要素をコードすることができる。例えば、それらは、以下をコードし得る：ｉ）ｇａｇ－ｐｏｌ；ｉｉ）エンベロープ；ｉｉｉ）ウイルスベクターゲノム（典型的にはＮＯＩをコードする）およびｉｖ）適宜、ｒｅｖまたはその機能的代替物、ここでｅｎｖはＶＳＶ－Ｇ ｅｎｖであり得る。ｉ）からｉｖ）までの各核酸配列は、別々であることもでき、または１つのモジュールコンストラクトの一部でもあり得る。例えば、ｉ）からｉｖ）までの核酸配列のうちの少なくとも２つは、同じ遺伝子座に位置するウイルスベクター構成要素をコードするモジュール式コンストラクトであり得る。さらなる一例では、核酸配列の少なくとも２つは、逆向きおよび／または交互の向きにウイルスベクター構成要素をコードするモジュール式コンストラクトであり得る。さらに別の例では、核酸配列の少なくとも２つはｇａｇ－ｐｏｌおよび／またはｅｎｖをコードするモジュール式コンストラクトであり、モジュール式コンストラクトは少なくとも１つのレギュレーターエレメントと関連付けられている。
ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列は、代替的に、異なるレトロウイルスベクターの産生のために必要なウイルスベクター構成要素、またはアデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターもしくはワクシニアウイルスベクターの産生のために必要なウイルス構成要素をコードすることもできる。これらのウイルスベクターのそれぞれの産生のために必要な機能的構成要素は、当技術分野で周知である。例えば、ＡＡＶベクターの産生のために、カプシドタンパク質をコードする核酸配列を使用することができる。ウイルスベクター産生中にウイルスベクタータイターを増加させるためのＰＫＣアクチベーターの使用も提供される。
好適には、ＰＫＣアクチベーターは、ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用することできる。
好適には、ウイルスベクターは自己不活性化ウイルスベクターであり得る。
好適には、ＰＫＣアクチベーターは、プロストラチンまたはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、ＨＤＡＣ阻害剤は、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤またはヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤であり得る。
好適には、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウムまたは吉草酸、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、ＰＫＣアクチベーターはプロストラチンであり得、ＨＤＡＣ阻害剤は酪酸ナトリウムであり得る。
好適には、ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤は、スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩であり得る。
好適には、ウイルスベクターは、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞から産生することができ、核酸配列の少なくとも１つは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されており、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択されてもよい。
本発明の様々な態様について、以下にさらに詳細に記載する。
本発明の実施形態について、添付の図面を参照しながらさらに説明する。
図１は、（Ａ）パッケージングシグナルのステムループ（ＳＬ２）内に埋め込まれた機能的な主要スプライスドナーを含有する、第３世代（自己不活性化（ＳＩＮ））レンチウイルスベクター発現カセットの典型的な構成の模式図、およびレンチウイルスベクター産生中に生成されるｍＲＮＡの種類を示している。「標準的」レンチウイルスベクター（ＬＶ）ＤＮＡカセット、およびＭＳＤからの乱交雑的な活性を抑制または除去する機能的突然変異をＭＳＤ領域に有するレンチウイルスベクターＤＮＡカセット（「ＭＳＤ－ＫＯ ＬＶ ＤＮＡカセット」）から生成されるｍＲＮＡの種類を示している。どちらのカセットについても、完全長（「非スプライス」）ベクターＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に結合して、ＭＳＤからＲＲＥ配列に含まれるスプライスアクセプター７（ｓａ７）へのスプライシングを抑制すると一般に考えられているｒｅｖの共発現によって生じている。標準的レンチウイルスベクターＤＮＡカセットについては、ｒｅｖが存在しない場合、すべてのイントロンのスプライスアウトが効率的に行われると一般に考えられている（「スプライスされた」）。しかし、「異常」スプライス産物がレンチウイルスベクター産生中に生じる可能性があり、ＭＳＤはスプライスアクセプター部位または潜在的スプライスアクセプター部位を非常に効率的にスプライスし［（「異常に」スプライスされた）］、典型的にはＲＲＥ含有イントロンを「見過ごす」ため、その結果、ｒｅｖはＭＳＤのこの活性に最小限の影響しか及ぼさない。また、レンチウイルスベクター産生を、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターＤＮＡカセットのパッケージング領域に再方向付けされた改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡの共発現によって行うこともできる（凡例：Ｐｒｏ、プロモーター；５’Ｒからｇａｇまでの領域はパッケージングエレメント｛Ψ｝を含有する；ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプター；ＧＯＩ、目的の遺伝子；グレーの矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生される非スプライスｖＲＮＡの割合を評価するための順方向｛ｆ｝および逆方向｛ｒ｝プライマーの位置を示す。わかりやすくするために転写後調節エレメント｛ＰＲＥ｝は示していない）。（Ｂ）ＳＩＮ ＬＶベクターのＬＴＲからＵ３が除去される。（Ｃ）第３世代ＣＭＶ駆動性ＬＶベクタープラスミド。 図２は、様々な濃度の抗酸化剤（ＮＡＣ）、ＨＤＡＣ阻害剤（酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウム、吉草酸、ＳＡＨＡ、ＴＳＡ）；ＨＡＴ阻害剤（タンニン酸）；転写アクチベーター：ＰＭＡ、ＨＭＢＡおよびプロストラチンにより誘導されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの最終的なベクタータイターを示している。 図３は、ＮＡＣのランダムな組み合わせ；ＨＤＡＣ阻害剤：酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウム、吉草酸、ＳＡＨＡ、ＴＳＡ；ＨＡＴ阻害剤（タンニン酸）ならびに転写アクチベーター：ＰＭＡ、ＨＭＢＡおよびプロストラチンにより誘導されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの最終的なベクタータイターを示している。点線は２０ｍＭ酪酸ナトリウムによる誘導レベルを示す。 図４は、様々な濃度のＨＤＡＣ阻害剤（酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウム、吉草酸、ＳＡＨＡ）；転写アクチベーター：ＨＭＢＡ、プロストラチンおよびＰＭＡ；ならびにＨＤＡＣ阻害剤と転写アクチベーターの組み合わせにより誘導されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの最終的なベクタータイターを示している。矢印は併用された誘導剤の濃度を示している。 図５は、（Ａ）様々な濃度の酪酸ナトリウム、プロストラチンおよびＨＭＢＡにより誘導されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの最終的なベクタータイター、（Ｂ）ベクタータイターの結果のＪＭＰ予測プロファイラーを示している。 図６は、（Ａ）バルプロ酸ナトリウム、（Ｂ）吉草酸、および（Ｃ）ＳＡＨＡについてのベクタータイターの結果のＪＭＰ予測プロファイラーを示している。 図７は、プロストラチンの存在下または非存在下で、様々な濃度の酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウム、吉草酸およびＳＡＨＡにより誘導されたＨＥＫ１．６５ｓ細胞からの最終的なベクタータイターを示している。 図８は、様々な濃度のプロストラチンおよび酪酸ナトリウムにより誘導されたＨＥＫ１．６５ｓ細胞からの最終的なベクタータイターを示している。 図９は、（Ａ）ベクタータイターに対する酪酸ナトリウムとプロストラチンの相互作用のＳｕｒｆａｃｅプロット、（Ｂ）ＤＯＥ予測と実際（Ａｃｔｕａｌ ｂｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ）のプロット、効果の概要および不適合度の表、ならびに（Ｃ）予測プロファイラーを示している。 図１０は、（Ａ）ＦＡＣＳおよび（Ｂ）二重組込みＱＰＣＲアッセイによって測定されたウイルスタイターを示している。 図１１は、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ分子の概略図であり、本発明において使用するために標的配列を変更する方法の一例である。Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、内因性非コード性ＲＮＡであり、イントロンスプライシングの初期段階で、５’－（ＡＣ）ＵＵＡＣＣＵＧ－３’（配列番号２）（グレーで強調表示）ネイティブ性スプライスドナー標的配列を介して、コンセンサススプライスドナー部位（５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’（配列番号１））に結合する。ステムループＩは、ポリＡ抑制に重要であることが示されているＵ１Ａ－７０Ｋタンパク質に結合する。ステムループＩＩはＵ１タンパク質に結合し、５’－ＡＵＵＵＧＵＧＧ－３’（配列番号３）配列はＳｍタンパク質に結合するが、これはステムループＩＶと共にＵ１ ｓｎＲＮＡのプロセシングに重要である。本発明では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを改変して、ネイティブ性スプライスドナー標的配列の部位に、ベクターゲノムｖＲＮＡ分子内の標的配列に相補的な異種配列を導入する；この図では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、標準的なＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノムの１５ヌクレオチド（ベクターゲノム分子の最初のヌクレオチド、２５６Ｕ１に対して２５６～２７０）に導かれる例が示されている（パッケージングシグナルの場合はＳＬ１ループに位置する）。 図１２は、ＨＩＶ－１に基づくレンチウイルスベクター内の主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ）からの異常スプライシングの影響。（Ａ）第３世代（自己不活性化（ＳＩＮ））レンチウイルスベクター発現カセットの典型的な構成を示す模式図は図１に示されている。図１２では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において標準的な第３世代レンチウイルスベクター産生を＋／－ｒｅｖで行い、産生後の細胞から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを、２つのプライマーセット（Ａの印を付した位置）を使用するｑＰＣＲ（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ）に供した：ｆ＋ｒＴはレンチウイルスベクター発現カセットから生成された全転写産物を増幅し、ｆ＋ｒＵＳは非スプライス転写産物を増幅した；これにより、非スプライスｖＲＮＡ転写産物と全ｖＲＮＡ転写産物との割合を計算してプロットした。このデータは、標準的な第３世代レンチウイルスベクター産生の合計に比して、非スプライスｖＲＮＡの割合が中程度であり、内部導入遺伝子カセット（この場合は異なるプロモーターおよびＧＦＰ遺伝子を含有する）によって異なることを示している。さらに、この割合はｒｅｖの作用によって最小限にしか増加しない。 図１３は、（Ａ）ＥＦ１ａ－ＧＦＰ内部発現カセットをコードする標準的またはＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクター発現カセットの構成、およびレンチウイルスベクター産生中に生成されるｍＲＮＡの種類を示す模式図。（凡例：凡例：Ｐｒｏ、プロモーター；５’Ｒからｇａｇまでの領域はパッケージングエレメント｛Ψ｝を含有する；ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプター；ＧＯＩ、目的の遺伝子；グレーの矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生される非スプライスｖＲＮＡの割合を評価するための順方向｛ｆ｝および逆方向｛ｒ｝プライマーの位置を示す。わかりやすくするために転写後調節エレメント｛ＰＲＥ｝は示していない）。（Ｂ）［ｉ］標準的レンチウイルスベクターまたはＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、＋／－ｔａｔ、または１７９Ｕ１、または３０５Ｕ１で産生させ、タイターを測定した。［ｉｉ］全細胞質ｍＲＮＡを産生後の細胞から抽出し、ＳＬ２スプライシング領域ＳＬ２スプライシング領域からＥＦ１スプライスアクセプターまでの主要な「異常な」スプライス産物を検出し得るプライマー（ｆ＋ｒＧ）を使用するＲＴ－ＰＣＲ／ゲル電気泳動によって分析した。データは、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム（ｖＲＮＡ）の５’パッケージング領域に再方向付けされた改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、ｔａｔと類似の様式で標準的およびＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの両方のタイターを増加させ得ることを示している。ＭＳＤ－２ＫＯ突然変異は、ＳＬ２スプライシング領域からＥＦ１スプライスアクセプターまでの「異常な」スプライシング産物の検出を消失させた（図１４参照）。重要なことに、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによるタイターの増加は、ｔａｔの使用とは対照的に、事実上検出不可能な「異常な」スプライス産物の維持を伴っていた。 図１４は、機能的な主要スプライスドナー突然変異、レンチウイルスベクタータイターに対するそれらの影響、および改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる回復の説明。（Ａ）「野生型」ＨＩＶ－１（ＮＬ４－３；今回のレンチウイルスベクターゲノム内の「標準的」配列）のステムループ２（ＳＬ２）領域の配列を上部に示す。この配列は主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ：コンセンサス＝ＣＴＧＧＴ）および潜在的スプライスドナー部位（これはＭＳＤ部位が独自に突然変異した場合に利用される（ｃｒＳＤ：コンセンサス＝ＴＧＡＧＴ））を含む。スプライスドナー部位を使用した用いた場合のスプライシング位置のヌクレオチドを太字および矢印によって特定している。ＭＳＤおよびｃｒＳＤ部位のスプライシング活性の両方を除去する４つの機能的ＭＳＤ突然変異が記載されている：ＭＳＤおよびｃｒＳＤから２つの「ＧＴ」モチーフを突然変異させるＭＳＤ－２ＫＯ；ＭＳＤおよびｃｒＳＤの両方の部位を破壊する突然変異も含むＭＳＤ－２ＫＯｖ２；スプライスドナー部位を全く持たない全く新しいステムループ構造を導入したＭＳＤ－２ＫＯｍ５；ならびにＳＬ２配列を完全に削除したΔＳＬ２。ＭＳＤ－２ＫＯ、ＭＳＤ－２ＫＯｖ２およびＭＳＤ－２ＫＯｍ５突然変異においてＳＬ２配列に導入された置換は小文字の斜体で示されている。（Ｂ）機能的ＭＳＤ突然変異（図１４Ａに記載）を含む４つのレンチウイルスベクターゲノム突然変異体をＥＦＳ－ＧＦＰ内部カセットにクローニングし、さらにＭＳＤ－２ＫＯまたはＭＳＤ－２ＫＯｍ５突然変異体をＥＦ１ａ－、ＣＭＶ－またはｈｕＰＧＫ－ＧＦＰ内部カセットにクローニングした。標準的およびＭＳＤ突然変異ＬＶをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、＋／－２５６Ｕ１で産生させて、タイターを測定した。このデータは、レンチウイルスベクタータイターの減衰の程度が特定の突然変異によって異なる可能性があり、ＭＳＤ－２ＫＯｍ５突然変異体は一般に減衰の少ない表現型を生じることを示している。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、産生中に共発現されると、機能的ＭＳＤ突然変異を含む４つのレンチウイルスベクターゲノム突然変異体についてのレンチウイルスベクタータイターを増加させることができた。タイターの増加は、２５６Ｕ１がＭＳＤ－２ＫＯｍ５配列を有するＭＳＤ突然変異ＬＶゲノムと共に発現された場合に最大であった。 図１５は、主要スプライスドナー（ＭＳＤ）領域内に機能的突然変異を有するレンチウイルスベクター（ＬＶ）の産生タイターを増加させるための、プロストラチンの単独での使用または改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡとの併用。ＭＳＤ、およびＭＳＤのすぐ下流の潜在的スプライス部位の突然変異による効果は、ベクターＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の産生の減少に起因する産生タイターの減少である。ＭＳＤ突然変異ＬＶのタイターは、ｖＲＮＡのパッケージング領域内の領域にアニールし得るように改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを供給することによって回復させることができ、それによってパッケージング可能なｖＲＮＡのプールを増やすことができる。ＭＳＤ突然変異ＬＶ産生中のプロストラチンの供給もまた、タイターを強化させ得るか否かを試験するために、ＨＩＶ－ＭＳＤ２ＫＯｍ５－ＥＦＳ－ＧＦＰ（Ａ）またはＨＩＶ－ＭＳＤ２ＫＯｍ５－ＥＦ１ａ－ＧＦＰ（Ｂ）を、誘導剤の非存在下で、または１１μＭのプロストラチン（酪酸ナトリウムの段階で添加）または「２５６Ｕ１」改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを発現するプラスミドとの共トランスフェクションにより、無血清浮遊ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生させた。驚いたことに、プロストラチンはＭＳＤ突然変異ＬＶベクタータイターを５～１０倍増加させ、プロストラチンおよび２５６Ｕ１を共に適用した場合に達成されたタイターは、誘導剤がない場合に産生される標準的ＬＶ産生タイターよりも高かった。 図１６は、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ１．６５ｓ細胞において、タイター増強剤の非存在下で産生されたＣＡＲ＃１、ＣＡＲ＃２およびＣＡＲ＃２－Ｔ２Ａ－ＧＦＰのベクタータイターを、２５６Ｕ１の発現下、誘導時の１１μＭプロストラチン、２５６Ｕ１発現と誘導時の１１μＭプロストラチンの組み合わせについて示している。 図１７は、ＥＩＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰの産生のための収集時のベクタータイター（ＴＵ／ｍＬ）を、誘導時の１１μＭのプロストラチンの存在下および非存在下について示している。 図１８は、プロストラチンによる強度の異なるプロモーターの誘導を示している。浮遊（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、一定のプロモーターによって駆動されるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトした。産生中のウイルスベクター構成要素（例えば、ＡＡＶカプシド、ＬＶゲノム）の発現をモデル化するために、２つの異なるプラスミド投入量（０．１μｇ／ｍＬ［Ｌｏ］および０．９５μｇ／ｍＬ［Ｈｉ］）を行い、トランスフェクション後にすべての培養物を、１０ｍＭ酪酸ナトリウムの存在下または非存在下で１１μＭプロストラチンにより誘導した。トランスフェクションのおよそ２日後に、細胞をフローサイトメトリーによって分析してＧＦＰ発現を測定した。各条件について導入遺伝子発現スコア（ＧＦＰ陽性率×蛍光強度中央値）を求め、直線ｙ軸に対してプロットした（２組のグラフのｙ軸の範囲は、一番上から一番下までｌｏｇ－１０の大きさの違いがあることに注意。すなわち、最も強いプロモーターから最も弱いプロモーターまで）。サイトメガロウイルスプロモーター－ＣＭＶ、ラウス肉腫ウイルスＵ３プロモーター－ＲＳＶ、ＣＡＧ合成プロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーターエキソン／イントロン、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプター）、チャイニーズハムスターＥＦ－１α－１プロモーター－ＣＨＥＦ１、ＧＲＰ７８／ＢｉＰ（ストレス誘導性）プロモーター－ＧＲＰ７８、ユビキチン－Ｃプロモーター－ＵＢＣ、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター－ＨＩＶ－１ Ｕ３、ヒトフェリチン重鎖プロモーター－ＦＥＲＨ、非形質転換対照－ＵＴＣ。
本発明の様々な態様について、以下にさらに詳細に説明する。
詳細な説明
本発明者らは、ＰＫＣアクチベーターを使用することで、ウイルスベクター産生中のウイルスベクタータイターを増加させ得ることを突き止めた。さらに、本発明者らは、ウイルスベクター産生中にＰＫＣアクチベーターが存在する場合に細胞生存率が維持されることを示した。したがって、本明細書に記載される方法、ウイルスベクター産生システム、および使用は、本明細書で以下により詳細に記載される通りのＰＫＣアクチベーターの使用を含む。
Ａ．ＰＫＣアクチベーター
（ｉ）ウイルスベクターを産生するための方法
ウイルスベクターを産生するための方法であって、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞を、ＰＫＣアクチベーターを含む細胞培養培地中で培養することを含む方法が提供される。
「細胞」、「培養」、「細胞培養」、「細胞培養培地」、「核酸配列」、「ウイルスベクター」および「ウイルスベクター構成要素」という用語は、本明細書中の他の箇所でより詳細に記載されており、ここに同様に適用される。
本明細書に記載される方法に使用される細胞は、一過性にトランスフェクトされた産生細胞または安定なプロデューサー細胞であり得る。「一過性にトランスフェクトされた産生細胞」および「安定なプロデューサー細胞」という用語は、本明細書中の他の箇所でより詳細に記載されており、ここに同様に適用される。
細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）であり得る。代替的な細胞型については、以下でより詳細に考察する。
細胞は、接着性であり得、または浮遊状態でもあり得る。好適な細胞型は、本明細書中の他の箇所でより詳細に考察されており、ＨＥＫ２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）またはその派生物が含まれる。
本明細書に記載される方法は、あらゆる好適なウイルスベクターの産生に使用し得る。適切なウイルスベクターについては、定義のセクションでより詳細に記載されており、ここに同様に適用される。本明細書に記載される方法によって産生され得るウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターが含まれる。これらの各ベクターの詳細は別の箇所に提示されており、ここに同様に適用される。
本明細書に記載される方法は、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターの産生に特に好適である。例えば、本明細書に記載される方法は、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびビスナレンチウイルスベクターからなる群から選択されるレンチウイルスベクターの産生に使用し得る。一例では、本明細書に記載される方法は、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）またはＥＩＡＶレンチウイルスベクターから選択されるレンチウイルスベクターの産生に使用し得る。
これらのレンチウイルスベクターのそれぞれについては、本明細書中の別の箇所でより詳細に記載される。
本明細書中に提供される方法は、自己不活性化（ＳＩＮ）ウイルスベクター（例えば、ＳＩＮレンチウイルスベクター）を産生する際に特に有用である。ＳＩＮベクターの特性は、本明細書中の別の箇所でより詳細に記載されている。特定の一例では、ＳＩＮベクターは、第３世代ＳＩＮウイルスベクター（例えば、第３世代レンチウイルスベクター）であり得る。
典型的には、本明細書に記載される方法によって産生されるウイルスベクターは、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む。ＮＯＩは任意の好適なＮＯＩであり得る。好適なＮＯＩの例は、本明細書中の別の箇所に提示されている。
典型的には、一部の例では、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列は、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｅｎｖ、適宜ｒｅｖ、およびウイルスベクターのゲノムを含むベクター構成要素をコードする。さらなる詳細は、本明細書中の他の箇所に提示されている。
本発明者らは、ＰＫＣアクチベーター（例えば、プロストラチン）の添加により、使用するプロモーターにかかわらず（すなわち、効果がプロモーター特異的ではない）、ウイルスベクタータイターが増加する（および細胞生存率が維持される）ことを示した。本発明者らは、本明細書で観察される効果が使用されるプロモーターとは無関係であることを実証するために、いくつかの異なるプロモーターを試験した。一例として、本発明者らは、本発明の方法が、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＣＨＥＦ－１（ＣＨＯ由来伸長因子１）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）およびＧＲＰ７８（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）プロモーター（それぞれＧＦＰゲノム、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶＧプラスミドの発現をそれぞれ駆動するため）の使用に適合することを示した。加えて、本発明者らは、ＧＦＰプラスミドの発現をプロストラチンにより誘導する際に、以下のプロモーターを使用し得ることを実証した：サイトメガロウイルスプロモーター－ＣＭＶ、ラウス肉腫ウイルスＵ３プロモーター－ＲＳＶ、ＣＡＧ合成プロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーター－エキソン／イントロン、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプター）、チャイニーズハムスターＥＦ－１α－１プロモーター－ＣＨＥＦ１、ＧＲＰ７８／ＢｉＰ（ストレス誘導性）プロモーター－ＧＲＰ７８、ユビキチン－Ｃプロモーター－ＵＢＣ、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター－ＨＩＶ－１ Ｕ３、およびヒトフェリチン重鎖プロモーター－ＦＥＲＨの各プロモーター（図１８参照）。これらのプロモーターを使用して、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターを含む、いくつかの異なる種類のウイルスベクターのウイルスベクター産生を駆動することができる。例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＣＡＧなどの強力なプロモーターを、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む構造的ウイルスベクター構成要素などのウイルスベクター構成要素の発現を駆動するために選択することができる。本明細書に記載されるＰＫＣアクチベーターは、これらのプロモーターの１つまたは複数を使用する場合に、ウイルスベクター産生を増加させるために有利に使用することができる。したがって、本発明は、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞からのウイルスベクター産生中にウイルスベクタータイターを増加させるためのＰＫＣアクチベーターの使用であって、核酸配列の少なくとも１つが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている使用を提供する。プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択されてもよい。このことは、強力なプロモーターの使用が望ましい場合に、構造的ウイルスベクター構成要素（ＡＡＶカプシドタンパク質など）をコードする核酸配列について特に該当する。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。
したがって、本発明は、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞からのウイルスベクター産生中にウイルスベクタータイターを増加させるためのＰＫＣアクチベーターの使用であって、核酸配列の少なくとも１つが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されており、ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、使用を提供する。プロモーターは、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択されてもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。
本発明者らは、ウイルスベクター産生中に細胞培養培地にＰＫＣアクチベーターが存在すると、ウイルスベクタータイターが増加することを突き止めた。したがって、本明細書に記載される方法に使用される細胞培養培地は、ＰＫＣアクチベーターを含むことを条件として、任意の好適な細胞培養培地であり得る。好適な細胞培養培地および細胞培養法については、本明細書中の他の箇所でより詳細に記載されており、ここに同様に適用される。
特定の一例では、細胞培養培地は無血清であり得る。本明細書で使用される場合、「無血清条件」は、培養培地から血清が除外されており、その結果、例えば、培養培地が血清を含まない（すなわち、本質的に含まないか、または添加されていない）条件である。
本明細書で使用される場合、「プロテインキナーゼＣアクチベーター」または「ＰＫＣアクチベーター」は、ＰＫＣによって触媒される反応の速度を増加させる物質を指す。いくつかのＰＫＣアクチベーター、およびＰＫＣアクチベーターを同定する方法が、当技術分野で周知である。ＰＫＣアクチベーターを同定する好適な方法の例は、Chakravarthy et al., Analytical Biochemistry, Vol 196, Issue 1, 1991, pp 144-150）に提示されている。ＰＫＣアクチベーターは、本明細書ではＰＫＣアゴニストとも称される。
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、プロテインキナーゼの最大の遺伝子ファミリーの１つである。セリン－トレオニンキナーゼのプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーは、種々の生物現象において重要な調節の役割を果たしている。ＰＫＣファミリーは、３つの異なるカテゴリーに属する少なくとも１２種の個別のアイソフォームで構成される：（ｉ）ホスホリパーゼＣによって細胞内に遊離されるＣａ２＋、ホルボールエステルおよびジアシルグリセロールによって活性化される通常のアイソフォーム２５（α、β１、β２、γ）；（ｉｉ）ホルボールエステルおよびジアシルグリセロールによって同じく活性化されるが、Ｃａ２＋によっては活性化されない新規アイソフォーム（δ、η、ε、θ）；ならびに（ｉｉｉ）Ｃａ２＋、ホルボールエステルまたはジアシルグリセロールによって活性化されない、このファミリーの非定型（ζ、λ、ι）メンバー。プロテインキナーゼＣの実体は、アデノシン三リン酸およびリン脂質補因子が存在する場合にタンパク質をリン酸化する能力によって一般に確立され、これらの補因子が存在しない場合には活性が大幅に低下する。さらに、プロテインキナーゼＣの一部の形態は、最大活性のためにカルシウムイオンの存在を必要とする。プロテインキナーゼＣ活性は、酵素上の認識部位に特異的かつ化学量論的に結合するある特定の１，２－ｓｎ－ジアシルグリセロールによっても大きく刺激される。活性化されると、すべてではないがほとんどのアイソフォームが細胞質から原形質膜に移行すると考えられている。ＰＫＣは多種多様な生物過程において重要であるため、多くの研究によってその構造および機能が特徴付けられている。
ＰＫＣアクチベーターは、非特異的なアクチベーターまたは特異的なアクチベーターであり得る。特異的なアクチベーターは、１つのＰＫＣアイソフォーム、例えば、ＰＫＣ－ε（イプシロン）を、別のＰＫＣアイソフォームよりも検出可能な程度で大きく活性化する。例示的なＰＫＣアクチベーターは、ＷＯ２０１７／０６２９２４ Ａ１に、特に段落［０３９］、［０４０］、［０５３］、［０５８］～［０１１２］に開示されており、その内容はすべて参照により本明細書に組み込まれる。その内容がすべて参照により本明細書に組み込まれる、Wu-Zhang and Newton, Biochem. J. (2013) 452, 195-209も、例示的なＰＫＣアクチベーターを開示している。
ＰＫＣアクチベーターは、プロストラチン、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、大環状ラクトン、ブリオログ（ｂｒｙｏｌｏｇ）、ジアシルグリセロール、イソプレノイド、オクチルインドラクタム、グニジマクリン、インゲノール、イリパリダル、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロール阻害剤、増殖因子、ポリ不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、シクロプロパン化ポリ不飽和脂肪酸、シクロプロパン化モノ不飽和脂肪酸、脂肪酸アルコールおよび誘導体、ならびに脂肪酸エステル、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体から選択され得る。
ＰＫＣアクチベーターは、プロストラチンもしくはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、またはそれらの類似体、誘導体もしくは薬学的に許容される塩であり得る。ＰＫＣアクチベーターは、例えば、１４員、１５員または１６員のラクトン環を含む大環状ラクトンであり得る。大環状ラクトンは、ブリオスタチン（例えば、ブリオスタチン－１、ブリオスタチン－２、ブリオスタチン－３、ブリオスタチン－４、ブリオスタチン－５、ブリオスタチン－６、ブリオスタチン－７、ブリオスタチン－８、ブリオスタチン－９、ブリオスタチン－１０、ブリオスタチン－１１、ブリオスタチン－１２、ブリオスタチン－１３、ブリオスタチン－１４、ブリオスタチン－１５、ブリオスタチン－１６、ブリオスタチン－１７、および／またはブリオスタチン－１８）；ネリスタチン（例えば、ネリスタチン－１）；シクロプロパン化ポリ不飽和脂肪酸の大環状誘導体（例えば、２４－オクタヘプタシクロノナコサン－２５－オン）；ブリオログ（ブリオスタチンの類似体）であり得る。ＰＫＣアクチベーターは、ＰＫＣに結合してそれを活性化するジアシルグリセロール（またはその誘導体）であり得る。ＰＫＣアクチベーターは、イソプレノイド、例えば、ファルネシルチオトリアゾールであり得る。ＰＫＣアクチベーターは、オクチルインドラクタムＶ、グニジマクリン、インゲノール、またはイリパリダルであり得る。ＰＫＣは、ナフタレンスルホンアミド、例えば、Ｎ－（ｎ－ヘプチル）－５－クロロ－１－ナフタレンスルホンアミド、またはＮ－（６－フェニルヘキシル）－５－クロロ－１－ナフタレンスルホンアミドであり得る。ＰＫＣアクチベーターは、ＰＫＣを間接的に活性化するジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤［例えば、６－（２－（４－［Ｒ４－フルオロフェニル）フェニルメチレン］－１－ピペリジニル）エチル）－７－メチル－５Ｈ－チアゾロ［３，２－ａ］ピリミジン－５－オン（Ｒ５９０２２）、または［３－［２－［４－（ビス－（４－フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン－１－イル）エチル］－２，３－ジヒドロ－２－チオキソ－４（１）－キナゾリノン（Ｒ５９９４９）］であり得る。ＰＫＣアクチベーターは、増殖因子［例えば、線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ－１８）、インスリン増殖因子、４－メチルカテコール酢酸、ＮＧＦ、またはＢＤＮＦ］であり得る。ＰＫＣアクチベーターは、ポリ不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、シクロプロパン化ポリ不飽和脂肪酸、シクロプロパン化モノ不飽和脂肪酸、脂肪酸アルコール、シクロプロパン化ポリ不飽和脂肪酸アルコール、シクロプロパン化モノ不飽和脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、シクロプロパン化ポリ不飽和脂肪酸エステル、またはシクロプロパン化モノ不飽和脂肪酸エステルであり得る。
プロストラチンは、１２－デオキシホルボール－１３－アセテート（≧９８％ ＨＰＬＣ、Ｓｉｇｍａ：Ｐ００７７）としても知られる。プロストラチンは当初、「黄熱病」、すなわち肝炎の治療のための伝統的なサモアの生薬に使用されていた熱帯植物ホマランツス・ヌタンス（Ｈｏｍａｌａｎｔｈｕｓ ｎｕｔａｎｓ）の抽出物の有効成分として、米国国立がん研究所（ＮＣＬ）で単離された［Gustafson et al., 1992, J Med Chem 35(11): 1978-86］。他のホルボールエステルとは対照的に、プロストラチンは強力な抗腫瘍剤である。プロストラチンおよびその構造類似体は、天然の供給源から精製することもでき、または合成して作ることもできる。プロストラチンおよび構造類似体を合成的に生成する方法は、当技術分野で公知である［Wender et al., 2008, Science 320(5876): 649-52］。
ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）は、１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール－１３－アセテート（ＴＰＡ）としても知られる。ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは強力な腫瘍プロモーターであり、インビボおよびインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でプロテインキナーゼＣを活性化する。これはホルボールエステルの１つであり、遺伝子転写、細胞の分裂および分化、アポトーシス、ならびに免疫応答を含む多くの細胞反応に関連している。
ＰＫＣアクチベーターは、細胞培養培地中に任意の好適な濃度で存在し得る。当業者は慣行的な実験を使用して、好適な濃度の範囲を容易に同定することができる。例えば、実施例のセクションにおけるものに類似した方法を使用して、ウイルスのタイターを増加させるＰＫＣアクチベーターの濃度を同定することができる。ウイルスタイターを測定するためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。さらなる詳細は、本明細書中の他の箇所に提示されている。
細胞を、任意の適した細胞培養容量を使用して、任意の適した細胞培養容器内で、ＰＫＣアクチベーターの存在下で培養することができる。細胞培養チューブ、細胞培養フラスコ、細胞培養皿および細胞培養プレートは、本明細書に記載される方法において使用され得る個別的な細胞培養製品（または消耗品）の例であるため、本明細書では細胞培養容器と称する。細胞培養チューブ、細胞培養フラスコ、細胞培養皿は典型的には、単一の細胞培養反応チャンバーを有する細胞培養容器であるのに対して、細胞培養プレートは典型的には、複数の細胞培養反応チャンバー（すなわち、複数のウェル）を有する細胞培養容器である。他の適切な細胞培養容器も当技術分野で周知である。
細胞を、ＰＫＣアクチベーターの存在下で、適切な期間にわたり培養することができる。典型的には、細胞を、ＰＫＣアクチベーターの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養することができる。換言すれば、細胞を、ＰＫＣアクチベーターの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などにわたり培養することができる。細胞を、ＰＫＣアクチベーターの存在下で、約３０分間から約５日間までの持続期間にわたり培養することができる。例えば、細胞を、ＰＫＣアクチベーターの存在下で、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間の最大持続期間にわたり培養することができる。
当業者には明らかであろうが、典型的には、細胞を少なくとも２日間の持続期間にわたり培養する場合、細胞を新鮮な培地中に継代することが有益である。本明細書で使用される場合、「継代」は、１つの「親」細胞培養アリコートから増殖した細胞を収集し、それらを再播種して新しい「娘」細胞培養アリコートを生じさせる工程を指す。したがって、継代は、細胞浮遊液および／または上清の一部分を１つのアリコートから別のアリコートに移行させることを指す。
接着細胞を継代する場合には、細胞を典型的には、接着したままＰＢＳで洗浄し、アリコートから剥離させた後に、培地中に再懸濁させる。再懸濁された細胞の一部分を新しいアリコートに移す。非接着細胞を継代する場合には、細胞は浮遊状態にあるため、アリコートの一部分を新しいアリコートに直接移行させることができる。
細胞培養の継代数は、細胞を収集して再播種した回数を指す。継代の間に、ある容量の親細胞培養物アリコートを収集して、新しい娘アリコート中に再播種する（典型的には、新鮮な細胞培養培地中に）。細胞をＰＫＣアクチベーターの存在下で継代を含む持続期間にわたり培養する例では、継代のために使用される新鮮な培地も目的のＰＫＣアクチベーターを含むことが明らかである。換言すれば、ＰＫＣアクチベーターを含む細胞培養培地を、細胞培養中に新たにすること（細胞から部分的または完全に取り出して、ＰＫＣアクチベーターを含む新鮮な培養培地と置き換えること）ができる。
非限定的な一例では、細胞培養培地中に存在するＰＫＣアクチベーターは、プロストラチン、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である。「プロストラチン」という用語は、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩を範囲に含むように、本明細書では一般に広義に使用される。したがって、本明細書の全体を通して、「プロストラチン」という用語は、「プロストラチン、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩」という語句と互換的である。
プロストラチンは、細胞培養培地中に好適な濃度で存在し得る。例えば、プロストラチンは、細胞培養培地中に少なくとも約０．１μＭの濃度で存在し得る。一例では、プロストラチンは、細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在し得る。換言すれば、プロストラチンは、細胞培養培地中に少なくとも約１μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約１６μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約３０μＭなどの濃度で存在し得る。
例えば、プロストラチンは、細胞培養培地中に約０．１μＭから５０μＭの濃度で存在し得る。換言すれば、プロストラチンは、細胞培養培地中に約０．５μＭから約３２μＭ、約１μＭから約３２μＭ、約２μＭから約３２μＭ、約４μＭから約３２μＭ、約５μＭから約３２μＭ、約８μＭから約３２μＭ、約１０μＭから約３２μＭ、約１５μＭから約３２μＭ、約１６μＭから約３２μＭ、約２０μＭから約３２μＭ、約２５μＭから約３２μＭなどで存在し得る。
細胞は、プロストラチンの存在下で、適切な持続期間にわたり培養され得る。典型的には、細胞は、プロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の期間にわたり培養される。換言すれば、細胞は、プロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの期間にわたり培養され得る。細胞は、プロストラチンの存在下で約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも０．１μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも０．１μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも０．１μＭのプロストラチンの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも０．５μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも０．５μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも０．５μＭのプロストラチンの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１μＭのプロストラチンの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。すなわち、少なくとも２μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２μＭのプロストラチンの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも４μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも４μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも４μＭのプロストラチンの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも８μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも８μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも８μＭのプロストラチンの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１６μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１６μＭのプロストラチンの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１６μＭのプロストラチンの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
別の非限定的な例では、細胞培養培地中に存在するＰＫＣアクチベーターは、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である。「ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート」という用語は、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩を範囲に含むように、本明細書では一般に広義に使用される。したがって、本明細書の全体を通して、「ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩」という用語は、「ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート」という語句と互換的である。
ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは、細胞培養培地中に好適な濃度で存在し得る。例えば、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは、細胞培養培地中に少なくとも約０．１ｎＭの濃度で存在し得る。一例では、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは、細胞培養培地中に少なくとも約０．５ｎＭの濃度で存在し得る。換言すれば、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは、細胞培養培地中に少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約２ｎＭ、少なくとも約４ｎＭ、少なくとも約８ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約１５ｎＭ、少なくとも約１６ｎＭ、少なくとも約２０ｎＭ、少なくとも約２５ｎＭ、少なくとも約３０ｎＭなどの濃度で存在し得る。
例えば、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは、細胞培養培地中に約０．１ｎＭから５０ｎＭの濃度で存在し得る。換言すると、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートは、細胞培養培地中に約０．５ｎＭから約３２ｎＭ、約１ｎＭから約３２ｎＭ、約２ｎＭから約３２ｎＭ、約４ｎＭから約３２ｎＭ、約５ｎＭから約３２ｎＭ、約８ｎＭから約３２ｎＭ、約１０ｎＭから約３２ｎＭ、約１５ｎＭから約３２ｎＭ、約１６ｎＭから約３２ｎＭ、約２０ｎＭから約３２ｎＭ、約２５ｎＭから約３２ｎＭなどの濃度で存在し得る。
細胞は、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、適切な持続期間にわたり培養され得る。典型的には、細胞は、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養される。換言すれば、細胞は、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも０．１ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも０．１ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも０．１ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも０．５ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも０．５ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも０．５ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも４ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも４ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも４ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも８ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも８ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも８ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１６ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１６ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１６ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテートの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
ＰＫＣアクチベーターは、任意の適切な手段を介して細胞培養培地中に含めることができる。例えば、ＰＫＣアクチベーターを、補給剤として細胞培養培地に添加することができる。この例では、ＰＫＣアクチベーターは、細胞培養培地を細胞に添加する前または後に、細胞培養培地に添加することができる。また、ＰＫＣアクチベーターを、当技術分野で公知の他の手段を通じて細胞培養物に含めることもできる。
ウイルスベクター産生中に細胞培養培地中にＰＫＣアクチベーターが存在することにより、ウイルスベクタータイターが増加することが示されている。この文脈において、「ウイルスベクタータイターの増加」は、ウイルスベクター産生中の「ウイルスベクタータイターを誘導すること」または「ウイルスベクタータイターを増強すること」を含み得る。当業者には明らかであろうが、この文脈において、ウイルスベクタータイターを「増加させること」は、ＰＫＣアクチベーターの非存在下でのウイルスベクター産生に比してのウイルスベクタータイターの増加を指す。したがって、ＰＫＣアクチベーターの存在下におけるウイルスベクターの産生は、ＰＫＣアクチベーターの非存在下でのウイルスベクターの産生と比較して、ウイルスベクタータイターを増加させる。ウイルスベクタータイターの測定のために好適なアッセイは、本明細書に記載される通りである（例えば、レンチウイルスについて）。一部の実施形態では、ウイルスベクタータイター（例えば、レンチウイルスベクタータイター）の増加は、機能的な５’ＬＴＲポリＡ部位の存在下または非存在下で起こる。一部の実施形態では、ＰＫＣアクチベーターによって媒介されるウイルスベクタータイター（例えば、レンチウイルスベクタータイター）の増加は、ベクターゲノムの５’ＬＴＲにおけるポリＡ部位の抑制とは無関係である。
一部の例では、ＰＫＣアクチベーターの存在は、ウイルスベクター産生中のウイルスベクタータイターを、ＰＫＣアクチベーターの非存在下でのウイルスベクター産生に比して少なくとも３０％増加させ得る。好適には、ＰＫＣアクチベーターは、ウイルスベクター産生中のウイルスベクタータイターを、ＰＫＣアクチベーターの非存在下でのウイルスベクター産生に比して少なくとも３５％（好適には少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％）増加させ得る。
本明細書に記載される方法は、ウイルスベクター産生がＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤の存在下で行われる場合に特に有利である。したがって、ウイルスベクターを産生するための方法であって、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞を、ＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤を含む細胞培養培地中で培養することを含む方法が提供される。
