WO2008120820A1 - 表層キメラ形質転換植物の作出方法 - Google Patents

表層キメラ形質転換植物の作出方法 Download PDF

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WO2008120820A1
WO2008120820A1 PCT/JP2008/056746 JP2008056746W WO2008120820A1 WO 2008120820 A1 WO2008120820 A1 WO 2008120820A1 JP 2008056746 W JP2008056746 W JP 2008056746W WO 2008120820 A1 WO2008120820 A1 WO 2008120820A1
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flower
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Junichi Togami
Ekaterina Mouradova
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International Flower Developments Proprietary Limited
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    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis

Definitions

  • the present invention provides a method for producing a chimeric transgenic plant having a transgene only in some cells.
  • chimeras An individual consisting of a plurality of genetically different cell groups is called a chimera.
  • Plant chimeras are divided into peripheral chimeras, partial chimeras and segmented chimeras based on their structure.
  • segmental chimeras that can be created by accidental or somatic mutation by radiation or chromosome doubling by drug treatment (sectorial chimera) ) Is a non-structural chimera that originates from the stacked structure of plants, and is caused by the proliferation of mutant cells that are non-structurally mixed at the growth point. That is, one tissue layer itself is a chimera and often appears as a different colored stripe on organs such as flowers, leaves, and stems. Sorted chimeras are usually unstable and often disappear, but rarely develop into peripheral chimeras.
  • Periclinal chimera is a structural chimera that originates from the tissue layer structure of a plant and has developed a segmented chimera, and one cell layer has been completely replaced with mutant cells. In the case of a peripheral chimera, one tissue layer itself is uniform and not a chimera. Peripheral chimeras are stable and are said to disappear less frequently.
  • Plant cell tissue is basically composed of three cell layers, and has a tissue layer structure of the first layer (L1), second layer (L2), and third layer (L3) from the outside. L 1 and L 2 are generated from the two layers of the growth point (t un i ca), and L 3 is generated from the inner body (corpus).
  • the epidermis is all produced from the L1 layer, which is related to the germline.
  • Peripheral chimeras with different properties for each of these cell layers are important for horticulture and have high industrial value, but accidentally or artificially induce mutations such as irradiation and drug treatment The probability of obtaining a peripheral chimera is also very low by this means.
  • a foreign gene When a foreign gene is introduced into a plant, it is not easy to artificially create a chimeric plant having a gene introduced into only some cells. So far, there has been an example in which a chimera plant having a transgene only in a germ cell or L2 cell layer was created by introducing a gene into an immature corn embryo by a method using a particle gun (see Table 10). No. 503374). However, if the gene is introduced through agrobacterium, it is more difficult to create a chimeric plant. In the method of introducing a gene via agrobacterium, a single cell into which the gene has been introduced is selected using a trait such as drug resistance due to the expression of the marker gene as an indicator, and the single cell is selected. One individual transformant plant is obtained from the transgenic cell.
  • genetically modified plants consist of genetically single cells and have transgenes in all cells. Even if a plant (chimeric plant) that has a foreign gene only in some cells is obtained, it is a coincidence, and with the current technology, a gene is only present in a specific part of the plant. It is very difficult to control it to be introduced. Even if it is obtained by chance, as described above, the probability of becoming a peripheral chimera having a gene only in a part of the cell layer is considered to be extremely low.
  • transgenic cells only a part of them
  • a chimeric cell mass or a chimeric plant that has been introduced into the gene may appear, but in this case, the chimera or the single tissue layer itself is chimera throughout the entire cell layer.
  • Foreign genes are introduced only into the layer, and the cell layer itself is not uniform.
  • a peripheral chimera body can be produced by using a vector containing a gene and a desorption factor (JP 2002-3 15460). is there.
  • transgenic plants In transgenic plants, transgenes incorporated into chromosomes are stably transmitted to their progeny according to Mendel's law. By using these transgenic plants as mating parents, new varieties can be created using the traits derived from the introduced gene.
  • genetically modified plants there are concerns about the impact on the ecosystem (environment) (such as the spread of transgenes into nature).
  • Technologies to prevent gene spread from genetically modified plants to non-transformants and wild plants include: (1) use of maternal inheritance, (2) use of male sterility, (3) use of sterile seeds, etc. It has been known.
  • the use of maternal inheritance is a method of preventing gene spread by pollen by introducing a foreign gene into the chloroplast genome that is not transmitted to pollen cells.
  • male sterility refers to a method that inhibits pollen formation or prevents pollen from having fertility, thereby allowing genetic isolation. For example, there is a method in which pollen formation is inhibited by using a promoter that is expressed specifically in the male reproductive organs to make a harmful gene product tissue-specific.
  • the use of sterile seeds is a method to prevent both crossing and spreading of seeds by directly inhibiting the seed formation of genetically modified plants, making self-seeding impossible. Etc. This is the case.
  • transgenic plant that does not have a transgene in germ cells
  • This also reduces the burden on procedures for cultivating genetically modified plants for those who cultivate genetically modified plants outdoors or for industrial use.
  • such procedures include biodiversity impact assessments based on the “Law Concerning the Ensuring Biodiversity through Regulations on the Use of Genetically Modified Organisms, etc. (Karuyu Henna Law)”. In other countries, there are evaluations based on similar laws.
  • Patent Document 1 Japanese National Patent Publication No. 10-503374
  • Patent Document 3 USP 5480789
  • Patent Document 4 W0 2005/017147
  • Patent Document 5 PCT / JP96 / 00348
  • Non-Patent Document 1 Firoozababy et al. Bio / Technology 12: 883-8 88 1994
  • Non-Patent Document 2 Lazo et al. Bio / Technology 9: 963-967, 199
  • Non-Patent Document 3 Fuj iwara et al. Plant J. 16 421-431, 1998
  • Non-Patent Document 4 Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 4 5-59 1996 Disclosure of Invention
  • the present invention provides a method for introducing a flowering plant such as a rose of a gene transfer in which a transgene is present only in a part of cells of a plant body, for example, not in a germ cell. It provides things.
  • the present inventors have found that foreign genes may be introduced into flower plants through Agrobacterium tumefaciens, and the regenerated flower plants may become chimeric plants. It was. Furthermore, it has been found that by selecting a peripheral chimera plant from among them, the intended transgenic flowering plant can be obtained, and the present invention has been completed. Therefore, the present invention provides flower plants such as roses in which foreign genes are present in some cells but not in other cells.
  • the partial cell constitutes a partial cell layer.
  • the other cell is, for example, pollen or ovule.
  • the partial cell layer is the L 1 layer, or the L 1 layer and the L3 layer.
  • foreign genes include genes related to the synthesis of flavonoids, especially genes related to flower color such as genes related to the synthesis of anthocyanins.
  • the exogenous genes for example, the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase gene derived from the violet family plant, and the aromatic acyltransferase gene derived from the cephalaceous family plant are important.
  • the violet family plant is, for example, a violet family pansy
  • the sesame family plant is, for example, a genus genus Lenya.
  • the rose is, for example, a hybrid tea such as a rose variety WKS82, a floripanda, or a mini rose.
  • the rose of the present invention has a flower color changed in a blue direction due to the effect of the transgene, for example, compared to the rose before the gene introduction.
  • the exogenous gene for example, the exogenous gene is a salvia-derived flavonoid 3 'or 5'-hydroxylase under the control of the promoter of the goldfish-derived chalcone synthase gene.
  • Gene cDNA, petunia dihydroflavonol 4-reductase staining gene, carcinogenic antocyanidin combination One or more genes among the gene genes.
  • the carnation is a standard type or a spray type.
  • the flower color changes in the blue direction due to the effect of the transgene, for example, compared to the carnation before the gene introduction.
  • the foreign gene is not limited to the gene as described above, and may be a gene that functions widely in a pigment synthesis system, for example, a gene that functions in a flavonoid synthesis system.
  • the foreign gene may be a gene for a selectable marker such as a GFP gene, NPT II gene, GUS gene, or SMB gene.
  • the foreign gene may be a gene encoding a transcription factor, for example, a gene encoding a myb-like transcription factor, specifically, a PHR1 gene or a Psrl gene.
  • the present invention also provides those tissues having the same properties as the above-mentioned flower plants such as roses, and vegetative growth bodies thereof.
  • the present invention further provides a method for producing a flower plant such as a rose, wherein an exogenous gene is introduced into a rose via an agrobacterium, and a rose in which the foreign gene is present only in some cells is selected.
  • a method comprising the steps of:
  • the present invention further provides a method for preventing the spread of a transgene to the natural world by producing a flowering plant having no foreign gene in a germ cell according to any one of claims 3 to 27. To do. Brief Description of Drawings
  • Fig. 1 shows the presence or absence of the introduced gene in each rose organ.
  • FIG. 2 shows that the introduced foreign gene is expressed only in cells in the L1 layer and not in the L2 and L3 layers.
  • Figure 3 shows the binary vector used in Example 2.
  • P SPB 1 30 FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the floret plant used in the present invention is not particularly limited as long as it is a floret plant into which an exogenous gene can be introduced via agrobacterium.
  • agrobacterium for example
  • Roses and carnations can be used particularly preferably.
  • the foreign gene used in the present invention is preferably an enzyme gene that functions in cells in the L1 layer after introduction.
  • a gene relating to flower color a gene for a selection marker, or a gene encoding a transcription factor is preferable.
  • genes related to flower color include genes for enzymes involved in the synthesis of flavonoids, such as genes involved in anthocyanin synthesis, proteins encoding protein synthesis, genes encoding proteins controlling vacuolar ⁇ , Examples include a gene that encodes an aliphatic acyltransferase, and a gene that codes for a flavone synthase.
  • the selection marker gene include GFP gene, ⁇ ⁇ ⁇ gene, GUS gene, and SURB gene.
  • Examples of a gene encoding a transcription factor include a gene encoding a ⁇ -like transcription factor, specifically, a PHR 1 gene and a Psrl gene. However, it is not limited to these specifically listed genes.
  • the rose used in the present invention may be either a garden species or a wild species. Among them, commercially useful hybrid tees such as Floribunda, Grundy Flora or mini roses (Rosa hybrida) are desirable. These varieties are not particularly limited.
  • the expression cassette of the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase gene from pansy and the aromatic acyltransferase gene from Torenia NPTII T-DNA consisting of a gene expression cassette was introduced.
  • the flower color was changed by the action of the transgene, suggesting that the transgene exists in the petal cells, especially in the L1 layer of the petal that is performing pigment synthesis.
  • PCR using the genome DM extracted from each organ of roses as a cocoon-shaped PCR suggested that there was no transgene in pollen cells.
  • genes for enzymes involved in the synthesis of flavonoids include the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase gene and the aromatic acyltransferase gene.
  • the origin of these is not particularly limited, but it has been confirmed that they function in roses.
  • a labnoid 3 ′, 5′-hydroxylase gene or an aromatic acyltransferase gene derived from a sesame family such as Trenia is preferred.
  • the carnation used in the present invention is desirably a commercially useful standard type or spray type. These varieties are not particularly limited. Any varieties such as feeling white, brecross douji, stazare and cortina chanel can be used.
  • flavonoids 3 'and 5 from salvia under the control of the promoter of the chalcone synthase gene from goldfish, via agrobacterium Elementary gene cDNA, petunia dihydroflavonol 4-reductase staining gene, carcinogenic antocyanidin synthase gene SURB gene were introduced.
  • the resulting transformation changed the flower color due to the action of the transgene, suggesting that the transgene is present in petal cells, especially in the L1 layer of the petal that is synthesizing. It was.
  • PCR using genomic DNA extracted in each organ of the carnation as a cage, it was determined that the transgene is a chimeric plant that exists only in the L1 layer.
