JP2015524264A - 遺伝子発現の下方制御のための核酸 - Google Patents

Abstract

ヘアピン構造を形成し、遺伝子発現を下方制御するのに使用しうる組換え核酸分子が提供される。例えば、核酸分子は、ｍｉｒ−１６遺伝子に由来するフランキング配列およびローワーステムループ配列；アンチセンス標的配列；ｍｉｒ−３０ループ配列；アンチセンス標的配列の相補体；ならびにｍｉｒ−１６配列と相補的なローワーステムループを含みうる。また、このような組換え核酸分子を使用して細胞内の遺伝子発現を下方制御するための方法も提供される。

Description

本出願は、２０１２年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６７２，４４１号の優先権の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

配列表の組込み
３ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定される）であり、２０１３年９月９日に作成された、「ＵＧＥＮ．Ｐ００１７ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたファイル内に含有される配列表は、電子提出により本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。

１．本発明の分野
本発明は一般に、分子生物学および生化学の分野に関する。より特定すれば、本発明は、阻害性ＲＮＡ分子を発現させるための方法および組成物に関する。

２．関連技術についての記載
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、植物および動物のほか、ヒトの進化において保存された自然発生の生物学的過程である。ＲＮＡｉを介する遺伝子発現の抑制は、ｍＲＮＡ分子の配列特異的な分解により、またはｍＲＮＡ分子の翻訳に干渉することにより生じる。これらの２つの機構は、ｍＲＮＡ内のそれらの相補的配列を認識する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子により媒介される。天然のＲＮＡｉ経路について手短に記載すると、ＲＮＡｉ遺伝子は、転写されると、一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）分子を産生させる。核内では、酵素であるＤｒｏｓｈａが、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの構造的エレメントを認識および切断し、これにより、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｍｉ−ＲＮＡ）を産生させる。エクスポルチン５が、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを細胞質へと輸送し、そこで、酵素であるＤｉｃｅｒが、分子をさらに切断する結果として、ｍｉＲＮＡ二重鎖がもたらされる。次いで、ｍｉＲＮＡ二重鎖のうちの半分、すなわち、一方の鎖が選択され、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）へと組み込まれる。選択されたｍｉＲＮＡ二重鎖の鎖が、標的ｍＲＮＡと１００％の相補性でない場合には、ｍＲＮＡの切断が生じる。選択されたｍｉＲＮＡ二重鎖の鎖が、標的ｍＲＮＡと１００％相補的でない場合、ｍＲＮＡは分解されない場合もあるが、ＲＩＳＣは、リボソーム機能に干渉し、これにより、タンパク質の翻訳を減少させる。いずれの場合にも、結果として生じる、最終的なタンパク質合成の減少を、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）と称する（ＨｅおよびＨａｎｎｏｎ、２００４年）。

Ｈｅ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ５：５２２−５３１， ２００４．

今や、ＲＮＡｉを使用することによる遺伝子発現の下方制御は、感染性疾患、がんのほか、また、遺伝性の遺伝子疾患に対処するための有望な治療的ツールとしても探索されている。しかし、本分野における著明な進歩にもかかわらず、このような戦略により達成される遺伝子発現の低減の大きさは、臨床的有効性をもたらすには不十分であることが多い。したがって、遺伝子発現のターゲティングされた低減のための著明で持続可能な方法は、依然として強く必要とされている。

第１の実施形態では、分子が一本鎖とされ、適切な条件下で、ヘアピン構造、すなわち、アンチセンス標的配列を相補的な配列とハイブリダイズさせたヘアピン構造を形成するように、アンチセンス標的配列およびアンチセンス標的配列と相補的な配列を含む組換え核酸分子が提供される。一部の態様では、分子は、ヘアピン構造を形成しうるＲＮＡ分子である。他の態様では、分子は、ＲＮＡとして発現させると、ヘアピン構造を形成しうるＤＮＡ分子である。例えば、アンチセンス標的配列は、２２ヌクレオチドの長さであることが可能であり、相補的な配列は、２２ヌクレオチドの長さであることが可能であり、アンチセンス標的配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含みうる。

したがって、一部の実施形態では、５’から３’へかつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、（ａ）ｍｉｒ−１６のフランキング配列（例えば、ヒトＭＩＲ１６−１またはＭＩＲ１６−２に由来するフランキング配列）、（ｂ）ｍｉｒ−１６遺伝子に由来する配列（例えば、ヒトＭＩＲ１６−１またはＭＩＲ１６−２に由来する配列）を含む第１のローワーステム配列（ｌｏｗｅｒ ｓｔｅｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、（ｄ）ｍｉｒ−３０遺伝子に由来する配列を含むループ配列（例えば、ヒトＭＩＲ３０Ａ遺伝子）、（ｅ）（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き（ｃ）の配列と相補的なセンス配列、（ｆ）（ｂ）の配列と相補的な第２のローワーステム配列、および（ｇ）第２のフランキング配列を含む、組換え核酸分子が提供される。

一部の態様では、実施形態の組換え核酸配列は、（ａ）ヒトＭＩＲ１６−１コード配列（参照により本明細書に組み込まれる、ＮＣＢＩ ＮＲ＿０２９４８６）を挟む配列など、ｍｉｒ−１６のフランキング配列を含む。一部の態様では、ｍｉｒ−１６のフランキング配列は、ヒトＭＩＲ１６遺伝子に由来する８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７ヌクレオチド以上を含む。例えば、配列は、配列番号１の配列、または配列番号１と同一であるが、１つ、２つ、もしくは３つの核酸の欠失もしくは置換を含む配列を含みうる。ある特定の態様では、ｍｉｒ−１６のフランキング配列は、配列番号１の配列からなる。

さらなる態様では、実施形態の組換え核酸配列は、（ｂ）ヒトＭＩＲ１６−１遺伝子に由来する配列など、ｍｉｒ−１６に由来する配列を含む第１のローワーステム配列を含む。例えば、第１のローワーステム配列は、ヒトＭＩＲ１６−１遺伝子配列に由来する８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド（例えば、配列番号２の１１ヌクレオチドを含む配列）を含みうる。ある特定の態様では、第１のローワーステム配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６の配列、または前出のうちのいずれかと同一であるが、１つ、２つ、もしくは３つの核酸の欠失もしくは置換を含む配列を含む。一部の態様では、第１のローワーステム配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の配列からなる。

またさらなる態様では、実施形態の組換え核酸配列は、２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列を含む。本明細書で使用される「アンチセンス標的配列」とは、哺乳動物などの生物に由来する遺伝子コード配列と相補的な核酸配列を指す。例えば、配列は、哺乳動物標的遺伝子のエクソンと相補的でありうる。ある特定の態様では、アンチセンス標的配列は、ｍＲＮＡ配列（例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のｍＲＮＡ配列、３’ＵＴＲ内のｍＲＮＡ配列、またはコード配列内のｍＲＮＡ配列）と相補的である。またさらなる態様では、アンチセンス標的配列は、ウイルス、細菌、または原虫（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属）などの微生物に由来する遺伝子と相補的である。ターゲティングされうる哺乳動物遺伝子の例は、限定せずに述べると、リボヌクレオチドレダクターゼ（例えば、ヒトＭ２サブユニット）、プロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ｋｅｘｉｎ９型（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９）（ＰＣＳＫ９）、トランスフェリン受容体サブタイプ２（ＴＦＲ２）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、プロテインＣ、ターゲティング膜貫通セリンプロテアーゼ６（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ， ｓｅｒｉｎｅ ６）（Ｔｍｐｒｓｓ６）、キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、およびタンパク質キナーゼＮ３（ＰＫＮ３）を含む。ターゲティングされうるウイルスの非限定的な例は、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ；例えば、ＲＳＶのヌクレオカプシド遺伝子）、ＨＩＶウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス、またはヘルペスウイルスに由来するゲノムまたはコード配列を含む。標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡまたはウイルスゲノム）を選択したら、当技術分野で十分に確立されている技法（例えば、インターネットでｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｒｎａｉ／ｐｕｂｌｉｃ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｕｌｅｓを参照されたい）を使用して、特異的な標的配列（アンチセンス標的配列と相補的な）を選択することができる。実施形態に従う方法および構築物によりターゲティングされうる遺伝子のさらなる非限定的な例は、ｂｃｒ／ａｂｌ融合体およびＰＭＬ／ＲａＬアルファがん遺伝子（例えば、抗白血病治療のための）を含む。

