CN101921849B

CN101921849B - 辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的方法及其专用引物对

Info

Publication number: CN101921849B
Application number: CN2010102425525A
Authority: CN
Inventors: 张沅; 何阳花; 俞英; 王雅春; 孙东晓; 张毅
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: CN101921849A

Abstract

本发明公开了辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的方法及其专用引物对。本发明提供的引物对为序列表的序列5和序列6所示DNA组成的引物对；本发明提供的方法是用所述引物对对待测奶牛的基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR产物判断待测奶牛为TT基因型还是TC基因型。TC基因型奶牛的产奶性状优于TT基因型奶牛；所述产奶性状优体现为产奶量高和/或乳蛋白量高。本发明提供的方法使用方便、灵敏度高，可用于中国荷斯坦牛群中高产、抗乳房炎奶牛的早期选种及分群。本发明为培育高产且具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础，有助于进一步加快奶牛育种进程，具有极其重大的应用价值和社会效益。

Description

辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的方法及其专用引物对

技术领域

本发明涉及分子生物学和抗病育种学领域，特别涉及一种辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的方法及其专用引物对。

背景技术

传统的以数量遗传学理论为基础的选择方法在指导牛育种中获得了成功，但传统的育种方法周期长，对一些低遗传力性状、限性性状、抗性性状和不能活体测定的性状改良效果甚微。九十年代以来，随着分子生物学技术的进步以及在家畜领域中的应用，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)和渗入等分子育种技术。分子标记的应用，为直接对基因型进行选择提供了可能。如果标记本身就是引起性状变异的因素，或者标记与目标基因紧密连锁，通过对标记基因型的选择，都可以实现对目标性状的选择，加速育种进程。能够应用于分子标记辅助选择的QTL、基因或标记必须对目标性状具有较大的遗传贡献率，即主效QTL或基因，因此寻找这些主效QTL、基因和与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础，也是当前和今后一段时间家畜分子生物学领域的研究重点。

奶牛产奶性状和一些重要功能性状，除了受多基因控制外，还受环境的影响。功能性状是指那些不是通过增加产品数量，而是通过降低生产投入来提高生产效率的一类性状。通常这类性状包括健康性状、繁殖力性状、长寿性、饲料利用率及工作能力性状。功能性状的QTL研究是从上个世纪90年代中期才开始陆续进行。并且研究较多的主要是乳房炎和繁殖力性状。Klungland et al.(2001)直接对奶牛乳房炎进行了分析，对于乳房炎的研究都是基于对体细胞评分相关QTL定位的研究。除了6，9，17，25，28号染色体上没有检测到与SCS相关QTLs外，其他24条常染色体上均检测到了相关的QTLs(http://www.vetsci.usyd.edu.au/reprogen/QTL_Map)。而且在5号染色体上，检测到了4个与SCS相关的QTLs，在19号染色体上只检测到了2个SCS相关的QTLs。

信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)是一族DNA结合蛋白，与酪氨酸磷酸化信号通路偶联，发挥转录调控作用，从而介导多种生物学效应。哺乳类STAT基因定位表明其进化可能与其功能有关。STAT1-STAT4、STAT2-STAT6、STAT3-STAT5a/STAT5b分别在染色体上紧密连锁，说明它们可能分别由共同的原始基因进化而来，具有相似的生物学功能。

