CN107312800B - 能敲低内源性pd-1表达的cik及其制备方法与应用 - Google Patents

能敲低内源性pd-1表达的cik及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能敲低内源性PD‑1表达的CIK及其制备方法与应用。本发明提供了制备能敲低内源性PD‑1表达的CIK细胞制剂的方法，包括：A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；B)向步骤A)所得CIK中转入能敲低内源性PD‑1表达的载体，培养13‑16天后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性PD‑1表达的CIK细胞制剂；所述能敲低内源性PD‑1表达的载体上含有多个串联的靶向PD‑1的miRNA的编码基因；所述多个为2‑30个。实验结果表明，该载体可以大大降低CIK细胞中内源PD‑1的表达水平，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。

Description

能敲低内源性PD-1表达的CIK及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于细胞治疗领域，涉及一种能敲低内源性PD-1表达的CIK及其制备方法与应用。
背景技术
CIK(Cytokine-Induced Killer Cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有肿瘤杀伤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，临床上已经有大量的病例证实其肿瘤杀伤活性。
PD-1(程序性死亡受体)是一种表达于T细胞表面的蛋白质分子，当PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合时可抑制下游NF-κB基因的转录，抑制干扰素-γ的分泌，从而抑制T细胞的杀伤活性。PD-L1或PD-L2表达于多种肿瘤细胞，如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌以及尿路上皮癌等肿瘤组织。T细胞表面的PD-1与表达于肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2结合所引起的T细胞细胞毒活性抑制是肿瘤细胞逃避免疫监视和杀伤的重要机制之一。采用PD-1抗体或PD-L1抗体阻断PD-1与PD-L1、PD-L2的结合，可使T细胞的肿瘤杀伤活性不受抑制，从而提高T细胞杀肿瘤的效果。研究证实，采用PD-1单抗静脉输注治疗恶性黑色素瘤、肺鳞癌、霍奇金氏淋巴瘤、结肠癌及肾癌等肿瘤收到良好的治疗效果。然而，静脉输注PD-1抗体所需抗体量大，成本很高；同时血液成分、淋巴组织微环境等成分会影响PD-1抗体与T细胞表面PD-1的结合。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核细胞中存在的一种RNA降解机制。当病原感染真核细胞或者采用人为的方法将双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入到真核细胞后，这些双链RNA被RNase III家族的成员Dicer加工成21-23bp的双链干扰RNA(shortinterfering RNA,siRNA)。每个siRNA随后被整合到RNA诱导的干扰复合体中(RISC)，该蛋白复合体可以将siRNA靶向到与其互补的转录本的响应序列，导致转录本的切割、降解或者转录抑制。小RNA(microRNA,miRNA)是一种可以诱导基因沉默的内源性RNA，它大概22bp长，可以通过RNAi通路来诱导基因沉默。不同于短发夹RNA(shRNA)，miRNA经常以簇的形式被一个转录本编码，该转录本可能有几kb长并含有发夹结构，其表达由RNA聚合酶II启动。柄环结构的pri-miRNA由核RNase III Drosha降解成70bp左右的前体miRNA(pre-miRNA)，该前体miRNA由exportin-5从核内转运到胞浆。随后前体miRNA被Dicer处理成22bp左右的成熟miRNA，然后被整合入含有miRNA的RAN诱导的沉默复合体。成熟的miRNA通过对mRNA切割或者翻译抑制来调控基因的表达。靶基因的切割可以通过人为改变靶基因或者miRNA的序列来完全互补。
发明内容
本发明的目的是提供一种能敲低内源性PD-1表达的CIK及其制备方法与应用。
本发明所提供的制备能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞制剂的方法，具体可包括如下步骤：
(A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；
(B)向步骤(A)所得CIK中转入能敲低内源性PD-1表达的载体，培养后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞制剂；
所述能敲低内源性PD-1表达的载体上含有多个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个。
进一步，所述能敲低内源性PD-1表达的载体为慢病毒载体。
在本发明的一个实施例中，所述能敲低内源性PD-1表达的载体上含有13个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因；所述13个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因具体分别如下：
(1)miRNA-PD1-244：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；
(2)miRNA-PD1-373：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；
(3)miRNA-PD1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；
(4)miRNA-PD1-791：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；
(5)miRNA-PD1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；
(6)miRNA-PD1-811：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；
(7)miRNA-PD1-818：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；
(8)miRNA-PD1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；
(9)miRNA-PD1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；
(10)miRNA-PD1-1466：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；
(11)miRNA-PD1-1483：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；
(12)miRNA-PD1-1697：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；
(13)miRNA-PD1-1960：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示。
更加具体的，所述能敲低内源性PD-1表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。
在所述方法的步骤(A)中，所述“利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK”为利用CD3mAb/CD28mAb磁珠、IFN-γ和IL-2诱导PBMC分化为CIK。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC；所述IFN-γ的用量为400-1200IU/ml体系；所述IL-2的用量为250-900IU/ml体系。
在所述方法的步骤(B)中，所述培养的时间为自转入所述能敲低内源性PD-1表达的载体后培养12天。
在本发明中，所述方法具体可包括如下步骤：
(1)将PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×105-9×105/ml，制成PBMC细胞悬液；所述淋巴细胞培养基中含有终浓度为300IU/ml的IL-2，以及终浓度为1000IU/ml的IFN-γ。
(2)将步骤(1)的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，并添加IFN-γ、IL-2。
进一步，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。
进一步，添加后，所述IFN-γ的终浓度为1000IU/ml；所述IL-2的终浓度为300IU/ml。
(3)培养第3天，将所述能敲低内源性PD-1表达的载体(全载体序列如序列表中序列1或序列2所示)电转入细胞；电转之后，添加含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基继续培养。
其中，进行电转时，细胞浓度为107-109/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞。所述含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基中IFN-γ的终浓度为1000IU/ml，IL-2的终浓度为300IU/ml。
(4)培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。