細胞をＨＤＡＣ阻害剤（一般的に酪酸ナトリウム）の存在下で培養する、他の転写促進剤の非存在下でウイルスベクター産生を誘導するための方法が知られている。本発明者らは現在では、細胞をＨＤＡＣ阻害剤とＰＫＣアクチベーターという特定の組み合わせに曝露させることにより、ウイルスベクター産生中にウイルスベクタータイターが予想外にさらに増加（増強）することを見出している。
本明細書に記載されるＰＫＣアクチベーターとＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせは、任意の好適なウイルスベクターの産生のために有用であり得る。本方法によって産生され得るウイルスベクターの例は、本明細書中の他の箇所に記載されており、これにはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターが含まれる。これらの各ベクターの詳細は他の箇所に提示されており、ここに同様に適用される。
ＰＫＣアクチベーターとＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせを使用する方法は、レトロウイルスベクターの産生、特にレンチウイルスベクター産生のために特に好適である。例えば、本明細書に記載される方法を、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびビスナレンチウイルスベクターからなる群から選択されるレンチウイルスベクターの産生に使用することができる。一例では、本明細書に記載される方法を、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）またはＥＩＡＶレンチウイルスベクターから選択されるレンチウイルスベクターの産生のために使用することができる。
ＰＫＣアクチベーターとＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせを使用する、本明細書に提供される方法は、自己不活性化（ＳＩＮ）ウイルスベクター（例えば、ＳＩＮレンチウイルスベクター）を産生する際に特に有用である。ＳＩＮベクターの特性は、本明細書中の別の箇所でより詳細に記載されている。特定の一例では、ＳＩＮベクターは第３世代ＳＩＮウイルスベクター（例えば、第３世代レンチウイルスベクター）であり得る。
一例では、細胞培養培地はＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤を含む。
核ＤＮＡの周りにはヒストンが巻き付いている。アセチル化によるヒストンの修飾は、遺伝子発現のエピジェネティック制御に重要な役割を果たしており、これは、これらのヒストンバレルのリジン尾部からアセチル基をそれぞれ付加または除去するヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）とヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の活性のバランスによって制御されている。アセチル基は、正のリジン残基がＤＮＡリン酸骨格と密接に相互作用するのを遮蔽して、より「開いた」クロマチン状態をもたらす。ＨＤＡＣはこれらのアセチル基を除去して、より「閉じた」または圧縮されたＤＮＡ－ヒストン状態をもたらす。
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、コアヒストンのリジン残基からアセチル基を除去する酵素であり、その結果、凝縮して転写的にサイレンシングされたクロマチンの形成を招く。現在１８種類のヒストンデアセチラーゼが知られており、これは４つのグループに分類される。クラスＩ ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣＩ、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３およびＨＤＡＣ８を含み、酵母ＲＰＤ３遺伝子に関連している。クラスＩＩ ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、およびＨＤＡＣ１０を含み、酵母Ｈｄａｌ遺伝子に関連している。クラスＩＩＩ ＨＤＡＣはサーチュインとしても知られ、Ｓｉｒ２遺伝子に関連し、ＳＩＲＴ１－７を含む。クラスＩＶ ＨＤＡＣはＨＤＡＣ１１のみを含み、クラスＩおよびＩＩの両方のＨＤＡＣの特徴を有する。
本明細書で使用される「ＨＤＡＣ」という用語は、１つまたは複数のヒストンデアセチラーゼを指す。
本明細書で使用される「ＨＤＡＣ阻害剤」という用語は、ＨＤＡＣによって触媒される反応の速度を低下させる物質を指す。例示的なＨＤＡＣ阻害剤は、Xu et al, Oncogene (2007), 26, 5541-5552、特にp.5543の表２に開示されており、その内容はすべて参照により本明細書に組み込まれる。「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」、「ＨＤＡＣ阻害剤」および「ＨＤＡＣｉ」という用語は、本明細書で互換的に使用される。本明細書に記載されるＨＤＡＣ阻害剤は、特定の種類のヒストンデアセチラーゼ酵素に対して選択的または非選択的であり得る。
いくつかのＨＤＡＣ阻害剤が当技術分野で公知である。ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサメート、環状ペプチド、ベンズアミド、もしくは脂肪酸、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体から選択され得る。これらの各クラスに該当するＨＤＡＣ阻害剤の例は、Kim HJ, Bae SCの図１に示されている。Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 2011;3(2):166-179、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＨＤＡＣ阻害剤は、脂肪酸、例えば、酪酸、バルプロ酸、吉草酸、もしくはフェニル酪酸、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサメート、例えば、スベルアニロヒドロキサム酸、パノビノスタット、ベリノスタット、ギビノスタット、もしくはアベキシノスタット、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。ＨＤＡＣ阻害剤は、環状ペプチド、例えば、ロミデプシン、またはその薬学的に許容される塩であり得る。ＨＤＡＣ阻害剤は、ベンズアミド、例えば、ピリジン－３－イルメチルＮ－［［４－［（２－アミノフェニル）カルバモイル］フェニル］メチル］カルバメート、もしくはＮ－（２－アミノフェニル）－４－［［（４－ピリジン－３－イルピリミジン－２－イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸、バルプロ酸、吉草酸、フェニル酪酸、もしくはスベルアニロヒドロキサム酸、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。ＨＤＡＣ阻害剤を同定する方法は当技術分野で周知である。ＨＤＡＣ阻害剤を同定するための適切な方法の例は、Wei et al., PLoS Pathog. 2014 Apr 10;10(4):e1004071 and Zaikos et al., J Virol. 2018 Mar 15; 92(6): e02110-17によって提示されている。
一例では、ＨＤＡＣ阻害剤は、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤またはヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤から選択され得る。好適な脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤には、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウムまたは吉草酸、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。特に好適な脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である。
酪酸ナトリウムは、酪酸のナトリウム塩である。バルプロ酸ナトリウムは、バルプロ酸のナトリウム塩である。吉草酸は、ペンタン酸としても知られる。
「酪酸ナトリウム」という用語は、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩を範囲に含むように、本明細書では一般に広義に使用される。したがって、本明細書の全体を通して、「酪酸ナトリウム」という用語は、「酪酸ナトリウム、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩」という語句と互換的である。
「バルプロ酸ナトリウム」という用語は、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩を範囲に含むように、本明細書では一般に広義に使用される。したがって、本明細書の全体を通して、「バルプロ酸ナトリウム」という用語は、「バルプロ酸ナトリウム、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩」という語句と互換的である。
「吉草酸」という用語は、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩を範囲に含むように、本明細書では一般に広義に使用される。したがって、本明細書の全体を通して、「吉草酸」という用語は、「吉草酸、その類縁体、誘導体または薬学的に許容される塩」という語句と互換的である。
好適なヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤には、スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。
「スベルアニロヒドロキサム酸」という用語は、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩を範囲に含むように、本明細書では一般に広義に使用される。したがって、本明細書の全体を通して、「スベルアニロヒドロキサム酸」という用語は、「スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩」という語句と互換的である。
特定の一例では、ウイルスベクターを産生するための方法であって、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞を、ＰＫＣアクチベーター（好ましくはプロストラチン）およびＨＤＡＣ阻害剤（好ましくは酪酸ナトリウム）を含む細胞培養培地中で培養することを含む方法が提供される。ＰＫＣアクチベーターの好適な濃度は上記に提示した通りである。ＨＤＡＣ阻害剤の濃度については以下に提示する。
ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞培養培地中に任意の好適な濃度で存在し得る。当業者は、慣行的な実験を使用して、好適な濃度の範囲を容易に同定することができる。例えば、実施例のセクションにおけるものに類似した方法を使用して、ウイルスのタイターを増加させるＨＤＡＣ阻害剤の濃度を同定することができる。ウイルスタイターを測定するためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。さらなる詳細は、本明細書中の他の箇所に提示されている。
細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で、適切な持続期間にわたり培養され得る。典型的には、ＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤は、培養時間の少なくとも一部にわたり、培養培地中に同時に存在する。ＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に同時または逐次的に添加され得る。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤を細胞に添加し、ＰＫＣアクチベーターをＨＤＡＣ阻害剤と同時に、またはＨＤＡＣ阻害剤の後のある時点で細胞に添加することができる。ＰＫＣアクチベーターは、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤の０時間から１０時間後に細胞に添加され得る。
典型的には、細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で、組み合わせて使用されるＰＫＣアクチベーターの場合と同程度の持続期間にわたり培養される。例えば、細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
当業者には明らかであろうが、典型的には、細胞を少なくとも２日間の持続期間にわたり培養する場合、細胞を新鮮な培地中に継代することが有益である。細胞をＨＤＡＣ阻害剤の存在下で継代を含む持続期間にわたり培養する例では、継代のために使用される新鮮な培地も目的のＨＤＡＣ阻害剤を含むことが明らかである。換言すれば、ＨＤＡＣ阻害剤を含む細胞培養培地を、培養中に新たにすること（細胞から部分的または完全に取り出して、ＨＤＡＣ阻害剤を含む新鮮な培養培地と置き換えること）ができる。
例えば、細胞培養培地中に存在するＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウムであり得る。酪酸ナトリウムは、細胞培養培地中に任意の好適な濃度で存在し得る。例えば、酪酸ナトリウムは、細胞培養培地中に少なくとも約１ｍＭの濃度で存在し得る。一例では、酪酸ナトリウムは、細胞培養培地中に少なくとも約２ｍＭの濃度で存在し得る。換言すれば、酪酸ナトリウムは、細胞培養培地中に少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭなどの濃度で存在し得る。
例えば、酪酸ナトリウムは、細胞培養培地中に約１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在し得る。換言すれば、酪酸ナトリウムは、細胞培養培地中に約２ｍＭから約３０ｍＭ、約２．５ｍＭから約３０ｍＭ、約３ｍＭから約３０ｍＭ、約４ｍＭから約３０ｍＭ、約５ｍＭから約３０ｍＭ、約８ｍＭから約３０ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭ、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、約２５ｍＭから約３０ｍＭなどの濃度で存在し得る。
細胞は、酪酸ナトリウムの存在下で、適切な持続期間にわたり培養され得る。典型的には、細胞は、酪酸ナトリウムの存在下で、組み合わせて使用されるＰＫＣアクチベーターの場合と同程度の持続期間にわたり培養される。一例では、細胞は、酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間培養される。換言すれば、細胞は、酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、酪酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
細胞は、例えば、少なくとも２ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２．５ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２．５ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２．５ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも４ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも４ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも４ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも５ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも５ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも５ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも８ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも８ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも８ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
酪酸ナトリウムについての上記の濃度および持続期間を、例えば、プロストラチンについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることができる。
代替的に、酪酸ナトリウムについての上記の濃度および持続期間を、例えば、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることもできる。
別の例として、細胞培養培地中に存在するＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸ナトリウムであり得る。バルプロ酸ナトリウムは、細胞培養培地中に任意の好適な濃度で存在し得る。例えば、バルプロ酸ナトリウムは、細胞培養培地中に少なくとも約１ｍＭの濃度で存在し得る。一例では、バルプロ酸ナトリウムは、細胞培養培地中に少なくとも約２ｍＭの濃度で存在し得る。換言すれば、バルプロ酸ナトリウムは、細胞培養培地中に少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭなどの濃度で存在し得る。
例えば、バルプロ酸ナトリウムは、細胞培養培地中に約１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在し得る。換言すれば、バルプロ酸ナトリウムは、細胞培養培地中に約２ｍＭから約３０ｍＭ、約２．５ｍＭから約３０ｍＭ、約３ｍＭから約３０ｍＭ、約４ｍＭから約３０ｍＭ、約５ｍＭから約３０ｍＭ、約８ｍＭから約３０ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭ、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、約２５ｍＭから約３０ｍＭなどの濃度で存在し得る。
細胞は、バルプロ酸ナトリウムの存在下で、適切な持続期間にわたり培養され得る。典型的には、細胞は、バルプロ酸ナトリウムの存在下で、組み合わせて使用されるＰＫＣアクチベーターの場合と同程度の持続期間にわたり培養される。一例では、細胞は、バルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間培養される。換言すれば、細胞は、バルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、バルプロ酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２．５ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２．５ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２．５ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも４ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも４ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも４ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも５ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも５ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも５ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも８ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも８ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも８ｍＭのバルプロ酸ナトリウムの存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
バルプロ酸ナトリウムについての上記の濃度および持続期間を、例えば、プロストラチンについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることができる。
代替的に、バルプロ酸ナトリウムについての上記の濃度および持続期間を、例えば、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることもできる。
別の例として、細胞培養培地中に存在するＨＤＡＣ阻害剤は、吉草酸であり得る。吉草酸は、細胞培養培地中に任意の好適な濃度で存在し得る。例えば、吉草酸は、細胞培養培地中に少なくとも約１ｍＭの濃度で存在し得る。一例では、吉草酸は、細胞培養培地中に少なくとも約２ｍＭの濃度で存在し得る。換言すれば、吉草酸は、細胞培養培地中に少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭなどの濃度で存在し得る。
例えば、吉草酸は、細胞培養培地中に約１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在し得る。換言すれば、吉草酸は、細胞培養培地中に約２ｍＭから約３０ｍＭ、約２．５ｍＭから約３０ｍＭ、約３ｍＭから約３０ｍＭ、約４ｍＭから約３０ｍＭ、約５ｍＭから約３０ｍＭ、約８ｍＭから約３０ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭ、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、約２５ｍＭから約３０ｍＭなどの濃度で存在し得る。
細胞は、吉草酸の存在下で、適切な持続期間にわたり培養され得る。典型的には、細胞は、吉草酸の存在下で、組み合わせて使用されるＰＫＣアクチベーターの場合と同程度の持続期間にわたり培養される。一例では、細胞は、吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養される。換言すれば、細胞は、吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、吉草酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも０．１ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも０．１ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも０．１ｍＭの吉草酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも０．５ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも０．５ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも０．５ｍＭの吉草酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１ｍＭの吉草酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２ｍＭの吉草酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも４ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも４ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも４ｍＭの吉草酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも８ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも８ｍＭの吉草酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも８ｍＭの吉草酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
吉草酸についての上記の濃度および持続期間を、例えば、プロストラチンについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることができる。
代替的に、吉草酸についての上記の濃度および持続期間を、例えば、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることもできる。
別の例として、細胞培養培地中に存在するＨＤＡＣ阻害剤は、スベルアニロヒドロキサム酸であり得る。スベルアニロヒドロキサム酸は、細胞培養培地中に任意の好適な濃度で存在し得る。例えば、スベルアニロヒドロキサム酸は、細胞培養培地中に少なくとも約０．１μＭの濃度で存在し得る。一例では、スベルアニロヒドロキサム酸は、細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在し得る。換言すれば、スベルアニロヒドロキサム酸は、細胞培養培地中に少なくとも約１μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約６μＭ、少なくとも約１０μＭなどの濃度で存在し得る。
例えば、スベルアニロヒドロキサム酸は、細胞培養培地中に約０．１μＭから５０μＭの濃度で存在し得る。換言すれば、スベルアニロヒドロキサム酸は、細胞培養培地中に約０．５μＭから約３０μＭ、約０．５μＭから約１６μＭ、約１μＭから約１６μＭ、約２μＭから約１６μＭ、約３μＭから約１６μＭ、約４μＭから約１６μＭ、約５μＭから約１６μＭ、約６μＭから約１６μＭ、約１０μＭから約１６μＭ、約１０μＭから約３０μＭなどの濃度で存在し得る。
細胞は、スベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、適切な持続期間にわたり培養され得る。典型的には、細胞は、吉草酸の存在下で、組み合わせて使用されるＰＫＣアクチベーターの場合と同程度の持続期間にわたり培養される。一例では、細胞は、スベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間培養される。換言すれば、細胞は、スベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、スベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも１μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも１μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも１μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２μＭスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２μＭスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも２．５μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも２．５μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも２．５μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも４μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも４μＭスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも４μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも５μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも５μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも５μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
例えば、細胞は、少なくとも８μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間の持続期間にわたり培養され得る。換言すれば、細胞は、少なくとも８μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間などの持続期間にわたり培養され得る。細胞は、少なくとも８μＭのスベルアニロヒドロキサム酸の存在下で、約３０分間から約５日間の持続期間にわたり培養され得る。例えば、最大持続期間は、例えば、約５日間、約４日間、約２日間、約２４時間であり得る。
スベルアニロヒドロキサム酸についての上記の濃度および持続期間を、例えば、プロストラチンについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることができる。
代替的に、スベルアニロヒドロキサム酸についての上記の濃度および持続期間を、例えば、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートについて提示された濃度および持続期間と適切に組み合わせることもできる。
ＨＤＡＣ阻害剤は、任意の適切な手段を使用して細胞培養培地中に含めることができる。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤を、補給剤として細胞培養培地に添加することができる。この例では、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞培養培地を細胞に添加する前または後に、細胞培養培地に添加することができる。また、ＨＤＡＣ阻害剤を、当技術分野で公知の他の手段を通じて細胞培養物に含めることもできる。
既に記載したように、ウイルスベクター産生中に細胞培養培地中にＨＤＡＣ阻害剤が存在することにより、それがＰＫＣアクチベーターと組み合わされた場合にウイルスベクタータイターが増加することが示されている。この文脈において、「ウイルスベクタータイターの増加」は、ウイルスベクター産生中の「ウイルスベクタータイターを誘導すること」または「ウイルスベクタータイターを増強すること」を含み得る。当業者には明らかであろうが、この文脈においてウイルスベクタータイターを「増加させること」は、ＰＫＣアクチベーターまたはＨＤＡＣ阻害剤のうちのいずれか１つの非存在下に比してのウイルスベクタータイターの増加を指す。したがって、ＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤の存在下におけるウイルスベクターの産生は、ＰＫＣアクチベーターまたはＨＤＡＣ阻害剤のうちのいずれか１つの非存在下におけるウイルスベクターの産生と比較して、ウイルスベクタータイターを増加させる。ウイルスベクタータイターの測定のために好適なアッセイは、本明細書に記載される通りである（例えば、レンチウイルスについて）。一部の実施形態では、ウイルスベクタータイター（例えば、レンチウイルスベクタータイター）の増加は、機能的な５’ＬＴＲポリＡ部位の存在下または非存在下で起こる。一部の実施形態では、ＰＫＣアクチベーターによって媒介されるウイルスベクタータイター（例えば、レンチウイルスベクタータイター）の増加は、ベクターゲノムの５’ＬＴＲにおけるポリＡ部位の抑制とは無関係である。
一部の例では、ＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤の存在は、ウイルスベクター産生中のウイルスベクタータイターを、ＰＫＣアクチベーターまたはＨＤＡＣ阻害剤のうちのいずれか１つの非存在下におけるウイルスベクター産生に比して少なくとも３０％増加させ得る。好適には、ＰＫＣアクチベーターは、ウイルスベクター産生中のウイルスベクタータイターを、ＰＫＣアクチベーターまたはＨＤＡＣ阻害剤のうちのいずれか１つの非存在下でのウイルスベクター産生に比して少なくとも３５％（好適には少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％）増加させ得る。
本明細書に記載される方法は、ウイルスベクタータイターを増加させるための好適なウイルスベクター産生プロトコールの一部であり得る。したがって、本明細書に提供される方法は、１回目またはその後の（例えば、２回目の）収集の一部としてウイルスベクターを産生するために使用することができる。
ベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列は、同時に、または任意の順序で逐次的に細胞に導入することができる。
当業者には明らかであろうが、これらの方法において、ベクター構成要素には、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよび／またはレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムが含まれ得る。これらのベクター構成要素は、本明細書中の他の箇所に記載されているヌクレオチド配列によってコードされる。
（ｉｉ）ウイルスベクター産生システム
ｉ）ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞；および
ｉｉ）ＰＫＣアクチベーターを含む細胞培養培地
を含むウイルスベクター産生システムも、本明細書中に提供される。
一例では、細胞培養培地は、ＰＫＣアクチベーターおよびＨＤＡＣ阻害剤を含む。
適切なウイルスベクター、ＰＫＣアクチベーターおよび濃度、ＨＤＡＣ阻害剤および濃度、細胞および細胞培養培地の詳細は、上記の方法のセクションに提示されており、ここに同様に適用される。
さらに、「ウイルスベクター産生システム」、「培養」、「細胞」、「核酸配列」、「ウイルスベクター」、「ウイルスベクター構成要素」、「細胞培養」および「細胞培養培地」という用語は、ここでの一般的な定義のセクションでより詳細に記載されており、ここに同様に適用される。
（ｉｉｉ）使用
本発明者らは、ウイルスベクター産生中にウイルスベクタータイターを増加させるためにＰＫＣアクチベーターを使用し得ることを初めて突き止めた。本発明者らはまた、ＰＫＣアクチベーターをＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用することで、ウイルスベクター産生中にウイルスベクタータイターを有利にさらに増加させ得ることも示した。
好適なウイルスベクター、ＰＫＣアクチベーターおよび濃度、ＨＤＡＣ阻害剤および濃度、細胞および細胞培養培地の詳細は、上記の方法のセクションに記載されており、ここに同様に適用される。
さらに、「ウイルスベクター産生システム」、「培養」、「細胞」、「核酸配列」、「ウイルスベクター」、「ウイルスベクター構成要素」、「細胞培養」および「細胞培養培地」という用語は、本明細書の一般的な定義のセクションでより詳細に記載されており、ここに同様に適用される。
Ｂ．改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ
特にレンチウイルスベクター産生の文脈において、本明細書に記載されるＰＫＣアクチベーター（および適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）を含む方法、ウイルスベクター産生システム、および使用は、本明細書にさらに記載されているように、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの共発現も含み得る。したがって、レンチウイルスベクター産生を検討する際には、ＰＫＣアクチベーター（および適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）に関連して記載されている特徴のそれぞれを、このセクションで改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡに関連して記載されている特徴と組み合わせることができる。
本発明者らは、内因性配列（スプライスドナー部位）を標的とせず、ｖＲＮＡ分子内の配列を新たに標的とするように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡに基づいて非コード性ＲＮＡを共発現させることによって、レンチウイルスベクターの出力タイターを増強させ得ることを既に示した。本発明者らはまた、本明細書に記載されるウイルスベクター産生方法の間に改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを共発現させることにより、ウイルスベクターの出力タイターがさらに増加することを見出している。したがって、ＰＫＣアクチベーターと改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを組み合わせて使用する（上記のように、ＨＤＡＣ阻害剤と共にしてもよい）方法、システムおよび使用が、本明細書中に提供される。このアプローチは、ベクター産生中に改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを他のベクター構成要素と共に共発現させることを含む。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡのネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列を、ベクターゲノムｖＲＮＡ内の標的配列に相補的な異種配列に置き換えることによって、コンセンサススプライスドナー部位への結合が除去されるように設計されている。標的配列および相補性の長さ、設計、発現様式を含む、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの最適な特性について以下に記載する。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ
ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）は、長さが１６４ｎｔであり、４つのステムループからなる明確に規定された構造を有する（図１１参照）。Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、内因性の非コード性ＲＮＡであり、イントロンスプライシングの初期段階で、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列［例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’（配列番号２）］を介してコンセンサス５’スプライスドナー部位［例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’（配列番号１）、ここでＭはＡまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである］に結合する。ステムループＩは、ポリＡ抑制に重要であることが示されているＵ１Ａ－７０Ｋタンパク質に結合する。ステムループＩＩはＵ１タンパク質に結合し、５’－ＡＵＵＵＧＵＧＧ－３’（配列番号３）配列はＳｍタンパク質に結合するが、これはステムループＩＶと共にＵ１ ｓｎＲＮＡのプロセシングに重要である。本明細書に記載される改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ネイティブ性スプライスドナー標的配列の部位にあるベクターゲノムｖＲＮＡ分子内の標的配列に相補的な異種配列を導入するために改変されている（図１１参照）。
本明細書で使用される場合、「改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」、「再方向付けされたＵ１ ｓｎＲＮＡ」、「再標的化されたＵ１ ｓｎＲＮＡ」、「別の目的に向けられた（ｒｅ－ｐｕｒｐｏｓｅｄ）Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子のスプライシング過程を開始するためにＵ１ ｓｎＲＮＡが使用するコンセンサス５’スプライスドナー部位配列［例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’（配列番号１）］に結合しなくなるように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡを意味する。したがって、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ドナー部位配列とＵ１ ｓｎＲＮＡの５’末端のネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列との相補性に基づくスプライスドナー部位配列［例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’（配列番号１）］への結合が行われなくなるように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡである。その代わりに、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、レンチウイルスベクターゲノム分子（標的部位）のパッケージング領域内に固有のＲＮＡ配列、すなわち、遺伝子のスプライシングとは無関係な配列を有するヌクレオチド配列に結合するように設計される。レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内のヌクレオチド配列を予め選択することができる。したがって、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、その５’末端がレンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡである。その結果、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、標的部位配列と改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の短い配列との相補性に基づいて、標的部位配列に結合する。
本明細書で使用される場合、「ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列」および「ネイティブ性スプライスドナー標的配列」という用語は、イントロンのコンセンサス５’スプライスドナー部位に対して広範囲に相補的な内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の短い配列を意味する。ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列は、５’－ＡＣＵＡＣＣＵＧ－３’（配列番号２）であり得る。
本明細書で使用される場合、「コンセンサス５’スプライスドナー部位」という用語は、例えば、配列５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’（配列番号１）を有する、スプライス部位選択に使用されるイントロンの５’末端にあるコンセンサスＲＮＡ配列を意味する。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列」、「標的配列」および「標的部位」という用語は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが結合するための標的部位として予め選択される、レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内に特定のＲＮＡ配列を有する部位を意味する。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」および「レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域」という用語は、５’Ｕ５ドメインの先頭からｇａｇ遺伝子に由来する配列の末端までの、レンチウイルスベクターゲノムの５’末端にある領域を意味する。したがって、レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域は、５’Ｕ５ドメイン、ＰＢＳエレメント、ステムループ（ＳＬ）１エレメント、ＳＬ２エレメント、ＳＬ３ψエレメント、ＳＬ４エレメント、およびｇａｇ遺伝子に由来する配列を含む。複製欠損ウイルスベクター粒子の産生を可能にするために、レンチウイルスベクター産生中に、完全なｇａｇ遺伝子をトランス性（ｉｎ ｔｒａｎｓ）にゲノムに提供することは、当技術分野で一般的である。トランス性に提供されるｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチドによってコードされる必要はないが、コドン最適化はされ得る；重要なこととして、トランス性に提供されるｇａｇ遺伝子の主な属性は、ｇａｇおよびｇａｇｐｏｌタンパク質をコードし、その発現を導くことである。したがって、完全なｇａｇ遺伝子がレンチウイルスベクターの産生中にトランス性に提供される場合、「レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」という用語は、５’Ｕ５ドメインの先頭からＳＬ３ψエレメントの「コア」パッケージングシグナルまでのレンチウイルスベクターゲノム分子の５’末端の領域、およびＡＴＧコドン（ＳＬ４内に存在）からベクターゲノム上に存在する残りのｇａｇヌクレオチド配列の最後までのネイティブ性ｇａｇヌクレオチド配列を意味し得ることが、当業者には理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「ｇａｇ遺伝子に由来する配列」という用語は、ベクターゲノム中に存在し得る、例えば、存続し得る、ＡＴＧコドンからヌクレオチド６８８までに由来する、ｇａｇ遺伝子の任意のネイティブ性配列を意味する（Kharytonchyk, S. et. al., 2018, J. Mol. Biol., 430:2066-79）。
本明細書で使用される場合、「ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列を範囲に含むＵ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチド内に異種配列を導入すること」「位置３～１１の９ヌクレオチド内に前記異種配列を導入すること」および「Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の最初の１１ヌクレオチド内に異種配列を導入すること」という用語は、Ｕ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチド、または位置３～１１の９ヌクレオチドの全体もしくは一部を前記異種配列に置き換えること、またはＵ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチド、または位置３～１１の９ヌクレオチドを前記異種配列と同じ配列を有するように改変することを含む。
本明細書で使用される場合、「ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入すること」および「Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端のネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入すること」という用語は、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列の全体もしくは一部を前記異種配列に置き換えること、またはネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列を前記異種配列と同じ配列を有するように改変することを含む。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡがレンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように改変されている、本明細書に記載される方法に使用し得る。一部の実施形態では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列が導入されるように、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡに比して５’末端で改変される。一部の実施形態では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列がネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列内に導入されるように、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡに比して５’末端で改変される。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ネイティブ性スプライスドナーのアニーリング配列を含む配列が、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列に置き換えられるように、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡに比して５’末端で改変され得る。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体であり得る。本発明に従って改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡ突然変異体は、天然に存在するＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体、Ｕ１－７０Ｋタンパク質結合を除去するステムループＩ領域内の突然変異を含有するＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体、またはＵ１タンパク質結合を除去するステムループＩＩ領域内の突然変異を含有するＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体であり得る。Ｕ１－７０Ｋタンパク質結合を除去する突然変異をステムループＩ領域内に含有するＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体は、Ｕ１＿ｍ１またはＵ１＿ｍ２であり得、好ましくはＵ１Ａ＿ｍ１またはＵ１Ａ＿ｍ２であり得る。
一部の実施形態では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載されるＵ１＿２５６配列の主要なＵ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）と少なくとも７０％の同一性（好適には、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載されるＵ１＿２５６配列の主要なＵ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）を含む。Ｕ１＿２５６配列の主要なＵ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）は、配列番号４に含まれる：
配列番号４：
Figure 2023525161000001
一部の好ましい実施形態では、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列を範囲に含むＵ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドは、全体または一部が、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列に置換され得る。好適には、Ｕ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドのうちの１～１１個（好適には、２～１１個、３～１１個、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個）の核酸が、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列に置き換えられる。
一部の実施形態では、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列は、全体または一部が、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列に置換され得る。好適には、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列のうちの１～１１個（好適には、２～１１個、３～１１個、５～１１個、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個）の核酸が、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列に置き換えられる。好ましい一実施形態では、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列の全体が、レンチウイルスベクターのゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列に置き換えられ、すなわち、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列（例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’（配列番号２））は、本発明による異種配列に完全に置き換えられる。
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を含む改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、Ａが標的配列へのアニーリングに関与するか否かにかかわらず、前記異種配列の５’末端の最初のヌクレオチドでＡをコードする。
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を含む改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＡまたはＵが標的配列へのアニーリングに関与するか否かにかかわらず、前記異種配列の５’末端の最初の２ヌクレオチドでＡＵをコードする。
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を含む改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、前記異種配列の５’末端の最初の２ヌクレオチドでＡＵをコードせず、この最初のヌクレオチドは標的配列へのアニーリングに関与することも関与しないこともあり得る。
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列は、前記ヌクレオチド配列に相補的な少なくとも７個のヌクレオチドで構成される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列は、前記ヌクレオチド配列に相補的な少なくとも９個のヌクレオチドで構成される。好ましくは、本発明で使用するための異種配列は、前記ヌクレオチド配列に相補的な１５個のヌクレオチドで構成される。
