MX2007000783A - Inhibidores de proteina angiopoietina tipo 4, combinaciones y su uso. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a composiciones de ANGPTL4 y metodos para utilizar las composiciones, y a sus agonistas y antagonistas para el diagnostico y tratamiento de enfermedades o trastornos, incluyendo los metodos para modular la proliferacion celular, adhesion celular y migracion celular.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE USO DE PROTEINA 4 DE TIPO ANGIOPOIETINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la .proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) . La invención se refiere a las composiciones y métodos para utilizar ANGPTL4 y sus agonistas y antagonistas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades o trastornos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) es parte de la familia de angiopoietinas de las proteínas secretadas. Las regiones conservadas de la familia de angiopoietinas incluyen un dominio de doble espiral y un dominio de tipo fibrinógeno (FBN) en el extremo C-terminal. Ver, por ejemplo, Kim y col., Biochem . J. 346:603-610 (2000). Otros miembros de la familia incluyen la angiopoietina 1, la angiopoietina 2 y la angiopoietina 3. La angiopoietina 1, angiopoietina 2 y angiopoietina 3/angiopoietina 4 se unen al receptor Tie2. Ver, por ejemplo, Davis y col., Cell 87, 1161-1169 (1996); Maisonpierre y col., Science 277 , 55-60 (1997); Valenzuela y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 96, 1904-1909 (1999); y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,521,073; 5,650,490; y 5,814,464. Las angiopoietinas 1 y 4 parecen ser agonistas del receptor Tie2, mientras que las REF. 179140 angiopoietinas 2 y 3 parecen ser antagonistas (y posiblemente agonistas) del receptor Tie2. Ver, por ejemplo, Folkman y D'Amore, Cell , 87:1153-1155 (1996); Suri y col., Cell , 87:1171-1180 (1996); Masionpierre y col., Science 277:55-60 (1997); y Ward y Dumont, Seminars in Cell & Developmental Biology, 13:19-27 (2002). El receptor Tie2 pertenece a la familia de los receptores tirosina cinasas específicos de las células endoteliales, que también incluye el receptor huérfano Tiel . Se observó que otro miembro de la familia, la proteina 3 de tipo angiopoietina, se une a la integrina avß3. Ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente Norteamericana 20030215451 y Camenisch y col., J. Biol . Chem . , 277 (19) :17281-17290 (2002). La ANGPTL4 se conoce con otras denominaciones. Por ejemplo, la ANGPTL4 también se conoce como proteina hepática relacionada con fibrinógeno/angiopoietina (HFARP) (Kim y col., Biochem . J. 346:603-610 (2000)), proteina PPAR? relacionada con angiopoietina (PGAR) (Yoon, y col., Mol Cell Biol . , 20:5343-5349 (2000)) y factor adiposo inducido por el ayuno (FIAF) (Kerten y col., J. Biol . Chem . , 275:28488-28493 (2000) ) . Los estudios in vitro e in vivo y las caracterizaciones de la ANGPTL4 pueden proporcionar la identificación y el descubrimiento valiosos de terapias y/o tratamientos útiles para la prevención, mejora y corrección de enfermedades y disfunciones asociadas a la actividad y/o expresión de la ANGPTL4. Por ejemplo, los estudios de cultivo de tejidos y los ratones transgénicos han demostrado ser herramientas invalorables para la disección funcional de procesos biológicos relevantes para enfermedades humanas, incluyendo inmunología, cáncer, neurobiologia, bioLogia cardiovascular, obesidad y muchos otros. Es necesario descubrir y comprender las diversas funciones biológicas de la ANGPTL4. La invención trata éstas y otras necesidades, tal como será evidente al considerar la descripción que aparece a continuación. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4). Proporciona una descripción del uso de la ANGPTL4 o de su susecuencia, o de sus agonistas o antagonistas, para tratar dolencias o enfermedades caracterizadas por una actividad o expresión anómala de la ANGPTL4 y/o que implican la actividad y/o expresión de la ANGPTL4. Se proporcionan los métodos para modular la proliferación de hepatocitos por medio de la ANGPTL4, o sus agonistas o antagonistas. En determinadas modalidades, los métodos incluyen la inducción de la proliferación de hepatocitos. Por ejemplo, un método comprende la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4 o agonista de ANGPTL4 a una población de hepatocitos o prehepatocitos, con lo que se induce la proliferación. En un aspecto, el paso de la administración comprende la administración de un ácido nucleico que codifica para la ANGPTL4. Opcionalmente, o además, puede administrarse una cantidad efectiva de un agente que induzca la producción de ANGPTL4 en un hepatocito o prehepatocito para estimular la proliferación. La ANGPTL4 o los agonistas de ANGPTL4 pueden utilizarse en el tratamiento de disfunciones, enfermedades y daños hepáticos mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4 o su agonista. En un aspecto, un ácido nucleico que codifica para la ANGPTL4 es el encargado de suministrarla. En una modalidad de la invención, un agonista de ANGPTL4 es un agonista para un receptor avßs. También se proporcionan métodos para inhibir la proliferación de hepatocitos. En ciertas modalidades, el método incluye la administración de una cantidad efectiva de una composición que contenga un antagonista de ANGPTL4 a una población de hepatocitos o prehepatocitos. En un aspecto, el antagonista de ANGPTL4 es un agente que inhibe la producción proteica • de ANGPTL4, como por ejemplo, una molécula antisentido o ribozima. En un aspecto, el antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo anti-ANGPTL4. En otro aspecto, el antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo antagonista anti-aVß5. En una modalidad, el antagonista de ANGPTL4 es una ANGPTL4-ARNSÍ. Los antagonistas de ANGPTL4 pueden utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer hepático o hipertrofia hepática no deseada mediante la administración de una cantidad efectiva del antagonista de ANGPTL4 a los hepatocitos . También se proporcionan métodos para modular la adhesión celular de los hepatocitos. En ciertas modalidades, los métodos incluyen la inducción de la adhesión celular de los hepatocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de una composición que contenga ANGPTL4 o agonista de ANGPTL4 a una población de hepatocitos o prehepatocitos. En otras modalidades, los métodos incluyen la inhibición de la adhesión celular de los hepatocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de una composición que contenga un antagonista de ANGPTL4 a una población de hepatocitos, con lo cual se inhibe la adhesión celular de los hepatocitos . Además de modular la proliferación y la adhesión celular de los hepatocitos, que integran la homeostasis de lipidos, la ANGPTL4 modula los niveles de colesterol y triglicéridos en suero y estimula la proliferación de preadipocitos, que también integran la homeostasis de lipidos . La invención proporciona métodos para modular diferentes aspectos de la homeostasis de lipidos. Por ejemplo, los métodos de la invención incluyen la estimulación de la proliferación dé preadipocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de una composición que contenga ANGPTL4 o agonista de ANGPTL4 a una población de preadipocitos, con lo cual se induce la proliferación de preadipocitos. También se proporcionan métodos para inhibir la proliferación de preadipocitos. Por ejemplo, los métodos incluyen la administración de una cantidad efectiva de una composición que contenga un antagonista de ANGPTL4 a una población de preadipocitos. También se incluyen métodos para modular la migración celular de preadipocitos. Por ejemplo, los métodos de la invención incluyen la inducción de la migración celular de preadipocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4 o de agonista de ANGPTL4 a una población de preadipocitos. También se proporcionan métodos para inhibir la migración celular de preadipocitos que incluyen, por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva de un antagonista de ANGPTL4 a una población de preadipocitos, con lo cual se inhibe la migración celular. En la invención, también se proporcionan métodos para modular los niveles de colesterol y triglicéridos en suero de un sujeto. Por ejemplo, los métodos incluyen la administración de una cantidad efectiva de una composición que contenga ANGPTL4 o agonista de ANGPTL4 o antagonista de ANGPTL4 a un sujeto, con lo cual se modulan los niveles de colesterol y/o triglicéridos en suero de un sujeto. En una modalidad, se administra ANGPTL4 o agonista de ANGPTL4, lo que produce una acumulación de triglicéridos y/o colesterol en suero de un sujeto, en comparación con un control. En otra modalidad, se le administra una cantidad efectiva de un antagonista de ANGPTL4 a un sujeto, con lo que se reduce el nivel de al menos un triglicérido, ácidos grasos libres y/o de colesterol en suero del sujeto. En determinadas modalidades de la invención, el control es el suero de un sujeto antes de iniciar el tratamiento o de un sujeto al que no se le realizó tratamiento o cuyo tratamiento se redujo, etc. Se pueden utilizar la ANGPTL4 y un modulador de ANGPTL4 (su agonista o antagonista) en el tratamiento de trastornos de homeostasis de lipidos mediante la administración de una cantidad efectiva de la molécula a un sujeto. Ver "Trastorno de .homeostasis de lipidos", en la sección definiciones de la presente. Por ejemplo, un método incluye la administración de una composición que contenga una cantidad efectiva de antagonista de ANGPTL4 a un sujeto para tratar la hiperlipidemia. También se proporcionan métodos para tratar la obesidad y/o reducir la masa corporal total de un sujeto. Por ejemplo, un método incluye la administración de una cantidad efectiva de un modulador de ANGPTL4 a un sujeto, con lo que se trata la obesidad y/o se reduce la masa corporal total del sujeto, en comparación con la ausencia de tratamiento o el tratamiento con un control . En una modalidad, se reduce la adiposidad (grasa) de un sujeto. De esta forma, también se pueden tratar las dolencias relacionadas con la obesidad, como por ejemplo, enfermedades cardiovasculares, diabetes, etc. En determinadas modalidades de la invención, las células, como por ejemplo, los hepatocitos, preadipocitos, etc., se encuentran en un sujeto. Generalmente, el sujeto es un ser humano. Una ANGPTL4 de la invención incluye una proteina de longitud completa, asi como también moléculas biológicas activas, como por ejemplo, residuos correspondientes al extremo N-terminal, dominio de doble espiral en el extremo N- terminal, extremo C-terminal, dominio de tipo fibrinógeno en el extremo C-terminal o ANGPTL4 (1-183), ANGPTL4 (23-183), ANGPTL4 (1-162 aproximadamente), ANGPTL4 -(162-406 • aproximadamente), ANGPTL4 (23-406) o ANGPTL4 (184-406) susecuencia de aminoácidos de ANGPTL4 humana y/o mANGPTL4 (1- 183), mANGPTL4 (23-183), mANGPTL4 (1-165 aproximadamente), mANGPTL4 (23-165 aproximadamente), mANGPTL4 (23-410) o mANGPTL4 (184-410) susecuencia de aminoácidos de ANGPTL4 murina. Otras subsecuencias también incluyen, entre otras, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 y 160-406 de hANGPTL4, y, por ejemplo, 40-183, 60-183, .80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 y 160-410 de mANGPTL4. Los agonistas de ANGPTL4 incluyen moléculas que activan la ANGPTL4 o producen actividades de ANGPTL4, como por ejemplo, polipéptidos activos, moléculas pequeñas y moléculas que incrementan la actividad o expresión de la ANGPTL4. Los agonistas de ANGPTL4 también incluyen agonistas de avßs- Los antagonistas de ANGPTL4 de la invención son moléculas que inhiben o reducen la actividad de la ANGPTL4. ün inhibidor de ANGPTL4 puede incluir una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido, moléculas antisentido, aptámeros de ARN, ribozimas contra la ANGPTL4 o sus polipéptidos receptores, un polipéptido, variantes antagonistas de ANGPTL4, una proteina aislada, una proteina recombinante, un anticuerpo o conjugados, o proteínas fusionadas de éstos que inhiben la actividad de ANGPTL4, ya sea directa o indirectamente. En determinadas modalidades de la invención, un anticuerpo antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo que inhibe o reduce la actividad de la ANGPTL4 al unirse a una susecuencia o región especifica de la proteina ANGPTL4, como por ejemplo, extremo N-terminal, dominio de doble espiral en el extremo N-terminal, extremo C-terminal, dominio de tipo fibrinógeno en el extremo C-terminal o ANGPTL4 (1-183), ANGPTL4 (23-183), ANGPTL4 (1- 162 aproximadamente) , ANGPTL4 (162-406 aproximadamente) , ANGPTL4 (23-406) o ANGPTL4 (184-406) susecuencia de aminoácidos de ANGPTL4 humana y/o mANGPTL4 (1-183), mANGPTL4 (23-183), mANGPTL4 (1-165 aproximadamente), mANGPTL4 (23-165 aproximadamente), mANGPTL4 (23-410) o mANGPTL4 (184-410) susecuencia de aminoácidos de ANGPTL4 murina. Otras subsecuencias también incluyen, entre otras, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 y 160-406 de hANGPTL4 y, por ejemplo, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 y 160-410 de mANGPTL4. En determinadas modalidades de la invención, un antagonista de ANGPTL4 incluye un anticuerpo anti-avß5r como por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-avßs. En determinadas modalidades, los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanizados. En determinadas modalidades de la invención, un antagonista de ANGPTL4 es una molécula ARNSi. En una modalidad, la molécula ARNSi es una molécula ANGPTL4-ARNSi, en la que la molécula actúa sobre una secuencia de ADN (por ejemplo, GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA) (SEC ID NO: 3) de un ácido nucleico que codifica la ANGPTL4. Una inmunoadhesina de ANGPTL4 comprende, al menos, la región de unión al receptor de ANGPTL4 fusionada con una secuencia de inmunoglobulina. En determinadas modalidades, la ANGPTL4, su agonista o antagonista constituyen un vehiculo, como por ejemplo, un vehiculo farmacéuticamente aceptable . Se describen animales con ANGPTL4 transgénica y bloqueada, junto con los usos de estos animales transgénicos. La invención también proporciona una célula aislada derivada de un animal transgénico no humano cuyo genoma posee una disrupción de un gen que codifica para una ANGPTL4. En determinadas modalidades, la célula aislada comprende una célula murina (por ejemplo, una célula madre embrionaria) . Las disrupciones génicas mutadas de ANGPTL4 han dado como resultado observaciones fenotipicas relacionadas con diversas enfermedades o disfunciones que incluyen: trastornos cardiovasculares, endoteliales o angiogénicos, incluyendo la ateroesclerosis; trastornos metabólicos anormales, incluyendo trastornos de homeostasis de lipidos; o trastornos inmunológicos e inflamatorios. Los métodos de la invención incluyen el tratamiento de trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico, trastorno metabólico anormal, trastorno inmunológico, trastorno de homeostasis de lipidos o trastorno oncológico asociado a la disrupción de un gen que codifica para una ANGPTL4 o asociado a la actividad de ANGPTL4, mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4, agonista o antagonista de ANGPTL4 a un sujeto, con lo que se logra tratar eficazmente los trastornos o enfermedades. Se proporcionan, además, métodos para identificar un fenotipo asociado a una disrupción de un gen que codifica para una ANGPTL4. Por ejemplo, el método incluye (a) la medición de una característica fisiológica de un animal transgénico no humano cuyo genoma comprenda una disrupción de un gen que codifica para una ANGPTL4; y (b) la comparación de la característica fisiológica medida con la de un animal de tipo natural equiparable por sexo. Se identifica un fenotipo resultante de la disrupción génica como la característica fisiológica del animal transgénico no humano que difiere de la característica fisiológica del animal de tipo natural. El animal transgénico no humano puede ser homocigoto o heterocigoto para la disrupción de un gen que codifica para una ANGPTL4. Se proporcionan, además, métodos para identificar un agente que module un fenotipo asociado a una disrupción de un gen que codifica para una ANGPTL4. Por ejemplo, un método incluye (a) la medición de una característica fisiológica de un animal transgénico no humano cuyo genoma comprenda una disrupción del gen que codifica para la ANGPTL4; y (b) la comparación de la característica fisiológica medida de (a) con la de un animal de tipo natural equiparable por sexo. Un fenotipo que resulta de la disrupción génica del animal transgénico no humano es una característica fisiológica del animal transgénico no humano que difiere de la característica fisiológica del animal de tipo natural. Se le administra un agente de prueba al animal transgénico no humano de (a) y se determina si el agente de prueba modula el fenotipo identificado asociado a la disrupción génica. Un agente de prueba que modula el fenotipo es un agente que modula el fenotipo. En ciertas modalidades, un fenotipo asociado con la disrupción génica de ANGPTL4 o un fenotipo exhibido por el animal transgénico no humano, cuando se lo compara con miembros de la carnada de tipo natural equiparables por sexo, es al menos uno de los siguientes, entre otros: un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico, un trastorno inmunológico, un trastorno de homeostasis de lipidos o un trastorno metabólico anormal. Se proporcionan, además, métodos para identificar un agente que module una característica fisiológica asociada a una disrupción del gen que codifica para una ANGPTL4. En ciertas modalidades, el método incluye (a) la medición de una característica fisiológica exhibida por un animal transgénico no humano cuyo genoma comprenda una disrupción del gen que codifica para una ANGPTL4; y (b) la comparación de la característica fisiológica medida de (a) con la de un animal de tipo natural equiparable por sexo. Una característica fisiológica exhibida por el animal transgénico no humano que difiere de la característica fisiológica exhibida por el animal de tipo natural se identifica como una característica fisiológica asociada a la disrupción génica. Se le administra un agente de prueba al animal transgénico no humano de (a) y se determina si se modula la característica fisiológica asociada a la disrupción génica. Un agente de prueba que modula la característica fisiológica es un agente que modula la característica. En ciertas modalidades, el animal transgénico no humano exhibe al menos una de las siguientes características fisiológicas, en comparación con miembros de la carnada de tipo natural equiparables por sexo: modulación en niveles medios de colesterol en suero, modulación en niveles medios de triglicéridos en suero, modulación en una prueba de tolerancia a la glucosa, modulación en homeostasis de glucosa, disminución del nivel medio de glucosa en suero, aumento del nivel medio de insulina en suero, disminución del nivel medio de insulina en suero, aumento del nivel medio de IgM y aumento del conteo medio de neutrófilos absolutos, aumento del porcentaje medio de grasa corporal, disminución de peso y altura corporales, disminución de la grasa corporal total, retardación de crecimiento con disminución de peso y altura corporales y/o disminución del porcentaje medio de grasa corporal total y de la masa total de tejidos. En una modalidad, la modulación en niveles medios de colesterol en suero es una disminución del nivel medio de colesterol en suero. En una modalidad, la modulación en el nivel medio de triglicéridos en suero es una disminución del nivel medio de triglicéridos en suero. En otra modalidad, la modulación en la prueba de tolerancia a la glucosa es una mayor tolerancia a la glucosa. Se proporcionan métodos para identificar un agente que mejore un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico, un trastorno inmunológico, un trastorno oncológico, un trastorno metabólico de lípidos, o un trastorno metabólico anormal asociado con una disrupción del gen que codifica para una ANGPTL4. Por ejemplo, un método incluye (a) la administración de un agente de prueba a un animal transgénico no humano con una disrupción en un gen ANGPTL4; y (b) la determinación de si el agente de prueba mejora el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico, trastorno inmunológico, trastorno oncológico, trastorno metabólico de lipidos o trastorno metabólico asociado a la disrupción génica en el animal transgénico no humano. La invención proporciona métodos para evaluar un agente terapéutico capaz de influir en una dolencia asociada con la disrupción de un gen que codifica para una ANGPL4. Por ejemplo, un método incluye (a) la medición de una característica fisiológica de una animal transgénico no humano cuyo genoma comprenda una disrupción del gen que codifica para la ANGPTL4; (b) la comparación de la característica fisiológica medida de (a) con la de un animal de tipo natural equiparable por sexo; (c) la administración de un agente de prueba al animal transgénico no humano de (a) ; y (d) la evaluación de los efectos del agente de prueba en la dolencia identificada asociada con la disrupción génica del ' animal transgénico no humano. La característica fisiológica del animal transgénico no humano que difiere de la característica fisiológica del animal de tipo natural se identifica como una dolencia resultante de la disrupción génica del animal transgénico no humano. Por ejemplo, en caso de que la dolencia sea un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico, trastorno inmunológico, trastorno oncológico, trastorno de homeostasis de lipidos o trastorno metabólico. Se proporcionan, además, métodos para identificar un agente que module la expresión de una ANGPTL4. Por ejemplo, un método incluye (a) el contacto entre un agente de prueba y una célula hospedadora que exprese una ANGPTL4; y (b) la determinación de si el agente de prueba modula la expresión de la ANGPTL4 por parte de la célula hospedadora. En la invención también se incluye un agente identificado por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente. En una modalidad, el agente comprende un agonista . En otra modalidad, el agente comprende un antagonista de una ANGPTL4. Los agentes que sean agentes terapéuticos también se incluyen en la invención, junto con una composición que incluye el agente terapéutico. En varios métodos de la invención, se le puede administrar una molécula de la invención, como por ejemplo, ANGPTL4, un agonista o antagonista de ANGPTL4, un agente, etc., al sujeto mediante un sistema de administración sistémico. En un aspecto, el sistema de administración sistémico incluye una preparación de células que comprende células de mamíferos (como por ejemplo, células CHO) que expresan una forma recombinanate del agente sujeto. En otro aspecto, el sistema de administración sistémico puede comprender una preparación de liberación lenta que contenga un agente purificado y una matriz de polímeros. En ciertas modalidades, se administra la molécula a un sujeto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como alternativa, la molécula de la invención puede administrarse mediante un vector de administración génica que actúa sobre el tejido (por ejemplo, adipocitos, higado, etc.) que comprende un ácido nucleico que codifica la molécula. En la invención, pueden utilizarse vectores virales o no virales bien establecidos para terapia génica como vectores de administración génica que actúan sobre el tejido. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra una secuencia de ácidos nucleicos de ANGPTL4 humana (SEC ID NO: 1) . La Figura 2 ilustra una secuencia de aminoácidos de ANGPTL4 humana (SEC ID NO: 2) derivada de la secuencia de codificación del SEC ID NO: 1 que se muestra en la Figura 1. La Figura 3, Panel A, ilustra una ANGPTL4 murina (23-410)' recombinante purificada separada en electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) (4-20%) en presencia (10 mM) o ausencia de ditiotreitol (DDT) . La Figura 3, Panel B, ilustra hANGPTL4 de tipo natural (banda 1) y variante (banda 2), separada en gel SDS y detectada mediante Western blotting, en la que la hANGPTL4 variante tiene una sustitución R162G y R164E. La Figura 4 ilustra a modo de esquema que la ANGPTL4 induce la adhesión celular de los hepatocitos humanos . La Figura 5 ilustra a modo de esquema que la ANGPTL4 induce la proliferación de hepatocitos . La Figura 6, Paneles A y B, ilustra a modo de esquema que la ANGPTL4 extracelular induce la proliferación visceral de preadipocitos humanos primarios (Panel A) y la proliferación subcutánea de preadipocitos (Panel B) . La Figura 7 ilustra a modo de esquema que la ANGPTL4 (23-406) y las formas de ANGPTL4 humana de IgG-quimera se unen a adipocitos humanos primarios subcutáneos mediante el análisis FACS. La Figura 8, Paneles A, B y C, ilustra que la ANGPTL4 induce la migración celular de los preadipocitos humanos primarios subcutáneos . Los Paneles A y B ilustran que la ANGPTL4 induce la migración celular de preadipocitos primarios durante la noche (Panel A) y a las 7 horas (Panel B) . El Panel C ilustra a modo de esquema la migración de preadipocitos primarios con ANGPTL4 a las 7 horas, en el que (1) no contiene suero agregado, (2) es suero fetal de ternero (FCS) al 10%, (3) es PDGF-BB y (4) es mANGPTL4. La Figura 9, Paneles A, B, C, D y E, ilustra la unión de ANGPTL4 a integrina cívßs- El Panel A ilustra la adhesión de células 293-1953 (avßs) a una placa recubierta de mANGPTL4 o vitonectrina con la concentración indicada en la parte inferior en (µg/ml) , en la que se utiliza BSA como control. El Panel B ilustra que los anticuerpos anti-avßs y anti-hANGPTL4 eliminan la actividad de adhesión celular de ANGPTL4, en el que (1) es BSA, (2) es vitronectina y (3) es p?ANGPTL4. El Panel. C ilustra la unión de proteína (mANGPTL4, hANGPTL4-Nterp?inai o hANGPTL4-Cterminai) utilizando la cantidad indicada en placas recubiertas de ßs. El Panel D ilustra la inhibición de la unión de proteina (mANGPTL4, hANGPTL4-Nterminai o hANGPTL4-Cterminai) a placas recubiertas de ofvßs con anti-hANGPTL4, en donde se utilizan como controles el anticuerpos anti-proteina de la región crítica 1 del síndrome de Down (Dscr) , 5G7 o medio de cultivo. El Panel E ilustra la unión de ANGPTL4 y vß5, en el que (1) es hANGPTL4-C-terminal recubierta en la placa, (2) es hANGPTL4-C-terminal recubierta en la placa e incubada con anti-hANGPTL4 , (3) es hANGPTL4-C-terminal recubierta en la placa e incubada con anti-Dscr, (4) es Vitronectina recubierta en la placa y (5) es 'BSA recubierta en la placa, antes de añadir avß5 La Figura 10 ilustra los niveles de triglicéridos de ratones con inyección intravenosa en la cola de ANGPTL4 y variantes de ANGPTL4, en el que (1) es Ad-GFP, (2) es Ad-Gd, (3) es ANGPTL4 (1-406), (4) es ANGPTL4 (1-183) , (5) es ANGPTL4 (184-406), (6) es variante de ANGPTL4 R1162G y R164E, (7) es ANGPTL4 (1-408) y (8) es un control. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Antes de describir la invención en detalle, debe entenderse qué la invención no se limita a las composiciones particulares o los sistemas biológicos, los cuales pueden, obviamente, variar. También debe tenerse en cuenta que la terminología que se utiliza en la presente tiene como finalidad describir únicamente las modalidades particulares y no pretende ser restrictiva. Tal como se utilizan en esta memoria detallada y en las reivindicaciones que se incluyen a continuación, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen el plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, la referencia a "una molécula", por ejemplo, incluye opcionalmente una combinación de dos o más de las moléculas y asi sucesivamente. A menos que se los defina de otra manera, todos los términos científicos y técnicos poseen el mismo significado que normalmente se utiliza en la técnica a la que pertenecen. A los fines de la invención, los siguientes términos se definen a continuación. El término "ANGPTL4 o "Angptl4" hace referencia al polipéptido o proteína 4 de tipo angiopoietina y a las formas alélicas, secretadas y procesadas de ésta que se producen naturalmente. Por ejemplo, la ANGPTL4 de los humanos es una proteina de 406 aminoácidos, mientras que la ANGPTL4 de los ratones es una proteína de 410 aminoácidos. El término "ANGPTL4" también se utiliza para hacer referencia a los fragmentos (por ejemplo, subsecuencias, formas truncadas, etc.) del polipéptido que comprenden, por ejemplo, fragmento del extremo N-terminal, dominio de doble espiral, fragmento del extremo C-terminal, dominio de tipo fibrinógeno, aminoácidos 1-183, 23-183, 1-162 aproximadamente, 23-162 aproximadamente, 23-406, 184-406, 162-406 aproximadamente o 23-184 de la proteína 4 de tipo 'angiopoietina humana y los aminoácidos 1-183, 23-183, 1-165 aproximadamente, 23-165 aproximadamente, 23-410 o 184-410 de la proteina 4 de tipo angiopoietina murina. Otros fragmentos incluyen, entre otros, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 y 160-406 de hANGPTL4 y, por ejemplo, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 y 160-410 de mANGPTL4. Las referencias a cualquier forma de ANGPTL4 también pueden identificarse en la solicitud, por ejemplo, como: "ANGPTL4 (23-406)", "ANGPTL4 (184-406)", "ANGPTL4 (23-183)", "mANGPTL4 (23-410)", "mANGPTL4 (184-410)", etc., en la que m indica la secuencia murina. La posición del aminoácido para un fragmento de ANGPTL4 nativa se enumera tal como se indica en la secuencia de ANGPTL4 nativa. Por ejemplo, la posición del aminoácido 22 (Ser) en un fragmento de ANGPTL4 es la misma que en la ANGPTL4 humana nativa; ver la Figura 2. Normalmente, el fragmento de ANGPTL4 nativa posee actividad biológica. Un polipéptido con "secuencia nativa" es un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido obtenido de la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido con secuencia nativa puede poseer la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido que se produce naturalmente de cualquier mamífero. El polipéptido con secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o producirse po medios sintéticos o recombinantes. El término polipéptido con "secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas o secretadas del polipéptido (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular) , formas variantes (por ejemplo, formas alternativamente enlazadas) y variantes alélicas del polipéptido, todas ellas producidas naturalmente . Una "variante" de polipéptido es un polipéptido biológicamente activo que posee al menos 80% de identificación de la secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa correspondiente o fragmento del mismo. Las variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se agregan o eliminan uno o más residuos de aminoácidos, en el extremo N- y/o C-terminal del polipéptido. Normalmente, una variante tendrá aproximadamente al menos 80% de identificación de la secuencia de aminoácidos o al menos 90% de identificación de la secuencia de aminoácidos o al menos 95% o más de identificación de la secuencia de aminoácidos con el polipéptido con secuencia nativa o fragmento del mismo. El término "variante de ANGPTL4", tal como se lo utiliza en la presente, hace referencia a una variante descrita anteriormente y/o a una ANGPTL4 que incluye una o más mutaciones de aminoácidos en la secuencia de ANGPTL4 nativa. Opcionalmente, la mutación o mutaciones de los aminoácidos incluyen una sustitución o sustituciones de aminoácidos. La ANGPTL4 y las variantes de la misma para el uso en la invención pueden prepararse mediante una variedad de métodos muy conocidos en la técnica. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de ANGPTL4 pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN de la ANGPTL4. Las variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones, inserciones o sustituciones de los residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de ANGPTL4, como por ejemplo, una secuencia de aminoácidos humana codificada mediante el ácido nucleico depositado con el número de depósito de ATCC 209284 o como se indica en la Figura 2. Cualquier combinación de eliminaciones, inserciones o sustituciones puede llevarse a cabo para obtener el constructo final con la actividad deseada. -Las mutaciones que' se llevarán a cabo en el ADN que codifica la variante no deberán ubicar la secuencia fuera de la estructura de lectura y, preferentemente, no deberán crear regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Patente Europea 75,444A. Las variantes de ANGPTL4 se preparan opcionalmente mediante mutagénesis dirigida al punto de los nucleótidos en el ADN que codifica la ANGPTL4 nativa o técnicas de presentación en fagos, lo que produce como resultado el ADN que codifica la variante. A continuación, el ADN se expresa en el cultivo de células recombinantes. Si bien el punto para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la mutación propiamente la también lo esté. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un punto dado, la mutagénesis aleatoria puede llevarse a cabo en el codón o región diana y las variantes de ANGPTL4 expresadas pueden monitorizarse para detectar la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en los puntos predeterminados de ADN que posean una secuencia conocida se conocen muy bien, como por ejemplo, la mutagénesis especifica de un punto. La preparación de las variantes de ANGPTL4 descritas en la presente puede llevarse a cabo mediante técnicas de presentación en fagos, tales como las descriptas en la Publicación PCT WO 00/63380. Después de seleccionar el clon, la región de la proteina mutada puede extraerse y colocarse en el vector apropiado para la producción proteica, que, generalmente, es un vector de expresión del tipo que puede utilizarse para la transformación de un hospedador adecuado. Las eliminaciones de la secuencia de aminoácidos generalmente comprenden entre 1 y 30 residuos aproximadamente, entre 1 y 10 o entre 1 y 5 o menos residuos opcionalmente y, normalmente, son contiguas. Las inserciones en las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo terminal de un residuo hasta polipéptidos de longitud básicamente ilimitada, así como las inserciones intrasecuenciales de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Las inserciones intrasecuenciales (es decir, inserciones dentro de la secuencia de ANGPTL4 nativa) pueden comprender generalmente entre 1 y 10 residuos aproximadamente o entre 1 y 5 ó 1 y 3 opcionalmente. Un ejemplo de una inserción terminal incluye una fusión de una secuencia de señal, ya sea heteróloga u homologa para la célula hospedadora, al extremo N-terminal para facilitar la secreción de los hospedadores recombinantes . Las variantes adicionales de ANGPTL4 son aquellas en las que se ha extraído al menos un residuo de aminoácido de la ANGPTL4 nativa y se ha colocado un residuo diferente en su lugar. En una modalidad de la invención, la variante de ANGPTL4 incluye una sustitución en 162 y/o 164 de la ANGPTL4 o una sustitución en 169 de mANGPTL4. Las sustituciones pueden realizarse de acuerdo con aquellas descritas en la Tabla 1. Las variantes de ANGPTL4 también pueden comprender aminoácidos no naturales, tal como se los describe en la presente. Los aminoácidos pueden agruparse conforme a las similitudes de las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry, edición segunda, pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polares no cargados: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D) , Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos que se obtienen naturalmente pueden dividirse en grupos en base a las propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. TABLA 1 Los "residuos de aminoácidos que se obtienen naturalmente" (es decir, los residuos de aminoácidos codificados por el código genético) pueden seleccionarse de un grupo integrado por: alanina (Ala) ; arginina (Arg) ; asparragina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteína (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleucina (He) ; leucina (Leu) ; lisina (Lys) ; metionina (Met) ; fenilalanina (Phe) ; prolina (Pro) ; serina (Ser) ; treonina (Thr) ; triptofano (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . Un "residuo de aminoácido que no se obtiene naturalmente" es un residuo que no es ninguno de los residuos de aminoácidos obtenidos naturalmente que se enumeraron anteriormente y que es capaz de unir covalentemente residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena de polipéptidos. Los ejemplos de residuos de aminoácidos que no se obtienen naturalmente incluyen, por ejemplo, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácidos, como por ejemplo, los descritos en Ellman y col., Meth . Enzym . 202:301-336 (1991) y las Publicaciones de Solicitudes de Patentes Norteamericanas 20030108885 y 20030082575. De manera resumida, los procedimientos implican la activación de un supresor de ARNt con un residuo de aminoácido que no se obtiene naturalmente, seguida de la transcripción y traducción in vitro o in vivo del ARN. Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitudes de Patentes Norteamericanas 20030108885 y 20030082575; Noren y col., Science 244:182 (1989); y Ellman y col., supra . El "porcentaje (%) de identificación de la secuencia de aminoácidos" se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identificación de la secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identificación de la secuencia. La alineación realizada con la finalidad de determinar el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos puede lograrse mediante varias formas que son conocidas en la técnica, como por ejemplo, la utilización de software disponible en el mercado, como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, a los fines indicados en la presente, los valores del % de identificación de la secuencia de aminoácidos se obtienen tal como se describe a continuación, utilizando el software de comparación de secuencias ALIGN-2. El software fue creado por Genentech, Inc. y presentado, junto con la documentación del usuario, en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está inscripto con el Registro de Derechos de Autor de Estados Unidos N° TXU510087, y está disponible en el mercado a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. Este programa debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, como por ejemplo, UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 define todos los parámetros de comparación de secuencias, que no varían. A los1 fines indicados en la presente, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A con respecto a o en comparación con una determinada secuencia de aminoácidos B (que puede expresarse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos con respecto a o en comparación con una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y en la que X es la cantidad de residuos de aminoácidos establecidos como coincidencia total por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de A y B, y en la que Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se detectará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. Un polipéptido "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural . Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En ciertas modalidades, el polipéptido se purificará (1) en más del 95% de su peso, tal como se determina por el método de Lowry, o en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia del extremo N-terminal o interna de aminoácidos mediante un secuenciador de taza giratoria o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, utilizando una tinción con azul de Coomassie o plata. Los polipéptidos aislados incluyen el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. De todas formas, normalmente, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación. El término "modulador de ANGPTL4" se refiere a una molécula que puede activar, por ejemplo, un agonista, una ANGPTL4 o la expresión de la misma o que puede inhibir, por ejemplo, un antagonista (o inhibidor) , la actividad de ANGPTL4 o la expresión de ésta. Los agonistas de ANGPTL4 incluyen anticuerpos y fragmentos activos. Un antagonista de ANGPTL4 se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de ANGPTL4, como por ejemplo, proliferación o crecimiento, migración o adhesión celular, modulación metabólica o de lípidos o la expresión de la proteína, incluyendo su unión a un receptor de ANGPTL4, como por ejemplo, vß5. Los antagonistas de ANGPTL4 incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-ANGPTL4 y fragmentos de unión a antigeno de éstos, moléculas receptoras, anticuerpos receptores anti-ANGPTL4 y antagonistas receptores de ANGPTL4, tales ' como pequeños inhibidores de moléculas del receptor. Otros antagonistas de ANGPTL4 también incluyen variantes antagonistas de ANGPTL4, moléculas antisentido (por ejemplo, ANGPTL4-ARNSÍ) , aptámeros de ARN y ribozimas contra ANGPTL4 o su receptor. En ciertas modalidades, los anticuerpos antagonistas de ANGPTL4 son anticuerpos que inhiben o reducen la- actividad de ANGPTL4 mediante la unión a una susecuencia o región específica de ANGPTL4, como por ejemplo, fragmento el extremo N-terminal, dominio de doble espiral, fragmento del extremo C-terminal, dominio de tipo fibrinógeno, aminoácidos 1-183, 23-183, 1-162 aproximadamente, 23-162 aproximadamente, 23-406, 184-406, 162-406 aproximadamente o 23-184 de la proteína 4 de tipo angiopoietina humana y los aminoácidos 1-183, 23-183, 1-165 aproximadamente, 23-165 aproximadamente, 23-410 o 184-410 de la proteina 4 de tipo angiopoietina murina. Otras subsecuencias también incluyen, entre otras, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 y 160-406 de hANGPTL4, y, por ejemplo, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 y 160-410 de mANGPTL4. Los moduladores de ANGPTL4 son moléculas que modulan la actividad de ANGPTL4, como por ejemplo, los agonistas y antagonistas. El término "agonista" se utiliza para referirse a análogos de péptidos o no péptidos de ANGPTL4 y a anticuerpos que unen específicamente las moléculas de ANGPTL4, siempre que sean capaces de señalar a través de un receptor de ANGPTL4 nativa (por ejemplo, integrina avßs) - El término "agonista" se define en el contexto del rol biológico de un receptor de ANGPTL4 (por ejemplo, o¡vß5) . En ciertas modalidades, los agonistas poseen las actividades biológicas de una ANGPTL4 nativa, tal como se definió anteriormente, como por ejemplo, el fomento de la proliferación, migración y/o adhesión celular y/o la modulación de la homeostasis de lípidos. El término "antagonista" se utiliza para referirse a moléculas que tienen la capacidad de inhibir la actividad biológica de la ANGPTL4, independientemente de si tienen la capacidad de unir la ANGPTL4 o su receptor, como por ejemplo, o¡vß5- Por ejemplo, los antagonistas que tienen la capacidad de unir la ANGPTL4 o su receptor incluyen anticuerpos anti-ANGPTL4 y anti-avß5- Los antagonistas que inhiben la expresión de la ANGPTL4 incluyen, por ejemplo, ANGPTL4-ARNSi. La ANGPTL4 antagonista puede evaluarse, por ejemplo, mediante la inhibición de las actividades de ANGPTL4, tales como la adhesión, migración, proliferación y/o modulación de la actividad de homeostasis de lipidos de ANGPTL4. Con respecto a la actividad del receptor de integrina oivßs el modulador de un receptor de integrina vß5 puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse el método descrito por J. W. Smith y col. en J. Biol . Chem . 265:12267-12271 (1990). El término "anticuerpo anti-ANGPTL4" se refiere a un anticuerpo que se une a la ANGPTL4 con suficiente afinidad y especificidad. En ciertas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-ANGPTL4 de la invención puede utilizarse como agente terapéutico para tratar e interferir con enfermedades o dolencias que impliquen la actividad de la ANGPTL4. Por lo general, el anticuerpo anti-ANGPTL4 no se unirá a otros homólogos de la ANGPTL4, como por ejemplo, la ANGPTL3. El término "anticuerpo" se utiliza en el más amplio sentido e incluye los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, multivalentes, multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos (ver más abajo) , siempre que muestren la actividad biológica deseada. A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo multivalente" se utiliza en la presente para referirse a un anticuerpo que comprenda tres o más puntos de unión a antígenos . El anticuerpo multivalente se diseña generalmente con tres o más puntos de unión a antígenos y no es un anticuerpo IgM o IgA de secuencia nativa. Los "fragmentos de anticuerpos" incluyen sólo una parte de un anticuerpo intacto y generalmente abarcan un punto de unión a antígenos del anticuerpo intacto, por lo que retienen la capacidad de unir a antígenos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos según la definición anterior incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CHl; (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteina en el extremo C-terminal del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd, que tiene dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd' , que tiene dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el extremo C-terminal del dominio CH1; (v) el fragmento Fv, que tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward y col., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, que son fragmentos bivalentes que incluyen dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpos de cadena única (por ejemplo, Fv y scFv de cadena única) (Bird y col., Science 242:423-426 (1988); y Huston y col., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988) ) ; (x) "diacuerpos" con dos puntos de unión a antigenos, incluyendo un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, ' 90 : 6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que incluyen un par de segmentos en tándem de Fd (VH-CH1-VH-CH1) , los cuales, junto con los polipéptidos complementarios de cadena ligera, forman un par de regiones de unión a antígenos (Zapata y col. Protein Eng. 8 (10): 1057 1062 (1995); y Patente Norteamericana No. 5,641,870). El término "anticuerpo monoclonal" se entiende en la presente como un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos, excepto en posibles mutaciones de formación natural que podrían estar presentes en cantidades insignificantes. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un único antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante del antígeno. No debe interpretarse que el modificador "monoclonal" requiere la producción del anticuerpo por cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben usarse de acuerdo con la invención pueden conseguirse utilizando el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler y col., Nature, 256:495 (1975) , o métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991). En la presente, los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos", en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de los anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567 y Morrison et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, los murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia minima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) , como el ratón, la rata, el conejo o los primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmuhoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y típicamente dos) en que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente humana. Para obtener más detalles, ver Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . , 2:593-596 (1992).

