JPH10501139A

JPH10501139A - グアーの形質転換

Info

Publication number: JPH10501139A
Application number: JP8501489A
Authority: JP
Inventors: モルテンヤースボー; フィンティーオッケルス
Original assignee: ダニスコエイ／エス
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1998-02-03
Also published as: MX9606226A; AU690999B2; WO1995034667A3; EP0766743A2; BR9507970A; PL317578A1; US6307127B1; CA2192552A1; US20010034887A1; WO1995034667A2; RU2173345C2; AU2669495A; NZ287848A; KR970704045A

Abstract

(57)【要約】組換えDNA配列を少なくとも１つの細胞又はプロトプラスト中に導入し、オーキシン阻害剤例えば2−（ｐ−クロロフェノキシ）−2−メチルプロピオン酸（PCIB）、β−ラクタマーゼ阻害剤例えばスルバクタム、及びエチレン阻害剤例えばチオ硫酸銀から選択される少なくとも1種の化合物を含有する少なくとも1つの選択又は苗条生長培地を用いて遺伝的に修飾された外植片を生成させ、少なくとも1つ組換えDNA配列をそのゲノム中に含有する遺伝的に修飾された植物又はその部分を得ることによる、シアモプシス属のマメ科植物の形質転換法及び再生法、詳しくはグアー（シアモプシス・テトラゴノロバ）のアグロバクテリウム仲介形質転換法；及びグアーと他の植物の形質転換を促進するβ-ラクタマーゼ阻害剤のスルバクタムのような物質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】グアーの形質転換発明の技術分野本発明は、シアモプシス（Cyamopsis）属のマメ科植物の形質転換法、再生法および選択法、詳しくはグアー〔シアモプシス・テトラゴノロバ（Cyamopsis te tragonoloba）〕のアグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介形質転換；上記方法で作製される遺伝的に修飾された植物、ならびにグアーおよび他の植物の形質転換を促進するβ−ラクタマーゼ阻害剤のスルバクタム（sulbactam）のような物質の使用に関する。発明の背景マメ科植物の形質転換ファバセエ（Fabaceae）〔レグミノセ（Leguminosae）〕科は、世界で最も重要な双子葉植物の科である。その経済的な重要性のため、遣伝子工学によって栽培特性を改良するのに多大の努力がなされている。アグロバクテリウム仲介形質転換は、植物中に遺伝子を転移させるのに通常用いられる方法である。現在までアグロバクテリウムによって形質転換を行って成功している植物種は専ら双子葉植物であるが（単子葉植物とは対照的に）、すべての双子葉植物が容易に形質転換されるわけではない。いくつかの植物の科例えばソラナセエ（Solanaceae）科は、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を行うのに特に好適であることが示されているが、他の科の例えばファバセエ科は扱いにくいことはよく知られている。形質転換大豆植物〔グリシネ・マックス（Glycine max）〕の作製は各種の方法で試みられている。葉とプロトプラストが外植片源として使用されているが、この方法で形質転換植物への再生は全く達成されていない。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を接種した大豆の子葉は形質転換植物になったが、この方法では、試験を行った多数の遺伝子型のうち１種しか形質転換に成功しなかった（Hincheeら、Bio/Technology，6巻、915頁、198 8年）。国際特許願公開第WO94/02620号には、胚軸または子葉節を用いて形質転換大豆植物を作製する方法、ならびに特定の温度、pH値およびアグロバクテリウムの濃度を含めて、大豆の形質転換を行うため特別にデザインした一連のステップが記載されている。しかし、外植片として子葉を使用することは、一般にマメ科植物の形質転換には利用できず、ほとんどの場合、他の外植片源が使用されている。例えばエンドウ豆〔ピスム・サティブム（Pisum sativum）〕を形質転換するのに、苗条（Sho ot）培養物および苗（Seedling）の上胚軸由来の外植片を外植片として利用して用い、形質転換カルスは6ヶ月後に植物に再生した（Puonti-Kaerlasら、Plant C ell Rep.,8巻、321頁、1989年）。シロツメクサ〔トリフォリウム・レペンス（Trifolium repens）〕を形質転換するため、苗条の先端にアグロバクテリウムを接種して形質転換植物が得られた（Voiseyら、Plant Cell Rep.，13巻、309頁、1994年）。その他いくつものマメ科植物を形質転換する試みがなされてきた。