ES2892972T3

ES2892972T3 - Métodos de activación de CD40 y bloqueo de punto de control inmunitario

Info

Publication number: ES2892972T3
Application number: ES16862825T
Authority: ES
Inventors: Willem W Overwijk; Manisha Singh; Patrick Hwu; Mark Cantwell
Original assignee: University of Texas System; Memgen Inc
Current assignee: University of Texas System; Memgen Inc
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2022-02-07
Anticipated expiration: 2036-11-02
Also published as: US20190057605A1; LT3370733T; SI3370733T1; WO2017079202A1; EP3370733B1; US11594135B2; US20200165339A1; EP3370733A1; EP3370733A4

Abstract

Un método in vitro de potenciación de la función de una célula inmunitaria que comprende poner en contacto dicha célula inmunitaria con al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico que comprende (a) un subdominio extracelular de CD154 humano que se une a un receptor de CD154 humano y (b) un subdominio extracelular de CD154 no humano que reemplaza un sitio de escisión de CD154 humano, donde el al menos un inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de activación de CD40 y bloqueo de punto de control inmunitario

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la inmunología y la medicina. Más particularmente, se divulgan composiciones y métodos de potenciación de la función inmunitaria.

2. Descripción de la técnica relacionada

Aunque la naturaleza inmunogénica del melanoma hace que la enfermedad sea muy susceptible a la inmunoterapia, el melanoma metastásico sigue siendo muy resistente a las inmunoterapias establecidas. Además, la metástasis cerebral es un problema clínico importante en pacientes con melanoma avanzado y la incidencia de metástasis cerebral aumenta cada año (Fonkem et al., 2012). Las vacunas contra el cáncer han aumentado el número y la actividad de los linfocitos T que reconocen antígenos asociados a tumores en muchos casos, sin embargo, existe una falta de respuesta clínica sólida con este método de tratamiento (Rosenberg et al., 2004).

Los linfocitos T CD8 citotóxicos suprimen el crecimiento del melanoma y se asocian a la supervivencia global de los pacientes; sin embargo, las terapias que inducen linfocitos T CD8 específicos de tumores han tenido un éxito clínico limitado. Por ejemplo, el documento US 2003/0220473 A1 proporciona métodos de uso de vectores de expresión que comprenden una secuencia polinucleotídica aislada que codifica un CD154 quimérico, tal como ISF35, para mejorar la inmunorreactividad de las células transfectadas y tratar la neoplasia. El documento WO 2008/070743 A2 se refiere a un método de tratamiento del cáncer mediante la administración de ISF35 o construcciones análogas, que permite una mayor sensibilidad al tratamiento con un agente quimioterápico. Los anticuerpos agonistas de CD40 inducen linfocitos T CD8 específicos de tumores tanto en ratones como en pacientes con melanoma, pero la mayoría de los pacientes no responden a esta terapia. Además, aunque los anticuerpos CD40 agonistas han demostrado generar una respuesta fuerte de linfocitos T CD8 específicos de tumores, la terapia sistémica anti-CD40 se ha asociado al síndrome de liberación de citocinas y la toxicidad hepática. Por tanto, se necesita una inmunoterapia que produzca una respuesta fuerte de linfocitos T c D8 en los tumores, así como un efecto terapéutico sólido.

La presente invención se define en las reivindicaciones. Se divulgan además métodos y composiciones para potenciar la función inmunitaria mediante la combinación de un inhibidor de punto de control inmunitario y un polipéptido CD154 quimérico. Se divulga además un método de potenciación de la función de una célula inmunitaria que comprende poner en contacto dicha célula inmunitaria con al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico que comprende (a) un subdominio extracelular de CD154 humano que se une a un receptor de CD154 humano y (b) un subdominio extracelular de CD154 no humano que reemplaza un sitio de escisión de CD154 humano. Como alternativa, el polipéptido CD154 puede comprender (a) un subdominio extracelular de CD154 humano que se una a un receptor de CD154 humano y (b) cualquier segmento peptídico que reemplace un sitio de escisión de CD154 humano pero que, por lo demás, mantenga la función de unión del polipéptido CD154. Más particularmente, el péptido debe mantener generalmente la estructura secundaria y terciaria global del polipéptido CD154, que puede incluir el mantenimiento del espaciado de las secuencias CD154 que flanquean el péptido una vez insertado.

En algunos aspectos, la potenciación de la función inmunitaria comprende potenciar el cebado, la activación, la proliferación y/o la actividad citolítica de linfocitos T CD8. En determinados aspectos, los linfocitos T CD8 son linfocitos T cD8-positivos e interferón gamma (IFNY)-positivos (CD8+IFN^y+).

En determinados aspectos, el al menos un inhibidor de punto de control inmunitario es un antagonista de unión al eje de la muerte celular programada 1 (PD-1) humana. En algunos aspectos, el al menos un inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA-4. En determinados aspectos, más de un inhibidor de punto de control se pone en contacto con dicha célula inmunitaria.

En algunos aspectos, el antagonista de unión al eje de PD-1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PDL1 y un antagonista de unión a PDL2. En determinados aspectos, el antagonista de unión al eje de PD-1 es un antagonista de unión a PD-1. En aspectos particulares, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PDL1 y/o PDL2. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En aspectos particulares, el antagonista de unión a PD-1 es nivolumab, pembrolizumab, CT-011, BMS 936559, MPDL328OA o AMP-224.

En determinados aspectos, el subdominio extracelular de CD154 no humano es un subdominio extracelular de CD154 murino. En aspectos particulares, el polipéptido CD154 quimérico se selecciona del grupo que consiste en ISF30, ISF31, ISF32, ISF33, ISF34, ISF35, ISF36, ISF37, ISF38, ISF39, ISF40 e ISF41. En aspectos particulares, el polipéptido CD154 quimérico es ISF35.

En aspectos adicionales, el polipéptido CD154 quimérico se pone en contacto con dicha célula inmunitaria (i) proporcionando una región codificante para el polipéptido CD154 quimérico en un vector de expresión y bajo el control de un promotor activo en una célula eucariota, y (ii) cultivando dicha célula inmunitaria y dicha célula eucariota en condiciones que favorezcan la expresión de dicho polipéptido CD154 quimérico. En algunos aspectos, el casete de expresión está en un vector vírico. En algunos aspectos, el vector vírico es un vector adenovírico, un vector retrovírico, un vector vírico de viruela, un vector vírico de herpes, un vector vírico adeno-asociado o un vector vírico de polioma. En aspectos particulares, el vector vírico es un vector adenovírico.

En otros aspectos, el polipéptido CD154 quimérico se pone en contacto con la célula inmunitaria.

Se divulga además una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico, que comprende (a) un subdominio extracelular de CD154 humano que se une a un receptor de CD154 humano y (b) un subdominio extracelular de CD154 no humano que reemplaza un sitio de escisión de CD154 humano, para su uso en un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto. En particular, el sujeto es un sujeto humano. Como alternativa, el polipéptido CD154 puede comprender (a) un subdominio extracelular de CD154 humano que se una a un receptor de CD154 humano y (b) cualquier segmento peptídico que reemplace un sitio de escisión de CD154 humano pero que, por lo demás, mantenga la función de unión del polipéptido CD154. Más particularmente, el péptido debe mantener generalmente la estructura secundaria y terciaria global del polipéptido CD154, que puede incluir el mantenimiento del espaciado de las secuencias CD154 que flanquean el péptido una vez insertado.

En algunos aspectos, el polipéptido CD154 quimérico se administra antes del al menos un inhibidor de punto de control inmunitario, simultáneamente con el al menos un inhibidor de punto de control inmunitario o después del al menos un punto de control inmunitario. En particular, el polipéptido CD154 quimérico y al menos un inhibidor de punto de control inmunitario se administran simultáneamente.

En algunos aspectos, el polipéptido CD154 quimérico y/o el inhibidor de punto de control inmunitario se administran por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intratraqueal, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía endoscópica, por vía intralesional, por vía percutánea, por vía subcutánea, por vía regional o por inyección o perfusión directa. En aspectos particulares, el polipéptido CD154 quimérico y/o el al menos un inhibidor de punto de control inmunitario se administran por inyección intratumoral directa. En determinados aspectos, el polipéptido CD154 quimérico y/o el al menos un inhibidor de punto de control inmunitario se administran por vía local o por vía regional.

En aspectos adicionales, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de riñón de células claras, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas de pulmón, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de células renales, cáncer de pulmón microcítico (CPM), cáncer de mama triple negativo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular, linfoma de Hodgkin (LH), linfoma de células del manto (LCM), mieloma múltiple (MM), proteína de la leucemia de células mieloides 1 (Mcl-1), síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma no Hodgkin (LNH) o linfoma linfocítico pequeño (LLP). En aspectos particulares, el cáncer es un melanoma. Incluso más particularmente, el melanoma es un melanoma metastásico.

En aspectos adicionales, la terapia de combinación comprende además al menos un agente terapéutico adicional. En algunos aspectos, el al menos un agente terapéutico adicional es quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, radioterapia o bioterapia.

En determinados aspectos, el número de linfocitos T CD8 e interferón gamma (IFNy)-positivos (CD8+IFN^y+) se eleva en el sujeto con respecto a antes de la administración de la terapia de combinación. En algunos aspectos, los linfocitos T c D8+IFNy+ son linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de antígenos tumorales. Por ejemplo, los linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de antígenos tumorales son linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de p15E. En aspectos particulares, los linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de p15E comprenden al menos el 1,5% de los linfocitos T CD8+IFNy+ totales en la sangre periférica del sujeto. Incluso más particularmente, los linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de p15E comprenden al menos el 2 % de los linfocitos T CD8+IFN^y+ totales en la sangre periférica del sujeto

En algunos aspectos, el polipéptido CD154 quimérico se proporciona administrando a dicho sujeto una región codificante para el polipéptido CD154 quimérico en un vector de expresión y bajo el control de un promotor activo en una célula eucariota. En determinados aspectos, el casete de expresión está en un vector vírico. En algunos aspectos, el vector vírico es un vector adenovírico. En otros aspectos, el polipéptido CD154 quimérico se administra a dicho sujeto.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

FIG. 1A-1F: Actividad antitumoral de ad-CD40L. (FIG. 1A) Esquema de la estrategia de tratamiento. (FIG. 1B) El día 10, se tiñeron leucocitos tumorales para CD45, CD8 y tetrámero Ova y se analizaron por citometría de flujo. (FIG. 1C) La relación de células CD8 a CD4 se evaluó en ratones tratados y sin tratar. Los ratones tratados con rAd.CD40L tenían una relación CD8/CD4 significativamente superior en comparación con los ratones tratados con rAd.vacío. (FIG. 1D) Curva de supervivencia de ratones tratados con ad-CD40L (ad-ISF35) o con vector adenovírico de control. El ad-CD40L utilizado en todos los experimentos de la presente divulgación fue ad-ISF35. El rD.CD40L dio lugar a una mayor supervivencia en comparación con el control. (FIG. 1E) Curva de supervivencia de ratones con agotamiento de linfocitos T CD8 solo o en combinación con ad-CD40L. El ISF-35 tuvo la mayor supervivencia, seguido del agotamiento de CD8_ISF-35, PBS y agotamiento de CD8+PBS. (FIG.

1F) Porcentaje de células CD8+IFNg+ (izquierda) y datos acumulados (derecha). Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes y se analizaron mediante ensayo t de dos colas no apareado. *p<0,05. Las barras de error son ETM. El análisis de supervivencia se realizó con el ensayo de rango logarítmico.

FIG. 2A-2G: Eficacia de la terapia de combinación. (FIG.2A) Regulación positiva de PD-1 y (FIG. 2F) CTLA-4 en linfocitos T CD8 asociadas a tumores después del tratamiento con ad-CD40L. (FIG. 2B) Estrategia de tratamiento para la terapia de combinación. (FIG. 2C) Se representan curvas de crecimiento de tumores para ratones individuales. (FIG. 2D) Linfocitos T FN-Y+CD8+ intracelulares específicos de p15E en CMSP el día 15 después del tratamiento indicado. Supervivencia de los ratones después del tratamiento sistémico con (FIG. 2E) anti-PD-LI o (FIG. 2G) anti-CTLA-4 y/o ad-CD40L intratumoral. ISF+anti-PDLI tuvo la mayor supervivencia, seguido de ISF-35 y anti-PDL1. Los datos se analizan mediante ensayo t de dos colas no apareado. *p<0,05. Las barras de error son ETM. El análisis de supervivencia se realizó con el ensayo de rango logarítmico

FIG. 3A-3C: Efecto sinérgico de la terapia de ad-CD40L y anti-CTLA-4 más anti-PD-1. (FIG. 3A) Curva de supervivencia de ratones portadores de B16-F10 subcutáneo tratados con ad-CD40L intratumoral y/o anticuerpos sistémicos anti-CTLA-4 más anti-PD1. rAdCD40L+anti-CTLA4+anti-PD1 tuvo el mayor porcentaje de supervivencia, seguido de rADCD40L, anti-CTLA-4+anti-PD1 y ningún tratamiento. (FIG. 3B) Imagen de vitíligo en el sitio tumoral en ratón curado. (FIG. 3C) Crecimiento tumoral de ratones curados vueltos a exponer al tumor B16.F10 en el flanco opuesto. Los datos se analizan mediante ensayo t de dos colas no apareado. *p<0,05. Las barras de error son ETM. El análisis de supervivencia se realizó con el ensayo de rango logarítmico.

FIG. 4A-4D: ad-CD40L y el bloqueo de punto de control (anti-CTLA-4 más anti-PD-1) hacen sinergia para suprimir tumores locales y distantes y generar inmunidad sistémica. (FIG.4A) Esquema de la estrategia de tratamiento. (FIG. 4B) Curva de supervivencia de ratones que recibieron los tratamientos indicados. El ISF35 tuvo el mayor porcentaje de supervivencia, seguido de ISF35, virus de control, anti-PDA+anti-CTLA4 y ningún tratamiento. (FIG. 4C) Porcentaje de linfocitos T CD8 específicos de antígeno tumoral (p15E) en circulación.

(FIG. 4D) Curvas de crecimiento tumoral de tumores B16.F10 tratados y distantes. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes y se analizaron mediante ensayo t de dos colas no apareado. *p<0,05. Las barras de error son ETM. El análisis de supervivencia se realizó con el ensayo de rango logarítmico

FIG. 5A-5B: ad-CD40L y el bloqueo de punto de control (anti-CTLA-4 más anti-PD-1) hacen sinergia para suprimir tumores cerebrales tratados y sin tratar locales. (FIG. 5A) Esquema de la estrategia de tratamiento.

