JP2003506035A - 新規なアグロバクテリウム介在植物形質転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、挿入物のコピー数が少なく、形質転換効率が改善された形質転換植物を形成する新規な形質転換系に関するものである。詳細には本発明は、アグロバクテリウム介在形質転換プロセス時における、アグロバクテリウムの成長を抑制し、標的植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡ転移を低減するアグロバクテリウム成長阻害剤の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、植物バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には本発明は
、Ｔ−ＤＮＡ転移プロセスを有する植物への遺伝子成分の組み込み方法に関する
。詳細には本発明においては、トウモロコシ、米および小麦などの単子葉植物を
遺伝的に形質転換する系が提供される。

【０００２】 （背景技術） 当該方法は、形質転換可能な植物の細胞または組織を用いて、アグロバクテリ
ウムの接種、共培養または浸潤を行う際の新規な条件を含むものである。その方
法の例としては、アグロバクテリウム介在形質転換プロセス時に細菌成長抑制剤
を用いる改良法などがある。この改良法は、各種の選択可能および／またはスク
リーニング可能なマーカー系を用い、多くの異なる植物種を用いて、形質転換可
能な細胞または組織に核酸を導入するのに用いることができる。本発明はさらに
、トランスジェニック植物、詳細にはトウモロコシ、米および小麦をも提供する
。他の態様において本発明は、安定に形質転換された植物、配偶子およびその植
物からの子孫の生産に関するものである。

【０００３】 過去１０年間に、広範囲の生物からの遺伝子を組換えＤＮＡ技術によって作物
植物に転移させることが可能となった。この進歩によって、害虫、疾患および除
草剤に対する植物の耐性を向上させ、生合成プロセスを変化させて植物生産物の
品質を変える機会が大きく広がった（Knutson et al., 1992; Piorer et al., 1
992）。しかしながら、経済的に重要な植物の大量生産に好適な有効なアグロバ
クテリウム介在形質転換法が利用可能な場合は限られている。詳細には、導入Ｄ
ＮＡの宿主ゲノムへの簡単な組み込みパターン、より具体的には導入ＤＮＡの低
コピー数（１〜２個のコピー）の組み込みで複製可能な形質転換体を与える新規
な培養系が必要である。

【０００４】 植物の形質転換を目的とした方法は多くあったが、非常に有効なものはごくわ
ずかである。さらに、非常に有効で、しかも単純な組み込みパターンおよび導入
ＤＮＡの低いコピー数にて形質転換体を生じる方法はほとんどない。コピー数と
は、宿主細胞に導入されたＴ−ＤＮＡの完全または不完全コピーの数を指す。Ｄ
ＮＡを細胞に導入する方法は当業者には公知であり、（１）化学的方法（Graham
and van der Eb, 1973）；（２）微量注入（Capecchi, 1980）、エレクトロポ
レーション（Fromm et al., 1985;米国特許５３８４２５３号）および遺伝子銃
（Christou, 1992; Fynan et al., 1993）などの物理的方法；（３）ウィルスベ
クター（Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis and Anderson, 1988）；（４
）受容体介在機序（Curiel et al., 1992）；および（５）アグロバクテリウム
介在植物形質転換法など（これらに限定されるものではない）のカテゴリーに分
類することができる。

【０００５】 最近まで、一部の単子葉植物で用いられる方法では、単離原形質体への直接Ｄ
ＮＡ転移およびマイクロプロジェクタイル（microprojectile）介在ＤＮＡ導入
（Fromm et al., 1990）が行われていた。原形質体法は米で広く使用されており
、リポソーム、ＰＥＧおよびエレクトロポレーションを用いてＤＮＡを原形質体
に導入するものである。いくつかの研究機関で非常に多くのトランスジェニック
植物が発見されたが（Datta et al., 1990）、原形質体法では、長期の胚形成懸
濁培養の確立が必要である。原形質体からの一部の再生体は、長期懸濁培養のた
めに、不稔であって、表現型的に異常である（Davey et al., 1991; Rhodes et
al., 1988）。米国特許５６３１１５２号には、単子葉植物および双子葉植物の
形質転換および再生のための迅速かつ有効なマイクロプロジェクタイル衝撃法が
記載されている。

【０００６】 今日までのところ、微粒子およびアグロバクテリウム介在の遺伝子組み込みと
いう２つの方法が、最も一般的に用いられる植物形質転換法である。微粒子介在
形質転換とは、いくつかの方法によって標的組織に向けて推進される微粒子上に
コーティングされたＤＮＡの組み込みを指す。この方法によると、コピー数が比
較的大きく、組み込みパターンが複雑で、挿入物が断片化した遺伝子導入となる
場合がある。アグロバクテリウム介在植物形質転換により、挿入物の複数のコピ
ーおよび複雑な組み込みパターンを有する形質転換植物が得られる場合がある。
Ｔ−ＤＮＡ転移の回数を低下させることで、コピー数を減らすことが可能である
。従って、新規な培養条件を操作して、Ｔ−ＤＮＡ転移の回数に影響を与えるこ
とができ、導入ＤＮＡの至適数コピーを含む形質転換事象が得られるようにする
ことができる。

【０００７】 一貫して挿入物のコピー数が少なく、非常に広範囲の植物に適用可能な再現性
のあるアグロバクテリウム介在法が、多くの理由から望ましい。例えば、複数の
挿入物が存在すると、複数のコピー間での組換えなど（これに限定されるもので
はない）のいくつかの機序によって生じて、後に遺伝子損失を生じる可能性があ
る遺伝子サイレンシングと称される現象が起こる場合がある。さらに、複数コピ
ーによって、遺伝子発現レベルの低下が起こる場合があり、それによって遺伝子
産物が提供する特性が低下する可能性がある。特定の植物系に利用可能な形質転
換法の数は多くあっても、各種作物および各種形質転換可能組織に利用可能な遺
伝子を導入する方法を有することは有利であると考えられる。

【０００８】 アグロバクテリウム介在形質転換は、アグロバクテリウム属に属する遺伝子操
作土壌細菌を使用することで行う。いくつかのアグロバクテリウム種が、遺伝子
操作を行うことで所望のＤＮＡ片を多くの植物に送り込むことができる「Ｔ−Ｄ
ＮＡ」と称される特異的ＤＮＡの転移に介在する。Ｔ−ＤＮＡが介在する病因の
プロセスを特徴づける主要な事象としては、毒性遺伝子の誘発、Ｔ−ＤＮＡのプ
ロセシングおよび転移がある。このプロセスは、多くの総覧のテーマとなってい
る（Ream, 1989; Howard and Citovsky, 1990; Kado, 1991; Hooykaas and Schi
lperoort, 1992; Winnans, 1992; Zambryski, 1992; Gelvin, 1993; Binns and
Howitz, 1994; Hooykaas and Beijersbergen 1994; Lessl and Lanka, 1994; Zu
pan and Zambryski, 1995）。

【０００９】 植物のアグロバクテリウム介在形質転換にはいくつかの段階がある。第１の段
階は、アグロバクテリウムと植物細胞を先ず互いに接触させるものであり、一般
に「接種」と称される。接種段階の次には、アグロバクテリウムと植物細胞／組
織を、数時間から数日以上という期間にわたり、成長およびＴ−ＤＮＡ転移に好
適な条件下で一緒に成長させるのが普通である。この段階は「共培養」と称され
る。共培養およびＴ−ＤＮＡ組み込み後、多くの場合、植物細胞を殺細菌剤また
は静菌剤で処理して、アグロバクテリウムを殺す。非トランスジェニック植物細
胞に対するトランスジェニック植物細胞の優先的成長を促進する選択的薬剤の非
存在下でそれを行う場合、それは通常、「遅延」段階と称される。トランスジェ
ニック植物細胞を優先させる選択圧力存在下で行う場合、それは「選択」段階と
称される。「遅延」を用いる場合、その段階後に、１以上の「選択」段階を行う
。アグロバクテリウム細胞の成長は感染（接種および共培養）プロセス後には望
ましくないことから、「遅延」段階と「選択」段階のいずれにおいても、殺細菌
剤および／または静菌剤を用いて、残留するアグロバクテリウムを殺すのが普通
である。

【００１０】 アグロバクテリウム介在形質転換によって生産されるトランスジェニック植物
は、微粒子介在遺伝子形質転換の場合と比較して、単純な組み込みパターンを有
するが、コピー数および挿入パターンは非常に多様である（Jones et al. 1987;
Jorgensen et al., 1987; Deroles and Gardner, 1988）。さらに、単一の植物
表現型内であっても、使用される外植片および形質転換系の種類により、各種の
Ｔ−ＤＮＡ組み込みパターンが可能である（Grevelding et al., 1993）。Ｔ−
ＤＮＡコピー数を調節する要素については、あまり解明されていない。低コピー
数、好ましくは１個のＴ−ＤＮＡコピーでの植物生産の効率を高めるための再現
性があって広く利用可能な方法を、当業者は強く望んでいると考えられる。

【００１１】 最近、アグロバクテリウム介在形質転換によって、単子葉植物の形質転換が成
功している。ＷＯ９７／４８８１４には、安定に形質転換された稔性小麦の生産
方法が開示されている。その方法では、各種外植片を用い、短時間でトランスジ
ェニック小麦が回収されると記載されている。アグロバクテリウム介在形質転換
では、実際に使用可能な衝撃法への代替法が提供され、その方法によって、トラ
ンスジェニック系のさらに有効な分子特性決定も可能となる。本発明は、形質転
換プロセス時におけるアグロバクテリウム成長の抑制に基づく改善されたアグロ
バクテリウム介在形質転換法である。より具体的には本発明は、Ｔ−ＤＮＡ転移
が起こり得るアグロバクテリウム介在形質転換の段階におけるアグロバクテリウ
ム成長の抑制を主眼としたものである。

【００１２】 アグロバクテリウム介在法を利用する現在の植物形質転換系における主要な欠
点には、その系の生産効率、遺伝子もしくは植物種の多様性および外植片の制限
によって形質転換が困難である点などがあるが、これらに限定されるものではな
い。ＷＯ９４／００９７７には、単子葉植物の形質転換法であって、ある種類の
単子葉植物についての培養したばかりの未成熟胚芽および異なる単子葉植物につ
いての培養未成熟胚芽もしくはカルスの使用に基づく方法が記載されている。い
ずれの系でも、外植片は単離したばかりのものでなければならず、その方法は労
働集約型であり、遺伝子型および外植片によって制限される。他の報告は、特異
株またはベクターを用いて高効率形質転換を行うというものである。ある報告で
は、高効率形質転換を達成するには、特異的超バイナリーベクターを用いなけれ
ばならない（Ishida et al., 1996）。

【００１３】 当業界では多くの形質転換法があるが、単一の作物種の表現型ならびに他の作
物種の表現型に広く利用可能な方法はほとんど開発されていない。当業界で欠け
ているものは、有効で、再現性があり、多くの植物系に利用可能であるアグロバ
クテリウム介在植物形質転換系ならびに単一の組み込みパターンおよび低いコピ
ー数を有する形質転換植物を効果的に与える形質転換系である。本発明は、形質
転換可能な植物細胞または組織を用いたアグロバクテリウムの接種および共培養
時に１以上の細菌培養阻害剤を用いる新規な培養条件であって、形質転換効率が
高くなり、いくつかの植物系に導入される遺伝子成分のコピー数が小さくなる条
件を提供するものである。本発明の方法によると、挿入物の数が少ない所望の遺
伝子導入事象が常に得られ、植物育種者、栽培者および消費者にとって、改良さ
れた生殖質の育種および導入のための至適な商業的系を確認することを目的とし
て数百の系についてスクリーニングを行う必要性が小さくなる。そこで本発明は
、従来のアグロバクテリウム介在形質転換法と比較して新規な改良を提供するも
のである。

【００１４】 （発明の開示） 本発明は、形質転換プロセスの際にアグロバクテリウム細胞の成長を阻害する
条件下での、植物の安定かつ有効な新規な形質転換方法を提供する。

【００１５】 １態様において本発明は、アグロバクテリウムによって植物細胞または植物組
織を形質転換する新規な方法であって、１以上の成長阻害剤の存在下に植物の細
胞または組織に転移可能な１以上の遺伝子成分を有する形質転換可能な細胞また
は組織を接種し；前記成長阻害剤の存在下または非存在下に共培養を行い；形質
転換植物細胞または組織を選択し；前記選択植物細胞または組織から遺伝子成分
を発現する形質転換植物を再生することで行う方法を提供する。

【００１６】 １実施態様において、前記成長阻害剤は、銀などの重金属、またはカルベニシ
リンなどの抗生物質、または核酸、またはアグロバクテリウム細胞の成長を阻害
もしくは抑制することができる蛋白を含み、その成長阻害剤は、形質転換プロセ
スにおける接種段階では存在させるが、共培養段階では存在させない。

【００１７】 別の実施態様では、アグロバクテリウム細胞成長に対して阻害性である成長阻
害剤を、形質転換プロセスの接種段階および共培養段階において存在させる。

【００１８】 別の実施態様では、アグロバクテリウム細胞成長に対して阻害性である成長阻
害剤を、形質転換プロセスの接種段階では存在させないが、共培養段階では存在
させる。

【００１９】 さらに別の実施態様では本発明は、アグロバクテリウム成長を抑制し、Ｔ−Ｄ
ＮＡ転移を低減することで導入ＤＮＡのコピー挿入を減らすだけの量での、接種
工程時における１以上のアグロバクテリウム成長阻害剤の存在に関するものであ
る。

【００２０】 本発明のさらに別の態様は、１以上の成長阻害剤の存在下に植物の細胞または
組織に転移可能な１以上の遺伝子成分を有する形質転換可能な細胞または組織を
接種し；前記成長阻害剤の存在下または非存在下に共培養を行い；形質転換植物
細胞または組織を選択し；前記選択植物細胞または組織から遺伝子成分を発現す
る形質転換植物を再生することで製造される形質転換植物に関するものである。

