CN110541037B

CN110541037B - 一种延边黄牛肉质相关的plin基因snp分子标记、引物对、试剂盒及其应用

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Publication number: CN110541037B
Application number: CN201910764592.7A
Authority: CN
Inventors: 夏广军; 徐红艳; 徐畅; 张珈溯
Original assignee: Yanbian University
Current assignee: Yanbian University
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2039-08-19
Also published as: CN110541037A

Abstract

本发明提供了一种延边黄牛肉质相关的PLIN基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用，属于黄牛肉质筛选技术领域。延边黄牛肉质相关的PLIN基因SNP分子标记，含有位于PLIN基因第三外显子第103bp的多态性为C/T的核苷酸序列。通过对PLIN基因多态性与延边黄牛肉水分含量、脂肪含量、蛋白含量、宰前重、胴体重、背膘厚性状进行关联分析，结果表明：103bp C/T位点与延边黄牛的脂肪含量、宰前重、胴体重、背膘厚呈显著相关性，且表现为CT基因型在脂肪含量、宰前重、胴体重以及背膘厚四种性状上均显著高于CC型。通过检测延边黄牛103bp C/T位点能够用于延边黄牛高档肉牛早期选择。

Description

一种延边黄牛肉质相关的 PLIN基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于黄牛肉质筛选技术领域，具体涉及一种延边黄牛肉质相关的 PLIN基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用。

背景技术

随着经济和农业的不断发展，在人们生活质量得到改善的同时，人们的饮食结构也逐渐改善。肉类中，牛肉营养价值高，牛肉的消费比重增加最快，是一种理想的肉类食品。人们对高档牛肉的需求量与日俱增。延边黄牛主产于我国吉林省延边地区，具有延边朝鲜族特色，属于五大地方良种牛之一，是我国优质的肉用地方品种。延边黄牛多年来适应当地的自然环境，体格结实健壮、抗病性强、适应性强、耐粗饲、抗寒性强、容易育肥，符合当地居民的消费习惯，并且延边朝鲜族自治州较好的草质可保证延边黄牛摄取足够的营养，肉质明显优于其他品种牛，是适合小孩和老年人健康的具有保健功能的一款牛肉。延边黄牛为东北地区第一个肉用牛品种，与韩国的韩牛具有相同的祖先，肉质可与韩牛和日本和牛相媲美，具有高档牛肉的优质性状，使其具有很强的市场竞争力。由于最具特色的延边黄牛受到众多消费者的喜爱，延边黄牛产业已成为延边州最重要的畜牧产业，延边黄牛已被列为国家农业部重点保护品种和开发品种。

我国对牛肉肉质等级评分有着严格要求，肉质优劣取决于牛肉大理石状，肉质光泽、明亮度，肉质坚挺度和质地，脂肪颜色和光亮，最后得出质量的综合得分，其中每个指标都有明确的等级鉴定标准。由此可见，脂肪含量、蛋白含量、水分含量、嫩度、肉色等共同影响优质牛肉的肉质等级，但此标准在肉牛生产中应用性不强。为了适应消费市场需求及生产的便利化，不同的肉牛品种、不同的牛肉生产企业均制定了各自的高档牛肉等级标准。延边黄牛牛肉生产实践中高档牛肉等级评定标准主要依据大理石花纹评分。肉眼观察第12～13胸肋肌肉横切面，对照牛肉大理石花纹等级评定图谱确定眼肌大理石花纹等级（图4）。按6个等级进行评定。1级最好，6级最差。可根据肌内脂肪含量对等级作适当调整：1 级：大理石花纹丰厚，肌内脂肪含量13%或以上；2 级：大理石花纹较丰厚，肌内脂肪含量11%～13%；3级：大理石花纹适度，肌内脂肪含量4%～11%；4 级：大理石花纹中等，肌内脂肪含量3%～4%；5 级：大理石花纹轻度或少量，肌内脂肪含量2.5%～3%；6 级：大理石花纹微量或无，肌内脂肪含量2.5%或以下。然而高档肉牛较普通肉牛培育，具有育肥时间长的特点，一般高档肉牛达到“育肥牛”的标准需要培育2年，而普通肉牛培育1年即可出栏，同时高档肉牛的培育中饲喂更多的精料，因此造成高档肉牛的育肥成本更高。如果能从小牛出生开始则能判断该牛的肉质情况，针对性的培育优质肉质的候选牛，将大大降低培育成本，提高养殖收益。