例えはファセオルス・ブルガリス（Phaseolus vulgaris）の子葉節および胚軸をアグロバクテリウム・ツメファシエンスとともにインキュベートした結果、形質転換カルスが得られたが形質転換植物は得られなかった（McCleanら、Plant Cell，Tissue & Org．Cult.，24巻、131頁、1991年）。ビグナ（Vigna）属の場合も同様であった（Garciaら、Plant Science，48巻、49頁、1986年）。落花生〔アラキス・ハイポガエア（Arachis hypogaea）の形質転換植物は、かなりの努力がなされているにもかかわらず報告されていない。本発明の発明者らは、Hincheeらが報告している大豆子葉法を用いてグアーの形質転換を試みてきたが成功しなかった。他の研究者らが報告している結果とともに、上記のことは、マメ科植物の形質転換法の選択は全く経験的なものであり、広く科学に基づいたガイドラインを導き出すことができないことを示している。したかって、マメ科植物の形質転換法と形質転換に用いる外植片源は、対象の属、種または遺伝子型の特別の必要条件にしたがって開発されなければならない。各種のマメ科植物の形質転換植物を得るため行われた多くの試みは、マメ科植物の形質転換は当該技術分野の熟達した科学者らにさえ非常に難しいことを明確に示している。このことは、商業上重要な約 100種のマメ科植物の種のうち５より少ない種しか形質転換されていないという事実によってさらに立証されている。したがって、今まで形質転換されていないマメ科植物の属または種の形質転換の成功は、常套手段以外の方法による。グアーグアー（シアモプシス・テトラゴノロバ）は、種子のガラクトマンナン含量が高いため商業上非常に重要なマメ科植物である。またグアーのガラクトマンナンは、グアーガムとして知られ、食品と非食品の両者の増粘剤として用いられている。ガラクトマンナンは胚乳中に見られ、種子の乾燥重量の約35％を占めており、 80〜90％が純品のガラクトマンナンである。ファバセアエ科植物の場合、大きな胚乳は異常な形態であり、種子の胚乳部分はほとんどないかまたは未発達のままである；かわりに、豆果の発芽のための栄養貯蔵物は大きくなった子葉中に堆積されることが最も多い。多量のガラクトマンナンを含有する胚乳を有するマメ科植物の種が、遺伝子的に形質転換されたという報告は全くない。スルバクタムアグロバクテリウム仲介遺伝子転移の固有の欠点は、細菌が形質転換を行った後も生長し続ける事実である。植物構成要素の過剰生長を防ぐため、細菌は、通常ペニシリン様抗生物質（β−ラクタム）例えばカルベニシリン、セホタキシムなどを添加することによって有効に除去しなければならない。ペニシリン様物質は、原則的に植物組織に対して無毒性なために選ばれている。しかし、実際には、これらの化合物は、外植片に対してかなりの毒作用をしばしば発揮する。おこりうる直接の毒性作用は別として、植物に有害な可能性がある１つの理由は、抗生物質が、細菌と植物組織の両者の存在下での長いインキュベーション期間中に徐々に分解することであろう。望ましくない分解生成物の例は、ごく普通に用いられる抗生物質のカルベニシリン由来のものであり、それはフェニル酢酸に分解される。フェニル酢酸はオーキシン様特性を有しているので結果として外植片上にカルスの生長を増大させ、次に再生を損なうかもしれない。したがって、一層少量の抗生物質および／またはかような望ましくない副作用がない抗生物質を使用できることが非常に望ましい。本発明の発明者らは、グアーの形質転換に関する研究の過程で、β−ラクタマーゼ阻害剤のスルバクタムがペニシリン様物質の必要濃度を劇的に低下させ、それにより形質転換の効率が改善され、かつコストが著しく減少することを発見したのである。アグロバクテリウムの生長を制御するこの新規な方法は、形質転換中には常に除去しなければならない細菌に関連があるから一般に植物の形質転換に利用することができ、したがっていずれの特定の植物の種に限定されない。発明の簡単な説明１つの態様で、本発明は、シアモプシス属の遺伝的に修飾された植物またはその部分に関し、前記植物または植物の部分は、そのゲノムに少なくとも１つの組換えDNA配列を含有している。本発明の別の態様は、シアモプシス属の遺伝的に修飾された植物またはその部分を作製する方法であって、組換えDNA配列を少なくとも１つの細胞またはプロトプラスト中に導入し、次いでオーキシン阻害剤、β−ラクタマーゼ阻害剤およびエチレン阻害剤から選択される少なくとも１種の化合物を含有する少なくとも１つの選択培地または苗条生長培地を用いて遺伝的に修飾された外植片を生成させて、少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列をそのゲノム中に含有する遺伝的に修飾された植物またはその部分を得るステップからなる方法に関する。本発明の別の態様は、細胞、プロトプラスト、カルスまたは植物の部分の選択または生長に用いる少なくとも１つの培地が、実質的に植物の生長を調節する作用または植物に対する毒性作用なしで、細菌の生長を阻害するかまたは細菌の生長阻害剤の作用を増大する少なくとも１種の物質を含有している、遺伝的に修飾された植物の作製方法に関する。