  • Agrobacterium tumef aciens Agl 0 strain (Lazo et al. Bio / Technology 9: 963- 967, 1991), soaked the rose callus derived from the leaves of sterile seedlings for 5 minutes, wiped off the excess bacterial solution with sterile filter paper, and transferred to the subculture medium for 2 days in the dark. And co-cultured.
  • the plate was washed with an MS liquid medium supplemented with 400 mg / l of carpenicillin, and transferred to a selective sterilizing medium containing kanamycin 50 mg / l and carbenicillin 200 mg / l as a subculture medium.
  • the kanamycin-resistant lusciousness was selected by repeatedly transplanting and culturing the part that normally grew without being inhibited on the selective medium.
  • the transformed callus showing kanamycin resistance was cultured in a regeneration medium supplemented with 50 mg / 1 kanamycin and 200 mg / l carbenicillin to obtain kanamycin resistant shoots.
  • the resulting shoot was 1 / 2MS medium
  • the anthocyanin By modifying the anthocyanin with an aromatic acyl group, the anthocyanin can be stabilized and its color can be blue (for example, PCT / JP96 / 00348).
  • the following experiments were conducted with the aim of producing acylated delphidinidine-type anthocyanins.
  • RNA was obtained from the petals of Trenya (trade name: Summerwave (trademark)), and polyA + RNA was prepared therefrom. From this polyA + RNA, a cDNA library with a vector of ⁇ ata (Stratagene) was prepared using the diffusional cDNA library preparation kit (Stratagene) as recommended by the manufacturer.
  • the major anthocyanins of trenia are modified at the 5-position glucose with an aromatic acyl group (Suzuki et al. Molecular Breeding 6, 239-246, 2000). Ninacyltransferase is expressed.
  • the amino acid sequence of Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys. Is conserved in the anthocyanin transferase, and the corresponding synthetic DNA is used as a primer to obtain the anthocyanin transferase gene. (PCT / JP96 / 00348).
  • the single-stranded cDNA lOng synthesized during the construction of the Torenia cDNA library is used as a cage, and the lOOng ATC primer (5 '-GA (TC) TT (TC) G GITGGGGIAA-3', I is inosine (TC) means either one) (SEQ ID NO: 1), lOOng oligo dT primer (5 '-TTTTTTTTTTTTTTTT TTTCTCGAG-3') (SEQ ID NO: 2) as the primer, TaQ polymerase (evening) PCR was performed under the conditions recommended by the manufacturer. PCR was performed for 25 cycles of 95 ° 1 minute, 55 ° 1 minute, 72 ° 1 minute. The obtained DNA fragment of about 400 bp was recovered by Gene Clean II (BI 0, 101. Inc.) by the method recommended by the manufacturer and subcloned into pCR_T0P0.
  • This DNA fragment was labeled with DIG using a DIG-labeled detection kit (Nippon Roche), and the cDNA library of the trainer was screened by the plaque hybridization method as recommended by the manufacturer.
  • PBE2113-GUS (Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 45-5 9 1996) was digested with Sacl, blunt-ended, and an 8 bp Xhol linker (TaKaRa) was inserted. Approximately 1.7 kb of DNA obtained by digesting pTAT7 with BamHI and Xhol was inserted into the BamHI and Xhol sites of this plasmid to obtain pSPB120. PSPB120 was digested with SnaBI and BamHI, then blunt-ended and ligated, and PSPB120 'was obtained.
  • the plasmid pCGP 1961 containing F3 ', 5' H # 40 cDNA derived from pansy was completely digested with BamHI, and a DNA fragment of about 1.8 kb obtained by partial digestion with Xhol was recovered.
  • PUEBP40 was obtained by ligation with PUE5H digested with Xhol.
  • PUEBP40 ′ was obtained by digesting PUEBP40 with SnaBI and BamHI, followed by blunting and ligation. An approximately 2.7 kb MA fragment obtained by partial digestion of PUEBP40 with Hindlll was recovered and ligated with a DNA fragment partially digested with Hindi II. Among the obtained plasmids, the neomycin phosphotransferase gene, pansy F3 '5' H # 40, and torenia 5 AT gene are in the same direction from the side of the light feeder on the binary-vector. Binary-concatenated to PSPB130
  • This plasmid is constitutively expressed in plants by pansy F3 '5' H # 40 gene and 5AT gene, and is devised to transcribe the gene in petal-specific manner. This plasmid was introduced into Agrobacterium tumef aciens AglO strain.
  • PSPB130 was introduced into the mauve rose “WKS82” and 89 transformants were obtained. Accumulation of delphidinidine was confirmed in all 44 individuals subjected to dye analysis. Delphidinidine content was up to 91% (average 49%). flower The color changed from RHS color chart 186d (GREYED-PURPLE GROUP) to 80c (PU RPLE-VIOLET GROUP). The analysis values of representative transformants are shown in the table below.
  • De 1 Delphidinidine, Cya: Cyanidin, Pe'Pelargonidin, M: Milysetin, Q: Quercetin, K: Kenferrol, Del (%): Perphidinidine ratio in total anthocyanidin, Acyl (% ): Ratio of acylated dye in total anthocyanins, na: not analyzed Table 2
  • De 1 Delphidinidine, Cya: Cyanidine, Pe 1: Pelargonidin, M: Milysetin, Q: Quercetin, K: Kenferrol, Del (%): Ratio of delphidinidine in total anthocyanidin, Acyl (%): Percentage of acylated pigment in total anthocyanins, na: not analyzed Example 4. Confirmation of presence of transgene in each organ
  • WildKS82 (hereinafter referred to as host) and recombinant N 0.5 and No. 24 produced in Example 3 (WKS82 / 130-4-1 and WKS82 / 130-9-1; hereinafter referred to as recombinant)
  • Genomic DNA was extracted from petals, leaves, stems, roots and pollen using DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) according to the method recommended by the manufacturer.
  • the transgenes Pansy F3 '5' H gene (SEQ ID NO: 4), Trenia 5AT gene (SEQ ID NO: 3), E. coli ⁇ gene) were amplified by PCR.
  • ANS rose anthocyanidin synthase
  • BP40-F2 and BP40—R3 are used to amplify the pansy F3'5'H gene
  • TAT7-50F and TAT7-R1 are used to amplify the Torenia 5AT gene
  • NPTII-F is used to amplify the NPTII gene.
  • NPTII-R and RhANS 69-rl and RhANS69-ml were used as primers for amplification of the ANS gene.
  • BP40-F2 5'-GAG CTA GGC CAC ATG CTT A-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • BP40-R3 5'-CTT TGC GCT CAT GAC TCG T-3' (SEQ ID NO: 6)
  • TAT7-50F 5'-AAC AAT ATG TGC AGT CCT CGA A-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • TAT7-R1 5'-AAC TCG CAT CGC CAA CTA C-3 '(SEQ ID NO: 8
  • NPTII-F 5'-GAT TGA ACA AGA TGG ATT GCA CGC-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • NPTII-R 5'-CGA AGA ACT CCA GCA TGA GAT CCC-3 '(SEQ ID NO: 10) ANS specific primers
  • Rh ANS 69-rl 5'-TTT GAT CTT CCC ATT GAG C-3 '(SEQ ID NO: 1 1)
  • Rh ANS 69-ml 5 '-TCC GCG GTG GGA AGA TCC CC-3' (SEQ ID NO: 12)
  • transgenes were detected in the petal, leaf, and stem genomes of this recombinant plant, but these transgenes were not detected in the root and pollen genomes.
  • Table 3 and Fig. 1 show the results.
  • petals, leaves and stem epidermis, sepals, stamens, pistils are derived from the L1 and L2 layers
  • pollen and egg cells are derived from the L2 layer
  • leaves and stem internal tissues are derived from the L3 layer.
  • roots are derived from the L3 layer.
  • Example 3 Recombinant No. 24 (WKS82 / 130-9-1; hereinafter referred to as recombinant) pollen was attached. After that, we pouched again to prevent other pollen from adhering, and investigated the presence or absence of seed formation.
  • the pollen used was fresh pollen collected from the cocoons that had been cleaved the next day after collecting the pods before cleavage and leaving them at room temperature for 1 day in a dessert overnight containing silica gel.
  • Grandi Flora four seasons rose cultivar Queen Elizabeth ”and Floribunda four-season rose cultivar“ Gold Baniichi ” were used.
  • Genomic MA is extracted from the re-collected seeds using Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences), further amplified with the REPLI-g Kit (QIAGEN), and then introduced into the introduced gene (pansy by PCR).
  • Tables 5 and 6 show the results of detection of the F3 ′ 5 ′ H gene). There was almost no difference in the fruiting rate between the host and the recombinant.
  • the pollen used was fresh pollen collected from the cocoons that had been cleaved the next day after collecting the pods before cleavage and leaving them at room temperature for 1 day in a desiccant with silica gel.
  • the KSN gene is produced by inserting a transposon of about 9 kb into the ksn gene (which maintains the shoot apex) that blooms in a single season, which suppresses the expression of the gene and forms flower buds at the shoot apex. because suppression is released, 1 flower bud formation is promoted, it has been reported that a perpetual property).
  • Horticultural species have the KSN gene in homology.
  • wild species that bloom in season have a homologous ksn gene. Therefore, in wild species (temporarily blooming), the KSN gene is considered to be detected only when crossed with horticultural species.
  • Genomic DNA is extracted from the re-collected seeds using Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences), further amplified with the REPLI-g Kit (QIAGEN), and then host or recombinant by PCR.
  • Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT Amersham Biosciences
  • REPLI-g Kit QIAGEN
  • the results are shown in Table 7 and Table 8.
  • the fruit set was extremely low whether the host or the recombinant plant was the pollen parent.
  • the obtained seedlings were analyzed by the PCR method. However, although a cross between the host or the recombinant and the wild species was observed, no transgene derived from the recombinant was detected. In addition, the seeds that have not germinated have been collected again and observed for seed enrichment. As a result, most of them were “Shi” (those without seed contents), and very few individuals were able to confirm normal embryos. These were also analyzed by PCR in the same manner, but no transgene derived from the recombinant was detected, although hybridization between the host or recombinant and wild species was observed. From this, it was considered that the transgene was not transmitted to the progeny because the transgene was not contained in the recombinant pollen cells.
  • DIG-labeled probes (BP40, TAT, and NPTIK gene antisense and sense probes) were dissolved in a hybridization solution and reacted on a dried slide glass. After hybridization, the slide glass was washed and DIG was detected. As shown in the photograph in Fig. 2, the transgene is expressed only in the cells in the L1 layer and is not expressed in the cells in the L2 and L3 layers. This means that the transgene is present only in the L1 layer and not in the U or U layer, and therefore there is no transgene in the germ cells (pollen cells or ovule cells) generated from the L2 layer. Proven.
  • a carnation was created in which the transgene was present only in the L1 layer.
  • the recombinant carnation was prepared as follows by gene transfer using agrobacterium. Plasmid p CGP2442 (Appli cation No. US60 / 988, 293, filed on Nov. 15, 2007) is located in its TD NA region and is under control of salvia under the control of the goldfish sour chalcone synthase gene.
  • the causal flower mosaic virus 35S promoted tobacco tobacco lactate synthesis gene SURBc DNA is included. This was introduced into agro-pacteria by the method described in Japanese Patent Application Special Publication No. 1-5051 16, and further introduced into the force-neutral variety Cortina Chanel. Delphidinidine, which is not contained in natural carnations, was detected in the petals of the resulting recombinant carnation. This indicates that the transgene is functional in at least petal epithelial cells.
  • system 19907 was analyzed in detail.
