CN114381530A - 一种鉴定牛mcat基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法 - Google Patents

一种鉴定牛mcat基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法，克服了现有技术中用于牛肉肉色性状育种的基因或标记稀缺的问题。所述引物为检测牛MCAT基因第四外显子片段的引物对，序列如SEQ ID NO.1～2所示，扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段第70bp与牛肉肉色性状显著相关，AA和GA基因型的肉色红度显著深于GG型，能够用于肉色性状的优良种群选育，鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物能够成功扩增出所述突变位点，评价牛肉肉色红度的方法切实可行，为肉牛优良品种的选育奠定了基础。

Description

一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛 肉肉色红度的方法
技术领域
本发明涉及分子遗传学技术领域，尤其涉及一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法。
背景技术
牛肉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成比猪肉更接近人体需要，能提高机体抗病能力，对生长发育及手术后、病后调养的人在补充失血和修复组织等方面特别适宜。寒冬食牛肉，有暖胃作用，为寒冬补益佳品。适用于中气下陷、气短体虚，筋骨酸软和贫血久病及面黄目眩之人食用。牛肉品质是消费者最看重的指标，通过测定肉质嫩度、背膘厚、眼肌面积、大理石纹分值、肉色等进行评定，影响牛肉肉质的功能基因筛选对分子标记辅助选育有重要意义。
牛肉的肉品质性状是多个基因相互调控、共同指导一系列生化反应的结果。基因标记信息可提高肉质性状并加快遗传进程，进而筛选优秀个体得到想要的基因型后代。重要经济性能的候选基因鉴定和利用已经成为提高肉牛生产率、牛肉品质和维持动物健康最重要的长期目标。但肉质性状为数量性状，受微效多基因和环境因素影响，尽管已经针对肉质性状鉴定到一些数量性状位点，但目前能用于育种的有用基因或标记十分稀缺。
目前关于牛肉品质性状的研究更多集中在肉质嫩度、背膘厚、眼肌面积等方面，但是牛肉肉色相关分子标记的报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法，能够用于优良种群选育。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物，所述引物为检测牛MCAT基因第四外显子片段的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明还提供了一种评价牛肉肉色红度的方法，采用上述引物对牛MCAT基因进行PCR扩增，得到PCR产物；
对PCR产物进行测序，根据测序结果确定扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段的第70bp位点的基因型；
当样本基因型为AA和GA时，肉色红度显著深于GG型。
优选的，所述PCR扩增的反应程序如下：
94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min。
本发明还提供了一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物的应用，用于肉色性状的优良种群选育。
优选的，所述肉色性状的优良种群选育具体为选择扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段的第70bp处基因型为AA和GA的个体进行育种。
本发明的技术效果和优点：
本发明提供了一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法，所述引物扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段的第70bp与牛肉肉色性状显著相关，AA和GA基因型的肉色红度显著深于GG型，能够用于肉色性状的优良种群选育，所述鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物能够成功扩增出所述突变位点，所述评价牛肉肉色红度的方法切实可行，为肉牛优良品种的选育奠定了基础。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图2为基因型波峰图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1引物设计
采用primerprenier 5.0软件设计引物MB，由天津金唯智有限公司合成，用超纯水溶解后于-20℃保存，引物序列如下：
上游序列：5’-AGCCTCCTCTGGATACGAT-3’(SEQ ID NO.1)
下游序列：5’-CCCAGGGTTTGACATAGGC-3’(SEQ ID NO.2)。
实施例2混池制备
采集吉林省内某规模化牛场延边黄牛89头的组织样，于-80℃保存，使用基因组DNA小量制备试剂盒(购自康宁生命科学吴江有限公司)提取延边黄牛组织基因组DNA，得到个体DNA和混池DNA样本。
实施例3PCR扩增
用上述引物对第四外显子进行PCR扩增，以延边黄牛组织基因组DNA为模板：
PCR扩增体系(总体积为20)：2xES酶预混液(购自北京康为世纪生物科技有限公司)10μL、上下游引物各0.5μL、超纯水8μL，DNA模板1μL。
PCR扩增程序：95℃预变性4min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min，取PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，(M为marker，1对应混池，2对应GG，3对应GA，4对应AA)，根据图1可知，本发明引物能够成功扩增出目的基因片段，电泳条带清晰、明亮，不同基因型片段大小均一，说明PCR产物特异性较高。