基因多态性是一种与生物性状有密切相关的一种分子标记，通过与生物性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选择和提高筛选准确性的目的。

脂滴包被蛋白（ PLIN）是一种属于脂滴包被蛋白PAT家族的磷脂蛋白，研究表明， PLIN基因主要在脂肪组织中表达，已经被确认为是与肥胖相关的基因。由于 PLIN基因的蛋白质结构特殊，可以精巧应对脂质的动员作用，多以对脂肪细胞的脂质代谢具有双向调控作用，能够加强脂肪水解，同样又可以保护其不受水解，维持脂滴的动态平衡，在一般情况下， PLIN基因对脂质处于保护状态，减少脂滴内相关酶类对脂质的脂解作用，但若受到一些激素等刺激， PLIN蛋白磷酸化，则加快脂解，称为脂滴的守护者和脂肪分解调控中的“分子开关”。

目前，国内外对人的 PLIN基因多态性的研究报道有很多，但在动物方面研究较少，例如赵小玲等研究了在16个鸡群体的 PLIN基因多态性的检测中发现，3个新的SNP位点显著影响鸡群体的部分肉质性状，并推测此基因可作为有关鸡群体部分肉质性状的候选基因。范红静等对 PLIN基因在四个鸭群体中进行基因多态性检测，结果显示所发现的突变位点显著影响肉鸭的部分胴体性状和部分脂肪性状。樊月圆等对秦川牛的PLIN基因进行了多态性检测，结果显示所发现的两个SNP位点显著影响秦川牛的部分胴体性状和脂肪沉积性状。由上述可知，在动物方面研究较少，尤其是对牛的研究特别少，更没有关于延边黄牛中 PLIN基因多态性及与其相关的性状的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的延边黄牛肉质相关的 PLIN基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用，所述 PLIN基因SNP分子标记与延边黄牛的肉质性状相关。

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的 PLIN基因SNP分子标记，是 PLIN基因序列CCCC(C/T）TGGT中多态性为C/T。

本发明提供一种用于扩增所述 PLIN基因SNP分子标记引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种用于预测延边黄牛牛肉品质的试剂盒，包括所述的引物对。

本发明提供的所述的 PLIN基因SNP分子标记或所述的引物对在延边黄牛高档肉牛早期筛选中的应用。

优选的，所述延边黄牛高档肉牛早期筛选的方法，包括以下步骤：

1）以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，用所述的引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物；

3）将步骤2）中扩增产物进行测序，得到片段序列；

4）根据所述片段序列中 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T多态性确定具体基因型；

5）根据所述基因型选择幼年延边黄牛的培育方向：

当基因型为CT基因型时，将幼年延边黄牛向高档肉牛方向培育；

当基因型为CC基因型时，将幼年延边黄牛向普通肉牛方向培育。

优选的，步骤2）中普通PCR扩增的反应程序：95℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。

优选的，步骤2）中普通PCR扩增的反应体系：2×Taq PCR Mastermix 10 μL，10 μmol/L上游引物 0.5 μL，10 μmol/L下游引物 0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O补充至20μl。

