CN103635483B - 用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于选择性抑制重组蛋白在转基因植物的雄性生殖组织中的表达的方法和组合物。本发明还提供了用于在转基因植物中诱导雄性不育性的方法和组合物。包括所述组合物的植物、植物细胞、植物部分、种子和商品是本发明的方面。

Description

用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月1日提交的美国临时专利申请61／504,102的优先权益，所述申请以引用的方式全部并入本文。
序列表的并入
名称为“MONS294WO.txt”的文件中含有的序列表通过电子方式提交来与本文一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表是41千字节(在中测量的大小)并且创建于2012年6月29日。
发明领域
本发明总体上涉及农业、植物育种以及分子生物学领域。更具体来说，本发明涉及用于选择性抑制转基因植物的雄性生殖组织中的重组蛋白表达的方法和组合物以及其使用。
发明背景
杂交种子，即通过近缘植物的杂交或异花受精而产生的种子，可以生长成拥有其任一亲本植物无法拥有的所需性状的组合的子代杂交植物。杂交植物可以显示出优越的农艺特征，包括植物大小、产量、营养组成、抗病性、除草剂耐受性、应激耐受性、气候适应性以及其它所需性状的改进。杂交种子的有效产生要求植物自身的花粉不允许使所述植物自花受精。
在杂交种子的产生中，可以防止花粉在雌性亲本植物中产生和／或散落，以便促进雌性亲本植物的异花授粉，而非自花授粉。所述防止可以通过例如人工去除含有花粉的结构(例如，在玉米中人工或机械去雄)、使用授粉控制的遗传手段(例如，细胞质雄性不育、核雄性不育)和／或使用化学试剂来实现。
发明概述
本发明总体上涉及在转基因植物的雄性生殖组织中选择性抑制重组蛋白表达的方法、在所述方法中有用的重组DNA构建体，以及含有所述重组DNA构建体的转基因植物、细胞以及种子。重组DNA构建体和含有所述构建体的转基因植物、细胞以及种子提供了一种使用除草剂来在转基因植物中诱导雄性不育性以用于产生杂交种子的极大改进的方法。
一方面，本发明提供一种重组DNA构建体，所述构建体包括对重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列和操作地连接至所述蛋白质编码序列的雄性组织特异性siRNA(mts-siRNA)元件。在一个实施方案中，mts-siRNA元件包含在蛋白质编码序列的3’非翻译区内。在另一个实施方案中，mts-siRNA元件位于蛋白质编码序列与为3’非翻译区的一部分的多腺苷酸化序列之间。在另一个实施方案中，mts-siRNA元件包括至少一个mts-siRNA序列。在另一个实施方案中，mts-siRNA元件包括选自由SEQ ID NO：1-56和105-149组成的组的至少一个mts-siRNA序列。在另一个实施方案中，mts-siRNA元件选自由SEQ ID NO：57-94和96-104组成的组。在另一个实施方案中，重组蛋白在转基因植物中的表达将至少植物性除草剂耐受性赋予所述植物。在另一个实施方案中，重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。
本发明的另一方面提供一种制造重组DNA构建体的方法，所述方法包括：鉴别包括至少一个mts-siRNA序列的mts-siRNA元件并且将所述mts-siRNA元件操作地连接至蛋白质编码序列，例如对重组蛋白进行编码的DNA序列。在一个实施方案中，mts-siRNA元件包括选自由SEQ ID NO：1-56和105-149组成的组的至少一个mts-siRNA序列，或者是选自由SEQ IDNO：57-94和96-104组成的组的至少一个mts-siRNA元件。在另一个实施方案中，mts-siRNA元件是雄穗特异性的。
在另一方面，本发明提供一种包含本发明的重组DNA构建体的转基因植物以及所述转基因植物的种子、细胞或一部分。在一个实施方案中，植物是单子叶植物。在另一个实施方案中，植物是玉蜀黍(玉米(Zea mays))植物。
在另一方面，本发明还提供了一种通过在转基因植物中表达重组DNA构建体来选择性抑制重组蛋白在转基因植物的雄性生殖组织中的表达的方法，所述构建体包括操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列的蛋白质编码序列。在一个实施方案中，mts-siRNA元件包括至少一个mts-siRNA序列。在另一个实施方案中，雄性生殖组织是玉蜀黍植物的雄穗。在另一个实施方案中，mts-siRNA元件包括选自由SEQ ID NO：1-56和105-149组成的组的至少一个mts-siRNA序列。在另一个实施方案中，mts-siRNA元件是选自由SEQ ID NO：57-94和96-104组成的组的至少一个元件。在另一个实施方案中，重组蛋白在转基因植物中的表达将至少植物性除草剂耐受性赋予所述植物。在另一个实施方案中，重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。
本发明还提供了一种在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，所述方法包括将除草剂施加至转基因植物的步骤，所述转基因植物在其基因组中具有重组DNA构建体，所述构建体包括操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列的蛋白质编码序列，所述蛋白质编码序列将至少植物性除草剂耐受性赋予所述转基因植物，其中在转基因植物的雄性生殖组织的发育过程中施加除草剂，从而在转基因植物中诱导雄性不育性。在一个实施方案中，转基因植物是玉蜀黍植物。在另一个实施方案中，除草剂施加防止了经过处理的转基因植物中的至少花粉散落或花药挤压。在另一个实施方案中，施加除草剂期间的雄性生殖组织的发育阶段是选自由以下各项组成的组的阶段：玉蜀黍植物发育的V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段。在另一个实施方案中，除草剂选自由以下组成的组：乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂、乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂、光系统II(PSII)抑制剂、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抑制剂、谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂以及合成生长素。在另一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。
本发明还提供了一种产生杂交种子的方法，所述方法包括将有效量的除草剂施加至转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述构建体包括蛋白质编码序列，所述蛋白质编码序列操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列，其中在转基因植物的雄性生殖组织的发育过程中施加除草剂，从而诱导转基因植物的雄性不育性；用来自第二种植物的花粉使转基因植物受精；以及从转基因植物收获杂交种子。在一个实施方案中，转基因植物是玉蜀黍。有效量的除草剂是足以使包含本发明的重组DNA构建体的转基因植物雄性不育的除草剂的剂量(有效剂量)。在另一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。在另一个实施方案中，在发育过程中按每英亩约0.125磅酸当量至每英亩约8磅酸当量的有效剂量施加草甘膦。在以下详细描述中公开了本发明的其它具体实施方案。贯穿本说明书和权利要求，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”及其变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解成暗示包括所陈述的整数、元件或步骤或整数组、元件组或步骤组，但不排除任何其它整数、元件或步骤或整数组、元件组或步骤组。
附图简述
图1描绘了如实施例1中所述的mts-siRNA元件(SEQ ID NO：85)上的mts-siRNA序列的图谱。X轴从左至右表示mts-siRNA元件的定向，其中上部链表示在图的上半部分，而下部链表示在图的下半部分；上部从左至右且下部从右至左示出了从5’至3’定向的核苷酸位置。mts-siRNA序列以其相对对准位置示出。Y轴表示在雄穗组织中表达的mts-siRNA的作为转录物／四分之一百万序列(tpq)的相对丰度。在库中着重表示的mts-siRNA是以圆形圈出。
图2描绘了如实施例2中所述的，用于测量雄穗特异性sRNA表达的RNA印迹分析。
图3描绘了如实施例2和实施例8中所述的mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87)上的mts-siRNA序列的图谱。X轴从左至右表示mts-siRNA元件的定向，其中上部链表示在图的上半部分，并且下部链表示在图的下半部分；上部从左至右并且下部从右至左示出了从5’至3’定向的核苷酸位置。mts-siRNA序列以其相对对准位置示出。指出了用于设计三种特定探针(sR648011(SEQ ID NO：8)、sR1372590(SEQ ID NO：26)以及sR410590(SEQ ID NO：33))的三个mts-siRNA序列。
图4描绘了如实施例2中所述的，使用来自不同自交种质的RNA来进行mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87)的雄穗成熟度时序表达的RNA印迹分析。
图5描绘了如实施例2中所述的，使用mts-siRNA序列(sR648011，SEQ ID NO：8)的反义(左图)或有义(右图)探针，siRNA表达在成熟花药中的原位定位。
图6描绘了如在实施例4中所述的，来自对构建体3(图6A)或构建体4(图6B)来说是转基因的未经过喷雾的植物的花药中的CP4-EPSPS蛋白定位。构建体3转基因玉蜀黍植物含有CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒。构建体4植物是对照。
图7描绘了如实施例7中所述的，从含有CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒的构建体产生的转基因玉蜀黍植物，所述转基因玉蜀黍植物对草甘膦具有植物性耐受性并且随着在晚期施加草甘膦而诱导出雄性不育性。图7A示出了喷雾有草甘膦以及未喷雾的转基因玉蜀黍植物。图7B示出了来自未经过喷雾的转基因植物的雄穗，且图7C示出了来自未经过喷雾的转基因植物的花粉颗粒。图7D示出了来自经过喷雾的转基因植物的雄穗，且图7E示出了来自经过喷雾的转基因植物的花粉颗粒。
