CN102242198A - 通过angptl4基因多态性进行牛育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于ANGPTL4基因多态性进行牛育种的方法，筛选具有特定ANGPTL4基因的牛作为父本和/或母本进行育种，其特征在于所述的ANGPTL4基因的1422位点序列TT。通过本发明的方法，能够培育出在体高、体斜长和腰角宽等指标上都更加优良的牛，促进我国的肉牛养殖行业的快速发展。

Description

通过ANGPTL4基因多态性进行牛育种方法

技术领域

本发明涉及牛育种方法，具体涉及通过牛ANGPTL4基因多态性进行牛育种的方法。

背景技术

牛肉肉质鲜美、营养丰富、蛋白质含量要比一般肉类高，其不仅含有人类所必需的一切氨基酸外，还具有低胆固醇、低脂肪的优点，是人类肉类食品中的佳品。从上世纪60年代开始，国际市场对牛肉的需求持续增长，世界的肉牛业在快速发展，而我国也成为继美国、巴西之后的世界第三大牛肉生产国。随着人民生活水平的不断提高，肉食结构的改善，牛肉的消费量呈现持续增长的局面，目前我国每年仍需要进口大量的高档牛肉。优质牛肉产品成为世界人民消费的发展趋势，但牛肉质量正成为制约我国肉牛业发展的一个瓶颈。

培育优质的肉牛品种一要注重生长速度、肌肉丰度和育肥速度；二要重视肉质性状和生长性状。在西方国家，肌内脂肪、嫩度、背膘厚等指标是作为育种的重要指标；在东方国家，日本和韩国特别重视从本国的役用牛品种培育出适合自己本国人民口味的优质肉牛品种。意大利皮埃蒙特牛、日本和牛及韩国韩牛都是从本土品种选育而成的颇具特色的优质肉牛品种，其品味独特、肉质优良、产肉率高，价格也比其他牛肉高。

肉牛品种是肉牛产业中的关键，要生产高品质的牛肉就需要有优良的肉牛品种。我国的黄牛品种资源丰富、肉质良好、适应性强，有清香之特色，是世界牛品种资源的宝库。但我国黄牛历史上以役用为主，要作为规模化产肉品种还是有一些差距的。我国本地黄牛多具有产肉少、育肥速度慢、后躯不发达的缺点，加之品种内个体间肉用性能差异较大(陈幼春，2001)，没有系统化的选育，高档肉块相对较少，因而肉牛生产的规模和效益与国外专门化肉牛品种相比较差。但在一些群体或者部分个体上，我国本地黄牛具有很好的肉用性能(陈幼春，1990；邱怀，1986)，若经过高强度的品种内选育，很有可能在较短时间内培育出我国特有的优质肉牛品种。

在育种进程中，韩牛和皮埃蒙特牛为了保持自身品种牛肉肉质的特性没有引入外源血统，而是通过纯繁育种选育的，这为我国本地黄牛选育提供了丰富的经验(许尚忠，2005)。我国育种工作者从1981年开始通过引种和杂交等方法对本地黄牛品种进行改良，经过20年的努力成功选育了中国西门塔尔牛品种，这是一个肉乳兼用的新品种。2007年，我国又成功培育了“夏南牛”，这是我们国家第一个肉牛品种，它是以法国夏洛来牛为父本，我国本地黄牛南阳牛为母本，采用了正反回交、导入杂交和横交固定的育种技术培育出来的，填补了我们国家肉牛品种的空白。但引进外来品种和我国本地品种杂交并不能从根本上加快我国肉牛业的发展，新品种也不一定能很快适应当地的自然条件及人民的口味的需要，同时也不能最大效率的利用我国优良的地方品种资源。据报道，我国本地黄牛品种，如秦川牛和晋南牛分别有5-10％和20-26％的个体不亚于国外优质肉牛品种的性能特点(张英汉，2001)。因此，我们要充分利用本地黄牛品种的优质资源，应用现代分子生物技术并结合传统育种方法，培育具有我国特色的优良品质肉牛。鲁西牛

