KR101083213B1

KR101083213B1 - 한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 한우 육질 진단 방법

Info

Publication number: KR101083213B1
Application number: KR1020100010326A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 신성철
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2011-11-11
Also published as: KR20110090506A

Abstract

본 발명은 한우의 근내지방도(marbling score)와 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자표지(DNA marker)를 이용한 한우 육질 진단 방법에 관한 것으로서, 근내지방도가 우수한 한우의 유전적 자질을 예측하고 판정하는 근내지방도 연관 분자표지를 개발하여 이를 이용한 고품질 한우의 조기선발 및 개체 평가의 정확성을 제고하는 데 활용 가능한 유전자 진단방법을 제공하기 위한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 한우 EDG1 (endothelial differentiation G-protein coupled receptor 1) 유전자의 5'-UTR 영역 내에 존재하는 특정 SNP를 이용하여 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 기법으로 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 DNA marker를 검출함으로써 이들 가운데 GG 유전자형을 가진 개체들을 AA 및 AG 유전자형을 가진 개체들에 비해 유전적으로 근내지방도가 우수한 한우 개체로 진단하여 판별하는 방법을 제공한다.

Description

한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 한우 육질 진단 방법{Diagnosis method of meat quality using DNA marker associated with marbling score in Hanwoo}

본 발명은 분자유전학적 분석기법인 PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism; 제한효소절편다형)분석을 통하여 한우 근내지방도와 밀접하게 연관되어 있는 EDG1 유전자의 특정 SNP(단일염기다형)를 이용한 한우 육질 연관 분자표지를 개발함으로써, 이를 이용하여 유전적으로 근내지방도가 우수한 한우를 조기에 진단하여 판별할 수 있는 기술을 제공한다.

1953년 Watson과 Crick에 의해 DNA 이중 나선구조가 명확하게 해명되는 것을 시작으로 그로부터 20년 후 제한효소의 발견과 더불어 DNA Clonig 기술, DNA 염기서열 분석기술 등이 새롭게 등장하면서 분자유전학 및 유전자 분석기술은 하루가 다르게 나날히 눈부신 발전을 거듭하고 있다. 분자유전학 및 유전자 분석기술의 발달로 인해 최근에는 DNA 분자수준에서 가축의 경제형질(economic trait)과 밀접하게 연관되어 있는 후보유전자들의 특이적인 DNA 다형성과의 연관분석(linkage analysis)에 대한 많은 연구가 수행되어 왔으며, 이를 이용한 가축의 양적형질(QTL; quantitative trait loci)관련 marker gene으로서 육종개량에 널리 활용되고 있는 실정이다. 특히, PCR (Polymorase chain reaction) 기술을 이용하는 RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSCP (single strand conformation polymorphisms) 기법 및 microsatellite 등 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 가축의 주요 경제형질과 관련된 분자표지를 이용한 조기 진단 및 선발 기술은 물론 다양한 산업 전반에 걸쳐 본 기술이 활용되고 있다. 위와 같은 다양한 분석 기술 가운데서도 제한효소 처리에 의한 DNA의 다형성을 분석할 수 있는 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석기법은 타 분석기법들에 비해 재현성과 정확성이 뛰어나 유전자 분석 검사에 매우 효율적인 분석기술로 각광받고 있다.

이와 같은 시대적 흐름에 발맞추어 최근에는 분자유전학적 기술을 이용한 한우 경제형질 관련 분자표지를 이용한 고능력 우량 한우 조기진단 기술이 몇몇 개발되어 대한민국 특허청에 특허출원/등록 되어 있다. 그 대표적인 예로, 한우의 근내지방도 연관 프라이머 및 그를 이용한 한우근내지방도 성적 검사방법(출원번호 : 10-2000-0065925), 한우의 경제형질과 연관성 있는 마이크로새틀라이트 DNA 및 이의 분석용 프라이머 세트(출원번호 : 10-2004-0091892) 및 신규 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 선발방법(출원번호 : 10-2003-0093288) 등 DNA 분자표지를 이용한 한우 경제형질 진단 방법과 관련된 발명기술들이 특허등록되어 있다.