图8描绘了晚期草甘膦喷雾之后测量雄能育性等级(MFR)的一年田间试验的数据。图8A示出了如在实施例5中所述的，在三种不同草甘膦喷雾处理方案(Trt1、Trt2以及Trt3)下针对NK603(CP4-EPSPS转基因玉蜀黍)、MON87427(具有草甘膦可诱导的雄性不育性的CP4-EPSPS转基因玉蜀黍)以及来自构建体3的两个品系的平均MFR；虚线指示了雄性不育性的行业标准MFR2。图8B描绘了来自用仅杂草喷雾处理进行处理的植物的雄穗。图8C描绘了来自用晚期草甘膦喷雾处理进行处理以用于诱导雄性不育性的植物的雄穗。
图9描绘了如在实施例5中所述的，测量每小块土地具有雄性不育性的植物数量的田间试验结果，雄性不育性是在两种不同的草甘膦喷雾处理方案(Trt2和Trt3)下通过花药挤压贯穿S90、在S90+3以及S90+6针对NK603(CP4-EPSPS转基因玉蜀黍)、MON87427(具有草甘膦可诱导的雄性不育性的CP4-EPSPS转基因玉蜀黍)以及来自构建体3的四个品系进行测量的。
图10描绘了如在实施例5中所述的花粉活力研究的结果。图10A和图10B示出了来自经过不育性喷雾的构建体3品系的雄穗中晚期破裂的花药挤压的一个实例。图10A中的框是图10B中放大的部分。晚期破裂的花药挤压的实例在图10B中以圆形圈出。来自经过喷雾的构建体3品系的经过不育性喷雾的晚期破裂的挤压的花药的花粉的亚历山大染色法(Alexander staining)仅示出了无活力的花粉(透射光蓝色，不规则形状的花粉颗粒)(图10C)。来自未经过喷雾的构建体3的花药的花粉是完全有活力的并且在亚历山大染色法下呈现不透明、深紫色且球形(图10D)。
图11描绘了如在实施例6中所述的，测试NK603植物和构建体3品系的自交谷粒产量和雄性能育性的田间试验结果。自交产量测量为蒲式耳／英亩(Bu／英亩)并且所诱导的雄性不育性测量为雄性能育性等级(MFR)。水平线条指示了雄性不育性的行业标准MFR2。Trt1、Trt2以及Trt3指处理方案1、2以及3。
图12描绘了测试非转基因雌性自交(无效)种、系MON87427以及均处于相同遗传背景中的来自构建体3的三个品系的田间试验的结果，所述三个品系与雄性MON810／MON88017测试物进行异花授粉以产生F1杂交种子。杂交谷粒产量被测量为蒲式耳／英亩(Bu／acre)。Trt1、Trt2以及Trt3指处理方案1、2以及3。
图13描绘了如实施例7中所述的，来自F1杂交植物的花粉颗粒分析。图示出了来自以下三种不同F1杂交种的花粉的亚历山大染色结果：非转基因雌性×MON88017雄性；MON87427雌性×MON88017雄性；以及构建体3品系雌性×MON88017雄性。使用MON88017花粉来使雄穗能育性在由构建体3品系植物产生的F1杂交种中功能恢复。
图14描绘了重组DNA构建体(从左至右在5’至3’方向上示出)的实施方案的示意图，所述构建体包括(上部)操作地连接至包括mts-siRNA元件(例如选自由SEQ ID NO：57-94和96-104组成的组的一个或多个)的DNA序列的蛋白质编码序列(例如编码草甘膦抗性EPSPS的DNA)(上部)。在一个非限制性特定实施方案中(下部)，重组DNA构建体包括按顺序操作地连接至内含子、转运肽、通过SEQ ID NO：95编码的CP4-EPSPS、mts-siRNA元件(SEQID NO：81)以及3’UTR的启动子。
发明详述
重组DNA构建体
本发明提供了用于选择性抑制转基因植物的雄性生殖组织中的重组蛋白表达的组合物和方法以及其用途。一方面，本发明提供了一种重组DNA构建体，其包括蛋白质编码序列，所述蛋白质编码序列操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列，即，包括对重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列和操作地连接至蛋白质编码序列的至少一个mts-siRNA元件的嵌合转基因。在一个实施方案中，所述重组DNA构建体可用于选择性抑制重组蛋白在转基因植物的雄性生殖组织中的表达。一方面，本发明提供了一种包含所述重组DNA构建体的重组DNA分子和其使用方法。按照规定，核酸序列可以作为DNA或作为RNA来提供；如本领域普通技术人员所已知，公开一种核酸序列必然定义了另一种核酸序列。此外，如本领域普通技术人员所已知，公开一种给定的核酸序列必然定义了所述序列的精确补体。
“雄性组织特异性siRNA”或“mts-siRNA”是植物(即具有雄性组织特异性表达图谱的植物)的一个或多个雄性生殖组织(例如雄花序)中富集或特异性表达的约18至约26个核苷酸(例如18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸)的小RNA(sRNA)。雄性组织特异性siRNA在植物中是天然发生的并且可以使用本领域中已知的技术如低分子量RNA印迹分析来检测。与mts-siRNA互补的DNA序列在本文中称为“mts-siRNA序列”。内源性植物mts-siRNA的mts-siRNA序列的实例作为SEQ ID NO：1-56和105-149来提供。在一个实施方案中，mts-siRNA序列是给定mts-siRNA的精确DNA补体(不具有错配)。在其它实施方案中，与给定mts-siRNA相比较，mts-siRNA序列通过1至3个核苷酸错配而改变，但仍具有足够的互补性来(例如)在典型的生理条件下结合所述mts-siRNA或与其杂交。“互补性”指一个多核苷酸链上的核苷酸与另一个多核苷酸链上的核苷酸根据标准沃森-克里克互补性规则(Watson-Crick complementarity rule)进行碱基配对的能力(即，鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G：C)，并且腺嘌呤与胸腺嘧啶(A：T)或尿嘧啶(A：U)配对)；有可能在单一多核苷酸的两个或更多个互补区域之间发生链内杂交。在包括在本文所述的重组DNA构建体中时，mts-siRNA能够对基因和／或蛋白质的表达进行RNAi介导的抑制或使所述表达破坏。
至少一个、至少两个、至少三个或三个以上mts-siRNA序列可以在单一DNA分子中簇集在一起在或甚至重叠。所述DNA分子在本文中称为“雄性组织特异性siRNA元件”或“mts-siRNA元件”并且定义为在约500个核苷酸序列的窗中中包括至少一个、至少两个、至少三个或三个以上mts-siRNA序列。mts-siRNA元件可以为任何长度，如约20个核苷酸(nt)、约25个nt、约30个nt、约40个nt、约50个nt、约60个nt、约70个nt、约80个nt、约100个nt、约150个nt、约200个nt、约250个nt、约300个nt、约350个nt、约400个nt、约450个nt、约500个nt、约550个nt或约600个nt。
本发明的重组DNA构建体是包括至少一个蛋白质编码序列的DNA分子，所述蛋白质编码序列操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列。术语“重组”指通过基因工程人为制造的分子或细胞或有机体，并且因而是人类活动的产物，而且在自然界中不会以其它方式正常发生。如本文所使用，重组DNA构建体是包括两个或更多个异源DNA序列的重组DNA分子。术语“异源”指源自不同来源(例如，源自基因组中的不同位置或源自不同种类)的两个或更多个核酸或蛋白质序列之间的关系。在一个实例中，如果启动子不是蛋白质编码DNA序列的天然启动子，那么启动子和蛋白质编码DNA序列相对于彼此是异源的。在另一个实例中，如果在自然界中未正常发现如操作地连接至除草剂耐受性基因的植物mts-siRNA元件(如CP4-EPSPS)的这种组合，那么蛋白质编码序列相对于mts-siRNA元件是异源的。此外，特定序列相对于引入其的细胞或有机体可以是“异源的”(即序列在所述特定细胞或有机体中不会天然发生)。
术语“操作地连接”指两个多核苷酸分子以使得一个多核苷酸分子可以影响另一个多核苷酸分子的表达的方式连接。例如，第一多核苷酸分子与第二多核苷酸分子操作地连接，其中所述多核苷酸分子被安排成使得第一多核苷酸分子可以影响第二多核苷酸分子的表达。所述两个多核苷酸分子可以是单一连续多核苷酸分子的一部分并且可以是邻近的或分开的。例如，如果在雄性生殖组织细胞中转录之后，mts-siRNA元件的存在导致抑制细胞中的重组蛋白表达，那么mts-siRNA元件操作地连接至蛋白质编码序列。例如可以通过将与蛋白质编码序列邻近的mts-siRNA元件(如位于蛋白质编码序列的5’或3’，但不必是连续的连接)并入到重组DNA构建体的非翻译区(UTR)中或其邻近处(如位于5’UTR或3’UTR，或者紧靠5’UTR或3’UTR)，和／或并入在蛋白质编码序列之后和多聚腺苷酸化信号之前来实现蛋白质编码序列与mts-siRNA元件的可操作连接。在一个实施方案中，一个或多个mts-siRNA元件位于蛋白质编码序列与多腺苷酸化序列之间，即，蛋白质编码序列的3’和其邻近处。在另一个实施方案中，一个或多个mts-siRNA元件位于蛋白质编码序列的终止密码子与多腺苷酸化序列之间。在另一个实施方案中，一个或多个mts-siRNA元件位于与蛋白质编码序列邻近的3’UTR序列内。
mts-siRNA元件的DNA序列可以通过使用单个mts-siRNA序列的不同组合和位置和／或通过将1至3个核苷酸错配并入到mts-siRNA元件中(相对于给定mts-siRNA序列)来改变。mts-siRNA元件的实例在本文中作为SEQ ID NO：57-94和96-104来提供并且提供在工作实施例中。mts-siRNA元件可以在任一方向上(即不定向的)发挥作用，并且因此可以在重组DNA构建体中按5’至3’定向或3’至5’定向来使用。
Mts-siRNA元件、mts-siRNA序列以及mts-siRNA可以通过本领域技术人员已知的方法例如通过植物sRNA和cDNA库的生物信息学分析来鉴别。下文实施例中提供了所述鉴别方法的一个实例。具体来说，可以从sRNA库中鉴别mts-siRNA和mts-siRNA序列。可以将所鉴别的mts-siRNA序列与cDNA和／或基因组序列集合相比较以鉴别mts-siRNA元件(即在500个核苷酸序列窗中包括至少一个、至少两个、至少三个或三个以上mts-siRNA序列的DNA区域)，所述元件可用于产生如本文所述的重组DNA构建体。
