KR20020086724A

KR20020086724A - 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스 프로모터

Info

Publication number: KR20020086724A
Application number: KR1020027012874A
Authority: KR
Inventors: 혼토마스; 스타볼론리비아; 데한페트루스테오도루스; 리곤호프톰슨; 코노노바마리아
Original assignee: 신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2002-11-18
Also published as: KR100766290B1; PL204327B1; EP1268826A1; DE60133807D1; JP4739634B2; CA2406191C; EA200200960A1; ES2304127T3; EA006761B1; CN100457913C; WO2001073087A1; HU225788B1; HUP0300570A3; BR0109530A; CN1430673A; BR0109530B1; PL358790A1; AU2001242516B2; NZ521412A; EP1268826B1

Abstract

본 발명은 연합 뉴클레오타이드 서열을 전사시키는 프로모터로서 작용하는 신규한 DNA 서열에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 연합 뉴클레오타이드 서열에 지속적 발현을 부여해주는 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 프로모터 서열을 함유하는 재조합 서열에 관한 것이다. 이러한 재조합 DNA 서열을 사용하여, 형질전환된 식물, 특히 관심있는 뉴클레오타이드 서열을 대부분의 조직 및 기관에서 계속적으로 발현할 수 있는 식물을 생성시킬 수 있다.

Description

세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스 프로모터{Cestrum yellow leaf curling virus promoters}

농업 분야에서는, 사람의 필요에 따라 식물을 변형시키고자 하는 열망이 지속적으로 있어왔다. 이를 달성하기 위한 한 가지 방법은 현대 유전 공학 기술을 사용하는 것이다. 예를 들면, 관심있는 유전자를 식물 내에 도입함으로써, 이러한 식물이 목적하는 표현형 특성을 발현하도록 이를 특이적으로 변형시킬 수 있다. 이를 위해, 프로모터 영역, 암호화 영역 및 종결 영역을 포함하는 이종 유전자를 이용하여 식물을 형질전환시키는 것이 가장 통상적인 방식이다. 식물에서의 발현을 위해 이종 유전자를 유전 공학적으로 가공한 경우에는, 프로모터의 선택이 중요한 요소이다. 특정한 자극에 대해서만 반응하는 특정 유전자를 발현하거나 또는특이적 세포 또는 조직에 한해서만 특정 유전자를 발현하는 것이 바람직할 수 있긴 하지만, 기타 유전자들은 보다 바람직하게는 지속적으로, 즉 식물 전반에 걸쳐 대부분의 조직과 기관에서 계속적으로 발현된다. 과거에는, 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus)로부터의 35S 프로모터(CaMV 35S 프로모터)가 식물에서 이종 유전자의 지속적 발현을 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 대체 프로모터를 사용하는 것이 요망되는 경우도 종종 있다. 따라서, 본 발명의 주요 목적은 식물에서 관심있는 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한 대체 프로모터를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자, 발현 벡터 및 형질전환된 식물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스(CmYLCV)의 게놈으로부터 수득될 수 있는, 연합 뉴클레오타이드 서열의 발현을 구동시킬 수 있는 DNA 서열을 제공한다. CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터로부터 수득될 수 있고 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열이 바람직하다.

특히,

·서열 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열

·서열 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열

·서열 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열

·서열 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열

·서열 6에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열

·엄격한 조건 하에서 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 또는 서열 6과 하이브리드화되는 DNA 서열[특히, 전술된 바와 같은 DNA 서열은 서열 19 또는 서열 20에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다]을 제공한다.

본 발명은 추가로, 서열 1의 길이에 있어 50nt 이상, 바람직하게는 약 400개 염기 내지 약 650개 염기, 보다 바람직하게는 약 200개 염기 내지 약 400개 염기, 가장 바람직하게는 약 350개 염기의 연속되는 연장물을 포함하는 DNA 서열을 제공하는데, 이러한 DNA 서열은 연합 뉴클레오타이드 서열의 발현을 구동시킬 수 있다.

본 발명의 특정한 양태에서는, 길이가 50nt 이상, 바람직하게는 약 400개 염기 내지 약 650개 염기, 보다 바람직하게는 약 200개 염기 내지 약 400개 염기, 가장 바람직하게는 약 350개 염기인 연속되는 연장물이, 서열 1의 길이에 있어 50nt 이상, 바람직하게는 약 400개 염기 내지 약 650개 염기, 보다 바람직하게는 약 200개 염기 내지 약 400개 염기, 가장 바람직하게는 약 350개 염기의 상응하는 연속되는 연장물과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 나타낸다.

본 발명은 추가로, 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스로부터 분리된 완전한 길이의 전사체 프로모터 영역을 포함하는 재조합 DNA 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 본 발명에 따르는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자 및 DNA 발현 카세트를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 재조합 DNA 분자 및 발현 카세트를 각각 포함하는 DNA 발현 벡터를 제공한다.

특히, 재조합 DNA 분자 및 DNA 발현 카세트가 제공되는데, 여기서 관심있는 뉴클레오타이드 서열은 암호화 서열을 포함하며, 특히 이러한 암호화 서열은 다음과 같다:

·암호화 서열은 목적하는 표현형 특성을 암호화한다.

·암호화 서열은 선별 가능한 또는 스크리닝 가능한 마커 유전자를 암호화한다.

·암호화 서열은 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 또는 기타 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 개선된 영양가, 개선된 산업 공정 성능 또는 변화된 생산 능력을 부여해주는 단백질을 암호화한다.

·암호화 서열은 이러한 암호화 서열로 형질전환시킨 세포에 포지티브의 선택적인 이점을 부여해주는 단백질을 암호화한다.

·암호화 서열은 특정 화합물(이러한 화합물은 만노즈 또는 크실로즈, 또는 이들의 유도체 또는 전구체, 또는 단백질의 기질이다)을 대사시킬 수 있거나, 또는 상기 암호화 서열로 형질전환시킨 세포에 의해 이러한 기질로 대사될 수 있는, 상기 암호화 영역으로 형질전환시킨 세포에 대사적 이점을 부여해주는 단백질을 암호화한다.

·암호화 서열은 크실로이소머라제, 포스포만노-이소머라제, 만노즈-6-포스페이트 이소머라제, 만노즈-1-포스페이트 이소머라제, 포스포만노 뮤타제, 만노즈 에피머라제, 만노즈 또는 크실로즈 포스파타제, 만노즈-6-포스파타제, 만노즈-1-포스파타제 및 만노즈 및 크실로즈 퍼메아제의 그룹 중에서 선택된 효소를 암호화한다.

·암호화 서열은 포스포만노 이소머라제를 암호화한다.

·암호화 영역 비-해독성이다.

·상기 비-해독성 암호화 영역은 바이러스 유전자, 특히 TSWV, 보다 특히 TSWV NP 유전자로부터 기원된 것이다.

·암호화 서열은 시판용 효소 또는 식물 내의 대사물을 암호화한다.

·암호화 서열은 안티센스 배향으로 존재한다.

본 발명은 또한, 전술된 바와 같은 DNA 서열 또는 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 특정 양태에서는, 상기 DNA 발현 벡터가 pNOV2819 또는 pNOV2819이다. 추가로, 관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 본 발명에 따르는 제1 DNA 서열, 및 관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 본 발명에 따르는 제2 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 벡터가 제공된다. 본 발명의 특정 양태에서는, 전술된 바와 같은 DNA 발현 벡터가 바이러스 게놈의 발현을 변화시킬 수 있다.

보다 특정한 양태에서는, 전술된 바와 같은 DNA 발현 벡터가 특정 세포에서 상기 바이러스 게놈의 센스 RNA 단편 또는 이의 일부를 발현할 수 있는 제1 DNA 서열, 및 특정 세포에서 상기 바이러스 게놈의 안티센스 RNA 단편 또는 이의 일부를 발현할 수 있는 제2 DNA 서열을 포함하는데, 상기 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA을 형성할 수 있다.

전술된 바와 같은 발현 벡터가 제공되는데, 여기서

·상기 바이러스는 토스포바이러스, 포티바이러스, 포텍스바이러스, 토바모바이러스, 루테오바이러스, 쿠쿠모바이러스, 브로모바이러스, 클로스테오르바이러스, 톰부스바이러스, 및 푸로바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

·상기 DNA 서열은 바이러스 코트 단백질 유전자, 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자, 바이러스 레플리카제 유전자, 또는 바이러스 운동 단백질 유전자로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부를 포함하며;

·상기 DNA 서열은 토마토 반점상 조고증 바이러스(tomato spotted wilt virus: TSWV)로부터 유도되고;

·상기 DNA는 뉴클레오캡시드 단백질 유전자로부터 유도된다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따르는 DNA 서열, 재조합 DNA 분자 또는 DNA 발현 벡터를 이용하여 안정적으로 형질전환시킨 숙주 세포를 제공한다. 특히,

·상기 숙주 세포는 세균이고;

·상기 숙주 세포는 식물 세포이며;

·상기 숙주 세포는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 사탕 옥수수, 콩, 완두, 치커리, 상추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 스쿼시, 호박, 대마, 애호박, 사과, 배, 마르멜로, 메론, 플럼, 체리, 복숭아, 승도 복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 당밀, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지씨, 클로버, 담배, 당근, 면, 자주개자리, 감자, 가지, 오이, 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 및 목재 식물, 예를 들면, 침염수 및 활엽수로 이루어진 그룹 중에서 선택된 식물 세포, 특히 벼, 옥수수, 밀, 보리, 양배추, 콜리플라워, 후추, 스쿼시, 메론, 대두, 토마토, 사탕무, 해바라기 또는 면, 보다 특히 벼, 옥수수, 밀, 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor), 새발풀, 사탕무 및 대두 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 식물 세포이며;

·상기 숙주 세포는 쌍떡잎 식물로부터의 식물 세포이고;

·상기 숙주 세포는 대두, 면, 담배, 사탕무 및 지유종자 평지로 이루어진 그룹 중에서 선택된 쌍떡잎 식물로부터의 식물 세포이며;

·상기 숙주 세포는 외떡잎 식물로부터의 식물 세포이고;

·상기 숙주 세포는 옥수수, 밀, 당밀, 호밀, 귀리, 잔디풀, 벼 및 보리로 이루어진 그룹 중에서 선택된 외떡잎 식물로부터의 식물 세포이다.

또한, 본 발명에 따르는 DNA 서열, 재조합 DNA 분자 또는 DNA 발현 벡터를 이용하여 안정적으로 형질전환시킨 식물, 및 종자를 포함한 이의 자손이 제공된다. 특히,

·상기 식물은 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 사탕 옥수수, 콩, 완두, 치커리, 상추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 스쿼시, 호박, 대마, 애호박, 사과, 배, 마르멜로, 메론, 플럼, 체리, 복숭아, 승도 복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 당밀, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지씨, 클로버, 담배, 당근, 면, 자주개자리, 감자, 가지, 오이, 아라비도프시스 탈리아나, 및 목재 식물, 예를 들면, 침염수 및 활엽수로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 특히 벼, 옥수수, 밀, 보리, 양배추, 콜리플라워, 후추, 스쿼시, 메론, 대두, 토마토, 사탕무, 해바라기 또는 면, 보다 특히 벼, 옥수수, 밀,소르검 비콜로르, 새발풀, 사탕무 및 대두 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명은 추가로,

·관심있는 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한, 본 발명에 따르는 DNA 서열의 용도; 및

·DNA가, 사용된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 서열 1의 15, 18, 20, 22, 24개 이상의 염기쌍의 연속되는 연장물을 나타내는 뉴클레오타이드의 특정 서열을 포함하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 생성되는, 본 발명에 따르는 DNA 서열의 생성 방법을 제공한다.

본 명세서 및 청구의 범위을 명확하고도 일관되게 이해하기 위해, 다음 정의가 제공된다:

CmYLCV:세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스.

DNA 셔플링(shuffling):DNA 셔플링은 전위물을 DNA 분자 내에 바람직하게는 무작위로, 신속하고, 용이하게 효율적으로 도입하는 방법, 또는 DNA 서열을 둘 이상의 DNA 분자 사이에서, 바람직하게는 무작위로 교환시키는 방법이다. DNA 셔플링으로부터 생성된 DNA 분자는 하나 이상의 주형 DNA 분자로부터 유도된 비-천연 DNA 분자인 셔플링된 DNA 분자이다.

발현:이는 식물에서 내인성 유전자 또는 형질전환 유전자의 전사 및/또는 해독을 지칭한다. 안티센스 작제물의 경우, 예를 들면, 발현은 안티센스 DNA 만의 전사를 지칭할 수도 있다.

작용적 등가 서열:이는 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터 또는 이의일부와 실질적으로 유사한 프로모터 활성을 지니고 있고 엄격한 하이브리드화 조건 하에 상기 프로모터 서열과 하이브리드화되는 DNA 서열을 지칭한다.

유전자:이는 암호화 서열 및 연합 조절 서열을 지칭하는데, 이러한 암호화 서열은 RNA, 예를 들면, mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA로 전사된다. 조절 서열의 예는 프로모터 서열, 5'- 및 3'-비해독 서열 및 종결 서열이다. 존재할 수 있는 추가의 요소는, 예를 들면, 인트론이다.

관심있는 유전자:이는 식물에 전이될 때, 식물에 대해 목적하는 특징들, 예를 들면, 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 또는 기타 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 개선된 영양가, 개선된 산업 공정 성능 또는 변화된 생산 능력을 부여해주는 모든 유전자를 지칭한다. 이러한 "관심있는 유전자"는 식물에서 상업적으로 유용한 효소 또는 대사물을 생성시키기 위해 식물에 전이되는 것일 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같은이종은 상이한 천연 또는 합성 기원을 의미한다. 예를 들면, 숙주 세포가 형질전환되지 않은 숙주 세포 내에서는 존재하지 않는 핵산 서열로 형질전환된 경우에는, 이러한 핵산 서열을 상기 숙주 세포에 대해 이종으로 지칭된다. 형질전환 핵산은 이종 프로모터, 이종 암호화 서열 또는 이종 종결 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 형질전환 핵산은 완전히 이종이거나, 또는 이종 핵산 서열과 내인성 핵산 서열의 가능한 어떠한 조합을 포함할 수도 있다.

리더 영역:이는 전사 개시 부위와 해독 개시 부위 사이의 유전자 영역이다.

마커 유전자:이는 선별 가능한 또는 스크리닝 가능한 특성을 암호화하는 유전자를 지칭한다.

조절성 DNA 서열에작동적으로 연결된/연합되는것은 조절성 DNA 서열이 암호화 DNA 서열의 발현에 영향을 미치도록 두 서열이 위치하는 경우에 특정 단백질 또는 RNA를 암호화하는 DNA 서열에 "작동적으로 연결"되거나 "연합되는" 것으로 지칭된다.

식물:이는 모든 식물, 특히 종자 식물을 지칭한다.

식물 세포:원형질체와 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 지칭한다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포 형태일 수 있거나, 보다 고등화된 단위의 일부, 예를 들면, 식물 조직 또는 식물 기관으로서 존재할 수 있다.

식물 재료:이는 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 일부, 과실, 화분, 화분관, 배주, 배낭, 난 세포, 접합체, 배아, 종자, 삽목, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 기타 모든 부분 또는 생성물을 지칭한다.

프로모터:이는 연합 DNA 서열의 전사를 개시하는 DNA 서열을 지칭한다. 이 프로모터 영역은 또한, 유전자 발현의 조절인자로서 작용하는 요소, 예를 들면, 활성인자, 인핸서(enhancer) 및/또는 억제인자를 포함할 수 있고 5' 비-해독 리더 서열 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.

재조합 DNA 분자:이는 재조합 DNA 기술을 사용하여 함께 결합시킨 DNA 서열의 조합물을 지칭한다.

재조합 DNA 기술:이는 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재된 바와 같이 DNA 서열을 함께 연결하기 위해 사용되는 과정을 지칭한다.

스크리닝 가능한 마커 유전자:이의 발현이 형질전환된 세포에 선별적인 이점을 부여해주지는 않지만, 이의 발현으로 인해, 형질전환된 세포가 형질전환되지 않은 세포와는 표현형적으로 구별되게 해주는 유전자를 지칭한다.

