CN113584182A - 一种与四川牦牛牛肉肉色红度性状相关的slc27a5基因的遗传标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与四川牦牛牛肉肉色红度性状的显著相关的SLC27A5基因SNP位点，该SNP位点位于NC_037345.1：65740140，即ARS‑UCD1.2版牛基因组的第18染色体的第65740140位，当样本基因型为CT时，肉色红度显著深于TT基因型。本发明从四川牦牛群体中发现了一个位于SLC27A5基因第2内含子上的一个SNP位点，即I2‑311C>T。该SNP位点不同基因型与四川牦牛肉色呈显著相关关系(P<0.05)，其中CT基因型的牦牛肉色红度显著深于TT基因型，可作为四川牦牛肉色的分子遗传标记位点。该SNP位点对为肉牛分子标记和辅助选择提供了依据，也为我国牛产业的优良牛品种的选育工作奠定理论基础。

Description

一种与四川牦牛牛肉肉色红度性状相关的SLC27A5基因的遗 传标记

技术领域

本发明涉及家畜分子育种技术领域，具体地，涉及一种与四川牦牛牛肉肉色红度性状相关的SLC27A5基因的遗传标记。

背景技术

牦牛(Bos grunniens)起源于中国，分布于我国高原及其毗邻地区，由于对高海拔地区冷冽严酷的自然条件有良好适应能力，而成为高寒牧区最基本的生产生活资料，得到了“雪域之舟”、“高原之舟”的美誉。牦牛在天然有机的绿色的高原牧场下自然放牧，形成了牦牛奶、牦牛肉、牦牛绒、牦牛皮等优质畜产品，在农业增效、牧民增收、等方面发挥了重要作用。

我国牦牛数量占世界总数的95％以上，有13个牦牛地方品种和1个牦牛培育品种，其中，四川牦牛如麦洼牦牛、九龙牦牛、木里牦牛、金川牦牛、昌台牦牛等多个传统地方畜禽品种已列入配套发布的《国家畜禽遗传资源品种名录》。

现代肉质主要包括食用品质、营养品质、技术品质等几大方面，牛肉品质主要分析肉色、嫩度、pH水平等方面性状。

(1)食用品质(Eating quality)：涉及色泽、嫩度、风味、多汁性等多个品质特性。主要由肌肉色素(肌红蛋白Mb为主，血红蛋白为辅)含量及其化学状态(铁离子价态及肌红蛋白和氧的化合反应)决定。若肌肉中血液残留较多，血红蛋白(Hb)含量增加，肉色也将会更深，肌纤维类型也会受到影响，即红肌纤维颜色较深，白肌纤维颜色较浅。此外，肉色也受动物品种、性别(雄性动物肉色较深)、年龄(年龄大的动物肉色较深)、部位、饲养管理等因素影响，其稳定性与牦牛肉的抗氧化能力和抗氧化酶活性直接相关。牦牛肉色明显比黄牛肉更红更深，是因为牦牛肉的肌红蛋白含量明显更高；然而牦牛肉中肌红蛋白较黄牛肉中肌红蛋白的的氧化速率更慢。有研究发现，草饲牦牛肉比谷饲牦牛肉肉色相对更稳定，这是因为草饲牦牛体内Fe离子还原能力和自由基清除能力更强，高铁肌红蛋白累积速率更慢。

(2)营养品质(Nutritional quality)：包括肉的蛋白质含量及氨基酸组分、脂肪含量及脂肪酸组分(饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸)、矿物质含量，维生素含量。牦牛肉中的蛋白质含量较高，约为21.6％左右，肌内脂肪含量比较低，约为1.6％～4.7％，与普通牛肉相比具有高钙、高蛋白、低脂、富含多种维生素矿物质的特点。牦牛肉总氨基酸含量高且种类齐全，接近联合国粮农组织(FAO)提出的理想蛋白。此外，脂肪酸在机体的生长发育和新陈代谢等生命活动过程中发挥着不可替代的作用。牦牛肉中饱和脂肪酸(SPA)相对含量范围是45％～50％；单不饱和脂肪酸(MUFA)的相对含量为35％～45％，多为油酸和棕榈油酸；而多不饱和脂肪酸(PUFA)相对含量为5％～12％。研究表明，牦牛肉比秦川牛、西门塔尔牛等黄牛品种具有更高相对水平含量的n-3多不饱和脂肪酸。