(FIG. 5B) Curva de supervivencia de ratones que recibieron los tratamientos indicados. El análisis de supervivencia se realizó con el ensayo de rango logarítmico. ISF+anti-PD1+anti-CTLA4 tuvo el mayor porcentaje de supervivencia, seguido de ISF35, anti-PDA+anti-CTLA4 y ningún tratamiento.

La presente divulgación supera varios problemas importantes asociados a las tecnologías actuales proporcionando métodos y composiciones para potenciar la función de una célula inmunitaria a través de la combinación de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD 154 quimérico. En este método, los linfocitos T CD8, tales como los linfocitos T CD8 que producen interferón gamma (IFN^y), tienen una actividad potenciada de cebado, activación, proliferación y/o citolítica.

La presente divulgación proporciona además una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso en un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto. En particular, el cáncer es un melanoma metastásico. En algunos aspectos, el método da como resultado un número elevado de linfocitos T CD8+IFNy+, tales como linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de antígeno tumoral.

Particularmente, el polipéptido CD154 quimérico en los métodos de la presente divulgación comprende un subdominio extracelular de CD154 humano que se une a un receptor de CD154 humano y un subdominio extracelular de CD154 no humano que reemplaza un sitio de escisión de CD154 humano. Por ejemplo, un subdominio extracelular de CD154 humano que comprende un sitio de escisión se reemplaza por un subdominio extracelular de CD154 no humano, tal como CD154 murino. En realizaciones particulares, el polipéptido CD154 quimérico es ISF35. En un método, el polipéptido CD154 quimérico se entrega en un casete de expresión, tal como un vector adenovírico, que codifica el polipéptido, en particular bajo el control de un promotor activo en una célula eucariota.

En algunos aspectos, el inhibidor de punto de control inmunitario es un antagonista de unión al eje de la muerte celular programada 1 (PD-1) humana. Por ejemplo, el antagonista de unión al eje de PD-1 es un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PDL1 y un antagonista de unión a PDL2. En un método, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 tal como nivolumab. En aspectos adicionales, el inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA-4. Particularmente, se administran dos inhibidores de punto de control inmunitario, tales como un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-CTLA-4.

Por tanto, los métodos que se divulgan en el presente documento permiten el tratamiento de un cáncer y/o la potenciación de la función inmunitaria que pueden producir una respuesta de linfocitos T CD8 fuerte, tal como en tumores, así como un efecto terapéutico sólido. A continuación se describen realizaciones y ventajas adicionales de la presente divulgación.

I. Definiciones

Como se usa en el presente documento, "esencialmente libre", en términos de un componente específico, se usa en el presente documento para decir que ninguno de los componentes especificados se ha formulado a propósito en una composición y/o está presente solo como contaminante o en cantidades traza. Por tanto, la cantidad total del componente especificado resultado de cualquier contaminación involuntaria de una composición es muy inferior al 0,05 %, en particular inferior al 0,01 %. Mucho más particular es una composición en la que no puede detectarse ninguna cantidad del componente especificado con métodos analíticos convencionales.

Como se usa en el presente documento, la especificación, "un" o "uno/una" pueden significar uno o más. Como se usa en el presente documento en la reivindicación o reivindicaciones, cuando se usa junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "uno/una" pueden significar uno o más de uno.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para decir "y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalde una definición que se refiere solo a alternativas e "y/o". Como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más.

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, empleándose el método para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

El término "quimérico" se define como que tiene secuencias de al menos dos especies diferentes. Por ejemplo, un polipéptido CD154 quimérico es quimérico porque está compuesto por dominios o subdominios CD154 de al menos dos especies diferentes, en particular CD154 humano y de ratón.

Como se usa en el presente documento, la expresión "CD154 quimérico" o "construcción de ISF quimérico" se refiere a un ligando compuesto por al menos un dominio o subdominio de CD154 de una especie y al menos un dominio o subdominio de CD154 de una especie diferente. En particular, las al menos dos especies de las que deriva el CD154 quimérico son el CD154 humano y el murino.

Como se usa en el presente documento, el término "subdominio" se refiere a una secuencia de al menos dos aminoácidos que forma parte de un dominio de CD154. Un "subdominio" también abarca una secuencia de aminoácidos de la que se han suprimido uno o más aminoácidos, incluyendo uno o más aminoácidos truncados desde un extremo de la secuencia.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de escisión" se refiere a una secuencia de aminoácidos que es reconocida por proteasas, normalmente metaloproteasas de la matriz (MMP) que escinden el CD154 de la superficie de la célula que lo expresa. El sitio de escisión de CD154 se encuentra normalmente en los límites de los dominios III y IV de CD154 o alrededor de los mismos. Por ejemplo, un sitio de escisión comprende la región situada aproximadamente entre los aminoácidos 108 y 116 del CD154 humano.

Como se usa en el presente documento, el término "correspondiente" se refiere a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de CD154 de una especie que es homóloga a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de CD154 de otra especie. Esta homología se basa en la similitud de la estructura secundaria, tal como la ubicación de los límites del dominio, entre CD154 de diferentes especies.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "menos susceptible a la escisión" o "escisión reducida" se refieren a la mayor resistencia de un CD154 quimérico a la escisión proteolítica en comparación con la del CD154 humano nativo, según se mide por la cantidad de CD154 soluble generado por un número dado de células durante un período de tiempo. En particular, un CD154 quimérico de la presente divulgación es "menos susceptible a la escisión" porque se escinde a una tasa al menos un 50 %, al menos un 75 % o al menos un 90 % inferior a la del CD154 nativo.

El término "exógeno", cuando se usa con respecto a una proteína, gen, ácido nucleico o polinucleótido en una célula u organismo se refiere a una proteína, gen, ácido nucleico o polinucleótido que se ha introducido en la célula u organismo por medios artificiales o naturales; o con respecto a una célula, el término se refiere a una célula que se aisló y posteriormente se introdujo en otras células o en un organismo por medios artificiales o naturales. Un ácido nucleico exógeno puede provenir de un organismo o célula diferente, o puede ser una o más copias adicionales de un ácido nucleico que se produce de forma natural dentro del organismo o célula. Una célula exógena puede provenir de un organismo diferente o puede provenir del mismo organismo. A modo de ejemplo no limitante, un ácido nucleico exógeno es uno que está en una ubicación cromosómica diferente de la que tendría en las células naturales, o que de otro modo está flanqueado por una secuencia de ácido nucleico diferente de la que se encuentra en la naturaleza.

Por "construcción de expresión" o "casete de expresión" se entiende una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la transcripción. Una construcción de expresión incluye, como mínimo, uno o más elementos de control de la transcripción (tales como promotores, potenciadores o una estructura funcionalmente equivalente a los mismos) que dirigen la expresión génica en uno o más tipos celulares, tejidos u órganos deseados. También pueden incluirse elementos adicionales, tales como una señal de terminación de la transcripción.

Un "vector" o "construcción" (en ocasiones denominado sistema de entrega de genes o "vehículo" de transferencia de genes) se refiere a una macromolécula o complejo de moléculas que comprende un polinucleótido que ha de entregarse a una célula hospedadora, tanto in vitro como in vivo.

Un "plásmido", un tipo común de un vector, es una molécula de ADN extracromosómico separada del ADN cromosómico que es capaz de replicarse independientemente del ADN cromosómico. En determinados casos, es circular y bicatenaria.

Un "origen de replicación" ("ori") u "origen de replicación" es una secuencia de ADN, por ejemplo, en un virus de herpes linfotrópico, que cuando está presente en un plásmido en una célula es capaz de mantener secuencias unidas en el plásmido y/o un sitio donde se inicia la síntesis de ADN o cerca del mismo. Como ejemplo, un ori para el VEB incluye secuencias FR (20 copias imperfectas de una repetición de 30 pb) y, particularmente, secuencias DS; sin embargo, otros sitios en el VEB se unen a EBNA-1, por ejemplo, las secuencias DS pueden sustituir por Rep* como origen de replicación (Kirshmaier y Sugden, 1998). Por tanto, un origen de replicación del VEB incluye secuencias FR, DS o Rep* o cualesquier secuencias funcionalmente equivalentes a través de modificaciones de ácido nucleico o una combinación sintética derivada de las mismas. Por ejemplo, la presente divulgación también puede usar un origen de replicación del VEB modificado por ingeniería genética, tal como mediante inserción o mutación de elementos individuales, como se describe específicamente en Lindner, et. al., 2008.

Un "gen", "polinucleótido", "región codificante", "secuencia", "segmento", "fragmento" o "transgén" que "codifica" una proteína particular, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe y opcionalmente también se traduce en un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, in vitro o in vivo cuando se ponen bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. La región codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de ADN, la molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria (es decir, la cadena sentido) o bicatenaria. Los límites de una región codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Un gen puede incluir, pero sin limitación, ADNc a partir de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN procariota o eucariota y secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción por lo general se ubicará en dirección 3' de la secuencia génica.

La expresión "elementos de control" se refiere colectivamente a regiones promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés), potenciadores, uniones de corte y empalme, y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, la transcripción, el procesamiento postranscripcional y la traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No es necesario que todos estos elementos de control estén presentes siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula hospedadora apropiada.

El término "promotor" se usa en el presente documento en su sentido habitual para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, donde la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (dirección 3'). Puede contener elementos genéticos a los que pueden unirse proteínas y moléculas reguladoras, tales como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción, para iniciar la transcripción específica de una secuencia de ácido nucleico. Las expresiones "colocado operativamente", "unido operativamente", "bajo control" y "bajo control de la transcripción" significan que un promotor está en una ubicación y/u orientación funcional correcta con respecto a una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y/o la expresión de esa secuencia.

Por "potenciador" se entiende una secuencia de ácido nucleico que, cuando se coloca cerca de un promotor, confiere una mayor actividad de transcripción con respecto a la actividad de transcripción resultante del promotor en ausencia del dominio potenciador.

Por "unido operacionalmente" o "coexpresado" con referencia a moléculas de ácido nucleico se entiende que dos o más moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que ha de transcribirse, un promotor y un elemento potenciador) están conectados de manera que permiten la transcripción de la molécula de ácido nucleico. "Unido operacionalmente" o "coexpresado" con referencia a moléculas peptídicas y/o polipeptídicas significa que dos o más moléculas peptídicas y/o polipeptídicas se conectan de manera que producen una única cadena polipeptídica, es decir, un polipéptido de fusión, que tiene al menos una propiedad de cada componente peptídico y/o polipeptídico de la fusión. El polipéptido de fusión es, en particular, quimérico, es decir, compuesto por moléculas heterólogas.

"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos. La correspondencia entre una secuencia y otra puede determinarse mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas polipeptídicas, alineando la información de secuencia y usando programas informáticos fácilmente disponibles. Como alternativa, la homología puede determinarse mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones que promuevan la formación de dúplex estables entre regiones homólogas, seguida de la digestión con una o más nucleasas específicas de una sola cadena y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de ADN, o de dos polipéptidos, son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando al menos aproximadamente el 80 %, en particular al menos aproximadamente el 90 % y mucho más particularmente al menos aproximadamente el 95 % de los nucleótidos, o aminoácidos, respectivamente, coinciden en una longitud definida de las moléculas, según se determina usando los métodos anteriores.

La expresión "ácido nucleico" se referirá generalmente a al menos una molécula o cadena de ADN, ARN o un derivado o imitación de los mismos, que comprende al menos una nucleobase, tal como, por ejemplo, una base púrica o pirimidínica de origen natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, adenina "A" guanina "G", timina "T" y citosina "C") o el ARN (por ejemplo, A, G, uracilo "U" y C). La expresión "ácido nucleico" abarca los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido". El término "oligonucleótido" se refiere a al menos una molécula de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleobases de longitud. El término "polinucleótido" se refiere a al menos una molécula de más de aproximadamente 100 nucleobases de longitud. Estas definiciones se refieren generalmente a al menos una molécula monocatenaria, pero en realizaciones específicas, también abarcará al menos una cadena adicional que es parcialmente, sustancialmente o totalmente complementaria a la al menos una molécula monocatenaria. Por tanto, un ácido nucleico puede abarcar al menos una molécula bicatenaria o al menos una molécula tricatenaria que comprende una o más cadenas complementarias o uno o más "complementos" de una secuencia particular que comprende una cadena de la molécula.

La expresión "beneficio terapéutico" utilizada a lo largo de la presente solicitud se refiere a cualquier cosa que promueva o potencie el bienestar del paciente con respecto al tratamiento médico de su cáncer. Una lista de ejemplos no exhaustivos de esto incluye la prolongación de la vida del paciente durante cualquier período de tiempo; la disminución o el retraso del desarrollo neoplásico de la enfermedad; la disminución de la hiperproliferación; la reducción del crecimiento tumoral; el retraso de las metástasis; la reducción de la tasa de proliferación de una célula cancerosa o una célula tumoral; la inducción de la apoptosis en cualquier célula tratada o en cualquier célula afectada por una célula tratada; y una disminución del dolor del paciente que pueda atribuirse a la afección del paciente.

Una "cantidad eficaz" es, al menos, la cantidad mínima necesaria para efectuar una mejora o una prevención medibles de un trastorno particular. Una cantidad eficaz en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del paciente, y la capacidad del anticuerpo para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del tratamiento es superado por los efectos terapéuticos beneficiosos. Para el uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como disminuir uno o más síntomas resultado de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, potenciar efecto de otra medicación, tal como el direccionamiento, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia. En el caso de un cáncer o tumor, una cantidad eficaz del fármaco puede tener el efecto de reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto o, deseablemente, detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y, deseablemente, detener) la metástasis tumoral; inhibiendo hasta cierto punto el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados al trastorno. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. A los efectos de los presentes métodos, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no conseguirse en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una "cantidad eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, puede conseguir o consigue un resultado deseable.

Como se usa en el presente documento, "vehículo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para principios activos farmacéuticos es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones principios activos complementarios.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que tiene una forma que permite que la actividad biológica del principio activo sea eficaz y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación. Dichas formulaciones son estériles. Los excipientes (vehículos, aditivos) "farmacéuticamente aceptables" son aquellos que pueden administrarse razonablemente a un mamífero objeto para proporcionar una dosis eficaz del principio activo empleado.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a la intervención clínica diseñada para alterar el curso natural del individuo o de la célula que se están tratando durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejoría o la paliación de la patología y la remisión o la mejora del pronóstico. Por ejemplo, un individuo se "trata" satisfactoriamente si se mitigan o eliminan uno o más síntomas asociados al cáncer, incluyendo, pero sin limitación, reducir la proliferación de (o destruir) las células cancerosas, disminuir los síntomas resultado de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos.