さらに別の態様で、本発明は、形質転換種子を産生することが可能で、かつ試験管内で培養された遺伝的に修飾された苗条を非試験管内で栽培された植物に接木することによって得られるキメラ植物に関する。発明の詳細な開示本願の明細書中の用語“遺伝的に修飾された植物”および“形質転換植物”は、当該技術分野でこれらの用語が一般に理解されている意味を有し、すなわちそのゲノムが少なくとも１つの組換えDNA配列を含有しているような方法で変化された植物を意味する。“組換えDNA配列”は一般に、植物中で、発現させることができるかまたは遺伝子の発現に影響する配列であるが、例えは必ずしも発現されないかまたは遺伝子の発現に影響せずにマーカーとして役立つ配列であってもよい。発現されるかまたは遺伝子の発現に影響する配列は、しばしばその天然型の対象の植物に対して外来性の遺伝子であるが、例えばわずかに変化した形態の天然遺伝子または例えば天然遺伝子の発現を変化させるプロモーター配列もしくはレギュレーター配列でもよい。ここで開示される、遺伝的に修飾された植物を作製する方法は、一般に遺伝的形質転換を目的とし、かついずれかの特定の範疇のDNA配列の組込みに限定されない。用語“植物の部分”は、一般に任意の植物の部分例えば組織または器官を意味し、すなわち完全な植物ではなく、未分化のカルスならびに分化した植物の部分、例えば苗条、葉、根、果実、種子などを含む。上記のように、本発明は詳しくはシアモプシス属の遺伝的に修飾された植物に関し、さらに詳しくは、シアモプシス・テトラゴノロバ種の植物（グアー）に関する。遺伝的に修飾されたシアモプシスの植物は上記の方法、すなわち第１ステップが組換えDNA配列を少なくとも１つの細胞またはプロトプラストに導入する方法によって作製し得る。組換えDNAの導入は、例えばエイ・ツメファシエンスのTi−プラスミドまたはエイ・リゾゲネス（A．rhizogenes）のRi−プラスミドをベクターとして用いるアグロバクテリウム仲介転移を含む遺伝子工学で処理された植物の作製に普通に用いられる方法、ならびに例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは粒子衝撃によって達成することができる。好ましい方法（後記諸実施例で記載）はアグロバクテリウム仲介遺伝子転移法である。以下に説明するように、使った子葉が比較的長期間たとえば11〜 12日間発芽させた種子由来の子葉でも、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて子葉を形質転換することによって良好な結果を得た。選択された植物構成要素（例えば組織、細胞またはプロトプラスト）に所望の組換えDNAを導入した後、遺伝的に修飾された外植片を、オーキシン阻害剤、β −ラクタマーゼ阻害剤およびエチレン阻害剤から選択される少なくとも１種の化合物を含有する少なくとも１つの選択または苗条生長培地を用いて生成させる。というのは、選択および／または苗条生長培地中におけるこれらの化合物の１以上の存在により、カルスが少なくなり、再生される形質転換苗条の頻度が増大することが見出されたからである。選択培地は少なくともオーキシン阻害剤とβ− ラクタマーゼ阻害剤を含有し、そして苗条生長培地は少なくともβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有していることが好ましい。選択培地はオーキシン阻害剤、β−ラクタマーゼ阻害剤およびエチレン阻害剤を含有し、そして苗条生長培地はオーキシン阻害剤とエチレン阻害剤を含有していることがさらに好ましい。阻害剤（オーキシン阻害剤、β−ラクタマーゼ阻害剤、エチレン阻害剤）は、それぞれの化合物を除くかもしくはその量を減少させることによって（すなわち化合物の生合成を阻害するかもしくは化合物を分解することによって）または化合物の作用を阻害することによって機能する。特定の理論に拘束されたくないが、阻害剤の作用は、少なくとも一部分は、抗オーキシン作用または“オーキシン様”作用の阻害に関連していると考えられる。なぜならば、オーキシンの存在によりカルスの生長が増大し、それにより苗条の再生と形質転換苗条の単離の頻度が少なくなるからである。これは明らかにオーキシン阻害剤として直接機能するこれら化合物の実情を示している。β−ラクタマーゼ阻害剤については、スルバクタムの１つの推定される作用が分解生成物のフェニル酢酸（抗生物質のカルベニシリン由来）の除去であるという例で先に説明したが、望ましくないオーキシン様特性をもつフェニル酢酸はカルスの生長を増大させる。同様に、おそらく生長中の苗条の早期老化を防止する働きをするエチレンに対するその直接作用に加えて、エチレン阻害剤はエチレンがオーキシン応答と関連があることが知られている事実のために、有益な作用を有していると考えられる。オーキシン阻害剤およびエチレン阻害剤の使用は利用される遺伝子転移の型にかかわらず、例えば、アグロバクテリウム仲介転移のような細菌仲介転移ならびにマイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび粒子衝撃のような他の方法に有利であるが、β− ラクタマーゼ阻害剤の使用は、アグロバクテリウムまたは他のβ−ラクタマーゼ産生細菌株による遺伝子転移を利用する方法に特に適している。