【００２１】 本発明のさらに別の態様は、本発明の方法によって製造される形質転換植物の
種子、または子孫に関するものである。

【００２２】 本発明のさらに別の目的、利点および態様については、添付の図面および本発
明の説明から明らかになろう。

【００２３】 図面の簡単な説明 図１は、ｐＭＯＮ３０１００のプラスミドマップである。

【００２４】 図２は、ｐＭＯＮ１８３６５のプラスミドマップである。

【００２５】 図３は、ｐＭＯＮ２５４５７のプラスミドマップである。

【００２６】 図４は、ｐＭＯＮ２５４９２のプラスミドマップである。

【００２７】 図５は、ｐＭＯＮ３２０９２のプラスミドマップである。

【００２８】 （詳細な説明） 本発明は任意の植物種に使用し得る。特に単子葉種に有用である。本発明を実
施するために特に好ましい種はトウモロコシ、コムギ及びイネである。

【００２９】 本発明は、トランスジェニック植物、並びに、植物の細胞または組織を形質転
換し、形質転換した細胞または組織から分化した形質転換植物を再生する方法を
提供する。本発明による形質転換プロセスを開始させるためには先ず、植物の細
胞または組織に挿入すべき遺伝子成分を選択する必要がある。遺伝子成分は、本
発明による方法を使用して植物の細胞または組織に導入される任意の核酸を包含
する。遺伝子成分は非植物ＤＮＡまたは合成ＤＮＡを包含し得る。

【００３０】 好ましい実施態様において、遺伝子成分は、少なくとも１つまたは複数の以下
のタイプの遺伝子成分を含む組換え二重鎖プラスミドまたはベクター分子のよう
なＤＮＡ組成物に組込まれる： （ａ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起するプロモーター、 （ｂ）農業用途の産生物をコードするＲＮＡ配列の産生を惹起する構造的ＤＮＡ
配列、及び、 （ｃ）ＲＮＡ配列の３’末端にポリアデニル化ヌクレオチド配列を付加させるべ
く植物細胞中で機能する３’非翻訳ＤＮＡ配列。

【００３１】 ベクターは、植物の細胞または組織の形質転換を促進するため、及び、所望の
（１つまたは複数の）遺伝子の発現を調節するための多数の遺伝子成分を含有し
得る。１つの好ましい実施態様において、遺伝子成分はｍＲＮＡを発現させるよ
うに配向されており、該実施態様ではｍＲＮＡがタンパク質に翻訳され得る。二
重鎖形態で存在する植物の構造コーディング配列（遺伝子、ｃＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａまたはその他のＤＮＡ）の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によってＤＮＡの
一本鎖からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を転写し、その後にｍＲＮＡ一次
転写物を核内でプロセシングする過程を含む。このプロセシングには、ｍＲＮＡ
の３’末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加する３’−非翻訳領域が関与す
る。

【００３２】 所望の遺伝子成分を含有するプラスミドまたはベクターの製造手段は当業界で
公知である。植物の形質転換に使用されるベクター及びこれらのベクターの製造
方法は、米国特許第４，９７１，９０８号、第９４０，８３５号、第４，７６９
，０６１号及び第４，７４７ ０１１号に記載されている。これらの特許の記載
内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする。ベクターは典型的には、
プロモーター配列、リーダー配列、イントロン配列及びターミネーター配列のよ
うな調節要素を非限定例とする多数の遺伝子成分から構成されている。調節要素
はまた、これらの要素のコントロール対象となる配列または（１つまたは複数の
）遺伝子に対する近位性次第で、シス−調節要素またはトランス−調節要素と呼
ばれる。

【００３３】 ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写は通常は“プロモーター”と呼ばれるＤＮＡの領域
によって調節される。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに会合
させ、ＤＮＡ鎖の１つを鋳型として使用してｍＲＮＡへの転写を開始させ、対応
するＲＮＡの相補鎖を形成させるシグナルを与える塩基配列を含んでいる。

【００３４】 植物細胞中で活性の多数のプロモーターが文献に記載されている。このような
プロモーターの非限定例は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓの腫瘍誘発プラスミドに担持されたノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモー
ター及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター、カリフラワーモザイク
ウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウ
イルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーターのようなカウリモウイルスプロモーター、
エンハンストＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｅ３５Ｓ）、リブロースビスリン酸
カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、極めて豊饒な植物ポ
リペプチド）に由来の光誘導プロモーターである。これらのプロモーターはいず
れも、植物体内で発現された多様なタイプのＤＮＡ構築物を作製するために使用
されている。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０２９１３（Ｒｏｇｅｒｓら，Ｍｏ
ｎｓａｎｔｏ、その記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする）
参照。

【００３５】 また、転写活性を増強するため（Ｈｏｆｆｍａｎ，米国特許第５，１０６，７
３９号）または所望の転写活性、誘導適性及び組織特異性または発生的特異性を
組合せるためにプロモーターハイブリッドを構築することもできる。植物体内で
機能するプロモーターの非限定例は、誘導プロモーター、ウイルスプロモーター
、合成プロモーター、構成的プロモーターであり（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉら，１
９８９；Ｏｄｅｌｌｏ，１９８５に記載）、並びに、時間的に調節されるもの、
空間的に調節されるもの及び時空間的に調節されるものがある（Ｃｈａｕら，１
９８９）。組織増強的、組織特異的または発生的に調節される別のプロモーター
も当業界で公知であり、本発明の実施に有用であると期待できる。

【００３６】 プロモーターは、植物体及び植物ＤＮＡウイルスのような多様なソースから得
ることができ、その非限定例は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓ
プロモーター、並びに、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子のよなう植物遺伝子から単離
されたプロモーターである。後述するように、選択された特定のプロモーターが
有益な遺伝子産物を有効量で産生させるべく十分な発現を惹起する能力を有して
いるのが好ましい。

【００３７】 本発明のＤＮＡ構築物（即ち、キメラ／組換え植物遺伝子）に使用されるプロ
モーターが、所望の場合にはそれらのコントロール特性を変化させるように修飾
されてもよい。プロモーターはオペレーター領域との結合、ランダムなもしくは
コントロールされた突然変異誘発、などを介して誘発され得る。更に、プロモー
ターが遺伝子発現の向上を支援する多数の“エンハンサー配列”を含むように改
造されてもよい。このようなエンハンサー配列の例はＫａｙら（１９８７）によ
って報告されている。

【００３８】 本発明のＤＮＡ構築物によって産生されるｍＲＮＡはまた、５’非翻訳リーダ
ー配列を含み得る。この配列は遺伝子を発現させるために選択されたプロモータ
ーに由来してもよく、ｍＲＮＡの翻訳を増進するように特異的に修飾できる。５
’非翻訳領域はまた、ウイルスＲＮＡ、適当な真核細胞遺伝子または合成遺伝子
配列から得られてもよい（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，１９９３）。得られるｍＲＮ
Ａの翻訳効率を増進または変更するためにこのような“エンハンサー”配列が望
ましい。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列に付随する５’非翻訳配列に
由来する構築物に限定されない。逆に、非翻訳リーダー配列が近縁でないプロモ
ーターまたは遺伝子に由来してもよい（例えば、米国特許第５，３６２，８６５
号参照）。遺伝子の発現増進に役立つかまたは転写もしくは翻訳に影響を与える
別の遺伝子成分も遺伝子成分に包含され得る。

【００３９】 キメラ構築物の３’非翻訳領域は、転写ターミネーターまたは等価の機能をも
つ要素と、植物体内でポリアデニル化ヌクレオチドをＲＮＡの３’末端に付加す
べく機能するポリアデニル化シグナルとを含んでいなければならない。適当な３
’領域の例は、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のようなＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍの腫瘍誘発性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグ
ナルを含む３’転写非翻訳領域、並びに、（２）ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子及
びリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲ
ＵＢＩＳＣＯ）遺伝子のような植物遺伝子である。好ましい３’領域の一例は、
エンドウマメのｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子に由来する（Ｆｉｓｃｈｈｏｆ
ｆら，欧州特許出願０３８５９６２、その記載内容全部が参照によって本発明に
含まれるものとする）。

【００４０】 典型的には、ポリアデニル化部位の下流に数１００塩基対が局在したＤＮＡ配
列は転写を終了させる機能を果たす。本文中ではこのようなＤＮＡ配列を転写終
結領域と呼ぶ。この領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を効
率的にボリアデニル化するために必要であり、３’非翻訳領域として知られてい
る。ＲＮＡポリメラーゼはポリアデニル化が生じる部位を介してコーディングＤ
ＮＡ配列を転写する。

【００４１】 １つの好ましい実施態様において、ベクターは選択可能、スクリーニング可能
またはスコアリング可能なマーカー遺伝子を含んでいる。これらの遺伝子成分は
形質転換植物の同定に役立つ産生物または農業用に役立つ産生物を生じさせるの
で、本文中ではこれらの遺伝子成分を機能性遺伝子成分とも呼ぶ。選択デバイス
として役立つＤＮＡは再生可能な植物組織中で、普通なら毒性の化合物に対する
耐性を植物組織に与える化合物を産生すべく機能する。選択可能、スクリーニン
グ可能またはスコアリング可能なマーカーとして使用され得る有益な遺伝子の非
限定例は、ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）
、抗生物質または除草剤耐性遺伝子である。トランスポゾン及び関連する抗生物
質耐性遺伝子の例は、トランスポゾンＴｎｓ（ｂｌａ）、Ｔｎ５（ｎｐｔＩＩ）
、Ｔｎ７（ｄｈｆｒ）、ペニシリン、カナマイシン（及びネオマイシン、Ｇ４１
８、ブレオマイシン）；メソトレキセート（及びトリメトプリム）；クロラムフ
ェニコール；カナマイシン及びテトラサイクリンである。

【００４２】 植物体内で選択可能マーカーとして有効な特性は微生物の使用に関する報告書
（Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｎｏｖｅｌ Ｆｏｏｄｓ ａ
ｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｊｕｌｙ １９９４）に概説されている。これらの
特性としては、 （ｉ）最小数の非形質転換組織を伴う緊縮性選択が可能である； （ｉｉ）有意な再生妨害を全く伴わない多数の独立した形質転換イベントが可能
である； （ｉｉｉ）多数の種に適用することが可能である； （ｉｖ）マーカーの存在に基づく組織スコアリングアッセイを使用することが可
能である。

【００４３】 カナマイシン耐性マーカー（ｎｐｔＩＩ）、ヒグロマイシンＢ耐性マーカー（
ａｐｈＩＶ）及びゲンタマイシン耐性マーカー（ａａｃ３及びａａｃＣ４）を含
む上述のような幾つかの抗生物質耐性マーカーはこれらの基準を満たす。

【００４４】 多数の選択可能マーカー遺伝子が当業界で公知であり、本発明に使用し得る（
例えば、Ｗｉｌｍｉｎｋ ａｎｄ Ｄｏｎｓ，１９９３参照）。本発明に使用す
るための特に好ましい選択可能マーカー遺伝子は、カナマイシンのような抗生物
質（Ｄｅｋｅｙｓｅｒら，１９８９）及びグリホセートのような除草剤（Ｄｅｌ
ｌａ−Ｃｉｏｐｐａら，１９８７）などの化合物に耐性を与える遺伝子を包含す
るであろう。また、別の選択デバイスを作製することもでき、その非限定例は、
ホスフィノトリシン、ビアラホス耐性及び陽性選択メカニズム（Ｊｏｅｒｓｂｏ
ら，１９９８）であり、これらも本発明の範囲内に包含されるであろう。

【００４５】 本発明は、上述のような選択可能またはスクリーニング可能マーカーと関連調
節要素とを、特定の所望形質を与えるように十分に発現された１つまたは複数の
核酸と共に含む適当な任意の植物形質転換用プラスミドまたはベクターに使用さ
れ得る。本発明によって期待される農業的に有益な適当な構造遺伝子の非限定例
は、昆虫または害虫に耐性の遺伝子、除草剤耐性遺伝子、収量、栄養強化、環境
もしくはストレス耐性のような品質改良に役立つか、または、植物の生理学、成
長、発生、形態学または（１つまたは複数の）植物産生物の望ましい任意の変化
に役立つ遺伝子である。

【００４６】 あるいは、ＤＮＡコーディング配列は、例えばアンチセンス−または同時抑制
−媒介メカニズムを介して内因性遺伝子の発現を標的阻害する翻訳不可能なＲＮ
Ａ分子をコードすることによってこれらの表現形質をもたらすこともできる（例
えば、Ｂｉｒｄら，１９９１参照）。ＲＮＡはまた、所望の内因性ｍＲＮＡ産物
を開裂するように操作された触媒ＲＮＡ分子（即ち、リボザイム）であってもも
よい（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｓｈｉｌｌｉｔｏｅ，１９９７参照）。
このように、タンパク質を産生する任意の遺伝子または表現形質もしくは形態の
有益な変化を発現するｍＲＮＡが本発明の実施に有用である。

【００４７】 本発明に包含される方法によって導入され得る代表的な核酸は例えば、別の種
に由来のＤＮＡ配列もしくは遺伝子、または、同じ種に由来もしくは存在するが
従来の繁殖もしくは育種技術でなく遺伝子操作方法によってレシピエント細胞に
組込まれた遺伝子もしくは配列を包含する。しかしながら、外因性という用語は
、形質転換される細胞中に正常には存在しない遺伝子、または、恐らく形質転換
性ＤＮＡセグメントもしくは遺伝子中に見られるような形態、構造などでは存在
しないというだけの遺伝子、または、正常に存在しているが例えば超発現させる
のが望ましい遺伝子を意味する。従って、“外因性”遺伝子またはＤＮＡという
用語は、同様の遺伝子がレシピエント細胞中に既に存在しているか否かにかかわ
りなく、レシピエント細胞に導入される任意の遺伝子またはＤＮＡセグメントを
包含する。外因性ＤＮＡに包含されるＤＮＡのタイプは、植物細胞中に既に存在
しているＤＮＡ、別の植物に由来のＤＮＡ、異なる生物に由来のＤＮＡ、または
、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ配列もしくは遺伝子の合成もし
くは修飾された変形をコードするＤＮＡ配列のような外的に作製されたＤＮＡを
包含する。

【００４８】 本文の開示に基づいて、他の多くの選択可能及び／またはスクリーニング可能
なマーカー遺伝子、調節要素、及び、その他の有益な配列が当業者に明らかであ
ろう。従って、上記の検討は例示的であって網羅的でないことを理解されたい。