一部の態様では、実施形態の組換え核酸配列は、（ｄ）ｍｉｒ−３０ループ配列などのループ配列を含む。例えば、配列は、ヒトＭＩＲ３０Ａ遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号ＮＲ＿０２９５０４；配列番号９）に由来するループ配列でありうる。さらなる態様では、ループ配列（ｄ）は、配列番号９の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの断片（例えば、配列番号７の配列を含む断片）を含む。したがって、ある特定の態様では、ループ配列（ｄ）は、配列番号７の配列を含むか、またはこれからなる。

またさらなる態様では、実施形態の組換え核酸配列は、（ｅ）アンチセンス標的配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き（ｃ）のアンチセンス標的配列と相補的なセンス配列（例えば、アンチセンス標的配列と相補的でない２２ヌクレオチドの配列のうちの１または２ヌクレオチド）を含む。例えば、ミスマッチは、センス配列の８、９、１０、１１、１２、１３、または１４位に（例えば、１１位に）位置するなど、センス配列の８〜１４位に位置しうる。さらなる態様では、ミスマッチは、センス配列の終端の３’位（２２位）に位置しうる。したがって、一部の態様では、実施形態の組換え核酸は、（ｉ）センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ（例えば、１１位における）、および（ｉｉ）センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む。

またさらなる態様では、実施形態の組換え核酸配列は、（ｆ）第１のローワーステム配列（ｂ）の全部または一部と相補的な第２のローワーステム配列を含む。したがって、一部の態様では、第２のローワーステム配列は、第１のステムループ配列と相補的な、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。したがって、ある特定の態様では、第２のローワーステムループ配列は、ヒトＭＩＲ１６−１遺伝子に由来する配列など、ｍｉｒ−１６配列と相補的な配列を含む。例えば、第２のローワーステム配列は、ヒトＭＩＲ１６−１遺伝子配列と相補的な８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド（例えば、配列番号２の１１ヌクレオチドと相補的な配列）を含みうる。さらなる態様では、第２のローワーステム配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と相補的な配列を含む。一部の態様では、第２のローワーステム配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と相補的な配列からなる。

なおまたさらなる態様では、実施形態の組換え核酸配列は、第２のローワーステムループ配列に対して３’側に位置する、第２のフランキング配列（ｇ）を含む。一部の態様では、第２のフランキング配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド以上の長さでありうる。いくつかの場合には、第２のフランキング配列は、ヒトマイクロＲＮＡ（ＭＩＲ：ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）遺伝子に由来する配列である。例えば、配列は、ＭＩＲ遺伝子の３’側フランキング配列（すなわち、コードされたＲＮＡステムループの３’側に位置する配列）に由来しうる。一部の好ましい態様では、第２のフランキング配列は、ｍｉｒ−１６遺伝子に由来しないか、またはｍｉｒ−１６のフランキング配列（ａ）と相補的ではない。

上記で指し示した通り、一部の態様では、実施形態の組換え核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。なおさらなる態様では、分子は、Ｃ５−エチニルロックト核酸（ＬＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシタール核酸（ＨＮＡ）、またはトレオフラノシル核酸（ＴＮＡ）を含む１または複数のヌクレオチド位置からなりうる。一部の態様では、組換え核酸は、プラスミド内または発現ベクター内に含まれるＤＮＡ配列などのＤＮＡ分子である。例えば、実施形態の組換え核酸に作動可能に連結した発現制御配列を含み、これにより、本実施形態に従うＲＮＡ分子の発現をもたらす発現ベクターが提供される。一部の態様では、発現ベクターは、プロモーター（例えば、真核生物Ｐｏｌ Ｉプロモーター、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、またはＰｏｌ ＩＩＩプロモーター）配列、イントロン配列、エンハンサー配列、ポリＡシグナル配列、および／または転写終結配列を含む。実施形態に従う使用のためのプロモーターの非限定的な例は、誘導性プロモーター（例えば、薬物誘導性プロモーターまたは薬物抑制的プロモーター）、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、細胞系統特異的プロモーター、およびサーカディアンプロモーターを含む。実施形態に従う使用のための発現ベクターの例は、限定せずに述べると、プラスミド、エピソームベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶベースのベクター）、およびポックスウイルスベクターを含む。

なおさらなる態様では、実施形態に従う発現ベクターは、１または複数のさらなる遺伝子エレメントをさらにコードする。発現ベクター内に含まれうるさらなる遺伝子エレメントの例は、限定せずに述べると、薬物耐性マーカー遺伝子もしくは薬物感受性マーカー遺伝子、レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質をコードする）、または治療用遺伝子を含む。

ある特定の態様では、実施形態の核酸分子は、本明細書で提示される配列の２つの以上の反復を含む。例えば、分子は、配列（ａ）〜（ｇ）の少なくとも２、３、４、５、６以上の反復を含みうる。一部の態様では、このような反復を、スペーサー配列で隔てる。発現ベクターの場合、反復は、共通のプロモーターから発現させることもでき、２つ以上の異なるプロモーターの制御下とすることもできる。したがって、ある特定の態様では、実施形態の核酸配列の２つ以上のコピーは、ポリシストロニックの転写物を形成する。

さらなる実施形態では、実施形態の組換え核酸分子を含む宿主細胞が提供される。例えば、宿主細胞は、原核生物の宿主細胞の場合もあり、哺乳動物細胞など、真核生物の宿主細胞の場合もある。いくつかの場合には、宿主細胞は、実施形態の発現ベクターを含む。宿主細胞は、例えば、核酸を一過性にトランスフェクトされる場合もあり、安定的な発現ベクター（例えば、ゲノム組込みベクターまたはエピソームベクター）を含む場合もある。ある特定の態様では、宿主細胞は、幹細胞（例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）、形質転換された細胞系統に由来する細胞、または初代血液細胞などの初代細胞である。特定の態様では、宿主細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはマクロファージである。

またさらなる実施形態では、細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、実施形態の核酸分子を細胞内で発現させるステップを含み、アンチセンス標的配列（ｃ）が、遺伝子のセンス鎖と相補的である方法が提供される。さらなる態様では、細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、（ｉ）遺伝子のセンス鎖と相補的なアンチセンス標的配列（ｃ）を含む、実施形態の核酸分子を得るステップと、（ｉｉ）このようにして細胞内で得られた核酸分子を発現させるステップとを含む方法が提供される。例えば、実施形態の核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、発現ベクター）として細胞へと導入する（例えば、トランスフェクトする）ことができる。一部の態様では、細胞は、培養物（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの）中にあり、他の態様では、細胞は、生物中にある（ｉｎ ｖｉｖｏ法）。

一部の態様では、実施形態の方法は、実施形態の核酸分子を発現させる細胞を選択または単離するステップをさらに含む。例えば、核酸を発現させる細胞は、核酸分子の発現またはレポーター遺伝子の発現を検出することにより選択することができる。さらなる態様では、核酸を含む細胞は、薬物選択（すなわち、核酸分子が薬物選択マーカーを含む薬物選択）を使用して選択することができる。

またさらなる態様では、方法は、核酸分子を発現させる細胞を、ヒトなどの生物へと移植するステップを含みうる。いくつかの場合には、核酸分子を発現させる細胞の選択は、有効量の選択用薬物を細胞を含む生物へと投与することによるなど、ｉｎ ｖｉｖｏにおける選択でありうる。

本明細書で使用される「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、「１または複数の」を意味する場合がある。本特許請求の範囲で使用される通り、「〜を含む」という語と共に使用される場合の「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」という語は、「１または複数の」を意味する場合がある。

特許請求の範囲における「または」という用語は、代替物だけを指すかまたは代替物が相互に排他的であることが明示的に指し示されない限り、「および／または」を意味するように使用するが、本開示は、代替物だけを指す定義および「および／または」を支持する。本明細書で使用される「別の」は、「少なくとも第２のまたはそれを超える序数の」を意味しうる。

本出願を通して、「約」という用語は、値が、値または研究対象の間に存在するばらつきを決定するのに援用されるデバイス、方法に固有の誤差のばらつきを含むことを指し示すように使用する。