  • chromosome DNA was extracted from strain 19907 and analyzed by the Southern hybridization method using the above gene on PCGP2442 T-DNA as a probe, the transgene was inserted into the chromosome. was confirmed.
  • Tissue cultures were made by planting 1990 1990 and 26898 shouts in hormone free MS solid medium containing 5 / z g / L Glean. When we observed the presence or absence of rooting in 4-5 weeks, line 26898 was rooted, but line 19907 was not rooted.
  • Chromosomal DNA was extracted from the leaves and roots of line 19907 using the DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Synthetic primers (# 960 5 '-ATT TCC GCC TCA TTA GAA GG-3', # 1468 5, -GCC TCA TGT TTC CAT TTG TGC-3 ' ) was used for PCR. The reaction was performed using Hot Star TaQ with a reaction volume of 25 1 and a 95 ° reaction for 15 minutes, then a 96 ° reaction for 1 minute, a 52 ° reaction for 30 seconds, and a 72 ° reaction for 2 minutes. One cycle of 35 cycles was performed, and another 72-degree reaction was performed for 7 minutes. When this reaction product was analyzed by agarose gel electrophoresis, a SURB band was observed when the leaf-derived DNA was in the cocoon shape, but when the root-derived DNA was in the cocoon shape, No SURB band was observed.
  • line 19907 contains a transgene in L1 cells but no transgenes in L2 and L3 cells. In other words, line 19907 is a chimera in which the transgene exists only in the L1 layer. It was judged to be a plant.
  • Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoted E1 2 35S promoter sequence (PlantCell Physiol. 37, 49-59 (1996)) with an enhancer sequence repeated twice upstream of the promoter, and F3, 5 ' H cDM sequence (described in Patent Application No. WO 2004/020637) and noparin synthesizing enzyme (nos) terminator sequence were introduced into binary vector pBinPlus (T rangenic Research, 4, 288-290 (1995)). From pSPB748 (PlantCell Physiol. 43, s227 (2002)), Bam HI digestion and EcoRI partial digestion of a DNA fragment (approximately 2.
  • PSPB 1459 was constructed by introducing a cassette (2.2 kb).
  • CaMV35S-sGFP (S65T) -N0S3 '(Curr. Biol. 6, 325-330 (1996)) was digested with BamHI and EcoRI, and the sGFP gene and the nos evening mine evening gene ligated DNA (1. Okb ) was introduced into the BamHI / EcoRI site of pBluescriptll (sk-) to construct plasmid pB-Gn.
  • the gene cassette of GUS gene and nos evening-minine evening was extracted from pBlueSXXREGU S-last with Xbal and Kpnl, and pB-Gn was digested with Xbal and Kpnl at the same site. Insert gene cassette (l. Okb) and construct pB-X6Gn.
  • a 6xXRE promoter excised by digesting pB-X6Gn with Xhol, sGFP, and the gene cassette (1.2 kb) of nos and mine were constructed at the sail site of pSKAVAt to construct PSPB 1458.
  • pSPB 1458 was introduced into the Agrobacterium strain AglO, and the leaf disc was used in the agro-pacteria method, and the torenia (variety Summer Wave Blue: SWB (Suntory Flowers)) was transformed into the leaf disc. It was.
  • the transformation of torenia was performed by a known method (Mol. Breeding 6, 239-246 (2000)).
  • the SWB flower color is blue, but for the purpose of this experiment, the torenia varieties used are not limited to SWB. Forty independent transformed trainer lines TAG were obtained.
  • the gene involved in the synthesis of flavonoids was introduced as an exogenous gene using Trenya as a flowering plant.
  • the gene cassette involved in aurone synthesis and the anthocyanin synthesis system can be obtained using the same agrobacterium as described above, using the trenia cultivar sama wavuru 1 as the host plant.
  • RNAi A construct with a cassette (PSFL307 or PSFL308) was introduced.
  • PSFL307 or PSFL308 was introduced.
  • the flower color changed from blue to yellow.
  • the Arabidopsis thaliana PHR1 gene (Genes & Development 15: 2122-2133 (2001)) expressed under phosphate starvation conditions is subcloned into a vector of pCR2.1. did.
  • PSPB2311A was obtained.
  • PSPB 1892 was cleaved with EcoRI and the blunted fragment was inserted into pS PB2311A to obtain PSPB2314.
  • agrobacterium strain: AglO
  • pS PB 1898 agrobacterium having this PSPB1898 was transformed.
  • Baco, Bapena, and Nielenbergia Tobacco, verbena, and 21-bell gear were transformed based on known methods (Science 227, 1229, 1985; Plant Cell Rep. 21, 459, 2003; Plant Biotech. 23, 19, 2006), respectively.
  • the gene introduction of the obtained plant bodies was confirmed by PCR using DNA extracted from the leaves of each plant body and using the PHR1 gene as a template.
  • Impatiens or begonias were used as flowering plants, and transcription factor genes were introduced as foreign genes.
  • Impatiens walleriana was basically transformed according to US Patent 6, 121, 511 using the varieties glittered red (Sakata evening) and tempo pink (evening seedling seedling).
  • the shoot apex, nodes, petiole, and leaf pieces cut out from Vitro seedlings were pre-cultured in pre-culture liquid medium (MS medium supplemented with lmg / L TD Z) for 5 days, and then pre-cultured solid medium (0.05 mg / L NAA, 6 mg / L Zeatin) And MS medium supplemented with 0.3% gellan gum) for 48 hours.
  • infection with agropacterium introduced with PSPB2314 was carried out on selective medium (0.05mg / L NAA, 6mg / L Zeatin, lOOmg / L Kanamyc in, 500mg / L Carbenic i 11 in, lOOmg / L-cefotaxime, MS medium supplemented with 0.3% gellan gum, was cultured for 4-8 weeks to obtain shoots (Table 9).
  • selective medium 0.05mg / L NAA, 6mg / L Zeatin, lOOmg / L Kanamyc in, 500mg / L Carbenic i 11 in, lOOmg / L-cefotaxime, MS medium supplemented with 0.3% gellan gum
  • the shoots formed in the meantime grew to a diameter of 5 mm or more, and the surrounding tissue was scraped off and transferred to selective medium 4 (150 mg / L Kanamycin, 500 mg / L Timentin, 0.4% agar-added MS medium).
  • selective medium 4 150 mg / L Kanamycin, 500 mg / L Timentin, 0.4% agar-added MS medium.