鲁西牛(LuXi Cattle，LX)主要分布于山东省菏泽市，作为五大地方良种黄牛之一，其生长速度较快、肉用性能好、役用能力强，肉质细嫩、柔软多汁、大理石花纹明显，耐粗饲，体躯高大结实、性情温和，是选育中国肉牛的基础(石璞等2006)。缺点是需要耗费大量的粗、精饲料，现牛存栏数少，杂交利用过度，对纯种保护没有重视(王淑辉等2007)。

郏县红牛

郏县红牛(JiaXian Catltle，JX)主产于我国河南省平顶山市郏县及周边地区，是我国八大优良地方黄牛品种之一。其体格较大、结构匀称、体质结实、肌肉发达，被毛红色、毛短且富有光泽，遗传稳定、抗逆性强且耐粗饲，对地理环境的适应性及分布的广泛性是其他品种不可比拟的(张花菊等2005，2006)。郏县红牛肉用性能较好，具有明显的大理石花纹，肉质细嫩、肉味香醇、色泽鲜红，具有很好的生产潜力，可以向肉役兼用型、肉用型牛品种发展，缺点是后躯不发达、生长缓慢(马桂变等2009)。

秦川牛

秦川牛(QinChuan Cattle，QC)主要分布于陕西关中一带，因产于八百里秦川而得名，在地方黄牛品种中体型最高大。其皮质优良、肉质鲜美、适应性强、遗传稳定、役肉兼用，被誉为“国之瑰宝”(蒋洪茂等1993)，是中国五大优良黄牛品种之一，在国际市场上占有重要的地位，国内市场上也高于其它牛品种价格。缺点是产肉效率低、饲料利用率低，正在向肉牛品种的方向选育(陈宏等2002；张岩2004)。

南阳牛

南阳牛(Nang Yang Cattle，NY)主要分布于河南省南阳市，是我国五大地方良种牛之一，役肉兼用型的黄牛品种。其体型高大、结构紧凑、皮薄毛细、肌肉发达、耐粗饲，产肉能力强、大理石纹明显、肉质细嫩，毛色以黄色为主(王冠立2000；张玉才等2010)。缺点是生长发育缓慢、不耐寒、产肉率一般、饲料利用率低(王建钦2006)。

DNA分子标记是指能够反映生物种群间或个体间基因组上某段DNA片段差异性的技术，常用电泳谱带的形式直接反映DNA水平上的遗传多态性，这项研究开始于19世纪80年代。随着DNA分子标记研究的深入，它在动物遗传及动物育种上也发挥了重要作用。

分子育种即分子标记辅助选择育种(MAS)，是应用分子数量遗传学的理论及技术来改良畜禽品种，是传统育种理论和方法的发展，其包括转基因动物育种和基因组育种。前者采用基因转移技术，外源DNA被导入另种动物基因组上，培育出新品系；其是在DNA水平上对目标性状的基因进行选择，选种准确率得到很大提高，且选育时间由传统育种的8～10代缩短到2～3代，克服了动物传统育种方法的缺陷，加快了品种改良和新品种培育的进展(陈宏等2008；陈丹霞等2009)。后者是以基因组和比较基因组研究为基础，利用DNA分子标记技术对动物数量性状基因座位进行筛选，或者通过标记辅助淘汰清除不利基因而达到改良品系性状的目的。

DNA分子标记可以用来构建家畜的基因图谱、预测家畜杂种优势、鉴定品种或个体、分析亲缘关系或遗传分化和保护遗传资源。在肉牛育种进程中，育种工作者希望通过选择与生长或肉质性状密切相关的DNA标记，达到提高育种准确性和早期选种的目的，以期在动物品种选育中获得较快的进展。随着基因组计划的逐步实施以及深入发展，分子标记育种已经在动物遗传育种过程中发挥着愈来愈重要的作用，也正不断呈现出广阔的应用前景，并带来巨大的效用和经济价值。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是基因组DNA序列中某一个特定核苷酸发生改变而引起的多态性，它包括单个碱基的插入或者缺失、碱基转换或者颠换等，是生物基因组中最广泛存在的一类变异(刘万清等1998；Halushka M K等1999)。1996年，这个概念由美国人Lander提出，被称为“第三代DNA遗传标记”。前两代以序列的长度差异作为遗传标记，SNPs则是以由单个碱基改变而造成的单链构象的差异为标记。SNPs分布广泛，每一千个核苷酸中就可能出现一个碱基突变(Bond C等1998)。

