KR101853201B1 - 글루타티온과산화효소 유전자의 단일염기다형 마커를 이용한 한우 도체중 진단 방법 - Google Patents

글루타티온과산화효소 유전자의 단일염기다형 마커를 이용한 한우 도체중 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한우의 글루타티온과산화효소 유전자의 (glutathione peroxidase 3, GPX3) 유전자의 특정 단일염기다형 마커(SNP marker)를 이용하여 유전자 검사를 통해 도체중이 높은 한우를 진단할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의한 한우 진단 방법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐 만 아니라 한우 집단 내에서 도체중이 높은 한우를 조기에 진단하여 선발함으로써 도체량이 우수한 한우 생산에 활용하기 위한 것이다.

Description

글루타티온과산화효소 유전자의 단일염기다형 마커를 이용한 한우 도체중 진단 방법{Diagnostic method for carcass weight by using SNP markers of glutathione peroxidase 3 gene in Korean cattle}
본 발명은 분자유전학적 분석기법인 PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism; 제한효소절편다형)분석을 통하여 한우 도체중(carcass weight) 형질과 밀접하게 연관되어 있는 GPX3 (glutathione peroxidase 3) 유전자의 특정 단일염기다형 마커(SNP marker)를 이용한 한우 육량형질과 연관된 분자표지를 발굴함으로써, 이를 이용하여 유전적으로 도체중이 높은 한우를 조기에 진단하여 판별할 수 있는 기술을 제공한다.
중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)은 1986년 Kary Mullis에 의해서 처음 소개되었다. PCR 방법의 개발로 인해 소량의 DNA를 이용하여 표적유전자의 상태를 알 수 있게 해 주는 혁명적인 것이라 할 수 있다. 1953년 Watson과 Crick에 의해 DNA 나선 구조의 해명으로 시작된 DNA 분자생물학의 세계는 20년 후 제한효소의 발견과 그에 따른 DNA Cloning법, 염기서열 결정법의 개발로 새로운 발전을 맞게 되었다. 최근의 분자 유전학 기법의 발달은 DNA수준에서의 유전자 marker의 개발이 가능한 방향으로 발달되어 왔다.
가축의 유전 및 육종학 분야에서도 DNA의 다형성을 이용하여 유전자를 marker gene으로 육종개량에 활용하고 있다. DNA의 다형성은 중요한 경제형질을 결정하는 주요 유전자와 양적형질(QTL; quantitative trait loci)에 의한 marker의 개발을 가능하게 하며, 연관 분석(linkage analysis), 유전자 지도(genetic map), 친자 감별(parenetage testing), 품종간의 구별(distingtion of breeds), 가계도 분석(pedigree analysis), 유전적 다양성(divergence) 및 연관성(relationship) 등을 분석할 수 있는 강력한 장치로서 이용되어 왔다. 특히, DNA marker를 이용한 선발육종 기술은 전통적인 선발육종법의 한계를 넘어 획기적으로 가축의 유전능력을 증진시키는 방법으로 이용되고 있다. 이러한 유전공학적 기법에는 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) 및 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)등이 있다. 이 중에서도 제한효소 처리에 의한 DNA 단편의 다형 현상을 분석하는 기법인 RFLP 기법은 재현성이 우수하고, 효율성이 높아 유전자 진단 방법으로 유용하게 사용되고 있다. 따라서, 본 발명에서는 PCR-RFLP 기법을 이용하여 한우 육량형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 분자표지를 검출하여 우량 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 기술을 제공한다.