(5)每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养液，使得细胞密度基本不变。
(6)培养第15天，离心收获细胞，即为所述能敲低内源性PD-1表达的CIK。
利用所述方法制备得到的能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞制剂也属于本发明的保护范围。
所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)制备治疗肿瘤的产品；
(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。
本发明还保护能敲低内源性PD-1表达的载体。
本发明所提供的能敲低内源性PD-1表达的载体为含有多个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因的慢病毒载体；所述多个为2-30个。
具体的，所述能敲低内源性PD-1表达的载体上含有13个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因；所述13个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因具体分别如下：
(1)miRNA-PD1-244：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；
(2)miRNA-PD1-373：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；
(3)miRNA-PD1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；
(4)miRNA-PD1-791：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；
(5)miRNA-PD1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；
(6)miRNA-PD1-811：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；
(7)miRNA-PD1-818：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；
(8)miRNA-PD1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；
(9)miRNA-PD1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；
(10)miRNA-PD1-1466：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；
(11)miRNA-PD1-1483：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；
(12)miRNA-PD1-1697：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；
(13)miRNA-PD1-1960：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示。
更加具体的，所述能敲低内源性PD-1表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。
所述载体在制备所述CIK细胞制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明采用pCDH-MIR质粒表达人工设计的13个靶向PD-1的串联miRNA，并将该质粒导入CIK细胞。实验结果表明，该质粒可以大大降低CIK细胞中内源PD-1的表达水平，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。
附图说明
图1为pCDH-miRNA-PD1及pCDH-miRNA-PD1-GFP载体在CIK细胞中对PD1的干扰作用。
图2为流式检测pCDH-miRNA-PD1载体对CIK细胞中PD1的敲低作用。
图3为流式检测pCDH-miRNA-PD1-GFP载体对CIK细胞中PD1的敲低作用。
图4为流式验证CIK、CIK-pCDH-miRNA-PD1、CIK-pCDH-miRNA-PD1-GFP三组细胞。
图5为CIK-pCDH-miRNA-PD1及CIK-pCDH-miRNA-PD1-GFP细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞的制备与鉴定
一、能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞的制备
1、淋巴细胞培养基的配制：含有终浓度为300IU/ml的IL-2、终浓度为1000IU/ml的IFN-γ的无血清培养基。其中，所述无血清培养基为Lonza公司产品，货号为04-418Q；所述IL-2为peprotech公司产品，货号为200-02；所述IFN-γ为peprotech公司产品，货号为300-02。
2、采集健康人外周血(当然如果采用绝大多数肿瘤患者的外周血也可以)，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用Ficoll淋巴细胞分离液(所述Ficoll淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml)将稀释的外周血进行单核细胞分离；分离得到的PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×105-9×105/ml，制成PBMC细胞悬液。
3、将步骤2的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC，并向培养瓶中添加IFN-γ至其终浓度为1000IU/ml，添加IL-2至其终浓度为300IU/ml。其中，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。
4、培养第3天，采用Celetrix公司的电转仪将PD-1干扰质粒(pCDH-miRNA-PD1或者pCDH-miRNA-PD1-GFP)电转入细胞，电转操作按照公司推荐的实验步骤进行(进行电转时，细胞浓度为107-109/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞)。电转之后，添加含有终浓度为1000IU/ml的IFN-γ和终浓度为300IU/ml的IL-2的无血清培养基继续培养。
其中，两个PD-1干扰质粒，pCDH-miRNA-PD1和pCDH-miRNA-PD1-GFP均含有13个靶向PD-1的串联miRNA的编码基因。
pCDH-miRNA-PD1载体的全序列如序列表中序列1所示。序列1的第234-414位为5’LTR；第458-583位为HIV-1Ψ；第2004-2007位为CMV promoter；第2391-2449位为miRNA-PD1-244；第2529-2587位为miRNA-PD1-373；第2667-2725位为miRNA-PD1-716；第2805-2863位为miRNA-PD1-791；第2943-3001位为miRNA-PD1-801；第3081-3039位为miRNA-PD1-811；第3219-3277位为miRNA-PD1-818；第3357-3415位为miRNA-PD1-904；第3495-3553位为miRNA-PD1-988；第3633-3691位为miRNA-PD1-1466；第3771-3829位为miRNA-PD1-1483；第3909-3967位为miRNA-PD1-1697；第4047-4105位为miRNA-PD1-1960；第4238-4825位为WPRE；第5193-5373位为3’LTR；第6940-7800位为AmpR。
pCDH-miRNA-PD1-GFP载体的全序列如序列表中序列2所示。第234-414位为5’LTR；第458-583位为HIV-1Ψ；第2004-2007位为CMV promoter；第2339-3058位为EmGFP；第3146-3204位为miRNA-PD1-244；第3284-3342位为miRNA-PD1-373；第3422-3480位为miRNA-PD1-716；第3560-3618位为miRNA-PD1-791；第3698-3756位为miRNA-PD1-801；第3836-3894位为miRNA-PD1-811；第3974-4032位为miRNA-PD1-818；第4112-4170位为miRNA-PD1-904；第4250-4308位为miRNA-PD1-988；第4388-4446位为miRNA-PD1-1466；第4526-4584位为miRNA-PD1-1483；第4664-4722位为miRNA-PD1-1697；第4802-4860位为miRNA-PD1-1960；第4993-5580位为WPRE；第5948-6128位为3’LTR；第7695-8555位为AmpR。
5、培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基(配方同上)，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。
6、每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养基(配方同上)，使得细胞密度基本不变。
7、培养第15天，离心收获CIK细胞。CIK转染了pCDH-miRNA-PD1或者pCDH-miRNA-PD1-GFP质粒之后，分别记为CIK-pCDH-miRNA-PD1和CIK-pCDH-miRNA-PD1-GFP。
二、能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞的鉴定
1、验证步骤一最终所得细胞能敲低内源性PD-1表达