本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な記載から明らかとなろう。しかし、当業者には、この詳細な記載から、本発明の趣旨および範囲内の多様な変化および改変が明らかとなるので、詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を指し示すものであるが、例示だけを目的として示されることを理解されたい。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに裏付けるために組み入れられる。本発明は、これらの図面のうちの１または複数を参照することにより、本明細書で提示される具体的な実施形態についての詳細な記載と組み合わせて、よりよく理解することができる。

図１は、実施形態の組換え核酸分子の例についての概略表示を示す。番号付けは、センス配列（アンチセンス標的配列と部分的に相補的な）に対する核酸の位置を指し示す。

図２Ａ〜Ｃは、多様なＣＣＲ５ノックダウンレンチベクター構築物についてのフローサイトメトリー解析である。左側の散布図は、Ｘ軸（水平軸）上にＧＦＰ蛍光のレベルを示す。Ｙ軸（垂直軸）は、ＣＣＲ５蛍光のレベルである。両方の軸上の第１の対数区間は、負である。各散布図は、単一のレンチベクター構築物の散布図であり、２つの異なる集団であるＲ２（非形質導入集団）、およびＲ３（形質導入集団）を示す。対照試料（ＧＦＰ）は、ＣＣＲ５ノックダウンを伴わない、ただＧＦＰだけのレンチベクターである。（ＣＣＲ５−７）は、ＧＦＰのほか、ｍｉＲＮＡをターゲティングする旧来のｍｉｒ−３０ベースのＣＣＲ５を発現させるレンチベクターである（ここで、７は、任意に７と標識された標的配列の標識である）。（ＣＣＲ５−７−７）は、２つのｍｉｒ−３０ベースのｍｉＲＮＡを伴うレンチベクターを指し示す。（ＣＣＲ５−７ ｍｉｒ−１６）は、新世代のハイブリッド体ｍｉＲＮＡを含有するレンチベクターを表示する。緑色のＧＦＰ平均値は、Ｒ３の各場合における形質導入集団のＧＦＰ平均である。 図２Ａ〜Ｃは、多様なＣＣＲ５ノックダウンレンチベクター構築物についてのフローサイトメトリー解析である。左側の散布図は、Ｘ軸（水平軸）上にＧＦＰ蛍光のレベルを示す。Ｙ軸（垂直軸）は、ＣＣＲ５蛍光のレベルである。両方の軸上の第１の対数区間は、負である。各散布図は、単一のレンチベクター構築物の散布図であり、２つの異なる集団であるＲ２（非形質導入集団）、およびＲ３（形質導入集団）を示す。対照試料（ＧＦＰ）は、ＣＣＲ５ノックダウンを伴わない、ただＧＦＰだけのレンチベクターである。（ＣＣＲ５−７）は、ＧＦＰのほか、ｍｉＲＮＡをターゲティングする旧来のｍｉｒ−３０ベースのＣＣＲ５を発現させるレンチベクターである（ここで、７は、任意に７と標識された標的配列の標識である）。（ＣＣＲ５−７−７）は、２つのｍｉｒ−３０ベースのｍｉＲＮＡを伴うレンチベクターを指し示す。（ＣＣＲ５−７ ｍｉｒ−１６）は、新世代のハイブリッド体ｍｉＲＮＡを含有するレンチベクターを表示する。緑色のＧＦＰ平均値は、Ｒ３の各場合における形質導入集団のＧＦＰ平均である。 図２Ａ〜Ｃは、多様なＣＣＲ５ノックダウンレンチベクター構築物についてのフローサイトメトリー解析である。左側の散布図は、Ｘ軸（水平軸）上にＧＦＰ蛍光のレベルを示す。Ｙ軸（垂直軸）は、ＣＣＲ５蛍光のレベルである。両方の軸上の第１の対数区間は、負である。各散布図は、単一のレンチベクター構築物の散布図であり、２つの異なる集団であるＲ２（非形質導入集団）、およびＲ３（形質導入集団）を示す。対照試料（ＧＦＰ）は、ＣＣＲ５ノックダウンを伴わない、ただＧＦＰだけのレンチベクターである。（ＣＣＲ５−７）は、ＧＦＰのほか、ｍｉＲＮＡをターゲティングする旧来のｍｉｒ−３０ベースのＣＣＲ５を発現させるレンチベクターである（ここで、７は、任意に７と標識された標的配列の標識である）。（ＣＣＲ５−７−７）は、２つのｍｉｒ−３０ベースのｍｉＲＮＡを伴うレンチベクターを指し示す。（ＣＣＲ５−７ ｍｉｒ−１６）は、新世代のハイブリッド体ｍｉＲＮＡを含有するレンチベクターを表示する。緑色のＧＦＰ平均値は、Ｒ３の各場合における形質導入集団のＧＦＰ平均である。

図３は、ＣＣＲ５ノックダウン結果を実施例において記載されるフローサイトメトリーにより決定し、結果をグラフ表示したものである。Ｒ２のＣＣＲ５発現およびＲ３のＣＣＲ５発現は、表示の標準偏差を伴う複数回の実験の平均蛍光値として示す。Ｒ３におけるＣＣＲ５ノックダウンは、各個別のｍｉＲＮＡの、Ｒ２と比較した百分率として示す。ＣＣＲ５−７（ｍｉｒ−１６）と対比したＣＣＲ５−７およびＣＣＲ５−７−７（ｍｉｒ−１６）と対比したＣＣＲ５−７−７の両方の場合におけるノックダウン効果について、効率は、１００％を超える改善である（すなわち、２倍を超えるノックダウン効果が観察される）。

Ｉ．本発明
ＲＮＡｉは、遺伝子発現の配列特異的下方制御をもたらす潜在的可能性を有する。このような特異的な調節であれば、広範にわたる遺伝子障害の処置および感染性疾患への対抗において有用であろう。しかし、このような治療に伴う今日の主要な問題は、遺伝子発現のノックダウンが、著明な実際の臨床的利益をもたらすのに不十分なことである。かつて、いかにしてこの問題に効果的に対処しうるのか、またはこの問題に効果的に対処しうるのかどうかは不明であった。

本明細書で提示される研究は、遺伝子発現のノックダウンを媒介する分子のための新規のデザインを裏付ける。新規の分子は、特に、形質導入レベルが低いときでも、標的の遺伝子発現を、かつては達成可能でなかった極めて低いレベルまで抑制することが可能である。具体的に、本明細書で提示される研究は、宿主細胞感染の過程に緊密に関与する重要なＨＩＶ共受容体であるＣＣＲ５遺伝子発現の下方制御を示す。研究は、ヒトＣＣＲ５を、天然の免疫細胞と比較して著明に高いレベルで、安定的に発現させる改変ＨｅＬａ細胞を援用する。新たにデザインされたＲＮＡ分子を発現させると、ＣＣＲ５下方制御の効率は、既に利用可能な、ターゲティングされたＲＮＡ発現ベクターと比較して１００％増大する。重要なことは、細胞１個当たり単一のレンチベクターコピーが解析に使用されるように、形質導入のレベルが注意深く制御される被験試料、および集団のうちの２〜２０％だけが形質導入される試料において、この高度に改善された下方制御について解析したことである。２週間超にわたり培養物中で保持した後、この新世代レンチベクターを細胞１個当たり複数またはいくつかのコピーで形質導入された細胞を、ＤＡＰＩで染色したところ、染色は、細胞は、レンチベクターによるＲＮＡ発現カセットの挿入に起因する細胞傷害作用のいかなる徴候も示していないことを明らかにした。

遺伝子疾患のほか、他の多くの可能な疾患を治癒させるための遺伝子治療法であれば、薬物関連副作用をもたらすことが多い、生涯にわたるかまたはなお長期にわたる薬物レジメンに対する必要を排するための方途として理想的であろう。しかし、多くのこのような遺伝子治療法は、今日の最も重要な疾患のうちのいくつかに対する生涯にわたる免疫を結果としてもたらす単回「投与」または遺伝子治療手順を要請するであろう。本明細書で初めて詳述される分子は、分子を細胞へと単一のコピーで送達する場合でも、頑健な遺伝子発現のノックダウンをもたらす。これは、例えば、レンチウイルスベクターの場合、細胞内の必須遺伝子を破壊するかまたはがん遺伝子を活性化させる危険性を低減するために、複数コピーの組込みを回避すべきであるので、特に有利である。したがって、本明細書で詳述される分子は、疾患の処置のための新規の遺伝子法において非常に有用であろう。