【００４９】 植物形質転換用ベクターまたは構築物を構築した後、ＤＮＡ組成物としてｉｎ
ｖｉｔｒｏ調製した上記の核酸分子を大腸菌のような適当な宿主に導入し、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのような別の適当な宿主に交配するか、または、コン
ピテントＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを直接に形質転換させる。これらの技術は
当業者に公知であり、ダイズ、綿及びコムギのような多数の植物系について記載
されている（例えば、米国特許第５，５６９，８３４号、第５，１５９，１３５
号及び国際特許ＷＯ９７／４８８１４参照、これらの特許の記載内容全部が参照
によって本発明に含まれるものとする）。

【００５０】 本発明は１つまたは複数の遺伝子成分を植物に導入するための細菌株の使用を
包含する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法の有効性は当業者の認め
るところであろう。植物体内に遺伝子を導入するために、ＴｉまたはＲｉプラス
ミドを保有されしているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの多数の失活させた（
ｄｉｓａｒｍｅｄ）野生型菌株を使用し得る。好ましくは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ宿主が、ベクターとして使用される腫瘍形成または根粒形成をそれぞれ
生じる腫瘍遺伝子を含有しない失活させた（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉ及びＲｉプ
ラスミドを含んでおり、以後に植物体内に導入される有益な遺伝子を含んでいる
。好ましい菌株の非限定例は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ Ｃ５８、植物細胞へのＤＮＡ導入を媒介するために使用されるノパリン
型菌株、ＬＢＡ４４０４のようなオクトピン型菌株、ＥＨＡ１０１もしくはＥＨ
Ａ１０５のようなスクシンアモピン型菌株である。植物を形質転換するためにこ
れらの菌株を使用することは報告されており、その方法は当業者の熟知するとこ
ろである。

【００５１】 本発明は任意の植物形質転換系に使用できる。本発明の実施に好適な植物ター
ゲットの非限定例は、アルファルファ、オオムギ、キャノーラ、トウモロコシ、
綿、エンバク、ジャガイモ、イネ、ライムギ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、ナ
ス及びコムギなどである。特に好ましい双子葉植物ターゲットはダイズ、綿、キ
ャラまたはヒマワリである。特に好ましい単子葉植物ターゲットは、トウモロコ
シ、コムギ及びイネのような穀物である。

【００５２】 本発明は任意の形質転換可能な細胞または組織と共に使用され得る。本文中に
使用した形質転換可能なという用語は、更に増殖して１つの植物のもとになり得
る細胞または組織を意味する。当業者は植物の多数の細胞または組織が形質転換
可能であり、外因性ＤＮＡを挿入した後に適当な培養条件で植物の細胞または組
織が分化植物に形成され得ることを認識している。これらの目的に適う組織の非
限定例は、未成熟胚、楯板組織、浮遊細胞培養物、カルス組織、胚軸組織、子葉
、根及び葉である。双子葉植物の好ましい外植体の非限定例は、葉、根、子葉、
カルス、花序、胚軸及び軸である。単子葉植物の好ましい外植体の非限定例は、
未成熟胚、胚形成性カルス、未成熟花序、根、苗条分裂組織、節、節状外植体及
び細胞浮遊液である。

【００５３】 外植体は、単一遺伝子型から又は複数の遺伝子型の組合せからのものでありう
る。好ましい実施態様では、植物ハイブリッドからの上質の外植体が外植体とし
て使用できる。例えば、いくつかの遺伝子型を含むハイブリッド胚子を使用して
、高い培養応答（より高い胚仮骨形成頻度、成長速度、植物再生頻度、等々）を
有する迅速成長細胞系統をを生成することができる。好ましい実施態様では、交
雑育種のＦ１ハイブリッド又は第一世代子孫をドナー植物として使用し、もう１
つの別の遺伝子型と交雑することができる。例えば、近交系であるＰａ９１をＨ
９９のような第二の近交系と交雑し、生じたＦ１ハイブリッド植物を近交系Ａ１
８８と交雑する。当業者は、ここで「雑種強勢（ｈｙｂｒｉｄ ｂｉｇｏｒ）」
とも称されるヘテローシスは、２つの近交系を交雑したときに起こることを認識
している。本発明は、それ故、少なくとも１つ又はそれ以上の近交系が高度に再
生可能であり、形質転換可能であって、三系雑種の形質転換及び再生頻度が個々
の近交系の頻度を上回る、三元又は「三系雑種」交雑から生じる外植体を包含す
る。他の組織も本発明の実施において有用性を持つと想定される。

【００５４】 本発明の好ましい実施態様では、トウモロコシ、イネ及びコムギの未熟胚子（
ＩＥ）を、アグロバクテリア菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介した形質転
換のための外植体として使用する。例えばコムギでは、未熟胚子をコムギ小穂か
ら単離しうる。コムギ未熟胚子の単離はＷｅｅｋｓら（１９９３）及びＶａｓｉ
ｌら（１９９３）によっても述べられている。同様に、トウモロコシの雌穂を受
粉の約８−１６日後に採取し、未熟胚子のソースとして使用する。イネでは、開
花後に未熟えい果を採集し、これらのえい果から単離した未熟胚子を外植体とし
て使用する。本発明は、それ故、上述したような新鮮単離した胚子の使用を包含
する。もう１つの実施態様では、形質転換のための適当な植物材料として懸濁細
胞培養を使用することができる。もう１つの実施態様では、前培養した組織を形
質転換のための標的植物材料として使用する。ここで使用するとき「前培養した
」とは、アグロバクテリア菌を接種する前に植物組織の成長を助けるため適切な
培地中で細胞又は組織を培養することを意味する。アグロバクテリア菌の接種に
先立つ形質転換可能細胞又は組織の前培養はどのような期間であってもよく、例
えば１日から７日間でありうる。好ましくは、前培養期間は７日間未満である。
より好ましくは前培養期間は３日間又はそれ以内である。さらに一層好ましくは
、形質転換可能細胞又は組織の前培養は１８−２８時間である。

【００５５】 どのような適当な植物培地も前培養に使用できる。前培養の適当な培地の例は
、ピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸）、２，４−Ｄ
（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）及びジカンバ（３，６−ジクロロアニス酸
）のようなオーキシン、ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）及びキネチンのよ
うなサイトカイニン、及びジベレリンを含むがこれらに限定されない付加的な植
物成長調節因子を補足したＭＳベースの培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇ
、１９６２）又はＮ６ベースの培地（Ｃｈｕら、１９７５）を含むが、これらに
限定されない。他の培地添加物は、アミノ酸、マクロ元素、鉄、微量元素、ビタ
ミン及び有機物、炭水化物、カゼイン加水分解産物のような定義されていない培
地成分、所望に応じて低融点アガロース又はＧｅｌｒｉｔｅのような、ある種の
形態の寒天のような適当なゲル化剤を含みうるが、これらに限定されない。当業
者は、適切に補足したとき植物組織の成長と発達を助け、植物の形質転換及び再
生に適する様々な組織培地に精通している。これらの組織培地は、市販試料とし
て購入するか、又は注文して調製及び修正することができる。そのような培地の
例は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏ
ｏｇ、１９６２）、Ｎ６（Ｃｈｕら、１９７５）、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇ、１９６５）、Ｕｃｈｉｙａｍ
ａ ａｎｄ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ（ＵｃｈｉｙａｍａとＭｕｒａｓｈｉｇｅ、１
９７４）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地（Ｇａｍｂｏｒｇら、１９６８）、Ｄ培地（Ｄｕ
ｎｃａｎら、１９８５）、ＭｃＣｏｗｎ木本培地（ＭｃＣｏｗｎとＬｏｙｄ、１
９８１）、Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ（ＮｉｔｓｃｈとＮｉｔｓｃｈ
、１９６９）、及びＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（Ｓｃｈｅ
ｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ、１９７２）又は適切に補足したこれらの培地の
派生物を含むが、これらに限定されないであろう。当業者は、形質転換及び再生
において使用するための培地及び養分や成長調節因子のような培地補足物、並び
に対象とする特定標的作物について至適化することができる、インキュベーショ
ン中の光の強さ、ｐＨ、及びインキュベーション温度のような他の培養条件を認
識している。

【００５６】 ひとたび形質転換可能植物組織が単離されれば、当該方法の次の段階は遺伝子
成分を植物組織に導入することである。この工程はここでは「形質転換」とも称
される。植物細胞を形質転換し、各々独立して形質転換した植物細胞を選択する
。独立した形質転換体はトランスジェニック体と称される。遺伝子成分を形質転
換可能植物組織に挿入するための多くの方法が報告されており、使用できる。

【００５７】 主としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して双
子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得るための方法は、綿（米国
特許第５，０６４，８６３号；米国特許第５，１５９，１３５号；米国特許第５
，５１８，９０８号、ＷＯ９７／４３４３０号）、ダイズ（米国特許第５，５６
９，８３４号；米国特許第５，４１６，０１１号；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）
；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８））、アブラナ（米国特許第５，４６３，１７
４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇら（１９９６）；Ｄｅ ＫａｔｈｅｎとＪａｃｏｂ
ｓｅｎ（１９９０））を含めた多くの作物について公表されている。 エレクト
ロポレーション、パーティクルガン、及びアグロバクテリア菌を使用する単子葉
植物の形質転換も報告されている。形質転換と植物再生は、アスパラガス（Ｂｙ
ｔｅｂｉｅｒら（１９８７））、オオムギ（ＷａｎとＬｅｍａｕｘ（１９９４）
、Ｔｉｎｇａｙら（１９９７）、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら（１９８８）；
Ｉｓｈｉｄａら（１９９６）；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）；Ｆｒｏ
ｍｍら（１９９０）；Ｋｏｚｉｅｌら（１９９３）；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（１
９９５）、カラスムギ（Ｓｏｍｅｒｓら（１９９２））、イネ（Ｔｏｒｉｙａｍ
ａら（１９８８）；ＺｈａｎｇとＷｕ（１９８８）；Ｚｈａｎｇら（１９８８）
；ＢａｔｔｒａｗとＨａｌｌ（１９９０）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）；
Ｈｉｅｉら（１９９４）；Ｐａｒｋら（１９９６））、サトウキビ（Ｂｏｗｅｒ
とＢｉｒｃｈ（１９９２）；Ａｒｅｎｃｉｂｉａら（１９９８））、ｔａｌｌ
ｆｅｓｃｕｅ（Ｗａｎｇら（１９９２））、及びコムギ（Ｖａｓｉｌら（１９９
２）；Ｗｅｅｋｓら（１９９３）；Ｃｈｅｎｇら（１９９７））において実現さ
れている。

【００５８】 本発明はアグロバクテリア菌を介した形質転換を利用する。本発明の１つの利
点は、付加的な毒性遺伝子の存在を必要としないことである。検討したすべての
植物系で形質転換が達成された。スーパーバイナリーベクターを必要としないと
いう事実は付加的な有用性を提供するが、報告されているもう１つのトウモロコ
シ系（Ｉｓｈｉｄａら、１９９６）において高い形質転換を達成するために必須
であることが示された。

【００５９】 好ましい実施態様では、成長阻害因子の存在下で形質転換可能組織にアグロバ
クテリア菌を接種する。ここで使用するとき成長阻害因子は、細菌細胞の成長を
抑制、抑圧、制限、又は阻害することができるあらゆる因子を意味する。好まし
くは、成長阻害因子はアグロバクテリア菌細胞の成長を阻害する。より好ましく
は、成長阻害因子はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞
の成長を阻害し、Ｔ−ＤＮＡ転移プロセスを低減する。ここで言及する因子は化
学的又は生物学的因子でありうる。アグロバクテリア菌の成長を抑圧する又は阻
害するいかなる方法又は因子も想定される。アグロバクテリア菌に対して毒性（
静菌性又は殺菌性）であり、植物細胞に対してより毒性が低い因子が、選択ステ
ップまでの形質転換工程の段階に含まれうる。好ましくは１つ又はそれ以上の成
長阻害因子を、植物細胞の増殖に関して中立又は肯定的なままでありながらアグ
ロバクテリア菌の成長を抑制、抑圧又は阻害する上で有効な濃度で、アグロバク
テリア菌と共に含む。従って、植物の系及び培地成分に依存して、成長阻害因子
を含む有効濃度及び期間を変化させ、至適化することができる。例えば、当業者
に既知の方法を用いて種々の濃度、種々の培養条件、及び種々の植物系において
因子を試験することを含むがこれに限定されない何らかの方法によって、当該因
子のアグロバクテリア菌細胞増殖への作用に関して因子を試験することができる
。１つ又はそれ以上の成長阻害因子を含むこれらの段階は、アグロバクテリア菌
と植物細胞を一緒にする期間及びＴ−ＤＮＡ転移が起こりうる期間中の、形質転
換工程のいずれの段階も包含する。特に好ましい形質転換段階は、接種、傷形成
、及びｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、１９９３；Ｃｌｏ
ｕｇｈとＢｅｎｔ、１９８８）の際の長期間の同時培養を含めた同時培養ステッ
プを含む。Ｔ−ＤＮＡ転移は生物学的工程であり、接種、傷形成、同時培養、及
び／又は浸潤ステップの際にそのような成長阻害因子を含むことは、同時にＴ−
ＤＮＡのプロセシングと転移も阻害しうる。成長阻害因子は単独で又は他の成長
阻害因子と組み合わせて存在しうる。適当な成長阻害因子の例は、アンホテリシ
ンＢ、カルベニシリン、セフォタキシム、クロラムフェニコール、シクロヘキシ
ミド、エリスロマイシン、硫酸ゲンタマイシンＡ、ゲネチシン、ヒグロマイシン
Ｂ、ヒドロキシキノリン、カナマイシン、メトトレキセート、ナリジクス酸、硫
酸ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ペニシリン、ペンタクロロニ
トロベンゼン、リファンピシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラ
サイクリン、トリメトプリム、チアベンダゾール、チカルシリン、バンコマイシ
ン、スペクチノマイシンのような抗生物質、硝酸銀、チオ硫酸銀、亜硝酸銀、ジ
チオン酸銀、ステアリン酸銀、セレン酸銀、サリチル酸銀、シュウ酸銀、リン酸
銀、メタリン酸銀、正リン酸銀、モノＨ正リン酸銀、炭酸銀、プロピオン酸銀、
酢酸銀、クエン酸銀、ラウリン酸銀、レブリン酸銀、ピロリン酸銀又は他の銀含
有化合物のような重金属を含む化合物、カリウム、マグネシウム又はカドミウム
を含む化合物、蛋白質、ヌクレオチド、及び細胞抽出物、細胞滲出物、二次代謝
産物、サルファ剤、及び成長調節因子のような他の化学物質を含むが、これらに
限定されない。ここで使用するとき誘導体は、アグロバクテリア菌の成長を阻害
することができる、塩誘導体、無水誘導体、又は水和誘導体を含むがこれらに限
定されない他の形態の成長阻害因子を指す。特に好ましい成長阻害因子は、硝酸
銀、チオ硫酸銀、及びカルベニシリン、アンピシリン及びクロキサシリンのよう
なペニシリン、セフォタキシム及びセフォキシチンのようなセファロスポロン、
又はペニシリンとオグメンチンやチメンチンのようなクラブラン酸のような混合
型抗生物質を含む。成長阻害因子は、因子の性質に依存して、多くの方法によっ
て接種及び接種後の段階において「含まれ」うる。例えば化学物質は、原液から
の添加によって培地中に含まれる、又は固体形態で添加することができる。当該
因子は、濾紙片のような支持マトリックスに付着させて、半固体、固体支持体上
に置く又は液体媒質に加えることができる。当該因子はまた、真空浸潤媒質に又
は音波破砕援用アグロバクテリア菌仲介形質転換のプロセス中に加えることもで
きる（Ｔｒｉｃｋら、１９９７）。