선별 가능한 마커 유전자:식물에서의 이의 발현이 세포에게 선별적인 이점을 제공해주는 유전자를 지칭한다. 선별 가능한 마커 유전자로 형질전환된 세포에 의해 보유된 선별적인 이점은 형질전환되지 않은 세포의 성장과 비교해서, 네가티브의 선별적인 제제, 예를 들면, 항생제 또는 제초제의 존재 하에서의 이들의 성장 능력에 기인된 것일 수 있다. 형질전환되지 않은 세포와 비교해서, 형질전환된 세포에 의해 보유된 선별적인 이점은 또한, 영양물, 성장 인자 또는 에너지원으로서 부가된 화합물을 활용하는 이들의 증진된 능력 또는 신규 능력에 기인된 것일 수 있다. 선별 가능한 마커 유전자는 또한, 선별적인 제제의 부재하와 비교해서, 선별적인 제제의 존재하에 식물 세포에서의 이의 발현이, 예를 들면, 성장 관점에서, 형질전환된 식물 세포에 대해서는 포지티브 효과를 나타내고 형질전환되지 않은 식물 세포에 대해서는 네가티브 효과를 나타내므로, 형질전환된 식물 세포에 포지티브의 선별적인 이점을 제공해주는 유전자 또는 유전자 조합물을 지칭한다.

서열 상동성:서열 상동성은 역학적 프로그래밍 연산에 근거한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정한다. 본 발명의 범주 내에서 바람직한 컴퓨터 프로그램에는조회 대상이 단백질이거나 DNA인지에 상관없이 이용 가능한 서열 데이터베이스 모두를 조사하도록 고안된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 검사 프로그램이 포함된다. 이러한 검사 도구의 버젼 BLAST 2.0(Gapped BLAST)은 인터넷 상에서 공개적으로 입수 가능하다(주소: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 이는 글로벌 정렬과는 반대로 국소적 정렬을 찾는 발견적 연산 방식을 이용하므로, 분리된 영역만을 공유하고 있는 서열들 간의 관계를 탐지할 수 있다. BLAST 검사에 할당된 스코어는 널리 규정된 통계적 해석을 지닌다. 상기 프로그램은 바람직하게는 디폴트(default) 값으로 설정된 임의의 파라미터를 이용하여 수행한다.

형질전환:이는 특정 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 특히, 이는 DNA 분자를 관심있는 유기체의 게놈 내로 안정적으로 통합시키는 것을 지칭한다.

TSWV:토마토 반점상 조고증 바이러스.

본 발명은 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스(CmYLCV)의 게놈으로부터 수득될 수 있는 DNA 서열에 관한 것이다. 관심있는 연합 뉴클레오타이드 서열의 발현을 구동시킬 수 있는 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터로부터 수득될 수 있는 DNA 서열이 바람직하다. 이의 작용성 및/또는 구조적 등가물을 포함하는 DNA 서열이 또한 본 발명에 포괄된다. 따라서, 본 발명은 연합 뉴클레오타이드 서열의 전사 프로모터로서 작용하는 DNA 서열에 관한 것이다. 프로모터 영역은 또한, 유전자 발현의 조절인자로서 작용하는 요소, 예를 들면, 활성인자, 인핸서 및/또는 억제인자를 포함할 수 있고, 전사된 mRNA의 5' 비-해독 리더 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서는, 상기 DNA 서열이 연합 뉴클레오타이드 서열에 지속적 발현을 부여해준다. 지속적 발현은 관심있는 뉴클레오타이드 서열이 대부분의 조직 및 기관에서 계속적으로 발현되는 것을 의미한다. 일시적인 발현 검정에서 GUS 또는 CAT 리포터 유전자와 연합하여 시험할 경우, 본 발명에 따르는 DNA 서열은 높은 수준의 GUS 또는 CAT 리포터 유전자를 발현시킨다. 따라서, 본 발명에 따르는 DNA 서열은 관심있는 연합 뉴클레오타이드 서열(이는 바람직하게는 암호화 서열이다)을 높은 수준으로 발현하는데 유용하다. 관심있는 연합 암호화 서열을 센스 배향 또는 안티센스 배향으로 발현할 수 있다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 추가로, 관심있는 암호화 서열은 형질전환시키고자 하는 식물에 대해 이종 또는 동종 기원일 수 있다. 동종 암호화 서열의 경우에는, 본 발명에 따르는 DNA 서열이 상기 서열을 전위성 발현하는데 유용하다. 본 발명의 한 가지 특정한 양태에서는, 본 발명에 따르는 DNA 서열의 조절 하에 관심있는 암호화 서열을 발현시키면, 공동억제로 불리우는 과정에 의해 이의 자신의 발현과 상기 유전자의 본래 복사물의 발현이 억제된다.

본 발명의 프로모터는 예를 들면, 감염된 세스트룸 파르퀴(Cestrum parqui) 식물로부터 분리될 수 있는, 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스(CmYLCV) 게놈 DNA로부터 수득될 수 있다. CmYLCV-감염된 세스트룸 파르퀴 식물은 이들의 잎 모자이크와 주름진 잎 기형에 의해 동정된다. 이어서, 상기 DNA를 서열화하고 분석한다. 데이터베이스 내의 서열과의 서열 비교 결과, CmYLCV의 게놈 체제가 콜리모바이러스(Caulimovirus) 계열의 기타 구성원들 중의 하나와 관계가 있는 것으로 나타났다. CmYLCV는 8개의 개방 판독 프레임을 함유하고 있다. CmYLCV 유전자 생성물을 서열 비교한 결과, 유전자 I 생성물은 세포내 운동과 관련이 있고; 유전자 A는 공지되지 않은 기능의 작은 단백질을 암호화하며; 유전자 B는 진디 전염 인자를 암호화하고; 유전자 C는 비리온 연합 단백질을 암호화하며; 유전자 IV는 주요 캡시드 단백질이고; 유전자 V는 역전사효소를 암호화하며; 유전자 VI는 완전한 길이의 전사체 상에서의 바이러스 유전자의 해독을 트랜스로 활성화시키는 것으로 나타났다. 특히 관심있는 것은, 소위 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터이다.

CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터의 각종 영역을 본 발명에 따라 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 한 가지 특정한 양태는 CmpD 프로모터로 불리우는, 서열 1에 제시된 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터 영역이다. 이 서열은 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터 350bp 및 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 5' 비-해독 리더 서열의 320bp를 함유한다. 상기 서열은 CmYLCV 게놈 DNA을 서열화함으로써 수득된다. 상기 프로모터 및 리더 서열은 각각, 데이터베이스 내의 서열과 비교함으로써 동정한다. CmYLCV 완전한 길이의 전사체 5' 비-해독 리더 서열이 320bp 대신 318bp인, CmpE로 명명되는 서열 1의 변이체가 서열 19에 제시되어 있다.

본 발명의 한 가지 바람직한 양태는 CmpC 프로모터로 명명되는, 서열 2에 도시된 DNA 서열이다. 이러한 CmpC 프로모터는 서열 1에 제시된 서열의 특정 단편이고, 서열 1의 염기 5 내지 350에 상응하는, CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터의 346bp를 함유한다. 이러한 DNA 서열은 정방향 프라이머 Cmp1(서열 13)와 역방향 프라이머 CmpC2(서열 14)를 사용하여 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스 또는 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스-감염된 세스트룸 파르퀴 식물로부터의 게놈 DNA로 PCR함으로써 수득될 수 있다. CmpC 프로모터의 추정된 TATA-박스는 서열 2의 염기 308에서부터 염기 315까지 위치되어 있다. CmpC 프로모터는 3개 이상의 추정된 인핸서 영역을 함유한다. 뉴클레오타이드 서열 CAAT를 갖는 인핸서 영역 1은 서열 2의 염기 232에서부터 염기 235까지 위치되어 있고; 뉴클레오타이드 서열 CAAT를 또한 갖는 인핸서 영역 2는 서열 2의 염기 243에서부터 염기 246까지 위치되어 있으며; 인핸서 영역 3은 서열 2의 염기 246에서부터 염기 253까지 위치되어 있고 뉴클레오타이드 서열 TGACGTAA를 갖는다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 CmpS 프로모터로 명명되는, 서열 3에 제시된 DNA이다. 이러한 CmpS 프로모터는 또한, 서열 1에 제시된 서열의 특정 단편이고 서열 2의 346bp 및 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터의 리더 영역으로부터의 54bp를 함유한다. 상기 리더 영역은 전사되긴 하지만 단백질로 해독되지는 않는 암호화 영역 앞의 뉴클레오타이드 서열이다. 리더 영역이 유전자 발현에 있어 중요한 기능을 갖는 조절 요소를 함유할 수 있다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 CmpS 프로모터는 정방향 프라이머 Cmp1(서열 13)와 역방향 프라이머 CmpS2(서열 15)를 사용하여 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스 또는 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스-감염된 세스트룸 파르퀴 식물로부터의 게놈 DNA로 PCR함으로써 수득될 수 있다. CmpS 프로모터는 리더 영역 내에 2개 이상의 추정된 인핸서 영역을 함유한다. 인핸서 영역 4(GAGAGA)는 서열 3의 염기 354에서부터 염기 359까지위치되어 있고; 인핸서 영역 5(GAGAGAGA)는 서열 3의 염기 368에서부터 염기 375까지 위치되어 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 CmpL 프로모터로 명명되는, 서열 4에 제시된 서열이다. 바로 전의 프로모터로서의 CmpL 프로모터는 서열 1에 제시된 서열의 특정 단편이고 서열 2의 346bp 및 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 5' 비-해독 리더 서열의 288bp를 함유한다. 상기 CmpL 프로모터는 정방향 프라이머 Cmp1(서열 13)와 역방향 프라이머 CmpL2(서열 16)를 사용하여 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스 또는 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스-감염된 세스트룸 파르퀴 식물로부터의 게놈 DNA로 PCR함으로써 수득될 수 있다. CmYLCV 완전한 길이의 전사체 5' 비-해독 리더 서열의 길이가 288bp 대신 286bp인, CmpF로 명명되는 서열 4의 변이체가 서열 20에 제시되어 있다.

서열 1, 2, 3, 4, 19 및 20에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 동종 또는 이종 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 이들의 5'-말단 또는 3'-말단에서 연장될 수 있다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열 1, 2, 3, 4, 19 및 20의 5'-말단은 서열 6에 제시된 뉴클레오타이드의 전부 또는 일부에 의해 연장될 수 있다. 서열 6은 서열 2, 3, 4 및 20의 천연상 발견된 상단부이고 CmYLCV의 ORF VI의 일부(서열 6의 염기 1 내지 염기 100) 뿐만 아니라 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터의 일부(서열 6의 염기 101 내지 104)를 함유한다. 마찬가지로, 서열 2, 3, 4 및 20의 3'-말단은 서열 5에 제시된 뉴클레오타이드의 전부 또는 일부에 의해 연장될 수 있고, 이러한 서열 5는 서열 4 및 20의 3'-말단에서 천연상 발견되는 뉴클레오타이드 서열을 나타내고 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 리더 서열의 일부를 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열은 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스 또는 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스-감염된 세스트룸 파르퀴 식물로부터의 게놈 DNA로 PCR함으로써 수득될 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 DNA 서열은 서열 특이적 프라이머를 사용하여 본 발명의 DNA 서열의 상동체를 포함하는 콜리모바이러스 계열의 기타 모든 바이러스로부터 수득할 수 있다.

서열 1 내지 6 및 서열 19 및 20에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 근거로 하여, 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 각종 길이의 DNA 단편을 PCR 증폭시키기 위해, 관심있는 어떠한 프라이머 조합물도 선택할 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따라서 작용하는, 즉 연합 뉴클레오타이드 서열의 발현을 부여해줄 수 있는 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터로부터 유도된 단편을 포함한다.

이는 상기 프로모터 단편을 생성시키고, 이들을 선별 가능하거나 스크리닝 가능한 마커 유전자와 융합시킨 다음, 이러한 융합 작제물을 대상으로 하여 프로모터 활성의 보유 여부를 검정함으로써 시험할 수 있다. 이러한 검정은 당업자에게는 통상적인 기술범위 내에 있다. 본 발명의 바람직한 DNA 단편은 길이가 약 50개 염기 이상, 바람직하게는 약 400개 내지 약 650개 염기, 보다 바람직하게는 약 200개 내지 약 400개 염기, 가장 바람직하게는 약 350개 염기이다.

하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌연변이물, 삽입물, 결실물 및/또는 치환물을, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 DNA 서열, 또는 이의 서열 정보로부터 유도된 보다 길거나 보다 짧은 단편 내로 도입할 수 있다는 것은 당업자에게 또한 명백하다. 또한, 본 발명의 변형되지 않거나 변형된 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 서열을 셔플링함으로써 변화시킬 수 있다. 본 발명에 따르는 변이체 DNA 서열의 기능에 대해 시험하기 위해, 관심있는 서열을 선별 가능하거나 스크리닝 가능한 마커 유전자에 작동적으로 연결시키고, 이러한 마커 유전자의 발현을 원형질체를 이용하여 일시적인 발현 검정에서 시험하거나 안정적으로 형질전환된 식물에서 시험한다. 연합 뉴클레오타이드 서열의 발현을 구동할 수 있는 DNA 서열이 모듈러 방식으로 만들어진다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 보다 짧은 DNA 단편으로부터의 발현 수준은 가장 긴 단편으로부터의 것과 상이할 수 있고, 이는 서로 상이할 수 있다. 예를 들면, 하향-조절성 상단부 요소의 결실로 인해, 연합 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준이 증가될 수 있는 반면, 상향-조절성 요소를 결실시키면, 연합 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준이 저하될 것이다. 발생-특이적 또는 조직-특이적 요소를 결실시키면, 연합 뉴클레오타이드 서열의 시간적 또는 공간적으로 변화된 발현 프로필이 야기될 것이라는 것은 당업자에게 또한 공지되어 있다.

본 발명의 프로모터의 작용성 등가물, 즉 엄격한 조건 하에서 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 또는 서열 6 중의 어느 하나와 하이브리드화되는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 서열 19 및 20에 제시된 서열도 본 발명의 범주 내에 포괄된다. 엄격한 하이브리드화는 0.1% SDS를 함유하는 2배 농도(2X) 시트레이트완충 식염수(SSC)에서 65℃, 바람직하게는 60℃, 가장 바람직하게는 55℃에서 수행한 다음, 동일한 온도에서 지지체를 SSC 농도가 감소된 완충제로 세정한다. 이러한 감소 농도의 완충제는 전형적으로 0.1% SDS를 함유하는 1/10 농도 SSC(0.1 X SSC), 바람직하게는 0.1% SDS를 함유하는 0.2 X SSC, 가장 바람직하게는 0.1% SDS를 함유하는 1/2 농도 SSC(0.5 X SSC)이다. 사실상, 기타 유기체로부터의 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터의 전부 또는 일부에 대한 작용성 등가물은, 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 19 및 서열 20 중의 어느 하나를 관심있는 유기체, 특히 또 다른 콜리모바이러스로부터 분리된 게놈 DNA와 하이브리드화시킴으로써 발견할 수 있다.

다른 유기체에서 동종 서열을 동정하는 것으로 당해 분야에 공지된 많은 방법이 있기 때문에, 당업자는 상기 서열을 발견하기 위한 처리 과정을 알고 있다. 이어서, 이와 같이 새로이 동정된 DNA 분자를 서열화하고, 이 서열을 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 19 및 서열 20 중의 어느 하나와 비교한 다음, 프로모터 활성을 시험한다. 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이에 걸쳐, 서열 1, 2, 3, 4 및 6 중의 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열에 대한 서열 상동성이 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 DNA 분자가 본 발명의 범주 내에 속한다. 서열 상동성(%)은 역학적 프로그래밍 연산에 근거한 컴퓨터 프로그램으르 사용하여 결정한다. 본 발명의 범주 내에서 바람직한 컴퓨터 프로그램에는 조회 대상이 단백질이거나 DNA인지에 상관없이 이용 가능한 서열 데이터베이스 모두를 조사하도록 고안된 BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool) 검사 프로그램이 포함된다. 이러한 검사 도구의 버젼 BLAST 2.0(Gapped BLAST)은 인터넷 상에서 공개적으로 입수 가능하다(주소: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 이는 글로벌 정렬과는 반대로 국소적 정렬을 찾는 발견적 연산 방식을 이용하므로, 분리된 영역만을 공유하고 있는 서열들 간의 관계를 탐지할 수 있다. BLAST 검사에 할당된 스코어는 널리 규정된 통계적 해석을 지닌다. 상기 프로그램은 바람직하게는 디폴트 값으로 설정된 임의의 파라미터를 이용하여 수행한다.

