CN110541036A

CN110541036A - 一种延边黄牛肉质相关的angptl4基因snp分子标记、引物对、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110541036A
Application number: CN201910764068.XA
Authority: CN
Inventors: 夏广军; 徐红艳; 徐畅; 尹宝珍; 张洛萌
Original assignee: Yanbian University
Current assignee: Yanbian University
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2039-08-19
Also published as: CN110541036B

Abstract

本发明提供了一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用，属于黄牛肉质筛选技术领域。延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记，含有位于所述基因第41995bp的多态性为C/T的核苷酸序列。ANGPTL4基因多态性与肉质性状关联分析，41995bp C/T位点与延边黄牛脂肪含量、蛋白含量、胴体重、大理石花纹等级性状呈显著相关性，表现为CT基因型的脂肪含量、胴体重和大理石花纹等级均显著高于CC型。而CC基因型的蛋白含量显著高于CT基因型。ANGPTL4基因的SNP分子标记能够作为筛选肉质性状相关的基因标记，用于延边黄牛高档肉牛早期选择。

Description

一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于黄牛肉质筛选技术领域，具体涉及一种延边黄牛肉质相关的 ANGPTL4基因SNP分子标记、引物对及其应用。

背景技术

随着经济和农业的不断发展，在人们生活质量得到改善的同时，人们的饮食结构也逐渐改善。肉类中，牛肉营养价值高，牛肉的消费比重增加最快，是一种理想的肉类食品。人们对高档牛肉的需求量与日俱增。延边黄牛主产于我国吉林省延边地区，具有延边朝鲜族特色，属于五大地方良种牛之一，是我国优质的肉用地方品种。延边黄牛多年来适应当地的自然环境，体格结实健壮、抗病性强、适应性强、耐粗饲、抗寒性强、容易育肥，符合当地居民的消费习惯，并且延边朝鲜族自治州较好的草质可保证延边黄牛摄取足够的营养，肉质明显优于其他品种牛，是适合小孩和老年人健康的具有保健功能的一款牛肉。延边黄牛为东北地区第一个肉用牛品种，与韩国的韩牛具有相同的祖先，肉质可与韩牛和日本和牛相媲美，具有高档牛肉的优质性状，使其具有很强的市场竞争力。由于最具特色的延边黄牛受到众多消费者的喜爱，延边黄牛产业已成为延边州最重要的畜牧产业，延边黄牛已被列为国家农业部重点保护品种和开发品种。

我国对牛肉肉质等级评分有着严格要求，肉质优劣取决于牛肉大理石状，肉质光泽、明亮度，肉质坚挺度和质地，脂肪颜色和光亮，最后得出质量的综合得分，其中每个指标都有明确的等级鉴定标准。由此可见，脂肪含量、蛋白含量、水分含量、嫩度、肉色等共同影响优质牛肉的肉质等级，但此标准在肉牛生产中应用性不强。为了适应消费市场需求及生产的便利化，不同的肉牛品种、不同的牛肉生产企业均制定了各自的高档牛肉等级标准。肉眼观察第12～13胸肋肌肉横切面，对照牛肉大理石花纹等级评定图谱确定眼肌大理石花纹等级(图5)。按6个等级进行评定。1级最好，6级最差。可根据肌内脂肪含量对等级作适当调整：1级：大理石花纹丰厚，肌内脂肪含量13％或以上；2级：大理石花纹较丰厚，肌内脂肪含量11％～13％；3级：大理石花纹适度，肌内脂肪含量4％～11％；4级：大理石花纹中等，肌内脂肪含量3％～4％；5级：大理石花纹轻度或少量，肌内脂肪含量2.5％～3％； 6级：大理石花纹微量或无，肌内脂肪含量2.5％或以下。延边黄牛牛肉生产实践中高档牛肉等级评定标准主要依据大理石花纹评分。然而高档肉牛较普通肉牛培育，具有育肥时间长的特点，一般高档肉牛达到“育肥牛”的标准需要培育2年，而普通肉牛培育1年即可出栏，同时高档肉牛的培育中饲喂更多的精料，因此造成高档肉牛的育肥成本更高。如果能从小牛出生开始则能判断该牛的肉质情况，针对性的培育优质肉质的候选牛，将大大降低培育成本，提高养殖收益。