好適には、本発明で使用するための異種配列は、７～２５個（好適には７～２０個、７～１５個、９～１５個、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個または２５個）のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、７個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、８個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、９個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１０個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１１個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１２個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１３個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１４個のヌクレオチドで構成され得る。
好適には、本発明で使用するための異種配列は、１５個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１６個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１７個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１８個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、１９個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、２０個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、２１個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、２２個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、２３個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、２４個のヌクレオチドで構成され得る。好適には、本発明で使用するための異種配列は、２５個のヌクレオチドで構成され得る。
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、５’Ｕ５ドメイン、ＰＢＳエレメント、ＳＬ１エレメント、ＳＬ２エレメント、ＳＬ３ψエレメント、ＳＬ４エレメントおよび／またはｇａｇ遺伝子に由来する配列の内部に位置する。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、ＳＬ１、ＳＬ２および／またはＳＬ３ψエレメントの内部に位置する。一部の好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、ＳＬ１および／またはＳＬ２エレメントの内部に位置する。一部の特に好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、ＳＬ１エレメントの内部に位置する。
一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、少なくとも７個のヌクレオチドで構成される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、少なくとも９個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターのゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、７～２５個（好適には７～２０個、７～１５個、９～１５個、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個または１５個）のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、７個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、８個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、９個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１０個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１１個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１２個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１３個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１４個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１５個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１６ヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１７個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１８個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１９個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、２０個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、２１個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、２２個のヌクレオチドで構成される。
好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、２３個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、２４個のヌクレオチドで構成される。好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、２５個のヌクレオチドで構成される。好ましくは、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１５個のヌクレオチドで構成される。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの、レンチウイルスベクターのゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列への結合は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの非存在下におけるレンチウイルスベクター産生に比して、レンチウイルスベクター産生中のレンチウイルスベクタータイターを増強させ得る。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、（ａ）改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが結合するためのレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内の標的部位（予め選択されたヌクレオチド部位）を選択すること；および（ｂ）Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端のネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列［例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’（配列番号２）］内に、工程（ａ）で選択された予め選択されたヌクレオチド部位に相補的な異種配列を導入すること、によって設計され得る。
分子生物学における従来の手法を使用して、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端のネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列［例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’（配列番号２）］の内部に、またはその代わりに、標的部位に相補的な異種配列を導入することは、当業者の通常の能力の範囲内にある。一般に、好適な慣行的な方法には、定方向突然変異誘発または相同組換えを介した置き換えが含まれる。
分子生物学の従来の手法を使用して、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端のネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列［例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’（配列番号２）］を標的部位に相補的な異種配列と同じ配列になるように改変することは、当業者の能力の範囲内にある。例えば、好適な方法には、定方向突然変異誘発またはランダム突然変異誘発法に続いて、本発明による改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが得られる突然変異について選択を行うことが含まれる。
本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、当技術分野で一般に公知である方法に従って製造することができる。例えば、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを、化学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術によって製造することができる。
従来の分子生物学および細胞生物学の手法を使用して、本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の細胞に導入することは、当業者の能力の範囲内にある。例えば、以下に記載するように発現カセットを使用することができる。
レンチウイルスベクター産生は、本明細書に記載される好適な産生細胞における本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡとベクター構成要素との共発現を含み得る。産生細胞は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする核酸配列を含む安定な産生細胞であり得る。代替的に、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする核酸配列を、細胞に一過性に導入することもできる。
したがって、レンチウイルスベクターを産生するための方法であって、
ａ）ベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列と、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを細胞に導入する工程；
ｂ）ベクター構成要素をコードする前記ヌクレオチド配列と、本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む細胞を選択する工程；
ｃ）細胞を、ＰＫＣアクチベーター（および適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で、レンチウイルスベクターが産生される条件下でさらに培養する工程；および
ｄ）適宜、レンチウイルスベクターを単離する工程
を含む方法が提供される。
ＰＫＣアクチベーター（および適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）の詳細は、本明細書中の他の箇所に記載されており、ここでも同様に適用する。
これらの方法では、ベクター構成要素は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよび／またはレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含み得る。これらのベクター構成要素は、本明細書中の他の箇所に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。
ベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列、および本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、同時に、または任意の順序で逐次的に細胞に導入することができる。ベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列を、本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の前に、細胞に導入することができる。本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列の前に、細胞に導入することもできる。
したがって、ＰＫＣアクチベーター（および適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）を含む、本明細書に記載される方法、システムおよび使用は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡも含むことができ、前記改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように改変されている。
好適には、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内にヌクレオチド配列に相補的な異種配列が導入されるように改変され得る。
好適には、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、位置３～１１の９ヌクレオチド内に前記異種配列が導入されるように、５’末端で改変され得る。
好適には、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列内に前記異種配列が導入されるように、５’末端で改変され得る。前記ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列の１～９個の核酸が、前記異種配列に置き換えられてもよい。
好適には、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ネイティブ性スプライスドナーアニーリング配列を範囲に含む配列を、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列に置き換えるように、５’末端で改変され得る。
好適には、異種配列は、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な少なくとも９個のヌクレオチドで構成され得る。
好適には、異種配列は、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な１５個のヌクレオチドで構成され得る。
好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域は、５’Ｕ５ドメインの先頭からｇａｇ遺伝子に由来する配列の末端までであり得る。
好適には、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、５’Ｕ５ドメイン、ＰＢＳエレメント、ＳＬ１エレメント、ＳＬ２エレメント、ＳＬ３ψエレメント、ＳＬ４エレメントおよび／またはｇａｇ遺伝子に由来する配列の内部に位置し得る。好適には、ヌクレオチド配列は、ＳＬ１、ＳＬ２および／またはＳＬ３ψエレメントの内部に位置し得る。好適には、ヌクレオチド配列は、ＳＬ１および／またはＳＬ２エレメントの内部に位置し得る。好適には、ヌクレオチド配列は、ＳＬ１エレメントの内部に位置し得る。
好適には、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、改変Ｕ１Ａ ｓｎＲＮＡまたは改変Ｕ１Ａ ｓｎＲＮＡ変異体である。
好適には、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の最初の２個のヌクレオチドはＡＵではない。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、発現カセットによってコードされ得る。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、細胞内に存在し得る。換言すれば、ウイルスベクター構成要素（例えば、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよびレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含む）をコードするヌクレオチド配列と、本明細書に記載される改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含むレンチウイルスベクターを産生するための細胞を、本発明の方法、システムまたは使用において使用することができる。代替的に、本明細書に記載される改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、レンチウイルスベクターを産生するための安定な、または一過性の産生細胞を、本発明の方法、システムまたは使用において使用することもできる。
例えば、レンチウイルスベクターを産生するための好適な方法は、
ａ．ベクター構成要素（例えば、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよびレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含む）をコードするヌクレオチド配列と、本明細書に記載される改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを細胞に導入する工程；
ｂ．ベクター構成要素をコードする前記ヌクレオチド配列と、少なくとも１つの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡとを含む細胞を、適宜、選択する工程；
ｃ．細胞を、ＰＫＣアクチベーター（および適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で、前記ベクター構成要素が前記改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡと共発現されて、レンチウイルスベクターが産生される条件下で培養する工程
を含み得る。
好適な改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ配列の例を表８に提示している。これには例えば、３０５Ｕ１、１７９Ｕ１および２５６Ｕ１に関連する配列が含まれており、これらは本発明を例示するために以下の実施例のセクションで使用される。これらの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡのうち、２５６Ｕ１が特に好ましい。
ＰＫＣアクチベーター（および適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）の詳細については、本明細書中の他の箇所に記載されており、ここでも同様に適用する。
Ｃ．主要スプライスドナー（ＭＳＤ）突然変異
特にレンチウイルスベクター産生の文脈において、本明細書に記載される方法、ウイルスベクター産生システム、およびＰＫＣアクチベーター（ならびに適宜、ＨＤＡＣ阻害剤および／または改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）を含む使用は、本明細書にさらに記載されるＭＳＤ突然変異体を含むレンチウイルスベクターゲノム分子と共に使用することができる。したがって、ＰＫＣアクチベーター（ならびに適宜、ＨＤＡＣ阻害剤および／または改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）に関連して本明細書に記載されている特徴のそれぞれを、ＭＳＤ突然変異に関連してこのセクションで記載されている特徴と組み合わせることができる。
ウイルスベクターのＲＮＡゲノムのパッケージング領域における主要スプライスドナー部位の突然変異は、ベクター産生タイターにとって有害であって、さらに、ＭＳＤのすぐ近隣にある潜在的スプライスドナー（ｃｒＳＤ）を活性化することが示されている。ＭＳＤまたはＣｒＳＤからの異常スプライシングは、ベクタービリオンへのパッケージングを行うことができないスプライスされたＲＮＡの産生を招く。また、形質導入細胞における組込みベクター由来の転写リードスルー産物から、ＭＳＤから細胞転写産物へのスプライシングも報告されており、安全性が懸念されている。本発明者らは、ベクタータイターのそれほど顕著ではない減少を招き（改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの非存在下で）、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下ではタイターのさらなる増加を招く、ＭＳＤスプライシング領域内の新規な突然変異を以前に記載している。主要スプライスドナー部位のそのような突然変異または欠失は、本明細書に記載されるものに加えてベクタータイターに対する追加的な改善効果を有する可能性があり、本明細書に記載される本発明の他のいずれかの態様と組み合わせて使用することができる。
ＲＮＡスプライシングは、５つの小さな核内リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）から構成される、スプライソソームと呼ばれる大きなＲＮＡ－タンパク質複合体によって触媒される。イントロンとエクソンの境界は、プレｍＲＮＡ内部の特定のヌクレオチド配列が目印となり、これはスプライシングが起こる場所を示す。そのような境界は「スプライス部位」と呼ばれる。「スプライス部位」という用語は、真核細胞のスプライシング機構によって、切断されるのに、および／または別のスプライス部位に連結されるのに好適であると認識され得るポリヌクレオチドを指す。
スプライス部位は、プレｍＲＮＡ転写物に存在するイントロンの切出しを可能にする。典型的には、５’スプライス境界は「スプライスドナー部位」または「５’スプライス部位」と称され、３’スプライス境界は「スプライスアクセプター部位」または「３’スプライス部位」と称される。スプライス部位には、例えば、天然に存在するスプライス部位、操作されたかもしくは合成性のスプライス部位、カノニカルもしくはコンセンサススプライス部位、および／または非カノニカルスプライス部位、例えば、潜在的スプライス部位が含まれる。
スプライスアクセプター部位は一般に、３つの別個の配列エレメント、すなわち、分枝点または枝分れ部位、ポリピリミジントラクト、および受容体コンセンサス配列からなる。真核生物における分枝点コンセンサス配列はＹＮＹＴＲＡＣ［（配列番号５）、ここでＹはピリミジン、Ｎは任意のヌクレオチド、Ｒはプリンである］である。３’アクセプタースプライス部位コンセンサス配列はＹＡＧ［（配列番号６）、ここでＹはピリミジンである］である［例えば、Griffiths et al., eds., Modern Genetic Analysis, 2nd edition, W.H. Freeman and Company, New York (2002)を参照］。典型的には、３’スプライスアクセプター部位はイントロンの３’末端に位置する。
そのため、主要スプライスドナー部位は、本明細書に記載される方法、システムおよび使用において使用するために、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列において不活性化され得る。
換言すれば、本明細書に記載される方法、システムおよび使用において使用される細胞は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム内の主要スプライスドナー部位が不活性化されている、例えば、突然変異しているかまたは削除されている、レンチウイルスベクター構成要素（例えば、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、および／またはレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム）をコードする核酸配列を含み得る。
「カノニカルスプライス部位」または「コンセンサススプライス部位」という用語は、互換的に使用することができ、種を越えて保存されているスプライス部位を指す。
真核生物のＲＮＡスプライシングに使用される５’ドナースプライス部位および３’アクセプタースプライス部位のコンセンサス配列は、当技術分野で周知である。これらのコンセンサス配列は、イントロンの各末端にほぼ不変のジヌクレオチドを含む：イントロンの５’末端にはＧＴ、イントロンの３’末端にはＡＧ。
カノニカルスプライスドナー部位のコンセンサス配列は、ＡＧ／ＧＴＲＡＧＴ（配列番号７）（ＤＮＡの場合）（ここでＡはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、“／”は切断部位を示す）であり得る。これは、本明細書に記載されるより一般的なスプライスドナーコンセンサス配列ＭＡＧＧＵＲＲ（配列番号１）に適合する。スプライスドナー配列がこのコンセンサスから逸脱する可能性があることは当技術分野で周知であり、例えば、ｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造のように他の制約が同じ配列にかかるウイルスゲノムでは特にそうである。非カノニカルスプライス部位も当技術分野で周知であるが、それらはカノニカルスプライスドナーコンセンサス配列と比較して稀にしか存在しない。
「主要スプライスドナー部位」という用語は、ウイルスベクターヌクレオチド配列の典型的には５’領域に位置するネイティブ性ウイルスＲＮＡパッケージング配列内にコードされ、埋め込まれている、ウイルスベクターゲノムの第１の（優性）スプライスドナー部位を指す。
一態様では、ウイルスベクターゲノムは、活性のある主要スプライスドナー部位を含有せず、すなわち、前記ヌクレオチド配列内の主要スプライスドナー部位からはスプライシングが起こらず、主要スプライスドナー部位からのスプライシング活性は除去されている。
主要スプライスドナー部位は、レンチウイルスゲノムの５’パッケージング領域内に位置する。ＨＩＶ－１ウイルスの場合、主要スプライスドナーコンセンサス配列は（ＤＮＡの場合）ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴ（（配列番号８）、ここでＡはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、“／”は切断部位を示す）である。
スプライスドナー領域、すなわち、突然変異前の主要スプライスドナー部位を含むベクターゲノムの領域は、以下の配列を有し得る：
ＧＧＧＧＣＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＴ（配列番号９）
一例では、突然変異したスプライスドナー領域は以下の配列を含み得る：
ＧＧＧＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号１０、ＭＳＤ－２ＫＯ）
一例では、突然変異したスプライスドナー領域は以下の配列を含み得る：
ＧＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＡＧＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＡＴ（配列番号１１、ＭＳＤ－２ＫＯｖ２）
別の例では、突然変異したスプライスドナー領域は以下の配列を含み得る：
ＧＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＴ（配列番号１２、ＭＳＤ－２ＫＯｍ５）
一例では、改変前のスプライスドナー領域は次の配列を含み得る：
ＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣ（配列番号１３）
この配列は、本明細書では「ステムループ２」領域（ＳＬ２）とも称される。この配列は、ベクターゲノムのスプライスドナー領域内でステムループ構造を形成し得る。一例では、この配列（ＳＬ２）は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列から削除され得る。
そのため、ＳＬ２を含まないヌクレオチド配列を使用することができる。上記ＳＬ２による配列を含まないヌクレオチド配列も使用することができる。
主要スプライスドナー部位は、以下のコンセンサス配列を有することができ、ここでＲはプリンであり、“／”は切断部位である：
ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴ（配列番号８）
一例では、Ｒはグアニン（Ｇ）であり得る。
主要スプライスドナー領域および潜在的スプライスドナー領域は、以下のコア配列を有することができ、ここで“／”は主要スプライスドナー領域および潜在的スプライスドナー部位での切断部位である：
／ＧＴＧＡ／ＧＴＡ（配列番号１４）。
一例では、ＭＳＤ突然変異ベクターゲノムは、主要スプライスドナー領域および潜在的スプライスドナーの「領域」に少なくとも２つの突然変異を有することができ、第１および第２の「ＧＴ」ヌクレオチドは、それぞれ主要スプライスドナーと潜在的スプライスドナーのヌクレオチドのすぐ３’側である。
本発明の一態様では、主要スプライスドナーのコンセンサス配列はＣＴＧＧＴ（配列番号１５）である。主要スプライスドナー部位は配列ＣＴＧＧＴ（配列番号１５）を含有し得る。
一態様では、ヌクレオチド配列は、本来であれば、ＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号９）のヌクレオチド１３および１４に対応するヌクレオチド間に切断部位を有したと考えられる、不活性化された主要スプライスドナー部位を含む。
本明細書に記載されるように、ヌクレオチド配列は不活性な潜在的スプライスドナー部位も含み得る。一態様では、ヌクレオチド配列は主要スプライスドナー部位に隣接する（３’側）、活性のある潜在的スプライスドナー部位を含有せず、すなわち、隣接する潜在的スプライスドナー部位からはスプライシングが起こらず、潜在的スプライスドナー部位からのスプライシングは除去されている。
「潜在的スプライスドナー部位」という用語は、スプライスドナー部位として正常に機能しないか、または隣接する配列の前後関係（例えば、近くの「好ましい」スプライスドナーの存在）のためにスプライスドナー部位としてあまり効率的に利用されないが、隣接する配列の突然変異（例えば、近くの「好ましい」スプライスドナー）によって活性化されて、より効率的に機能するスプライスドナー部位になることができる核酸配列を指す。
一態様では、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナーの３’側にある第１の潜在的スプライスドナー部位である。
一態様では、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー部位の３’側の主要スプライスドナー部位から６ヌクレオチド以内にある。好ましくは、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー切断部位から４または５、好ましくは４ヌクレオチド以内にある。
本発明の一態様では、潜在的スプライスドナー部位は、コンセンサス配列ＴＧＡＧＴ（配列番号１６）を有する。
一態様では、ヌクレオチド配列は、本来であればＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号９）のヌクレオチド１７および１８に対応するヌクレオチド間に切断部位を有したと考えられる、不活性化された潜在的スプライスドナー部位を含む。
本発明の一態様では、主要スプライスドナー部位および／または隣接する潜在的スプライスドナー部位は、「ＧＴ」モチーフを含有する。本発明の一態様では、主要スプライスドナー部位および隣接する潜在的スプライスドナー部位の両方が、突然変異した「ＧＴ」モチーフを含有する。突然変異したＧＴモチーフは、主要スプライスドナー部位および隣接する潜在的スプライスドナー部位の両方からのスプライス活性を不活性化し得る。そのような突然変異の一例を、本明細書では「ＭＳＤ－２ＫＯ」と称する。
一態様では、スプライスドナー領域は以下の配列を含み得る：
ＣＡＧＡＣＡ（配列番号１７）
例えば、一態様では、突然変異したスプライスドナー領域は次の配列を含み得る：
ＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣ（配列番号１８）
不活性化突然変異のさらなる一例は、本明細書では「ＭＳＤ－２ＫＯｖ２」と称される。
一態様では、突然変異したスプライスドナー領域は以下の配列を含み得る：
ＧＴＧＧＡＧＡＣＴ（配列番号１９）
例えば、一態様では、突然変異したスプライスドナー領域は次の配列を含み得る：
ＧＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号２０）
例えば、一態様では、突然変異したスプライスドナー領域は次の配列を含み得る：
ＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＴ（配列番号２１）
一態様では、上記のようなステムループ２領域がスプライスドナー領域から削除されて、その結果、主要スプライスドナー部位および隣接する潜在的スプライスドナー部位の両方が不活性化される可能性がある。そのような削除を、本明細書では「ΔＳＬ２」と称する。
主要および隣接する潜在的スプライスドナー部位を不活性化するために、多種多様な突然変異をウイルスベクターヌクレオチド配列に導入することができる。
一態様では、突然変異はスプライス領域におけるスプライシング活性を除去または抑制する機能的突然変異である。好適な突然変異は当業者に公知であり、本明細書に記載されている。
例えば、核酸配列に点突然変異を導入することができる。「点突然変異」という用語は、本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドへのあらゆる変化を指す。点突然変異には、例えば、欠失、トランジション、トランスバージョンが含まれる；これらは、タンパク質コード配列内に存在する場合、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、サイレント突然変異として分類可能である。「ナンセンス」突然変異は、終止コドンを生じる。「ミスセンス」突然変異は、異なるアミノ酸をコードするコドンを生じる。「サイレント」突然変異は、タンパク質の機能を変化させない、同じアミノ酸または異なるアミノ酸のいずれかをコードするコドンを生じる。１つまたは複数の点突然変異を、潜在的スプライスドナー部位を含む核酸配列に導入することができる。例えば、潜在的スプライス部位を含む核酸配列を、その中に２つまたはそれ以上の点突然変異を導入することによって突然変異させることができる。
主要スプライスドナー領域および潜在的スプライスドナー部位を含む核酸配列内のいくつかの場所に少なくとも２つの点突然変異を導入することにより、スプライスドナー領域からのスプライシングの減弱化を達成することができる。一態様では、突然変異はスプライスドナー切断部位の４ヌクレオチドの内部に存在し得る；カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列では、これはＡ１Ｇ２／Ｇ３Ｔ４であり、ここで“／”は切断部位である。スプライスドナー配列がこのコンセンサスから逸脱する可能性があることは当技術分野で周知であり、例えば、ｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造のように他の制約が同じ配列にかかるウイルスゲノムでは特にそうである。Ｇ３Ｔ４ジヌクレオチドは一般に、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列内で最も可変性の低い配列であることがよく知られており、Ｇ３およびまたはＴ４への突然変異は最も大きな減弱効果を達成する可能性が高い。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノムの主要スプライスドナー部位の場合、これはＴ１Ｇ２／Ｇ３Ｔ４であり得、ここで“／”は切断部位である。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノムの潜在的スプライスドナー部位の場合、これはＧ１Ａ２／Ｇ３Ｔ４であり得、ここで“／”は切断部位である。さらに、スプライスドナー部位に隣接して点突然変異を導入することもできる。例えば、点突然変異をスプライスドナー部位の上流または下流に導入することができる。主要および／または潜在的スプライスドナー部位を含む核酸配列を、その中に複数の点突然変異を導入することによって突然変異させる実施形態では、点突然変異を、潜在的スプライスドナー部位の上流および／または下流に導入することができる。
したがって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムの主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在的スプライスドナー部位３’が不活性化されている、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列を、本明細書に記載される方法、システムおよび使用において使用することができる。
好適には、レンチウイルスベクターは第３世代レンチウイルスベクターであり得る。
好適には、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー部位の３’側にある最初の潜在的スプライスドナー部位であり得る。
好適には、前記潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー部位の６ヌクレオチド以内に存在し得る。
好適には、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムの主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位を突然変異させるかもしくは削除することができ、ならびに／または主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位からのスプライス活性を抑制または除去することができる（例えば、トランスフェクトされた細胞または形質導入細胞において）。
スプライス部位突然変異体の構築
本発明のスプライス部位突然変異体は、種々の手法を使用して構築することができる。例えば、突然変異を、突然変異体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に導入して、その両側にネイティブ性配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位を置くことができる。ライゲーションの後に、得られた再構築された配列は、目的のヌクレオチド挿入、置換、または欠失を有する誘導体を含む。
ＤＮＡ配列の変更を可能にする他の既知の手法には、組換えアプローチ、例えば、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー、Ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅクローニング、およびＩｎ－ｆｕｓｉｏｎがある。
代替的に、オリゴヌクレオチド指定部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発法を用いて、必要な置換、欠失、または挿入に応じて変化した配列をもたらすこともできる。所望の欠失に隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、スプライス部位突然変異体の欠失または切断誘導体を構築することもできる。
制限の後に、オーバーハングを埋めて、ＤＮＡを再ライゲートすることができる。
上記に示された変更を行う方法の例は、Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）によって開示されている。スプライス部位突然変異体を、ＰＣＲ突然変異誘発、強制的ヌクレオチド誤取込み（例えば、Liao and Wise, 1990）による化学突然変異誘発（Drinkwater and Klinedinst, 1986）、またはランダム突然変異誘発オリゴヌクレオチド（Horwitz et al., 1989）を使用して構築することもできる。
Ｄ．ｔａｔ非依存性レンチウイルスベクター
特にレンチウイルスベクター産生の文脈において、ｔａｔ非依存性レンチウイルスベクターを、本明細書に記載される方法、ウイルスベクター産生システム、およびＰＫＣアクチベーター（ならびに適宜、ＨＤＡＣ阻害剤）を含む使用と共に使用することができる。一態様では、レンチウイルスベクターは第３世代レンチウイルスベクターであり得る。明確にするために、「ｔａｔ非依存性」という用語は、ベクターゲノムカセットの転写を駆動するために使用されるＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーターが異種プロモーターに置き換えられることを意味すると理解される。一態様では、ｔａｔはレンチウイルスベクターの製造方法、システムまたは使用において提供されず、例えば、ｔａｔはトランス性に提供されない。一態様では、本明細書に記載される細胞、ベクターまたはベクター産生システムは、ｔａｔタンパク質を含まない。
定義
本発明の実施には、別段の指示がない限り、化学、分子生物学、微生物学および免疫学の従来の手法を利用するが、それらの技術は当業者の能力の範囲内にある。そのような手法は文献で説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY; B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press;およびD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press.を参照されたい。これらの一般的な文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、一本鎖ポリペプチド分子のほかに、個々の構成ポリペプチドが共有結合的または非共有結合的な手段によって連結されている複数のポリペプチド複合体を含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、単量体がアミノ酸であり、ペプチド結合またはジスルフィド結合を介して接続されている重合体を指す。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」および／または「タンパク質」という用語と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。
本明細書に記載される方法、システムおよび使用は、明記されたＰＫＣアクチベーター、またはその類似体、誘導体もしくは薬学的な塩のうちの１つを含み得る。また、本明細書に記載される方法、システムおよび使用は、明記されたＨＤＡＣ阻害剤、またはその類似体、誘導体もしくは薬学的な塩のうちの１つも含み得る。
「類似体」という用語は、構造類似体を含む。本明細書で使用される場合、「構造類似体」という用語は、明記された化合物と共通の構造的特徴を有するが、他の点で、例えば、１つまたは複数の他の化学的部分の包含または削除の点で構造的に異なる化合物を意味する。
「誘導体」という用語は、その生物活性に影響を及ぼさない様式で変更された分子を意味し得る。誘導体は、親分子の機能的誘導体または生物学的効果のある類似体であり得る。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載される化合物に見出される特定の置換基に応じた、比較的毒性のない酸または塩基と共に調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、そのような化合物の中性形態を、溶媒なしで、または好適な不活性溶媒中で、十分な量の所望の塩基と接触させることにより、塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または類似の塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、そのような化合物の中性形態を、溶媒なしで、または好適な不活性溶媒中で、十分な量の所望の酸と接触させることによって酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、リン酸一水素、リン酸二水素、硫酸、硫酸水素、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸から誘導される塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的毒性のない有機酸から誘導される塩が含まれる。また、アルギン酸などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツノール酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照のこと）。本発明のある特定の化合物は、塩基性および酸性の両方の官能基を含有し、塩基付加塩および酸付加塩のいずれにも変換することができる。
ベクター／発現カセット
ベクターは、１つの環境から別の環境への実体の移行を可能にするか、または促進するツールである。本発明に従い、および例示の目的で、組換え核酸技術において使用されるいくつかのベクターは、実体、例えば、核酸のセグメント（例えば、異種ＤＮＡセグメント、例えば、異種ｃＤＮＡセグメント）が、標的細胞に移行して標的細胞によって発現されるのを可能にする。ベクターは、標的細胞内のヌクレオチド配列の組込みを促進し得る。例えば、ベクターは、本明細書に記載される改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の組込みを促進することにより、本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的細胞内でのその発現を維持することができる。
ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）および／または追跡可能なマーカー遺伝子［例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子］を含有し得る。ベクターは、例えば、標的細胞に感染させ、および／または形質導入するために使用され得る。ベクターはさらに、ベクターが当該宿主細胞内で複製することを可能にするヌクレオチド配列を含み得る。
ベクターは、発現カセット（発現コンストラクトとも称される）である場合もあれば、発現カセットを含む場合もある。本明細書に記載される発現カセットは、転写され得る配列を含有する核酸の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡをコードする配列はこの定義に含まれる。
「カセット」という用語は、「コンジュゲート」、「コンストラクト」、「ハイブリッド」などの用語と同義であり、プロモーターに直接的または間接的に結び付けられたポリヌクレオチド配列を含む。
発現カセットは、典型的には、コードされるヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター、および適宜、コードされるヌクレオチド配列の調節因子を含む。例えば、ウイルスベクター構成要素をコードする発現カセットは、典型的には、ウイルスベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター、および適宜、ウイルスベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列の調節因子を含む。好ましくは、カセットは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を少なくとも含む。
本明細書に記載される改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを含む方法、システムまたは使用の文脈において、発現カセットを使用して、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを宿主細胞に提供することができる。例えば、発現カセットは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター、および適宜、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の調節因子を含み得る。発現カセットは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を、適合する標的細胞においてインビトロで複製するために使用することができる。したがって、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする発現カセットを適合する標的細胞にインビトロで導入し、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの発現がもたらされる条件下で標的細胞を増殖させることによって、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをインビトロで作成することができる。従来の分子生物学および細胞生物学の手法を使用して本発明の発現カセットを細胞に導入することは、当業者の能力の範囲内にある。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、当業者に周知の方法によって標的細胞から回収することができる。好適な標的細胞には、哺乳動物細胞株および他の真核細胞株が含まれる。
発現カセット、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存する。発現カセットは、ＤＮＡプラスミド（高次コイル状、ニック入り、直鎖状化）、小環状ＤＮＡ（直鎖状または高次コイル状）、制限酵素消化および精製によるプラスミド骨格の除去によって目的の領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、使用される最終的なＤＮＡが閉じた連結形態であるかまたはそれが開放切断端を有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）、酵素的ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えば、ドギーボーン（ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ）ＤＮＡ［ｄｂＤＮＡ（商標）］を使用して生成されたＤＮＡであり得る。
本明細書に記載される方法、ウイルスベクター産生システム、および使用は、ウイルスベクターの産生のためのものである。当業者には明らかであろうが、いかなる好適なウイルスベクターも、本明細書に記載される方法、ウイルスベクター産生システムおよび使用によって産生することができる。例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から、好適なウイルスベクターを選択することができる。一例では、ウイルスベクターは自己不活性化（ＳＩＮ）ウイルスベクターである。
アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター
アデノウイルスを、本明細書に記載される方法を使用して検出することもできる。アデノウイルスは二本鎖の直鎖状ＤＮＡウイルスであり、ＲＮＡ中間体を介しては複製されない。アデノウイルスには５０種を上回る異なるヒト血清型が存在し、その遺伝子配列に基づいて６つのサブグループに分けられる。
アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスであり、ヒト由来および非ヒト由来の広範な細胞型にインビボ、エクスビボおよびインビトロで形質導入を行うことができる。これらの細胞には、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、初代乳腺上皮細胞、および有糸分裂後終末分化細胞、例えば、ニューロンが含まれる。
アデノウイルスベクターは、非分裂細胞にも形質導入が可能である。これは、肺上皮内の罹患細胞の代謝回転速度が遅い疾患、例えば、嚢胞性線維症では非常に重要である。実際に、罹患した成人嚢胞性線維症患者の肺内への嚢胞性線維症トランスポーター（ＣＦＴＲ）のアデノウイルス媒介性移入を利用するいくつかの試験が進行中である。
アデノウイルスは、遺伝子治療および異種遺伝子発現用のベクターとして使用されている。大きな（３６ｋｂ）ゲノムには最大８ｋｂの外来インサートＤＮＡを収容することができ、補完細胞株において効率的に複製されて、１ｍｌあたり最大１０１２形質導入単位という非常に高いタイターを生じ得る。このため、アデノウイルスは、初代非複製細胞における遺伝子の発現を研究するための最良の系の１つである。
アデノウイルスゲノムからのウイルス遺伝子または外来遺伝子の発現は、複製細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞内に侵入する。ひとたび細胞内に入ったとして、アデノウイルスベクターが宿主染色体に組み込まれることは稀である。アデノウイルスベクターは実際には、宿主核内で線状ゲノムとしてエピソーム性に（宿主ゲノムとは独立して）機能する。
遺伝子治療のための組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびアデノウイルスに基づくウイルスベクターの使用は広く普及しており、その製造については十分に記載されてきた。典型的には、ＡＡＶに基づくベクターは、哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３に基づく）またはバキュロウイルス／Ｓｆ９昆虫細胞系の使用を通じて産生される。ＡＡＶベクターは、ＤＮＡをコードするベクター構成要素を、典型的にはアデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のヘルパー機能と共に一過性に導入することによって、またはＡＡＶベクター構成要素を安定して発現する細胞株を使用することによって産生することができる。アデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルスＥ１の機能を安定して発現する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３に基づく）において産生される。