본 발명의 또 다른 목적은 관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 본 발명에 따르는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하는 것이다. 관심있는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들면, 리보솜 RNA, 안티센스 RNA, 또는 단백질로 해독되지 않는 기타 모든 유형의 RNA를 암호화할 수 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서는, 관심있는 뉴클레오타이드 서열이 단백질 생성물로 해독된다. 당해 프로모터 서열과 연합된 뉴클레오타이드 서열은 형질전환될 식물에 대해 동종 또는 이종 기원일 수 있다. 상기 서열은 완전히 또는 부분적으로 합성 서열일 수 있다. 기원에 상관없이, 연합 DNA 서열은 이것이 연결되는 프로모터의 발현 성질에 따라서 형질전환된 식물에서 발현될 것이다. 프로모터 서열과 연합된 동종 뉴클레오타이드 서열의 경우에는, 본 발명에 따르는 프로모터가 상기 동종 서열의 전위성 발현에 유용하다. 전위성 발현은 프로모터 서열과 연합된 뉴클레오타이드 서열이 조직 및 기관에서 발현되고/되거나 상기 서열이 자체 프로모터의 조절 하에 발현될 수 없을 때에 발현되는 것을 의미한다. 본 발명의 한 가지 특정한 양태에서는, 프로모터 서열과 연합된 뉴클레오타이드 서열의 발현으로 인해, 공동억제로 불리우는 과정에 의해 이의 자신의 발현과 상기 유전자의 본래 복사물의 발현이 억제된다.

본 발명의 바람직한 양태에서는, 연합 뉴클레오타이드 서열이, 대부분의 조직 및 기관에서 계속적으로 식물 전반에 걸쳐 발현되는 것이 요망되는 단백질을 암호화할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는, 이를 이용하여 형질전환시킨 식물에 목적하는 표현형 특성을 부여해주는 단백질을 암호화한다. 이의 예는 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 또는 기타 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 개선된 영양가, 개선된 산업 공정 성능 또는 변화된 생산 능력을 부여해주는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다. 연합 뉴클레오타이드 서열은 식물에서 상업적으로 유용한 효소 또는 대사물을 생성시키기 위해 식물에 전이되는 것일 수도 있다. 또한, 선별 가능하거나 스크리닝 가능한 마커 유전자, 즉 선별 가능한 특성 또는 스크리닝 가능한 특성을 암호화하는 암호화 영역에 작동적으로 연결된 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 유전자가 본 발명에 범주에 포괄된다.

선별 가능하거나 스크리닝 가능한 마커 유전자의 예가 다음에 기재되어 있다. 특정의 표적 종의 경우, 상이한 항생제 또는 제초제 선별 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 통상적으로 사용된 선별 마커에는 카나마이신, 파로모마이신, 제네티신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여해주는nptII 유전자[참조: Vieira and Messing, 1982, Gene 19:259-268; Bevan et al., 1983, Nature 304:184-187];아미노글리코시드 3'-아데닐릴트랜스퍼라제를 암호화하고 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여해주는 세균성aadA 유전자[참조: Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res. 19:4083-4089]; 항생제 히그로마이신에 대한 내성을 부여해주는hph유전자[참조: Blochlinger and Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2929-2931]; 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여해주는dhfr유전자[참조: Bourouis and Jarry, 1983, EMBO J. 2:1099-1104]가 포함된다. 사용될 기타 마커에는 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여해주는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자[참조: White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18:1062; Spencer et al. 1990, Theor. Appl. Genet. 79:625-631]; 글리포세이트 내성을 암호화하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자[참조: Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6:915-922]; 이미다졸린온 또는 설포닐우레아 내성을 부여해주는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제(ALS) 유전자[참조: Lee et al., 1988, EMBO J. 7:1241-1248]; 아트라진에 대한 내성을 부여해주는 돌연변이체 psbA 유전자[참조: Smeda et al., 1993, Plant Physiol. 103:911-917]; 또는 EP 0 769 059에 기재된 바와 같은 돌연변이체 프로토포르피리노겐 옥시다제 유전자가 포함된다. 형질전환된 세포를 동정하는 것은 또한, 스크리닝 가능한 마커 유전자, 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT), β-글루쿠로니다제(GUS), 루시퍼라제(LUC) 및 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 상기 형질전환된 세포에 표현형적으로 별개인 특성을 부여해주는 기타 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 통하여 수행될 수 있다. WO 93/05163에 기재된 바와 같이, 포스포만노즈 이소머라제 유전자 등의, 포지티브선별을 가져다 주는 선별 마커를 사용하기도 한다. 포지티브 선별을 위해 사용될 기타 유전자는 WO 94/20627에 기재되어 있고, 크실로이소머라제 및 포스포만노-이소머라제, 예를 들면, 만노즈-6-포스페이트 이소머라제 및 만노즈-1-포스페이트 이소머라제; 포스포만노 뮤타제; 만노즈 에피머라제, 예를 들면, 탄수화물을 만노즈로 전환시키거나 만노즈를 탄수화물, 예를 들면, 글루코즈 또는 갈락토즈로 전환시키는 것; 포스파타제, 예를 들면, 만노즈 또는 크실로즈 포스파타제, 만노즈-6-포스파타제 및 만노즈-1-포스파타제; 및 만노즈, 또는 이의 유도체 또는 전구체를 세포 내로 수송하는 것과 관련된 퍼메아제를 암호화한다. 세포에 대한 화합물의 독성을 저하시키는 제제는 전형적으로 글루코즈 유도체, 예를 들면, 메틸-3-O-글루코즈 또는 플로리드진이다. 형질전환된 세포는 집단 내의 형질전환되지 않은 세포에게 손상을 입히거나 이를 사멸시키지 않고 또한 항생제 또는 제초제 내성 유전자를 함께 도입하지 않고서 동정한다. WO 93/05163에 기재된 바와 같이, 항생제 또는 제초제 내성 유전자에 대한 필요성이 제거된 사실 이외에도, 포지티브 선별 방법은 종종, 전통적인 네가티브 선별 방법 보다 훨씬 더 효율적인 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 프로모터는 바람직하게는, (a) 해당 화합물의 대사에 관여하는 단백질을 암호화하는 영역; 및/또는 (b)단백질을 암호화하는 유전자의 활성을 조절해주는 영역[여기서, 상기 화합물은 만노즈 또는 크실로즈, 또는 이들의 유도체 또는 전구체, 또는 단백질의 기질이거나, 또는 형질전환된 세포에 의해 이러한 기질로 대사될 수 있다]을 포함하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 만노즈-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하고, 상기 화합물은 만노즈일 수 있다. 또 다른 한편, 상기 뉴클레오타이드 서열은 포스포슈가-이소머라제, 포스포슈가-뮤타제, 예를 들면, 포스포만노 뮤타제, 포스파타제, 예를 들면, 만노즈-6-포스파타제, 슈가-에피머라제, 슈가 퍼메아제, 포스포슈가-퍼메아제 또는 크실로즈 이소머라제를 암호화할 수 있고, 상기 화합물은 만노즈, 만노즈-6-포스페이트, D-만노즈아민 또는 크실로즈일 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서는, 본 발명의 프로모터가, 포스포만노즈 이소머라제(PMI), 및 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) T-DNA[참조: Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6), 561-573(1982)]로부터 수득된 Nos(노팔린 신세타데) 종결인자를 암호화하는, 이. 콜라이 manA 유전자의 암호화 영역[참조: Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803]에 작동적으로 연결된다. 당업자는 Nos 종결인자가 식물에서 작용하는 기타 모든 종결인자로 대체될 수 있다는 것을 인지한다. 본 발명의 프로모터는 서열 1 내지 6 및 19 내지 20에 제시된, CmpD, CmpC, CmpS, CmpL, CmpB, CmpA, CmpE 또는 CmpF 프로모터, 또는 이들로부터 유도된 모든 프로모터일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 양태에서는, 프로모터가 서열 3에 제시된 CmpS 프로모터이다.

본 발명의 프로모터를 또한 사용하여, 방제하고자 하는 바이러스로부터의 유전자의 암호화 영역에 본 발명의 프로모터를 작동적으로 연결함으로써 바이러스에 대한 내성을 제공해줄 수 있다.

네가티브 쇄 바이러스, 예를 들면, 토마토 반점상 조고증 바이러스(TSWV)의 바이러스 방제를 위해서는, 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 및 운동 단백질(MP) 유전자 서열을 사용할 수 있고, 바이러스의 알파-유사 슈퍼그룹에 속하는 바이러스, 예를 들면, TMV 및 CMV의 경우에는, RNA-의존적 RNA-폴리머라제(RdRp) 및 운동 단백질(MP) 유전자 서열을 사용할 수 있다. 포티바이러스를 포함한, 바이러스의 피코르나-유사 슈퍼그룹에 속하는 바이러스의 경우에는, 어떠한 바이러스 서열도 본 발명의 프로모터에 연결시킬 수 있다. 최종적으로, DNA 바이러스를 포함한 기타 모든 바이러스의 경우에는, RNA-의존적 RNA-폴리머라제(RdRp) 또는 레플리카제-관련 유전자 서열을 사용할 수 있다. 바이러스 방제를 위한 이러한 작제물은 WO 00/68374의 실시예 8 및 실시예 9에 예시된 바와 같이 작제할 수 있다. WO 00/68374에 기재된 프로모터를 본 발명의 프로모터로 대체시키는 것은 당업자에게는 통상적인 기술이다. WO 00/68374의 교시에 따라서, 당업자는 해당 바이러스에게 내성을 부여해주기 위해 전술된 바와 같이 바이러스 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 프로모터를 포함하는 작제물을 제조하는 방법을 인지하고 있다.

WO 00/68374에 기재된 바와 같이, 형질전환된 식물에서 이본쇄 바이러스 RNA를 발현하는 것 대신, 상기 바이러스 RNA를, 예를 들면, 미국 특허 제558302 또는 본 발명의 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 비-해독성 RNA 플러스-센스 바이러스 RNA 분자로서 발현될 수도 있다.

본 발명의 추가의 목적은, 관심있는 연합 뉴클레오타이드 서열에 융합된 본발명의 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다. 이들 벡터에서는, 외래 DNA를 폴리링커 영역 내로 삽입하여, 이들 외인성 서열이, 예를 들면, 세균 또는 식물 기원일 수 있는 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 한다. 예를 들면, 아그로박테륨 투메파시엔스 이원성(binary) 벡터 pBIN19로부터 유도된 플라스미드 pBI101은, 베타-글루쿠로니다제(GUS) 발현 시그날을 사용하여 프로모터의 클로닝과 시험을 허용해준다[참조: Jefferson et al., 1987, EMBO J 6:3901-3907]. 이 벡터의 크기는 12.2kb이다. 이는 낮은 복사수의 RK2 복제 오리진을 가지고 있으며 세균과 식물 모두에게 카나마이신 내성을 부여해준다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 당업자에게 공지된 수 많은 기타 발현 벡터가 있다.

본 발명의 추가의 목적은, 본 발명의 재조합 DNA 서열을 포함하는 형질전환된 식물을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 식물 세포, 이러한 세포로부터 유도된 식물, 식물 재료, 상기 식물로부터 유도된 종자 및 자손, 및 다음에 기재된 형질전환 방법 중의 어느 하나에 의해 수득된 개선된 성질을 지닌 농업 생성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라서 형질전환된 식물은 외떡잎 및 쌍떡잎 식물이고, 이에는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 고구마, 사탕 옥수수, 콩, 완두, 치커리, 상추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 후추, 셀러리, 스쿼시, 호박, 대마, 애호박, 사과, 배, 마르멜로, 메론, 플럼, 체리, 복숭아, 승도 복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 대두, 토마토, 당밀, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 평지씨, 클로버, 담배, 당근, 면, 자주개자리, 감자, 가지, 오이, 아라비도프시스탈리아나, 및 목재 식물, 예를 들면, 침염수 및 활엽수가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 형질전환될 바람직한 식물은 벼, 옥수수, 밀, 보리, 양배추, 콜리플라워, 후추, 스쿼시, 메론, 대두, 토마토, 사탕무, 해바라기 또는 면, 보다 특히 벼, 옥수수, 밀, 소르검 비콜로르, 새발풀, 사탕무 및 대두이다. 본 발명의 재조합 DNA 서열을 수 많은 널리 공지된 방법에 의해 식물 세포에 도입할 수 있다. 당업자는 상기 방법의 선택이 형질전환에 표적이 된 식물의 유형, 즉 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물인지에 따라서 결정될 수 있다는 것을 인지한다. 식물 세포를 형질전환시키는데 적합한 방법에는 미세주사[참조: Crossway et al., 1986, Bio Techniques 4:320-334], 전기천공[참조: Riggs and Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:5602-5606], 아그로박테륨-매개된 형질전환[참조: Hinchee et al., 1988, Bio/Technology 6:915-922; EP 0 853 675], 직접적인 유전자 전달[참조: Paszkowski et al., 1984, EMBO J 3:2717-2722], 및 공급처[Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc.,Wilmington, Delaware]로부터 입수 가능한 장치를 이용한 탄성 입자 가속화[참조: 미국 특허 제4,945,050호; 및 McCabe et al., 1988, Bio/Technology 6:923-926]가 포함된다. 형질전환시키고자 하는 세포는 분화된 잎 세포, 배아 발생성 세포, 또는 기타 모든 유형의 세포일 수 있다. 원형질체를 직접적으로 형질전환시키는데 있어서, 외인성 유전 물질을 원형질체 내로 흡수시키는 것은 화학적 제제 또는 전기장을 사용함으로써 증진시킬 수 있다. 이어서, 상기 외인성 물질을 핵상 게놈 내로 통합시킬 수 있다. 기존의 연구는 쌍떡잎 담배 식물에서 수행하였으며, 이로써 외래 유전자가 자손 식물에 혼입 및 전이되었다[참조: Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2712-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet 199:169-177]. 예를 들면, 트리티쿰 모노코쿰(Triticum monococcum), 롤륨 물티플로룸(Lolium multiflorum)(이탈리아산 독보리), 옥수수 및 블랙 멕시칸(Black Mexian) 사탕 옥수수의 외떡잎 원형질체를 상기 과정에 의해 형질전환시킨다. 부가의 바람직한 양태는 EP 0 292 435 및 EP 0 846 771에 기재된 바와 같은 옥수에 대한 원형질체 형질전환 방법이다. 옥수수 형질전환에 대해서는 또한 다음 문헌[Koziel et al., 1993, Bio/Technology 11:194-200]을 참조할 수 있다. 벼의 형질전환은 원형질체 또는 입자 충격을 이용하는 직접적인 유전자 전달 기술에 의해 수행할 수 있다. 원형질체-매개된 형질전환은 자포니카형(Japonica-type) 및 인디카형(Indica-type)에 대해 기재되어 있다[참조: Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7:379-384; Shimanoto et al., 1989, Nature 338:274-276; Datta et al., 1990, Bio/Technology 8:736-740]. 상기 언급된 두 가지 유형은 또한, 입자 충격을 이용하여 통상적으로 형질전환 가능하다[참조: Christou et al., 1991, Bio/Technology 9:957-962]. EP 0 332 581에는 포이데애(Pooideae) 원형질체의 발생, 형질전환 및 재생 기술이 기재되어 있다. 이들 기술은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀을 포함한 모든 포이데애 식물의 형질전환을 가능케 해준다. 더우기, 밀 형질전환이 EP 0 674 715; 및 문헌[Weeks et al., 1993(Plant Physiol. 102:1077-1084)]에 기재되어 있다. 이와 같이 작제된 식물 발현 벡터는, 예를 들면, 통상적인 식물 형질전환 방법에 따라서 벼의 칼리(calli) 내로 도입할 수 있으며, 이로부터 뿌리와 잎의 분화를 유도시킨 다음, 이를 재배용 화분에 옮김으로써, 형질전환된 벼를 수득할 수 있다.

본 발명의 DNA 서열 또는 벡터로 형질전환시킨 식물은 식물 전반에 걸쳐 대부분의 조직 및 기관에서 관심있는 뉴클레오타이드 서열을 발현할 것이다.