基因多态性是一种与生物性状有密切相关的一种分子标记，通过与生物性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选择和提高筛选准确性的目的。

血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是血管生成素样蛋白家族(ANGPTLs) 的成员。马云对7个品种牛ANGPTL4基因进行了多态性检测，发现一个突变位点，位于基因3’非编码区54bp C→T，且研究表明此位点与牛的肌内脂肪含量具有相关性。马云等还研究了ANGPTL4基因在地方黄牛和青海牦牛上的基因多态性，结果发现，新的突变位点显著影响地方黄牛的部分性状，而对牦牛的部分性状影响不明显。张静等人对ANGPTL4基因的单核苷酸多态性检测表明ANGPTL4的遗传变异与牛育肥后肌内脂肪含量存在显著相关关系。Y.Ma等发现了牛ANGPTL4基因一个新突变(NC_007305.3： g.C6640T)，该突变位点与肌内脂肪(IMF)和牛肉性能指数(BPI)显著相关(p<0.01)，表明牛ANGPTL4基因对产量性状有正向影响。由上述研究进展可知，ANGPTL4基因在牛中研究广泛，并且存在多个多态性位点，不同的位点对性状的影响不同、且在不同品种中影响也不同，而有关延边黄牛ANGPTL4基因的多态性研究未见报道。因此，有待确定ANGPTL4基因的新的多态性位点及其与延边黄牛肉质性状的关联性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的延边黄牛ANGPTL4基因SNP 分子标记，所述SNP分子标记与延边黄牛的牛肉品质性状相关。

本发明的目的还在于提供一种用于新的延边黄牛ANGPTL4基因SNP分子标记的引物对和试剂盒，能够准确扩增、准确所述SNP分子标记的DNA片段。

本发明的目的还在于提供上述新的延边黄牛ANGPTL4基因SNP分子标记在筛选具有优质牛肉的延边黄牛中的应用。

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记，含有位于ANGPTL4基因第41995bp的多态性为C/T的核苷酸序列。

优选的，含有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的225位多态性位点为C/T。

本发明提供了一种用于扩增延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

本发明提供的用于预测延边黄牛肉质的试剂盒，包括所述的引物对。

本发明提供的所述ANGPTL4基因SNP分子标记、所述的引物对或所述试剂盒在延边黄牛高档肉牛早期筛选的应用。

优选的，所述延边黄牛高档肉牛早期筛选的方法，包括以下步骤：

1)以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，用所述的引物对进行普通 PCR扩增，得到扩增产物；

3)将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列；

4)根据所述片段序列中ANGPTL4基因225位的多态性确定具体基因型；

5)根据所述基因型选择幼年延边黄牛的培育方向：

当基因型为CT基因型时，将幼年延边黄牛向高档肉牛方向培育；

当基因型为CC基因型时，将幼年延边黄牛向普通肉牛方向培育。

优选的，步骤2)中普通PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃ 变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

优选的，步骤2)中普通PCR扩增的反应体系：2×TaqPCRMastermix 10 μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O补充至20μl。

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记，含有位于ANGPTL4基因第41995bp的多态性为C/T的核苷酸序列。所述 SNP分子标记位于ANGPTL4基因的第八外显子中。根据ANGPTL4基因遗传效应统计分析，等位基因频率和基因型频率计算结果显示：CC基因型出现的频率高于CT基因型，只发现这两种基因型，没有发现TT基因型，等位基因C为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算ANGPTL4基因41995bp C/T位点的相关参数，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC＝0.2688＜0.5，处于中度多态。ANGPTL4 基因多态性与肉质性状关联分析，41995bpC/T位点与延边黄牛脂肪含量、蛋白含量、胴体重性状呈显著相关性，表现为CT基因型的脂肪含量和胴体重均显著高于CC型(P＜0.05)，CT基因型大理石花纹等级显著优于CC 型。而CC基因型的蛋白含量显著高于CT基因型(P＜0.05)。

附图说明

图1为本发明中提取基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2为ANGPTL4基因SNP分子标记的扩增；