【００６０】 もう１つの実施態様では、同時培養及と形質転換工程の間アグロバクテリア菌
細胞増殖を減速する又は阻害するために、イントロンのような核酸配列を選択マ
ーカー遺伝子に含めることができる。微生物由来のプロモーター、例えば３５Ｓ
、ＮＯＳ、等々はアグロバクテリア菌細胞において遺伝子の発現を調節しうるこ
とが報告されている。イントロンを含む抗生物質マーカー遺伝子、例えばｎｐｔ
ＩＩ（カナマイシンに対する耐性を与える）、ａｐｈＩＶ（ヒグロマイシンＢに
対する耐性を与える）、ａｃＣ３及びａａｃＣ４（ゲンタマイシンに対する耐性
を与える）又はａａｄＡ（スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する
耐性を与える）を使用して、分別選択戦略を用いることによりアグロバクテリア
菌細胞を阻害することができる。例えば、植物細胞は２５ｍｇ／Ｌの濃度のカナ
マイシンに対してほとんど感受性がないが、同じ濃度がアグロバクテリア菌に対
しては致死的である。

【００６１】 別の実施形態において、増殖阻害剤は、アグロバクテリウム細胞の増殖を阻害
し、Ｔ−ＤＮＡのプロセシング、転移、および組込みを阻害する、ヌクレオチド
配列である。これは、アグロバクテリウム細胞への、センスまたはアンチセンス
遺伝子（群）の導入およびその発現の調節により行なうことができる。かかる遺
伝子または遺伝子（群）の選択的調節により、Ｔ−ＤＮＡ媒介遺伝子送達を操作
することができる。適切な遺伝子は、炭水化物の代謝経路に関与する代謝遺伝子
を含むがこれに限定されない。

【００６２】 増殖阻害剤を、アグロバクテリウム増殖に対する所望の効果を達成するに十分
な量で添加できる。薬剤の有効範囲を操作して、薬剤の最適濃度を決定できる。
増殖阻害剤の濃度は、使用する培地の成分および植物系を含むがこれに限定され
ない培養条件に応じて変化し得る。例えば、異なる培地成分は、阻害剤（群）と
相互作用し得、特定の植物組織系の特定の培養条件下で必要な薬剤の量に影響を
及ぼし得る。１つの実施形態において、１つまたはそれ以上の増殖抑制剤を合わ
せて、共に、または形質転換プロセスの異なる段階で含めることができる。好ま
しくは、アグロバクテリウム存在下での薬剤（群）の存在は、アグロバクテリウ
ムの密度が、薬剤の存在下で増加しない程度、効果的である。より好ましくは、
薬剤（群）の存在は、アグロバクテリウム増殖に対して負の効果を有し、植物成
長に対して中立または正の効果を有する。

【００６３】 本発明のさらなる実施形態において、増殖阻害剤は、接種ステップにのみ、共
培養ステップにのみ、または、接種および共培養ステップの両方に含め得る。

【００６４】 当業者は、植物形質転換プロセスの典型的なステップを認識している。アグロ
バクテリウムは、直接グリセロールからのルリア・ブルタニ（ＬＢ）培地などの
液体を接種するか、または、グリセロールからの固形培地にアグロバクテリウム
を画線し、適切な選択条件下で、一般に約２６℃から３０℃、より好ましくは約
２８℃で細菌を増殖させ、プレートから１つのコロニーを採取し、選択剤を含む
液体培養培地を接種することにより調製できる。別に、１スプーンまたはスラリ
ーのアグロバクテリウムをプレートから採取し、液体に再懸濁し、接種に使用で
きる。当業者には、アグロバクテリウムの増殖手順および適切な培養条件、並び
に、その後の接種手順は公知である。接種に使用するアグロバクテリウム培養液
の密度およびアグロバクテリウム細胞と外植片の比は、系により異なり得、それ
故、任意の形質転換法におけるこれらのパラメータの最適化が期待される。

【００６５】 典型的には、アグロバクテリウム培養液は、画線プレートまたはグリセロール
ストックから接種し、一晩増殖し、細菌細胞を洗浄し、外植片の接種に適切な培
養培地に再懸濁する。本発明に適切な接種培地は、１／２ＭＳＰＬまたは１／２
ＭＳＶＩ（表３）を含むがこれに限定されない。好ましくは、接種培地に、増殖
阻害剤を補充する。増殖阻害剤の範囲および濃度は変化し得、薬剤および植物系
に依存する。本発明では、硝酸銀、チオ硫酸銀またはカルベニシリンが、好まし
い増殖阻害剤である。増殖阻害剤は、所望の効果を達成するのに必要な量で加え
る。硝酸銀は、好ましくは、約１μＭ（マイクロモル）から１ｍＭ（ミリモル）
、より好ましくは５μＭから１００μＭの濃度で接種培地に使用する。接種培地
に使用するカルベニシリンの濃度は、約５ｍｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌ、より好
ましくは約５０ｍｇ／Ｌである。アセトシリンゴンなどのアグロバクテリウム病
原性誘導物質も接種培地に添加できる。

【００６６】 好ましい実施形態において、接種に使用するアグロバクテリウムは、アセトシ
リンゴン、炭水化物および選択的抗生物質を含む、適切な塩を有する、緩衝化培
地などの培地にプレ誘導する。好ましい実施形態において、形質転換に使用する
アグロバクテリウム培養液は、約２８℃で、約２００μＭのアセトシリンゴンお
よび約２％のグルコースを補充したＡＢ−グルコース最小培地中（Ｃｈｉｌｔｏ
ｎら、１９７４；ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＤｒａｐｅｒ、１９８６）で
培養することによりプレ誘導する。プレ誘導培地中でのアグロバクテリウムの選
択的抗生物質の濃度は、選択に通常使用する濃度の約半分である。使用するアグ
ロバクテリウム細胞の密度は、約１０^７から１０^１０ｃｆｕ／ｍｌのアグロバク
テリウムである。より好ましくは、使用するアグロバクテリウム細胞の密度は、
約５×１０^８から４×１０^９である。接種前に、アグロバクテリウムを、１／２
ＭＳなどの適切な培地で洗浄できる。

【００６７】 形質転換プロセスの次段階は、接種である。この段階では、外植片およびアグ
ロバクテリウム細胞懸濁液を共に混合する。アグロバクテリウムおよび外植片（
群）の混合は、傷害段階前または後に行ない得る。本明細書に使用したような傷
害は、植物細胞を破壊し、それにより、アグロバクテリウムが植物細胞と相互作
用できるようにする任意の方法を意味する。当業者は、傷害の数多くの方法を認
識している。これらの方法は、植物組織の微粒子衝撃、超音波処理、真空吸引、
剪断、穿孔、突く、切断、または、メス、針または他の装置で植物組織を引裂く
ことを含むがこれに限定されない。接種の期間および条件およびアグロバクテリ
ウム細胞密度は、植物形質転換系に応じて変化する。接種は、一般に、約１５℃
から３０℃、好ましくは２３℃から２８℃、１分未満から約３時間までで実施す
る。接種はまた、真空吸引システムを使用しても実施できる。

【００６８】 任意のアグロバクテリウム増殖阻害剤または薬剤の組合せを接種培地に含める
ことができる。本発明では、硝酸銀、チオ硫酸銀、またはカルベニシリンなどの
増殖阻害剤の例が、ＭＳをベースとする接種培地に含まれる。接種培地中の硝酸
銀またはチオ硫酸銀の濃度の範囲は、１μＭから１ｍＭ、より好ましくは５μＭ
から１００μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭから５０μＭ、最も好ましく
は約２０μＭであり得る。接種培地中のカルベニシリンの濃度は、約５ｍｇ／Ｌ
から１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは約１０ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌ、さら
により好ましくは約５０ｍｇ／Ｌである。

【００６９】 接種後、任意の過剰のアグロバクテリウム懸濁液を除去し、アグロバクテリウ
ムおよび標的植物材料を共培養する。共培養は、接種後および遅延または選択培
地への移行前の時間を意味する。任意の数の植物組織培養培地を、共培養ステッ
プに使用できる。本発明では、１／２ＭＳをベースとした共培養培地などの減塩
培地（表４）を使用し、培地は、カゼイン加水分解物などの定義されていない添
加剤、およびＢ５ビタミンおよび有機添加物を含むがこれに限定されない、複合
培地添加物を欠失している。アグロバクテリウムでの接種後の植物組織を、液体
培地で培養できる。より好ましくは、アグロバクテリウムでの接種後の植物組織
を、アガロース、より好ましくは低ＥＥＯアガロースなどのゲル化剤で固形化し
た、半固体培養培地上で培養する。共培養期間は、約１時間から７２時間、好ま
しくは３６時間未満、より好ましくは約６時間から３５時間である。共培養培地
は、１つ以上のアグロバクテリウム増殖阻害剤（群）または増殖阻害剤の組合せ
を含むことができる。好ましくは、共培養培地は、硝酸銀、チオ硫酸銀、または
カルベニシリンなどのアグロバクテリウム増殖阻害剤を含む。硝酸銀またはチオ
硫酸銀の濃度は、好ましくは約１μＭから１ｍＭ、より好ましくは約５μＭから
１００μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭから５０μＭ、最も好ましくは約
２０μＭである。共培養培地中のカルベニシリンの濃度は、好ましくは約５ｍｇ
／Ｌから１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌ、さら
により好ましくは約５０ｍｇ／Ｌである。共培養は、典型的には、約１から３日
間、より好ましくは２４時間未満、約１８℃から３０℃、より好ましくは約２３
℃から２５℃の温度で実施する。共培養は、光または光の制限された条件下で実
施できる。好ましくは、共培養は、光の制限された条件下で実施する。本明細書
に使用したような光の制限された条件により、植物／アグロバクテリウム混合物
を含む培養皿を布、ホイルで覆う、または、培養皿を黒いバッグに入れる、また
は、培養細胞を暗い部屋に置くことを含むがこれに限定されない、共培養期間中
の光を制限する任意の条件を意味する。光条件は、当業者に公知のような各植物
系について最適化できる。

【００７０】 アグロバクテリウムと共培養した後、外植片を、選択培地に直接入れることが
できる。外植片は、連続的なステップまたは段階で、選択培地上で継代培養でき
る。例えば、第一選択培地は、少量の選択剤を含むことができ、次の継代培養液
は、高濃度の選択剤を含むことができ、その逆もある。外植片はまた、一定濃度
の選択剤上に直接入れることができる。別に、アグロバクテリウムと共に共培養
した後、外植片を、選択剤を含まない培地に入れることもできる。当業者は、植
物系および選択剤に応じて変化する、選択措置、培地、および増殖条件における
、数多くの変形を認識している。好ましい実施形態において、選択剤を用いずに
アグロバクテリウム増殖を阻害するために、抗生物質を含む非選択培地上でイン
キュベートした後、外植片を、選択増殖培地上で培養する。典型的な選択剤は、
ジェネテシン（Ｇ４１８）、カナマイシン、パロモマイシンなどの抗生物質、ま
たはグリフォセートなどの他の化学物質を含むがこれに限定されない。追加の適
切な培地成分を、選択または遅延培地に添加して、アグロバクテリウム増殖を阻
害できる。かかる培地成分は、カルベニシリンまたはセフォタキシムなどの抗生
物質を含むがこれに限定されない。

【００７１】 アグロバクテリウム増殖を阻害する共培養ステップ後、好ましくは、外植片を
選択または遅延培地上に置く前に、それらを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
をコードする遺伝子などのスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むがこれに
限定されない、形質転換ベクター上に含まれる、１つ以上の遺伝子（群）の存在
を検出するのに使用できる一過性アッセイにより、ＤＮＡ送達の効率について分
析できる。選択した数の外植片についての青い斑点（ＧＵＳ発現を示す）の総数
を、正のＤＮＡ導入効率相関として使用する。Ｔ−ＤＮＡ送達の効率およびアグ
ロバクテリウム増殖阻害剤のＴ−ＤＮＡ送達に対する効果および形質転換効率の
予測を、記載のような一過性分析で試験できる。Ｔ−ＤＮＡ導入プロセスの減少
により、コピー数は減少し、複雑な組込みパターンのような組込みの複雑性が、
別々のＴ−ＤＮＡの共組込みから発生し得る（ＤｅＮｅｖｅら、１９９７）。Ｔ
−ＤＮＡ導入および形質転換効率に影響を及ぼすことによる、コピー数の減少に
対する、アグロバクテリウム増殖阻害剤の効果は、一過性分析により、より好ま
しくは安定な形質転換植物で試験できる。組織化学的アッセイ、生物学的アッセ
イ、および分子分析を含むがこれに限定されない、任意の数の方法が適切である
。

【００７２】 好ましい実施形態において、追加の実験を、アグロバクテリウム細胞に対する
増殖阻害剤の効果を評価するために実施でき、植物を、任意の植物の形質転換系
のために増殖できる。例えば、アグロバクテリウム増殖は、形質転換プロセスに
おいて、異なる濃度および異なる時点で、１つ以上の増殖阻害剤の存在下および
非存在下でモニタリングできる。１つの実施形態において、アグロバクテリウム
に対する増殖阻害剤の効果は、増殖阻害剤（群）と比較しておよび比較せずに、
プロセスにおけるステップ後のアグロバクテリウムの回収を定量することにより
モニタリングできる。