Un "anticuerpo humano" es aquel que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producción de anticuerpos humanos expuestas en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contenga residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una modalidad, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, en la que la biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996); Sheets y col., PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol . Biol . , 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581 (1991)). Los anticuerpos humanos también pueden producirse mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, como por ejemplo, ratones, en los que los genes de inmunoglobulina endógenos han sido inactivados total o parcialmente. Tras la prueba, se observa la producción del anticuerpo humano, que se asemeja mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización y ensamblaje de genes y el repertorio de anticuerpos. Este método se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; ,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (-1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern . Rev. Immunol . 13:65-93 (1995). Como alternativa, el anticuerpo humano puede prepararse mediante la inmortalización de los linfocitos humanos B que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (los linfocitos B pueden obtenerse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro) . Ver, por ejemplo, Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol . , 147(1) :86-95 (1991); y la Patente Norteamericana No. 5,750,373. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su antígeno particular. De todos modos, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos, denominados regiones hipervariables, de los dominios variables tanto de la cadena ligera como la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman regiones de estructura (FRs) . Cada dominio variable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FRs que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-beta, conectadas por tres regiones hipervariables que crean bucles que conectan la estructura de la hoja-beta y en algunos casos forman parte de ella. Las FRs mantienen unidas y en estrecha proximidad a las regiones hipervariables de cada cadena, las cuales, junto con las regiones hipervariables de las otras cadenas, contribuyen a la formación del punto de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat y col., Seguences of Proteins of Immunological Interest , 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) . Los dominios constantes no participan directamente en el proceso de unión al antigeno de un anticuerpo, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . El término "región hipervariable", en el contexto de la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col., Seguences of Proteins of I munological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol . Biol . , 196:901-917 (1987)). Los residuos de una "región estructural" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable, tal como se define en la presente. Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a distintas "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en "subclases" (isotipos) , como por ejemplo, IgG? (incluyendo los alotipos A y no A) , IgG2, IgG3, IgG , IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de anticuerpos se denominan OÍ, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (6) y lambda (8), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. El término "región Fc" se utiliza para definir la región del extremo C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede generarse mediante la digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los limites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de una cadena pesada de IgG humana se suele definir como que se extiende a partir de un residuo de aminoácido en la posición Cys226 o desde Pro230 hasta el extremo carboxilo terminal de la región Fc. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente puede comprender un dominio CH4. En la presente, el término "cadena de la región Fc" se refiere a una de las dos cadenas de polipéptidos de una región Fc. El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana (también llamado dominio "Cg2") se extiende generalmente desde un residuo de aminoácido en la posición 231 hasta un residuo de aminoácido en la posición 340, El dominio CH2 es único porque no está unido estrechamente a ningún otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidratos ramificadas enlazadas a N se interponen entre dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que los carbohidratos pueden proporcionar un sustituto para el apareamiento dominio-dominio y contribuir a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol . 22:161-206 (1985). El dominio CH2 de la presente puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o un dominio CH2 variante. El "dominio CH3" comprende una región de residuos del extremo C-terminal a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, desde un residuo de aminoácidos en posición 341 hasta un residuo de aminoácido en posición 447 de IgG) . La región CH3 de la presente puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o un dominio CH3 variante (por ejemplo, un dominio CH3 con una "protuberancia" insertada en una cadena del mismo y una "cavidad" correspondiente insertada en la otra cadena del dominio; ver la Patente Norteamericana No. 5,821,333, expresamente incorporada a la presente para su referencia) . Los dominios CH3 variantes pueden utilizarse para generar anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), tal como se describe en la presente. La "región bisagra" se define generalmente como la región desde Gluc216 o Cys226 aproximadamente hasta Pro230 aproximadamente de la IgGl humana (Burton Molec. Immunol . 22:161-206 (1985)). Las regiones bisagras de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia, de IgG si se colocan el primer y el último residuo de cisteína formando uniones S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones. La región bisagra de la presente puede ser una región bisagra de secuencia nativa o una región bisagra variante. Las dos cadenas de polipéptidos de una región bisagra variante retienen generalmente al menos un residuo de cisteína por cadena de polipéptido, de modo que las dos cadenas de polipéptidos de la región bisagra variante puedan formar una unión disulfuro entre las dos cadenas. La región bisagra preferida en la presente es la región bisagra humana de secuencia nativa, como por ejemplo, una región bisagra IgGl humana de secuencia nativa. Una "región Fc funcional" tiene al menos una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Algunos ejemplos de "funciones efectoras" incluyen unión Clq; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) ; unión de receptor Fc; citotoxicidad con mediación celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) ; fagocitosis; regulación a la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor celular B; BCR) , etc. Estas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpos) y se puede evaluar utilizando varios ensayos conocidos de la materia para considerar las funciones efectoras de anticuerpos. Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la secuencia de aminoácido de una región Fc que se puede encontrar en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en al menos una modificación de aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos, en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido principal, por ejemplo, entre una y diez sustituciones de aminoácidos y, . preferiblemente, entre una y cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido principal. La región Fc variante de la presente tendrá, por ejemplo, al menos 80% de identificación de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido principal y, preferiblemente, al menos 90% de identificación de secuencia o al menos 95% o más de identificación de secuencia con la región. La "citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos" y las siglas "ADCC" se refieren a una reacción con mediación celular en la cual las células citotóxicas no especificas que expresan receptores de Fc (FcRs) (por ejemplo, las células asesinas naturales (NK) , los neutrófilos y los macrófagos) reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente producen la lisis de ésta.

Las células primarias para mediar en la ADCC, células NK, expresan sólo Fc?Rlll, mientras que los monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y Fc?Rlll. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Inmuno 1, 9:457-92 (1991). A fin de evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, como el que se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,500,362 ó 5,821,337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) y las asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se muestra en Clynes y col., PNAS (USA) , 95:652-656 (1998). Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Generalmente, las células expresan al menos el Fc?Rlll y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC serían las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) , las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, pero son las PBMC y las NK las que se prefieren generalmente. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, como por ejemplo, la sangre o las PBMC, tal como se describe en la presente . Los términos "receptor de Fc" y "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano con secuencia nativa. Además, el FcR preferente es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye las subclases de receptores Fc?RI, Fc?RII y Fc?Rlll, incluidas las variantes alélicas y las formas enlazadas alternativamente de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen el Fc?RIIA (un "receptor activador") y el Fc?RIIB (un "receptor inhibidor") , los cuales tienen secuencias similares de aminoácidos que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor activador Fc?RIIA contiene en su dominio citoplásmico un motivo activador inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) . El receptor inhibidor Fc?RIIB contiene en su dominio citoplásmico un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) (ver una reseña al respecto en Daéron, Annu . Rev. Immunol . , 15:203-234 (1997)). En Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol, 9:457-92 (1991), Capel y col., Immunomethods , 4:25-34 (1994) y de Haas y col., J. Lab. Clin . Med. , 126:330-41 (1995) también se analizan los FcRs. Otros FcRs, incluidos aquellos que se identifiquen en el futuro, se engloban en el término "FcR" de la presente. Este término también incluye el receptor neonatal, FcRn, responsable de la transferencia de los IgGs maternos al feto (Guyer y col., J. Immunol . , 117:587 (1976) y Kim y col., J. Immunol . , 24:249 (1994) ) . La "citotoxicidad dependiente de complemento" o CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forme complejo con un antigeno cognado. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, como por ejemplo, el que se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol . Methods, 202:163 (1996) . El término "inmunoadhesina" se refiere a moléculas tipo anticuerpo que combinan con la especificidad de unión de la proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión entre una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que no sea el reconocimiento de un antígeno ni el punto de unión de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La porción de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es, generalmente, una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el punto de unión de un receptor o ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina de la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, como por ejemplo, los subtipos Igd, IgG2, IgG3, o IgG , IgA (incluyendo IgAi e IgA2) , IgE, IgD o IgM. A los fines de la presente, los términos "activa" o "actividad" se refieren a una forma o formas de ANGPTL4 que retienen una actividad biológica y/o inmunológica de una ANGPTL4 nativa u obtenida naturalmente, en la que actividad "biológica" significa una función (ya sea inhibitoria o promotora) provocada por una ANGPTL4 nativa u obtenida naturalmente que no sea la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo con un epítopo antigénico que posee una ANGPTL4 nativa u obtenida naturalmente, y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra el epítopo antigénico que posee una ANGPTL4 nativa u obtenida naturalmente. Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo que dan lugar a una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparación con un anticuerpo parental que no incluye las alteraciones. Los anticuerpos con maduración de afinidad preferentes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares con el antígeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se obtienen mediante procedimientos bien conocidos de la materia. En Marks y col., Bio/Technology 10:779-783 (1992) se describe la maduración de afinidad a través de la eliminación de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos estructurales se describen en: Barbas y col., Proc Nat . Acad. Sci , USA 91:3809-3813 (1994); Schier y col., Gene 169:147-155 (1995); Yelton y col., J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol . 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins y col., J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992). Un "punto de unión a antígeno funcional" de un anticuerpo es aquel capaz de unirse a un antigeno diana. La afinidad de unión a antígeno del punto de unión a antígeno no es necesariamente tan fuerte como la del anticuerpo parental del que se deriva el punto de unión a antigeno, pero la capacidad de unión a antígeno debe poder medirse utilizando cualquier método conocido para evaluar la unión del anticuerpo a un antígeno. Además, no es necesario que la afinidad de unión a antígeno de cada uno de los puntos de unión a antígeno de un anticuerpo multivalente de la presente sea igual cuantitativamente. Para los anticuerpos multiméricos de la presente, puede evaluarse la cantidad de puntos de unión a antígeno funcionales utilizando un análisis de ultracentrifugación. Según este método de análisis, se combinan los distintos índices de antígeno diana frente al anticuerpo multimérico y el peso molecular medio de los complejos se calcula asumiendo diferentes cantidades de puntos de unión funcionales. Estos valores teóricos se comparan con los valores experimentales reales obtenidos para evaluar la cantidad de puntos de unión f ncionales . Un anticuerpo con una "característica biológica" de un anticuerpo designado es aquel que posee una o más de las características biológicas del anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antigeno. A fin de examinar los anticuerpos que se unen a un epitopo de un antigeno unido por un anticuerpo de interés, se puede llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado, como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David La e (1988) . Una "cadena de polipéptidos" es un polipéptido en el que cada uno de sus dominios está unido a otro/s dominio/s por unión/es péptida/s, a diferencia de interacciones no covalentes o uniones disulfuro. En la presente, un "enlazador flexible" se refiere a un péptido que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por uniones péptidas y que proporciona más libertad rotacional a dos polipéptidos (como por ejemplo, dos regiones Fd) unidos por éste. La libertad rotacional les permite a dos o más puntos de unión a antigeno unidos por el enlazador flexible acceder al antígeno diana de manera más eficiente. Los ejemplos de secuencias de péptidos enlazadores flexibles apropiadas incluyen gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser y gly-gly-gly-ser . Un "dominio de dimerización" se forma a partir de la asociación de al menos dos residuos de aminoácidos (generalmente, residuos de cisteína) o de al menos dos péptidos o polipéptidos (que pueden tener secuencias de aminoácidos iguales o diferentes) . Los péptidos o polipéptidos pueden interactuar entre sí a través de asociaciones covalentes o no covalentes. Los ejemplos de dominios de dimerización de la presente incluyen una región Fc; una región bisagra; un dominio CH3; un dominio CH4; un par CH1-CL; una "interfase" con una "perilla" y/o "protuberancia" diseñada tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,821,333, expresamente incorporada a la presente para su referencia; una cremallera de leucina (por ejemplo, cremallera de leucina Jun/Fos; ver Kostelney y col., J. Immunol . , 148: 1547-1553 (1992); o una cremallera de leucina GCN4 de levadura) ; una cremallera de isoleucina; un par dímero receptor (por ejemplo, receptor de interleucina-8 (IL-8R) ; y heterodímeros de integrina, tales como LFA-1 y GPIIIb/IIIa) , o las regiones de dimerización de los mismos; polipéptidos ligandos di éricos (por ejemplo, factor de crecimiento nervioso (NGF) , neurotrofina-3 (NT-3) , interleucina-8 (IL-8) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , miembros de VEGF-C, VEGF-D, PDGF y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); ver Arakawa y col., J. Biol . Chem . 269(45): 27833-27839 (1994) y Radziejewski y col., Biochem . 32(48): 1350 (1993)), o las regiones de dimerización de los mismos; un par de residuos de cisteína capaces de formar una unión disulfuro; un par de péptidos o polipéptidos, cada uno con al menos un residuo de cisteína (por ejemplo, desde aproximadamente uno, dos o tres hasta aproximadamente diez residuos de cisteína) , de modo que puedan formarse uniones disulfuro entre los péptidos o polipéptidos (de aquí en adelante, una "bisagra sintética") ; y dominios variables de anticuerpos. El dominio de dimerización preferido en la presente es una región Fc o una región bisagra. La frase "estimulación de la proliferación de una célula" comprende el aumento del límite de crecimiento y/o reproducción de una célula en relación con una célula no tratada o una célula tratada reducida, ya sea in vitro o in vivo. El aumento de la proliferación celular en el cultivo celular puede detectarse mediante el conteo de la cantidad de células antes y después de la exposición a la molécula de interés. El limite de proliferación puede cuantificarse mediante un examen microscópico del grado de confluencia. Además, la proliferación celular puede cuantificarse utilizando los ensayos conocidos de la materia, como por ejemplo, el ensayo de incorporación de timidina, y los ensayos disponibles en el mercado. La frase "inhibición de la proliferación de una célula" comprende la disminución del limite de crecimiento y/o reproducción de una célula en relación con una célula no tratada o una célula tratada reducida, ya sea in vitro o in vivo. La inhibición puede cuantificarse tal como se describió anteriormente. La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y/o consecutiva en cualquier orden. A los fines de tratamiento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal. Generalmente, el animal es un mamífero. A los efectos de tratamiento, el término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, animales de compañía, utilizados en actividades deportivas, o en zoos, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cerdos, etc. Generalmente, el mamífero es un humano. El término "mejora" (como verbo o sustantivo) , tal como se lo utiliza en la presente, se refiere a la disminución, reducción o eliminación de una dolencia, enfermedad, trastorno o fenotipo, incluyendo una anormalidad o síntoma. Un "trastorno" es cualquier dolencia que se beneficiaría del tratamiento con una molécula de la invención. Este término incluye enfermedades o trastornos crónicos y agudos, incluidos las dolencias patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno de un sujeto. El "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas.

Entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen aquellas que ya tienen el trastorno, así como también aquellas que deben tomar medidas para prevenirlo. Tal como se lo utiliza en la presente, el término "hipertrofia" se define como un aumento de la masa o estructura de un órgano que no se relaciona con el crecimiento natural y que no implica la formación de un tumor. La hipertrofia de un órgano o tejido se produce por un aumento de la masa de las células individuales (hipertrofia verdadera) o por un aumento de la cantidad de células que componen el tejido (hiperplasia) o por ambos. Por ejemplo, el crecimiento hipertrófico de adipocitos es el aumento del tamaño del adipocito estimulado por una acumulación de lípidos. El crecimiento hiperplásico de adipocitos es el aumento de la cantidad de adipocitos en el tejido adiposo. Las frases "trastorno cardiovascular y endotelial", "disfunción cardiovascular y endotelial" y "trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico" se utilizan indistintamente y se refieren a trastornos, generalmente sistémicos, que estimulan la angiogénesis y/o la cardiovascularización. Esto incluye enfermedades que afectan a los vasos, así como también enfermedades de los mismos vasos, como por ejemplo, las arterias, los capilares, las venas y/o los vasos linfáticos. Los trastornos incluyen, entre otros, enfermedades arteriales, como por ejemplo, ateroesclerosis, diabetes mellitus, hipertensión, vasculitis inflamatoria, enfermedad de Reynaud y fenómeno de Reynaud, aneurismas y reestenosis arterial; trastornos venosos y linfáticos, como por ejemplo, tromboflebitis, linfangitis y linfedema; cáncer del tipo de tumores vasculares, como por ejemplo, hemangioma (capilar y cavernoso), tumores de glomo, telangiectasia, angiomatosis bacilar, hemangioendotelioma, angiosarcoma, hemangiopericitoma, sarcoma de Kaposi, linfangioma y linfagiosarcoma; angiogénesis tumoral; y otros trastornos vasculares, como por ejemplo, enfermedad vascular periférica, traumatismos, tales como heridas, quemaduras y otros tejidos dañados, fijación de implantes, cicatrización, lesión por reperfusión isquémica, artritis reumatoide, enfermedad cerebrovascular, enfermedades renales tales como insuficiencia renal aguda, derrame cerebral, enfermedad de la arteria coronaria, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y/u osteoporosis. Esto también incluiría angina, infartos miocardiales, tales como infartos miocardiales agudos, hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardíaca, tal como la insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) . Las enfermedades cardiovasculares asociadas con la dislipedemia también se incluyen, como por ejemplo, hipertensión, ateroesclerosis, insuficiencia cardíaca, derrame cerebral, diversas enfermedades de la arteria coronaria, obesidad, diabetes, etc. El término "trastorno de homeostasis de lípidos" incluye un trastorno, enfermedad o dolencia asociado a la regulación anormal (por ejemplo, regulación al alta o regulación a la baja) del metabolismo de lípidos o producido por ésta y/o vinculado a ésta. Los trastornos de homeostasis de lípidos pueden estar asociados a o producirse por lipólisis anómala, absorción anómala de lípidos, síntesis y/o secreción anómala de lípidos, liberación y/o producción intracelular anómala de lípidos, liberación y/o producción intracelular anómala de triglicéridos, masa intracelular anómala de lípidos y/o triglicéridos y/o masa secretada anómala de lípidos y/o triglicéridos dentro de una célula o desde ésta, como por ejemplo, una célula hepática. Los trastornos de homeostasis de lipidos incluyen, entre otros, ateroesclerosis, obesidad, dolencias relacionadas con la obesidad, diabetes, resistencia a la insulina, hiperlipidemia, hipolipidemia, dislipedemia, hipercolesterolemia, hipocolesterolemia, enfermedad de almacenamiento de triglicéridos, enfermedad cardiovascular, enfermedad de la arteria coronaria, hipertensión, derrame cerebral, sobrepeso, anorexia, caquexia, hiperlipoproteinemia, hipolipoproteinemia, enfermedad de Niemann Pick, hipertrigliceridemia, hipotrigliceridemia, pancreatitis, hiperostosis esquelética difusa idiopática (DISH) , fenotipo lipoproteico aterogénico (ALP) , epilepsia, enfermedad hepática, hígado adiposo, esteatohepatitis, síndrome ovárico poliquístico, cáncer, etc. El término "trastorno metabólico de lipidos" se refiere a niveles químicos clínicos anormales de colesterol y triglicéridos. El término "hiperlipidemia" o "hiperlipemia" se refiere a una dolencia caracterizada por niveles de lipidos en suero por encima de los normales. Los lipidos en suero incluyen colesterol (esterificado y libre) , lipoproteínas, triglicéridos, ácidos grasos libres y otros esteróles. En un aspecto, los niveles elevados de estos lipidos son síntomas de ateroesclerosis. El término "obesidad" se refiere a la dolencia por la que un mamífero tiene un Índice de masa corporal (IMC) , que se calcula multiplicando el peso (kg) por la altura2 (metros2), de al menos 25,9. Generalmente, las personas de peso normal tienen un IMC de entre 19,9 y 25,9. La obesidad, tal como se la utiliza en la presente, puede deberse a cualquier causa, ya sea genética o ambiental. Los ejemplos de trastornos que pueden resultar en obesidad o ser la causa de ésta incluyen, entre otros, alimentación en exceso y bulimia, enfermedad ovárica poliquística, craneofaringioma, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Frohlich, diabetes tipo II, sujetos con deficiencia de HC, estatura corta variante de la normal, síndrome de Turner y otras dolencias patológicas que presentan una actividad metabólica reducida o una disminución del gasto energético en reposo como porcentaje de la masa total libre de grasa, como por ejemplo, niños con leucemia linfoblástica aguda. Una "propiedad que determina la obesidad" incluye células y tejidos grasos, tales como panículos adiposos, peso corporal total, niveles de triglicéridos en los músculos, el higado y el tejido adiposo y niveles en ayunas y sin ella de leptina, ácidos grasos libres y triglicéridos en sangre. El término "dolencias relacionadas con la obesidad" se refiere a dolencias que se producen o agravan por la obesidad, como por ejemplo, entre otras, trastornos dermatológicos como infecciones, venas varicosas, Acantosis nigricans y eccemas, intolerancia al ejercicio, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, hipertensión, .hipercolesterolemia, colelitiasis, osteoartritis, lesión ortopédica, enfermedad tromboembólica, cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, etc.) y enfermedad cardiaca coronaria (o cardiovascular) , especialmente las dolencias cardiovasculares asociadas con altos niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres en un sujeto. La obesidad es el trastorno de peso corporal más frecuente y afecta aproximadamente a entre el 30% y el 50% de la población mediana edad de Occidente. Otros trastornos de peso corporal, como por ejemplo, anorexia nerviosa y bulimia nerviosa, que juntas afectan aproximadamente al 0.2% de la población femenina de Occidente, también representan serias amenazas para la salud. Además, los trastornos como la anorexia y la caquexia (adelgazamiento) también son características importantes de otras enfermedades, tales como cáncer, fibrosis quística y SIDA. El término trastornos de "adelgazamiento" (por ejemplo, síndrome de adelgazamiento, caquexia, sarcopenia) se refiere a trastornos provocados por una pérdida de peso o de masa celular corporal no deseada y/o insalubre. En pacientes mayores, así como también en pacientes con SIDA o cáncer, la enfermedad de adelgazamiento puede resultar en la pérdida no deseada de peso corporal, incluyendo los compartimientos de grasa y libres de ésta. Las enfermedades de adelgazamiento también pueden ser ocasionadas por la ingesta inapropiada de alimentos y/o los cambios metabólicos relacionados con enfermedades y/o el proceso de envejecimiento. Los pacientes con cáncer y SIDA, así como también los pacientes que hayan sido sometidos a cirugías extensivas o que padezcan infecciones crónicas, enfermedades inmunológicas, hipertiroidismo, enfermedad de Crohn extraintestinal, enfermedad psicogénica, insuficiencia cardíaca crónica u otro trauma severo, padecen frecuentemente la enfermedad de adelgazamiento, que también recibe el nombre de caquexia, un trastorno metabólico y, a veces, alimenticio. La caquexia se caracteriza además por el hipermetabolismo y el hipercatabolismo. Si bien la caquexia y la enfermedad de adelgazamiento se utilizan frecuentemente de manera indistinta para referirse a dolencias de adelgazamiento, hay al menos una línea de investigación que diferencia la caquexia del síndrome de adelgazamiento como la pérdida de masa libre de grasa y, especialmente, masa celular corporal (Mayer, 1999, J. Nutr. 129 (1S Suppl .): 256S-259S) . La sarcopenia, otro trastorno que puede afectar al individuo en proceso de envejecimiento, se caracteriza generalmente por la pérdida de la masa muscular. Es posible que la enfermedad de adelgazamiento en etapa final, tal como se la describió anteriormente, se origine en individuos que padezcan caquexia o sarcopenia. La diabetes es una enfermedad crónica que afecta al metabolismo de carbohidratos, grasas y proteínas en animales. La diabetes es la principal causa de ceguera, insuficiencia renal y amputaciones de los miembros inferiores en adultos, y es un factor de gran riesgo para las enfermedades cardiovasculares y los derrames cerebrales. La diabetes mellitus tipo I (o diabetes mellitus dependiente de la insulina ("IDDM") o diabetes juvenil temprana) abarca aproximadamente el 10% de todos los casos de diabetes. La enfermedad se caracteriza por una pérdida progresiva de la función secretora de insulina por parte de las células beta del páncreas. Esta característica también la comparte la diabetes no idiopática o "secundaria", que se origina en la enfermedad pancreática. La diabetes mellitus tipo I se relaciona con los siguientes signos o síntomas clínicos: concentración elevada persistente de glucosa en plasma o hiperglicemia; poliuria; polidipsia y/o hiperfagia; complicaciones microvasculares crónicas tales como retinopatia, nefropatia y neuropatía; y complicaciones macrovasculares tales como hiperlipidemia e hipertensión, que también pueden ocasionar ceguera, enfermedad renal en etapa final, amputación de miembros e infarto de miocardio. La diabetes mellitus tipo II (diabetes mellitus no dependiente de insulina o NIDDM) es un trastorno metabólico que implica la desregulación del metabolismo de glucosa y un trastorno de la sensibilidad a la insulina. La diabetes mellitus tipo II se desarrolla generalmente en adultos y se relaciona con la incapacidad del cuerpo para utilizar la insulina o producirla en cantidades suficientes. Además de la resistencia a la insulina que se observa en los tejidos diana, los pacientes que padecen diabetes mellitus tipo II tiene una deficiencia de insulina relativa, es decir, estos pacientes tienen niveles de insulina menores a los esperados para una concentración determinada de glucosa en plasma. La diabetes mellitus tipo II se caracteriza por los siguientes signos o síntomas clínicos: concentración elevada persistente de glucosa en plasma o hiperglicemia; poliuria; polidipsia y/o hiperfagia; complicaciones microvasculares crónicas tales como retinopatia, nefropatia y neuropatía; y complicaciones macrovasculares tales como hiperlipidemia e hipertensión, que también pueden ocasionar ceguera, enfermedad renal en etapa final, amputación de miembros e infarto de miocardio. El síndrome X, también denominado Síndrome de resistencia a la insulina (SRI) , Síndrome metabólico o Síndrome metabólico X, se presentan en aproximadamente el 2% de las caracterizaciones diagnósticas coronarias. Este síndrome, que a menudo es incapacitante, presenta síntomas o factores de riesgo para el desarrollo de la diabetes mellitus tipo II y enfermedades cardiovasculares, que incluyen trastorno de tolerancia a la glucosa (IGT) , trastorno de glucosa en ayunas (IFG) , hiperinsulinemia, resistencia a la insulina, dislipidemia (por ejemplo, niveles altos de triglicéridos y bajos de HDL) , hipertensión y obesidad.

Un trastorno inmunológico incluye, entre otros, lupus eritematoso sistémico; artritis reumatoide; artritis crónica juvenil; espondiloartropatias; esclerosis sistémica (esclerodermia) ; miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis) ; síndrome de Sjdgren; vasculitis sistémica; sarcoidosis; . anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria paroxismal nocturna) ; trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia de origen inmune) ; tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) ; diabetes mellitus; enfermedad renal de origen inmune (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial) ; enfermedades de desmielinización de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía idiopática con desmielinización o síndrome de Guillain-Barré y polineuropatía con desmielinización crónica inflamatoria; enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos) , hepatitis crónica activa autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis, granulomatosa y colangitis esclerosante; enfermedad inflamatoria intestinal (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn) ; enteropatia por sensibilidad al gluten y enfermedad de Whipple; enfermedades de la piel autoinmunes o de origen inmune, incluyendo dermatitis bullosa, eritema multiforme y dermatitis por contacto, psoriasis; enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos y urticaria; enfermedades inmunológicas de los pulmones tales como neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad; y/o enfermedades asociadas con transplantes, incluyendo rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra el hospedador. Pueden presentarse otros trastornos, como por ejemplo, trastorno de desarrollo (por ejemplo, letalidad embrionaria), trastorno neurológico (por ejemplo, ansiedad disminuida en respuesta a una prueba de actividad en campo abierto, ritmo circadiano anormal durante la prueba de actividad en jaula, etc.), anormalidad ocular (por ejemplo, anormalidad retinal) y/o anormalidad o trastorno metabólico óseo (por ejemplo, artritis, osteoporosis y/u osteopetrosis) . La palabra "etiqueta" utilizada en la presente se refiere a un compuesto o composición detectables que se conjuga directa o indirectamente al polipéptido. La etiqueta puede ser detectable por si misma (por ejemplo, etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un sustrato de compuestos o composiciones que sea detectable. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o entorno en los que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el polipéptido en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en' una posición cromosómica distinta de la que tiene en las células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo hospedador concreto. Las secuencias de control que son aptas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operadores y un punto de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. El ácido nucleico esta "operativamente enlazado" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o un líder secretor está operativamente enlazado al ADN de un polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; y un punto de unión al ribosoma está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si está situado para facilitar la traducción. Por lo general, por "operativamente enlazado" se entiende que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de restricción apropiados. Si esos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de conformidad con la práctica habitual. En la presente, las expresiones "célula", "linea celular" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente y todas las designaciones de los términos incluyen progenie. De este modo, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula de sujeto primaria y los cultivos derivados de ésta, sin importar la cantidad de transferencias. También se deberá tener en cuenta que toda la progenie puede no precisamente ser idéntica en cuanto al contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o involuntarias . Se incluye la progenie mutante que tenga la función o actividad biológica monitorizadas en la célula transformada originalmente. Cuando se pretendan realizar designaciones distintas, quedará claro según el contexto. El término "gen" se refiere a (a) un gen que contiene una secuencia de ADN que codifica ANGPTL4, por ejemplo, número de depósito de ATCC 209284 o ver la Figura 1; (b) cualquier secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de ANGPTL4 (ver la Figura 2) ; y/o (c) cualquier secuencia de ADN que se hibride al complemento de las secuencias de codificación expuestas en la presente. En ciertas modalidades, el término incluye regiones de codificación como así también aquellas que no lo son e incluye, preferentemente, todas las secuencias necesarias para la expresión génica normal. El término "mutación génica dirigida" se refiere a un tipo de recombinación homologa que tiene lugar cuando se inserta un fragmento de ADN genómico en una célula de mamífero y el fragmento se ubica y recombina con secuencias endógenas homologas . La mutación génica dirigida mediante recombinación homologa utiliza tecnologías de ADN recombinante para reemplazar secuencias genómicas especificas por ADN exógeno de diseño específico. El término "recombinación homologa" se refiere al intercambio de fragmentos de ADN entre dos moléculas de ADN o cromátidas en el lugar de las secuencias nucléotidas homologas. El término "gen diana" (denominado alternativamente "secuencia génica diana" o "secuencia de ADN diana") se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico, polinucléotido o gen que deberá modificarse mediante recombinación homologa. La secuencia diana incluye un gen intacto, un exón, un intrón, una secuencia reguladora o cualquier región entre los genes. El gen diana puede comprender una parte de un gen particular o locus genético del ADN genómico del individuo . La "disrupción" de un gen ANGPTL4 tiene lugar cuando un fragmento del ADN genómico ubica y se recombina con una secuencia endógena homologa, en la que la disrupción es la eliminación del gen nativo o una parte del mismo o una mutación del gen nativo o en la que la disrupción es la inactivación funcional del gen nativo. Alternativamente, las disrupciones de secuencias pueden producirse por una inactivación por inserción no específica mediante un vector de trampa génico (es decir, animales transgénicos no humanos que contienen y expresan un transgen insertado aleatoriamente; ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,436,707, concedida el 20 de agosto de 2000). Estas disrupciones o modificaciones de secuencias pueden incluir inserciones, mutaciones de sentido erróneo, desplazamientos del marco, eliminaciones, sustituciones o reemplazos de secuencias de ADN o cualquier combinación de éstas. Las inserciones incluyen la inserción de genes enteros, que pueden ser de origen animal, vegetal, fúngico, insectil, procariótico o viral. La disrupción puede, por ejemplo, alterar el producto génico normal mediante la inhibición de su producción en forma parcial o completa o mediante el aumento de la actividad del producto génico normal. En una modalidad, la disrupción es una disrupción nula, en la que no hay una expresión significativa del gen ANGPTL4. El término "expresión nativa" se refiere a la expresión del polipéptido de longitud completa codificado por el gen ANGPTL4, a niveles de expresión presentes en el ratón de tipo natural. De este modo, una disrupción en la que "no hay una expresión nativa" del gen ANGPTL4 endógeno se refiere a una reducción parcial o completa de la expresión de al menos una parte de un polipéptido codificado por un gen ANGPTL4 endógeno de una única célula, células seleccionadas o todas las células del mamífero. El término "bloqueo" se refiere a la disrupción de un gen ANGPTL4 que resulta en: la inactivación funcional del gen nativo; la eliminación del gen nativo o una parte de éste; o la mutación del gen nativo. El término "incorporación" se refiere al reemplazo del ortólogo del ratón (u otro gen del ratón) por genes humanos ADNc que codifiquen ANGPTL4 o variantes de ésta (es decir, la disrupción resulta en el reemplazo de un gen de ratón nativo por un gen de humano nativo) . El término "constructo" se refiere a un segmento de ADN ensamblado artificialmente que deberá transferirse a un tejido, línea celular o animal diana. Generalmente, el constructo incluirá un gen o una secuencia de ácido nucleico de interés particular, un gen marcador y secuencias de control apropiadas. Tal como se lo expone en la presente, un constructo ANGPTL4 de dirección incluye una secuencia de ADN que sea homologa al menos de una parte de un gen ANGPTL4 y es capaz de producir una disrupción en un gen ANGPTL4 de una célula hospedadora. El término "célula transgénica" se refiere a una célula que contiene en su genoma un gen ANGPTL4 que ha sufrido una disrupción, modificación, alteración o reemplazo, en su totalidad o en parte, mediante el método de mutación génica dirigida. El término "animal transgénico" se refiere a un animal que contiene- en su genoma un gen específico que ha sufrido una disrupción o cualquier otra modificación o mutación por los métodos descritos en la presente o cualquier otro método conocido en la técnica. En ciertas modalidades, el animal transgénico no humano es un mamífero. En una modalidad, el mamífero es un roedor, tal como una rata o un ratón. Además, un "animal transgénico" puede ser un animal heterocigoto (es decir, un alelo defectivo y uno alelo de tipo natural) o un animal homocigoto (es decir, dos alelos defectivos) . Se considera que un embrión está incluido en la definición de animal. El suministro de un animal incluye el suministro de un embrión o feto in útero, ya sea por apareamiento o cualquier otra manera y ya sea que el embrión llegue a término o no. Tal como se los utiliza en la presente, los términos "marcador selectivo" y "marcador de selección de posición" se refieren a un gen que codifica un producto que permite que sólo las células que tienen el gen sobrevivan y/o crezcan en determinadas condiciones. Por ejemplo, las células animales y vegetales que expresan el gen insertado de la resistencia a la neomicina (Neor) son resistentes al compuesto G418. El G418 destruye a las células que no tengan el marcador génico Neor. Los expertos en la técnica conocen o tienen a su alcance otros marcadores de selección positivos . El término "modula" o "modulación", tal como se lo utiliza en la presente, se refiere a la disminución, inhibición, reducción, mejora, aumento o incremento de la función, expresión o actividad de un gen ANGPTL4 o, alternativamente, de un fenotipo asociado al gen ANGPTL4. El término "anormalidad" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno, dolencia o fenotipo que implique la ANGPTL4, incluyendo afecciones patológicas y observaciones de comportamiento . ANGPTL4 La invención resulta del deseo de dilucidar aún más la función biológica de la ANGPTL4 y su rol en los estados de enfermedad. La expresión de la ANGPTL4 se presenta principalmente en los tejidos adiposos, hepáticos, renales y de la placenta. Esta invención proporciona usos adicionales de la ANGPTL4 y los moduladores de la ANGPTL4 en las áreas de hepatocitos, adipocitos y homeostasis de lípidos. La invención describe, además, ratones transgénicos o con bloqueo con una disrupción del gen ANGPTL4 y los usos del mismo. La proteina 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) es una proteína secretada y forma parte de la familia de angiopoietinas. También se la conoce como proteína hepática relacionada con fibrinógeno/angiopoietina (HFARP) (Kim y col., Biochem . J. 346:603-610 (2000)), PGAR (proteína PPAR? relacionada con angiopoietina) (Yoon, y col., Mol Cell Biol . , 20:5343-5349 (2000)), factor adiposo inducido por el ayuno (FIAF) (Kerten y col., J. Biol . Chem . , 275:28488-28493 (2000)), proteína relacionada con angiopoietina (ARP-4), NL2 (ver las Patentes Norteamericanas Nos. 6,348,350, 6,372,491, y 6,455,496) y Ang6. La proteina ANGPTL4 de humanos es una proteína de 406 aminoácidos (por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 6,348,350; 6,372,491 y 6,455,496), mientras que la ANGPTL4 de ratones es una proteina de 410 aminoácidos (Kim y col., Biochem . J. 346:603-610(2000)). La proteina humana y la de los ratones comparten aproximadamente el 75% de identidad a nivel de aminoácidos. Kim y col., Biochem . J. 346:603-610 (2000) . La ANGPTL4 tiene un péptido de señal, tres lugares potenciales de N-glicosilación y cuatro cisteinas que pueden participar de la unión disulfuro intramolecular . La ANGPTL4 forma estructuras moleculares superiores, como por ejemplo, tal como lo indica la Figura 3, Panel A. Ver también, por ejemplo, Ge y col., J. Biol . Chem . , 279 (3) : 2038-2045 (2004); Ge y col., J. Lipid Res . 45:2071-2079 (2004); y Mandard y col., J. of Biol . Chem . , 279 (33) : 34411-34420 (2004). La ANGPTL4 también puede procesarse proteolíticamente. Por ejemplo, la sustitución de R162G y R164E de ANGPTL4 da como resultado un mayor peso molecular para la ANGPTL4 variante en un SDS-Gel que la proteína de tipo natural (ver la Figura 3, Panel B) . Ver también, por ejemplo, Ge y col., J. Biol . Chem . , 279(3) :2038-2045 (2004) y Mandard y col., J. of Biol . Chem . , 279(33) :34411-34420 (2004). Las regiones conservadas de la familia de angiopoietinas incluyen un dominio de doble espiral y un dominio de tipo fibrinógeno (FBN) C-terminal. Ver, por ejemplo, Kim y col., Biochem . J. 346:603-610 (2000). Se sugiere que la ANGPTL4 se procesa proteolíticamente de manera regulada para liberar el dominio de tipo fibrinógeno C-terminal. Ver, por ejemplo, Ge y col., J. Biol . Chem . , 279(3) :2038-2045 (2004). La ANGPTL4 se une a la integrina avßs- Ver, por ejemplo, la Figura 9, Paneles A-E. Otro miembro de la familia, la proteína 3 de tipo angiopoietina (ANGPTL3) es un factor angiogénico que se une a la integrina avß3- Ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente Norteamericana 20030215451, publicada el 20 de noviembre de 2003, y Camenisch y col., J. Biol . Chem . , 277 (19) : 17281-17290 (2002). Aparentemente, la ANGPTL3 no se une al receptor Tie2. Camenish y col., Journal of Biol . Chem . 277 (19) : 17281-17290 (2002). La ANGPTL3 es, además, reguladora de los niveles de lipidos en plasma. Ver, por ejemplo, Koishi y col., Nat . Genetics 30:151-157 (2002). La integrina avß5 es un receptor de proteínas de matriz extracelular, incluyendo vitronectina y Del-1 (ver, por ejemplo, Stupack y Cheresh, Journal of Cell Science 115:3729-3738 (2002)). Las integrinas alfa v participan de la progresión y metástasis de tumores. Ver, por ejemplo, Marshall, J F y Hart, I R Semin . Cáncer Biol . 7(3): 129-38 (1996) . Además, se ha demostrado que las integrinas alfa v participan en la angiogénesis. Ver, por ejemplo, Eliceiri, B P y Cheresh, D A Molecular Medicine 4: 741-750 (1998). Por ejemplo, se mostró que un anticuerpo monoclonal para ctyßs inhibe la angiogénesis inducida por VEGF en córneas de conejos y en el modelo de membrana corioalantoica de polluelos. Ver, por ejemplo, M. C. Friedlander y col., Science 270:1500-1502 (1995). Los antagonistas de avß3 y aß5 también demostraron inhibir el factor de crecimiento y la angiogénesis inducida por tumor. Ver, por ejemplo, Eliceiri y Cheresh, Current Opinión in Cell Biology, 13:563-568 (2001) . USO DE LA ANGPTL4 Y DE LOS MODULADORES DE ANGPTL4 La invención proporciona una descripción de los usos de la ANGPTL4 o de sus agonistas o antagonistas para modular diversas actividades y- procesos celulares, por ejemplo, la proliferación de hepatocitos y/o adhesión celular y la proliferación de preadipocitos y/o migración celular de preadipocitos. La ANGPTL4 participa en la modulación de los niveles de colesterol y triglicéridos en suero. Además, la ANGPTL4 también puede ser un regulador negativo de las respuestas inflamatorias. Asimismo, los moduladores de ANGPTL4 pueden utilizarse para tratar enfermedades y trastornos relacionados con estas actividades. HÍGADO La ANGPTL4 estimula la proliferación y adhesión de los hepatocitos. El hígado es el principal órgano para la homeostasis del colesterol. Ver también la sección "Homeostasis de lípidos" de la presente. Él hígado es el responsable de la biosintesis y el catabolismo del colesterol. El hígado sintetiza y secreta lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL) . En la circulación, la VLDL se metaboliza para convertirse en lipoproteínas de baja densidad (LDL) , que son las principales lipoproteinas transportadoras de colesterol en el plasma. El hígado funciona como un protector que se interpone entre el tracto digestivo y el resto del cuerpo. Una de las principales funciones hepáticas incluye el consumo, almacenamiento, metabolismo y distribución efectivos a la sangre y bilis de grandes cantidades de sustancias tales como carbohidratos, lípidos, aminoácidos, vitaminas y oligoelementos . Otra de las funciones del hígado es desintoxicar contaminantes xenobióticos, fármacos y metabolitos endógenos mediante los mecanismos de fase I (oxidación/reducción) y fase II (conjugación) . El hígado es el principal órgano de control metabólico del cuerpo humano que comprende miles de lóbulos diminutos (lobuli hepatis) , que son las unidades funcionales del órgano. El tejido hepático posee dos tipos principales y diferenciados de células: las células parenquimales (es decir, hepatocitos) y las células no parenquimales. Las funciones complejas del hígado se ejecutan en gran medida por medio de los hepatocitos, mientras que las células no parenquimales tales como las células de Kupffer, las células de Ito y las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) desempeñan un papel fundamental en el sustento y abastecimiento de suministros a los hepatocitos. Mochida y col., Biochem . Biophy. Res . Comm . 226:176-179 (1996). Además del crecimiento normal durante el desarrollo inicial, el tejido hepático posee la capacidad única de regeneración en la edad adulta. La regeneración del hígado tras la pérdida de tejido hepático es un componente fundamental del proceso de recuperación en respuesta a diversas formas de lesiones hepáticas tales como hepatotoxicidad, viremia, lesión vascular y hepatectomía parcial. Por ejemplo, después de una hepatectomia parcial, el tamaño del hígado generalmente vuelve a su masa original dentro de los seis días, aproximadamente. El proceso de crecimiento y regeneración del hígado incluye la proliferación de hepatocitos y células no parenquimales tales como las células endoteliales sinusoidales. Generalmente, los hepatocitos son los primeros en proliferarse, mientras que otras células hepáticas ingresan a la síntesis de ADN aproximadamente 24 horas después. Michalopoulos y DeFrances, Science 276:60-65 (1997). La invención ^.proporciona métodos para promover el crecimiento hepático y/o proliferación celular de los hepatocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4 o de agonista de la misma. Los efectos de promoción de la invención pueden evaluarse in vitro o in vivo, utilizando métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Drakes y col., J. Immunol . 159:4268 (1997); Omori y col., Hepatology 26:720 (1997); y la Patente Norteamericana No. 5,227,158. Por ejemplo, la proliferación celular se evalúa durante el cultivo utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, entre otros, la medición de la tasa de síntesis de ADN (ver, por ejemplo, Nakamura y col., Biochem . Biophy. Res . Comm . 122:1450 (1984), exclusión del colorante azul de tripán/conteo con hemacitómetro (ver, por ejemplo, Omiri y col., (1997) supra) o flujocitometría (ver, por ejemplo, Drakes (1997) supra) . En determinadas modalidades de la invención, la ANGPTL4 o el agonista de la misma se administran para inducir la adhesión celular, de los hepatocitos. La adhesión de los hepatocitos puede analizarse mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, el ensayo con cristal violeta. Ver también Landegren, U., J. Immunological Methods, 67:379-388 (1984). En una modalidad de la invención, los hepatocitos y otras células hepáticas no parenquimales se aislan de los hígados diana y se resuspenden en un medio de cultivo de tejidos apropiado con ANGPTL4 o agonista de la misma para inducir la adhesión celular. De ser- necesario, las diferentes fracciones celulares pueden separase aún más (por ejemplo, las células parenquimales de las células no parenquimales) mediante centrifugación a diferentes velocidades durante diferentes períodos de tiempo. En otra modalidad, el efecto proliferativo de una ANGPTL4 o agonista de ANGPTL4 en las células hepáticas y el órgano hepático en su totalidad se mide in vivo utilizando, por ejemplo, ensayos histoquimicos de las muestras del tejido hepático. En un aspecto, la proliferación in vivo de las células hepáticas se evalúa mediante la reactividad a un anticuerpo dirigido contra una proteina que se encuentra presente en mayores concentraciones en las células en proliferación que en aquellas que no están en proliferación, tales como el antigeno nuclear de células en proliferación (PCNA o ciclina). Rodgers y col., J. Burn Care Rehabil . 18:381-388 (1997). En otro aspecto, un ensayo inmunohistoquímico con BrdU puede utilizarse tal como se ha descrito en Gerber y col., Development 126:1149-1159 (1999). Debido a su rol fundamental en la vida, la disfunción y los trastornos hepáticos suelen ser debilitantes y mortales para quienes los padecen. Algunas dolencias patológicas crónicas o agudas están asociadas con anormalidades estructurales y/o funcionales del hígado. Éstas incluyen, entre otros, insuficiencia hepática, hepatitis (aguda, crónica o alcohólica) , cirrosis hepática, daño hepático tóxico, daño hepático medicamentoso, encefalopatía hepática, coma hepático o necrosis hepática.