图3为ANGPTL4基因41995bp C/T位点扩增产物测序峰图；

图4为ANGPTL4基因41687bp C/T位点扩增产物测序峰图；

图5为大理石花纹评级图谱，其中1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。

具体实施方式

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记，含有位于ANGPTL4基因第41995bp的多态性为C/T的核苷酸序列，优选含有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的225位多态性位点为C/T。在本发明中，所述ANGPTL4基因SNP分子标记的片段优选采用基因合成或PCR扩增的方法得到。本发明对所述基因合成的方案没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成公司即可。

本发明提供了一种用于扩增延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。本发明对所述引物对的合成方程没有特殊限制，委托本领域所熟知的基因合成公司合成即可。

本发明提供了一种用于预测延边黄牛肉质的试剂盒，包括所述的引物对。本发明对所述引物对的浓度和体积的用量没有特殊限制，采用本领域所熟知的用量和浓度均可。所述试剂盒优选还包括2×Taq PCR Mastermix。所述2×Taq PCR Mastermix包括以下组分：PCR缓冲液、Mg²⁺、Taq聚合酶、 dNTPs等组分。本发明对所述2×TaqPCR Mastermix的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的2×Taq PCR Mastermix的来源即可。在本发明中，所述 2×TaqPCRMastermix购自大连宝生物公司。

本发明提供的所述ANGPTL4基因SNP分子标记或所述的引物对在延边黄牛高档肉牛早期筛选的应用。

在本发明中，所述延边黄牛高档肉牛早期筛选的方法，优选包括以下步骤：

1)以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

3)将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列；

5)根据所述基因型选择幼年延边黄牛的培育方向：

本发明以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA。所述提取基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因组DNA提取方法即可。在本发明实施例中，提取基因组DNA的方法采用试剂盒方法。所述试剂盒的种类为血液基因组DNA提取试剂盒，所述血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

得到基因组DNA后，本发明对基因组DNA进行质量检测。所述质量检测优选包括纯度检测和完整性检测。所述纯度检测优选在紫外分光光度计上进行，纯度检测的结果显示A₂₆₀/A₂₈₀值处于1.8左右，表明所提取的DNA 质量较好。所述完整性检测是将基因组DNA进行电泳，电泳图中DNA分子条带具有很好的完整性并且很清晰、没有发生明显拖尾、没有降解和污染现象，符合下一步PCR扩增要求。

得到合格的基因组DNA后，本发明以提取的基因组DNA为模板，用所述引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物。

在本发明中，所述普通PCR扩增的反应程序优选如下：95℃预变性5 min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸 10min。普通PCR扩增的反应体系优选如下：2×TaqPCRMastermix 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O补充至20μl。扩增产物的长度为703bp。

得到扩增产物后，本发明将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列。

在本发明中，所述测序委托基因测序公司进行。在本发明实施例中，测序是委托生工生物技术有限公司(上海)公司进行。

得到片段序列后，本发明根据所述片段序列中ANGPTL4基因225位的多态性确定具体基因型。

根据片段序列的峰图判断基因型，例如ANGPTL4基因225位出现两个不同碱基的套峰，则判断基因型为CT基因型(见图3-b)。当ANGPTL4基因225位出现一个单峰C时，则判断为基因型为CC基因型(见图3-a)。

得到幼年延边黄牛的基因型后，本发明根据所述基因型选择幼年延边黄牛的培育方向：

在本发明中，在本发明中，一般把色泽、新鲜度好、脂肪含量高、大理石状明显、嫩度好、食用价值高的牛肉称为“高档牛肉”。“高档牛肉”的来源为高档肉牛，通过早期筛选有利于了解幼年延边黄牛的肉质性状，定向培育，最大程度获得经济利益。优质牛肉的检测指标优选包括水分含量，脂肪含量、蛋白质含量、背膘厚度、大理石花纹评级和胴体重。所述水分含量的测定方法优选为直接干燥法。脂肪含量测定优选为索氏提取法。蛋白质含量测定方法优选为凯氏定氮法检测牛肉中的蛋白质含量。背膘厚度测定方法优选为屠宰后利用螺旋测微器垂直测量背最长肌部位的皮下脂肪厚度。大理石花纹评级的方法优选参考大理石花纹评级图谱(图5)，观察背最长肌横切面，按 6个等级评定延边黄牛大理石花纹等级，1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。通过测定一定数量的延边黄牛的上述6个指标，得到每头延边黄牛的6个指标的数据。