Un agente "antineoplásico" es capaz de afectar negativamente a una célula cancerosa/tumor en un sujeto, por ejemplo, promoviendo la destrucción de células cancerosas, induciendo la apoptosis en las células cancerosas, reduciendo la tasa de crecimiento de las células cancerosas, reduciendo la incidencia o el número de metástasis, reduciendo el tamaño tumoral, inhibiendo el crecimiento tumoral, reduciendo el suministro de sangre a un tumor o a las células cancerosas, promoviendo una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas o un tumor, previniendo o inhibiendo la progresión del cáncer, o aumentando la esperanza de vida de un sujeto con cáncer. El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones de origen natural, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos individuales. En determinadas realizaciones, un anticuerpo monoclonal de este tipo normalmente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, donde la secuencia polipeptídica de unión a la diana se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana de entre una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un único clon entre una pluralidad de clones, tal como un conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe comprenderse que una secuencia de unión a la diana seleccionada puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a la diana alterada es también un anticuerpo monoclonal de la presente divulgación. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante de un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas en el sentido de que normalmente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

La expresión "antagonista de unión al eje de PD-1" se refiere a una molécula que inhibe la interacción de un compañero de unión al eje de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, para eliminar la disfunción de los linfocitos T resultante de la señalización en el eje de señalización de PD-1, siendo el resultado restaurar o potenciar la función de los linfocitos T (por ejemplo, la proliferación, la producción de citocinas, la destrucción de células diana). Como se usa en el presente documento, un antagonista de unión al eje de PD-1 incluye un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2.

La expresión "antagonista de unión a PD-1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1 y/o PD-L2. En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, Los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. En una realización, un antagonista de unión a PD-1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T que median la señalización a través de PD-1, para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1. En un aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MDX-1106 (nivolumab). En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MK-3475 (pembrolizumab). En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es CT-011 (pidilizumab). En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es AMP-224.

La expresión "antagonista de unión a PD-L1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1 o B7-1. En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1 y/o B7-1. En algunas realizaciones, los antagonistas de unión a PD-L1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1 o B7-1. En una realización, un antagonista de unión a PD-L1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T que median la señalización a través de PD-L1, para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-Ll. En un aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-Ll es YW243,55.S70. En otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-Ll es MDX-1105. En otro aspecto específico más, un anticuerpo anti-PD-Ll es MPDL3280A. En otro aspecto específico más, un anticuerpo anti-PD-Ll es MEDI4736.

La expresión "antagonista de unión a PD-L2" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-1. En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L2 es una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L2 inhibe la unión de PD-L2 a PD-1. En algunas realizaciones, los antagonistas de PD-L2 incluyen anticuerpos anti-PD-L2, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-1. En una realización, un antagonista de unión a PD-L2 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T que median la señalización a través de PD-L2, para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunas realizaciones, un antagonista de unión a PD-L2 es una inmunoadhesina.

La expresión "punto de control inmunitario" se refiere a un componente del sistema inmunitario que proporciona señales inhibidoras a sus componentes con el fin de regular reacciones inmunitarias. Las proteínas de punto de control inmunitario conocidas comprenden CTLA-4, PD1 y sus ligandos PD-L1 y PD-L2 y, además, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR. Se reconoce en la técnica que las vías que implican L^aG3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3 y KIR constituyen vías de control inmunitario similares a las vías dependientes de CTLA-4 y PD-1 (véase, por ejemplo, Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264; Mellman et al., 2011. Nature 480:480-489).

Un "inhibidor de punto de control inmunitario" se refiere a cualquier compuesto que inhibe la función de una proteína de punto de control inmunitario. La inhibición incluye la reducción de la función y el bloqueo total. En particular, la proteína de punto de control inmunitario es una proteína de punto de control inmunitario humana. Por tanto, el inhibidor de proteína de punto de control inmunitario, en particular, es un inhibidor de una proteína de punto de control inmunitario humana.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "ligando CD40", "CD40-L" y "CD154" se usan indistintamente en el presente documento. Por ejemplo, una construcción adenovírica que codifica un ligando CD40 quimérico puede denominarse ad-CD40L.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos", "antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos", "CTLA-4", "CTLA-4", "antígeno CTLA-4" y "CD152" (véase, por ejemplo, Murate, Am. J. Pathol. 155:453-460, 1999) se usan indistintamente, e incluyen variantes, isoformas, especies homólogas de CTLA-4 humano y análogos que tengan al menos un epítopo común con CTLA-4 (véase, por ejemplo, Balzano, Int. J. Cancer Supl. 7:28-32, 1992).

II. CD40 y ligando de CD40

CD40 es una glicoproteína de 50 Kd que se expresa en la superficie de linfocitos B, células dendríticas, epitelio normal y algunos carcinomas epiteliales (Briscoe et al., 1998). El ligando de CD40, CD40L, se expresa en linfocitos T activados, células dendríticas humanas, células endoteliales vasculares humanas, células musculares lisas y macrófagos. CD40L existe en dichas células como una estructura trimérica, que induce la oligomerización de su receptor tras la unión.

El ligando CD40 (CD40-L o gp39) es un polipéptido de membrana de tipo II que tiene una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. El ligando CD40 se ha clonado y secuenciado, y se han publicado secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos humanas (números de acceso de GenBank Z15017/S49392, D31793-7, X96710, L07414 y X67878/S50586), murina (número de acceso de GenBank X65453), bovina (número de acceso de GenBank Z48469), canina (número de acceso de GenBank AF086711), felina (número de acceso de GenBank AF079105) y de rata (números de acceso de GenBank AF116582, AF013985). Dichas secuencias murina, bovina, canina, felina y de rata también se divulgan en la Patente de los EE.UU. N.° 6482411. Se divulgan secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos adicionales del ligando CD40 en las Patentes de los EE.UU. N.° 5.565.321 y 5.540.926, y se divulgan secuencias mutantes del ligando CD40 en la Patente de los EE.UU. N.° 5.716.805 y en las Solicitudes de Patente de los EE.UU., N.° de Serie 08/484.624 y 09/088.913.

En algunas realizaciones, pueden usarse uno o más agonistas de CD40, tales como ligandos CD40 y/o anticuerpos agonistas anti-CD40, en combinación con uno o más inhibidores de punto de control inmunitario para potenciar la función inmunitaria o para tratar una afección neoplásica. Por ejemplo, pueden usarse polipéptidos de ligando CD40 conocidos en la técnica en una terapia de combinación para tratar el cáncer (Patente de los EE.UU. N.° 6482411). Todos los agonistas de CD40 son adecuados para su uso en los métodos proporcionados en el presente documento, siempre que se unan y activen uno o más receptores de CD40 en una célula neoplásica. Un agonista de CD40 que se une a un receptor de CD40 en una célula neoplásica y lo activa es un componente o agente biológico o químico que estimula la señalización celular a través de ^cD40 en dichas células. Por ejemplo, el agonista de CD40 es un anticuerpo anti-CD40 agonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo, incluyendo, pero sin limitación, al menos una primera región de unión a antígeno scFv, Fv, Fab', Fab o F(ab^')2de un anticuerpo anti-CD40. En determinados aspectos, el agonista de CD40 es un anticuerpo anti-CD40 quimérico humano, humanizado o parcialmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otros aspectos, el agonista de CD40 es un anticuerpo monoclonal anti-CD40, incluyendo, pero sin limitación, el anticuerpo monoclonal G28-5, mAb89, EA-5 o S2C6, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

A. Polipéptidos CD154 quiméricos

CD154 (también conocido como ligando CD40) es un miembro de una familia más grande de ligandos, denominada colectivamente como la superfamilia del TNF (Gruss et al., Cytokines Mol Ther, 1:75-105, 1995 y Locksley et al, Cell, 104:487-501, 2001). Los miembros de la superfamilia del TNF incluyen el ligando Fas ("FasL"), TNFa, LTa, linfotoxina (TNFp), CD154, TRAIL, CD70, ligando CD30, ligando 4-1BB, APRIL, TWEAK, ligando RANK, LIGHT, ligando AITR, ectodisplasina, BLYS, VEGI y ligando OX40. Los miembros de la superfamilia del TNF comparten una estructura secundaria conservada que comprende cuatro dominios: dominio I, el dominio intracelular; dominio II, que atraviesa la membrana celular y se conoce como el dominio transmembrana; dominio III, que consiste en los aminoácidos extracelulares más cercanos a la membrana celular; y dominio IV, el dominio extracelular distal. Normalmente, al menos una parte del dominio IV puede escindirse de la molécula parental. El fragmento escindido con frecuencia presenta la misma actividad biológica que el ligando intacto y se denomina convencionalmente una "forma soluble" del miembro de la familia del TNF. Pueden prepararse versiones solubles del ligando CD40 a partir de la región extracelular, o un fragmento de la misma, y se ha descubierto un ligando CD40 soluble en sobrenadantes de cultivos de células que expresan una versión del ligando CD40 unida a membrana, tales como las células EL-4.

Las interacciones entre CD154 y su receptor afín, CD40, son críticas para el reconocimiento inmunitario. (Banchereau J. et al., Annu. Rev. Immunol. 12:881-922, 1994). CD154 se expresa transitoriamente en linfocitos T CD4+ después de que las células presentadoras de antígenos se acoplen al receptor de linfocitos T a través de moléculas de MHC de clase II (Cantwell M. et al., Nat. Med., 3:984-989, 1997). Esto, a su vez, puede provocar la activación de células presentadoras de antígenos (CPA) que expresan CD40, incluyendo linfocitos B, células dendríticas, monocitos y macrófagos (Ranheim E. A. et al., Cell. Immunol., 161:226-235, 1995). Dichas células activadas por CD40 pueden desencadenar una cascada de eventos de activación inmunitaria que conducen a una respuesta inmunitaria específica y eficaz contra antígenos extraños, tales como virus o tumores.

Se sabe en la técnica que al menos una parte del CD154 humano se escinde de la molécula parental y se convierte en una molécula soluble, sin embargo, la forma soluble generalmente no es deseable. Por tanto, el polipéptido CD154 quimérico de la presente divulgación puede formarse intercambiando un aminoácido o una secuencia de aminoácidos, del CD154 humano que comprende un sitio de escisión reconocido por enzimas proteolíticas con un aminoácido, o secuencia de aminoácidos, de CD154 no humano, que no contiene este sitio de escisión. Como alternativa, el polipéptido CD154 quimérico puede incluir una mutación puntual en el sitio de escisión, o un péptido que reemplaza el sitio de escisión, pero que, por lo demás, no altera sustancialmente la función de unión de CD154.

En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica de CD154 quimérico comprende una primera secuencia nucleotídica que codifica un subdominio extracelular de CD154 no humano que corresponde a un sitio de escisión del CD154 humano y lo reemplaza. El polipéptido CD154 quimérico puede producirse reemplazando un subdominio de CD154 humano que contiene un sitio de escisión de CD154 por el subdominio correspondiente de CD154 no humano, dando como resultado un CD154 quimérico que es notablemente menos susceptible a la escisión que el CD154 humano. La primera secuencia de nucleótidos puede unirse operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un subdominio extracelular de CD 154 humano implicado en la unión a un receptor de CD 154 humano, tal como el ligando CD40. De esta manera, la secuencia polinucleotídica de la presente divulgación codifica un CD154 quimérico que se une a células humanas que expresan el receptor de CD154. Por otra parte, en algunos aspectos, un dominio extracelular de CD154 murino y humano incluye al menos un aminoácido, o una secuencia de aminoácidos, que permite la expresión de la molécula en las membranas de células murinas y humanas.

Los polipéptidos CD154 quiméricos de la presente divulgación son quiméricos en el sentido de que pueden estar compuestos por dominios o subdominios CD154 de al menos dos especies diferentes, en particular CD154 humano y de ratón. Estos polipéptidos se designan "factores estimuladores inmunitarios", o FEI, porque combinan regiones de CD154 humano y no humano para maximizar la estimulación de la respuesta inmunitaria. Específicamente, al menos un dominio o subdominio de CD154 que contiene un sitio de escisión de CD154 humano se reemplaza por un dominio o subdominio correspondiente de CD154 no humano, en particular CD154 murino. Además, el polipéptido quimérico se compone de un dominio o subdominio de CD154 humano que es responsable de la unión de un receptor de CD154.

Se describen polipéptidos quiméricos CD154 o CD40L para su uso en la presente divulgación en las Patentes de los EE.UU. N.° 7.495.o9o y 7.928.213. Por ejemplo, el dominio IV de CD154 humano puede unirse a los dominios I, II y III de CD154 murino. Se proporcionan ejemplos de dichas secuencias polinucleotídicas en el presente documento como las SEQ ID. NO. 1, 3, 5, 7, 9 y 11 y codifican construcciones de CD154 quimérico designadas como ISF 30, 32, 34, 36, 38 y 40, respectivamente. Adicionalmente, el dominio IV de CD154 humano puede unirse a los dominios 1, II y III de CD154 humano. Se proporcionan ejemplos de dichas secuencias polinucleotídicas como las SEQ ID. NO.

2, 4, 6, 8, 10 y 12, y codifican construcciones de CD154 quimérico que se designan ISF 31, 33, 35, 37, 39 y 41, respectivamente. En particular, el polipéptido CD154 quimérico es ISF35.

B. Métodos de entrega de polipéptidos

En algunas realizaciones, el polipéptido CD154 quimérico se entrega en nanopartículas. Por ejemplo, las nanopartículas están hechas de polímeros biodegradables tales como ácido poli láctico, policaprolactona, poli(ácido láctico-co-glicólico), el anhídrido poli(fumárico-co-sebácico) quitosano y quitosano modificado. Como alternativa, el polipéptido CD154 quimérico se entrega en liposomas, liposomas PEGilados, niosomas o acuasomas. Pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica para la entrega de péptidos o proteínas, tales como se describen en las Patentes de los EE.UU. N.° 8288113 y 5641670, y en las Publicaciones de Patente de los EE.UU. N.° 20100291065, 20140242107, 2014023213, 20150191710 y 2010026678.

En algunas realizaciones, el polipéptido CD154 quimérico se proporciona en una construcción de expresión. En particular, la construcción de CD154 quimérico se estabilizaría en la membrana y sería resistente a la escisión proteolítica y, por tanto, sería menos probable que generara la forma soluble de CD154. Sin embargo, la construcción de CD154 quimérico en particular mantendría la función de unión al receptor del CD154 nativo. Por otra parte, una construcción de CD154 particular no sería inmunogénica en el dominio crítico para la unión al receptor después de la administración en seres humanos, evitando por tanto la neutralización funcional.