(3)技术品质(Technological quality)：包括系水力，pH水平，蛋白质变性程度﹑脂肪饱和程度、结缔组织含量、抗氧化能力等方面。肌肉pH值的变化与宰后肌肉中糖酵解等反应有关，刚屠宰后牛肉pH值约为7，随着无氧糖原酵解产生大量酸性物质，ATP下降到初始含量的20％以下，屠宰后24h通常下降至极点5.4～5.6，而僵直解除后pH会缓慢上升，而做好屠宰前后管理措施可有效控制肌肉pH值。过度运动等宰前应激行为会造成牦牛肌肉内肌糖原消耗增加，pH值偏高，肌肉内含氧量减少，阻碍氧合肌红蛋白生成，从而导致肉色发黑，形成黑干肉(DFD)。放牧牦牛比舍饲牦牛肉的pH值下降更慢且pH 极限值更高，猜测是因为补祠后的舍饲牦牛肉中的糖原储存量更充足，从而拥有更高水平的乳酸生成量。

牦牛的肉品质性状是多个基因相互调控、共同指导一系列生化反应的结果。目前与牦牛肉品质相关的基因有心脂肪酸结合蛋白(Heart Fatty Acid Binding Protein，H-FABP)、生肌调节因子(MRFs)、瘦素(Leptin)、脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase，FASN)、锚定蛋白(Ankyrin1，ANKI)、肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)等。

CN201711323849.2公开了草原红牛生理指标相关的分子标记及其应用，其中涉及到草原红牛的屠宰率、体长、体高、胸围、管围和十字部性状；CN201711323847.3公开了草原红牛肉质相关的分子标记及其在肉质鉴定中的应用，其中涉及到草原红牛的净肉率、失水率、大理石花纹、剪切力、肉色和pH值性状；CN201711323846.9公开了草原红牛脂肪含量相关的分子标记及其获取方法和应用；CN201910614268.7公开了与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用，但是尚无牦牛相关分子标记的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种与四川牦牛牛肉肉色红度性状相关的SLC27A5基因的遗传标记。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明采用DNA测序技术和PCR-RFLP的方法对91头四川牦牛样品的SLC27A5基因进行单核苷酸多态性分析，探究SLC27A5基因多态性与四川牦牛肉品质性状的相关关系。本发明从四川牦牛群体中发现了一个位于SLC27A5基因第2内含子上的一个SNP位点，即I2-311 C>T(该SNP位点位于NC_037345.1：65740140，即ARS-UCD1.2版基因组的第18染色体的第65740140位核苷酸)。该SNP位点不同基因型与四川牦牛肉色呈显著相关关系(P<0.05)，其中CT基因型的牦牛肉色红度显著深于TT基因型，可作为四川牦牛肉色的分子遗传标记位点。

本发明要求保护一种检测与四川牦牛牛肉肉色红度性状的显著相关的SNP位点基因型的试剂，所示试剂用于检测位于NC_037345.1：65740140的SNP位点基因型，即 ARS-UCD1.2版牛基因组的第18染色体的第65740140位核苷酸；

当样本基因型为CT时，肉色红度显著深于(大于)TT基因型。

优选地，所述试剂为引物。

更优选地，所述引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明还要求保护所述试剂的任意一种或几种在制备评价四川牦牛牛肉肉色红度品质性状的试剂盒中的应用。

以及，所述试剂的任意一种或几种在评价四川牦牛牛肉肉色红度品质性状中的应用。

本发明还要保护一种评价四川牦牛牛肉肉色红度性状的试剂盒，包括所述的试剂。

优选地，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示引物。

上游序列:5'-CGTTTCGCACCCCAATAC-3'(SEQ ID NO:1)；

下游序列:5'-GCACAGAGTCAGCATCCCT-3'(SEQ ID NO:2)。

更优选地，还包括PCR试剂。

进一步优选地，还含有特异性内切酶EarI。

一种评价四川牦牛牛肉肉色红度性状的方法，检测位于NC_037345.1：65740140的SNP位点基因型：

当样本基因型为CT时，肉色红度显著深于TT基因型。

在本发明的一个具体的实施例中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示引物对样本进行PCR扩增，扩增产物中NC_037345.1：65740140的基因型为CT时，肉色红度显著深于TT基因型。