유전 공학적 처리에 의한 상기 언급된 형질전환된 식물의 유전적 특성은 유성 생식 또는 무성 성장에 의해서 유전되므로, 자손 식물에서 유지 및 증식될 수 있다. 일반적으로, 이러한 유지 및 증식으로, 경작, 파종 또는 수확과 같은 특정 목적에 맞도록 개발된 공지된 농작법을 이용할 수 있다. 수경재배 또는 온실 재배와 같은 특수 과정을 적용할 수도 있다. 본 발명에 따르는 형질전환된 식물의 유리한 유전 특성을 이용함으로써, 개선된 특성, 예를 들면, 해충, 제초제 또는 스트레스에 대한 내성, 개선된 영양가, 생산량 증가, 또는 로징(lodging) 또는 샤터링(shattering)로부터의 상실을 덜 유발시키는 개선된 구조를 지닌 식물 개발을 목표로 하는 식물 육종(breeding)을 추가로 이룰 수 있다. 각종 육종 단계는 교배하고자 하는 식물주를 선택하거나, 모 식물주의 수분을 지시하거나 또는 적당한 자손 식물을 선택하는 것과 같이 널리 규정된 사항을 사람이 개입하여 수행하는 것을 특징으로 한다. 목적하는 특성에 따라서, 상이한 육종 측정치를 취한다. 이와 관련된 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 하이브리드화, 동종 번식, 역교배 육종, 다중주 육종, 변종 블렌드, 이종간 하이브리드화, 이수성 기술 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 하이브리드화 기술에는 또한, 기계적, 화학적 또는 생화학적 수단에 의해 웅성 또는 자성 멸균 식물을 수득하기 위해 식물을 멸균시키는 기술이 포함된다. 상이한 주의 화분을 지닌 웅성 멸균 식물의교배 수분 작용으로, 웅성 생식 불능성이지만 자성 수정 가능한 식물의 게놈은 양 부모 주의 특성을 균일하게 획득할 것이다. 따라서, 본 발명에 따르는 형질전환된 식물은 예를 들어, 제초제 또는 살충제 처리와 같은 통상적인 방법의 효능을 증가시키거나 또는 이들의 변형된 유전 특성들로 인해 상기 방법을 필요없게 만들 수 있는 개선된 식물 주의 육종에 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 이들의 최적화된 유전적 "장비"로 인해, 필적하는 해로운 발생 조건에 견딜 수 없었던 생성물 보다 양질의 생성물을 수확할 수 있게 해주는, 개선된 스트레스 내성을 지닌 새로운 농작물을 수득할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 목적하는 유기체에 발현하는데 사용될 수 있는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 이러한 유기체는 세균, 식물, 또는 관심있는 어떠한 유기체일 수 있다.

추가로, 서열 1 내지 6의 기재 내용으로부터 당업자는, 서열 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중의 15개, 바람직하게는 20 내지 30개 이상 염기쌍의 연속된 서열을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 주형으로부터 DNA 단편을 증폭시키기 위한 폴리머라제 연쇄 반응용 올리고뉴클레오타이드를 고안할 수 있게 된다. 상기 뉴클레오타이드는 서열 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 15개, 바람직하게는 20 내지 30개 이상 염기쌍을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 하나 이상을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하고, 이들의 증폭 생성물은 본 발명의 또 다른 양태를 구성한다.

서열 목록 내의 서열에 관한 간단한 설명

서열 1 CmpD

서열 2 CmpC

서열 3 CmpS

서열 4 CmpL

서열 5 CmpB

서열 6 CmpA

서열 7 S1 정방향 프라이머

서열 8 S1 역방향 프라이머

서열 9 GUS 정방향 프라이머

서열 10 GUS 역방향 프라이머

서열 11 CAT 정방향 프라이머

서열 12 CAT 역방향 프라이머

서열 13 Cmp1 정방향 프라이머

서열 14 CmpC2 역방향 프라이머

서열 15 CmpS2 역방향 프라이머

서열 16 CmpL2 역방향 프라이머

서열 17 PA 정방향 프라이머

서열 18 PA 역방향 프라이머

서열 19 CmpE

서열 20 CmpF

서열 21 NOS 종결인자 정방향 프라이머

서열 22 NOS 종결인자 역방향 프라이머

서열 23 TSWV NP 유전자 정방향 프라이머

서열 24 TSWV NP 유전자 역방향 프라이머

서열 25 CmYLCV 프로모터 정방향 프라이머

서열 26 CmYLCV 프로모터 역방향 프라이머

서열 27 AGLINK 다중클로닝 부위

서열 28 BIGLINK 다중클로닝 부위

서열 29 Cmpf-B 프라이머

서열 30 CmpS-B 프라이머

서열 31 pNOV2804; 프로모터 없는 PMI-nos 종결인자 발현 카세트를 함유하는 이원성 벡터

서열 32 pNOV3604; 프로모터 없는 PMI-nos 종결인자 발현 카세트를 함유하는, 바이오리스틱스(biolistics)에 의한 형질전환용 벡터

서열 33 CmpMr 역방향 프라이머

서열 34 CmpMf 정방향 프라이머

서열 35 CmpMrs 역방향 프라이머

서열 36 CmpMfs 정방향 프라이머

서열 37 synGFPI; 인트론을 갖는 식물 최적화 GFP 유전자

서열 38 GIG; 인트론을 갖는 GUS 유전자

서열 39 Cmp-C 역방향 프라이머

서열 40 CmpS-synGFPI-nos 발현 카세트

서열 41 CmpS-GIG-nos 발현 카세트

서열 42 CmpC-synGFPI-nos 발현 카세트

서열 43 CmpC-GIG-nos 발현 카세트

서열 44 pNOV2117 벡터

서열 45 pNOV4200 벡터

서열 46 ZmUbi-GFP-35S term 발현 카세트

서열 47 ZmUbi-GIG-nos 발현 카세트

서열 48 Ubq3(At)-synGFPI-nos 발현 카세트

서열 49 Ubq3(At)-GIG-nos 발현 카세트

본 발명은 식물에서 연합 뉴클레오타이드 서열 전사의 프로모터로서 작용하는 신규한 DNA 서열에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 관심있는 연합 뉴클레오타이드 서열에 지속적(constitutive) 발현을 부여해주는 신규한 프로모터에 관한 것이다.

본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY and Ausubel et al., 1994, "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, New York]에 기재되어 있다.

실시예 1: 바이러스 클로닝

1. DNA 추출

바이러스 게놈 DNA를 세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스-감염된 세스트룸 파르퀴 식물로부터 추출한다. 감염된 잎 5g을 TP10 프로브가 장착된 브린크만 폴리트론(Brinkman Polytron) 균질화기에서 최대 속도로 60초 동안 분쇄용 완충액(0.2M 트리스 pH 7.0, 0.02M EDTA, 2M 우레아) 30ml에서 균질화시킨 다음, 트리톤 X-100(2% 최종 농도)와 함께 4℃에서 밤새 약하게 진탕시킨다. 바이러스를 저속 원심분리(Sorvall SS-34 로터에서 20분 동안 10,000rpm)함으로써 조 균질물로부터 정제시키고, 이와 같이 수득된 상등액으로부터, 슈크로즈 쿠션(15% 슈크로즈 3ml)을 통하여 고속 원심분리(Beckman SW-28 로터 에서 2시간 동안 27,000rpm)함으로써 정제한다. 이어서, 상기 펠릿-함유 바이러스를 0.1M 트리스, pH 7.4, 2.5mM MgCl₂에 재현탁시킨다. DNase I(Sigma) 및 RNase A(Sigma)을 각각 10mg/ml의 농도로 가한다. 37℃에서 30분 후, 10mM가 되도록 EDTA를 가하면서 상기 반응을 중지시킨다. 65℃에서 15분 동안 1% SDS의 존재 하에 프로테아제 K(E. Merck, 0.5mg/ml 최종 농도)로 처리함으로써, 바이러스 DNA를 CmYLCV 입자로부터 분리한다. 이어서, 상기 바이러스 DNA를 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제한다. 최종 에탄올 침전물에서 수득된 바이러스 DNA를 물에 용해시킨다.

2. DNA 증폭 및 클로닝

상기와 같이 수득된 DNA 100나노그램을, 각 프라이머 10μM, 각 dNTP 25mM, pfu 반응 완충액(Stratagene) 5㎕ 및 pfu 터보 DNA 폴리머라제(Stratagene) 2.5단위를 함유하는 50㎕ 반응 용적에서 PCR 증폭용 주형으로서 사용한다. S1 정방향 프라이머(gaccacaaacatcagaag, 서열 7) 및 S2 역방향 프라이머(caaacttattgggtaatc, 서열 8)을 상기 PCR 반응에 사용한다. PCR에 대한 주기 파라이터는 다음과 같다: 1 x (1분간 94℃); 30 x (1분간 94℃, 1분간 50℃, 1분간 72℃); 1 x (10분간 72℃). 각각의 단일 DNA 단편을 제조업자의 지시에 따라서 pPCR-Script™ Amp SK(+) 플라스미드(Stratagene)에서 클로닝한다.

실시예 2: DNA 서열화

제조업자의 지시에 따라서 자동화 ABI PRISM 377 DNA 서열화기(Perkin Elmer) 및 ABI PRISM dRhodamine 종결인자 주기 서열화 키트(Perkin Elmer)를 사용하여, DNA 바이러스 클론의 서열화를 수행한다. 상기 기재된 S1 프라이머와 S2 프라이머(실시예 1) 뿐만 아니라 보편적인 M13 20 및 역방향 프라이머를 당해 서열화 반응에 사용한다.

실시예 3: 일시적인 발현용 플라스미드의 작제

실시예 1에 기재된 바와 같은 Pfu 폴리머라제(Stratagene)를 사용하여 모든 PCR 반응을 수행한다.

1. 리포터 유전자 증폭

베타-글루쿠로니다제(GUS) 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 리포터 유전자를 증폭시킨다. GUS 유전자 증폭의 경우에는, GUS 정방향(cagggtaccactaaaatcacc, 서열 9) 및 GUS 역방향(aggggatccccaattcccc, 서열 10) 올리고뉴클레오타이드를 60℃의 어닐링 온도에서 사용한다. CAT정방향(aggggtaccatcgatatggag, 서열 11) 및 CAT 역방향(ttaggatccgccctgccac, 서열 12) 올리고뉴클레오타이드를 62℃의 어닐링 온도에서 사용한다. 상기 정방향 프라이머는KpnI 인식 부위를 함유하도록 고안되고, 역방향 프라이머는BamHI 부위를 함유하도록 고안된다.

2. CmYLCV 프로모터 증폭

3가지 상이한 프로모터 단편을 선택한다: CmpC(서열 2), CmpS(서열 3) 및 CmpL(서열 4). Cmp1 정방향 프라이머(cttctagacaaagtggcagac, 서열 13)가 52℃의 어닐링 온도에서 상기 3가지 증폭 반응 모두에 사용된다. 이는 XbaI 인식 부위를 함유하도록 본래의 서열로부터 변형된다(진하게 표시됨). CmpC2 역방향 프라이머(ttggtaccttaacaatgaggg, 서열 14)가 CmpC 단편 증폭에 사용되고, CmpS2 역방향 프라이머(ctacttctaggtaccttgctc, 서열 15)는 CmpS 단편의 증폭에 사용된다. 이들 모두는 KpnI 인식 부위를 함유하도록 변형된다. CmpL2 역방향 프라이머(ttggtaccttaacaatgaggg, 서열 16)가 CmpL 단편 증폭에 사용되고, 이는 ClaI 제한 부위를 함유하도록 변형된다.

3. 폴리아데닐화 시그날 증폭

폴리아데닐화 시그날 단편을 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 감염성 클론으로부터 증폭시킨다[참조: Frank et al., Cell 21(1), 285-294, 1980]. PA(폴리아데닐화 시그날 증폭) 정방향(ggggatccccagtctctctc, 서열 17) 및 PA 역방향(gtgaattcgagctcggta, 서열 18) 올리고뉴클레오타이드를 PCR에 사용하고 60℃에서 어닐링시킨다. 상기 정방향 프라이머는 BamHI 인식 부위를 함유하도록 고안되고, 역방향 프라이머는 EcoRI 부위를 함유하도록 고안된다.

4. 생성된 작제물

·pCmpCG(CmpC 프로모터 단편 + GUS 유전자 + 폴리 A)

·pCmpSG(CmpS 프로모터 단편 + GUS 유전자 + 폴리 A)

·pCmpCC(CmpC 프로모터 단편 + CAT 유전자 + 폴리 A)

·pCmpSC(CmpS 프로모터 단편 + CAT 유전자 + 폴리 A)

·pCmpLC(CmpL 프로모터 단편 + CAT 유전자 + 폴리 A)

상기 프로모터 단편, 리포터 유전자 및 폴리아데닐화 시그날을 함유하는 카세트를, XbaI 및 EcoRI로 제한 절단된 pUC19 벡터(Stratagene)에 삽입시킨다.

5. 비교를 위해 사용된 작제물

·pCapG(Cap 프로모터 단편 + GUS 유전자 + 폴리 A)

·pCapSG(CapS 프로모터 단편 + GUS 유전자 + 폴리 A)

·pCapC(Cap 프로모터 단편 + CAT 유전자 + 폴리 A)

이들 작제물에 함유된 프로모터 단편은 CaMV[Franck et al., Cell 21(1), 285-294, 1980; 유전자 뱅크 기탁 번호 V00141 참조]로부터 수득한다. GUS, CAT 및 폴리 A 단편은 CmYLCV 작제물에 사용된 것과 동일하다. Cap는 TATA-박스로부터의 염기 -227에서부터 염기 +33까지의 단편(CaMV 게놈의 염기 7175 내지 염기 7438; 유전자 뱅크 기탁 번호 V00141 참조)에 상응하고, CapS는 TATA-박스로부터의 염기 -227에서부터 염기 +82까지의 단편(CaMV 게놈의 염기 7175 내지 염기 7486; 유전자 뱅크 기탁 번호 V00141 참조)에 상응한다. 이들 위치는 CmYLCV 단편에 대해 선택된 것과 대략적으로 상응한다.

실시예 4: 일시적인 발현 실험

1. 현탁 배양물 및 원형질체 제조

오리코프라그무스 비올라세우스(Orychophragmus violaceus). 현탁 배양물을 100mg/ml 이노시톨, 2% 슈크로즈 및 0.1mg/ml 2,4D를 포함한 40ml의 MS 배지(Murashige and Skoog, Physiol Plant 15, 474-497, 1962)에 유지시킨다. 4일 내지 5일생 배양물로부터 원형질체를 분리시킨다. 세포벽을 26℃에서 1시간 동안 0.1% 펙토리아제 Y23(Seishin Pharmaceutical Co., Japan), 1% 셀룰로즈 오노즈카(Onozuka) R10(Yakult Honsha Co., Japan), 0.4M D-만니톨 및 0.1% MES, pH 5.5에서 분해시킨다. 원형질체를 50㎛ 체를 통하여 여과시키고, 전기천공(EP) 용액(10mM HEPES, 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, 0.2M 만니톨, pH 7.1)으로 2회 세척한다.

니코티아나 플룸바기니폴리아(Nicotiana plumbaginifolia). 식물을 RPM2 배지(참조: Blonstein et al., Mol Gen Genet 211, 252-259, 1988) 플러스 7g/l 박토 아가, pH 5.6 상에서 무균적으로 유지시킨다. 원형질체 제조를 위해, 잎을 절단하고, 이를 0.5% 드리셀라제(Fluka), 0.25mM PVP 10(폴리비닐피롤리돈 MW 10000), 3.85mM CaCl₂, 6mg/l NAA, 2mg/l BAP 및 0.5M 슈크로즈, pH 5.7의 용액에서 26℃ 하에 밤새 항온 배양한다. 원형질체를 100㎛ 체를 통하여 여과시킨다. 슈크로즈 용액(0.6M 슈크로즈, 0.1% MES, 및 15mM CaCl₂, pH 5.7)을, 제1 정제 단계를 위해 상기 원형질체 현탁액에 가하고, 이 현탁액에 W5 용액(150mM NaCl, 125mM CaCl₂, 5mMKCl, 6mM 글루코즈; Menczel et al. Theor Appl Genet 59, 191-195, 1981)을 덮는다. 이어서, 원형질체를 W5 용액으로 1회 세척한 다음, EP 용액으로 최종적으로 세척한다.

오리자 사티바(Oryza sativa). 문헌[참조: Datta et al., 1990, Bio/Technology 8:736-740]에 기재된 바와 같은 오. 사티바 재배 변종 니폰바레(O. sativa cv. Nipponbare)로부터 확립된 형태발생성 벼 현탁 배양물로부터 원형질체를 제조한다.

2. 일시적인 발현 실험

0.66ml EP 완충액에서 2 x 10⁶오리코프라그무스 비올라세우스 원형질체를 전기천공함으로써 형질감염시키는 것은, 원형질체 현탁액을 4mm 간격을 통하여 960μF 콘덴서를 방전함으로써 수행한다. 이 콘덴서를 450볼트로 부하한다. 전기천공을 5 내지 10㎍의 플라스미드 DNA의 존재하에 수행한 다음, 원형질체를 25℃에서 16 내지 24시간 동안 배양한다. 0.3ml 현탁액에서 2 x 10⁶니코티아나 플룸바기니폴리아 원형질체를 형질감염시키는 것은, 0.3ml PEG(40% 폴리에틸렌글리콜 6000) 및 5 내지 10㎍의 플라스미드 DNA의 존재하에 수행한다. 원형질체를 25℃에서 16 내지 24시간 동안 0.4ml K3 배지(참조: Godall et al., Methods Enzyme 181, 148-161, 1990)에서 재배하고, 수확하기 전에 10ml W5 완충액을 가한다.

동결과 해동을 3주기 이상 수행하여 단백질 추출물을 제조하고, 원심분리시킴으로써 청정하게 한다.

