JP2006340726A - 発生 - Google Patents
発生 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006340726A JP2006340726A JP2006216297A JP2006216297A JP2006340726A JP 2006340726 A JP2006340726 A JP 2006340726A JP 2006216297 A JP2006216297 A JP 2006216297A JP 2006216297 A JP2006216297 A JP 2006216297A JP 2006340726 A JP2006340726 A JP 2006340726A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- domain
- nucleic acid
- protein
- rks
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title description 80
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 280
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 194
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 122
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 89
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 55
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims abstract description 55
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 53
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 113
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 47
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 37
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 claims description 28
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 abstract description 48
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract description 13
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 141
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 110
- 239000000047 product Substances 0.000 description 91
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 60
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 56
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 description 54
- 108010006444 Leucine-Rich Repeat Proteins Proteins 0.000 description 41
- 230000006870 function Effects 0.000 description 40
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 38
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 36
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 34
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 description 32
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 30
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 28
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 25
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 25
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 24
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 23
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 22
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 21
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 19
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 19
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 18
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 17
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 17
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 16
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 14
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 14
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 13
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 12
- 125000003508 trans-4-hydroxy-L-proline group Chemical group 0.000 description 12
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 11
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 10
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 9
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 9
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 9
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 8
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 6
- 101100309711 Arabidopsis thaliana SD113 gene Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 6
- 235000007230 Sorghum bicolor Nutrition 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 4
- 101100088077 Arabidopsis thaliana RKS1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100053984 Arabidopsis thaliana ZRK1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 4
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L disulfate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OS([O-])(=O)=O VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 4
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 108091005687 plant receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 4
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 3
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 3
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 241000722923 Tulipa Species 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 3
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 2
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 2
- 101000591385 Homo sapiens Neurotensin receptor type 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 2
- 102000017921 NTSR1 Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 2
- 235000008566 Pinus taeda Nutrition 0.000 description 2
- 241000218679 Pinus taeda Species 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241001112810 Streptocarpus Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 2
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 230000000888 organogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- -1 radiation Substances 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 2
- 230000009417 vegetative reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000013466 vegetative reproduction Methods 0.000 description 2
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000232084 Achimenes Species 0.000 description 1
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 1
- 241000556588 Alstroemeria Species 0.000 description 1
- 101100329444 Arabidopsis thaliana CRPK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001099992 Arabidopsis thaliana DNA repair protein RAD51 homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100288144 Arabidopsis thaliana KNAT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000218993 Begonia Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 101100274507 Caenorhabditis elegans cki-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- HSSBORCLYSCBJR-UHFFFAOYSA-N Chloramben Chemical compound NC1=CC(Cl)=CC(C(O)=O)=C1Cl HSSBORCLYSCBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000555678 Citrus unshiu Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 241000732800 Cymbidium Species 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000208296 Datura Species 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 241000221079 Euphorbia <genus> Species 0.000 description 1
- 241000218218 Ficus <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 244000062175 Fittonia argyroneura Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 241000735332 Gerbera Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000723543 Homo sapiens 14-3-3 protein theta Proteins 0.000 description 1
- 241001382593 Imperialibacter roseus Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101150108663 KAPP gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 1
- 241000234280 Liliaceae Species 0.000 description 1
- 241001656403 Lunaria Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 241000196329 Marchantia polymorpha Species 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000499865 Ornithogalum Species 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- 241001303601 Rosacea Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000008622 extracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000003165 hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035040 seed growth Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8295—Cytokinins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8294—Auxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】植物に少なくとも一種の組み換え遺伝子産物またはその機能的フラグメントを導入する無種子繁殖方法の提供。
【解決手段】シロイヌナズナに由来するRKS亜群の核酸分子からなる群から選択される核酸分子にハイブリッド形成可能な受容体様キナーゼをコードする核酸、またはその機能的フラグメントを植物材料に導入することにより根部および/または芽部の形成開始を促進し、培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略することを特徴とする植物の増殖方法、ならびに植物の増殖方法に使用する核酸、ベクタ、宿主細胞。
【選択図】なし
【解決手段】シロイヌナズナに由来するRKS亜群の核酸分子からなる群から選択される核酸分子にハイブリッド形成可能な受容体様キナーゼをコードする核酸、またはその機能的フラグメントを植物材料に導入することにより根部および/または芽部の形成開始を促進し、培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略することを特徴とする植物の増殖方法、ならびに植物の増殖方法に使用する核酸、ベクタ、宿主細胞。
【選択図】なし
Description
本発明は、細胞の再生、(微)生物の自己復元、植物の組織又は器官のような植物の一部の栄養繁殖、例えば組織又は器官の培養物中で増殖する細胞の領域に関し、より具体的には植物体の無種子(seedless)繁殖に関する。
植物および動物の細胞の、より多くの細胞、組織、器官、および完全な植物体および生物体への復元は、既に長い間、人間の気まぐれおよび望みの対象であった生物にとって中心的な過程である。特定の微生物スターター培養物の自己復元は、食品および飲料の発酵に使用されている。さらに、抗生物質又は酵素の製造のための最新の大規模発酵培養物により産生されるような、それらが産生する代謝物自体のため有用である培養物もある。動物細胞の範囲では、復元した培養細胞の使用は、かなり最近のことであるが、細胞又は組織の培養物におけるたとえばウイルスワクチンの製造で大きく飛躍した。さらに最近では、個体から採取し、培養物中で増殖および/又は分化させたドナー細胞が、移植目的のため使用されている。そのような細胞(たとえば骨髄細胞)は、十分に再生させられ分化させられた後、増殖させられるか、又は所望の特徴を付与され、医学的目的のためレシピエントへと移植される。簡単に述べると、そのような療法は、最新の組換え技術による形質転換により所望の特徴を付与され、そして移植されるトランスジェニック細胞すら含むであろう。