在一些实施方案中，合成或体外修饰这些mts-siRNA元件以含有更多、更少或不同的mts-siRNA序列和／或重新安排一个或多个mts-siRNA序列的相对位置，其中所述修饰有益于增加或减少mts-siRNA元件的作用。用于合成或体外修饰mts-siRNA元件和确定用于所需抑制水平的最优变异性的方法是本领域技术人员已知的。嵌合mts-siRNA元件还可以使用本领域技术人员已知的方法如通过将另外的所需mts-siRNA序列在内部插入到mts-siRNA元件中或通过将另外的mts-siRNA序列5’或3’连接至mts-siRNA元件来设计。嵌合mts-siRNA元件的非限制性实施方案包括具有以下各项的mts-siRNA元件：SEQ ID NO：86的约80个nt、约100个nt、约150个nt、约200个nt、约250个nt或约300个nt；SEQ ID NO：87的约80个nt、约100个nt、约150个nt、约200个nt、约250个nt或约300个nt；和／或SEQ ID NO：85的约80个nt、约100个nt、约150个nt、约200个nt、约250个nt、约300个nt、约350个nt、约400个nt、约450个nt、约500个nt或约550个nt。工作实施例中提供了另外的实施方案。
重组DNA构建体可以用于选择性抑制重组蛋白在表达构建体的转基因植物的雄性生殖组织中的表达，即，导致在至少营养组织中，但不在雄性生殖组织中表达。如本文所使用，“重组蛋白的表达”指重组蛋白由细胞中的蛋白质编码序列和所得转录物(mRNA)的产生。如本文所使用，术语“抑制”意指减少；例如，抑制重组蛋白的表达意指(例如)通过RNAi介导的转录后基因抑制来减少细胞中产生的重组蛋白的水平。
如本文所使用，重组蛋白的选择性抑制指与参考细胞或组织相比较，使细胞或组织中重组蛋白的产生减少至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。参考细胞或`织可以为(例如)来自表达重组蛋白的相同或相似转基因植物的营养细胞或组织，或者(例如)来自具有用于表达重组蛋白的相似的转基因、但缺少mts-siRNA元件的转基因植物的营养细胞或组织。蛋白质表达的抑制可以使用本领域技术人员已知的任何技术如通过使用如ELISA或蛋白质印迹分析的技术直接测量细胞或组织样品中的蛋白质累积，通过测量蛋白质的酶活性，或通过表型地确定蛋白质表达来确定。在一个实施方案中，重组蛋白的选择性抑制指在转基因植物的雄性组织中的、能够赋予除草剂耐受性的重组蛋白的表达的充分减少，从而在转基因植物中产生雄性能育性改变的可检测的表型，除草剂作为不育喷雾剂施加至所述转基因植物。在所述转基因植物中雄性能育性改变的检测将因此指示重组蛋白的选择性抑制。
如本文所使用，术语“蛋白质编码序列”指具有对多肽或蛋白质序列进行编码的核苷酸序列的多核苷酸分子，即，对重组蛋白进行编码的多核苷酸序列。取决于条件，在细胞中核苷酸序列实际上可能或可能不翻译成多肽分子。蛋白质编码序列的边界一般由5′末端处的翻译起始密码子和3′末端处的翻译终止密码子划定。本发明的蛋白质编码序列包括但不限于提供与植物形态学、生理学、生长与发育、产量、营养强化、疾病或虫害抗性、除草剂耐受性或环境耐受性或化学耐受性相关联的所需特征的蛋白质编码序列。在一个实施方案中，本发明的蛋白质编码序列对重组蛋白进行编码，当在转基因植物中表达时，所述重组蛋白至少在存在经过表达的蛋白质的细胞和／或组织中赋予除草剂耐受性选择性抑制转基因植物的雄性生殖组织中的除草剂耐受性蛋白，结合适时施加除草剂导致了至少减少的雄性能育性或导致雄性不育性。所述可诱导的雄性不育性与植物性除草剂耐受性相组合可以用于提高产生杂交种子的效率，例如通过消除或减少杂交种子产生过程中将给定杂交种中用作雌性的玉蜀黍植物物理地去雄的需要。例如美国专利号6,762,344和美国专利公开2011／0126310中已经描述了除草剂可诱导的雄性不育性系统。用于实践本发明的除草剂的实例包括但不限予乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂(例如fops和dims)、乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂(例如磺酰脲(SU)和咪唑啉酮(IMI))、光系统II(PSII)抑制剂(例如三嗪和苯基醚)、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂(例如丙炔氟草胺(flumioxazsin)和氟黄胺草醚)、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂(例如异噁唑草酮和三酮如甲基磺草酮(mesotrione))、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抑制剂(例如草甘膦)、谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂(例如草丁膦(glufosinate)和草铵膦(phosphinothricin))、合成生长素(例如2,4-D和麦草畏)。用于实践本发明的蛋白质编码序列和／或重组蛋白的实例包括但不限于编码将耐受性赋予HPPD抑制剂的重组蛋白(如对除草剂不敏感的HPPD)的基因、编码将耐受性赋予草丁膦重组蛋白(如pat和bar)的基因、编码将耐受性赋予草甘膦的重组蛋白(如称为CP4-EPSPS的草甘膦耐受性EPSPS，本文作为SEQ ID NO：95来提供)的基因，以及编码将耐受性赋予麦草畏的重组蛋白(如麦草畏单加氧酶(DMO))的基因。
本发明的重组DNA构建体通过本领域中已知的技术来制造并且在各个实施方案中包含在在植物转化载体、质粒或质体DNA内。所述重组DNA构建体可用于产生转基因植物和／或细胞，并且因此也可以含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的基因组DNA内。因此，本发明包括其中重组DNA构建体位于植物转化载体内，或用于转化植物细胞的生物弹道颗粒上，或转基因植物细胞的染色体或质体内，或转基因细胞、转基因植物组织、转基因植物种子、转基因花粉颗粒或转基因或部分转基因的(例如接枝的)植物内的实施方案。载体是可以用于植物转化(即将DNA引入到细胞)目的的任何DNA分子。本发明的重组DNA构建体可以(例如)插入到植物转化载体中并且用于植物转化以产生转基因植物、种子以及细胞。用于构建植物转化载体的方法在本领域中是熟知的。本发明的植物转化载体总体上包括但不限于用于表达操作地连接的DNA的合适的启动子、操作地连接的重组DNA构建体以及多聚腺苷酸化信号(可能包含在3’UTR序列内)。可用于实践本发明的启动子包括在植物中起作用用于表达操作地连接的多核苷酸的那些启动子。所述启动子是不同的并且在本领域中是熟知的，并且包括为诱导型、病毒型、合成型、组成型、时序调控型、空间调控型和／或时空调控型的那些启动子。另外任选的组分包括但不限于以下元件中的一个或多个：5’UTR、增强子、顺式作用元件、内含子、信号序列、转运肽序列和一个或多个可选的标记基因。在一个实施方案中，植物转化载体包含重组DNA构建体。
本发明的重组DNA构建体和植物转化载体通过适于预期应用的任何方法来制造，其中将(例如)所需表达的类型、所需蛋白质编码序列(并且因此除草剂耐受性)以及在有待表达重组DNA构建体的植物中的使用便利性考虑在内。适用于操纵用于制造和使用重组DNA构建体和植物转化载体的DNA分子的一般方法在本领域中是熟知的并且(例如)在包括Sambrook和Russell，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第三版)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY，2001的手册和实验指南中进行了详细描述。例如，为了增加DNA操纵(如限制性酶识别位点或基于重组的克隆位点)的便利性，或为了包括植物优选的序列(如植物密码子使用或Kozak共有序列)或包括对重组DNA构建体设计(如间隔子或连接子序列)有用的序列，可以通过本领域中已知的方法来完全或部分地修饰本发明的重组DNA构建体。在某些实施方案中，重组DNA构建体的DNA序列包括已针对有待表达重组DNA构建体的植物进行密码子优化的DNA序列。例如，植物中有待表达的重组DNA构建体可以通过本领域中已知的方法来使其序列的全部或部分进行密码子优化以用于在植物中进行表达。例如可以通过表达或抑制其它基因来使本发明的重组DNA构建体堆叠有其它重组DNA以用于赋予另外的性状(例如，在转化植物的情况下，包括除草剂抗性、虫害抗性、冷发芽耐受性、缺水耐受性的性状)。
转基因植物细胞和转基因植物
本发明的一方面包括转基因植物细胞、转基因植物组织以及转基因植物或种子，其包括本发明的重组DNA构建体。本发明的另一面包括人工或重组植物染色体，所述人工或重组植物染色体包括本发明的重组DNA构建体。用于转化宿主植物细胞以用于本发明的适合的方法实际上包括可以将DNA引入到细胞(例如，其中将重组DNA构建体稳定整合到植物染色体中)中的任何方法并且在本领域中是熟知的。用于将重组DNA构建体引入到植物的一个示例性的且广泛使用的方法是本领域技术人员熟知的土壤杆菌(Agrobacterium)转化系统。转基因植物可以通过植物细胞培养方法从转化的植物细胞再生。相对于转基因来说是纯合的转基因植物可以通过使独立分离的转基因植物与其本身有性交配(自花授粉)来获得，所述独立分离的转基因植物含有单一外源基因序列，例如F0植物，以便产生F1种子。所产生的F1种子的四分之一相对于所述转基因来说将是纯合的。通常，可以使用允许杂合子与纯合子之间的差异的SNP测定或热扩增测定(即接合性测定)来测试由发芽的F1种子生长成的植物的杂合性。
本发明提供在其基因组中具有本发明的重组DNA构建体的转基因植物，所述转基因植物尤其包括但不限于紫花苜蓿、棉花、玉蜀黍、芸苔、水稻、大豆、小麦。本发明还提供了所述转基因植物的转基因植物细胞、植物部分以及子代。如本文所使用，“子代”包括任何植物、种子、植物细胞和／或从植物、种子、植物细胞产生或再生的植物部分和／或植物部分，其包含本发明的重组DNA构建体。由所述植物产生的转基因植物、细胞、部分以及种子针对本发明的重组DNA构建体可以为纯合或杂合的。
本发明进一步包括其中重组DNA构建体处于由本发明的转基因植物、种子或植物部分生产的商品中的实施方案；所述商品包括但不限于植物的收获部分、植物的压碎的或完整的谷粒或种子、或包含本发明的重组DNA构建体的任何食物或非食物产品。
在转基因植物中诱导雄性不育性的方法和产生杂交种子的方法
本发明的另一方面包括一种在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，所述方法包括将有效量的除草剂施加至包含重组DNA构建体的转基因植物，所述构建体包括对将除草剂耐受性赋予转基因植物的重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列，所述蛋白质编码序列操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列，所述蛋白质编码序列将至少植物性除草剂耐受性赋予转基因植物，其中在转基因植物的雄性生殖组织的发育过程中进行除草剂施加，从而在转基因植物中诱导雄性不育性。