El aumento del crecimiento celular de los hepatocitos puede ser útil para tratar enfermedades hepáticas. Los compuestos y métodos de la invención pueden contribuir a la reparación del daño hepático. Sin restricciones teóricas, se cree que esto puede lograrse, ya sea directa o indirectamente, estimulando el crecimiento y la división de las células hepáticas. Según una modalidad, la invención proporciona métodos para tratar una dolencia hepática patológica en un sujeto mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4 o agonista de ANGPTL4 de la invención. La frase "dolencia hepática patológica" se utiliza indistintamente junto con "trastorno hepático" o "enfermedad hepática" para hacer referencia a cualquier anormalidad hepática estructural y/o funcional. Algunos ejemplos de dolencias hepáticas patológicas incluyen aquellas dolencias asociadas con insuficiencia hepática, hepatitis (aguda, crónica o alcohólica) , cirrosis hepática, daño hepático tóxico, daño hepático medicamentoso, encefalopatía hepática, coma hepático o necrosis hepática. En un aspecto, la invención proporciona métodos para proteger el hígado en aquellos sujetos susceptibles a los factores o dolencias que ocasionan daño hepático. La frase "daño hepático" se utiliza en la presente en el sentido más amplio y hace referencia a cualquier lesión hepática estructural o funcional provocada, directa o indirectamente, por factores internos o externos o sus combinaciones. El daño hepático puede ser el resultado de diversos factores incluyendo, entre otros, exposición a los compuestos hepatotóxicos, exposición a la radiación, lesiones hepáticas mecánicas, predisposición genética, viremia, enfermedad autoinmune, tal como la hepatitis autoinmune crónica, o niveles elevados in vivo de proteínas tales ' como activina y TGF-ß. El daño hepático inducido por los compuestos hepatotóxicos incluye la citotoxicidad directa con reacciones de hipersensibilidad a los fármacos, colestasis y lesiones del endotelio vascular. Diversos agentes biológicos y químicos, ya sean terapéuticos o puramente nocivos, pueden provocar daño hepático, por lo que se consideran hepatotóxicos. Asimismo, los compuestos hepatotóxicos son una de las principales causas de enfermedad hepática crónica, incluyendo hígado adiposo, hepatitis, cirrosis y lesiones hepáticas vasculares y neoplásicas. (Sinclair y col., Textbook of Internal Medicine, 569-575 (1992) (editor: Kelley; editorial: J. B. Lippincott Co.). En la invención se proporcionan métodos para proteger el higado de un sujeto del daño provocado por la exposición a un agente hepatotóxico, incluyendo la administración de ANGPTL4 o su agonista a un sujeto, en los que la ANGPTL4 o su agonista protegen eficazmente al higado. En un aspecto, la ANGPTL4 o su agonista se administra antes de la exposición del sujeto al agente hepatotóxico o simultáneamente y el agente hepatotóxico es un agente terapéutico, como por ejemplo, un agente quimioterapéutico o radioterapéutico para tratar el cáncer. Como tales, los métodos sirven para aumentar la eficacia del tratamiento, ya que posibilitan la tolerancia del sujeto a altas dosis de agentes terapéuticos. En otro aspecto, la ANGPTL o su agonista se administra después de la exposición del sujeto al agente hepatotóxico, pero antes de cualquier daño hepático detectable en el sujeto. Los métodos pueden resultar útiles para el tratamiento de daño hepático provocado por la exposición accidental del sujeto a agentes hepatotóxicos. Los agentes hepatotóxicos pueden provocar daño hepático por citotoxicidad directa del hígado o a través de la producción de metabolitos tóxicos (esta categoría incluye las reacciones de hipersensibilidad que emulan una alergia a los fármacos) ; colestasis, que es una detención en el flujo biliar debido a la obstrucción de los conductos biliares; y lesiones vasculares, como por ejemplo, la enfermedad veno-oclusiva (VOD) , en la que la lesión del endotelio vascular da lugar a la trombosis venosa hepática. La susceptibilidad individual al daño hepático provocado por los agentes hepatotóxicos se ve influenciada por los factores genéticos, la edad, el sexo, el estado nutricional, la exposición a otros fármacos y las enfermedades sistémicas (Sinclair y col., Textbook of Internal Medicine, supra) . Muchos compuestos hepatotóxicos generan inesperadamente daño hepático en una pequeña proporción de receptores. En algunos pacientes, el daño hepático se conoce como una reacción de hipersensibilidad similar a la de una reacción a los fármacos, en la que el paciente presenta fiebre, sarpullido o eosinofilia y una reaparición de los síntomas ante la reexposición al fármaco. ' En otras situaciones, el mecanismo de lesión es desconocido y puede representar un metabolismo anómalo en pacientes susceptibles que posibilita la producción o acumulación de metabolitos hepatotóxicos . Los fármacos que inducen la citotoxicidad mediante ataque químico directo incluyen los siguientes: Anestésicos, tales como enflurano, fluroxeno, halotano y metoxiflurano; neuropsicotrópicos, tales como cocaína, hidracidas, metilfenidato y triciclicos; anticonvulsivantes, tales como fenitoína y ácido valproico; analgésicos, tales como acetaminofeno, clorzoxazona, dantroleno, diclofenac, ibuprofeno, indometacina, salicilato, tolmetina y zoxazolamina; hormonas, tales como acetohexa ida, carbutaraida, glipizida, etahexamida, propiltiouracil, tamoxifeno, dietilestilbestrol; antimicrobiales, tales como anfotericina B, clindamicina, ketoconazol, mebendazol, metronidazol, oxacilina, ácido paraaminosalicílico, penicilina, rifampicina, sulfonamida, tetraciclina y zidovudina; fármacos cardiovasculares, tales como amiodarona, diltiazem, alfa-metildopa, mexiletina, hidrazalina, ácido nicotinico, papaverina, perhexilina, procainamida, quinidina y tocainamida; e i munosupresores y antineoplásicos, tales como asparaginasa, cisplatina, ciclofosfamida, dacarbacina, doxorubicina, fluorouracil, metotrexato, mitramicina, 6-mercaptopurina, nitrosoureas, tamoxifeno, tioguanina y vincristina; y varios fármacos, tales como disulfiram, ion de yodo, oxifenisatina, vitamina A y ácido paraaminobenzoico. Los compuestos hepatotóxicos que producen una reacción de hipersensibilidad en el hígado incluyen los siguientes: fenitoina, ácido paraaminosalicílico, clorpromazina, sulfonamida, estolato de eritromicina, isoniazida, halotano, metildopa y ácido valproico. Los compuestos hepatotóxicos, incluyendo la colestasis, que es una detención en el flujo biliar, pueden adoptar diversas formas. La colestasis centrilobular va acompañada de cambios inflamatorios portales . Se han detectado cambios en los conductos biliares con el uso de algunos fármacos como la eritromicina, mientras que la colestasis canalicular pura es característica de otros fármacos, como por ejemplo, los esteroides anabólicos. La colestasis crónica se ha relacionado con fármacos tales como la metiltestosterona y el estradiol.

Los compuestos hepatotóxicos que inducen la colestasis incluyen los- siguientes: Esteroides anticonceptivos, esteroides androgénicos, esteroides anabólicos, ácido acetilsalicílico, azatioprina, benzodiazepina, ácido quenodesoxicólico, clordiazepoxida, estolato de eritromicina, flufenazina, furosemida, griseofulvina, haloperidol, imip amina, 6-mercaptopurina, metimazol, metotrexato, metildopa, metilenediamina, metiltestosterona, naproxeno, nitrofurantoína, penicilamina, perfenazina, proclorperazina, promazina, tiabendazol, tioridazina, tolbutamida, trimetoprimsulfametoxazol, arsénico, cobre y paraquat. Algunos fármacos, si bien son principalmente colestáticos, también pueden producir hepatotoxicidad y, por lo tanto, la lesión hepática que provocan es mixta. Los fármacos que provocan lesiones hepáticas mixtas incluyen, por ejemplo, los siguientes: clorpromazina, fenilbutazona, halotano, clordiazepóxido, diazepam, alopurinol, fenobarbital, naproxeno, propiltiouracil, cloranfenicol, trimetoprimsulfametoxazol, amrinona, disopiramida, azatioprina, cimetidina y ranitidina. Los fármacos pueden provocar lesiones hepáticas vasculares, incluyendo la trombosis venosa hepática, la oclusión de las vénulas hepáticas o la enfermedad veno-oclusiva (VOD) y la hepatitis peliosis. Además, pueden producirse lesiones, incluyendo la dilatación sinusoidal, la fibrosis perisinusoidal y la esclerosis hepatoportal. La dilatación sinusoidal de la zona media y pericentral se detectó primero como una complicación de la terapia anticonceptiva oral. La hepatitis peliosis es una dolencia que presenta grandes cavidades llenas de sangre que se producen como resultado de la pérdida de glóbulos rojos a través de la barrera endotelial, seguida de fibrosis perisinusoidal. Se ha detectado en pacientes que utilizan anticonceptivos orales, esteroides anabólicos, azatioprina y danazol. La lesión y la oclusión de las vénulas hepáticas centrales también están relacionadas con la ingesta de alcaloides de pirrolizidina, tales como el té de arbusto. La lesión inicial es la necrosis central, junto con una disminución progresiva del calibre venular. Todas estas lesiones sólo pueden ser parcialmente reversibles cuando el fármaco se interrumpe y es posible que se desarrolle una cirrosis . Diversos tipos de neoplasmas hepáticos benignos y malignos pueden ser el resultado de la administración de compuestos hepatotóxicos. El adenoma, una lesión específica de la mujer en edad reproductiva, está relacionado con el uso de esteroides anticonceptivos .y el riesgo aumenta durante su uso. El carcinoma hepatocelular también puede observarse en pacientes que utilizan hormonas androgénicas para el tratamiento de la anemia aplásica o hipopituitarismo . Los compuestos hepatotóxicos que han demostrado ocasionar lesiones hepáticas incluyen los siguientes: esteroides anticonceptivos, alcaloides de pirrolizidina, uretano, azatioprina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, mitomicina, BCNU, vincristina, adriamicina, vitamina E intravenosa, esteroides anabólicos-androgénicos, azatioprina, acetato de medroxiprogesterona, sulfato de estrona, tamoxifeno, arsénicos inorgánicos, dióxido de torio, vitamina A, metotrexato, clorhidrato de metilanfetamina, vitamina A, corticosteroides, dióxido de torio y radioterapia. El daño hepático ocasionado por otros factores generalmente adopta formas similares. El daño hepático, ya sea ocasionado por hepatotoxicidad de un compuesto, radioterapia, predisposición genética, lesiones mecánicas o cualquier combinación de estos y otros factores, puede detectarse mediante diversos métodos. Las pruebas bioquímicas se han utilizado clínicamente durante muchos años como medida estándar de la hepatotoxicidad. Generalmente, la mayoría de l s pruebas bioquímicas se dividen en dos categorías: pruebas que miden marcadores hepáticos específicos, como por ejemplo, el tiempo de coagulación de la protrombina y/o el flujo sanguíneo hepático o pruebas que analizan los marcadores séricos para la detección de necrosis, colestasis, fibrogénesis progresiva o hepatoma (Cornelius, C. en Hepatotoxicology, Meeks y col. eds., pgs. 181-185 (1991)). La importancia de las pruebas radica en su simpleza y en el hecho de que no son invasivas. Las razones para el uso de las enzimas séricas en la evaluación del daño hepático es que estas enzimas, que normalmente se hallan dentro de las células hepáticas, tienen acceso a la circulación general cuando las células hepáticas se lesionan. Los niveles elevados de actividad de las enzimas séricas sugieren necrosis y/o colestasis. Los niveles elevados de los conjugados de bilirrubina sérica sugieren colestasis intra- o extra-hepática. Sin embargo, existen algunas limitaciones para el uso de los niveles de enzimas séricas como único medio para el diagnóstico de la lesión hepática. Los niveles de enzimas séricas pueden aumentar como resultado de la pérdida de células con permeabilidad alterada debido a los efectos sistémicos de un agente y no de la lesión hepática especifica ocasionada por un químico. El examen histopatológico del hígado es el próximo paso lógico en la identificación y cuantificación de la naturaleza y alcance de la lesión hepática. Las enzimas séricas como marcadores de la lesión hepática pueden dividirse en cuatro grupos en base a la especificidad y sensibilidad al daño hepático (Kodavanti y col., Toxicologic Pathology 20(4):556-69 (1992); Kodavanti y col., Archives o f Toxicology 63 (5) : 367-75 (1989)).

Grupo I: Estas enzimas detectan la colestasis hepática más selectivamente cuando aumentan su nivel, como por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP) , 5 ' -nucleotidasa (51- ND) , alfa-glutamil transpeptidasa (G-GT) y leucina aminopeptidasa (LAP). Grupo II: Estas enzimas indican la lesión parenquimal cuando aumentan su nivel, como por ejemplo, aspartato transaminasa (AST), alanina transaminasa (ALT), fructosa-1, 6-difosfato aldolasa (ALD) , lactato dehidrogenasa (LDH) , isocitrato dehidrogenasa (ICDH) , ornitina-carbamoil-transferasa (OCT) , sorbitol dehidrogenasa (SDH) , arginasa y guanasa. Grupo III: Estas enzimas representan lesiones de otros tejidos cuando aumentan su nivel, como por ejemplo, la creatina fosfocinasa (CPK) . Grupo IV: Estas enzimas se encuentran en niveles bajos cuando hay una lesión hepática, como por ejemplo, la colinesterasa (ChE) . Otros marcadores séricos incluyen los niveles del péptido procolágeno tipo III (PIIIP) para evaluar si la fibrogénesis hepática está activa; los niveles de amonio en sangre en las hepatoencefalopatías; los niveles de ligandos en necrosis y hepatoma; los niveles de hialuronato debido al daño celular endotelial hepático; los niveles de alfa-1-fetoproteina (AFP) para detectar el hepatoma; los niveles del antígeno carcinoembrionario (CEA) para detectar la metástasis cancerígena en el hígado; los niveles elevados de anticuerpos contra diversos componentes celulares, como por ejemplo, proteínas mitocondriales, nucleares y específicas de la me brana hepática; y detección de proteínas, como por ejemplo, albúmina, globina, aminoácidos, colesterol y otros lípidos. Asimismo, el análisis bioquímico de diversos minerales, metabolitos y enzimas obtenidos a partir de las biopsias hepáticas puede ser de utilidad en el estudio de defectos bioquímicos específicos en los trastornos hepáticos heredados, adquiridos o inducidos experimentalmente. Las pruebas de función hepática pueden llevarse a cabo para evaluar las lesiones hepáticas. Las pruebas de función hepática incluyen lo siguiente: Grupo I: evaluación de la eliminación hepática de los aniones orgánicos, como por ejemplo, bilirrubina, verde indocianina (ICG) , sulfobromoftaleína (BSP) y ácidos biliares; Grupo II: evaluación del flujo sanguíneo hepático mediante las mediciones de galactosa y eliminación de ICG; y Grupo III: evaluación de la función microsomal hepática mediante la prueba del aliento con aminopirina y la prueba de eliminación de cafeína. Por ejemplo, la bilirrubina sérica puede medirse para confirmar la presencia y gravedad de la ictericia y para determinar el grado de hiperbilirrubina, tal como se observa en la lesión hepática parenquimal. Los niveles elevados de aminotransferasa (transaminasa) reflejan la gravedad del daño hepatocelular activo, mientras que los niveles elevados de fosfata alcalina se hallan con la colestasis y las infiltraciones hepáticas (Isselbacher, K. y Podolsky, D. en Harrisson ' s Principies of Internal Medicine, 12th edition, Wilson y col. eds., 2:1301-1308 (1991)). Los métodos para realizar el análisis de enzimas séricas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Kodavanti y col., supra . Debido a que una lesión hepática amplia puede ocasionar la disminución de los niveles en sangre de albúmina, protrombina, fibrinógeno y demás proteínas sintetizadas exclusivamente por los hepatocitos, los niveles de proteínas pueden medirse para indicar la lesión hepática. • A diferencia de las medidas de las enzimas séricas, los niveles de proteína sérica reflejan la función sintética hepática y no solamente las lesiones celulares (Podolsky, D. Harrison ' s Principies of Internal Medicine, 12a edición, Wilson y col., eds., 2: 1308-1311 (1991)). En diversos pacientes, es posible que sea necesario realizar una tomografia computada (TC) , ultrasonido, escintigrafia o biopsia hepática para determinar la naturaleza de la enfermedad hepática (Isselbacher, K. y Friedman, L. y Needleman, L. en Harrison ' s Principies of Internal Medicine, 12th edition, Wilson y col., eds., 2: 1303-1307 (1991)). La invención proporciona métodos para incrementar el efecto del tratamiento en un sujeto. Los métodos incluyen la administración de ANGPTL4 o su agonista al sujeto de forma eficaz para proteger el hígado del daño ocasionado por un compuesto hepatotóxico antes del tratamiento, o simultáneamente, aumentando asi la tolerancia del sujeto al tratamiento. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos utilizados durante la quimioterapia pueden tener efectos citotóxicos sobre las células hepáticas, limitando asi la dosis y/o duración del agente quimioterapéutico que se le administra al paciente. Si se expone el hígado a una composición que incluya ANGPTL4 o su agonista, los efectos tóxicos pueden prevenirse o reducirse. Como tal, la dosis de agentes quimioterapéuticos puede incrementarse, aumentando así la eficacia del tratamiento contra el cáncer. La ANGPTL4 o su agonista pueden combinarse con otros agentes en los métodos que se describen en la presente. Por ejemplo, diversos factores de crecimiento y citoquinas se han relacionado con la regeneración hepática, más precisamente, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor de crecimiento tumoral- (TGF-) , la interleucina-6 (IL-6) , el factor de necrosis tumoral- (TNF-a) , los factores de crecimiento fibroblástico básico y acídico, CTGF, HB-EGF y la norepinefrina. Fujiwara y col., Hepatol . 18:1443-9 (1993); Baruch y col., J. Hepatol . 23:328-32 (1995); Ito y col., Biochem . Biophys . Res . Commun . 198:25-31 (1994); Suzuma y col., J. Biol . Chem . 275:40725-31 (2000); y Michalopoulos y DeFrances (1997) supra. Éstos pueden combinarse con la ANGPTL4 o su agonista. El HGF, uno de los mitógenos hepáticos más potentes, se identificó por primera vez como un factor capaz de estimular la síntesis de ADN en cultivos de hepatocitos, pero también posee múltiples funciones diferentes en una variedad de células epiteliales. Nakamura y col., Biochem . Biophys . Res . Comm . 122:1450 (1984); y Russell y col., J. Cell . Physiol . 119:183-192 (1984). El HGF también se conoce como el factor de dispersión (SF) , lo que conduce a la designación HGF/SF. Stoker y Perry an J. Cell Sci . 77:209-223 (1985); y Gherardi y Stoker Nature 346:228 (1990). Los efectos biológicos del HGF se transducen mediante un receptor único de tirosina cinasa, Met, que es el producto del protooncogén Met. En el higado, el HGF se expresa en células que no sean hepatocitos, tales como las células de Ito y las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) , mientras que los transcritos Met se expresan totalmente en hepatocitos. Hu y col., Am . J. Pathol . 142:1823-1830 (1993). Después de una lesión hepática química o mecánica, los niveles de HGF aumentan notablemente, lo que conduce a una abundante proliferación de hepatocitos. Horimoto y col., J. Hepatol . 23:174-183 (1995). Los hígados de ratones transgénicos con sobreexpresión hepática especifica de HGF son dos veces más grandes que los hígados de los animales de control y se regeneran mucho más rápido después de una hepatectomía parcial. Sakata y col., (1996) Cell Growth Differ. 7:1513-1523; Shiota y col., (1994) Hepatol . 19:962-972. La angiogénesis es un suceso celular importante en el que las células endoteliales vasculares se proliferan, reducen y reorganizan para formar nuevos vasos a partir de la red vascular preexistente. Existen pruebas convincentes de que el desarrollo de un medio de aporte vascular es fundamental para los procesos de proliferación normales y patológicos (Folkman y Klagsbrun (1987) Science 235:442-447). El hígado en regeneración, en analogía con los tumores de crecimiento rápido, debe sintetizar nuevos estromas y vasos sanguíneos. Ver, por ejemplo, el documento WO03/103581; Yamane y col., Oncogene 9:2683-2690 (1994); Mochida y col., Biochem . Biophy. Res . Comm . 226:176-179 (1996); Ajioka y col., Hepatology 29:396-402 (1999); y Assy y col., J. Hepatol . 30:911-915 (1999). Michalopoulos y DeFrances (1997) supra; Mochida y col., (1996). En una modalidad de la invención, la ANGPTL4 o su agonista se administran en combinación con un agente angiogénico, como por ejemplo, el VEGF o los activadores de los VEGFRs. Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de los vasos sanguíneos, es decir, promueve la angiogénesis, el crecimiento celular endotelial, la estabilidad de los vasos sanguíneos y/o vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos incluyen, entre otros, el VEGF y los miembros de su familia (A, B, C, D y E) , el P1GF, la familia PDGF, la familia de los factores de crecimiento fibroblástico (FGFs) , los ligandos TIE (angiopoietinas), la ANGPTL3, las efrinas, etc. También incluyen factores que aceleran la curación de heridas, tales como la hormona de crecimiento, el factor I de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) , el VIGF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el CTGF y los miembros de su familia, así como también los TGF-a y TGF-ß. Ver, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu. .Rev. Physiol . , 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364 (1999); Tonini y col., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1, que enumera los factores angiogénicos conocidos) ; y Sato Int . J. Clin . Oncol . , 8:200-206 (2003). HOMEOSTASIS DE LIPIDOS La ANGPTL4 interviene en la modulación de otros aspectos de la homeostasis energética, además del hígado. La ANGPTL4 está asociada a la . diferenciación adiposa, el metabolismo sistémico de lípidos y la angiogénesis. Ver, por ejemplo, Yoon y col., Molecular and Cellular Biology, 20(14) : 5343-5349 (2000); Le Jan y col., American Journal of Pathology, 162 (5) : 1521-1528 (2003); y el documento EP 1403367. La expresión de la ANGPTL4 también se induce mediante las proteínas PPAR gama y alfa en el tejido adiposo y mediante la inanición. Ver, por ejemplo, Yoon y col., Mol . Cell . Biol . , 20:5343-5349 (2000); y Kersten y col., J. Biol . Chem . , 275: 28488-28493 (2000). La expresión de la ANGPTL4 experimenta una regulación al alza durante el ayuno, mientras que la abundancia de la proteina en plasma disminuye con una dieta rica en grasas. Además, la ANGPTL4 inhibe la actividad de la lipoproteína lipasa (LPL) . Ver, por ejemplo, el documento EO1403367. La lipoproteina lipasa (LPL) es una glicoproteína secretada que interviene en el metabolismo de las lipoproteinas, ya que hidroliza los triglicéridos presentes en los quilomicrones y en las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLs) para producir ácidos grasos libres y fosfolípidos . Tal como se expone en la presente, los ratones con bloqueo de ANGPT.L4 presentan una disminución de los niveles de colesterol y triglicéridos en suero, en comparación con los miembros de la carnada de tipo natural equiparables por sexo. Véanse las secciones Animales transgénicos con bloqueo y Ejemplo 4 de la presente. Además, la inyección intravenosa de ANGPTL4 aumenta los niveles de lipidos circulantes en plasma en ratones y aumenta los niveles de lipoproteínas de muy baja densidad. Ver, por ejemplo, Yoshida y col., Journal of Lipid Research, 43: 1770-1772 (2002) y ver la Figura 10. En la invención, también se proporcionan métodos para modular los niveles de colesterol o triglicéridos en suero de un sujeto. Por ejemplo, los métodos incluyen la administración de una cantidad efectiva de una composición que contenga ANGPTL4, agonista de ANGPTL4 o antagonista de ANGPTL4 a un sujeto, con lo cual se modulan los niveles de colesterol o triglicéridos en suero de un sujeto. En una modalidad, se administra una ANGPTL4 o su agonista, lo cual deriva en una acumulación de colesterol o triglicéridos en suero. En otra modalidad, se le administra una cantidad efectiva de un antagonista de ANGPTL4 a un sujeto, con lo que se reduce el nivel de al menos un triglicérido, los ácidos grasos libres y/o el colesterol en suero del sujeto, en comparación con el sujeto antes del tratamiento o con un sujeto que no haya recibido tratamiento alguno o que haya recibido un tratamiento reducido. Los niveles medios de colesterol y triglicéridos en suero pueden evaluarse tal como se conoce en la técnica. La ANGPTL4 también puede modular los adipocitos. Por ejemplo, la ANGPTL4 puede estimular la proliferación de preadipocitos o inducir la migración celular de preadipocitos. El tejido adiposo está conformado principalmente por adipocitos, que también desempeñan un papel importante en la homeostasis energética. Los adipocitos sintetizan y almacenan lípidos cuando los nutrientes abundan y liberan ácidos grasos en la circulación cuando se requieren nutrientes. El tejido adiposo blanco (TAB) y el tejido adiposo marrón (TAM) se hallan en los vertebrados. El TAB almacena y libera grasa, dependiendo de las necesidades nutricionales del animal. La grasa almacenada en el TAB se utiliza (1) para aislamiento térmico (por ejemplo, grasa subcutánea), (2) para protección mecánica (por ejemplo, la que circunda los órganos internos) y (3) como fuente de energia. El TAM quema grasas, liberando la energía en forma de calor mediante la termogénesis para mantener la homeotermia, mediante el aumento de la termogénesis en respuesta a temperaturas bajas, o para mantener el balance de energía, mediante el aumento del gasto energético en respuesta a una mayor ingesta calórica. Ver, por ejemplo, Sears, I. B., y col., (1996) Mol . Cell . Biol . 16 (7) : 3410-3419 (1996) . Generalmente, el TAM disminuye con la edad, pero puede reactivarse bajo ciertas condiciones, por ejemplo, exposición prolongada al frió, mantenimiento de una dieta rica en grasas o en presencia de tumores productores de noradrenalina . La adipogénesis implica cambios morfológicos, detención del crecimiento, expresión de enzimas lipogénicas, acumulación de lípidos y sensibilidad adquirida a diversas hormonas, como por ejemplo, la insulina. Se proporcionan métodos que incluyen la estimulación de la proliferación de adipocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4 o su agonista. La proliferación celular puede evaluarse durante el cultivo utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, entre otros, la medición de la tasa de síntesis de ADN (ver, por ejemplo, Nakamura y col., Biochem . Biophy. Res . Comm . 122:1450 (1984), exclusión del colorante azul de tripán/conteo con hemacitómetro (ver, por ejemplo, Omiri y col., (1997) supra) o flujocitometría (ver, por ejemplo, Drakes (1997) supra) . La ANGPTL4 o sus agonistas pueden ser útiles para inducir la proliferación de adipocitos en trastornos en los que la presencia de adipocitos adicionales puede resultar beneficiosa. Éstos incluyen, entre otros, enfermedades de adelgazamiento (como las que se evidencia en distintos tipos de cáncer, en pacientes inmunocomprometidos (por ejemplo, pacientes con SIDA, etc.), en individuos en proceso de envejecimiento, etc.). También se proporcionan métodos que incluyen la inducción de la migración celular de preadipocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4 o su agonista. La ANGPTL4 o sus agonistas también pueden combinarse con otros factores que promueven la diferenciación de adipocitos. Estos factores incluyen, entre otros, IGF-1, insulina, glucocorticoides, 3, 3' , 5-triiodotironina, ácido retinoico, PGF2c(, PGI2, etc. Algunos factores adicionales también pueden combinarse con ANGPTL4 o su agonista. Por ejemplo, la adipogénesis está sujeta al control hormonal y transcripcional. Por ejemplo, la adipogénesis puede estar mediada por una cascada de factores de transcripción incluyendo, por ejemplo, los miembros del receptor activado por proliferadores de peroxisoma (PPAR) , por ejemplo, la familia (PPARa, ?) , la familia (C/EBP) de proteínas de unión a los activadores/CCAAT y la familia de- proteínas (bHLH) con cremallera de leucina con motivo hélice-giro-hélice básico, por ejemplo, ADD1/SREBP1. Ver, por ejemplo, Wu y col., Current Opin . Cell Biol 11:689-694 (1999); Rosen y Spiegelman Annu .Rev Cell Dev Biol 16:145-171 (2000); Gregoire y col., Physiological Reviews 78(3) (1998); y Kim y Spiegelman Genes Devel 10:1096-1107 (1996). La PPAR? actúa en el tejido adiposo y promueve la adipogénesis y el almacenamiento de lípidos. Ver, por ejemplo, Rosen y col., Annu . Rev. Cell Dev. Biol . , 16:145-171 (2000); Rosen y col., Mol . Cell . 4:611-617 (1999); Ren y col., Genes Dev. 16:27-32 (2002); Rosen y col., Genes Dev. , 16:22-26 (2002); y Fukumura y col., Circ. Res . 93:e88-e97 (2003). La PPAR también media el ARNm de la lipoproteína lipasa y los niveles de proteína en los adipocitos y otras células (ver, por ejemplo, Gbaguidi y col., FEBS Letters 512:85-90 (2002)) y las PPARs también intervienen en el cáncer (ver, por ejemplo, Yoshimura y col., Int . J. Cáncer 104:597-602 (2003) y Kubota y col., Cáncer Research 58:3344-52 (1998)). Sin embargo, el crecimiento y/o la formación del tejido adiposo no son generalmente deseados. Por ejemplo, la obesidad generalmente tiene lugar cuando la ingesta de energia excede al gasto energético, lo que deriva en el crecimiento y/o formación de tejido adiposo mediante crecimiento hipertrófico e hiperplásico. El crecimiento hipertrófico es el aumento del tamaño de los adipocitos estimulado por una acumulación de lípidos . El crecimiento hiperplásico es el aumento de la cantidad de adipocitos en el tejido adiposo. La obesidad es una enfermedad crónica típica de la sociedad moderna y está asociada no sólo con un estigma social, sino también con una menor esperanza de vida y diversos problemas médicos que incluyen desarrollo psicológico adverso, trastornos reproductivos, como por ejemplo, la enfermedad ovárica poliquística,- trastornos dermatológicos tales como infecciones, venas varicosas, Acantosis nigricans y eccemas, intolerancia al ejercicio, resistencia a la insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis, osteoartritis, lesión ortopédica, enfermedad tromboembólica, cáncer y enfermedad cardíaca coronaria.