  • the cells were transferred to a rooting medium (100 mg / L Kana mycin, 500 mg / L Timentin, MS medium supplemented with 0.4% agar) to obtain a rooting medium (Table 10).
  • foreign genes are introduced into a flowering plant other than roses or carnations using agrobacterium, such as betunia, trenija, tobacco, verbena, biren, impact, begonia, etc. I found that I can enter.
  • agrobacterium such as betunia, trenija, tobacco, verbena, biren, impact, begonia, etc.
  • any gene that functions in L1 cells after introduction can be introduced into these floret plants using the same method. It is done.
  • the technology of the present invention can introduce a foreign gene using agrobacterium. Since these plants are also adaptable to floret plants, the floret plant of the present invention, that is, a floret in which the transgene is present only in some cells of the transformant plant and is not present in other cells. It is possible to create plants.
  • the transformant plant produced by the method disclosed by the present invention is a chimeric plant having no transgene in the L2 cell layer containing germ cells and the like, but having the transgene only in the cells of the L1 layer. . Since such a transformant does not have a transgene in the germ cell, it is possible to prevent the possibility that the transgenic plant can be freely used as a mating parent by an unauthorized third party.

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Abstract

導入遺伝子が一部の細胞、例えば花弁のL1層の細胞等に存在し、他の細胞、例えば花粉細胞や胚珠細胞などの生殖細胞には存在しないバラを作出する。このバラは他のバラと交雑しても導入遺伝子が他のバラに伝播しないので、導入遺伝子拡散の可能性を完全に否定することができる。

Description

明 細 書 表層キメラ形質転換植物の作出方法 技術分野
本発明は一部の細胞にのみ導入遺伝子を有するキメラの遺伝子組 換え植物を作出する方法を提供するものである。 背景技術
複数の遺伝的に異なる細胞群よりなる個体はキメラと呼ばれる。 植物のキメラはその構造から周縁キメラ、 部分キメラ及び区分キメ ラに分けられ、 たとえば接木のほかに偶発的あるいは放射線照射に よる体細胞変異や薬剤処理による染色体倍加によって作製されうる 区分キメラ （sectorial chimera) は植物の積み重ね構造に起因 する非構造的キメラで、 成長点に非構造的に混在する変異細胞の増 殖により生じる。 すなわち、 ひとつの組織層自体がキメラであるも のを指し、 花 · 葉 · 茎などの器官に異色の縞として現れることが多 い。 区分キメラは通常不安定で消失することが多いが、 稀に周縁キ メラに発展することもある。
周縁キメラ （periclinal chimera) は、 植物の組織層構造に起因 する構造的キメラで区分キメラが発展し、 ひとつの細胞層が変異細 胞で完全に置換された状態のものを言う。 周縁キメラの場合、 ひと つの組織層自体は均一であり、 キメラではない。 周縁キメラは安定 しており、 消失する頻度は小さいと言われている。 植物の細胞組織 は基本的に 3つの細胞層より構成されており、 外側から第 1層 （L1 ) ， 第 2層 （L2) 、 第 3層 （L3) という組織層構造を持っている。 成長点の 2層の外皮 （t un i ca) から生じるのが L 1と L2であり、 内 体 （co rpu s ) から生じるのが L3である。 ほとんどの植物種において 、 表皮は全て L 1層から生成し、 L 2層は生殖細胞系に関係する。 これ らの細胞層ごとに異なる性質をもつ周縁キメラは園芸的に重要なも のが多く産業的価値は高いが、 偶発的に、 あるいは放射線照射や薬 剤処理のような人為的に変異を誘発する手段によっても周縁キメラ が得られる確率は極めて低い。
外来遺伝子を植物体へ導入する際に人為的に一部の細胞のみ導入 遺伝子を有するキメラ植物を作出するのは容易ではない。 これまで には、 パ一ティクルガンを用いた方法により トウモロコシの未成熟 胚に遺伝子を導入し、 生殖細胞または L2細胞層にのみ導入遺伝子を 有するキメラ植物を作出した例がある （特表平 10— 503374号公報） 。 しかし、 ァグロパクテリゥムを介して遺伝子を導入する場合には 、 キメラ植物を作出するのは一層難しい。 ァグロバクテリウムを介 して遺伝子を導入する方法においては、 マーカー遺伝子の発現によ る薬剤耐性などの形質を指標として、 遺伝子が導入された単一の細 胞を選別し、 当該単一の遺伝子導入細胞から一個体の形質転換体植 物を得る。
よって、 通常得られる遺伝子組換え植物は遺伝的に単一の細胞か らなり、 すべての細胞において導入遺伝子を有するものである。 仮 に一部の細胞にしか外来遺伝子を有しない植物 （キメラ植物） が得 られたとしても、 それは偶然の結果であり、 現在の技術を以つて植 物体の特定の部分の細胞にのみ遺伝子が導入されるように制御する ことは非常に困難である。 また偶然得られたとしても、 前述のよう に、 一部の細胞層にのみ遺伝子を有する周縁キメラとなる確率は極 めて低いと考えられる。
遺伝子導入細胞を選抜する過程において、 その一部にのみ外来遺 伝子導入されたキメラ細胞塊あるいはキメラ植物体が出現すること はあるが、 この場合、 全細胞層を通してキメラ、 もしくはひとつの 組織層自体がキメラとなっており、 完全な周縁キメラ （特定の細胞 層にのみ外来遺伝子が導入され、 その細胞層自体は均一なもの） で はない。 これまでに完全な周縁キメラ形質転換植物を作出し、 それ を分子生物学的手法で証明した例は極めて少ない。 これまでには Γ 0
1遺伝子と脱離因子を含むベクターを用いることにより、 周縁キメ ラ体が作出できることを見出した例が報告されている （特開 2002-3 15460号） が、 この場合は L3層の周縁キメラである。
遺伝子組換え植物においては、 染色体に取り込まれた導入遺伝子 はメンデルの法則に従いその子孫にまで安定して伝達される。 これ らの遺伝子組換え植物を交配親として用いることにより、 導入遺伝 子に由来する形質を利用してさらに新たな品種が作り出せる。
また、 遺伝子組換え植物に関しては、 生態系 （環境） への影響 （ 自然界への導入遺伝子の拡散等） が懸念されている。 遺伝子組換え 植物から非形質転換体や野生植物への遺伝子拡散を防ぐ技術として は、 （ 1 ) 母性遺伝の利用、 . （ 2 ) 雄性不稔の利用、 （ 3 ) 不稔種 子の利用などが知られている。 母性遺伝の利用とは、 花粉細胞には 伝わらない葉緑体のゲノムに外来遺伝子を導入することで、 花粉に よる遺伝子拡散を防ぐ方法である。
雄性不稔の利用とは、 花粉形成を阻害したり、 花粉に生殖能を持 たせない方法をいい、 これにより遺伝的隔離を.行うことができる。 例えば雄性生殖器官特異的に発現するプロモーターを使って有害な 遺伝子産物を組織特異的に作らせて、 花粉形成を阻害する方法など がある。 不稔種子の利用とは遺伝子組換え植物の種子形成を直接阻 害することにより、 交雑あるいは種子の拡散の両方を防ぐ方法であ り、 自家採種を不可能にする 「夕一ミネ一夕一テクノロジー」 等は これに該当する。
仮に生殖細胞には導入遺伝子を持たない遺伝子組換え植物を作出 することができれば、 その組換え植物を花粉親とした場合あるいは 種子親とした場合いずれにおいても、 交雑による導入遺伝子拡散の 可能性を完全に排除できることになる。 このことは、 遺伝子組換え 植物を野外で栽培したり、 産業利用したりする者にとっては、 遺伝 子組換え植物の栽培のための手続きに係る負担を軽減することにも なる。 このような手続は、 日本国内.においては、 「遺伝子組換え生 物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 （カル 夕へナ法） 」 に基づく生物多様性影響評価などであり、 他の国にお いては同様の法律に基く評価がある。
特許文献 1 特表平 10— 503374号公報
特許文献 2 特開 2002-315460号
特許文献 3 USP 5480789
特許文献 4 W0 2005/017147
特許文献 5 PCT/JP96/00348
非特許文献 1 Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-8 88 1994
非特許文献 2 Lazo et al. Bio/Technology 9: 963-967, 199
1
非特許文献 3 Fuj iwara et al. Plant J. 16 421-431, 1998 非特許文献 4 Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 4 5-59 1996 発明の開示
従って、 本発明は、 導入遺伝子が植物体の一部分の細胞にのみ存 在し、 例えば生殖細胞には存在しない遺伝子導入のバラ等の花卉植 物を提供するものである。
本発明者らは、 上記の課題を解決すべく種々検討した結果、 外来 遺伝子をァグロバクテリ ゥム · ッメファシエンスを介して花卉植物 に導入し、 再生した花卉植物がキメラ植物となる場合があることを 見出した。 さらに、 その中から周縁キメラの植物を選択することに より、 目的とする遺伝子組換え花卉植物が得られることを見出し、 本発明を完成した。 従って本発明は、 外来遺伝子が一部の細胞に存 在し、 他の細胞には存在しないバラ等の花卉植物を提供する。
好ましくは、 前記一部の細胞は一部の細胞層を構成している。 例 えば、 上記他の細胞は、 例えば花粉又は胚珠である。 より具体的な 例として、 前記一部の細胞層が、 L 1層であるか、 または L 1層と L3層 とである。 外来遺伝子としては、 フラボノイ ドの合成に係る遺伝子 、 中でもアン 卜シァニンの合成に係る遺伝子等の花色に関する遺伝 子が挙げられる。
花卉植物がバラの場合においては、 外来遺伝子は、 例えばスミ レ 科植物由来のフラボノィ ド 3 ' , 5 '—水酸化酵素遺伝子、 ゴマノハグ サ科植物由来の芳香族ァシル基転移酵素遺伝子が重要である。 前記 スミ レ科植物は例えばスミ レ科パンジーであり、 前記ゴマノハグサ 科植物は例えばゴマノハグサ科卜 レニァである。 前記バラは、 例え ばバラ品種 WKS82などのハイブリ ッ ドティー、 フロリパンダ、 ミニ バラである。 本発明のバラは導入遺伝子の効果によって、 たとえば 遺伝子導入前のバラと比べて花色が青色方向に変化している。
花卉植物がカーネーショ ンの場合においては、 外来遺伝子は、 例 えば前記外来遺伝子が、 キンギヨ ソゥ由来のカルコン合成酵素遺伝 子のプロモーター制御下にあるサルビア由来のフラボノイ ド 3 ' 、 5 ' -水酸化酵素遺伝子 c DNA、 ペチュニアのジヒ ドロフラボノール 4 - 還元酵素の染色遺伝子、 カーネーショ ン由来のアン トシァニジン合 成酵素遺伝子のうちの一ないし複数の遺伝子である。 前記カーネー ションは、 スタンダ一ドタイプまたはスプレータイプのものである 。 本発明のカーネーションは導入遺伝子の効果によって、 たとえば 遺伝子導入前のカーネーショ ンと比べて花色が青色方向に変化して いる。
しかし、 外来遺伝子は上記のような遺伝子に限定されるものでは なく、 広く色素合成系で機能する遺伝子、 例えばフラボノイ ド合成 系で機能する遺伝子であってもよい。 また外来遺伝子は GFP遺伝子 や NPT I I遺伝子、 GUS遺伝子、 SMB遺伝子のような選択マーカーの遺 伝子であってもよい。 さらに外来遺伝子は転写因子をコードする遺 伝子でもよく、 例えば myb様転写因子をコードする遺伝子、 具体的 には PHR 1遺伝子や P s r l遺伝子であつてもよい。