アデノウイルスベクターはまた、典型的には、産生細胞株を使用する一連の「感染」によるヘルパー機能依存的複製を介しても「増幅」される。アデノウイルスベクターおよびその産生システムは、アデノウイルスゲノムの全体または一部を含むポリヌクレオチドを含む。アデノウイルスは、限定するものではないが、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１２、Ａｄ４０に由来するアデノウイルスであることが知られている。アデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルスの外被に封入されたＤＮＡ、または別のウイルスもしくはウイルス様の形態（例えば、単純ヘルペス、ＡＡＶ）にパッケージングされたアデノウイルスＤＮＡの形態にある。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８を含むがこれらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターであると一般に理解されている。ＡＡＶベクターは、１つまたは複数のＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子について全体または一部が欠失し得るが、機能的な隣接ＩＴＲ配列は保持し得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシス性（ｉｎ ｃｉｓ）であることが必要とされる配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含むと定義される。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。「ＡＡＶベクター」はまた、そのタンパク質シェルまたはカプシドも指し、ベクター核酸を標的細胞の核にデリバリーするための効率的なビヒクルとなる。ＡＡＶ産生システムはヘルパー機能を必要とするが、これは典型的にはＡＡＶ由来のコード配列を指し、発現されてＡＡＶ遺伝子産物をもたらし、それは続いて生産的なＡＡＶ複製のためにトランス性に機能することができる。そのため、ＡＡＶヘルパーの機能には、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐおよびｃａｐの両方が含まれる。Ｒｅｐ発現産物は多くの機能を有することが示されており、これには特に、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節が含まれる。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書において、ＡＡＶベクターに欠けているトランス性のＡＡＶ機能を補完するために使用される。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは一般に、目的のヌクレオチド配列のデリバリーのための形質導入ベクターを生成するために使用されるＡＡＶベクターから削除されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指すと理解されている。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶ複製のために必要な欠けているＡＡＶ機能を補完する目的で、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供するために一般に使用される；しかし、ヘルパーコンストラクトはＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、複製することも自らをパッケージングすることもできない。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはウイルス粒子の形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードする一般に使用されるプラスミドであるｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐｌＭ２９＋４５などの、いくつかのＡＡＶヘルパーコンストラクトが記載されている。例えば、Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828;およびMcCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945を参照。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物をコードするベクターは他にもいくつか記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同第６，３７６，２３７号を参照のこと。加えて、「アクセサリー機能」という用語が、ＡＡＶがその複製に依存している非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞機能を指すことはよく知られている。したがって、この用語はＡＡＶ複製に必要なタンパク質およびＲＮＡをとらえており、これにはＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶカプシドのアセンブリーに関与する部分が含まれる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかから導き出すことができる。
単純ヘルペスウイルスベクター
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、エンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスであり、自然にニューロンに感染する。これは外来性ＤＮＡの大きな断片を収容し得るため、ベクターシステムとして魅力的であり、ニューロンへの遺伝子デリバリー用のベクターとして利用されている［Manservigiet et al Open Virol J. (2010) 4:123-156］。
治療手技におけるＨＳＶの使用には、株が溶解サイクルを確立し得ないように弱毒化する必要がある。特に、ＨＳＶベクターをヒトの遺伝子治療に使用する場合には、好ましくは、ポリヌクレオチドは必須遺伝子に挿入されるべきである。これは、ウイルスベクターが野生型ウイルスに遭遇すると、野生型ウイルスへの異種遺伝子の移入が組換えによって起こり得るためである。しかし、ポリヌクレオチドが必須遺伝子に挿入されている限り、この組換え移入はレシピエントウイルスの必須遺伝子をも欠失させるため、複製能力のある野生型ウイルス集団への異種遺伝子の「逸脱」は防がれることになる。
ワクシニアウイルスベクター
本明細書に記載される方法を使用することで、複製能力のあるワクシニアウイルスの存在を検出することもできる。ワクシニアウイルスベクターには、ＭＶＡまたはＮＹＶＡＣが含まれる。ワクシニアベクターの代替物には、トリポックスベクター、例えば、ＡＬＶＡＣとして知られる鶏痘またはカナリア痘、およびそれらに由来する株であって、ヒト細胞に感染し、ヒト細胞において組換えタンパク質を発現するが、複製不能であるものが含まれる。
別の例では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであり、好ましくは、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクター（例えば、ＳＩＮレンチウイルスベクター）である。これらのウイルスのさらなる詳細は、本明細書中の他の箇所に提示されている。好適なレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびビスナレンチウイルスベクターからなる群から選択され得る。例えば、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）またはＥＩＡＶレンチウイルスベクターから選択され得る。
レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、任意の好適なレトロウイルスに由来し得るか、または導き出すことができる。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。その例としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が含まれる。レトロウイルスの詳細な一覧は、Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に見出し得る。
レトロウイルスは、２つのカテゴリー、すなわち、「単純型」および「複合型」に大きく分けることができる。レトロウイルスはさらに７つの群に分けることができる。これらの群のうちの５つは、発がん能を有するレトロウイルスに相当する。残りの２つの群はレンチウイルスおよびスプーマウイルスである。これらのレトロウイルスの概説は、Coffin et al (1997)、前掲に記載されている。
レトロウイルスおよびレンチウイルスのゲノムの基本構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲのような多くの共通の特徴を有しており、それらの間または内部には、ゲノムがパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、標的細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位、ならびにウイルス粒子のアセンブリーに必要なポリペプチドであるパッケージング構成要素をコードするｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が位置する。レンチウイルスには、ＨＩＶのｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列などのさらなる特徴があり、これらは組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物を、感染された標的細胞の核から細胞質へと効率的に輸出することを可能にする。
プロウイルスでは、これらの遺伝子は両端で、長末端反復（ＬＴＲ）と称される領域に隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組込みおよび転写を担っている。ＬＴＲはまた、エンハンサー－プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。
ＬＴＲそれ自体は、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つの要素に分けることができる同一の配列である。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。これら３つのエレメントのサイズは、レトロウイルスによってかなり違いがある。
典型的なレトロウイルスベクターでは、複製に必須の１つまたは複数のタンパク質コード領域の少なくとも一部がウイルスから除去され得る；例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖが存在しないこと、または機能的でないことがあり得る。このため、ウイルスベクターは複製欠損性になる。
レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、より大きなレトロウイルス群の一部である。レンチウイルスの詳細な一覧は、Coffin et al (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763）に記載されている。手短に述べると、レンチウイルスは霊長類群および非霊長類群に分類され得る。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらには限定されない。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「スローウイルス」であるビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）のほか、関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
レンチウイルス科は、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる［Lewis et al (1992) EMBO J 11(8):3053-3058、およびLewis and Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516］。対照的に、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、非分裂細胞、または遅く分裂する細胞、例えば、筋肉、脳、肺および肝組織を構成する細胞には感染することができない。
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、レンチウイルスに由来し得る少なくとも１つの構成要素部分を含むベクターである。好ましくは、その構成要素部分は、ベクターが標的細胞に感染するかまたは形質導入して、ＮＯＩを発現する生物学的メカニズムに関与する。
レンチウイルスベクターは、適合する標的細胞においてインビトロでＮＯＩを複製させるために使用される。したがって、適合する標的細胞にインビトロで本発明のベクターを導入し、ＮＯＩの発現をもたらす条件下で標的細胞を増殖させることによって、インビトロでタンパク質を作成する方法が、本明細書に記載される。タンパク質およびＮＯＩは、当技術分野で周知の方法によって標的細胞から回収し得る。好適な標的細胞には、哺乳動物細胞株および他の真核細胞株が含まれ、それらは本明細書中の他の箇所に記載されている。
ベクターは、プロモーターとエンハンサーとの間の相互作用を遮断し、隣接する遺伝子からのリードスルーを減少させる障壁として機能する遺伝子配列である「インスレーター」を有し得る。インスレーターは、プロモーターの干渉、および隣接する遺伝子からのリードスルーを防ぐために、１つまたは複数のレンチウイルス核酸配列の間に存在し得る。インスレーターが１つまたは複数のレンチウイルス核酸配列の間のベクター中に存在する場合、これらの絶縁された遺伝子のそれぞれは個々の発現単位として配置され得る。
レトロウイルスおよびレンチウイルスのゲノムの基本構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲのような多くの共通の特徴を有しており、それらの間または内部には、ゲノムがパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、標的細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位、ならびにウイルス粒子のアセンブリーに必要なポリペプチドであるパッケージング構成要素をコードするｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が位置する。レンチウイルスには、ＨＩＶのｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列などのさらなる特徴があり、これらは組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物を、感染された標的細胞の核から細胞質へと効率的に輸出することを可能にする。
プロウイルスでは、これらの遺伝子は両端で、長末端反復（ＬＴＲ）と称される領域に隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組込みおよび転写を担っている。ＬＴＲはまた、エンハンサー－プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。
ＬＴＲそれ自体は、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つの要素に分けることができる同一の配列である。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。これら３つのエレメントのサイズは、レトロウイルスによってかなり違いがある。
本明細書に記載される典型的なレンチウイルスベクターでは、複製に必須の１つまたは複数のタンパク質コード領域の少なくとも一部がウイルスから除去され得る；例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖが存在しないこと、または機能的でないことがあり得る。このため、ウイルスベクターは複製欠損性になる。
レンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）または非霊長類レンチウイルス（例えば、ＥＩＡＶ）のいずれかに由来し得る。
一般論として、典型的なレトロウイルスベクター産生システムは、ウイルスゲノムを必須のウイルスパッケージ機能から分離することを伴う。これらの構成要素は通常、別々のＤＮＡ発現カセット（別名プラスミド、発現プラスミド、ＤＮＡコンストラクトまたは発現コンストラクトとしても知られる）上にある形で産生細胞に提供される。
ベクターゲノムはＮＯＩを含む。ベクターゲノムは典型的には、パッケージングシグナル（ψ）、ＮＯＩを保持する内部発現カセット、（適宜）転写後エレメント（ＰＲＥ）、典型的には中央ポリプリントラクト（ｃｐｐｔ）、３’－ｐｐｕ、および自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを必要とする。Ｒ－Ｕ５領域は、ベクターゲノムＲＮＡおよびＮＯＩ ｍＲＮＡの両方の適切なポリアデニル化、ならびに逆転写の過程のために必要である。ベクターゲノムには、ＷＯ２００３／０６４６６５に記載されているように、適宜、オープンリーディングフレームを含めることができ、これによりｒｅｖの非存在下でもベクターの産生が可能になる。
パッケージング機能には、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が含まれる。これらは産生細胞によるベクター粒子の産生のために必要である。これらの機能をトランス性にゲノムに提供することにより、複製欠損ウイルスベクターの産生が促進される。
ガンマ－レトロウイルスベクターの産生システムは、典型的には、ゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ発現コンストラクトを必要とする３構成要素系である。ＨＩＶ－１に基づくレンチウイルスベクターの産生システムでは、さらに補助遺伝子ｒｅｖが提供されることと、ベクターゲノムにｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）が含まれることが必要になり得る。ＥＩＡＶに基づくレンチウイルスベクターは、ゲノム内にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する場合には、ｒｅｖがトランス性に提供される必要はない（ＷＯ２００３／０６４６６５を参照されたい）。
通常、ベクターゲノムカセット内にコードされる「外部」プロモーター（ベクターゲノムカセットを駆動する）および「内部」プロモーター（ＮＯＩカセットを駆動する）の両方は、他のベクターシステム構成要素を駆動するものと同様に、強力な真核生物またはウイルスプロモーターである。そのようなプロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、およびユビキチンプロモーターが含まれる。ＤＮＡライブラリーによって作製されるような強力な「合成」プロモーター（例えば、Ｊｅｔプロモーター）も、転写を駆動するために使用され得る。代替的に、組織特異的プロモーター、例えば、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体－桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、神経特異的神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、およびＢ２９プロモーターも、転写を駆動するために使用され得る。
ウイルスベクターの産生は、これらのＤＮＡ構成要素による産生細胞の一過性のコトランスフェクションか、またはすべての構成要素が産生細胞ゲノムに安定に組み込まれた安定した産生細胞株の使用のいずれかを伴う［例えば、Stewart HJ, Fong-Wong L, Strickland I, Chipchase D, Kelleher M, Stevenson L, Thoree V, McCarthy J, Ralph GS, Mitrophanous KA and Radcliffe PA. (2011). Hum Gene Ther. Mar; 22 (3):357-69］。代替的なアプローチは、安定したパッケージング細胞（その中にパッケージング構成要素が安定に組み込まれている）を使用し、および次いで、ベクターゲノムプラスミドにおける一過性トランスフェクションを必要に応じて行うことである［例えば、Stewart, H. J., M. A. Leroux-Carlucci, C. J. Sion, K. A. Mitrophanous and P. A. Radcliffe (2009). Gene Ther. Jun; 16 (6):805-14］。また、完全ではない代替的なパッケージング細胞株を作製し（１つまたは２つのパッケージング構成要素のみが細胞株に安定に組み込まれている）、ベクターを作製するために欠けている構成要素を一過性にトランスフェクトすることも可能である。産生細胞はまた、調節タンパク質、例えば、転写調節因子のｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質グループのメンバー（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－ＯｎおよびＴｅｔ－Ｏｆｆ）、転写調節因子のクマート誘導性スイッチシステムグループのメンバー［例えば、クマートリプレッサー（ＣｙｍＲ）タンパク質］、またはＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ－トリプトファン活性化ＲＮＡ結合タンパク質）も発現しうる。
一例では、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡＶはレンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、本発明における使用に特に好ましい。ＥＩＡＶは、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に加えて、他の３つの遺伝子、すなわち、ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２をコードする。ｔａｔはウイルスＬＴＲの転写アクチベーターとして作用し［Derse and Newbold (1993) Virology 194(2):530-536 and Maury et al (1994) Virology 200(2):632-642］、ｒｅｖはｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節し、協調させる［Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111］。これらの２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける同様のメカニズムに広く類似すると考えられている［Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111］。Ｓ２の機能は不明である。また、ＥＩＡＶタンパク質の１つであるＴｔｍが同定されており、これは膜貫通タンパク質の開始部位でｅｎｖコード配列へとスプライシングされるｔａｔの第１エキソンによりコードされる。本発明の代替的な一実施形態では、ウイルスベクターはＨＩＶに由来する。ＨＩＶがＥＩＡＶと異なるのは、それはＳ２をコードしないが、ＥＩＡＶとは違って、それがｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆをコードする点である。
「組換えレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター」（ＲＲＶ）という用語は、標的細胞に形質導入しうるウイルス粒子内へのＲＮＡゲノムのパッケージングを、パッケージング構成要素の存在下で可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターを指す。
標的細胞の形質導入は、逆転写および標的細胞ゲノムへの組込みを含み得る。ＲＲＶは、ベクターによって標的細胞に送達しようとする非ウイルス性コード配列を保有する。ＲＲＶは、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を産生する独立した複製の能力を持たない。通常、ＲＲＶは機能的ｇａｇ／ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子、ならびに／または複製に必須の他の遺伝子を欠く。
好ましくは、本発明のＲＲＶベクターは最小ウイルスゲノムを有する。
本明細書で使用される場合、「最小ウイルスゲノム」という用語は、標的細胞に感染して、ＮＯＩの形質導入および送達を行うために必要な機能性を与えるのに必須のエレメントを保有する一方で、非必須エレメントが除去されるようにウイルスベクターが操作されていることを意味する。この戦略のさらなる詳細は、ＷＯ１９９８／１７８１５およびＷＯ９９／３２６４６に見出すことができる。最小ＥＩＡＶベクターは、ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２遺伝子を欠き、これらの遺伝子はいずれも産生システムにおいてトランス性に提供されない。最小ＨＩＶベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆを欠く。
産生細胞内でベクターゲノムを産生させるために使用される発現カセットは、産生細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を導くためにレトロウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節制御配列を含み得る。産生細胞内でベクターゲノムを産生させるために使用される発現プラスミドは、産生細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を導くためにレトロウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節制御配列を含み得る。すべての第３世代レンチウイルスベクターは、５’Ｕ３エンハンサー－プロモーター領域において欠失を有し、ベクターゲノムＲＮＡの転写は、異種プロモーター、例えば、別のウイルスプロモーター、例えば、以下に考察されるＣＭＶプロモーターによって駆動され得る。この特徴は、ｔａｔに非依存的なベクター産生を可能にする。いくつかのレンチウイルスベクターゲノムは、効率的なウイルス産生のための追加の配列を要する。例えば、特にＨＩＶの場合には、ＲＲＥ配列が含まれ得る。しかし、（別々の）ＧａｇＰｏｌカセット上のＲＲＥの必要性（およびトランス性に提供されるｒｅｖに対する依存性）は、ＧａｇＰｏｌ ＯＲＦのコドン最適化によって低減または排除され得る。この戦略のさらなる詳細は、ＷＯ２００１／７９５１８に見出され得る。
ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす代替的な配列も公知である。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体が、マソン・ファイザー（Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルスにおいて見出される。これは恒常的な輸送エレメント（ＣＴＥ）として公知であり、感染細胞内の因子と相互作用すると考えられているＲＲＥ型配列をゲノム内に含む。この細胞因子はｒｅｖ類似体と考え得る。したがって、ＣＴＥを、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替物として使用し得る。公知であるかまたは利用可能となるＲｅｖタンパク質の他のあらゆる機能的等価物が、本発明に妥当であり得る。例えば、ＨＴＬＶ－ＩのＲｅｘタンパク質はＨＩＶ－１のＲｅｖタンパク質に機能的に置き換わり得ることも公知である。ＲｅｖおよびＲＲＥは、本発明の方法における使用のためのベクターにおいて存在しないかまたは非機能的であることがあり得、代替的にｒｅｖおよびＲＲＥ、または機能的に等価な系が存在し得る。
本明細書で使用される場合、「機能的代替物」という用語は、別のタンパク質または配列と同じ機能を果たす代替的な配列を有するタンパク質または配列を意味する。「機能的代替物」という用語は、同じ意味を有する「機能的等価物」および「機能的類似体」と本明細書において互換的に使用される。
ＳＩＮベクター
本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、ウイルスエンハンサーおよびプロモーター配列が欠失している自己不活性化（ＳＩＮ）構成に使用され得る。例えば、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターを、ＳＩＮ構成に使用することができる。ＳＩＮベクターを作製して、非ＳＩＮベクターのものに類似した有効性で、インビボ、エクスビボまたはインビトロで非分裂性の標的細胞に形質導入することができる。ＳＩＮプロウイルスにおける長末端反復（ＬＴＲ）の転写不活性化はｖＲＮＡの動員を妨げるはずであり、これは複製可能ウイルスが形成される可能性をさらに減じさせる特徴である。これはまた、ＬＴＲのシス作用性効果を排除することにより、内部プロモーターからの遺伝子の調節発現をも可能にするはずである。
一例として、自己不活性化レトロウイルスベクターシステムが、３’ＬＴＲのＵ３領域内の転写エンハンサーまたはエンハンサーおよびプロモーターを欠失させることによって構築されている。ベクターの逆転写および組込みを１回行った後に、これらの変化が５’および３’ＬＴＲの両方にコピーされて、転写的に不活性な「プロウイルス」が生成される。しかし、そのようなベクターにおいてＬＴＲに対して内部にある任意のプロモーターは依然として転写活性を有すると考えられる。この戦略は、内部に位置する遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲにおけるエンハンサーおよびプロモーターの効果を排除するために利用されている。そのような効果には、転写の増大または転写の抑制が含まれる。また、この戦略は、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡ内への下流転写を排除するためにも使用し得る。これは、あらゆる内因性がん遺伝子の偶発的活性化を防止することが重要であるヒト遺伝子治療において特に関心が持たれる。Yu et al., (1986) PNAS 83: 3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261: 120-32; Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90。ＳＩＮレンチウイルスベクターは、米国特許第６，９２４，１２３号および同第７，０５６，６９９号に記載されている。
複製欠損レンチウイルスベクター
複製欠損レンチウイルスベクターのゲノムにおいて、ｇａｇ／ｐｏｌおよび／またはｅｎｖの配列が突然変異している、および／または機能的でないことが可能である。
本明細書に記載される典型的なレンチウイルスベクターでは、ウイルス複製に必須のタンパク質に関する１つまたは複数のコード領域の少なくとも一部がベクターから除去され得る。これにより、ウイルスベクターは複製欠損になる。また、非分裂標的細胞に形質導入を行うことができ、および／またはそのゲノムを標的細胞ゲノム内に組み込むことができるＮＯＩを含むベクターを作製する目的で、ウイルスゲノムの部分をＮＯＩによって置き換えることもできる。
一例では、ウイルスベクターは、ＷＯ２００６／０１０８３４およびＷＯ２００７／０７１９９４に記載されている非組込み性ベクターである。
さらなる一例では、ベクターは、ウイルスＲＮＡが全くないかまたは欠いている配列を送達する能力を有する。さらなる一例では、送達しようとするＲＮＡのパッケージングを確実に行うために、ＧａｇまたはＧａｇ Ｐｏｌ上のコグネイト結合ドメインを使用することができる。これらのベクターは両方ともＷＯ２００７／０７２０５６に記載されている。
ベクター産生システムおよび細胞
本明細書に記載されるウイルスベクター産生システムは、ウイルスベクターの産生に必要な構成要素をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。したがって、ベクター産生システムは、ウイルスベクター粒子を生成するために必要な構成要素をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。典型的には、ヌクレオチド配列のセットは細胞内に存在する。
「ウイルスベクター産生システム」または「ベクター産生システム」または「産生システム」は、ウイルスベクター産生のための必要な構成要素を含むシステムであると解釈される。「ベクターの産生のために必要な構成要素」と「ウイルスベクター構成要素」という用語は、本明細書中で互換的に使用される。ウイルスベクター産生システムは、ウイルスベクター粒子を生成するために必要な構成要素をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。
本明細書に記載されるウイルスベクター産生システムの非限定的な例は、レンチウイルスベクター産生システムである。本発明のレンチウイルスベクター産生システムは、レンチウイルスベクターの産生に必要な構成要素をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。したがって、レンチウイルスベクター産生システムは、レンチウイルスベクター粒子を生成するために必要な構成要素をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。前述の通り、ヌクレオチド配列のセットは典型的には細胞内に存在する。
一例では、ヌクレオチド配列のセットはベクター産生のためのｔａｔ非依存システムにおけるレンチウイルスベクターの生成に好適であり得る。本明細書に記載されるように、第３世代レンチウイルスベクターはＵ３依存性である（そして転写を駆動する異種プロモーターを利用する）。一例では、ｔａｔはレンチウイルスベクター産生システムに提供されず、例えば、ｔａｔはトランス性に提供されない。したがって、一態様では、本明細書に記載されるウイルスベクター産生システムは、ｔａｔタンパク質を含まない。
一例では、ヌクレオチド配列のセットは、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびにＥｎｖタンパク質およびベクターゲノム配列を含み得る。ヌクレオチド配列のセットは、Ｒｅｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその機能的代替物を含んでもよい。
一実施形態では、ウイルスベクター産生システムは、モジュール式核酸コンストラクト（モジュール式コンストラクト）を含む。モジュール式コンストラクトは、ウイルスベクターの産生に使用される２つ以上の核酸を含むＤＮＡ発現コンストラクトである。モジュール式コンストラクトは、ウイルスベクターの産生に使用される２つ以上の核酸を含むＤＮＡプラスミドであり得る。プラスミドは細菌性プラスミドであり得る。核酸は、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムをコードし得る。さらに、パッケージングおよびプロデューサー細胞株の生成のために設計されたモジュール式コンストラクトは、さらに、転写調節タンパク質（例えば、ＴｅｔＲ、ＣｙｍＲ）および／または翻訳抑制タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）ならびに選択マーカー［例えば、ゼオシン（商標）、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、ピューロマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子］をコードする必要があり得る。好適なモジュール式コンストラクトはＥＰ ３５０２２６０に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
モジュール式コンストラクトは、１つのコンストラクト上に２つ以上のウイルス構成要素をコードする核酸配列を含有するため、これらのモジュール式コンストラクトの安全性プロファイルが考慮され、追加の安全上の特徴がコンストラクトに直接操作されている。これらの特徴には、ウイルスベクター構成要素の複数のオープンリーディングフレームに対するインスレーターの使用、ならびに／またはモジュール式コンストラクトにおけるウイルス遺伝子の特定の向きおよび配置が含まれる。これらの特徴を利用することにより、複製能力のあるウイルス粒子が生成される直接リードスルーが妨げられると考えられている。
ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列は、モジュール式コンストラクト内で逆向きおよび／または交互の向きの転写方向であり得る。したがって、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列は、同じ５’から３’への向きでは提示されず、その結果、同一のｍＲＮＡ分子からウイルスベクター構成要素を産生することはできない。逆向きとは、異なるベクター構成要素の少なくとも２つのコード配列が「頭から頭へ」および「尾から尾へ」の転写方向で提示されることを意味し得る。これは、一方の鎖上に１つのベクター構成要素（例えば、ｅｎｖ）のコード配列を提供し、モジュール式コンストラクトの反対側の鎖上に別のベクター構成要素（例えば、ｒｅｖ）のコード配列を提供することによって達成することができる。好ましくは、モジュール式コンストラクトに２つを上回るベクター構成要素のコード配列が存在する場合には、コード配列のうちの少なくとも２つが逆の転写方向で存在する。したがって、モジュール式コンストラクト内に２つを上回るベクター構成要素のコード配列が存在する場合、各構成要素は、隣接する他のベクター構成要素のすべての隣接するコード配列に対して逆の５’から３’への向きに存在するように配置することができ、すなわち、各コード配列に対して５’から３’へ（または転写）の向きを交互に使用することができる。
モジュール式コンストラクトは、以下のベクター構成要素：ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムのうちの２つ以上をコードする核酸配列を含み得る。モジュール式コンストラクトは、ベクター構成要素の任意の組み合わせをコードする核酸配列を含み得る。一例では、モジュール式コンストラクトは、
ｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｒｅｖ、またはその機能的代替物；
ｉｉ）レトロウイルスベクターＲＮＡゲノムおよびｇａｇ－ｐｏｌ；
ｉｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｅｎｖ；
ｉｖ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｒｅｖ、もしくはその機能的代替物；
ｖ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖ；
ｖｉ）ｅｎｖおよびｒｅｖ、もしくはその機能的代替物；
ｖｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖもしくはその機能的代替物、およびｇａｇ－ｐｏｌ；
ｖｉｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖもしくはその機能的代替物、およびｅｎｖ；
ｉｘ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖ；または
ｘ）ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖもしくはその機能的代替物、およびｅｎｖ、
をコードする核酸配列を含むことができ、ここで核酸配列は逆向きおよび／または交互の向きにある。
一部の例では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得る。
本明細書中の他の箇所に記載されるように、本明細書に記載されるウイルスベクター産生システムは、典型的には、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を細胞内に含む（換言すれば、細胞はウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む）。一例では、ウイルスベクター産生システムの細胞は、上記のｉ）からｘ）の組み合わせのうちのいずれか１つをコードする核酸配列を含むことができ、ここで核酸配列は同じ遺伝子座に位置し、逆向きおよび／または交互の向きである。同じ遺伝子座は、細胞内の１つの染色体外遺伝子座、例えば、単一のプラスミド、または細胞のゲノム内の１つの遺伝子座（すなわち、単一の挿入部位）を指すことがある。細胞は、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを産生するための安定した、または一過性の細胞である。
ＤＮＡ発現コンストラクトは、ＤＮＡプラスミド（高次コイル状、ニック入り、または直鎖状化）、小環状ＤＮＡ（直鎖状または高次コイル状）、制限酵素消化および精製によるプラスミド骨格の除去によって目的の領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、使用される最終的なＤＮＡが閉じた連結形態であるかまたはそれが開放切断端を有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）、酵素的ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えば、ドギーボーンＤＮＡ［ｄｂＤＮＡ（商標）］を使用して生成されたＤＮＡであり得る。
「ウイルスベクター産生細胞」、「ベクター産生細胞」、または「産生細胞」は、ウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産生することができる細胞と理解されるべきである。ウイルスベクター産生細胞は、「プロデューサー細胞」または「パッケージング細胞」であり得る。ウイルスベクターシステムの１つまたは複数のＤＮＡコンストラクトは、ウイルスベクター産生細胞に安定に組み込まれている場合もあれば、エピソーム性に維持されている場合もある。代替的に、ウイルスベクターシステムのすべてのＤＮＡ構成要素が、ウイルスベクター産生細胞に一過性にトランスフェクトされる場合もある。さらに代替的には、構成要素のいくつかを安定して発現する産生細胞に、ベクター産生に必要な残りの構成要素を一過性にトランスフェクトすることもできる。
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞」は、ウイルスベクター粒子の産生に必要な要素を含有するが、ベクターゲノムを欠く細胞を指す。そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を発現することができる１つまたは複数の発現カセットを含有してもよい。
プロデューサー細胞／パッケージング細胞は、任意の好適な細胞型であり得る。プロデューサー細胞は一般に哺乳動物細胞であるが、例えば、昆虫細胞であることもできる。
本明細書で使用される場合、「プロデューサー／産生細胞」または「ベクター産生／産生細胞」という用語は、ウイルスベクター粒子の産生に必要なすべてのエレメントを含む細胞を指す。プロデューサー細胞は、安定したプロデューサー細胞株でもあり得、または一過性に導き出されたものでもあり得、またはウイルスゲノムが一過性に発現される安定したパッケージング細胞でもあり得る。
ベクター産生細胞は、インビトロで培養された細胞、例えば、組織培養細胞株であり得る。好適な細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、マウス線維芽細胞由来細胞株またはヒト細胞株が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクター産生細胞は、ヒト細胞株に由来する。
細胞および産生方法
本明細書に記載される方法、ウイルスベクター産生システム、および使用は、目的のウイルスベクターを産生するためのものである。
ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞（プロデューサー／産生細胞）からウイルスベクターを産生するための一般的な方法は当技術分野で周知である。これらの方法は、細胞を、ウイルスベクターの産生に好適な条件下で培養することを含み、産生されたウイルスベクターを単離する段階をさらに含んでもよい。
ウイルスベクターを産生するのに好適な１つまたは複数の細胞は、適切な条件下で培養した場合にウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産生する能力を有する細胞であり得る。したがって、細胞は典型的には、ベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列を含み、これにはｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよびウイルスベクターのゲノムが含まれ得る。好適な細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、マウス線維芽細胞由来細胞株またはヒト細胞株が含まれるが、これらに限定されない。これらは一般にヒト細胞を含む哺乳動物細胞であり、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ－ＴまたはＣＨＯ細胞であるが、例えば、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞であることもあり得る。好ましくは、ベクター産生細胞は、ヒト細胞株に由来する。したがって、そのような好適な産生細胞は、本発明の方法または使用のいかなるものにも使用し得る。
ヌクレオチド配列を細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、以前にも記載されている。したがって、分子生物学および細胞生物学における従来の手法を使用して、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよびウイルスベクターのゲノムを含むベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入することは、当業者の能力の範囲内にある。
安定した産生細胞は、パッケージング細胞またはプロデューサー細胞であり得る。パッケージング細胞からプロデューサー細胞を作製するために、ベクターゲノムＤＮＡコンストラクトを安定または一過性に導入することができる。パッケージング／プロデューサー細胞は、ＷＯ２００４／０２２７６１に記載されているように、ベクターの構成要素の１つ、すなわち、ゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ構成要素およびエンベロープを発現するレトロウイルスベクターにより、好適な細胞株に形質導入することによって作製することができる。代替的に、ヌクレオチド配列を細胞にトランスフェクトし、次いで産生細胞ゲノムへの組込みを稀にランダムに起こすこともできる。トランスフェクション法は、当技術分野で周知の方法を使用して行うことができる。例えば、安定なトランスフェクション過程は、コンカテマー化を助けるために操作されたコンストラクトを使用することができる。別の例では、リン酸カルシウム、または市販の製剤、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、トランスフェクション過程を行うことができる。代替的に、エレクトロポレーションを介して産生細胞にヌクレオチド配列を導入することもできる。当業者は、産生細胞へのヌクレオチド配列の組込みを促進する方法を把握しているであろう。例えば、核酸コンストラクトの線状化は、それが天然に環状であれば有用であり得る。よりランダムでない組込み法は、内因性ゲノム内の選択された部位への組込みを導くために、哺乳動物宿主細胞の内因性染色体との相同性を有する領域を含む核酸コンストラクトを伴い得る。さらに、組換え部位がコンストラクト上に存在する場合、これらを標的化組換えに使用することができる。例えば、核酸コンストラクトは、Ｃｒｅリコンビナーゼと組み合わされた場合に標的化組込みを可能にするｌｏｘＰ部位を含み得る（すなわち、Ｐ１バクテリオファージに由来するＣｒｅ／ｌｏｘシステムを使用する）。代替的または追加的に、組換え部位はａｔｔ部位（例えば、λファージ由来）であり、このａｔｔ部位はラムダインテグラーゼの存在下で部位特異的組込みを可能にする。これにより、ウイルス遺伝子を宿主細胞ゲノム内の遺伝子座に標的化することが可能となり、高発現および／または安定な発現が可能となると考えられる。
標的化組込みの他の方法は、当技術分野で周知である。例えば、選択された染色体遺伝子座での標的化組換えを促進するために、ゲノムＤＮＡの標的化切断を誘導する方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの生理的機構による切断の修復を誘導するための内因性ゲノムにおけるニックのような、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するための方法またはシステムの使用をしばしば伴う。切断は、特異的ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用、特異的切断を導くための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９システムの使用、および／またはＡｒｇｏｎａｕｔｅ系に基づくヌクレアーゼ［例えば、サーマス・サーモフィラス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来］の使用によって生じ得る。
パッケージング／プロデューサー細胞株は、ウイルス形質導入のみ、または核酸トランスフェクションのみ、またはその両方の組み合わせの方法を使用するヌクレオチド配列の組込みによって作製することができる。
産生細胞からレトロウイルスベクターを作製する方法、特にレトロウイルスベクターのプロセシングについては、ＷＯ２００９／１５３５６３に記載されている。
一例では、産生細胞は、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、ＴＲＡＰ）および／またはＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質もしくは代替的な調節タンパク質（例えば、ＣｙｍＲ）を含み得る。
産生細胞からのウイルスベクターの産生は、トランスフェクション法、誘導工程（例えば、ドキシサイクリン誘導）を含み得る安定した細胞株からの産生、または両方の組み合わせによるものであり得る。トランスフェクション法は、当技術分野で周知の方法を使用して行うことができ、その例は以前に記載されている。
パッケージング細胞株もしくはプロデューサー細胞株のいずれかであるか、またはウイルスベクターをコードする構成要素が一過性にトランスフェクトされた細胞である産生細胞を培養して、細胞数およびウイルス数、ならびに／またはウイルスタイターを増加させる。細胞の培養は、細胞が代謝し、および／または増殖し、および／または分裂し、および／または目的のウイルスベクターを産生することを可能にするように行う。これは当業者に周知の方法によって達成することができ、例えば、好適な培養培地中で細胞に栄養分を与えることを含むが、これには限定されない。本方法は、表面に接着しての増殖、浮遊液中での増殖、またはそれらの組み合わせを含み得る。培養は、例えば、組織培養フラスコ、組織培養マルチウェルプレート、皿、ローラーボトル、ウェーブバッグまたはバイオリアクターにおいて、バッチ、流加バッチ、連続システムなどを使用して行うことができる。細胞培養によるウイルスベクターの大規模生産を達成するためには、細胞が浮遊液中で増殖可能であることが当技術分野では好ましい。細胞を培養するための好適な条件が公知である［例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), and R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley- Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9］を参照されたい。
細胞をまず、組織培養フラスコまたはバイオリアクターにおいて「増量」し、その後に多層培養容器または大型バイオリアクター（５０Ｌを上回る）で増殖させて、ベクター産生細胞を生成することができる。
細胞は、ベクター産生細胞を生成するために接着様式で成長させることができる。代替的に、細胞を浮遊モードで増殖させて、ベクター産生細胞を生成することもできる。
目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含むヌクレオチド配列
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」という用語は、「ポリヌクレオチド」および／または「核酸配列」という用語と同義である。本発明に関連する「ヌクレオチド配列」という用語は、二本鎖または一本鎖分子であることが可能であり、これにはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡおよびキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子が含まれる。典型的には、本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ手法（すなわち、組換えＤＮＡ）を使用して調製される。そのような技術は当技術分野で周知である。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。遺伝子暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同一のポリペプチドをコードし得ることは、当業者には理解されるであろう。さらに、当業者には、本発明のポリペプチドを発現させようとするいずれかの特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、慣行的な手法を使用して、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることも理解されるであろう。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変することができる。そのような改変は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドは、組換え、合成により、または当業者が利用可能な任意の手段によって生成することができる。それらを標準的な技術によってクローニングすることもできる。
比較的長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング法を使用して生成される。これは、クローニングしようとする標的配列に隣接する一対のプライマー（例えば、約１５から３０ヌクレオチド）を作成し、動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとプライマーを接触させて、所望の領域の増幅をもたらす条件下でＰＣＲを行い、増幅された断片を単離し（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）、増幅されたＤＮＡを回収することを伴うと考えられる。プライマーは、増幅されたＤＮＡが好適なベクター中にクローニングされ得るように、好適な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
一般的なウイルスベクターエレメント
プロモーターおよびエンハンサー
ＮＯＩおよびポリヌクレオチドの発現は、制御配列、例えば、転写調節エレメントまたは翻訳抑制エレメントを使用して制御することができ、これには、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節シグナル［例えば、ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）システム］、またはベクター産生細胞システムにおける導入遺伝子抑制（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）（ＴＲＩＰ）または本明細書に記載されるＮＯＩの他の調節因子が含まれる。
原核生物プロモーターおよび真核細胞において機能するプロモーターが使用され得る。組織特異的または刺激特異的プロモーターが使用され得る。２つ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターも使用され得る。
好適なプロモーター配列は、強力なプロモーターであり、これにはウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス（ＳＶ４０）のゲノムに由来するもの、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ＥＦ１α、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、ユビキチン、ＰＧＫまたはリボソームタンパク質プロモーターが含まれる。代替的に、組織特異的プロモーター、例えば、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体－桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、Ｇ ＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーターを、転写を駆動するために使用することができる。