在本发明的另一个具体的实施例中使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示引物对样本进行PCR扩增，限制性内切酶EarI对纯化后的PCR扩增产物进行酶切，电泳；TT基因型为一条条带，CT基因型至少为两条条带；基因型为CT时，肉色红度显著深于TT基因型。

所述试剂、或所述试剂盒中的一种或几种在四川牦牛牛肉肉色红度性状育种中的应用，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从四川牦牛群体中发现了一个位于SLC27A5基因第2内含子上的一个SNP位点，即I2-311 C>T。该SNP位点不同基因型与四川牦牛肉色呈显著相关关系(P<0.05)，其中CT基因型的牦牛肉色红度显著深于TT基因型，可作为四川牦牛肉色的分子遗传标记位点。该SNP位点对为肉牛分子标记和辅助选择提供了依据，也为我国牛产业的优良牛品种的选育工作奠定理论基础。

附图说明

图1为SLC27A5基因PCR扩增结果；M为DL 2000DNA Marker，泳道1、2为PCR 产物电泳结果。

图2为SLC27A5基因混池扩增产物测序结果

图3为SLC27A5基因单个样品PCR扩增结果；M：为DL2000 DNA Marker，泳道1～ 16：为PCR产物电泳结果。

图4为酶切产物电泳结果；M为DL 2000DNA Marker；泳道1～6：基因型依次为CC、TT、CT、CC、TT、CT。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1牛SLC27A5基因的基因型

一、实验方法

1、DNA引物的设计

根据Ensembl中公布的牛SLC27A5基因序列(ENSBTAT00000020170.6)，利用Primer5.0软件对SLC27A5基因进行引物设计，上游序列:5'-CGTTTCGCACCCCAATAC-3'(SEQ ID NO:1)；下游序列:5'-GCACAGAGTCAGCATCCCT-3'(SEQ ID NO:2)，扩增产物长度为736bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、四川牦牛血液基因组DNA混池的制备

选用91头在相同的管理条件下、相同环境、相同时期饲养于四川某牛场的四川牦牛，收集每头牛相同部位的静脉血液并用抗凝剂处理，放于-80℃冰箱储存。使用血液DNA提取试剂盒(北京天根)提取个体样本的DNA，得到个体的DNA和DNA混池样品。

3、混池的PCR扩增及测序

以四川牦牛血液基因组DNA混池为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系(总体积为 20μL)：DNA模板1.0μL，上下游引物(SEQ ID NO:1和2)各0.4μL，Buffer 4μL，dNTP Mix 1.6μL，Primer STAR 0.4μL，去离子水12.2μL，见表1。

PCR扩增程序：94℃预变性4min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min， 35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测确认目的片段正确，交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表1PCR反应体系

二、实验结果

PCR扩增的电泳结果显示各产物条带清晰明亮，无抹带现象和非特异性扩增条带，引物扩增的PCR产物大小为736bp，引物序列为：上游序列:5'-CGTTTCGCACCCCAATAC-3'(SEQ ID NO:1)；下游序列:5'-GCACAGAGTCAGCATCCCT-3'(SEQ ID NO:2)，参考 Marker标识，引物位置准确，如图1所示。

测序结果如图2，从PCR扩增产物的测序结果中发现1个明显套峰。该突变位点位于内含子2上第311个碱基处(I2-311 C>T)，位于NC_037345.1：65740140，即ARS-UCD1.2 版牛基因组的第18染色体的第65740140位核苷酸。

实施例2个体PCR-RFLP检测及基因分型

一、实验方法

以实施例1的在相同的管理条件、相同环境、相同时期饲养于四川某牛场的四川牦牛 91头，提取血液DNA样品，对四川牦牛血液基因组个体DNA为模板进行PCR扩增。具体体系和PCR扩增反应程序同实施例1。