在一个实施方案中，转基因植物是玉蜀黍植物。在一个实施方案中，除草剂施加防止了至少花粉散落或花药挤压。在一个实施方案中，雄性生殖组织的发育是选自由以下各项组成的组的阶段玉蜀黍植物发育的V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段。
在一个实施方案中，除草剂选自由以下组成的组：乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂、乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂、光系统II(PSII)抑制剂、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抑制剂、谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂以及合成生长素。在一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。
本发明的另一方面包括一种产生杂交种子的方法，所述方法包括：(a)将除草剂施加至包含重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包括对将除草剂耐受性赋予转基因植物的重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列，所述蛋白质编码序列操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列，其中在转基因植物的雄性生殖组织的发育过程中进行除草剂施加，从而在转基因植物中诱导雄性不育性；(b)用来自第二种植物的花粉使转基因植物受精；以及(c)从转基因植物收获杂交种子。在一个实施方案中，转基因植物是玉蜀黍。在一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。在一个实施方案中，在发育过程中按每英亩约0.125磅酸当量至每英亩约8磅酸当量的有效剂量施加草甘膦。
本发明的另一方面包括从已经用来自第二种植物的花粉受精的雄性不育转基因植物收获的杂交种子，其中雄性不育转基因植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括对将除草剂耐受性赋予转基因植物的重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列，所述蛋白质编码序列操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列，并且其中在转基因植物的雄性生殖组织的发育过程中，已通过施加有效量的除草剂将转基因植物诱导成雄性不育。在一个实施方案中，杂交种子是杂交转基因玉蜀黍种子。在一个实施方案中，除草剂是草甘膦，并且重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。在一个实施方案中，在发育过程中按每英亩约0.125磅酸当量至每英亩约8磅酸当量的有效剂量施加草甘膦。在一个实施方案中，除草剂施加防止了至少花粉散落或花药挤压。在一个实施方案中，雄性生殖组织的发育是选自由以下各项组成的组的阶段：玉蜀黍植物发育的V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段。
实施例
实施例1
此实施例描述了mts-siRNA和mts-siRNA元件的鉴别。对来自多个玉蜀黍小RNA库的测序数据的生物信息学分析鉴别出在玉蜀黍雄穗中富集的或特异性表达的一组小RNA(sRNA)。玉蜀黍雄穗中这些mts-siRNA的相对丰度的范围是约50至631个转录物／四分之一百万序列，所述相对丰度是标准化的丰度。这些sRNA因为它们的长度(18至26个核苷酸)和它们来自dsRNA前体的可能来源而被鉴别为siRNA。雄性组织特异性siRNA因其表达模式而称为“mts-siRNA”。如本文所使用，“表达模式”是差异DNA、RNA或蛋白质表达的任何模式。例如，雄穗特异性表达模式指雄穗组织和／或细胞中DNA、RNA或蛋白质的特异性或富集的表达。本文称为“mts-siRNA序列”的mts-siRNA的对应DNA序列的实例作为SEQ ID NO：1-56和105-149来提供。
然后，将这些mts-siRNA序列与cDNA序列集合进行比较。使用BLAST进行mts-siRNA相对于玉蜀黍单一基因集合(编译的cDNA序列)的序列比较产生了令人意外的结果在若干近缘但独特的cDNA序列中发现的DNA区域内，大量mts-siRNA簇集在一起并且甚至重叠。这组cDNA序列都含有所述区域，但是所述区域的DNA序列因单个mts-siRNA序列的不同组合和定位和／或与单个mts-siRNA序列的1至3个核苷酸错配而发生变化。定义为在核苷酸序列窗中具有至少一个mts-siRNA序列的所述区域在本文中称为“mts-siRNA元件”。在不同实施方案中，核苷酸序列窗包括至少约20个连续的核苷酸(nt)(例如，至少18、19、20、21、22、23或24个nt)、至少约25个nt、至少约30个nt、至少约40个nt、至少约50个nt、至少约100个nt、或至少约150个nt。mts-siRNA元件的DNA序列的实例在本文中作为SEQ ID NO：57-94和96-104来提供。在给定的核苷酸序列窗中，mts-siRNA元件可以具有一个以上mts-siRNA序列，例如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或五个以上mts-siRNA序列。给定mts-siRNA元件内的两个或更多个mts-siRNA序列可能重叠，因为它们的核苷酸序列的至少一部分是相同的(参见表5的具有重叠的核苷酸序列的mts-siRNA的实例)。
生物信息学分析指示多个mts-siRNA可以由相同的RNA转录物产生，所述相同的RNA转录物例如由上文中被描述为包括mts-siRNA元件的cDNA序列中的一个产生的转录物。当与来自整个近缘cDNA序列组的mts-siRNA元件相比较时，还发现许多mts-siRNA具有1至3个错配。认为这指示了这些mts-siRNA由多个近缘转录物产生，从而产生了大且近缘的mts-siRNA组。因此，由包括mts-siRNA元件(含有多个mts-siRNA序列)的cDNA产生的RNA转录物将与多个mts-siRNA和／或它们的补体互补，并且因此能够与其补体杂交。因此，天然发生的mts-siRNA具有为mts-siRNA序列的完美或近乎完美的补体的RNA序列(例如，其中mts-siRNA具有相对于mts-siRNA序列具有不超过约1至3个错配的RNA序列)引申开来，相同的mts-siRNA具有为mts-siRNA元件的节段的完美或近乎完美的补体的RNA序列。
使用BLAST进行mts-siRNA相对于玉蜀黍基因组DNA数据库的序列相似性搜索鉴别出与mts-siRNA元件具有显著相似性的多个基因座。然后分析这些基因座的开放读码框(ORF)，但未发现所鉴别的推测的多肽与任何已知蛋白质具有显著的同源性。产生mts-siRNA的cDNA序列的生物信息学分析指示了在核苷酸水平上，与任何已知的植物基因都没有显著的序列同源性。这些数据表明mts-siRNA可以通过加工极性相反的转录物之间形成的dsRNA或通过加工来自因依赖RNA的RNA聚合酶活性而异常的转录物的dsRNA来从所述基因座中产生。mts-siRNA也有可能从内部二级dsRNA结构加工，所述内部二级dsRNA结构可以在一些产生mts-siRNA的转录物中形成。
mts-siRNA的逆转录提供了定位到mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87)中的一个上的mts-siRNA序列。这呈现在图1中，其中X轴表示上部从左至右并且下部从右至左从5’至3’定向的核苷酸位置。mts-siRNA的相对丰度作为绘制在Y轴上的转录物／四分之一百万序列(tpq)给出。如从图1中可以看出，在雄穗特异性sRNA库(Y轴)中着重表示了数个mts-siRNA(以圆形圈出)。预测的mts-siRNA序列也不均匀地分布在mts-siRNA元件(X轴)上。
实施例2
此实施例说明了mts-siRNA的内源性雄穗表达分析。使用数种不同的方法来分析mts-siRNA的天然在植物中的表达模式。这些分析确认了在横贯玉蜀黍种质内的雄穗中富集了和／或特异性表达了与mts-siRNA元件杂交的sRNA(即雄穗中富集了和／或特异性表达了mts-siRNA)，并且在一个实施方案中，在花粉发育的单核小孢子阶段，花粉颗粒中富集了和／或特异性表达了mts-siRNA。
为了证实mts-siRNA在植物中的雄穗特异性累积，将使用三个代表性mts-siRNA序列(SEQ ID NO：26(1372590)、SEQ ID NO：8(648011)、SEQ ID NO：33(410590))来设计探针以用于由玉蜀黍或水稻制备的sRNA的低分子量(LMW)RNA印迹分析。对于这些实验，使用试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从植物组织中提取总RNA。在95℃下使每个样品的RNA(7.5μg)变性5分钟，之后在0.5×TBE缓冲液中在含有7M脲的17％PAGE凝胶上进行分离(Allen等(2004)Nature Genetics36：1282-1290)。电泳之后，根据制造商协议使用SD半干电泳转移槽(Bio-Rad，Hercules，CA)将凝胶转印到膜(Whatman-Schleicher & Schuell，Florham Park，NJ)上。所得印迹在1800(Stratagene，Cedar Creek，TX)中在1200微焦耳／cm2×100下进行交联。为了制备探针，RNA探针模板通过PCR产生并且在一端含有T7启动子且在相对端含有小RNA序列中的一个。并入到RNA探针模板中的sRNA序列包括：[1]Gma-miR159a(miRBase.org登录号MI0001773)，其用作装载的对照；[2]sR1372590(SEQ ID NO：26)；[3]sR648011(SEQ ID NO：8)；以及[4]sR410590(SEQ ID NO：33)。根据制造商协议使用T7RNA聚合酶转录RNA探针并且使用DIG Northem Starter试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)用地高辛配基(DIG)进行标记。在38℃下用100ngDIG标记的探针在PerfectHybTM杂交缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)中执行杂交16小时。在暴露于BiomaxTM XAR薄膜(Sigma，St.Louis，MO)之前，根据制造商协议用DIG Northem Starter试剂盒执行检测。测试的样品包括所有以下各项或其子集：在氮胁迫下生长的植物的玉蜀黍叶子；在冷胁迫下生长的植物的玉蜀黍嫩芽、根或胚乳；在干旱胁迫下生长的植物的玉蜀黍叶子和根；玉蜀黍的须；玉蜀黍的幼嫩雄穗；玉蜀黍的成熟雄穗；未受精的玉蜀黍籽粒；玉蜀黍胚芽-受精后24天(DAP)；玉蜀黍籽粒-22DAP；成熟的玉蜀黍籽粒；玉蜀黍胚芽-成熟(干)籽粒；玉蜀黍胚乳-干；稻粒；以及稻秧。使用至少三种不同mts-siRNA探针(sR1372590、sR648011以及sR410590)，LMw RNA印迹分析获得的结果显示信号仅存在于与幼嫩雄穗对应的泳道和成熟雄穗泳道内，确认了生物信息学分析和以下结论：mts-siRNA表达高度富集在雄穗组织中或对雄穗组织来说是特异性的。