好ましいオーキシン阻害剤は２−（ｐ−クロロフェノキシ）−２−メチルプロピオン酸（PCIB）であり、これは濃度が約0.01〜10mg／ｌ、一般に約0.05〜5mg ／ｌ例えば約0.1〜2mg／ｌで選択培地および任意に苗条生長培地にも用いることができる。使用可能な他のオーキシン阻害剤は、例えば2,3,5−トリヨード安息香酸（TIBA）、N−ナフチルフタルアミド酸（NPA）、モルファクチン類、2,4,6 −トリクロロフェノキシ酢酸および7−クロロインドール酢酸である。好ましいβ−ラクタマーゼ阻害剤はスルバクタムである（Pfizer社から商品名 Betamazeで入手できる）。スルバクタムは濃度が約10〜1000mg／ｌ、一般に約20 〜500mg／ｌ、例えば約50〜200mg／ｌで選択培地または苗条生長培地に用いることができる。好ましいエチレン阻害剤はチオ硫酸銀であり、濃度が約50μＭまで、一般に約 0.1〜10μＭ、例えば約0.5〜5μＭで選択培地または苗条生長培地に一般に用いられる。使用できる他のエチレン阻害剤は、例えばアミノエトキシビニルグリシン（AVG）、コバルトおよびノルボルネオールである。上記の諸化合物に加えて、特定の他の化合物も、選択および／または苗条生長培地に使用すると有益な作用があることが見出された。例えば、ニッケル塩を選択培地に加えると形質転換の頻度が改善されることが見出されている。したがって、選択培地はニッケル塩例えばNiCl₂、6H₂ Oを、例えば濃度が約0.1〜10mg／ｌ、例えば0.5〜5mg／ｌで含有していることが好ましい。ベンジルアデニンプリン（BAP）も改善された結果を導くことが見出されている。したがって、選択培地はBAPを濃度約0.1〜10mg／ｌ、例えば1〜5mg ／ｌで含有していることが好ましい。またBAPは、苗条生長培地中、類似の濃度で存在していてもよい。カナマイシンが、例えば硫酸カナマイシンの形態で濃度約50〜300mg／ｌ、一般に約100〜200mg／ｌ、例えば約130〜160mg／ｌで選択培地中に存在していると、挿入されたDNA配列がカナマイシン耐性遺伝子を含有している場合有益な作用を有していることも示されている。外植片、一般に収穫した苗条由来の外植片を、第１選択培地よりカナマイシン濃度が低い、好ましくは125mg／ｌ以下、一般に20〜100mg／ｌ、例えば30〜70mg／ｌの第二選択培地に移すと良好な結果が得られることも見出されている。同様に、他のアミノグリコシド抗生物質、例えばハイグロマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンも、関連する抗生物質耐性遺伝子を含有する挿入DNA配列とともに選択培地中に利用することができる。他の選択剤、例えば除草剤または正の選択剤、例えばマンノースもしくはキシロースも使用できる。再生した苗条の選択および収穫後に、遺伝的に形質転換された苗条が存在していることは、各種の方法で確認できる。これらの１つは（上記のように抗生物質を、挿入された抗生物質耐性遺伝子とともにする使用に加えて）、リポーター遺伝子β−グルクロニダーゼによって行われ、その使用については国際特許出願公開第WO93/05163号ならびに以下に記載している。得られた形質転換シアモプシスの苗条は、次に公知の方法、すなわち苗条に直接根を形成させるかまたは形質転換苗条を安定した定着植物に接木することによって全植物に再生され得る。後者の方法、すなわち安定した植物（それ自体は形質転換されていてもいなくてもよい）の茎への形質転換苗条の接木は適切であり、形質転換種子を産生できるキメラ植物を生じることが見出されている。さらに形質転換苗条を、例えば7〜28日齢、一般に12〜21日齢の苗に接木すると特に良好な結果を得られることが見出されている。上記のように、本発明の他の態様は遺伝的に修飾された植物の作製方法に関しており、細胞、プロトプラスト、カルスまたは植物の部分の選択もしくは生長のために用いる少なくとも１つの培地は、実質的な植物生長調節作用もしくは植物毒性作用なしで、細菌の生長を阻害するかまたは細菌生長阻害剤の作用を増大する少なくとも１種の物質、例えばβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有している、この態様は、例えばスルバクタムのようなβ−ラクタマーゼ阻害剤を用いることによる有利な作用が、グアー植物の形質転換と選択に限定されず、むしろ形質転換後の望ましくない細菌の生長をなくすため、任意の植物のアグロバクテリウム仲介遺伝子転移（または他のβ−ラクタマーゼ産生細菌株の存在下）に一般に適用可能であるという事実に関連している。この方法の実施上および経済上の重要な利益は、選択および苗条生長培地に用いられるペニシリン様抗生物質の量を、例えばβ−ラクタマーゼ阻害剤のない場合に、必要な量の約10％のレベルまで大きく減らすことができるということである。β−ラクタマーゼ阻害剤がスルバクタムの場合、上記の量で用いられる。本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。実施例グアーの形質転換の一般的な方法苗グアーの種子を2.5％の遊離塩素、pH7.0と溶液100ml当り2滴のTween 80を含む亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌した。