CN104561304A - 一种检测奶牛乳房炎抗性的dna甲基化的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记及其引物对。根据所述分子标记设计的扩增引物对和测序引物对，可对奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化进行检测。所述检测的方法为：将待测奶牛的基因组DNA经过重亚硫酸盐处理，利用扩增引物对进行TRAPPC9基因的PCR扩增，再利用测序引物对配合焦磷酸仪进行测序，即可检测待测奶牛的TRAPPC9基因启动子区的甲基化程度。本发明为培育具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记，具体地说，涉及一种检测DNA甲基化的分子标记。
背景技术
奶牛乳房炎是影响世界奶业发展的主要疾病之一，也是造成奶牛养殖损失最主要的疾病。奶牛乳房炎不仅会影响奶牛的产奶量，降低原料奶的品质，还会影响奶牛正常生理功能，增加母牛流产率及淘汰率。奶牛乳房炎的遗传力较低，仅为0.02-0.04之间，传统的育种方法对其选择效果不明显。随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术逐步应用到畜禽育种中去，并取得了一定的成果。奶牛乳房炎受环境影响较大，研究者们正致力于通过寻找与奶牛乳房炎抗性相关的表观遗传分子标记及相关靶基因来选择乳房炎抗性高的个体，为培育具有乳房炎抗性的奶牛新品系奠定基础。
表观遗传学是指DNA的序列没有发生改变，而基因的表达却发生了可遗传的变化。表观遗传学的修饰方式和调节机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等方面。这些修饰方式和调节机制易受环境的作用，因此与经典遗传学相比，表观遗传学更关注环境诱导的可遗传变异。DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基转移酶的作用下，CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)被选择性地添加甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化对奶牛乳房炎的发生、发展和维持具有重要的影响。
转运蛋白颗粒复合体9基因(trafficking protein particle complex 9,TRAPPC9)位于奶牛的14号染色体上，全长387232bp，cDNA全长4179bp，拥有22个外显子。其编码的蛋白转运蛋白颗粒复合体9也叫做NIBP(NIK and IKKβ-binding protein)，具有参与NF-κB信号通路激活的过程、参与膜泡运输、参与内质网到高尔基体的囊泡转移和参与神经细胞的分化等功能。NF-κB信号通路是一个非常重要的炎症调控通路，尤其是在维持表皮和上皮细胞内环境稳态中发挥着重要的作用。大量研究表明NF-κB信号通路在奶牛乳房炎发生、发展过程中发挥着重要调控作用。我们前期研究发现，TRAPPC9基因是奶牛乳房炎抗性的重要候选基因，但目前关于奶牛TRAPPC9基因的DNA甲基化对乳房炎抗性的影响还没有报道。
目前，定性研究DNA甲基化的方法有很多，而定量分析DNA甲基化水平的方法却很少，而且费用昂贵，通量低。新发展的焦磷酸测序技术，是针对目的基因DNA甲基化进行定量分析的新一代测序技术，目前，该测序平台已经升级到第二代，一次能够检测400bp的序列。该技术通过预先设计的反应体系，在一次检测中快速、准确、定量一个或多个甲基化位点，是目前最理想的DNA甲基化定量分析技术。目前，焦磷酸测序法在人类疾病检测中有很多报道，但在传统的动物疾病研究中鲜有报道。因此利用焦磷酸测序方法进行奶牛乳房炎抗性候选基因的DNA甲基化定量分析，对研究奶牛乳房炎抗性具有重要意义。同时，也为后续的分子育种提供了可靠的表观遗传学分子标记素材和理论基础。
发明内容
为了解决现有技术中对奶牛乳房炎抗性基因的DNA甲基化研究的缺陷，本发明的目的是提供一种检测奶牛乳房炎抗性的TRAPPC9基因甲基化的分子标记及其引物。
为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记，所述分子标记是通过针对牛TRAPPC9基因，选取其启动子区内的一段富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得到。
具体地，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种用于扩增前述分子标记的扩增引物对，所述扩增引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物，所述测序引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了一种包含前述测序引物对试剂盒。
本发明还提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测奶牛基因组DNA；
2)基因组DNA的重亚硫酸盐处理；
3)以步骤2)处理后的基因组DNA为模板，利用前述扩增引物对，在其下游引物的5’端按照5’→3’方向连接通用引物，并在有生物素标记的通用引物的参与下，进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；
其中，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
4)利用前述测序引物对，用焦磷酸仪对步骤3)获得的PCR产物进行测序，定量检测CpG座位的甲基化程度。
进一步地，所述步骤3)中PCR扩增的反应体系为：重亚硫酸盐处理的基因组DNA 4μl，10μM的上游扩增引物1μl，10μM的下游扩增引物0.1μl，10μM的通用引物0.9μl，ddH2O 14μl，Zymo Premix 20μl；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性15min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，45个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