再生は、栄養繁殖においてそれが重要である植物においてきわめて多く研究されている。原則として、所望の植物体を得るためには、2つの様式、すなわち種子を介した様式、又は出発材料として種子を使用しない栄養的な様式、で繁殖させることができる。いずれの型の繁殖も、ある種の条件下では、不可能であるか又は望ましくない場合がある。種子を介した繁殖が不十分なものである場合(所望の種子が全く、もしくはほとんど形成されないか、又は所望の種が急速に発芽力を失う場合)には、無種子繁殖が採用されることが多い。また、有性交配によって、その強いヘテロ接合性のためにきわめて異質な子孫が得られるか、又は得られる可能性のある場合にも、種子を介した繁殖は不十分と見なされる場合が多い。当然、本質的に無種子の出発材料の無種子繁殖は、後の段階において所望の種子を生じる場合があり、それは、さらに、所望の植物体を得るために使用されうる。
植物体の無種子繁殖は、インビボ栄養繁殖およびインビトロ栄養繁殖という2つの主要な領域に区別されうる。インビボ栄養繁殖(たとえば、挿木、分割又は分裂、取木、土寄せ、接木又は芽接ぎ、および庭師又は園芸家に既知のその他の方法)は、長年、農業において、たとえばジャガイモ、リンゴ、ナシ、多くの観賞球根植物およびジャガイモのような塊茎植物、多くの樹木作物、カーネーション、キク等のため重要な役割を果たしてきた。栄養繁殖は、植物育種においてもきわめて重要であり、親系統は、種子製造のため栄養的に維持され繁殖させられなければならず、遺伝子バンクの構築のためにはクローニングが必要とされる場合が多く、突然変異誘導後に固体変異体を得るためには不定根形成が必要とされる。
しかしながら、古典的なインビボ栄養繁殖法は、要求される水準に達しないか(過度に遅い、過度に困難、もしくは過度に高価)、又は完全に不可能である場合が多い。最近20年間で、植物はインビボよりもインビトロでの方が迅速にクローニングされうることが発見されて以来、栄養繁殖に関する知識は急速に増加した。このことは、温帯植物についても、亜熱帯植物についても、熱帯植物についても、同様である。インビボのクローニングが不可能である種を、インビトロ培養技術によりクローニングすることすら可能となった。植物出発材料からのインビトロ栄養又は無種子繁殖の様々な方法は、たとえば、外植片又はカルス組織のような出発材料における単一節挿木、腋性分枝、不定器官(根又はシュート)の再生、および出発材料として使用された細胞又はプロトプラストの懸濁液からの植物体の再生を使用している。ほとんどの植物形質転換系の基礎となるのは個々の植物細胞の多能性であるため、形質転換又はトランスジェニック植物体の生成のためには、インビトロ繁殖が必須であるとさえ考えられる。
インビトロで出発材料から植物体を繁殖させるには、原則として、出発材料中の少なくとも1個の細胞が再生能を有していることが必要である。再生能は、たとえば、遺伝子型、環境条件(栄養供給量、調節物質、および物理的条件)、もしくは植物の発達段階、又はこれらの組合せにより決定される。Solanacea(Solanum、Nicotiana、Petunia、Datura、およびLycopersion)、Crucifera(Lunaria、Brassica、Arabidopsis)、Generiaceae(Achimenes、Saintpaulia、Streptocarpus)、Compositae(Chicorium、Lactuca、Chrysantemum)、Liliaceae(Lilium、Hawarthia、Allium、Ornithogalum)のようないくつかの科および属が高い再生能を有することは周知であるが、多くの装飾植物、低木、針葉樹、又は高木、特に果樹、Rosacea、Alstroemeria、Euphorbiaのような樹木種、およびTulipaのような球根植物等は、インビトロ技術を用いたとしても困難であることは有名である。
前述のように、再生((微)生物の自己復元、および植物、動物、又はそれらの一部の自己復元、すなわち栄養生殖/繁殖)は、微生物種、動物種、および植物種の界全体に観察される修復戦略とも見なされる。たとえば、植物における再生は、個々の細胞又は細胞群からの、根およびシュート両方の分裂組織を含有する新組織、別々のシュート又は根の分裂組織、植物器官又は器官原基の形成を含む。再生は、一般に、植物体の発生中に起こり様々な植物器官を形成させる正常な細胞および器官の分化の過程と類似している。正常な発生においては、個体発生初期に、共通の系統の細胞および組織が、発生シグナルに応答して、しばしば対照的な発生進路へと分岐する。この特定のシグナルに応答して発生する能力は、細胞反応能又は細胞発生能としても既知である。反応能を有する細胞は、特定の分化進路へと運命付けられると、他の経路には容易には分岐しない。この細胞発生能の拘束は、決定とも呼ばれる。
通常の条件下で、ある種の植物器官、分裂組織、又は器官原基の形成を開始することができない植物の細胞又は細胞群は、細胞の分化段階を修飾する細胞外刺激により刺激される場合が多い。細胞外拡散性因子は、植物細胞における細胞再分化にとって不可欠であることが示されている(SiegelおよびVerbeke,1989 Science 244,580−582)。最終的には転写調節を変化させる、細胞表面におけるこれらのシグナルの認知および細胞内シグナル伝達は、そのような細胞外刺激に応答する能力を細胞に供給する。再生は、シュートのみを形成させる場合もあるし、又は根のみを形成させる場合もあるし、又はそれら両方を形成させる場合もある。成熟した所望の植物体が発生しうる、必要な新生植物体の3次元配置、頂部−基底部又はシュート−根正面線図を、分化した組織が再び含むようになる再生は、細胞又は組織の再分化の後にのみ、可能である。
実際、無種子繁殖のためのインビトロ技術の中心は、これらの細胞外刺激と類似した、培養培地に添加されることが多い植物ホルモンおよびその他の因子である。再び完全に分化した植物体をもたらす、細胞、組織、又は外植片の培養におけるインビトロの体細胞性の胚形成又は器官形成の基礎となり、それらに先行する、最初の出発細胞の多細胞多能性組織への再生の過程には、一般に、よくバランスのとれた、植物種によって異なることの多い、植物ホルモンの培養物への添加が必要とされる。全体的には、オーキシンとサイトカイニンとの間のバランスが必要とされる。外因性のオーキシン(たとえば、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、クロラムベン(chloramben)、もしくはジカムバ(dicamba))又はサイトカイニン(たとえば、6−ベンジルアミノプリンもしくはゼアチン)又はそれら両方への曝露の後、細胞又は組織は、シュート−根正面線図の発達により、たとえばシュートおよび/又は根の形成により、反応する。それは容易である場合もあるし、適切なホルモンバランスが適切に選択されていない場合には特に、不安定である場合もある。
インビトロ再生、特にインビトロ培養物の操作可能性は、主に、これらの2つの型のホルモンの施用に依存し、培養中の植物ホルモン変化に対する組織の応答能にも依存する。一般に、再生には3つの期が認識されうる。第1期において、培養中の細胞は、器官誘導のホルモンシグナルに応答する能力(許容量ではない)として定義される「反応能」を獲得する。器官形成反応能の獲得の過程は、器官形成反応能を獲得するための、分化した細胞の「脱分化」と呼ばれることが多い。培養中の反応能を有する細胞は、第2期において、休止期の細胞の細胞周期への再進入、並びに植物ホルモンバランスの影響下で特定の原基および分裂組織を形成させるためのシュート−根正面線図の線に沿った細胞分裂の組織化のため、特定の組織および器官の形成へと導かれ、決定される。特に、オーキシンは、不定根開始のための特定の再生シグナル伝達経路に関与していると考えられており、サイトカイニンは、不定シュート開始のための特定の再生シグナル伝達経路に関与していると考えられている。
次いで、第3期において、形態形成、完全に分化した状態への植物体の生長が、外因的に供給されたホルモンとは独立に進行する。
外因性植物ホルモンの添加を介した再生を支配する一般原理は、このようにきわめてよく理解されているが、きわめて多くの個々の種について、妥当なバランス、妥当な投与時間、又はホルモンの妥当な型もしくは亜型を見出すインビトロ培養プロトコルの設計作業は、依然として、多かれ少なかれ試行錯誤の過程である。しかしながら、前述のように、きわめて多くの植物種にとって、特に一般に繁殖が困難なものにとっては、インビトロ再生又は無種子繁殖は、きわめて重要である。
本発明は、再生過程における培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、植物出発材料からの植物体の繁殖のための培養法を提供する。本方法においては、特にシュート−根正面線図の発生期において、植物発達の調節に関与する1個以上の遺伝子に由来する少なくとも1個の組換え遺伝子産物又はその機能的断片を出発材料に導入することにより、たとえば根又はシュートの開始のための少なくとも1個のシグナル伝達経路を刺激することにより、根又はシュートの開始が刺激される。好ましい実施態様において、本発明は、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、出発材料の再生を含む、植物出発材料からの植物体の栄養繁殖のための培養法を提供する。本方法においては、出発材料の再生の間、不定根又はシュートの開始のための少なくとも1個の特異的シグナル伝達経路が、内因的に刺激され、特に、経路は、ホルモン産生に関与する遺伝子もしくは遺伝子産物、ホルモン産生にフィードバックを与える遺伝子もしくは遺伝子産物、又は再生へと至るイベントカスケードに関与する遺伝子もしくは遺伝子産物のような、再生の発生調節に関与する1個以上の遺伝子に由来する組換え遺伝子産物により内因的に刺激される。
オーキシン又はサイトカイニンが最も広く使用されているのはインビトロ培養であるため、多くの装飾用植物、低木、針葉樹、又は高木、特に果樹、Rosacea、Alstroemeria、Euphorbiaのような樹木種、およびTulipaのような球根植物のような、栄養繁殖のための再生が困難であることが有名な植物については特に、好ましくは、本発明により提供されるような方法は、再生過程中に少なくとも1つのインビトロ培養工程を含む。しかしながら、明らかに、ホルモンは、インビボ培養においても一般的に使用されており(インビボ培養とは、農業において伝統的に使用されている本質的に全ての作物又は植物の培養法)、ここで、そのようなホルモンは、一般に、(根又は茎の)浸漬、噴霧、又は潅水により添加されている。特に、本質的に無種子の様式で繁殖する植物は、より容易な再生又は繁殖が可能であり、したがって、好ましい実施態様において、本発明は、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、出発材料の再生を含む、植物出発材料からの植物体の本質的に無種子の繁殖のための培養法を提供する。方法においては、再生中、不定根又はシュートの開始のための少なくとも1つの特異的シグナル伝達経路が、たとえば前記の遺伝子産物により内因的に刺激される。
本明細書において、本質的に無種子の繁殖とは、出発材料が本質的に種子を含んでいないか、少なくとも出発材料中に存在する可能性のある種子が、出発材料の再生の基礎となっていないか、もしくは所望の植物体へと発達しないことと定義される。しかしながら、本発明により提供されるような再生を含む培養法の1つの面として、本発明による再生又は繁殖の過程の間、又はその後に、種子は形成されてもよく、本発明による繁殖の基礎としてではなく、その結果として、それから所望の植物体を発達させることすら可能である。
特に、本発明は、出発材料が、植物ホルモンの添加が自明であると考えられるインビトロ培養法において一般的に使用されている材料、個々の植物細胞又はプロトプラスト又は外植片又は植物組織を含む、培養法を提供する。本方法においては、そのような添加はもはや必要でないか、又は減少させることが可能であり、そのような様々なホルモンの添加の複雑なバランスを考慮する必要がない、より容易なインビトロ培養様式が提供される。
本発明は、たとえば植物組織の繁殖特徴の操作を提供する。多数の植物種が、比較的短かい時間で大量に得るため、組織培養において繁殖させられている。本発明を使用すれば、増倍率を数倍増加させることが比較的容易である。低木、高木、および様々な球根植物種のような、いくつかの困難であることが有名な種についても、本発明を使用すれば、本質的に無種子の繁殖、特にインビトロ培養を使用することが可能となる。これらの植物から単離された細胞又は組織の再生許容量は、核酸又は(修飾型)タンパク質のようなある種の生理活性分子の導入により、有意に増加し、したがって、増倍率が増加する。核酸又はタンパク質は、粒子銃、電気穿孔、微量注入、又は序論において記載されたその他の技術のような当分野において既知の方法により導入されうる。導入される分子は、RNA、もしくはゲノムへ組み込まれる確率が低い裸のDNAである核酸、又は(修飾型)タンパク質産物のいずれかである。分子は、一般に、再生過程中に失われ、したがって一時的にのみ存在するであろう。使用されうる核酸は、再生過程を刺激し、かつ外因的に添加される植物ホルモンの使用を減少させるか、又は排除するタンパク質を、コード又は産生する。添加されうるタンパク質は、これらの核酸のタンパク質産物又はそれらの修飾型である。前記の特徴を有する分子の例は、植物発達の調節又は植物ホルモンの認知に関与するタンパク質、又はそのようなタンパク質をコードする遺伝子である。本発明を使用することにより、増倍率は、より広い意味で、より困難な種についてもインビトロ繁殖技術を使用することを可能にするであろう程度に増加しうる。また、本発明を使用することにより、これらの植物のための繁殖特徴を永久的に増加させることも、比較的容易である。これらの植物の再生許容量は、植物発達の調節又は植物ホルモンの認知に関与するタンパク質をコードする遺伝子、又はより具体的には根もしくはシュートの開始のための1つのシグナル伝達経路を刺激もしくは誘導する産物をコードする遺伝子、又はさらに具体的には植物受容体キナーゼファミリーRKSの代表をコードする遺伝子を導入することにより、これらの植物をトランスジェニックにした場合、有意に増加しうる。形質転換は、アグロバクテリウム媒介形質転換、粒子銃、前記のマーカーフリー形質転換系等のような、当分野において既知の技術を使用して達成されうる。そして、遺伝子の非致死的発現体が選択される。
1つの好ましい実施態様において、本発明は、出発材料が所望の体細胞性突然変異を含む、本発明に係る培養法を提供する。突然変異は、生存生物の任意の細胞において起こりうるが、この突然変異が、その生物の配偶体細胞が由来する細胞において起こった場合にのみ、子孫に受け継がれる。体細胞性突然変異は、突然変異が認められる組織が栄養繁殖しない場合、又はこの組織の細胞が再生し、完全な新たな生物体を形成する場合、通常失われる。本発明に記載の技術を使用すれば、植物における体細胞性突然変異の救出が提供される。体細胞系の組織のみならず、生殖系の組織も、本発明により提供されるような核酸又は(修飾型)タンパク質のような生理活性分子の導入により、再生するよう刺激される。核酸又はタンパク質は、粒子銃、電気穿孔、微量注入、又は記載されているその他の技術のような当分野において既知の方法により導入されうる。導入される分子は、RNA、もしくはゲノムへ組み込まれる確率が低い(必ずではない)裸のDNAである核酸、又は(修飾型)タンパク質産物のいずれかである。分子は、一般に、再生過程中に失われ、したがって一時的にのみ存在するであろう。使用されうる核酸は、再生過程を刺激し、かつ外因的に添加される植物ホルモンの使用を減少させるか、又は排除するタンパク質を、コードする。添加されうるタンパク質は、これらの核酸のタンパク質産物又はそれらの修飾型である。前記の特徴を有する分子の例は、植物発達の調節又は植物ホルモンの認知に関与するタンパク質、又はそのようなタンパク質をコードする遺伝子である。又は、体細胞性突然変異は、コルヒチン、EMS、放射線、又は発癌性物質等のような突然変異誘発剤により種子を処理することにより作出されたものであってもよい。これらの処理された種子から生長したこれらのモザイク植物体の中のセクターが、所望の表現型に関してスクリーニングされよう。続いて、重要なセクターが単離され、これらの所望の形質のクローン性繁殖を得るため、前記の本発明により再生のための出発材料として使用されよう。
もう一つの好ましい実施態様において、本発明は、出発材料がトランスジェニック材料を含む、本発明に係る培養法を提供する。今日では、トランスジェニック植物は、数は限定されているものの、迅速に製造されている。圃場条件下でのさらなる繁殖のため十分な数の植物体を迅速に獲得するため、インビトロ培養技術が広く使用されている。本発明は、そのようなトランスジェニック植物培養物中の植物ホルモンレベルに、ほとんど又は全く注意を払う必要のない方法を提供する。
特に、本発明は、出発材料が所望の形質をコードする組換え核酸をさらに含む方法を提供した。本発明は、それにより、本質的にマーカーフリーの形質転換を提供するか、又は少なくとも形質転換および繁殖の後、本質的にマーカーフリーである植物体を提供する。植物体のゲノムへと組み込むべき所望の形質をコードする組換え核酸は、ベクター、粒子銃、電気穿孔、微量注入、又は当分野において記載されているその他の技術のような遺伝子輸送のための媒体又は方法により、出発材料の少なくとも一部に供給される。たとえば、たとえば植物発達の調節に関与する1個以上の遺伝子に由来する根又はシュートの開始のための少なくとも1個のシグナル伝達経路を刺激することにより、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、少なくとも1つの組換え遺伝子産物又はその機能的断片を有する、組換え核酸を含む細胞も、本発明により供給される。本発明は、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、出発材料の再生を含む、所望の形質をコードする組換え核酸が供給された植物出発材料からの植物体の栄養繁殖のための培養法を提供する。本方法においては、出発材料の再生中、不定根又はシュートの開始のための少なくとも1つのシグナル伝達経路が、内因的に刺激され、特に、経路は、ホルモン産生に関与する遺伝子もしくは遺伝子産物、ホルモン産生にフィードバックを与える遺伝子もしくは遺伝子産物、又は再生へと至るイベントカスケードに関与する遺伝子もしくは遺伝子産物のような、再生の発生調節に関与する遺伝子に由来する組換え遺伝子産物により内因的に刺激される。
好ましい実施態様において、所望の形質をコードする組換え核酸には、核ターゲティングおよび/又は植物ゲノムへの組み込みのための手段が、さらに供給されている。そのような手段は、、核への適切なターゲティングおよび/又は適切な組み込みの刺激を処理する、所望の形質をコードする組換え核酸と結合させられた核酸シグナル、又はトランスポザーゼのようなタンパク質性の物質、又は細胞内の組換え核酸を保護するためのウイルスもしくは細菌のタンパク質(たとえば、Virタンパク質)であり得る。
さらに好ましくは、本発明は、出発材料が、とりわけ所望の形質をコードする組換え核酸を含む、形質転換すべき個々の植物細胞又はプロトプラスト又は外植片又は植物組織を含み、未形質転換出発材料から形質転換された材料が選択されなければならない方法を提供する。
一般に、たとえば植物形質転換の過程の一部として、トランスジェニック植物体を再生させうるトランスジェニック細胞を選択するため、優性選択可能マーカーが使用される。第1に、これらのマーカー遺伝子は、完全なトランスジェニック植物体が確立された後には、一般に、余分なものとなる。さらに、経済価値の高い遺伝子を作物へ導入するために使用される、たとえば抗生物質又は除草剤に対する耐性を与える選択可能マーカー遺伝子は、以下のような大きな問題を有している。修飾酵素の発現による選択剤の解毒が、未形質転換細胞の回避を可能にする可能性がある。死滅する未形質転換細胞が、毒性があり、形質転換細胞の再生を阻害する産物を放出する。選択剤は、細胞の増殖および分化に対する負の効果を有する可能性がある。多くの選択可能遺伝子の環境への影響に関して、不確実性が存在する。所望の遺伝子を徐々に増加させるために、同一の選択可能マーカーを使用した形質転換を繰り返し実施することは困難である。本発明は、培養物への選択剤の添加を減少させるか、又は省略する方法を提供する。