将PCR产物送到天津金唯智测序。
实施例4序列比对
通过DNAMAN软件对测序结果进行核苷酸序列比对，结果发现扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段第70bp处存在A/G的突变；对其氨基酸序列进行比对发现，结果引起氨基酸发生改变；利用Chromas软件对测序结果的波峰图依次比对。将与GenBank中牛MCAT基因(登录号：113892135)具有相同序列的定义为AA和GG基因型，将具有套峰的碱基序列定义为AG基因型，如图2所示。
实施例5基因频率统计
统计分析基因频率是指某种基因在某个种群中所出现的比例；基因型频率是指某种特定基因型的个体占群体内全部个体的比例。通过基因(型)频率计算遗传杂合度(He)、遗传纯合度(Ho)、多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(Ne)，计算公式如下：
Ne＝1/(1-He)
Figure BDA0003510948600000041
Ho＝1-He
Figure BDA0003510948600000042
式中，n：等位基因数；Pi、Pj：第i、j个等位基因频率。
PIC＜0.25为低度多态，0.25＜PIC＜0.5为中度多态，PIC＞0.5为高度多态。
综合琼脂糖凝胶电泳结果可知，扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段第70bp处A突变为G，出现频率31％(31/100)，基因型频率和基因频率如下表1所示：
表1位点基因型频率和基因频率
Figure BDA0003510948600000043
遗传杂合度(He)、遗传纯合度(Ho)、多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(Ne)如下表2所示：
表2位点遗传杂合度(He)、遗传纯合度(Ho)、多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(Ne)
Figure BDA0003510948600000044
实施例6性状关联
色度仪参数中的红度(a值)对评定肉质来说有着重要的参考意义，肉的红度越高，肉色越好，即肉品质性状越佳，本发明
在样本宰杀后45-60分钟内进行肉色值测定，得到a值肉色1h，利用SPSS 19.0软件分析不同基因型与延黄牛肉色性状相关性，结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05为差异显著性判断标准，结果如下表3所示：
表3不同基因型与肉质性状(肉色1h a值)相关性
基因型 头数 肉色1ha值
AA 20 20.20±1.86
GA 42 20.23±2.07
GG 27 18.93±2.53
采用SPSS 13.0统计软件的独立样本t检验方法对肉质性状与基因型之间进行关联分析，结果如下表4所示：
表4基因型与肉质性状(a值肉色1h)关联分析
Figure BDA0003510948600000051
*.均值差的显著性水平为0.05。
由表3和表4可知，扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段第70bp的不同基因型与延黄牛肉色1h，a值存在显著性差异，其中GG和GA基因型均显著高于AA基因型(P＜0.05)。
由以上实施例可知，本发明提供了一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法，涉及的位点与牛肉肉色性状显著相关，AA和GA基因型的肉色红度显著深于GG型，能够用于肉色性状的优良种群选育，所述鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物能够成功扩增出上述突变位点，所述评价牛肉肉色红度的方法切实可行，为肉牛优良品种的选育奠定了基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物以及一种评价牛肉肉色红度的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcctcctct ggatacgat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccagggttt gacataggc 19

Claims (5)

1.一种鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物，其特征在于，所述引物为检测牛MCAT基因第四外显子片段的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.1～2所示。
2.一种评价牛肉肉色红度的方法，其特征在于，采用权利要求1所述引物对牛MCAT基因进行PCR扩增，得到PCR产物；
对PCR产物进行测序，根据测序结果确定扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段的第70bp位点的基因型；
当样本基因型为AA和GA时，肉色红度显著深于GG型。
3.根据权利要求2所述的评价牛肉肉色红度的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序如下：
94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min。
4.权利要求1所述的鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物的应用，其特征在于，用于肉色性状的优良种群选育。
5.根据权利要求4所述的鉴定牛MCAT基因单核苷酸多态性的引物的应用，其特征在于，所述肉色性状的优良种群选育具体为选择扩增出的牛MCAT基因第四外显子片段的第70bp处基因型为AA和GA的个体进行育种。
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