使用LMw RNA印迹分析横跨大范围玉蜀黍种质评价识别mts-siRNA元件的sRNA的组织特异性与累积。针对此分析，选择了mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87，其含有多个mts-siRNA序列)。此mts-siRNA元件包括用来设计siRNA探针sR1372590、sR648011以及sR410590的三个mts-siRNA序列，从而允许这些探针用于玉蜀黍种质样品的LMw RNA印迹分析。针对这些实验，由具有不同遗传背景(例如具有83至120的相对成熟度等级(表1))的二十种不同玉蜀黍自交系制备RNA。针对这些自交系中的三种(91DUA6、01DKD2、以及LH244)，从幼嫩雄穗、老熟雄穗、叶子、穗以及根部收集组织。表1提供了幼嫩雄穗和老熟雄穗收集时的对应的V阶段和雄穗大小。使用溶液提取总RNA。用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(目录号AM1560，Ambion，Austin，TX)分离LMW RNA。使用Bio-Rad CriterionTM预制15％TBE-脲丙烯酰胺凝胶(目录号345-0092，BioRad，Hercules，CA)进行LMw RNA印迹分析。将凝胶转印到带正电荷的膜(目录号11209272，Roche Applied Systems，Mannheim，Germany)上。用以下标记探针：(1)32-P随机引物法，或(2)DIG DNA(使用Roche PCR标记试剂盒)，或(3)如上文所述的DIG RNA探针。用于探测RNA印迹的所有探针都是mts-siRNA元件的内源转录物或cDNA序列的反向补体。与转基因mts-siRNA元件杂交的sRNA的存在对雄穗来说是特异性的；针对叶子、穗或根，没有检测到三种自交玉蜀黍基因型91DUA6、01DKD2以及LH244中任一型的信号(图2)。
为了确定能识别mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87)的sRNA的雄穗发育过程中的时序表达模式，进行LMW RNA印迹分析。由来自不同玉蜀黍自交系的幼嫩雄穗和老熟雄穗制备RNA，参见表1。RNA制备和LMW RNA印迹技术基本上如上文所述。
表1：自交种质、成熟度等级以及雄穗发育阶段
如在图4中可见，与mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87)的反向补体对应的DIG标记的RNA探针与幼嫩雄穗和老熟雄穗中的sRNA杂交，除了长度为2.5英寸至3英寸的幼嫩雄穗：泳道5(自交DIDA404)、9(自交JEDO115)、10(自交FIDA240)、16(自交DIDA403)、17(自交64DJD1)、18(自交DIQ423)以及20(自交LH244)。另外，此实验确认没有检测到sRNA与来自自交BIQA208和LH244的叶子(泳道21和22)或穗(泳道23和24)的样品的mts-siRNA元件杂交。总的来说，这些数据指示了在雄穗大于约3.5英寸时，与mts-siRNA元件杂交的sRNA特异性地表达在来自所测试的每个自交基因型的雄穗中。
进行原位杂交分析来研究mts-siRNA序列(sR648011，SEQ ID NO：8)的细胞特异性表达。在玉蜀黍花药中，小孢子通过减数分裂产生并且发育成成熟花粉。玉蜀黍小孢子发生(microsporegenesis)可以粗略分成以下阶段：造孢细胞的减数分裂、四分体作为自由小孢子的释放、产生三核花粉的单核小孢子的减数分裂以及成熟的花粉颗粒。针对这些实验，使用了在开花期之前从温室中标准条件下生长的玉蜀黍植物获得的玉蜀黍雄穗。锁核酸(LNA)探针(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)如下文所指示使用，其中LNA的位置由‘+’符号指示。反义探针被设计成检测sR648011(SEQ ID NO：8)(5’-生物素-CAT+GCA+CTG+GTG+AGT+CAC+TGT-3’)的mts-siRNA，而有义探针是反义探针(5’-生物素-ACA+GTG+ACT+CAC+CAG+TGC+ATG-3’)的反向补体，用作阴性对照。LNA探针允许高严谨性洗涤并且因此确保了高度特异性的杂交(Válóczi等，2006；Nuovo等，2009)。所有的探针都用生物素标记。在4℃下将玉蜀黍雄穗的样品在含4％甲醛的1×PBS中固定36小时，并且然后在4℃下通过分级的乙醇：H2O系列脱水。然后将所述雄穗在75％EtOH和25％脱蜡剂(Histoclear)(National Diagnostics，Atlanta，GA)中放置1.5小时，在50％EtOH和50％脱蜡剂中放置1.5小时，在25％EtOH和75％脱蜡剂中放置1.5小时并且在100％脱蜡剂中放置3×1.5小时，全部处于25℃下。接着，在50℃下用熔化的高纯石蜡(paraplast)逐渐替换脱蜡剂，并且将雄穗转移到模具上并储存在4℃下，之后进行切片。在切片机上将石蜡包埋的雄穗切成8μm厚。一系列的切片由相同的花药制成，并且邻近的切片然后用于分别用有义探针或反义探针进行探测。在42℃下进行预杂交和杂交并且在55℃下洗涤。与转录物退火的生物素标记的LNA探针的检测是用1至400倍稀释的抗生物素-碱性磷酸酯酶(AP)和BM紫色AP底物(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)。图像从奥林巴斯(0lympus)显微镜(CenterValley，PA)上的照相机捕获。来自相同花药的切片被分成两组，一组用于反义探针(图5，左图)，且另一组用于有义探针(图5，右图)。仅在与反义探针杂交的切片上检测到杂交信号(深紫色)，而在用有义探针孵育的那些切片上并未检测到杂交信号(图5)。用反义探针获得的强信号指示了在花粉发育的单核小孢子阶段，花粉颗粒中富含(高度表达)此mts-siRNA。
实施例3
此实施例说明了植物转化构建体和转基因植物的产生。将mts-siRNA元件并入到转基因表达盒的3’UTR中并且用于产生转基因玉蜀黍植物，以测试所述元件对转基因植物中转基因表达的影响。将mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87)插入到CP4-EPSPS转基因表达盒的3’UTR中以用于玉蜀黍转化。选择了此mts-siRNA元件，因为它内部具有丰富的mts-siRNA序列(图3)，包括用于实施例2中LMWRNA印迹分析的三个siRNA探针(sR1372590、sR648011以及sR410590)的序列。此mts-siRNA元件还允许测试mts-siRNA错配的影响。与一个潜在mts-siRNA序列(SEQ ID NO：33，用于设计探针sR410590)相比较，此处测试的mts-siRNA元件(SEQ ID NO：87)具有一个核苷酸变化(CAT：AAGCTATTGATTCCCTAAGTGCCA)。mts-siRNA元件按相对于其在内源cDNA中的位置成反向补体定向插入到转基因盒中，但认为所述元件在两种定向上均相似地起作用，因为可以在玉蜀黍雄穗中找到与siRNA元件中任一链互补的雄穗特异性siRNA分子(图1和图3)。
构建数种CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒(表2)并且用于转化玉蜀黍植物。在CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒中测试了表达元件的不同组合。转基因的有效且稳定表达所需的表达元件如启动子、引导子、内含子、叶绿体转运肽以及3’UTR在本领域中是熟知的。CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒被设计成包括两个独立的启动子中的一个；操作地连接至两个独立的引导子中的一个的DNA；操作地连接至两个内含子中一个的DNA；操作地连接至对同一叶绿体转运肽(CTP)进行编码的两个DNA分子中的一个；操作地连接至源自土壤杆菌种菌株CP4的aroA基因并且对CP4-EPSPS蛋白进行编码的DNA分子；操作地连接至对mts-siRNA元件进行编码的DNA；操作地连接至两个3’UTR DNA分子中的一个。构建体4含有野生型CP4-EPSPS基因并且所有其它载体含有植物密码子优化形式的CP4-EPSPS基因。构建体3、5以及6(表2)被设计成确定并入到3’-UTR中的siRNA元件是否会产生对草甘膦具有雄穗特异性敏感性和植物性草甘膦耐受性的植物。缺少mts-siRNA元件的构建体4和7是对照构建体。
表2：植物转化构建体
构建体 启动子 引导子 内含子 CTP 转基因 mts-siRNA 3’UTR
3 A A A A CP4 SEQ ID NO：87 A
4 A A A A CP4 ** A
5 B B B B CP4 SEQ ID NO：87 A
6 B B B B CP4 SEQ ID NO：87 B
7 B B B B CP4 ** A
使用熟知的方法来产生用五个表达盒中的每一个转化的转基因玉蜀黍植物。简单来说，用表2中所列出的构建体中的每一个使玉蜀黍细胞通过土壤杆菌介导的转化来转化并且将所述玉蜀黍细胞再生为完好的玉蜀黍植物。从示出转基因表达盒的完整性和对草甘膦的抗性的植物群体中选出单株植物。选择具有正常表型特征的生根植物并且将其转移到土壤中用于生长和进一步的评价。将R0植物转移到土壤中用于生长，在V3至V4用0.751b／英亩草甘膦喷雾，之后在V7至V9用0.751b／英亩草甘膦喷雾，并且然后用来自相同种质的非转基因玉蜀黍植物的花粉异花授粉(针对构建体3、5以及6品系)或自花授粉(针对构建体4和7品系)以产生R1种子。然后，通过包括TaqMan、PCR分析的分析技术、对除草剂喷雾的植物性耐受性以及除草剂(草甘膦)喷雾之后的减少的(所需的)雄性能育性等级的组合来选择植物。
实施例4
此实施例说明了分析温室中转基因植物的方法。分析用CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒转化的转基因植物的植物性草甘膦耐受性和雄性能育性。发现由含有CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒的构建体产生的转基因植物具有对草甘膦的植物性耐受性和用晚期草甘膦施加诱导的雄性不育性。