使用されたマーカー遺伝子が、その任務を果たした後、形質転換細胞から除去されるような、多様な植物種のマーカーフリー形質転換体を得るため、マーカー遺伝子の排除を可能にする形質転換系を設計しようという試みが以前になされた。1つの方法は、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)により媒介される細胞の、2つの異なるT−DNAを保持するバイナリーベクター(一方はたとえば薬剤耐性選択マーカー遺伝子を含み、もう一方は所望の遺伝子を含む)による共形質転換、それに続く、所望の遺伝子とは異なる遺伝子座に位置していると考えられる不要な薬物耐性遺伝子の交配による除去を含む。所望の遺伝子を含む薬物感受性形質転換体は、このようにして入手されうるが、これらの全ての形質転換体が実際に完全に選択マーカー遺伝子又はその断片についてフリー(非機能性又は部分的機能性)であるか否かは明らかでない。又、最初に使用された選択剤は、依然として、形質転換過程中の植物細胞の増殖および分化に対する望ましくない負の効果を有している。さらに、その方法は、有性交配を必要とするため、栄養生殖ではなく有性交配が実用的な生殖法である植物種に限定され、実務上は、十分に短い世代時間を有する植物種にさらに限定される。
植物を有性交配させる必要のない、細胞が形質転換された後、余分なマーカーを排除するための現在利用可能な1つの戦略は、MATベクター系である。しかしながら、この系は、偶然的にしか起こらず、形質転換過程の最終効率を減少させるイベントである、トランスポザーゼ因子に含まれる選択遺伝子の内在性の形質転換後切り出しに依存している。
さらに別の戦略は、Cre−Loxシステムで見られるような部位特異的組換えを含み、これにより第一形質転換では、選択マーカー遺伝子を、予め決定した特異的部位に挿入し、これにより形質転換細胞の選択が可能となり、その後、部位特異的リコンビナーゼの導入を含む第二の形質転換において、選択マーカー遺伝子を再度ゲノムから切出す。
他の問題とは離れて、適切な部位を形質転換細胞に有する必要条件は、前記方法を、ゲノムが公知である生物に制限されることは言うまでもない。本発明はここで、インビトロ培養により形質転換細胞を得る方法を提供し、ここでの前記トランスジェニック物質は、選択物質に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子を欠いている。選択物質に対する耐性は、もはや必要ではない。なぜなら、本発明により、形質転換物質には、外来植物ホルモンの前記培養液への添加を減少または排除し、これにより前記遺伝子産物またはその機能的断片を提供されていない非形質転換細胞よりも、好ましい増殖条件を形質転換細胞に与えることを可能とする、植物の発達調節に関与する遺伝子から得られた、必要な組換え遺伝子産物または遺伝子産物群またはまたはその機能的断片(群)を備えているからである。特に、本発明は、前記出発物質の再生を含む形質転換植物出発物質からの植物の栄養的増殖の培養法を提供し、ここで、前記形質転換出発物質の再生中、不定根またはシュート開始のための少なくとも1つの特異的シグナル伝達経路は、内因的に刺激され、外来植物ホルモンの前記培養液への添加を減少または排除することが可能となり、特にここでは前記経路は、再生の発達調節に関与する遺伝子から得られた組換え遺伝子産物により内因的に刺激される。その美点は、選択物質に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子を全く前記物質に導入する必要がなく、よって後に前記マーカー遺伝子の形質転換物質を枯渇する必要がなくなる。特に、したがって本発明は、抗生物質または除草剤に対する耐性を利用せず、ここで関連した全ての欠点を有さない。
端的に言えば、大半の植物形質転換系は、除草剤または抗生物質耐性の選択に基づき、形質転換体の選択は、それ自体の特徴の他に追加の選択マーカー遺伝子の存在に基づく。本発明に記載の技術を使用して、植物でのマーカーを使用しない形質転換を提供する。この新しい形質転換/再生(t/r)系は、たとえば、2つの成分からなる(図20)。本実施例の第一成分は、アグロバクテリアT−DNAの境界の間に存在し得るが、適切なプロモーター以外は他のDNAは必要ではない特徴である。この第一成分は、一本鎖または二本鎖DNAであり得、VirE2タンパク質および/またはVirD2の分子でインビトロでコーティングし得る(好ましくは、このDNAの5’末端に共有結合している)。Vir−タンパク質は、植物細胞内のDNAを保護するように存在し得、核に対して適切な標的化に注意し、植物DNAへの適切な組込みを刺激する。組織は、特定の生物活性分子の導入により再生するように刺激する。これらの生物活性分子は、第二成分として作用する。第二成分は、ゲノムまたは(修飾)タンパク質産物に組込まれる機会は少ない、核酸、RNA、または裸DNAである。
核酸またはタンパク質(第二成分)は、微粒子銃衝撃、電気穿孔法、マイクロインジェクション、または序論で記載した他の技術のような、当分野で公知の方法により第一成分と混合して導入し得る。両方の成分が、植物細胞に一緒に十分量で存在しなければならないが、2つの成分の間の比は、植物DNAの種および特徴の組込みの好ましい数に応じて変化し得る。第二成分は、好ましくは、再生プロセス中に消失し、それ故、一過性にしか存在せず、一方、第一成分は、植物ゲノムに組込まれる確率が高い。第二成分は、再生プロセスを刺激し、再生プロセスを刺激し外的に添加した植物ホルモンの使用を低下または消失するタンパク質を産生する核酸または核酸混合物であるか、または、タンパク質産物またはこれらの核酸の産物のこの混合物またはその修飾形または両方の混合物である。上記の特徴を有する分子の例は、タンパク質、または、植物発達または植物ホルモンの知覚の調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。このt/r−系の主な利点は、図20の例を用いて説明したとおりである:
特徴のみを、植物DNAに導入する;T−DNA境界とは別に(VIRタンパク質を使用する場合にのみ、T−DNA境界を特徴DNAに含めることが必要である)、存在する場合、選択マーカーのような他の望まないDNAは全く存在しない。植物ゲノム上で特徴DNAを対応する内因性DNAに相同的組換えするプロセスを可能とするために、At R51、AtRAD51またはRecAをコードする遺伝子または遺伝子産物、または類似の機能をもつ遺伝子産物を、第二成分に適用して、リコンビナーゼの一過性発現を生じることができる。特徴DNAの標的化および局在化組込み後、リコンビナーゼは欠失する。
再生の原理は全体的に適用可能である。
再生用の外的植物ホルモンの量は減少または排除できない。
主に形質転換細胞は再生するので、能動選択は必要ではない。
特徴のみを、植物DNAに導入する;T−DNA境界とは別に(VIRタンパク質を使用する場合にのみ、T−DNA境界を特徴DNAに含めることが必要である)、存在する場合、選択マーカーのような他の望まないDNAは全く存在しない。植物ゲノム上で特徴DNAを対応する内因性DNAに相同的組換えするプロセスを可能とするために、At R51、AtRAD51またはRecAをコードする遺伝子または遺伝子産物、または類似の機能をもつ遺伝子産物を、第二成分に適用して、リコンビナーゼの一過性発現を生じることができる。特徴DNAの標的化および局在化組込み後、リコンビナーゼは欠失する。
再生の原理は全体的に適用可能である。
再生用の外的植物ホルモンの量は減少または排除できない。
主に形質転換細胞は再生するので、能動選択は必要ではない。
植物発達の調節に関与する前記遺伝子は、既に既知であるか、または再生に関与すると既に決定されている、非常に多くの遺伝子から選択できる。前記遺伝子の例は、不活性化された場合に再生を刺激する、clavata(Clarkら、1997、Cell 89、575〜585)およびprimordia時期遺伝子(Mordhorstら、1998、Genetics 149、549〜563)、Leafy−Cotelydon遺伝子(LEC、Lotanら、1998、Cell 93、1195〜1205)、KAPP遺伝子(Stoneら、1994、Science 266、793〜795;Stoneら、1998、Plant Physiol 117、1217〜1225)、IPT(Morris,R.O.、1986、Annu.Rev.Plant Physiol.37、509〜538)、WUSCHEL(Mayerら、1998
Cell 95、805〜815;Schoofら、2000 Cell 100、635〜644)、KNAT1&2(アラビドプシスkn1様遺伝子)(Chuckら、1996、Plant Cell 8、1277〜1289;Lincolnら、1994 The Plant Cell 6、1859〜1876)、SHOOT MERISTEMLESS遺伝子(Endrizziら、1996 Plant J.10、967〜979)、CUP−SHAPED
COTYLEDON(Aidaら、1999、Development 126、1563〜1570)、CYCLIN D(Cockcroftら、2000 Nature 405、575〜579;Riou−Khamlichiら、1999 Science 283、1541〜1544)、CKI1(Kakimoto 1996 Science 274、982〜985)、AINTEGUMENTA(MizukamiおよびFischer 2000 PNAS 97、942〜947;Krizek 1999 Dev.Genetics 25、224〜236)、SBP−ボックスタンパク質(Cardonら、1999 Gene 237、91〜104)、CDC2a(Hemerlyら、1993、The Plant Cell 5、1711〜1723)(これは誘導または過剰発現された場合に再生を刺激する遺伝子である)、または、分子レベルで植物胚発生または器官発生を研究することにより見出し得るような、広い意味で植物発達の調節に関与するそのアンタゴニストまたはその他である。特に、再生に関与する遺伝子産物の個体群は、RKSタンパク質により直接リン酸化され、それにより活性化される細胞内シグナル伝達因子により示される。
Cell 95、805〜815;Schoofら、2000 Cell 100、635〜644)、KNAT1&2(アラビドプシスkn1様遺伝子)(Chuckら、1996、Plant Cell 8、1277〜1289;Lincolnら、1994 The Plant Cell 6、1859〜1876)、SHOOT MERISTEMLESS遺伝子(Endrizziら、1996 Plant J.10、967〜979)、CUP−SHAPED
COTYLEDON(Aidaら、1999、Development 126、1563〜1570)、CYCLIN D(Cockcroftら、2000 Nature 405、575〜579;Riou−Khamlichiら、1999 Science 283、1541〜1544)、CKI1(Kakimoto 1996 Science 274、982〜985)、AINTEGUMENTA(MizukamiおよびFischer 2000 PNAS 97、942〜947;Krizek 1999 Dev.Genetics 25、224〜236)、SBP−ボックスタンパク質(Cardonら、1999 Gene 237、91〜104)、CDC2a(Hemerlyら、1993、The Plant Cell 5、1711〜1723)(これは誘導または過剰発現された場合に再生を刺激する遺伝子である)、または、分子レベルで植物胚発生または器官発生を研究することにより見出し得るような、広い意味で植物発達の調節に関与するそのアンタゴニストまたはその他である。特に、再生に関与する遺伝子産物の個体群は、RKSタンパク質により直接リン酸化され、それにより活性化される細胞内シグナル伝達因子により示される。
好ましい実施形態において、本発明は、本発明に記載の方法を提供し、ここで、植物発達の調節に関与する前記遺伝子は、以下のようなアラビドプシスRKSタンパク質ファミリーの細胞外ドメインに相同性を有する、植物データベース集合に存在するような、受容体様のキナーゼを含む、ロイシンリッチリピートをコードする:
GB:AW011134 AW011134 ST17B03Pinus taeda
GB:LELRPGENE X95269 L.esculentum
GB:AI775448 AI775448 EST256548 Lycopersicon esculentum
GB:AI496325 AI496325 sb05c09.y1 Gm−c1004グリシン
GB:AI487272 AI487272 EST245594 Lycopersicon esculentum
GB:AI441759 AI441759 sa82d08.y1 Gm−c1004グリシンマックス
GB:AI782010 AI782010 EST262889 Lycopersicon esculentum
GB:AI772079 AI772079 EST253179 Lycopersicon esculentum
GB:SBU62279 U62279 Sorghum bicolor
GB:C22645 C22645 C22645 Oryza sativaGB:D49016 D49016 RICS15625A Oryza sativa
GB:AI776399 AI776399 EST257499 Lycopersicon esculentum
GB:AI776208 AI776208 EST257308 Lycopersicon esculentum
GB:AI352795 AI352795 MB61−10D PZ204.BNlib Brassica napus
GB:AQ578072 AQ578072 nbxb0092C18f Oryza sativa
GB:C95313 C95313 C95313 Citrus unshiu Miyagawa
GB:AI162893 AI162893 A026P38U Hybrid
aspen
GB:AI782076 AI782076 EST262955 Lycopersicon esculentum
GB:AI726177 AI726177 BNLGHis5165Cotton
GB:AI777982 AI777982 EST258861 Lycopersicon esculentum
GB:AI774881 AI774881 EST255981 Lycopersicon esculentum
GB:AI896737 AI896737 EST266180 Lycopersicon esculentum
GB:AI676939 AI676939 605047A07.x1Zea
mays
GB:D40598 D40598 RICS2674A Oryza sativa
GB:OSU82168 U82168 Oryza sativa
GB:SBRLK1 Y14600 Sorghum bicolor
GB:AI495359 AI495359 sa97a09.y1 Gm−c1004グリシンマックス
GB:C96041 C96041 C96041 Marchantia polymorpha、または、植物データベース集合に存在するような、アラビドプシスRKSタンパク質ファミリーの細胞内ドメインに類似性を有する、たとえば
GB:AI896277 AI896277 EST265720 Lycopersicon esculentum
GB:AU056335 AU056335 AU056335 Oryza sativa
GB:AA738546 AA738546 SbRLK4 Sorghum bicolor
GB:AA738544 AA738544 SbRLK2 Sorghum bicolor
GB:AA738545 AA738545 SbRLK3 Sorghum bicolor
GB:SBRLK1 Y14600 Sorghum bicolor
GB:AI729090 AI729090 Gossypium hirsutum
GB:AI920205 AI920205 Pinus taeda
GB:AI896183 AI896183 EST265626 Lycopersicon esculentum
GB:AI967314 AI967314 Lotus japonicusGB:AI730535 AI730535 BNLGHi7007 Gossypium hirsutum
GB:AF078082 AF078082 Phaseolus vulgaris
GB:CRPK1 Z73295 C.roseus
GB:C22536 C22536 C22536 Oryza sativaGB:C22530 C22530 C22530 Oryza sativaGB:ZMA010166 AJ010166 Zea mays mRNA
GB:AQ271213 AQ271213 Oryza sativa、または、Schmidtら(1997、Development 124、2049〜2062、第WO97/43427号)から公知であり、ここで、たとえば、SERK(RKSO)での植物の選択での使用において再生や一過性発現ではなく、安定な形質転換を考える。また、本発明の方法に適用可能なのは、細菌遺伝子またはその断片、たとえばAK−6b遺伝子(Wabikoら、Plant Physiol 1996、939〜951)またはrolABC遺伝子(Jasik J、Plant Science、1997、57〜68)であるが、安定な形質転換による再生のみを目的とする場合、本明細書に開示したような植物遺伝子が好ましい。
GB:AW011134 AW011134 ST17B03Pinus taeda
GB:LELRPGENE X95269 L.esculentum
GB:AI775448 AI775448 EST256548 Lycopersicon esculentum
GB:AI496325 AI496325 sb05c09.y1 Gm−c1004グリシン
GB:AI487272 AI487272 EST245594 Lycopersicon esculentum
GB:AI441759 AI441759 sa82d08.y1 Gm−c1004グリシンマックス
GB:AI782010 AI782010 EST262889 Lycopersicon esculentum
GB:AI772079 AI772079 EST253179 Lycopersicon esculentum
GB:SBU62279 U62279 Sorghum bicolor
GB:C22645 C22645 C22645 Oryza sativaGB:D49016 D49016 RICS15625A Oryza sativa
GB:AI776399 AI776399 EST257499 Lycopersicon esculentum
GB:AI776208 AI776208 EST257308 Lycopersicon esculentum
GB:AI352795 AI352795 MB61−10D PZ204.BNlib Brassica napus
GB:AQ578072 AQ578072 nbxb0092C18f Oryza sativa
GB:C95313 C95313 C95313 Citrus unshiu Miyagawa
GB:AI162893 AI162893 A026P38U Hybrid
aspen
GB:AI782076 AI782076 EST262955 Lycopersicon esculentum
GB:AI726177 AI726177 BNLGHis5165Cotton
GB:AI777982 AI777982 EST258861 Lycopersicon esculentum