ＮＯＩの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより、さらに増加させることができる。エンハンサーは比較的、配向および位置に非依存的である；しかし、真核細胞ウイルス由来のエンハンサー、例えば、ＳＶ４０エンハンサーおよびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーを利用することができる。エンハンサーはプロモーターに対して５’または３’側の位置においてベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に位置する。
プロモーターは、好適な標的細胞における発現を確保または増強するための特徴をさらに含むことができる。例えば、特徴は、保存された領域、例えば、プリブノーボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ Ｂｏｘ）またはＴＡＴＡボックスであり得る。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現レベルに影響を及ぼす（例えば、維持する、増強する、または減少させる）他の配列を含有し得る。好適な他の配列には、Ｓｈ１－イントロンまたはＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列には、誘導性エレメント、例えば、温度、化学物質、光またはストレス誘導性のエレメントが含まれる。また、転写または翻訳を増強するための好適なエレメントも存在し得る。
ＮＯＩの調節因子
レトロウイルスパッケージング／プロデューサー細胞株の作製およびレトロウイルスベクター産生における複雑化要因は、ある特定のレトロウイルスベクター構成要素およびＮＯＩの恒常的発現が細胞毒性であり、これらの構成要素を発現する細胞の死を招き、したがってベクターを産生することができないことである。したがって、これらの構成要素（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質、例えば、ＶＳＶ－Ｇ）の発現を調節することが可能である。他の非細胞毒性ベクター構成要素、例えば、ｒｅｖの発現も、細胞への代謝負荷を最小化するように調節することができる。したがって、本明細書に記載されるベクター構成要素および／または細胞をコードするモジュール式コンストラクトまたはヌクレオチド配列は、少なくとも１つの調節エレメントに関連する細胞毒性および／または非細胞毒性ベクター構成要素を含み得る。本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、関連する遺伝子またはタンパク質の発現に、増加させるかまたは減少させるかのいずれかの影響を及ぼし得る、あらゆるエレメントを指す。調節エレメントには、遺伝子スイッチシステム、転写調節エレメントおよび翻訳抑制エレメントが含まれる。
いくつかの原核生物調節システムが、哺乳動物細胞において遺伝子スイッチを生成するように適合化されている。多くのレトロウイルスパッケージングおよびプロデューサー細胞株は、遺伝子スイッチシステム（例えば、テトラサイクリンおよびクメート誘導スイッチシステム）を使用して制御されているため、ベクター産生時に１つまたは複数のレトロウイルスベクター構成要素の発現をオンにすることができる。遺伝子スイッチシステムには、転写調節因子の（ＴｅｔＲ）タンパク質グループのもの（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ）、転写調節因子のクマート誘導スイッチシステムグループのもの（例えば、ＣｙｍＲタンパク質）、ＲＮＡ結合タンパク質を含むもの（例えば、ＴＲＡＰ）がある。
そのようなテトラサイクリン誘導システムの１つは、Ｔ－ＲＥｘ（商標）システムに基づくテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）システムである。一例として、そのようなシステムでは、最初のヌクレオチドがヒトサイトメガロウイルスの主要前初期プロモーター（ｈＣＭＶｐ）のＴＡＴＡＴＡＡエレメントの最後のヌクレオチドの３’末端から１０ｂｐの位置となるように、テトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）が配置され、ＴｅｔＲのみがリプレッサーとして作用することができる（Yao F, Svensjo T, Winkler T, Lu M, Eriksson C, Eriksson E., 1998, Hum Gene Ther; 9: 1939-1950）。そのようなシステムでは、ＴｅｔＯ２配列の２つのコピーがタンデムに挿入されたＣＭＶプロモーターによってＮＯＩの発現を制御することができる。ＴｅｔＲホモ二量体は、誘導剤（テトラサイクリンまたはその類似体であるドキシサイクリン［ｄｏｘ］）が存在しない場合、ＴｅｔＯ２配列に結合し、上流のＣＭＶプロモーターからの転写を物理的に遮断する。誘導剤は存在すると、ＴｅｔＲホモ二量体に結合してアロステリックな変化を引き起こし、それがＴｅｔＯ２配列に結合できないようにして、遺伝子発現が生じる。ＴｅｔＲ遺伝子はコドンが最適化されている可能性があるが、これはそれが翻訳効率を改善し、ＴｅｔＯ２で制御される遺伝子発現をより厳密に制御することが見出されたためである。
ＴＲＩＰシステムはＷＯ２０１５／０９２４４０に記載されており、ベクター産生中の産生細胞におけるＮＯＩの発現を抑制する別の方法を提供する。組織特異的プロモーターを含む恒常的および／または強力なプロモーターが導入遺伝子を駆動することが望ましい場合、特に産生細胞における導入遺伝子タンパク質の発現がベクタータイターの減少を招き、および／または導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクターデリバリーによってインビボで免疫応答を誘発する場合に、ＴＲＡＰ結合配列（例えば、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ）相互作用は、レトロウイルスベクターの産生のための導入遺伝子タンパク質抑制システムの基礎を形成する［Maunder et al, Nat Commun. (2017) Mar 27; 8］。
手短に記載すると、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用は翻訳遮断をもたらして、導入遺伝子タンパク質の翻訳を抑制する［Maunder et al, Nat Commun. (2017) Mar 27; 8］。翻訳遮断は産生細胞でのみ有効であり、そのため、ＤＮＡまたはＲＮＡに基づくベクターシステムを妨げない。ＴＲｉＰシステムは、導入遺伝子タンパク質が、単一または複数のシストロン性ｍＲＮＡからの組織特異的プロモーターを含む、恒常的および／または強力なプロモーターから発現される場合に、翻訳を抑制することができる。導入遺伝子タンパク質の無秩序な発現はベクタータイターを減少させ、ベクター産物の品質に影響を及ぼし得ることが実証されている。毒性または分子負荷の問題が細胞ストレスにつながり得る場合；導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクターデリバリーによって導入遺伝子タンパク質がインビボで免疫反応を誘発する場合；遺伝子編集導入遺伝子の使用が、オン／オフ・ターゲットの影響をもたらし得る場合；導入遺伝子タンパク質がベクターおよび／またはエンベロープ糖タンパク質の排除に影響を及ぼし得る場合に、一過性および安定なＰａＣＬ／ＰＣＬベクター産生システムの両方に対する導入遺伝子タンパク質の抑制は、ベクタータイターの減少を防ぐために産生細胞にとって有益である。
エンベロープおよびシュードタイプ化
好ましい一態様では、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターはシュードタイプ化されている。これに関して、シュードタイプ化には１つまたは複数の利点がある。例えば、ＨＩＶに基づくベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、これらのベクターを、ＣＤ４と称されるタンパク質を発現する細胞のみに感染するように制限する。しかし、これらのベクター内のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープウイルス由来のｅｎｖ配列で置換されている場合、それらはより広い感染スペクトルを有する可能性がある［Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242］。一例として、ＶＳＶ由来の糖タンパク質による、ＨＩＶに基づくベクターのシュードタイプ化を、研究者らが行っている［Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242］。
さらに代替的に、Ｅｎｖタンパク質は、改変Ｅｎｖタンパク質、例えば、突然変異体または操作されたＥｎｖタンパク質であり得る。改変は、標的化能力を導入するために、または毒性を軽減するために、または別の目的のために行われ、または選択され得る［Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70: 2056-64; Nilson et al (1996) Gene Ther 3(4):280-286;およびFielding et al (1998) Blood 91(5):1802-1809、ならびにそれらに引用されている参考文献］。
ベクターは、選択された任意の分子によってシュードタイプ化され得る。
本明細書で使用される場合、「ｅｎｖ」は、本明細書に記載されるように、内因性レンチウイルスエンベロープまたは異種エンベロープを意味するものとする。
ＶＳＶ－Ｇ
ラブドウイルスの一種である水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、ある特定のエンベロープウイルスおよびウイルスベクタービリオンをシュードタイプ化し得ることが示されているエンベロープタンパク質である。
それが、レトロウイルスのエンベロープタンパク質の非存在下でＭｏＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターをシュードタイプ化する能力は、Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207によって初めて示された。ＷＯ１９９４／２９４４４０は、レトロウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇによって首尾良くシュードタイプ化され得ることを教示している。これらのシュードタイプ化ＶＳＶ－Ｇベクターは、広範囲の哺乳動物細胞に形質導入するために使用され得る。最近では、Abe et al. (1998) J Virol 72(8) 6356-6361が、ＶＳＶ－Ｇの付加によって非感染性レトロウイルス粒子を感染性にし得ることを教示している。
Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-7は、レトロウイルスＭＬＶをＶＳＶ－Ｇによってシュードタイプ化することに成功し、これにより、ネイティブ形態のＭＬＶと比較して宿主範囲が変化したベクターが得られた。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターは、哺乳動物細胞だけでなく、魚類、爬虫類および昆虫にに由来する細胞株にも感染することが示されている［Burns et al. (1993)、前掲］。それらはまた、様々な細胞株に対して従来の広宿主性エンベロープよりも効率的であることが示されている［Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9564-9568, Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207］。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、その細胞質尾部がレトロウイルスのコアと相互作用することができるため、ある特定のレトロウイルスのシュードタイプ化に使用することができる。
ＶＳＶ－Ｇタンパク質などの非レトロウイルス性シュードタイプ化エンベロープを提供することには、ベクター粒子を感染性を失うことなく高度のタイターに濃縮し得るという利点がある［Akkina et al. (1996) J. Virol. 70:2581-5］。レトロウイルスエンベロープタンパク質は、超遠心分離中の剪断力に耐えられないようであるが、これはおそらく、それが非共有結合性に連結された２つのサブユニットからなるためである。サブユニット間の相互作用は遠心分離によって破壊され得る。これに比して、ＶＳＶ糖タンパク質は単一の単位で構成されている。このため、ＶＳＶ－Ｇタンパク質のシュードタイプ化は、効率的な標的細胞の感染／形質導入および製造過程の両方に潜在的な利点をもたらし得る。
ＷＯ２０００／５２１８８は、膜関連ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）を有する、安定したプロデューサー細胞株からのシュードタイプ化レトロウイルスベクターの作製を記載し、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の遺伝子配列を提供している。
ロスリバーウイルス
ロスリバーウイルスエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）のシュードタイプ化のために使用されており、全身投与後に主に肝臓に形質導入を行った（Kang et al., 2002, J. Virol., 76:9378-9388）。効率はＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターにより得られるもの２０倍の高さであると報告されており、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによる測定では、それほど大きな細胞毒性は引き起こさなかった。
バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床および商業的用途に必要な高タイターウイルスの大規模生産に使用されるウイルスベクターとしてＶＳＶ－Ｇの代替物となることが示されている［Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J (2003) Hum Gene Ther. 14(1):67-77］。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプ化ベクターは、類似した広い指向性および類似した天然のタイターを有する。ＧＰ６４の発現は細胞を死滅させないため、ＧＰ６４を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ｔベースの細胞株を作製することができる。
代替的なエンベロープ
ＥＩＡＶをシュードタイプ化するために使用された場合に妥当なタイターが得られる他のエンベロープには、モコラ、狂犬病、エボラおよびＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）がある。４０７０Ａによりシュードタイプ化されたレンチウイルスのマウスへの静脈内投与により、肝臓において最大の遺伝子発現がもたらされた。
パッケージング配列
本発明の文脈で使用される場合、「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」と互換的に称される「パッケージングシグナル」という用語は、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成のために必要とされる非コード性シス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ－１では、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまでに及ぶ遺伝子座にマッピングされている（ヌクレオチド６８８までのｇａｇの５’配列の一部または全体が含まれ得る）。ＥＩＡＶでは、パッケージングシグナルは、Ｇａｇの５’コーディング領域内へのＲ領域を含む。
本明細書で使用される場合、「拡張されたパッケージングシグナル」または「拡張されたパッケージング配列」という用語は、ｇａｇ遺伝子内へとさらに拡張された、ｐｓｉ配列周囲の配列の使用を指す。これらの追加的なパッケージング配列を含めることにより、ベクターＲＮＡのウイルス粒子への挿入効率が増加する可能性がある。
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＲＮＡカプシド形成決定因子は離散的で不連続的であることが示されており、ゲノムｍＲＮＡの５’末端の１つの領域（Ｒ－Ｕ５）およびｇａｇの近位３１１ｎｔ内にマッピングされるもう１つの領域を含むことが示されている［Kaye et al., J Virol. Oct;69(10):6588-92 (1995)］。
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳエレメントの挿入により、単一のプロモーターからの複数のコード領域の発現が可能になる［Adam et al (前記); Koo et al (1992) Virology 186:669-675; Chen et al 1993 J. Virol 67:2142-2148］。ＩＲＥＳエレメントは、ピコルナウイルスの非翻訳５’末端で最初に見出され、これはそこでウイルスタンパク質のキャップ非依存的な翻訳を促進する［Jang et al (1990) Enzyme 44: 292-309］。ＩＲＥＳエレメントは、ＲＮＡ内のオープンリーディングフレーム間に位置する場合、ＩＲＥＳエレメントでのリボソームの進入およびそれに続いて下流の翻訳開始を促進することにより、下流オープンリーディングフレームの効率的翻訳を可能にする。ＩＲＥＳの概説は、Mountford and Smith (TIG May 1995 vol 11, No 5:179-184）によって提示されている。いくつかの異なるＩＲＥＳ配列が公知であり、これには、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991)；ＢｉＰタンパク質［Macejak and Sarnow, Nature 353:91 (1991)］；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディア遺伝子（エキソンｄおよびｅ）［Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)］由来のもののほか、ポリオウイルス（ＰＶ）におけるもの［Pelletier and Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988);また、Mountford and Smith, TIG 11, 179-184 (1985)も参照のこと］が含まれる。
ＰＶ、ＥＭＣＶおよびブタ水疱病ウイルス由来のＩＲＥＳエレメントは、レトロウイルスベクターに既に使用されている（Coffin et al, 前記）。
「ＩＲＥＳ」という用語は、ＩＲＥＳとして動作するかまたはＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列または配列の組み合わせを含む。ＩＲＥＳは、ウイルス由来（例えば、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＰＶ ＩＲＥＳまたはＦＭＤＶ ２Ａ様配列）または細胞由来（例えば、ＦＧＦ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、Ｎｏｔｃｈ ２ ＩＲＥＳまたはＥＩＦ４ ＩＲＥＳ）であり得る。
ＩＲＥＳが各ポリヌクレオチドの翻訳を開始し得るためには、それがモジュール式コンストラクト中でポリヌクレオチドの間または前に位置するべきである。
安定した細胞株の開発のために利用されるヌクレオチド配列は、安定した組込みが生じた細胞の選択のための選択マーカーの付加を必要とする。これらの選択マーカーは、ヌクレオチド配列内の単一の転写単位として発現させることもでき、またはポリシストロン性メッセージにおける選択マーカーの翻訳を開始させるためにＩＲＥＳエレメントを使用することが好ましいこともあり得る（Adam et al 1991 J.Virol. 65, 4985）。
遺伝子の向きおよびインスレーター
核酸には方向性があり、これは細胞における転写および複製などの機構に最終的に影響を及ぼすことが周知である。したがって、遺伝子は、同一の核酸コンストラクトの一部である場合、互いに対して相対的な向きを有し得る。
ある特定の例では、細胞またはコンストラクト内の同じ遺伝子座に存在する少なくとも２つの核酸配列は、逆向きおよび／または交互の向きで存在し得る。換言すれば、この特定の遺伝子座において、連続する遺伝子の対は同じ向きを有しない。これは、その領域が宿主細胞の同じ物理的位置において発現される場合、転写および翻訳の両方のリードスルーを防ぐのに役立ち得る。
ベクター産生のために必要な核酸が細胞内の同じ遺伝子座を拠点とする場合、交互の向きを有することはウイルスベクター産生に利益をもたらす。また、これはひいては、複製可能ウイルスベクターの生成を防ぎ、得られるコンストラクトの安全性をも改善し得る。
核酸配列が逆向きおよび／または交互の向きで存在する場合、インスレーターの使用により、ＮＯＩが周囲の遺伝子環境から不適切な発現またはサイレンシングを起こすのを防ぐことができる。
「インスレーター」という用語は、インスレーター結合タンパク質に結合した場合に周囲の調節因子シグナルから遺伝子を保護する能力を有するＤＮＡ配列エレメントのクラスを指す。インスレーターには、エンハンサー遮断機能およびクロマチン障壁機能という２つの種類が存在する。インスレーターがプロモーターとエンハンサーとの間に位置している場合、インスレーターのエンハンサー遮断機能は、エンハンサーの転写増強効果からプロモーターを保護する（Geyer and Corces 1992; Kellum and Schedl 1992）。クロマチン障壁インスレーターは、付近の凝縮クロマチンの前進を防止することによって機能し、それは転写的に活性なクロマチン領域の転写的に不活性なクロマチン領域への変換を招き、遺伝子発現のサイレンシングをもたらすと考えられる。ヘテロクロマチンの広がりを阻害し、それ故に遺伝子サイレンシングを阻害するインスレーターは、ヒストン修飾に関与する酵素を動員して、この過程を妨げる（Yang J, Corces VG. 2011;110:43-76; Huang, Li et al. 2007; Dhillon, Raab et al. 2009）。インスレーターはこれらの機能のうちの一方または両方を有することができ、ニワトリβ－グロビンインスレーター（ｃＨＳ４）はそのような一例である。このインスレーターは、最も広範に研究されている脊椎動物インスレーターであり、高度にＧ＋Ｃリッチであり、エンハンサー遮断機能およびヘテロクロマチン障壁機能の両方を有する（Chung J H, Whitely M, Felsenfeld G. Cell. 1993;74:505-514）。エンハンサー遮断機能を有する他のそのようなインスレーターには、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ヒトβ－グロビンインスレーター５（ＨＳ５）、ヒトβ－グロビンインスレーター１（ＨＳ１）およびニワトリβ－グロビンインスレーター（ｃＨＳ３）［Farrell CM1, West AG, Felsenfeld G., Mol Cell Biol. 2002 Jun;22(11):3820-31; J Ellis et al. EMBO J. 1996 Feb 1; 15(3): 562-568］。望ましくない遠位の相互作用を減少させることに加えて、インスレーターは、隣接するウイルス核酸配列間のプロモーター干渉（すなわち、１つの転写単位のプロモーターが、隣接する転写単位の発現を妨害する）を防ぐのにも役立つ。ウイルスベクター核酸配列のそれぞれの間にインスレーターが使用される場合、直接リードスルーの減少は、複製可能ウイルスベクター粒子の形成を防ぐのに役立つと考えられる。
インスレーターは、ウイルス核酸配列のそれぞれの間に存在し得る。一実施形態では、インスレーターの使用は、プロモーター－エンハンサー相互作用を妨げ、ベクター構成要素をコードするヌクレオチド配列において１つのＮＯＩ発現カセットが別のＮＯＩ発現カセットと相互作用することを妨げる。
ベクターゲノム配列とｇａｇ－ｐｏｌ配列との間にインスレーターが存在することが可能である。したがって、これにより、複製可能ウイルスベクターおよび「野生型」様のＲＮＡ転写産物の産生の可能性が制限され、コンストラクトの安全性プロファイルが改善する。安定に組み込まれた多重遺伝子ベクターの発現を改善するためのインスレーターエレメントの使用は、Moriarity et al, Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(8):e92に引用されている。
ベクタータイター
ウイルスベクターのタイター（例えば、レンチウイルスベクター、ＳＩＮベクターのウイルスタイター）を決定する多数の異なる方法が存在することを、当業者は理解するであろう。タイターはしばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。タイターは、ベクター粒子の数を増やすことによって、およびベクター調製物の比活性を増加させることによって増加させることができる。
治療的使用
本明細書に記載されるウイルスベクター、または本明細書に記載されるウイルスベクターによって形質導入された細胞もしくは組織は、医療に使用することができる。
さらに、本明細書に記載されるウイルスベクター、本発明の産生細胞、または本明細書に記載されるレンチウイルスベクターによって形質導入された細胞もしくは組織は、目的のヌクレオチドを、それを必要とする標的部位にデリバリーするための医薬の調製に使用することもできる。ウイルスベクターまたは形質導入細胞のそのような使用は、以前に記載されている通り、治療または診断の目的のためのものであり得る。
したがって、本明細書に記載されるウイルスベクターによって形質導入された細胞が提供される。
「ウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞」は、ウイルスベクター粒子によって運搬される核酸が移入された細胞、特に標的細胞として理解されるべきである。
目的のヌクレオチド
本発明の一実施形態では、ＴＲＡＰを欠く標的細胞において目的のヌクレオチドが翻訳される。
「標的細胞」は、ＮＯＩを発現させることが望ましい細胞として理解されるべきである。ＮＯＩは、本発明のウイルスベクターを使用して標的細胞に導入され得る。標的細胞へのデリバリーは、インビボ、エクスビボまたはインビトロで行われ得る。
好ましい一実施形態では、目的のヌクレオチドは治療効果を生じさせる。
ＮＯＩは、治療用途または診断用途を有し得る。好適なＮＯＩとしては、酵素、補因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、単鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、キメラ抗原受容体、標的タンパク質のトランスドメイン陰性突然変異体、毒素、条件付き毒素（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｔｏｘｉｎ）、抗原、転写因子、構造タンパク質、レポータータンパク質、細胞内局在化シグナル、腫瘍抑制タンパク質、増殖因子、膜タンパク質、受容体、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（例えば、関連レポーター基を有する誘導体）をコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＯＩはマイクロＲＮＡもコードし得る。理論に拘束されることは望まないが、マイクロＲＮＡのプロセシングはＴＲＡＰによって阻害されると考えられている。
一実施形態では、ＮＯＩは、神経変性障害の治療において有用であり得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、パーキンソン病および多系統萎縮症の治療において有用であり得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する１つまたは複数の酵素をコードし得る。例えば、酵素は以下のうちの１つまたは複数であり得る：チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩおよび／または芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ。この３つすべての遺伝子の配列が入手可能である［それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３およびＭ７６１８０］。
別の実施形態では、ＮＯＩは、小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）をコードし得る。代替的な一実施形態では、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩ、およびＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含み得る。そのようなゲノムは、パーキンソン病の治療において、特にＬ－ＤＯＰＡの末梢投与と共に使用され得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、１つの治療用タンパク質または治療用タンパク質の組み合わせをコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インスリン増殖因子－２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＦＧ－ＡとＰＤＦＧ－Ｂとのヘテロ二量体およびホモ二量体からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、胎盤増殖因子、レスチン（ｒｅｓｔｉｎ）、インターフェロン－α、インターフェロン誘導性タンパク質、ｇｒｏ－βおよびチューブダウン（ｔｕｂｅｄｏｗｎ）－１、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－１２、レチノイン酸、抗ＶＥＧＦ抗体またはそれらの断片／変異体、例えば、アフリベルセプト、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦ受容体タンパク質、例えば、米国特許第５，９５２，１９９号および同第６，１００，０７１号に記載されているもの、ならびに抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群から選択される１つまたは複数の抗血管新生タンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、ＮＦ－κＢ阻害剤、ＩＬ１β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－２３阻害剤、ＩＬ－１８阻害剤、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β、リンホトキシンαおよびリンホトキシンβ、ＬＩＧＨＴ阻害剤、αシヌクレイン阻害剤、タウ阻害剤、βアミロイド阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤、ＩＬ－３３阻害剤、ＩＬ－３３受容体阻害剤、ＴＳＬＰ阻害剤からなる群から選択される抗炎症タンパク質、抗体、またはタンパク質もしくは抗体の断片／変異体をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、通常は眼細胞において発現されるタンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、通常は光受容細胞および／または網膜色素上皮細胞において発現されるタンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、ＲＰＥ６５、アリール炭化水素相互作用性受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチンレチナールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、光受容体特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、レチナールグアニル酸シクラーゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチンレチナールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、光受容体特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、レチナールグアニル酸シクラーゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ５、ジストロフィン、ＰＲＰＨ２、ＣＮＴＦ、ＡＢＣＲ／ＡＢＣＡ４、ＥＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＯＶＬ４、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＤ２、ＲＬＢＰ１、ＣＯＸ－２、ＦＰＲ、ハルモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１、ＣＮＧＢ２、ＣＮＧＡ３、ＣＥＰ ２９０、ＲＰＧＲ、ＲＳ１、ＲＰ１、ＰＲＥＬＰ、グルタチオン経路酵素およびオプチシン（ｏｐｔｉｃｉｎ）を含む群から選択されるタンパク質をコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、ヒト凝固因子ＶＩＩＩまたはＩＸをコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、３メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、カルバモイル－リン酸シンターゼアンモニア、オルニチントランスカルバミラーゼ、αガラクトシダーゼＡ、グルコシルセラミダーゼβ、シスチノシン、グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－グルコサミニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、シトクロムＢ－２４５β、ＡＢＣＤ１、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｌｙｓａｓｅ）、アルギナーゼ１、アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ ｇｌｙｃｏｘｈｙｌａｔｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢメンバーを含む群から選択される、代謝に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし得る。一実施形態では、ＣＡＲは抗５Ｔ４ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＮＯＩは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ４７、ＣＤ１３８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原（ＬｅＹ）、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、膜結合型ムチン１（Ｍｕｃ１）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、内皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン、非受容体２２型チロシンホスファターゼ、インターロイキン２受容体α、ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、メシオテリン、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、スミス抗原、二本鎖ＤＮＡ、リン脂質、プロインスリン、インスリノーマ抗原２（ＩＡ－２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５ｋＤａアイソフォーム（ＧＡＤ６５）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、膵島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛輸送体８（ＺｎＴ８）をコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、ＵＬＢＰ１、２および３、Ｈ６０、Ｒａｅ－１、ｂ、ｇ、ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢを含む群から選択されるＮＫＧ２Ｄリガンドに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。
さらなる実施形態では、ＮＯＩは、ＳＧＳＨ、ＳＵＭＦ１、ＧＡＡ、共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）、アデノシンデアミナーゼ、ＷＡＳタンパク質、グロビン、αガラクトシダーゼＡ、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、δ－アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＯＰＲＯ）オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＲＯＴＯ）オキシダーゼ、フェロケラターゼ、α－Ｌ－イデュロニダーゼ、イデュロン酸スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン－α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、３Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼおよびヒアルロニダーゼをコードし得る。
ＮＯＩに加えて、ベクターは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または調節されたｓｈＲＮＡを含むか、またはコードすることもできる［Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295, Silva et al. (2005) Nature Genetics 37:1281-1288］。
適応症
本発明によるレトロウイルスベクターおよびＡＡＶベクターを含むベクターは、ＷＯ１９９８／０５６３５、ＷＯ１９９８／０７８５９、ＷＯ１９９８／０９９８５に列挙されている障害の治療において有用な１つまたは複数のＮＯＩのデリバリーのために使用することができる。目的のヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。そのような疾患の例を以下に記載する。
以下のものに応答する障害：サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制物質または免疫刺激物質の活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルスの感染を含む免疫不全の治療、リンパ球増殖の調節、がんおよび多くの自己免疫疾患の治療、ならびに移植片拒絶の予防または腫瘍免疫の誘導のため）；造血の調節（例えば、骨髄またはリンパ系疾患の治療）；骨、軟骨、腱、靭帯および神経組織の成長の促進（例えば、創傷治癒、火傷、潰瘍および歯周病および神経変性の治療のため）；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（妊孕性の調節）；走化性／ケモキネシス活性（例えば、損傷または感染部位に特定の細胞型を動員するため）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および脳卒中の治療のため）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショックまたはクローン病の治療のため）；マクロファージ阻害および／またはＴ細胞阻害活性、それ故に抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、炎症に関連しない応答を含む、細胞性および／または体液性免疫応答に対する阻害効果）；マクロファージおよびＴ細胞が細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着する能力の阻害、ならびにＴ細胞におけるアップレギュレートされたｆａｓ受容体発現。
がん、白血病、良性および悪性の腫瘍の増殖、浸潤および拡大、血管新生、転移、腹水および悪性胸水貯留を含む、悪性障害。
関節リウマチを含む自己免疫疾患、過敏症、乾癬、シェーグレン症候群、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、膠原病および他の疾患を含む、自己免疫疾患。
動脈硬化、動脈硬化性心疾患、再灌流障害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群、心血管系作用、末梢血管疾患、片頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症、脳卒中、脳虚血、虚血性心疾患または他の疾患を含む、血管疾患。
消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病および他の疾患を含む、消化管の疾患。
肝線維症、肝硬変、アミロイドーシスを含む、肝疾患。
フェニルケトン尿症ＰＫＵ、ウィルソン病、有機酸血症、糖原病、尿素サイクル異常症、胆汁うっ滞および他の疾患、または他の疾患を含む、遺伝性代謝障害。
甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎、ループス腎炎または他の疾患を含む、腎臓および泌尿器の疾患。
耳炎または他の耳鼻咽喉科疾患を含む耳鼻咽喉科障害、皮膚炎または他の皮膚疾患。
歯周病、歯周炎、歯肉炎または他の歯／口腔疾患を含む、歯科疾患および口腔疾患。
精巣炎または精巣上体－精巣炎、不妊症、精巣外傷または他の精巣疾患を含む、精巣疾患。
胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症、子宮内膜症または他の婦人科疾患を含む、婦人科疾患。
眼科障害、例えば、ＬＣＡ１０を含むレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、後部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、前部ぶどう膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ぶどう膜網膜炎、視神経炎、開放隅角緑内障および若年性先天緑内障を含む緑内障、網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫などの眼内炎症、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、ベスト病、若年性黄斑変性症、ベスト卵黄様黄斑変性症、シュタルガルト病を含む黄斑変性症、アッシャー症候群、ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー、ソースビー黄斑変性症（Ｓｏｒｂｙ’ｓ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、若年性網膜分離症、錐体桿体ジストロフィー、角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アディー症候群、小口病、変性性眼底疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｆｏｎｄｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、眼外傷、感染による眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、過度の瘢痕、例えば、緑内障濾過手術後、眼インプラントに対する反応、角膜移植片拒絶反応、ならびに他の眼疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィー、全脈絡膜萎縮および色覚異常。
パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連認知症症候群、ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性疾患、ＣＮＳの病態または障害、脳卒中、ポリオ後症候群、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ファブリー病、ゴーシェ病、シスチン症、ポンペ病、異染性白質ジストロフィー、ウィスコット・アルドリッチ症候群、副腎白質ジストロフィー、βサラセミア、鎌状赤血球症、ギラン・バレー症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽性脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳ感染症、筋萎縮および筋ジストロフィー、中枢神経系および末梢神経系の疾患、病態または障害、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄および剥脱損傷を含む運動ニューロン疾患を含む、神経障害および神経変性障害。
他の疾患および病態、例えば、嚢胞性線維症、サンフィリポ症候群Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ、ハンター症候群、ハーラー・シャイエ症候群、モルキオ症候群を含むムコ多糖症、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患、ポルフィリン症、血友病Ａ、血友病Ｂ、外傷後炎症、出血、凝固および急性期反応、悪液質、食欲不振、急性感染症、敗血症性ショック、感染症、糖尿病、手術の合併症または副作用、骨髄移植または他の移植の合併症および／または副作用、遺伝子治療の合併症および副作用、例えば、ウイルスキャリアの感染またはＡＩＤＳによるもの、天然または人工の細胞、組織および臓器、例えば、角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工の皮膚組織を移植する場合の移植片拒絶反応の予防および／または治療のための体液性および／または細胞性免疫反応の抑制または阻害のためのもの。
ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある特定の他の実施形態では、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生される低分子ＲＮＡの非常に大きな一群であり、それらの少なくとも一部は標的遺伝子の発現を調節している。マイクロＲＮＡファミリーの最初のメンバーはｌｅｔ－７およびｌｉｎ－４である。ｌｅｔ－７遺伝子は、線虫の発生過程で内因性タンパク質コード遺伝子の発現を調節する、高度に保存された小型のＲＮＡ種をコードする。活性ＲＮＡ種は最初に約７０ｎｔの前駆体として転写され、転写後プロセシングによって成熟した約２１ｎｔの形態となる。ｌｅｔ－７およびｌｉｎ－４は両方ともヘアピンＲＮＡ前駆体として転写され、ダイサー酵素によってプロセシングされて成熟形態となる。
ベクターは、ＮＯＩに加えて、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節されたｓｈＲＮＡを含むか、またはコードすることができる［Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295, Silva et al. (2005) Nature Genetics 37:1281-1288］。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾンやウイルスなどのエレメントのランダムな組込みは、相同な一本鎖ｍＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的な分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられている。このサイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉として知られる［Ralph et al. (2005) Nature Medicine 11:429-433］。ＲＮＡｉの機構は、長いｄｓＲＮＡの約２１～２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡの二本鎖へのプロセシングを伴う。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターである低分子干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される。分化した哺乳動物細胞では、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡはインターフェロン応答を活性化し、タンパク質合成の阻止および非特異的ｍＲＮＡ分解を招くことがわかっている［Stark et al., Annu Rev Biochem 67:227-64 (1998)］。しかし、この応答は、２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用することによって回避することができ［Elbashir et al., EMBO J. Dec 3;20(23):6877-88 (2001), Hutvagner et al., Science.Aug 3, 293(5531):834-8. Eupub Jul 12 (2001)］、培養哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することが可能になる。
医薬組成物
本明細書に記載されるウイルスベクター、または本明細書に記載されるウイルスベクターにより形質導入された細胞もしくは組織を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
遺伝子治療によって個体を治療するための医薬組成物であって、治療有効量のウイルスベクターを含む組成物が提供される。医薬組成物は、ヒト用または動物用であり得る。
組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含み得る。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬行為に基づいて行うことができる。医薬組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤を、またはこれらに加えて、任意の好適な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、および標的部位へのベクター進入を補助または増加させ得る他の担体物質（例えば、脂質デリバリーシステム）を含み得る。
適切な場合には、組成物を、以下のうちのいずれか１つまたは複数によって投与することができる：吸入；坐剤もしくはペッサリーの形態で；ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏もしくは散布粉剤の形態で局所的に；皮膚パッチの使用により；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトースを含有する錠剤の形態で、または単独でもしくは賦形剤と混合されたカプセル剤またはオビュール剤（ｏｖｕｌｅ）において、または香味剤もしくは着色剤を含有するエリキシル剤、液剤もしくは懸濁剤の形態で経口的に；またはそれらを、非経口的に、例えば、海綿体内、静脈内、筋肉内、頭蓋内、眼内、腹腔内もしくは皮下に注射することもできる。非経口投与の場合、組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖類を含有し得る無菌水溶液の形態で最良に使用され得る。口腔内または舌下投与の場合には、組成物は、従来の様式で製剤化され得る錠剤またはロゼンジ剤の形態で投与され得る。
また、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、エクスビボで標的細胞または標的組織に形質導入した後に、前記標的細胞または組織を、それを必要とする患者に移入するために使用することもできる。そのような細胞の一例は自己Ｔ細胞であり得、そのような組織の一例はドナー角膜であり得る。
変異体、誘導体、類似体、相同体および断片
本明細書において言及される特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明は、それらの変異体、誘導体、薬学的に許容される塩、類似体、相同体および断片の使用も範囲に含む。
任意の所与の配列の変異体は、問題のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持するような様式で、残基（アミノ酸残基または核酸残基のいずれであれ）の特定の配列が改変されている配列のことである。変異体配列は、天然に存在するタンパク質に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、改変、置換および／または変化によって得ることができる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して本明細書で使用される「誘導体」という用語は、生じるタンパク質またはポリペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持するという条件の下で、配列からのまたは配列に対する、１つ（または複数）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、改変、置き換え、欠失および／または付加を含む。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書に記載される「類似体」という用語は、任意の模倣体、すなわち、それが模倣しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを保有する化合物を含む。
典型的には、アミノ酸置換は、改変された配列が、要求される活性または能力を保持するという条件の下で、例えば、１、２または３個から１０個または２０個までの置換として行われ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含み得る。
本発明に使用されるタンパク質は、サイレントな変化を起こし、機能的に同等なタンパク質をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換も有し得る。内因性機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換が行われ得る。例えば、負荷電アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正荷電アミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ；類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンが含まれる。
保存的置換は、例えば以下の表に従って行うことができる。第２列で同じブロックにあるアミノ酸、および好ましくは、第３列で同じ行にあるアミノ酸が、互いに置換され得る。
Figure 2023525161000002