その種子（100ml当り約10g）を25分間攪拌し、滅菌水で５回洗浄し、濾紙上で一夜乾燥した。次いで、種子を発芽培地にまき暗所に25℃で４日間置いた。次に12時間／12時間、昼／夜の方式で7日間発芽を続けさせた。リッチな発芽培地を使用して高品質のグアーの苗を得た。発芽培地： 4.43g/ｌ MSMO（Sigma M6899） 20g/ｌスクロース 8.0g/ｌ寒天 pH5.8（KOHで調節）アグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液アグロバクテリウム懸濁液は、LB培地で一夜培養（17〜18時間インキュベーション）して調製した。上記細菌培養液にアセトシリンゴン（acetosyringone）は添加しなかった。 LB培地： 10g/ｌバクトトリプトン 10g/ｌ NaCl 5.0g/ｌ酵母エキス pH7.4（NaOHで調節）形質転換および共生培養細菌懸濁液はほとんどの場合、LB培地で0D0.1（660nm）まで希釈したが、0Dが約１でも良好な結果が得られた。約2mmの胚軸を有する子葉を12日齢の苗から切取った。次いで、子葉をピンセットを用いて引き裂き傷ついた表面を作り、アグロバクテリウム懸濁液中に30分間置いた。共生培養の好ましい方法はいわゆるサンドイッチ法であり、外植片を濾紙の上に置いて、共生培養培地上に置いた。液状共生培養培地を含ませた濾紙を上記外植片の上に置いて外植片が乾燥するのを防止した。共生培養培地： 0.43g/ｌ MS基礎塩混合物（Sigma M5524） 20g/ｌスクロース 100mg/ｌミオーイノシトール 0.1mg/ｌチアミン、HCl 0.5mg/ｌピリドキシン、HCl 0.5mg/ｌニコチン酸 1.0μＭチオ硫酸銀 8.0g/ｌ寒天 pH5.1 共生培養を、12時間／12時間、昼／夜の方式で25℃にて３日間行った。共生培養の後、外植片を、100mg／ｌのカルベニシリン、100mg／ｌのセホタキシムおよび1000mg／ｌのリゾチームを予め添加した1／10MS培地で、100rpmで攪拌しながら、45分間、2〜3回洗浄した。選択外植片を選択培地に移し、上記と同様にしてインキュベートした（25℃、12時間昼／12時間夜）。選択培地： 3.2g/ｌガンボルグ（Gamborg）B5（Sigma G5893） 20g/ｌスクロース 1.0gm/ｌベンジルアミノプリン 0.05mg/ｌジベレリン酸（GA3） 1.0μＭチオ硫酸銀 1.0mg/ｌ NiCl₂、6H₂O 0.5mg/ｌ２−（ｐ−クロロフェノキシ）−２− メチルプロピオン酸（PCIB） 50mg/ｌセホタキシム 50mg/ｌカルベニシリン 100mg/ｌスルバクタム（Batamaze） 145mg/ｌ硫酸カナマイシン pH5.7形質転換苗条の収穫第一の収穫： 4週間後、3mmより大きくなった苗条を収穫し、苗条培地に移した。10〜14日後に、これら苗条のリポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（GUS）の活性について試験した。以下参照のこと。GUS陰性の苗条を除いて、GUS陽性の苗条を新しい苗条培地に移した。苗条培地： 3.2g/ｌガンボルグ（Gamborg）B5（Sigms G5893） 20g/ｌスクロース 0.1mg/ｌベンジルアミノプリン 1.0μＭチオ硫酸銀 0.1mg/ｌジベレリン酸（GA3） 100mg/ｌセホタキシム 100mg/ｌスルバクタム（Betamaze） 8.0g/ｌ寒天 pH5.7 第二の収穫第一の収穫の後、外植片（収穫された苗条由来のもの）を、低カナマイシン濃度（50mg／ｌ）の第二選択培地に移した。さらに4週間後、苗条を収穫しGUSについて試験した。陰性の苗条を除いて、陽性のものを新しい培地に移した。形質転換苗条の分析若い葉の先端を切り取り、200μｌX-gluc溶液を含むマルチディッシュウェル（multi-dish well）に移した。35℃で16時間インキュベートした後、葉の先端を96％エタノールで脱色し、青変度を顕微鏡下で測定した。 X-gluc溶液（50ml）： 0.2M Na₂HPO₄ 15.57ml 0.2M NaH₂PO₄ 9.5ml H₂O 19.5ml 0.1M K₃（Fe(CN)₆） 0.25ml 0.1M K₄（Fe(CN)₆）、3H₂O 0.25ml 0.1M Na₂-EDTA 5.0ml X-gluc（シクロヘキシルアンモニウム5− ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D− グルクロネート） 50mg接木形質転換苗条の定着は接木によって行った。外観が自然な緑色で長さが0.5〜1 .0cmの苗条を、32℃／25℃、14時間／10時間昼／夜方式で生長させた1.5〜2ヶ月齢のグアー植物に接木するために選択した。接木を行う前に、最上部の2枚の葉以外の葉をすべて除き、形質転換苗条を、茎の節のほぼ垂直の切れ目に接木した。接木した植物を湿潤室に5〜6日間移した。形質転換植物接木した植物を、次に生長室に移して形質転換苗条をさらに生長させた。その生長条件は先に記載したのと同じであった。約2ヶ月後、多数の形質転換種子が入った成熟したさやを収穫した。