Rissanen y col., British Medical Journal, 301: 835-837 (1990) . El tratamiento de la obesidad implica la utilización de supresores del apetito y demás inductores de pérdida de peso, modificaciones dietarias y otras pautas similares. Sin embargo, al igual que los pacientes con resistencia a la insulina, la mayoría de los pacientes obesos sufre una deficiencia dietaria primaria con el tiempo, con lo cual no logra alcanzar el peso corporal ideal. Los antagonistas de ANGPTL4 pueden utilizarse para tratar la obesidad y/o reducir la masa corporal total de un sujeto, mediante la utilización de una cantidad efectiva de un antagonista de ANGPTL4. La obesidad puede determinarse mediante el IMC y/o una propiedad que determina la obesidad, que son conocidos en la técnica y se describen en la presente. Por ejemplo, el tratamiento de la obesidad generalmente se refiere a la reducción del IMC del mamífero a menos de 25.9 aproximadamente y al mantenimiento de ese peso durante al menos 6 meses. El tratamiento deriva en la reducción de la ingesta calórica o alimenticia del mamífero. Además, el tratamiento en este contexto se remite a evitar que la obesidad tenga lugar si el tratamiento se administra antes de la aparición de la dolencia. El tratamiento incluye la inhibición y/o supresión completa de la lipogénesis en los mamíferos obesos, es decir, la acumulación excesiva de lípidos en las células grasas o la acumulación de células grasas, que es una de las principales características de la obesidad humana y animal, junto con la pérdida de peso corporal total. La reducción de la masa corporal total puede medirse utilizando técnicas estándares (es decir, balanzas) . En una modalidad, se reduce la adiposidad (grasa) de un sujeto. De esta forma, también se pueden tratar las dolencias relacionadas con la obesidad, como por ejemplo, enfermedades cardiovasculares, diabetes, etc. La ANGPTL4 también interviene en la modulación de la leptina, que es una hormona derivada de los adipocitos. La leptina, que está estructuralmente relacionada con las citoquinas, actúa sobre los receptores que pertenecen a la superfamilia de receptores de citoquinas. Ver, por ejemplo, Zhang F, y col., Nature 387:206-209 (1997); Tartaglia L A, y col., Cell 83:1263-1271 (1995); y Lee G -H, y col., Nature 379:632-635 (1996). La leptina es codificada por el gen afectado en la mutación obesa (ob) (Zhang F, y col., Nature 387:206-209 (1997)). La forma larga del receptor de leptina es codificada por el gen afectado en la mutación diabética (db) (Tartaglia L A, y col., Cell 83:1263-1271 (1995)). El receptor de leptina, del cual existen diversas isoformas, se relaciona más estrechamente con las unidades transductoras de señal gpl30 y LIFR que se activan por medio de citoquinas tales como IL-6, LIF y CNTF y receptores de hormonas para el crecimiento de hormonas tales como la eritropoyetina. Ver, por ejemplo, Tartaglia L A, y col., supra . La falta de leptina funcional o de su receptor ocasiona obesidad severa. Ver, por ejemplo, Zhang y col., supra ; Lee y col., supra; y Chen H, y col., Cell 84:491-495 (1996). Se sabe que la • leptina actúa en ciertas regiones del cerebro (por ejemplo, el hipotálamo) para regular la ingesta de alimentos, el gasto energético y la función neuroendocrina. Por ejemplo, se demostró que es un regulador clave en las reservas de grasas, ya que los niveles de leptina aumentan cuando las reservas de grasas aumentan. Ver, por ejemplo, Zhang Y, y col., Nature 372:425-432 (1994); Halaas J L, y col., Science 269:543-546 (1995); Campfield L A, y col., Science 269:546-549 (1995); y Pellymounter M A, y col., Science 269:540-543 (1995). También se descubrió que la leptina es un factor angiogénico. Ver, por ejemplo, Sierra-Honigmann y col., "Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor" Science 281:1683-1686 (1998); y Bouloumie y col., Circ . Res . 83:1059- 1066 (1998) . El crecimiento del tejido adiposo depende de la neovascularización. Ver, por ejemplo, Rupnick y col., PNAS USA 99(16) : 10730-10735 (2002). La leptina también participa en la inmunidad. Ver, por ejemplo, La Cava y Matarese, "The Weight of Leptin in Immunity" Nature Reviews 4:371-379 (2004) . Otras actividades de la leptiná incluyen la modulación de la reproducción, la hematopoyesis y el metabolismo de la glucosa, asi como también la modulación de las respuestas inmunes proinflamatorias. Ver, por ejemplo, Chelab y col., Nature Genetics 12:318-320 (1996); Stroebel y col., Nature Genetics 18:213-215 (1998); Clement y col., Nature 392:398-401 (1998); Cioffi y col., Nature Medicine 2: 585-589 (1996); Gainsford y col., PNAS USA, 93:14564-14568 (1996); Kamohara y col., Nature 389:374-377 (1997); Loffreda y col., FASEB J. 12:57-65 (1998); y Lord y col., Nature 394:897-901 (1998) . La ANGPTL4 experimenta una regulación al alza en ratones ob/ob (bloqueo de leptina) y db/db (bloqueo de los receptores de leptina) . La invención proporciona métodos para modular la leptina y/o las actividades de la leptina mediante la administración de una cantidad efectiva de ANGPTL4, su agonista o antagonista. Los niveles de •leptina pueden evaluarse utilizando técnicas estándares, como por ejemplo, SDS-PAGE, inmunotransferencias, etc. La ANGPTL4, sus agonistas y/o antagonistas pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con las disrupciones de homeostasis de lípidos y metabolismo de grasa que incluyen, entre otros, trastornos metabólicos tales como los trastornos cardíacos, cardiovasculares, endoteliales o angiogénicos, dislipidemia, hipertensión, ateroesclerosis, arteriosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria (CAD) , enfermedad cardíaca coronaria, hipercolesterolemia, insuficiencia cardíaca, derrame cerebral, diabetes, disfunciones, pancreáticas, osteoartritis, cálculos biliares, cáncer, glaucoma, obesidad, así como, también trastornos relacionados tales como adiposidad, trastornos alimenticios, síndromes de adelgazamiento (caquexia), apnea del sueño y otros. Por ejemplo, diversas dolencias humanas se caracterizan por contar con composiciones lipídicas distintivas de tejidos, células, membranas y regiones o estructuras extracelulares. Por ejemplo, en la ateroesclerosis, el colesterol (no esterificado, esterificado y oxidado) y otros lípidos se acumulan en las células y en las áreas extracelulares de la pared arterial y en otros lugares. Estos lípidos poseen efectos biológicos que pueden resultar perjudiciales ya que, por ejemplo, cambian las funciones celulares, incluyendo la expresión génica, y acortan la luz de los vasos, lo que obstruye el flujo sanguíneo. La regulación de los niveles de lípidos proporcionaría diversos beneficios sustanciales. Los efectos de la administración de ANGPTL4, su agonista o antagonista pueden medirse del mismo modo mediante diversos ensayos conocidos en la técnica, incluyendo el análisis de células y tejidos grasos, tales como panículos adiposos, peso corporal total, niveles de triglicéridos en los músculos, el hígado y el tejido adiposo y niveles en ayunas y sin ella de los ácidos grasos libres y triglicéridos en sangre. El antagonista de ANGPTL4 también puede utilizarse para inhibir la migración de los preadipocitos mediante la administración de una cantidad efectiva de tal antagonista. En ciertos aspectos de la invención, es conveniente combinar los agentes terapéuticos ANGPTL4, su agonista o antagonista con otros regímenes terapéuticos. La ANGPTL4 o sus agonistas pueden combinarse con la administración de otros factores tales como aquellos descritos en la presente. En cuanto a los antagonistas, éstos pueden combinarse con la administración de, por ejemplo, agentes terapéuticos para tratar la hiperlipidemia (y las enfermedades asociadas con ésta, tales como obesidad, hipercolesterolemia, ateroesclerosis, enfermedad cardiovascular, diabetes mellitus, hipotiroidismo, síndrome de Cushing) , que incluyen, entre otros, niacina, colestiramina, colestipol, gemfibrozil, clofibrato, estatinas, fluvastatina (Lescol) , pravastatina, simvastatina, calcio de rosuvastatina (ZD-4522) , pitavastatina (NK104), premarina/pravacol (estrógeno/pravastatina) , ezetimibe/simvastatina, superestatina, Lipitor, vacuna CETi-1, anticuerpos contra CETP (proteína de transferencia de los esteres de colesterol) , BMS-201038 (proteína microsomal de transferencia de triglicéridos) , FM-VP4 (inhibidor del transporte del colesterol) , fitostanol, agentes hipoglicémicos, insulina, pramlintida, amilina, AC2993 exendina-4 sintética, Xenical (orlistato) , factor neutrófico ciliar, Axokine, metformina XT, metformina, Glucovance (metformina/gliburida) , dexlipotam (ácido alfalipoico R+/-) , agonistas de PPAR, agonistas del receptor adrenérgico beta-3, inhibidores de lipasa, ATL-962, leptina, anorécticos o supresores del apetito, fentermina, Meridia (sibutramina) , Wellbutrin (bupropiona) , Prociglem (diazoxida) , Tenuate (dietilpropión) , Revia (naltrexona) , Bontril (fendimetrazina) , Zoloft (sertralina), factor neutrófico ciliar (CNTF) , Axokine, antagonistas de los receptores canabinoides CB1, SR 141716, Phytopharm, AOD9604, hGH 177-191, agente de pérdida de peso y sus derivados (por ejemplo, sales, versiones pegiladas, etc.). Véanse también los documentos WO96/04260 (compuestos para el tratamiento de la diabetes tipo II), WO94/01420, W095/17394, W097/36579, WO97./25042, WO99/08501, W099/19313 y W099/16758. Los cambios en el estilo de vida también pueden combinarse con los agentes terapéuticos de la invención. Éstos incluyen, entre otros, dieta, ejercicio, ingesta limitada de colesterol, dejar de fumar, etc. Ver también el documento WO91/19702 (agentes hipoglicémicos e hipocolesterolémicos) . En ciertos aspectos, los antagonistas de ANGPTL4 pueden combinarse con, por ejemplo, citoquinas y otras moléculas proinflamatorias y con diversos factores de crecimiento que inhiben la adipogénesis. Éstos incluyen, entre otros, el factor de •necrosis tumoral alfa (TNF-a), IL-1, PDGF, FGF, EGF, los factores alfa y beta de crecimiento tumoral (TGF-a, -ß) , el factor preadipocito 1 (pref-1) , etc. Ver, por ejemplo, Gregoire y col., Physiological Reviews 78 (3) : 783-809 (1998). Un "agente de pérdida de peso" hace referencia a una molécula útil en el tratamiento o prevención de la obesidad. Las moléculas incluyen, por ejemplo, hormonas (catecolaminas, glucagona, ACTH y la hormona del crecimiento combinada con IGF-1; la proteína Ob; clofibrato; halogenato; cincocaína; clorpromazina; fármacos supresores del apetito que actúan sobre los neurotransmisores noradrenérgicos como el mazindol y los derivados de la fenetilamina, como por ejemplo, fenilpropanolamina, dietilpropión, fentermina, fendimetrazina, benzfetamina, anfetamina, etanfetamina y fenmetrazina; fármacos que actúan sobre los neurotransmisores de serotonina tales como fenfluramina, triptófano, 5-hidroxitriptófano, fluoxetina y sertralina; fármacos centralmente activos como naloxona, neuropéptido-Y, galanina, hormona liberadora de corticotropina y colecistoquinina; un agonista colinérgico como la piridostigmina; un esfingolípido, como lisosfingolípido o derivado del mismo; fármacos termogénicos, como la hormona tiroide; efedrina; agonistas beta adrenérgicos; fármacos que afectan el tracto gastrointestinal tales como los inhibidores de enzimas, como por ejemplo, tetrahidrolipostatina, alimentos no digeribles, como el poliéster de sacarosa, y los inhibidores de vaciado gástrico, como el ácido treoclorocítrico o sus derivados; agonistas beta adrenérgicos como isoproterenol y yohimbina; aminofilina para aumentar los efectos similares a los adrenérgicos ß de la yohimbina, un fármaco bloqueador a2-adrenérgico como la clonidina sola o en combinación con un péptido liberador de la hormona de crecimiento; fármacos que interfieren en la absorción intestinal, como por ejemplo, las biguanidas como metformina y fenformina; agentes que aumentan el volumen de la heces, como la metilcelulosa; bloqueadores metabólicos como el hidroxicitrato; progesterona; agonistas de colecistoguinina; pequeñas moléculas que imitan a los cetoácidos; agonistas de la hormona liberadora de corticotropina; un compuesto inhibidor de prolactina relacionado con el ergot que reduce el almacenamiento de grasa corporal (Patente Norteamericana No. 4,783,469 concedida el 8 de noviembre de 1988) ; agonistas beta-3; bromocriptina; antagonistas de los péptidos opioidos; antagonistas del neuropéptido Y; antagonistas del receptor de glucocorticoides; agonistas de la hormona del crecimiento; y combinaciones de los mismos, etc. OTROS USOS La ANGPTL4 también es un regulador negativo de las respuestas inflamatorias. En ciertas modalidades de la invención, se pueden utilizar las ANGPTL4s o sus agonistas para inhibir la respuesta inmune, por ejemplo, en el caso de respuesta inmune no deseada o perjudicial, por ejemplo, en rechazo de injerto o enfermedades de injerto contra el hospedador. Los antagonistas de ANGPTL4 pueden ser útiles para estimular el sistema inmunológico. Por ejemplo, la estimulación del sistema inmunológico sería deseada en leucemia, otros tipos de cáncer, pacientes inmunocomprometidos (por ejemplo, personas que padecen SIDA), etc. La ANGPTL4 también interviene en el cáncer. Cuando se expresa en células tumorales, la ANGPTL4 provoca la proliferación de estas células, in vitro o in vivo (véanse la solicitud provisional 60/589.782 y el Expediente número P2144R1, presentados simultáneamente junto con la presente solicitud, que se incorporan como referencia para cualquier fin) . Cuando la ANGPTL4 se expresa en tumores que se tratan con un factor anti-angiogénesis, como por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, el tumor retiene la capacidad de crecer. Además, se ha demostrado que experimenta una regulación al alza en tumores renales. Ver, por ejemplo, el expediente número P5032R1; el documento WO 02/07941; y Le Jan y col., American Journal of Pathology, 162 (5) : 1521-1528 (2003) . La ANGPTL4 también es un factor proangiogénico (ver, por ejemplo, S. Le Jan y col., Am . J. Pathol . , 162(5): 1521- 1528 (2003)), que constituye una diana para la terapia contra el cáncer, y es un factor de supervivencia a la apoptosis para las células endoteliales (ver, por ejemplo, Kim y col., Biochem J. 346:603-610 (2000)). Al igual que el VEGF (Shweiki y col., Proc . Nati . Acad. Sci , USA 92:768-772 (1995) ) , la expresión de ANGPTL4 aumenta en respuesta a la hipoxia. Ver, por ejemplo, Le Jan y col., American Journal of Pathology, 162 (5) : 1521-1528 (2003). Los investigadores han encontrado conexiones entre la angiogénesis y la adipogénesis o crecimiento del tejido adiposo. Ver, por ejemplo, Sierra-Honigmann y col., "Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor" Science 281:1683-1686 (1998); Rupnick y col., "Adipose tissue mass can be regulated through the vasculature" Proc. Nat . Acad. Sci . USA, 99 (16) : 10730-10735 (2002); Kolonin y col., "Reversal of obesity by targeted ablation of adipose tissue" Na ture Medicine Advance Online publication, 9 de mayo de 2004: 1-8; y Fukumura y col., "Paracrine Regulation of Angiogenesis and Adipocyte Differentiation During In Vivo Adipogenesis, " Circ . Res . 93:e88-e97 (2003). La ANGPTL4 también puede utilizarse en ensayos de diagnóstico. Pueden utilizarse diversos ensayos y formatos de ensayo para detectar la cantidad de ANGPTL4 en una muestra en relación con una muestra de control. Estos formatos son útiles a su vez para realizar los ensayos de diagnóstico de la invención, que se utilizan para detectar la presencia o el comienzo en un sujeto de los trastornos descritos en la presente.

Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido de la materia para medir los analitos solubles que pueden utilizarse en la práctica de la invención. Los procedimientos incluyen, entre otros, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático (EIA) , como por ejemplo, ELISA, inmunoensayo tipo "sandwich", reacción de precipitina, reacción de difusión en gel, ensayo de inmunodifusión, ensayo de aglutinación, ensayo de fijación del complemento, ensayo inmunoradiométrico, inmunoensayo fluorescente, inmunoensayo de proteína A y ensayo de inmunoelectroforesis . Ver también las Patentes Norteamericanas Nos. 4,845,026 y 5,006,459. ANIMALES TRANSGENICOS CON BLOQUEO DE ANGPTL4 Los ácidos nucleicos que codifican la ANGPTL4 o sus formas modificadas también pueden utilizarse para generar ya sea animales transgénicos o con bloqueo p knock out") , los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y monitorización de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que posee células con un transgen que se insertó en el animal o en un ancestro de éste en una etapa prenatal, es decir, embrionaria. Un transgen es un ADN que se integra al genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. La invención proporciona un ADNc que codifica una ANGPTL4 que puede utilizarse para clonar un ADN genómico que codifica una ANGPTL4, de acuerdo con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que poseen células que ' expresan el ADN que codifica la ANGPTL4. Puede utilizarse cualquier técnica conocida de la materia para insertar un transgen de un gen diana en animales para producir las lineas fundadoras de los animales transgénicos. Las técnicas incluyen, entre otras, microinyección pronuclear (Patentes Norteamericanas Nos. 4,873,191, 4,736,866 y 4,870,009); transferencia génica con mediación de retrovirus en líneas germinales (Van der Putten y col., Proc. Nati . Acad. Sci . , USA, 82:6148-6152 (1985)); mutación génica dirigida en células madre embrionarias (Thompson y col., Cell , 56:313-321 (1989)); inactivación de inserción no específica con vector de trampa génico (Patente Norteamericana No. 6,436,707); electroporación de embriones (Lo, Mol . Cell . Biol . , 3:1803-1814 (1983)); y transferencia génica mediante esperma (Lavitrano y col., Cell , 57 : 111-123 (1989)); etc. Generalmente, se identificarían las células particulares para la incorporación del transgen ANGPTL4 con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica una ANGPTL4 insertado en la línea germinal de un animal en etapa embrionaria pueden utilizarse para examinar el efecto de la expresión incrementada de ADN que codifica los polipéptidos ANGPTL4. Los animales pueden utilizarse como animales de prueba para reactivos que se supone confieren protección contra dolencias patológicas asociadas con su sobreexpresión, por ejemplo. Según esta faceta de la invención, un animal tratado con el reactivo y que tiene una incidencia reducida de la dolencia patológica, en comparación con animales sin tratar que portan el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial para la afección patológica. Alternativamente, los homólogos no humanos de ANGPTL4 pueden utilizarse para construir un animal "con bloqueo" ANGPTL4 que tenga un gen defectuoso o alterado que codifica la proteina - ANGPTL4 como resultado de una recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica la ANGPTL4 y el ADN genómico alterado que codifica la ANGPTL4 insertada en una célula madre embrionaria del animal. En ciertas modalidades, el animal con bloqueo es un mamífero, como por ejemplo, un -roedor como una rata o un ratón. Por ejemplo, el ADNc que codifica la ANGPTL4 puede utilizarse para clonar ADN genómico que codifica la ANGPTL4, de acuerdo con las técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica la ANGPTL4 puede eliminarse o reemplazarse por otro gen, como por ejemplo, un gen que codifique un marcador seleccionable que puede utilizarse para monitorear la integración. Generalmente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueador sin alterar (en los extremos 5' y 3' ) en el vector (ver, por ejemplo, Tho as y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para obtener una descripción de los vectores de recombinación homologa) . Se inserta el vector en una linea de células madre embrionarias (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN insertado se haya recombinado homólogamente con el ADN endógeno (ver, por ejemplo, Li y col., Cell, 69:915 (1992)). A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo, una rata o un ratón) para formar quimeras de agregación (ver, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) , pp. 113-152) . Puede implantarse luego un embrión quimérico en una hembra sustituta pseudopreñada apropiada y hacer que el embrión llegue a término para crear un animal "con bloqueo". La progenie que tiene el ADN recombinado homólogamente en sus células madre puede identificarse mediante técnicas estándares y se utiliza para criar animales cuyas células, en su totalidad, contengan el ADN recombinado homólogamente. Los animales con bloqueo pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra determinadas dolencias patológicas y por el desarrollo de dolencias patológicas debido a la ausencia del gen que codifica la ANGPTL4. Además, los ratones con bloqueo pueden resultar ser grandes fuentes de información para el descubrimiento de la función génica y la utilidad farmacológica de un fármaco diana, como así también para la determinación de los posibles efectos secundarios sobre la diana asociados con una diana determinada. La fisiología y las funciones génicas se preservan muy bien entre ratones y humanos, ya que ambos son mamíferos y tienen una cantidad similar de genes, los cuales se preservan bien entre las especias. Por ejemplo, se documentó recientemente que el 98% de los genes del cromosoma 16 de un ratón tienen un ortólogo humano (Mural y col., Science 296:1661-71 (2002)). Si bien la mutación génica dirigida de células madre embrionarias (ES) ha permitido crear ratones con mutaciones nulas en varios genes asociados a enfermedades humanas, no todas las enfermedades genéticas pueden atribuirse a las mutaciones nulas. Pueden diseñarse modelos de ratones valiosos para las enfermedades humanas mediante la determinación de un método de reemplazo de genes (knock-in) que provocará una disrupción en el locus del ratón e insertará un homólogo humano con mutación. A continuación, pueden llevarse a cabo estudios farmacológicos in vivo dirigidos a la proteina humana (Kitamoto y col., Biochemical and Biophysical Res . Commun . , 222:742-47 (1996)). USOS DE ANIMALES TRANSGENICOS En ciertas modalidades, la invención abarca métodos de monitorización de compuestos para identificar aquellos que imiten la ANGPTL4 (agonistas) o que impidan los efectos de la ANGPTL4 (antagonistas). Los agonistas que imitan una ANGPTL4 serían especialmente valiosos terapéuticamente para las actividades inductoras de ANGPTL4, como por ejemplo, las que se describen en la presente, y en aquellas ocasiones en las que se observe un fenotipo negativo en. base a los descubrimientos realizados con animales transgénicos no humanos cuyo genoma comprenda una disrupción del gen que codifica para la ANGPTL4. Los antagonistas que impiden los efectos de una ANGPTL4 serian especialmente valiosos terapéuticamente para prevenir actividades de ANGPTL4, como por ejemplo, las que se describen en la presente, y en aquellas ocasiones en las que se observa un fenotipo positivo en base a observaciones con el animal transgénico no humano con bloqueo. Los ensayos de monitoreo para los candidatos fármacos antagonistas se diseñan para identificar compuestos que se unen o forman complejos con la ANGPTL4 codificada por los genes identificados en la presente o que interfieran en la interacción del polipéptido codificado con otras proteínas celulares, como por ejemplo, un receptor de ANGPTL4 (por ejemplo, avßs) , una proteína de lipolipasa, etc.

Por ejemplo, puede evaluarse el efecto de un antagonista en la ANGPTL4 mediante la administración de un antagonista 'de ANGPTL4 a un ratón de tipo natural para imitar un fenotipo con bloqueo conocido. De este modo, se podria bloquear inicialmente al gen ANGPTL4 de interés y observar el fenotipo resultante del bloqueo o disrupción del gen ANGPTL4. Posteriormente, puede evaluarse la efectividad de . un antagonista en la ANGPTL4 mediante la administración de un antagonista de ANGPTL4 a un ratón de tipo natural. Un antagonista efectivo deberla imitar el efecto fenotípico que se observó inicialmente en el animal con bloqueo. Del mismo modo, puede evaluarse el efecto de un agonista sobre la ANGPTL4 mediante la administración de un agonista de ANGPTL4 en un ratón transgénico para mejorar un fenotipo negativo con bloqueo conocido. De este modo, se podria bloquear inicialmente al gen ANGPTL4 de interés y observar el fenotipo resultante del bloqueo o disrupción del gen ANGPTL4. Posteriormente, puede evaluarse la efectividad de un agonista en la ANGPTL4 mediante la administración de un agonista de ANGPTL4 a un ratón transgénico. Un agonista efectivo debería mejorar el efecto fenotípico negativo que se observó inicialmente en el animal con bloqueo. En otro ensayo para antagonistas, deberían incubarse las células de mamíferos o una preparación de membrana que expresan el receptor con una ANGPTL4 etiquetada en presencia de un compuesto candidato. En consecuencia, podria medirse la capacidad del compuesto para potenciar o bloquear esta interacción. ANTICUERPOS Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos anti-ANGPTL4 o fragmentos de unión a antígeno de ANGPTL4, anticuerpos anti-avßs u otros anticuerpos descritos en la presente. Los anticuerpos ejemplares incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, fragmentados, multiespecíficos, heteroconjugados, multivalentes, de función efectora, etc. Los anticuerpos pueden ser agonistas o antagonistas. ANTICUERPOS POLICLONALES Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos policlonales. El experto en la técnica conoce los métodos para preparar anticuerpos policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales contra la ANGPTL4 se producen en animales mediante inyecciones subcutáneas (se) o intraperitonales (ip) de uno o múltiples antígenos y adyuvantes relevantes. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunogénico en la especie que se deberá inmunizar, por ejemplo, hemocianina extraída de la lapa californiana (Keyhole Limpet) , albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o R1N=C=NR, en la que R y R1 son grupos alquilos .

^— Los animales se inmunizan contra ANGPTL4, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación, por ejemplo, de 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección intradérmica de la solución en múltiples lugares. Un. mes más tarde, los animales se refuerzan con entre 1/5 y 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples lugares. Entre siete y catorce días más tarde los animales se desangran y el suero se analiza para titular los anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta obtener los niveles adecuados de titulación. Generalmente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo reticulante diferente. Los conjugados también se pueden hacer en cultivos celulares recombinantes como fusiones proteicas. También, los agentes agregantes como el alumbre se utilizan para incrementar la respuesta inmune.

ANTICUERPOS MONOCLONALES Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales utilizando el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o métodos de ADN recombinante (Patente Norteamericana No. 4,816,567). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, como un hámster o un mono macaco, se inmuniza tal como se describió anteriormente en la presente para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteina utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro . A continuación, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como por ejemplo, polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Por lo tanto, las células de hibridoma preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que normalmente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales no poseen la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células con déficit de HGPRT. Las células de mieloma típicas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan altos niveles estables de producción de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre éstas, las lineas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, como aquellas derivadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653, disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984);- Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987) ) . El medio de cultivo- en el cual las células de hibridoma crecen se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra ANGPTL4. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse por la inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) . Los ensayos y técnicas son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal . Biochem . , 107:220 (1980) . Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y pueden cultivarse mediante métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640, Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, los fluidos ascíticos o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, como por ejemplo, la proteina-A-sefarosa, la cromatografía de hidroxilapatita, la electroforesis en gel, la diálisis o la cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse mediante métodos de ADN recombinante, como los que se describen la Patente Norteamericana No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como fuente del ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras, como por ejemplo, las células E. coli, las células COS de monos, las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que no produzcan de cualquier otro modo la proteína de la inmunoglobulina para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá a continuación más detalladamente. En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos generados mediante las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante combinación de cadenas (Marks y col.,, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como también la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col., Nuc . Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993) ) . De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales . El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación de los dominios constantes de la cadena pesada y cadena ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente Norteamericana No. 4,816,567 y Morrison y col., Proc. Nati Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)) o uniendo covalentemente toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido, que no sea inmunoglobulina, a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina . Generalmente, los polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación a antígeno con especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tenga especificidad para otro antígeno diferente.

ANTICUERPOS HUMANOS Y HUMANIZADOS Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos humanos o humanizados. Un anticuerpo humanizado posee uno o más residuos de aminoácidos introducidos desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen por lo general como residuos "importados" que con frecuencia se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente a través del método de Winter y colegas (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de los CDR o las secuencias CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Norteamericana No. 4,816,567), en los que se ha sustituido básicamente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en los que los residuos de CDR, y posiblemente algunos residuos de FR, se sustituyen por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedores. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán en la realización de los anticuerpos humanizados es muy importante para disminuir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado método "del más apto", la secuencia del dominio variable del anticuerpo de un roedor se compara con toda la biblioteca de secuencias conocidas de los dominios variables humanos. Entonces, se acepta la secuencia humana más parecida a la de los roedores como estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)). Otro método utiliza una estructura especifica derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de las cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter y col., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol . , 151:2623 (1993)). Es también importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la afinidad alta para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método general, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de la inmunoglobulina se encuentran generalmente disponibles y son conocidos para los expertos en la técnica. Algunos programas informáticos que ilustran y muestran posibles estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas también se encuentran disponibles. La inspección de estas visualizaciones posibilita el análisis de la posible función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de aquellos residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación para lograr la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo, una mayor afinidad para el antígeno o los antígenos diana. En general, los residuos de CDR influyen directa y sustancialmente en la unión al antigeno. Como alternativa, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos cuando no exista producción de inmunoglobulina endógena alguna. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la cadena pesada del anticuerpo que se une al gen de la región (JH) en ratones con mutaciones quiméricas y en líneas germinales ocasiona la completa inhibición de la producción de los anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes de la inmunoglobulina de la línea germinal humana en los ratones mutantes generará la producción de anticuerpos humanos frente al antígeno presentado. Ver, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno . , 7:33 (1993); y Duchosal y col., Nature 355:258 (1992) . Los anticuerpos humanos también pueden derivar de bibliotecas de representación de imágenes de fagos (Hoogenboom y col., J. Mol . Biol . , 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991); Vaughan y col., Nature Biotech 14:309 (1996)). Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de representación de imágenes de fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol . Biol . , 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol . Biol . , 222:581 (1991)). De acuerdo con esta técnica, los genes de dominios V de los anticuerpos se clonan en pauta de lectura con un gen proteico con revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como el M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia del ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones que se basan en las propiedades funcionales del anticuerpo también conducen a la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita alguna de las propiedades de la célula B. La presentación de fagos puede realizarse en diversos formatos, revisados, por ejemplo, en Johnson, K S y Chiswell, D J, Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993). Es posible utilizar diversas fuentes de segmentos del gen V para la presentación de fagos. • Por ejemplo, Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un conjunto de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatorial de genes V aleatoria derivada de los bazos de ratones inmunizados. Es posible construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y aislar anticuerpos contra un gran conjunto de antígenos (incluyendo los autoantigenos) , por ejemplo, siguiendo fundamentalmente las técnicas descritas por Marks y col., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991) o Griffith y col., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse también las Patentes Norteamericanas Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Las técnicas de Colé y col. y de Boerner y col. también se encuentran disponibles para la preparación de los anticuerpos monoclonales humanos (Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)). Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (véanse las Patentes Norteamericanas Nos. 5,567,610 y 5,229,275).

FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS Los fragmentos de anticuerpos también se incluyen en la invención. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos . Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban a través de la digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente en células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos descritas anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y unirse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otro método, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de los cultivos de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para aquellos profesionales expertos. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv) . Ver el documento WO 93/16185, la Patente Norteamericana No. 5,571,894 y la Patente Norteamericana No. 5,587,458. Fv y scFv son las únicas especies con puntos de combinación intactos que están privadas de regiones constantes. Por lo tanto, son aptas para una unión no específica reducida durante el uso in vivo . Pueden construirse las proteínas de fusión scFv para obtener la fusión de una proteína efectora en el extremo carboxi-terminal o amino-terminal de un scFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra . El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", tal y como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,641,870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecificos o biespecíficos. ANTICUERPOS MULTIESPECIFICOS (POR EJEMPLO, BIESPECIFICOS) Los anticuerpos de la invención también incluyen, por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos, que poseen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes . Mientras que las moléculas por lo general sólo unen dos antigenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs) , los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como los anticuerpos triespecífieos, se engloban en esta expresión cuando se utilizan en la presente. Los ejemplos de BsAbs incluyen aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno celular y el otro dirigido contra una molécula activadora citotóxica, como por ejemplo, anti-Fc?RI/anti-CD15, anti-pl85HER2/Fc?RIII (CD16) , anti-CD3/anti-células B malignas (1D10) , anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-Dl (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/anti-análogo de la hormona que estimula los melanocitos, anti-receptor EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adhesión celular neural (NCAM) /anti-CD3, anti-proteína de unión a folato (FBP) /anti-CD3, anti-antigeno pan asociado al carcinoma (AMOC-31) /anti-CD3; BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno en una célula y otro que se une a una toxina, como por ejemplo, anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/cadena A anti-ricina, anti-interferón-a (IFN-a) /anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-alcaloide de la vinca; BsAbs para la conversión de los profármacos de activación enzimática, como por ejemplo, anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión del profármaco fosfato de mitomicina a alcohol de mitomicina) ; BsAbs para su utilización como agentes fibrinolíticos, como por ejemplo, anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno tisular (tPA) , anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno tipo urocinasa (uPA) ; BsAbs para dirigir los complejos inmunes a los receptores de la superficie celular, tales como anti-lipoproteínas de baja densidad (LDL) /antireceptor Fe (por ejemplo, FcyRI, FcyRII o FcyRIII) ; BsAbs para su utilización en el tratamiento de enfermedades infecciosas, tales como anti-CD3/anti-virus del herpes simplex (HSV) , anti-receptor de célula T, complejo CD3/anti-gripe, anti-Fc?R/anti-VIH; BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo, tales como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacunas; y BsAbs como herramientas de diagnóstico, como por ejemplo, anti- IgG de conejo/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano picante (HRP) /antihormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-ß-galactosidasa. Los ejemplos de anticuerpos triespecificos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Los métodos para realizar anticuerpos biespecificos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una posee la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante compleja y la cantidad de producto que se obtiene es baja. En el documento WO 93/08829 y en Traunecker y col., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares. Según una técnica distinta, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias de domino constante de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible tener presente la primera región constante de cadena pesada (CH1) , que contiene el lugar necesario para la unión de la cadena- ligera, en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan a un organismo hospedador. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptidos en realizaciones en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o de todas las cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos de estas cadenas de polipéptidos con proporciones iguales da como resultado rendimientos altos o cuando las proporciones no tienen particular importancia. En una modalidad de este método, los anticuerpos biespecificos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina hibrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecífica proporciona un método de fácil separación. Este método se revela en el documento WO 94/04690, Para obtener mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Según otro de los métodos descritos en el documento W096/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpos puede modificarse para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo.

