CN103290004B - 一种检测奶牛乳房炎抗性的dna甲基化的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记及其引物对。根据所述分子标记设计的扩增引物对和测序引物对，可对奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化进行检测。所述检测的方法为：将待测奶牛的基因组DNA经过重亚硫酸盐处理，利用扩增引物对进行CD4基因的PCR扩增，再利用测序引物对配合焦磷酸仪进行测序，即可检测待测奶牛的CD4基因启动子区的甲基化程度。本发明为培育具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。

Description

一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记

技术领域

本发明涉及分子标记，具体地说，涉及一种检测DNA甲基化的分子标记。

背景技术

奶牛功能性状的QTL（数量性状座位）研究是从上个世纪90年代中期才开始陆续进行，并且研究较多的主要是乳房炎和繁殖力性状。乳房炎会降低产奶量，影响奶品质，而且增加母牛流产率及淘汰率。在奶牛抗乳房炎育种中，由于乳房炎抗性的遗传力较低，传统的遗传改良方法很难提高其抗病性，研究者们正努力通过寻找奶牛乳房炎抗性相关的稳定DNA甲基化标记及靶基因，选择乳房炎抗性高的个体，为培育抗乳房炎奶牛新品系奠定基础。

白细胞是一类有核细胞，在正常奶牛血液中常见的白细胞主要包括中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。白细胞是机体的防卫细胞，参与机体对细菌、病毒等异物入侵时的察觉和反映过程。细菌或病毒侵犯机体遇到的最初抵抗就来自于白细胞，因此机体反映的最初变化就是白细胞升高或降低。淋巴细胞是一种具有特异性免疫功能的细胞，可进一步分为T淋巴细胞和B淋巴细胞，分别执行细胞免疫功能和体液免疫功能。成熟的T淋巴细胞根据其表面抗原标志和功能分为CD4+辅助T细胞（含CD4分化抗原）和CD8+抗毒性T细胞（含CD8分化抗原）。CD4+T细胞的主要功能是通过分泌的淋巴因子，增强和扩大免疫应答过程，激活巨噬细胞，激活体液免疫和促进体液免疫。CD8+T细胞具有免疫抑制作用，可抑制T细胞和B细胞功能，从而抑制免疫应答过程，这样二者在双向调控下分别表现出适当的强度，分别发挥正负调节作用。机体的相对免疫平衡状态主要靠CD4+和CD8+T细胞相互影响来维持，比例失调就会使免疫功能失常。

成熟的CD4+T细胞表面存在CD4分化抗原，参与免疫应答。感染葡萄球菌乳房炎的奶牛表现出CD4+T细胞比率的急剧变化，而感染链球菌乳房炎的奶牛则是CD4+和CD8+同步增长。此外，CD4+/CD8+的比值在未被金黄色葡萄球菌感染的牛群中远高于已感染的牛群。近些年发现，CD4基因的表观遗传修饰对T细胞在免疫过程中的表达有显著的影响。比如，CD4基因的沉默子缺失，会导致CD4在整个T细胞分化过程中去阻遏，从而影响免疫反应。

奶牛CD4基因位于5号染色体上（Genbank登陆号：NC_007303），全长约16Kb（含7个外显子和6个内含子），编码白细胞表面抗原CD4蛋白，共395个氨基酸。我们前期研究发现，CD4基因是奶牛乳房炎抗性相关的重要候选基因，但目前关于奶牛CD4基因的DNA甲基化水平对乳房炎抗性的影响还没有报道。

因此，如何定量测定乳房炎抗性成为该研究领域的重中之重。新发展的焦磷酸测序技术，是针对目的基因DNA甲基化进行定量研究的新一代序列分析技术。通过预先设计的反应体系，在一次检测中快速、准确、定量一个或多个甲基化位点，甲基化状态随即以序列形式呈现，是目前最理想的目的基因DNA甲基化研究方法，该技术在DNA甲基化研究中逐渐成为分析的标准。焦磷酸测序法在人类疾病检测中多有报道。但在传统奶牛乳房炎抗性研究中，鲜见候选基因的DNA甲基化研究。因此利用稳定、可靠、简单操作的焦磷酸测序方法，进行抗乳房炎候选基因的DNA甲基化定量，对于乳房炎抗性的研究具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中对奶牛乳房炎抗性基因的DNA甲基化研究的缺陷，本发明的目的是提供一种检测奶牛乳房炎抗性的CD4基因甲基化的分子标记及其引物。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记，所述分子标记是通过针对牛CD4基因，选取其转录起始点上游0～1000bp内的富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得到的。

具体地，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种用于扩增前述分子标记的扩增引物对，所述扩增引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物对，所述测序引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了一种包含前述测序引物对试剂盒。