「相同体」という用語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と、ある特定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は「同一性」と等しいことがあり得る。
この文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一であり得、好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むとみなされる。典型的には、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含むと考えられる。相同性を類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点で考慮することもできるが、本発明の文脈においては、配列同一性の点で相同性を表すことが好ましい。
この文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一であり得、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むとみなされる。相同性を類似性の点で考慮することもできる、本発明の文脈においては、配列同一性の点で相同性を表すことが好ましい。
相同性比較は、目視により、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの支援により、より容易に実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の間の相同性または同一性のパーセンテージを計算することができる。
相同性パーセンテージは、連続的アミノ酸にわたって計算することができ、すなわち、一方の配列を他方の配列と整列化して、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列における対応アミノ酸と１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと称される。典型的には、そのようなギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数にわたってのみ行われる。
これは非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば、ヌクレオチド配列に１つの挿入または欠失が存在し、そうでなければ同一である配列の対において、後続のコドンがアラインメントからの逸脱を引き起こし、それ故にグローバルアラインメントが行われた場合に相同性パーセントの大きな減少がもたらされ得ることを考慮に入れていない。その結果として、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを課さずに、考え得る挿入および欠失を考慮に入れる最適なアラインメントが生じるように設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して、局所的相同性の最大化を試みることによって達成される。
しかし、より複雑なこれらの方法は、アラインメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てており、その結果、同一アミノ酸の数が同じである場合は、可能な限り少数のギャップを有する配列アラインメントが行われ、比較される２つの配列間のより高度な関連性を反映して、多数のギャップを有するものよりも高いスコアが得られる。典型的には、「アファインギャップコスト」が使用され、これはギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基にはより小さなペナルティを課す。これは、最も一般的に使用されているギャップスコア化法である。高いギャップペナルティでは、当然ながら、より少数のギャップを有する最適化アラインメントが生成されるであろう。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合には、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティはギャップ毎に－１２であり、各伸長毎に－４である。
したがって、最大相同性パーセンテージの計算は、まずギャップペナルティを考慮に入れて、最適なアラインメントを生成することが必要である。そのようなアラインメントを実施するのに好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387］である。配列比較を実施することができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ［Ausubel et al. (1999)、前掲-Ch.18を参照］、ＦＡＳＴＡ［Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410］、およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは両方とも、オフラインおよびオンライン検索のために利用可能である［Ausubel et al. (1999)、前掲、pages 7-58 to 7-60を参照］。しかし、一部のアプリケーションについては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる別のツールも、タンパク質およびヌクレオチド配列の比較のために利用可能である［FEMS Microbiol Lett (1999) 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett (1999) 177(1):187-8を参照］。
最終的な相同性パーセンテージを同一性に関して測定することができるが、アラインメント過程自体は、典型的には、全か無かのペア比較には基づいていない。実際には、化学的類似性または進化距離に基づく各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化された類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの一例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは一般に、公開デフォルト値、またはカスタム記号比較表が提供されている場合はそれを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。一部のアプリケーションについては、ＧＣＧパッケージには公開デフォルト値を、または他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。
ソフトウェアが最適なアラインメントをひとたび生成したならば、相同性パーセンテージ、好ましくは配列同一性パーセンテージを算出することが可能である。ソフトウェアは通常、これを配列比較の一部として行い、数値の結果を生成する。
「断片」も変異体であり、この用語は典型的には、機能的に、または例えばアッセイにおいて関心が持たれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列または核酸配列を指す。
そのような変異体は、標準的な組換えＤＮＡ手法、例えば、部位特異的変異誘発を使用して調製することができる。挿入を作成しようとする場合には、挿入部を、挿入部位の両側に天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域と共にコードする合成ＤＮＡを作成することができる。隣接領域は、天然に存在する配列内の部位に対応する便利な制限部位を含有しており、その結果、配列を適切な酵素で切断して、合成ＤＮＡを切断部にライゲートすることができる。次いで、ＤＮＡを本発明に従って発現させて、コードされたタンパク質を作り出す。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当技術分野で公知の数多くの標準的手法の例示に過ぎず、他の公知の手法を使用することもできる。
本発明の細胞および／またはモジュール式コンストラクトにおいて使用するのに好適な調節性タンパク質のすべての変異体、断片または相同体は、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように、ＮＯＩのコグネイト結合部位に結合する能力を保持すると考えられる。
結合部位のすべての変異体断片または相同体は、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように、コグネイトＲＮＡ結合タンパク質に結合する能力を保持すると考えられる。
コドン最適化
本発明において使用されるポリヌクレオチド（ベクター産生システムのＮＯＩおよび／または構成要素を含む）は、コドンが最適化され得る。コドン最適化は、ＷＯ１９９９／４１３９７およびＷＯ２００１／７９５１８に以前に記載されている。細胞が異なれば、特定のコドンの使用頻度も異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量の偏りに対応する。配列内のコドンを、それを調整して対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するように変更することによって、発現を増加させることが可能である。同じ理由で、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において希少であることが公知であるコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。このようにして、さらなる度合いでの翻訳制御を行えるようになる。
レトロウイルスを含む多くのウイルスは、多数の希少コドンを使用しており、これらを一般的に使用される哺乳動物コドンに対応するように変化させることで、哺乳動物産生細胞における目的の遺伝子、例えば、ＮＯＩまたはパッケージング構成要素の発現の増加を達成することができる。哺乳動物細胞について、ならびに種々の他の生物についてのコドン使用頻度の表が、当技術分野で公知である。
ウイルスベクター構成要素のコドン最適化には、他にもいくつか利点がある。それらの配列の変更により、プロデューサー細胞／パッケージング細胞のウイルス粒子のアセンブリーのために必要なウイルス粒子のパッケージング構成要素をコードするヌクレオチド配列では、ＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）がそれらから除去されている。同時に、パッケージング構成要素のアミノ酸配列コード配列は保持されるため、配列によってコードされるウイルス構成要素が同じであるか、またはパッケージング構成要素の機能は損なわれない程度に少なくとも十分に類似したままである。レンチウイルスベクターでは、コドン最適化は、輸出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性をも克服させて、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。コドン最適化は、ベクターシステム内の異なるコンストラクト間の相同組換えも減少させる（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）。したがって、コドン最適化の全体的な効果は、ウイルスタイターの顕著な増加および安全性の改善である。
一実施形態では、ＩＮＳに関係するコドンのみがコドン最適化される。しかし、はるかにより好ましく実際的な一実施形態では、配列は、一部の例外、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を範囲に含む配列を除いて、その全体がコドン最適化される（以下を参照）。
レンチウイルスベクターのｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複するリーディングフレームを含む。この両方のタンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソーム「スリップ」の結果として起こる。このスリップは、少なくとも一部には、リボソーム停止性ＲＮＡ二次構造によって引き起こされると考えられている。そのような二次構造は、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複の領域は、ｇａｇの開始部（ヌクレオチド１は、ｇａｇ ＡＴＧのＡである）の下流のヌクレオチド１２２２からｇａｇの終了部（ｎｔ １５０３）まで及ぶ。その結果として、フレームシフト部位から２つのリーディングフレームの重複領域までにわたる２８１ｂｐ断片は、好ましくはコドン最適化されない。この断片の保持は、Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現を可能にすると考えられる。ＥＩＡＶの場合、重複の開始部はｎｔ１２６２であるとされ（ヌクレオチド１は、ｇａｇ ＡＴＧのＡである）、重複の終了部はｎｔ１４６１であるとされる。フレームシフト部位およびｇａｇ－ｐｏｌ重複が確実に保たれるようにするために、ｎｔ１１５６から１４６５までは野生型配列が保持されている。
例えば、便利な制限部位を収容するために、最適なコドン使用からの逸脱がなされることが可能であり、保存的アミノ酸変化をＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質に導入することができる。
一例では、コドン最適化は、発現が軽度である哺乳動物遺伝子に基づく。第３の塩基、そして時には第２および第３の塩基を変化させることができる。
遺伝暗号の縮重性のために、多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列が実現され得ることが当業者には認識されるであろう。また、コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列を作製するための出発点として使用し得るレトロウイルス変異体が多数記載されてもいる。レンチウイルスゲノムは、極めて可変性が高い。例えば、依然として機能的であるＨＩＶ－１の疑似種が多数存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらの変異体は、形質導入過程の特定の部分を増強するために使用され得る。ＨＩＶ－１変異株の例は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＬＬＣによって運営されているＨＩＶデータベース、http://hiv-web.lanl.govで見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、http://www.ncbi.nlm.nih.govにある、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のデータベースで見出すことができる。
コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列についての戦略を、任意のレトロウイルスに対して使用することができる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－１、およびＨＩＶ－２を含むすべてのレンチウイルスに当てはまると考えられる。加えて、この方法を使用して、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ、およびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ、および他のレトロウイルスに由来する遺伝子の発現を増加させることもできると考えられる。
コドン最適化により、ｇａｇ－ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかし、レンチウイルスベクターにおける抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター産生システムを完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存的にすることが必要であろう。したがって、ゲノムを改変することも必要である。これは、ベクターゲノム構成要素を最適化することによって達成される。有利なこととして、これらの改変は、プロデューサー細胞および形質導入細胞の両方においてすべての追加のタンパク質が存在しない、より安全な系の産生にもつながる。
本明細書において考察されている刊行物は、本出願の出願日よりも前のそれらの開示のために提供されているに過ぎない。本明細書におけるいかなるものも、そのような刊行物が、本明細書に添付されている特許請求の範囲の先行技術を構成することを認めるものと解釈されるべきではない。
以下に、実施例によって、本発明についてさらに詳細に記載するが、これらの実施例は、本発明を実施する上で当業者を援助するのに役立つことを意図しており、本発明の範囲を限定することは全く意図していない。
読者の注目は、本出願に関連して本明細書と同時に、またはそれの前に提出され、本明細書と共に一般の閲覧に自由に供されるすべての論文および文書に向けられており、すべてのそのような論文および文書の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された特徴のすべて、および／またはそのように開示された任意の方法もしくは過程の工程のすべては、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。
本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示された各特徴は、他に明白に記載されない限り、同じ、同等の、または類似の目的を果たす代替的な特徴に置き換えることができる。したがって、他に明白に記載されない限り、開示された各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
本発明は、任意の上記の実施形態の詳細に制限されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規のものもしくは任意の新規の組み合わせ、またはそのように開示された任意の方法もしくは過程の工程の任意の新規のものもしくは任意の新規の組み合わせに及ぶ。
本開示は、本開示の例示的な方法および材料に限定されず、本開示の実施形態の実施または試験において、本開示に記載された方法および材料と類似または同等の方法および材料を使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。他に指示がない限り、核酸配列は左から右に５’から３’の向きで書かれる；アミノ酸配列は左から右に、それぞれアミノからカルボキシの方向に書かれる。
値の範囲が提供されている場合、文脈が明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限の間にある、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されていることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値または介在する値と、その記載された範囲内の他の記載された値または介在する値との間の各小さな範囲は、本開示の範囲内に含まれる。これらのより小さな範囲の上限と下限は、独立して範囲に含まれても除外されてもよく、いずれか、どちらの限界もより小さな範囲に含まれていないか、または両方の限界がより小さな範囲に含まれている各範囲も、記載される範囲の特に除外された限界に従うことを条件として、本開示の範囲に含まれる。記載された範囲が制限の一方または両方を含む場合、これらの含まれる制限の一方または両方を除く範囲も本開示に含まれる。
本明細書および添付の請求項で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形の指示対象が含まれることに留意しなければならない。
本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加で列挙されていないメンバー、要素または方法工程を除外しない。「含むこと」、「含む」および「で構成される」という用語は、「からなる」という用語も含む。
本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); and Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は、当業者に、本発明で使用される用語の多くの一般的な辞書を提供する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料は、本発明の実施において使用が認められるが、好ましい方法および材料は本明細書に記載される。したがって、すぐ下に定義されている用語は、仕様全体を参照することによってより完全に記載される。
本発明の態様は、以下の非限定的な例によって示される。
［実施例１］
ＨＥＫ２９３Ｔにおけるベクター産生を増強するための小分子誘導剤の予備評価
本発明者らは、一過性にトランスフェクトされた接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてベクタータイターを増加させるための代替的な小分子誘導剤の使用について予備調査を行った。一過性過程における標準的な手順は、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤の１つである１０ｍＭ酪酸ナトリウムにより、トランスフェクション２４時間後の時点でベクター産生を誘導することである。予備的なハイスループット分子スクリーニングを使用して、代替的なＨＤＡＣ阻害剤（バルプロ酸ナトリウム、吉草酸、ＳＡＨＡおよびＴＳＡ）、ＨＡＴ阻害剤（タンニン酸）、細胞分化剤（ＨＭＢＡ）、ＰＫＣアゴニスト（プロストラチンおよびＰＭＡ）、および抗酸化剤（Ｎ－アセチルシステイン）の使用がタイターに及ぼす影響を同定した。
材料および方法
接着細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全培地［１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）］で３７℃、５％ ＣＯ２にて維持した。
ＨＩＶ ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、１２ウェルプレート規模で以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種し、およそ２４時間後に細胞にゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶ－Ｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＯｐｔｉＰＲＯ中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。
自動液体処理装置を使用して、完全培地中でストック試薬を表２（Ｔａｂｌｅ １）（に一覧にした最終濃度まで希釈して、１ｍＬの誘導混合物を調製した。細胞は、トランスフェクションの約２４時間後に、培地を廃棄し、０．８ｍＬの誘導混合物に置き換えることによって誘導した。ベクター上清を２４時間後に収集し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＧＶ ０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過した。
Figure 2023525161000003