Un experto en la materia estaría bien equipado para construir un vector a través de técnicas recombinantes convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001 y Ausubel et al., 1996). Los vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófago, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC), tales como vectores retrovíricos (por ejemplo, derivados de vectores del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SⁿV etc), vectores lentivíricos (por ejemplo, derivados de VIH-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV etc.), vectores adenovíricos (Ad), incluyendo formas competentes para la replicación, deficientes para la replicación y "evisceradas" de los mismos, vectores víricos adeno-asociados (Aa V), vectores del virus de simio 40 (SV-40), vectores del virus del papiloma bovino, vectores del virus de Epstein-Barr, vectores del virus del herpes, vectores del virus de la vaccinia, vectores del virus del sarcoma murino Harvey, vectores del virus del tumor mamario murino, vectores del virus del sarcoma de Rous.

1. Vectores víricos

Pueden proporcionarse vectores víricos que codifican el polipéptido CD154 quimérico en determinados aspectos de la presente divulgación. En la generación de vectores víricos recombinantes, los genes no esenciales normalmente se reemplazan por un gen o una secuencia codificante de una proteína heteróloga (o no nativa). Un vector vírico es un tipo de construcción de expresión que utiliza secuencias víricas para introducir ácido nucleico y posiblemente proteínas en una célula. La capacidad de determinados virus para infectar células o entrar en células a través de endocitosis mediada por receptores, así como para integrarse en los genomas de células hospedadoras y expresar genes víricos de forma estable y eficiente, los han convertido en candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos extraños dentro de células (por ejemplo, células de mamífero). A continuación se describen ejemplos no limitantes de vectores víricos que pueden usarse para entregar un ácido nucleico de determinados aspectos de la presente divulgación.

Los lentivirus son retrovirus complejos, que, además de los genes retrovíricos comunes gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. Los vectores lentivíricos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; las Patentes de los EE.UU. 6.013.516 y 5.994.136).

Los vectores lentivíricos recombinantes son capaces de infectar células que no se dividen y pueden usarse para la transferencia de genes tanto in vivo como ex vivo y la expresión de secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, se describe un lentivirus recombinante capaz de infectar una célula que no se divide, donde una célula hospedadora adecuada se transfecta con dos o más vectores que llevan las funciones de empaquetamiento, en concreto, gag, pol y env, así como rev y tat, en la Patente de los EE.UU. 5.994.136.

a. Vector adenovírico

Un método para la entrega del polipéptido CD154 quimérico implica el uso de un vector de expresión de adenovirus. Aunque se sabe que los vectores de adenovirus tienen una capacidad baja de integración en el ADN genómico, esta característica se contrarresta por la eficacia alta de la transferencia génica que ofrecen estos vectores. Los vectores de expresión de adenovirus incluyen construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) respaldar el empaquetamiento de la construcción y (b) expresar en última instancia una construcción génica recombinante que se ha clonado en ella.

Los expertos en la materia conocen el crecimiento y la manipulación de adenovirus, y presentan un amplio intervalo de hospedadores in vitro e in vivo. Este grupo de virus puede obtenerse en títulos elevados, por ejemplo, 109-1011 unidades formadoras de placa por ml, y son altamente infectivos. El ciclo vital del adenovirus no requiere la integración en el genoma de la célula hospedadora. Los genes extraños entregados por los vectores de adenovirus son episómicos y, por tanto, tienen una baja genotoxicidad para las células hospedadoras. No se han notificado efectos secundarios en estudios de vacunación con adenovirus de tipo silvestre (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), lo que demuestra su seguridad y potencial terapéutico como vectores de transferencia génica in vivo.

El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de ADN bicatenario, lineal, de 36 kb, permite la sustitución de trozos grandes de ADN adenovírico con secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). A diferencia de los retrovirus, la infección adenovírica de células hospedadoras no da como resultado la integración cromosómica, debido a que el ADN adenovírico puede replicarse de manera episómica sin potencial genotoxicidad. Además, los adenovirus son estructuralmente estables y no se ha detectado ninguna reordenación genómica después de una amplificación extensa.

El adenovirus es particularmente adecuado para su uso como vector de transferencia génica debido a su genoma de tamaño medio, facilidad de manipulación, título alto, gama amplia de células diana e infectividad alta. Ambos extremos del genoma vírico contienen repeticiones invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases, que son elementos cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento de ADN vírico. Las regiones tempranas (E) y tardías (L) del genoma contienen unidades de transcripción diferentes que se dividen al iniciarse la replicación del ADN vírico. La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma vírico y de algunos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de las proteínas para la replicación del ADN vírico. Estas proteínas están implicadas en la replicación del ADN, la expresión génica tardía y el cierre de la célula hospedadora (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de la cápside vírica, se expresan solo después de un procesamiento significativo de un único transcrito primario emitido por el promotor tardío principal (MLP). El MLP, (ubicado a 16,8 m.u.) es particularmente eficaz durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm emitidos por este promotor poseen una secuencia líder 5-tripartita (TPL) que los convierte en ARNm particulares para la traducción.

Puede generarse un adenovirus recombinante proporcionado en el presente documento a partir de la recombinación homóloga entre un vector lanzadera y un vector provirus. Debido a la posible recombinación entre dos vectores províricos, puede generarse adenovirus de tipo silvestre a partir de este proceso. Por tanto, se aísla un único clon de virus a partir de una placa individual y se examina su estructura genómica.

El vector de adenovirus puede ser de replicación defectuosa, o al menos condicionalmente defectuosa, la naturaleza del vector de adenovirus no se considera crucial para la puesta en práctica satisfactoria de los presentes métodos. El adenovirus puede ser de cualquiera de los 42 serotipos o subgrupos conocidos diferentes A-F. El Adenovirus de tipo 5 del subgrupo C es el material de partida particular con el fin de obtener el vector de adenovirus de replicación defectuosa condicional para su uso en la presente divulgación. Esto se debe a que el Adenovirus de tipo 5 es un adenovirus humano sobre el que se conoce una gran cantidad de información bioquímica y genética, y que históricamente se ha utilizado para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como vector.

Pueden introducirse ácidos nucleicos en vectores adenovíricos en una posición de la que se ha eliminado una secuencia codificante. Por ejemplo, un vector adenovírico de replicación defectuosa puede tener las secuencias codificantes E1 eliminadas. El polinucleótido que codifica el gen de interés también puede insertarse en lugar de la región E3 suprimida en vectores de reemplazo E3 como los descritos por Karlsson et al. (1986) o en la región E4 cuando una estirpe celular auxiliar o un virus auxiliar complementa el defecto de E4.

La generación y la propagación de vectores de adenovirus de replicación deficiente pueden realizarse con estirpes celulares auxiliares. Se transformó una única estirpe de células auxiliares, designada 293, a partir de células de riñón embrionario humano mediante fragmentos de ^aDⁿAd5 y expresa constitutivamente proteínas E1 (Graham et al., 1977). Puesto que la región E3 es prescindible del genoma de adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los vectores de adenovirus, con la ayuda de células 293, llevan ADN extraño en la región E1, la E3, o ambas regiones (Graham y Prevec, 1991).

Las estirpes celulares auxiliares pueden derivar de células humanas, tales como células de riñón embrionario, células musculares, células hematopoyéticas humanas u otras células mesenquimáticas o epiteliales embrionarias humanas. Como alternativa, las células auxiliares pueden derivar de las células de otras especies de mamíferos que sean permisivas para el adenovirus humano. Dichas células incluyen, por ejemplo, células Vero u otras células mesenquimáticas o epiteliales embrionarias de mono. Como se ha indicado anteriormente, una estirpe celular auxiliar particular es 293.

Se conocen en la técnica métodos para producir adenovirus recombinantes, tales como la Patente de los EE.UU. N.° 6740320. Además, Racher et al. (1995) han divulgado métodos mejorados para cultivar células 293 y propagar adenovirus. En un formato, los agregados celulares naturales se cultivan inoculando células individuales en matraces de centrifugado siliconados de 1 litro (Techne, Cambridge, Reino Unido) que contienen 100-200 ml de medio. Después de la agitación a 40 rpm, la viabilidad celular se estima con azul de tripano. En otro formato, se emplean microvehículos Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, Reino Unido) (5 g/1) como se indica a continuación. Se añade un inóculo celular, resuspendido en 5 ml de medio, al vehículo (50 ml) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se deja inmóvil, con agitación ocasional, durante 1 a 4 horas. Después, el medio se reemplaza con 50 ml de medio fresco y se inicia la agitación. Para la producción de virus, se deja que las células crezcan a una confluencia de aproximadamente el 80 %, después de lo cual se reemplaza el medio (al 25 % del volumen final) y se añade adenovirus a una MOI de 0,05. Los cultivos se dejan inmóviles durante la noche, después de lo cual, el volumen se aumenta al 100 % y se comienza a agitar durante otras 72 horas.

b. Vector retrovírico

Adicionalmente, el polipéptido CD154 quimérico puede codificar un vector retrovírico. Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario que se caracterizan por su capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas por un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante después se integra de forma estable en cromosomas celulares en forma de un provirus y dirige la síntesis de proteínas víricas. La integración da como resultado la retención de las secuencias génicas víricas en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retrovírico contiene tres genes, gag, pol y env que codifican proteínas de la cápside, enzima polimerasa y componentes de la envoltura, respectivamente. Una secuencia que se encuentra aguas arriba del gen gag contiene una señal para el empaquetamiento del genoma en viriones. Hay presentes dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) en los extremos 5' y 3' del genoma vírico. Éstas contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes y también son necesarias para la integración en el genoma de la célula hospedadora (Coffin, 1990).

Con el fin de construir un vector retrovírico, se inserta un ácido nucleico que codifica un gen de interés en el genoma vírico en el lugar de determinadas secuencias víricas para producir un virus de replicación defectuosa. Con el fin de producir viriones, se construye una estirpe celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env, pero sin los componentes LTR y de empaquetamiento (Mann et al., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retrovírica y las secuencias de empaquetamiento, se introduce en esta estirpe celular (por precipitación de fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas víricas, que después se secretan en el medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Después, el medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge, opcionalmente se concentra, y se usa para la transferencia génica. Los vectores retrovíricos son capaces de infectar una amplia diversidad de tipos celulares. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de células hospedadoras (Paskind et al., 1975).

La preocupación con el uso de vectores retrovíricos defectuosos es la posible aparición de virus de tipo silvestre competentes para la replicación en las células de empaquetamiento. Esto puede ser el resultado de eventos de recombinación en los que la secuencia intacta del virus recombinante se inserta aguas arriba de la secuencia gag, pol, env integrada en el genoma de la célula hospedadora. Sin embargo, hay disponibles estirpes celulares de empaquetamiento que deberían disminuir en gran medida la probabilidad de recombinación (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).

c. Vector vírico adeno-asociado

El virus adeno-asociado (AAV) es un sistema vectorial atractivo para su uso en la presente divulgación, ya que tiene una frecuencia alta de integración y puede infectar células que no se dividen, haciéndolo útil para la entrega de genes en células de mamífero (Muzyczka, 1992). El AAV tiene una amplia gama de hospedadores para la infectividad (Tratschin, et al., 1984; Laughlin, et al., 1986; Lebkowski, et al., 1988; McLaughlin, et al., 1988), lo que significa que es aplicable para su uso con la presente divulgación. Los detalles relativos a la generación y el uso de vectores rAAV se describen en la Patente de los EE.UU. N.° 5.139.941 y la Patente de los EE.UU. N.° 4.797.368. El AAV es un parvovirus dependiente en el sentido de que requiere la coinfección con otro virus (ya sea adenovirus o un miembro de la familia de los virus del herpes) para experimentar una infección productiva en células cultivadas (Muzyczka, 1992). En ausencia de coinfección con virus auxiliares, el genoma del AAV de tipo silvestre se integra a través de sus extremos en el cromosoma 19 humano, donde reside en estado latente en forma de un provirus (Kotin et al., 1990; Samulski et al., 1991). rAAV, sin embargo, no se restringe al cromosoma 19 para la integración, a menos que la proteína Rep del AAV también se exprese (Shelling y Smith, 1994). Cuando una célula que lleva un provirus AAV se sobreinfecta con un virus auxiliar, el genoma del AAV se "rescate" del cromosoma o de un plásmido recombinante y se establece una infección productiva normal (Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1988; Kotin et al., 1990; Muzyczka, 1992).

Normalmente, el virus AAV recombinante (rAAV) se prepara por cotransfección de un plásmido que contiene el gen de interés flanqueado por las dos repeticiones terminales del AAV (McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989) y un plásmido de expresión que contiene las secuencias codificantes del AAV de tipo silvestre sin las repeticiones terminales, por ejemplo, pIM45 (McCarty et al., 1991). Las células también se infectan o transfectan con adenovirus o plásmidos que llevan los genes de adenovirus necesarios para la función auxiliar del AAV. Las soluciones madre de virus rAAV elaborados de esta manera se contaminan con adenovirus que deben separarse físicamente de las partículas de rAAV (por ejemplo, mediante centrifugación por densidad con cloruro de cesio). Como alternativa, pueden usarse vectores de adenovirus que contengan las regiones codificantes del AAV o estirpes celulares que contengan las regiones codificantes del AAV y algunos o todos los genes ayudantes del adenovirus (Yang et al., 1994; Clark et al., 1995). También pueden usarse estirpes celulares que lleven el ADN del rAAV en forma de un provirus integrado (Flotte et al., 1995).

d. Otros vectores víricos

Pueden emplearse otros vectores víricos como construcciones en la presente divulgación. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como el virus de la vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) y los herpesvirus. Ofrecen varias características atractivas para diversas células de mamíferos (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

Una cepa clonada molecularmente del virus de la encefalitis equina venezolana (EEV) se ha perfeccionado genéticamente como vector vacunal competente para la replicación para la expresión de proteínas víricas heterólogas (Davis et al., 1996). Los estudios han demostrado que la infección por VEE estimula respuestas de CTL potentes y se ha sugerido que el VEE puede ser un vector extremadamente útil para inmunizaciones (Caley et al., 1997).

En realizaciones adicionales, el ácido nucleico que codifica CD154 quimérico se aloja dentro de un virus infectivo que se ha modificado por ingeniería genética para expresar un ligando de unión específico. Por tanto, la partícula del virus se unirá específicamente a los receptores afines de la célula diana y entregará el contenido a la célula. Recientemente se ha desarrollado un enfoque novedoso diseñado para permitir el direccionamiento específico de vectores retrovíricos, basado en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de restos de lactosa a la envoltura vírica. Esta modificación puede permitir la infección específica de hepatocitos a través de receptores de sialoglicoproteína.