本发明还提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的方法，所述方法包括以下步骤：

1）提取待测奶牛基因组DNA；

2）基因组DNA的重亚硫酸盐处理；

3）以步骤2）处理后的基因组DNA为模板，利用前述扩增引物对，在其下游引物的5’端按照5’→3’方向连接通用引物，并在有生物素标记的通用引物的参与下，进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；

其中，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

4）利用前述测序引物对，用焦磷酸仪对步骤3）获得的PCR产物进行测序，定量检测CpG座位的甲基化程度。

其中，前述方法中所述的奶牛为荷斯坦牛。

本发明还提供了一种优化奶牛育种的方法，具体为根据前述检测方法得到的检测结果，筛选出中度DNA甲基化修饰的CD4基因的奶牛进行育种。

本发明还提供了前述分子标记在优化奶牛育种中的应用。

本发明通过前述分子标记设计的CD4基因DNA甲基化引物序列具有较强特异性，配合焦磷酸仪，可用于有效、准确、定量检测奶牛CD4基因DNA甲基化程度。该特异引物所检测出的CD4基因甲基化作为新型的表观遗传分子标记，为培育具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。

附图说明

图1为部分奶牛抗凝血DNA提取；

图中：M：DL7000分子量标记；1～7：1-7号试验样品。

图2为牛CD4基因的PCR扩增效果：

图2A为用于重亚硫酸盐测序的194bp PCR片段；

图2B为用于焦磷酸测序的生物素标记的194bp PCR片段；

M：DL600分子量标记；1～7：1-7号试验样品8：阴性对照。

图3为牛CD4基因重亚硫酸盐混池测序及个体直接测序结果：

图3A为DNA池测序；图3B为B262测序；图3C为3538测序

图4为克隆子的挑取及3个个体的重亚硫酸盐克隆测序：

图4A圆圈代表随机挑取的克隆子；图4B、图4C、图4D为3个个体9个CG座位重亚硫酸盐克隆测序后的DNA甲基化程度。

图5为乳房炎易感牛（A）及乳房炎抗性牛（B）CD4基因的焦磷酸测序结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1优化引物设计

一、利用Oligo软件设计PCR-重亚硫酸盐扩增引物

针对牛CD4基因，选取其转录起始点上游0～1000bp内的富含CpG二核苷酸的序列作为目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。先将目标序列的“CG”座位替换为“YG”，再把所有的“C”替换为“T”，得到CD4基因经重亚硫酸盐转换后的序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。对重亚硫酸盐转换后的序列进行引物设计，设计原则为：引物长度一般在18～25碱基之间；G+C含量在40%～60%之间，Tm值在55～65℃之间，上、下游引物Tm值相差不能超过4℃；能量应尽量小于5kcal，最高为7kcal/mol；无发夹结构、无二聚体；上、下游引物3’端不能为A；上游或下游引物5’端可以包含一个CG座位，尽量靠近5’端。按上述设计原则，设计得到上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

二、设计用于焦磷酸测序的热启动PCR扩增引物

（1）合成通用引物(5’-GGG ACA CCG CTG ATC GTT TA-3’)，如SEQ ID No.9所示，并在通用引物的5’端标记生物素（biotin），HPLC纯化，-20℃避光贮存。（此步骤由上海生工完成）

（2）用于PCR的上下游引物设计，设计原则同上，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。不同的是需要在下游引物的5’端按照5’→3’方向连接上述通用引物，连接通用引物后的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

三、利用Oligo软件设计焦磷酸测序引物

设计测序引物的标准与PCR引物相似，只是要其Tm尽可能低点。Tm在45～55℃范围内；测序引物要距离第一个甲基化座位5个碱基以内，最好与第一个甲基化座位相邻；测序引物要设计在PCR上游引物与第一个甲基化座位之间；测序引物不需要用生物素标记。注意测序引物设计在上游或者下游区域，是根据通用引物的位置确定，需要设计在相对的位置。例如通用引物连接在下游引物5’端，测序引物就要设计在上游区域。设计得到焦磷酸仪测序引物对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

测序反应在28℃下进行，要注意检查引物的自身退火，特别是在引物的3’端。我们已经发现在引物的3’如果有4个碱基能配对或者在引物3’端有一个碱基配对，在其他位置二聚体被稳定，这样测序时会出现背景信号问题。