STAT蛋白在细胞因子诱导的细胞的增殖、分化过程中毫无置疑发挥着重要的生物学功能。然而，由于由激活的STAT蛋白所诱导的大多数基因仍是未知数，再者，已知30种以上的配体可激活7种已知STAT蛋白中的一个或更多个，必然有一些STAT蛋白本身以外的因素调节受体反应的特异性，因此，STAT蛋白的详细生物学功能仍不十分清楚。用缺乏STAT1蛋白的小鼠进行研究显示，STAT1蛋白独特的、非特异性的功能在于调节一系列基因的表达，这些基因共同维持小鼠的先天免疫。STAT4和STAT6在获得性免疫方面起着非常重要的作用。STAT6介导白细胞介素4(IL-4)诱导的主要组织相容性复合物(MHC)类抗原、多种免疫球蛋白受体和细胞表面蛋白表达上调。STAT3被许多种细胞因子激活后，诱导多种基因的表达。这些基因的表达量在组织损伤和炎症时明显增高(急性期应答基因)。在应答中，STAT3作为一耦合器，把JAK-STAT信号通路与其它通路连在一起。STAT3在IL-6和白血病抑制因子(LIF)诱导的M1白血病细胞的生长阻滞和终末分化中发挥重要作用。STAT5在乳腺组织对催乳素的应答中调节乳蛋白基因的表达。STAT5a蛋白也可以被认为是一种乳腺因子，起初在乳腺中被发现作为乳蛋白基因表达的调控者；而且STAT5a蛋白也是干扰素-τ(IFN-τ)和胎盘催乳素(PL)信号通路的一员。它参与各种细胞的信号转导，包括子宫和乳腺上皮细胞。子宫除了受IFN-τ和PL作用外，还受许多其他激素的作用，包括雌激素、孕酮和胎盘生长激素等。催乳素刺激STAT5a/b同型二聚体结合来诱导牛的子宫乳蛋白(UTMP)基因及骨桥蛋白(OPN)基因的转录。

牛STAT5a基因定位在19号染色体上，STAT5a基因大约有20kb长，编码749个氨基酸链。牛的STAT5b基因也位于19号染色体(NCBI序列登陆号NC_007317)上，大约36Kb，包含19个外显子，18个内含子，总共编码787个氨基酸。STAT5a和STAT5b基因在跨越内含子5到内含子9区间内，在3373bp上有97.5％的同源性，从内含子5跨越到内含子7区间内，在2619bp序列上的同源性达到99.43％，此外，它们在蛋白质水平上的同源性达到了91.6％。Keiko在2001年报道，由催乳素受体和STAT5介导的信号通路在妊娠过程中对乳腺腺泡的发育非常重要，STAT5a/b基因的敲除会使乳腺上皮细胞在妊娠过程中形成乳腺管，而不能形成腺泡，且无乳蛋白基因的表达。所以，STAT5b基因和5a一样，都参与催乳素-干扰素信号通路，因此它们与奶牛的产奶性状都有关。但是，通过STAT5a和5b单敲除和双敲除的小鼠试验证明，它们又有各自不同的功能。STAT5a主要参与依赖催乳素的乳腺发育和乳汁形成过程，而STAT5b主要介导生长激素的性别二态性效应，除此之外，STAT5b基因还与细胞的分化、增殖、凋亡等细胞代谢过程有关，在依赖性别的肝脏基因表达中STAT5b也起到非常重要的作用。STAT5蛋白的酪氨酸残基只有被磷酸化，它才能形成同源或异源二聚体进入细胞核来调控靶基因的表达。目前关于STAT5b基因的多态对乳房炎和产奶性状的影响还没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的方法及其专用引物对。

本发明提供了辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的试剂，为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对；所述产奶性状为产奶量和/或乳蛋白量。

本发明还保护序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对在制备辅助鉴别具有不同产奶性状奶牛的试剂盒中的应用；所述产奶性状为产奶量和/或乳蛋白量。

本发明还保护序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对在辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛中的应用；所述产奶性状为产奶量和/或乳蛋白量。

本发明提供的辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的方法，包括如下步骤：检测待测奶牛的19号染色体中序列表的序列1所示DNA自5’末端第54位核苷酸是T还是C，确定待测奶牛的基因型是TC还是TT，TC基因型奶牛的产奶性状优于TT基因型奶牛；所述产奶性状优体现为产奶量高和/或乳蛋白量高。

本领域的技术人员都清楚，有很多分析方法可用于检测STAT5b基因外显子16序列中是否存在该单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)：DNA测序、杂交测序、DNA芯片、PCR-RFLP、PCR-SSCP、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱(DHPLC)等。

所述确定待测奶牛的基因型是TC还是TT方法具体可包括如下步骤：

(1)提取待测奶牛的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，用序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)用限制性内切酶BbsI酶切PCR扩增产物；如果PCR扩增产物只有一种，且不能被BbsI内切酶酶切，待测奶牛为TT基因型；如果PCR扩增产物有两种，其中一种能被BbsI内切酶酶切，另一种不能被BbsI内切酶酶切，待测奶牛为TC基因型。