使R0植物在温室中以两个重复生长，并且不喷雾，或在(早期)V6阶段用0.751b／英亩草甘膦喷雾，之后在(晚期)V9阶段用0.751b／英亩草甘膦喷雾(图7和表3)。测试的R0品系是多拷贝品系。所有未经过喷雾的R0植物具有正常的花药挤压和如由亚历山大染色法确定的全育花粉。所有经过喷雾的R0植物具有对草甘膦的植物性耐受性。由不含mts-siRNA元件的构建体4和7产生的R0植物未示出雄穗对草甘膦的敏感性或诱导的雄性不育性。由确实含有mts-siRNA元件的构建体3、5以及6产生的R0植物示出了雄穗对草甘膦的敏感性和诱导的雄性不育性；这些植物不具有或具有非常少的花药挤压并且如由亚历山大染色法所确定，大于>99％的花粉是无活力的。
表3：草甘膦喷雾数据
这些观察结果证实了mts-siRNA元件在转基因盒的3’UTR中的存在引起了转基因的雄穗特异性转基因沉默。由CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒产生的mRNA转录物的雄穗特异性丧失产生了对草甘膦敏感的雄穗，从而产生了具有诱导的雄性不育性的植物，而所述植物的其它组织具有草甘膦耐受性，从而产生了植物性草甘膦耐受性和良好的雌性能育性。
然后使用免疫定位来测量转基因植物组织中的CP4-EPSPS蛋白。雄穗从用构建体3或构建体4转化的植物和非转基因玉蜀黍(LH198)获得。使植物在温室中生长，其中在80°F下光照14小时，并且在70°F下的黑暗中8小时。每盆种植一粒种子。所述盆随机地安排在温室地板上。按需对植物浇水并且分别用氮、钾以及磷的20-20-20混合物对所述植物施肥。在V2阶段，按0.751b／英亩用草甘膦对来自构建体3或构建体4的植物喷雾以确认对草甘膦的植物性耐受性。在V10至V11收获幼嫩雄穗的处于小孢子母细胞和游离小孢子阶段的花药组织；在T7阶段，即花粉散落前1至2天收获成熟雄穗的具有完全发育的花粉的花药组织。使用解剖镊子从雄穗小穗中去除花药并且立即在柔和真空下固定在含3.7％的甲醛的磷酸缓冲盐水溶液(PBS)中。在PBS中洗涤过后，将组织放置在包埋介质中并且立即冷冻。将冷冻的组织块储存在-80℃下，直至在-20℃切片机上切片并收集到电化载玻片上。
用阻断剂(含10％正常山羊血清，5％牛血清白蛋白，0.1％曲通X-100的PBS)阻断组织切片2小时。用抗CP4-EPSPS抗体(在PBS中1／500)孵育切片。在PBS中将切片洗涤三次之后，用二级抗体，缀合有Alexa荧光团488的山羊抗小鼠IgG(Invitrogen，Eugene，Oregon)孵育组织切片。对于阴性对照，省略了CP4-EPSPS抗体孵育。作为阳性对照，α-微管蛋白的抗体(Sigma，St.Louis，MO)(在大多数细胞类型中表达的细胞骨架蛋白)取代了独立切片上的CP4-EPSPS抗体。一级抗体与二级抗体都在室温下孵育2至4小时并且然后在4℃下进一步孵育过夜。洗涤之后，用蔡司激光扫描显微镜(Zeiss Laser Scanning Microscope)(LSM)510META共聚焦显微镜，使用488nm的激光用于激发和500至550nm用于发射滤光片组使组织成像。在包括对照的样品中应用了相同的成像参数。从每个切片都扫描到了荧光且亮视野的图像，并且随后使用LSM软件将所述图像合并以示出结构信息。用抗CP4-EPSPS抗体在细丝组织(图6A，短箭头)和成熟雄穗中的花粉(图6A，长箭头)中获得了强信号，所述成熟雄穗来自用缺少mts-siRNA元件的构建体4(图6A)产生的植物。图6A中的植物对于转基因盒来说是半合的，所以仅约50％的花粉示出了阳性CP4-EPSPS信号。相比之下，用抗CP4-EPSPS抗体仅在细丝组织(图6B，短箭头)中获得了强信号，并且来自用含有mts-siRNA元件的构建体3(图6B)产生的植物的成熟雄穗中的花粉(图6B，长箭头)中未看到信号。阳性对照抗体(抗α-微管蛋白)在来自由构建体4或构建体3产生的植物的成熟雄穗内的花粉中示出了信号。阴性对照的数据示出了预期的信号缺失。常规非转基因对照的数据根据用抗CP4-EPSPS抗体染色示出了预期的信号缺失并且用抗α-微管蛋白抗体染色示出了阳性信号。这些数据指示了花粉中从含有mts-siRNA元件的转化盒没有翻译或翻译了非常少的转录物，但在植物性细丝组织中翻译了转录物。花粉中CP4-EPSPS蛋白表达的缺失与由构建体3产生的植物中所观察到的雄穗特异性草甘膦敏感性有关。
实施例5
此实施例说明了测试雄性能育性或不育性的转基因植物田间试验。在田间试验中，针对表达盒的功效测试了通过用CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒(构建体3)转化而产生的十三个已确认的单拷贝R1至R3转基因植物品系。在第一年中，在一个田间位置中测试了十三个品系。在第二年中，在四个田间位置中测试八个品系。在第三年中，在四个田间位置中测试四个品系。在三年田间试验期间，由构建体3产生的品系的平均雄性能育性等级(MFR)接近或低于MFR2，MFR2被认为是雄性不育性的行业标准。
图8中呈现了一年功效田间试验的的数据，其中在三种不同草甘膦喷雾处理方案下产生的，NK603(CP4-EPSPS转基因玉蜀黍)、MON87427(具有草甘膦可诱导的雄性不育性的CP4-EPSPS转基因玉蜀黍)以及来自构建体3的两个品系的平均MFR呈现在图表(图8A)中。来自在此特定功效田间试验期间生长的植物的雄穗的照片说明了当仅在V3按0.751b／英亩对植物喷雾草甘膦时雄穗能育(图8B)；以及在V3按0.751b／英亩喷雾了草甘膦，接着在V8按0.751b／英亩喷雾，之后在V10按0.751b／英亩喷雾的植物上的雄穗不育(没有或最少的花药挤压)(图8C)。对于此田间试验来说，喷雾方案为：处理1由在V30.751b／英亩的草甘膦(杂草控制)组成；处理2由在V30.751b／英亩的草甘膦(杂草控制)，接着在V80.751b／英亩，之后在V100.751b／英亩组成；处理3由在V30.751b／英亩的草甘膦(杂草控制)，接着在V81.251b／英亩，之后在V101.251b／英亩组成。后两次喷雾(即V8和V10)被称为不育性喷雾。这些结果指示了用仅杂草控制草甘膦喷雾处理1，所有植物(NK603、MON87427以及构建体3品系)均是雄性能育的。用草甘膦不育性喷雾处理2，NK603植物具有MFR=5，MON87427具有MFR=2是不育的，并且构建体3的品系2和3具有MFR<3是部分雄性能育的。用草甘膦不育性喷雾处理3，NK603植物具有MFR=5，MON87427具有MFR<2是雄性不育的，并且构建体3的品系2和3具有接近或低于2分值的MFR是雄性不育的。
虽然平均MFR接近或为分值2，但在S90+3和S90+6在经过草甘膦处理的构建体3品系中观察到了花药挤压(图9)。对于这些数据，对于两种草甘膦喷雾方案，将四种独立的构建体3品系与MON87427和NK603植物相比较，所述方案为：处理2由在V2／V31.51b／英亩草甘膦(杂草控制)，接着在生长度单位(GDU)875(约V8)0.751b／英亩草甘膦，之后在GDU1025(约V10)0.751b／英亩草甘膦组成；并且处理3由在V2／V31.51b／英亩草甘膦(杂草控制)，接着在GDU875(约V8)1.251b／英亩草甘膦，之后在GDU1025(约V10)1.251b／英亩草甘膦组成。在S90、S90+3以及S90+6评定了每小块土地(68至74株植物／小块土地)的示出花药挤压的植物的数量，其中S90是当田间90％植物抽丝的天数；S90+3是S90之后3天；并且S90+6是S90之后6天。如在图9中可见，在S90，对于两种草甘膦处理方案，每小块土地有70(±15)NK603植物示出花药挤压。相比之下，对于MON87427和四个构建体3品系来说，在S90，对于两种草甘膦处理方案，每小块土地有1(±12)植物示出花药挤压。在S90+3和S90+6，用任一种草甘膦处理方案，对于四个构建体3品系来说，每小块土地有30(±12)至70(±12)的植物示出花药挤压，这接近对于NK603所观察的值。MON87427品系的花药挤压对于S90+3和S90+6时间点并且对于每一种草甘膦处理方案保持在S90水平。具有≥1的挤压的花药的任何植物都被评定为对花药挤压是阳性的。这种晚期花药挤压(即S90+3和S90+6)在玉蜀黍发育过程中的某一时刻发生，此时存在雄穗的最大生长高度并且存在足够距离以允许机器伴随对玉蜀黍植物的顶部两片叶子的最小损伤、因此对自交产量影响最小的情况下切割雄穗。而且，在S90+3或之后的花药挤压被认为对种子纯度几乎不具有影响。
进行花粉活力的分析以确定在S90+3至S90+6观察到的低水平但一致的花药挤压是否是潜在的晚期破坏的雄性能育性的指示。图10A和图10B图解了来自经过不育性喷雾的构建体3品系的雄穗中晚期破裂的花药挤压的实例。图10A中的框是图10B中放大的部分。晚期破裂的花药挤压的一个实例在图10B中以圆形圈出。为了确定花粉活力，从晚期破裂的挤压的花药采集花粉并且用亚历山大染色法染色，图10C。在同一天还从未经过喷雾的构建体3品系采集了花粉并且用亚历山大染色法染色以作为比较，图10D。此亚历山大染色法的结果仅示出了来自经过喷雾的构建体3品系的晚期破裂的花药的无活力的花粉(透射光蓝色，不规则形状的花粉颗粒)(图10C)。完全有活力的花粉在亚历山大染色法下呈现不透明、深紫色且球形(图10D)。除了对从单独分离的晚期破裂的挤压的花药收集的花粉进行染色，还将授粉袋放置在一些经过喷雾的构建体3品系上以确定花粉散落。花粉没有明显散落到这些授粉袋中，所以在用于与受体穗进行异花授粉时未能产生任何种子。此结果表明了没有花粉从晚期挤压花药中散落或散落的任何花粉都是无活力的。
总的来说，这些数据指示了尽管从经过不育性喷雾的构建体3品系存在低水平花药挤压，但这些挤压的花药并未散落有活力的花粉。
实施例6
此实施例说明了测试产量的转基因植物田间试验。测试了构建体3R2植物的自交产量和杂交产量。针对自交产量，在四个田间位置中测试了构建体3R2植物的产量，对草甘膦喷雾的植物性耐受性以及草甘膦喷雾下的雄性不育性。对于这些田间试验，在小块土地中按68至74株植物／小块土地种植了来自构建体3的四个品系。喷雾处理为：处理1由在V31.51b／英亩的草甘膦(杂草控制)组成；处理2由在V31.51b／英亩的草甘膦，接着在V80.751b／英亩，之后在V110.751b／英亩组成；处理3由在V31.51b／英亩的草甘膦，接着在V81.251b／英亩，之后在V111.251b／英亩组成。如在图11中可见，在所有三种草甘膦处理方案下，构建体3品系均示出了如通过植物高度测量的良好的植物性耐受性(白色条)和按蒲式耳(Bu)／英亩测量的良好的自交产量(黑色条)。在用仅杂草控制草甘膦处理方案(处理1)进行处理时，这些相同的品系是完全雄性能育的，但在用草甘膦处理方案2或3处理时，具有等于或小于2的MFR分值是雄性不育的(灰色条)。图11上的水平线条指示了不育的行业标准MFR2。NK603被提供用于比较。表4中提供了草甘膦喷雾下构建体3品系和NK603的自交谷粒产量的测量结果，其中MST=谷粒的水分％，TWT=测试重量(密度等级，通常是磅／蒲式耳)，并且S50D是小块土地中穗抽丝50％时的天数。与NK603对照相比较，用草甘膦处理2或3测试的四个构建体3品系中的任一个的产量没有测量到显著的差异(nd)。