GB:AI774881 AI774881 EST255981 Lycopersicon esculentum
GB:AI896737 AI896737 EST266180 Lycopersicon esculentum
GB:AI676939 AI676939 605047A07.x1Zea
mays
GB:D40598 D40598 RICS2674A Oryza sativa
GB:OSU82168 U82168 Oryza sativa
GB:SBRLK1 Y14600 Sorghum bicolor
GB:AI495359 AI495359 sa97a09.y1 Gm−c1004グリシンマックス
GB:C96041 C96041 C96041 Marchantia polymorpha、または、植物データベース集合に存在するような、アラビドプシスRKSタンパク質ファミリーの細胞内ドメインに類似性を有する、たとえば
GB:AI896277 AI896277 EST265720 Lycopersicon esculentum
GB:AU056335 AU056335 AU056335 Oryza sativa
GB:AA738546 AA738546 SbRLK4 Sorghum bicolor
GB:AA738544 AA738544 SbRLK2 Sorghum bicolor
GB:AA738545 AA738545 SbRLK3 Sorghum bicolor
GB:SBRLK1 Y14600 Sorghum bicolor
GB:AI729090 AI729090 Gossypium hirsutum
GB:AI920205 AI920205 Pinus taeda
GB:AI896183 AI896183 EST265626 Lycopersicon esculentum
GB:AI967314 AI967314 Lotus japonicusGB:AI730535 AI730535 BNLGHi7007 Gossypium hirsutum
GB:AF078082 AF078082 Phaseolus vulgaris
GB:CRPK1 Z73295 C.roseus
GB:C22536 C22536 C22536 Oryza sativaGB:C22530 C22530 C22530 Oryza sativaGB:ZMA010166 AJ010166 Zea mays mRNA
GB:AQ271213 AQ271213 Oryza sativa、または、Schmidtら(1997、Development 124、2049〜2062、第WO97/43427号)から公知であり、ここで、たとえば、SERK(RKSO)での植物の選択での使用において再生や一過性発現ではなく、安定な形質転換を考える。また、本発明の方法に適用可能なのは、細菌遺伝子またはその断片、たとえばAK−6b遺伝子(Wabikoら、Plant Physiol 1996、939〜951)またはrolABC遺伝子(Jasik J、Plant Science、1997、57〜68)であるが、安定な形質転換による再生のみを目的とする場合、本明細書に開示したような植物遺伝子が好ましい。
好ましい実施形態において、本発明は、本発明に記載の方法を提供し、ここで、植物発達の調節に関与する前記遺伝子は、受容体様のキナーゼを含むロイシンリッチリピートをコードし、ここでの前記受容体様キナーゼは、図3に示したような植物受容体キナーゼファミリーRKSを示す。
特に、本発明は、前記遺伝子産物またはその機能的断片が、N末端シグナル配列、ロイシンジッパードメインを含む細胞外領域、ジスルフェート橋ドメイン、3〜5個のロイシンリッチリピートを含むロイシンリッチリピートドメイン、膜貫通ドメイン、アンカードメインを含む細胞内領域、セリン/トレオニンキナーゼドメインおよび/またはC末端ロイシンリッチリピートドメインを含む受容体様キナーゼから得られる方法を提供する。
これらの遺伝子は、シグナル伝達に特定の機能を有する膜貫通タンパク質をコードし、これにより、本発明の方法に使用する遺伝子産物またはその機能的断片を提供する主な候補遺伝子である。
特に、本発明は、前記の受容体様キナーゼが、Arabidopsis thalianaが、図4または8から20のいずれか1つに示したような配列を含む、核酸によりコードされる方法を提供する。Arabidopsis thaliana以外の植物由来の適切な受容体キナーゼ様遺伝子、たとえばDaucus carota、Rosa、Gerbera、Chrysanthemum、Alstroumeria、Lilium、Tulipa、Dyanthus、Cymbidium、Gypsopays、Ficus、Calangoe、Begonia、Phalasnopsis、Rhonondendrum、Spatiphilus、Cucubitaceae、Solanaceae、および穀物などの芝生は、容易に、当分野で公知の方法により本明細書で提供されるArabidopsis thaliana配列を使用して見出される。一般に、Arabidopsis thalianaで同定された各RKS遺伝子について、対応するRKS遺伝子は、単子葉並びに双子葉植物の両方の個々の種に存在する。本発明は、前記受容体様キナーゼが、核酸(ここでArabidopsis thalianaは図4または8から20のいずれか1つに示したような配列を含む)に対応するまたは相同な植物由来核酸によりコードされる、方法を提供する。Arabidopsis thaliana以外の植物種での対応するまたは相同なRKS遺伝子および遺伝子産物は、種々のアプローチにより単離される。たとえば、ArabidopsisRKScDNAプローブを使用して、上記したような低ストリンジェントなハイブリダイゼーション/洗浄条件下で、cDNAおよびゲノムライブラリーのスクリーニングにより、別法として変性RKSプライマーの使用により(所望の遺伝子のエキソン断片を増幅するために本明細書に示したようなRKSB正およびRKSE逆プライマー組合せ)。全長cDNAクローンは、さらに、レースおよびテイルPCRアプローチにより得ることができる。また、植物種内のRKS遺伝子ファミリーの異なるファミリー内の保存または別個および特異的領域を認識する抗体の産生により、所望の単離が可能となる。別法として、種々の植物種で1つの特異的RKS遺伝子産物を認識する特異的抗体を作成する。これらの抗体を使用して、植物種のcDNA発現ライブラリーをスクリーンする。さらに、電子データベースでRKS相同配列についてスクリーンが可能である。探索はヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方で実施する。別法として、Arabidopsis thaliana以外の植物種のRKS遺伝子および遺伝子産物を、たとえば、RKSクローンを用いて酵母で2または3重ハイブリッドスクリーニングにより単離し、類似または非関連植物種におけるこのRKSファミリーの(ヘテロ)二量体メンバーを単離する。
1つの実施形態において、本発明は、植物出発物質から植物を増殖する方法を提供し、ここで、前記出発物質の再生中、根またはシュート開始の少なくとも1つのシグナル伝達経路が、外的植物ホルモンの前記培養液への添加を可能とする、植物発達の調節に関与する遺伝子から得られた組換え遺伝子産物またはその機能的断片により刺激され、ここでの前記遺伝子産物またはその機能的断片は、形質転換により出発物質の少なくとも一部に導入される。本発明はまた、再生遺伝子作成物の細胞への導入を提供し、これにより細胞自体の再生または隣接細胞での再生プロセスの誘導が生じ得、さらには前記誘導細胞から生じた体細胞胚がここに提供される。周囲細胞の分化状態に不可欠な個々の形質転換細胞が作成される。ここに提供したような前記誘導再生因子の植物細胞への導入により、隣接細胞の増殖の形成、および、これらの増殖細胞塊からの新しい植物またはその一部の形成が起こる。最初に形質転換した植物は、増殖プロセスそれ自体に必ずしも含まれず、それ故、生じる再生植物またはその部分において必ずしも一部ではない。それに提供された隣接細胞の誘導再生の特異的形は、導入遺伝子または遺伝子産物を含まない植物を再生する選択肢を与え、それ故、遺伝子産物を最初の細胞個体群に導入し、それをコードするこれらの遺伝子産物または核酸を維持する必要なく、再生を誘導する方法を示す。誘導した誘導のプロセスの例は図6Fに示し、ここでの、1つのGUS陽性細胞は、衝撃を与えたDNA作成物の最初の誘導部位に印を付す。この細胞の上に、明らかにGUS陰性である増殖細胞塊が形成された。この誘導増殖細胞塊の上端に、我々は、体細胞胚を形態学的に示す数個の構造を検出できる。体細胞胚は、前記したような増殖細胞塊の境界から発達する(Schmidtら、1997 Development 124、12049〜2062)。体細胞胚は、再生植物の優れた起源を提供する。なぜなら、全ての器官および植物部分が、接合胚発生中に起こるような類似のプロセスにより形成される。この観察により、明らかに、このクラスの再生分子が増殖中で形質転換されていない細胞塊(これから新しい植物を再生できる)を誘導する能力が示される。それは、予めインビトロ培養手順を導入する必要さえなく、生存植物組織上に直接的に体細胞胚を誘導する手段を提供する。
ここでも、したがって、ここに提供したような形質転換は、安定な様式であり得、ここでの導入遺伝子情報または核酸は、核、葉緑体またはミトコンドリアゲノムに組込まれ、構成的または誘導的に発現されるが、好ましくは一過性であり、ここでの核酸は、ゲノムに導入されず、導入後の特定の期間後に欠失する。組換えDNAまたはRNAの細胞またはプロトプラストへの形質転換は、当分野で公知のプロトコルを使用して、粒子衝撃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルス媒介形質転換、細菌コンジュゲーション、電気穿孔法、浸透圧ショック、小胞輸送または直接的な遺伝子導入などの、種々の方法で、核酸分子に結合したタンパク質性基質を添加してまたは添加せずに起こり得る。タンパク質性基質の細胞またはプロトプラストへの組込みは、上記のような形質転換プロトコルの系に沿って促進できる。植物発達の調節に関与する遺伝子から得られた遺伝子産物(すなわちDNA、RNAまたはタンパク質性基質またはその機能的断片)を提供された細胞またはプロトプラストはここでそれ自体の上で再生でき、その細胞またはプロトプラストを含む培養液に加えて外来植物ホルモンを減少または排除することができる。栄養増殖のプロセスは、これにより非常に簡単となり、同一の遺伝子バックグラウンドを有する大量の植物をここで、所望の特徴を有する出発物質から開始して得ることができる。
好ましい実施形態において、本発明は、植物出発物質から植物を増殖する方法を提供し、ここで、前記出発物質は、所望の特徴を有する細胞またはプロトプラストから得られる生じるトランスジェニック植物を提供する目的の、所望の核酸配列で形質転換した細胞またはプロトプラストを含む。たとえば植物発達の調節に関与する遺伝子から得られた、遺伝子産物(すなわちDNA、RNAまたはタンパク質性基質またはその機能的断片)を提供された本発明に記載のかかる細胞またはプロトプラストは、ここでそれ自体の上で再生でき、形質転換細胞またはプロトプラストを含む培養液への外的植物ホルモンの添加を減少または排除することが可能である。所望の配列を産生遺伝子産物で形質転換した後の再生細胞または組織の選択により、好ましくは安定な様式で植物ゲノムに組込まれた、所望の核酸配列を含む植物または植物物質のみが、および、再生遺伝子産物が回収され、これにより、形質転換出発物質の選択的再生に基づいた所望のトランスジェニック植物の選択が提供される。
好ましい実施形態において、本発明は、再生遺伝子産物は、単に一過性に発現され、再生遺伝子産物またはそのコード配列は、ゲノムに導入されず、導入後の特定の期間後に失われ、これにより、所望のトランスジェニック核酸のみを含み、使用した選択マーカーをコードする核酸は含まない、最終産物として実質的にマーカーを含まないトランスジェニック植物が提供され、遺伝子産物を再生する方法を提供する。
さらに、本発明は、系に沿ってまたは本明細書に開示した方法を使用して、増殖した本発明に記載の方法により得ることのできる植物または植物物質を提供する。特に、本発明は、植物出発物質から本発明に記載のインビトロでの栄養または種子のない増殖により、たとえば、単一節カット、補助分岐、付属的器官の再生(根またはシュート)、または出発物質、たとえば外植片またはカルス組織またはその懸濁液、またはさらには単一細胞またはプロトプラストを使用して得ることのできる、植物または植物物質を提供し、特にここでは、前記出発物質はトランスジェニック物質を含み、本発明に記載の前記トランスジェニック植物または植物物質は好ましくは選択マーカー遺伝子を含まない。
更にまた本発明は、図8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の何れかに記載の核酸分子、またはその相補核酸に相当する、または、これとハイブリダイズできる、受容体用キナーゼをコードする単離および/または組み換え核酸またはその機能的フラグメントまたは機能的等価物を提供する。このような核酸は前述したとおり単離される。好ましい実施態様においては、このような核酸は、たとえばArabidopsis thalianaに由来する、図8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の何れかに記載の核酸分子またはその機能的等価物または機能的フラグメントまたはその相補核酸に対して、少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、またはもっとも好ましくは少なくとも95%相同である。
更にまた本発明は本発明の核酸を含有するベクターを提供する。このようなベクターは好ましくは本発明の核酸(DNAまたはRNA)または核酸に由来する蛋白を細胞に提供することにより該細胞を安定してまたは一過性にトランスフォームすることができる。核酸または蛋白を細胞に与えるための方法は種々のものが知られており、たとえばエレクトロポレーション、リポソーム媒介転移、マイクロインジェクション、粒子銃衝突または細菌媒介転移が挙げられる。RNAはたとえばSP6、T7またはT3のような部位を組み込んだ適切なベクター構築物からin vitroで生成することができる。蛋白はたとえばコウボまたは細菌または昆虫細胞または他の適切な当該分野で知られた細胞においてin vitroで生成する。DNAは、恐らくは増殖のための適当なベクター内に入れた状態で線状または環状DNAとして供給することができる。
1.更にまた、本発明は本発明の核酸またはベクターを含有する宿主細胞を提供する。好ましい実施態様においては、このような宿主細胞は、好ましくはそのゲノムに安定な状態で組み込まれた、所望の、ただし大部分の場合は全く無関係の、核酸配列を更に含有するトランスフォームされた細胞である。更に好ましいものは、本発明の核酸またはベクターが一過性にのみ発現される本発明の宿主細胞である。当然ながら、本発明により提供される培養方法において使用するためには、本発明の核酸、ベクターまたは宿主細胞を使用するのが好ましい。本発明はまた植物の発達段階を測定する方法を提供し、該方法は、該植物またはその一部において本発明の核酸または蛋白性物質を検出することを包含する。すなわち該検出はRKSファミリーに属する受容体キナーゼ遺伝子または遺伝子産物またはそのフラグメントを植物発達のマーカーとして使用することを意図している。
本発明はさらにまた、図8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の何れかに示すアミノ酸配列またはその機能的等価物または機能的フラグメントを含有する単離されたまたは組み換えの蛋白性物質を提供する。本明細書においては蛋白性物質は、場合によりたとえばグリコシル化、ミリスチル化、ホスホリル化、脂質付加、同種または異種の2量体化または多量体化または当該分野で知られている何らかの他の(翻訳後の)修飾により修飾された、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白を含有する物質として定義される。
配列の組成に基づいて、RKS遺伝子ファミリーの予測されるアミノ酸配列のN末端ドメインはシグナルペプチドを表し、このことは、蛋白のこの領域が細胞外であることを示している。このシグナル配列の長さおよび予測される切断部位は予測プログラム:http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/を用いて明らかにされている。このドメインに引き続き、7アミノ酸残基で相互に分断されている、ロイシン残基に富む短いドメインが存在する。両親媒性のヘリックス内のこれらのロイシンの保存に基づけば、このドメインは短いコイルドコイルの構造の形成を通じて蛋白の2量体化を媒介するロイシンジッパードメインを表す(Landschultz WH, Johnson PF and McKnight sSL (1988) Science 240, 1759−1764)。RKS蛋白においはこのロイシンジッパードメインは受容体のヘテロ/ホモ2量体化に関与していると考えられる。次のドメインはジスルフェート結合を形成する2個の保存されたシステイン残基を含んでいる。その後のドメインは各々約24個のアミノ酸の3〜5個のロイシンリッチ反復配列(LRR)を有するLRR領域を表す。動物においては、このドメインは蛋白−蛋白相互作用に関与していることがわかっている(Kobe B and Deisenhofer J (1994) TIBS 19, 415−420)。植物においては、細胞外LRR領域はリガンドとエリシターの結合に必要であると推測されている。大部分のRKS蛋白のLRR領域のC末端部分では、システイン残基の他の保存された対が別のジスルフィド結合の形成に関与している。すなわち両末端において、LRRドメインは2個のジスルフィド結合により包囲されている。次のドメインは比較的多数のPおよびSアミノ酸残基を含んでおり、エクステンシンのような細胞壁蛋白と類似性を有する。http://genome.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/のような予測サーバープログラムによればこのドメイン内に複数のO−グリコシル化部位が存在することが示されている。このドメインはエクステンシンと同様の機能を有し、複数の細胞壁成分との相互作用部位を与え、これによりRKS蛋白の完全な細胞外領域が包埋されている細胞壁との安定な固定化相互作用を確立する。次のドメインはプログラムhttp://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM−1.0/により予測される単一の膜貫通へリカルドメインを表す。このドメインの末端および細胞内原形質ドメインの開始部には小数の塩基性KおよびR残基が含まれている。次のドメインは比較的酸性である。次の大型のドメインは植物セリン、スレオニン受容体キナーゼのファミリーと広範な相同性を示している。SERKに対する自己ホスホリル化実験(Schmidt等、1997)によれば、このドメインはセリン、スレオニンキナーゼ活性を示すことがわかっている。キナーゼドメイン内では、RKS0およびRKS8のような幾つかのRKS蛋白がコア配列RxpSxP(式中xは何れかのアミノ酸を示す)により表される推定14−3−3結合部位を含んでいる(Yaffe MB, Rittinger K, Volinia S, Caron PR, Aitken A, Leffers H, Gamblin SJ, Smerdon SJ and Cantley