【００７３】 別の実施形態において、植物細胞を、野生型腫瘍誘導アグロバクテリウム株で
感染し、腫瘍形成に対する１つ以上の増殖阻害剤の効果を、薬剤（群）の存在下
または非存在下での腫瘍形成を評価することにより評価できる。Ｔ−ＤＮＡ導入
は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）アッセイ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．
１９８７）のアッセイを含むがこれに限定されない、一過性アッセイに基づいて
モニタリングできる。

【００７４】 続いて培養物を形質転換された苗木の回収に適した培地に移す。当業者は形質
転換された植物の回収方法を多く知っている。植物形質転換およびトランスジェ
ニック植物の回収用の各植物系に関して種々の培地および移動の要件を実行し、
最適化できる。従って、本発明において開示されたかかる培地および培養条件を
修飾または栄養的に等価な成分、またはトランスジェニック体の選別および回収
のための類似の方法と置き換えることができ、これも本発明の範囲内になる。

【００７５】 製造された形質転換体を続いて分析し、形質転換ベクターに含まれる目的の特
定の核酸の存在または不在を決定する。分子分析には、非限定例としては、サザ
ーンブロット（サザーン、１９７５）またはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）分
析、免疫診断研究法、およびフィールド評価などがある。これらのおよびその他
の公知の方法を実施して、開示する方法により製造された形質転換植物の安定性
を確認することができる。これらの方法は当業者に公知であり、文献報告されて
いる（例えばＳａｍｂｔｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９））。

【００７６】 本発明により提供される方法および組成物の多くの利点は当業者には理解され
よう。以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を示すために含まれている。実
施例に開示された技術は本発明の実行おいて十分に機能するために発明者により
見出された本技術に従い、故にそれを実行するための好ましい様式を構成すると
考えられることを当業者は理解すべきである。しかしながら、本開示を鑑み、開
示される具体的な実施態様に多くの変更が為され、本発明の精神および範囲から
逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを当業者は理解
すべきである。

【００７７】 実施例 実施例１ 細菌株およびプラスミド 使用したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株および２価プ
ラスミドベクターを表１に列挙する。当業者に公知の標準的な分子生物学の技術
を用いてプラスミドベクターを構築した。簡単には、本明細書に記載する植物形
質転換ベクターは、非限定例としては、１つまたはそれ以上のＴ−ＤＮＡボーダ
ー配列（右ボーダー、ＲＢ；左ボーダー、ＬＢ）などを含んでなり、植物ゲノム
、複製エレメント、選別可能マーカーおよび１つまたはそれ以上の目的の遺伝子
への核酸分子の移動を促進する。試験したプラスミドーベクターを図１ないし図
５に示す。

【００７８】 プラスミドの簡単な説明は以下のとおりである：ｅ３５Ｓプロモーターは，−
９０ないし−３００領域の二重体を含有するカリフラワーモザイクウイルス（Ｃ
ａＭＶ）の３５ＳＲＮＡ３５Ｓプロモーターに由来する３５Ｓプロモーターの修
飾体である；ｎｏｓプロモーターはアグロバクテリウム・ツメファシエンツ（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｔｓ）ＰＴＩＴ３７に由来し
する；ＧＵＳ遺伝子は出発コドンでＮｃｏ部位を有するように修飾されたイー・
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するβ−グルクロニダーゼコーディング配列である
；ＳＴ−ＬＳ１＊ＮＴはソラナム・ルベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｒｕｂｅｒｏ
ｓｕｍ）由来のイントロンである；ｎｐｔＩＩ遺伝子（ｋａｎ）はネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼをコードする；ｎｏｓ３’領域はアグロバクテリウム
・ツメファシエンツ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｔｓ
）ｐＴＩＴ３７のＮＯＳ遺伝子の下流の未翻訳配列およびポリＡシグナルを含有
する；ｏｒｉ−Ｖは植物性の複製起点である；０ｒｉ−３２２は機能的複製起点
の公知の最小配列である；ＣＰ４遺伝子はＥＰＳＰシンターゼのコーディング配
列である（グリホサート除草剤に耐性を付与する）；ＧＦＰは緑経口タンパク質
の修飾コーディング配列である。選別可能（ｎｐｔＩＩ）およびレポーター遺伝
子（ｕｉｄＡ）は増強３５Ｓプロモーター（Ｅ３５Ｓ：ｆｉｇ．）に誘導され、
未翻訳ｈｓｐ７０イントロンが続く（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒら、（１９８６））；
ｕｉｄＡはコーディング配列内に別のイントロンを有し、細菌発現を最小限にす
る（Ｖａｎｃａｎｎｙｅｔら、（１９９０））；ｂａｒ遺伝子は除草剤ビアラフ
ォスに対する抵抗性を付与する；ｇｅｎｔ遺伝子はゲンタマイシンに対する抵抗
性を付与する；Ｐ−ｒａｃｔＩおよびｒａｃｔＩイントロンは各々イネアクチン
プロモーターおよびイネアクチンイントロンと称される。

【００７９】 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（２．５ｋｖおよび４００オームで
操作）を用いるエレクトロポレーションにより、２価プラスミドを異なるアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に導入した。接合完了体を適当
な構成物質を用いて半固体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）で選別した
。

【００８０】

【表１】

【００８１】 実施例２ アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の前誘導 ＡＢ基盤の誘導培地においてアセトシリンゴン（２００μＭ）およびグルコー
ス（２％）により、形質転換に用いたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）培養物を前誘導する（特記するものを除く）。方法は以下のとおりで
あった： 第１工程： 新たに培養したプレートからループの多い細菌コロニーを採り、適当な抗生物
質を含有するＬＢ培地５０ｍｌ中２８℃で１５ないし２４時間成長させた。培養
期間の終わりに細菌培養物の光学密度はＡ６６０で−１．４であった。

【００８２】 第２工程： これらの細胞の１０ｍｌアリコートを適当な抗生物質を含む新鮮ＬＢ５０ｍｌ
に移し、さらに６ないし８時間成長させた（光学密度〜１．２まで）。

【００８３】 第３工程： アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞を３２５０ｇで４℃
で１０分間遠心し、ペレットを前誘導培地に再懸濁し、最終光学密度Ａ６６０で
０．２にし、２８℃で１２ないし１５時間インキュベートした。

【００８４】 第４工程： 形質転換に使用する前に、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）細胞を３２５０ｇで４℃で１０分間遠心した。上澄をデカンテーションした後
、ペレットを１／２ＭＳ洗浄培地に再懸濁し（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物１ｌに１／２ＭＳ洗浄培地少なくとも１００ｍｌを用
いた）、５０ｍｌ遠心管に等分し、３２５０ｇで４℃で１０分間細胞を遠心し、
上澄を除去し、ペレットの入った管を用時まで氷中で保存した（アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞を氷上で４時間まで保存できる）。

【００８５】 試薬は市販により入手でき、多くの提供者から購入できる（例えばＳｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。

【００８６】

【表２】

【００８７】 前誘導培地の抗生物質濃度はＬＢ培地で用いる濃度の０．５Ｘである。例えば
ＬＢ培地で成長させたＥＨＡ１０１（ｐＭＯＮ２５４５７）の選別に用いた抗生
物質濃度はＫａｎ１００プラスＧｅｎｔ１００（μｇ／ｍｌで）であり、誘導培
地で用いたレベルは５０ｍｇ／ｌ カナマイシンおよび５０ｍｇ／ｌ ゲンタマ
イシンである。Ｃ５８−ＡＢＩ株選別に用いる濃度は：ＬＢ培地中１００ｍｇ／
ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ スペクチノマイシン、１００ｍｇ／ｌ ス
トレプトマイシン、および２５ｍｇ／ｌ クロラムフェニコール、並びに誘導培
地中５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／ｌ スペクチノマイシン、５０ｍ
ｇ／ｌ ストレプトマイシン、および２５ｍｇ／ｌ クロラムフェニコールであ
る。^１ 最終濃度 実施例３ 外植片調製 本研究ではいくつかの外植片を使用した： １）カランコエの若い植物を温室で成長させた。この植物の葉を形質転換実験に
使用した。 ２）最大−１００セル／クランプの大きさで、倍化時間およそ２日のブラック・
メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ：ＢＭＳ）の
Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．セルラインの微細懸濁液をＢＭＳを用いる実験で用いた
。ＢＭＳ細胞を修飾液体ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）・アンド・スクーグ（
Ｓｋｏｏｇ）培地（ＭＳ−ＢＭＳ）中維持した（表９）。懸濁培養物を１５０ｒ
ｐｍの水平振盪機中暗闇内、２８℃で維持し、新鮮培地５０ｍｌで細胞懸濁液５
ｍｌを希釈することにより２日間隔で継代培養した。 ３）未成熟胚：数種の穀物、例えばトウモロコシ、イネおよび小麦に由来する未
成熟胚を使用した。

【００８８】 トウモロコシ Ｈ９９、（Ｈ９９ Ｘ Ｐａ９１）Ａ１８８、Ｈ９９ ｘＡ１８８、ＬＨ１９
８ ｘ Ｈｉ−ＩＩなどのトウモロコシのいくつかの遺伝子型をこの研究で使用
した。受粉のおよそ１０日後、未成熟胚を含有する穂を収穫し、用時まで４℃で
冷蔵した（収穫後５日まで）。形質転換のこの方法に好ましい胚の大きさは、ハ
イブリッド（Ｐａ９１ｘＨ９９）Ａ１８８には〜１．５ないし２．５ｍｍである
。平均温度８７°Ｆ、ＧＥ１０００ワット高圧ナトリウムランプにより供給され
る光で補充して昼の長さを１４時間にする成長条件に従って、通常温室内で受粉
した後１０日でこの大きさに到達する。

【００８９】 イネ 一般に入手できるカリフォルニア品種Ｍ２０２を使用した。平均温度７８°Ｆ
昼／７０°Ｆ夜で、ＧＥ１０００ワット高圧ナトリウムランプにより供給される
光で補充して昼の長さ１４時間で、温室中母株を成長させた。開花後７ないし１
２日の植物から未成熟穀果を回収した。ＩＥを無菌的に切開し、形質転換に直接
用いるか、または接種前にＭＳカルス誘導培地（ＭＳＩ）で予め培養した。全培
養物を２３ないし２５℃の温度でインキュベートした。

【００９０】 小麦 春播き小麦トリチカム・アエスティバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕ
ｍ）栽培品種ボブホワイト（Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）を使用した。環境的に制御され
たチャンバー内で、高圧放電シルバニアライト（ＧＴＥ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃ
ｏｒｐ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ）により提供される８００μモル ｍ−
２ ｓ−１で１６時間の光周期で母株を成長させた。昼および夜の温度は１８／
１６℃であった。開花後１４日の植物から未成熟穀果を回収した。ＩＥを無菌的
に切開し、形質転換に直接用いるか、または接種前にＭＳカルス誘導培地（ＭＳ
Ｉ）で予め培養した。別のケースでは、培養物を２３ないし２５℃の温度でイン
キュベートした。

【００９１】 その他の外植片 このセクションで記載しない他のいずれかの外植片については具体的な実施例
で詳細を記載する。

【００９２】 実施例４ 接種 接種期間と条件およびアグロバクテリウム細胞密度は本発明の経過を通じて変
化しており、また、特定の実施例において詳細に説明されている。

【００９３】 以下の接種の方法は、ＢＭＳ懸濁細胞以外のすべての組織片に適用される。Ｂ
ＭＳ細胞懸濁液形質転換に関する手順は表８に掲載される。アグロバクテリウム
懸濁液は、アセトシリンゴン（２００μＭ）とその他の殺菌性化学物質を補充し
た１／２ＭＳ ＰＬ 培地を加えた （必要に応じて）、所望の光学密度（ＯＤ _Ａ６６０ １．０ ＝ １０^９ ｃｆｕ／ｍｌ）に再懸濁された。このアグロバ
クテリウム懸濁培養培地の３ ｍｌｓが、６−ウェルプレートの中に加えられた
（Ｃｏｓｔｅｒ未処理６−ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、マサチューセッ
ツ州アクトン市）。ＩＥは分離されて直接各ウェルの中に１０〜１５分間入れ（
組織片として新たに分離されたＩＥを使用する場合）、接種はその分離期間後に
付け加えた１分間の間に実施された。

【００９４】 その接種期間後に、そのアグロバクテリウム懸濁液の大部分は無菌移動ピペッ
トを使用してやさしく除去された。胚は無菌スパーテルでやさしく収集され、ま
た、〜５０個の胚を単一共培養プレートに移動させた。共培養の間、胚を含んで
いるそのプレートは、２３℃にて１〜３日間インキュベートされた。形質転換プ
ロセスの間、共培養プレートの光への曝露はホイールあるいは暗幕によりそのプ
レートを覆うことにより最小限度にされた。

【００９５】

【表３】

【００９６】 実施例５ 共培養 共培養のための条件（接種後の期間、および遅延、延長された共培養（カラン
コエの葉）あるいは選択培地に組織片を移動する前）はその植物系統によりさま
ざまに変化した。その使用されたさまざまな培地は以下の諸表中に概要されてい
る。

【００９７】

【表４】

【００９８】

【表５】

【００９９】 実施例６ トウモロコシ、小麦および米（さまざまな選択可能なマーカー）の形質転換の
諸方法

【０１００】

【表６】

【０１０１】

【表７】

【０１０２】

【表８】

【０１０３】

【表９】

【０１０４】

【表１０】

【０１０５】

【表１１】

【０１０６】

【表１２】

【０１０７】

【表１３】

【０１０８】

【表１４】

【０１０９】

【表１５】

【０１１０】 実施例７ Ｔ−ＤＮＡ送出の効率 各研究での遺伝子導入事象の数は、特に指示されない限り植物が分析された後
に測定された。形質転換効率（事象の数／外殖片の数、例えば未熟な胚は、研究
から研究まで変化し、そして様々な処理条件および様々な遺伝子型の間で変化し
た。