실시예 5: CAT 및 GUS 검정

CAT 유전자 발현을 탐지하기 위하여, 제조업자의 지시에 따라서 CAT ELISA 키트(Boehringer)를 사용하여 이중 항체 샌드위치(DAS)-ELISA를 수행한다. Dynex MRXII 장치를 사용하여 CAT 활성을 측정한다. GUS 검정용 샘플을 GUS 완충액(0.05M NaPO₄, pH 7, 0.01M EDTA, 0.1% 트리톤-X-100, 0.1% Sarkosyl)에서 희석시킨다. 이 반응을 37℃에서 등량의 GUS-반응 완충액(100ml/l 10x GUS 완충액, 200mg/l BSA, 705mg/l 4-메틸움벨리페릴-글루쿠로니드)의 존재하에 수행하고, 2M 암메디올을 사용하여 중지시킨다. Titertek Fluoroskan II에서 활성을 측정한다.

CAT 및 GUS 검정 결과 모두를 표준 클론 값으로 표준화시킨다. 10가지 상이한 실험으로부터 수득된 결과는, 각종 CmYLCV 프로모터 단편이 고도로 활성인 프로모터로서 작용한다는 것을 보여준다.

엔. 플룸바기니폴리아(N. plumbaginifolia) 원형질체 일시적인 발현

GUS 리포터 유전자

CmpCG	100
CmpSG	86.9 +/-20%
CapG	9 +/-20%
CapSG	38.9 +/-15%

CAT 리포터 유전자

CmpCC	100
CmpSC	78 /-20%
CapSC	89.5 +/-15%
CmpLC	9 +/-20%

오. 비올라세우스(O. violaceus) 원형질체 일시적인 발현

GUS 리포터 유전자

CmpCG	100
CmpSG	84.6 +/-15%
CapG	9.6 +/-15%
CapSG	40.7 +/-15%

CAT 리포터 유전자

CmpCC	100
CmpSC	255 +/-20%
CapSC	546 +/-15%
CmpLC	10 +/-20%

오. 사티바(O. sativa) 원형질체 일시적인 발현

GUS 리포터 유전자

CmpCG	100
CmpSG	84.6 +/-15%
CapG	9.6 +/-15%
CapSG	40.7 +/-15%

실시예 6: 식물 재생 및 형질전환용 용액 및 배지의 제조

배양 배지 GM, CIM 및 SIM은 문헌[참조: Valvekens et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5536-5540]에 기재된 배지이다.

배양 배지 GM은, 1N KOH를 사용하여 pH를 5.8로 조정시킨, 문헌(Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15:473-497)의 무기염, 1.0mg/l 티아민(스톡 1mg/ml), 0.5mg/l 피리독신 HCl(스톡 1mg/ml), 0.5mg/l 니코틴산(스톡 1mg/ml), 0.5g/l 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 10g/l 슈크로즈, 8g/l 한천을 함유한다.CIM은 B5 배지(참조: Gamborg et al., 1968, Exp. Cell Res. 50:151-158)의 무기염 및 비타민, 0.5g/l 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 20g/l 글루코즈, 0.5mg/l 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)(DMSO 중의 스톡 10mg/ml), 0.05mg/l 키네틴(DMSO 중의 스톡 5mg/ml)을 함유한다(pH 5.8). CIM 고체 배지는 8g/l 한천을 함유한다. SIM은 B5 배지(Gamborg et al., 1968, 상기 참조)의 무기염 및 비타민, 0.5g/l 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 20g/l 글루코즈, 5mg/l N6-(2-이소펜테닐)아데닌(2iP)(DMSO 중의 스톡 20mg/ml), 0.15mg/l 인돌-3-아세트산(IAA)(DMSO 중의 스톡 1.5mg/ml), 8g/l 한천을 함유한다(pH 5.8). SIM V750 K100은 750mg/l 반코마이신과 100mg/l 카나마이신이 보충된 SIM 배지이다. SIM V500 K100은 500mg/l 반코마이신과 100mg/l 카나마이신이 보충된 SIM 배지이다. GM K50은 50mg/l 카나마이신이 보충된 GM 배지이다.

배양 배지를 오토클레이빙(20분, 121℃)함으로써 모두 멸균시킨다. 비타민을 물에 용해시키고, 오토클레이빙하기 전에 이를 배지에 가한다. 호르몬을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시킨다. 항생제를 물에 용해시키고, 여과(0.22㎛)시켜 멸균시킨다. 호르몬과 항생제를 오토클레이빙 후에 가하고, 배지를 65℃로 냉각시킨다. 모든 경우에 있어, 9cm 페트리 디쉬(Falcon, 3003)을 사용하는데, 단 GM 및 GM K50은 통상적으로 15cm 페트리 디쉬(Falcon, 3025)에 따라 붓는다.

고체 배지를 갖는 판을 건조시킨 후, 층류에 활용하여 응축물을 제거시킨다.

실시예 7: 아라비도프시스 균주 및 성장 조건

아라비도프시스 탈리아나 종자 에코타입 콜롬비아(Col-0) 야생형을 다음 공급처[Lehle Seeds, USA, 1102 South Industrial Blvd. Suite D, Round Rock TX 78681, USA]로부터 구입한다. 식물을 모래 4부, 정원 토양 4부 및 아그릴리트(agrilit) 1부의 혼합물에서 화분 내의 16/8 시간 광/암 주기로 22℃에서 생장시킨다.

실시예 8: 아그로박테륨 균주 및 배양물

문헌[참조: Walkerpeach and Velten("Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems". In: Plant Molecular Biology Manual, B1:1-19, 1994, Eds.: S.B. Gelvin, R.A., Schiperoort, Kluvers Acad. Publishers]에 기재된 프로토콜에 따라서 3쌍의 모 교배함으로써, 벡터 플라스미드를 수용체 아그로박테륨 투메파시엔스 균주 LBA4404(Clontech)에 도입한다. 사용된 고정화 균주는 접합 플라스미드 pRK2013을 수반하는 이. 콜라이 HB101이다[참조: Ditta et al., 1980, Broad host range DNA cloning system from Gram-negative bacteria. Construction of gene bank ofRhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7351]. 뿌리 형질전환에 사용된 아그로박테리아를 28℃ 및 200rpm에서 항생제를 사용하지 않고 LB 배지[참조: Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]에서 증식시킨다.

실시예 9: 종자 멸균

종자를 2ml 에펜도르프 튜브에서 1분 동안 70% EtOH/0.05% 트윈 20에 놓아둔다. 70% EtOH/0.05% 트윈 20을 피펫으로 꺼내고, 이를 5% NaOCl/0.05% 트윈 20으로 15분 동안 대체시킨다. 종자를 규칙적으로 진탕시킨다. 용액을 멸균 조건 하에 제거하고, 종자를 멸균 증류수에서 각각 10분 동안 3회 세척한다. 마지막 세척 후, 종자를 0.5 내지 1ml 물에 유지시킨다. 종자를 즉시 사용하거나 4℃에서 2 내지 3주 동안 저장할 수 있다. 멸균 처리된 종자(20-30)를 15cm 페트리 디쉬 내의 GM 배지 상에 겸자로 옮겨놓는다. 묘목을 생장실(22℃, 16/8 광/암 주기) 내에 수직으로 놓여진 판에서 생장시킨다.

실시예 10: 아라비도프시스 탈리아나의 뿌리 외식편의 형질전환

3주생 묘목의 뿌리를 형질전환 과정에 사용한다. 뿌리가 녹색 또는 갈색을 나타내지 않아야 한다. 묘목의 녹색 부분을 작은 칼과 겸자로 제거한다. 나머지 뿌리 부분을 수집하고, 대략 5개의 완전한 뿌리 시스템을 각 판에 고형의 CIM 배지와 함께 놓아둔다. 뿌리를 상기 판의 표면 상에 적절히 가압시켜 배지와 완전히 접촉하게끔 하지만, 이를 한천 내에 침지시키지 말아야 한다. 뿌리를 생장실(22℃, 16/8 광/암 주기)에서 3일 동안 항온 배양한다. 이어서, 뿌리를 액상 CIM 배지로 습윤시킨 여과지가 있는 멸균 페트리 디쉬에 옮기고, 작은 칼을 사용하여 이를 0.5 내지 1cm 조각편으로 절단한다. 이어서, 뿌리 외식편을 10ml의 액상 CIM 배지를 함유하는 50ml 멸균 팔콘 튜브에 옮긴다. 이에, 밤새 배양한 아그로박테륨 배양물(OD 0.6-1) 0.5ml를 가하고, 온화하게 진탕시키면서 1 내지 2분 동안 항온 배양한다. 상기 액체를, 겸자로 유지시킨 멸균 금속 스크린(50메쉬, Sigma, S-0895)을 통하여 상기 튜브에 따라 붓는다. 뿌리는 통상적으로, 이의 가장자리에 근접한 튜브의 벽에 있다. 이어서, 뿌리 외식편을 여과지가 있는 멸균 페트리 디쉬에 옮기고, 간단히 블롯팅 건조시켜 과량의 액체를 제거한다. 뿌리 외식편을 고형 CIM 배지가 있는 판 위에 놓아두고, 어둑한 조명(1.5-2klux) 하에 2일 동안 생장실에서 항온 배양한다. 아그로박테륨을 이용한 과생장에 관한 약간의 흔적이, 공동재배 기간 후에 가시적이어야 한다. 이어서, 뿌리 외식편을, 1000mg/l 반코마이신이 보충된, 20ml의 액상 CIM 배지를 갖는 50ml 멸균 팔콘 튜브에 옮긴다. 이어서, 상기 팔콘 튜브를 온화하게 와동시켜 아그로박테리아를 제거한다. 상기 액체를 상기 언급된 바와 같이 튜브에 따라 붓고, 외식편을 여과지 상에서 간단하게 블롯팅 건조시킨다. 이어서, 외식편을 SIM V750 K100 배지를 함유하는 판에 옮긴다. 뿌리가 상기 배지와 밀접하게 접촉해야 한다. 상기 외식편을 1주 동안 정상적인 조건 하에서 생장실에서 항온 배양한 다음, SIM V500 K100 배지에 옮기고 1주 더 항온 배양한다. 이어서, 반코마이신의 양을 250mg/l로 감소시킨다. SIM 배지 상에서의 재배 3째주 말에 첫 번째 어린 가지(shoot)가 보여야 한다. 0.3 내지 0.5cm 길이이면, 어린 가지를 잘라내고, 어떠한 잔류성 칼루스(callus)도 제거하며, 상기 어린 가지를, GM K50 배지를 함유하는 15cm 판에 옮긴다. 각 판마다 최대 3개의 어린 가지를 놓아둔다. 보다 많은 어린 가지를 획득하기 위해, 나머지 뿌리 외식편을, 125mg/l 반코마이신과 100mg/l 카나마이신이 보충된 신선한 SIM 판에 2주 더 옮겨 놓을 수 있다. 뿌리가 형성된 어린 가지를 토양에 옮겨 종자 세트를 허용한다. 뿌리가 없는 어린 가지는 GM 배지를 함유하는 마겐카 자르(Magenta jar)(1개 자르당 1개씩)에 옮겨 시험관내에서 종자를 생성시킨다.

개개의 형질전환된 식물로부터의 종자를 2주 동안 생장실에서 GM K50 배지상에 발아시킨다. 녹색 잎과 가지가 있는 뿌리 시스템을 형성하는, 표현형적으로 정상적인 카나마이신 내성 묘목을 추가의 분석을 위해 선별한다.

실시예 11: 조직화학적 β-글루쿠로니다제(GUS) 검정

시험관내에서 생장시킨 묘목 또는 토양에서 생장시킨 식물을 GUS 검정에 사용한다. 완전한 묘목 또는 절개된 기관을 GUS 염색 용액 내로 침지시킨다. GUS 염색 용액은 1mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 글루쿠로니드(X-Gluc, Duchefa, DMSO 중의 20mM 스톡), 100mM Na-포스페이트 완충액 pH 7.0, 10mM EDTA pH 8.0 및 0.1% 트리톤 X100을 함유한다. 조직 샘플을 37℃에서 1 내지 16시간 동안 항온 배양한다. 필요한 경우, 샘플을 70% EtOH로 수회 세척하여 엽록소를 제거함으로써 청정하게 할 수 있다.

실시예 12: 담배 형질전환 벡터 pZU627의 작제

제조업자의 지시에 따라서 백금 Pfx DNA 폴리머라제(Life Technologies)를 사용하여 모든 PCR 반응을 수행한다.

1. NOS 종결인자 증폭 및 클로닝

NOS 종결인자 정방향 프라이머(서열 21) 및 NOS 종결인자 역방향 프라이머(서열 22)를 사용하여 pBIN19(Beven et al 1984)로부터 NOS 종결인자를 증폭시킨다. 상기 정방향 프라이머는 PstI 부위를 함유하도록 변형시키고, 역방향 프라이머는 HindIII 부위를 함유하도록 변형시킨다. NOS 종결인자 증폭 생성물을, 플라스미드 pZU400A를 생성시키는 pBluescript(Stratagene)의 동일한 부위에서 PstI/HindIII 단편으로서 클로닝한다.

2. 토마토 반점상 조고증 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(TSWV NP) 유전자 증폭 및 클로닝

비-해독성 TSWV NP 유전자를 수득하기 위하여, 변형된 TSWV NP 유전자 프라이머를 사용하여 TSWV NP 유전자를 증폭시킨다. TSWV NP 유전자 정방향 프라이머에는 BamHI, SphI, 출발 및 정지 코돈이 도입된다(서열 23). 역방향 프라이머는 PstI 부위가 도입되도록 변형된다(서열 24). 증폭 생성물을 NOS 종결인자와 동일한 방향 및 이의 pZU400A 상단부의 BamHI/PstI 부위 내로 BamHI/PstI 단편으로서 클로닝한다. 이로써 생성된 클론 pZU400b에서, 제조업자의 지시에 따라서 T4 DNA 폴리머라제 처리(Life Technologies)를 이용하여, TSWV NP 유전자와 NOS 종결인자 사이의 PstI 부위를 제거한다. 이로써 생성된 클론(pZU400C로 명명됨)으로부터, TSWV NP 유전자 및 NOS 종결인자를, 셔틀 벡터 pZO1560의 SphI/HindIII 부위 내로 SphI/HindIII 단편으로서 클로닝하면, 플라스미드 pZU400이 생성된다. pZO1560은 본래의 다중 클로닝 부위가 AGLINK 다중 클로닝 부위(서열 27)로 대체된 pBluescript 유도체이다.

3. CmYLCV 프로모터 증폭 및 클로닝

CmYLCV 프로모터 정방향 프라이머(서열 25) 및 CmYLCV 프로모터 역방향 프라이머(서열 26)을 사용하여 CmYLCV 바이러스 프로모터를 증폭시킨다. 정방향 프라이머는 SstI 부위를 함유하도록 변형시키고, 역방향 프라이머는 PstI 부위를 함유하도록 변형시킨다. 이와 같이 증폭된 CmYLCV 바이러스 TSWV-N 유전자와 동일한 방향 및 이의 상단부에서, pZU400의 SstI/PstI 부위 내로 SstI/PstI 단편으로서 클로닝한다. 이로써, 비-해독성 TSWV NP RNA를 생성시키는 바이러스 유전자 카세트를 함유하는 클론 pZU625가 생성된다.

4. pVictorHiNK으로의 바이러스 유전자 카세트의 클로닝

상기 바이러스 유전자 카세트를 pZU625로부터 AscI/PacI 단편으로서 pVictorHiNK 벡터 pZU494의 AscI/PacI 부위 내로 클로닝한다. 이로써, 식물 형질전환 벡터 pZU627이 생성된다. pVictorHiNK는 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens)에서 고도로 안정적인 것으로 공지되어 있는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 플라스미드 pVS1로부터 유도된 복제 오리진(ORI)을 포함하는 이원성 벡터이다[참조: Itoh et al., 1984, Plasmid 11:206-220; Itoh and Haas, 1985, Gene 36:37-36]. pVS1 OR1은 아그로박테륨에서만 작용성이고, 이는 3쌍의 모 교배 과정을 통하여, 헬퍼 플라스미드 pRK2013의 도움 하에 이. 콜라이로부터 에이. 투메파시엔스로 이동시킬 수 있다[참조: Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7351].

상기 이원성 벡터는 이. 콜라이에서 작용성이고 pUC19로부터 유도되는 CoIEI 복제 오리진을 또한 포함한다[참조: Yannisch-Perron et al., 1985, Gene 33:103-119].