実施例１グアーの各種変種の形質転換この実施例は、上記の方法を用いたいくつかのグアーの変種の形質転換を示す。ノパリン（nopaline）アグロバクテリウム菌株C58を用いて形質転換させた100 0個の外植片当りのGUS⁺（GUS陽性すなわち形質転換された）の苗条の数を算出した。アメリカの変種のルイスは、形質転換成功のマーカーとしてGUS遺伝子を保有する形質転換苗条の数が最大であり、この変種を以下の実施例に使用した。実施例２アグロバクテリア安全化された（disarmed）各種のアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株のいくつかをグアーの形質転換に用いて試験してすべてが適していることが見出された。例えば１細菌株当り500個のグアー外植片を４種の各菌株で処理した〔オクトピン（octopine）菌株LBA 4404、Dittaら、Proc．Nat．Acad．Sci.，77巻、7347頁、1980年およびC5 8由来の3種の菌株〕。各菌株について11〜26個の再生苗条が産生されたが、そのうち1〜3個がGUS陽性苗条であった。同様に他のアグロバクテリウム菌株〔L,L− サクシンアモピン（succinamopine）菌株EHA101〕を用いて2500個の外植片を処理したところ、25個の苗条が再生しそのうち8個がGUS陽性であった。またLBA 44 04を用いて2000個の外植片を処理したところ、67個の苗条が再生し、そのうち17 個がGUS陽性であった。使用したエイ・ツメファシエンス菌株は、T-DNA領域に、β−グルクロニダーゼ（GUSアッセイに用いる）およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（カナマイシン含有培地上での選択に用いる）をエンコードする遺伝子を含有していた。実施例３カナマイシン選択この実施例で、選択培地における硫酸カナマイシンの最適濃度は145mg／ｌであったが、125〜145mg／ｌの範囲の他の濃度を用いても有効な形質転換が達成された。100mg／ｌ又はそれ以下のカナマイシンを使用したところ、再生頻度は100 ％に近かったが、形質転換苗条はごく少数しか得られなかった。各処理で、合計1600個の外植片をアグロバクテリウム菌株EHA101で形質転換した。カナマイシン濃度を低下させた第二収穫で形質転換苗条の約50％が見出された。カナマイシン濃度を125〜145mg／ｌに維持したところ、第二収穫ではごく少数の形質転換苗条しか見つからなかった。実施例４ BAP とNiCl₂ この実施例では、選択培地にベンジルアデニンプリン（BAP）とNiCl₂を添加した場合の有益な作用を示す。各処理で、合計1200個の外植片をアグロバクテリウム菌株EHA101を用いて形質転換した。5mg／ｌのBAPを添加すると、形質転換体の数のみならず再生された苗条の合計数も増大したが、それはBAPが5mg／ｌの場合、1mg／ｌの場合の約2倍であった。 1mg／ｌのNiCl₂、6H₂Oを添加すると、形質転換の頻度は2〜4倍になったが、これは恐らく、使用されたMS培地とガンボルグB5培地中にNiが存在しないからであろう。実施例５チオ硫酸銀この実施例は、チオ硫酸銀（STS）が形質転換頻度を有意に増大することを示す。 EHA101を用いて形質転換した1000個の外植片当りのGUS⁺の苗条の数を算出した。チオ硫酸銀の濃度が2.5μＭの場合、チオ硫酸銀濃度が0、0.5または10.0μＭの場合より形質転換体の数は非常に多かった。 STSによって形質転換の頻度が増大したのは、苗条の品質が有意に改善されたためである。STSなしの場合、形質転換苗条は萎縮し黄色を帯びていたが、STSが存在していると生長が維持された。銀イオンがエチレンの作用を阻害することは公知であるから、STSの有益な作用は、容器中のエチレンの作用が減少して早期老化が防止されるためであろう。実施例６ PCIB PCIB〔２−（ｐ−クロロフェノキシ）−２−メチルプロピオン酸〕は抗オーキシン作用を有しておりカルスの形成を阻害できる。PCIBが存在していないと、選択を行っている間にカルスの形成が増大し、再生が阻害される。 0.1〜2mg／ｌのPCIBを添加すると、カルスの量が有意に減少し、再生および形質転換苗条の数が増大した。実施例７スルバクタムこの実施例は、β−ラクタマーゼ阻害剤のスルバクタムが、選択時に必要なカルベニシリンとセホタキシムの量を有意に減らし、かつ形質転換頻度を増大することを示す。各処理で、合計800個の外植片をEHA101を用いて形質転換を行った。3種のすべての処理によってアグロバクテリアは消失した。 800mg／ｌのカルベニシリンを用いた形質転換苗条は生長が貧弱でかつ黄色を帯びた外観を示した。これらの苗条は苗条培地に移した後に回復せず、多数の形質転換苗条が最終的に枯れた。 100mg／ｌのスルバクタムの存在下50もしくは100mg／ｌのカルベニシリンで選択された形質転換苗条は良好に生長し、正常な緑色の外観を示しかつ長期間にわたって試験管内で維持することができた。実施例８チジアズロン（thidiazuron）サイトカイニンのチジアズロン（TDZ）を添加すると形質転換の頻度が有意に増大した。下表に示すように、選択培地におけるTDZの最適濃度は0.3〜3.0mg／ｌの範囲内であり、形質転換の頻度を1.5〜1.8倍に増大させた。