本発明はまた、 上記のバラ等の花卉植物と同じ性質を有するそれ らの組織、 及びこれらの栄養増殖体を提供する。
本発明は更に、 前記のバラ等の花卉植物の製造方法において、 外 来遺伝子をァグロバクテリゥムを介してバラに導入し、 そして当該 外来遺伝子が一部の細胞にのみ存在するバラを選択する工程を含む 方法を提供する。 本発明はさらに、 請求項 3〜27のいずれかに 1項 に記載の、 生殖細胞に外来遺伝子をもたない花卉植物を作出するこ とにより自然界への導入遺伝子の拡散を防止する方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 導入された遺伝子の、 バラの各器官における存在の有無 を示す図である。
図 2は、 導入された外来遺伝子が L 1層の細胞においてのみ発現し ており、 L 2層及び L 3層には発現していないことを示す。
図 3は、 実施例 2において使用するバイナリ一べク夕一 P SPB 1 30 の構造を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる花卉植物は、 ァグロパクテリゥムを介して外 来遺伝子を導入可能な花卉植物であれば特に限定されない。 例えば
、 バフ 、 力一ネーシヨ ン、 ペチュニァ、 トレニァ、 タバコ、 バーべ ナ、 一一レンベルギア、 キク、 ユリ 、 アサガオ、 金魚草、 シクラメ ン、 ラン、 トルコギキヨウ、 フリージァ、 ガーベラ、 グラジオラス
、 力スミソゥ、 カランコェ、 ペラルゴニゥム、 ゼラニゥム、 チュー
U ップ 、 ナタネ、 ポテト、 卜マ卜、 ポプラ、 バナナ、 ユーカリ、 サ ッマィモ、 タイズ、 アルフアルファ 、 ルーピン、 カリフラワーなど が挙げられる。 なかでも、 ノ ラ、 力一ネ一シヨ ン、 ペチュニア、 卜 レニァ 、 タバコ、 バーべナ、 二一レンベルギアが好ましい。 中でも
、 バラとカーネーションは特に好適に用いることができる。
本発明で用いる外来遺伝子としては、 導入後に L 1層の細胞で機能 する酵素の遺伝子であることが望ましい。 例えば花色に関する遺伝 子や選択マーカ一の遺伝子、 あるいは転写因子をコードする遺伝子 が好ましい。 花色に関する遺伝子としては、 フラボノイ ドの合成に 係る酵素の遺伝子、 たとえばアン卜シァニン合成に関わる遺伝子や ォー Pン合成に関する蛋白質をコードする遺伝子、 液胞の ρΗを制御 する蛋白質をコードする遺伝子、 脂肪族ァシル基転移酵素をコード する退伝子、 フラボン合成酵素をコ ―ドする遺伝子などが挙げられ る。 選択マーカ一遺伝子としては GFP遺伝子や ΝΡΤ Ι Ι遺伝子、 GUS遺 伝子、 SURB遺伝子などが挙げられる。 転写因子をコードする遺伝子 としては、 例えば ΜΥΒ様の転^因子をコードする遺伝子、 具体的に は PHR 1遺伝子や Ps r l遺伝子が挙げられる。 しかし、 これら具体的に 挙げた遺伝子に限定されるものではない。 本発明で用いるバラは、 園芸種または野性種のいずれでもよい。 なかでも、 商業的に有用なハイブリ ッ ドティ一、 フロリバンダ、 グ ランディ · フローラまたはミニバラ等の園芸種 （Rosa hybrida) が 望ましい。 これらの品種は特に限定されない。
バラのカルスに一定の条件下で、' ァグロパクテリ ゥムを介して、 パンジー由来のフラボノィ ド 3', 5'—水酸化酵素遺伝子の発現カセ ッ トならびに トレニァ由来の芳香族ァシル基転移酵素遺伝子 NPTII 遺伝子の発現カセッ トからなる T-DNAを導入した。 得られた形質転 換は導入遺伝子の作用により花色が変化したことから、 導入遺伝子 が花弁の細胞、 とく に色素合成を行っている花弁の L 1層の細胞に は存在することが示唆された。 バラの各々の器官にわけて抽出した ゲノム DMを铸型とする PCRにより、 花粉細胞には導入遺伝子が存在 しないことが示唆された。
. また、 当該組換え植物から得られた花粉を用いて他の園芸種なら びに野生種のバラと交雑試験を行った場合において、 得られた種子 には導入遺伝子が全く検出されなかった。 このことからも、 導入遺 伝子が花粉細胞には含まれていないことが示唆された。 更に in sit u八イブリダィゼ一シヨ ンによって、 導入遺伝子が L 1細胞層にのみ 存在することが明かとなった。 このことは、 L2細胞層を起源とし て形成される花粉などの生殖細胞には導入遺伝子が存在しないこと を裏付けるものである。 よって、 上記のようにしてバラカルスに外 来遺伝子を導入することにより、 一部の細胞にのみ導入遺伝子を有 するキメラ植物を作出することができる。
このうち、 フラポノイ ド類の合成に係る酵素の遺伝子としては、 フラポノィ ド 3'， 5'-水酸化酵素遺伝子や芳香族ァシル基転移酵素遺 伝子が挙げられる。 これらの由来は特に限定されないが、 バラで機 能することが確認されている、 パンジーなどスミ レ科植物由来のフ ラボノイ ド 3', 5'-水酸化酵素遺伝子、 あるいは、 ト レニァなどゴマ ノハグサ科植物由来の芳香族ァシル基転移酵素遺伝子が好ましい。 本発明で用いるカーネーショ ンは、 商業的に有用なスタンダー ド タイプまたはスプレータイプが望ましい。 これらの品種は特に限定 されない。 フィーリ ングホワイ ト、 ブレクロス ドウジィ 、 スターザ —ル、 コルティナシャネルなどいずれの品種でもよい。
力一ネ一シヨ ンについて、 一定の条件下で、 ァグロパクテリ ゥム を介して、 キンギヨ ソゥ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモー ター制御下にあるサルビア由来のフラボノィ ド 3' 、 5； -水酸化酵 素遺伝子 c DNA、 ペチュニアのジヒ ドロフラボノール 4-還元酵素の 染色遺伝子、 カーネーショ ン由来のアン トシァニジン合成酵素遺伝 子 SURB遺伝子を導入した。 得られた形質転換は導入遺伝子の作用に より花色が変化したことから、 導入遺伝子が花弁の細胞、 とく に色 素合成を行っている花弁の L 1層の細胞には存在することが示唆さ れた。 カーネーショ ンの各々の器官にわけて抽出したゲノム DNAを 铸型とする PCRにより、 導入遺伝子が L1 層にのみ存在するキメラ植 物であること判断された。 実施例
次に、 本発明を実施例により、 更の具体的に説明する。
実施例 1. バラへの遺伝子導入方法
バラの形質転換に関してはすでに多くの方法が報告されており （ たとえば Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 1994, U S 5480789、 WO 2005/017147) , これらの方法に従ってバラへ外来遺 伝子を導入することができる。
具体的にはァグロバクテリゥム · ッメファシエンス （Agrobacter ium tumef ac iens) Agl 0株 (Lazo et al. Bio/Technology 9： 963- 967, 1991) の菌液中に、 無菌苗の葉から誘導したバラのカルスを 5 分間浸し、 滅菌濾紙で余分な菌液を拭き取った後、. 継代用培地に移 植し、 2日間暗所で共存培養した。
その後、 カルペニシリ ンを 400mg/l 加えた MS液体培地で洗浄し、 継代用培地にカナマイシン 50mg/l とカルべニシリ ン 200mg/lを加え た選抜 · 除菌用培地へ移植した。 選抜培地上で生育阻害を受けず、 正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、 カナマイシン耐性力 ルスを選抜した。
カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、 カナマイシン 50mg /1、 カルべニシリ ン 200mg/lを添加じた再分化用の培地で培養し、 カナマイシン耐性シュートを得た。 得られたシュー トは 1/2MS培地
(カナマイシンを添加していない） で発根させた後、 馴化を行った 。 馴化個体は鉢上げ後、 閉鎖系温室で栽培して開花させた。 その後 、 通常の栄養増殖 （挿し木） にて維持 ， 増殖を行った。
実施例 2. バイナリ一バク夕一 PSPB130の構築
アン トシァニンを芳香族ァシル基により修飾することによりアン トシァニンを安定化させ、 かつその色を青くすることができる （た とえば、 PCT/JP96/00348) 。 ァシル化したデルフィ二ジン型アン ト シァニンの生産を目指して以下の実験を行った。
トレニァ （商品名 ： サマーウエーブ （商標） ） の花弁から total RNAを得、 さ らにこれから polyA+RNAを調製した。 この polyA+RNAか ら λΖΑΡΙΙ (Stratagene社） をべクタ一とする cDNAライブラリーを d irectional cDNAライブラリー作製キッ ト （Stratagene社） を用い て製造者が推奨する方法で作製した。
トレニァの主要アン トシァニンはその 5位のグルコースが芳香族 ァシル基により修飾されている （Suzuki et al. Molecular Breedi ng 6, 239-246, 2000) ので、 トレニァ花弁においてはアン トシァ ニンァシル基転移酵素が発現している。 アン トシァニンァシル基転 移酵素は Asp-Phe-Gly-Trp-Gly- Lys. というアミノ酸配列が保存され ており、 これに対応する合成 DNAをプライマ一として用いることに よりアン トシァニンァシル基転移酵素遺伝子を取得することができ る （PCT/JP96/00348) 。
具体的には、 トレニァ cDNAライブラリー作製の際に合成した 1本 鎖 cDNAlOngを铸型とし、 lOOng の ATCプライマ一（5' - GA (TC) TT (TC) G GITGGGGIAA-3' , Iはイノシン、 （TC)はいずれか一方を意味する） （ 配列番号 ： 1 ) 、 lOOngのオリゴ dTプライマー （5' - TTTTTTTTTTTTTT TTTCTCGAG-3') (配列番号 ： 2 ) をプライマ一とし、 TaQポリメラー ゼ （夕カラ、 日本） を用いて製造者の推奨する条件で PCRを行った 。 PCRは、 95度 1分、 55度 1分、 72度 1分を 1サイクルとする反応を 25 サイクル行った。 得られた約 400 bpの DNA断片を Gene Clean II (BI 0, 101. Inc. ) により製造者の推奨する方法で回収し、 pCR_T0P0に サブクローニングした。
その塩基配列を決定したところリ ンドウのァシル基転移酵素遺伝 子 （Fujiwara et al. Plant J. 16 421-431, 1998) に相同な配列 が見られた。 なお塩基配列はダイプライマー法 （アプライ ドバイオ システムズ社） を用い、 シークェンサ一 310あるいは 377 (いずれも アプライ ドバイオシステムズ社） を用いて決定した。
この DNA断片を DIG標識検出キッ ト （日本ロシュ） を用いて DIGに より標識し、 製造者が推奨する方法でト レニァの cDNAライブラリー をプラークハイブリダィゼーシヨ ン法によりスク リーニングした。 得られたポジティ ブシグナルをもたらしたクローンを無作為に 1 2 個選択し、 そこからプラスミ ドを回収し、 塩基配列を決定した。 こ れらはアン トシァニンァシル基転移酵素によい相同性を示した。 こ れらのクローンのうち pTAT7としたクローンに含まれる cDNAの全塩 基配列を決定した （配列番号 ： 3 ) 。
PBE2113-GUS (Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 45-5 9 1996) を Saclで消化した後、 平滑末端化し、 8bpの Xholリンカ一 (TaKaRa) を挿入した。 このプラスミ ドの BamHIと Xhol部位に pTAT7 を BamHIと Xholで消化して得られる約 1.7kbの DNAを挿入し、 pSPB120 を得た。 PSPB120を SnaBIと BamHIで消化した後平滑末端化しライゲ —シヨ ンすることにより PSPB 120' を得た。 一方、 パンジー由来の F 3'， 5' H#40 cDNA を含むプラスミ ド pCGP 1961を BamHIで完全消化し 、 さらに Xholで部分消化し得られる約 1.8kbの DNA断片を回収し、 こ れと BamHIと Xholで消化した PUE5Hとライゲーシヨ ンし得られたブラ スミ ドを PUEBP40とした。
PUEBP40を SnaBIと BamHIで消化し 後平滑末端化しライゲーショ ンすることにより PUEBP40' を得た。 PUEBP40を Hindlllで部分消化 し得られる約 2.7kbの MA断片を回収し、 Hindi IIで部分消化した DNA 断片と連結した。 得られたプラスミ ドのうち、 バイナリ -ベクター 上でライ トポ一ダ一側から、 ネオマイシンフォスフォ トランスフエ ラ一ゼ遺伝子、 パンジー F3' 5' H#40、 トレニァ 5 AT遺伝子の順に それぞれが同方向に連結されたバイナリ -ベクタ一を PSPB130とした
