KR20130050211A

KR20130050211A - 한우 마블링 진단용 유전자 검사 방법

Info

Publication number: KR20130050211A
Application number: KR1020110115437A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 신성철; 허재필; 김옥정; 박세영
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2013-05-15
Also published as: KR101289484B1

Abstract

본 발명은 한우의 마블링(marbling)과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자표지(DNA marker)를 이용한 한우 육질 진단 방법에 관한 것으로서, 마블링이 우수한 한우의 유전적 자질을 예측하고 판정하는 마블링 연관 분자표지를 발굴하여 이를 이용한 고품질 한우의 조기선발 및 개체 평가의 정확성을 제고하는 데 활용 가능한 유전자 검사 방법을 제공하기 위한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 한우 ACAD8 (endothelial differentiation G-protein coupled receptor 1) 유전자의 exon 3번 영역 내에 존재하는 특정 SNP를 이용하여 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 기법으로 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 DNA marker를 검출함으로써 이들 가운데 AA 유전자형을 가진 개체들을 GG 및 GA 유전자형을 가진 개체들에 비해 유전적으로 마블링이 우수한 개체로 진단하여 판별하는 한우 마블링 진단용 유전자 검사 방법을 제공한다.

Description

한우 마블링 진단용 유전자 검사 방법 {Method of genetic test for diagnosis of marbling trait in Korean cattle}

본 발명은 분자유전학적 분석기법인 PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism; 제한효소절편다형)분석을 통하여 한우 마블링(marbling) 형질과 밀접하게 연관되어 있는 ACAD81 (acyl-CoA dehydrogenase family, member 8) 유전자의 특정 SNP(단일염기다형)를 이용한 한우 육질 연관 분자표지를 발굴함으로써, 이를 이용하여 유전적으로 마블링이 우수한 한우를 조기에 진단하여 판별할 수 있는 기술을 제공한다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)은 1986년 Kary Mullis에 의해서 처음 소개되었다. PCR 방법의 개발로 인해 소량의 DNA를 이용하여 표적유전자의 상태를 알 수 있게 해 주는 혁명적인 것이라 할 수 있다. 1953년 Watson과 Crick에 의해 DNA 나선 구조의 해명으로 시작된 DNA 분자생물학의 세계는 20년 후 제한효소의 발견과 그에 따른 DNA Cloning법, 염기서열 결정법의 개발로 새로운 발전을 맞게 되었다. 최근의 분자 유전학 기법의 발달은 DNA수준에서의 유전자 marker의 개발이 가능한 방향으로 발달되어 왔다.

가축의 유전 및 육종학 분야에서도 DNA의 다형성을 이용하여 유전자를 marker gene으로 육종개량에 활용하고 있다. DNA의 다형성은 중요한 경제형질을 결정하는 주요 유전자와 양적형질(QTL; quantitative trait loci)에 의한 marker의 개발을 가능하게 하며, 연관 분석(linkage analysis), 유전자 지도(genetic map), 친자 감별(parenetage testing), 품종간의 구별(distingtion of breeds), 가계도 분석(pedigree analysis), 유전적 다양성(divergence) 및 연관성(relationship) 등을 분석할 수 있는 강력한 장치로서 이용되어 왔다. 특히, DNA marker를 이용한 선발육종 기술은 전통적인 선발육종법의 한계를 넘어 획기적으로 가축의 유전능력을 증진시키는 방법으로 이용되고 있다. 이러한 유전공학적 기법에는 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) 및 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)등이 있다. 이 중에서도 제한효소 처리에 의한 DNA 단편의 다형 현상을 분석하는 기법인 RFLP 기법은 재현성이 우수하고, 효율성이 높아 유전자 진단 방법으로 유용하게 사용되고 있다.

　따라서, 본 발명에서는 PCR-RFLP 기법을 이용하여 한우 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자표지를 검출하여 고품질 한우 조기 진단에 활용할 수 있는 기술을 제공한다.