그러나, 상기에 제시한 기존의 발명들은 특정한 형질 발현과 밀접하게 연관되어 있는 유전자를 이용하는 본 발명에서의 분석방법과 달리, 약 2-7 bp 크기의 DNA 염기 반복 수에 따라 개체별 유전적 다형성을 구분하는 마이크로새틀라이트(microsatellite) 분석기술을 이용한 분자표지들로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석기법에 비해 분자표지의 재현성이 낮아 정확성이 현저하게 떨어지는 단점이 있다. 그에 반해 본 발명에서는 한우 경제형질과 밀접하게 연관되어 있는 EDG1 후보유전자의 특정 SNP영역을 이용하여 PCR-RFLP기법으로 분자표지를 개발한 것으로서 한우 경제형질과 보다 연관성 있는 유전자 분자마커를 제공할 수 있을 뿐만이 아니라, 타 분석기법들에 비해 RFLP 마커의 재현성이 뛰어나 보다 정확성 높고 효율적인 DNA 분자표지를 제공하는 장점이 있다.

1990년대 이후 쇠고기의 소비증가가 가속화 되고 있으며, 최근에는 한미 FTA 협상 타결로 인해 쇠고기 수입량이 지속적으로 증가되고 있는 실정이다. 이에 대응한 국내 한우 사육농가의 보호 및 발전을 위해서는 한우육의 육질 고급화를 통한 수입육과의 차별화로 품질경쟁력을 높이고, 또한 고육량화로 한우의 경제성을 높이는 전략이 필요하다. 이를 위해서는 최적의 사육 환경 조성도 중요하겠지만, 근본적으로 유전적 자질이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발하는 최첨단 육종개량 모델을 개발하여 품질 좋고 경제성 높은 고능력 한우를 생산함으로써 소비자들에게 안전하고, 맛 좋은 고급육한우를 보다 저렴한 가격에 제공할 수 있을 것이다.

현재 우리나라 축산물 등급판정소에서는 근내지방도(marbling), 육색(meat color), 지방색(fat color), 조직감(meat texture) 및 성숙도(meat firmness)등의 도체성적 항목을 이용하여 한우 육질등급을 1++, 1+, 1, 2 및 3등급으로 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 특히 근내지방도는 육질 등급을 결정하는데 매우 지대한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 근내지방은 근육지방 가운데 1, 2차 근속 사이에 있는 지방을 일컬으며 일명 "마블링" 또는 "상강지방(霜降脂肪)"으로 불려지기도 하는데 붉은 살코기에 지방이 들어 있는 모양이 마치 서리가 내린 것처럼 보이거나 대리석 같기 때문인 것으로 근내지방은 고기의 육질을 결정하는 중요한 요소로 고기의 맛과 밀접한 관계가 있다. 따라서, 한우의 육질품질을 향상시켜려면 유전적으로 근내지방도가 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육 관리하는 것이 중요하며, 더불어 단 기간에 보다 효율적으로 한우의 품질을 높일 수 있는 육종개량 모델 개발이 필요하다.

이에 본 발명에서는 최첨단 분자육종 기술을 이용한 한우 육량형질 연관 유전자 분자표지를 개발하고 이를 이용하여 유전적으로 육량이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발할 수 있는 방법을 제공한다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 연구 개발한 결과, 소의 3번 염색체에 존재하는 EDG1 (endothelial differentiation G-protein coupled receptor 1) 유전자를 한우의 육질형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 근내지방도와 밀접하게 연관된 분자표지를 개발하고, 이를 이용한 한우 육질 진단 방법을 발명하였다. 최근 연구에 의하면 EDG1 유전자는 소 체내에서 EDG1 유전자의 발현양이 증가하면 지방세포 계통의 세포들이 성숙 분열하면서 근육 내 혈관이 새로 발생될 때 근육에 에너지를 공급하게 되어 결과적으로 소의 높은 근내지방도 형성에 관여하는 유전자로 보고되어 있어 새로운 한우 육질관련 후보유전자로 주목받고 있다.