SNPs的特点是(1)高多态性。虽然每个SNP就只有2种变异体，其变异程度也不如微卫星或者小卫星DNA强，但是在整体上SNPs数量巨大，占基因组所有已知多态性的90％以上(Lewis R 2002)。(2)高遗传稳定性。SNPs的遗传稳定性高，在漫长历史上先形成的SNPs在群体中会稳定遗传，常有很高的频率，而后形成的则所占的频率较低(Brookes A J 1999)。同时，SNPs在各地各群体中所占比例也并非相同，但仍然有大约85％是共通的(Cargill M 1999)。(3)检测方法多。SNP是由单个核苷酸突变引起的，凡是可以检测点突变的方法都可以用于鉴定SNPs位点。检测分析SNPs的技术很多，常用且有代表性的有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism，SSCP)、寡核昔酸连接分析(oligo-nucleotide ligation assay，OLA)、变性梯度凝胶电泳分析(denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)等(方唯意等2003)。本实验中采用的是RFLP、SSCP和DNA直接测序法。(4)功用广泛。DNA分子标记的的研究一直很活跃，其功用也十分广泛。研究者们常利用DNA分子标记技术对可以用家畜基因图谱进行构建，鉴定分析品种优势和起源进化等，对保护生物多样性和遗传资源发挥了重要作用。

血管生成素相关蛋白4(angiopoietin-related protein 4，ANGPTL4)是与血管生成、脂类代谢、葡萄糖代谢、胰岛素敏感性密切相关的分泌性蛋白质因子(Hato T et al.2008；Adachi H et al.2009；Aronsson，L et al.2010)，并与TGFβ信号通路直接关联，在肿瘤细胞的恶性转移过程中起着关键作用(Kaddatz K et al.2010；Nakayama T et al.2010)。

2000年，Kim等从人和小鼠的胚胎cDNA中分离出这种基因(Kim I et al.2000)，分别编码406和410个氨基酸，在肝脏中特异性表达(Mamedova LK et al.2010)。现有研究表明，ANGPTL4基因为过氧化物增殖体激活受体α(PPARα)和γ(PPARγ)的下游靶基因，抑制脂蛋白脂肪酶的活性，调节血浆甘油三酯水平和葡萄糖水平(Mandard S etal.2004；Georgiadi A et al.2010)。不同营养条件下，ANGPTL4基因调节甘油三酯的水平和胆固醇的摄入(Lu B et al.2010)。

目前，ANGPTL4基因在人和小鼠上研究的较多，是针对动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、肿瘤及其他一些心血管疾病的潜在治疗药物(Goh YY et al.2010；Lionel CC et al.2011)。除了脂类代谢，ANGPTL4基因还与血糖代谢调控联系，在C57/B6小鼠中人们发现腺病毒介导ANGPTL4基因过分表达与血糖水平急剧降低和葡萄糖耐受性的提高有关(Xu A et al.2005)。相反，ANGPTL4基因的删除或肝部过度表达不影响进食或空腹时的血糖水平(Koster A et al.2005)。实验显示，周缘组织ANGPTL4基因的过分表达不会改变血糖水平，但会适度削弱对葡萄糖的耐受性，在吃完一份高脂肪食物时，这一现象更加显著(Kersten S 2005)。以人肝瘤细胞系HepG2为材料，丰胜求发现高浓度葡萄糖和地塞米松显著增加ANGPTL4 mRNA的表达，胰岛素则反之(丰胜求2006)。