ＩＩ．クローニング、遺伝子導入、および発現のためのベクター
ある特定の態様では、発現ベクターを、特定の遺伝子の発現を阻害する核酸など、対象の核酸を発現させるのに援用する。発現は、ベクター内で適切なシグナルがもたらされ、これらは、宿主細胞内の対象の遺伝子の発現を駆動するウイルス供給源および哺乳動物供給源の両方に由来するエンハンサー／プロモーターなどの多様な調節的エレメントを含むことを要請する。また、宿主細胞内のＲＮＡの安定性を最適化するようにデザインされたエレメントも規定される。また、産物を発現させる永続的で安定的な細胞クローンを確立するための多数の主要な薬物選択マーカーの使用についての条件も、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と連関させるエレメントと同様に提供される。

Ａ．調節的エレメント
本出願を通して、「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全部を転写することが可能な遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物を含むことを意味する。転写物は、タンパク質へと翻訳されうるが、その必要はない。ある特定の実施形態では、発現は、遺伝子の遺伝子産物への転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態では、発現は、対象の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含むが、すなわちこれは、実施形態のＲＮＡ分子の場合の通りである。

ある特定の実施形態では、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入される合成機構により認識されるＤＮＡ配列であって、遺伝子の特異的な転写を開始するのに要請されるＤＮＡ配列を指す。「転写制御下」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御する核酸との関連で適正な位置および配向性にあることを意味する。

本明細書では、プロモーターという用語は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの開始部位の近傍に凝集する転写制御モジュール群を指すのに使用されるであろう。プロモーターがいかに構成されるのかについての考えの大半は、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）およびＳＶ４０初期転写単位のプロモーターを含む、いくつかのウイルスＰｏｌ ＩＩプロモーターについての解析に由来する。より近年の作業により増補されているこれらの研究は、プロモーターが、各々が約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子タンパク質または転写抑制因子タンパク質の１または複数の認識部位を含有する、離散的な機能モジュールから構成されることを示している。

各プロモーター内の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を定めるように機能する。このモジュールの最も公知の例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始部位上にある離散的なエレメント自体が開始の地点を固定する一助となる。

さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、近年、多数のプロモーターが、開始部位の下流にもまた、機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメントの間の間隔は、エレメントが互いに対して逆行または移動してもプロモーターの機能が保存されるように、しばしば柔軟である。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が減衰し始める前に、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。プロモーターに応じて、個別のエレメントは、転写を活性化させるのに、協働作用的に機能する場合もあり、独立的に機能する場合もあると考えられる。

他の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、対象のコード配列の高発現レベルを得ることができる。発現レベルが所与の目的に十分であるという条件で、対象のコード配列の発現を達成することが当技術分野で周知の他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用もまた想定される。

周知の特性を伴うプロモーターを援用することにより、トランスフェクションまたは形質転換の後における対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。さらに、特異的な生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能とする。表２および３は、本発明の文脈で、対象の遺伝子の発現を調節するために援用されうるいくつかの調節的エレメントを列挙する。このリストは、遺伝子発現の促進に関与する全ての可能なエレメントについて網羅的であることを意図するものではなく、それについて例示的であることだけを意図するものである。一部の態様では、本実施形態に従う使用のためのプロモーターは、構成的プロモーターなど、非組織特異的プロモーターである。

エンハンサーとは、同じＤＮＡ分子上の遠隔の位置に位置するプロモーターからの転写を増大させる遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと非常に類似して構成される。すなわち、エンハンサーは、それらの各々が１または複数の転写タンパク質に結合する多くの個別のエレメントから構成される。

エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は、作動的なものである。エンハンサー領域は全体として、遠位における転写を刺激することが可能でなければならない。これは、プロモーター領域またはその構成要素であるエレメントに当てはまる必要はない。他方、プロモーターは、ＲＮＡ合成の開始を、特定の部位において特定の配向性で方向付ける１または複数のエレメントを有さなければならないのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、重複し、連続的であることが多く、極めて類似のモジュラー構成を有すると考えられることが多い。

以下は、発現構築物内の対象の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用されうる、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、および誘導性プロモーター／エンハンサーのリストである（表２および表３）。加えてまた、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ：ＥＰＤＢによる）も、遺伝子の発現を駆動するのに使用されうるであろう。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部として、またはさらなる遺伝子発現構築物として供給される場合、ある種の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持しうる。

特に興味深いのは、筋肉特異的プロモーターであり、より特定すると、心筋特異的プロモーターである。これらは、ミオシン軽鎖２プロモーター（Ｆｒａｎｚら、１９９４年； Ｋｅｌｌｙら、１９９５年）、アルファアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓら、１９９６年）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒら、１９９６年）、Ｎａ^＋／Ｃａ^２＋交換体プロモーター（Ｂａｒｎｅｓら、１９９７年）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａら、１９９７年）、アルファ７インテグリンプロモーター（ＺｉｏｂｅｒおよびＫｒａｍｅｒ、１９９６年）、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９９６年）、およびアルファＢ−クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、１９９５年）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａら、１９８９年）、およびＡＮＦプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９８８年）を含む。

任意のｃＤＮＡ挿入配列を援用する場合は、ポリアデニル化シグナルを組み入れて、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を行わせることが典型的であろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施を成功させるのに決定的であるとは考えられず、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなど、任意のこのような配列を援用することができる。しかし、一部の態様では、ポリアデニル化シグナル配列を、実施形態のベクター内に組み入れない。例えば、このようなシグナル配列のレンチウイルスベクター内の組込み（３’ＬＴＲの前）は、結果として得られるレンチウイルス力価を低減しうる。

発現カセットのエレメントとしてはまた、ターミネーターも想定される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列へのリードスルーを最小化するのに役立ちうる。

Ｂ．選択性マーカー
本発明のある特定の実施形態では、細胞は、本発明の核酸構築物を含有し、細胞は、マーカーを発現構築物内に組み入れることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて同定することもでき、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて同定することもでき、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて同定することもできる。このようなマーカーであれば、同定可能な変化を細胞へと付与し、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能とするであろう。通常、薬物選択マーカーの組入れは、クローニングおよび形質転換細胞の選択の一助となり、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択性マーカーである。代替的に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素も援用することができる。また、免疫学的マーカーも、援用することができる。援用される選択性マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることが可能である限りにおいて重要ではないと考えられる。当業者には、選択性マーカーのさらなる例が周知である。

ＩＩＩ．核酸分子および発現ベクターの送達
ある特定の態様では、実施形態の核酸を送達するためのベクターを構築して、これらの因子を細胞内で発現させることができよう。特定の態様では、以下の系および方法を、核酸を所望の細胞型へと送達するのに使用することができる。

Ａ．相同組換え
実施形態のある特定の態様では、実施形態の核酸分子をコードするベクターを、細胞へと、特殊な様式で、例えば、相同組換えを介して導入することができる。遺伝子を幹細胞内で発現させるための現行の手法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）またはゲノム内にランダムに組み込まれるトランス遺伝子の使用を伴っている。これらの手法は、部分的には、ランダムに組み込まれたベクターが、内因性の遺伝子発現および／またはトランス遺伝子発現のサイレンシングを活性化させるかまたは抑制しうるために、成功していない。ランダムな組込みと関連する問題であれば、標的ゲノム内の特異的な遺伝子座への相同組換えにより部分的に克服することができよう。