En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales largas se crean en la interfase de la segunda molécula del anticuerpo mediante el reemplazo de las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre los productos finales no deseados, tales como los homodímeros . Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando una unión química. Brennan y col., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se separan proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen con la presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con el ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados del tionitrobenzoato (TNB) . uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces en Fab' -tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab' -TNB para formar un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los avances recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli , que se pueden unir químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp . Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecifica F(ab')2 completamente humanizada. Cada uno de los fragmentos Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a la unión química dirigida in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico formado fue capaz de unirse a células con sobreexpresión del receptor VEGF y las células T humanas normales, como así también de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano . También se han descrito diversas técnicas para realizar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se 'redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodimeros de anticuerpos . La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger y col., Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando, por lo tanto, dos lugares de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros Fv de cadena única (scFv) . Ver Gruber y col., J. Immunol . , 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecificos . Tutt y col. J. Immunol . 147: 60 (1991).

ANTICUERPOS HETEROCONJUGADOS Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulantes o "heteroconjugados", que son los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede unir a la avidina o a la biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunológico actúen sobre células no deseadas (Patente Norteamericana No. 4,676,980) y para el tratamiento de la infección de VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden obtenerse utilizando cualquier procedimiento reticulante conveniente. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la técnica y se desvelan en la Patente Norteamericana No. 4,676,980, junto con una serie de técnicas de reticulación. ANTICUERPOS MULTIVALENTES Los anticuerpos de la invención incluyen un anticuerpo multivalente . Un anticuerpo multivalente puede 'internalizarse (y/o catabolizarse) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por medio de una célula que exprese un antigeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son los que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más puntos de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más puntos de unión al antígeno. El dominio preferente de dimerización comprende una región Fc o una región bisagra o consiste en ellas. En esta situación, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más puntos de unión al antigeno amino-terminal a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferente en la presente comprende entre tres y ocho puntos de unión al antígeno aproximadamente, aunque preferentemente cuatro, o consiste en esos puntos . El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptidos (y preferentemente, dos cadenas de polipéptidos) en la que la cadena o las cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables . Por ejemplo, la cadena o las cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1- (XI) n_VD2- (X2) n_Fc, en la que VDl es un primer dominio de variable, VD2 es un segundo dominio de variable, Fc es una cadena de polipéptidos de una región Fc, XI y X2 representan una aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o las cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-CHl-enlazador flexible-VH-CHl- cadena de la región FC o VH-CHl-VH-CHl-cadena de la región Fc. El anticuerpo multivalente de la presente comprende, además, preferentemente, al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente, por ejemplo, puede comprender entre dos y cuatro polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera considerados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, un dominio CL. INGENIERÍA DE LA FUNCIÓN EFECTORA Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora para aumentar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. .Por ejemplo, uno o más residuos de cisteína pueden introducirse en la región Fc, lo que posibilita la formación de un puente disulfuro entre las cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener mayor capacidad de internalización y/o mayor destrucción celular con mediación del complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véanse Carón y col., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B., J. Inmuno 1. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad de actuación también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales, tal como se describe en Wolff y col. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). De manera alternativa, puede diseñarse un anticuerpo con dobles regiones Fc, potenciando así la lisis por complemento y las capacidades ADCC. Ver Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la semivida sérica del anticuerpo, puede incorporarse un epitopo de unión a receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente, un fragmento de anticuerpo) , tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,739,277, por ejemplo. Tal como se utiliza en la presente, el término "epítopo de unión a receptor de rescate" hace referencia a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG) que es responsable de incrementar la semivida sérica in vivo de la molécula IgG. INMUNOCONJUGADOS La invención también se relaciona con los inmunoconjugados que comprendan el anticuerpo descrito en la presente conjugado a un agente citotóxico, como por ejemplo, un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y de la misma) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) . Hay disponibles una variedad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen, entre otros, 212Bi, 131I, 131ln, 90Y y 186Re. Los agentes quimioterapéuticos son útiles en la generación de los inmunoconjugados que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, BCNU, estreptozoicina, vincristina, 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos en conjunto como el complejo LL-E33288, descrita en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,053,394, 5,770,710, esperamicinas (Patente Norteamericana No. 5,877,296), etc. (ver también la definición de agentes quimioterapéuticos en la presente) pueden conjugarse a los anticuerpos anti-ANGPTL4 o anti-angiogénesis o a fragmentos de los mismos. Para la destrucción selectiva de una célula, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Hay disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados anti-ANGPTL4 o fragmentos de los mismos. Los ejemplos incluyen, entre otros, 211At, 131I, 125I, S0Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 1:aIn, isótopos radiactivos de Lu, etc. Cuando se utiliza el conjugado para fines de diagnóstico, puede comprender un átomo radiactivo para gammagrafía, por ejemplo, 99tc o 123I o una etiqueta rotatoria para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como diagnóstico por imágenes obtenidas mediante resonancia magnética, IRM) , como por ejemplo, yodo-123, yodo-131, indio-111, fluorina-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Pueden incorporarse etiquetas radiactivas o de otro tipo al conjugado utilizando las formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores adecuados de aminoácidos que contengan, por ejemplo, fluorina-19 en vez de hidrógeno. Las etiquetas tales como 99tc o 123I, 186Re, a88Re y 11:LIn pueden unirse a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker y col., Biochem . Biophys . Res . Commun . 80: 49-57 (1978) puede utilizarse para incorporar yodo-123. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies in Inmuno se int igraphy (Chatal, CRC Press 1989) , que describe otros métodos detalladamente. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordií, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden realizarse utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales, tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (por ejemplo, el dimetil adipimidato HCL), esteres activos (como disuccinimidil suberato) , aldehidos (como glutaraldehidos) , compuestos bis-azido (por ejemplo, bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (por ejemplo, 2, 6-diisocianato de tolueno) y compuestos bis-activos de fluoruro (como por ejemplo, 1, 5-difluoruro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse tal y como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido al anticuerpo. Ver el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador de fotolabilo, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contenga disulfuro (Chari y col., Cáncer Research 52:127131 (1992); Patente Norteamericana No. 5,208,020) . Alternativamente, es posible realizar una proteína de fusión que contenga el agente anti-ANGPTL4 y el citotóxico mediante, por ejemplo, técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede incluir regiones respectivas que codifiquen la^s dos porciones del conjugado, ya sea que estén adyacentes una a otra o separadas por una región que codifica un péptido de enlace que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En ciertas modalidades, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (-como por ejemplo, estreptavidina) para utilizarlo para encontrar la diana celular, en las que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarador y, posteriormente, de la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . En ciertas modalidades, se forma un inmunoconjugado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN, tal como la desoxirribonucleasa; ADNasa) .

MAITANSINA Y MAITANS NOIDES La invención proporciona un anticuerpo de la invención que se conjuga a una o más moléculas maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (Patente Norteamericana No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producían maitansinoides, como el maitansinol y los esteres de C-3 maitansinol (Patente Norteamericana No. 4,151,042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,137,230; 4,248,870 4,256,746 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016 4,308,268 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929 4,317,821 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866 4,424,219 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533. Por ejemplo, un anticuerpo anti-ANGPTL4 o anti-avßs se conjuga a una molécula maitansinoide sin disminuir notablemente la actividad . biológica del anticuerpo o de la molécula maitansinoide. Una media de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por anticuerpo ha mostrado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, a pesar de que podría esperarse que incluso una molécula toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad en relación con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se describen maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,208,020 y en otras patentes y publicaciones no patentadas a las que se ha hecho referencia anteriormente en la presente. En una modalidad, los maitansinoides son el maitansinol y sus análogos modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, como por ejemplo, distintos esteres del maitansinol. Se conocen muchos grupos de enlace en la técnica para producir conjugados maitansinoides de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, los revelados en la Patente Norteamericana No. 5,208,020 o en la Patente Europea 0 425 235 Bl y en Chari y col., Cáncer Research 52:127-131 (1992). Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuros, grupos de tioéteres, grupos de lábil al ácido, grupos fotolábilos, grupos de lábil peptidasa o grupos de lábil esterasa, tal como se describen en las patentes mencionadas anteriormente. Los grupos disulfuros y los de tioéteres son los preferidos. Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteína bifuncionales, como por ejemplo, N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como el dimetil adipimidato HCL) , esteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaraldehídos) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (por ejemplo, 2, 6-diisocianato de tolueno) y compuestos bis-activos de fluoruro (tales como 1, 5-difluoruro-2, 4-dinitrobenceno) . Los agentes de unión habituales incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carisson y col., Biochem . J. 173:723737 [1978]) y N-succinimidil-4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. El enlazador se puede unir a la molécula maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace con éster se puede formar mediante reacción con un grupo hidroxilo que utilice técnicas de unión convencionales . La reacción puede ocurrir en la posición C-3 con un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 con un grupo hidroxilo. La unión se forma en la posición C-3 del maitansinol o el análogo de maitansinol. CALIQUEAMICINA Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-ANGPTL4 o anti-avßs conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones por debajo de picomolar. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, véanse las Patentes Norteamericanas Nos. 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; 5,877,296 (todas para American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, entre otros, ? ^, c^1, «3^, N-acetil-?i1, PSAG y ?1! (Hinman y col., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode y col., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes Norteamericanas para American Cyanamid mencionadas anteriormente) . Otro fármaco antitumoral al que es posible conjugar el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen puntos intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por ello, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos . OTRAS MODIFICACIONES DE ANTICUERPOS En la presente se consideran otras modificaciones de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a uno o varios polímeros no proteináceos, como por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización -interfacial (como por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Las técnicas se describen en Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed. , (1980). LIPOSOMAS Y NANOPARTICULAS Los polipéptidos de la invención pueden .formularse en liposomas. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención también pueden formularse como inmunoliposornas . Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo, el descrito en Epstein y col., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Nati Acad. Sci . USA, 77:4030 (1980) y las Patentes Norteamericanas Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la Patente Norteamericana No. 5,013,556. Generalmente, la formulación y el uso de los liposomas son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la invención pueden conjugarse a los liposomas tal y como se describe en Martin y col. J. 'Biol . Chem . 257: 286-288 (1982)-, a través de una reacción de intercambio disulfuro. Las nanopartículas o nanocápsulas también pueden utilizarse para atrapar los polipéptidos de la invención. En una modalidad, una nanoparticula. de polialquilcianoacrilato biodegradable puede utilizarse junto con los polipéptidos de la invención. OTROS USOS Los anticuerpos anti-ANGPTL4 poseen diversas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-ANGPTL4 pueden utilizarse en los ensayos de diagnóstico de ANGPTL4 o sus fragmentos, como por ejemplo, para la detección de su expresión en células específicas, tejidos o suero para la detección de enfermedades tales como los trastornos que se describen en la presente, etc. En una modalidad, los anticuerpos de ANGPTL4 se utilizan para seleccionar la población de pacientes para el tratamiento con los métodos proporcionados en la presente. Se utilizan diversas técnicas de ensayos de diagnóstico conocidas en la técnica, tales como ios ensayos de unión competitiva, los ensayos ELISA directos o indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas (Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques , CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158) . Los anticuerpos utilizados en los ensayos de diagnóstico pueden marcarse con una porción detectable. La porción detectable debe ser capaz de producir una señal detectable, ya sea directa o indirectamente. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo como 3H, 1C, 3P, 35S o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminescente como el isotiocianato de fluoresceina, rodamina o luciferina o una enzima como la fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo a la porción detectable, incluyendo los métodos descritos por Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain y col., J. Immunol . Meth . , 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem . And Cytochem . , 30:407 (1982) . Los anticuerpos anti-ANGPTL4 también son de utilidad en la purificación de afinidad de ANGPTL4 a partir de un cultivo celular recombinante o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra ANGPTL4 se inmovilizan en un soporte sólido, como por ejemplo, resina Sephadex o papel de filtro, utilizando métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado entra en contacto con una muestra que contiene el ANGPTL4 que deberá purificarse y, a continuación, el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra, excepto la ANGPTL4, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará la ANGPTL4 del anticuerpo . VECTORES, CÉLULAS HOSPEDADORAS Y MÉTODOS RECOMBINANTES Los polipéptidos de la invención pueden producirse de forma recombinante, utilizando técnicas y materiales de fácil obtención. Para la producción recombinante , de un polipéptido de la invención, como por ejemplo, una ANGPTL4, un anticuerpo anti-ANGPTL4 o un anticuerpo anti-avß5/ el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el polipéptido de la invención se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, el ADN que codifica un anticuerpo monoclonal se aisla y secuencia, por ejemplo, mediante sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. Existen muchos vectores disponibles. Los componentes del vector suelen incluir, entre otros, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcador, un potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. COMPONENTE DE SECUENCIA DE SEÑAL Los polipéptidos de la invención pueden producirse de forma recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es generalmente una secuencia de señal u otro polipéptido con una escisión especifica en el terminal N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada generalmente es aquella que la célula hospedadora reconoce y procesa (es decir, la escindida por una peptidasa de señal) . Para las células hospedadoras procarióticas que no reconocen ni procesan la secuencia de señal del polipéptido nativo, la secuencia de señal se sustituye mediante una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre un grupo de fosfatasa alcalina, penicilasa, lpp o líderes de enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede sustituirse, por ejemplo, por el lider de la invertasa de levadura, el lider del factor a (incluidos los líderes del factor a Saccharomyces y Kluyveromyces) , el líder de la fosfatasa acida, el lider de la glucoamilasa C. albicans o la señal descrita en el documento WO 90/13646. Las secuencias de señal de los mamíferos y los líderes secretores víricos, como por ejemplo, la señal del herpes simplex gD, se encuentran disponibles en la expresión celular de los mamíferos . El ADN para la región del precursor está ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica el polipéptido de la invención.

COMPONENTE DE ORIGEN DE LA REPLICACION Tanto los vectores de expresión como los vectores de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más de las células hospedadoras seleccionadas. Por lo general, en los vectores de clonación, esta secuencia permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedador e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Las secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación a partir -del plásmido pBR322 es apto para la mayoría de las bacterias gramnegativas, el origen plasmídico 2µ es adecuado para la levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos . Por lo general, el componente origen de la replicación no se precisa en los vectores de expresión en mamíferos (el origen SV40 puede utilizarse habitualmente sólo porque contiene el promotor temprano) .

COMPONENTE DEL GEN DE SELECCIÓN Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, como por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) proporcionan nutrientes importantes que no se encuentran disponibles en otros medios complejos, como por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Las células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteina que otorga resistencia al fármaco y, de esta manera, sobreviven a la estrategia de selección. Los ejemplos de la selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de las células encargadas de absorber el ácido nucleico del anticuerpo, tales como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína I y II, genes de metalotioneína en primates, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero a través del cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo del DHFR. Cuando se utiliza el DHFR de tipo natural, una célula hospedadora adecuada es la línea de células de ovario de hámster chino (CHO) con deficiencia de actividad del DHFR. Como alternativa, las células hospedadoras (en especial los hospedadores naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un polipéptido de la invención, la proteína DHFR natural y otro marcador seleccionable, como por ejemplo, la aminoglicosida 3' -fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse mediante crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglicosídico, como por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Ver la Patente Norteamericana No. 4,965,199. Un gen de selección apto para el uso en levadura es el gen trpl, presente en el plásmido de levadura Yrp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, como por ejemplo, ATCC N° 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura con deficiencia de Xeu-2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos portadores del gen Leu-2 . Además, los vectores que derivan del plásmido circular pKDl de 1,6 µm pueden utilizarse para la transformación de las levaduras Kluyveromyces . Alternativamente, se detectó un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis . Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han descubierto vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces . Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991). COMPONENTE PROMOTOR Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y que está operativamente enlazado al ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención. Los promotores aptos para el uso con hospedadores procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de lactosa y beta lactamasa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor en base a triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac. No obstante, otros promotores bacterianos conocidos también son adecuados. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente enlazada al ADN que codifica el polipéptido de la - invención. Se conocen secuencias de promotores para las eucariotas . Prácticamente todos los genes eucarióticos poseen una región rica en AT situada aproximadamente entre las bases 25 y 30 antes del extremo 5' del promotor desde donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada entre las bases 70 y 80 antes del extremo 5' del promotor desde el inicio de la transcripción de diversos genes es la región CNCAAT, en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli (A) al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en los vectores de expresión eucariótica. Entre los ejemplos de secuencias de promotores adecuados para el uso con hospedadores de levadura están los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles con la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones de promotores para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocro o C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión de levadura se describen con más detalle en la Patente Europea 73,657. Los potenciadores de levadura también se usan favorablemente con los promotores de levadura. La transcripción de los polipéptidos de la invención proveniente de los vectores en células hospedadoras de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de genomas de virus tales como el poliomavirus, el virus de la viruela de las aves de corral, el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviario, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40) , de promotores heterólogos de mamíferos, como por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o de promotores de choque térmico, siempre que los promotores sean compatibles con los sistemas de las células hospedadoras.

Los promotores precoces y tardíos del virus SV40 se obtienen fácilmente en forma de un fragmento de restricción del SV40 que también contiene el origen viral de replicación del SV40, El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano s'e obtiene fácilmente en forma de un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en hospedadores de mamíferos gue utilizan el virus del papiloma bovino como vector se da a conocer en la Patente Norteamericana No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente Norteamericana No. 4,601,978. Ver también Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) para la expresión del AD?c del interferón ß humano en células de ratón bajo el control de un promotor timidina cinasa del virus del herpes simplex. Alternativamente, la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous puede utilizarse como promotor. COMPONENTE DEL ELEMENTO POTENCIADOR La trascripción del ADN que codifica un polipéptido de esta invención mediante eucariotas más altas aumenta con frecuencia al insertar la secuencia de un potenciador en el vector. Actualmente, se conocen diversas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína a e insulina) . Por lo general, se utiliza un potenciador procedente de un virus de células eucarióticas. Algunos ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270) , el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) acerca de los elementos de potenciación para activar los promotores eucarióticos. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' ó 3' a la secuencia de codificación del polipéptido, pero por lo general está situado en un sitio 5' desde el promotor. COMPONENTE DE FINALIZACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN Los vectores de expresión utilizados en las células hospedadoras eucarióticas (células de levadura, fúngicas insectiles, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contarán con secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y la estabilización del ARNm. Estas secuencias se encuentran generalmente disponibles desde las regiones no traducidas del extremo 5' , y ocasionalmente el 3' , de los ADN o ADNc virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el polipéptido de la invención. Un componente útil de finalización de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Ver el documento WO94/11026 y el vector de expresión que se da a conocer en el mismo.

SELECCIÓN Y TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS HOSPEDADORAS Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión del ADN que codifica los polipéptidos de la invención en los vectores de la presente son las células procariotas, de levadura o eucariotas más altas descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este fin incluyen eubacterias, como organismos grampositivos o gramnegativos, por ejemplo, enterobacteriáceas tales como Escherichia, como por ejemplo, E. coli , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella , Proteus, Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P revelada en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989) , Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Generalmente, el hospedador de clonación E. coli habitual es el E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas, tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325), también son adecuadas. Estos ejemplos tienen carácter ilustrativo y no restrictivo. Además de las procariotas, los microbios eucarióticos, como los hongos filamentosos o la levadura, también son aptos como hospedadores para la expresión o clonación de los vectores de codificación del polipéptido de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura habitual del pan, es la que más se utiliza de entre los microorganismos hospedadores eucarióticos inferiores. No obstante, diversos géneros, especies y cepas de utilidad en la presente están disponibles, como por ejemplo, 5 Schizosaccharomyces pombe; hospedadores Kluyveromyces tales como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K.. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (Patente Europea 402,226); Pichia ° pastoris (Patente Europea 183,070); Candida ; Trichoderma reesia (Patente Europea 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales -como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como Neurospora , Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores Aspergillus tales como A. 5 nidulans y A . niger. Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de los polipéptidos glicosilados de la invención se derivan de organismos multicelulares. Algunos ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de insectos y 0 plantas. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivas procedentes de hospedadores como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori . Diversas cepas de virus para transfección se encuentran disponibles, como por ejemplo, la variante L-l del NPV Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV Bombyx mori y estos virus pueden utilizarse como el virus de la presente, de acuerdo con la presente invención, específicamente para la transfección de las células de Spodoptera frugiperda . Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden utilizarse como hospedadores. No obstante, el mayor interés se ha centrado en las células de vertebrados y la propagación de éstas en cultivos (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Algunos ejemplos útiles de líneas celulares de mamíferos son la línea CV1 de riñon del mono, transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la linea de riñon embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células caninas de riñon (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñon de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células humanas de pulmón (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065) ; tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRl (Mather y col., Annals N. Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982)); células MRC 5;, células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de polipéptidos de la invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados adecuadamente para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. CULTIVO DE CÉLULAS HOSPEDADORAS Las células hospedadoras utilizadas para producir los polipéptidos de la invención pueden cultivarse en diversos medios. Los medios comercialmente disponibles, como por ejemplo, FIO de Ham (Sigma) , Minimal Essential Médium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Modified Eagle' s Médium de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) , los medios de crecimiento normal para hepatocitos (Cambrex) , los medios de crecimiento para preadipocitos (Cambrex), etc., son aptos para el cultivo de células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth . Enz . 58:44 (1979), Barnes y col., Anal . Biochem.102: 255 (1980), las Patentes Norteamericanas Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ó 5,122,469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la Patente Norteamericana de Referencia No. 30,985 pueden utilizarse como medios de cultivo para las células hospedadoras . Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones (como HEPES) , nucleótidos (tales como, adenosina y timidina) , antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™) , oligoelementos (definidos como los compuestos inorgánicos generalmente presentes en las concentraciones finales del intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energia equivalente. También pueden incluirse otros suplementos necesarios -en las concentraciones adecuadas conocidas por los expertos en la- técnica. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura o el pH, entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para los expertos. PURIFICACIÓN DE POLIPEPTIDOS Cuando se utilizan técnicas recombinantes, un polipéptido de la invención, como por ejemplo, la ANGPTL4, el anticuerpo anti-ANGPTL4 o un anticuerpo anti-avßs pueden producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o pueden secretarse directamente en el medio. Los polipéptidos de la invención pueden recuperarse de un medio de un cultivo o de lisados celulares hospedadores. Si se encuentra unido a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente apropiada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células utilizadas en la expresión de un polipéptído de la invención pueden sufrir una disrupción por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclo de congelación/descongelación, sonicación, disrupción mecánica o agentes de lisado celular. Es posible que se desee purificar un polipéptido de la invención de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silicilico, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio iónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico, DEAE, etc.), cromatoisoenfoque, SDS-PAGE, precipitación en sulfato de amonio, filtrado en gel mediante, por ejemplo, Sephadex G-75, columnas de proteina A sefarosa para eliminar contaminantes tales como IgG y columnas quelantes de metal para unir formas de polipéptidos de la invención marcados con epítopos. Pueden utilizarse diversos métodos de purificación de proteínas y los métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982) . Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del polipéptido particular de la invención producido. Por ejemplo, la composición de un anticuerpo preparado a partir de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Esta última técnica es la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier domino Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas ?l, ?2 o ?4 (Lindmark y col., J. Immunol . Meth . 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la ?3 humana (Guss y col., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que el ligando de afinidad se une es con frecuencia la más agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio poroso controlado o poli (estirenodivinil) benceno, permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. Otras técnicas de purificación de proteínas, como las mencionadas anteriormente, por ejemplo, también están disponibles, dependiendo del anticuerpo que deba recuperarse. Ver también Cárter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992), que describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli . MODIFICACIONES COVALENTES PARA POLIPEPTIDOS DE LA INVENCIÓN Las modificaciones covalentes de un polipéptido de la invención, como por ejemplo, ANGPTL4 o agonista de polipéptido o antagonista de polipéptido se incluyen dentro del campo de la presente invención. Las modificaciones pueden ser síntesis químicas o una escisión enzimática o química del polipéptido, de ser aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del polipéptido se insertan en la molécula mediante residuos de aminoácidos reactivos dirigidos del polipéptido con un agente derivatizante orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos de los terminales N o C o mediante la incorporación de un aminoácido modificado o no natural en la cadena en crecimiento del polipéptido. Ver, por ejemplo, Ellman y col., Meth . Enzym . 202:301-336 (1991); Noren y col., Science 244:182 (1989); y las solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 20030108885 y 20030082575. Los residuos cisteinilos reaccionan generalmente con haloacetatos-a (y las aminas correspondientes) , tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para producir derivados de carboximetil o carboxiamidometil . Los residuos cisteinilos también se derivan mediante reacciones con bromotrifluoroacetona, a-bromo-ß- (5-imidozoil) ácido propiónico, fosfato cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil 2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol . Los residuos histidilos se derivan mediante reacción con dietilpirocarbonato con pH 5.5-7.0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilos . El bromuro para-bromofenacil también es útil y la reacción se lleva a cabo generalmente en cacodilato de sodio 0.1 M con pH 6.0. Los residuos lisinilos y de amino terminales reaccionan con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilos. Otros reactivos para la derivatización de residuos que contengan a-amino incluyen imidoésteres tales como metil picolinimidato, fosfato de piroxidal, piroxidal, cloroborohidrido, ácido trinitrobenzenosulfónico, 0-metilisourea, 2, 4-pentanodiona y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Los residuos arginilos se modifican mediante reacción con uno o más reactivos convencionales, entre los que se encuentran fenilglioxal, 1, 2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como también con los grupos amino epsilon de arginina . La modificación específica de los residuos tirosilos puede realizarse con un interés especial en la inserción de etiquetas espectrales en los residuos mediante la reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Generalmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de tirosilos 0-acetilos y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosilos se yodan utilizando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para utilizarlas en radioinmunoensayos . Los grupos laterales carboxilos (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R' ) , en las que R y R' son diferentes grupos alquilos, tales como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia-4, 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos aspartilos y glutamilos se convierten en residuos asparaginilos y glutaminilos mediante reacción con iones de amonio. Los residuos glutaminilos y asparaginilos se desamidan frecuentemente a los residuos glutamilos y aspartilos correspondientes, respectivamente. Estos residuos se desamidan en condiciones neutrales o básicas. La forma desamidada de estos residuos se encuentra dentro del campo de la presente invención. Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilos de residuos serilos y treonilos, metilación de grupos a-amino de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina (T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilación de amino N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal . Otro tipo de modificación covalente implica el apareamiento químico o enzimático de glicosidas a un polipéptido de la invención. Estos procedimientos tienen la ventaja de que no requieren la producción del polipéptido en una célula hospedadora que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación unida por enlace O o N. Dependiendo del modo de apareamiento utilizado, el azúcar o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilos libres, (c) grupos sulfidrilos libres, tales como los de la cisteina, (d) grupos hidroxilos libres, tales como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos, tales como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit . Rev. Biochem . , pp. 259-306 (1981). La eliminación de cualquier porción de carbohidratos presente en un polipéptido de la invención deberá realizarse química o enzimáticamente. La deglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto de ácido triflurometanosulfónico u otro compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de casi todos o todos los azúcares, excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras que el polipéptido permanece intacto. La deglicosilación química se describe en Hakimuddin y col., Arch . Biochem . Biophys . 259:52 (1987) y en Edge y col., Anal . Biochem . , 118:131 (1981). La escisión enzimática de porciones de carbohidratos, como por ejemplo, en anticuerpos, puede llevarse a cabo mediante el uso de diversas endo- y exo-glicosidasas, tal como se describe en Thotakura y col., Meth . Enzymol . 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de la invención comprende la unión del polipéptido a uno de diversos polímeros no proteináceos, como por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, tal como se establece en la Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Las formulaciones terapéuticas de las moléculas de la invención, ANGPTL4, su agonista o antagonista, utilizadas de acuerdo con la presente invención, se preparan para el almacenamiento mezclando una molécula, por ejemplo, un polipéptido, que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A., ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores no son tóxicos para ios receptores en las dosis y concentraciones utilizadas e incluyen soluciones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio; el cloruro de bencetonio; el fenol; el alcohol butílico o bencílico; los alquil parabenos, como por ejemplo, el metil o el propil parabeno; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol y el m-cresol) ; los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos aproximadamente) ; las proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrófilos, como por ejemplo, la polivinilpirrolidona; los aminoácidos tales como la glicina, la glutamina, la asparragina, la histidina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la mañosa o las dextrinas; agentes quelantes, como por ejemplo, el EDTA; los azúcares, como por ejemplo, la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; los contraiones que forman sales, como por ejemplo, el sodio; los complejos metálicos (por ejemplo, los complejos de la proteina Zn) y/o los tensoactivos no iónicos, como por ejemplo, TWEEN™, PLÜRONICS™ o el polietilenglicol (PEG) . Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (como por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Las técnicas se muestran en Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980). Ver también, Johnson y col., Nat . Med. , 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. , 27:1221-1223 (1993); Hora y col., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design . and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, ed.s, (Plenum Press: Nueva York, 1995), pp. 439-462; documentos WO 97703692, WO 96/40072, WO 96/07399 y la Patente Norteamericana No. 5,654,010. En ciertas modalidades, las formulaciones utilizadas para la administración in vivo son estériles. Esto se logra mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Algunos ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrófobos sólidos con un polipéptido de la invención, cuyas matrices se encuentran en forma de elementos moldeados, como por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli- (2-hidroxietil-metacrilato) o poli- (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Patente Norteamericana No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico e Y etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolimeros degradables de ácido glicólico-ácido láctico, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) , polímero de ácido poliláctico-coglicólico y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el acetato de etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas durante un periodo de más de 100 dias, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que conduce a una pérdida de la actividad biológica y a posibles cambios en la inmunogenicidad. Es posible idear estrategias racionales para su estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante el intercambio tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los residuos sulfidrilos, liofilizando a partir de soluciones acídicas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polimeros específicas. Ver también, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,699,501, que describe las cápsulas cubiertas de polielectrolitos . También se contempla que un agente de la proteina terapéutica de la invención (ANGPTL4, su agonista o antagonista) pueda introducirse en un sujeto mediante terapia génica. La terapia génica hace referencia a la terapia que se lleva a cabo mediante la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células con el fin de obtener la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz para el reemplazo de un gen defectuoso, por ejemplo. La "terapia génica" comprende tanto la terapia génica convencional, en la que se obtiene un efecto duradero mediante un único tratamiento, y la administración de agentes génicos terapéuticos, que involucran la administración única o reiterada de ADN o ARNm terapéuticamente eficaces. Los ADN y ARN antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo . Ver también, por ejemplo, la Ad-ANGPTL4-ARNSi descrita en la presente. Ya se ha demostrado que los oligonucléotidos antisentido cortos pueden importarse hacia las células en las que actúan como inhibidores, a pesar de contar con concentraciones intracelulares bajas a causa de la absorción restringida de la membrana celular. (Zamecnik y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 83:4143-4146 (1986)). Es posible modificar los oligonucléotidos para aumentar su absorción, por ejemplo, sustituyendo los grupos de fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados . Para obtener revisiones generales de los métodos de terapia génica, ver, por ejemplo, Goldspiel y col., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann . Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan y Anderson Ann . Rev. Biochem . 62:191-217 (1993); y May TIBTECH 11:155-215 (1993). Los métodos habitualmente conocidos en la tecnología del ADN recombinante que son de utilidad se describen en Ausubel y col., eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; y Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY. Existen diversas técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían, dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere hacia las células en cultivo in vitro o in vivo hacia las células del hospedador deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico hacia las células de mamíferos in vitro incluyen uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, procedimiento de precipitación con fosfato calcico, etc. Por ejemplo, las técnicas de transferencia génica in vivo incluyen, entre otras, la transfección con vectores virales (generalmente retrovirales) y la transfección mediada por liposoma-proteína de envoltura viral (Dzau y col., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993) ) . Por ejemplo, las técnicas para la transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen la transfección con vectores virales (como por ejemplo, un adenovirus, el- virus del herpes simplex I, un lentivirus, un retrovirus o un virus adeno-asociado) y los sistemas basados en lípidos (los lipidos de utilidad para la transferencia mediada por lipidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Col, por ejemplo) . Algunos ejemplos de la utilización de vectores virales en la terapia génica pueden encontrarse en Clowes y col., J. Clin . Invest . 93:644-651 (1994); Kie y col., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman y Wilson Curr. Opin . in Genetics and Devel . 3:110-114 (1993); Bout y col., Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994); Rosenfeld y col., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld y col., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli y col., J. Clin . Invest . 91:225-234 (1993); y Walsh y col., Proc. Soc. Exp. Biol . Med. 204:289-300 (1993). En algunas situaciones es conveniente proporcionar la fuente del ácido nucleico con un agente que actúe sobre las células dianas, como por ejemplo, un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor de la célula diana, etc. Cuando se utilizen liposomas, pueden utilizarse las proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para actuar y/o facilitar la unión, como por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas con tropismo para un tipo de célula en particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en ciclos y proteínas que actúan en la localización intracelular y mejoran la semivida intracelular. La técnica de endocitosis mediada por un receptor se describe, por ejemplo, en Wu y col., J. Biol . Chem . 262:4429-4432 (1987); y Wagner y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 87:3410-3414 (1990). Para obtener una revisión de los protocolos para la marcación de genes y la terapia génica, ver Anderson y col., Science 256:808-813 (1992) . DOSIFICACIÓN Y ADMINISTRACIÓN Las dosis y las concentraciones farmacológicas deseadas de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden variar, dependiendo del uso particular previsto. La determinación de la dosificación o vía de administración apropiadas es parte de la experiencia de cualquier médico. Los experimentos en animales son una guía confiable para la determinación de las dosis eficaces para el tratamiento en humanos. El ajuste de las dosis eficaces para los organismos interespecíficos puede realizarse siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development , Yacobi y col., Eds., Pergamon Press, Nueva York 1989, pp 42-96. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración en un paciente es aproximadamente de entre 1 µg/kg y 50 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20mg/kg) de ANGPTL4, agonista de ANGPTL4 o antagonista de ANGPTL4, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Cuando se utiliza la administración in vivo de ANGPTL4 o su agonista o antagonista, las dosis normales pueden variar entre 10 n/kg y 100 mg/kg de peso corporal de mamífero o más por día, preferentemente entre 1 µg/kg/dia y 10 mg/kg/dia, dependiendo de la via de administración. La literatura sobre la materia ofrece diversas guías sobre las dosis particulares y los métodos de administración. Véanse, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,657,760; 5,206,344; ó 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos y que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede requerir realizarse de manera distinta a la realizada para otro órgano o tejido. Para administraciones repetidas durante varios días o un periodo más prolongado, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que se logra la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, también pueden ser eficaces otras pautas de dosificación. Generalmente, el médico administrará una o más moléculas de la invención hasta obtener una dosis que brinde el efecto biológico requerido. El progreso del tratamiento de la invención se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. La composición terapéutica de la invención puede administrarse por vía de cualquier medio apto, incluyendo, entre otros, administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, cefalorraquídea, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, la composición terapéutica se administra correctamente mediante infusión de efecto rápido con dosis cada vez menores del anticuerpo. En ciertas modalidades, la composición terapéutica se realiza mediante inyecciones, por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Tal como se describe en la presente, la ANGPTL4, el agonista de ANGPTL4 o el antagonista de ANGPTL4 pueden combinarse con uno o más agentes terapéuticos. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica y la administración consecutiva en cualquier orden. El uso de agentes múltiples también se incluye en la invención. Por ejemplo, una ANGPTL4 o' su agonista pueden administrarse antes, después, de manera alternada o incluso simultáneamente con el agente terapéutico adicional. En una modalidad, existe un periodo en el cual ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas . En ciertas modalidades, el tratamiento de la invención implica la administración combinada de un antagonista de ANGPTL4 y uno o más agentes terapéuticos. La invención también contempla la administración de inhibidores múltiples. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica y la administración consecutiva en cualquier orden. Por ejemplo, un antagonista de ANGPTL4 puede administrarse antes, después, de manera alternada o incluso simultáneamente con el agente terapéutico adicional. En una modalidad, existe un periodo en el cual ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de ANGPTL4, su agonista o antagonista dependerá del tipo de enfermedad que se tratará, tal y como se define anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el agente se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente, y el criterio del médico tratante. El agente se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. En un tratamiento combinado, las composiciones de la invención se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva o sinérgica. Tal como se la utiliza en la presente, una cantidad terapéuticamente efectiva la que genera que la coadministración de ANGPTL4, su agonista o antagonista y uno o más agentes terapéuticos o la administración de una composición de la invención resulte en la reducción o inhibición de la enfermedad o dolencia diana. Una cantidad terapéuticamente sinérgica es la cantidad de ANGPTL4, su agonista o antagonista y uno o más agentes terapéuticos, como por ejemplo, los descritos en la presente, necesaria para reducir o eliminar sinérgicamente o notablemente las dolencias o los síntomas asociados a una enfermedad particular. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN En otra modalidad de la invención, se propone un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para los métodos y el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente . El artículo de fabricación comprende un envase, una etiqueta y un prospecto. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, botes, viales y jeringas. Los envases pueden estar hechos de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El envase tiene una composición que es eficaz en el tratamiento de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja hipodérmica) . Al menos un agente activo de la composición es una ANPGTL4, un agonista de ANGPTL4 o un antagonista de ANGPTL4. La etiqueta del envase o asociada a él indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la dolencia elegida. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo envase que contiene una solución farmacéuticamente aceptable, como por ejemplo, una solución salina fosfatada, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidas otras soluciones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Opcionalmente, se incluyen instrucciones, generalmente escritas, que se relaciona con el uso y la dosificación de ANGPTL4, agonista o antagonista, para un trastorno descrito en la presente. Las instrucciones incluidas en el kit generalmente comprenden información tal como la dosis, el cronograma de dosificación y la vía de administración para el tratamiento del trastorno.