チジアズロンは、形質転換頻度の増大に加えて、形質転換苗条をその後クローン化するのにも有益であった。実施例９接木形質転換苗条の定着は接木で行った。先に述べたように生長した植物（1.5〜2 ヶ月齢）への接木が可能であるが、12〜21日齢の苗に接木することによって一層優れた成功率が得られた。滅菌したグアーの種子を発芽培地（上記を参照）上に置いて苗を作製し、次にそれらを13時間／11時間、昼／夜方式で25℃で12〜21日間栽培した。子葉を切り取り、胚軸に垂直に下方へ0.5〜1cm切り込みを作った。形質転換苗条をその切り込み部分に入れ、短い滅菌ひもで結び付けた。5〜10日後ひもを除き、接木された苗木を耕作地へ移した。かような苗に接木した49個の形質転換苗条のうち42個が生存し（89％）、正常な表現型を有する稔性植物になった。実施例１０サザーンブロット分析形質転換グアー系中の、導入遺伝子の存在および遺伝子コピー数を確認するため、ゲノムDNAを葉の試料から抽出し、HindIIIで消化し次に0.8％アガロースゲル上で電気泳動に付した。サザーンブロットをHybond N⁺（Amersham社）を用いて実施し、次にプレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションをメーカー推奨の緩衝液中68℃にて行った。DNAプローブは、“Ready to go”キット（Ph armacia社）でランダムプライミング（random priming）によって標識したPMI遺伝子またはGUS遺伝子であった。1×10⁶CPM／mlの標識化プローブをハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。プローブとしてPMI遺伝子を用いたサザーンブロット分析を図１に示す。各レーンから分かるように、レーン１を除いて、HindIIIによる消化によって得られるDNAフラグメントの予想される大きさである2.1kbに強いバンドを示している。レーン1 は類似の大きさのフェイントバンド（faint band）を示す。レーン8は非形質転換グアー系である。 GUS遺伝子をプローブとして用いたサザーンブロット分析を図２に示す。大部分のレーンが一つの強いバンドを示していることが見られるように、これらの系はGUS遺伝子の1コピーを含有していることを示している。レーン7のDNAを消化したところ4個のバンドになったが、これはこの系がGUS遺伝子の4コピーを含有していることを示唆している。レーン8は非形質転換グアー系である。図1は形質転換グアー系のゲノムサザーン分析を示す。HindIIIで消化した各種形質転換グアー系のゲノムDNA10μｇを0.8％アガロースゲル上で電気泳動に付し、そのDNAをHybond N⁺上にブロットさせ、次に〔³²P〕dCTPで標識したPMI遺伝子からなるプローブとハイブリッドさせた。〔³⁵S〕DNAマーカー（Amersham社）を分子量マーカー（MW）として使用した。図2は形質転換グアー系のゲノムサザーン分析を示す。HindIIIで消化した各種形質転換グアー系のゲノムDNA10μｇを0.8％アガロースゲル上で電気泳動に付し、そのDNAをHybond N⁺上にブロットさせ、次に〔³²P〕dCTPで標識したGUS遺伝子からなるプローブとハイブリッドさせた。〔³⁵S〕DNAマーカー（Amersham社）を分子量マーカー（MW）として使用した。実施例１１形質転換子孫の分析グアーの独立形質転換体のいくつかにおける導入遺伝子の遺伝と分離について試験を行った。一次形質転換体は、自家受粉性でありいくつかの種子（10〜20）を播種した。第二世代植物中のGUS遺伝子の存在はGUSアッセイ（上記参照）で示した。この表はGUS遣伝子が安定した状態で受け継がれていること、および単一優性遺伝子に予想されているのとほぼ同様に分離することを示している。さらに、GU S遺伝子はその活性を保持していた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年８月８日【補正内容】接木する請求の範囲４〜２１項のいずれか一つに記載の方法。２３．形質転換種子を産生でき、試験管内で培養した遺伝的に修飾した苗条を非試験管内で栽培した植物に接木することによって得ることかできるシアモプシス属に属するキメラ植物。２４．シー・テトラゴノロバ種に属する請求の範囲２３項記載のキメラ形質転換植物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．そのゲノム中に少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を含有している、シアモプシス属（Cyamopsis）の遺伝的に修飾された植物またはその部分。２．シー・テトラゴノロバ（C．tetragonoloba）の種の請求の範囲１項記載の遺伝的に修飾された植物またはその部分。３．請求の範囲１または２項記載の植物から得られる種子、苗または植物の部分。４．