本发明将ANGPTL4基因225位多态性与肉质性状关联分析，结果发现： CT基因型的脂肪含量和胴体重均显著高于CC型(P＜0.05)，CT基因型大理石花纹等级显著优于CC型。而CC基因型的蛋白含量显著高于CT基因型(P＜0.05)。水分含量和背膘厚度两个指标在两个基因型中不呈现显著差异。高档牛肉的影响指标大理石花纹为决定性因素，也是市场选择高档牛肉的重要指标，而决定大理石花纹等级的因素包括脂肪含量、胴体重及宰杀前重等指标，而蛋白质含量不是影响大理石花纹的因素，因此，本申请舍弃蛋白质含量指标作为培育高档牛肉的选择指标。综合考量，将基因型为CT 的幼年延边黄牛向高档肉牛方向培育。本发明对所述高档肉牛方向培育的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的高档肉牛的培育方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记、引物对及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、样品采集

本试验牛群体选取吉林省延边畜牧开发集团有限公司延边黄牛公牛70 头，所有试验牛统一标准饲养条件育肥30月龄屠宰，按国家统一标准进行屠宰分割，屠宰前每头牛颈静脉采血25ml，加入抗凝剂，分装-80℃保存备用。

2、参照TIANGEN-血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取延边黄牛 DNA样本。紫外分光光度计检测所提取的延边黄牛DNA样品的纯度，确定 OD₂₆₀/OD₂₈₀值。琼脂糖凝胶电泳检测：用1％琼脂糖凝胶检测所提的延边黄牛DNA样本，根据片段长度电压电泳30min；凝胶成像系统观察。

紫外分光光度计检测结果显示A₂₆₀/A₂₈₀值处于1.8左右，表明所提取的 DNA质量较好。将提取DNA进行电泳，电泳图见图1，DNA分子条带具有很好的完整性并且很清晰、没有发生明显拖尾、没有降解和污染现象，符合下一步PCR扩增要求。

3、DNA扩增引物的选择与设计

参照NCBI提供的牛ANGPTL4基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计ANGPTL4引物(EU599233.1)，送至生工生物技术有限公司(上海)进行合成。引物序列见表1。

表1 基因引物信息

注：F:正向引物，R:反向引物。

4、PCR扩增与产物测序

在冰盒上按照表2反应体系配制溶液。

表2 PCR扩增反应体系

PCR扩增程序：预变性95℃5min；变性94℃30s，60℃30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，放至凝胶成像系统观察其扩增结果。以延边黄牛血液DNA为模板，扩增ANGPTL4基因，结果显示， ANGPTL4基因引物所扩增出来的片段与所预期的片段长度吻合，可以应用于接下来的测序分析中(见图2)。

5、PCR扩增产物测序

将所有PCR扩增产物及相应引物分装送至生工生物技术有限公司(上海)进行测序。

将扩增ANGPTL4基因的PCR产物进行直接测序，在第八外显子发现2 个SNP位点，图3为41995bp C/T位点扩增产物测序峰图，其中图3-a为 CC基因型峰图；图3-b为CT基因型峰图；图4为41687bp C/T位点位点扩增产物测序峰图，其中图4-a为CC基因型峰图；图4-b为CT基因型峰图。

6、ANGPTL4基因遗传效应统计分析

ANGPTL4基因41687bp C/T位点的等位基因频率和基因型频率计算结果见表3，表现为CC基因型出现的频率高于CT基因型，只发现这两种基因型，没有发现TT基因型，等位基因C为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算ANGPTL4基因 41687bp C/T位点的相关参数，如表4所示，该位点的多态信息含量为0.25 ＜PIC＝0.2604＜0.5，处于中度多态。

表3 ANGPTL4基因41687bp C/T位点的基因频率及基因型频率

表4 ANGPTL4基因41687bp C/T位点的遗传变异参数

ANGPTL4基因41995bp C/T位点的等位基因频率和基因型频率计算结果见表5，表现为CC基因型出现的频率高于CT基因型频率，只发现这两种基因型，没有发现TT基因型，等位基因C为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算ANGPTL4基因41995bp C/T位点的相关参数，如表6所示，该位点的多态信息含量为 0.25＜PIC＝0.2688＜0.5，处于中度多态。