(1)Western blot检测步骤一所获得的CIK细胞内源PD-1表达。1500rpm离心收集未转染任何质粒的CIK细胞、分别转染pCDH-miRNA-PD1和pCDH-miRNA-PD1-GFP质粒的CIK细胞(即CIK-pCDH-miRNA-PD1和CIK-pCDH-miRNA-PD1-GFP)上清，细胞沉淀按照每105个细胞加入100μl RIPA裂解液(配方：50mM Tris，150mM NaCl，1％(v/v)Triton X-100，1％(w/v)sodium deoxycholate，0.1％(w/v)SDS)并吹打均匀，室温裂解15分钟，然后12000g离心5分钟，取上清并加入SDS-PAGE上样缓冲液，然后进行SDS-PAGE电泳及Western blot分析，所用一抗为小鼠抗PD-1抗体(Santa Cruz Biotechnology公司，货号SC-73402)，二抗为HRP标记兔抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology公司，货号SC-358914)。
结果如图1所示，由图可见：CIK转染了pCDH-miRNA-PD1或者pCDH-miRNA-PD1-GFP质粒之后，与CIK对照相比，内源性PD-1蛋白表达水平至少下降了95％以上。
(2)取上述步骤一收获的CIK、CIK-pCDH-miRNA-PD1、CIK-pCDH-miRNA-PD1-GFP各300μl放入1.5ml EP管中，300g离心5分钟，弃上清，加入500μl含有0.5％多聚甲醛的PBS悬浮细胞并室温保持10分钟。然后300g离心5分钟，弃上清，加入300μl PBS，用移液器吹打并悬浮细胞，然后加入5μl相应的荧光抗体，室温避光孵育20分钟之后，用流式细胞仪进行检测。所用荧光抗体APC-anti-human PD-1antibody为Biolegend公司产品，货号为329953。
结果如图2和图3所示，由图可见：CIK转染了pCDH-miRNA-PD1或者pCDH-miRNA-PD1-GFP质粒之后，与CIK对照相比，细胞表面表达的内源性内源性PD-1蛋白表达水平至少下降到了检测不到的水平。
2、验证步骤一最终所得细胞为CIK细胞
处理细胞步骤同上述1(2)中所述，所用荧光抗体PE-anti-CD8antibody、FITC-anti CD4antibody、APC-anti-CD56antibody及PerCP-anti-CD3antibody为Biolegend公司产品，货号分别为300907、357405、362503、300325。
结果如图4所示，CIK、CIK-pCDH-miRNA-PD1、CIK-pCDH-miRNA-PD1-GFP三组细胞培养都获得了成功，CD8+细胞超过80％，CD4+细胞不超过20％，CD56+细胞超过50％。三组细胞的分子表型类似，因此只给出了CIK-pCDH-miRNA-PD1的结果。
实施例2、实施例1制备的能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果检测
首先将人肿瘤细胞系SKOV3接种到艾森活细胞检测站的细胞培养板上，12小时之后，待细胞贴壁生长，加入一定数量的CIK、CIK-pCDH-miRNA-PD1、CIK-pCDH-miRNA-PD1-GFP细胞，形成不同的效靶比。继续培养48小时，检测各种CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
结果如图5所示，由图可见：转染了pCDH-miRNA-PD1或pCDH-miRNA-PD1-GFP质粒的CIK细胞对肿瘤的杀伤活性显著提高。
<110> 北京瑞健科技有限公司
<120> 能敲低内源性PD-1表达的CIK及其制备方法与应用
<130> GNCLN171462
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccgctga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt 1800
taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc 1860
aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaattcaaaa ttttatcgat 1920
actagtatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 1980
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 2040
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 2100
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 2160
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgc tagctctggc 2220
taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggagt 2280
cccaagctgg ctagttaagc tatcaacaag tttgtacaaa aaagcaggct ttaaagggag 2340
gtagtgagtc gaccagtgga tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg ttagcacgaa 2400
gctctccgat ggttttggcc actgactgac catcggagct tcgtgctaac aggacacaag 2460
gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccagatc ctggaggctt gctgaaggct 2520
gtatgctgtc atgtggaagt cacgcccgtg ttttggccac tgactgacac gggcgtcttc 2580
cacatgacag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg cccagatcct 2640
ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgtagt ccacagagaa cacaggcgtt ttggccactg 2700
actgacgcct gtgttctgtg gactacagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 2760
acaaatggcc cagatcctgg aggcttgctg aaggctgtat gctgtactcc gtctgctcag 2820
ggacagtttt ggccactgac tgactgtccc tgcagacgga gtacaggaca caaggcctgt 2880
tactagcact cacatggaac aaatggccca gatcctggag gcttgctgaa ggctgtatgc 2940
tgaatggtgg catactccgt ctggttttgg ccactgactg accagacgga atgccaccat 3000
tcaggacaca aggcctgtta ctagcactca catggaacaa atggcccaga tcctggaggc 3060
ttgctgaagg ctgtatgctg taggaaagac aatggtggca tgttttggcc actgactgac 3120
atgccacctg tctttcctac aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat 3180
ggcccagatc ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgat tccgctagga aagacaatgg 3240
ttttggccac tgactgacca ttgtctccta gcggaatcag gacacaaggc ctgttactag 3300
cactcacatg gaacaaatgg cccagatcct ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgaaga 3360
gcagtgtcca tcctcaggtt ttggccactg actgacctga ggatacactg ctcttcagga 3420
cacaaggcct gttactagca ctcacatgga acaaatggcc cagatcctgg aggcttgctg 3480
aaggctgtat gctgttctcc tgaggaaatg cgctggtttt ggccactgac tgaccagcgc 3540
atcctcagga gaacaggaca caaggcctgt tactagcact cacatggaac aaatggccca 3600
gatcctggag gcttgctgaa ggctgtatgc tgtaggcctg cagggagcag atagttttgg 3660
ccactgactg actatctgct ctgcaggcct acaggacaca aggcctgtta ctagcactca 3720
catggaacaa atggcccaga tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg cttccctgaa 3780
acttctctag ggttttggcc actgactgac cctagagatt tcagggaagc aggacacaag 3840
gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccagatc ctggaggctt gctgaaggct 3900
gtatgctgta ggatgtccct ctcccgagtg ttttggccac tgactgacac tcgggaggga 3960