(図 3 ) 。 本プラスミ ドは植物においてはパンジー F3' 5' H#40遺 伝子と 5AT遺伝子構成的に発現し、 遺伝子を花弁特異的に転写する ように工夫されている。 このプラスミ ドを Agrobacter ium tumef aci ens AglO株に導入した。
実施例 3. WKS82へのパンジー F3' , 5' Η# 40遺伝子と トレニァァ ントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系バラ 「WKS82」 へ PSPB130を導入し、 89個体の形質転換体を 得た。 色素分析を行った 44個体全てでデルフィ二ジンの蓄積を確認 した。 デルフィ二ジン含有率は最高 91% (平均 49%) であった。 花 色は RHSカラーチャー ト 186d (GREYED-PURPLE GROUP) から 80c (PU RPLE-VIOLET GROUP) へ変化した。 代表的な形質転換体の分析値を 下表に示す。
表 1
Figure imgf000014_0001
De 1 ： デルフィ ジニジン、 Cya： シァニジン、 Peし' ペラルゴ二ジ ン、 M : ミ リセチン、 Q : ケルセチン、 K : ケンフエロール、 Del (% ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合、 Acyl (%) ： 総アン トシァニン中のァシル化された色素の割合、 na： 分析未実施 表 2
Figure imgf000015_0001
De 1 ： デルフィ ジニジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴニジ ン、 M : ミ リセチン、 Q : ケルセチン、 K : ケンフエロール、 Del ( % ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合、 Acyl (%) ： 総アン トシァニン中のァシル化された色素の割合、 na： 分析未実施 実施例 4. 各器官における導入遺伝子の存在の有無確認
「WKS82」 （以下、 宿主という）及び実施例 3で作出した組換え体 N 0.5及び No.24 (WKS82/130- 4-1及び WKS82/130- 9- 1 ； 以下、 組換え体 という） の花弁、 葉、 茎、 根及び花粉より DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いて製造業者推奨の方法に従ってゲノム DNA を抽出し た。 抽出したゲノム DNA を铸型として TaKaRa Ex Tad (TaKaRa) に より PCR 法にて導入遺伝子 （パンジー F3' 5' H 遺伝子 （配列番号 4) 、 トレニァ 5AT 遺伝子 （配列番号 3 ) 、 大腸菌 ΝΡΤΠ遺伝子） の増幅を行った。
さらに、 内在性コントロールとしてバラのアントシァニジン合成 酵素（ANS)遺伝子の増幅を行った。 PCR の反応条件は、 熱変性が 94 でで 5 分間、 続いて 94でで 30 秒、 55でで 30 秒、 72でで 1 分のサイ クルを 25 回繰り返し、 その後、 伸長反応が 72 で 7 分である。 得 られた増幅産物をァガロースゲルにて電気泳動を行い、 ェチジゥム プロマイ ド染色によって増幅断片の検出を行った。
なお、 パンジー F3'5'H 遺伝子の増幅には BP40- F2 と BP40— R3 を 、 トレニァ 5AT 遺伝子の増幅には TAT7-50F と TAT7- R1 を、 NPTII遺 伝子の増幅には NPTII- F と NPTII-R を、 ANS遺伝子の増幅には RhANS 69-rl と RhANS69- ml をプライマーとして用いた。
パンジー F3 ' 5 ' H 特異的プライマー
BP40-F2： 5' -GAG CTA GGC CAC ATG CTT A-3' (配列番号 ： 5) BP40-R3： 5' -CTT TGC GCT CAT GAC TCG T- 3' (配列番号 ： 6
)
トレニァ 5AT 遺伝子特異的プライマ一
TAT7-50F ： 5' -AAC AAT ATG TGC AGT CCT CGA A-3' (配列番号 ： 7 )
TAT7-R1 ： 5'-AAC TCG CAT CGC CAA CTA C-3' (配列番号 ： 8
)
NPTII遺伝子特異的プライマー
NPTII-F： 5' -GAT TGA ACA AGA TGG ATT GCA CGC-3' (配列番号 ： 9 )
NPTII- R : 5' -CGA AGA ACT CCA GCA TGA GAT CCC-3' (配列番号 ： 10) ANS 特異的プライマー
Rh ANS 69-r l ： 5 ' -TTT GAT CTT CCC ATT GAG C-3' (配列番号 ： 1 1 )
Rh ANS 69- m l ： 5 ' - TCC GCG GTG GGA AGA TCC CC-3 ' (配列番号 ： 12)
PCR による解析の結果、 本組換え体の花弁、 葉、 茎のゲノム中に は導入遺伝子が検出されたが、 根、 花粉のゲノムにおいてはこれら 導入遺伝子は検出されなかつた。 表 3及び図 1 に結果を示した。
また、 花弁、 葉や茎の表皮系、 がく片、 雄ずい、 雌ずいは L 1 層 及び L2 層、 花粉と卵細胞は L2 層、 葉や茎の内部組織、 根は L3 層 に由来することが知られている。 根及び花粉のゲノムにおいて導入 遺伝子が検出されなかったことより、 本組換え体は導入遺伝子が L 1 層にのみ存在するキメラ植物であることが示唆された。
表 3 ： 組換え体の各器官における導入遺伝子の存在の有無
Figure imgf000017_0001
実施例 5 . 園芸種との人工交配 （温室内）
常法に従い、 園芸種の開花直前に除雄、 袋かけをした後、 雌しベ が十分に成熟した時点で晴天日の午前中に温室内で栽培した宿主あ るいは実施例 3で作出した組換え体 No. 24 ( WKS82/ 130-9- 1 ； 以下、 組換え体という） の花粉を付着させた。 その後、 他の花粉が付着し ないように再度袋かけを行い、 種子形成の有無を調査した。 なお、 花粉は開裂前の葯を回収後、 シリカゲルを入れたデシケ一夕内で 1 日間室温放置し、 翌日開裂した葯から回収した新鮮な花粉を用いた 。 交雑母本として、 グランディ · フローラ系四季咲きバラ品種 「ク ィーンエリザベス」 、 フロリバンダ系四季咲きバラ品種 「ゴールド バニ一」 を用いた。
交配後 1 ヶ月以上経過した時点で、 生理落果せず、 結実が認めら れた果実について種子形成の有無を確認した。 さらに組換え体との 交配により得られた種子については、 後代における導入遺伝子の伝 達性を確認するため、 得られた種子より Nucleon PHYTOPURE for PL ANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham B iosc i ences)を用いてゲノム M A を抽出し、 さらに REPLI-g Kit (QIAGEN)にてこれを増幅後、 PCR 法にて導入遺伝子 （パンジー F3'5' H 遺伝子） を検出した。
結果を表 4に示した。 結実率は、 宿主及び組換え体間でほとんど 差異は認められなかった。 さらに組換え体との交配により得られた 種子を解析した結果、 これらの種子からは導入遺伝子は全く検出さ れなかった。 このことから、 花粉の受精能力については宿主と組換 え体間で差異はないものの、 組換え体の花粉細胞中には導入遺伝子 が含まれていない等の理由により、 導入遺伝子は後代に伝達されな いことが示唆された。
表 4 ： 園芸種との人工交配
Figure imgf000018_0001
実施例 6. 園芸種との人工交配 （野外）
常法に従い、 園芸種の開花直前に除雄、 袋かけをした後、 雌しベ が十分に成熟した時点で晴天日の午前中に野外で栽培した宿主ある いは実施例 3で作出した組換え体 No.24 (WKS82/ 130-9- 1 ； 以下、 組 換え体という） の花粉を付着させた。 その後、 他の花粉が付着しな いように再度袋かけを行い、 種子形成の有無を調査した。 なお、 花 粉は開裂前の葯を回収後、 シリカゲルを入れたデシケ一タ内で 1 日 間室温放置し、 翌日開裂した葯から回収した新鮮な花粉を用いた。 交雑母本として、 グランディ · フローラ系四季咲きバラ品種 「ク ィ一ンエリザベス」 、 フロリバンダ系四季咲きバラ品種 「ゴールド バニ一」 を用いた。
交配後 3ヶ月以上経過した時点で、 生理落果せず、 結実が認めら れた果実について種子形成の有無を確認した。 さらに組換え体との 交配により得られた種子を回収し、 4でで 3ヶ月間低温処理した後、 播種した。 これらにおける導入遺伝子の伝達の有無を確認するため 、 得られた実生の葉より DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いて ゲノム DNAを抽出し、 PCR法にて導入遺伝子 （パンジー F3' 5'H遺伝子 ) の検出を行った。 なお、 内在性コントロール遺伝子としてバラの ダリセルアルデヒ ド- 3-リン酸デヒ ドロゲナーゼ（GAPDH)遺伝子の検 出を行った。
また、 種子を低温処理した場合、 通常は 1ヶ月程度で発芽が認め られるが、 3ヶ月経過してもその一部しか発芽が認められなかった 。 そこで、 発芽しなかった播種種子の一部を再回収し、 種子を用い て同様の解析を行った。 再回収した種子より、 Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences)を用いてゲ ノム MAを抽出し、 さらに REPLI-g Kit (QIAGEN)にてこれを増幅後、 PCR法にて導入遺伝子 （パンジー F3' 5' H遺伝子） の検出を行った 結果を表 5及び表 6に示す。 結実率は、 宿主及び組換え体間でほ とんど差異は認められなかった。 さらに、 組換え体との交配により 得られた実生を P C R法にて解析したが、 これらの実生からは組換え 体由来の導入遺伝子は検出されなかった。 さらに、 いずれの種子に おいても組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。 このこと から、 花粉の受精能力については宿主と組換え体間で差異はないも のの、 組換え体の花粉細胞中には導入遺伝子が含まれていない等の 理由により、 導入遺伝子は後代に伝達されないことが示唆された。
人工交配による園芸種との結実率及び発芽個体における導入遺伝子の検出率
Figure imgf000021_0001
表 6. 園芸種との人工交配により得られた種子における導入遺伝子 の検出率
Figure imgf000022_0001
* 1), 2) ： 回収種子数と解析種子数の相違は、 秕 （種子の中身が ないもの） 、 DNA抽出が不可能であったもの、 PCR解析でコン ト口一 ル遺伝子の増幅が認められなかったものは本解析の対象から除外し たため生じた。 実施例 7. 野生種との人工交配 （野外）
常法に従い、 園芸種の開花直前に除雄、 袋かけをした後、 雌しベ が十分に成熟した時点で晴天日の午前中に野外で栽培した宿主ある いは実施例 3で作出した組換え体 No.24 (WKS82/130- 9-1 ； 以下、 組 換え体という） の花粉を付着させた。
その後、 他の花粉が付着しないように再度袋かけを行い、 種子形 成の有無を調査した。 なお、 花粉は開裂前の葯を回収後、 シリカゲ ルを入れたデシケ一夕内で 1 日間室温放置し、 翌日開裂した葯から 回収した新鮮な花粉を用いた。
交雑母本として、 野生種はノイバラ （R. multiflora Thunb. ex Murray) 、 テリハノイバラ （R. wichuraiana Crep. ) 、 ハマナス （ R. rugosa Thunb. ex Murray) を用レ た。
交配後 2ヶ月以上経過した時点で、 生理落果せず、 結実が認めら れた果実について種子形成の有無を確認した。 さらに得られた種子 を回収し、 4でで 3ヶ月間低温処理した後、 播種した。 これらにおけ る宿主あるいは組換え体との交雑の有無、 導入遺伝子の伝達の有無 を確認するため、 得られた実生の葉より DNeasy Plant Mini Kit (Q IAGEN) を用いてゲノム DNAを抽出し、 PCR法にて解析を行った。 宿 主あるいは組換え体との交雑の有無にづいては四季咲き性に関与す る遺伝子 （KSN遺伝子）を指標とし、 導入遺伝子の伝達の有無につい ては組換え体由来の導入遺伝子であるパンジー F3' 5' H遺伝子を指 標とした。 なお、 内在性コントロール遺伝子としてバラの GAPDH遺 伝子を用いた。
KSN遺伝子は一季咲きのバラの ksn遺伝子 （茎頂を維持する働きを もつ） に約 9kbのトランスポゾンが挿入されて生じたもので、 これ により当該遺伝子の発現が抑制され、 茎頂における花芽の形成抑制 が解除されるため、 花芽形成が促進され、 四季咲き性となることが 報告されている1 )。 園芸種は KSN遺伝子をホモで有する。 一方、 一 季咲きの野生種は ksn遺伝子をホモで有する。 従って、 野生種 （一 季咲き） においては、 KSN遺伝子は園芸種と交雑した場合にのみ検 出されると考えられる。