Figure 2023525161000004


Figure 2023525161000005


Figure 2023525161000006


表1. 12ウェルプレートに添加した被験誘導試薬の濃度。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した２７０μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルに形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間にウェルを５３０μＬの完全培地で満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を剥離させて、フローサイトメトリーのために完全培地中に再懸濁させた。ＧＦＰ発現率は、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ、形質導入時の細胞数１×１０５個、ベクター希釈係数および形質導入時のベクター容量に基づいて、以下の式を使用して算出した。
Figure 2023525161000007
結果
これらの結果は、試験したＨＤＡＣ阻害剤の多くがＨＥＫ２９３Ｔにおいて誘導効果を有し、５ｍＭ酪酸ナトリウム、１０ｍＭバルプロ酸ナトリウム、２０ｍＭ吉草酸、および２．５μＭ ＳＡＨＡの濃度でベクター産生が最適であることを示している（図２）。ＴＳＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるベクタータイターを、２０ｍＭ酪酸ナトリウムのレベルを上回って改善することができなかった。抗酸化剤であるＮＡＣは、単独ではタイターにプラスの影響を及ぼさず、１～４ｍＭ ＮＡＣの存在下での基礎的なベクター産生は、非誘導対照と同じままであった。タンニン酸はベクター産生にかなりの悪影響を及ぼし、測定可能なベクター産生は生じなかった。別のクラスの化合物として、転写アクチベーターは個々にベクター誘導能を示し、ＰＫＣアクチベーターであるＰＭＡおよびプロストラチンによって起こったベクター誘導が最も高度であった。ランダム化された組み合わせスクリーン（図３）は、ＨＤＡＣ阻害剤を転写アクチベーターと組み合わせた場合に最も高いタイターが達成されたことを示しており、これは、潜伏性ＨＩＶ治療法においてＨＤＡＣ阻害剤を潜伏感染再活性化剤（ｌａｔｅｎｃｙ ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と組み合わせた場合のウイルス産生増加に関する報告と一致している（Reuse et al., 2009）。
考察
本発明者らは、ＨＤＡＣ阻害剤とＰＫＣアクチベーターの併用がベクタータイターの最大の増加を刺激することを実証した。
［実施例２］
ＨＥＫ２９３Ｔにおけるベクター産生を増強するための小分子誘導剤の評価
本発明者らはさらに、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてベクタータイターを増加させるための代替的な小分子誘導剤の使用について調査した。一過性過程における標準的な手順は、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤の１つである１０ｍＭ酪酸ナトリウムにより、トランスフェクション２４時間後の時点でベクター産生を誘導することである。２つの代替的な脂肪族化合物（バルプロ酸ナトリウムおよび吉草酸）およびヒドロキサム酸化合物（ＳＡＨＡ）のＨＤＡＣ阻害剤としての使用を調査するためのハイスループットスクリーニング法の使用が報告されている。さらに、本発明者らは、ＨＤＡＣ阻害剤を転写アクチベーターであるＨＭＢＡ（細胞分化誘導剤）およびプロストラチンおよびＰＭＡ（ＰＫＣアゴニスト）と組み合わせることが、タイターを増加させる効果を調べた。
材料および方法
実験１
接着細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全培地［１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）］で３７℃、５％ ＣＯ２にて維持した。
ＨＩＶ ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、１２ウェルプレート規模で以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１ｍＬの完全培地に播種し、およそ２４時間後に細胞にゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶ－Ｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＯｐｔｉＰＲＯ中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。
自動液体処理装置を使用して、完全培地中でストック試薬を表３（Ｔａｂｌｅ ２）に一覧にした最終濃度まで希釈して、１．２ｍＬの誘導混合物を調製した。細胞は、トランスフェクションの約２４時間後に、培地を廃棄し、１ｍＬの誘導混合物に置き換えることによって誘導した。ベクター上清をおよそ２４時間後に収集し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＧＶ ０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過した。
Figure 2023525161000008


Figure 2023525161000009


Figure 2023525161000010


Figure 2023525161000011


Figure 2023525161000012


表2. 12ウェルプレートに添加した被験誘導試薬の濃度。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した２６５μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルに形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に５３０μＬの完全培地でウェルを満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を剥離させて、フローサイトメトリーのために完全培地中に再懸濁させた。ＧＦＰ発現率は、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ、形質導入時の細胞数８．４６×１０４個、ベクター希釈係数および形質導入時のベクター容量に基づいて、以下の式を使用して算出した。
Figure 2023525161000013
実験２
接着細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全培地［１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）］で３７℃、５％ ＣＯ２にて維持した。
ＨＩＶ ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、１２ウェルプレート規模で以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１ｍＬの完全培地に播種し、およそ２４時間後に細胞にゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶ－Ｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＯｐｔｉＰＲＯ中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。
ＪＭＰを使用して、酪酸ナトリウム、プロストラチンおよびＨＭＢＡをスクリーニングするための３×３×２完全実施（ｆｕｌｌ ｆａｃｔｏｒｉａｌ）ＤＯＥ、ならびに代替的なＨＤＡＣ阻害剤であるプロストラチンおよびＨＭＢＡをスクリーニングするための２×２×２完全実施を作成した。自動液体処理装置を使用して、完全培地中でストック試薬を表４（Ｔａｂｌｅ ３）に一覧にした最終濃度まで希釈して、１．２ｍＬの誘導混合物を調製した。細胞は、トランスフェクションの約２４時間後に、培地を廃棄し、１ｍＬの誘導混合物に置き換えることによって誘導した。ベクター上清を２４時間後に収集し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＧＶ ０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過した。
Figure 2023525161000014


Figure 2023525161000015


Figure 2023525161000016


Figure 2023525161000017


Figure 2023525161000018


表3. 12ウェルプレートに添加した被験誘導試薬の濃度。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した２６５μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルに形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に５３０μＬの完全培地でウェルを満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を剥離させ、フローサイトメトリーのために完全培地中に再懸濁させた。ＧＦＰ発現率は、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ、形質導入時の細胞数７．９８×１０４個、ベクター希釈係数、形質導入時のベクター容量に基づいて、以下の式を使用して算出した。
Figure 2023525161000019
結果
実験１
これらの結果（図４参照）は、試験したＨＤＡＣ阻害剤が同程度の誘導効果を有し、１０ｍＭバルプロ酸ナトリウム、１０ｍＭ吉草酸、および１μＭ ＳＡＨＡが最適濃度であることを示している。転写アクチベーターはすべて細胞に対して良好な誘導効果を示し、１６ｍＭ ＨＭＢＡ、１６μＭプロストラチンおよび３２ｎＭ ＰＭＡという最適濃度は、非誘導対照よりもおよそ４倍の高さのタイターを生じた。注目すべきことに、ベクタータイターの最大の増加は、ＨＤＡＣ阻害剤と試験したＰＫＣアゴニスト（プロストラチンとＰＭＡ）の併用によって誘導され、そのどちらも対応するＨＤＡＣ濃度の１．６倍から２．０倍の間への同程度の増加を誘導した。プロストラチンとは対照的に、ＨＭＢＡとＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせは、同等の濃度のＨＤＡＣ阻害剤単独によって誘導されたものと比較して、タイターの改善を示さないか、わずかしか示さなかった。
ＧＦＰ ＦＡＣＳからのＭＦＩは、０．５から８μＭまでのプロストラチンの濃度範囲で変化は観察されなかった。しかし、ＭＦＩは１６μＭプロストラチンで２６％増加し、このことは、ベクター希釈（４０倍）後の残存濃度０．４μＭのプロストラチンが、形質導入細胞の導入遺伝子合成に影響を及ぼすのに十分であることを示している。
実験２
実験２の目的は、ＨＤＡＣ阻害剤およびプロストラチンの両方と組み合わせた場合に、ＨＭＢＡがタイターにプラスの影響を及ぼすか否かを調べることであった。様々な濃度の酪酸ナトリウム、プロストラチンおよびＨＭＢＡの間の相互作用を調べるために、３×３×２の全要因ＤＯＥを行った（図５）。プロストラチンの存在と１０ｍＭ酪酸ナトリウムの組み合わせは、ベクター産生の良好な増強を示し、１０μＭプロストラチンの濃度でタイターが９２％増加した。予測プロファイラーからは、より高濃度のプロストラチンの存在が、１μＭまたは５μＭのプロストラチンと比較して、より高い望ましさスコア（ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）を与えることが示された（図５Ｂ）。実験１では単独で誘導効果を示したにもかかわらず、８ｍＭ ＨＭＢＡとプロストラチンおよび酪酸ナトリウムとの組み合わせの存在下でのタイターは、ＨＭＢＡを除外した条件と比較して顕著な減少を示した。
同様に、ＨＭＢＡは代替的なＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸ナトリウム、吉草酸およびＳＡＨＡとの組み合わせでタイターにマイナスの影響を示し、このことは、ＨＭＢＡが、ＨＤＡＣ阻害剤およびプロストラチンに加える添加剤としてはいかなる増強効果ももたらさないことを示唆している。にもかかわらず、プロストラチンを１μＭから１０μＭに増加させることによる誘導のプラスの増強は、試験したすべてのＨＤＡＣ阻害剤で共通しており、このことは、ベクター誘導の増強剤の可能性があるものとしてのＰＫＣアゴニストの有効性を裏付ける（図６）。
考察
これらの実験により、ＨＤＡＣ阻害剤とＰＫＣアクチベーターの併用は、対応するＨＤＡＣ阻害剤単独による誘導から期待される値を１．６倍から２．０倍上回るベクタータイターの増加をもたらすと結論付けられる。それらの構造的および機能的類似性と一致して、ＰＭＡはプロストラチンと同程度の増強効果を示した。しかし、プロストラチン（または他の同様の類似体）の使用は、その非腫瘍形成特性から、医薬用ベクターの産生を誘導するためにＰＭＡよりも好都合である可能性がある。ＨＭＢＡは、他の小分子誘導剤との併用では、タイターに対していかなるプラスの効果ももたらさなかったことに留意されたい。
［実施例３］
ＨＥＫ１．６５Ｓにおけるベクター産生を増強するための小分子誘導剤の評価
本発明者らは、一過性にトランスフェクトされた浮遊順応性ＨＥＫ２９３Ｔ（ＨＥＫ１．６５ｓ）細胞におけるベクタータイターを増加させるための代替的な小分子誘導剤の使用について調査した。一過性過程における標準的な手順は、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤の１つである１０ｍＭ酪酸ナトリウムを使用して、トランスフェクション２４時間後の時点でベクター産生を誘導することである。２つの脂肪族化合物（バルプロ酸ナトリウムと吉草酸）およびヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）の代替的なＨＤＡＣ阻害剤としての使用を調査するためのハイスループットスクリーニング法の使用が報告されている。さらに、本発明者らは、これらのＨＤＡＣ阻害剤を非腫瘍促進性ＰＫＣアクチベーターであるプロストラチンと組み合わせることが、ＧＦＰ ＨＩＶベクタータイターを増加させる効果についても調査した。
材料および方法
実験１
浮遊細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（ＦＳ）培地＋０．１％コレステロール脂質濃縮物（ＣＬＣ）（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器で増殖させた。
ＨＩＶ ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、２４ウェル低接着プレートで以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を１ｍＬの無血清培地に播種し、およそ２４時間後に細胞にゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶ－Ｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、無血清培地中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器中でインキュベートし、ベクターを産生させた。
ＪＭＰを使用して、各ＨＤＡＣｉについて２×２完全実施条件マトリックスを作成し、各条件について２×中心点および２×反復物を設定した。自動液体処理装置を使用して、２５０μＬの１２倍濃縮誘導混合物を含む９６ウェルプレートを調製した。１２倍濃縮誘導混合物の１００μＬを各２４ウェルプレートの対応するウェルにピペットで注入し、表５（Ｔａｂｌｅ ４）に一覧にした最終濃度を得た。ベクター上清を２日後に収集し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＧＶ ０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過した。
Figure 2023525161000020


Figure 2023525161000021


Figure 2023525161000022


表4. 24ウェルプレートへの添加時の被験誘導試薬の最終濃度。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した１６０μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルに形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に３２０μＬの完全培地でウェルを満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を剥離させ、フローサイトメトリーのために完全培地中に再懸濁させた。ＧＦＰ発現率は、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ、形質導入時の細胞数６．７×１０４個、ベクター希釈係数、形質導入時のベクター容量に基づいて、以下の式を使用して算出した。
Figure 2023525161000023
実験２
浮遊細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（ＦＳ）培地＋０．１％コレステロール脂質濃縮物（ＣＬＣ）（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器で増殖させた。
ＨＩＶ ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、２４ウェル低接着プレートで以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を１ｍＬの無血清培地に播種し、およそ２４時間後に細胞にゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶ－Ｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、無血清培地中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器中でインキュベートし、ベクターを産生させた。
ＪＭＰを使用して、各条件について２×中心点および２×反復物を有する４×５完全実施条件マトリックスを作成した。自動液体処理装置を使用して、２５０μＬの１２倍濃縮誘導混合物を含む９６ウェルプレートを調製した。１２倍濃縮誘導混合物の１００μＬを各２４ウェルプレートの対応するウェルにピペットで注入し、表６（Ｔａｂｌｅ ５）に一覧にした最終濃度を得た。ベクター上清を２日後に収集し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＧＶ ０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過した。
Figure 2023525161000024


Figure 2023525161000025


表5. 24ウェルプレートへの添加時の被験誘導試薬の最終濃度。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した２７０μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルの形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に５４０μＬの完全培地でウェルを満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を剥離させ、フローサイトメトリーのために完全培地中に再懸濁させた。ＧＦＰ発現率は、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ、形質導入時の細胞数１．１８×１０５個、ベクター希釈係数、形質導入時のベクター容量に基づいて、以下の式を使用して算出した。
Figure 2023525161000026
結果
実験１
ＨＥＫ１．６５ｓ細胞で試験した種々のＨＤＡＣｉのうち、酪酸ナトリウムは最も高いＬＶタイターを誘導した（図７）。驚いたことに、ＳＡＨＡは、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、酪酸ナトリウムに匹敵するＬＶ収量を刺激したことを示す以前のデータにもかかわらず、最も低い誘導効果を示し、最も低いＬＶタイターが生じた。ほぼすべての場合に、ＨＤＡＣｉにプロストラチンを追加するとタイターが増加したことから、ＨＥＫ１．６５ｓにおいてＰＫＣアゴニストを誘導剤として前向きに適用することが裏付けられた。実験１の結果を受けて、最も成績の良いＨＤＡＣ阻害剤（酪酸ナトリウム）とプロストラチンの併用効果についてより詳細なモデルを確立し、各誘導剤の至適濃度を決定するための実験２を実施した。
実験２
実験２の結果は、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ１．６５ｓ浮遊細胞において、プロストラチンが酪酸ナトリウムとの組み合わせでタイターに対して顕著なプラスの効果を有することを示している（図８）。ここに示されたデータから、２～４μＭという低濃度のプロストラチンでタイターが増加し、８～１６μＭの濃度ではさらに増加することが観察される。興味深いことに、これらのデータは、プロストラチンが単独でベクタータイター増加を促進するという以前の知見も裏付けており、この場合には８～１６μＭの濃度で非誘導対照と比較してタイターが約１３倍に増加し、至適濃度の酪酸ナトリウムの約半分の誘導効果が示されている。
得られたタイターをＪＭＰ ＤＯＥソフトウェアに戻し、ＬＶタイターに対する酪酸ナトリウムおよびプロストラチンの相互作用モデルを作成した（図９）。「予測と実際」のプロット（図９Ｂ）は、ＤＯＥモデルとランダム効果による収集データの変動との間の強い適合を示している。酪酸ナトリウム（１１．５）、プロストラチン（８．８）、酪酸ナトリウム＊酪酸ナトリウム（４．９）、プロストラチン＊プロストラチン（４．９）のＬｏｇＷｏｒｔｈ値はいずれも２を超えており、各効果の有意性が閾値ｐ値０．０１を大きく上回っていることを示している。予測プロファイラー（図９Ｃ）からは、組み合わせた誘導剤についての予測至適濃度は８ｍＭ酪酸ナトリウムおよび１１μＭプロストラチンであることを示している。これらの至適条件下では、ＬＶのタイターは酪酸ナトリウム（８ｍＭ）のみの至適濃度の場合よりも１．９３倍増加する。
細胞生存率の測定からは、２～３２μＭの濃度範囲のプロストラチンで処理した細胞では、酪酸ナトリウム処理細胞で観察された４％という低下と比較して、それ以上の細胞生存率の低下は見られなかった［表７（Ｔａｂｌｅ ６）］。これらの結果は、プロストラチンが４８時間のベクター産生期間にわたって細胞に対する細胞傷害性作用をほとんど有しないことを示している。
Figure 2023525161000027