catcctacag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg cccagatcct 4020
ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgtgca gtgtgtggat gtgaggagtt ttggccactg 4080
actgactcct cacacacaca ctgcacagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 4140
acaaatggcc cagatctggc cgcactcgag atatctagac ccagctttct tgtacaaagt 4200
ggttgatcta gagggcccgc ggttcgctga tcccgggaat caacctctgg attacaaaat 4260
ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 4320
tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 4380
gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 4440
cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 4500
tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 4560
cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 4620
gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 4680
gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 4740
cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtctccgc cttcgccctc agacgagtcg 4800
gatctccctt tggccgcctc cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc 4860
tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca 4920
acgatgtcaa gaattggaac gctgacgtca tcaacccgct ccaaggaatc gcgggcccag 4980
tgtcactagg cgggaacacc cagcgcgcgt gcgcctggca ggaagatggc tgtgagggac 5040
aggggagtgg cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa tcaccataaa 5100
cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac ttggatcctc 5160
tgaattcttc gattctgctt tttgcttcta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 5220
cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 5280
gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 5340
gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc 5400
agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag 5460
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 5520
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct 5580
agctatcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 5640
tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc 5700
tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctagactttt gcagagacgg 5760
cccaaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 5820
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 5880
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 5940
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 6000
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 6060
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 6120
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 6180
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 6240
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 6300
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 6360
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 6420
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 6480
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 6540
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 6600
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 6660
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 6720
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 6780
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 6840
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 6900
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 6960
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 7020
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 7080
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 7140
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 7200
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 7260
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 7320
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 7380
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 7440
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 7500
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 7560
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 7620
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 7680
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 7740
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 7800
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 7860
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 7920
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 7980
tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 8040
gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 8100
tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 8160
gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 8220
aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 8280
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 8340
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa 8400
gctg 8404
<210> 2
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<220>
<223>
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acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
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tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
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cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
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cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
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ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
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tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 2040
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gcccagatcc tggaggcttg ctgaaggctg tatgctgaat ggtggcatac tccgtctggt 3720
tttggccact gactgaccag acggaatgcc accattcagg acacaaggcc tgttactagc 3780
actcacatgg aacaaatggc ccagatcctg gaggcttgct gaaggctgta tgctgtagga 3840
aagacaatgg tggcatgttt tggccactga ctgacatgcc acctgtcttt cctacaggac 3900
acaaggcctg ttactagcac tcacatggaa caaatggccc agatcctgga ggcttgctga 3960
aggctgtatg ctgattccgc taggaaagac aatggttttg gccactgact gaccattgtc 4020
tcctagcgga atcaggacac aaggcctgtt actagcactc acatggaaca aatggcccag 4080
atcctggagg cttgctgaag gctgtatgct gaagagcagt gtccatcctc aggttttggc 4140
cactgactga cctgaggata cactgctctt caggacacaa ggcctgttac tagcactcac 4200
atggaacaaa tggcccagat cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctgt tctcctgagg 4260
aaatgcgctg gttttggcca ctgactgacc agcgcatcct caggagaaca ggacacaagg 4320
cctgttacta gcactcacat ggaacaaatg gcccagatcc tggaggcttg ctgaaggctg 4380
tatgctgtag gcctgcaggg agcagatagt tttggccact gactgactat ctgctctgca 4440
ggcctacagg acacaaggcc tgttactagc actcacatgg aacaaatggc ccagatcctg 4500
gaggcttgct gaaggctgta tgctgcttcc ctgaaacttc tctagggttt tggccactga 4560
ctgaccctag agatttcagg gaagcaggac acaaggcctg ttactagcac tcacatggaa 4620
caaatggccc agatcctgga ggcttgctga aggctgtatg ctgtaggatg tccctctccc 4680
gagtgttttg gccactgact gacactcggg agggacatcc tacaggacac aaggcctgtt 4740
actagcactc acatggaaca aatggcccag atcctggagg cttgctgaag gctgtatgct 4800
gtgcagtgtg tggatgtgag gagttttggc cactgactga ctcctcacac acacactgca 4860
caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcccagat ctggccgcac 4920
tcgagatatc tagacccagc tttcttgtac aaagtggttg atctagaggg cccgcggttc 4980
gctgatcccg ggaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 5040
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 5100
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 5160
tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 5220
gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 5280
ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 5340
ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 5400
ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 5460
ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 5520
cttccgcgtc tccgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttggcc gcctccccgc 5580
ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa 5640
gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgat gtcaagaatt ggaacgctga 5700
cgtcatcaac ccgctccaag gaatcgcggg cccagtgtca ctaggcggga acacccagcg 5760
cgcgtgcgcc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc tgcaatattt 5820
gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg gatttgggaa 5880
tcttataagt tctgtatgag accacttgga tcctctgaat tcttcgattc tgctttttgc 5940
ttctactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg 6000
gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg 6060
tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat 6120
ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg 6180
aatatcagag agtgagagga acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 6240
tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 6300
caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc 6360
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 6420
tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 6480
ggcttttttg gaggcctaga cttttgcaga gacggcccaa attcgtaatc atggtcatag 6540
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 6600
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 6660