また、 種子を低温処理した場合、 通常は 1ヶ月程度で発芽が認め られるが、 3ヶ月経過してもその一部しか発芽が認められなかった 。 そこで、 発芽しなかった播種種子の一部を再回収し、 種子を用い て同様の解析を行った。 再回収した種子より、 Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences)を用いてゲ ノム DNAを抽出し、 さらに REPLI-g Kit (QIAGEN)にてこれを増幅後、 PCR法にて宿主あるいは組換え体との交雑の有無、 導入遺伝子の伝 達の有無について解析を行った。
結果を表 7及び表 8に示す。 結実率は宿主、 組換え体いずれを花 粉親とした場合でも極めて低かった。 得られた実生を PCR法にて解 析したが、 宿主あるいは組換え体と野生種との交雑は認められたも のの、 組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。 さらに、 発 芽しなかった播種種子を再回収し、 種子の充実について観察を行つ たところ、 そのほとんどが 「しいな （種子の中身がないもの） 」 で あり、 正常な胚が確認できた個体はごくわずかであった。 これらに ついても同様に PCR法にて解析を行ったが、 宿主あるいは組換え体 と野生種との交雑は認められたものの、 組換え体由来の導入遺伝子 は検出されなかった。 このことから、 組換え体の花粉細胞中に導入 遺伝子が含まれていない等の理由により、 導入遺伝子が後代に伝達 されなかったものであると考えられた。
よって、 本組換え体と野生種 （ノイバラ、 テリハノイバラ、 ハマ ナス） が交雑したとしても、 組換え体の花粉細胞中に導入遺伝子が 含まれていない等の理由から、 導入遺伝子が後代に伝達される可能 性はないことが示唆された。
なおテリハノイバラについては、 いずれの種子も正常な胚を確認 できなかった。
表 7 . 人工交配による野生種 （ノイバラ、 テリハノイバラ、 ハマナス） との結実率及び発芽個体 における導入遺伝子の検出率
Figure imgf000025_0001
表 8 . 野生種 （ノイバラ、 テリハノイバラ、 ハマナス） との人工交配により得られた種子における 導入遺伝子の検出率
Figure imgf000026_0001
* 1) , 2) ： 回収種子数と解析種子数の相違は、 秕 （種子の中身がないもの） 、 DNA抽出が不可 能であったもの、 PCR解析でコントロール遺伝子の増幅が認められなかったものは本解析の対 象から除外したため生じた。
実施例 8. in s i t uハイブリダィゼーシヨ ン
導入遺伝子の局在性をさらに詳しく調べるために、 in situハイ ブリダイゼ一ショ ンを行った。 5mm程度の大きさの蕾を垂直方向に 半分に切断後、 ホルムアルデヒ ド固定液に浸して固定した。 次に脱 水を行うため、 固定液を 50%エタノールから 100%エタノールに順 に置換し、 さ らに 25%レモプールに置換（透徹） した。 その後パラフ イ ンを徐々に浸潤させ、 包埋した。 包埋サンプルをミクロ トームで 薄切し、 スライ ドグラスに接着させた。 スライ ドグラスを水和し、 プロテネース K処理、 ァセチル化などの前処理を行った後、 脱水、 乾燥させた。 DIGラベルしたプローブ（BP40、 TAT、 NPTIK 各遺伝子 のアンチセンス及びセンスプローブ）をハイブリダィゼ一シヨ ン溶 液に溶解し、 乾燥させたスライ ドグラスにのせ反応させた。 ハイブ リダィゼ一シヨ ン後、 スライ ドグラスを洗浄し、 DIGを検出した。 図 2の写真に示されるように、 導入遺伝子は L1層の細胞でのみ発 現しており、 L2層、 L3層の細胞では発現が見られない。 このことか ら、 導入遺伝子は L1層にのみ存在し U層、 U層には存在しないこと 、 ゆえに L2層から生じる生殖細胞 （花粉細胞や胚珠の細胞） には導 入遺伝子が存在しないことが証明された。
実施例 9 : 組換えカーネーショ ンの作製と解析
導入遺伝子が L1 層にのみ存在するカーネーショ ンを作成した。 組換えカーネ一ショ ンは、 ァグロパクテリ ゥムを用いる遺伝子導 入により、 以下のように作製した。 プラスミ ド p CGP2442 (Appl ica tion No. US60/988, 293 出願日 2007年 11月 15日に記載） はその T-D NA領域に、 キンギヨ ソゥ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモー 夕一制御下にあるサルビア由来のフラポノィ ド 3' 、 5' -水酸化酵 素遺伝子 c DNA、 ペチュニアのジヒ ドロフラボノ一ル 4-還元酵素の 染色遺伝子、 カーネーショ ン由来のアン トシァニジン合成酵素遺伝 子、 さらに形質転換の選抜マーカ一としてカリフラワーモザイクゥ ィルス 35Sプロモー夕 制御下にあるタバコのァセトラクテート合 成遺伝子 SURBc DNAが含まれている。 これを特許出願特表平 1卜 5051 16に記載されている方法でァグロパクテリゥムに導入し、 さらに力 —ネ一シヨン品種コルティナシャネルに導入した。 得られた組換え カーネーショ ンの花弁には、 天然のカーネーショ ンには含まれない デルフィ二ジンが検出された。 これは導入遺伝子が少なく とも花弁 の上皮細胞で機能していることを示している。 このうち 1系統 （系 統 19907) について詳細に解析した。 また、 系統 19907から染色体 DN Aを抽出し、 上述の PCGP2442の T- DNA上の遺伝子をプローブとして用 いてサザンハイブリダィゼーシヨ ン法により解析したところ、 導入 遺伝子が染色体に挿入されていることが確認された。
5/z g/L Glean.を含むホルモンフリ一MS固形培地に系統 19907と系 統 26898のシユートを植えることにより組織培養物を作製した。 4_ 5週間に発根の有無を観察したところ、 系統 26898は発根していたが 、 系統 19907は発根していなかった。
次に系統 19907と系統 26898および品種コルティナシャネルから得 た葉の切片を 5 i g/L Glean を含む hali_s t rength MS 固形 medium w ith 0.5 mg/L IAAと Gl eanを含まない hal f - s t rength MS 固形 medium with 0.5 mg/L IAA上において 5週間培養した。 5 g/L Glean を含 む培地で培養した系統 19907と品種コルティナシャネルの葉片はい ずれも褐変した。 系統 26898の得られた葉片は緑色で発根が見られ た。
系統 19907の葉と根から DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社） を用 いて染色体 DNAを抽出した。 この DNA100 ngを铸型にし、 SuRB遺伝子 を増幅するための合成プライマ一 （# 960 5 ' -ATT TCC GCC TCA TTA GAA GG-3' , # 1468 5， -GCC TCA TGT TTC CAT TTG TGC-3' ) を用いて PCRを行った。 反応は Hot Star TaQを用い、 25 1の反 応体積で、 95度の反応を 15 分行った後、 96度の反応を 1 分， 52度の反応 30 秒， 72度の反応を 2 分 からなる 1サイクルを 35 サイ クル行い、 さらに 72度の反応を 7 分おこなった。 この反応物をァ ガロースゲル電気泳動で解析したところ、 葉由来の DNAを铸型と し た場合には、 SURBのバン ドが観察されたが、 根由来の DNAを铸型と した場合には、 SURBのバンドが観察されなかった。
葉は Ll、 L2、 L3細胞からなり、 根は L2、 L3細胞からなることが知 られている。 以上の結果から、 系統 19907は L1細胞には導入遺伝子 が入っているが L2， L3細胞には導入遺伝子が入っていないこと、 す なわち、 系統 19907は導入遺伝子が L1 層にのみ存在するキメラ植物 であること判断された。
実施例 10
各種植物について、 本発明の技術の応用の可能性を検討した。
(1) ペチュニアへの感染例
花卉植物としてペチュニアを用いて、 外来遺伝子としてフラボノ ィ ドの合成に係る遺伝子を導入した。
カリ フラワーモザイクウィルス （CaMV) 35Sプロモ一夕一上流に ェンハンサー配列を 2回繰り返し持つ E 1235Sプロモーター配列 （Pla ntCell Physiol. 37, 49-59 (1996) ) と、 チョ ウマメの F3， 5' H cDM配列 （特許出願番号 WO 2004/020637に記載） 、 ノパリ ン合成酵 素 （nos) のターミネータ一配列をバイナリーベクタ一 pBinPlus (T rangenic Research, 4， 288-290 (1995) ) に導入してある pSPB748 (PlantCell Physiol. 43, s227 (2002) ) より、 チョ ウマメ F3， 5 ' H cMAと nos夕一ミネ一ターの連結した DNA断片 （約 2. Okb) を Bam HI消化と EcoRIの部分消化によって回収し、 pBluescriptll (sk-) ( Stratagene社） の BamHI/EcoRIサイ トに導入することにより、 ブラ スミ ド pB-Bnとした。 マウスの異物応答配列 （XRE) を 6回繰り返し 持つ 6xXREプロモーター配列と、 GUS遺伝子、 nosターミネ一夕一を p Bluescriptll (ks+) (Stratagene) に導入してある pB 1 ueSXXREGUS
(Kodama (2003) Molecular mechanisms of chemical - inducible g ene express ion in higher plants for monitoring and remed i a t i on of environmental contaminants, Diss. ) より GUS遺伝子と nos 夕一ミネ一夕一の遺伝子カセッ トを Xbalと Kpnlで抜き出し、 同サイ 卜に pB-Bnから Xbalと Kpnl消化で切り出したチョウマメ F3' 5' Ηと η os夕一ミネ一夕一の連結した DNA断片 （約 2.0kb) を挿入し、 pB-X6B nを得た。 バイナリーベクタ一 pBinl9上に、 CaMV35Sプロモーターと nos夕一ミネ一夕一からなる発現ユニッ ト 2組にアルフアルファモザ イクウィルスの 5' 非翻訳（UTR)配列をそれぞれ付加させた AhRV及び Arntを順方向に挿入したベクタ一 pSKAVAt (Kodama (2003) ) の Sail サイ トに、 pB_X6Bnを Xhol消化して切り出した 6xXREプロモータ一配 列とチョウマメ F3' 5' H cDNA、 nos夕一ミネ一夕一配列の遺伝子 カセッ ト （2.2kb) を導入することにより、 PSPB 1459を構築した。
PSPB1459をァグロバクテリウムッメファシエンス AglO株 （BioTec hnology 9， 963-967 (1991)) に導入し、 ペチュニア （品種 PL, Skr 4 xSw63 (Nature, 366, 276-279 と同じ）） をリーフディスクを 用いるァグロパクテリゥム法で形質転換した。 ァグロパクテリゥム へのプラスミ ドの導入、 形質転換の方法は公知の方法 （Plant J. 5 , P81-92 (1994)) によった。 品種 PLはフラボノイ ド 3 ' ， 5 ' -水酸 化酵素遺伝子、 フラボノイ ド 3' -水酸化酵素遺伝子を欠損している ため花色は白ないし薄いピンクであるが、 本実験の目的には使用す るペチュニア品種は PLに限定されるものではない。 独立した形質転 換ペチュニア PABを 38系統取得した。
(2) ： 卜レニァへの感染例 その 1 花卉植物として卜レニァを用いて、 外来遺伝子として選択マ一力 一の遺伝子である GFP遺伝子を導入した。
CaMV35S-sGFP (S65T) -N0S3' (Curr. Biol. 6, 325-330 (1996) ) を BamHIと EcoRIで消化し、 sGFP遺伝子と nos夕一ミネ一夕一遺伝 子の連結 DNA (1. Okb)を pBluescriptll (sk- )の BamHI/EcoRIサイ トに 導入することにより、 プラスミ ド pB-Gnを構築した。 pBlueSXXREGU S- lastより GUS遺伝子と nos夕ーミネー夕一の遺伝子カセッ トを Xbal と Kpnlで抜き出し、 同サイ トに pB-Gnから Xbalと Kpnl消化で切り出 した sGFPと nos夕一ミネ一夕一の遺伝子カセッ ト （l. Okb) を挿入、 pB- X6Gnを構築。 pSKAVAtの Sailサイ トに、 pB- X6Gnを Xhol消化して 切り出した 6xXREプロモーターと sGFP、 nos夕一ミネ一夕一の遺伝子 カセッ ト （1.2kb)を導入、 PSPB 1458を構築した。
pSPB 1458をァグロバクテリゥムッメファシエンス AglO株に導入し 、 リーフディスクを用いるァグロパクテリゥム法でトレニァ （品種 サマーウェーブブルー ： SWB (サントリーフラワーズ株式会社） ） リーフディスクに形質転換を行った。 トレニァの形質転換は公知の 方法 （Mol. Breeding 6, 239-246 (2000) ) によった。 SWBの花色は 青であるが、 本実験の目的には使用する トレニァ品種は SWBに限定 されるものではない。 独立した形質転換トレニァ系統 TAGを 40系統 取得した。