使用1.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物后，再将扩增出的PCR产物用内切酶EarI进行特异性酶切检测。

限制性内切酶的酶切体系(总体积为10μL)：PCR产物7μL，特异性内切酶EarI 0.2μL，10×Cutsmart buffer 1μL，去离子水1.8μL，放于37℃水浴1h后，取8μL酶切产物，与2μL上样缓冲液混匀，再用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测条带，电泳条件：120V、400A、 20min。最后观察结果并记录不同样品个体的基因型。

二、实验结果

PCR扩增产物电泳结果如图3所示，以四川牦牛的个体血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物进行DNA电泳检测，观察确认电泳条带清晰明亮，无抹带现象和特殊结构再进行酶切试验。

限制性内切酶EarI的酶切结果如图4显示，四川牦牛群体SLC27A5基因的突变位点位于内含子2上第311个碱基处，位于NC_037345.1：65740140，即基因组的第18染色体的第65740140位核苷酸位，碱基C突变为T，即I2-311 C>T。I2-311 C>T位点存在三种基因型，分别是CC、TT和CT。理论上，CC基因型电泳结果有两条带，即736bp的双链DNA分子均被EarI酶切割成长度为662bp和74bp的片段；TT基因型的电泳结果显示为一条736bp的条带，即736bp的双链DNA分子未被EarI酶识别切割；CT基因型本应显示出三条带，即736bp的双链DNA分子中一条链未被EarI酶识别切割仍为736bp，另一条链被EarI酶切割成662bp和74bp，但由于PCR样品中目的片段的浓度不高，且 74bp条带的亮度仅仅约为条带736bp的1/10，其分子量太小又导致在相同电流条件下电泳速度远大于另外两个片段，因而本次试验中的74bp条带在电泳图中难以显像。

实施例3肉品质性状测定

一、实验方法

选取四川牦牛的3个肉品质性状对实施例1的91头四川牦牛进行测量并记录数据。以下是性状的测定方法：

(1)背膘厚：测量位置约在脂肪厚测定在第十二、十三肋骨间脂肪处，也即在眼肌长度约四分之三处。每头牛使用标尺测量三次，取平均值并记录。

(2)pH值：将91头四川牦牛屠宰后的里脊置于4℃保存，在45min和24h时，分别用pH计测定里脊的pH值。每个样品进行三次测定，取平均值并记录。

(3)肉色：将91头四川牦牛屠宰后取肌肉样品置于4C冷库保存，在宰后约24小时分别用色度仪测量背最长肌的亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)等三个参数。每个样品分别三次测定取平均值。

二、实验结果

91头四川牦牛SLC27A5基因SNP位点的基因型频率和基因频率分布情况如下表2所示。I2-311 C>T位点的等位基因C和T的基因频率均为0.5，因两种基因的频率相等，所以研究群体中无明显的优势基因；该位点存在三种基因型CT、CC、TT，其中优势等位基因型为CT，基因型频率为0.4945，CC、TT基因型的频率均为0.2527。卡方值为0.0110，遗传杂合度(H)为0.500，多态信息含量(polymorphism information content，PIC)为0.375，均在0.25～0.5范围内，这表明该位点在群体中属于中度多态性，χ2检验说明I2-311 C>T 位点在该四川牦牛群体中处于哈代温伯格平衡(p>0.05)。

表2.SLC27A5基因SNP的群体遗传特性

注：χ²值表示未达到显著水平(P>0.05)，χ² _0.05(df＝2)＝5.99，χ² _0.01(df＝2)＝9.21

实施例4四川牦牛SLC27A5基因I2-311 G>T位点与肉质性状的相关性分析

一、实验方法

统计计算该四川牦牛群的等位基因的基因频率、基因型频率、遗传杂合度(H)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)；利用SPSS 23.0软件的单因素方差分析对SLC27A5基因多态位点与四川牦牛的肉品质的相关性进行差异显著性检验，当P<0.05时表示差异显著，P<0.01时表示差异极显著，数据以“平均数±标准误”表示。

二、实验结果

选取背膘厚(cm)、屠宰pH45min、屠宰pH24h、肉色亮度(L*)、肉色红度(a*)、肉色黄度(b*)这6个评价肉品质性状的指标进行数据统计分析，探究期与SLC27A5基因I2-311 C>T位点上三种基因型的关联性。