組換えＤＮＡ配列を少なくとも１つの細胞またはプロトプラスト中に導入し、次いでオーキシン阻害剤、β−ラクタマーゼ阻害剤およびエチレン阻害剤から選択される少なくとも１種の化合物を含有する少なくとも１つの選択または苗条生長培地を用いて遺伝的に修飾された外植片を生成させ、少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列をそのゲノム中に含有する遺伝的に修飾された植物またはその部分を得るステップからなる、シアモプシス属の遺伝的に修飾された植物またはその部分の作製方法。５．遺伝的に修飾された苗条を、少なくともオーキシン阻害剤およびβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有する選択培地ならびに少なくともβ−ラクタマーゼ阻害剤を含有する苗条生長培地を用いて生成させる請求の範囲４項記載の方法。６．選択培地がオーキシン阻害剤、β−ラクタマーゼ阻害剤およびエチレン阻害剤を含有し、そして苗条生長培地がオーキシン阻害剤およびエチレン阻害剤を含有している請求の範囲５項記載の方法。７．オーキシン阻害剤が２−（ｐ−クロロフェノキシ）−２−メチルプロピオン酸（PCIB）でありそして、β−ラクタマーゼ阻害剤がスルバクタム（sulbactam ）である請求の範囲4〜6項のいずれか一つに記載の方法。８．選択培地がオーキシン阻害剤としてPCIBを0.01〜10mg／ｌの濃度でおよび、 β−ラクタマーゼ阻害剤としてスルバクタムを10〜1000mg／ｌの濃度で含有し、ならびに苗条生長培地がβ−ラクタマーゼ阻害剤としてスルバクタムを10〜1000 mg／ｌの濃度で含有している請求の範囲４〜７項のいずれか一つに記載の方法。９．選択培地がPCIBを0.05〜5mg／ｌ例えば0.1〜2mg／ｌの濃度で含有している請求の範囲８項記載の方法。１０．選択培地および／または苗条生長培地がスルバクタムを20〜500mg／ｌ例えば50〜200mg／ｌの濃度で含有している請求の範囲８または９項に記載の方法。１１．選択培地がさらにカナマイシンを含有している請求の範囲４〜１０項のいずれか一つに記載の方法。１２．選択培地が硫酸カナマイシンを50〜300mg／ｌ、一般に100〜200mg／ｌ、例えば130〜160mg／ｌの濃度で含有している請求の範囲１１項記載の方法。１３．選択培地から、第一選択培地より低い濃度、好ましくは125mg／ｌ以下、一般に20〜100mg／ｌ、例えば30〜70mg／ｌで硫酸カナマイシンを含有している第二選択培地へ、外植片を移す請求の範囲１２項記載の方法。１４．選択および／または苗条生長培地が、エチレン阻害剤としてチオ硫酸銀を 50μＭまでの濃度で含有している請求の範囲４〜１３項のいずれか一つに記載の方法。１５．選択および／または苗条生長培地がチオ硫酸銀を0.1〜10μＭ例えば0.5〜 5μＭの濃度で含有している請求の範囲１４項記載の方法。１６．選択および／または苗条生長培地がさらにニッケル塩を含有している請求の範囲４〜１５項のいずれか一つに記載の方法。１７．選択および／または苗条生長培地がさらにジベレリンを含有している請求の範囲４〜１６項のいずれか一つに記載の方法。１８．選択および／または苗条生長培地がさらにペニシリン様抗生物質、例えばカルベニシリンまたはセホタキシムを含有している請求の範囲４〜１７項のいずれか一つに記載の方法。１９．形質転換を子葉で行う請求の範囲４〜１８項のいずれか一つに記載の方法。２０．子葉が、少なくとも４日間一般に少なくとも７日間例えば少なくとも10日間発芽させた種子由来である請求の範囲１９項記載の方法。２１．シー・テトラゴノロバ種の遺伝的に修飾された植物を作製する請求の範囲４〜２０項のいずれか一つに記載の方法。２２．遺伝的に修飾された菌条を、苗または安定な定着植物に接木する請求の範囲４〜２１項のいずれか一つに記載の方法。２３．細胞、プロトプラスト、カルスまたは植物部分の選択または生長のために用いる少なくとも１つの培地が、実質的な植物の生長調節作用もしくは植物毒性作用なしに、細菌の生長を阻害するかまたは細菌生長阻害剤の作用を増大する少なくとも１種の物質を含有している、遺伝的に修飾された植物の作製方法。２４．物質がβ−ラクタマーゼ阻害剤である請求の範囲２３項記載の方法。２５．β−ラクタマーゼ阻害剤がスルバクタムである請求の範囲２４項記載の方法。２６．スルバクタムが、少なくとも１つの選択または生長培地の中に、10〜1000 mg／ｌ、一般に20〜500mg／ｌ、例えば50〜200mg／ｌの濃度で存在している請求の範囲２５項記載の方法。２７．β−ラクタマーゼ阻害剤を、量を減らした抗生物質とともにβ−ラクタマーゼ産生細菌株の存在下で使用する請求の範囲２４〜２６項のいずれか一つに記載の方法。２８．物質がアグロバクテリウム（Agrobacterium）を仲介した遺伝子転移に用いられる請求の範囲２３〜２７項のいずれか一つに記載の方法。２９．細菌生長阻害剤を、シアモプシス種の遺伝的に修飾された植物の作製に使用する請求の範囲２３〜２８項のいずれか一つに記載の方法。３０．形質転換種子を産生でき、試験管内で培養した遺伝的に修飾した苗条を非試験管内で栽培した植物に接木することによって得ることができるキメラ植物。３１．ファバセエ（Fabaceae）科に属する請求の範囲３０項記載のキメラ形質転換植物。３２．シアモプシス属に属する請求の範囲３１項記載のキメラ形質転換植物。３３．シー・テトラゴノロバ種に属する請求の範囲３２項記載のキメラ形質転換植物。