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 6720
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 6780
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 6840
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 6900
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 6960
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 7020
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 7080
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 7140
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 7200
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 7260
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 7320
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 7380
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 7440
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 7500
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 7560
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 7620
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 7680
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 7740
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 7800
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 7860
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 7920
tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 7980
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 8040
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 8100
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 8160
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 8220
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 8280
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 8340
actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 8400
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 8460
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 8520
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 8580
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 8640
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 8700
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg 8760
cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 8820
tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 8880
gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 8940
atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg 9000
ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 9060
cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 9120
cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagctg 9159

Claims (7)

1.一种制备能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞制剂的方法，包括如下步骤：
(A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；
(B)向步骤(A)所得CIK中转入能敲低内源性PD-1表达的载体，培养后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞制剂；
所述能敲低内源性PD-1表达的载体为慢病毒载体；
所述能敲低内源性PD-1表达的载体上含有13个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因；所述13个串联的靶向PD-1的miRNA的编码基因分别如下：
(1)miRNA-PD1-244：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位所示；
(2)miRNA-PD1-373：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位所示；
(3)miRNA-PD1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位所示；
(4)miRNA-PD1-791：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位所示；
(5)miRNA-PD1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位所示；
(6)miRNA-PD1-811：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位所示；
(7)miRNA-PD1-818：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位所示；
(8)miRNA-PD1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位所示；
(9)miRNA-PD1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位所示；
(10)miRNA-PD1-1466：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位所示；
(11)miRNA-PD1-1483：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位所示；
(12)miRNA-PD1-1697：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位所示；
(13)miRNA-PD1-1960：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位所示；
所述能敲低内源性PD-1表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述细胞因子为CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ和IL-2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(B)中，所述培养的时间为自转入所述能敲低内源性PD-1表达的载体后培养12天。
4.利用权利要求1-3中任一所述方法制备得到的能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞制剂。
5.权利要求4所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用：
(1)制备治疗肿瘤的产品；
(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。
6.能敲低内源性PD-1表达的载体，其特征在于：所述能敲低内源性PD-1表达的载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。
7.权利要求6所述的载体在制备权利要求4所述CIK细胞制剂中的应用。
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