이. 콜라이 및 에이. 투메파시엔스에서의 유지를 위해, 상기 벡터는 이. 콜라이 및 에이. 투메파시엔스에서 상기 벡터를 유지시키기 위한 선별 마커로서 작용하는 트랜스포손 Tn7[참조: Fling et al., 1985, Nucl. Acid Res. 13:7095]로부터의 0.93kb 유전자에 의해 암호화된, 스펙토마이신 및 스트렙토마이신에 대한 세균성 내성 유전자를 함유한다. 효율적인 세균성 발현을 위해, 상기 유전자를 tac 프로모터에 융합시킨다[참조: Amman et al., 1983, Gene 25:167-178]. 24bp 보더(border) 반복 서열을 포함하는, 각각 1.9kb 및 0.9kb의 우측 및 좌측 T-DNA 보더 단편을 노팔린 유형 에이. 투메파시엔스 균주 pTI137의 Ti-플라스미드로부터 유도시킨다[참조: Yadev et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6322-6326]. 연속해서, M13 유도된 서열을 결실시킴으로써, 상기 보더 사이의 T-DNA 영역을 변형시키고, 이의 클로닝 가변능을 개선시키기 위해, BIGLINK 다중 클로닝 부위(서열 28)을 도입하여 pVictorHiNK를 생성시킨다.

pVictorHiNK는 식물 형질전환 과정 동안 형질전환체를 선별하기 위한 NPTII 유전자 카세트를 함유한다. 이러한 유전자 카세트는 에이. 투메파시엔스로부터 유도된, NOS 프로모터, NPTII 유전자 및 NOS 종결인자를 함유한다.

실시예 13: 식물 형질전환 및 내성에 대한 스크리닝

1. 식물 재료로의 이원성 벡터의 형질전환

이원성 벡터를 식물 재료로 전이시키는 방법은 당업자에게 널리 정립되어 있고 공지되어 있다. 예를 들면, 사용된 아그로박테륨 균주의 차이, 외식편 재료의 상이한 공급원, 의존하고 있는 재생 시스템의 차이 뿐만 아니라 사용된 식물 종으로서의 재배 변종으로 인해 절차상 다양할 수 있다. 이원성 벡터 pZU627이 다음 과정에 따라서 식물 형질전환 실험에 사용된다. pZU627을 수용체 아그로박테륨 투메파시엔스 균주에 3쌍의 모 교배에 의해 전이시킨 다음, 상기 작제물이 상기 수용체 균주에 적당히 전이되었는지를 확인하기 위해 외-접합체를 서던 블롯 분석하고,무균 외식편 재료에 재조합 아그로박테륨 투메파시엔스 균주를 접종하며 함께 배양하고, 적당한 항생제를 사용하여 아그로박테륨 투메파시엔스 균주를 선택적으로 사멸시키며, 카나마이신을 함유하는 선택적 배지 상에서 성장시킴으로써 형질전환된 세포를 선별하고, 모종을 토양에 옮기며, 상기 식물의 분리된 염색체성 DNA를 서던 블롯 분석함으로써 통합된 T-DNA의 고유성을 검정한다.

2. TSWV 감염에 대한 식물의 내성

병원체에 의한 어떠한 감염도 예방하기 위하여, 형질전환된 식물을 표준 검역 조건 하에서 온실에서 생장시킨다. 4잎 단계시, 상기 식물에 TSWV를 기계적 접종함으로써 상기 바이러스로 감염시킨다. TSWV가 식물체 전체에 침투하여 감염된 식물 조직을 빙냉 접종 완충액(1% Na₂SO₃가 보충된 10mM 인산염 완충액) 5 용적에서 연마시키고, 카보런던(carborundum) 분말의 존재 하에, 처음으로 완전히 전개된 새로운 2개 잎을 문지른다. 이와 같이 접종된 식물을 대상으로 하여, 접종 후 3주 동안 징후가 발생되었는지를 모니터한다. pZU627 서열을 함유하는 식물은 TSWV 징후를 나타내지 않은 반면, 형질전환되지 않은 대조군 식물은 접종한지 7일 이내에 심각한 전체 TSWV 징후를 나타낸다. 내성 식물은 자체-수분 작용하고, 종자를 수확한다. 자손 식물을 대상으로 하여, 상기 삽입된 유전자가 격리되었는지를 분석한 다음, 상기 언급된 바와 같이 TSWV 감염에 대한 내성에 대해 재스크리닝한다.

실시예 14: 식물 형질전환을 위한 CmpS-포스포만노즈 이소머라제-nos 작제물의 작제

플랭킹 BamHI 부위를 갖는 CmpS-B(cgc gga tcc tac ttc tag gct act tg, 서열 30) 및 Cmpf-B(cgc gga tcc tgg cag aca aag tgg cag a, 서열 29)를 사용하여, CmpS 프로모터를 PCR 증폭시킨다. 이로써 생성된 PCR 단편을 pBluescript KS(+)의 BamHI 부위 내로 클로닝하여 pNOV4211을 형성한다.

아그로박테륨 투메파시엔스를 통한 형질전환용 이원성 벡터를 생성하기 위해, BamHI를 사용하여 CmpS 프로모터를 pNOV4211로부터 절개하고, 이를 PMI 유전자의 BamHI-분해된 pNOV2804(서열 31) 상단부 내로 삽입하며, 이로써 생성된 벡터는 pNOV2819로 불리운다. pNOV2804(서열 31)는 VS1 복제 오리진, 주쇄 내의 아그로박테륨 virG 유전자의 복사물, 및 T-DNA의 좌측 보더와 우측 보더 사이의 프로모터 없는 PMI-nos 종결인자 발현 카세트를 갖는 이원성 벡터이다. PMI(포스포만노즈 이소머라제)는 이. 콜라이 manA 유전자의 암호화 영역이다[참조: Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803]. nos(노팔린 신타제) 종결인자를 아그로박테륨 투메파시엔스 T-DNA로부터 수득한다[참조: Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1(6), 561-573]. 포스포만노즈 이소머라제 암호화 영역 및 nos 종결인자는 각각 pNOV2804(서열 31)의 nt 290 내지 nt 1465 및 nt 1516 내지 nt 1789에 위치한다.

바이오리스틱 형질전환용 벡터를 생성하기 위해, BamHI를 사용하여 CmpS 프로모터를 pNOV4211로부터 절개하고, 이를 BamHI-분해된 pNOV3604(서열 32) 내로 삽입하여 pNOV2820을 형성함으로써, CmpS 프로모터에 의해 구동된 PMI 발현 카세트를 생성시킨다. pNOV3604는 바이오리스틱 단편을 제조하기 위한 벡터이고, 이는ColEI 복제 오리진 및 앰피실린 내성을 부여해주는 베타-락타마제 유전자를 갖는 pUC19를 주요 골격으로 한 것이다. pNOV2804 처럼, pNOV3604는 또한, 프로모터 없는 PMI-nos 종결인자 발현 카세트(상기 참조)를 함유한다. 포스포만노즈 이소머라제 암호화 영역 및 nos 종결인자는 각각 pNOV3604(서열 32)의 nt 42 내지 nt 1217 및 nt 1268 내지 nt 1541에 위치한다.

이원성 벡터 pNOV2819가 아그로박테륨 투메파시엔스을 통한 형질전환에 사용되고, 벡터 pNOV2820이 바이오리스틱 형질전환에 사용된다.

실시예 15: 식물계에서의 안정적 발현을 위한 CmpC-GUS 플라스미드의 작제

1. 이원성 벡터의 작제

벡터 pCambia 1302[참조: Cambia, Canberra, Australia; Roberts, C.S., Rajagopal, S., Smith, L., Nguyen, T., Yang, W., Nugroho, S., Ravi, K.S. Cao, M.L., Vijayachandra, K., et al., A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulation and efficient trassformation of plants. Presented at the Rockefeller Foundation Meeting of the International Program on Rice Biotechnology, Malacca, Malaysia, September 15-19, 1997]를 선택하고, 이를 본 실험을 위해 변형시킨다: 9788번 위치를 HindIII 엔도뉴클레아제로 분해하고 1번 위치를 NcoI 엔도뉴클레아제로 분해함으로써, GFP 유전자 전방의 CaMV 35S 프로모터를 제거하고, 상기 벡터를 상기 2개의 상용성 말단에 재연결시킨다. 7613번 위치에서 XhoI 엔도뉴클레아제로 분해하고, 9494번 위치에서의 BstXI는 히그로마이신 유전자를 절개하며, CaMV 35S 프로모터를 그 앞에 둔다. 35S 프로모터 서열을 상기 벡터로부터 제거하여, 상동성 매개된 어떠한 유전자 침묵 위험도 배제시킨다.

1' 프로모토[참조: Mengiste et al., Plant J, 1997, 12(4):945-948]에 의해 구동된 바 유전자를 선별 가능한 마커로서 9737번 위치에서 EcoRI 부위에 도입한다. 이로써 수득된 벡터는 pCamBar로 명명된다.

2. 생성된 작제물

실시예 3에 기재된 카세트 CmpCG 및 CapG를 pCamBar 벡터 내에서 9764번 위치의 XbaI 부위와 9737번 위치의 EcoRI 부위 사이에 삽입하여, pCamBarCmpCG 및 pCamBarCapG 플라스미드를 각각 수득한다. 이러한 두 작제물을 사용하여 아그로박테륨 투메파시엔스 세포를 형질전환시킨다.

실시예 16: 아라비도프시스 탈리아나에서의 안정적 발현

1. 식물 생성 및 형질감염

아라비도프시스 탈리아나(콜롬비아 0) wt 종자를 파종하고, 암실에서 4℃ 하에 3일 동안 냉처리하여 동시에 발아되도록 하고, 이를 생장실(22℃/24시간 광선)에 옮긴다. 발아된 식물이 최대 수의 개화안된 봉오리를 맺으면, 이를 침윤시킨다. 이러한 침윤은 문헌[참조: Clough and Bent, Plant J. 16:735-743, 1987]에 기재된 프로토콜에 따라서 수행한다.

2. 형질전환된 식물의 선별

BASTA 제초제(Pluss-Staufer AG/SA)(150mg/l)를 5일마다 3회씩 분무함으로써, T1-세대 종자로부터 수득된 묘목을 선별한다. 선별 후, 20개의 pCamBarCmpCG 내성 식물과 9개의 pCamBarCapG 내성 식물을 수집한다. 이들을 기재된 조건 하에서 생장시켜 T2-세대 종자를 수득한다. 이들 종자는 상기 wt에 대해 기재된 바와 동일한 과정을 진행하므로, T2 묘목을 BASTA 분무함으로써 선별하고, 내성 돌연변이체를 대상으로 하여, GUS-유전자 발현에 대해 분석한다.

3. 안정적으로 형질전환된 아라비도프시스 식물에서의 조직화학적 GUS 발현

조직화학적 GUS 염색을 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행한다. 이 분석은 형질전환된 묘목을 X-gluc 용액에 침지시키고, 130mBar 압력을 10분 동안 가한 다음, 37℃에서 밤새 항온 배양함으로써 15ml 배양 튜브 내에서 수행한다. pCamBarCmpCG로 형질전환시킨 아라비도프시스 식물로부터 수득된 결과는, 모든 무성 기관 내에서 CmpC 프로모터에 의해 구동된 GUS 리포터 유전자의 지속적 발현을 지시해준다.

4. 안정적으로 형질전환된 아라비도프시스 식물에서 정량적 효소 GUS 검정

A. 샘플 제조

형질전환된 주당 4개의 식물, 및 이들 식물 1개당 1개의 잎을 시험용으로 선별한다. 4개 잎을 동일한 에펜도르프 튜브 내에 수집하고, 액체 질소로 동결시킨 다음, 1회용 연마기로 연마하여 미세한 분말로 만든다. 이를 150㎕ GUS 완충액(0.05M NaPO₄, pH 7, 0.01M EDTA, 0.1% 트리톤-X-100, 0.1% Sarkosyl)에서 희석시키고, 37℃에서 5분 동안 항온 배양한 다음, 미세원심분리기에서 5분 동안 최대 속도로 방사시킨다. 이 상등액을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고, 이들 샘플을 효소 시험에 사용한다. 표준물로서 BSA를 사용하여 브래드포드 방법[참조:Bradford, M.M. Anal. Biochem. 72:248-254, 1976]에 따라서, 이들 식물 추출물 내의 단백질을 평가한다. 주형으로서 상기 추출된 샘플을 사용하여 PCR 분석함으로써, 상기 돌연변이체 주 내에 해당 프로모터와 GUS 유전자가 존재하는지를 확인한다.

B. 형광측정 GUS 검정

형광측정 GUS 검정을 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행한다. GUS 유전자를 탐지하기 위하여, 발현 샘플을 GUS 완충액에 희석시킨다. 이 반응을 37℃에서 등량의 GUS-반응 완충액의 존재 하에 수행하고, 2M 암메디올을 이용하여 중지시킨다. Titertek Fluoroskan II에서 활성을 측정한다.

pCamBarCmpCG로 형질전환된 20개의 선별된 주 중에서 15개 및 pCamBarCapG로 형질전환된 9개 주 중에서 8개는 잎에서 GUS 효소적 활성을 나타낸다. 몇몇 CmpCG 형질전환된 주에서의 활성 수준은 CapG에 필적한다. 그러나, 이들의 유전형(유전자좌의 수 및 유전자좌당 형질전환 삽입물의 수) 차이로 인해 상이한 형질전환된 주 마다 결과는 다양할 수 있다.

실시예 17: CmpC 프로모터 변이체의 작제

모든 PCR 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 Pfu 폴리머라제(Stratagene)을 이용하여 수행한다.

1. DNA 증폭 및 클로닝

pCmpCG 플라스미드(실시예 3)의 2가지 변이체인 pCmpMG 및 pCmpMsG를 생성시킨다. 전자는 CmpC 프로모터 내에 서열 "GTGGTCCC"가 결실되어 있고, 후자는 이를서열 "GTGCTCGC"로 돌연변이시킨다.

pCmpMG를 수득하기 위해, 3가지 PCR 생성물을 증폭시킨다:

CmpM1주형으로서 pCmpCG 플라스미드를 사용하고 Cmp1 정방향 프라이머(실시예 3 참조, 서열 13) 및 CmpMr 역방향 프라이머(CCATCGTGGTATTTGGTATTG, 서열 33)을 사용한다.

CmpM2주형으로서 pCmpCG 플라스미드를 사용하고 CmpMf 정방향 프라이머(CAATACCAAATACCACGATGG, 실시예 34) 및 CmpC2 역방향 프라이머(실시예 3 참조, 서열 14)을 사용한다.

CmpM주형으로서 CmpM1 및 CmpM2 PCR 생성물의 등몰량 혼합물을 사용하고 Cmp1 정방향 프라이머 및 CmpC2 역방향 프라이머를 사용한다.

pCmpMsG를 수득하기 위해, 3가지 PCR 생성물을 증폭시킨다:

CmpMs1주형으로서 pCmpCG 플라스미드를 사용하고 Cmp1 정방향 프라이머 및 CmpMrs 역방향 프라이머(CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT, 서열 35)를 사용한다.

CmpMs2주형으로서 pCmpCG 플라스미드를 사용하고 CmpMfs 정방향 프라이머(AAGTGCTCGCTACCACGATGG, 실시예 36) 및 Cmp2 역방향 프라이머를 사용한다.

CmpsM주형으로서 CmpMs1 및 CmpMs2 PCR 생성물의 등몰량 혼합물을 사용하고 Cmp1 정방향 프라이머 및 Cmp2 역방향 프라이머를 사용한다.

pCmpMG 및 pCmpMsG 플라스미드를 수득하기 위해, 본래의 pCmpCG 플라스미드를 XbaI 및 BamHI 엔도뉴클레아제로 제한 절단하여 CmpC 단편을 제거하고, 이것 대신 CmpM 및 CmpMs PCR 생성물을 삽입한다.

실시예 18: pCmpM 및 pCmpMs 작제물을 이용한 일시적인 발현 실험

1. 현탁 배양물 및 원형질체 제조

현탁 배양물 및 원형질체를 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조한다.

2. GUS 검정

형질감염 및 단백질 추출물 제조를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하고, GUS 검정을 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행한다.

GUS 검정 결과는 10가지 상이한 실험치를 평균내고 이를 표준 클론 값으로 표준화시킴으로써 수득한다. CmpCG 작제물 내에 "GTGGTCCC" 서열이 결실되면, GUS 리포터 유전자의 발현이 모든 원형질체 종(다음 참조)에서 CmpC로부터의 GUS 리포터 유전자 발현의 약 50%로 감소된다. "GTGCTCGC" 돌연변이에 의해 유도된 효과는 식물 종에 좌우된다. 오. 비올라세우스 및 오. 사티바 원형질체에서는, GUS 유전자 발현 수준이 각각 65.2% 및 73.6%로 저하되었다. 엔. 플룸바기니폴리아 원형질체에서는, CmpMs 프로모터 활성이 CmpM 프로모터와 유사하다.