表6. 細胞生存率の測定値
考察
これらの結果は、プロストラチンが、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ１．６５ｓにおけるＬＶタイターの効果的な増強剤であることを示している。８～１６μＭのプロストラチンのみで形質転換細胞を誘導すると、非誘導対照よりもベクタータイターが１０倍以上に増加する。さらに、このＤＯＥモデルで確立された至適濃度では、８ｍＭ酪酸ナトリウムを伴う１１μＭのプロストラチンは、ＬＶタイターを、至適な酪酸ナトリウム条件での誘導をほぼ２倍上回るまで増加させる。その誘導効果に加えて、プロストラチンへの細胞曝露の結果として細胞生存率の低下は観察されなかった。代替的な脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤（３ｍＭバルプロ酸ナトリウムおよび１０ｍＭ吉草酸）を使用した場合には、ある程度の誘導効果が観察されたが、ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡは最も弱い誘導効果を示し、この実験で試験した濃度では、代替的なＨＤＡＣ阻害剤のいずれも酪酸ナトリウムよりもタイターを増加させなかった。このことは、標準的な一過性ベクター産生方法において、プロストラチンが単独で、または酪酸ナトリウムとの組み合わせで、誘導の候補となる小分子であることを示している。
［実施例４］
ベクター誘導の小分子増強剤としてのプロストラチン：４０ｍＬ振盪フラスコ試験
プロストラチンは小分子の非腫瘍促進性プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）モジュレーターであり、がん（Alotaibi et al., 2018）およびアルツハイマー病（Hongpaisan & Alkon, 2007）の治療に有望な治療特性を示している。本発明者らは実施例３で、ＨＥＫ１．６５ｓを使用した一過性ＬＶ産生過程において、プロストラチンがＨＤＡＣ阻害剤との組み合わせで、ＧＦＰ－ＨＩＶ ＬＶタイターを２４ウェルプレート規模で２倍以上増加させるのに有効であることを実証した。本発明者らは以下のスケールアップ実験を行い、プロストラチンで増強されたＨＥＫ細胞の産生能力を、振盪フラスコ容量（４０ｍＬ）にも拡張し得るか否かを調べた。
材料および方法
浮遊細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（ＦＳ）培地＋０．１％コレステロール脂質濃縮物（ＣＬＣ）（Ｇｉｂｃｏ）中において、３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器で増殖させた。
ＨＩＶ ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、６本の１２５ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコ内で、以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を４０ｍＬの無血清培地に播種し、およそ２４時間後に細胞にゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶ－Ｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、無血清培地中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。ベクター産生の過程を通じて、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器中でインキュベートした。
最終濃度８ｍＭの酪酸ナトリウムを使用して、振盪フラスコ１～６におけるベクター産生を誘導した。酪酸ナトリウム誘導と同時に、フラスコ３および４にはＤＭＳＯを添加して最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯとし、振盪フラスコ５および６にはプロストラチン（ＤＭＳＯ中に溶解）を添加して、最終濃度１１μＭのプロストラチンおよび０．２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯとした［表８（Ｔａｂｌｅ ７）］。ベクター上清を誘導の約２４時間後に収集し、０．４５μｍで濾過した。
Figure 2023525161000028


表7. 振盪フラスコの誘導組成。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＦＡＣＳによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した１５７μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルの形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に３１４μＬの完全培地でウェルを満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を剥離させ、フローサイトメトリーのために完全培地中に再懸濁させた。ＧＦＰ発現率は、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ、形質導入時の細胞数４．４×１０４個、ベクター希釈係数、形質導入時のベクター容量に基づいて、以下の式を使用して算出した。
Figure 2023525161000029
二重ＱＰＣＲ組込みアッセイによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種から約２４時間後に、完全培地で希釈した５００μＬのベクターおよび８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルに形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に１ｍＬの完全培地でウェルを満たした。培養物を１０日間継代した後に、１×１０６個の細胞ペレットから宿主ＤＮＡを抽出した。ＨＩＶパッケージングシグナル（ψ）およびＲＲＰＨ１にセットしたＦＡＭプライマー／プローブを使用して二重定量ＰＣＲを行い、以下の因子を使用してベクタータイター（ＴＵ／ｍＬ）を算出した：形質導入容量、ベクター希釈度、ＲＲＰＨ１で正規化された１反応あたりに検出されたＨＩＶ－１ψコピー。
結果および考察
ＤＯＥで最適化された誘導条件（８ｍＭ酪酸ナトリウム＋１１μＭプロストラチン：実施例３）の振盪フラスコ規模への拡張により、ＨＩＶ－ＧＦＰのタイターの増加が首尾良く実証された。プロストラチンの存在下で、ベクタータイターは、酪酸ナトリウム単独でＨＥＫ１．６５ｓ細胞を誘導することによって達成されたタイターよりも２．４倍から２．９倍高度であった（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。ＶＲＣおよびＶＲＣ＋５５ｎＭプロストラチンについて報告されたタイターが同一であることにより、組込みアッセイから決定されたタイターが、ベクター希釈後に残存するプロストラチンの残留濃度の影響を受けないことが実証された（図１０Ｂ）。
［実施例５］
本発明の文脈においてＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生中に共発現され得る例示的な改変Ｕ１ ＳＮＲＮＡ発現コンストラクト
本発明者らは以前に、Ｕ１ ｓｎＲＮＡを改変し、レンチウイルスベクター（ＬＶ）と共発現させることで、産生タイターの増強につながり得ることを示した。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ分子の例を図１１に示す。手短に述べると、ネイティブ性スプライスドナー部位のアニーリング配列（ヌクレオチド１～１１）を、レンチウイルスベクターＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の５’領域内の「標的」配列－典型的にはコアパッケージ領域内にある－に相補的な配列に置き換えて、ｖＲＮＡおよび他のベクター構成要素と並行して発現させることにより、ベクタータイターの増加を招き得る。理論に拘束されることは望まないが、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは核内でｖＲＮＡに結合し、最終的にはビリオンへのパッケージングに利用し得るｖＲＮＡの定常状態プールを安定化／増加させるという仮説が立てられる。本発明者らは以前、レンチウイルスベクターゲノムｖＲＮＡのパッケージングシグナル内に埋め込まれた主要スプライスドナー（ＭＳＤ）領域が非常に乱交雑的であり得、導入遺伝子配列内の強力または潜在的なスプライスアクセプターへのスプライシングが（ｒｅｖの存在下であっても）、パッケージングに利用可能な完全長ｖＲＮＡの量の減少につながる可能性があることを示した（図１参照）。この異常なスプライシング活性の除去は、機能的突然変異またはＭＳＤおよび下流の数ヌクレオチドをコードする潜在的スプライスドナーの欠失によって達成される（図１４Ａ参照）。ＬＶに対するこの種の改変は産生タイターの減少につながる；しかし、ＬＶ産生中に改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが供給されることによってタイターが増加／回復し、同時に異常なスプライシングの遮断も維持される（図１３および１４参照）。
本発明者らは、ＭＳＤ突然変異ＬＶの産生におけるプロストラチンの使用が出力タイターの増強につながるか否か、およびプロストラチンおよび改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの両方を同時に適用できるか否かを評価しようと考えた。
浮遊細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ２９３Ｔ．１－６５ｓ浮遊細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ＋０．１％ＣＬＣ（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器（２５ｍｍ軌道で１９０ ＲＰＭに設定）で増殖させた。ＨＥＫ２９３Ｔｓ細胞を無血清培地に８×１０５個／ｍｌで播種し、ベクター産生を通じて、３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪インキュベーションを行った。播種からおよそ２４時間後に、トランスフェクション時の有効最終培養容量あたりのプラスミドの質量比として以下を使用して、細胞をトランスフェクトした：ゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＶＳＶ－Ｇ、および利用時に０．０１から０．２μｇ／ｍＬの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡプラスミド。
トランスフェクションは、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。約１８時間後に酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度１０ｍＭとして添加し、適宜、プロストラチンを、最終濃度１１μＭの酪酸ナトリウムと共に加えた。典型的には、ベクター上清を２０～２４時間後に収集し、次いで濾過（０．２２μｍ）して、－２０／－８０℃で凍結させた。ヌクレアーゼ処理に関する陽性対照として、典型的にはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を、濾過の１時間前に５Ｕ／ｍＬとして収集物に添加した。
プロストラチンおよび改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの評価について、使用した標準的ＳＩＮ－ＬＶゲノムはＨＩＶ－ＥＦＳ－ＧＦＰまたはＨＩＶ－ＥＦ１ａ－ＧＦＰであり、ＭＳＤ突然変異ＳＩＮ－ＬＶゲノムはＨＩＶ－ＭＳＤ２ＫＯｍ５－ＥＦＳ－ＧＦＰまたはＭＳＤ２ＫＯｍ５－ＥＦ１ａ－ＧＦＰであった。ＭＳＤ２ＫＯｍ５の改変を図１４に示す。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは２５６Ｕ１であり、これはパッケージングシグナル（配列番号２２を参照）のＳＬ１ループを標的とする。表８に、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの標的化配列の他の例を示す。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクタータイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１．２×１０４個／ウェルで播種した。ＧＦＰをコードするウイルスベクターを使用して、８ｍｇ／ｍｌポリブレンおよび１×ペニシリンストレプトマイシンを含有する完全培地中で細胞の形質導入をおよそ５～６時間行った後に、新しい培地を添加した。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて２日間インキュベートした。次いで、Ａｔｔｕｎｅ－ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、培養物をフローサイトメトリー用に調製した。ＧＦＰ発現率を測定し、形質導入時の予測細胞数２×１０４個（典型的な増殖速度に基づく）、ベクター試料の希釈係数、陽性ＧＦＰ集団のパーセンテージおよび形質導入時の総容量を使用してベクタータイターを算出した。
結果
驚いたことに、ＳＩＮ－ＬＶ産生中にプロストラチンを添加することにより、ＭＳＤ突然変異ＳＩＮ－ＬＶベクター（および標準的ＳＩＮ－ＬＶ）のタイターが強化されることが見出された（図１５参照）。さらに、産生中にプロストラチンを２５６Ｕ１と共に供給すると、ＭＳＤ突然変異ＳＩＮ－ＬＶベクターの出力タイターは、誘導剤が存在しない場合に、標準的ＳＩＮ－ＬＶベクターよりも高度に増加した。このデータは、化学物質とポリヌクレオチドに基づく誘導剤分子との組み合わせが、標準的ＳＩＮ－ＬＶおよびＭＳＤ突然変異ＳＩＮ－ＬＶの両方のタイターを増加させ得ることを初めて示すものである。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡのＤＮＡベースの発現コンストラクトは、ＲＮＡの転写および終結を駆動する内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡ遺伝子の保存された配列を含み、それは２５６Ｕ１（Ｕ１＿２５６とも称される）ｓｎＲＮＡの非限定的な例において、以下に強調表示されている：
Figure 2023525161000030
 （配列番号２２）
凡例：大文字のみ＝Ｕ１ ＰｏｌＩＩプロモーター（ｎｔ １～３９２）；小文字＝再標的化領域（ｎｔ ３９３～４０９）；小文字の太字＝再標的化配列［この例では、野生型ＨＩＶ－１パッケージングシグナルのｎｔ ２５６～２７０を標的とする］（ｎｔ ３９５～４０９）；大文字の斜体＝主要なＵ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）；大文字の下線＝転写終結領域（ｎｔ ５６３～６５２）
本発明者らが使用した最初の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡおよび対照の概要を以下の表に提示しており、新しいアニーリング配列および標的部位配列（配列は５’から３’方向に表される）が示されている。
Figure 2023525161000031


Figure 2023525161000032


Figure 2023525161000033


［実施例６］
一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ１．６５ｓにおける治療用ベクターの産生のための改変Ｕ１ ＳＮＲＮＡ発現およびプロストラチン誘導の個々の効果および複合効果の評価
以前に観察されたＧＦＰレポーター導入遺伝子を保有するＳＩＮ－ＬＶベクタータイターの増加から先に進めて、本発明者らはさらに、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ１．６５ｓ細胞における治療用導入遺伝子（ＣＡＲ＃１、ＣＡＲ＃２、およびＣＡＲ＃２－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ）を含むＨＩＶベクターの産生を増強するための２５６Ｕ１およびプロストラチンの個々の使用および併用のについて調べようとを考えた。タイターの増加を、ポリヌクレオチドまたは小分子誘導剤の非存在下で、同じ導入遺伝子の標準的なＳＩＮ－ＬＶ産生手順と比較した。
材料および方法
浮遊細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（ＦＳ）培地＋０．１％コレステロール脂質濃縮物（ＣＬＣ）（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器で増殖させた。
ＨＩＶ ＣＡＲ＃１、ＣＡＲ＃２、およびＣＡＲ＃２－Ｔ２ Ａ－ＧＦＰベクターを、１２個の１２５ｍＬ三角振盪フラスコ内で、以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を２０ｍＬの無血清培地に播種し、およそ２４時間後に細胞にゲノム、Ｇａｇ－Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびＶＳＶ－Ｇでトランスフェクトした。振盪フラスコ２、４、６、８、１０および１２では２５６Ｕ１プラスミドをコトランスフェクトした［表１０（Ｔａｂｌｅ ９）］。トランスフェクションは、無血清培地中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。ベクター産生の過程を通じて、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器中でインキュベートした。
振盪フラスコ１～１２内でのベクター産生を、トランスフェクションから約２４時間後に、最終濃度１０ｍＭの酪酸ナトリウムを使用して誘導した。酪酸ナトリウム誘導と同時に、振盪フラスコ３、４、７、８、１１および１２にはプロストラチン（ＤＭＳＯ中に溶解）を添加して、最終濃度１１μＭのプロストラチンおよび０．２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯとした（表９）。ベクター上清を誘導から約２４時間後に収集し、０．４５μｍで濾過した。
Figure 2023525161000034



表9. ベクタータイターに対する改変U1 snRNAおよびプロストラチンの影響を調べるための実験条件。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＦＡＣＳによるレンチウイルスベクターのタイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した５０μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルの形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に２００μＬの完全培地でウェルを満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を剥離させ、完全培地中に再懸濁させて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後に、フローサイトメトリーのための抗体染色を行った。ＣＡＲ＃１およびＣＡＲ＃２ベクターについては、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）発現のパーセントをＬｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ｓｃＦｖ＋ゲーティングを使用して測定し、ＣＡＲ＃２－Ｔ２ Ａ－ＧＦＰベクターについては、ｓｃＦｖおよびＧＦＰのパーセントをＬｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ｓｃＦｖ＋＆ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ｓｃＦｖ＋またはｓｃＦｖ＋＆ＧＦＰ＋細胞のパーセント、形質導入時の細胞数１．６５×１０４個、ベクター希釈係数および形質導入時のベクター容量に基づいて、以下の式を使用して算出した。
Figure 2023525161000035
結果および考察
２５６Ｕ１ ｓｎＲＮＡを産生細胞によって発現させた場合、３つのＣＡＲベクター産物すべてについて、標準的な産生手順の対照フラスコと比較してタイター増加が観察された（ＣＡＲ＃１については４６倍、ＣＡＲ＃２については２．５倍、ＣＡＲ＃２－Ｔ２Ａ－ＧＦＰについては２．７倍）（図１６）。同様に、３つのベクター産物についてのタイター増加は、ベクター誘導時にプロストラチンを酪酸ナトリウムと共に含めた場合にも観察された（ＣＡＲ＃１については２４倍、ＣＡＲ＃２については２．６倍、ＣＡＲ＃２－Ｔ２Ａ－ＧＦＰについては２倍）。注目すべきことに、２５６Ｕ１ ｓｎＲＮＡの発現を誘導時のプロストラチン添加と組み合わせた振盪フラスコでは、ベクタータイターの最大の増加が達成された（ＣＡＲ＃１については１２５倍、ＣＡＲ＃２については７．９倍、ＣＡＲ＃２－Ｔ２Ａ－ＧＦＰについては４．５倍）。これらの結果は、実施例５で得られた本発明者の以前の観察を裏付けるものであり、治療用ベクター産生において、ポリヌクレオチドと小分子誘導剤とを組み合わせて、一過性のＳＩＮ－ＬＶ産生過程においてベクタータイターを増加させ得ることを初めて示したものである。
［実施例７］
ＥＩＡＶベクター誘導の小分子増強剤としてのプロストラチン
プロストラチンは小分子の非腫瘍促進性プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）モジュレーターであり、がん（Alotaibi et al., 2018）およびアルツハイマー病（Hongpaisan & Alkon, 2007）の治療に有望な治療特性を示している。本発明者らは実施例４において、プロストラチンが振盪フラスコ容量（４０ｍＬ）でＧＦＰ－ＨＩＶ ＬＶタイターを増加させるのに有効であることを示した。ここでは本発明者らは、遺伝子治療に使用される代替的レンチウイルスであるウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）の産生中に、プロストラチンがタイターを増加させるのに有効であることを実証する。
材料および方法
浮遊細胞培養、トランスフェクションおよび第３世代ＳＩＮ－レンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（ＦＳ）培地＋０．１％コレステロール脂質濃縮物（ＣＬＣ）（Ｇｉｂｃｏ）中において、３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器で増殖させた。
ＥＩＡＶ ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、１２５ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコ内で、以下の条件下で産生させた：ＨＥＫ１．６５ｓ細胞を２０ｍＬの無血清培地に播種し、およそ２４時間後に、細胞にＥＩＡＶ－ＧＦＰ－ＣＭＶ、ＥＩＡＶ－Ｇａｇ－ＰｏｌおよびＶＳＶ－Ｇをトランスフェクトした。トランスフェクションは、無血清培地中でＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを、製造元のプロトコール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って混合することによって媒介した。ベクター産生の過程を通じて、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて振盪培養器中でインキュベートした。
振盪フラスコ１～４では、酪酸ナトリウムを最終濃度１０ｍＭで使用してベクター産生を誘導した。酪酸ナトリウム誘導と同時に、プロストラチン（ＤＭＳＯ中に溶解）を振盪フラスコ３および４に加え、最終濃度１１μＭのプロストラチンおよび０．２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯとした［表１１（Ｔａｂｌｅ １０）］。ベクター上清を誘導から約２４時間後に収集し、０．４５μｍシリンジフィルターを使用して濾過した。
Figure 2023525161000036


表10. 振盪フラスコの誘導組成。
レンチウイルスベクタータイター測定アッセイ
ＦＡＣＳによるレンチウイルスベクターのタイター測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を完全培地に播種した。播種からおよそ２４時間後に、完全培地で希釈した５００μＬのベクター＋８μｇ／ｍＬポリブレンによりウェルの形質導入を行い、形質導入後３～６時間の間に１ｍＬの完全培地でウェルを満たした。形質導入細胞を３７℃、５％ ＣＯ２にて３日間インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を剥離させ、フローサイトメトリーのために完全培地中に再懸濁させた。ＧＦＰ発現率は、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔ／ＧＦＰ＋ゲーティングを使用して測定した。タイターは、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ、形質導入時の細胞数１．８５×１０５個、ベクター希釈係数、形質導入時のベクター容量に基づいて算出した。
結果および考察
ＥＩＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターの誘導にプロストラチンを含めたところ、対照タイターと比較して、タイターの２倍への増加がもたらされた（プロストラチンを伴う誘導時の９．１Ｅ＋０５ ＴＵ／ｍＬに対して、プロストラチンなしでは４．４Ｅ＋０５ ＴＵ／ｍＬ）（図１７）。
［実施例８］
ベクター産生中のウイルスベクター構成要素発現の誘導をモデル化するための、種々の恒常的プロモーターからの発現を強化するためのプロストラチンの使用
種々の恒常的プロモーターを、ＧＦＰ発現プラスミド：サイトメガロウイルスプロモーター－ＣＭＶ；ラウス肉腫ウイルスＵ３プロモーター－ＲＳＶ；ＣＡＧ合成プロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーターエキソン／イントロン、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプター）；チャイニーズハムスターＥＦ－１α－１プロモーター－ＣＨＥＦ１；ＧＲＰ７８／ＢｉＰ（ストレス誘導性）プロモーター－ＧＲＰ７８；ユビキチンＣプロモーター－ＵＢＣ；ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター－ＨＩＶ－１ Ｕ３；ヒトフェリチン重鎖プロモーター－ＦＥＲＨ；およびシミアンウイルス４０プロモーター－ＳＶ４０中にクローニングした。
ベクター産生中のウイルスベクター構成要素（例えば、ＡＡＶカプシド、ＬＶゲノムなど）の発現をモデル化するために、浮遊（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各ｐＰｒｏｍｏｔｅｒ－ＧＦＰ ＤＮＡにより、２種類の投入量で別々にトランスフェクトした（代替的な比率での発現をモデル化するため）。トランスフェクション後に、すべての培養物を、酪酸ナトリウム（１０ｍＭ；典型的な誘導処理）により、１１μＭプロストラチンと同時にまたはその非存在下で処理した。トランスフェクションからおよそ２日後に、フローサイトメトリーによって培養物を分析し、トランスフェクション効率およびＧＦＰ発現レベルを評価した。導入遺伝子発現スコアは、各培養物／条件について、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージに蛍光強度中央（ＭＦＩ）値（任意単位）を乗算することによって求めた。これらのデータは図１８にプロットされており、驚いたことに、遺伝子発現の誘導剤として周知である酪酸ナトリウムの存在下であってもプロモーターからの発現誘導が示されている。このことは、プロストラチンが酪酸ナトリウムとは異なる機序でプロモーター活性を誘導し、それ故に必要に応じて両方の化合物を同時に使用し得ることを示唆している。注目されるのは、両方のｐＤＮＡ投入レベルで、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＲＳＶという３つの強力なプロモーターが明確に誘導されることである。このことは、ウイルスベクター構成要素発現システムにおける使用のための既存の強力なプロモーター、例えば、ＬＶ、ＡＡＶおよびＡｄＶ（これらに限定されない）から、より高度の遺伝子発現を誘導するためにプロストラチンを使用することの有用性を示している。例えば、他の研究者らは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を、異種プロモーター、例えば、ＣＭＶやＲＳＶによって個別に発現させ得ることを示している（Vincent et al., 1997; Journal of Virology, pg 1897-1905）。本明細書において観察された、プロストラチンによるこれらの（および他の）プロモーターの誘導を考慮すると、本明細書において例示されたこれらのプロモーターのうちのいずれかに転写性に依存している場合、プロストラチンが任意のウイルスベクターパッケージング構成要素の発現を増加させることを期待することは妥当であり、他の任意のものについても、本明細書に示されているようにプロストラチンによる誘導について容易に試験することができる。
参考文献
Figure 2023525161000037
Figure 2023525161000038

Claims (69)

  1. ウイルスベクターを産生するための方法であって、ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞を、ＰＫＣアクチベーターを含む細胞培養培地中で培養することを含む方法。
  2. ウイルスベクターが自己不活性化ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  3. ＰＫＣアクチベーターが、プロストラチンまたはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  4. ａ）プロストラチンが細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在し、プロストラチンが約０．５から約３２μＭの濃度で存在してもよく；または
    ｂ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートが細胞培養培地中に少なくとも約１ｎＭの濃度で存在し、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートが約１から約３２ｎＭの濃度で存在してもよい、
    請求項３に記載の方法。
  5. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡがレンチウイルスベクター構成要素と共発現され、前記改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  6. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、レンチウイルスベクターゲノムの主要スプライスドナー領域からのスプライシング活性が機能的に除去されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  7. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、レンチウイルスベクターゲノムが、主要スプライスドナー領域で突然変異しているか、または主要スプライスドナー領域および少なくとも１つの潜在的スプライスドナー領域で突然変異している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  8. 細胞培養培地がＨＤＡＣ阻害剤をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  9. ＨＤＡＣ阻害剤が、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤またはヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤である、請求項８に記載の方法。
  10. 脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウムまたは吉草酸、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項９に記載の方法。
  11. ＰＫＣアクチベーターがプロストラチンであり、ＨＤＡＣ阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項８～１０のいずれかに記載の方法。
  12. ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤が、スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項９に記載の方法。
  13. ａ）酪酸ナトリウムが細胞培養培地中に少なくとも約２．５ｍＭの濃度で存在し、酪酸ナトリウムが約２．５から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；
    ｂ）バルプロ酸ナトリウムが細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在し、バルプロ酸ナトリウムが約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；
    ｃ）吉草酸が細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在し、吉草酸が約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；または
    ｄ）スベルアニロヒドロキサム酸が細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在し、スベルアニロヒドロキサム酸が約０．５から約１６μＭの濃度で存在してもよい、
    請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 細胞が、一過性にトランスフェクトされた産生細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  15. 細胞が安定したプロデューサー細胞である、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  16. 細胞が真核細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  17. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. 細胞がヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 細胞が接着性である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  20. 細胞がＨＥＫ２９３細胞またはその派生物である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  21. ＨＥＫ２９３産生細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項２０に記載の方法。
  22. 細胞が浮遊状態にある、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
  23. ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  24. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２３に記載の方法。
  25. レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびビスナレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. ウイルスベクターが、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  27. 細胞培養培地が、容量が少なくとも約５リットルの培地で構成される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  28. 細胞培養培地が無血清である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  29. ウイルスベクター構成要素をコードする少なくとも１つの核酸配列が、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  30. プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  31. ｉ）ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞；および
    ｉｉ）ＰＫＣアクチベーターを含む細胞培養培地
    を含むウイルスベクター産生システム。
  32. ウイルスベクターが自己不活性化ウイルスベクターである、請求項３１に記載のウイルスベクター産生システム。
  33. ＰＫＣアクチベーターが、プロストラチンもしくはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項３１または３２に記載のウイルスベクター産生システム。
  34. ａ）プロストラチンが細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在し、プロストラチンが約０．５から約３２μＭの濃度で存在してもよく；または
    ｂ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートが細胞培養培地中に少なくとも約１ｎＭの濃度で存在し、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートが約１から約３２ｎＭの濃度で存在してもよい、
    請求項３３に記載のウイルスベクター産生システム。
  35. 改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする核酸配列をさらに含み、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡがレンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合する、請求項３１～３４のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  36. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、レンチウイルスベクターゲノムの主要スプライスドナー領域からのスプライシング活性が機能的に除去されている、請求項３１～３５のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  37. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、レンチウイルスベクターゲノムが、主要スプライスドナー領域で突然変異しているか、または主要スプライスドナー領域および少なくとも１つの潜在的スプライスドナー領域で突然変異している、請求項３１～３６のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  38. 細胞培養培地がＨＤＡＣ阻害剤をさらに含む、請求項３１～３７のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  39. ＨＤＡＣ阻害剤が、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤またはヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤である、請求項３８に記載のウイルスベクター産生システム。
  40. 脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウムまたは吉草酸、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項３９に記載のウイルスベクター産生システム。
  41. ＰＫＣアクチベーターがプロストラチンであり、ＨＤＡＣ阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項３８～４０のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  42. ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤が、スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項３９に記載のウイルスベクター産生システム。
  43. ａ）酪酸ナトリウムが細胞培養培地中に少なくとも約２．５ｍＭの濃度で存在し、酪酸ナトリウムが約２．５から約３０ｍＭの濃度であってもよく；
    ｂ）バルプロ酸ナトリウムが細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在し、バルプロ酸ナトリウムが約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；
    ｃ）吉草酸が細胞培養培地中に少なくとも約３ｍＭの濃度で存在し、吉草酸が約３から約３０ｍＭの濃度で存在してもよく；または
    ｄ）スベルアニロヒドロキサム酸が細胞培養培地中に少なくとも約０．５μＭの濃度で存在し、スベルアニロヒドロキサム酸が約０．５から約１６μＭの濃度で存在してもよい、
    請求項４０～４２のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  44. 細胞が、一過性にトランスフェクトされた産生細胞である、請求項３１～４３のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  45. 細胞が安定したプロデューサー細胞である、請求項３１～４３のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  46. 細胞が真核細胞である、請求項３１～４５のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  47. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項４６に記載のウイルスベクター産生システム。
  48. 細胞がヒト細胞である、請求項４７に記載のウイルスベクター産生システム。
  49. 細胞が接着性である、請求項３１～４８のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  50. 細胞がＨＥＫ２９３細胞またはその派生物である、請求項３１～４９のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  51. ＨＥＫ２９３産生細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項５０に記載のウイルスベクター産生システム。
  52. 細胞が浮遊状態にある、請求項３１～４８のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  53. ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３１～５２のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  54. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５３に記載のウイルスベクター産生システム。
  55. レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶおよびビスナレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５４に記載のウイルスベクター産生システム。
  56. ウイルスベクターが、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む、請求項３１～５５のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  57. ウイルスベクター構成要素をコードする少なくとも１つの核酸配列が、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３１～５６のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  58. プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択される、請求項５７に記載のウイルスベクター産生システム。
  59. 細胞培養培地が無血清である、請求項３１～５８のいずれかに記載のウイルスベクター産生システム。
  60. ウイルスベクター産生中のウイルスベクタータイターを増加させるためのＰＫＣアクチベーターの使用。
  61. ＰＫＣアクチベーターがＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用される、請求項６０に記載の使用。
  62. ウイルスベクターが自己不活性化ウイルスベクターである、請求項６０または６１に記載の使用。
  63. ＰＫＣアクチベーターが、プロストラチンまたはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項６０から６２に記載の使用。
  64. ＨＤＡＣ阻害剤が、脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤またはヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤である、請求項６１から６３に記載の使用。
  65. 脂肪族ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム、バルプロ酸ナトリウムまたは吉草酸、それらの類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項６４に記載の使用。
  66. ＰＫＣアクチベーターがプロストラチンであり、ＨＤＡＣ阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項６１から６５に記載の使用。
  67. ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤が、スベルアニロヒドロキサム酸、その類似体、誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項６４に記載の使用。
  68. ウイルスベクター構成要素をコードする核酸配列を含む細胞からウイルスベクターが産生され、核酸配列の少なくとも１つが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧ合成プロモーター、ＣＨＥＦ１プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＨＩＶ－１ Ｕ３プロモーター、およびＦＥＲＨプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項６０～６７のいずれかに記載の使用。
  69. プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびＣＡＧ合成プロモーターからなる群から選択される、請求項６８に記載の使用。
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