表4：自交谷粒产量测量结果
针对F1杂交谷粒产量，在四个田间位置中测试了构建体3R3品系。对于这些杂交产量田间试验来说，非转基因雌性自交(无效)种、系MON87427以及均处于相同遗传背景中的来自构建体3的三个品系与雄性MON810／MON88017测试物进行异花授粉以产生F1杂交种子。在标准小块土地中按68至74株植物／小块土地种植从这些杂交种中的每一个产生的F1杂交种子。喷雾处理由以下各项组成：处理1：不进行草甘膦喷雾；处理2：在V42.251b／英亩草甘膦，之后在V72.251b／英亩；处理3：在V42.251b／英亩草甘膦，接着在V72.251b／英亩，之后在V102.251b／英亩。对F1植物进行开放授粉以产生F2谷粒，产量是按蒲式耳／英亩(Bu／英亩)测量的。所有三个构建体3品系示出了在所有草甘膦处理方案下，当与无效×MON810／MON88017和MON87427×MON810／MON88017的对照杂交种相比较时，相等的F1杂交谷粒产量(图12)。
实施例7
此实施例说明了F1杂交植物的雄性能育性恢复。测试了从作为雌性亲本的构建体3品系的杂交种产生的F1杂交植物的雄性能育性。三个不同F1杂交种设置如下：非转基因雌性×MON88017雄性；MON87427雌性×MON88017雄性；以及构建体3品系雌性×MON88017雄性。从三个杂交种的每一个收获F1杂交种子，种植在田间，并且在V4按1.1251b／英亩用草甘膦喷雾，之后在V10按1.1251b／英亩用草甘膦喷雾。通过雄性能育性等级(MFR)和花粉的亚历山大活力染色法来评价F1的雄性能育性。对于每一个杂交种来说，F1杂交植物的MFR是5或全育的。亚历山大活力染色法示出了正如所预期的，由所述杂交种中的每一个的F1杂交产生的50％的花粉是有活力的(图13)。这些数据指示了雄性能育可以在F1杂交植物中得到功能性恢复，所述杂交植物是从用CP4-EPSPS／mts-siRNA元件表达盒转化的草甘膦可诱导的雄性不育性转基因植物产生。
实施例8
此实施例说明了变体和嵌合mts-siRNA元件的构建。如图3中所呈现，将单个mts-siRNA定位到mts-siRNA元件上；X轴指示了上部从左至右和下部从右至左的5’至3’定向的核苷酸位置，并且Y轴指示了mts-siRNA的被指示为转录物／四分之一百万序列(中q)的相对丰度。mts-siRNA还不均匀地分布在mts-siRNA元件(X轴)上。
使用此信息，mts-siRNA元件的变体和／或使用一个或多个mts-siRNA元件产生的嵌合体经过工程改造以含有更多(或更少)的总mts-siRNA序列(任选地或替代地，添加或删除一个或多个mts-siRNA序列)，从而导致操作地连接的蛋白质编码序列的更多(或更少)沉默。所述变体或嵌合mts-siRNA元件可用于增加或减少重组蛋白在转基因植物的雄性生殖组织中的表达的选择性抑制。
使用SEQ ID NO：87的片段来构建mts-siRNA元件的变体和嵌合体的实例。使用来自SEQ ID NO：87的5’端的104核苷酸片段来构建第一变体(SEQ ID NO：88)。使用来自SEQID NO：87的3’半的80核苷酸片段来构建第二变体(SEQ ID NO：89)。嵌合mts-siRNA元件是通过将一个片段(SEQ ID NO：88)连接到另一个片段(SEQ ID NO：89)上以形成新的嵌合mts-siRNA元件(SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91)来构建。另外的嵌合mts-siRNA元件通过连接SEQ ID NO：87内含有的三个单独的mts-siRNA来构建；第一嵌合体(SEQ ID NO：92)通过连接mts-siRNA序列SEQ ID NO：26、27以及8来构建；第二嵌合体(SEQ ID NO：93)通过连接mts-siRNA序列SEQ ID NO：10、33以及5来构建；第三嵌合体(SEQ ID NO：94)通过连接mts-siRNA序列SEQ ID NO：26、10以及33来构建。这些变体和嵌合体可以操作地连接至蛋白质编码序列以产生重组DNA构建体(参见图14)，所述构建体可以在植物和植物细胞中针对由蛋白质编码序列编码的重组蛋白在转基因植物的雄性生殖组织中的选择性抑制来进行测试。
实施例9
此实施例说明了变体和嵌合mts-siRNA元件的设计。变体和嵌合mts-siRNA元件基于300个核苷酸(nt)长的具有SEQ ID NO：81的mts-siRNA元件来设计，所述mts-siRNA元件与具有SEQ ID NO：82和87的300个核苷酸的mts-siRNA元件相似。通过SEQ ID NO：96提供了mts-siRNA元件SEQ ID NO：81、82以及87的高度保守的共有序列。这些各自单独地还适用作mts-siRNA元件或例如通过选择从基因组序列或cDNA鉴别的mts-siRNA元件的片段(如包括至少一个mts-siRNA序列的片段)并且组合或联结所述片段而适用作设计变体或嵌合mts-siRNA元件的基础。
选择了SEQ ID NO：81内的两个片段；片段A(SEQ ID NO：97)含有来自SEQ ID NO：81的5’区域(位置1至104)的104个连续核苷酸，并且片段B(SEQ ID NO：98)含有来自SEQ IDNO：81的3’区域(位置215至294)的80个连续核苷酸；应清楚片段A(SEQ ID NO：97)或片段B(SEQ ID NO：98)单独为含有至少一个mts-siRNA序列的mts-siRNA元件。以下SEQ ID NO：81的全序列中示出了片段A和片段B的位置(由带有下划线的文本指示)，所述全序列还指示了发现定位到此mts-siRNA元件的mts-siRNA序列(由斜体文本指示；具有大于18个连续核苷酸的斜体节段可以包括一个以上重叠的mts-siRNA序列)的位置：GGACAACAAGCACCTTCTTGC CTTGCAAGGCCTCCCTTCCCTATGGTAGCCACTTGAGTGGATGACTTCACCTTAAAGCTATCGATTCCCTAAGTGCC AGACATAATAGGCTATACATTCTCTCTGGTGGCAACAATGAGTCATTTTGGTTGGTGTGGTAGTCTATTATTGAGTTTGTTTTGGCACCGTACTCCCATGGAGAGTACAAGACAAACTCTTCACCGTTGTAGTCGTTGATGGTATTGGTGGTGA CGACATCCTTGGTGTGCATGCACTGGTGAGTCACTGTIGTACTCGGCG(SEQ ID NO：81)。使用“A”和“B”片段设计了变体mts-siRNA元件，包括“A+B”mts-siRNA元件(SEQ ID NO：99)和“B+A”mts-siRNA元件(SEQ ID NO：100)。嵌合元件(SEQ ID NO：101)被设计成包括发现定位到mts-siRNA元件(SEQ ID NO：81)上的mts-mts-siRNA序列(上文在SEQ ID NO：81中示出为斜体文本)。
相似地，从玉蜀黍基因组序列(Zm_B73_CR10：：片段{75361491..75361742})鉴别的251-nt长的mts-siRNA元件(SEQ ID NO：102)和121-nt长的mts-siRNA元件(SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：102的片段，即位于SEQ ID NO：102的核苷酸位置47至167的连续片段)具有雄穗特异性并且与来自幼嫩雄穗的mts-siRNA对应(玉蜀黍LH244，库347；在一些情况下单独鉴别的mts-siRNA的大多数序列重叠并且仅数个核苷酸不同；参见表5)。基于SEQ ID NO：102和103，设计了嵌合mts-siRNA元件(SEQ ID NO：104)。
表5：定位到SEQ ID NO：103的mts-siRNA
*SEQ ID NO：103内的核苷酸位置
实施例10
此实施例说明了含有重组DNA构建体的载体和转基因植物细胞、组织以及植物，所述构建体包括对重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列和操作地连接至所述蛋白质编码序列的mts-siRNA元件。
包含重组DNA构建体的植物转化载体用于玉蜀黍细胞的土壤杆菌介导的转化。此转化载体包括用于土壤杆菌介导的T-DNA转移的DNA、表达盒(操作地连接至所关注的DNA序列的启动子)、可选择标记表达盒(用于方便地选择所转化的玉蜀黍细胞或植物)以及用于将载体维持在大肠杆菌内的DNA(例如大肠杆菌来源的复制序列)。在一个实施方案中，转化载体包括表达盒，所述表达盒包含由来自土壤杆菌的右边界序列和左边界序列侧接的重组DNA构建体，其中重组DNA构建体包括除草剂耐受性转基因CR-AGRtu.aroA-CP4.nat(提供为SEQ ID NO：95)作为对重组蛋白进行编码的DNA序列。当DNA序列对mts-siRNA元件编码时，除草剂耐受性转基因CR-AGRtu.aroA-CP4.nat操作地连接至提供为SEQ ID NO：81、作为对mts-siRNA元件编码的DNA序列的mt-siRNA。
用于表达不同重组DNA构建体的转化载体通过将包括mts-siRNA元件(例如SEQ IDNO：57-94或97-104)的多核苷酸插入到植物转化载体中来构建。将mts-siRNA元件插入到对重组蛋白进行编码的DNA序列的邻近处或插入到对重组蛋白进行编码的DNA序列的3’未翻译区域内。所述植物转化载体可用于制造可以通过施加除草剂来诱导雄性不育性的转基因植物。
用于转化植物的方法在本领域中是熟知的。例如，使可转化系的玉蜀黍植物在温室中生长并且在胚芽长度为1.5至2.0mm时收获穗。用80％乙醇使穗表面灭菌，之后进行空气干燥。将不成熟的胚胎从来自经过灭菌的穗的单个籽粒分离。在玉蜀黍细胞接种之前，使各自含有用于表达本发明的至少一个重组DNA构建体的转化载体的土壤杆菌的单个培养物在室温下生长过夜。用土壤杆菌接种不成熟的玉蜀黍胚芽细胞培养物，在室温下与土壤杆菌孵育5至20分钟，在23摄氏度下在黑暗中与土壤杆菌一起培养1至3天，转移到选择培养基上并且培养约2周以允许胚性愈伤组织发育。将胚性愈伤组织转移到含有100mg／L巴龙霉素(paromomycin)的培养基中并且以约2周时间间隔传代培养。在选择开始之后的6至8周回收转化的植物细胞的多个品系。
转基因玉蜀黍植物自由转化和选择产生的多个转基因品系中每一个的转基因植物细胞愈伤组织再生，这是通过将每个品系的转基因愈伤组织放置在培养上以开始将嫩芽和根发育成小植株，将所述小植株转移到盆栽土以在26摄氏度在生长室中进行初期生长，接着在喷雾台上生长，之后将所述小植株移植到植物将生长至成熟的盆内。使再生的植物自花受精。收获第一代(“R1”)种子。由R1种子生长出来的植物(“R2”植物)用于产生子代。