엔. 플룸바기니폴리아

CmpCG	100
CmpMG	52 +/-12%
CmpMsG	53.7 +/-16%
CapG	28.3 +/-14%

오. 비올라세우스

CmpCG	100
CmpMG	55.2 +/-12%
CmpMsG	73.6 +/-10%
CapG	5 +/-1%

오. 사티바

CmpCG	100
CmpMG	59.6 +/-21%
CmpMsG	65.2 +/-20%
CapG	42.5 +/-16%

실시예 19: GFP 또는 GUS 리포터 유전자에 작동적으로 연결된 5'-프로모터 단편을 함유하는 식물 형질전환 벡터의 작제

1. 프로모터 증폭 및 클로닝

인트론을 갖는 식물 최적화된 GFP(synGFPI, 서열 37) 또는 인트론을 갖는 GUS 리포터 유전자(GIG; 서열 38) 서열과 융합된 CmYLCV 완전한 길이의 전사체 프로모터(서열 1)로부터의 DNA 서열을 포함하는 키메릭 유전자를 작제한다. 상기 GIG 유전자는 서열 38의 nt 385에서 nt 576에 솔라눔 튜베로숨(Solanum tuberosum)로부터의 ST-LS1 인트론을 함유한다[공급처: Dr. Stanton Gelvin, Purdue University; 문헌(Narasimhulu et al., 1996, Plant Cell, 8:873-886)에 기재되어 있다]. synGFPI는 ST-LS1 인트론이 도입된 식물 최적화된 GFP 유전자이다(서열 37의 nt 278 내지 nt 465). 프로모터에 대해서는, CmYLCV 게놈 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 대한 주형으로서 사용한다. 유전자 특이적 프라이머를 고안하여 DNA 서열을 증폭시킨다. Cmpf-B 정방향 프라이머(서열 29)를 역방향 프라이머로서5'에서 3' 프라이머 CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG(서열 39)와 함께 사용하여, CmpC(서열 2)에 상응하는 유전자 단편을 분리시킨다. Cmpf-B 정방향 프라이머(서열 29)를 CmpS-B 역방향 프라이머(서열 30)와 함께 사용하여, CmpS(서열 3)에 상응하는 유전자 단편을 분리시킨다. 3가지 프라이머 모두는 이들의 5' 말단에 BamHI 제한 효소 인식 부위 CGCGGA를 함유한다. 모든 PCR 반응을 제조업자의 권장 사항(Stratagene)에 따라서 Pfu 폴리머라제로 수행한다. 열순환기(DNA Engine, MJResearch, Inc., Waltham, MA USA)를 사용하여, 다음 PCR 조건에 따라서 상기 프로모터 단편을 증폭시킨다: [(94℃:10s):(94℃:10s/56℃:30s/72℃:1분)X20]:(72℃:1.5분)]. BamHI로 제한 분해한 후, 상기 프로모터 단편을, GIG 유전자 또는 synGFPI 유전자를 갖는 pUC계 벡터에 연결하여, nos 종결인자에 작동적으로 연결된 프로모터-리포터 유전자 융합물을 생성시킨다.

2. 생성된 프로모터-리포터 카세트

·CmpS 프로모터 단편 + synGFPI 유전자 + nos(서열 40)

·CmpS 프로모터 단편 + GIG 유전자 + nos(서열 41)

·CmpC 프로모터 단편 + synGFPI 유전자 + nos(서열 42)

·CmpC 프로모터 단편 + GIG 유전자 + nos(서열 43)

서열 번호	프로모터	유전자(synGFPI 또는 GIG)	종결인자
40	nt 1 내지 nt 402	nt 411 내지 nt 1331	nt 1343 내지 nt 1618
41	nt 1 내지 nt 405	nt 425 내지 nt 2425	nt 2479 내지 nt 2751
42	nt 1 내지 nt 354	nt 380 내지 nt 1292	nt 1304 내지 nt 1577
43	nt 1 내지 nt 354	nt 399 내지 nt 2399	nt 2453 내지 nt 2725

3. 아그로박테륨 이원성 벡터 내로의 아클로닝

상기 프로모터 단편, 리포터 유전자 및 nos 종결인자를 함유하는 프로모터-리포터 카세트(서열 40 내지 43)를, 옥수수 형질전환을 위한 이원성 벡터 pNOV2117 및 토마토 형질전환을 위한 이원성 벡터 pNOV4200에 삽입한다. pNOV2117(서열 44)은 VS1 복제 오리진, 주쇄 내의 아그로박테륨 virG 유전자의 복사물, 및 T-DNA의 좌측 보더와 우측 보더 사이의 마이즈 우비퀴틴(Maize Ubiquitin) 프로모터-PMI 유전자-nos 종결인자 발현 카세트를 갖는 이원성 벡터이다. PMI(포스포만노즈 이소머라제)는 이. 콜라이 manA 유전자의 암호화 영역이다[참조: Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803]. nos(노팔린 신타제) 종결인자를 아그로박테륨 투메파시엔스 T-DNA로부터 수득한다[참조: Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1(6), 561-573]. 상기 마이즈 우비퀴틴 프로모터, 포스포만노즈 이소머라제 암호화 영역 및 nos 종결인자는 각각 pNOV2117(서열 44)의 nt 31 내지 nt 2012, nt 2109 내지 nt 3212 및 nt 3273 내지 nt 3521에 위치한다. 상기 리포터-프로모터 카세트는 우측 보더에 가장 근접하게 삽입한다. 상기 이원성 벡터 내의 선별 가능한 마커 발현 카세트는 좌측 보더에 가장 근접해 있다.

토마토 형질전환을 위해, pNOV4200(서열 45)이 VS1 복제 오리진, 주쇄 내의 아그로박테륨 virG 유전자의 복사물, 및 좌측 보더와 우측 보더 사이의 하이그로마이신 선별 가능한 마커 카세트를 함유하는 이원성 벡터로서 사용된다. 하이그로마이신 선별 가능한 마커 카세트는 하이그로마이신 내성을 암호화하는 유전자[본원에서 "HYG"로 명명됨, 이. 콜라이로부터의 합성 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자; JP 1986085192-A 1 30-APR-1986 참조] 및 nos 종결인자[참조: Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1(6), 561-573]에 작동적으로 연결된 아라비도프시스 우비퀴틴 3 프로모터[Ubq3(At); Callis et al., J. Biol. Chem. 265:12486-12493(1990) 참조]를 포함한다. 상기 아라비도프시스 우비퀴틴 프로모터, HYG 유전자 및 nos 종결인자는 각각 pNOV4200(서열 45)의 nt 162 내지 nt 11494, nt 1897 내지 nt 2939 및 nt 2939 내지 nt 3236에 위치한다. 상기 리포터-프로모터 카세트(서열 40 내지 43)는 우측 보더에 가장 근접하게 삽입한다. 상기 이원성 벡터 내의 선별 가능한 마커 발현 카세트는 좌측 보더에 가장 근접해 있다.

이원성 벡터 작제물 내의 선별 가능한 마커 및 프로모터-리포터 카세트의 배향이 다음에 제시되어 있다.

4. 이원성 벡터 작제물:

·NOV4215(RB CmpS 프로모터 단편 + synGFPI 유전자 + nos - ZmUbi + PMI 유전자 + nos LB)

·NOV4216(RB nos + synGFPI 유전자 + CmpS 프로모터 단편 - ZmUbi + PMI 유전자 + nos LB)

·NOV4217(RB CmpS 프로모터 단편 + synGFPI 유전자 + nos - Ubq3(At) + HYG 유전자 + nos LB)

·NOV4220(RB CmpS 프로모터 단편 + GIG 유전자 + nos - Ubq3(At) + HYG 유전자 + nos LB)

·NOV4224(RB CmpC 프로모터 단편 + GIG 유전자 + nos - ZmUbi + HYG 유전자 + nos LB)

·NOV4226(RB CmpC 프로모터 단편 + synGFPI 유전자 + nos - ZmUbi + PMI 유전자 + nos LB)

비교용으로 사용될 공지된 프로모터를 이용하여, 부가의 카세트를 작제한다. 이를 위하여, synGFP 및 35S 종결인자(35S term)에 작동적으로 연결된 마이즈 우비퀴틴 프로모터[참조: Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12:619-632(1989)]를 포함하는 프로모터 카세트 ZmUbi-GFP-35S term(서열 46)을 작제하고, GIG 유전자 및 nos 종결인자에 작동적으로 연결된 마이즈 우비퀴틴 프로모터를 포함하는 프로모터 카세트(NOV 3612, 서열 47)를 또한 작제한다. 상기 ZmUbi 프로모터, GFP 유전자 및 35S 종결인자는 각각 서열 46의 nt 1 내지 nt 2019, nt 2020 내지 nt 2751 및 nt 2876 내지 nt 2949에 위치한다. 상기 ZmUbi 프로모터, GIG 유전자 및 nos 종결인자는 각각 서열 47의 nt 1 내지 nt 1982, nt 2015 내지 nt 4015 및 nt 4069 내지 nt 4341에 위치한다. ZmUbi-GIG nos 카세트(서열 47)을 pUC계 벡터 내로 클로닝한다. ZmUbi-GFP nos 카세트(서열 46)을 상기 언급된 바와 같이, 옥수수 형질전환용 pNOV2117 이원성 벡터 내로 클로닝한다. synGFPI 및 nos 종결인자에 작동적으로 연결된 아라비도프시스 우비퀴틴 3 프로모터(Ubq3(At))를 포함하는 프로모터 카세트(서열 48), 및 GIG 유전자 및 nos 종결인자에 작동적으로 연결된 아라비도프시스 우비퀴틴 3 프로모터를 포함하는 프로모터 카세트(서열 49)를 작제한다. 상기 우비퀴틴 3 프로모터, synGFPI 및 nos 종결인자는 각각 서열 48의 nt 1 내지 nt 1332, nt 1738 내지 nt 2658 및 nt 2670 내지 nt 2943에 위치한다. 상기 우비퀴틴 3 프로모터, GIG 유전자 및 nos 종결인자는 각각 서열 49의 nt 1 내지 nt 1335, nt 1746 내지 nt 3746 및 nt 3800 내지 nt 4072에 위치한다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 프로모터 카세트를 토마토 형질전환을 위해 하이그로마이신 선별 가능한 마커 카세트를 함유하는 pNOV4200 이원성 벡터 내로 클로닝시킨다. 이러한 이원성 벡터 작제물 내의 상기 선별 가능한 마커 및 프로모터-리포터 카세트의 배향이 다음에 제시되어 있다.

5. 이원성 벡터 작제물:

·NOV2110(RB ZmUbi 프로모터 + synGFP 유전자 + 35S term - ZmUbi + PMI 유전자 + nos LB)

·NOV4209(RB Ubq3(At) 프로모터 + synGFPI 유전자 + nos - Ubq3(At) + HYG 유전자 + nos LB)

·NOV4208(RB Ubq3(At) 프로모터 + GUS-인트론-GUS 유전자 + nos - Ubq3(At) + HYG 유전자 + nos LB)

실시예 20: 옥수수의 아그로박테륨-매개된 형질전환

미숙한 옥수수 배아의 형질전환을 본질적으로 문헌[참조: Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803]에 기재된 바와 같이 수행한다. 본 실시예의 경우, 모든 배지 구성분이 상기 문헌에 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌에 기재된 각종 배지 구성분을 대체할 수도 있다.

1. 형질전환 플라스미드 및 선별 가능한 마커

형질전환에 사용된 유전자를 실시예 19에 기재된 바와 같이 옥수수 형질전환에 적합한 벡터 내로 클로닝한다. 사용된 벡터는 포스포만노즈 이소머라제(PMI) 유전자를 함유한다[참조: Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803].

2. 아그로박테륨 투메파시엔스의 제조

식물 형질전환 플라스미드를 함유하는 아그로박테륨 균주 LBA4404(pSB1)를 28℃에서 2 내지 4일 동안 YEP[효모 추출물(5g/l), 펩톤(10g/l), NaCl(5g/l), 15g/l 한천, pH 6.8] 고체 배지 상에서 성장시킨다. 대략 0.8 X 10⁹아그로박테리아를, 100μM 아세토시린곤(As)이 보충된 LS-inf 배지에 현탁시킨다[참조: Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep 19:798-803]. 세균을 상기 배지에서 30 내지 60분 동안 예비-유도시킨다.

3. 접종

A188로부터의 미숙한 배아 또는 기타 적합한 옥수수 유전형을 8 내지 12일생 옥수수 열매로부터 절개하여 액상 LS-inf + 100μM As에 놓아둔다. 배아를 신선한 감염 배지로 1회 세정한다. 이어서, 아그로박테륨 용액을 가하고, 배아를 30초 동안 와동시킨 다음, 상기 세균을 5분 동안 침강시켜 둔다. 이어서, 상기 배아를 LSAs 배지 내로 배반면을 들어 옮기고, 암실에서 2 내지 3일 동안 배양한다. 연속해서, 페트리 판당 20 내지 25개 배아를, 세포탁심(250mg/l) 및 질산은(1.6mg/l)이보충된 LSDc 배지에 옮기고, 28℃하 암실에서 10일 동안 배양한다.

4. 형질전환된 세포의 선별 및 형질전환된 식물의 재생

배아발생 칼루스를 생성하는 미숙한 배아를 LSD1M0.5S 배지에 옮긴다. 3주째 계대배양 단계를 이용하여 6주 동안 상기 배지에서 당해 배양물을 선별한다. 살아있는 칼루스를, 증대시키고자 하는 LSD1M0.5S 배지 또는 Reg1 배지에 옮긴다. 광선(16시간 광선/8시간 암실 방식) 하에 배양한 후, 녹색 조직을 성장 조절인자가 없는 Reg2 배지에 옮긴 다음, 1 내지 2주 동안 항온 배양한다. Reg3 배지를 함유하는 마겐타 GA-7 박스(Magenta Corp, Chicago III)에 모종을 옮기고 광선 하에 생장시킨다. 프로모터-리포터 카세트에 대해 PCR 포지티브인 식물을 토양에 옮기고 온실에서 생장시킨다.

실시예 21: 토마토의 안정한 형질전환

토마토의 형질전환을 본질적으로 문헌[참조: Meissner et al., The Plant Journal 12:1465-1472, 1997]에 기재된 바와 같이 수행한다.

1. 형질전환 플라스미드 및 선별 가능한 마커

형질전환에 사용된 유전자를 실시예 19에 기재된 바와 같이 토마토 형질전환에 적합한 이원성 벡터 내로 클로닝한다. 벡터는 선별용 하이그로마이신 내성 유전자를 함유한다.

2. 아그로박테륨 투메파시엔스의 제조

식물 형질전환 플라스미드를 함유하는 아그로박테륨 균주 GV3101를 22℃에서 2일 동안 LB[효모 추출물(5g/l), 펩톤(10g/l), NaCl(5g/l), 15g/l 한천, pH 6.8]액체 배지 상에서 성장시킨다. 대략 0.8 X 10⁹아그로박테리아를, 100μM 아세토시린곤이 보충된 KCMS 접종 배지[MS 염(4.3g/l), 미오-이노시톨, 티아민(1.3㎍/ml), 2,4-D(0.2㎍/ml), 키네틴 0.1㎍/ml 및 3% 슈크로즈, pH 5.5]에 현탁시킨다. 세균을 상기 배지에서 60분 동안 예비-유도시킨다.

3. 종자 멸균 및 발아

토마토의 Micro-Tom 재배 변종 종자[참조: Meissner et al., The Plant Journal 12:1465-1472, 1997] 및 ZTV-840 재배 변종을 20분 동안 트윈을 함유한 20% 표백 용액에 침지시킨다. 이어서, 종자를 멸균수로 3회 세척하고, 발아를 위해 마겐타 박스(Magenta Corp, Chicago III) 내의 TSG 배지[1/2 MS 염, 1% 슈크로즈, 1% 피토아가, pH 5.8] 상에 도말한다. 발아한지 7 내지 10일 후에, 떡잎을 절개하고 떡잎 잎꼭지를 5mm 절편으로 절단한다.

4. 접종

아그로박테륨을 접종하기에 앞서, 7일 내지 10일생 떡잎 및 떡잎 잎꼭지 절편을 담배 BY-2 공급인자 세포판(MS 염, 미오-이노시톨 0.1mg/ml, 카세인 가수분해물 0.2mg/ml, 티아민-HCl 1.3㎍/ml, 3% 슈크로즈, pH 5.5) 상에서 24시간 동안 항온 배양한다.

떡잎을 액체 KCMS 아그로박테륨 현탁액 내로 5분 동안 침지시킨다. 이어서, 20 내지 25개 떡잎을 동일한 공급인자 세포판 위로 축에서 떨어지게 옮긴 다음, 암실에서 2 내지 3일 동안 배양한다.