Los envases de ANGPTL4, agonista de ANGPTL4 o antagonista de ANGPTL4 pueden ser unidades de dosis únicas, envases a granel (por ejemplo, envases con dosis múltiples) o unidades de subdosis . DEPOSITO DE MATERIALES El siguiente material se ha depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, Estado Unidos de Norteamérica (ATCC) : El depósito se realizó de conformidad con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y el Reglamento del mismo. Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. La ATCC pondrá a disposición los depósitos según los términos del Tratado de Budapest y sujeto al acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente e ilimitada al público de la progenie del cultivo del depósito una vez concedida la Patente Norteamericana pertinente o una vez que se haga pública cualquier Solicitud de Patente Norteamericana o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a la persona que determine el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas de los Estados Unidos de Norteamérica para que tenga derecho a la misma, en función- del artículo 122 del Título 35 del Código de EE.UU. (35 USC § 122) y las normas del Comisionado de conformidad con lo anterior (incluyendo el articulo 1.14 del Título 37 del Código de Normas Federales (37 CFR § 1.14), con especial referencia a 886 OG 638). El cesionario de la presente solicitud ha acordado que en caso de que el cultivo de los materiales en depósito muera o se pierda o destruya mientras se lo cultiva en condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán de inmediato por otros iguales una vez que se lo notifique al respecto. La disponibilidad de los materiales depositados no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados por la autoridad de cualquier gobierno, de acuerdo con sus leyes de patentes. EJEMPLOS EJEMPLO 1: LA ANGPTL4 INDUCE LA ADHESIÓN CELULAR Y LA PROLIFERACIÓN DE HEPATOCITOS HUMANOS Generación de vectores adenovirales y transducción : Los constructos adenovirales se han construido mediante la clonación de las inserciones de Notl-Notl AD?c en el sitio poliligador de los kits AdEasy de construcción de vectores de Stratagene (LaJolla, CA) , básicamente tal como lo describe el fabricante. Ver, por ejemplo, Hesser y col., Blood, 104(1) .149-158 (2004). Generación de la proteína marcada con etiqueta única hAngptlé (23-406) (PUR9384) , mAngptl (184-410) -IgG (PUR9388) y mAngptl4 (23-410) (PUR9452) : El ' fluido del cultivo celular recolectado se transfirió a la resina anti-flag M2 (Sigma#A-2220) durante la noche. La columna se lavó con PBS hasta alcanzar el valor de referencia y se eludió con citrato de ?a 50 mM con pH 3.0, Este volumen se concentró en Amicon-15 10.000MWCO (Millipore #UFC901024). El último paso fueron la diálisis en HCl 1 mM/H20 Super-Q y la filtración por 0.2 um. Se utilizó un gel SDS-PAGE al 4-20% de tris/glicina (Invitrogen#EC6028box) +/- DTT 10 mM para determinar la pureza. Las proteínas correctas se identificaron mediante espectrometría de masa o secuenciación del extremo ?-terminal de Edman. Generación de la etiqueta hAngptl4 (184-406) -IgG (PUR 9 '441) N- -terminal seguida en serie por una etiqueta hu Fc N-terminal : El fluido del cultivo celular se transfirió a ProSep A (Amersham #113111835) durante la noche. La columna se lavó con PBS hasta alcanzar el valor de referencia. Después del paso de lavado del volumen TMAC 0.5 M/PBS pH 7.5 de la cuarta columna, se procedió al lavado con PBS hasta alcanzar el valor de referencia. El paso de elución se realizó con un tampón de citrato de Na 50 mM pH 3.0, Este volumen se concentró en Amicon-15 10.000MWCO (Millipore #UFC901024) . El último paso fueron la diálisis en HCl 1 mM/H20 Super-Q y la filtración por 0.2 um. Se utilizó un gel SDS-PAGE al 4-20% de tris/glicina (Invitrogen#EC6028box) +/- DTT 10 mM para determinar la pureza. Las proteínas correctas se identificaron mediante espectrometría de masa o secuenciación del extremo N-terminal de Edman. Las proteínas recombinantes también pueden realizarse utilizando técnicas estándares conocidas en la técnica. Generación de Ad -ANGPTL4-ARNSÍ : Se generaron 4 moléculas ANGPTL4-ARNSÍ potenciales (Qiagen) en base a la longitud completa de la secuencia de hANGPTL4. Se seleccionó una molécula ANGPTL4-ARNSÍ en base a la capacidad de ARNSi de inhibir la expresión de hANGPTL4. Se dirigió a la siguiente secuencia diana de ADN GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (SEC ID NO: 3) de ANGPTL4, por ejemplo, r (GGCCAAGCCUGCCCGAAGAUU) (SEC ID NO:4) y/o r (UCUUCGGGCAGGCUUGGCCAC) (SEC ID NO: 5). Se clonó el ARNSi en el vector de transferencia CMVpShuttle- Hl .1 con un promotor de ARN, como por ejemplo, el promotor Hl (GenScript) . El cásete de expresión de ARNSi se clonó para generar un constructo adenoviral AdhANGPTL4-ARNSi. Los constructos adenovirales se han construido mediante la clonación de las inserciones de Notl-Notl AD?c en el sitio poliligador de los kits AdEasy de construcción de vectores de Stratagene (LaJolla, CA) , básicamente tal como lo describe el fabricante. Ver, por ejemplo, Hesser y col., Blood, 104 (1) : 149-158 (2004) , La expresión de A?GPTL4 se verificó mediante un análisis de Western blotting utilizando un anticuerpo anti-FLAG. . Se seleccionó un clon de expresión total y se amplificaron las titulaciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las preparaciones virales se purificaron mediante centrifugación de CsCl y se probaron para revertantes mediante PCR. Las titulaciones virales se determinaron mediante experimentos de lisis celular en 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos vectores, junto con el vector pShuttleCMV-lacZ proporcionado, se recombinaron en bacterias electrocompetentes BJ5183 con el vector AdEasy que no tiene el genoma Ad5 para las regiones El y E3. Se prepararon los stocks virales primarios mediante la transfección transitoria de los plásmidos AdEasy recombinados en las células hospedadoras HEK293. Los stocks de adenovirus se amplificaron aún más en las células HEK293 y se purificaron mediante el procedimiento de purificación en gradiente de CsCl descrito por el fabricante. Las titulaciones en funcionamiento del adenovirus se obtuvieron mediante el ensayo ELISA.

Generación de mANGPTL4 : Se transfectaron provisoriamente 293 células utilizando un constructo con un ácido nucleico que codifica la mANGPTL4 (1-410) de longitud completa. La mANGPTL4 se purificó a partir del sobrenadante y se utilizó para los experimentos. Adhesión celular de hepatocitos : La capacidad de ANGPTL4 de inducir la adhesión celular de los hepatocitos primarios se evaluó en placas de 96 pozos. Las placas se recubrieron con la susecuencia 23-410 de la Angptl4 murina, ° fibronectina o una proteína de control NL4 en diversas concentraciones, por ejemplo, sin recubrimiento, 0.3 µg/ml, 3.0 µg/ml o 30 µg/ml en 60 µl a 4 °C durante la noche. Se eliminó la proteína excedente y se bloquearon los pozos recubiertos con 200 µl de BSA al 3% en PBS a 37°C durante 1 5 hora y media. Después de la incubación, se aspiró el sobrenadante y se lavó una vez con PBS . Se prepararon los hepatocitos humanos primarios y se cultivaron en un medio de crecimiento normal (Cambrex) . Las células se lavaron 3 veces con PBS. Las células se 0 tripsinizaron y después se colocó una solución neutralizadora de tripsina (Clonetics) . A continuación, las células se volvieron a suspender en un medio de crecimiento normal (Cambrex) . Las células se sembraron en un volumen total de 1.5 x 104 células/pozo. Las células se dividieron en suero al 5% 24 horas antes de la dosificación. Las células se incubaron en pozos a 37°C durante 2 horas. Se eliminó el sobrenadante. Se midió la unión celular mediante un ensayo con cristal violeta. Se agregaron 50 µl de solución de formalina al 10% a los pozos y se fijaron durante 10 minutos. Las células se lavaron cuidadosamente una vez con PBS. Se agregaron 50 µl de solución cristal violeta al 0.5% filtrada antes de la utilización. La solución se incubó en los pozos durante 30 minutos o más a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron entre 3 y 5 veces con PBS. Se eliminó el PBS de los pozos y se secaron. La placa de 96 pozos se leyó en un OD550, Ver la Figura 4. El método PNAG de Landegren también puede utilizarse. Ver, Landegren, U. (1984) J. Im unol . Methods 67:379-388. Como se observa en la Figura 4, la mAngptl4 (23-410) recombinante induce la adhesión celular de los hepatocitos primarios in vitro . Proliferación de hepatocitos : Se examinó el efecto de proliferación de la Angptl4 en los hepatocitos humanos primarios. Se prepararon constructos adenovirales de Angptl4 (h) Ad-humana, Angptl4, Ad-LacZ y Ad-Angptl3. Ver, por ejemplo, Hesser y col., Blood 104 (1) : 149-158 (2004). Los hepatocitos humanos primarios se transdujeron, ya sea con una construcción que abarca el constructo del adenovirus-Angptl4 (Ad-Angptl4) , el constructo del adenovirus-LacZ (Ad-LacZ) como control o el constructo de adenovirus-Angptl3 (Ad-Angptl3) en una multiplicidad de infección (MOI) de 10, 100 y 1000, Después de 5 dias de cultivar los hepatocitos en un medio de crecimiento normal (Cambrex) , se contaron las células. Tal como se indica en la Figura 5, la Ad-Angptl4 induce la proliferación de hepatocitos in vitro en una MOI de 10.

EJEMPLO 2 : LA ANGPTL4 INDUCE LA PROLIFERACIÓN DE PRE-ADIPOCITOS Proliferación de preadipocitos : Se evaluó la capacidad de la ANGPTL4 para inducir la proliferación de preadipocitos. Se cultivaron los preadipocitos humanos (viscerales o subcutáneos) en 6 pozos (Falcon, Primaria) mediante la división de las células a una densidad de .000/pozo en un volumen de 3 ml de un medio de crecimiento que contenga suero (medio de crecimiento de preadipocitos (Cambrex) ) . Directamente después de sembrar las células, se agregaron 500 µl de medio condicionante de células COS de células que se habían sido transducidas con constructos adenovirales, como por ejemplo, Ad-LacZ (4), Angptl4 Ad-humana (h) (23-406) (5) o Angptl3 Ad-humana (h) (proteína de longitud completa) (6) o proteínas recombinantes (Angptl4 murina recombinada (23-410) (2) ; IgG-mAngptl4 (184-410) (3) o sin ningún agregado (1) , con las siguientes concentraciones (rmAngptl4 (23-410) (5 µg/ml); IgG-mAngptl4 (5 µg/ml)). Las células se cultivaron durante 5 días a 37 °C en incubador con 5% de C02. Las células se tripsinizaron con 500 µl de 1 x tripsina durante 3 a 5 minutos. Se pipeteó la mezcla celular (0.5 ml) en 9,5 ml de solución amortiguadora isotónica y realizó el conteo en un vial contador de células (considerando el factor de dilución de 20) . Tal como lo indica la Figura 6, Panel A, tanto la Angptl4 murina recombinante (23-410) (2) como los medios condicionantes de células COS con hAngptl4 (23-406) (5) inducen la proliferación visceral de preadipocitos primarios humanos. La Figura 6, Panel B, ilustra que tanto la Angptl4 murina recombinante (23-410) (2) como los medios condicionantes de células COS - con hAngptl4 (23-406) (5) inducen ,1a proliferación subcutánea de preadipocitos primarios humanos.

Análisis FACS de Angptl4 que se une a adipocitos primarios humanos : Se examinó la unión de ANGPTL4 a adipocitos primarios humanos mediante un análisis FACS. Los adipocitos primarios humanos subcutáneos se colocan en placas cultivadas de 10 cm a 500.000 para 1 x 106 células/pozo de muestra. Las células se dividieron el dia anterior al análisis FACS. Se lavaron las células una vez con PBS y a continuación se agregaron 10 ml de EDTA 20 mM en PBS y se incubaron durante 10 a 20 minutos. Pasados los 20 minutos, se rasparon las células de la placa. Se agregaron 10 ml de FCS al 5% en PBS y se transfirieron las células a un tubo Falcon de 50 ml . Las células se centrifugaron a 1,8 K rpm durante 5 minutos a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y las células volvieron a suspenderse en 1 ml de FCS al 5% en PBS. Se distribuyeron 100 µl de suspensión celular en tubos FACS de 5 ml con 1 µg de proteina y se incubaron durante 30 minutos o más en hielo. Se utilizaron las siguientes proteínas: mAngptl4 (23-410), PUR 9452, 0.428 mg/ml (2µl/muestra) ; hAngptl4 (23-406), PUR 9384, +/- 90 µg/ml (10 µl/muestra) ; mAngptl4 (184-410) -IgG, PUR 9388, 8,5 mg/ml (0.2µl/muestra) ; hAngptl4 (184-406) -IgG, PUR 9441, 1,5 mg/ml (1 µl/muestra) ; y control FLAG-BAP (Sigma) 0.1 mg/ml (2 µl/muestra) . Después de la incubación, se llenaron los tubos con 5 ml de FCS al 5% en PBS en hielo. Se centrifugaron las células durante 5 minutos a 2K rpm. Se eliminó el sobrenadante. Se agregó el anticuerpo anti-FLAG-FITC (Sigma) (2 µl de anticuerpo (100 µg/ml de stock) ) y se incubaron en hielo durante 5 minutos o más. La concentración final de anticuerpos fue de 1 µg/ml. Se agregaron 5 ml de FCS al 5% en PBS y se centrifugaron las células durante 5 minutos a 1,8 K rpm a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y las células volvieron a suspenderse en 0.25 ml de PBS con FCS al 5% en hielo. También se puede contar con 0.05% de azida sódica para evitar la internalización del receptor. Se agregó 1 µl de stock diluido 1:50 de yoduro de propidio (Pl) por muestra. Posteriormente, se sometieron las células al análisis FACS.

Tal como lo indica la Figura 7, en estas condiciones, tanto las formas de Angptl4 humana como la rhAngptl4 (23-406) y rhIgG-hAngptl4 (184-406) se unen más eficazmente a los adipocitos subcutáneos, en comparación con el ortólogo murino .

EJEMPLO 3: LA ANGPTL4 INDUCE LA MIGRACIÓN DE LOS PRE-ADIPOCITOS HUMANOS PRIMARIOS SUBCUT NEOS La Angptl4 induce la migración celular: Examinamos la capacidad de la Angptl4 de inducir la migración celular de los preadipocitos humanos primarios subcutáneos. La motilidad celular se midió tal como se describe (ver, por ejemplo, Camenish y col., J. Biol . Chem . , 277 (19) : 17281-17290 (2002)), utilizando inserciones del cultivo de tejido en multipozo HTS con un tamaño de poro de 3 µm (Becton Dickinson, NJ) . La hANGPTL4 (1-406) se diluyó en BSA al 50/50/0.1% para 5, 1 y 0.2 µg/ml. Como control positivo, las membranas se incubaron, ya sea en un medio de cultivo con 10% de suero fetal de ternero (FCS) o con 0. Iµg/ml de PDGF-BB humano recombinante (R&D Systems). Se utilizó PBM/BSA al 0.1% como control negativo. Los adipocitos humanos primarios se lavaron tres veces con PBS, se recolectaron y se suspendieron en aproximadamente 2-5 x 105 células/ml en PBM/BSA al 0.1%. Se probaron las siguientes preparaciones celulares, en las que la ANGPTL4 se indica como NL2.

Las preparaciones se agregaron a la cámara inferior y se incubaron a 37 °C durante 19 horas. Se agregó la suspensión celular (250 µl) a la cámara superior y se permitió que las células migraran durante la noche a 37°C en un incubador de C02 humidificado al 5%. Después de la incubación, se aspiró el medio de la cámara superior e inferior y las células que habían migrado a la superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol (400 µl de MeOH durante 30 minutos a 4 °C; retirar el MeOH y dejar secar al aire durante 40 minutos) y se tiñeron con yoduro YO-PRO-1 (Sondas moleculares, OR) (400 µl de yoduro YO-PRO-1 a 10 µm (1:100 de stock lmM)). Los resultados de la migración se cuantifican según la cantidad promedio de células/campos microscópicos en una magnificación de 20 veces con el programa Openlab (Improvision, MA) . Tal como se observa en la Figura 8, Panel A, la hAngptl4 agregada a los preadipocitos humanos primarios subcutáneos induce a que éstos migren. La Figura 8, Panel B, ilustra la migración en 7 horas. La Figura 8, Panel C, ilustra gráficamente la migración de los adipocitos después de 7 horas de tratamiento sin suero (1), con 10% de suero fetal de ternero (FCS) (2), con PDGF-BB (3), o mANGPTL4 (4). EJEMPLO 4: VARIANTE DE ANGPTL4 Se realizó una variante ANGPTL4 utilizando un kit de mutagénesis estándar (por ejemplo, el kit QuikChange XL de mutagénesis dirigida desde el sitio (Invitrogen, Carlsbad, California)) en base al protocolo del fabricante. Se realizaron dos sustituciones de aminoácidos en la secuencia de ANGPTL4 humana (ver, por ejemplo, la Figura 2) . Las sustituciones se encontraban en las posiciones 162 y 164 (R162G y R164E) , lo que condujo a una sustitución de GKE a partir de RKR. Se aisló la proteína ANGPTL4 (plásmido L280, aa 1-406) o ANGPTL4 variante del sobrenadante de las células COS-7 transfectadas provisoriamente. Para la purificación, se cargó el sobrenadante en una columna de niquel. La proteína se detectó mediante análisis Western blot con un anticuerpo anti-FLAG-HRP. Ver la Figura 3, Panel B. Cuando se realizaron las sustituciones y se comparó la ANGPTL4 variante con una proteína ANGPTL4 nativa o de tipo natural, se detectó, mediante Western blotting, que la ANGPTL4 variante posee un mayor peso molecular que la ANGPTL4 nativa. La sustitución de GKE a partir de RKR en las posiciones 162 y 164 de la proteína nativa evitó la degradación proteolitica de ANGPTL4. EJEMPLO 5: LA ANGPTL4 SE UNE A LA INTEGRINA sVß5 Las angiopoietinas son factores secretados que regulan la angiogénesis al unirse al receptor Tie2 de tirosina cinasa específico de las células endoteliales mediante el dominio fibrinógeno (FBN) -símil. Se descubrió que el dominio de doble espiral presente en la familia de los ligandos secretados es necesario para la oligomerización de los ligandos ( ver, por ejemplo, Procopio y col., J. Biol . Chem . , 274:30196-201(1999)). Del mismo modo que las angiopoietinas, la ANGPTL3 y la ANGPTL4 son glicoproteinas secretadas, cada una de las cuales comprende un péptido de señal en el extremo N-terminal, seguido de un dominio de doble espiral y un dominio FBN-símil en el extremo C-terminal . Se determinó que la ANGPTL3 se une a vß3 mediante el dominio FBN-símil. Se determinó que la ANGPTL4 se- une a la a ßs. Se probó la línea celular 293-1953 que se transfecta de manera estable con la integrina avßs para comprobar la capacidad de unión o adhesión a las placas recubiertas de ANGPTL4. Las células se recolectan y diluyen a 105 células/ml en un medio de cultivo sin suero, PBS, BSA al 1%, CaCl2 1 mM y MgCl2 1 M. Las células se preincubaron con o sin anticuerpos (MAB1961 (Chemicon, Temecula, CA) ) o péptidos anti-integrina avßs durante 15 minutos a 37 °C. La mANGPTL4, BSA o vitronectina recombinantes (1 µg, 3 µg, 10 µg o 30 µg/ml) se utilizaron para cubrir placas de microtitulación de base plana y de 96 pozos Nunc Maxisorp durante la noche a 4 °C y se bloquearon con 200 µl de BSA al 3% en una solución salina de tampón fosfato (PBS), con pH 7.4, durante 1.5 horas a 37°C. Las suspensiones celulares (5 x 104 células/100 µl/pozo (5 x 105/ml) ) se agregaron a los pozos recubiertos y las placas se incubaron a 37 °C durante 5,5 horas. Las células no adherentes se extrajeron mediante lavados con PBS y la unión celular se midió agregando 200 µl de Colorante CyQuant GD (Sondas moleculares (Invitrogen detection Technologies (Carlsbad, California)) (1 : 400) /tampón de lisis celular y se incubaron durante un periodo de entre 2 y 5 minutos. La fluorescencia de la muestra se midió utilizando excitación a 480 nm y máximos de emisión de 520 nm. Puede utilizarse el método PNAG de Lanndegren (ver, por ejemplo, Landegren, J. Immunol . Methods, 67:379-388 (1984)). Las células que expresan avßs mostraron una adhesión a la ANGPTL4 y la vitonectrina (USBiological, Swampscott, Massachussets) , un control positivo, en comparación con BSA, que es un control positivo. Ver la Figura 9, Panel A.