一般組換えとしてもまた公知の相同組換え（ＨＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）とは、生命の全ての形態において使用される一種の遺伝子組換えであって、それらのヌクレオチド配列が、ＤＮＡの類似であるかまたは同一な２つの鎖の間で交換される遺伝子組換えである。この技法は、１９８０年代半ば以来、哺乳動物細胞内のゲノム操作のための標準的な方法となっている。このプロセスは、ＤＮＡの物理的な切断および最終的な再接合によるいくつかのステップを伴う。このプロセスは、天然において、潜在的に致死性のＤＮＡにおける二本鎖切断を修復するのに極めて広く使用されている。加えて、相同組換えは、真核生物が、精子および卵子などの生殖細胞を作り出す工程である減数分裂において、ＤＮＡ配列の新規の組合せももたらす。これらのＤＮＡの新規の組合せは、子孫における遺伝子変異であって、時間経過において、集団が環境条件の変化へと進化的に適合することを可能とする遺伝子変異を表す。相同組換えはまた、細菌およびウイルスの異なる株および種の間で遺伝物質を交換する、遺伝子の水平移動においても使用される。相同組換えはまた、遺伝子変化を標的生物へと導入するための、分子生物学における技法としても使用されている。

相同組換えは、ターゲティングされたゲノム修飾として使用することができる。哺乳動物細胞内の標準的なＨＲの効率は、処理される細胞のうちの１０^−６〜１０^−９であるに過ぎない（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９９０年）。メガヌクレアーゼまたはＩ−ＳｃｅＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼは、ＨＲの効率を増大させるのに使用されている。天然のメガヌクレアーゼならびにターゲティングの特異性を改変した操作メガヌクレアーゼのいずれも、ＨＲの効率を増大させるのに活用されている（ＰｉｎｇｏｕｄおよびＳｉｌｖａ、２００７年； Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、２００２年）。ＨＲの効率を増大させるための別の経路は、キメラエンドヌクレアーゼを、プログラム可能なＤＮＡ特異性ドメインで操作すること（Ｓｉｌｖａら、２０１１年）である。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインを、ＦｏｋＩ（Ｄｕｒａｉら、２００５年；ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０６０６において総説されている）など、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒性ドメインと融合させた、このようなキメラ分子の一例である。このような特異性分子の別のクラスは、ＦｏｋＩなど、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒性ドメインと融合させた、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合性ドメインを含む（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１年：ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４）。

Ｂ．核酸送達系
当業者は、標準的な組換え法によりベクターを構築するのに十分に装備されているであろう（例えば、それらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６年を参照されたい）。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、など、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来する）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来する）、それらの複製コンピテント形態、複製欠損形態、およびガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）形態を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０：ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳房腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。

１．エピソームベクター
本発明のある特定の態様では、例えば、体細胞を再プログラミングするための、プラスミドベースまたはリポソームベースの染色体外（すなわち、エピソーム）ベクターの使用もまた提供されうる。このようなエピソームベクターは、例えば、ｏｒｉＰベースのベクターおよび／またはＥＢＶタンパク質であるＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターを含みうる。これらのベクターは、ＤＮＡの大型断片を細胞へと導入し、染色体外で維持し、細胞周期１周期当たり１回ずつ複製し、娘細胞へと効率的に分割し、免疫応答を実質的に誘発しないことを可能としうる。

特に、ｏｒｉＰベースの発現ベクターを複製するのに要請される唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ−１は、その抗原をＭＨＣクラスＩ分子上に提示するのに要請されるプロセシングをバイパスする効率的な機構を発生させているため、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７年）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、いくつかの細胞系統において、トランスにおいて、クローニングされた遺伝子の発現を増強するように作用して、クローニングされた遺伝子の発現を１００倍まで誘導しうる（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８年； Ｅｖａｎｓら、１９９７年）。最後に、このようなｏｒｉＰベースの発現ベクターの作製は廉価である。

他の染色体外ベクターは、他のリンパ向性ヘルペスウイルスベースのベクターを含む。リンパ向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）内で複製され、その天然の生活環の一部にわたりプラスミドとなるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ向性ヘルペスウイルスは、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）を含むがこれらに限定されない。また、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、またはＢＰＶなど、エピソームベースのベクターの他の供給源も想定される。

当業者は、標準的な組換え法によりベクターを構築するのに十分に装備されているであろう（例えば、それらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８年；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４年を参照されたい）。

ベクターはまた、遺伝子送達および／もしくは遺伝子発現をさらにモジュレートするか、または他の形で有益な特性をターゲティングされた細胞へともたらす、他の構成要素または機能性も含みうる。このような他の構成要素は、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響を及ぼす構成要素（細胞型特異的結合または組織特異的結合を媒介する構成要素を含む）；ベクター核酸の細胞による取込みに影響を及ぼす構成要素；ポリヌクレオチドの、取込みの後における細胞内の局在化に影響を及ぼす構成要素（核局在化を媒介する作用物質など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成要素を含む。

このような構成要素はまた、ベクターにより送達される核酸を取り込み、発現させている細胞を検出または選択するのに使用しうる検出性マーカーおよび／または選択マーカーなどのマーカーも含みうるであろう。このような構成要素は、ベクターの天然の特色としてもたらされる場合（結合および取込みを媒介する構成要素または機能性を有するある種のウイルスベクターの使用など）もあり、ベクターを、このような機能性をもたらすように改変する場合もある。当技術分野では、多種多様なこのようなベクターが公知であり、一般に利用可能である。宿主細胞内でベクターを宿主細胞内で維持する場合、ベクターは、有糸分裂において細胞により自律的構造として安定的に複製させることもでき、宿主細胞のゲノム内に組み込むこともでき、宿主細胞の核内または細胞質内で維持させることもできる。

２．トランスポゾンベースの系
特定の実施形態によれば、核酸の導入は、トランスポゾン−トランスポザーゼ系を使用しうる。使用されるトランスポゾン−トランスポザーゼ系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅによる周知のトランスポゾン−トランスポザーゼ系（後者の記載については、例えば、ＥＰ１５０７８６５を参照されたい）、またはＴＴＡＡ特異的トランスポゾン系であるＰｉｇｇｙＢａｃｋ系でありうるであろう。

トランスポゾンとは、単一の細胞のゲノム内の異なる位置へと転々と移動しうる（転位と呼ばれる過程）ＤＮＡの配列である。このプロセスにおいて、トランスポゾンは、突然変異を引き起こすことが可能であり、ゲノム内のＤＮＡの量を変化させうる。トランスポゾンはまたかつては、ジャンピング遺伝子とも呼ばれ、可動遺伝要素の例である。

様々な可動遺伝要素が存在するが、これらは、それらの転位機構に基づいて群分けすることができる。クラスＩの可動遺伝要素またはレトロトランスポゾンは、まずＲＮＡへと転写され、次いで、逆転写酵素により再度ＤＮＡへと逆転写され、次いで、ゲノム内の別の位置に挿入されることを介してコピーされる。クラスＩＩの可動遺伝要素は、トランスポザーゼを使用して、１つの位置から別の位置へと直接移動して、ゲノム内で「カットアンドペースト」される。

３．ウイルスベクター
組換えウイルスベクターの作製では、非必須遺伝子を、異種（または非天然の）タンパク質または核酸の遺伝子またはコード配列で置きかえることが典型的である。ウイルスベクターとは、核酸、および、可能なら、タンパク質を、細胞へと導入するのにウイルス配列を活用する一種の発現構築物である。ｐＨ依存的機構またはｐＨ非依存的機構を介して細胞に感染するかまたは細胞に侵入し、それらの遺伝子カーゴを宿主細胞ゲノムへと組み込み、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現させるある種のウイルスの能力により、ウイルスは、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）へと転移させるための魅力的な候補物質となっている。本発明のある特定の態様の核酸を送達するのに使用しうるウイルスベクターの非限定的な例については、下記に記載する。

レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムへと組み込み、大量の外来遺伝物質を導入し、広範なスペクトルの種および細胞型に感染し、特異的な細胞系統内にパッケージングされるそれらの能力のために、遺伝子送達ベクターとして有望である（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２年）。

レトロウイルスベクターを構築するためには、核酸を、ある種のウイルス配列の代わりに、ウイルスゲノムへと挿入して、複製欠損ウイルスを産生させる。ビリオンを産生させるために、パッケージング細胞系統は、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲを伴わず、パッケージング構成要素が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３年）。組換えプラスミドが、レトロウイルスのＬＴＲと共にｃＤＮＡを含有し、パッケージング配列を特異的な細胞系統へと導入する（例えば、リン酸カルシウム沈殿により）場合、パッケージング配列は、組換えプラスミド（すなわち、ベクターゲノム）のＲＮＡ転写物を、ウイルス粒子へとパッケージングすることを可能とし、次いで、これを、培養培地中に分泌させる（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年； Ｔｅｍｉｎ、１９８６年； Ｍａｎｎら、１９８３年）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を回収し、任意選択で濃縮し、遺伝子導入に使用する。ベクター粒子表面を覆うのに使用されるエンベロープタンパク質の向性に応じて、レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染することが可能である。しかし、組込みおよび安定的な発現は、宿主細胞の分裂を要請する（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５年）。

レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節的機能または構造的機能を伴う他の遺伝子も含有する複雑なレトロウイルスである。当技術分野では、レンチウイルスベクターが周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６年； Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７年； Ｂｌｏｍｅｒら、１９９７年； Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅら、２０１１年；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。

組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することが可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏのいずれにおいても、遺伝子導入および核酸配列発現に使用することができる。例えば、非分裂細胞に感染することが可能な組換えレンチウイルスであって、適切な宿主細胞にパッケージング機能を保有する２つの以上のベクター、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのほか、ｒｅｖおよびｔａｔもトランスフェクトする組換えレンチウイルスは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９９４，１３６号において記載されている。

Ｃ．核酸の送達
本明細書で記載される通り、または当業者に公知の通り、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の細胞への導入であって、本発明によりプログラムされる導入は、細胞を形質転換するために核酸を送達するための任意の適切な方法を使用しうる。このような方法は、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９年、Ｎａｂｅｌら、１９８９年）；マイクロインジェクション（参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年；米国特許第５，７８９，２１５号）を含む注射（各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号）；電気穿孔（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３８４，２５３号； Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年； Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）；リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年； ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年； Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）；ＤＥＡＥ−デキストランに続く、ポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）；直接的な超音波によるローディング（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）；リポソームを媒介するトランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年； Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年； Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年； Ｗｏｎｇら、１９８０年； Ｋａｎｅｄａら、１９８９年； Ｋａｔｏら、１９９１年）および受容体を媒介するトランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年； ＷｕおよびＷｕ、１９８８年）；微粒子銃（各々が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９６９９号および同第ＷＯ９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号、同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号、および同第５，５３８，８８０号）；炭化ケイ素繊維による撹拌（各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０年；米国特許第５，３０２，５２３号、および同第５，４６４，７６５号）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を媒介する形質転換（各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６１６号、および同第５，５６３，０５５号）；乾燥／阻害を媒介するＤＮＡの取込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５年）；ならびにこのような方法の任意の組合せによるなど、ＤＮＡの直接的な送達を含むがこれらに限定されない。これらの技法などの技法の適用を介して、細胞小器官、細胞、組織、または生物を、安定的または一過性に形質転換することができる。

１．リポソームを媒介するトランスフェクション
本発明のある特定の実施形態では、核酸を、例えば、リポソームなどの脂質複合体内に封じ込めることができる。リポソームとは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多層状リポソームは、水性媒質で隔てられた複数の脂質層を有する。リポソームは、リン脂質を過剰な水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質の構成要素は、閉止構造を形成する前に自己再構成を経、水および溶存させた溶質を脂質二重層の間に封じ込める（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１年）。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合させた核酸も想定される。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質のほか、使用される細胞の性質により変化する場合があり、例えば、細胞百万〜１千万個当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡを想定することができる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリポソームを媒介する核酸送達および外来ＤＮＡの発現は、大きな成功を収めている（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年； Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年； Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。また、培養されたニワトリ胚細胞内、ＨｅＬａ細胞内、および肝がん細胞内におけるリポソームを媒介する核酸送達および外来ＤＮＡの発現の実現可能性も裏付けられている（Ｗｏｎｇら、１９８０年）。

本発明のある特定の実施形態では、リポソームを、血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合させることができる。これは、細胞膜との融合を容易とし、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）。他の実施形態では、リポソームは、核内非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合させるか、またはこれらと共に援用することもできる（Ｋａｔｏら、１９９１年）。またさらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合させるか、またはこれらと共に援用することもできる。他の実施形態では、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含みうる。

２．電気穿孔
本発明のある特定の実施形態では、核酸を、電気穿孔を介して、細胞小器官、細胞、組織、または生物へと導入することができる。電気穿孔は、細胞およびＤＮＡの懸濁液の、高電圧の放電への曝露を伴う。レシピエント細胞は、機械的損傷により、形質転換を受けやすくすることもできる。また、使用されるベクターの量も、使用される細胞の性質により変化する場合があり、例えば、細胞百万〜１千万個当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡを想定することができる。

電気穿孔を使用する真核細胞のトランスフェクションは、大きな成功を収めている。この様式で、マウスプレＢリンパ球にヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子がトランスフェクトされており（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、ラット肝細胞にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年）。

３．リン酸カルシウム
本発明の他の実施形態では、核酸を、リン酸カルシウム沈殿を使用して細胞へと導入する。この技法を使用して、ヒトＫＢ細胞にアデノウイルス５ＤＮＡがトランスフェクトされている（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年）。この様式ではまた、マウスＬ（Ａ９）細胞、マウスＣ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＨｅＬａ細胞にネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年）、ラット肝細胞に様々なマーカー遺伝子がトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）。

４．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランに続き、ポリエチレングリコールを使用して、核酸を、細胞へと送達する。この様式で、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞およびマウス赤白血病細胞へと導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）。

Ｄ．細胞の培養
一般に、本発明の細胞は、細胞の成長を持続させることが可能な、栄養物質に富む緩衝液である培養培地中で培養する。

本明細書で記載される方法に従い、幹細胞を単離し、増殖させ、分化させるのに適する培養培地は、高ブドウ糖のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、ライボビッツＬ−１５、ＲＰＭＩ １６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を含むがこれらに限定されない。既知組成培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、およびマイトジェンを補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）などの最小必須培地を含み、これもまた適する。本明細書で使用されるマイトジェンとは、細胞分裂を刺激する薬剤を指す。薬剤は、細胞が細胞分裂を始めることを促し、有糸分裂を誘発する化学物質、通常はタンパク質の何らかの形態でありうる。一実施形態では、米国出願第０８／４６４，５９９号およびＷＯ９６／３９４８７において記載されている無血清培地などの無血清培地、ならびに米国特許第５，４８６，３５９号において記載されている「完全培地」が、本明細書で記載される方法による使用のために想定される。一部の実施形態では、培養培地には、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト自家血清、ヒトＡＢ型血清、またはヘパリンを補充した血小板に富む血漿（２Ｕ／ｍｌ）を補充する。細胞培養物は、例えば、培養液のｐＨを維持するように、５％〜１２％のＣＯ_２雰囲気中で維持し、加湿雰囲気中３７℃でインキュベートし、８５％未満のコンフルエンシーを維持するように継代培養することができる。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を裏付けるために組み入れる。当業者は、後続の実施例において開示される技法は、本発明の実施において良好に機能し、したがって、その実施のための好ましい方式を構成すると考えうることが本発明者により発見された技法を表すことを察知されたい。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態では、多くの変化を施すことが可能であり、本発明の趣旨および範囲から逸脱しない限りにおいて、やはり同様の結果または類似の結果が得られることを察知されたい。

（実施例１）
新世代ｍｉｒ−１６レンチベクターの構築
以下のプライマー：

を使用するＰＣＲにより、人工ＣＣＲ５ ｍｉＲＮＡターゲティングオリゴを作り出した。

Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを、ＰＣＲ反応に使用した。反応条件は、製造元（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）の仕様に従い設定した。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＸｂａＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で消化し、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで切断された、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード配列をあらかじめ含有するｐＥＮＴＲ Ｇａｔｅｗａｙエントリープラスミドである、ｐＥＮＴＲ−ＧＦＰへとライゲーションした。濃縮されたＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して、消化されたｍｉＲＮＡオリゴを、ｐＥＮＴＲ−ＧＦＰへとライゲーションした。（Ｓｕｎら、２００６年）を出典とする方法により、複数のｍｉＲＮＡを伴うｐＥＮＴＲ−ＧＦＰ構築物を創出した。ＨＩＶ−１に由来する第３世代のレンチベクター骨格であるｐＣＬＸとのＧａｔｅｗａｙ ＬＲ反応を実行することにより、ＧＦＰおよびｍｉＲＮＡの発現を駆動するヒトＵＢＩ プロモーターを伴う最終的なレンチベクターを構築した。