LC (1997) Cell 91, 961−971)。すなわちリガンド媒介受容体キナーゼ活性化の結果としてのこの配列内でのS残基の(自己)ホスホリル化により14−3−3蛋白の結合とその後の活性化が可能となる。次のドメインについては、WD対残基の保存が他の蛋白とのドッキング部位の機能を示唆しているものの、未知の機能を有している。C末端細胞内ドメインにはやはり単一のLRR配列の部分が含まれており、このため、蛋白−蛋白相互作用に関与していると考えられる。好ましくは、本発明のこのような蛋白性物質は本発明の核酸によりコードされるか、または、本発明の宿主細胞が産生するものである。
LC (1997) Cell 91, 961−971)。すなわちリガンド媒介受容体キナーゼ活性化の結果としてのこの配列内でのS残基の(自己)ホスホリル化により14−3−3蛋白の結合とその後の活性化が可能となる。次のドメインについては、WD対残基の保存が他の蛋白とのドッキング部位の機能を示唆しているものの、未知の機能を有している。C末端細胞内ドメインにはやはり単一のLRR配列の部分が含まれており、このため、蛋白−蛋白相互作用に関与していると考えられる。好ましくは、本発明のこのような蛋白性物質は本発明の核酸によりコードされるか、または、本発明の宿主細胞が産生するものである。
特に、本発明は本発明の培養方法において使用するための蛋白性物質を提供する。細胞またはプロトプラストへの蛋白性物質の導入は当該分野で知られているトランスフォームプロトコルにそって容易に行なうことができる。種々の方法が知られており、たとえばマイクロインジェクション、粒子銃衝突または細菌媒介転移などが挙げられる。すなわち植物の発達の調節に関与する遺伝子に由来する蛋白性物質またはその機能的フラグメントを付与された細胞またはプロトプラストはここでそれ自体を再生することが可能となり、これにより、その細胞またはプロトプラストを含有する培養物への外因性植物ホルモンの添加を低減ないしは省略することが可能となる。増殖の過程はこれにより極端に単純化でき、同一の遺伝的背景を有する多数の植物を所望の特性を有する出発材料から得ることが可能となる。RKS遺伝子によりコードされる蛋白またはペプチドは、E.coli、コウボ、バキュロウィルスまたは動物の細胞培養物中のin vitroまたはin vivoの発現系において相当するcDNA配列またはその部分を発現することにより産生される。発現した蛋白配列は(HIS)6タグのような蛋白に結合した組み換えTag配列を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製する。タグは蛋白分解により精製後に除去する。得られた蛋白配列は機能的に活性な受容体キナーゼまたはその誘導体をコードしている。好ましい実施態様においては、蛋白は(構造的)活性キナーゼドメインを含んでいる。精製された組み換え蛋白を植物細胞に導入することによりこれらの細胞からの再生を一過性に誘導することができる。蛋白はヌクレオチド配列の導入に関して記載した方法と同様にして、たとえばリポソーム媒介転移、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子銃衝突または細菌媒介転移等により導入する。所望によりグリコシル化、ジスルフェート結合形成、ホスホリル化などの組み換え蛋白の修飾を旨適化することにより、蛋白の安定性と活性において最適な効率を得ることができる。更にまた、本発明は本発明の蛋白性物質を特異的に認識する単離されたまたは合成された抗体を提供する。このような抗体はたとえば、本発明の蛋白性物質またはその免疫原性フラグメントまたはその等価物で実験動物を免疫化し、該免疫化動物からポリクローナル抗体を回収することにより得るか、または、当該分野で知られた他の方法、たとえばモノクローナル抗体または(1本鎖)抗体、またはたとえばファージディスプレイ法を介して得られる核酸ライブラリに由来する組み換え核酸から発現された結合蛋白を生成することにより得ることができる。このような抗体は、たとえば前述のとおり同定された再生遺伝子産物を含有する細胞を同定するために、本発明の培養方法において好都合に使用することができる。このようなんぼを使用することにより、本発明はまた、たとえば免疫沈降、ウエスタンブロットまたは当該分野で知られた他の免疫学的方法により得ることができる、本発明の上記抗体により特異的に認識され得る蛋白性物質を提供する。更にまた、植物種内のRKS遺伝子ファミリーの異なるメンバー内で保存された、または固有の特定の領域を認識する上記抗体を発生させることにより、所望のRKS相同体の単離が可能となり、また、種々の植物種中で特定のRKS遺伝子産物が認識される。これらの抗体はまたRKS相同体を得るスクリーニングのために植物種のcDNA発現ライブラリをスクリーニングする際に使用される。本発明、および、本発明の方法における本発明の核酸、ベクター、宿主細胞、蛋白性物質または抗体の前述の使用について、以下に更に詳述するが、これにより本発明は制限されない。
詳細な説明
植物における再生の発生調節に関連する遺伝子を単離するために、その発現が発生する花序において存在した遺伝子のファミリーの異なるメンバーを同定した。この組織内で、多数の異なる器官原基が花序分裂組織から開始された。モデル植物種として、Arabidopsis thalianaが、多くの十分に特徴付けられた遺伝子変異の存在およびデータベースにおける遺伝子情報の利用可能性に基づいて選択された。
植物における再生の発生調節に関連する遺伝子を単離するために、その発現が発生する花序において存在した遺伝子のファミリーの異なるメンバーを同定した。この組織内で、多数の異なる器官原基が花序分裂組織から開始された。モデル植物種として、Arabidopsis thalianaが、多くの十分に特徴付けられた遺伝子変異の存在およびデータベースにおける遺伝子情報の利用可能性に基づいて選択された。
分化の段階はin vivoで非常に安定であり、核移植または細胞融合の応答においてもなお、分化した細胞の核は、動物においておよび植物細胞においての両方で、変化する顕著な能力を示す(Blau、1989)。分化の段階を変化する能力は、細胞および組織に、それらの環境に適応する能力を提供する。通常、少数の幹細胞のみが、異なる細胞型に分化する能力を有する。植物において、真に全能性である細胞のみが、融合された卵細胞および精子からなる接合体である。これらの二倍体全能性細胞に、全ての他の分化された細胞型が由来する。
再生は、多数の動物および植物種において観察される栄養性の再生および修復のストラテジーである。植物における再生は、根およびシュート分裂組織の両方、別々のシュートまたは根分裂組織、個々の細胞または細胞の群からの植物器官または器官原基を含む新規な組織の形成として規定される。再生は、植物の発生の間に行われる通常の細胞および器官の分化のプロセスを模倣し、そして異なる植物機関の形成を生じる。しかし、通常の条件下である植物器官、分裂組織、または器官原基の形成を開始し得ない植物細胞または細胞の群は、細胞外刺激または細胞の分化の段階の細胞内改変のいずれかによって刺激され得る。再生は、in vivoまたはin vitroのいずれかの条件下で行われ得る。再生は、栄養性植物再生の特異的な形態が種子中で行われるアポミクシスのプロセスを誘導しない。細胞外の分散可能な因子は、植物細胞における細胞再分化に必要不可欠であることを示した(SiegelおよびVerbeke、1989)。細胞表面でのこれらのシグナルの認知、および転写調節における変化を最終的に生じる細胞内シグナル伝達は、細胞に、このような細胞外刺激に応答する能力を提供する。
細胞分化を調節する能力を有する遺伝子産物についてのサーチにおいて、本発明者らは細胞内分化シグナル伝達の認知および伝達に関与する遺伝子に集中化した。動物細胞における細胞外シグナルは通常、高い親和性の結合化合物の、センサー分子によって認知される。
細胞外シグナル伝達分子はさらに、リガンドとして言及され、およびそれらの細胞結合対は、受容体として規定される。結合の際に、細胞外シグナルは受容体の改変を生じ得、細胞膜を超えるシグナルの伝達を生じる。細胞表面受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達成分へのシグナル伝達に関与する細胞内ドメインを含む(Walker、1994)。SERKは、植物および動物において種々の機能を有する膜貫通受容体キナーゼの大きな群のメンバーを示す。これらの遺伝子産物の多くは、Clavata
1(Clarkら、1997)またはErecta(Toriiら、1996)のように細胞分化プロセスに関与することが知られる。植物におけるこれらの遺伝子の過剰発現は、植物器官または植物細胞において形態学的な変化を生じる。
1(Clarkら、1997)またはErecta(Toriiら、1996)のように細胞分化プロセスに関与することが知られる。植物におけるこれらの遺伝子の過剰発現は、植物器官または植物細胞において形態学的な変化を生じる。
体細胞胚発生受容体様キナーゼ(Somatic Embryogenesis Receptor−like Kinase)SERKは元来、in vivoおよびin vitroの両方での胚発生細胞についてのマーカーとして同定された(Schmidtら、1997a)。SERK遺伝子の発現は、体細胞胚を形成する能力、植物が、接合体胚と同じ形態学的な、細胞学的な、および分子的な胚発生の段階の順序を介して体細胞細胞から形成されるプロセスと相関する。
受容体キナーゼのような膜貫通タンパク質は、器官または細胞分化に関与される候補の重要な調節遺伝子産物のセットを提供する。分化を調節する能力を有する遺伝子産物についてのサーチにおいて、本発明者らは、非常に多様な細胞分化プロセスをともなう植物組織、花序分裂組織中で発現される受容体キナーゼ遺伝子についてサーチした。細胞の分化の段階の調節に関与する遺伝子産物についてのスクリーニングにおいて、本発明者らは、受容体様キナーゼの完全なファミリーを同定した。
Arabidopsis thalianaにおけるレセプター様キナーゼの新規なファミリー、RKS遺伝子ファミリーの同定
Arabidopsisのゲノムデータベース(アクセス http://genome-www2.
stanford.edu/cgi-bin/AtDB/nph-blast2atdb)において、Arabidopsis SERK配列(Schmidtら、1997b)に対する相同性を有する少数の配列が同定された。これらの配列は、ヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸レベルに対して相同性を示し、そして受容体キナーゼ様SERK(RKS)遺伝子としてさらに規定された。最初に同定された配列はさらに、RKS1〜5として同定された。これらの5つのRKS配列に基づいて、縮重されたDNAプライマーのセットが設計され、これはArabidopsisからの可能なRKS遺伝子フラグメントの増幅を許容した。
Arabidopsisのゲノムデータベース(アクセス http://genome-www2.
stanford.edu/cgi-bin/AtDB/nph-blast2atdb)において、Arabidopsis SERK配列(Schmidtら、1997b)に対する相同性を有する少数の配列が同定された。これらの配列は、ヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸レベルに対して相同性を示し、そして受容体キナーゼ様SERK(RKS)遺伝子としてさらに規定された。最初に同定された配列はさらに、RKS1〜5として同定された。これらの5つのRKS配列に基づいて、縮重されたDNAプライマーのセットが設計され、これはArabidopsisからの可能なRKS遺伝子フラグメントの増幅を許容した。
プライマーRKS B正方向:
5'−CC[C/G] AAG AT[C/T] AT[A/T] CAC CG[A/C/T] GAT GT[A/C/G] AA[A/G] GC−3'
プライマーRKS E逆方向:
5'−CC[A/G] [A/T]A[A/C/G/T] CC[A/G] AA[A/G] ACA TCG GTT TTC TC−3'
5'−CC[C/G] AAG AT[C/T] AT[A/T] CAC CG[A/C/T] GAT GT[A/C/G] AA[A/G] GC−3'
プライマーRKS E逆方向:
5'−CC[A/G] [A/T]A[A/C/G/T] CC[A/G] AA[A/G] ACA TCG GTT TTC TC−3'
これらの配列は、キナーゼドメインの1つのエクソンをコードするヌクレオチド内の保存された部分に基づく。PCR増幅反応(60秒、94℃;60秒、50℃;90秒、72℃)×40サイクルを、100ngのゲノムDNAを鋳型として用いて行った。得られるPCR産物は、209bp DNAフラグメントから構成された。pGEM-T(Promega)ベクター中でのクローン化後、合計21個の異なるクローンを増幅したヌクレオチド配列を同定するために分析した。縮重されたプライマー配列の除去は、154ヌクレオチドの配列を生じた。RKS1〜4およびSERK遺伝子の配列を除いて、合計4つの新規な未同定のRKS相同配列が同定され、RKS6〜10としてさらに規定された。RKS遺伝子からの配列は、このスクリーニングにおいて同定されなかった。RKS5遺伝子からの配列はこのスクリーニングにおいて同定されなかった。
異なるRKS遺伝子についての単離されおよび配列決定されたクローンの数、続いて単回(複数回)のゲノムPCRにおいて同定されたクローンの数
RKS1 1
RKS2 4
RKS3 2
RKS4 5
RKS5 0
RKS6 2
RKS7 1
RKS8 2
RKS103
SERK/RKSO 1
RKS1 1
RKS2 4
RKS3 2
RKS4 5
RKS5 0
RKS6 2
RKS7 1
RKS8 2
RKS103
SERK/RKSO 1
これらの結果は、Arabidopsisゲノムにおいて予測されるRKS遺伝子(SERK以外)の保存されたキナーゼドメインに対する相同性を伴う少なくとも9つの異なる配列の存在を示した(図1)。これらのデータを確認するために、単離されたRKS遺伝子の1つのフラグメントを、サザンブロットにおいてプローブとして使用した(図2)。低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、プローブフラグメントに関連する多くの配列の存在を確認した。使用されたストリンジェンシー(材料および方法を参照のこと)の下、合計約5個のハイブリダイズするバンドが観察され得、Arabidopsisにおける小さなRKS遺伝子ファミリーの存在を示す。
Arabidopsis花序組織におけるRKS遺伝子発現
RKS遺伝子が、原基および器官の形成が開始される組織において発現されるか否かを試験するために、RT−PCR反応を、花序に対して行った。RKSフラグメント増幅について、PCRプライマーの、ゲノムPCR反応について記載されるのと同じ組合せを使用した。記載されるヌクレオチドフラグメントにおけるイントロン配列の不在に起因して、得られる産物は再び209bpであった。第1鎖cDNAから開始して、標準的なPCR反応を(60秒間、94℃;60秒間、50℃;90秒間、72℃)×40サイクルについて行った。十分に大量の増幅産物を得るために、最初のRT-PCR増幅反応混合液からの10%の混合液を鋳型として使用して、再増幅を類似の条件下で行った。pGEM−Tベクター中でのクローニング後、合計21個の異なるクローンを、増幅された配列を同定するために配列決定した。縮重されたプライマーの除去は、154ヌクレオチドの配列を生じた(図1)。
RKS遺伝子が、原基および器官の形成が開始される組織において発現されるか否かを試験するために、RT−PCR反応を、花序に対して行った。RKSフラグメント増幅について、PCRプライマーの、ゲノムPCR反応について記載されるのと同じ組合せを使用した。記載されるヌクレオチドフラグメントにおけるイントロン配列の不在に起因して、得られる産物は再び209bpであった。第1鎖cDNAから開始して、標準的なPCR反応を(60秒間、94℃;60秒間、50℃;90秒間、72℃)×40サイクルについて行った。十分に大量の増幅産物を得るために、最初のRT-PCR増幅反応混合液からの10%の混合液を鋳型として使用して、再増幅を類似の条件下で行った。pGEM−Tベクター中でのクローニング後、合計21個の異なるクローンを、増幅された配列を同定するために配列決定した。縮重されたプライマーの除去は、154ヌクレオチドの配列を生じた(図1)。
異なるRKS遺伝子について単離および配列決定されたRT−PCRクローンの数、続いて花序組織から同定された単回(複数回)のRT−PCR産物の数
RKS1 0
RKS2 0
RKS3 2
RKS4 5
RKS5 0
RKS6 0
RKS7 1
RKS8 2
RKS104
RKS112
RKS123
RKS131
RKS141
SERK/RKSO 0
RKS14
RKS1 0
RKS2 0
RKS3 2
RKS4 5
RKS5 0
RKS6 0
RKS7 1
RKS8 2
RKS104
RKS112
RKS123
RKS131
RKS141
SERK/RKSO 0
RKS14
これらの結果は、Arabidopsisゲノムにおける予測されるRKS遺伝子(SERK以外)の保存されたキナーゼドメインに対して相同性を伴う、少なくとも14個の異なる配列の存在を示す(図1)。花序内で、少なくとも9つのRKS様遺伝子が発現された。この実験内で、花序におけるRKS0、1、2、5、および6の発現は確認され得なかった。異なるRKS配列間の相同性は、Geneworks2.2からのALLIGMENTソフトウェアを使用して行われた(図3)。少なくとも3つの異なる亜群が、RKS遺伝子ファミリーを視覚化し、亜群1においてRKS2およびRKS6、亜群2においてRKS4、11、1、5、14、および7、ならびに亜群3においてRKS0、8、10、12、および13を示す。これらの結果は、ハイブリダイゼーションパターンを確認し、RKS亜群3のメンバーとハイブリダイズされるゲノミックサザンを用いて観察した(図2)。合計5つのハイブリダイズするバンドが観察され得、これらは、RKS0、8、10、12、および13からの遺伝子を示すようであった。
単離されたPCRフラグメントが完全なRKS遺伝子の部分を示したか否かを研究するために、これらのPCRフラグメントに相同な完全長のおよび部分的なcDNAクローンを単離し、そして特徴付けた。
ArabidopsisにおけるRKS遺伝子産物の単離および特徴づけ
Arabidopsis thaliana Colombia野生型からのcDNAライブラリーを、PCR増幅されたRKS遺伝子フラグメントとハイブリダイズするcDNAクローンを単離するために使用した。cDNAライブラリーは、異なる植物器官(長角果、花、幹、ロゼッタ、葉、および根を含む)からのcDNAインサートに連結されたSalI、NotIを含有するBRLλZipLoxベクターからなった。
Arabidopsis thaliana Colombia野生型からのcDNAライブラリーを、PCR増幅されたRKS遺伝子フラグメントとハイブリダイズするcDNAクローンを単離するために使用した。cDNAライブラリーは、異なる植物器官(長角果、花、幹、ロゼッタ、葉、および根を含む)からのcDNAインサートに連結されたSalI、NotIを含有するBRLλZipLoxベクターからなった。
フィルターハイブリダイゼーション、異なるRKSフラグメントプローブとストリンジェントな条件(65℃、0.1SSC)下でハイブリダイズするプラークの精製、および最後にヌクレオチド配列分析は、多くのRKS cDNAクローンの特徴づけを生じた。これらのクローンの予測されるアミノ酸配列は、遺伝子産物が、RKS植物受容体キナーゼファミリーRKSのメンバーを示すことを確認した。cDNAライブラリーによって同定されたクローンからの配列は、データベースhttp://arabidopsis.org/blast/からの配列情報と比較されそして組合された。14個の異なる完全長のcDNAクローン以外に、多くの4つの異なる部分的なクローンが同定された。
トランスジェニックArabidopsisにおけるRKS遺伝子産物の過剰発現