(3) 卜レニァへの感染例 その 2
花卉植物としてトレニァを用いて、 外来遺伝子としてフラボノィ ドの合成に係る遺伝子を導入した。
W02005-059141に開示されている方法に準じ、 トレニァ品種サマ 一ウェーブブル一を宿主植物として、 上記同様のァグロバクテリウ ムを用いる方法により、 オーロン合成に関わる遺伝子の発現カセッ 卜と、 アン 卜シァニン合成系遺伝子の発現を RNAiにより抑制するた めのカセッ トを有するコンス トラク ト （PSFL307または PSFL308) を 導入した。 得られたトレニァでは、 花色が青から黄色に変化した。
(4) タバコ、 バーべナ、 ニーレンベルギアへの感染例
花卉植物としてタバコ、 バーべナまたはニーレンベルギアを用い て、 外来遺伝子として転写因子遺伝子を導入した。
リン酸飢餓条件下で発現するシロイヌナズナの PHR1遺伝子 （Gene s & Development 15:2122-2133 (2001) ) を TOPO- TACloningKi t (ィ ンビトロジェン株式会社） を用い、 解説書に従い pCR2. 1ベクタ一に サブクローニングした。 プライマー PHRf (5' -ATGGAGGCTCGTCCAGTT CAT- 3' ) と PHRr (5' -TCAATTATCGATTTTGGGACGC-3 ' ) を用いた PCR 反応で増幅した産物をサブクローニングし、 PSPB 1892とした。 .35S プロモ一夕一のェンハンサ一配列とマノピンシン夕一ゼプロモ一夕 —を連結した （Mac) プロモーターとマノピンシン夕ーゼ （mas) 夕 ―ミネーターを有するバイナリ一べクタ一 PSPB2311を Smalで切断し 、 PSPB2311Aを得た。 PSPB 1892を EcoRIで切断し平滑化した断片を pS PB2311Aに挿入し PSPB2314を得た。
引き続いて、 公知の方法 （Plant J. 5, 81, 1994) に基づいて pS PB 1898を用いてァグロパクテリゥム （菌株 ： AglO) を形質転換し、 この PSPB1898を有する形質転換体ァグロバクテリゥムを用いて、 夕 バコ、 バ一ペナ、 ニーレンベルギアの形質転換を実施した。 タバコ 、 バーべナ、 二一レンベルギアの形質転換はそれぞれ公知の方法 （ Science 227, 1229, 1985 ； Plant Cell Rep. 21, 459, 2003； Plant Biotech. 23, 19, 2006) に基づき行った。 得られた植物体の遺伝 子導入については、 各植物体の葉より DNAを抽出し、 PHR1遺伝子を テンプレートとした PCRにより確認した。 タバコで 11個体、 バーべ ナで 16個体、 二一レンベルギアで 1個体の PHR1形質転換植物を取得 した。 (5) インパチエンス、 ベゴニァへの感染例
花卉植物としてインパチエンスまたはべゴニァを用いて、 外来遺 伝子として転写因子遺伝子を導入した。
インパチエンス （Impatiens walleriana) の形質転換は基本的に US Patent 6， 121， 511に従い、 品種グリ ッターレッ ド （サカタの夕 ネ） とテンポピンク （夕キイ種苗） を用いておこなった。 ビトロ苗 から切り出した茎頂、 節、 葉柄、 葉片を前培養液体培地 （lmg/L TD Z 添加 MS培地） で 5 日間前培養後、 前培養固形培地 （0.05mg/L NAA , 6mg/L Zeatin, 0.3%ゲランガム 添加 M S培地） に 4 8時間静置 した。 その後、 PSPB2314を導入したァグロパクテリゥム （菌株 AglO ) を感染させ、 選択培地上 （0.05mg/L NAA, 6mg/L Zeatin, lOOmg/ L Kanamyc in, 500mg/L Carbenic i 11 in, lOOmg/L Cefotaxime, 0.3 %ゲランガム添加 MS培地） で 4— 8週間培養しシュートを得た （表 9 ) 。 葉片は容易に褐変してしまいシュートは得られなかった。 茎 頂および節では 1つの外植片より多くのシュートが得られたが、 偽 陽性も多数含まれると考えられた。 葉柄からのシュートは出現に時 間がかかり、 数も少ないが、 最も確からしい。
ベゴニァ （Begonia Semper f lorens) の形質転換は品種アンバサ ダ一ホワイ トとアンバサダースカーレッ ト （サカ夕のタネ） を用い ておこなった。 ビトロ苗から葉片と葉柄を切り出し、 PSPB2314を導 入したァグロパクテリゥム （菌株 AglO) を感染させ、 共存培養培地 (0.5mg/L IAA, 0. lmg/L TDZ, 0.5% PVP, 2mg/L AgN03, 200 ^ M Ac etosyringone, 0.3 %ゲランガム添加 MS培地） 上で暗黒下 3 日間培 養した。 その後、 前選択培地 （lmg/L BAP, lmg/L Zeatin, 0. lmg/L IAA, 500mg/L Timentin, 50^M Ace tosyr ingone, 0.25%ゲランガ ム添加 MS培地） で 3 — 5 日間、 選択培地 1 (2mg/L TDZ, 0. lmg/L N AA, lOOmg/L Kanamyc in, 500mg/L Timentin, 0.4%寒天添加 MS培地 ) で 2週間、 選択培地 2 (0.2mg/L BAP, 0. lmg/L NAA, lOOmg/L Ka namycin, 500mg/L Timentin, 0.4%寒天添加 MS培地） で 2週間、 選 択培地 3 (100mg/L Kanamycin, 500mg/L Timentin, 0.4%寒天添加 MS培地） で 3週間連続して培養した。 その間に形成されたシュー ト は直径 5mm以上に成長したところで、 周りの組織を削り取り、 選択 培地 4 ( 150mg/L Kanamycin, 500mg/L Timentin, 0.4%寒天添加 MS 培地） に移し、 さ らに 2 — 3週間培養後、 発根培地 （100mg/L Kana mycin, 500mg/L Timentin, 0.4%寒天添加 MS培地） に移し発根シュ 一卜を得た （表 10) 。
表 9. インパチエンスのシュー ト数
Figure imgf000034_0001
以上のように、 バラやカーネーショ ン以外の花卉植物、 例えばべ チュニァ、 トレニァ、 タバコ、 バーべナ、 二一レン、 イ ンパチェン ス、 ベゴニァなどにもァグロバクテリゥムを用いて外来遺伝子を導 入することが出来ることがわかった。 導入する外来遺伝子としては
、 ここで挙げている具体的な遺伝子に限らず、 導入後に L 1細胞で 機能する遺伝子であれば、 いずれの遺伝子であっても同様の方法に てこれら花卉植物に導入することができると考えられる。 本発明の 技術はァグロパクテリゥムを用いて外来遺伝子を導入することがで きる花卉植物に適応可能であることから、 これらの植物についても 、 本発明の花卉植物、 すなわち、 導入遺伝子が形質転換体植物の一 部の細胞にのみ存在し、 他の細胞には存在しない花卉植物を作出す ることが可能である。 産業上の利用可能性
本発明によって開示された方法によって作出される形質転換体植 物は生殖細胞等を含む L2細胞層には導入遺伝子を有さず、 L 1層の細 胞にのみ導入遺伝子を有するキメラ植物である。 このような形質転 換体は生殖細胞に導入遺伝子を有さないため、 権限なき第三者によ り、 当該遺伝子組換え植物が自由に交配親として利用される可能性 を阻止することができる。
また、 遺伝子組換え植物に関しては、 自然界への導入遺伝子の拡 散が懸念されるところ、 このような生殖細胞に導入遺伝子を持たな い遺伝子組換え植物を作出することで、 導入遺伝子拡散の可能性が 完全に否定されることとなる。 よって、 遺伝子組換え植物を産業上 利用しょうとする者にとつては遺伝子組換え植物の商業利用のため の承認申請 （日本国内においては、 「遺伝子組換え生物等の使用等 の規制による生物の多様性の確保に関する法律 （カルタヘナ法） 」 に基づく生物多様性影響評価など） に係る負担を軽減することとな る。

Claims

1 . 外来遺伝子を一部の細胞に含み、 他の細胞には含まない花卉 植物。
2 . 前記一部の細胞が一部の細胞層を構成している、 請求項 1 に 記載の花卉植物。
請
3 . 前記他の細胞が、 花粉の細胞又は胚珠の細胞である、 請求項 1又は 2 に記載の花卉植物。 .
の
4 . 前記他の細胞が、 L 2層を構成する細胞である、 請求項 1又は 2 に記載の花卉植物。 範
5 . 前記一部の細胞層が、 L 1層であるか、 または L 1層と L 3層であ る、 請求項 2又は 3 に記載の花卉植物。
6 . 花卉植物が、 ァグロパクテリゥムを介して外来遺伝子を導入 可能な花卉植物である請求項 1ないし 5記載の花卉植物。
7 . 花卉植物が、 バラ、 カーネーショ ン、 ペチュニア、 ト レニァ 、 タバコ、 バーべナ、 二一レンベルギア、 キク、 ユリ、 アサガオ、 金魚草、 シクラメン、 ラン、 トルコギキヨウ、 フリージア、 ガーべ ラ、 グラジオラス、 カスミソゥ、 カランコェ、 ペラルゴ二ゥム、 ゼ ラニゥム、 チューリ ップ、 ナタネ、 ポテト、 トマ ト、 ポプラ、 パナ ナ、 ユーカ リ、 サツマィモ、 タイズ、 アルフアルファ、 ルーピン、 カ リ フラワーのいずれかである請求項 6記載のの花卉植物。
8 . 前記外来遺伝子が、 導入後に L 1層の細胞で機熊する遺伝子で ある請求項 1ないし 7いずれか 1項に記載の花卉植物。
9 . 前記外来遺伝子が花色に関する遺伝子である、 請求項 8に記 載の花卉植物。
10. 前記外来遺伝子が、 フラボノイ ドの合成に係る遺伝子である 請求項 9に記載の花卉植物。
1 1. 前記外来遺伝子が、 スミ レ科植物由来のフラポノイ ド 3 '， 5 ' 一水酸化酵素遺伝子、 ゴマノハダサ科植物由来の芳香族ァシル基転 移酵素遺伝子、 サルビア由来のフラボノィ ド 3 ' 、 5 ' -水酸化酵素 遺伝子 c DNA、 ペチュニアのジヒ ドロフラボノール 4-還元酵素の染 色遺伝子、 カーネーショ ン由来のアン トシァニジン合成酵素遺伝子 の一ないし複数の遺伝子である請求項 10に花卉植物。
12. 前記外来遺伝子が選択マーカーの遺伝子、 または転写因子を コ一 ドする遺伝子である請求項 8に記載の花卉植物。
13. 花卉植物がバラである請求項 7記載の花卉植物。
14. 前記バラが、 Ro s a hyb r i d aである、 請求項 13に記載の花卉植 物。
15. 前記バラが、 ハイブリ ッ ドティ一、 フロリバンダ又はミニバ ラである 14に記載の花卉植物。
16. 前記外来遺伝子が花色に関する遺伝子である、 請求項 13ない し 15のいずれか 1項に記載の花卉植物。
17. 前記外来遺伝子が、 フラボノイ ドの合成に係る遺伝子である 請求項 16のいずれか 1項に記載の花卉植物。
18. 前記外来遺伝子が、 スミ レ科植物由来のフラポノイ ド 3 '， 5 ' 一水酸化酵素遺伝子、 ゴマノハグサ科植物由来の芳香族ァシル基転 移酵素遺伝子のいずれか一方、 またはその両方である、 請求項 17記 載の花卉植物。
19. 前記スミ レ科植物がスミ レ科パンジーである、 請求項 18に記 載の花卉植物。
20. 前記ゴマノハグサ科植物がゴマノハグサ科トレニァである、 請求項 18記載の花卉植物。
2 1. 遺伝子導入前のバラと比べて花色が青色方向に変化している 、 請求項 13ないし 20のいずれか 1項に記載の花卉植物。
22. 花卉植物がカーネーショ ンである請求項 7記載の花卉植物。
23. 前記カーネーショ ンが、 スプレータイプまたはスタンダード タイプである請求項 22に記載の花卉植物。
24. 前記外来遺伝子が花色に関する遺伝子である、 請求項 22また は 23に記載の花卉植物。
25. 前記外来遺伝子が、 フラボノイ ドの合成に係る酵素の遺伝子 である請求項 24に記載の花卉植物。
26. 前記外来遺伝子が、 サルビア由来のフラボノィ ド 3 ' 、 5 ' - 水酸化酵素遺伝子 c DNA、 ペチュニアのジヒ ドロフラポノール 4-還 元酵素の染色遺伝子、 カーネーショ ン由来のアントシァニジン合成 酵素遺伝子の一ないし複数の遺伝子である、 請求項 25に記載の花卉 植物。
27. 遺伝子導入前の力一ネーショ ンと比べて花色が青色方向に変 化している、 請求項 22ないし 26のいずれか 1項に記載の花卉植物。
28. 請求項 1〜 27のいずれか 1項に記載の花卉植物と同じ性質を 有するそれらの組織、 及びこれらの栄養増殖体。
29. 請求項 1〜27のいずれか 1項に記載の花卉植物の製造方法に おいて、 外来遺伝子をァグロパクテリゥムを介して植物に導入し、 そして当該外来遺伝子が一部の細胞にのみ存在する植物を選択する 工程を含む方法。
30. 請求項 3〜27のいずれかに 1項に記載の、 生殖細胞に外来遺 伝子をもたない花卉植物を作出することにより 自然界への導入遺伝 子の拡散を防止する方法。
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