（実施例２）
ウイルスの産生および滴定
既に（ＳａｌｍｏｎおよびＴｒｏｎｏ、２００７年）において記載されている方法である、リン酸カルシウムを媒介するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより、ＨＩＶ−１に由来するパッケージングｐｓＰＡＸ２プラスミドおよびエンベロープｐＣＡＧ−ＶＳＶＧプラスミドを使用して、レンチウイルスベクター原液を作り出した。レンチウイルス力価は、既に（Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅら、２０１１年； ＳａｌｍｏｎおよびＴｒｏｎｏ、２０１１年）において記載されている通り、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上のフローサイトメトリーを介して、５日後における、形質導入されたＨｅＬａ細胞内のレポーター遺伝子（ＧＦＰ）のレベルを解析することにより評価した。

（実施例３）
標的細胞への形質導入およびＣＣＲ５ノックダウン解析
新世代のｍｉｒ−１６ ｍｉＲＮＡレンチウイルスベクターのノックダウン効果について調べるために、天然のＣＣＲ５タンパク質を発現させる改変ＨｅＬａ細胞系統（ＴＺ）細胞を使用した。ＤＭＥＭ中で培養したＴＺ細胞に、採取された、３つの異なる容量のレンチベクターを形質導入した。５日後において、細胞を、ＡＰＣで標識されたヒトＣＣＲ５モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し（対照としては、非ＣＣＲ５発現ＨｅＬａを使用した）、フローサイトメトリーを介してＧＦＰ発現のレベルを測定することにより、形質導入効率を解析した。細胞のうちの２〜２０％の間が形質導入された（ＧＦＰを発現させる）試料を、細胞１個当たり１コピーのレベルにおける、多様なレンチベクター構築物のノックダウン効果を見ることを可能とする、さらなる解析に使用した。

（実施例４）
結果および考察
フローサイトメトリー解析は、多様なＣＣＲ５ノックダウンレンチベクター構築物を使用して実施した（図２Ａ〜Ｃ）。左側の散布図は、Ｘ軸（水平軸）上にＧＦＰ蛍光のレベルを示した。Ｙ軸（垂直軸）は、ＣＣＲ５蛍光のレベルである。両方の軸上の第１の対数区間は、負である。各散布図は、単一のレンチベクター構築物の散布図であり、２つの異なる集団であるＲ２（非形質導入集団）、およびＲ３（形質導入集団）を示す。対照試料（ＧＦＰ）は、ＣＣＲ５ノックダウンを伴わない、ただＧＦＰだけのレンチベクターである。（ＣＣＲ５−７）は、ＧＦＰのほか、ｍｉＲＮＡをターゲティングする旧来のｍｉｒ−３０ベースのＣＣＲ５を発現させるレンチベクターである（ここで、７は、任意に７と標識された標的配列の標識である）。（ＣＣＲ５−７−７）は、２つのｍｉｒ−３０ベースのｍｉＲＮＡを伴うレンチベクターを指し示す。（ＣＣＲ５−７ ｍｉｒ−１６）は、新世代のハイブリッド体ｍｉＲＮＡを含有するレンチベクターを表示する。緑色のＧＦＰ平均値は、Ｒ３の各場合における形質導入集団のＧＦＰ平均である。

本研究は、広く使用されているヒトｍｉｒ−３０骨格（Ｓｕｎら、２００６年）を援用するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ分子に基づいた。上記で記載した通り、これは、標的遺伝子の概して弱い下方制御を結果としてもたらした。たしかに、ポリシストロニックのｍｉｒ−３０ベースの系を援用することにより、結果の改善がもたらされたが、飽和点に達したことは、ある点から先、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの数を増大させても、ノックダウン効果は増大しないことを意味する。作業の次の段階は、本発明者らのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ分子の骨格を完全にデザインし直すことであり、この新規のデザインを、任意の特定または単一の自然発生ヒトｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ骨格に基づかせなかった。この新規のデザインの目標は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物が、ＲＮＡｉ経路へと効率的に組み込まれ、より強力な下方制御効果をもたらすように円滑にプロセシングされることを確実とすることであった。この新規のハイブリッド体デザインの結果は、下方制御効率の、元のヒトｍｉｒ−３０ベースのデザインと比較した、１００％の増大であった（図３）。この結果は、細胞１個当たりのレンチウイルスベクターのコピー数を変化させる（ＭＯＩを変化させる）複数回の実験にわたり達成された。新規のデザインは常に、旧来のｍｉｒ−３０ベースのデザインと比較してちょうど２倍を超えるノックダウンをもたらした。これは、新規のデザインの優れたプロセシングであって、それらのプロセシングの後において、適正な鎖の、ＲＩＳＣ複合体へのより良好な組込みを確実とするようにデザインされた、ｍｉＲＮＡ二重鎖をよりたやすく産生するプロセシングに帰せられうる可能性が極めて高い。

考慮すべきデータの別の側面は、Ｒ３集団または形質導入集団のＸ軸平均である。レンチベクターが構築される様式に起因して、ＧＦＰおよびｍｉＲＮＡは、１つの転写単位として転写されるが、これは、ｍｉＲＮＡを、ＧＦＰ転写物の末端に配置することを意味する。このことの含意は、ｍｉＲＮＡが核内でＤｒｏｓｈａにより容易かつ効率的に認識され、プロセシングされる場合、それらは、ＧＦＰ転写物の末端から分離され、ポリＡテールを伴わないＧＦＰ ｍＲＮＡを残すことである。これは、ＧＦＰ転写物の安定性／翻訳に著明に影響を及ぼし、各試料中の形質導入集団の平均ＧＦＰ値の、非形質導入集団と比較した低下により検出可能である。実際、新規の（ｍｉｒ−１６）デザインの、旧来のデザインと比較して観察される優れたプロセシングは、形質導入集団Ｒ３のＸ軸平均（ＧＦＰ）値の間の大きな差違により明らかであり、例えば、ＧＦＰだけのレンチベクターにおけるＲ３の平均ＧＦＰは、１７９であり、これを、ベースのＧＦＰレベルとして使用することができる。ＧＦＰだけのレンチベクターでは、ＣＣＲ５レベルが、Ｒ２集団とＲ３集団との間で同じレベルにとどまることに注目することは重要である。Ｒ３のＧＦＰ平均を、一重ｍｉＲＮＡ（旧来のデザインによる構築物）で観察する場合、それが１７９から９４へと減少したことは、ＧＦＰ蛍光のうちの一部が失われたことを指し示し、これは、ｍｉＲＮＡのうちの一部が認識され、プロセシングされたことを意味する。これは、ＣＣＲ５の発現の１７％の低下を伴うことにより裏付けられる。しかし、新規のデザインによる一重ｍｉＲＮＡ構築物において、Ｒ３内のＧＦＰ平均が３１へと減少したことは、より多くのｍｉＲＮＡが認識およびプロセシングされ、したがって、より大きな下方制御が達成される（ここでは、ＣＣＲ５蛍光の３７％の減少であり、旧来のデザインと比較して２倍を超える効果である）ことを意味するはずである。これは、構築物１つ当たりのｍｉＲＮＡの数を変化させたいくつかの形質導入実験を通して見られる傾向である。一般傾向は、新規のデザインおよび旧来のデザインによる一重構築物と二重構築物との間にあり、一重ｍｉＲＮＡから二重ｍｉＲＮＡへと移行すると、下方制御は倍増する：７−７（旧来）＝３４％と対比した７（旧来）＝１７％；７−７（ｍｉｒ−１６）＝７８％と対比した７（ｍｉｒ−１６）＝３７％。しかし、一重ｍｉＲＮＡだけを比較すると、新規のデザインによる７（ｍｉｒ−１６）＝３７％と対比した７（旧来）＝１７％であり、新規の一重ｍｉＲＮＡは、旧来のデザインの常に２倍の効果をもたらす。これは、二重構築物についても同じであり、７−７（ｍｉｒ−１６）＝７８％と対比した７−７（旧来）＝３４％である。しかし、三重ヘアピンを付加しても、７−７−７（ｍｉｒ−１６）＝９１％と対比した７−７（ｍｉｒ−１６）＝７８％であり、効果がここでもまた倍増することはないことから、経路の飽和点に達しつつあることが指し示される。