实施例2优化PCR反应

一、血液基因组DNA的重亚硫酸盐处理

利用EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒（ZYMO，北京天漠科技代理）对定量的DNA进行重亚硫酸盐优化处理。具体步骤如下：将130μL CT Conversion Reagent和20μL血液基因组DNA（1μg）混匀，分于两个PCR管，每管65μL CT Conversion Reagent和10μL DNA（500ng）经PCR热循环后，两PCR管合并入柱，加入600μL M-Bindingbuffer，颠倒混匀，12000rpm，离心30s，弃废液；100μL M-Wash buffer，入柱，12000rpm，离心30s，弃废液；200μL M-Desulphonation buffer，入柱，室温放置20min，12000rpm，离心30s，弃废液；200μL M-Washbuffer，入柱，12000rpm，离心30s，弃废液；20μL M-Elution buffer，入柱，转入新的离心管中，室温放置10min，12000rpm，离心30s，收集转化后的DNA，1:5稀释，-20℃贮存。

其中，血液基因组DNA是通过北京天根公司基因组提取试剂盒提取。

二、基于重亚硫酸盐处理的热启动PCR扩增

PCR25μL扩增体系为：2×Reaction Buffer12.5μL，dNTP Mix0.25μL，上游引物（SEQ ID No.5所示）0.5μL（10μmol/L），下游引物（SEQ ID No.6所示）0.5μL（10μmol/L），重亚硫酸盐处理后的基因组DNA模板2～4μL，Zymo Taq酶0.2μL（ZYMO，北京天漠科技代理），Dnase/Rnase free水补足至25μL。反应条件为：95℃变性10min；94℃30s，50～60℃40s，72℃45s，50次循环；72℃延伸7min，获得扩增产物（产物序列如SEQ ID No.4所示），4℃贮存。

三、用于焦磷酸测序的热启动PCR

PCR30μL扩增体系为：Zymo Premix15μL（ZYMO，北京天漠科技代理），上游引物（SEQ ID No.5所示）0.6μL（10μmol/L），下游引物（SEQ ID No.10所示）0.06μL（10μmol/L），生物素标记的通用引物0.54μL（10μmol/L，SEQ ID No.9所示）重亚硫酸盐处理的DNA模板2～4μL，Zymo Taq酶0.2μL，Dnase/Rnase free水补足至30μL。反应条件为：95℃变性10min；94℃30s，50～60℃40s，72℃45s，50次循环；72℃延伸7min，获得带有生物素标记的扩增产物（产物序列如SEQ ID No.4所示），-20℃避光保存。

PCR反应中生物素标记的引物应少加，避免模板中存在游离的生物素标记引物存在，这样会降低单链分离纯化的效率；45～50次循环可以完全消耗掉生物素标记的引物。

四、热启动PCR扩增结果检测

扩增完毕后，在2%的琼脂糖胶上检测4μL PCR产物，需要得到单一信号较强的条带，并且没有剩余的引物，没有引物二聚体或其他非特异的条带存在。

实施例3重亚硫酸盐直接测序

一、重亚硫酸盐混池测序及个体直接测序

将1:5稀释好的重亚硫酸盐处理后DNA等量混池，选择池DNA做模板，进行温度梯度热启动PCR扩增，获得合适的PCR产物，对PCR产物凝胶电泳检测合格后使用ABI公司3730XL直接测序检测。个体测序是将个体DNA经上一步的适温度扩增后进行直接测序。测序工作由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

二、重亚硫酸盐克隆测序

（1）对实施例2第二步扩增产物进行切胶回收

（2）连接

将回收到的目的片段与pMD18-T载体按表一的成分加入反应管并混匀，置15℃水浴锅中链接过夜。

表1连接反应体系

（3）重组质粒的转化

在完全无菌状态下，从-80℃冰箱取出一管100μL新鲜DH5α大肠杆菌感受态细菌，用手握融；向每支感受态细胞中加入5μl链接产物，轻轻混匀，冰上静置30min；42℃水浴热激活90sec；快速转移EP管到冰上，使细胞迅速致冷1-2min；在无菌操作台，向EP管加600μlLB液体培养基（无AMP），复苏细菌（200rpm，50min，37℃）；取100μl复苏菌液，图板于LA平板培养基上。在37℃培养箱中培养过夜；次日，观察培养皿菌落生长情况，随机挑取20个菌落在另一块LA固体培养基上划线培养（8～12h）。

（4）重组质粒的鉴定及阳性重组质粒的测序

菌体PCR与实验例2第三步的PCR扩增反应相同，只是将其中的DNA模板换为菌液。每个样本挑选10个阳性重组质粒进行Sanger法测序（如图4B、图4C、图4D所示）。