【０１１１】 様々の細胞型に対するＴ−ＤＮＡ送出の効率は、特定の実施例でいっそう詳細
に記述される。

【０１１２】 実施例８ トランスジェニック植物分析 上に記述されるとおりの適切な成長条件下で、植物を、温室で育成した。大半
の植物は、完全に受精していた。各植物を、以下の方法の１つまたはそれ以上に
よって試験した： ａ）植物の様々の部分を使用したＧＵＳ組織化学的アッセイ（Ｊｅｆｆｅｒｓ
ｏｎ，１９８７年）。

【０１１３】 ｂ）生物学的アッセイ（葉脱色アッセイ）。およそ２週齢の幼苗から得た葉サ
ンプル（葉打ち抜き）を、２４穴細胞培養クラスター（コスター・コーポレーシ
ョン（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マサチューセッツ州ケンブリ
ッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））のウエルに載せた。各ウエルを、３００ｍ
ｇ／Ｌパロモマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および１００ｍｇ／Ｌベンレー
ト（デュポンから製造された殺真菌剤）から構成される０．５ｍｌの水性溶液で
満たした。１００ｍｇ／Ｌベンレート単独を、対照として使用した。各植物の同
じ葉から得られた３つの葉サンプルを、それぞれ、パロモマイシン足すベンレー
トを含む２つのウエルに、そしてベンレート単独を含有する１つのウエルに入れ
た。非形質転換植物から得た葉サンプルを、陰性対照として使用した。サンプル
を、５分間、社内真空システムを用いたデシケーターで真空浸透させ、そしてそ
の後、クラスターを、パラフィルムで密着して封入してから、光（１４０μＭｏ
ｌｍ−２ｓ−１）の下に置いた。結果は、６０時間後に測定された。パロモマイ
シンに非常に耐性のある葉サンプルは、切断先端（＜１ｍｍ幅）を除くほとんど
の領域で緑色のままであり、それは、その植物が、機能性ｎｐｔＩＩ遺伝子を有
することを示した。遺伝子なし、または非機能性遺伝子を有する植物から得られ
る葉サンプルは、負の対照としてパロモマイシンによって完全に脱色されるか、
またはほんの小さなパッチの緑色の領域を示した。

【０１１４】 ｃ）サザンハイブリダイゼーション分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５年）。
ゲノムＤＮＡは、Ｓｈｕｒｅら（１９８３年）の方法にしたがって植物の葉組織
から単離された。１０から１５ミリグラムのゲノムＤＮＡを、適切な制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、そして０．８％アガロースゲルで分画した。標準手段（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）によって、ＤＮＡを、ハイボンドＮ膜（アメ
シャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、イリノイ州アリントン・ハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔ
ｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））に移行させた。ｐＭＯＮ１８３６５（図２）お
よびｐＭＯＮ２５４５７（図３）で形質転換したトウモロコシ植物についてのプ
ローブは、３５ｓ−ｈｓｐ断片を含有する〜１．５ｋｂ断片をゲル精製すること
によって作製された。トウモロコシ系列のゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化し
た。ｐＭＯＮ３２９０２で形質転換した米系列から得られるＤＮＡを、ＸｈｏＩ
で消化し、そしてＣＰ４遺伝子を含有するｐＭＯＮ２５４９２（図４）から得ら
れるゲル精製した〜１．６ｋｂ断片で釣上げた。ランダムプライマー標識キット
（プライム−ＩｔＩＩ、カリフォルニア州ラホーラ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ））
を用いて、プローブを、２．６×１０９ｃｐｍ／ｍｇの比活性まで、３２Ｐ ｄ
ＣＴＰで標識した。１４時間、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５
×デンバート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを含有す
る溶液中で、膜を、ハイブリッド形成させた。最終洗浄液の状態は、６０℃で、
１５分間、０．１％ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳであった。

【０１１５】 実施例９ 植物細胞の形質転換におけるアグロバクテリウム細胞の成長の間の成長阻害剤
の添加の効果 外殖片作製 ２つの外殖片は、この研究のために使用される： １）温室で育成されたカランコエ植物の幼生葉および ２）迅速に成長するＢＭＳ懸濁細胞。

【０１１６】 アグロバクテリウム細胞の作製 形質転換のために使用されたアグロバクテリウム細胞を、表２で記述されると
おりに予備誘導させた。カレンコエ葉の形質転換については、アグロバクテリウ
ム細胞を、なんら添加剤なしの（塩のみを用いた）ＭＳ接種培地で洗浄した。Ｂ
ＭＳ懸濁細胞の形質転換については、表８で記述されるとおりの標準プロトコー
ルに従った。 接種および同時栽培 ＢＭＳ懸濁細胞の形質転換を、表８で記述されるプロトコールにしたがって行
った。カランコエ葉を形質転換するために、アグロバクテリウム株Ａ２８１から
得られるカリス（ｃａｒｉｓ）の懸濁液を、ＷｈｉｔｅおよびＮｅｓｔｅｒで記
述されるとおり機械的傷つけを行った後に塗布した。二重ベクターｐＭＯＮ２５
４５７（図３）を宿すアグロバクテリウム株Ａ１３６を、負の対照として使用し
た。

【０１１７】 Ｔ−ＤＮＡ送出の効率 ＢＭＳ細胞へのＴ−ＤＮＡ送出の効率は、一過性ＧＵＳ発現後期同時栽培によ
って、並びに同時培養の４週後のフィルターの単独片に現れるＧＵＳ陽性コロニ
ーを染色することによって測定された。

【０１１８】 カランコエ葉へのＴ−ＤＮＡ送出の効率は、２０ｍｌのアグロバクテリウム株
Ａ２８１懸濁細胞を用いて、接種の４週後に、発酵中の麦芽形成を評価すること
によって測定された。

【０１１９】 実施例１０ アグロバクテリウム細胞の予備誘導の間の成長阻害剤の添加の効果 アグロバクテリウム細胞ＥＨＡ１０１：ｐＭＯＮ２５４５７（ＢＭＳ細胞を形
質転換させるために）およびＡ２８１（カランコエ葉を形質転換させるために）
を、ＡＢ培地中で上に記述されるとおり予備誘導した。予備誘導の間に、ＡｇＮ
Ｏ_３を、予備誘導培地に、２つの異なるレベル（２０μＭおよび４０μＭ最終濃
度）で添加した。誘導の前の最終光学濃度を、Ａ_６６０（ＯＤ ０．２）に調節
した。アグロバクテリウム細胞を、１５時間、予備誘導させた。光学濃度の測定
（成長の測定値）を、形質転換の直前に、予備誘導の終わりに行った。ＡｇＮＯ _３ の不在下で予備誘導されたアグロバクテリウム細胞を、対照として使用した。
成長およびＴ−ＤＮＡ移行における予備誘導段階の間のＡｇＮＯ_３の効果は、表
１６、表１７および表１８に示される。形質転換の前のアグロバクテリウム細胞
の成長の間のＡｇＮＯ_３の存在は、アグロバクテリウム細胞の成長およびＴ−Ｄ
ＮＡ移行能力を阻害する。半固形ＬＢプレート上でアグロバクテリウム細胞を平
板培養させることは、ＡｇＮＯ_３の存在下でのアグロバクテリウムの１５時間の
培養期間が、アグロバクテリウム細胞に致命的であることを示した。したがって
、アグロバクテリウム細胞が、成長阻害剤ＡｇＮＯ_３で処理された場合に、安定
な形質転換体は得られなかった。対照は、腫瘍（カレンコエ植物組織における株
Ａ２８１）およびＧＵＳ陽性カルス（ＢＭＳ懸濁細胞での株ＥＨＡ１０１０：ｐ
ＭＯＮ２５４５７）を生じた。

【０１２０】

【表１６】

【０１２１】

【表１７】

【０１２２】

【表１８】

【０１２３】 実施例１１ アグロバクテリウム細胞成長における同時培養の間の成長阻害剤の存在の効果 植物材料 種々のトウモロコシ外殖片、例えば受粉のおよそ１０日後に単離された未成熟
胚、およびカルス由来の未成熟胚、両方とも、Ｄ培地で培養された；未成熟胚か
ら由来し、そして修飾Ｎ６培地（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１年）で培養し
たカルス（Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型から由来したタイプＩＩカルス）；先に記述され
たとおりＢＭＳ懸濁細胞は、この研究で使用された。 アグロバクテリウム株およびプラスミド 二重ベクターｐＭＯＮ１８３６５（図２）を宿す無害化されたアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）株Ｃ５８（ＡＢ１）を、実施例で使用した。アグロバクテリウム株を、先に
記述されるとおり予備誘導させた。 接種および同時栽培 ３ｍｌの予備誘導アグロバクテリウム懸濁液（Ａ_６６０ＯＤ １．０）を、６
穴組織培養プレートに添加した。外殖片を添加した後に、植物組織およびアグロ
バクテリウム懸濁細胞を、３時間、真空浸透にかけた。３時間の真空浸透の後、
アグロバクテリウム懸濁液を除去し、そして植物組織を、１０μＭ ＡｇＮＯ_３ （最終濃度）を含有する半固形培地に載せた。全ての組織を、暗所で、３日間イ
ンキュベートした。 アグロバクテリウム細胞成長における同時培養の間のＡｇＮＯ_３の効果 同時培養の３日後に同時培養培地で、外殖片を囲むアグロバクテリウム細胞の
成長は観察されなかった。成長阻害剤なしに、全ての外殖片を、培地に移行させ
、そしてアグロバクテリウム成長の評価は、移行の７日後に観察された。アグロ
バクテリウム細胞の過多の成長が、外殖片の周囲で示された。したがって、同時
培養培地への成長阻害剤の添加は、ある種の細菌細胞の成長を阻害したが、しか
し、試験された条件下で全てのアグロバクテリウム細胞を死滅させはしなかった
。

【０１２４】 実施例１２ アグロバクテリウムの回復における同時培養期間のの間の成長阻害剤の存在の
効果 別の実施例では、未成熟胚を、実施例３で記述されるとおり単離させた。二重
ベクターｐＭＯＮ２５４５７（図３）を宿す無毒化されたアグロバクテリウム・
ツメファシエンス株ＥＨＡ１０１が使用された。アグロバクテリウム株は、実施
例２に記述されるとおり予備誘導された。３ｍｌの予備誘導アグロバクテリウム
懸濁液（Ａ_６６０ＯＤ ４．０）を、記述されるとおり、６穴組織培養プレート
に添加した。アグロバクテリウム懸濁細胞への外殖片の添加の後、接種を、１５
分間行った。アグロバクテリウム懸濁液を除去し、そして胚を、ＡｇＮＯ３（２
０μＭ最終濃度）を伴うか、またはなしの半固形培地に載せた。全ての組織を、
暗所で３日間インキュベートさせた。アグロバクテリウム存在の量は、接種直後
に未成熟胚を任意にサンプル採取することによって、最初に、そして同時培養期
間の終わりに再度、概算されて、未成熟な胚外殖片当たり付着したアグロバクテ
リウム細胞の数を決定した。結果は、表１９に表される。結果は、ＡｇＮＯ_３の
封入が、アグロバクテリウムの成長を明らかに阻害することを表した。

【０１２５】

【表１９】

【０１２６】 実施例１３ アグロバクテリウムの予備誘導は、成長阻害剤の存在下で同時培養された場合
に、Ｔ−ＤＮＡ送出を最適化する。

【０１２７】 トウモロコシ表現型Ｈ９９×Ａ１８８の未成熟胚および二重ベクターｐＭＯＮ
１８３６５を宿すアグロバクテリウム株ＡＢＩ（図２）を、使用した。アグロバ
クテリウム株を、先に記述されるとおりに予備誘導し、そして３ｍｌの予備誘導
されたアグロバクテリウム懸濁液（Ａ_６６０ＯＤ １．０、２．０、３．０およ
び４．０）を使用した。アグロバクテリウム懸濁細胞に外殖片を添加した後、１
５分間、接種を行った。アグロバクテリウム懸濁液を除去し、そして胚を、１０
μＭ ＡｇＮＯ_３（最終濃度）で補足した１／２ＭＳトウモロコシ同時培養培地
に載せた。同時培養期間は、暗所で３日間であった。Ｔ−ＮＡ送出の効率は、同
時培養の３日後、１２−１５時間、ＧＵＳ染色緩衝液で直接胚をインキュベート
させ、そして未成熟胚外殖片当たりＧＵＳフォーカスの数を計数することによる
一過性ＧＵＳ分析によって概算された（表２０）。アグロバクテリウム細胞の濃
度を増加させることは、アグロバクテリウム細胞が、ＬＢ培地で育成される場合
に、トウモロコシ組織へのＴ−ＤＮＡ移行の頻度における影響は示さなかった。
予備誘導段階の処理について、一過性ＧＵＳ発現によって測定されるとおりＴ−
ＤＮＡ移行は、アグロバクテリウム濃度が、１．０のＯＤ_６６０から４．０に増
加した時に増加した。

【０１２８】

【表２０】

【０１２９】 実施例１４ Ｔ−ＤＮＡ移行および植物細胞成長における同時培養中の成長阻害剤の存在の
効果 遺伝子型Ｈ９９×Ａ１８８の未成熟胚を、上に記述されるとおり単離した。二
重ベクターｐＭＯＮ１８３６５を宿す無害化されたアグロバクテリウム株ＡＢＩ
を使用した。アグロバクテリウム株を、上に示すとおり予備誘導し、そして３ｍ
ｌの予備培養アグロバクテリウム懸濁液（Ａ_６６０ＯＤ ４．０）を、先に記述
されたとおり６穴組織培養プレートに添加した。３時間、真空下で接種を行った
。アグロバクテリウム懸濁液を除去し、そして胚を、種々の濃度のＡｇＮＯ_３（
０、１０、２０、４０、６０ｍＭ ＡｇＮＯ_３最終濃度）を含有する個々の半固
形培地に載せた。全ての組織を、暗所で、３日間インキュベートした。Ｔ−ＤＮ
Ａ送出の効率は、未成熟胚外殖片当たりのＧＵＳフォーカスの数を計数すること
により、同時培養の３日コロニー刺激因子に行われた一過性ＧＵＳ分析によって
概算された（表２１）。培養反応の効率は、胚を、遅延培地（５００ｍｇ／Ｌカ
ルベニシリンで補足したＤ培地）に移行させ、そして移行の２週後に観察を行う
ことによって測定された。同時培養中の１０μＭ ＡｇＮＯ_３の存在は、ＧＵＳ
フォーカスおよび生存した組織の平均数によって測定されるとおりＴ−ＤＮＡ移
行の頻度において正の効果を示した。ＡｇＮＯ_３のレベルを、２０μＭまで増加
させることは、Ｔ−ＤＮＡ移行の数を減少させたが、培養に応答する胚の頻度を
増加させた。ＡｇＮＯ_３のレベルを、６０μＭまで増加させることは、Ｔ−ＤＮ
Ａ移行に対して阻害性があることが分かったが、高いレベルは、培養反応をはっ
きりと分かるほど増加しなかった。結果は、ＡｇＮＯ_３のような成長阻害剤の濃
度が、滴定されて、Ｔ−ＤＮＡ移行の所望の効率を得うることを示した。