所述步骤(3)具体可为：用限制性内切酶BbsI酶切PCR扩增产物，然后将酶切产物进行5％琼脂糖凝胶电泳；如果显示134bp的一条DNA片段，待测奶牛为TT基因型；如果显示111bp和134bp的两条DNA片段，待测奶牛为TC基因型。

所述步骤(3)具体可为：用限制性内切酶BbsI酶切PCR扩增产物；如果酶切产物为134bp的DNA片段，待测奶牛为TT基因型；如果酶切产物有三种，分别为134bp的DNA片段、111bp的DNA片段和23bp的DNA片段，待测奶牛为TC基因型。

所述奶牛具体可为荷斯坦牛，如中国荷斯坦牛。

所述待测奶牛可为TC基因型的奶牛和TT基因型的奶牛。

本发明还保护一种奶牛育种的方法，是采用以上所述方法鉴别出的TC基因型的奶牛进行育种。

本发明还保护序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。

序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对可用于制备辅助鉴别具有不同产奶性状奶牛的试剂盒；所述产奶性状为产奶量和/或乳蛋白量。

序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对可用于辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛中；所述产奶性状为产奶量和/或乳蛋白量。

在影响奶牛业生产效率的四个主要因素(遗传育种，营养饲料，饲养管理和疾病防治)中，遗传育种技术的贡献最大，达到40％，所以可望通过遗传改良来达到奶牛综合育种的目的。随着人工授精技术的发展，种公牛的育种变得尤为重要，但是公牛的后裔测定耗时耗力，过程复杂，本发明的方法在公牛的出生早期就能判断其基因型，实现了早期选种，使有利的基因型个体保留，不利的个体淘汰，大大缩短了世代间隔，加快了育种进程，节约了成本。我国奶牛隐性乳房炎的发病率高达25％-60％，给我国奶业造成了巨大的经济损失。目前主要是通过抗生素去控制乳房炎，但是采用抗生素易出现奶牛抗药性和牛奶中药物残留等缺陷，而本发明的方法是通过遗传改良去改变个体的遗传基础，可望从遗传上达到抗病育种的目的。

本发明首次发现中国荷斯坦牛群中STAT5b基因外显子16区域存在一个SNP分子标记(T/C)，在1013头中国荷斯坦牛群中经过关联分析得出该SNP对产奶量和乳蛋白量影响极显著(p＜0.01)，对SCS影响虽然不显著，但是突变却会导致SCS一定程度的下降。本发明提供的方法使用方便、灵敏度高，可用于中国荷斯坦牛群中高产、抗乳房炎奶牛的早期选种及分群。本发明为培育高产且具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础，有助于进一步加快奶牛育种进程，具有极其重大的应用价值和社会效益。

附图说明

图1为中国荷斯坦奶牛STAT5b基因池的PCR扩增结果；M为DNA分子量标准(100ladder Marker)；1-10泳道为部分PCR扩增产物。

图2为STAT5b外显子16基因池的测序峰图(↑处为突变位点)。

图3为用PIRA-PCR法对STAT5b基因T43660093C进行引物设计的错配图；↑表示突变碱基‘T’；↓表示错配碱基‘G’。

图4为血样中提取基因组DNA 1％琼脂糖凝胶检测结果；1-14泳道为部分样本的基因组DNA。

图5为中国荷斯坦奶牛STAT5b基因包括SNP位点的PCR扩增结果；M为DNA分子量标准(100ladder Marker)；1-8泳道为部分基因组DNA的PCR扩增产物(STAT5b基因包含SNP位点的序列)。

图6为部分酶切产物的电泳图(STAT5b基因PCR-RFLP结果)；M：100bp DNA ladderMarker。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、SNP的发现和引物对的设计

一、STAT5b和STAT5a外显子16的基因序列比对

STAT5a和STAT5b基因在跨越内含子5到内含子9区间内，在3373bp上有97.5％的同源性，从内含子5跨越到内含子7区间内，在2619bp序列上的同源性达到99.43％。此外，它们在蛋白质水平上的同源性达到了91.6％。

运用DNAMAN软件对STAT5a和STAT5b外显子16的DNA序列进行比对。它们之间具有35.96％的一致性，STAT5b的外显子16这段序列比较保守，所以一碱基替换可能会影响该基因的表达和功能，具有一定的研究意义。