Por ejemplo, se diseñó un sistema de direccionamiento de retrovirus recombinantes en el que se usaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de envoltura retrovírica y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron a través de los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux et al., 1989). Usando anticuerpos contra antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y clase II, demostraron la infección de una diversidad de células humanas que portaban aquellos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

2. Elementos reguladores

Los casetes de expresión incluidos en vectores útiles en la presente divulgación contienen, en particular, (en una dirección 5'-a-3') un promotor de la transcripción eucariota unido operacionalmente a una secuencia codificante de proteínas, señales de corte y empalme incluyendo secuencias intermedias y una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. Los promotores y potenciadores que controlan la transcripción de genes que codifican proteínas en células eucariotas se componen de múltiples elementos genéticos. La maquinaria celular es capaz de reunir e integrar la información reguladora transmitida por cada elemento, permitiendo que diferentes genes evolucionen de forma distinta, con frecuencia patrones complejos de regulación de la transcripción. Un promotor utilizado en el contexto de la presente divulgación incluye promotores constitutivos, inducibles y específicos de tejido. a. Promotor/Potenciadores

Las construcciones de expresión proporcionadas en el presente documento comprenden un promotor para impulsar la expresión de los genes de programación. Un promotor generalmente comprende una secuencia que actúa posicionando el sitio de inicio para la síntesis de ^aRⁿ. El ejemplo más conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tales como, por ejemplo, el promotor para el gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamíferos y el promotor para los genes tardíos de SV40, un elemento individual superpuesto sobre el propio sitio de inicio ayuda a fijar el lugar de inicio. Otros elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de inicio de la transcripción. Normalmente, se encuentran en la región de 30 110 pb aguas arriba del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que varios promotores también contienen elementos funcionales aguas abajo del sitio de inicio. Para poner una secuencia codificante "bajo el control de" un promotor, se sitúa el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción del marco de lectura de la transcripción "aguas abajo" (es decir, 3') del promotor elegido. El promotor "aguas arriba" estimula la transcripción del ADN y promueve la expresión del ARN codificado.

El espaciado entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de manera que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven uno con respecto al otro. En el promotor tk, el espaciado entre los elementos promotores puede aumentarse a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden actuar cooperativa o independientemente para activar la transcripción. Un promotor puede o no usarse junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora de acción cis implicada en la activación de la transcripción de una secuencia de ácido nucleico.

Un promotor puede ser uno asociado de forma natural a una secuencia de ácido nucleico, como puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes 5' ubicadas aguas arriba del segmento codificador y/o del exón. Un promotor de este tipo puede denominarse "endógeno". De manera similar, un potenciador puede ser uno asociado de forma natural a una secuencia de ácido nucleico, ubicado aguas abajo o aguas arriba de esa secuencia. Como alternativa, se obtendrán determinadas ventajas colocando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que normalmente no se asocia a una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un potenciador recombinante o heterólogo se refiere también a un potenciador que normalmente no se asocia a una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Dichos promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otro virus, o célula procariota o eucariota, y promotores o potenciadores "de origen no natural", es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción y/o mutaciones que alteran la expresión. Por ejemplo, los promotores más utilizados en la construcción de ADN recombinante incluyen la p-lactamasa (penicilinasa), sistemas promotores de lactosa y triptófano (trp). Además de producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores de forma sintética, pueden producirse secuencias usando tecnología de clonación recombinante y/o de amplificación de ácido nucleico, incluyendo PCR™, con respecto a las composiciones que se divulgan en el presente documento (véanse las Patentes de los EE.UU. N.° 4.683.202 y 5.928.906). Además, se contempla que también pueden emplearse las secuencias de control que dirigen la transcripción y/o la expresión de secuencias dentro de orgánulos no nucleares tales como mitocondrias, cloroplastos y similares.

Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija eficazmente la expresión del segmento de ADN en el orgánulo, tipo celular, tejido, órgano u organismo elegido para la expresión. Los expertos en la técnica de la biología molecular generalmente conocen el uso de combinaciones de promotores, potenciadores y tipos de células para la expresión de proteínas, (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejidos, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de nivel alto del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.

Adicionalmente, también podría usarse para impulsar la expresión cualquier combinación de promotor/potenciador (según, por ejemplo, la base de datos de promotores eucariotas EPDB, a través de la web epd.isb-sib.ch/). Otra realización posible es el uso de un sistema de expresión citoplasmático T3, T7 o SP6. Las células eucariotas pueden soportar la transcripción citoplasmática a partir de determinados promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de entrega o como una construcción de expresión genética adicional.

Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen promotores víricos tempranos o tardíos, tales como, promotores tempranos o tardíos de SV40, promotores tempranos inmediatos de citomegalovirus (CMV), promotores tempranos de virus del sarcoma de Rous (RSV); promotores de células eucariotas, tales como, por ejemplo, promotor de beta actina (Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), promotor de GADPH (Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), promotor de metalotioneína (Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); y promotores de elementos de respuesta concatenados, tales como promotores de elementos de respuesta al AMP cíclico (cre), promotor de elementos de respuesta al suero (sre), promotor de éster de forbol (TPA) y promotores de elementos de respuesta (tre) cerca de una caja TATA mínima. También es posible usar secuencias promotoras de la hormona de crecimiento humana (por ejemplo, el promotor mínimo de hormona de crecimiento humana descrito en Genbank, n.° de acceso X05244, nucleótido 283 341) o un promotor de tumor mamario de ratón (disponible en la ATCC, N.° de Cat. ATCC 45007).

En determinados aspectos, los métodos de la divulgación también se refieren a secuencias potenciadoras, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que aumentan la actividad de un promotor y que tienen el potencial de actuar en cis, e independientemente de su orientación, incluso a distancias relativamente largas (hasta varias kilobases de distancia del promotor diana). Sin embargo, la función de los potenciadores no se restringe necesariamente a dichas distancias largas, ya que también pueden actuar en las proximidades de un promotor dado.

b. Señales de inicio y expresión unida

También puede usarse una señal de inicio específica en las construcciones de expresión proporcionadas en la presente divulgación para la traducción eficiente de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales exógenas de control de la traducción, incluyendo el codón de inicio ATG. Un experto habitual en la materia sería capaz de determinar esto y proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de inicio debe estar "en fase" con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Las señales exógenas de control de la traducción y los codones de inicio pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados.

En determinadas realizaciones, se usan elementos de sitios de entrada ribosómicos internos (IRES) para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de eludir el modelo de cribado del ribosoma de la traducción dependiente de Cap metilado en posición 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito elementos IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden unirse a marcos de lectura abiertos heterólogos. Pueden transcribirse juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Pueden expresarse eficientemente múltiples genes usando un único promotor/potenciador para transcribir un único mensaje (véanse las Patentes de los EE.UU. N.° 5.925.565 y 5.935.819).

Adicionalmente, podrían usarse determinados elementos de la secuencia 2A para crear una expresión unida o conjunta de genes en las construcciones proporcionadas en la presente divulgación. Por ejemplo, podrían usarse secuencias de escisión para coexpresar genes uniendo marcos de lectura abiertos para formar un único cistrón. Una secuencia de escisión de ejemplo es la secuencia F2A (virus de la fiebre aftosa 2A) o una secuencia "similar a 2A" (por ejemplo, el virus Thosea asigna 2A; T2A) (Minskaia y Ryan, 2013).

c. Orígenes de replicación

Con el fin de propagar un vector en una célula hospedadora, puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (con frecuencia denominados "ori"), por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que corresponde a oriP del VEB como se ha descrito anteriormente o un oriP modificado por ingeniería genética con una función similar o elevada en la programación, que es una secuencia específica de ácido nucleico en la que se inicia la replicación. Como alternativa, puede emplearse un origen de replicación de otro virus de replicación extracromosómica como se ha descrito anteriormente o una secuencia de replicación autónoma (ARS).

3. Marcadores de selección y cribables

En algunas realizaciones, las células que contienen una construcción de la presente divulgación pueden identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula que permitiendo identificar fácilmente las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador de selección es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador de selección positiva es uno en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador de selección negativa es uno en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de un marcador de selección positiva es un marcador de resistencia a fármacos.

Por lo general, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, son marcadores de selección útiles genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol. Además de marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes basándose en la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores, incluyendo marcadores cribables, tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. Como alternativa, pueden utilizarse enzimas cribables como marcadores de selección negativa, tales como la timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la materia también sabría cómo emplear marcadores inmunitarios, posiblemente junto con análisis por FACS. No se cree que el marcador utilizado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Un experto en la materia conoce bien ejemplos adicionales de marcadores de selección y cribables.

C. Entrega de ácidos nucleicos

Además de la entrega vírica de los ácidos nucleicos que codifican CD 154 quimérico, los siguientes son métodos adicionales de entrega de genes recombinantes a una célula hospedadora dada y, por tanto, se consideran en la presente divulgación.

La introducción de un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, puede usar cualesquier métodos adecuados para la entrega de ácido nucleico para la transformación de una célula, como se describe en el presente documento o como sabría un experto habitual en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, la entrega directa de ADN, tal como por transfección ex vivo (Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989), por inyección (Patentes de los EE.UU. N.° 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyección (Harland y Weintraub, 1985; Patente de los EE.UU. N.° 5.789.215); por electroporación (Patente de los EE.UU. N.° 5.384.253; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); por precipitación de fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988); por bombardeo de microproyectiles (Solicitudes PCT N.° 94/09699 y 95/06128; Patentes de los EE.UU. N.° 5.610.042; 5.322.783 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; Patentes de los EE.UU. N.° 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los EE.UU. N.° 5.591.616 y 5.563.055); por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985) y cualquier combinación de dichos métodos. A través de la aplicación de técnicas tales como éstas, pueden transformarse de forma estable o transitoria uno o más orgánulos, una o más células, uno o más tejidos o uno o más organismos.

1. Electroporación

En determinadas realizaciones particulares de la presente divulgación, la construcción génica se introduce en células hiperproliferativas diana a través de electroporación. La electroporación implica la exposición de células (o tejidos) y ADN (o un complejo de ADN) a una descarga eléctrica de alto voltaje.

La transfección de células eucariotas usando electroporación ha sido bastante satisfactoria. Se han transfectado linfocitos pre-B de ratón con genes de inmunoglobulina kappa humana (Potter et al., 1984) y se han transfectado hepatocitos de rata con el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (Tur-Kaspa et al., 1986) de esta manera.

Se contempla que las condiciones de electroporación para células hiperproliferativas de diferentes fuentes pueden optimizarse. Es posible que particularmente se desee optimizar parámetros tales como la tensión, la capacitancia, el tiempo y la composición del medio de electroporación. Los expertos en la materia conocerán la ejecución de otros ajustes habituales. Véase, por ejemplo, Hoffman, 1999; Heller et al., 1996.

2. Transformación mediada por lípidos

En una realización adicional, el CD154 quimérico puede estar atrapado en un liposoma o formulación lipídica. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se autoreorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). También se contempla una construcción génica que forma complejo con Lipofectamina (Gibco BRL).

La entrega de ácido nucleico mediada por lípidos y la expresión de ADN extraño in vitro han sido muy satisfactorias (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong et al. (1980) demostraron la viabilidad de la entrega mediada por lípidos y la expresión de ADN extraño en células de embriones de pollo cultivados, HeLa y de hepatoma.

Las formulaciones no víricas basadas en lípidos proporcionan una alternativa a las terapias génicas adenovíricas. Aunque muchos estudios de cultivo celular han documentado la transferencia génica no vírica basada en lípidos, la entrega génica sistémica a través de formulaciones basadas en lípidos ha sido limitada. Una de las principales limitaciones de la entrega de genes basada en lípidos no víricos es la toxicidad de los lípidos catiónicos que comprenden el vehículo de entrega no vírico. La toxicidad in vivo de los liposomas explica parcialmente la discrepancia entre los resultados de la transferencia génica in vitro e in vivo. Otro factor que contribuye a estos datos contradictorios es la diferencia en la estabilidad del vehículo lipídico en presencia y ausencia de proteínas séricas. La interacción entre vehículos lipídicos y proteínas séricas tiene un impacto drástico en las características de estabilidad de los vehículos lipídicos (Yang y Huang, 1997). Los lípidos catiónicos atraen y se unen a proteínas séricas con carga negativa. Los vehículos lipídicos asociados a proteínas séricas se disuelven o son absorbidos por macrófagos, conduciendo a su eliminación de la circulación. Los métodos actuales de entrega de lípidos in vivo usan la vía inyección subcutánea, intradérmica, intratumoral o intracraneal para evitar los problemas de toxicidad y estabilidad asociados a lípidos catiónicos en la circulación. La interacción de vehículos lipídicos y proteínas plasmáticas es responsable de la disparidad entre la eficiencia de la transferencia génica in vitro (Feigner et al., 1987) e in vivo (Zhu et al., 1993); Philip et al., 1993; Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995; Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996).

Los avances en las formulaciones lipídicas han mejorado la eficiencia de la transferencia génica in vivo (Templeton et al. 1997; documento WO 98/07408). Una formulación lipídica novedosa compuesta por una relación equimolar de 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetil amonio)propano (DOTAP) y colesterol potencia significativamente la transferencia génica in vivo sistémica, aproximadamente 150 veces. El DOTAP: la formulación de lípidos de colesterol forma una estructura única denominada un "liposoma intercalado". Se publica que esta formulación "intercala" ADN entre una estructura bicapa invaginada o de "jarrón". Las características beneficiosas de estas estructuras lipídicas incluyen un p positivo, la estabilización coloidal por colesterol, el empaquetamiento de ADN bidimensional y una estabilidad sérica aumentada. Las Solicitudes de Patente N.° 60/135.818 y 60/133.116 analizan formulaciones que pueden usarse con la presente divulgación.

La producción de formulaciones lipídicas con frecuencia se logra mediante ultrasonidos o extrusión en serie de mezclas liposómicas después de (I) evaporación en fase inversa (II) deshidratación-rehidratación (III) diálisis con detergente e (IV) hidratación de película fina. Una vez fabricadas, pueden usarse estructuras lipídicas para encapsular compuestos que son tóxicos (quimioterápicos) o lábiles (ácidos nucleicos) cuando están en circulación. La encapsulación de lípidos ha dado como resultado una menor toxicidad y a una semivida sérica más larga para dichos compuestos (Gabizon et al., 1990). Numerosos tratamientos de enfermedades usan estrategias de transferencia génica basadas en lípidos para potenciar terapias convencionales o establecer terapias novedosas, en particular terapias para tratar enfermedades hiperproliferativas.