植物細胞へのプラスミドDNAの形質転換を、A.tumefaciens C58C1を使用して行った。使用されたバイナリベクターは、pGREEN、pGREENIK、またはRKS発現構築物からなった。細菌コロニーを、20mg/Lゲンタマイシン、50mg/Lカナマイシンおよび50mg/Lラパマイシンを含有するLB寒天プレート上で増殖した。5つのコロニーを、50mg/Lカナマイシンおよび50mg/Lラパマイシンを含有する50mlのLB培地を接種するために使用した。30℃にて16時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離によって濃縮し、そして10mlの浸潤培地(水中の5%スクロースおよび0.05% Silwett L−77からなる)中に再懸濁した。形質転換に必要な、ヘルパープラスミドは、ベクターpJIC Sa−Repからなり、およびpGREENベクターとともに同時形質転換された。エレクトロポレーションおよび2時間30℃でのインキュベーション後、細胞を50mg/Lラパマイシンおよび50mg/Lカナマイシンを含有するLBプレート上にプレートした。Arabidopsis thaliana野生型WS品種を花浸漬プロトコル(CloughおよびBent、1998)に従って形質転換した。簡潔には、長日条件(16時間明所、および8時間暗所)下で生長されたArabidopsisWS幼植物の花序を、10mlの浸潤溶液中で10秒間浸漬した。植物をさらに、長日条件のもとで生長させ、そしてさらに3〜5週間後、種子を採集した。種子を、4%漂白溶液中で15分間滅菌し、そして滅菌水中での徹底的な洗浄後、60mg/Lカナマイシンを含有する1/2MSプレート上にプレートした。長日条件下での10日間のインキュベーション後、トランスジェニックカナマイシン耐性芽生えを単離し、そして標準的な長日温室条件下でのさらなる非滅菌生長のために土壌に植えた。この浸潤プロトコルは日常的に、使用されたそれぞれのRKS遺伝子構築物について約1%の形質転換された種子を生じた。
植物細胞へのプラスミドDNAの形質転換を、A.tumefaciens C58C1を使用して行った。使用されたバイナリベクターは、pGREEN、pGREENIK、またはRKS発現構築物からなった。細菌コロニーを、20mg/Lゲンタマイシン、50mg/Lカナマイシンおよび50mg/Lラパマイシンを含有するLB寒天プレート上で増殖した。5つのコロニーを、50mg/Lカナマイシンおよび50mg/Lラパマイシンを含有する50mlのLB培地を接種するために使用した。30℃にて16時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離によって濃縮し、そして10mlの浸潤培地(水中の5%スクロースおよび0.05% Silwett L−77からなる)中に再懸濁した。形質転換に必要な、ヘルパープラスミドは、ベクターpJIC Sa−Repからなり、およびpGREENベクターとともに同時形質転換された。エレクトロポレーションおよび2時間30℃でのインキュベーション後、細胞を50mg/Lラパマイシンおよび50mg/Lカナマイシンを含有するLBプレート上にプレートした。Arabidopsis thaliana野生型WS品種を花浸漬プロトコル(CloughおよびBent、1998)に従って形質転換した。簡潔には、長日条件(16時間明所、および8時間暗所)下で生長されたArabidopsisWS幼植物の花序を、10mlの浸潤溶液中で10秒間浸漬した。植物をさらに、長日条件のもとで生長させ、そしてさらに3〜5週間後、種子を採集した。種子を、4%漂白溶液中で15分間滅菌し、そして滅菌水中での徹底的な洗浄後、60mg/Lカナマイシンを含有する1/2MSプレート上にプレートした。長日条件下での10日間のインキュベーション後、トランスジェニックカナマイシン耐性芽生えを単離し、そして標準的な長日温室条件下でのさらなる非滅菌生長のために土壌に植えた。この浸潤プロトコルは日常的に、使用されたそれぞれのRKS遺伝子構築物について約1%の形質転換された種子を生じた。
RKS形質転換後のArabidopsis植物の再生
空のpGREENベクター、または35Sプロモーターの制御下でRKS遺伝子を含むpGREEN1Kベクターを含有する、A.tumefaciensで浸潤された植物から得られた、Arabidopsis T2種子を、表面滅菌し、そして1mg/L 2、4−Dが添加された40mlの1/2MS培地培養液に添加した。4℃での層別化の3日後、培養物を細胞増殖を誘導するために、0〜18日間、20℃の気候室中で長日条件下、振盪器上でインキュベートした。異なる時間の間隔で、芽生えを培養物から単離し、洗浄し、そして2、4−Dも任意の他のホルモンも含有しない1/2寒天プレート上に移した。気候室でのインキュベーションを、長日条件下、さらに4週間続けた。形質転換されたバイナリーベクター中のRKS遺伝子の不在下、植物の再生は何ら観察され得なかった(図5C)。しかし、RKS遺伝子発現の存在下、増殖する細胞塊に起源する再生化植物が観察され得た(図5A、B)。異なるRKS遺伝子構築物は、シュート分裂組織および葉を再生する能力を示した。再生を誘導する能力は、個々の取り込み事象間、およびRKS遺伝子構築物間で変化した(図5A対5B)。4週間の再生のこの時点で、植物は、非滅菌土壌に直接移され、そして長日条件下でさらに4〜6週間生長された。肥沃な種子を備える植物が、図5AおよびBにおいて示されるように、再生された植物から得られた。
空のpGREENベクター、または35Sプロモーターの制御下でRKS遺伝子を含むpGREEN1Kベクターを含有する、A.tumefaciensで浸潤された植物から得られた、Arabidopsis T2種子を、表面滅菌し、そして1mg/L 2、4−Dが添加された40mlの1/2MS培地培養液に添加した。4℃での層別化の3日後、培養物を細胞増殖を誘導するために、0〜18日間、20℃の気候室中で長日条件下、振盪器上でインキュベートした。異なる時間の間隔で、芽生えを培養物から単離し、洗浄し、そして2、4−Dも任意の他のホルモンも含有しない1/2寒天プレート上に移した。気候室でのインキュベーションを、長日条件下、さらに4週間続けた。形質転換されたバイナリーベクター中のRKS遺伝子の不在下、植物の再生は何ら観察され得なかった(図5C)。しかし、RKS遺伝子発現の存在下、増殖する細胞塊に起源する再生化植物が観察され得た(図5A、B)。異なるRKS遺伝子構築物は、シュート分裂組織および葉を再生する能力を示した。再生を誘導する能力は、個々の取り込み事象間、およびRKS遺伝子構築物間で変化した(図5A対5B)。4週間の再生のこの時点で、植物は、非滅菌土壌に直接移され、そして長日条件下でさらに4〜6週間生長された。肥沃な種子を備える植物が、図5AおよびBにおいて示されるように、再生された植物から得られた。
Arabidopsis組織への微粒子銃DNA送達のための20μgのベクターDNAを、バリスティック懸濁混合液:10mgの金(Aldrich、Chem、Co. Gold 1.5〜3ミクロン)、30μl 5M NaCl、5μl 2M Tris pH8,965μl水、100μl 0.1Mスペルミジン、100μl 25% PEG、100μl 2.5M CaCl2とともに混合した。懸濁液を室温で10分間インキュベートし、そして遠心分離した。得られるペレットをエタノールで2回洗浄し、そして200μlの氷冷された99.8%エタノール中に再懸濁した。各マイクロプロジェクタイルボンバードメントについて、10μlの金でコートされたDNAを使用した。HELIUM GUN 461についてのボンバードメント条件は以下のようであった:ヘリウム圧6bar、50mbarへの減圧、およびフィルターから組織の9cmの距離。0.1mmメッシュサイズのスクリーンを、組織とフィルターとの間で、フィルターからスクリーンの3cmの距離で使用した。ボンバードメント後、Arabidopsis植物を、長日条件下で3週間の期間培養した。
再生を刺激する遺伝子産物の発現によって誘導されるNicotiana tabacumにおける再生
20μgのプラスミドDNAを、DNAでコートされた金粒子とともに微粒子銃ボンバードメントを使用して、タバコ(NTSR1)葉の細胞に移した。葉切片を続いて、1mg/lカイネチンを含有する液体MS30培地(MS培地30g/スクロース/l、MurashigeおよびSkoog、1962)培地中に浸し、そして回転振盪器(250rpm)上で14日間インキュベートした。次いで、葉をMS30プレート、0.8%寒天でプレートするために移した。全てのインキュベーションは、20℃にて16時間明所、8時間暗所で行われた。空のまたはコントロールベクターを用いるコントロール実験は、シュート形成を決して生じなかった。再生する小植物は、図6A〜Cにおいて示されるような再生化DNA構築物でのパーティクルボンバードメントの結果として出現した。導入された構築物の一過性の性質は、ボンバードメントされた組織から得られた10個の異なる再生体のうちの9個について確認され得た(図6D)。
20μgのプラスミドDNAを、DNAでコートされた金粒子とともに微粒子銃ボンバードメントを使用して、タバコ(NTSR1)葉の細胞に移した。葉切片を続いて、1mg/lカイネチンを含有する液体MS30培地(MS培地30g/スクロース/l、MurashigeおよびSkoog、1962)培地中に浸し、そして回転振盪器(250rpm)上で14日間インキュベートした。次いで、葉をMS30プレート、0.8%寒天でプレートするために移した。全てのインキュベーションは、20℃にて16時間明所、8時間暗所で行われた。空のまたはコントロールベクターを用いるコントロール実験は、シュート形成を決して生じなかった。再生する小植物は、図6A〜Cにおいて示されるような再生化DNA構築物でのパーティクルボンバードメントの結果として出現した。導入された構築物の一過性の性質は、ボンバードメントされた組織から得られた10個の異なる再生体のうちの9個について確認され得た(図6D)。
再生を誘導する遺伝子産物の発現によるArabidopsis thalianaにおける細胞増殖の誘導
パーティクルボンバードメント後の再生のより早い段階を同定するために、細胞増殖の形成が、再生化遺伝子産物の活性の結果として研究された。単一の再生化構築物またはこのようなDNA構築物の組合わせを、MS寒天プレート上で生長されたArabidopsis thalianaの2週齢の芽生え上にボンバードメントした。1〜3週間後、ボンバードメントされたロゼッタ葉の表面から生じる多細胞構造の形成が観察され得た(図6E〜H)。空のコントロールベクターでのボンバードメントは、これらの構造の形成を決して生じなかった。興味深いことに、GT−W−20S構築物でのボンバードメントに起源する増殖する細胞塊は、体細胞胚発生のプロセスによる再生の明らかな同定として体細胞胚を発達した。体細胞胚発生は従って、起源する組織の組織培養状態に依存しないが、親植物になお付着される成葉において直接的に開始され得る。ボンバードメントの前に同じ金粒子上にコートされた異なる再生化構築物の組合せはまた、細胞性増殖のプロセスが開始されることを許容した(図6G)。増殖された組織の複数の遺伝子座が、異なる再生構築物後に個々の葉において観察され得(図6H)、再生の頻度が、個々の再生化物でのボンバードメントに比較して再生化構築物の組合せを使用する場合に比較的高かったことを示す。
パーティクルボンバードメント後の再生のより早い段階を同定するために、細胞増殖の形成が、再生化遺伝子産物の活性の結果として研究された。単一の再生化構築物またはこのようなDNA構築物の組合わせを、MS寒天プレート上で生長されたArabidopsis thalianaの2週齢の芽生え上にボンバードメントした。1〜3週間後、ボンバードメントされたロゼッタ葉の表面から生じる多細胞構造の形成が観察され得た(図6E〜H)。空のコントロールベクターでのボンバードメントは、これらの構造の形成を決して生じなかった。興味深いことに、GT−W−20S構築物でのボンバードメントに起源する増殖する細胞塊は、体細胞胚発生のプロセスによる再生の明らかな同定として体細胞胚を発達した。体細胞胚発生は従って、起源する組織の組織培養状態に依存しないが、親植物になお付着される成葉において直接的に開始され得る。ボンバードメントの前に同じ金粒子上にコートされた異なる再生化構築物の組合せはまた、細胞性増殖のプロセスが開始されることを許容した(図6G)。増殖された組織の複数の遺伝子座が、異なる再生構築物後に個々の葉において観察され得(図6H)、再生の頻度が、個々の再生化物でのボンバードメントに比較して再生化構築物の組合せを使用する場合に比較的高かったことを示す。
材料および方法
サザンブロッティング
Arabidopsis thaliana野生型からの10μgのゲノムDNAを異なる制限酵素で消化した。フラグメントDNAを、0.9%アガロースゲル上でサイズ分離した。DNA精製を、0.4M NaOHを含有する0.6M NaCl中で行った。キャピラリーブロッティングを、Hybond N+メンブレン上で行った。メンブレンをC&Gハイブリダイゼーションミックス(ChurchおよびGilbert、1985)中、65℃にて一晩ハイブリダイズし、そして続いて65℃にて、5SSC、0.1% SDSで洗浄した。放射活性の検出のために、Phosphorimager 425(Molecular Dynamics)を、ホスホスクリーン露光カセットおよびImageQuaNTソフトウェアと組合せて使用した。
サザンブロッティング
Arabidopsis thaliana野生型からの10μgのゲノムDNAを異なる制限酵素で消化した。フラグメントDNAを、0.9%アガロースゲル上でサイズ分離した。DNA精製を、0.4M NaOHを含有する0.6M NaCl中で行った。キャピラリーブロッティングを、Hybond N+メンブレン上で行った。メンブレンをC&Gハイブリダイゼーションミックス(ChurchおよびGilbert、1985)中、65℃にて一晩ハイブリダイズし、そして続いて65℃にて、5SSC、0.1% SDSで洗浄した。放射活性の検出のために、Phosphorimager 425(Molecular Dynamics)を、ホスホスクリーン露光カセットおよびImageQuaNTソフトウェアと組合せて使用した。
DNAフラグメント精製
DE81濾紙(Whatmann)を、アガロースゲルからのDNAフラグメントの単離のために使用した。濾紙切片を、所望されるDNAフラグメント(これは、エチジュームブロミド染色を用いて長波長UVの下に可視化される)の丁度後ろに、アガロースゲルに導入した。電気泳動を、10分間、10V/cmゲルにて行い、そしてDNAが結合されたDE81濾紙をゲルから取り出した。濾紙切片を低塩緩衝液(Low Salt Buffer)(LSB)中で徹底的に洗浄し、そして続いてDNAを少量の高塩緩衝液(High Salt Buffer)(HSB)中に濾紙から回収した。
LSB(低塩緩衝液): HSB(高塩緩衝液):
10mM Tris pH7.5 10mM Tris pH7.5
1mM EDTA 1mM EDTA
100mM LiCl2 1M LiCl2
20%エタノール
DE81濾紙(Whatmann)を、アガロースゲルからのDNAフラグメントの単離のために使用した。濾紙切片を、所望されるDNAフラグメント(これは、エチジュームブロミド染色を用いて長波長UVの下に可視化される)の丁度後ろに、アガロースゲルに導入した。電気泳動を、10分間、10V/cmゲルにて行い、そしてDNAが結合されたDE81濾紙をゲルから取り出した。濾紙切片を低塩緩衝液(Low Salt Buffer)(LSB)中で徹底的に洗浄し、そして続いてDNAを少量の高塩緩衝液(High Salt Buffer)(HSB)中に濾紙から回収した。
LSB(低塩緩衝液): HSB(高塩緩衝液):
10mM Tris pH7.5 10mM Tris pH7.5
1mM EDTA 1mM EDTA
100mM LiCl2 1M LiCl2
20%エタノール
放射活性プローブ
精製されたDNAフラグメントを、ランダムにプライムされる放射標識に従って32P−dCTPで放射標識した:
27μl水中の50ngのフラグメントDNAを5分間、100℃にて変性した。氷上で、21μlのGATミックスを添加した:0.67M Hepes、0.17M Tris、17mM MgCl2、33mg/mlアセチル化BSA、25mg/mlランダムヘキサマープライマー、33mM b−メルカプトエタノール、5mM dNTP(G+A+T)非含有dCTP、2μl dCTP、および2μl Klenow(1U/μl)を添加し、混合し、そしてインキュベーションを60分間、25℃にて行った。
精製されたDNAフラグメントを、ランダムにプライムされる放射標識に従って32P−dCTPで放射標識した:
27μl水中の50ngのフラグメントDNAを5分間、100℃にて変性した。氷上で、21μlのGATミックスを添加した:0.67M Hepes、0.17M Tris、17mM MgCl2、33mg/mlアセチル化BSA、25mg/mlランダムヘキサマープライマー、33mM b−メルカプトエタノール、5mM dNTP(G+A+T)非含有dCTP、2μl dCTP、および2μl Klenow(1U/μl)を添加し、混合し、そしてインキュベーションを60分間、25℃にて行った。
ゲノムPCR
ゲノムDNAを、Klimyukら(1993)のプロトコルを使用して野生型Arabidopsis thaliana植物から単離した。全てのPCR反応を、Perkin ElmerからのThermal Cyclerを使用して行った。PCR増幅反応を以下のミックスを使用して標準的な条件下で行った:5分間100℃にて変性された、5μl水中の100ngゲノム鋳型DNA。氷上で以下の成分を添加した:2μlプライマーB(10μM)および2mlプライマーE(10μM)、1μl dNTP(10mM)、5μl 10×Taq緩衝液(Boehringer Mannheim)、0.1ml Taqポリメラーゼ、5単位/μl(Boehringer Mannheim)、35μl水。パラフィンオイルを20μlの容量において表面に添加し、そして増幅を以下の条件下で行った:(60秒間、94℃、60秒間、50℃、90秒間、72℃)×40サイクル。PCR産物をHigh Pure−PCR産物精製キット(Boehringer Mannheim)を使用して日常的に精製した。精製されたDNAを、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、pGEM−T Easyベクター(Promega)中に5倍モル過剰にクローン化した。
ゲノムDNAを、Klimyukら(1993)のプロトコルを使用して野生型Arabidopsis thaliana植物から単離した。全てのPCR反応を、Perkin ElmerからのThermal Cyclerを使用して行った。PCR増幅反応を以下のミックスを使用して標準的な条件下で行った:5分間100℃にて変性された、5μl水中の100ngゲノム鋳型DNA。氷上で以下の成分を添加した:2μlプライマーB(10μM)および2mlプライマーE(10μM)、1μl dNTP(10mM)、5μl 10×Taq緩衝液(Boehringer Mannheim)、0.1ml Taqポリメラーゼ、5単位/μl(Boehringer Mannheim)、35μl水。パラフィンオイルを20μlの容量において表面に添加し、そして増幅を以下の条件下で行った:(60秒間、94℃、60秒間、50℃、90秒間、72℃)×40サイクル。PCR産物をHigh Pure−PCR産物精製キット(Boehringer Mannheim)を使用して日常的に精製した。精製されたDNAを、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、pGEM−T Easyベクター(Promega)中に5倍モル過剰にクローン化した。
RT−PCR