在91个样品中，SLC27A5基因I2-311 C>T位点上三种基因型在背膘厚(cm)、屠宰pH45min、屠宰pH24h、肉色亮度(L*)、肉色红度(a*)、肉色黄度(b*)这6个评价肉品质性状的指标上的数据如下表3所示，可看出该位点与背膘厚、屠宰后45min肉质 pH、屠宰后24h肉质pH、肉色亮度(L*)、肉色黄度(b*)无明显关联，而SLC27A5 基因I2-311 C>T位点不同基因型与肉色红度(a*)存在显著相关关系(P<0.05)，CT基因型肉色红度显著高于TT基因型(P<0.05)，但与CC基因型差异不显著(P＞0.05)。

表3.四川牦牛SLC27A5基因SNP与肉质性状的相关性分析

多态信息含量(Polymorphism information content，PIC)用于估计群体样本中标记基因的多态性，表示DNA变异程度高低。PIC<0.25为低度多态，0.25<PIC<0.5为中度多态， PIC>0.5为高度多态。I2-311 C>T位点的等位基因C和T的基因频率均为0.5，因两种基因的频率相等，所以研究群体中无明显的优势基因；该位点存在三种基因型CT、CC、TT，其中优势等位基因型为CT，基因型频率为0.4945，CC、TT基因型的频率均为0.2527。卡方值为0.0110，说明该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，表明91个四川牦牛个体受到人工选择的影响较小，群体遗传性较好。遗传杂合度(H)和多态信息含量 (PIC)均在0.25～0.5范围内，这表明该位点在群体中属于中度多态性。

背膘厚一般与肌肉脂肪含量呈正相关，与瘦肉率呈负相关，一般规定背膘厚不低于3mm 较为理想。脂肪在肌肉中的含量会很大程度影响肉的嫩度和多汁性等食用品质，而脂肪酸的组成一定程度上决定了肉的风味和营养价值。色度仪参数有亮度(L*)、红度(a*值)、黄度(b*值)等，对评定肉质有重要参考意义。肉色深浅和均匀度主要由肌肉色素含量及其化学状态决定，若肌肉中血液残留较多，Hb含量增加，肉色也更深。肉色对评定肉质有重要参考意义。一般来说肉的亮度越低，肉色越好；红度越高，肉色越好，即肉品质性状越佳，黄度越低，肉色越好。而肌肉的pH值是反映家畜屠宰后肌肉糖原酵解速率的重要指标，通常正常肉的pH45min≥5.6，pH24h≤6.0，否则可能是生理异常肉(PSE肉、DFD 肉)。本发明显示SLC27A5基因I2-311 C>T位点与肉色红度(a*)存在显著相关关系，其中杂合基因型CT型比突变基因型TT会使四川牦牛肉色红度更深，肉质更好。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种与四川牦牛牛肉肉色红度性状相关的SLC27A5基因的遗传标记

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtttcgcac cccaatac 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacagagtc agcatccct 19

Claims (10)

1.一种检测与四川牦牛牛肉肉色红度性状的显著相关的SLC27A5基因的SNP位点基因型的试剂，其特征在于，

所示试剂用于检测位于NC_037345.1：65740140位点的SNP位点基因型；

当样本基因型为CT时，肉色红度显著深于TT基因型。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂为引物。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

4.权利要求1到3所述试剂的任意一种或几种在制备评价四川牦牛牛肉肉色红度品质性状的试剂盒中的应用。

5.权利要求1到3所述试剂的任意一种或几种在评价四川牦牛牛肉肉色红度品质性状中的应用。

6.一种评价四川牦牛牛肉肉色红度性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示引物。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR试剂。

9.一种评价四川牦牛牛肉肉色红度性状的方法，其特征在于，

检测位于NC_037345.1：65740140的SNP位点基因型；

当样本基因型为CT时，肉色红度显著深于TT基因型。

10.权利要求1到3所述试剂、或权利要求6所述试剂盒中的一种或几种在四川牦牛牛肉肉色红度性状育种中的应用。

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