한우(Hanwoo)는 한국 고유의 소품종으로서 오랫동안 한국의 기후풍토에 적응하여 그에 적합한 체질로 고정되어 온 주요 가축이다. 한우의 주요 육종개량 대상형질로서 개체의 도체중 및 도체량에 결정에 영향을 미치는 육량등급 판정 항목으로는 도체량(carcass weight), 도체율(dressing percentage), 등지방두께(backfat thickness), 배최장근 단면적(M. longissimus dorsi area) 등이 있는데 이 가운데서도 도체중은 육량등급을 결정하는 매우 중요한 요인 중 하나이다. 일반적으로 가축의 육종개량에 있어 종래의 양적 유전학적 방법은 가축의 표현형적 기록에 의존해왔다. 즉, 후보종모우는 혈통기록과 체형 발달 등의 당대 기록으로 우선 선발하고 빈우와의 교배에 의해 생산되는 후대 검정우를 사육, 도축하여 도체 및 육질형질들을 기록하고 가축이 사육되어진 환경 요인들을 최대한 배제하면서 가축의 진정한 육종가를 추정해 내기 위한 가장 적절한 통계 모델식을 고안하여 종축을 선발하게 되는데 이러한 표현형적 관찰치를 측정하는 데는 많은 시간이 소요되므로 종축의 선발을 지연하게 되어 세대 간격이 길어지고 많은 두수의 후보 종축을 사육하게 되므로 사료비, 시설투자비 및 유지비, 인건비 등의 경제적 비용과 과도한 노동력이 소요된다. 이와 같은 매우 비효율적인 방법으로 인해 보다 과학적이고 신속하게 우수한 육량등급의 비육우를 조기에 선발하고 사육하기 위한 한우 육량등급 판정 방법이 요구되어 왔다. 유전공학 기술의 눈부신 발달로 DNA 분자수준에서의 여러 실험기법들의 발전이 지속적으로 이루어져 왔으며, 이러한 실험기법들의 발전을 토대로 가축의 유전적 특성이나 능력개량을 위한 다양한 DNA 분석기술들이 개발되어 동물산업에 이용되고 있다. 이러한 유전공학적 기법에는 여러 가지가 있는데, 그 중 최근에 많이 사용되고 있는 PCR(Polymerase Chain Reaction)기술을 이용한 분석방법 중 PCR-RFLP(Restriction Fragment length polymorphism)기법은 특정 점 돌연변이(point mutation)부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 DNA의 다형성으로 본 기술을 사용할 경우 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명에서는 소 GPX3 유전자의 제한효소절편다형(RFLP) 분자마커를 이용한 유전자 검사를 통하여 도체중이 높은 한우를 조기에 진단하고 선발에 활용할 수 있는 DNA 분자 마커를 제공하고자 한다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 연구 개발한 결과, 소의 7번 염색체에 존재하는 GPX3 유전자를 한우의 육량형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 도체중과 밀접하게 연관된 분자표지를 발굴하고, PCR-RFLP 분석방법을 이용한 도체중이 높은 한우 진단용 유전자 검사 방법을 발명하였다.
더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, 이를 GPX3 유전자의 3'-UTR 영역을 포함하는 프라이머(primer)를 제작하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 500 bp 크기의 PCR 증폭산물에 Bsp1286 I (5'-GDGCH↓C-3') 제한효소를 첨가하여 37℃ 에서 3시간 이상 반응시켜 각 SNP 유전자형별로 다르게 절단된 DNA 단편을 2% agarose gel에 전기영동하고 각 유전자형별 SNP marker를 결정하였다. 최종적으로 한우의 육량형질 관련 도체성적과 SNP marker의 연관성 통계분석을 수행하여 도체중과 밀접하게 연관되어 있는 SNP marker를 발굴하였다. 따라서, 본 발명에서는 이와 같은 유전자 검사방법을 통하여 유전적으로 도체중이 높은 한우를 진단하고 판별하는 방법을 제공한다.
한우 GPX3 유전자 3'-UTR 영역(PCR 증폭 영역 내 203번째 : 서열번호 1의 203번째)의 C↔T 염기치환으로 인한 DNA 유전자형 마커(CC, CT 및 TT형)를 이용하여 한우 개체의 도체중 형질에 대한 도체 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 우량 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, GPX3 유전자의 CC 및 CT 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 유전자 검사 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.
도면 1은 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 GPX3 유전자의 PCR 증폭 영역 내 203번째에 위치한 C↔T 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker) 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 GPX3 유전자 PCR 증폭 영역 내 203번째 C↔T 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker)의 염기서열 분석 크로마토그램
상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시 예 1 : 한우 GPX3 유전자의 SNP 유전자형 검출
1. 공시재료 및 DNA 분리 정제
본 발명에 사용한 한우는 횡성축산업협동조합의 횡성축협한우 농가에서 사육되어 27개월령에 도축된 농가현장에서 생산된 한우로서 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 한우 집단 총 300두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer(10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.
2. 한우 GPX3 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출
한우 GPX3 유전자의 3'-UTR 영역을 포함하는 서열번호 1에 제시한 500 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 NCBI GenBank에 등록되어 있는 Bos taurus UMD 3.1.1 reference sequence의 등록번호 AC_000164.1호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.