Arabidopsis thalianaからの花序を、SiebertおよびChenchik(1993)のプロトコルに従って全RNAを単離するための供給源材料として使用した。10μlの水中の2.5μgの全RNAを、100℃での1分間のインキュベーションによって線状化し、続いて氷上で以下の成分を添加した:
−2μl(10pmol)dTレースプライマー5'-GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TT-3'
−1μl dNTP(10mM)
−4μl 5×RT緩衝液(Boehringer Mannheim)
−0.8μl逆転写酵素M−MuLV Expand(Boehringer Mannheim)
−2μl 100mM DTT
Arabidopsis thalianaからの花序を、SiebertおよびChenchik(1993)のプロトコルに従って全RNAを単離するための供給源材料として使用した。10μlの水中の2.5μgの全RNAを、100℃での1分間のインキュベーションによって線状化し、続いて氷上で以下の成分を添加した:
−2μl(10pmol)dTレースプライマー5'-GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TT-3'
−1μl dNTP(10mM)
−4μl 5×RT緩衝液(Boehringer Mannheim)
−0.8μl逆転写酵素M−MuLV Expand(Boehringer Mannheim)
−2μl 100mM DTT
インキュベーションを60分間42℃で行い、等量のRNアーゼ非含有水で希釈し、そして−20℃にて保存した。RKS変性化プライマーBおよびE、2μlのプライマーB(10μM)および2μlのプライマーE(10μM)、1μM dNTP(10mM)、5μl 10×Taq緩衝液(Boehringer Mannheim)、0.1ml Taqポリメラーゼ、5単位/μl(Boehringer Mannheim)、38μl水を用いて、2μlの第1鎖(=125ng)をPCR反応において使用した。
パラフィンオイルを20μlの容量において表面に添加し、そして増幅を以下の条件下で行った:(60秒間、94℃、60秒間、50℃、90秒間、72℃)×40サイクル。PCR産物をBoehringer MannheimからのHigh Pure−PCR産物精製キットを使用して日常的に精製した。精製されたDNAを、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、pGEM−T Easyベクター(Promega)中に5倍モル過剰にクローン化した。
E.coliおよびA.tumefaciens形質転換
コンピテント細菌へのプラスミドDNAの形質転換を、Genepulser(Biorad)を使用して、エレクトロポレーション(Dowerら、1988)によって行った。エレクトロポレーションについての条件は以下のようであった:標準的なキュベット中の1.5kV、25mFおよび200W。形質転換直後に、細胞をSOC培地(Sambrookら、1989)中で90分間、37℃にてインキュベートした。細菌懸濁液を、選択的な寒天プレート上にプレートし、そしてトランスジェニック細菌コロニーを可視化するために、一晩37℃にて(E.coli)、または2日間30℃にて(A.tumefaciens)インキュベートした。
コンピテント細菌へのプラスミドDNAの形質転換を、Genepulser(Biorad)を使用して、エレクトロポレーション(Dowerら、1988)によって行った。エレクトロポレーションについての条件は以下のようであった:標準的なキュベット中の1.5kV、25mFおよび200W。形質転換直後に、細胞をSOC培地(Sambrookら、1989)中で90分間、37℃にてインキュベートした。細菌懸濁液を、選択的な寒天プレート上にプレートし、そしてトランスジェニック細菌コロニーを可視化するために、一晩37℃にて(E.coli)、または2日間30℃にて(A.tumefaciens)インキュベートした。
ヌクレオチド配列解析
プラスミドDNAを、標準的な煮沸法プロトコル(Sambrookら、1989)によってE.coliから単離した後、続いてBoehringer MannheimからのPCR産物精製キットで精製した。プラスミドを、480
DNA Thermal Cyclerについて設計されたような標準的なプロトコルを用い、Perkin ElmerからのABI PRISM Dye
Terminator Cycle Sequencing Core Kitを使用して配列決定した。ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動後、結果を、Applied Biosystemsからの373A DNA Sequencerを使用して解析した。データを、Sequencer 3.0、Geneworks2.2、およびDNA−strider1.2プログラムを使用して解析した。
プラスミドDNAを、標準的な煮沸法プロトコル(Sambrookら、1989)によってE.coliから単離した後、続いてBoehringer MannheimからのPCR産物精製キットで精製した。プラスミドを、480
DNA Thermal Cyclerについて設計されたような標準的なプロトコルを用い、Perkin ElmerからのABI PRISM Dye
Terminator Cycle Sequencing Core Kitを使用して配列決定した。ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動後、結果を、Applied Biosystemsからの373A DNA Sequencerを使用して解析した。データを、Sequencer 3.0、Geneworks2.2、およびDNA−strider1.2プログラムを使用して解析した。
cDNAライブラリースクリーニング
cλZipLox cDNAライブラリーのプレーティングを、供給者のプロトコル(GIBCO BRL)によって記載されるように行い、そしてプレートリフティングおよび精製を、Sambrookら(1989)によって記載されるように行った。cDNAライブラリーのスクリーニングを、20個の複製のフィルターを使用して行い、それぞれは約250,000個の個々のプラークを含んだ。フィルターを、209bpの増幅されたPCRフラグメントを示す異なるRKS DNAプローブを用いてスクリーニングした。標識化の前に、DNAフラグメントを消化によってpGEM−Tベクターから単離し、アガロースゲルからのDE81精製によって2回精製した。フィルターを、ストリンジェントな条件(0.1SSC、65℃)下でハイブリダイズした。両方のフィルターにハイブリダイズするプラークを単離し、そしてその後の2回のさらなる精製のために使用した。得られるcDNAクローンを、λZipLoxベクターのマルチクローニング部位のプライマー結合領域からのT7およびSP6プライマーを使用して配列決定した。内部オリゴを、RKSクローンの完全なcDNAクローンを配列決定するために消化した。同定された各RKS遺伝子産物について、1つのcDNAのみが完全に配列決定された。RKS遺伝子からcDNAを同定し、続いて単離するための代替のアプローチは、そしてArabidopsisゲノムデータベース(アクセスhttp://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/AtDB/nph-blast2atdb)から得られる配列データに基づいて、RKSに相同な遺伝子についてArabidopsisゲノムデータベースをスクリーニングすること、これらのRKS遺伝子産物に特異的なプライマーを使用した、上記のようなRT−PCRアプローチにより、cDNAクローンを増幅することであった。精製されたRT−PCR産物を、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、pGEM−T Easyベクター(Promega)中に5倍モル過剰にクローン化した。
cλZipLox cDNAライブラリーのプレーティングを、供給者のプロトコル(GIBCO BRL)によって記載されるように行い、そしてプレートリフティングおよび精製を、Sambrookら(1989)によって記載されるように行った。cDNAライブラリーのスクリーニングを、20個の複製のフィルターを使用して行い、それぞれは約250,000個の個々のプラークを含んだ。フィルターを、209bpの増幅されたPCRフラグメントを示す異なるRKS DNAプローブを用いてスクリーニングした。標識化の前に、DNAフラグメントを消化によってpGEM−Tベクターから単離し、アガロースゲルからのDE81精製によって2回精製した。フィルターを、ストリンジェントな条件(0.1SSC、65℃)下でハイブリダイズした。両方のフィルターにハイブリダイズするプラークを単離し、そしてその後の2回のさらなる精製のために使用した。得られるcDNAクローンを、λZipLoxベクターのマルチクローニング部位のプライマー結合領域からのT7およびSP6プライマーを使用して配列決定した。内部オリゴを、RKSクローンの完全なcDNAクローンを配列決定するために消化した。同定された各RKS遺伝子産物について、1つのcDNAのみが完全に配列決定された。RKS遺伝子からcDNAを同定し、続いて単離するための代替のアプローチは、そしてArabidopsisゲノムデータベース(アクセスhttp://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/AtDB/nph-blast2atdb)から得られる配列データに基づいて、RKSに相同な遺伝子についてArabidopsisゲノムデータベースをスクリーニングすること、これらのRKS遺伝子産物に特異的なプライマーを使用した、上記のようなRT−PCRアプローチにより、cDNAクローンを増幅することであった。精製されたRT−PCR産物を、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、pGEM−T Easyベクター(Promega)中に5倍モル過剰にクローン化した。
再生化遺伝子産物の発現構築物
−343/−90bp領域の複製によって増強されるCaMV35Sプロモーター(Kayら、1987)を、NotI消化によりNOSターミネーターとともにベクターpMON999から単離した。得られる構築物をベクターpGreen(Beanら、1997)にクローン化し、そして得られるバイナリーベクターをさらに、pGreen1Kとして規定した。RKScDNAクローン(図2)を、EcoRI消化によりpGEM−T easyベクターから、またはEcoRI/BamHI消化によりλZipLoxベクターからのいずれかから単離した。得られるcDNAフラグメントをそれぞれ、EcoRI消化されたpGreen1KまたはEcoRI/BamHI消化されたpGreen1Kにクローン化した。ヌクレオチド配列解析を、完全性およびpGreen1KにおけるRKScDNAの方向を試験するために行った。異なるRKS0~14が、35Sプロモーターに関してセンス配座にライゲーションされた得られる構築物はさらに、RKS発現構築物として規定される。以前に言及された他の再生遺伝子産物は、35Sプロモーターの制御下、pGreen発現構築物に類似の様式においてクローン化された。
−343/−90bp領域の複製によって増強されるCaMV35Sプロモーター(Kayら、1987)を、NotI消化によりNOSターミネーターとともにベクターpMON999から単離した。得られる構築物をベクターpGreen(Beanら、1997)にクローン化し、そして得られるバイナリーベクターをさらに、pGreen1Kとして規定した。RKScDNAクローン(図2)を、EcoRI消化によりpGEM−T easyベクターから、またはEcoRI/BamHI消化によりλZipLoxベクターからのいずれかから単離した。得られるcDNAフラグメントをそれぞれ、EcoRI消化されたpGreen1KまたはEcoRI/BamHI消化されたpGreen1Kにクローン化した。ヌクレオチド配列解析を、完全性およびpGreen1KにおけるRKScDNAの方向を試験するために行った。異なるRKS0~14が、35Sプロモーターに関してセンス配座にライゲーションされた得られる構築物はさらに、RKS発現構築物として規定される。以前に言及された他の再生遺伝子産物は、35Sプロモーターの制御下、pGreen発現構築物に類似の様式においてクローン化された。
RKS遺伝子産物の一過性の発現により誘導される再生
長日条件下で生長された3週齢のArabdopsis植物からのロゼッタ葉およびシュート分裂組織を、1%漂白溶液中で20分間表面滅菌し、徹底的に滅菌水で洗浄し、そして0.8%寒天で固化された1/2MSプレート上に置いた。
長日条件下で生長された3週齢のArabdopsis植物からのロゼッタ葉およびシュート分裂組織を、1%漂白溶液中で20分間表面滅菌し、徹底的に滅菌水で洗浄し、そして0.8%寒天で固化された1/2MSプレート上に置いた。
パーティクルボンバードメント
植物組織への微粒子銃DNA送達のために、20μgのベクターDNAをバリスティック懸濁ミックス:10mgの金(Aldrich Chem、Co.Gold 1.5〜3ミクロン)、30μl 5M NaCl、5μl 2M Tris pH8.0、965μl水、100μl 0.1Mスペルミジン、100μl 25% PEG、100μl 2.5M CaCl2とともに混合した。懸濁液を室温で10分間インキュベートし、そして遠心分離した。得られるペレットをエタノールで2回洗浄し、そして200μlの氷冷された99.8%エタノール中に再懸濁した。各マイクロプロジェクタイルボンバードメントについて、10μlの金でコートされたDNAを使用した。HELIUM GUN 461についてのボンバードメント条件は以下のようであった:ヘリウム圧6bar、50mbarへの減圧、およびフィルターから組織の9cmの距離。0.1mmメッシュサイズのスクリーンを、組織とフィルターとの間で、フィルターからスクリーンの3cmの距離で使用した。
植物組織への微粒子銃DNA送達のために、20μgのベクターDNAをバリスティック懸濁ミックス:10mgの金(Aldrich Chem、Co.Gold 1.5〜3ミクロン)、30μl 5M NaCl、5μl 2M Tris pH8.0、965μl水、100μl 0.1Mスペルミジン、100μl 25% PEG、100μl 2.5M CaCl2とともに混合した。懸濁液を室温で10分間インキュベートし、そして遠心分離した。得られるペレットをエタノールで2回洗浄し、そして200μlの氷冷された99.8%エタノール中に再懸濁した。各マイクロプロジェクタイルボンバードメントについて、10μlの金でコートされたDNAを使用した。HELIUM GUN 461についてのボンバードメント条件は以下のようであった:ヘリウム圧6bar、50mbarへの減圧、およびフィルターから組織の9cmの距離。0.1mmメッシュサイズのスクリーンを、組織とフィルターとの間で、フィルターからスクリーンの3cmの距離で使用した。
本発明は、次の実施の形態が可能である。
(1)植物出発材料からの植物の増殖方法であって、該出発材料に少なくとも1種の組み換え遺伝子産物またはその機能的フラグメントを導入することにより根部および/または芽部の形成開始を促進し、これにより該培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略する、植物出発材料からの植物の増殖方法。
(1)植物出発材料からの植物の増殖方法であって、該出発材料に少なくとも1種の組み換え遺伝子産物またはその機能的フラグメントを導入することにより根部および/または芽部の形成開始を促進し、これにより該培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略する、植物出発材料からの植物の増殖方法。
(2)該少なくとも1種の遺伝子産物またはその機能的フラグメントが該出発材料中一過性にのみ存在する方法。
(3)該遺伝子産物が植物発達の調節に関与する遺伝子に由来する遺伝子産物である方法。
(4)該遺伝子産物をコードする核酸により該出発材料の少なくとも部分をトランスフォームすることを更に包含する方法。
(5)該核酸が該部分で一過性に発現する方法。
(6)該培養がin vitro培養を包含する方法。
(6)該培養がin vitro培養を包含する方法。
(7)該増殖が本質的に非種子増殖である方法。
(8)該出発材料が個々の植物細胞またはプロトプラストまたは移植片または植物組織を含有する方法。
(8)該出発材料が個々の植物細胞またはプロトプラストまたは移植片または植物組織を含有する方法。
(9)該出発材料が更に所望の性質をコードする組み換え核酸を含有する方法。
(10)所望の性質をコードする該組み換え核酸が、植物ゲノム内で核ターゲティングおよび/または組込みのための手段を更に付与されている方法。
(10)所望の性質をコードする該組み換え核酸が、植物ゲノム内で核ターゲティングおよび/または組込みのための手段を更に付与されている方法。
(11)該培養物への選択薬剤の添加を低減または省略可能とする方法。
(12)選択薬剤への耐性を付与する選択性マーカーを該出発材料が含有しない方法。
(12)選択薬剤への耐性を付与する選択性マーカーを該出発材料が含有しない方法。
(13)選択薬剤が抗生物質または除草剤である方法。
(14)植物発達の調節に関与する該遺伝子がロイシンリッチ反復配列含有受容体様キナーゼをコードする方法。
(14)植物発達の調節に関与する該遺伝子がロイシンリッチ反復配列含有受容体様キナーゼをコードする方法。
(15)該受容体様キナーゼが図3に示す植物受容体キナーゼファミリーRKSの代表である方法。
(16)該受容体様キナーゼがN末端シグナル配列、ロイシンジッパードメインを有する細胞外領域、ジスルフェート結合ドメイン、ロイシンリッチ反復配列ドメイン、プロリンリッチドメイン、膜貫通ドメイン、アンカードメインを有する細胞内領域、セリン/スレオニンキナーゼドメインおよび/またはC末端ロイシンリッチ反復配列ドメインを含有する方法。
(17)該受容体様キナーゼがArabidopsis thalianaにおいて図4、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23の何れかに1つに記載の配列を有する核酸によりコードされる方法。
(18)前記方法により得られる植物または植物材料。
(19)図8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23の何れかに1つに記載の核酸分子またはその相補核酸にハイブリダイズすることのできる、受容体様キナーゼをコードする単離および/または組み換え核酸またはその機能的フラグメントまたは機能的等価物。
(19)図8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23の何れかに1つに記載の核酸分子またはその相補核酸にハイブリダイズすることのできる、受容体様キナーゼをコードする単離および/または組み換え核酸またはその機能的フラグメントまたは機能的等価物。
(20)図8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23の何れかに1つに記載の核酸分子またはその機能的等価物または機能的フラグメントまたはその相補核酸に対して少なくとも75%の相同性を有する核酸。
(21)Arabidopsis thalianaに由来する核酸。
(22)前記核酸を含有するベクター。
(22)前記核酸を含有するベクター。
(23)前記核酸または前記ベクターを含有する宿主細胞。
(24)前記方法において使用するための核酸、ベクターまたは宿主細胞。
(24)前記方法において使用するための核酸、ベクターまたは宿主細胞。
(25)図8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23の何れかに1つに記載のアミノ酸配列またはその機能的等価物または機能的フラグメントを含有する単離または組み換え蛋白性物質。