本明細書で開示および特許請求される方法の全ては、本開示に照らして不要な実験を伴わずに作り上げ、実施することができる。好ましい実施形態との関係で、本発明の組成物および方法について記載してきたが、当業者には、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書で記載される方法および方法のステップまたはステップの連鎖には、変化を適用しうることが明らかであろう。より具体的には、化学的かつ生理学的に類縁であるある種の作用物質で、本明細書で記載される作用物質を置換しながら、同じであるかまたは類似の結果を達成しうることが明らかであろう。当業者に明らかな、全てのこのような類似の置換物および改変物は、付属の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨、範囲、および概念の中にあるものとみなされる。
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書に記載されているものに対する例示的な手順または他の詳細な補足を提供する範囲で、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。

Claims (60)

1. ５’から３’へかつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、
   （ａ）配列番号１の配列を含むｍｉｒ−１６のフランキング配列、
   （ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のｍｉｒ−１６配列を含む第１のローワーステム配列、
   （ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、
   （ｄ）配列番号７の配列を含むｍｉｒ−３０ループ配列、
   （ｅ）該（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き該（ｃ）の配列と相補的なセンス配列であって、該１つまたは２つのミスマッチが、
   ｉ）該センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、または
   ｉｉ）該センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチ
   を含むセンス配列、
   （ｆ）該（ｂ）の配列と相補的な第２のローワーステム配列、および
   （ｇ）第２のフランキング配列
   を含む、組換え核酸分子。
2. 前記センス配列（ｅ）が、配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含み、該ミスマッチが、該センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記センス配列（ｅ）が、配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含み、該ミスマッチが、（ｉ）該センス配列（ｅ）の１１位、および（ｉｉ）該センス配列（ｅ）の末端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する、請求項１に記載の核酸分子。
4. フランキング配列（ｇ）を含み、該フランキング配列が、前記ｍｉｒ−１６のフランキング配列（ａ）と相補的ではない、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
5. ＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
6. ＤＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
7. 前記配列（ａ）〜（ｇ）の少なくとも２つの反復を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
8. 前記少なくとも２つの反復が、スペーサー配列で隔てられている、請求項７に記載の核酸分子。
9. 前記アンチセンス標的配列が、ＣＣＲ５ ｍＲＮＡ配列と相補的である、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
10. プロモーター配列に作動可能に連結した、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
11. 前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、請求項１０に記載の発現ベクター。
12. 前記真核生物プロモーターが、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターである、請求項１１に記載の発現ベクター。
13. 前記プロモーターが、誘導性組織特異的プロモーターまたは誘導性細胞系統特異的プロモーターである、請求項１０に記載の発現ベクター。
14. 請求項１に記載の核酸配列の２つ以上のコピーを含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
15. 請求項１に記載の核酸配列の前記２つ以上のコピーが、ポリシストロニックの転写物コード配列を形成する、請求項１４に記載の発現ベクター。
16. アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項１０に記載の発現ベクター。
17. 少なくとも１つの薬物耐性マーカーをさらに含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
18. 請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１０から１７のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
19. 細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子を該細胞内で発現させるステップを含み、前記アンチセンス標的配列（ｃ）が、該遺伝子のセンス鎖と相補的である方法。
20. 前記核酸分子を前記細胞内で発現させるステップが、前記細胞に核酸をトランスフェクトすることを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記核酸分子を前記細胞内で発現させるステップが、前記核酸分子を発現ベクターから発現させることを含む、請求項１９に記載の方法。
22. 前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記遺伝子が、ＣＣＲ５である、請求項１９に記載の方法。
24. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１９に記載の方法。
25. ｉｎ ｖｉｖｏ法としてさらに定義される、請求項１９に記載の方法。
26. ｉｎ ｖｉｔｒｏ法またはｅｘ ｖｉｖｏ法としてさらに定義される、請求項１９に記載の方法。
27. 前記核酸分子を発現させる前記細胞を、生物へと移植するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記細胞が生物に含まれる、請求項１９に記載の方法。
29. ５’から３’へかつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、
    （ａ）ｍｉｒ−１６のフランキング配列、
    （ｂ）ｍｉｒ−１６配列を含む第１のローワーステム配列、
    （ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、
    （ｄ）ｍｉｒ−３０ループ配列、
    （ｅ）該（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き該（ｃ）の配列と相補的なセンス配列であって、該１つまたは２つのミスマッチが、
    ｉ）該センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、または
    ｉｉ）該センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチ
    を含むセンス配列
    （ｆ）該（ｂ）の配列と相補的な第２のローワーステム配列であって、少なくとも１１ヌクレオチドの長さである、ローワーステム配列、および
    （ｇ）第２のフランキング配列
    を含む、組換え核酸分子。
30. 前記ローワーステムが、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドの長さである、請求項２９に記載の核酸分子。
31. 前記第１のローワーステム（ｂ）が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の前記ｍｉｒ−１６配列を含む、請求項２９に記載の核酸分子。
32. 前記ｍｉｒ−１６のフランキング配列（ａ）が、配列番号１の配列を含む、請求項２９に記載の核酸分子。
33. 前記ｍｉｒ−３０ループ配列が、配列番号７の配列を含む、請求項２９に記載の核酸分子。
34. 前記センス配列（ｅ）が、配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含み、該ミスマッチが、該センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する、請求項２９に記載の核酸分子。
35. 前記センス配列（ｅ）が、配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含み、該ミスマッチが、（ｉ）該センス配列（ｅ）の１１位、および（ｉｉ）該センス配列（ｅ）の末端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する、請求項２９に記載の核酸分子。
36. フランキング配列（ｇ）を含み、該フランキング配列が、前記ｍｉｒ−１６のフランキング配列（ａ）と相補的ではない、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の核酸分子。
37. ＲＮＡである、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の核酸分子。
38. ＤＮＡである、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の核酸分子。
39. 前記配列（ａ）〜（ｇ）の少なくとも２つの反復を含む、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
40. 前記少なくとも２つの反復が、スペーサー配列で隔てられている、請求項３９に記載の核酸分子。
41. 前記アンチセンス標的配列が、ＣＣＲ５ ｍＲＮＡ配列と相補的である、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の核酸分子。
42. プロモーター配列に作動可能に連結した、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
43. 前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、請求項４２に記載の発現ベクター。
44. 前記真核生物プロモーターが、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターである、請求項４３に記載の発現ベクター。
45. 前記プロモーターが、誘導性組織特異的プロモーターまたは誘導性細胞系統特異的プロモーターである、請求項４２に記載の発現ベクター。
46. 請求項２９に記載の核酸配列の２つ以上のコピーを含む、請求項４２に記載の発現ベクター。
47. 請求項２９に記載の核酸配列の前記２つ以上のコピーが、ポリシストロニックの転写物コード配列を形成する、請求項４６に記載の発現ベクター。
48. アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項４２に記載の発現ベクター。
49. 少なくとも１つの薬物耐性マーカーをさらに含む、請求項４２に記載の発現ベクター。
50. 請求項２９から４１のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項４２から４９のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
51. 細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の核酸分子を該細胞内で発現させるステップを含み、前記アンチセンス標的配列（ｃ）が、該遺伝子のセンス鎖と相補的である方法。
52. 前記核酸分子を前記細胞内で発現させるステップが、前記細胞に核酸をトランスフェクトすることを含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記核酸分子を前記細胞内で発現させるステップが、前記核酸分子を発現ベクターから発現させることを含む、請求項５１に記載の方法。
54. 前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項５３に記載の方法。
55. 前記遺伝子が、ＣＣＲ５である、請求項５１に記載の方法。
56. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項５１に記載の方法。
57. ｉｎ ｖｉｖｏ法としてさらに定義される、請求項５１に記載の方法。
58. ｉｎ ｖｉｔｒｏ法またはｅｘ ｖｉｖｏ法としてさらに定義される、請求項５１に記載の方法。
59. 前記核酸分子を発現させる前記細胞を、生物へと移植するステップをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
60. 前記細胞が生物に含まれる、請求項５１に記載の方法。

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