二、SNP的发现

采用DNA池筛查SNPs，从8个荷斯坦牛家系中随机抽出48个个体，提取基因组DNA，将其浓度配成大约100ng/μl，用紫外分光光度计检测其浓度并达到均一，每个个体取5μl共240μl的DNA混合构建成DNA池。

对混池DNA STAT5b基因的含外显子16的一段序列进行PCR扩增。

PCR扩增的引物对如下：

正向引物F(SEQ ID NO.3)：5’-CGCTTGGGAGACCTGAGTTA-3’；

反向引物R(SEQ ID NO.4)：5’-CCTAAAACAAAGCCCCGAAT-3’。

上述引物对针对的靶序列如序列表的序列1所示。

PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

试剂	用量(μl)
		ddH₂O	11.1
10×Buffer扩增缓冲液	2.0
		Mg²⁺(25mM)	1.2
dNTP混合物(每种2.5mM)	1.5
		正向引物F(10pmol/μl)	1.0
反向引物R(10pmol/μl)	1.0
		Taq DNA聚合酶(5U/μl)	0.2
模板DNA(100ng/μl)	2.0
		总体积	20

PCR反应条件：95℃8min预变性；95℃40s、62℃45s、72℃45s、35个循环；72℃延伸7min。

反应完成后，将3ul PCR反应液在2％的琼脂糖凝胶上电泳检测，结果得到一条159bp的特异性条带(见图1)。

将STAT5b基因池的PCR扩增产物取大约100μl，进行纯化，并用ABI3730xl测序仪进行正反向测序。用Chromas软件打开测序峰图(见图2)，用DNAMAN进行序列分析，并最终发现了一个T/C突变的SNP，位于Chr19：43,660,093处(UCSC)，即序列表的序列1自5’末端第54位核苷酸由T突变为C(T43660093C)。

三、引物对的设计

根据NEBcutter V2.0软件对测序发现的SNP进行酶切位点的预测，发现此T/C突变所在处无内切酶位点。针对测序结果设计一对PIRA-PCR的引物如下：

正向引物F(SEQ ID NO.5)：5’-TTTCCTGACCGGCCCGAAGA-3’；

反向引物R(SEQ ID NO.6)：5’-CACACACACCTAAAACAAAGCCCCG-3’。

上述引物对针对的靶序列如序列表的序列2所示。T/C突变位于序列表的序列2自5’末端第21位核苷酸。

其中在上游引物3’末端距离突变位点4个碱基处引入一错配碱基G，从而形成了可被BbsI内切酶识别的5’---GAAGAC(N)2↓---3’序列，见图3。

实施例2、SNP位点与产奶性状的关联分析

本实施例中的实验样本为8头公牛家系的1013头女儿牛，均来自中国北京地区出生于1996-2004年的有生产性能记录的中国荷斯坦牛群，共20个牛场，分别是：西郊一队、西郊二队、西郊四队、辛卜、德茂、金银岛(原名：亦庄)、鹿圈、金星、北郊一队、北郊三队、北郊五队、南口二队、南口三队、中以示范、渠头、半截荷、三垡、朝阳北、朝阳南、草厂。虽然用计算育种值可以校正场效应，但是由于共同环境效应使同一牛场女儿的相似性增加，所以为了剔除这种共同环境效应，尽可能选择均匀分布的公牛家系来减少试验误差。在筛选家系时，尽可能选择女儿数多、女儿分布场多、分布均匀的公牛家系。

一、基因分型

1、提取基因组DNA

分别对各个实验样本进行采血，采用试剂盒DP318(Tiangen Biotech Co.，Ltd，Beijing，China)从血块中提取基因组DNA。基因组DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，以验证提取效果。部分样本基因组DNA的电泳图见图4。

2、PIRA-PCR

分别以各个样本的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示DNA组成的引物对进行PCR扩增。

正向引物F(SEQ ID NO.5)：5’-TTTCCTGACCGGCCCGAAGA-3’；

反向引物R(SEQID NO.6)：5’-CACACACACCTAAAACAAAGCCCCG-3’。

PCR反应体系见表1。

PCR反应条件：95℃ 8min预变性；95℃ 40s、63℃ 45s、72℃ 45s、35个循环；72℃延伸7min。

反应完成后，将3ul PCR反应液进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测。各个样本的基因组DNA均得到了134bp的单一条带。部分基因组DNA的扩增结果见图5。