111. Inhibidores de punto de control inmunitario

La presente divulgación proporciona métodos para combinar el bloqueo de puntos de control inmunitarios con la activación de CD40, tales como el polipéptido CD154 quimérico. Los puntos de control inmunitario aumentan una señal (por ejemplo, las moléculas coestimuladoras) o reducen una señal. Las moléculas inhibidoras de punto de control que pueden ser diana del bloqueo de punto de control inmunitario incluye receptor de adenosina A2A (A2AR), B7-H3 (también conocido como CD276), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, también conocida como CD152), indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), inmunoglobulina de células citolíticas (KIR), gen 3 de activación de linfocitos (LAG3), muerte programada 1 (PD-1), dominio de inmunoglobulina de linfocitos T y dominio de mucina 3 (TIM-3) y supresor de Ig de dominio V de activación de linfocitos T (VISTA). En particular, los inhibidores de punto de control inmunitario se dirigen al eje de PD-1 y/o CTLA-4.

Los inhibidores de punto de control inmunitario pueden ser fármacos tales como moléculas pequeñas, formas recombinantes de ligando o receptores, o, en particular, son anticuerpos, tales como anticuerpos humanos (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012). Pueden usarse inhibidores conocidos de las proteínas de punto de control inmunitario o análogos de las mismas, en particular pueden usarse formas quimerizadas, humanizadas o humanas de anticuerpos. Como sabrá el experto en la materia, pueden usarse nombres alternativos y/o equivalentes para determinados anticuerpos mencionados en la presente divulgación. Dichas denominaciones alternativas y/o equivalentes son indistintas en el contexto de la presente divulgación. Por ejemplo, se sabe que el lambrolizumab también se conoce con los nombres alternativos y equivalentes MK-3475 y pembrolizumab.

A. Antagonistas del eje de PD-1

La disfunción o anergia de linfocitos T se produce simultáneamente con una expresión inducida y sostenida del receptor inhibidor, el polipéptido de muerte programada 1 (PD-1). Por tanto, el direccionamiento terapéutico de PD-1 y otras moléculas que señalan a través de interacciones con PD-1, tales como ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y ligando de muerte programada 2 (PD-L2). PD-L1 se sobreexpresa en muchos cánceres y con frecuencia se asocia a un mal pronóstico (Okazaki T et al., Intern. Immun. 200719(7):813). Por tanto, la inhibición de la interacción PD-L1/PD-1 en combinación con la activación de CD40 se proporcionan en el presente documento tal como para potenciar la destrucción de tumores mediada por linfocitos T ^{C d 8 .}

En el presente documento se proporciona una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje de PD-1 y un polipéptido CD154 quimérico para su uso en un método para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo. En el presente documento también se proporciona una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje de PD-1 y un polipéptido CD154 quimérico para su uso en un método de potenciación de la función inmunitaria en un individuo que lo necesite.

Por ejemplo, un antagonista de unión al eje de PD-1 incluye un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PDL1 y un antagonista de unión a PDL2. Los nombres alternativos para "PD-1" incluyen CD279 y SLEB2. Los nombres alternativos para "PDL1" incluyen B7-H1, B7-4, CD274 y B7-H. Los nombres alternativos para "PDL2" incluyen B7-DC, Btdc y ^{c D 2 7 3 .}En algunas realizaciones, PD-1, PDL1 y PDL2 son PD-1, PDL1 y PDL2 humanos. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión a ligando. En un aspecto específico, los compañeros de unión a ligando de PD-1 son PDL1 y/o PDL2. En otra realización, un antagonista de unión a PDL1 es una molécula que inhibe la unión de PDL1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, los compañeros de unión a PDL1 son PD-1 y/o B7-1. En otra realización, el antagonista de unión a PDL2 es una molécula que inhibe la unión de PDL2 a sus compañeros de unión a ligando. En un aspecto específico, un compañero de unión a PDL2 es PD-1. El antagonista puede ser un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo, una inmunoadhesina, una proteína de fusión o un oligopéptido. Se describen anticuerpos de ejemplo en las Patentes de los EE.UU. N.° US8735553, US8354509 y US8008449. Se conocen en la técnica otros antagonistas del eje de PD-1 para su uso en los métodos proporcionados en el presente documento, tal como se describe en las Solicitudes de Patente de los EE.UU. N.° US20140294898, US2014022021 y US20110008369.

En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona del grupo que consiste en nivolumab, pembrolizumab y CT-011. En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-1 es una inmunoadhesina (por ejemplo, una inmunoadhesina que comprende una porción extracelular 0 de unión a PD-1 de PDL1 o PDL2 fusionada con una región constante (por ejemplo, una región Fc de una secuencia de inmunoglobulina). En algunas realizaciones, el antagonista de unión a PD-1 es AMP-224. Nivolumab, conocido también como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 y OPDIVO®, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2006/121168. El pembrolizumab, conocido también como MK-3475, Merck 3475, lambrolizumab, KEYTRUDA® y SCH-900475, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/114335. CT-011, también conocido como hBAT o hBAT-1, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/101611. AMP-224, también conocido como B7-DCIg, es un receptor soluble de fusión de PDL2-Fc descrito en los documentos WO2010/027827 y WO2011/066342.

En algunos aspectos, el anticuerpo que se describe en el presente documento (tal como un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL1 o un anticuerpo anti-PDL2) comprende además una región constante humana o murina. En un aspecto adicional más, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. En un aspecto específico adicional más, la región constante humana es IgG1. En un aspecto adicional más, la región constante murina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En un aspecto específico adicional más, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. En un aspecto específico adicional más, la función efectora mínima es resultado de la producción en células procariotas. En un aspecto específico adicional más, la función efectora mínima es resultado de una "mutación de Fc sin efector" o de aglicosilación.

En consecuencia, un anticuerpo utilizado en el presente documento puede estar aglicosilado. Normalmente, la glicosilación de los anticuerpos está ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la conexión del resto de hidrato de carbono con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la conexión enzimática del resto de hidrato de carbono con la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más habitualmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La eliminación de los sitios de glicosilación de un anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que se elimine una de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La alteración puede realizarse por sustitución de un resto de asparagina, serina o treonina dentro del sitio de glicosilación por otro resto de aminoácido (por ejemplo, glicina, alanina o una sustitución conservadora).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede prepararse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un proceso que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PDLl, anti-PD-1 o anti-PDL2 descritos anteriormente, o fragmento de unión a antígeno, en una forma adecuada para su expresión, en condiciones adecuadas para producir dicho anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento.

B. CTLA-4

Otro punto de control inmunitario que puede ser la diana en los métodos que se proporcionan en el presente documento es la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), también conocida como CD152. La secuencia completa de ADNc de CTLA-4 humana tiene el número de acceso de Genbank L15006. CTLA-4 se encuentra en la superficie de linfocitos T y actúa como un "interruptor de apagado cuando se une a CD80 o CD86 en la superficie de células presentadoras de antígenos. CTLA4 es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas que se expresa en la superficie de linfocitos T auxiliares y transmite una señal inhibidora a los linfocitos T. CTLA4 es similar a la proteína coestimuladora de linfocitos T, CD28, y ambas moléculas se unen a CD80 y CD86, también denominados B7-1 y B7-2, respectivamente, en células presentadoras de antígenos. CTLA4 transmite una señal inhibidora a los linfocitos T, mientras que CD28 transmite una señal estimuladora. También se encuentra CTLA4 intracelular en los linfocitos T reguladores y puede ser importante para su función. La activación de linfocitos T a través del receptor de linfocitos T y CD28 conduce a un aumento de la expresión de CTLA-4, un receptor inhibidor para moléculas B7.

En algunos aspectos, el inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico), un fragmento de unión a antígeno del mismo, una inmunoadhesina, una proteína de fusión o un oligopéptido.

Pueden generarse anticuerpos anti-TCLA-4 humano (o dominios VH y/o VL derivados de los mismos) adecuados para su uso en los presentes métodos usando métodos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos antiCTLA-4 reconocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CTLA-4 divulgados en: el documento US 8119129, el documento WO 01/14424, el documento WO 98/42752; el documento WO 00/37504 (CP675,206, también conocido como tremretirumab; antes ticilimumab), la Patente de los EE.UU. N.° 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Resumen N.°2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304 pueden usarse en los métodos que se divulgan en el presente documento. También pueden usarse anticuerpos que compitan con cualquiera de estos anticuerpos reconocidos en la técnica para la unión a CTLA-4. Por ejemplo, se describe un anticuerpo contra CTLA-4 humanizado en la Solicitud de Patente Internacional N.° WO2001014424, WO2000037504, y la Patente de los EE.UU. N.° US8017114.

Un anticuerpo antiCTLA-4 de ejemplo es ipilimumab (también conocido como 10D1, MDX- 010, MDX- 101 y Yervoy®) o fragmentos de unión a antígeno y variantes de los mismos (véase, por ejemplo, el documento WOO 1/14424). En otras realizaciones, el anticuerpo comprende las CDR o VR de cadenas pesada y ligera de ipilimumab. En consecuencia, en una realización, el anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH de ipilimumab, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL de ipilimumab. En otra realización, el anticuerpo compite por la unión con y/o se une al mismo epítopo en CTLA-4 que los anticuerpos mencionados anteriormente. En otra realización, el anticuerpo tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos de la región variable con los anticuerpos mencionados anteriormente (por ejemplo, al menos aproximadamente un 90 %, un 95 % o un 99 % de identidad de región variable con ipilimumab).

Otras moléculas para modular CTLA-4 incluyen ligandos y receptores de CTLA-4 tales como se describen en las Patentes de los EE.UU. US5844905, US5885796 y las Solicitud de Patente Internacionales N.° WO1995001994 y WO1998042752, e inmunoadhesinas tales como se describen en la Patente de los EE.UU. N.° US8329867.

IV. Métodos de tratamiento

El presente documento se divulga una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un antagonista de unión al eje de PD-1 y/o un anticuerpo contra CTLA-4) y un agonista de CD40 (por ejemplo, un polipéptido CD154 quimérico) para su uso en métodos para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo. Cualquiera de los inhibidores de punto de control inmunitario (por ejemplo, el antagonista de unión al eje de PD-1 y/o el anticuerpo contra CTLA-4) y los agonistas de CD40 (por ejemplo, el polipéptido CD154 quimérico) conocidos en la técnica o que se describen en el presente documento puede usarse en los métodos que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado una respuesta sostenida en el individuo después del cese del tratamiento. Los métodos que se describen en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de afecciones en las que se desea una inmunogenicidad potenciada, tal como el aumento de la inmunogenicidad del tumor para el tratamiento del cáncer. En el presente documento también se proporciona una cantidad eficaz de un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un antagonista de unión al eje de PD-1 y/o un anticuerpo contra CTLA-4) y un polipéptido CD 154 quimérico para su uso en métodos de potenciación de la función inmunitaria, tal como en un individuo que tiene cáncer. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. Los ejemplos de cánceres contemplados para el tratamiento incluyen cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de huesos, cáncer de testículos, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal, linfomas, lesiones preneoplásicas en el pulmón, cáncer de colon, melanoma y cáncer de vejiga.

En algunas realizaciones, el individuo tiene un cáncer que es resistente (se ha demostrado que es resistente) a una o más terapias antineoplásicas. En algunas realizaciones, la resistencia a la terapia antineoplásica incluye la recurrencia del cáncer o el cáncer refractario. La recurrencia puede referirse a la reaparición del cáncer, en el sitio original o en un sitio nuevo, después del tratamiento. En algunas realizaciones, la resistencia a la terapia antineoplásica incluye la progresión del cáncer durante el tratamiento con la terapia antineoplásica. En algunas realizaciones, el cáncer está en una fase temprana o en una fase tardía.

El individuo puede tener un cáncer que exprese (se ha demostrado que expresa, por ejemplo, en un ensayo de diagnóstico) biomarcador PD-L1. En algunas realizaciones, el cáncer del paciente expresa biomarcador PD-L1 bajo. En algunas realizaciones, el cáncer del paciente expresa biomarcador PD-L1 alto. El biomarcador PD-L1 puede detectarse en la muestra usando un método seleccionado del grupo que consiste en FACS, transferencia Western, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoensayo, transferencia puntual, métodos de inmunodetección, HPLC, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia óptica, espectrometría de masas, HPLC, qPCR, RT-qPCR, qPCR múltiple o RT-qPCR, RNA-seq, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY y FISH, y combinaciones de las mismas.

La eficacia de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, tratamientos de combinación incluyendo administrar una cantidad eficaz de una combinación de al menos un inhibidor de punto de control inmunitario y un polipéptido CD154 quimérico) puede someterse a ensayo en diversos modelos conocidos en la técnica, tales como modelos clínicos o preclínicos. En el presente documento se ejemplifican modelos preclínicos adecuados y además pueden incluir, sin limitación, modelos de cáncer de cáncer de ovario ID8, modelos GEM, melanoma B16, cáncer de células renales RENCA, cáncer colorrectal CT26, cáncer colorrectal MC38 y melanoma Cloudman.

En algunas realizaciones de los métodos de la presente divulgación, el cáncer tiene niveles bajos de infiltración de linfocitos T. En algunas realizaciones, el cáncer no tiene ningún infiltrado de linfocitos T detectable. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer no inmunogénico (por ejemplo, cáncer colorrectal y/o cáncer de ovario no inmunogénicos). Sin desear quedar ligados a teoría alguna, el tratamiento de combinación puede aumentar el cebado, la activación y/o la proliferación de linfocitos T (por ejemplo, linfocito T CD4+, linfocito T CD8+, linfocito T de memoria), con respecto a antes de la administración de la combinación.

En algunas realizaciones de los métodos de la presente divulgación, los linfocitos T CD4 y/o CD8 activados en el individuo se caracterizan por linfocitos T CD4 y/o CD8 productores de y-IFN y/o una actividad citolítica potenciada con respecto a antes de la administración de la combinación. El y-IFN puede medirse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, tinción intracelular de citocinas (ICS) que implica la fijación, la permeabilización y la tinción de células con un anticuerpo contra ^y-IFN. La actividad citolítica puede medirse por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, usando un ensayo de destrucción de células con células efectoras y diana mixtas.

La presente divulgación es útil para cualquier célula humana que participe en una reacción inmunitaria, ya sea como diana para el sistema inmunitario o como parte de la respuesta del sistema inmunitario a la diana extraña. Los métodos incluyen métodos ex vivo, métodos in vivo y otros diversos métodos que implican la inyección de polinucleótidos o vectores en la célula hospedadora. Los métodos también incluyen la inyección directamente en el tumor o lecho tumoral, así como local o regional con respecto al tumor.

La presente divulgación contempla, por tanto, métodos ex vivo que comprenden el aislamiento de células de un sujeto animal o humano. Se introduce en las células aisladas una secuencia polinucleotídica que codifica un CD154 quimérico. Después, las células se reintroducen en un lugar específico o directamente en la circulación del sujeto. Pueden usarse marcadores de la superficie celular, incluyendo moléculas tales como marcadores o antígenos tumorales que identifican las células, para aislar específicamente estas células del sujeto.