ANGPTL4基因是影响肉质与生长的关键基因(Kim H.K et al.2010)。在家畜上，马云克隆了牛ANGPTL4基因的CDS序列和部分DNA序列，并运用测序和PCR-SSC P结合的方法对该基因的3’UTR序列进行了单核苷酸多态检测，初步研究结果表明，牛ANGPTL4基因的遗传变异与牛育肥后肌内脂肪含量存在密切的关系(马云2006)。丰胜求利用辐射杂种板、RT-PCR、5’RACE和3’RACE等方法，将猪ANGPTL4基因定位于2号染色体，克隆了该基因的编码区序列(编码412个氨基酸)，并证实其在脂肪组织中表达最丰富。同时，通过分子进化树研究发现牛的ANGPTL4基因在人、小鼠、大鼠、猪、黑猩猩、狗、鸡等物种中，与猪的亲缘关系最近(马云等2010)。

ANGPTL4基因与血管生成和肿瘤存在密切关系(Nakayama T et al.2010)。目前其研究主要是就血管和抑制细胞生长两方面，尚处于初期阶段。ANGPTL4的组织特异性和个体特异性也不清楚。若将其研究清楚，可能会为肿瘤的治疗提供新的方法和思路。

发明内容

本发明的目的在于，通过分析牛ANGPTL4基因的单核苷酸多态性，并将其与生产性状进行关联分析，以筛选出SNP位点以辅之于育种，加快牛育种进程。

为了实现上目的，本发明采取如下技术方案：

一种基于ANGPTL4基因多态性进行牛育种的方法，筛选具有特定ANGPTL4基因的牛作为父本和/或母本进行育种，其特征在于所述的ANGPTL4基因的1422位点序列TT。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的牛为鲁西黄牛或郏县红牛，优选为鲁西黄牛。

本发明还涉及具有特定ANGPTL4基因的牛筛选方法，包括提取待筛选牛的DNA，其特征在于采用TGCGAATCCAGAATCTAC和AGCAAAAGGTTGGACACT作为PCR引物对牛DNA进行扩增；并进一步包括对扩增产物进行凝胶电泳检测。

通过本发明的方法，能够培育出在体高、体斜长和腰角宽等指标上都更加优良的牛，促进我国的肉牛养殖行业的快速发展。

附图说明

图1牛ANGPTL4基因P7(292)、P8(179bp)和P9(387bp)对引物扩增结果；

图2牛ANGPTL4基因P7对引物测序图谱；

图3牛ANGPTL4基因ANGPTL4-E3位点SSCP效果图；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1引物设计与合成

以GenBank公布的牛LXRa基因(登录号：NC_007313)和ANGPTL4基因(登录号：NC_007305)序列为参照，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，送南京金斯瑞公司合成，具体信息见表1。

表1牛LXRa基因和ANGPTL4基因引物相关信息

Table 1 Primers information of bovine LXRa and ANGPTL4 gene

2引物稀释

将引物管8000r/min瞬时离心1min，根据引物单提示加入适量的灭菌双蒸水配制成浓度为100μM的贮存液，用时将其稀释到10μM。贮存液保存于-20℃冰箱备用，稀释液放置于4℃冰箱。

3优化PCR反应条件

PCR反应使用的是天根公司的双组分试剂，25μL扩增体系为所含的各成分为灭菌双蒸水10.5μL、Mix组分12.5μL、上下游引物各0.5μL、DNA样品1μL和Taq DNA聚合酶0.2μL。PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、T℃退火40s、72℃延伸40s、35个循环，72℃后延伸5min。

根据预测的引物退火温度，在其上下10℃范围进行梯度PCR，筛选每对引物的最佳退火温度，并进行PCR反应条件的优化。

4PCR扩增产物检测

配制2％浓度的琼脂糖凝胶，取3μL PCR产物加入点样孔，在120V条件下电泳30min，EB染色后在凝胶成像系统下观察结果并拍照，PCR产物扩增情况可与Marker(上样量为2μL)条带进行对照。