其中，前述方法中所述的奶牛为荷斯坦牛。
本发明还提供了一种优化奶牛育种的方法，具体为利用前述方法检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化，筛选出基因启动子区甲基化标记中DNA未甲基化的TRAPPC9基因的奶牛进行育种。
本发明还提供了前述分子标记在优化奶牛育种中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明通过前述分子标记设计的TRAPPC9基因DNA甲基化引物序列具有较强特异性，配合焦磷酸仪，可用于有效、准确、定量检测奶牛TRAPPC9基因DNA甲基化程度。该特异引物所检测出的TRAPPC9基因甲基化作为新型的表观遗传分子标记，为培育具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。
附图说明
图1为4头试验中国荷斯坦奶牛的焦磷酸测序结果图；
其中：A和B所示个体属于乳房炎易感个体；C和D所示个体属于乳房炎抗性个体。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1与中国荷斯坦牛乳房炎抗性相关的DNA甲基化分子标记甲基化水平的检测
1.1待测中国荷斯坦奶牛血液基因组DNA提取
尾静脉采集待测中国荷斯坦奶牛血液，常温放置3-4小时待血液凝固，此时血液分为血清和凝血块两部分，血清呈清亮黄色，凝血块为暗红色，牛血液中只有白细胞内含有DNA，存在于凝血块中。
利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒从凝血块中提取基因组DNA，具体步骤如下：
用眼科剪剪取0.2-0.3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离心管中，加入500μL的细胞裂解液CL；
利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，振荡15s，12000rpm离心1min，弃去上层暗红色上清液；
再次加入700μL细胞裂解液CL，充分振荡使下层沉淀散开悬浮，12000rpm离心1min，弃去上清液；
加入200μL缓冲液GS，充分涡旋至沉淀充分悬浮；
加入20μL蛋白酶K和250μL缓冲液GB，充分混匀；
将离心管用封口膜封好放入到56℃杂交炉中消化3-4小时，为确保充分消化，消化过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明，简短离心；
加入200μL冰镇无水乙醇，上下颠倒混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；
将上一步所得溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白缓冲液GD，静置2min，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW,12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW,12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液；
将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底挥发吸附柱上残余的乙醇；
将吸附柱转入至一个新的离心管中，加入100μL 56℃预热的TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，基因组DNA则存在于离心管中。
利用NanoDrop2000紫外分光光度计检测基因组DNA提取的质量与浓度，-20℃保存备用。
1.2基因组DNA重亚硫酸盐处理
本研究利用EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒对基因组DNA进行处理，为保证样品转化完全，每份样品处理1μg的DNA。具体步骤如下：
1)CT Conversion Reagent的制备：通过添加900μl水，50μl的M-Dissolving Buffer，和300μl的M-Dilution Buffer到一管的CTConversion Reagent中；
2)在PCR管中添加130μl的CT Conversion Reagent到每20μlDNA样品中，如果DNA样品的体积小于20μl，则用水来弥补差量。
3)将样品放到PCR仪上反应，反应条件为：98℃10min，64℃2.5h；
4)添加600μl的M-Binding Buffer到Zymo-Spin IC Column吸附柱中，并将吸附柱试剂盒所提供的Collection Tube中；
5)将步骤3样品转移到含有M-Binding Buffer的吸附柱中，盖上盖颠倒混匀，13000rpm离心1min，弃废液；
6)添加100μl的M-Wash Buffer到柱中，13000rpm离心30sec；
7)添加200μl的M-Desulphonation Buffer到柱中并且在室温(20℃-30℃)下放置15-20分钟，然后13000rpm离心30sec，弃废液；
8)添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，13000rpm离心30sec，重复一次；
9)在柱中央加入10μl ddH2O，1min后13000rpm离心1min，收集洗脱液-20℃保存。
1.3用于焦磷酸测序的热启动PCR扩增
PCR40μl扩增体系，分别为：重亚硫酸盐处理的基因组DNA 4μl，10μM的上游扩增引物1μl(SEQ ID NO.3)，10μM的下游扩增引物0.1μl(SEQ ID NO.4)，10μM的通用引物0.9μl(5’-biotin-GGGACACCGCTGATCGTTTA-3’)，ddH2O 14μl，ZymoPremix 20μl；PCR反应条件为：95℃预变性15min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，45个循环；72℃延伸10min；4℃保存。获得带有生物素标记的扩增产物，-20℃避光保存。
1.4PCR产物焦磷酸测序