현재 우리나라 축산물 등급판정소에서는 마블링(marbling), 육색(meat color), 지방색(fat color), 조직감(meat texture) 및 성숙도(meat firmness)등의 도체성적 항목을 이용하여 한우 육질등급을 1++, 1+, 1, 2 및 3등급으로 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 특히 마블링은 육질 등급을 결정하는데 매우 지대한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 마블링은 근육지방 가운데 1, 2차 근속 사이에 있는 지방을 일컬으며 일명 "상강지방(霜降脂肪)"으로 불려지기도 하는데 붉은 살코기에 지방이 들어 있는 모양이 마치 서리가 내린 것처럼 보이거나 대리석 같기 때문인 것으로 마블링은 고기의 육질을 결정하는 중요한 요소로 고기의 맛과 밀접한 관계가 있다. 따라서, 한우의 육질품질을 향상시켜려면 유전적으로 마블링이 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육 관리하는 것이 중요하며, 더불어 단 기간에 보다 효율적으로 한우의 품질을 높일 수 있는 육종개량 모델 개발이 필요하다.

이에 본 발명에서는 최첨단 분자육종 기술을 이용한 한우 마블링 진단용 유전자 검사방법을 개발하고 이를 이용하여 유전적으로 마블링이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발할 수 있는 방법을 제공한다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 연구 개발한 결과, 소의 15번 염색체에 존재하는 ACAD8 (acyl-CoA dehydrogenase family, member 8) 유전자를 한우의 육질형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 마블링과 밀접하게 연관된 분자표지를 발굴하고, 이를 이용한 한우 마블링 진단용 유전자 검사 방법을 발명하였다. ACAD8 유전자는 지방산의 이화작용 및 생합성을 조절하는 유전자로서 주로 대방대사와 관련된 기능이 있는 것으로 보고되어 있다. 최근 선행 연구에 따르면, ACAD8 유전자는 소의 일당증체량 등 성장형질과 연관되어 있음이 보고되었으며, 또한 육 연도(tenderness)와 같은 육질형질과도 밀접하게 연관되어 있는 것으로 알려져 있어 새로운 한우 육질 관련 후보유전자로 주목 받고 있다. 따라서 본 발명에서는 ACAD8 유전자를 한우 육질형질 관련 후보유전자로 최종 선정하고, ACAD8 유전자의 특정 SNP를 이용한 PCR-RFLP 분석 및 육질 및 육량 관련 형질들과의 연관성 통계 분석을 통해 마블링과 밀접하게 연관되어 있는 분자표지(DNA marker)를 발굴하여 유전적으로 마블링이 높은 고품질 한우 조기 진단에 활용할 수 있는 유전자 검사 방법을 개발하였다.

더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, 이를 ACAD8 유전자의 exon 2,3번 영역을 모두 포함하는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물에 Drd I (= Aas I, DesD I) 제한효소를 첨가하여 절단된 DNA 단편을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동하고 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적과의 연관성 통계분석을 통해 최종적으로 마블링과 밀접하게 연관되어 있는 DNA marker를 개발함으로써 이를 이용하여 유전적으로 마블링이 우수한 한우를 진단하고 판별하는 유전자 검사 방법을 제공한다.

한우 ACAD8 유전자 exon 3 영역(PCR 증폭 영역 내 711번째 : 서열번호 1의 711번째)의 G↔A 염기치환으로 인한 DNA 유전자형 마커(GG, GA 및 AA형)를 이용하여 한우 개체의 마블링 형질에 대한 도체 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 고급육 생산 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, ACAD8 유전자의 AA 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 유전자 검사 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.

도면 1은 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 ACAD8 유전자 증폭 영역 내 711번째 G↔A 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker) 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 ACAD8 유전자 증폭 영역 내 711번째 G↔A 단일염기다형(SNP)에 대한 각 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker)의 염기서열 분석 크로마토그램

상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시 예 1 : 한우 ACAD8 유전자의 SNP 유전자형 검출

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제

본 발명에 사용한 한우는 국가 후대검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 후보 종모우 집단 총 252두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer(10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.

2. 한우 ACAD8 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출

한우 ACAD8 유전자의 exon 2 및 3번 영역을 포함하는 서열번호 1에 제시한 861 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank 등록번호 NC_007313.4호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.

ACAD8 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열

유전자명	증폭 영역	프라이머 염기서열(5'-3')	서열번호
ACAD8	intron 1 - intron 3	정방향 F-ATGTAGGGGTGCTCTCGAAGTC 역방향 R-CTTCAAAGATGACGGAGGTGTC	2 3

ACAD8 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 55℃에서 20초 그리고 72℃에서 1분간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 한우 ACAD8 유전자의 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1에 제시한 바와 같이 총 861 bp 크기의 염기를 검출하였으며, 검출된 이들 증폭 영역 내 염기에서 총 1개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, 서열번호 1의 711번째 (NCBI GenBank 등록번호 NC_007313.4호의 4,681번째) 염기에서 G↔A 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다. 참고로, 본 SNP 부위는 exon 3번 내에 존재하는 SNP로서 염기치환에 의한 아미노산 치환 여부를 확인해 본 결과, Valine (GTC)↔ Isoleucine (ATC)으로의 아미노산 치환이 확인되었다. 검출된 G↔A SNP에 대한 각 검정대상 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 분자표지(DNA marker) 검출을 위해 Drd I (= Aas I, DesD I) 제한효소를 이용하여 RFLP 분석을 실시하였다.

3. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 ACAD8 유전자의 SNP 유전자형 마커 분석

검출된 한우 ACAD8 유전자의 증폭영역 내 711번째 G↔A SNP 부위에 Drd I 제한효소 인지부위(5'-GACNN_NN^↓NNGTC-3')가 존재하여 PCR-RFLP 기법으로 한우 ACAD8 유전자의 세 종류 SNP 유전자형(GG, GA 및 AA)에 상응하는 분자표지(DNA marker)를 검출하였다[도면 1 및 도면 2]. 한우 ACAD8 유전자의 RFLP 분석은 10 ㎕의 PCR 증폭산물에 2 unit의 Drd I 제한효소를 첨가한 다음 37℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 2% 아가로즈젤에 약 100 volt 전압으로 약 2시간에서 2시간 30분 동안 전기영동하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 즉, GG homo 유전자형을 가진 개체들에서는 1개의 제한효소 인지부위가 존재하여 708 및 153 bp 크기를 갖는 총 2개의 DNA band가 검출되었고, AA homo 유전자형을 가진 개체들에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 861 bp 크기를 갖는 1개의 DNA band가 검출되었다. 그리고 GA hetero 유전자형을 가진 개체들은 이들 3가지의 DNA 단편이 모두 검출되어 154, 708 및 861 bp 크기를 갖는 DNA band가 검출되었다[도면 1].

이상과 같은 방법으로 한우 후대 검정우 집단 총 252두를 대상으로 분석한 ACAD8 유전자의 증폭영역 내 711번째 SNP에 대한 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현빈도를 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 G 대립유전자가 약 57.9%, A 대립유전자가 약 42.1%로 G 대립유전자 출현빈도가 A 대립유전자에 비해 높게 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 GG 유전자형이 약 32.5%(82두), GA 유전자형이 약 50.8%(128두), 그리고 AA 유전자형이 약 16.7%로(42두)로 GA 유전자형의 출현빈도가 가장 높고, AA 유전자형이 가장 낮은 것으로 분석되었다.

실시 예 2. 한우 ACAD8 유전자의 DNA marker 유전자형과 육질 및 육량 형질과의 연관성 통계 분석

본 발명을 통해 검출된 한우 ACAD8 유전자의 SNP 유전자형과 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적과의 연관성을 분석하기 위하여 SASⓐ9.1 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan′s Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다. 그 결과 한우 ACAD8 유전자의 exon3 영역 내 G↔A 염기치환에 의한 SNP 부위(서열번호 1의 711번째)의 유전자형은 한우의 마블링 형질과의 유의적 연관성이 입증되었다(P<0.05). 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 마블링 육종가추정치에서 AA 유전자형을 가진 개체들이 GA 및 GG 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 0.181 및 0.128 정도 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

한우 ACAD8 유전자의 SNP 유전자형과 육량 및 육질형질과의 연관성 분석

육량 및 육질형질	SNP 유전자형			P-value
육량 및 육질형질	GG	GA	AA	P-value
도체중 육종가추정치	3.744± 1.647	3.412± 1.318	7.370± 2.302	0.315
등지방두께 육종가추정치	0.058± 0.089	0.057± 0.071	0.079± 0.124	0.987
배최장근단면적육종가추정치	0.368± 0.544	0.671± 0.435	1.547± 0.760	0.448
마블링 육종가추정치	-0.080± 0.019^b	-0.027± 0.015^b	0.101± 0.027^a	0.034

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 ACAD8 유전자의 증폭영역 내 711번째 G↔A 염기치환에 의한 SNP 유전자형은 한우의 육질등급 판정에 있어 매우 중요한 항목인 마블링 육종가추정치와의 유의적 연관성이 입증되어 본 분자표지를 이용하여 유전적으로 마블링이 우수한 한우를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 유전자 검사 기술로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

표 2에서, ^a,b: 서로 다른 부호 간에는 유의차가 있음(P<0.05).
도면 1에서, M: 100 bp DNA size marker; GG, GA, AA: 본 발명의 ACAD8 유전자 SNP 에 의한 각각의 DNA marker 유전자형; 861bp, 708bp,153bp: RFLP분석을 통해 검출된 DNA 단편의 크기
도면 2에서, GG, GA, AA: 본 발명의 ACAD8 유전자 SNP에 의한 염기서열 분석 크로마토그램에 대한 각각의 DNA marker 유전자형.