(26)前記核酸によりコードされる、または、前記宿主細胞により産生される蛋白性物質。
(27)前記記載の方法において使用するための蛋白性物質。
(28)前記蛋白性物質を特異的に認識する単離または合成抗体。
(28)前記蛋白性物質を特異的に認識する単離または合成抗体。
(29)前記方法において使用するための抗体。
(30)前記方法における、核酸、ベクター、宿主細胞、蛋白性物質または抗体の使用。
(30)前記方法における、核酸、ベクター、宿主細胞、蛋白性物質または抗体の使用。
(31)植物またはその部分中において前記核酸または前記蛋白性物質を検出することを包含する、植物の発達段階を測定する方法。
Claims (9)
- 図8,11,12,16,19および20のいずれか1つに記載の、RKS亜群2の核酸分子からなる群から選択される核酸分子にハイブリッド形成可能なことを特徴とする、受容体様キナーゼをコードする単離および/または組み換え核酸またはその、機能的フラグメントまたは機能的等価物。
- 図8,11,12,16,19および20のいずれか1つに記載の、RKS亜群2の核酸分子からなる群から選択される核酸分子に対して少なくとも75%相同であることを特徴とする請求項1記載の核酸。
- 前記核酸がシロイヌナズナに由来することを特徴とする請求項1または2に記載の単離および/または組み換え核酸。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸を含むことを特徴とするベクタ。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸、または請求項4に記載のベクタを含むことを特徴とする宿主細胞。
- 植物出発材料に少なくとも1種の組み換え遺伝子産物またはその機能的フラグメントを導入することにより根部および/または芽部の形成開始を促進し、培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略することを特徴とする、植物出発材料からの植物の増殖方法に使用するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸、請求項4に記載のベクタまたは請求項5に記載の宿主細胞。
- 図8,11,12,16,19および20のいずれか1つに記載の、RKS亜群2のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする受容体様キナーゼ活性を有する単離および/または組み換え蛋白性物質。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸にコードされることを特徴とする請求項7記載の蛋白性物質。
- 請求項7または8に記載の蛋白性物質を特異的に認識することを特徴とする単離または合成抗体。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP99203480A EP1094113A1 (en) | 1999-10-22 | 1999-10-22 | Regeneration |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001532223A Division JP2003512061A (ja) | 1999-10-22 | 2000-10-20 | 再 生 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006340726A true JP2006340726A (ja) | 2006-12-21 |
JP2006340726A5 JP2006340726A5 (ja) | 2007-04-12 |
Family
ID=8240773
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001532223A Pending JP2003512061A (ja) | 1999-10-22 | 2000-10-20 | 再 生 |
JP2006216297A Withdrawn JP2006340726A (ja) | 1999-10-22 | 2006-08-08 | 発生 |
JP2006216298A Withdrawn JP2006340727A (ja) | 1999-10-22 | 2006-08-08 | 発生 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001532223A Pending JP2003512061A (ja) | 1999-10-22 | 2000-10-20 | 再 生 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006216298A Withdrawn JP2006340727A (ja) | 1999-10-22 | 2006-08-08 | 発生 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7723566B2 (ja) |
EP (4) | EP1094113A1 (ja) |
JP (3) | JP2003512061A (ja) |
AU (1) | AU784016B2 (ja) |
CA (1) | CA2388346A1 (ja) |
IL (3) | IL149244A0 (ja) |
NZ (1) | NZ518533A (ja) |
WO (1) | WO2001029240A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200203177B (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR122015007037B1 (pt) | 2000-12-21 | 2017-04-04 | Monsanto Technology Llc | moléculas de dna associadas com proliferação e desenvolvimento de células de plantas e métodos de produzir plantas com tamanho de órgão aumentado |
EP1382682A3 (en) | 2002-07-17 | 2004-06-30 | Expressive Research B.V. | Modulating developmental pathways in plants |
EP1621629A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-01 | Expressive Research B.V. | A method to increase pathogen resistance in plants |
US20090130685A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-21 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plants With Altered Root Architecture, Related Constructs and Methods Involving Genes Encoding Leucine Rich Repeat Kinase (LLRK) Polypeptides and Homologs Thereof |
EP2119786A1 (en) | 2008-05-13 | 2009-11-18 | Expressive Research B.V. | Increased production of health-promoting compounds in plants |
NL2004624C2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-01 | Stichting Dienst Landbouwkundi | A new glycosyltransferase protein and its role in the metabolism of phenylpropanoid volatiles in tomato. |
WO2013192278A1 (en) | 2012-06-19 | 2013-12-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Gene targeting in plants using dna viruses |
EP3008186B1 (en) * | 2013-06-14 | 2018-11-28 | Cellectis | Methods for non-transgenic genome editing in plants |
TWI642385B (zh) * | 2017-08-31 | 2018-12-01 | 川湖科技股份有限公司 | 滑軌總成及其滑軌機構 |
CN108308027A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-07-24 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所 | 一种多肉植物月光寿的组织培养方法 |
CN109913466A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-06-21 | 天津大学 | 佛甲草耐Cd基因SlSERK3及其应用 |
WO2021015616A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-28 | Wageningen Universiteit | Lrr-rlkii receptor kinase interaction domains |
CN110592137B (zh) * | 2019-10-12 | 2021-02-23 | 中国科学院昆明植物研究所 | 拟南芥at5g10290基因及其突变体在提高植物耐旱性的应用 |
KR102091361B1 (ko) * | 2019-12-16 | 2020-03-19 | 최진산 | 선반용 고정 장치 |
CN112753581A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-05-07 | 公孙国林 | 一种阿福花科十二卷属多肉植物多倍体植株培育配方 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2687284B1 (fr) * | 1992-02-14 | 1995-06-23 | Verneuil Rech | Plante portant des genes codant pour des enzymes de la voie de biosynthese des phytosterols, et procede d'obtention. |
GB9610044D0 (en) * | 1996-05-14 | 1996-07-17 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
EP1033405A3 (en) * | 1999-02-25 | 2001-08-01 | Ceres Incorporated | Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby |
-
1999
- 1999-10-22 EP EP99203480A patent/EP1094113A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-10-20 WO PCT/NL2000/000765 patent/WO2001029240A2/en active Application Filing
- 2000-10-20 IL IL14924400A patent/IL149244A0/xx unknown
- 2000-10-20 EP EP00980076A patent/EP1226262A2/en not_active Withdrawn
- 2000-10-20 EP EP06076480A patent/EP1734126A3/en not_active Withdrawn
- 2000-10-20 NZ NZ518533A patent/NZ518533A/en unknown
- 2000-10-20 AU AU17378/01A patent/AU784016B2/en not_active Ceased
- 2000-10-20 EP EP06076479A patent/EP1770167A3/en not_active Withdrawn
- 2000-10-20 JP JP2001532223A patent/JP2003512061A/ja active Pending
- 2000-10-20 CA CA002388346A patent/CA2388346A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-04-22 ZA ZA200203177A patent/ZA200203177B/xx unknown
-
2006
- 2006-08-08 JP JP2006216297A patent/JP2006340726A/ja not_active Withdrawn
- 2006-08-08 JP JP2006216298A patent/JP2006340727A/ja not_active Withdrawn
- 2006-09-05 US US11/515,613 patent/US7723566B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-05 US US11/515,614 patent/US20090029439A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-02-18 IL IL181413A patent/IL181413A0/en unknown
- 2007-02-18 IL IL181414A patent/IL181414A0/en unknown
-
2008
- 2008-05-16 US US12/152,760 patent/US20090126041A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001029240A3 (en) | 2002-03-28 |
EP1226262A2 (en) | 2002-07-31 |
JP2003512061A (ja) | 2003-04-02 |
EP1770167A2 (en) | 2007-04-04 |
WO2001029240A9 (en) | 2002-11-07 |
US20090029439A1 (en) | 2009-01-29 |
EP1734126A3 (en) | 2007-04-18 |
EP1770167A3 (en) | 2007-04-11 |
WO2001029240A2 (en) | 2001-04-26 |
EP1094113A1 (en) | 2001-04-25 |
AU1737801A (en) | 2001-04-30 |
US7723566B2 (en) | 2010-05-25 |
ZA200203177B (en) | 2003-07-22 |
JP2006340727A (ja) | 2006-12-21 |
IL149244A0 (en) | 2002-11-10 |
EP1734126A2 (en) | 2006-12-20 |
US20090126041A1 (en) | 2009-05-14 |
AU784016B2 (en) | 2006-01-12 |
NZ518533A (en) | 2004-10-29 |
IL181413A0 (en) | 2007-07-04 |
CA2388346A1 (en) | 2001-04-26 |
US20070089182A1 (en) | 2007-04-19 |
IL181414A0 (en) | 2007-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7723566B2 (en) | Regeneration | |
US10947550B2 (en) | AP2 domain transcription factor ODP2 (ovule development protein 2) and methods of use | |
Zuo et al. | The WUSCHEL gene promotes vegetative‐to‐embryonic transition in Arabidopsis | |
MXPA06013287A (es) | Promocion de la embriogenesis somatica en plantas mediante la expresion del gene de pga37. | |
EP0915984A1 (en) | Production of apomictic seed | |
JP2004527201A (ja) | アルフィン1の発現、ならびに根の生長および根の特定の遺伝子活性化の増大したトランスジェニック植物を生産する方法 | |
CA2464147C (en) | Promotion of somatic embryogenesis in plants by wuschel gene expression | |
KR20010073218A (ko) | Serk 상호작용 단백질의 발현에 의해 부여되는무수정생식 | |
JP4005129B2 (ja) | Parp阻害剤を使用した遺伝的形質転換 | |
US20030014776A1 (en) | Maternal effect gametophyte regulatory polynucleotide | |
US20040023395A1 (en) | Transgenic tetraploid plants and methods of production | |
AU2007201633B2 (en) | Promotion of somatic embryogenesis in plants by wuschel gene expression | |
WO2004042066A2 (en) | NtSM GENE | |
Chory et al. | Molecular methods for isolation of signal transduction pathway mutants | |
Cassan-Wang | Auxin-Dependent Transcriptional Regulation During Fruit Development | |
JP2001321185A (ja) | 統括的形態形成制御方法及び遺伝子 | |
WO2003091441A1 (en) | Sfr2 protein encoding gene | |
MXPA99008795A (en) | Plants with modified growth |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070223 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071012 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20100616 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100616 |