A. Administración

La terapia de combinación proporcionada en el presente documento comprende la administración de un inhibidor de

punto de control inmunitario (por ejemplo, un antagonista de unión al eje de PD-1 y/o un anticuerpo contra CTLA-4) y

un polipéptido CD154 quimérico. La terapia de combinación puede administrarse de cualquier manera adecuada

conocida en la técnica. Por ejemplo, un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un antagonista de

unión al eje de PD-1 y/o un anticuerpo contra CTLA-4) y un polipéptido CD154 quimérico pueden administrarse

secuencialmente (en momentos diferentes) o simultáneamente (al mismo tiempo). En algunas realizaciones, los uno

o más inhibidores de punto de control inmunitario están en una composición separada como el polipéptido CD154

quimérico o una construcción de expresión del mismo. En algunas realizaciones, el inhibidor de punto de control

inmunitario está en la misma composición que el polipéptido CD 154 quimérico.

El uno o más inhibidores de punto de control inmunitario y el polipéptido CD154 quimérico pueden administrarse por

la misma vía de administración o por vías de administración diferentes. En algunas realizaciones, el inhibidor de

punto de control inmunitario se administra por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía

tópica, por vía oral, por vía transdérmica, por vía intraperitoneal, por vía intraorbital, por implantación, por inhalación,

por vía intratecal, por vía intraventricular o por vía intranasal. En algunas realizaciones, el polipéptido CD40

quimérico se administra por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía tópica, por vía oral,

por vía transdérmica, por vía intraperitoneal, por vía intraorbital, por implantación, por inhalación, por vía intratecal,

por vía intraventricular o por vía intranasal. Puede administrarse una cantidad eficaz del antagonista de unión al eje

de PD-1 y el polipéptido CD154 quimérico para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. La dosis

apropiada de inhibidor de punto de control inmunitario y/o del polipéptido CD154 quimérico puede determinarse

basándose en el tipo de enfermedad que ha de tratarse, la gravedad y el curso de la enfermedad, el estado clínico

del individuo, la historia clínica del individuo y la respuesta al tratamiento, y el criterio del médico especialista. En

algunas realizaciones, el tratamiento de combinación con al menos un inhibidor de punto de control inmunitario (por

ejemplo, un antagonista de unión al eje de PD-1 y/o un anticuerpo contra CTLA-4) y un polipéptido CD154 son

sinérgicos, por lo que una dosis eficaz de un polipéptido CD154 quimérico en la combinación se reduce con respecto

a la dosis eficaz de al menos un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un antagonista de unión al

eje de PD-1 y/o un anticuerpo contra CTLA-4) como agente único.

Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de punto de control inmunitario, tal como un

anticuerpo, y/o el polipéptido CD154 quimérico o la construcción de expresión del mismo que se administra a un ser

humano estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg de peso c

mediante una o más administraciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo utilizado es de apr

a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg/kg, de aprox

aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 m adamente 0, aproximadamente 25 mg/kg,

aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 m adamente 0, aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 m adamente 0, aproximadamente 5 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg administ

ejemplo. En algunas realizaciones, el anticuerpo se administra a 15 mg/kg. Sin embargo, pued

pautas de dosificación. En una realización, se administra un anticuerpo anti-PDL1 que se desc

documento a un ser humano a una dosis de aproximadamente 100 mg, aproxima

aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 500 mg, aproxim

aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproxima

aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg o aproximadamente 1400 mg el

día 1 de los ciclos de 21 días. La dosis puede administrarse en forma de una dosis única o en forma de dosis

múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tales como infusiones. El progreso de esta terapia puede controlarse fácilmente

mediante técnicas convencionales.

Se contempla específicamente la inyección intratumoral, o la inyección en la vasculatura tumoral, para tumores

individuales, sólidos y accesibles. La administración local, regional o sistémica también puede ser apropiada. Para

tumores de > 4 cm, el volumen que ha de administrarse será de aproximadamente 4-10 ml (en particular, 10 ml),

mientras que para tumores de <4 cm, se usará un volumen de aproximadamente 1-3 ml (en particular, 3 ml). Las

inyecciones múltiples entregadas en forma de dosis única comprenden volúmenes de aproximadamente 0,1 a

aproximadamente 0,5 ml. Por ejemplo, pueden ponerse en contacto ventajosamente partículas víricas de CD154

quimérico adenovírico administrando múltiples inyecciones al tumor.

Las pautas de tratamiento también pueden variar y, con frecuencia, dependen del tipo de tumor, de la ubicación del

tumor, de la progresión de la enfermedad y de la salud y la edad del paciente. Obviamente, determinados tipos de

tumores requerirán un tratamiento más agresivo, mientras que al mismo tiempo, determinados pacientes no pueden

tolerar protocolos más exigentes. El médico será el más indicado para tomar dichas decisiones basándose en la

eficacia y la toxicidad conocidas (si las hay) de las formulaciones terapéuticas.

En determinadas realizaciones, el tumor que se está tratando puede ser resecable o no, al menos al principio. Los

tratamientos con construcciones víricas terapéuticas pueden aumentar la resecabilidad del tumor debido a la

contracción de los márgenes o por la eliminación de determinadas porciones particularmente invasivas. Siguiendo

los tratamientos, la resección puede ser posible. Los tratamientos adicionales posteriores a la resección servirán

para eliminar la enfermedad residual microscópica en el sitio tumoral.

B. Formulaciones farmacéuticas

En el presente documento también se divulgan composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden al menos un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1 y/o anticuerpo anti-CTlA-4) y un polipéptido CD154 quimérico (por ejemplo, ad-ISF35), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas como se describen en el presente documento pueden prepararse mezclando los principios activos (tales como un anticuerpo o un polipéptido) que tengan el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 22a edición, 2012), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente son atóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables de ejemplo en el presente documento incluyen adicionalmente agentes de dispersión de fármacos instersticiales, tales como glicoproteínas solubles de hialuronidasa neutra-activa (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP y métodos de uso de ejemplo, incluyendo rHupH20, se describen en las Publicaciones de Patente de los EE.UU. N.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas adicionales, tales como las condroitinasas.

La composición y la formulación que se describen en el presente documento también pueden contener más de un principio activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, en particular aquellos con actividades complementarias que no se afectan de forma adversa mutuamente. Dichos principios activos están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

C. Terapias adicionales

En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender además una terapia adicional. La terapia adicional puede ser radioterapia, cirugía (por ejemplo, lumpectomía y una mastectomía), quimioterapia, terapia génica, terapia de ADN, terapia vírica, terapia de ^{A r N ,}inmunoterapia, trasplante de médula ósea, nanoterapia, terapia de anticuerpos monoclonales o una combinación de las anteriores. La terapia adicional puede estar en forma de terapia adyuvante o neoadyuvante.

En algunos aspectos, la terapia adicional es la administración de un inhibidor enzimático de molécula pequeña o un agente antimetastásico. En algunos aspectos, la terapia adicional es la administración de agentes limitantes de los efectos secundarios (por ejemplo, agentes destinados a disminuir la aparición y/o la gravedad de los efectos secundarios del tratamiento, tales como agentes contra las náuseas, etc.). En algunos aspectos, la terapia adicional es radioterapia. En algunos aspectos, la terapia adicional es cirugía. En algunos aspectos, la terapia adicional es una combinación de radioterapia y cirugía. En algunos aspectos, la terapia adicional es irradiación gamma. En algunos aspectos, la terapia adicional es una terapia dirigida a la vía PBK/AKT/mTOR, inhibidor de HSP90, inhibidor de tubulina, inhibidor de la apoptosis y/o agente quimiopreventivo. La terapia adicional puede ser uno o más de los agentes quimioterápicos conocidos en la técnica.

La terapia adicional puede ser un antagonista dirigido contra B7-H3 (también conocido como CD276), por ejemplo, un anticuerpo de bloqueo, MGA271, un antagonista dirigido contra un TGF beta, por ejemplo, metelimumab (también conocido como CAT-192), fresolimumab (también conocido como GC1008) o LY2157299, un tratamiento que comprende la transferencia adoptiva de un linfocito T (por ejemplo, un linfocito T citotóxico o CTL) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), un tratamiento que comprende la transferencia adoptiva de un linfocito T que comprende un receptor de TGF beta dominante-negativo, por ejemplo, un receptor de tipo II de TGF beta dominantenegativo, un tratamiento que comprende un protocolo HERCREEM (véase, por ejemplo, ClinicalTrials.gov Identificador NCT00889954), un agonista dirigido contra CD137 (también conocido como TNFRSF9, 4-1BB o ILA), por ejemplo, un anticuerpo activador, urelumab (también conocido como BMS-663513), un agonista dirigido contra el OX40 (también conocido como CD134), por ejemplo, un anticuerpo activador, administrado junto con un anticuerpo anti-OX40 diferente (por ejemplo, AgonOX)., un agonista dirigido contra CD27, por ejemplo, un anticuerpo activador, CDX-1127, indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO), 1-metil-D-triptófano (también conocido como 1-D-MT), un conjugado anticuerpo-fármaco (en algunas realizaciones, que comprende mertansina o monometil auristatina E (MMAE)), un conjugado de anticuerpo anti-NaPi2b-MMAE (también conocido como DNIB0600A o RG7599), trastuzumab emtansina (también conocido como T-DM1, ado-trastuzumab emtansina o KADCYLA®, Genentech), DMUC5754A, un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido al receptor de endotelina B (EDNBR), por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra EDNBR conjugado con MMAE, un inhibidor de angiogénesis, un anticuerpo dirigido contra un VEGF, por ejemplo, VEGF-A, bevacizumab (también conocido como AVASTIN®, Genentech), un anticuerpo dirigido contra angiopoyetina 2 (también conocido como Ang2), MEDI3617, un agente antineoplásico, un agente dirigido a CSF-1R (también conocido como M-CSFR o CD 115), anti-CSF-1R (también conocido como IMC-CS4), un interferón, por ejemplo, interferón alfa o interferón gamma, Roferón-A, GM-CSF (también conocido como factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humano recombinante, rhu GM-CSF, sargramostim o Leukine®), IL-2 (también conocida como aldesleucina o Proleukin®), IL-12, un anticuerpo dirigido a CD20 (en algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido a CD20 es obinutuzumab (también conocido como GA101 o Gazyva®) o rituximab), un anticuerpo dirigido a GITR (en algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido a GITR es TRX518), junto con una vacuna contra el cáncer (en algunas realizaciones, la vacuna contra el cáncer es una vacuna peptídica contra el cáncer, que en algunas realizaciones es una vacuna peptídica personalizada; en algunas realizaciones la vacuna peptídica contra el cáncer es un péptido largo multivalente, un multipéptido, un cóctel de péptidos, un péptido híbrido o una vacuna de células dendríticas pulsada por péptidos (véase, por ejemplo, Yamada et al., Cancer Sci, 104: 14 21, 2013)), junto con un adyuvante, un agonista de TLR, por ejemplo, Poli-ICLC (también conocido como Hiltonol®), LPS, MPL o CpG ODN, factor de necrosis tumoral (TNF) alfa, IL-1, HMGB1, un antagonista de IL-10, un antagonista de IL-4, un antagonista de IL-13, un antagonista de HVEM, un agonista de ICOS, por ejemplo, por administración de ICOS-L o un anticuerpo agonista dirigido contra ICOS, un tratamiento dirigido a CX3CL1, un tratamiento dirigido a CXCL10, un tratamiento dirigido a CCL5, un agonista de LFA-1 o ICAM1, un agonista de Selectina, una terapia dirigida, un inhibidor de B-Raf, vemurafenib (también conocido como Zelboraf®, dabrafenib (también conocido como Tafinlar®), erlotinib (también conocido como Tarceva®), un inhibidor de una MEK, tal como MEK1 (también conocida como MAP2K1) o MEK2 (también conocida como MAP2K2), cobimetinib (también conocido como GDC -0973 o XL-518), trametinib (también conocido como Mekinist®), un inhibidor de K-Ras, un inhibidor de c-Met, onartuzumab (también conocido como MetMAb), un inhibidor de Alk, AF802 (también conocido como CH5424802 o alectinib), un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K), BKM120, idelalisib (también conocido como GS-1101 o CAL-101), perifosina (también conocida como KRX-0401), un Akt, MK2206, GSK690693, GDC-0941, un inhibidor de mTOR, sirolimus (también conocido como rapamicina), temsirolimus (también conocido como CCI-779 o Torisel®), everolimus (también conocido como RAD001), ridaforolimus (también conocido como AP-23573, MK-8669 o deforolimus), OSI-027, AZD8055, INK128, un inhibidor dual de PI3K/mTOR, XL765, GDC-0980, BEZ235 (también conocido como NVP-BEZ235), BGT226, GSK2126458, PF-04691502, PF-05212384 (también conocido como PKI-587).

V. Artículos de fabricación o kits

Se divulga un artículo de fabricación o un kit que comprende al menos un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 y/o un anticuerpo anti-CTlA-4) y un polipéptido CD154 quimérico (por ejemplo, ad-ISF35). El artículo de fabricación o el kit puede comprender además un prospecto que comprenda instrucciones para usar el al menos un inhibidor de punto de control junto con un polipéptido CD154 quimérico para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo o para potenciar la función inmunitaria de un individuo que tiene cáncer. Puede incluirse cualquiera de los inhibidores de punto de control inmunitario y/o polipéptidos CD154 quiméricos que se describen en el presente documento en el artículo de fabricación o los kits. En algunas realizaciones, el al menos un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 y/o el anticuerpo anti-CTlA-4) y un polipéptido CD154 quimérico (por ejemplo, ad-ISF35) están en el mismo recipiente o en recipientes separados. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, bolsas y jeringas. El recipiente puede estar formado por una diversidad de materiales tales como vidrio, plástico (tal como cloruro de polivinilo o poliolefina) o aleación metálica (tal como acero inoxidable o Hastelloy). En algunas realizaciones, el recipiente contiene la formulación y la etiqueta en, o asociada a, el recipiente puede indicar instrucciones de uso. El artículo de fabricación o kit puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación incluye además uno o más de otro agente (por ejemplo, un agente quimioterápico y un agente antineoplásico). Los recipientes adecuados para el uno o más agentes incluyen, por ejemplo, frascos, viales, bolsas y jeringas.