表5 ANGPTL4基因41995bp C→T位点的基因频率及基因型频率

表6 延边黄牛ANGPTL4基因41995bp C→T位点的遗传变异参数

实施例2

1、试验动物与样品采集

本试验牛群体选取吉林省延边畜牧开发集团有限公司延边黄牛公牛70 头，所有试验牛统一标准饲养条件育肥30月龄屠宰，按国家统一标准进行屠宰分割，采集12到13肋间背最长肌，真空包装后低温保存，用于测定肉质性状。

2、牛主要性状指标的测定

⑴水分含量测定:直接干燥法

水分质量分数按式(1)计算：

式中：M1为称量瓶及烘干前质量，g；M2为称量瓶及烘干后质量，g； M0为已恒重的称量瓶质量，g。

⑵脂肪含量测定：索氏提取法

脂肪的质量分数按式(2)计算：

式中：M为试样质量，g；M1为抽提后质量，g；M2为抽提前质量，g。

⑶蛋白质含量测定

选择凯氏定氮法检测牛肉中的蛋白质含量。

⑷背膘厚度测定

屠宰后利用螺旋测微器垂直测量背最长肌部位的皮下脂肪厚度。

⑸大理石花纹评级

参考大理石花纹评级图谱(见图5)，观察背最长肌横切面，按6个等级评定延边黄牛大理石花纹等级，1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。

3、ANGPTL4基因多态性与肉质性状关联分析

通过对ANGPTL4基因多态性与延边黄牛肉水分含量、脂肪含量、蛋白含量、宰前重、胴体重、背膘厚性状进行关联分析，结果见表7，可知，上述性状方面，41687bp C/T位点与延边黄牛上述肉质性状均不显著相关。 41995bp C/T位点与延边黄牛脂肪含量、蛋白含量、胴体重性状呈显著相关性，表现为CT基因型的脂肪含量和胴体重均显著高于CC型(P＜0.05)， CT基因型大理石花纹等级显著优于CC型。而CC基因型的蛋白含量显著高于CT基因型(P＜0.05)。

表7 ANGPTL4基因C41687T、C41995T位点多态性与肉质性状的关联分析

注：表中肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P ＞0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 延边大学

<120> 一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 706

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcccttccc ccagacaacc agaggggagc cccttcctca accagcccca acctgactct 60

gtgcctctct cccatcacca cctccgggtg gcctccaggc tttctctgag tgggtacagt 120

ggctcagcag ggcgccagag cagcctggtc ctccagggca ccaacttcag cacgcgcgac 180

gcagacaatg acaactgcct ctgcaagtgc gcccagatgc tgtccggagg tgggtgcaag 240

atggggtgga cccacgcctc tgcacaggct cacctggctg aacaccttta tcgcctcccc 300

acttgggtct ttgtgcagcc aggtgccatc aagaagtggg tacaagtcag ggtctcactc 360

acttgcaggc tggcctggct gtacctcatc caaacttccc tacttccact gagtccttaa 420

ggtcccctcc agggtctcac cgccccctaa agctggcacc tccagttctc ccctgagacc 480

tcagagcagc actgatgctg gggaccaggg tgcaccctag gggggtaaaa tgcctaatct 540

gctccaaccc cagatttgag actcccccgc aaccctcctc caggccaagc aggatcagga 600

ggagggagac ctgggttggg ggcagagggg cagctgccca ccaactctga ctcaggcagt 660

gttttctgca gagagcgatg tcagagagtg ggagtggggg atgtga 706

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccttccca ggacaacc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcacatccca tctcccac 18

Claims

1.一种延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记，其特征在于，含有位于ANGPTL4基因第41995bp的多态性为C/T的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的ANGPTL4基因SNP分子标记，其特征在于，含有如序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的225位多态性位点为C/T。

3.一种用于扩增延边黄牛肉质相关的ANGPTL4基因SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

4.一种用于预测延边黄牛肉质的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物对。

5.权利要求1或2所述的ANGPTL4基因SNP分子标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在延边黄牛高档肉牛早期筛选中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述延边黄牛高档肉牛早期筛选的方法，包括以下步骤：

1)以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，用权利要求3所述的引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物；

3)将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列；

5)根据所述基因型选择幼年延边黄牛的培育方向：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中普通PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤2)中普通PCR扩增的反应体系：2×Taq PCR Mastermix 10μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O补充至20μl。