Para determinar si la integrina avßs era suficiente para mediar la adhesión celular de ANGPTL4, se probaron los anticuerpos de bloqueo para determinar su capacidad de inhibir la adhesión en el ensayo de adhesión celular. Se agregaron los anticuerpos de bloqueo funcionales (anticuerpo anti-avßs (MAB1961 (Chemicon, Temecula, C?) ) o anticuerpos anti-hANGPTL4) a células 293-1953 antes de la incubación con los pozos recubiertos de proteína (BSA (1) , vitonectrina (2) o ANGPTL (3) ) . Ver la Figura 9, Panel B. Los anticuerpos anti-avß5 y anti-ANGPTL4 eliminaron la actividad de adhesión celular de ANGPTL4. Se realizaron experimentos adicionales para confirmar que la ANGPTL4 se une a la avß=. Se realizaron experimentos ELISA para detectar si la mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal (1-183) y/o IgG-hANGPTL4-C-terminal (184-406) se une a placas recubiertas con avßs (USBiological, 37K, Swampscott, Massachusetts) . Se incubaron 100 µl/pozo de diluyente de integrina avßs (lµg/ml de tampón de recubrimiento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9.6)) con tampón de recubrimiento a 4 °C durante la noche. Se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (PBS, pH 7.4, Tween-20 al 0.05%) y se agregaron 100 µl/pozo de tampón bloqueante (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se prepararon diversas cantidades (0.0.070µg, 0.22 µg, 0.66 µg, 2 µg, o 6 µg) de muestras, mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal (1-183) y/o IgG-hANGPTL4-C-terminal (184-406) en una solución tamponada de muestra (BSA al 0.5%, Tris 50 mM, pH 7.4, Tween 20 " al 0.05%, MnCl2 lmM, CaCl250 µM, MgCl250 µM, NaCl 100 mM) y se incubaron durante 30 minutos. Se colocaron las muestras en placas (lOOµl/pozo en las cantidades incubadas anteriormente) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas con solución tamponada y se agregaron 100 µl/pozo de peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-Flag (100 ng/ml) (Jackson, #109-036-098) en solución tamponada de ensayo (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%, Tween 20 al 0.05%) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas. Se agregaron 100 µl/pozo de tetrametilbenzidina (TMB) (Moss, Inc.) y se incubaron en las placas hasta que se formara un buen color a temperatura ambiente. Se agregaron 100 µl/pozo de solución de detención (H3P041 M) para detener la reacción. Se leyeron las placas a 630 nm. La mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal e IgG-hANGPTL4-C-terminal se unieron a las placas recubiertas de avßs y sólo n poco más de IgG-hANGPTL4-Cterminal se unió a las placas. Ver la Figura 9, Panel C. Los anticuerpos anti-ANGPTL4 inhiben la unión de la ANGPTL4 a las placas recubiertas con avßs. Se realizaron experimentos ELISA. Se incubaron 100 µl/pozo de diluyente de integrina avßs (lµg/ml de tampón de recubrimiento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9.6)) con tampón de recubrimiento a 4 °C durante la noche. Se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (PBS, pH 7.4, Tween-20 al 0.05%) y se agregaron 100 µl/pozo de tampón bloqueante (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se incubaron entre 0.6 µg y 6,0 µg de muestras, mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal (1-183) y/o IgG-hANGPTL4-C-terminal (183-406) en una solución tamponada de muestra (BSA al 0.5%, Tris 50 mM, pH 7.4, Tween 20 al 0.05%, MnCl2 ImM, CaCl2 50 µM, MgCl2 50 µM, NaCl 100 mM) con anticuerpos anti-ANGPTL4 (1.5 µg) o anti-Dscr (1.5 µg) durante 30 minutos. Después de la incubación, se incubaron 100 µl/pozo de anticuerpo +/- de muestra con las placas durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas con solución tamponada y se agregaron 100 µl/pozo de HRP anti-Flag (100 ng/ml) en solución tamponada de ensayo (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%, Tween 20 al 0.05%) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas y se agregaron 100 µl/pozo de TMB y se incubaron en placas hasta que se formara un color bueno a temperatura ambiente. Se agregaron 100 µl/pozo de solución de detención (H3P0 1 M) para detener la reacción. Se leyeron las placas a 630 nm. Los anticuerpos anti-ANGPTL4 redujeron la cantidad de mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal e IgG-hANGPTL4-C-terminal que se une a las placas recubiertas con avßs, en comparación con anticuerpos anti-Dscr, anticuerpos monoclonales 5G7 o medios. Ver la Figura 9, Panel D. En otro experimento, se demostró la unión de la ANGPTL4 a la integrina avßs mediante ensayos ELISA. En este experimento, se agregaron 80 µl/pozo de hANGPTL4-C-terminal, vitronectina o BSA • (5 µg/ml) a las placas en- solución tamponada de recubrimiento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6) y se incubaron a 4°C durante la noche. Se lavaron las placas (solución tamponáda de lavado: PBS, pH 7.4, Tween-20 al 0.05%) y se agregaron lOOµl/pozo de solución tamponada bloqueante PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%) con cualquier medio, ya sea anticuerpos anti-hANGPTL4 (15 µg/lOOµl) o anticuerpos anti-Dscr (15 µg/100 µl) , y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas y se agregaron 100 µl de avßs (3-9 µg/ml) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavaron las placas y se agregó 1 µg/ml (1:1000) de anticuerpo anti-avßs (Chemicon) (5 µg/100 µl) en solución tamponada de ensayo (PBS, pH 7.4, BSA al 0.5%, Tween 20 al 0.05%) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Después de la incubación, se lavaron las placas y se agregaron 100 µl/pozo de peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-ratones (1:5000) en solución tamponada de ensayo. Se lavaron las placas y se agregaron lOOµl/pozo de tetrametilbenzidina (TMB) y se incubaron a temperatura ambiente hasta que se formara un buen color. La reacción se detuvo con lOOµl/pozo de H3P04 1 M y se leyeron las placas a 630 nm. avßs se una a las placas recubiertas de 5 ANGPTL4 (banda 1) y vitonectrina (banda 4) . Se bloquea la unión con anticuerpos anti-ANGPL4 (banda 2) , pero no cuando se utiliza un anticuerpo anti-Dscr (banda 3) o una proteína de control está recubierta en las placas (banda 5) . Ver la Figura 9, Panel E. ° Por lo tanto, estos descubrimientos demuestran que la ANGPTL4 recombinante se une específicamente a la integrina avßs • . EJEMPLO 6: LA ANGPTL4 AUMENTA LOS TRIGLICÉRIDOS DE UN RATÓN CUANDO SE INYECTA POR VÍA INTRAVENOSA. 5 Se determinaron los niveles de triglicéridos en ratones C57Bl-6e inyectados con diversos constructores de adenovirus que incluyen la ANGPTL4. Se inyectaron los ratones C57B1-6 por via intravenosa en la cola con (1) constructo de adenovirus GFP, (2) constructo de adenovirus 0 Gd, (3) constructo de adenovirus ANGPTL4 (1-406), (4) constructo de adenovirus ANGPTL4 (1-183) , (5) constructo de adenovirus ANGPTL4 (184-406), (6) constructo de adenovirus ANGPTL4 variante, (7) constructo de adenovirus ANGPTL4 (1- 408) o constructo de adenovirus de control. Se midieron los niveles de triglicéridos en (mg/dl) a partir de muestras de sangre de los ratones, siete dias después de la inyección. Tal como se muestra en la Figura 10, el constructo ANGPTL4 N-terminal (1-183) tiene el efecto más pronunciado sobre los niveles de triglicéridos, junto con el constructo ANGPTL4 de longitud completa y el constructo ANGPTL4 variante. EJEMPLO 7 : GENERACIÓN Y ANÁLISIS DE RATONES CON DISRUPCION GENICA DE ANGPTL4 Se produjeron disrupciones en un gen ANGPTL4 por recombinación homologa para investigar el rol de una ANGPTL4. Más específicamente, se crearon ratones transgénicos con disrupción del gen ANGPTL4 (es decir, ratones con blogueo) , ya sea mediante mutación génica dirigida o captura génica . Se confirmaron las mutaciones mediante análisis Southern blot para confirmar la acción correcta sobre los extremos 5' y 30 También se realizó una genotipación específica para el gen mediante PCR genómico para confirmar la pérdida del transcrito nativo endógeno, tal como lo demuestra RT-PCR, utilizando cebadores que se hibridan con los exones que flanquean el lugar de inserción. Se electroporaron los vectores de dirección en células ES de la cepa 129 y se identificaron los clones dirigidos. Los clones dirigidos se microinyectaron en los blastocitos hospedadores para producir quimeras. Se criaron las quimeras con animales C57 para producir heterocigotos Fl. Se entrecruzaron heterocigotos para producir cohortes de F2 tipo natural, heterocigotos y homocigotos, que se utilizaron para el análisis fenotipico. En raras ocasiones, si no se producían suficientes heterocigotos Fl, se criaban los heterocigotos Fl con ratones C57 de tipo natural para producir heterocigotos suficientes como para criar cohortes para analizar un fenotipo. Todos los análisis fenotípicos se realizaron entre las 12 y 16 semanas posteriores al nacimiento. RESULTADOS Generación y análisis de ratones con disrupciones génicas de ANGPTL4 : En estos experimentos con bloqueo, se produce una disrupción del gen que codifica la ANGPTL4 (polipéptido PR0197 designado como ADN 22780-1078; UNQ171) . La información génica específica para estos estudios es la siguiente: el gen del ratón mutado corresponde a la referencia nucléotida: NM_020581. ACCESSION :NM_020581 NID: 10181163; o Mus musculus angiopoietina-símil 4 (Angptl4); referencia de proteína: Q9Z1P8. ACCESSION: Q9SZ1P9 NID; o Mus musculus (ratón) . NG27 (PROTEÍNA HEPÁTICA RELACIONADA CON LA ANGIOPOIETINA) (PROTEÍNA HIPOTÉTICA 425018-1) (PROTEÍNA RELACIONADA A FIBRINÓGENO/ANGIOPOIETINA) (PROTEÍNA ANGIOPOIETINA-SIMIL) (ANGIOPOIETINA-SÍMIL 4) . MOUSESTRNRDB; referencia de la secuencia del gen humano: NM_139314. ACCESSION: NM_139314 NID: 21536397 Homo sapiens 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) ; la secuencia de proteína humana corresponde a la referencia: Q9BY76. ACCESSION: Q9BY78 NID: u Homo sapiens (Humana) . Precursor de proteína relacionada a la angiopoietina (4 de tipo Angiopoietina) (proteína hepática relacionada con fibrinógeno/angiopoietina) (HFARP) (proteína angiopoietina-símil PP1158) . HUMANSTRNRDB . El gen del ratón que sufrió la disrupción es el Angptl4 (4 de tipo angiopoietina) , que es el ortólogo de la ANGPTL4 humana. Los alias incluyen aquellos descritos en la presente y BK89, Bk89, FIAF, NG27, Ng27, HFARP, pendiente de Farp, proteína relacionada con fibrinógeno/angiopoietina, región NG27 mayor de complejo de histocompatibilidad, ARP4, PGAR, PPARG, PP1158, ANGPTL2, factor de adiposidad inducido por el ayuno, proteína PPARG relacionada con la angiopoietina, proteina hepática relacionada con al angiopoietina y proteína hepática relacionada con fibrinógeno/angiopoietina. Las mutaciones del gen dirigidas o capturadas se generaron en células madre (ES) embrionarias derivadas de la cepa 129SvEVBrd. Los ratones quiméricos se criaron con ratones albinos C57BL/6J para generar animales heterocigotos Fl . Estas progenies se entrecruzaron para generar progenies mutantes F2 de tipo natural, tanto heterocigotos como homocigotos. En raras ocasiones, por ejemplo, cuando se obtuvieron muy pocos ratones Fl de la quimera, se cruzaron ratones Fl heterocigotos con ratones híbridos 129SvEVBrd/C57 para producir animales heterocigotos adicionales para entrecruzarlos y generar ratones F2. Se realizó un análisis fenotípico en ratones de esta generación, tal como se describe a continuación. wt het hom Total Observados 18 38 11 67 Esperados 16.75 33.5 16.75 67 Chi-Sq.=2,76 Significación=0.26294 (hom/n)=0.16 Tamaño medio de camada=7 La inserción retroviral (OST) tuvo lugar al provocar la disrupción del gen entre los éxodos de codificación 2 y 3 (NCBl registro NM_020581.1) . La expresión de tipo natural del gen diana se detectó en células madre (ES) embrionarias y en todas las muestras de tejido de adultos probadas mediante RT-PCT, con excepción de la cola. El análisis RT-PCR reveló que el transcrito estaba ausente en el ratón (-/-) analizado. 1. ANÁLISIS FENOTIPICO Resumen fenotípico general : La mutación del gen que codifica el ortólogo de la angiopoietina-símil 4 humana (ANGPTL4) dio como resultado la reducción de los niveles de colesterol y triglicéridos de los ratones (-/-) . Además, los ratones (-/-) machos presentaron una mayor tolerancia a la glucosa en la Prueba de tolerancia a la glucosa. Los ratones (-/-) mutantes también presentaron anormalidades inmunológicas, incluyendo el aumento de los niveles medios de IgM y los conteos medios de neutrófilos absolutos, en comparación con los miembros de la carnada (+/+) . El transcrito se ausentó por RT-PCR. Análisis fenotípico - cardiovascular/Química metabolismo-sangre : En el área de la biología cardiovascular, las pruebas fenotípicas se realizaron para identificar dianas potenciales para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, endoteliales o angiogénicos, tales como hipertensión, aterosclerosis, insuficiencia cardiaca, derrame cerebral, diversas enfermedades de la arteria coronaria, dislipidemias tales como colesterol alto (hipercolesterolemia) y niveles elevados de triglicéridos en suero (hipertrigliceridemia) , cáncer y/u obesidad. Las pruebas fenotípicas incluyen la medición de colesterol y triglicéridos en suero. Además, los análisis fenotipicos de la química sanguínea también incluyen pruebas de tolerancia a la glucosa para medir la sensibilidad a la insulina y los cambios en el metabolismo de la glucosa. Los resultados anormales de pruebas de tolerancia a la glucosa indican, entre otros, los siguientes trastornos o dolencias: Diabetes Tipo 1 y Tipo 2, Síndrome X.

Las pruebas fenotípicas en esta instancia incluyeron la medición del colesterol y los triglicéridos en suero.

LIPIDOS EN SANGRE Procedimiento : Se utilizó una cohorte de 4 machos tipo natural y 8 homocigotos en estos ensayos. Se midieron los niveles medios de colesterol y triglicéridos en suero y se compararon con miembros de la camada (+/+) equiparables por sexo. Se realizó una prueba concurrente de tolerancia a la glucosa, ya que esta prueba es el estándar para definir un trastorno de homeostasis de glucosa en mamíferos. Se realizó la prueba de tolerancia a la glucosa utilizando un medidor de glucosa Lifescan. Se les inyectó IP a los animales IP a 2g/kg con D-glucosa administrada como una solución al 20% y se midieron los niveles de glucosa en sangre a 0, 30, 60 y 90 minutos después de la inyección. Se utilizó COBAS Integra 400 (Roche) para realizar las pruebas de química sanguínea en ratones. Resultados : Los ratones machos y hembras homocigotos mutantes mostraron niveles medios de triglicéridos notablemente menores, en comparación con los miembros de la camada de tipo natural equiparables por sexo y las medias históricas. Estos mutantes mostraron además una reducción de los niveles medios de colesterol en suero, en comparación con miembros de la camada de tipo natural. Simultáneamente, los ratones (-/-) machos exhibieron una mayor tolerancia a la glucosa en presencia de glucosa en ayunas en los 3 intervalos que se probaron, en comparación con miembros de la camada (+/+) equiparables por sexo y las medias históricas, mientras que los ratones (+/+) hembras mostraron una reducción de los niveles medios de glucosa en suero. En resumen, estos ratones con bloqueo exhibieron un fenotipo positivo con respecto al metabolismo de lípidos y/o glucosa. De este modo, los ratones con deficiencia del gen ANGPTL4 pueden servir como modelos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Los antagonistas de ANGPTL4 o su gen codificador cumplirían un papel muy importante en la regulación de los lípidos en sangre y, especialmente, en el mantenimiento del metabolismo normal de colesterol y triglicéridos. Los inhibidores o antagonistas de ANGPTL4 serían útiles en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares asociadas a la lipidemia, tales como: hipertensión, aterosclerosis, insuficiencia cardíaca, derrame cerebral, diversas enfermedades de la arteria coronaria, obesidad y/o diabetes. Análisis fenotípico de inmunología : Las enfermedades inmunorelacionadas e inflamatorias son las manifestaciones o consecuencias de vías biológicas bastante complejas y a menudo múltiples e interrelacionadas que, en la fisiología normal, son muy importantes para responder a heridas o lesiones, iniciar la reparación de heridas y establecer una defensa innata y adquirida contra organismos extraños. Las enfermedades o patologías se desarrollan cuando estas vías fisiológicas normales provocan más heridas, ya sea como relación directa de la intensidad de la respuesta, como consecuencia de la regulación anormal o la estimulación excesiva o como una reacción al organismo o una combinación de éstas. Si bien la génesis de estas enfermedades a menudo implican vías de pasos múltiples y sistemas/vías biológicos múltiples y diferentes, la intervención en los puntos importantes en una o más de estas vías puede tener un efecto mejorador o terapéutico. La intervención terapéutica puede llevarse a cabo mediante antagonismo de un proceso/vía perjudicial o estimulación de un proceso/vía benéfico. Los linfocitos T (células T) son un componente importante de la respuesta inmune de un mamífero. Las células T reconocen antígenos que están asociados con una automolécula codificada por genes dentro del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) . Los antigenos pueden mostrarse junto con moléculas de MHC en la superficie de las células que presentan antígenos, células infectadas con virus, células cancerígenas, injertos, etc. El sistema de células T elimina estas células alteradas que representan una amenaza para la salud del animal hospeador. Las células T incluyen células T auxiliares y células T citotóxicas. Las células T auxiliares se proliferan extensivamente después del reconocimiento de un complejo antígeno-MHC en una célula que presenta antigeno. Las células T auxiliares también secretan una variedad de citoquinas, como por ejemplo, las linfoquinas, que cumplen un rol vital en la activación de células B, células T citotóxicas y una variedad de otras células que participan en la respuesta inmune. En muchas respuestas inmunes, las células inflamatorias se infiltran en el lugar de la herida o infección. Las células migratorias pueden ser neutrofílicas, eosinofílicas, monocíticas o linfocíticas, como puede determinarse mediante el examen histológico de los tejidos afectados. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc. Muchas enfermedades inmunorrelacionadas son conocidas y han sido estudiadas extensivamente. Las enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias autoinmunes (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad renal autoinmune, enfermedades hepatobiliares, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) , psoriasis y asma) , enfermedades inflamatorias que no sean autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades de inmunodeficiencia, neoplasia y rechazo de injerto, etc. En el área de la inmunología, se identificaron las dianas para el tratamiento de la inflamación y los trastornos inflamatorios. En el área de inmunología, se han identificado las dianas en la presente para el tratamiento de inflamación y trastornos inflamatorios. En una instancia, las enfermedades inmunorrelacionadas podrían tratarse mediante la supresión de la respuesta inmune. La utilización de anticuerpos que inhiben las moléculas que tienen actividad de estimulación inmune sería beneficiosa en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias . Las moléculas que inhiben la respuesta inmune pueden utilizarse (proteínas directamente o mediante el uso de agonistas de • anticuerpo) para inhibir la respuesta inmune y así mejorar la enfermedad inmunorrelacionada . Se realizó la siguiente prueba: Ensayo isotópico de inmunoglobulina en suero : Se realizó un Ensayo isotópico de inmunoglobulina en suero utilizando un kit Cytometric Bead Array (CBA) . Se utilizó este ensayo para identificar rápidamente los isótopos de cadena pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal de ratón en una única muestra. Los valores expresados son "unidades de fluorescencia relativas" y se basan en la detección de cadenas de luz kappa. Cualquier valor <6 no es significativo .

Resultados : El ensayo isotópico de inmunoglobulina en suero reveló que los ratones (-/-) mutantes exhibieron un aumento de las inmunoglobulinas IgM en suero, en comparación con miembros de la camada (+/+) equiparables por sexo. Las inmunoglobulinas IgM son las primeras en producirse en una respuesta inmune humoral para la neutralización de toxinas bacterianas y son particularmente importantes en la activación del sistema de complemento. - Del mismo modo, las inmunoglobulinas IgG tienen efectos neutralizantes y, en menor medida, son importantes para la activación del sistema de complemento-. Además, los ratones (-/-) exhibieron un aumento del conteo medio de neutrófilos absolutos, en comparación con miembros de la camada (+/+) y la media histórica. El fenotipo observado sugiere que la ANGPTL4 es un regulador negativo de las respuestas inflamatorias . Estas anormalidades inmunológicas sugieren que los inhibidores (antagonistas) de ANGPTL4 pueden ser agentes importantes que podrían estimular el sistema inmunológico (tal como la proliferación de células T) y serian útiles en aquellos casos en los que este efecto seria beneficioso para el individuo, como en el caso de la leucemia y otros tipos de cáncer y en pacientes inmunocrompometidos, tales como los que padecen SIDA. Por lo tanto, la ANGPTL4 o sus agonistas pueden cumplir un rol importante en la inhibición de la respuesta inmune y serían candidatos útiles para la supresión de respuestas inmunes perjudiciales, como por ejemplo, en el caso de rechazo de injerto o enfermedades de injerto contra el hospedador.

EJEMPLO 8: PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS QUE SE UNEN A LA ANGPTL4 Las técnicas para producir los anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidas en materia y se describen en la presente. Los antigenos (inmunógenos) que pueden utilizarse incluyen la proteina purificada de la invención, fragmentos de proteína, proteínas de fusión que contengan la proteína y células que expresen proteína recombinante y/o fragmentos de proteína en la superficie celular. El experto en la técnica puede seleccionar el antígeno sin una experimentación indebida. Los ratones tales como los Balb/c se inmunizan con el antígeno emulsionado en adyuvante de Freund completo y se inyectan subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad entre 1 y 100 microgramos. Como alternativa, se emulsiona el antígeno en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mont . ) y se lo inyecta en los panículos alimenticios traseros del animal. Los ratones inmunizados se refuerzan posteriormente a los 10/12 días con antígeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, y durante varias semanas, los ratones también pueden reforzarse con inyecciones adicionales de inmunización. Pueden obtenerse muestras de suero periódicamente de los ratones mediante hemorragia retro-orbital para realizar ensayos ELISA para detectar anticuerpos . Después de que se ha detectado una titulación adecuada de anticuerpo, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final del ligando dado. Tres o cuatro días después, se sacrifican los ratones y se cultivan las células esplénicas . Las células esplénicas se fusionan a continuación (utilizando polietilenglicol al 35%) a una línea celular seleccionada de mieloma murino, como por ejemplo, P3X63AgU.l, disponible en ATCC, N° CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden colocarse después en placas de cultivo de tejido de 96 pozos con medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timinida) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células esplénicas . Las células de hibridoma se monitorearán en un ensayo ELISA para determinar la reactividad contra el antígeno. La determinación de las células- de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales contra la ANGPTL4 deseados en la presente se encuentra dentro de la técnica conocida. Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse luego intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para producir ascitis con anticuerpos monoclonales anti-ANGPTL4. Como alternativa, las células de hibridoma pueden cultivarse en matraz o frascos rotativos para cultivo de tejido. La purificación de los anticuerpos monoclonales producida en las ascitis puede lograrse utilizando precipitación en sulfato de amonio, seguida de cromatografía de exclusión en gel. Como alternativa, puede utilizarse cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales de conejos se generaron mediante inmunización de conejo con 500 µg de proteína ANGPTL4 humana recombinante (23-406) en E. Coli en los dias 1, 40 y 70, Se cosechó el suero en los dias 80 y 120 después de la inmunización y se purificaron los anticuerpos con columnas Sephadex de proteina A. EJEMPLO 9: ANTICUERPOS BLOQUEANTES O NEUTRALIZANTES Los anticuerpos contra los antigenos descritos en la presente, como por ejemplo, ANGPTL4, pueden identificarse utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, como por ejemplo, el ensayo ELISA. Por ejemplo, las placas pueden recubrirse con el polipéptido de interés, como por ejemplo, ANGPTL4 o fragmento de ésta, e incubarse con anticuerpos generados contra el polipéptido, como por ejemplo, ANGPTL4 (véanse, por ejemplo, las descripciones en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,348,350; 6,372,491 y 6,455,496). El anticuerpo unido puede detectarse mediante diversos métodos.

Los anticuerpos antagonistas (por ejemplo, bloqueantes o neutralizantes) pueden identificarse mediante ensayos de competición y/o ensayos de actividad. Por ejemplo, la expresión de ANGPTL4 estimula la proliferación celular de hepatocitos o preadipocitos, la migración de adipocitos, regula las cantidades de triglicéridos o se une a la integrina aVß5. La determinación de un anticuerpo bloqueante o neutralizante de ANGPTL4 puede mostrarse mediante la capacidad del anticuerpo de bloquear las actividades (ver, por ejemplo, la Figura 9, Paneles B, D y E) . Por ejemplo, las células de hepatocitos o preadipocitos pueden colocarse en placas e incubarse con sobrenadante de células COS7 transducidas con Ad-hAngptl4 junto con un anticuerpo anti-ANGPTL4 o un anticuerpo de control o PBS. Después de varios dias, las células pueden tripsinizarse y contarse. Los anticuerpos que reducen las cantidades de células se identifican como anticuerpos bloqueantes o neutralizantes. También se sabe que la ANGPTL4 induce la adhesión de hepatocitos y la migración de preadipocitos, por lo que la determinación de un anticuerpo bloqueante o neutralizante de ANGPTL4 puede demostrarse con la capacidad del anticuerpo de bloquear la adhesión de los hepatocitos y/o la migración celular de los preadipocitos. También se sabe que la ANGPTL4 es un factor proangiogénico. Ver, por ejemplo, Le Jan y col., American Journal of Pa thology, 164(5): 1521-1528 (2003). De este modo, los anticuerpos bloqueantes o neutralizantes de ANGPTL4 pueden identificarse utilizando los anticuerpos en combinación con la ANGPTL4 en ensayos de angiogénesis, como por ejemplo, el ensayo CAM. Se considera que la presente es suficiente para permitir que un experto en la técnica practique la invención. Se entiende que los ejemplos y las modalidades descritos en la presente sólo tienen fines ilustrativos. La invención no tiene un ámbito de aplicación limitado por el constructo depositado, dado que el objetivo de la modalidad depositada es ilustrar determinados aspectos de la invención y cualquier constructo funcionalmente equivalente está dentro del ámbito de aplicación de la invención. El depósito de material de la presente no constituye reconocimiento alguno de que la descripción por escrito en la misma no es suficiente para permitir la aplicación de cualquier aspecto de la invención, incluido el mejor modo de la misma, ni se interpretará de forma que limite el ámbito de aplicación de las reivindicaciones para las ilustraciones especificas que representa. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y se encuentran dentro del ámbito de aplicación de las reivindicaciones incluidas más adelante. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente se incorporan a la misma a modo de referencia en su plenitud y para cualquier fin.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para estimular la proliferación de hepatocitos, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de proteína 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) a una población de hepatocitos o prehepatocitos, lo que estimula la proliferación. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los hepatocitos se encuentran en un sujeto.
3. 3. Método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el paciente es humano.
4. 4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la ANGPTL4 comprende los residuos de aminoácidos 23 a 406 de la ANGPTL4 humana.
5. 5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la ANGPTL4 comprende los residuos de aminoácidos 184 a 406 de la ANGPTL4 humana.
6. 6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de administración comprende la administración de una secuencia de ácido nucleico que codifique para la ANGPTL4.
7. 7. Método para estimular la proliferación de hepatocitos, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de un agente que estimula la producción de ANGPTL4 en hepatocitos o prehepatocitos, lo que estimula la proliferación.
8. 8. Método para inhibir la proliferación de hepatocitos, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad efectiva de un antagonista de ANGPTL4 a una población de hepatocitos o prehepatocitos .
9. 9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista es un agente que inhibe la producción de la proteína ANGPTL4 en el hepatocito.
10. 10. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente es una molécula antisentido o ribozima.
11. 11. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo anti-ANGPTL4.
12. 12. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo anti-aVß5.
13. 13. Método para inducir la adhesión celular de hepatocitos, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de una composición que comprenda una ANGPTL4 a una población de hepatocitos, lo que induce la adhesión celular de los hepatocitos .
14. 14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la ANGPTL4 comprende los residuos de 5 aminoácidos 23 a 406 de la ANGPTL4 humana.
15. 15. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la ANGPTL4 comprende los residuos de aminoácidos 185 a 406 de la ANGPTL4 humana.
16. 16. Método de conformidad con la reivindicación ° 13, caracterizado porque la composición comprende la ANGPTL4 con un vehículo.
17. 17. Método para inhibir la adhesión celular de hepatocitos, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de una 5 composición que comprenda un antagonista de ANGPTL4 a una población de hepatocitos, lo que inhibe la adhesión celular de los hepatocitos.
18. 18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo 0 anti-ANGPTL4.
19. 19. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo anti-aVß5.
20. 20. Método para estimular la proliferación de preadipocitos, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de una composición que comprenda una ANGPTL4 o agonista a una población de preadipocitos, lo que induce la proliferación de preadipocitos .
21. 21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los preadipocitos se encuentran en un sujeto.
22. 22. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el paciente es humano.
23. 23. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la composición comprende la ANGPTL4 con un vehículo.
24. 24. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la ANGPTL4 comprende los residuos de aminoácidos 23 a 406 de la ANGPTL4 humana.
25. 25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la ANGPTL4 comprende los residuos de aminoácidos 23 a 162 aproximadamente de la ANGPTL4 humana.
26. 26. Método para inhibir la proliferación de preadipocitos, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista de ANGPTL4 a una población de preadipocitos.
27. 27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo anti-ANGPTL4.
28. 28. Método para inhibir la actividad biológica de la ANGPTL4, caracterizado porque comprende administrar un antagonista de ANGPTL4 que se une al extremo C-terminal de la ANGPTL4. -
29. 29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo anti-ANGPTL4.
30. 30. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el antagonista de ANGPTL4 es un anticuerpo anti-aVß5.
31. 31. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el antagonista de ANGPTL4 bloquea la Angptl4 para que no se una a un avßs.
32. 32. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la actividad biológica comprende la inducción de la proliferación o la diferenciación celular.
33. 33. Anticuerpo, caracterizado porque se une al extremo C-terminal de la ANGPTL4.
34. 34. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo neutralizador.
35. 35. ' Composición, caracterizada porque comprende una variante de ANGPTL4, en la que la ANGPTL4 variante no se procesa poleolíticamente .
36. 36. Composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la variante de ANGPTL4 comprende una alteración del aminoácido 162 y/o 164.
37. 37. Composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la alteración es una sustitución.
38. 38. Composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la sustitución se realiza en la posición 162 y en la posición 164.