GPX3 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열
유전자명 증폭 영역 프라이머 염기서열(5'-3') 서열번호
GPX3 3'-UTR 정방향 F- GACATCCTGACCTACATGCG
역방향 R- AGGCACTTCTGGGTGGTGTT		 2
3
GPX3 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 한우 GPX3 유전자의 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1에 제시한 바와 같이 총 500 bp 크기의 DNA 염기를 검출하였으며, 검출된 이들 증폭 영역 내 염기에서 총 1개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, 서열번호 1의 203번째 (NCBI GenBank 등록번호 Bos taurus UMD 3.1.1 reference sequence AC_000164.1호의 7,493번째) 염기에서 C↔T 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다. 참고로, 본 SNP 부위는 3'-UTR 영역에 존재하는 SNP이므로 아미노산 합성에는 직접적으로 관여하지는 않는다. 검출된 SNP에 대한 각 검정대상 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 분자표지(DNA marker) 검출을 위해 Bsp1286 I (5'-GDGCH↓C-3') 제한효소를 이용하여 PCR-RFLP 분석을 수행하였다.
3. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 GPX3 유전자의 SNP 유전자형 마커 분석
검출된 한우 GPX3 유전자의 증폭영역 내 203번째 C↔T SNP 부위에 Bsp1286 I (5'-GDGCH↓C-3') 제한효소 인지부위가 존재하여 PCR-RFLP 기법으로 한우 GPX3 유전자의 세 종류 SNP 유전자형(CC, CT 및 TT)에 상응하는 분자표지(DNA marker)를 검출하였다[도면 1 및 도면 2]. 한우 GPX3 유전자의 RFLP 분석은 10 ㎕의 PCR 증폭산물에 2 unit의 Bsp1286 I 제한효소를 첨가한 다음 37℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 2% agarese gel에 약 100 volt 전압으로 약 2시간 동안 전기영동하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 즉, CC homo 유전자형을 가진 개체들에서는 제한효소 인지부위가 1개 존재하여 204 및 296 bp 크기를 갖는 총 2개의 DNA band가 검출되었고, TT homo 유전자형을 가진 개체들에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 500 bp 크기를 갖는 1개의 DNA band가 검출되었다. 그리고 CT hetero 유전자형을 가진 개체들은 이들 3가지의 DNA 단편이 모두 검출되어 204, 296 및 500 bp 크기를 갖는 DNA band가 검출되었다[도면 1].
이상과 같은 방법으로 한우 집단 총 300두를 대상으로 분석한 GPX3 유전자의 증폭영역 내 203번째 SNP에 대한 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현빈도를 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 C 대립유전자가 약 59.5%, T 대립유전자가 약 40.5%로 C 대립유전자 출현빈도가 T 대립유전자에 비해 높게 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 CC 유전자형이 약 34%, CT 유전자형이 약 51%, 그리고 TT 유전자형이 약 15%로 CT 유전자형의 출현빈도가 가장 높고, TT 유전자형이 가장 낮은 것으로 분석되었다.
실시 예 2. 한우 GPX3 유전자의 SNP 유전자형과 육량형질과의 연관성 분석
본 발명을 통해 검출된 한우 GPX3 유전자의 SNP 유전자형과 한우의 육량형질 관련 도체성적과의 연관성을 분석하기 위하여 SASⓐ9.2 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan′s Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다. 그 결과 본 발명을 통해 검출된 한우 GPX3 유전자의 3'-UTR 영역 내 C↔T 염기치환에 의한 SNP 유전자형은 한우 도체중과의 유의적 연관성이 입증되었다(P<0.05), 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 CC 및 CT 유전자형을 가진 개체들이 TT 유전자형을 가진 개체들에 비해 도체중이 유의적으로 높은 것으로 분석되었다.