实施例4优化焦磷酸测序（Pyrosequencing）

焦磷酸仪测序前，保证所有的溶剂达到室温。10～25μL实施例2中的产物（SEQ ID No.4所示）加入40μL Binding Buffer、3μLSepharose Beads（GE Health care，北京中原领先科技代理）、Dnase/Rnase free水补足体系至80μL；常温下，2400rpm震荡10min，若产物片段长，可适当延长震荡时间；Vacuum Prep Tool3min内抓取含生物素标记PCR产物的Sepharose Beads，经70%乙醇纯化5s，0.2MNaOH变性5s，1×Washing Buffer清洗10s，清洗时间是液体通过Vaccum后开始计时；将Vacuum放在酶标板上方，关闭真空泵后，将Beads释放到预先准备好的酶标板（40μL1×Anealing Buffer，0.2μL100μM测序引物SEQ ID No.7或SEQ ID No.8）中，此时可见酶标板中液体由清亮变为白色浑浊，说Beads释放充分；Plate板在80℃烘箱中预热，酶标板放在Plate板上，加热变性2min；再冷却至室温；根据焦磷酸仪自行计算的E、S、A、C、G、T按固定位置加入到焦磷酸仪的Catrigen反应仓中；运行焦磷酸仪程序，开始焦磷酸测序。测序结果如SEQ ID No.3所示。

实施例5奶牛乳房炎抗性相关基因CD4的DNA甲基化

一、奶牛K3EDTA抗凝血提取DNA的凝胶电泳检测

图1可以看出，从奶牛抗凝血中提取出10～20μg DNA，经分光光度计检测OD A260/A280值均在1.80～2.0之间，OD A260/A230值均在1.50～1.8之间，说明蛋白质去除效果很好，无残留的RNA和乙醇等有机溶剂。为后续研究DNA甲基化提供基础。

二、用于重亚硫酸盐测序与焦磷酸测序的奶牛CD4基因的PCR产物琼脂糖胶检测

图2所示CD4基因用于重亚硫酸盐测序和焦磷酸测序的扩增结果，且电泳带明亮整齐，无非特异条带，无引物二聚体，无污染，说明扩增效果较好，可以进行甲基化测序分析。生物素标记的PCR产物浓度在相同的扩增条件下低于无生物素标记的PCR产物。

三、奶牛CD4基因重亚硫酸盐混池测序及个体测序结果

为初步检测CpG座位是否发生甲基化，本发明首先针对实施例2中第二步所得PCR产物进行混成测序。图3所示为奶牛CD4基因的重亚硫酸盐混池测序（图3A）及2个个体直接测序（图3B、3C）结果，共测得8个CG座位，图3显示了前5个CG测序座位。箭头所示为CpG座位，有箭头所示的碱基表示为差异甲基化座位。

四、奶牛CD4基因DNA甲基化克隆测序验证结果

重亚硫酸盐PCR产物的克隆测序是DNA甲基化的传统检测方法，我们进一步采用此法判断上述CpG座位是否确实发生了DNA甲基化修饰。图4所示为奶牛CD4基因的重亚硫酸盐PCR产物的克隆测序结果，共测得8个CpG座位，8个CG座位在三个个体的平均DNA甲基化程度分别为76.3%、87.8%及71.3%。

五、临床乳房炎及健康奶牛CD4基因的焦磷酸测序结果

由图2、图3、图4可知，我们在奶牛CD4基因启动子区200bp以内共测得8个CG座位，我们进一步利用焦磷酸测序选择其中5个CG座位测定DNA甲基化程度。图5A所示乳房炎易感牛（临床乳房炎奶牛）CD4基因的焦磷酸测序结果，图5B所示为乳房炎抗性牛（健康泌乳牛）CD4基因的焦磷酸测序结果。结果显示，测序图无C峰（质控峰），表明DNA重亚硫酸盐转化好，检测结果有效。

采用此法，我们又检测了50头乳房炎易感牛（临床乳房炎奶牛）及51头同群乳房炎抗性牛（健康泌乳牛）CD4基因启动子区DNA甲基化水平。结果表明，乳房炎易感牛该基因启动子区DNA甲基化水平极其显著的高于乳房炎抗性牛（P<5.1×10^-19）（如表2所示）。具体表现为，乳房炎易感牛甲基化程度为74.8%±7.6%，而乳房炎抗性牛的甲基化程度平均为59.6%±9.7%。此外，对比传统的重亚硫酸盐克隆测序结果，焦磷酸测序与其趋势一致，且焦磷酸测序具有定量化的特性，更易于量化奶牛的乳房炎抗性。

表2奶牛CD4基因启动子区5个CG座位的DNA甲基化水平

中度甲基化即50-60%的甲基化程度。高度甲基化指大于70%的甲基化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种与奶牛乳房炎抗性相关的DNA甲基化的分子标记，其特征在于，所述分子标记是通过针对牛CD4基因，选取其转录起始点上游0～1000bp内的富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得到；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述的分子标记的扩增引物对，其特征在于，所述扩增引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物对，其特征在于，所述测序引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

4.包含权利要求3所述的测序引物对的试剂盒。