3、酶切和电泳

将各个PCR产物进行BbsI内切酶消化，酶切体系和酶切参数见表2。

表2PCR产物酶切体系组成和酶切参数

取酶切产物8μl，加2μl 6×loading buffer，上样于5％的琼脂糖凝胶上(含EB染色液)。恒压(8-10V/cm)电泳50-60min，在紫外透射仪上观察、照相。

所有酶切产物显示三种带型，基于酶切产物的电泳图分型如下：

带型I：显示134bp的一条带。

带型II：显示134bp和111bp的两条带。

带型III：显示111bp的一条带。

4、测序验证

将步骤2的各个PCR扩增产物以及步骤3的各个酶切产物分别进行测序，测序结果与带型显示的结果一致，基于测序结果分型如下：

TT型：PCR扩增产物(134bp)如序列表的序列2所示，该PCR扩增产物不能被BbsI内切酶酶切；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型I。

CC型：PCR扩增产物(134bp)为将序列表的序列2自5’末端第21位核苷酸突变为C得到的DNA片段，该PCR扩增产物能被BbsI内切酶酶切，产生111bp和23bp的两个酶切产物；23bp太短所以未在电泳图显示，该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型III。

TC型：PCR扩增产物为TT型PCR产物和CC型PCR产物的混合物；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型II(即TT型酶切产物和CC型酶切产物的叠加)。

部分基因型的样本的酶切产物的5％的琼脂糖凝胶电泳图见图6。

二、性状测定和关联分析

检测各个实验样本的乳房炎性状(SCS)以及5个产奶性状(产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率)。

1013头奶牛的6个重要经济性状的育种值基本信息见表3。

表3 1013头奶牛6个经济性状的育种值信息

性状	平均值	标准差	最小值	最大值
					产奶量(kg)	192.27	623.30	-2268.00	2945.00
乳脂量(kg)	1.57	23.66	-70.00	82.00
					乳蛋白量(kg)	5.20	16.95	-73.00	68.00
乳脂率(％)	-5.63	24.37	-104.00	91.00
					乳蛋白率(％)	-7.89	100.33	-356.00	296.00
体细胞评分(SCS)	3.00	0.13	2.61	3.46

三、关联分析

考虑到5个产奶性状及SCS的表型值已经转化为育种值，因此其它的影响因素如家系、胎次、场年季效应等在模型中都忽略不计。

基于步骤一确定的基因型，对各个性状的育种值进行关联分析。

关联分析的模型：y_ik＝μ+g_k+a_i+e_ik

y_ik：每个个体6个性状的育种值；

μ：各性状育种值均值；

g_k：基因型k的效应，k＝TT，TC和CC；

a：第i个个体的加性效应；

e_ik：随机误差。

结果见表4。

表4STAT5b T43660093C SNP对性状的效应

(p值和最小二乘均值±标准误)

备注：P值被命名为相伴概率，当p值小于显著性水平α时(通常为0.05或0.01)，将否认零假设，同意备择假设，即检验统计量之间的差异是显著或极显著的；^§：每种基因型的个体数，总的群体大小是1013；a，b意味着同列中没有相同上标的值间差异显著(p＜0.05)；A，B意味着同列中没有相同上标的值间差异极显著(p＜0.01)；NS意味着同列中的值间差异不显著(p＞0.05)。

本发明的SNP位点突变对产奶量和乳蛋白量的效应均达到极显著(p＜0.01)的水平，对其他性状影响不显著，对于SCS，p＝0.2808。

Claims

1.辅助鉴别具有不同产奶性状的奶牛的方法，包括如下步骤：检测待测奶牛的19号染色体中序列表的序列1所示DNA自5’末端第54位核苷酸是T还是C，确定待测奶牛的基因型是TC还是TT，TC基因型奶牛的产奶性状优于TT基因型奶牛；所述产奶性状优体现为产奶量高和/或乳蛋白量高；

所述奶牛为荷斯坦牛。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述确定待测奶牛的基因型是TC还是TT的方法如下：

(1)提取待测奶牛的基因组DNA；

3.一种奶牛育种的方法，是采用权利要求1或2所述方法鉴别出的TC基因型的奶牛进行育种。