5PCR-SSCP

根据优化好的PCR反应条件进行PCR扩增，并抽取部分PCR产物样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，待确定PCR产物明亮且无非特异性扩增后可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本实验采用30％丙烯酞胺(29∶1)配方配制10％或12％聚丙烯酰胺凝胶。

(1)将每套玻璃板和梳子清洗干净后晾干，玻璃板与胶条组装好后用夹子固定。

(2)按配方配制好所需要的凝胶，混匀后沿玻璃板上边缘缓缓倒入(尽量不要产生气泡，否则电泳时DNA单链所遇电泳阻力不一致而导致电泳条带变歪)。倒胶后，立刻插上梳子，保证梳子齿和液面间没有留下气泡。灌好凝胶的玻璃板可平置于桌面上，静置40min，待其充分聚合。

(3)小心从玻璃板上拔掉梳子，用蒸馏水冲洗点样孔，将玻璃板安装到电泳槽上，并在电泳槽内加入1×TBE，电泳液要没过点样孔。电泳槽接通电源，250V电压下预电泳5-10min。

(4)PCR产物变性：96孔变性板上每一孔中加入6μL变性缓冲液和4μL PCR产物，用宽胶带对其密封，振荡器上轻轻震荡混匀，将变性板置于PCR仪上开启程序，98℃条件下变性10min后立即置于事先准备好的冰中，静置5min。

(5)取出变性产物，将其全部上样，加入到点样孔中。打开电源，250V电压条件下电泳15-30min后再以130V电压条件下电泳4h。根据PCR产物大小，聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电泳的电压和时间是需要摸索确定的。

(6)电泳结束后关闭电源，从电泳槽上取下玻璃板，轻轻的从玻璃板上分离凝胶置于蒸馏水中，并做好标记。蒸馏水清洗2次。

(7)预先配制0.1％的AgNO₃溶液，倒入盛有凝胶的平盘中，避光条件下放置于水平摇床上100r/min震荡30min。0.1％AgNO₃溶液回收，蒸馏水清洗凝胶2-3次，每次30s左右。

(8)倒入少量现用现配的2％NaOH溶液到盛有凝胶的平盘中漂洗1次，再将剩余的2％NaOH溶液倒入进行显色反应，100r/min水平摇床上震荡直至条带清晰可见(约20-30min)。

(9)条带清晰后倒掉2％NaOH显色液，加入适量蒸馏水洗2次。轻轻将凝胶置于凝胶成像系统中照相并保存于密封带中。

6PCR-RFLP

根据扩增混合DNA样品的PCR产物测序结果，利用DNAStar或者DNAMan软件将其与候选基因参照序列进行比对，筛查碱基突变位点，利用BioXM(Version 2.6)软件分析并选择合适的酶切位点。当不存在合适的常用限制性内切酶时，可引入错配碱基，构成合适的常用限制性内切酶的酶切位点，重新设计引物并优化PCR反应条件。

根据已经优化的PCR反应条件进行PCR反应，对PCR产物进行琼脂糖电泳检测，确定目的条带明亮且没有非特性扩增时方可进行酶切反应。

MspI限制性酶酶切反应体系如表2：

表2MspI限制性酶酶切体系

Table 2 Reaction system of MspI restricted enzyme

XhoI限制性酶酶切体系如表3：

表3XhoI限制性酶酶切体系

Table 3 Reaction system of XhoI restricted enzyme

MspI和XhoI限制性酶的最适反应温度都是37℃，按照表2-和3配制酶切反应体系，并将其置于37℃恒温箱过夜，约14h。消化完成后，将酶切产物从恒温箱取出，并8000r/min瞬时离心约15s待用。本实验酶切产物所含的DNA片段长度差异较小，故采用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测各样品的酶切效果。配制12％的聚丙烯酰胺(29∶1)凝胶，吸取6μL酶切样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样前酶切产物无需98℃高温变性，可直接加入到点样孔中，200V条件下电泳2h。具体过程参考PCR-SSCP步骤。