本研究利用QIAGEN公司的焦磷酸测序仪进行DNA甲基化水平定量检测，同时利用该公司提供的Pyro Q-CpG软件进行测序Assay设计及相关参数设定。具体操作步骤如下：
1)在测序开始前，提前90min打开仪器预热，连接电脑与测序仪，同时控制室温在18-25℃之间；
2)利用Pyro Q-CpG软件针对相应的测序片段进行Assay的设计，根据配套的实验设备设定合适的实验参数；
3)将上一步获得的PCR扩增产物与2μl Beads，37μl Bindingbuffer混合，在振荡器上振荡20min，使PCR产物与Beads充分结合；
4)取40μl Annealing buffer与2μl测序引物(10μM)混合到酶标板上；
5)制备单链：利用Pyrosequencing Vacuum Prep Tool充分吸取Beads-PCR混合物，然后将Beads-PCR混合物分别在70％乙醇纯化5sec，在Denature buffer中变性5sec，在Washing buffer中洗涤15sec，然后将探头竖直举起直至水被抽干；
6)将探头对准酶标板，关闭真空，在酶标板上空停留3sec后，将探头放入酶标板，轻轻晃动探头，将制备的单链溶入到Annealingbuffer和测序引物混合物中；
7)将酶标板放在80℃的金属浴上加热2min，然后冷却到室温；
8)打开Pyro Q-CpG软件，根据具体实验设定运行程序并获得酶和碱基的加样量；
9)将酶、底物和各个碱基按照要求加入到试剂槽中，然后将试剂槽和酶标板放入到测序仪中，然后运行程序；
10)测序完成后，利用Pyro Q-CpG软件分析出测序结果，从而获得待测样品DNA甲基化水平数据。
1.5上述DNA甲基化标记在中国荷斯坦牛乳房炎抗性优势品种选育中的应用
该DNA甲基化标记可作为新型表观遗传标记用于分子育种，从而加快中国荷斯坦牛乳房炎抗性优势品种的选育。
实施例2TRAPPC9基因启动子区甲基化状态与乳房炎抗性的关联分析与检测应用
按照实施例1的方法，对采自北京地区不同奶牛养殖场的152头中国荷斯坦奶牛进行甲基化状态检测，检测结果如图1所示，可见每个CpG位点均存在甲基化与未甲基化质的变异。
运用SAS 9.0软件的GLM过程分析各个CpG位点甲基化与否与中国荷斯坦牛乳房炎抗性的关联关系，采用的模型如下：
y＝μ+hys+p+m+e
其中，y为表型值，μ为表型值群体均值，hys为场年季效应，p为胎次效应，m为甲基化效应，e为随机残差效应。分析结果如表1所示。
表1中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因启动子区甲基化状态与乳房炎抗性关联分析
表1中的数值表示为最小二乘均值±标准误差；表中不同字母表示差异显著(P<0.01)，大写字母表示差异极显著(P<0.05)，小写字母表示差异显著表中*表示差异显著(P<0.05)，**表示极显著相关(P<0.01)。
由表1可知，CpG-2位点甲基化状态与否对细胞因子TNF-α和IL-17影响极显著(P<0.01)，对IFN-γ影响显著(P<0.05)；CpG-3位点甲基化状态与否对细胞因子TNF-α、IL-17和NF-κB影响极显著(P<0.01)，对IFN-γ影响显著(P<0.05)；CpG-3位点甲基化状态与否对细胞因子TNF-α影响显著(P<0.05)。可见，TRAPPC9基因启动子区甲基化标记中未甲基化的个体具有较高的乳房炎抗性。在育种生产中，选择图C和图D所示启动子区甲基化标记中未甲基化的个体能够提高群体乳房炎抗性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记，其特征在于，所述分子标记是通过针对牛TRAPPC9基因，选取其启动子区内的一段富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得到。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种用于扩增权利要求1或2所述的分子标记的扩增引物对，其特征在于，所述扩增引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物，其特征在于，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.包含权利要求4所述的测序引物的试剂盒。
6.一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测奶牛基因组DNA；
2)基因组DNA的重亚硫酸盐处理；
3)以步骤2)处理后的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的扩增引物对，在其下游引物的5’端按照5’→3’方向连接通用引物，并在有生物素标记的通用引物的参与下，进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；
其中，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
4)利用权利要求4所述的测序引物，用焦磷酸仪对步骤3)获得的PCR产物进行测序，定量检测CpG座位的甲基化程度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增的反应体系为：重亚硫酸盐处理的基因组DNA 4μl，10μM的上游扩增引物1μl，10μM的下游扩增引物0.1μl，10μM的通用引物0.9μl，ddH2O 14μl，Zymo Premix 20μl；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性15min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，45个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述奶牛为荷斯坦牛。
9.一种优化奶牛育种的方法，其特征在于，利用权利要求6所述的方法检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化，筛选出基因启动子区甲基化标记中DNA未甲基化的TRAPPC9基因的奶牛进行育种。
10.权利要求1或2所述的分子标记在优化奶牛育种中的应用。
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