【０１３０】

【表２１】

【０１３１】 実施例１５ 成長阻害剤を用いた同時培養中のアグロバクテリウム密度の減少は、トウモロコ
シ、米および小麦の形質転換の頻度を増加させる 外殖片作製 この研究に使用された外殖片は、未成熟胚であり、そして先に記述されるとお
り作製された。 アグロバクテリウム形質転換および選択： 以下の形質転換プロトコールは、以下のパラメーターを含んだ：２４時間未満
の間、予備培養された未成熟胚の使用：細菌接種密度＞ＯＤ_６６０で２．０。１
から３日間の同時培養期間。正常な組織培養中に要求されるより高い濃度のオー
キシン、または様々の型のオーキシン／成長調節剤の組合せの使用。作物および
選択スキームにより、同時培養（選択圧力なしの）当初の外殖片の予備培養なし
、段階的増加または減少に続く２−７日の遅延期間、および９−１２週の間の形
質転換期間。

【０１３２】

【表２２】

【０１３３】 実施例１６ 接種培地に対する成長阻害剤の効果 トウモロコシ遺伝子型ＬＨ１９８Ｘ Ｈｉ−ＩＩを使用した。トウモロコシ未
成熟胚を、先に記述されるとおり単離した。およそ３０個の未成熟胚に、各処理
について、５分間、プラスミドｐＭＯＮ１８３６５を宿すアグロバクテリウム株
ＡＢＩを接種させ、そして２から３日間、同時培養培地に載せた。処理当たり４
重の複写物があった。４つの処理は、 処理１：成長阻害剤の不在（接種および同時培養培地の両方で） 処理２：接種培地中で剤の不在：同時培養培地で剤の存在（２０μＭ硝酸銀） 処理３：接種培地中で剤の存在（２０μＭ硝酸銀）：同時培養培地で剤の不在 処理４：接種および同時培地の両方中で剤の存在（２０μＭ硝酸銀） を含む。

【０１３４】 各処理内で、５個の未成熟胚を、一過性分析のために使用した。これは、各処
理内の全ての代表にわたって繰返された。ＧＵＳスポットの数は、表２３に示さ
れるとおり胚盤の表面（胚盤側面上向き）の両方で測定され、そしてＧＵＳスポ
ットの数は、表２４で示されるとおり胚の軸側で測定された。結果は、接種培地
および同時培養培地中のアグロバクテリウム成長阻害剤の存在が、接種または同
時培養培地のいずれかでの剤の存在、または阻害剤なしに比べて、ＧＵＳスポッ
トの数を減少させることを示した。したがって、接種段階中、および同時培養段
階中のアグロバクテリウム成長阻害剤の存在は、Ｔ−ＤＮＡ移行およびコピー数
を減少させるために使用された。Ｔ−ＤＮＡ移行は、組織（同時培養プレート上
の成長阻害剤に最も近い）の底面である組織の軸側におけるＧＵＳスポットの数
おける減少によって示されるとおり、阻害剤の位置に関して組織の配向正によっ
ても影響された（表２４）。

【０１３５】

【表２３】

【０１３６】

【表２４】

【０１３７】 実施例１７ 接種中の成長阻害剤の添加はコーンにおける形質転換効率を改善する 遺伝子型（ＨＰＰｘＰａ９１）Ａ１８８の未熟胚を記載されているように単離
した。バイナリーベクターｐＭＯＮ２５４２７（図３）を有するアグロバクテリ
ウム菌株ＥＨＡ １０１を使用した。アグロバクテリウム菌株を記載されている
ように前誘導し、２０μＭ ＡｇＮＯ_３を補充した前誘導アグロバクテリウム懸
濁液（Ａ_６６０ＯＤ ６．５）３ｍｌを上記したように６ウェル組織培養プレー
トに添加した。接種を１５分間実施した。アグロバクテリウム懸濁液を除去し、
胚を２０μＭ ＡｇＮＯ_３（最終濃度）を含有する半固体共培養培地上に置いた
。すべての組織を暗所で３日間インキュベートした。形質転換プロトコルは実施
例６に記載に従った。対照胚は、形質転換のすべてのステップでＡｇＮＯ_３の非
存在下で培養した。形質転換効率をパロモマイシン耐性カルスを産生する胚の数
に基づいて計算した。結果は、接種中にＡｇＮＯ_３のような成長阻害剤を添加す
ると形質転換効率が上昇することを示す。

【０１３８】

【表２５】

【０１３９】 実施例１８ アグロバクテリウムの成長に対する他の化学物質の効果 表２６に示す各化学物質をＭＳ−ＢＭＳ培地に再懸濁し、アグロバクテリウム
（ＡＢ１菌株）の一晩培養物５０ｍｌに添加した（最終濃度５０μＭ）。接種か
ら２４時間後、アグロバクテリウムの成長に対する化学物質の効果を調べた。公
知の殺菌性化合物カルベニシリン（最終濃度５０ｍｇ／Ｌ）及びＡｇＮＯ_３（２
０μＭ）を対照として使用した。「成長なし」は、当該化学物質の殺菌または静
菌特性を示す細胞密度の増加が見られなかったことを示す。「ゆっくり成長」は
、細胞密度の僅かな増加が認められ、より高レベルでは死に至るおそれがある。
「成長」は、使用した濃度では対照培地に比較して細菌成長に対する効果はなく
、成長に対する効果を引き出すためにはより高濃度が必要である。

【０１４０】

【表２６】

【０１４１】 実施例１９ 各種成長阻害剤との共培養中のアグロバクテリウム密度の低下によりコーンの形 質転換が改善する 遺伝子型（ＨＰＰｘＰａ９１）Ａ１８８の未熟胚を記載されているように単離
した。バイナリーベクターｐＭＯＮ２５４５７（図３）を有するアグロバクテリ
ウム菌株ＥＨＡ １０１を使用した。アグロバクテリウム菌株を記載されている
ように前誘導した。接種はＡ_６６０ＯＤ ４．０の濃度を用いて記載されている
ように１５分間実施した。後接種：アグロバクテリウム懸濁液を除去し、胚を各
種殺菌性化合物を補充した異なる半固体共培養培地上に置いた。すべての組織を
暗所で３日間インキュベートした。形質転換プロトコルは上記（コーンＩＥ形質
転換）したように従った。ただし、５０ｍｇ／Ｌ パロモマイシンを用いる第１
回選択を２５ｍｇ／Ｌ パロモマイシン×２週間及び５０ｍｇ／Ｌ パロモマイ
シン×更に２週間に変えた。形質転換効率を、上記した葉漂白剤アッセイ(leaf
bleach assay)で測定したようにｎｐｔＩＩ陽性植物を産生する胚の数に基づい
て計算した。形質転換から３週間後、各種成長阻害剤の存在下で共培養したＩＥ
誘導カルスの品質及び成長特性を調べた。各種物質を含有する共培養培地に対す
る培養応答は以下の通りであった。５０μＭ ＡｇＮＯ_３は最も多くのコンピテ
ントカルスを胚成長的に産生した＞２０Ｍ ＡｇＮＯ_３＞カルベニシリン＞添加
剤なし＞Ｋ_２ＣｒＯ_４は最も少ないコンピテントカルスを胚成長的に産生した。
結果は、硝酸銀のような成長阻害剤を共培養中に添加したときに高頻度の形質転
換が得られ得ることを示す。ＡｇＮＯ_３の濃度を２０μＭから５０μＭに増加さ
せたときに高い培養応答が達成されたが、形質転換レベルは低下した（Ｔ−ＤＮ
Ａ転移の低頻度）。Ｋ_２ＣｒＯ_４の添加は有害であった。これは多分、化学物質
のアグロバクテリウムに対する影響に加えて、化学物質は植物細胞健康に対して
非常に悪影響を与えるからである。データは、形質転換効率の増加は培養応答の
改善よりもむしろ共培養中のアグロバクテリウム成長の阻害に関連していること
を示した。

【０１４２】

【表２７】

【０１４３】 実施例２０ 穀物のアグロバクテリウムでの形質転換のための新規外植片：３の遺伝子を含有 するハイブリッド胚を用いるコーンの形質転換の改善 形質転換を改善するための成長阻害剤の影響を調べるためにハイブリッドコー
ン胚を使用した。表２８に示すデータは、より早く分裂する細胞系を使用すると
形質転換頻度が増加し得ることを示した。更に、より早く細胞分裂すると当該複
合体またはマルチコピーを有する形質転換事象を選択／排除することが可能であ
り得る。

【０１４４】 異なるコーン遺伝子型（例えば、Ｈ９９、Ｈ９９ｘＡ１８８及び（Ｈ９９ｘＰ
ａ９１）Ａ１８８）の未熟胚を記載されているように単離した。バイナリーベク
ターｐＭＯＮ２５４５７（図３）を有するアグロバクテリウム菌株ＥＨＡ １０
１またはバイナリーベクターｐＭＯＮ１８３６５（図２）を有するＡＢＩを使用
した。アグロバクテリウム菌株を記載されているように前誘導した。接種はＡ_{６ ６０} ＯＤ ４．０の濃度を用いて記載されているように１５分間実施した。接種
後、アグロバクテリウム懸濁液を除去し、２０μＭ ＡｇＮＯ_３を補充した半固
体共培養培地上に胚を置いた。すべての組織を暗所で３日間インキュベートした
。前記した形質転換プロトコルに従った。ただし、遺伝子型Ｈ９９に関して、５
０ｍｇ／Ｌ パロモマイシンでの第１回選択を２５ｍｇ／Ｌ パロモマイシン×
２週間及び５０ｍｇ／Ｌ パロモマイシン×更に２週間に変えた。形質転換効率
を、前記した葉漂白剤アッセイで測定したｎｐｒＩＩ陽性植物を産生する胚の数
に基づいて計算した。表２８に示すデータから、３遺伝子型を含有するより早く
分裂する細胞を使用すると形質転換頻度がより高くなりることが明らかである。

【０１４５】

【表２８】

【０１４６】 実施例２１ 共培養中の殺菌性化合物の使用による低コピー数インサートを有する形質転換事 象の産生 コーン及びコメの未熟胚を、上記した共培養中に成長阻害剤を含む方法を用い
てバイナリーベクターｐＭＯＮ １８３６５（図２）を有するアグロバクテリウ
ム菌株ＡＢＩ １０１及びバイナリーベクターｐＭＯＮ３２０９２（図５）を有
するＥＨＡ １０１で形質転換した。コピー数の分析は上記したサザンハイブリ
ダイゼーションを用いて実施した。表２９に示すデータは、成長阻害剤を使用す
ると、今までに公開された他の形質転換系（Ｈｉｅｉら，１９９４及びＩｓｈｉ
ｄａら，１９９６）を用いて達成された場合に比して非常に高い頻度でインサー
トの１〜２コピー数を有する植物が産生されたことを示す。

【０１４７】

【表２９】

【０１４８】 実施例２２ リポーター遺伝子の高い共発現を有する形質転換事象の産生 コーン及びコメの未熟胚を、上記した共培養中に成長阻害剤を含む方法を用い
てバイナリーベクターｐＭＯＮ １８３６５（図２）を有するアグロバクテリウ
ム菌株ＡＢＩ １０１及びバイナリーベクターｐＭＯＮ２５４５７（図３）を有
するＥＨＡ １０１で形質転換した。共形質転換効率を、上記した組織化学染色
を用いてＧＵＳを発現するｎｐｔＩＩ陽性植物の数を測定することにより計算し
た。表３０に示すデータは、成長阻害剤を使用すると植物が高い共発現頻度で産
生されたことを示した。

【０１４９】

【表３０】

【０１５０】 実施例２３ リポーター遺伝子の高い共発現での形質転換事象の産生 ２つの異なる遺伝子型のコーンの未熟胚を、上記した共培養中に成長阻害剤を
含む方法を用いてバイナリーベクターｐＭＯＮ２５４５７（図３）を有するアグ
ロバクテリウム菌株ＥＨＡ １０１で形質転換した。分離分析を、１００ｍｇ／
Ｌ パロモマイシンを含有するＭＳＯＤ培地においてコントロール受粉（戻し交
雑）後１２〜１４日にコーンの未熟胚を発芽させることにより実施した。表３１
に示すデータは、成長阻害剤を使用すると単一座での移植遺伝子の存在下で植物
は高い事象で産生されたことを示す。この座の大部分が低いコピーインサート（
コメで＞５０％の単コピー、コーンで＞８７％の単コピー）を含むことの証拠は
既に提示されている。更に、前記結果から、３つ以上の遺伝子型を組み合わせる
とＨ９９よりも単一分離座でより多数の植物が産生されたことも明らかである。
このことは、より早い細胞分裂により複合体またはインサートのマルチコピーを
含む形質転換事象が選択／排除され得るという本出願人の前記結果を裏付ける。

【０１５１】

【表３１】

【０１５２】 実施例２４ 成長阻害剤の添加と共に高濃度のオーキシンはコメにおける形質転換効率を改善 する コメの未熟胚を、上記した共培養中に成長阻害剤２０μＭ ＡｇＮＯ_３を含む
方法を用いてバイナリーベクターｐＭＯＮ２５４５７（図３）を有するアグロバ
クテリウム菌株ＥＨＡ １０１で形質転換した。形質転換効率を、上記したよう
にｎｐｔＩＩ陽性事象／接種した胚の総数基づいて測定した。結果は、共培養中
にピコラムの添加とオーキシンまたは２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを組み合わせると
形質転換効率が改善されることを示した。更に、上記したコーン形質転換プロト
コルは共培養培地中に３ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを使用した。このレベルは、コー
ンの胚形成カルスの誘導及びコーンの胚形成カルスの定期的維持のためにしばし
ば非常に高い。