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的 PLIN基因SNP分子标记，含有位于 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的多态性为C/T的核苷酸序列。所述 PLIN基因SNP分子标记的多态性位点位于 PLIN基因的第三外显子上。通过计算基因频率和基因型频率，结果显示该位点发现两种基因型，CC基因型出现的频率高于CT型出现的频率，没有发现TT基因型，等位基因C为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点相关参数表明，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC=0.1638＜0.5，处于低度多态。通过对 PLIN基因多态性与延边黄牛肉水分含量、脂肪含量、蛋白含量、宰前重、胴体重、背膘厚性状进行关联分析，结果表明：序列CCCC(C/T）TGGT中的C/T位点与延边黄牛的脂肪含量、宰前重、胴体重、背膘厚呈显著相关性，且表现为CT基因型在脂肪含量、宰前重、胴体重以及背膘厚四种性状上均显著高于CC型。因此，通过检测延边黄牛 PLIN基因序列CCCC(C/T）TGGT中的C/T位点的CC型能够用于延边黄牛高档肉牛早期筛选。

附图说明

图1为本发明中提取基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2为 PLIN基因SNP分子标记的扩增；

图3为 PLIN基因序列CCCC(C/T）TGGT中的C/T位点扩增产物测序峰图；

图4为大理石花纹评级图谱，其中1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。

实施方式

本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的 PLIN基因SNP分子标记，含有位于 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的多态性为C/T的核苷酸序列。在本发明中，只要包含 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT多态性为C/T位点的序列均属于本发明所要求保护的范围之内。所述 PLIN基因SNP分子标记的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成方法或PCR扩展方法得到即可。

本发明提供一种用于扩增所述 PLIN基因SNP分子标记引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明对所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物对的来源即可，例如根据核苷酸序列人工合成。在本发明实施例中，所述引物对委托生工生物技术有限公司（上海）公司合成。

本发明提供了一种用于预测延边黄牛牛肉品质的试剂盒，包括所述的引物对。本发明对所述引物对的浓度和体积的用量没有特殊限制，采用本领域所熟知的用量和浓度均可。所述试剂盒优选还包括2×Taq PCR Mastermix。所述2×Taq PCR Mastermix包括以下组分：PCR缓冲液、Mg²⁺、Taq聚合酶、dNTPs等组分。本发明对所述2×Taq PCR Mastermix的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的2×Taq PCR Mastermix的来源即可。在本发明中，所述2×Taq PCR Mastermix购自大连宝生物公司。

本发明提供的所述的 PLIN基因SNP分子标记、所述的引物对或所述试剂盒在延边黄牛高档肉牛早期筛选中的应用。

在本发明中，所述延边黄牛高档肉牛早期筛选的方法，优选包括以下步骤：

1）以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

3）将步骤2）中扩增产物进行测序，得到片段序列；

5）根据所述基因型选择幼年延边黄牛的培育方向：

本发明以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA。所述提取基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因组DNA提取方法即可。在本发明实施例中，提取基因组DNA的方法采用试剂盒方法。所述试剂盒的种类为血液基因组DNA提取试剂盒，所述血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

得到基因组DNA后，本发明对基因组DNA进行质量检测。所述质量检测优选包括纯度检测和完整性检测。所述纯度检测优选在紫外分光光度计上进行，纯度检测的结果显示A₂₆₀/A₂₈₀值处于1.8左右，表明所提取的DNA质量较好。所述完整性检测是将基因组DNA进行电泳，电泳图中DNA分子条带具有很好的完整性并且很清晰、没有发生明显拖尾、没有降解和污染现象，符合下一步PCR扩增要求。

得到合格的基因组DNA后，本发明以提取的基因组DNA为模板，用所述引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物。

在本发明中，所述普通PCR扩增的反应程序优选如下：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。所述普通PCR扩增的反应程序优选如下：2×Taq PCR Mastermix 10 μL，10 μmol/L上游引物 0.5 μL，10 μmol/L下游引物 0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O补充至20μl。扩增产物的长度为349bp。

得到扩增产物后，本发明将步骤2）中扩增产物进行测序，得到片段序列。

在本发明中，所述测序委托基因测序公司进行。在本发明实施例中，测序是委托生工生物技术有限公司（上海）公司进行。

得到片段序列后，本发明根据所述片段序列中 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T多态性确定具体基因型。