따라서 본 발명에서는 EDG1 유전자를 한우 경제형질 관련 후보유전자로 최종 선정하고, EDG1 유전자의 특정 SNP를 이용한 PCR-RFLP 분석 및 육질 및 육량 관련 형질들과의 연관성 통계 분석을 통해 근내지방도와 밀접하게 연관되어 있는 분자표지(DNA marker)를 발굴하여 유전적으로 근내지방도가 높은 고품질 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 DNA 분자표지를 개발하였다. 더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, 이를 EDG1 유전자 5'-UTR의 특정영역을 포함하는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물에 Msc I (= Bal I, Mls I, MluN I, Msp20 I) 제한효소를 첨가하여 절단된 DNA 단편을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동하여 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적과의 연관성 통계분석을 통해 최종적으로 근내지방도와 연관되어 있는 DNA marker를 개발함으로써 이를 이용하여 유전적으로 근내지방도가 우수한 한우를 진단하고 판별하는 방법을 제공한다.

한우 EDG1 유전자 5'-UTR 영역(증폭영역 내 82번째)의 A↔G 염기치환으로 인한 DNA 유전자형 마커(AA, AG 및 GG형)를 이용하여 한우 개체의 근내지방도에 대한 도체 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 고급육 생산 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, EDG1 유전자의 GG 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.

도면 1은 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 EDG1 유전자 증폭 영역 내 82번째 A↔G 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker) 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 EDG1 유전자 증폭 영역 내 82번째 A↔G 단일염기다형(SNP)에 대한 각 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker)의 염기서열 분석 크로마토그램

상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시 예 1 : 한우 EDG1 ( endothelial differentiation G- protein coupled receptor 1)유전자의 SNP 유전자형 검출

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제

본 발명에 사용한 한우는 국가 후대검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 후보 종모우 집단 총 150두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer(10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.

2. 한우 EDG1 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출

한우 EDG1 유전자의 5'-UTR 영역을 포함하는 서열번호 1에 제시한 693 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank 등록번호 NC_007301.3호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.

한우 EDG1 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열

프라이머	증폭영역	프라이머 염기서열(5'-3')	서열번호
EDG1	5'-UTR	정방향 F-CTAAAGAAGCCACTCAGCCTCA 역방향 R-GTGGAATTCTCAAGACCACAGC	2 3

EDG1 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 한우 EDG1 유전자의 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1에 제시한 바와 같이 총 691 bp 크기의 염기를 검출하였으며, 검출된 이들 증폭 영역 내 염기에서 총 1개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, 서열번호 1의 82번째 (NCBI GenBank 등록번호 NC_007301.3호의 166번째) 염기에서 A↔G 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다. 검출된 A↔G SNP에 대한 각 검정대상 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 분자표지(DNA marker) 검출을 위해 Msc I (= Bal I, Mls I, MluN I, Msp20 I) 제한효소를 이용하여 RFLP 분석을 실시하였다.

3. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 EDG1 유전자의 SNP 유전자형 마커 분석

검출된 한우 EDG1 유전자의 증폭영역 내 419번째 T↔C SNP 부위에 Msc I 제한효소 인지부위(5'-TGG^↓CCA-3')가 존재하여 PCR-RFLP 기법으로 한우 EDG1 유전자의 세 종류 SNP 유전자형(AA, AG 및 GG)에 상응하는 분자표지(DNA marker)를 검출하였다[도면 1 및 도면 2].

한우 EDG1 유전자의 RFLP 분석은 5 ㎕의 PCR 증폭산물에 3 unit의 Msc I 제한효소를 첨가한 다음 37℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 2% 아가로즈젤에 약 100 volt 전압으로 약 2시간에서 2시간 30분 동안 전기영동하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 즉, AA homo 유전자형을 가진 개체들에서는 1개의 제한효소 인지부위가 존재하여 79 및 612 bp 크기를 갖는 총 2개의 DNA band가 검출되었고, GG homo 유전자형을 가진 개체들에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 691 bp 크기를 갖는 1개의 DNA band가 검출되었다. 그리고 AG hetero 유전자형을 가진 개체들은 이들 3가지의 DNA 단편이 모두 검출되어 79, 612 및 691 bp 크기를 갖는 DNA band가 검출되었다[도면 1]. 참고적으로 DNA 단편의 크기가 작아 발현량이 미약한 79 bp 크기의 DNA band는 본 도면에서 제외하였다.