Ejemplo 1 - Actividad antitumoral de ad-CD40L

Aunque la activación de la vía de CD40 a través de CD40L induce una respuesta inmunitaria antitumoral sólida (Sotomayor et al., 1999; Malmstrom et al., 2010), la entrega sistémica de CD40L recombinante dio como resultado eventos adversos en pacientes con cáncer (Ruter et al., 2010; Vonderheide et al., 2007). Por tanto, el presente estudio se realizó para determinar la actividad antimelanoma y el mecanismo de acción de un adenovirus recombinante que expresa una versión estabilizada de CD40L (ad-CD40L/ISF35) mediante la entrega local intratumoral para tratar el melanoma metastásico. Para determinar la inmunidad específica de tumor, se trataron ratones portadores de melanomas B16-Ova (500.000 células/tumor de células de melanoma B 16 transfectadas con un péptido de ovoalbúmina (OVA)) con inyección intratumoral de ad-CD40L o rAd.vacío como se muestra en la FIG.

1A. Diez días después del tratamiento, se analizaron los leucocitos infiltrantes de tumores para determinar la presencia de linfocitos T CD8 específicos de Ova. Se descubrió que había más linfocitos T CD8 específicos de OVA257-264 en el grupo de ad-CD40L que en el grupo de ad-vacío (FIG. 1B). A continuación, se evaluó la respuesta inmunitaria en melanomas B16 inyectados y sin inyectar contralaterales en ratones. Siete días después del tratamiento con ad-CD40L, había una infiltración excesiva de linfocitos T CD8 y un aumento de la relación de linfocitos T CD8/CD4 tanto en los tumores inyectados como en los sin inyectar contralaterales (FIG. 1C).

La administración directa de ad-CD40L en el melanoma B16.F10 de ratón suprimió el crecimiento tumoral y prolongó la supervivencia de los ratones (FIG. 1D). La dependencia de la terapia de ad-CD40L de linfocitos T CD 8 se demostró por el agotamiento de CD 8. Los ratones que se trataron con ad-CD40L y agotados de linfocitos T CD8 tuvieron una menor supervivencia en comparación con los ratones tratados con rAD-CD40L solo (FIG. 1E). Además, los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se aislaron de tumores alterados mecánicamente mediante un medio de separación de linfocitos y se cultivaron con el péptido P15E durante 6 horas antes de realizar la tinción de linfocitos T c D8 e IFNy. Se comprobó que el porcentaje de células CD8+IFNy+ específicas de p15E aumentaba significativamente con el tratamiento con ad-CD40L (FIG. 1F). Estos resultados sugieren que la inyección intratumoral de ad-CD40L induce una expansión sólida de linfocitos T CD8 y, por tanto, una inmunidad específica de tumor dando como resultado una supervivencia prolongada de los ratones. Sin embargo, los tumores de melanoma no retrocedieron totalmente después de la terapia de ad-CD40L

Ejemplo 2 - Reguladores negativos de la activación de CD40

En el modelo en ratón de melanoma B 16, la inyección intratumoral de ad-CD40L suprimió significativamente el crecimiento del melanoma e indujo una expansión sólida de linfocitos T CD8, como se muestra en el Ejemplo 1; sin embargo, ningún ratón se curó después de este tratamiento. Por tanto, se analizó la expresión de los reguladores negativos PD-1 y CTLA-4 en linfocitos T CD8 después del tratamiento con ad-CD40L. PD-1 estaba altamente regulada en casi el 100 % de los linfocitos T CD8 asociados a tumor (FIG. 2A) y había una mayor expresión del ligando de PD-1, PD-L1, en las células mieloides asociadas a tumor, independientemente del tratamiento. También se encontró que CTLA-4 estaba regulado positivamente en los linfocitos T CD8 de los ratones tratados con ad-CD40L. Estos resultados sugieren que PD-1 y/o CTLA-4 podrían ser los principales factores limitantes de la eficacia de la respuesta de linfocitos T antitumoral inducida y que el bloqueo de la vía de PD-1 y/o CLTA-4 en combinación con el tratamiento con ad-CD40L podría ser una estrategia más eficaz e inducir una mejor respuesta inmunitaria antitumoral.

Por tanto, se estudió una estrategia de tratamiento de combinación con ad-CD40L y un anticuerpo anti-PD-1, anti-PDL1 o CTLA-4. El esquema de tratamiento para ratones B6 de tipo silvestre se muestra en la FIG. 2B. Se implantó un total de 4x105 células tumorales B16-F10 por vía subcutánea en el flanco izquierdo 7 días antes del tratamiento con el adenovirus, y se implantó el mismo número de células tumorales B16-F10 por vía subcutánea en el flanco derecho 3 días antes del tratamiento. Los ratones se trataron con (1) ad-CD40L intratumoral más anti-PD-1 intraperitoneal, anti-PDL1 o anti-CTLA-4, (2) ad-CD40L intratumoral más control de isotipo intraperitoneal, (3) rAd.vacío intratumoral más anti-PD-1, anti-PDL1 o anti-CTLA-4 intraperitoneal, o (4) rAd.vacío intratumoral más control de isotipo intraperitoneal. El ad-CD40L o ad-vacío se entregó en PBS en un volumen total de 50 pl, y la dosis de anticuerpo anti-PD-1, anti-PDL1 o anti-CTLA-4 y su control de isotipo fue de 200 pg. Para medir el tamaño tumoral, se midieron los diámetros perpendiculares de los tumores con calibres cada 2 días. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen tumoral total alcanzó los 200 mm2. El análisis de supervivencia se realizó con el ensayo de rango logarítmico.

Los resultados mostraron que el tratamiento combinado de ad-CD40L intratumoral y anticuerpo anti-PDL1 intraperitoneal no solo suprimió el crecimiento del tumor tratado, sino que también inhibió eficazmente el crecimiento del tumor distante, sin tratar (FIG. 2C) y también generó un mayor número de linfocitos T CD8 específicos de tumores en circulación (FIG. 2D) en comparación con la monoterapia, lo que sugiere que este enfoque local puede tener una eficacia sistémica. Además, el ad-CD40L combinado con anticuerpo anti-CTLA-4 dio como resultado un aumento de la supervivencia y potencialmente curó varios ratones. Estos resultados demostraron la actividad antimelanoma sinérgica de la combinación de ad-CD40L y el bloqueo de punto de control inmunitario.

Ejemplo 3 - Terapia de combinación con ad-ISF35, anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CTLA-4

Para determinar si la combinación de ad-CD40L con múltiples inhibidores de punto de control inmunitario tiene un efecto sinérgico sobre la inhibición del crecimiento tumoral y el aumento de la supervivencia, se estudió una estrategia de tratamiento con tres agentes, como se muestra en la FIG. 4A. Se trataron por vía intratumoral ratones portadores de melanomas B16 establecidos con ad-CD40L (ISF35) o con virus ad-control y recibieron anticuerpo anti-PD1 más anticuerpo anti-CTLA-4 por vía sistémica. Los efectos antitumorales de la monoterapia o de las terapias de combinación se determinaron mediante la medición de la supervivencia de los ratones y del crecimiento tumoral. La contribución mecanicista de las células inmunitarias a esta terapia se determinó usando bloqueos de anticuerpos. Se analizaron los infiltrados de células inmunitarias en los tumores y la expresión de reguladores negativos en estas células por citometría de flujo.

El estudio demostró que la administración intratumoral de ad-CD40L combinada con anticuerpo anti-PD1 era altamente sinérgica e inducía un mayor número de linfocitos T CD8 específicos de melanoma de forma sistémica (FIG. 4B). El bloqueo simultáneo de CTLA-4 mejoró adicionalmente la eficacia del tratamiento y condujo a la regresión completa del melanoma en aproximadamente el 50 % de los ratones y generó una respuesta fuerte de linfocitos T CD8 de memoria. Además, la terapia de combinación de tres agentes tuvo un efecto inhibidor del crecimiento tumoral también en los tumores distantes sin tratar (FIG. 4D). La inmunoterapia basada en la activación intratumoral de CD40 se potencia por el bloqueo de PD-1 y CTLA-4 y esta combinación genera una inmunidad antitumoral de linfocitos T CD8 funcional y duradera que suprime sistémicamente las metástasis de melanoma.

En un análisis adicional, los ratones tratados con la combinación de tres agentes que mostraron una regresión completa se volvieron a exponer a tumores B16.F10 en el flanco opuesto y no se detectó ningún crecimiento tumoral (FIG. 3C). Estos resultados sugieren que una combinación de ad-CD40L con inhibidores del bloqueo de punto de control puede ofrecer una opción inmunoterápica prometedora del melanoma metastásico que no responde a la monoterapia de bloqueo de punto de control.

Para determinar si la terapia de combinación de tres agentes puede usarse para tratar las metástasis distantes, tales como las metástasis cerebrales, se inyectaron en ratones 400.000 linfocitos B16.F10 en el flanco derecho 12 días antes de la terapia y 5.000 linfocitos B16.F10 en el cerebro cuatro días antes del inicio de la terapia de combinación (FIG. 5B). Después del tratamiento con ad-CD40L, anticuerpo anti-PD1 y anticuerpo anti-CTLA-4 los ratones mostraron una regresión completa tanto del tumor en el flanco derecho como del tumor en el cerebro (FIG. 5B). Por tanto, el tratamiento de combinación podría usarse para tratar metástasis distantes, así como tumores locales.

Referencias

Las siguientes referencias proporcionan detalles procedimentales de ejemplo u otros detalles complementarios a aquellos expuestos en el presente documento.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro de potenciación de la función de una célula inmunitaria que comprende poner en contacto dicha célula inmunitaria con al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico que comprende (a) un subdominio extracelular de CD154 humano que se une a un receptor de CD154 humano y (b) un subdominio extracelular de CD154 no humano que reemplaza un sitio de escisión de CD154 humano, donde el al menos un inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

2. El método de la reivindicación 1, donde la función potenciadora de una célula inmunitaria comprende potenciar el cebado, la activación, la proliferación y/o la actividad citolítica de linfocitos T CD8, preferentemente, los linfocitos T CD8 son linfocitos T CD8-positivos e interferón gamma (IFNY)-positivos (CD8+IFN^y+), donde el subdominio extracelular de CD154 no humano es un subdominio extracelular de CD154 murino, donde más de un inhibidor de punto de control se pone en contacto con dicha célula inmunitaria, o donde el polipéptido CD154 quimérico se pone en contacto con dicha célula inmunitaria.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde el polipéptido CD154 quimérico se selecciona del grupo que consiste en factor estimulador inmunitario 30 (SEQ ID No . 1), factor estimulador inmunitario 31 (SEQ ID NO. 2), factor estimulador inmunitario 32 (SEQ ID NO. 3), factor estimulador inmunitario 33 (SEQ ID NO. 4), factor estimulador inmunitario 34 (SEQ ID NO. 5), factor estimulador inmunitario 35 (SEQ ID NO. 6), factor estimulador inmunitario 36 (SEQ ID NO. 7), factor estimulador inmunitario 37 (SEQ ID NO. 8), factor estimulador inmunitario 38 (SEQ ID NO. 9), factor estimulador inmunitario 39 (SEQ ID NO. 10), factor estimulador inmunitario 40 (SEQ ID NO. 11) y factor estimulador inmunitario 41 (SEQ ID NO 12), preferentemente el polipéptido CD154 quimérico es el factor estimulador inmunitario 35.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el polipéptido CD154 quimérico se pone en contacto con dicha célula inmunitaria (i) proporcionando una región codificante para el polipéptido CD154 quimérico en un vector de expresión y bajo el control de un promotor activo en una célula eucariota, y (ii) cultivando dicha célula inmunitaria y dicha célula eucariota en condiciones que favorezcan la expresión de dicho polipéptido CD154 quimérico, preferentemente, el casete de expresión está en un vector vírico, más preferentemente, el vector vírico es un vector adenovírico, un vector retrovírico, un vector vírico de viruela, un vector vírico de herpes, un vector vírico adeno-asociado o un vector vírico de polioma, en particular, un vector adenovírico.

5. El método de la reivindicación 1, donde el antagonista de unión al eje de PD-1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PDL1 y un antagonista de unión a PDL2, preferentemente, el antagonista de unión al eje de PD-1 es un antagonista de unión a PD-1.

6. El método de la reivindicación 5, donde el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PDL1 y/o PDL2, donde el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o donde el antagonista de unión a PD-1 es nivolumab, pembrolizumab, CT-011, BMS 936559, MPDL328OA o AMP-224.

7. Una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico que comprende (a) un subdominio extracelular de CD154 humano que se une a un receptor de CD154 humano y (b) un subdominio extracelular de CD154 no humano que reemplaza un sitio de escisión de CD154 humano para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, donde el al menos un inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

8. La cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde el polipéptido CD154 quimérico se administra antes del al menos un inhibidor de punto de control inmunitario, simultáneamente con el al menos un inhibidor de punto de control inmunitario o después del al menos un punto de control inmunitario,

donde el polipéptido CD154 quimérico y/o el inhibidor de punto de control inmunitario se administran por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intratraqueal, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía endoscópica, por vía intralesional, por vía percutánea, por vía subcutánea, por vía regional o por inyección o perfusión directa, donde el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de riñón de células claras, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas de pulmón, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de células renales, cáncer de pulmón microcítico (CPM), cáncer de mama triple negativo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular, linfoma de Hodgkin (LH), linfoma de células del manto (LCM), mieloma múltiple (MM), proteína de la leucemia de células mieloides 1 (Mcl-1), síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma no Hodgkin (LNH) o linfoma linfocítico pequeño (LLP), preferentemente, el cáncer es un melanoma, más preferentemente, el melanoma es un melanoma metastásico, o

donde la terapia de combinación comprende además al menos un agente terapéutico adicional, preferentemente, el al menos un agente terapéutico adicional es quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, radioterapia o bioterapia.

9. La cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde el número de linfocitos T CD8 e interferón gamma (IFNY)-positivos (CD8+IFN^y+) se eleva en el sujeto con respecto a antes de la administración de la terapia de combinación.

10. La cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde los linfocitos T CD8+IFN^y+ son linfocitos T CD8+IFN^y+ específicos de antígenos tumorales.

11. La cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde los linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de antígenos tumorales son linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de p15E.

12. La cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde los linfocitos T CD8+IFNy+ específicos de p15E comprenden al menos el 1,5 % de los linfocitos T CD8+IFNy+ totales en la sangre periférica del sujeto.

13. La cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde el polipéptido CD154 quimérico se proporciona administrando a dicho sujeto una región codificante para el polipéptido CD154 quimérico en un vector de expresión y bajo el control de un promotor activo en una célula eucariota, preferentemente, el casete de expresión está en un vector vírico.

14. La cantidad eficaz de al menos un inhibidor de punto de control y un polipéptido CD154 quimérico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-13, donde dicho sujeto es un sujeto humano.