5. 형질전환된 떡잎 및 잎꼭지의 선별 및 형질전환된 식물의 재생

광선 하에 아그로박테륨을 접종한지 2 내지 3일 후에, 떡잎 및 잎꼭지 단편을 선별용 배지 TSM-1[4.3g/l MS 염, 1X B5 비타민, 2% 슈크로즈, 1% 글루코즈, 1㎍/ml 제아틴, 0.05㎍/ml IAA, 5㎍/ml하이그로마이신 및 250㎍/ml 카베니실린, pH 5.8] 상으로 옮긴다. 배아발생성 칼루스를 생성하는 떡잎 및 잎꼭지 절편을 TSM-2 배지[4.3g/l MS 염, 1X MS 비타민, 2% 슈크로즈, 1㎍/ml 제아틴, 5㎍/ml하이그로마이신 및 250㎍/ml 카베니실린, pH 5.8]에 옮긴다. 모종을 형성하는 살아있는 칼루스를 TRM 배지[4.3g/l MS 염, 1X MS 비타민, 2% 슈크로즈, pH 5.8]를 함유하는 마겐타 GA-7 박스(Magenta Corp, Chicago III)에 옮기고, 광선하에 생장시킨다. 뿌리 형성 후, 1차 형질전환체를 토양에 옮긴다.

실시예 22: 녹색 형광 단백질(GFP) 형광측정 검정

synGFP 유전자 발현을 탐지하기 위해, 형광측정 검정을 수행한다. 안정적으로 형질전환된 옥수수 및 토마토의 잎 디스크를 드라이 아이스 상에서 동결시킨다. 동결된 조직을 철저히 연마하고, 300㎕의 GFP 추출용 완충액[10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 1mM MgCl₂, 10mM DTT 및 0.1% 사르코실]과 혼합한다. 이 추출물을 원심분리시켜 상기 잎 부스러기로부터 분리시킨 다음, 청정한 바닥을 지닌 96웰 블랙 판(Costar 3615)에 옮긴다. 465nm 여기 및 512nm 방출에서 스펙트라 플루오르 플러스 판 판독기로 상대적 형광 단위(RFU)를 측정한다. BCA 검정(Pierce에 따름)을 사용하여 측정된 총 단백질에 대해 GFP 활성을 표준화시킨다.

실시예 23: 안정적으로 형질전환된 옥수수 및 토마토 식물의 발현 분석

1. 제아 마이스( Zea mays ) 형질전환된 To 식물

ZmUbi 프로모터(NOV2110)와 비교해서 CmpS 프로모터(NOV4215, NOV4216)의 조절 하에서의 GFP 발현도가 10 내지 20배 더 높다. 이들 결과는 총 93개 To 식물을 나타내는 42개의 독립적인 To 주의 잎 샘플로부터 수득된 것이다.

2. GFP 엘리자(Elisa) 검정

녹색 형광 단백질(GFP)을 탐지하기 위해, 정량적인 샌드위치 면역검정을 수행한다. 2개의 시판용 폴리클로날 항체를 사용한다. 고우트(goat) 항-GFP IAP(Rochland, #600-1-1-215)를 면역친화성으로 정제하고, 래빗트 항-GFP 항체(Torrey Pines Biolabs, #TP401)를 단백질 A로 정제한다. 상기 식물 추출물 내의 GFP 단백질을 래빗트 항체에 의해 고체상 미세역가측정기 상으로 포획한다. 이어서, 웰 내에 있는 상기 고체상 래빗트 항체, GFP 단백질 및 2차 고우트 항체 사이에 "샌드위치"가 형성된다. 세척 단계 후, 결합되지 않은 2차 항체가 제거된 경우에는, 알칼린 포스파타제-표지된 항체를 사용하여, 결합된 항체를 탐지한다. 효소에 대한 기질을 가하고, 각 웰에서의 흡광도를 판독함으로써 색 발생을 측정한다. 이어서, 상기 판독치를 표준 곡선에 고정시켜 GFP 농도 대 흡광도를 플롯팅한다.

synGFP 리포터 유전자

이원성 벡터 카세트	GFP 활성(평균)RFU/mf 단백질	엘리자(평균)ng GFP/mg 단백질
NOV4215(CmpS)	4722.3	657.1
NOV4216(CmpS)	2795.8	246.1
NOV2110(ZmUbi)	272.0	41.4

2. 리코페르시콘 에스쿨렌툼( Lycopersicon esculentum ) To 식물

CmYLCV 프로모터(NOV4217)의 CmpS 단편은 아라비도프시스의 Ubq3 프로모터(NOV4209)의 발현 수준 보다 상당히 더 높은 synGFP 발현 수준을 가져다 준다.

synGFP 리포터 유전자

NOV4217 카세트로 형질전환된 5개의 독립적인 안정적으로 형질전환된 칼루스 주 및 NOV4209 카세트로 형질전환된 2개의 독립적인 안정적으로 형질전환된 칼루스 주의 1차적인 어린 가지 및 칼루스에서 현미경으로 조사함으로써 synGFP 형광 강도를 평가하여 본 결과를 수득한다.

이원성 벡터 카세트(프로모터)	칼루스 ID	GFP 형광 강도
NOV4217(CmpS)	NOV4217-1	+++++
NOV4217(CmpS)	NOV4217-2	++++
NOV4217(CmpS)	NOV4217-3	++++
NOV4217(CmpS)	NOV4217-4	+++
NOV4217(CmpS)	NOV4217-5	+++
NOV4209(Ubq3(At))	NOV4209-1	+
NOV4209(Ubq3(At))	NOV4209-2	+

GUS-인트론-GUS 리포터 유전자

CmpS 프로모터-리포터 카세트을 함유하는 11개의 독립적인 안정적으로 형질전환된 칼루스(주 NOV4220-1 내지 NOV4220-11)에서 GUS 염색 강도를 평가하여 본 결과를 수득한다. CmYLCV 프로모터의 CmpC 프로모터 단편을 함유하는 2개의 안정적으로 형질전환된 칼루스 주(NOV4224-1, NOV4224-2)를 평가한다. 비교를 위해,아라비도프시스 우비퀴틴 3(Ubq3) 프로모터를 함유하는 2개의 안정적으로 형질전환된 칼루스 주(NOV4208-1, NOV4208-2)를 평가한다.

이원성 벡터 카세트(프로모터)	칼루스 ID	GUS 염색
NOV4220(CmpS)	NOV4220-1	++++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-2	+++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-3	++++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-4	+++++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-5	+++++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-6	+++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-7	++++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-8	+++++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-9	++++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-10	+++
NOV4220(CmpS)	NOV4220-11	++++
NOV4224(CmpC)	NOV4224-1	++++
NOV4224(CmpC)	NOV4224-2	+++
NOV4208(Ubq3(At))	NOV4208-1	+
NOV4208(Ubq3(At))	NOV4208-2	++

실시예 24: 옥수수에서 일시적인 발현 실험

1. 배아 제조

A188로부터의 미숙한 배아 또는 기타 적합한 옥수수 유전형을 8 내지 12일생 옥수수 열매로부터 절개하여 액상 2DG4 + 0.5d(20mg/l 글루코즈를 함유하도록 변형되고 10g/l 만노즈가 보충된 Duncan's D 배지) 내에 놓아두고 1 내지 2일 동안 배양한다.

2. 원형질분리

충격에 앞서, 미숙한 배아를 12% 슈크로즈 용액 내에서 3 내지 4시간 동안 항온 배양한다. 배아를 판 상에 8 내지 10mm 환으로 배열한다.

3. 충격

문헌[참조: Wright et al., 2001, Plant Cell Reports, In Press]에 기재된 바와 같이 650psi에서 플라스미드 DNA 5㎍의 존재하에 옥수수 배아의 입자 충격에 의한 형질감염을 수행한다. 상기 참조문헌에서는 행해지지 않았지만, 이의 내역이 다음에 제시된다:

다음 매뉴얼[DuPont Biolistics Manual]에 기재된 바와 같이 단편 DNA를 금 미소운반체(<1㎛) 상으로 침전시킨다. PDS-1000He 바이오리스틱스 장치를 사용하여 유전자를 표적 조직 세포에 전달한다. 장치에 대한 세팅은 다음과 같다: 파열 디스크와 매크로운반체 사이 8mm, 매크로운반체와 정지 스크린 사이 10mm, 및 정지 스크린과 표적 사이 7cm. 650psi-파열 디스크를 사용하여 DNA-코팅된 입자를 상기 판에 2회 발사한다. 헬륨 폭발의 충격파로부터의 조직 손상을 저하시키기 위해, 수평 및 수직적 선형 인치당 200개 개구의 스텐레스 강 메쉬(McMaster-Carr, New Brunswick, NJ)를 상기 정지 스크린과 표적 조직 사이에 놓아둔다. 배아를 25℃하 암실에서 48시간 동안 상기 판 위에서 배양한다. 세포를 GUS 용해 완충액에서 용해시킴으로서 단백질 추출물을 제조하고, 원심분리시킴으로써 정화시킨다.

실시예 25: GUS 검정

GUS 유전자 발현을 탐지하기 위해, 조직화학적 및 화학발광성 검정을 수행한다.

1. 조직화학적 β-글루쿠로니다제(GUS) 검정

옥수수 배아 및 토마토 시험관내 칼루스 주를 GUS 검정에 사용한다. 완전한 배아 또는 칼루스의 작은 조각을 GUS 염색 용액 내로 침지시킨다. GUS 염색 용액을 1mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 글루쿠로니드(X-Gluc, Duchefa, DMSO 중의 20mM 스톡), 100mM Na-포스페이트 완충액 pH 7.0, 10mM EDTA pH 8.0 및 0.1% 트리톤 X100을 함유한다. 조직 샘플을 37℃에서 1 내지 16시간 동안 항온 배양한다. 필요한 경우, 샘플을 70% EtOH로 수회 세척하여 엽록소 제거함으로써 청정하게 할 수 있다.

2. β-글루쿠로니다제(GUS) 화학발광 검정

GUS 발현을 정량적으로 분석하기 위해, GUS 화학발광성 검정을 제조업자의 지시에 따라서 GUS-광 키트(Tropix, Inc.)를 사용하여 수행한다. 발광계를 이용하여 활성을 측정한다.

작제물 pCmpS 및 pCmpMG(실시예 17)을 이용한 GUS 결과를 비교용 클론 값(pNOV3612, 실시예 19)에 대해 표준화시킨다. 2가지 상이한 실험으로부터 수득된 결과는, CmYLCV 프로모터(pCmpMG, 실시예 17)에서의 8bp 결실은 pCmpS와 비교해서 GUS 리포터의 발현 수준에 상당한 영향을 미치지 못한다는 것을 보여준다.

지. 마이스(Z. mays) 배아에서의 일시적인 발현

형질감염시킨지 48 및 72시간 후의 GUS 활성

작제물 ID	GUS 활성 RFU/mg 단백질48시간 72시간
pCmpS	103.7	51.7
pCmpMG	81.4	70.8
ZmUbi(pNOV3612)	52.6	70.2

Claims

서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 연합 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있는 DNA 서열.
제1항에 있어서, 서열 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열.
제1항에 있어서, 서열 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열.
제1항에 있어서, 서열 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열.
제1항에 있어서, 서열 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열.
제1항에 있어서, 서열 6에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열.
엄격한 조건 하에서 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6 중 어느 하나와 하이브리드화하는 DNA 서열.
제7항에 있어서, 서열 19에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열.
제7항에 있어서, 서열 20에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열.
연합 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있는, 서열 1의 50nt 이상의 연속되는 연장물을 포함하는 DNA 서열.
제10항에 있어서, 50nt 이상의 연속되는 연장물이 서열 1의 50nt 이상의 연속되는 연장물과 70% 이상의 서열 상동성을 나타내는 DNA 서열.
세스트룸 황색 잎 컬링 바이러스로부터 분리된 완전한 길이의 전사 프로모터 영역을 포함하는 재조합 DNA 분자.
관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
제13항에 있어서, 관심있는 뉴클레오타이드 서열이 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
제14항에 있어서, 암호화 서열이 목적하는 표현형 특성을 암호화하는 재조합 DNA 분자.
제15항에 있어서, 암호화 서열이, 이러한 암호화 서열로 형질전환시킨 세포에 포지티브 선택적인 이점을 부여해주는 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자.
제15항 또는 제16항에 있어서, 암호화 서열이, 특정 화합물(여기서, 화합물은 만노즈 또는 크실로즈, 또는 이들의 유도체 또는 전구체, 또는 단백질의 기질이다)을 대사시킬 수 있거나, 또는 상기 암호화 서열로 형질전환시킨 세포에 의해 이러한 기질로 대사될 수 있는, 상기 암호화 서열로 형질전환시킨 세포에 대사적 이점을 부여해주는 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자.
제17항에 있어서, 암호화 서열이 크실로이소머라제, 포스포만노-이소머라제, 만노즈-6-포스페이트 이소머라제, 만노즈-1-포스페이트 이소머라제, 포스포만노 뮤타제, 만노즈 에피머라제, 만노즈 또는 크실로즈 포스파타제, 만노즈-6-포스파타제, 만노즈-1-포스파타제 및 만노즈 또는 크실로즈 퍼메아제의 그룹 중에서 선택된효소를 암호화하는 재조합 DNA 분자.
제18항에 있어서, 암호화 서열이 포스포만노 이소머라제를 암호화하는 재조합 DNA 분자.
제14항에 있어서, 암호화 영역이 비-해독성인 재조합 DNA 분자.
제20항에 있어서, 비-해독성 암호화 영역이 바이러스 유전자로부터 기원하는 재조합 DNA 분자.
제21항에 있어서, 바이러스 유전자가 TSWV, 특히 TSWV NP 유전자로부터 기원하는 재조합 DNA 분자.
제14항에 있어서, 암호화 서열이 안티센스 배향인 재조합 DNA 분자.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 DNA 서열 또는 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 발현 벡터.
제24항에 있어서, pNOV2819인 DNA 발현 벡터.
제24항에 있어서, pNOV2820인 DNA 발현 벡터.
관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 제1 DNA 서열, 및 관심있는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 제2 DNA 서열을 포함하는 DNA 발현 벡터.
제27항에 있어서, 바이러스 게놈의 발현을 변화시킬 수 있는 DNA 발현 벡터.
제28항에 있어서, 바이러스 게놈의 센스 RNA 단편 또는 이의 일부를 특정 세포에서 발현할 수 있는 제1 DNA 서열, 및 상기 바이러스 게놈의 안티센스 RNA 단편 또는 이의 일부를 특정 세포에서 발현할 수 있는 제2 DNA 서열(여기서, 상기 센스 RNA 단편과 안티센스 RNA 단편은 이본쇄 RNA를 형성할 수 있다)을 포함하는 DNA 발현 벡터.
제29항에 있어서, 바이러스가 토스포바이러스(tospovirus), 포티바이러스(potyvirus), 포텍스바이러스(potexvirus), 토바모바이러스(tobamovirus), 루테오바이러스(luteovirus), 쿠쿠모바이러스(cucumovirus), 브로모바이러스(bromovirus), 클로스테오르바이러스(closteorvirus), 톰부스바이러스(tombusvirus) 및 푸로바이러스(furovirus)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 DNA 발현 벡터.
제30항에 있어서, 상기 DNA 서열이 바이러스 코트 단백질 유전자, 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자, 바이러스 레플리카제 유전자 또는 바이러스 이동 단백질 유전자로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 일부를 포함하는 DNA 발현 벡터.
제31항에 있어서, DNA 서열이 토마토 반점상 조고증 바이러스(TSWV)로부터 유도되는 DNA 발현 벡터.
제32항에 있어서, DNA가 뉴클레오캡시드 단백질 유전자로부터 유도되는 DNA 발현 벡터.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 DNA 서열, 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 DNA 분자, 또는 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따르는 DNA 발현 벡터로 안정적으로 형질전환시킨 숙주 세포.
제34항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 DNA 서열, 제12항 내지 제23항중의 어느 한 항에 따르는 재조합 DNA 분자, 또는 제24항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA 발현 벡터로 안정적으로 형질전환시킨 식물 및 이의 자손.
제36항에 있어서, 옥수수, 밀, 당밀, 호밀, 귀리, 잔디풀, 벼, 보리, 대두, 면, 담배, 사탕무 및 지유종자 평지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 식물.
관심있는 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 DNA 서열의 용도.
사용된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 서열 1의 15개 이상의 염기쌍의 연속되는 연장물인 뉴클레오타이드의 특정 서열을 포함하는, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 DNA가 생성되는, 제1항에 따르는 DNA 서열의 제조 방법.