<110> SANGJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method of genetic test for diagnosis of marbling tarit in Korean cattle <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 861 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> gene <222> (1)..(861) <223> Bovine ACAD8 gene <220> <221> intron <222> (1)..(113) <223> intron 1 <220> <221> exon <222> (114)..(214) <223> exon 2 <220> <221> intron <222> (215)..(602) <223> intron 2 <220> <221> exon <222> (603)..(722) <223> exon 3 <220> <221> intron <222> (723)..(861) <223> intron 3 <220> <221> variation <222> (711) <223> SNP : G>A <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> Forward primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (840)..(861) <223> Reverse primer binding site <400> 1 atgtaggggt gctctcgaag tcgtctgccc gccacgctgc atggggcttc tggcctgctg 60 tcctctcccc tgagccccga cctggttcag agtaaatgct gccttgccca cagcttccat 120 gggactaagt gaagagcaga aagagttcca gaaagtggcc ttcaactttg ctgcccggga 180 gatggcgccg cacatggcag agtgggacca gaaggtgagg gcgttcagct gcacggtgcc 240 tcccaccaag agcctgcctc ctcccaagca cccagcttgc aaaactcaca gcaaatgcga 300 gtcctgtagg ggcgcgaggc ctccttctgc agatgccacc gctttaattc gtagatgaaa 360 attaagattt gggcactctt aaaacccagg cagtactgga atgataaaaa gaaacttcag 420 tgccagaaag cagtccacat agaatgcatt ttaactggcc cgctgtgtgg gcgacaaaag 480 cggcgctgag tcgaggggct ctgtcccctc ctgcgtgcac acgtctgggc ccctcctcac 540 gcccctggat gagaagcccg cctgtgagtc cctctccgat gaccctgccc ttttctccac 600 aggagctgtt ccctgtggac acgatgcgga aggcagcgca gctgggcttc gggggggtgt 660 atgttcaaac agatgtcgga ggggcgggcc tctcgcggct ggacacctcc gtcatctttg 720 aagccttggc cacaggctgc accagcacca cggcctacat gagcatccac aagtgagtgc 780 cagcccggtg gacgcagcgt gtgctggcgt tggtcggtgg gcaccttctg tgtggacagg 840 agagggtttc gctgtgtagt g 861 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <223> Forward primer(5'-3') <400> 2 atgtagggtg ctctcgaagt c 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> Reverse primer(5'-3') <400> 3 cttcaaagat gacggaggtg tc 22

Claims

서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머(primer)에 의해 PCR (Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응) 증폭된 한우 ACAD8 (acyl-CoA dehydrogenase family, member 8) 유전자 증폭산물에 Drd I (= Aas I, DesD I) 제한효소를 처리하는 과정을 포함하는 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형) 분석법으로 서열번호 1에 제시한 한우 ACAD8 유전자 염기서열 711번째 G↔A 염기치환에 따른 검사대상 개체별 분자표지(DNA marker)를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형(GG, GA 및 AA)을 분석하여 유전적으로 마블링이 높은 한우를 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 마블링 진단용 유전자 검사 방법
청구항 1에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 ATGTAGGGTGCTCTCGAAGTC의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 2의 정방향 프라이머와 5'에서 3' 방향으로 CTTCAAAGATGACGGAGGTGTC의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용하여 한우 ACAD8 유전자 exon 2 및 3번을 모두 포함하는 영역을 PCR로 증폭하는 것을 특징으로 하는 한우 마블링 진단용 유전자 검사 방법
청구항 1에 있어서,
PCR-RFLP 분석법으로 검출된 한우 ACAD8 유전자의 세 가지 분자표지(DNA marker) 유전자형(GG, GA및 AA) 가운데 AA 유전자형을 나타내는 한우개체를 GG 및 GA 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 마블링이 높은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 마블링 진단용 유전자 검사 방법