이상과 같은 방법으로 한우 후대 검정우 집단 총 150두를 대상으로 분석한 EDG1 유전자의 증폭영역 내 82번째 SNP에 대한 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현빈도를 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 A 대립유전자가 약 71.0%, G 대립유전자가 약 29.0%로 A 대립유전자 출현빈도가 G 대립유전자에 비해 높게 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 AA 유전자형 45.3%(68두), AG 유전자형 51.3%(77두), 그리고 GG 유전자형 3.4%로(5두) GG 유전자형이 가장 낮고, AG 유전자형이 가장 높은 것으로 분석되었다.

실시 예 2. 한우 EDG1 유전자의 DNA marker 유전자형과 육질 및 육량 형질과의 연관성 통계 분석

본 발명을 통해 검출된 한우 EDG1 유전자의 SNP 유전자형과 한우의 육량 및 육질형질 관련 도체성적과의 연관성을 분석하기 위하여 SASⓐ8.2 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan′s Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다. 그 결과 한우 EDG1 유전자의 5'-UTR 영역 내 A↔G 염기치환에 의한 SNP 부위(서열번호 1의 82번째)의 유전자형은 한우의 근내지방도와 유의적 연관성이 입증되었다(P<0.05). 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 근내지방도에서 GG 유전자형을 가진 개체들이 AA 및 AG 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 1.786 및 1.710 정도 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

한우 EDG1 유전자의 DNA marker 유전자형과 육량 및 육질형질과의 연관성 통계분석 결과

육량 및 육질형질	DNA marker 유전자형			P-value
육량 및 육질형질	AA	AG	GG	P-value
생체중/kg	549.411±6.041	543.116±5.677	532.000±22.281	0.619
도체중/kg	313.661±3.778	313.116±3.550	308.400±13.932	0.935
등지방두께/cm	0.732±0.035	0.750±0.033	0.780±0.131	0.894
배최장근단면적/cm²	77.102±0.980	76.298±0.921	76.400±3.615	0.834
근내지방도/1-7	3.014±0.200^b	3.090±0.188^b	4.800±0.737^a	0.047

^a,b: 서로 다른 부호간에는 유의차가 있음.

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 EDG1 유전자의 증폭영역 내 82번째 A↔G 염기치환에 의한 SNP 유전자형은 한우의 육질등급 판정에 있어 매우 중요한 항목인 근내지방도과의 유의적 연관성이 입증되어 본 분자표지를 이용하여 유전적으로 근내지방도이 우수한 한우를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 DNA 분자표지로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

도면 1에서, M : DNA size marker, 1~10 : 한우개체번호, AA, AG, GG : 본 발명의 EDG1 유전자 SNP 에 의한 각각의 DNA marker 유전자형.
도면 2에서, AA, AG, GG : 본 발명의 EDG1 유전자 SNP에 의한 염기서열 분석 크로마토그램에 대한 각각의 DNA marker 유전자형.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머(primer)에 의해 PCR (Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응) 증폭된 한우 EDG1 (endothelial differentiation G-protein coupled receptor 1) 유전자 증폭산물에 Msc I (= Bal I, Mls I, MluN I, Msp20 I) 제한효소를 처리하는 과정을 포함하는 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형) 분석법으로 서열번호 1에 제시한 한우 EDG1 유전자 염기서열 82번째 A↔G 염기치환에 따른 검사대상 개체별 분자표지(DNA marker)를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형(AA, AG 및 GG)을 분석하여 유전적으로 근내지방도가 높은 한우를 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 한우 육질 진단 방법
청구항 1에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 CTAAAGAAGCCACTCAGCCTCA의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 2의 정방향 프라이머(Forward primer)와 5'에서 3' 방향으로 GTGGAATTCTCAAGACCACAGC의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 3의 역방향 프라이머(Reverse primer)를 이용하여 한우 EDG1 유전자 5'-UTR의 일부 영역을 PCR로 증폭하는 것을 특징으로 하는 한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 한우 육질 진단 방법
청구항 1에 있어서,
PCR-RFLP 분석법으로 검출된 한우 EDG1 유전자의 세 가지 분자표지(DNA marker) 유전자형(AA, AG 및 GG) 가운데 GG 유전자형을 나타내는 한우개체를 AA 및 AG 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 근내지방도가 높은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 한우 육질 진단 방법