【０１５３】

【表３２】

【０１５４】

【参考文献】

【０１５５】

【表３３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＭＯＮ３０１００のプラスミドマップである。

【図２】 ｐＭＯＮ１８３６５のプラスミドマップである。

【図３】 ｐＭＯＮ２５４５７のプラスミドマップである。

【図４】 ｐＭＯＮ２５４９２のプラスミドマップである。

【図５】 ｐＭＯＮ３２０９２のプラスミドマップである。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年４月１０日（２００２．４．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項３】 前記成長阻害剤が抗生物質である請求項１に記載の方法。

【請求項４】 前記抗生物質がカルベニシリンである請求項３に記載の方法
。

【請求項５】 前記成長阻害剤が、アグロバクテリウム細胞成長およびＴ−
ＤＮＡ転移プロセスを抑制することができる核酸である請求項１に記載の方法。

【請求項６】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、単子葉植物由来
のものである請求項１に記載の方法。

【請求項７】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、双子葉植物由来
のものである請求項１に記載の方法。

【請求項８】 前記単子葉植物が穀物である請求項６に記載の方法。

【請求項９】 前記単子葉植物が、トウモロコシ、小麦またはイネである請
求項６に記載の方法。

【請求項１０】 前記双子葉植物が、大豆、棉、カノーラまたはヒマワリで
ある請求項７に記載の方法。

【請求項１１】 アグロバクテリウム介在プロセスを用いる植物細胞または
植物組織の形質転換方法において、 植物の細胞または組織に転移可能な１以上の遺伝子成分を有するアグロバクテ
リウムを形質転換可能な植物細胞または組織に接種する段階； 前記遺伝子成分を発現する植物細胞もしくは組織の成長を抑制することができ 、さらに 成長阻害剤を含む培地であって、前記成長抑制剤が、抗生物質、蛋白質 、核酸、細胞抽出物、成長調節剤またはアグロバクテリウムの成長を阻害もしく は抑制することができる二次代謝物からなる群から選択される培地中において 、
接種後の前記形質転換可能な植物細胞または組織を共培養する段階； 形質転換植物細胞または組織を選択する段階； 前記選択植物細胞または組織から前記遺伝子成分を発現する形質転換植物を再
生する段階 を含む方法。

【請求項１３】 前記成長阻害剤が抗生物質である請求項１１に記載の方法
。

【請求項１４】 前記抗生物質がカルベニシリンである請求項１３に記載の
方法。

【請求項１５】 前記成長阻害剤が、アグロバクテリウム細胞成長およびＴ
−ＤＮＡ転移プロセスを抑制することができる核酸である請求項１１に記載の方
法。

【請求項１６】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、単子葉植物由
来のものである請求項１１に記載の方法。

【請求項１７】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、双子葉植物由
来のものである請求項１１に記載の方法。

【請求項１８】 前記単子葉植物が穀物である請求項１６に記載の方法。

【請求項１９】 前記単子葉植物が、トウモロコシ、小麦またはイネである
請求項１６に記載の方法。

【請求項２０】 前記双子葉植物が、大豆、棉、カノーラまたはヒマワリで
ある請求項１９に記載の方法。

【請求項２１】 アグロバクテリウム介在プロセスを用いる植物細胞または
植物組織の形質転換方法において、 １以上の成長阻害剤存在下に、植物の細胞または組織に転移可能な１以上の遺
伝子成分を有するアグロバクテリウムを形質転換可能な植物細胞または組織に接
種する段階（前記成長抑制剤は、抗生物質、蛋白質、核酸、細胞抽出物、成長調 節剤またはアグロバクテリウムの成長を阻害もしくは抑制することができる二次 代謝物からなる群から選択される） ； 前記遺伝子成分を発現する植物細胞もしくは組織の成長を抑制することができ
る培地であって、成長阻害剤をさらに含む培地にて、接種後の前記形質転換可能
な植物細胞または組織を共培養する段階（前記成長抑制剤は、抗生物質、蛋白質 、核酸、細胞抽出物、成長調節剤またはアグロバクテリウムの成長を阻害もしく は抑制することができる二次代謝物からなる群から選択される） ； 形質転換植物細胞または組織を選択する段階； 前記選択植物細胞または組織から前記遺伝子成分を発現する形質転換植物を再
生する段階 を含む方法。

【請求項２２】 接種および共培養時に前記成長阻害剤を存在させて、アグ
ロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ転移プロセスを低下させる請求項２１に記載の方法
。

【請求項２３】 前記成長阻害剤が抗生物質である請求項２１に記載の方法
。

【請求項２４】 前記抗生物質がカルベニシリンである請求項２３に記載の
方法。

【請求項２５】 前記成長阻害剤が、アグロバクテリウム細胞成長およびＴ
−ＤＮＡ転移プロセスを抑制することができる核酸である請求項２１に記載の方
法。

【請求項２６】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、単子葉植物由
来のものである請求項２１に記載の方法。

【請求項２７】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、双子葉植物由
来のものである請求項２１に記載の方法。

【請求項２８】 前記単子葉植物が穀物である請求項２６に記載の方法。

【請求項２９】 前記単子葉植物が、トウモロコシ、小麦またはイネである
請求項２６に記載の方法。

【請求項３０】 前記双子葉植物が、大豆、棉、カノーラまたはヒマワリで
ある請求項２７に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＥ，ＡＬ，Ａ Ｍ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ， ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2B030 AA00 CA04 CA07 CA15 CA17 CA19 CD05 CD07 CD11 4B065 AA88X AA88Y AB01 BA02 BB40 BD22 BD35 CA53

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アグロバクテリウム介在プロセスを用いる植物細胞または植
   物組織の形質転換方法において、 １以上の成長阻害剤の存在下に植物の細胞または組織に転移可能な１以上の遺
   伝子成分を有するアグロバクテリウムを形質転換可能な植物細胞または組織に接
   種する段階； 前記遺伝子成分を発現する植物細胞もしくは組織の成長を抑制することができ
   る培地であって、成長阻害剤を含まない培地にて、接種後の前記形質転換可能な
   植物細胞または組織を共培養する段階； 形質転換植物細胞または組織を選択する段階； 前記選択植物細胞または組織から前記遺伝子成分を発現する形質転換植物を再
   生する段階 を有することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 接種時に前記成長阻害剤を存在させて、アグロバクテリウム
   のＴ−ＤＮＡ転移プロセスを低下させる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記成長阻害剤が、抗生物質、重金属イオンを含む化合物、
   ならびに蛋白、核酸、細胞抽出物、成長調節剤、またはアグロバクテリウムの成
   長を阻害もしくは抑制することができる二次代謝物からなる群から選択される請
   求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記重金属イオンを含む化合物が、銀、カリウム、マンガン
   またはカドミウムを含む請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記重金属イオンが銀である請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記成長阻害剤が硝酸銀である請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 硝酸銀の濃度が約５μＭ〜約５０μＭである請求項６に記載
   の方法。
8. 【請求項８】 硝酸銀の濃度が約２０μＭである請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記成長阻害剤がチオ硫酸銀である請求項３に記載の方法。
10. 【請求項１０】 チオ硫酸銀の濃度が約５μＭ〜約５０μＭである請求項９
    に記載の方法。
11. 【請求項１１】 チオ硫酸銀の濃度が約２０μＭである請求項１０に記載の
    方法。
12. 【請求項１２】 前記成長阻害剤が抗生物質である請求項３に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記抗生物質がカルベニシリンである請求項１２に記載の
    方法。
14. 【請求項１４】 前記成長阻害剤が、アグロバクテリウム細胞成長およびＴ
    −ＤＮＡ転移プロセスを抑制することができる核酸である請求項３に記載の方法
    。
15. 【請求項１５】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、単子葉植物由
    来のものである請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、双子葉植物由
    来のものである請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記単子葉植物が穀物である請求項１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記単子葉植物が、トウモロコシ、小麦または米である請
    求項１６に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記双子葉植物が、大豆、棉、カノーラまたはヒマワリで
    ある請求項１７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記単子葉植物がトウモロコシである請求項１８に記載の
    方法。
21. 【請求項２１】 前記単子葉植物が小麦である請求項１８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記単子葉植物が米である請求項１８に記載の方法。
23. 【請求項２３】 アグロバクテリウム介在プロセスを用いる植物細胞または
    植物組織の形質転換方法において、 植物の細胞または組織に転移可能な１以上の遺伝子成分を有するアグロバクテ
    リウムを形質転換可能な植物細胞または組織に接種する段階； 前記遺伝子成分を発現する植物細胞もしくは組織の成長を抑制することができ
    る培地であって、成長阻害剤をさらに含む培地にて、接種後の前記形質転換可能
    な植物細胞または組織を共培養する段階； 形質転換植物細胞または組織を選択する段階； 前記選択植物細胞または組織から前記遺伝子成分を発現する形質転換植物を再
    生する段階 を有することを特徴とする方法。
24. 【請求項２４】 共培養時に前記成長阻害剤を存在させて、アグロバクテリ
    ウムのＴ−ＤＮＡ転移プロセスを低下させる請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記成長阻害剤が、抗生物質、重金属イオンを含む化合物
    、ならびに蛋白、核酸、細胞抽出物、成長調節剤、またはアグロバクテリウムの
    成長を阻害もしくは抑制することができる二次代謝物からなる群から選択される
    請求項２３に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記重金属イオンを含む化合物が、銀、カリウム、マンガ
    ンまたはカドミウムを含む請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記重金属イオンが銀である請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記成長阻害剤が硝酸銀である請求項２５に記載の方法。
29. 【請求項２９】 硝酸銀の濃度が約５μＭ〜約５０μＭである請求項２８に
    記載の方法。
30. 【請求項３０】 硝酸銀の濃度が約２０μＭである請求項２９に記載の方法
    。
31. 【請求項３１】 前記成長阻害剤がチオ硫酸銀である請求項２５に記載の方
    法。
32. 【請求項３２】 チオ硫酸銀の濃度が約５μＭ〜約５０μＭである請求項３
    １に記載の方法。
33. 【請求項３３】 チオ硫酸銀の濃度が約２０μＭである請求項３２に記載の
    方法。
34. 【請求項３４】 前記成長阻害剤が抗生物質である請求項２５に記載の方法
    。
35. 【請求項３５】 前記抗生物質がカルベニシリンである請求項３４に記載の
    方法。
36. 【請求項３６】 前記成長阻害剤が、アグロバクテリウム細胞成長およびＴ
    −ＤＮＡ転移プロセスを抑制することができる核酸である請求項２５に記載の方
    法。
37. 【請求項３７】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、単子葉植物由
    来のものである請求項２３に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、双子葉植物由
    来のものである請求項２３に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記単子葉植物が穀物である請求項３７に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記単子葉植物が、トウモロコシ、小麦または米である請
    求項３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記双子葉植物が、大豆、棉、カノーラまたはヒマワリで
    ある請求項３８に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記単子葉植物がトウモロコシである請求項４０に記載の
    方法。
43. 【請求項４３】 前記単子葉植物が小麦である請求項４０に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記単子葉植物が米である請求項４０に記載の方法。
45. 【請求項４５】 アグロバクテリウム介在プロセスを用いる植物細胞または
    植物組織の形質転換方法において、 １以上の成長阻害剤存在下に、植物の細胞または組織に転移可能な１以上の遺
    伝子成分を有するアグロバクテリウムを形質転換可能な植物細胞または組織に接
    種する段階； 前記遺伝子成分を発現する植物細胞もしくは組織の成長を抑制することができ
    る培地であって、成長阻害剤をさらに含む培地にて、接種後の前記形質転換可能
    な植物細胞または組織を共培養する段階； 形質転換植物細胞または組織を選択する段階； 前記選択植物細胞または組織から前記遺伝子成分を発現する形質転換植物を再
    生する段階 を有することを特徴とする方法。
46. 【請求項４６】 接種および共培養時に前記成長阻害剤を存在させて、アグ
    ロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ転移プロセスを低下させる請求項４５に記載の方法
    。
47. 【請求項４７】 前記成長阻害剤が、抗生物質、重金属イオンを含む化合物
    、ならびに蛋白、核酸、細胞抽出物、成長調節剤、またはアグロバクテリウムの
    成長を阻害もしくは抑制することができる二次代謝物からなる群から選択される
    請求項４５に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記重金属イオンを含む化合物が、銀、カリウム、マンガ
    ンまたはカドミウムを含む請求項４７に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記重金属イオンが銀である請求項４８に記載の方法。
50. 【請求項５０】 前記成長阻害剤が硝酸銀である請求項４７に記載の方法。
51. 【請求項５１】 硝酸銀の濃度が約５μＭ〜約５０μＭである請求項５０に
    記載の方法。
52. 【請求項５２】 硝酸銀の濃度が約２０μＭである請求項５１に記載の方法
    。
53. 【請求項５３】 前記成長阻害剤がチオ硫酸銀である請求項４７に記載の方
    法。
54. 【請求項５４】 チオ硫酸銀の濃度が約５μＭ〜約５０μＭである請求項５
    ３に記載の方法。
55. 【請求項５５】 チオ硫酸銀の濃度が約２０μＭである請求項５４に記載の
    方法。
56. 【請求項５６】 前記成長阻害剤が抗生物質である請求項４７に記載の方法
    。
57. 【請求項５７】 前記抗生物質がカルベニシリンである請求項５６に記載の
    方法。
58. 【請求項５８】 前記成長阻害剤が、アグロバクテリウム細胞成長およびＴ
    −ＤＮＡ転移プロセスを抑制することができる核酸である請求項４７に記載の方
    法。
59. 【請求項５９】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、単子葉植物由
    来のものである請求項４５に記載の方法。
60. 【請求項６０】 前記形質転換可能な植物細胞または組織が、双子葉植物由
    来のものである請求項４５に記載の方法。
61. 【請求項６１】 前記単子葉植物が穀物である請求項５９に記載の方法。
62. 【請求項６２】 前記単子葉植物が、トウモロコシ、小麦または米である請
    求項６１に記載の方法。
63. 【請求項６３】 前記双子葉植物が、大豆、棉、カノーラまたはヒマワリで
    ある請求項６０に記載の方法。
64. 【請求項６４】 前記単子葉植物がトウモロコシである請求項６２に記載の
    方法。
65. 【請求項６５】 前記単子葉植物が小麦である請求項６２に記載の方法。
66. 【請求項６６】 前記単子葉植物が米である請求項６２に記載の方法。