牛ANGPTL4基因的多态性检测

牛ANGPTL4基因CDS区全长1233bp，共7个外显子，共设计7对引物涵盖了整个编码区，本实验已在外显子3、5和6上发现了碱基突变位点，故其余对引物PCR扩增及测序结果都没有列出。

牛ANGPTL4基因经P7-P9对引物PCR扩增和琼脂糖电泳检测后，结果见图1。P7对引物扩增牛ANGPTL4基因第3外显子(292bp)，P8对引物扩增第5外显子(179bp)，P9对引物扩增第6外显子(387bp)。由此图得知目的条带清晰明亮，无非特异性扩增，可进行SSCP的实验。

1ANGPTL4基因SNPs位点测序结果

以构建好的DNA混合样品和随机选取的2个个体为模板，按照优化的最佳PCR条件进行PCR扩增。PCR产物经2％琼脂糖电泳检测，确定目的条带清晰明亮且无非特异扩增后送至南京金斯瑞生物公司进行双向测序。测序结果利用DNAStar软件，和牛ANGPTL4基因(登录号：NC_007305)进行序列比对，筛选SNPs位点。

由图2，牛ANGPTL4基因P7对引物的测序结果得出牛ANGPTL4基因1422bp处发生T＞C的突变，位于外显子3，此处突变引起氨基酸密码子CUG＞CCG，为亮氨酸＞脯氨酸的错义突变。野生型为TT基因型、突变型为CC基因型、杂合型为TC。

由P7对引物测序结果得知牛ANGPTL4基因1422bp处发生T＞C的碱基突变，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到三种基因型。TT基因型为野生型个体，TC基因型为杂合型个体，CC基因型为突变型个体。

2牛ANGPTL4基因遗传结构分析及其多态性与生长性状的关联分析

表4牛ANGPTL4-E3位点PCR-SSCP的遗传结构分析

Table4 Genetic diversity of bovine ANGPTL4-E3 locus in six populations

利用设计的P7对引物对牛ANGPTL4-E3位点进行遗传检测，结果见表4。在6个牛群体中均检测到3种基因型，分别是TT、TC和CC。鲁西牛(LX)群体CC基因型稍占优势，等位基因C为优势基因；其余5个牛群体均是TT基因型占优势，等位基因T为优势基因。因0.25＜PIC＜0.5为中度多态、PIC＜0.25为低度多态，故该位点的多态性在鲁西牛(LX)和秦川牛(QC)群体为中度多态，在郏县红牛(JX)、渤海黑牛(BH)、南阳牛(NY)和高原牦牛(GY)群体为低度多态。经卡方检测显示南阳牛(NY)和高原牦牛(GY)处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。

表5牛ANGPTL4-E3位点多态性与生长性状的关联分析

Table 5 Association analysis between different genotypes and growth traits at ANGPTL4-E3 locus inLX and JX cattle(mean±SD)

注：同一性状中标有不同小写字母a、b的平均值间差异显著(P＜0.05)。

Note：Different small letter within the same column differ significantly(P＜0.05).

如表5所示，鲁西牛(LX)群体体斜长、腰角宽和十字部高指标上TT基因型显著高于CC基因型(P＜0.05)，其他生长性状指标上差异不显著。鲁西牛(LX)群体体高指标的平均值较高于郏县红牛群体(JX)，腹围指标上较低于郏县红牛群体(JX)，其他指标上大致相当。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于ANGPTL4基因多态性进行牛育种的方法，筛选具有特定ANGPTL4基因的牛作为父本和/或母本进行育种，其特征在于所述的ANGPTL4基因的1422位点序列TT。

2.根据权利要求1所述的牛育种方法，所述的牛为鲁西黄牛或郏县红牛，优选为鲁西黄牛。

3.一种特定ANGPTL4基因的牛筛选方法，包括提取待筛选牛的DNA，其特征在于采用TGCGAATCCAGAATCTAC和AGCAAAAGGTTGGACACT作为PCR引物对牛DNA进行扩增；并进一步对扩增产物进行凝胶电泳检测。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，所述的牛为鲁西黄牛或郏县红牛，优选为鲁西黄牛。

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