实施例11
此实施例说明了选择用于重组DNA构建体中的mts-siRNA序列和mts-siRNA元件的方法，所述构建体包括对重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列以及操作地连接至蛋白质编码序列的mts-siRNA元件。
验证mts-siRNA元件选择性抑制重组蛋白在转基因植物的雄性生殖组织中的表达的功效的一种方法包括使用原生质体测定，其中将植物细胞原生质体与以下各项共转化：(a)含有重组DNA构建体的载体，所述构建体包括蛋白质编码序列和操作地连接至蛋白质编码序列的mts-siRNA元件；以及(b)具有与一个或多个mts-siRNA元件(或替代地，一个或多个mts-siRNA序列)对应的一个或多个siRNA的序列的一个或多个RNA，其中重组蛋白的表达水平预期与一个或多个RNA裂解mts-siRNA元件的程度成反比。
这通过以下非限制性实施例来说明。所述测定在两个mts-siRNA序列(与发现在玉蜀黍雄穗中高度表达的两个siRNA对应)上进行。简单来说，将玉蜀黍叶子原生质体与以下各项共转化：(a)含有重组DNA构建体的质粒(3微克／320,000个细胞)，所述构建体含有对重组蛋白进行编码的蛋白质编码序列(CP4-EPSPS，SEQ ID NO：95)和mts-siRNA元件(SEQ IDNO：81)，以及(b)第一dsRNA，其具有第一链和第二链，所述第一链在5’至3’方向上具有序列SEQ ID NO：150，所述第二链是所述第一链的补体；和第二dsRNA，其具有第一链和第二链，所述第一链在5’至3’方向上具有序列SEQ ID NO：151，所述第二链是所述第一链的补体。在0、5、25或50纳克／320000个细胞下测试dsRNA(来自Integrated DNA Technologies公司，Coralville，Iowa)，其中用由miRNA395(作为成熟21-聚体，提供为dsRNA)或酵母tRNA组成的“填充”RNA来将每次共转化测定中使用的总RNA调节到50纳克／320000细胞。CP4-EPSPS蛋白的水平通过ELISA来确定并且用于评估所测试的dsRNA抑制重组蛋白表达的能力。表6中提供了结果。
表6：CP4-EPSPS蛋白的水平
*与对照相比，具有显著的统计学差异
当与含有重组DNA构建体的质粒共转化时，每个dsRNA(SEQ ID NO：150和151)强烈抑制CP4-EPSPS表达(通过减少的CP4-EPSPS蛋白质累积指示)，所述构建体包括CP4-EPSPS蛋白编码序列和mts-siRNA元件。观察到的CP4-EPSPS抑制对dsRNA的数量具有剂量依赖性并且与填充RNA的类型无关。取代测试dsRNA，用填充RNA共转化的对照样品中未观察到CP4-EPSPS的抑制。
实施例12
此实施例说明了本发明的重组DNA构建体、载体以及转化的植物。与实施例10中描述的那些相似的载体和转化方法用于产生在其基因组中含有重组DNA构建体的稳定转化的玉蜀黍植物，所述构建体包括操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列的蛋白质编码序列。测试了构建体设计／mts-siRNA元件的六个组合(参见表7)。用0.751b酸当量／英亩(ae／A)的对植物喷雾两遍(在V5和V8)。表7中提供了结果。针对每个构建体设计／mts-siRNA元件组合，未对约20株植物喷雾以便于与草甘膦喷雾的植物进行比较。未经过喷雾的植物全都散落花粉并且具有良好的雄性能育性(数据未示出)。用构建体设计B转化的玉蜀黍植物显示出了比用构建体设计A转化的玉蜀黍植物更为显著的雄性不育性。构建体设计(5’至3’，左至右)是：构建体A是启动子A/内含子A／转运肽A／CP4-EPSPS(SEQ ID NO：95)／mts-siRNA元件／3’UTR，并且构建体B是启动子B／内含子B／转运肽B／CP4-EPSPS／mts-siRNA元件／3’UTR。如下文所使用，“n.m.”意指未测量。雄性能育性等级(MFR)量表是：5=花药出苗正常，花粉量与未经过喷雾的小块土地的花粉量相同，但可能或可能不散落花粉；4=50％花药出苗正常，但略微散落或不散落正常数量的花粉；3=雄穗看起来正常但存在零星的花药挤压(>10花药／雄穗)并且几乎没有或没有花粉散落；2.5=没有花粉散落，开花期极大地缩短(<10花药／雄穗)或相对于抽丝结束来说非常晚(1周)；2=没有花粉散落，没有开花期或开花期相对于抽丝结束来说非常晚(1周)；以及1=没有花粉散落，雄穗具有异常的伸出表型(stick phenotype)或开花期在抽丝之后延迟两周或两周以上。S90是90％植物具有准备用于受精的丝并且S90+3是S90后三天。
表7：构建体设计／mts-siRNA元件喷雾数据
在没有不当实验的情况下，可以如上文公开内容所指示的制造和使用本文公开和要求的所有材料和方法。包括以上实施例来证实本发明的实施方案。本领域技术人员应理解实施例中公开的技术表示由本发明人发现的，在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。对本领域技术人员来说清楚的所有所述相似的替代和修改被认为处在如由随附权利要求限定的本发明的精神、范围以及理念内。

Claims (23)

1.一种重组DNA构建体，其包括操作地连接至包括mts-siRNA元件的DNA序列的蛋白质编码序列，其中所述mts-siRNA元件选自由SEQ ID NO:57-94和96-104组成的组并且包括至少一个mts-siRNA序列，其中所述mts-siRNA元件相对于所述蛋白质编码序列是异源的并且包含与内源植物mts-siRNA互补的DNA序列，由所述蛋白质编码序列编码的蛋白的表达在表达所述重组DNA构建体的转基因植物的雄性生殖组织中被抑制。
2.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述mts-siRNA序列选自由SEQ ID NO:1-56和105-149组成的组。
3.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述蛋白质编码序列在转基因植物中的表达将至少植物性除草剂耐受性赋予所述植物。
4.如权利要求3所述的重组DNA构建体，其中所述蛋白质编码序列对草甘膦耐受性EPSPS进行编码。
5.一种制造重组DNA构建体的方法，其包括鉴别包括至少一个mts-siRNA序列的mts-siRNA元件以及将所述mts-siRNA元件操作地连接至蛋白质编码序列，其中所述mts-siRNA元件选自由SEQ ID NO:57-94和96-104组成的组并且相对于所述蛋白质编码序列是异源的，其中所述mts-siRNA元件包含与内源植物mts-siRNA互补的DNA序列，由所述蛋白质编码序列编码的蛋白的表达在表达所述重组DNA构建体的转基因植物的雄性生殖组织中被抑制。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一个mts-siRNA序列是选自由SEQ ID NO:1-56和105-149组成的组的至少一个。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述mts-siRNA元件具有雄穗特异性。
8.一种选择性抑制重组蛋白在转基因植物的雄性生殖组织中的表达的方法，其包括在所述转基因植物中表达如权利要求1所述的重组DNA构建体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述雄性生殖组织是玉蜀黍植物的雄穗。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述mts-siRNA元件包括至少三个mts-siRNA序列。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述mts-siRNA元件包括选自由SEQ ID NO:1-56和105-149组成的组的至少一个mts-siRNA序列。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述重组蛋白在转基因植物中的表达将至少植物性除草剂耐受性赋予所述植物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。
14.一种在转基因植物中诱导雄性不育性的方法，其包括将有效量的除草剂施加至包含如权利要求1所述的重组DNA构建体的转基因植物，其中在所述转基因植物的雄性生殖组织的发育过程中进行所述除草剂施加，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述转基因植物是玉蜀黍植物。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述除草剂施加防止了至少花粉散落或花药挤压。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述雄性生殖组织的所述发育是选自由以下各项组成的组的阶段：玉蜀黍植物发育的V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13以及V14阶段。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述除草剂选自由以下组成的组：乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、乙酰乳酸合成酶抑制剂、光系统II抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂以及合成生长素。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述除草剂是草甘膦，并且所述重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。
20.一种产生杂交种子的方法，其包括：
a.将有效量的除草剂施加至包含如权利要求1所述的重组DNA构建体的转基因植物，其中在所述转基因植物的雄性生殖组织的发育过程中进行所述除草剂施加，从而在所述转基因植物中诱导雄性不育性；
b.用来自第二种植物的花粉使所述转基因植物受精；以及
c.从所述转基因植物收获杂交种子。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述转基因植物是玉蜀黍。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述除草剂是草甘膦，并且所述重组蛋白是草甘膦耐受性EPSPS。
23.如权利要求22所述的方法，其中在所述发育过程中按每英亩0.125磅酸当量至每英亩8磅酸当量的有效剂量来施加所述草甘膦。
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