한우 GPX3 유전자의 SNP 유전자형과 육량형질과의 연관성 분석
형질 GPX3 SNP 유전자형 (means ±SE) p-value
CC CT TT
도체중/kg 447.000±38.422a 435.619±7.898a 407.935±11.952b 0.003
등지방두께/mm 12.666±2.624 14.492±0.539 12.870±0.816 0.228
등심단면적/㎠ 92.666±6.384 91.774±1.312 86.935±1.986 0.077
이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 GPX3 유전자의 증폭영역 내 203번째 C↔T 염기치환에 의한 SNP 유전자형은 한우의 육량등급 판정에 있어 매우 중요한 항목인 도체중과 유의적 연관성이 입증되어 본 발명의 SNP maker를 이용하여 유전적으로 도체중이 높은 한우를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 유전자 검사 방법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
표 2에서, a,b: 서로 다른 부호 간에는 유의차가 있음(P<0.05)
도면 1에서, M: 100 bp DNA ladder; CC, CT, TT: 본 발명의 GPX3 유전자 SNP에 의한 각각의 단일염기다형 마커 유전자형; 204, 296, 500 bp: RFLP분석을 통해 검출된 DNA 단편의 크기
도면 2에서, CC, CT, TT : 본 발명의 GPX3 유전자 SNP에 의한 염기서열 분석 크로마토그램에 대한 각각의 DNA marker 유전자형
<110> Sangji University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Diagnostic method for carcass weight by using SNP markers of glutathione peroxidase 3 gene in Korean cattle <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 500 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> gene <222> (1)..(500) <223> GPX3 gene of Korean cattle <220> <221> variation <222> (203) <223> SNP: C/T <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> Forward primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (481)..(500) <223> Reverse primer binding site <400> 1 gacatcctga cctacatgcg gcggcgggcg gtctgggagg ccaaggggaa gtaactgagg 60 cccaccgccc ctccccccaa gtccaccaca cgggctaggg aggactctgt tcaggaagga 120 acccatttct ccaactacgc cacactccca tgctagaccc tttactgtta cacaaggccc 180 cagcctgaga tgaacgtttg tgcccgtact gctctgcaca tgggcgtttg cacacatgcc 240 tacaggcgtg tgtacacacg agtacagggc cacatgtgtc aacctgcaca agtgtatatg 300 tggcaacagc tgtgtgccgt gaagaatgcc agagaggaac ttccctttcc ttccagttct 360 ctgttccagt gataaccatc cactttcagc tgagtccaaa ctgaaaaacc agctctagat 420 tcaattgttc tgctttaacc aggacctcac cctaccggct ggcatctctt actgcctcca 480 aacaccaccc agaagtgcct 500 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> Forward primer sequence of GPX3 gene on this study <400> 2 gacatcctga cctacatgcg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> Reverse primer sequence of GPX3 gene on this study <400> 3 aggcacttct gggtggtgtt 20

Claims (4)

  1. 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머(primer)에 의해 PCR (Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응) 증폭된 한우 GPX3 (glutathione peroxidase 3) 유전자 증폭산물에 제한효소를 처리하는 과정을 포함하는 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형) 분석법으로 서열번호 1에 제시한 GPX3 유전자 증폭영역 내 염기서열 203번째 T↔C 염기치환에 따른 검사 대상 한우 개체별 단일염기다형 마커(SNP marker)를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형(CC, CT 및 TT)을 분석하여 CC 및 CT 유전자형을 나타내는 한우 개체를 TT 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 도체중이 높은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 글루타티온과산화효소 유전자의 단일염기다형 마커를 이용한 한우 도체중 진단 방법
  2. 청구항 1에 있어서,
    5'에서 3' 방향으로 GACATCCTGACCTACATGCG의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 2의 정방향 프라이머와 5'에서 3' 방향으로 AGGCACTTCTGGGTGGTGTT의 염기서열 구조를 갖는 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용하여 한우 GPX3 유전자 3'-UTR 영역을 PCR로 증폭하여 RFLP 분석에 이용하는 것을 특징으로 하는 글루타티온과산화효소 유전자의 단일염기다형 마커를 이용한 한우 도체중 진단 방법
  3. 청구항 1에 있어서,
    본 발명의 한우 GPX3 유전자를 이용한 PCR-RFLP 분석시 Bsp1286 I (5'-GDGCH↓C-3') 제한효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 글루타티온과산화효소 유전자의 단일염기다형 마커를 이용한 한우 도체중 진단 방법
  4. 청구항 1에 있어서,
    본 발명의 PCR-RFLP 분석법으로 검출된 한우 GPX3 유전자의 세 가지 DNA 분자표지(CC, CT 및 TT) 가운데 CC 및 CT 유전자형을 나타내는 한우 개체를 TT 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 도체중의 수치가 높은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 글루타티온과산화효소 유전자의 단일염기다형 마커를 이용한 한우 도체중 진단 방법
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