根据片段序列的峰图判断基因型，例如 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T多态性出现两个不同碱基的套峰，则判断基因型为CT基因型（见图3-b）。当 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T多态性出现一个单峰C时，则判断为基因型为CC基因型（见图3-a）。

得到幼年延边黄牛的基因型后，根据具体的基因型种类选择幼年延边黄牛的培育方向：

在本发明中，一般把色泽、新鲜度好、脂肪含量高、大理石状明显、嫩度好、食用价值高的牛肉称为“高档牛肉”。“高档牛肉”的来源为高档肉牛，通过早期筛选在幼年了解延边黄牛的肉质性状，定向培育，最大程度获得经济利益。优质牛肉的检测指标优选包括水分含量、脂肪含量、蛋白质含量、背膘厚度、大理石花纹评级和胴体重。所述水分含量的测定方法优选为直接干燥法。脂肪含量测定优选为索氏提取法。蛋白质含量测定方法优选为凯氏定氮法检测牛肉中的蛋白质含量。背膘厚度测定方法优选为屠宰后利用螺旋测微器垂直测量背最长肌部位的皮下脂肪厚度。大理石花纹评级的方法优选参考大理石花纹评级图谱（图4），观察背最长肌横切面，按6个等级评定延边黄牛大理石花纹等级，1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。通过测定一定数量的延边黄牛的上述6个指标，得到每头延边黄牛的6个指标的数据。然后采用上述方法得到每头延边黄牛的基因型，与肉质性状进行关联分析。

本发明通过将 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T多态性与延边黄牛肉水分含量、脂肪含量、蛋白含量、宰前重、胴体重、背膘厚性状进行关联分析，结果发现，CT基因型在脂肪含量、宰前重、胴体重以及背膘厚四种性状上均显著高于CC型。因此，将基因型为CT的幼年延边黄牛向高档肉牛方向培育。本发明对所述高档肉牛方向培育的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的高档肉牛的培育方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种延边黄牛肉质相关的 PLIN基因SNP分子标记、引物对、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例

1、样品采集

本试验牛群体选取吉林省延边畜牧开发集团有限公司延边黄牛公牛70头，所有试验牛统一标准饲养条件育肥30月龄屠宰，按国家统一标准进行屠宰分割，屠宰前每头牛颈静脉采血25 ml，加入抗凝剂，分装-80℃保存备用。

2、参照TIANGEN-血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取延边黄牛DNA样本。紫外分光光度计检测所提取的延边黄牛DNA样品的纯度，确定OD₂₆₀/OD₂₈₀值。琼脂糖凝胶电泳检测：用1%琼脂糖凝胶检测所提的延边黄牛DNA样本，根据片段长度电压电泳30 min；凝胶成像系统观察。

紫外分光光度计检测结果显示A₂₆₀/A₂₈₀值处于1.8左右，表明所提取的DNA质量较好。将提取DNA进行电泳，电泳图见图1，DNA分子条带具有很好的完整性并且很清晰、没有发生明显拖尾、没有降解和污染现象，符合下一步PCR扩增要求。

3、DNA扩增引物的选择与设计

参照NCBI提供的牛 PLIN基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计 PLIN引物（NC_007312.4），送至生工生物技术有限公司（上海）进行合成。引物序列见表1。

表1基因引物信息

注：F:正向引物，R:反向引物。

4、PCR扩增与产物测序

在冰盒上按照表2反应体系配制溶液。

表2 PCR扩增反应体系

PCR扩增程序：预变性95℃ 5 min；变性94℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸30s，30个循环；72℃ 延伸10 min；4℃保存。

采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，放至凝胶成像系统观察其扩增结果。以延边黄牛血液DNA为模板，扩增 PLIN基因，结果显示， PLIN基因引物所扩增出来的片段与所预期的片段长度吻合，可以应用于接下来的测序分析中（见图2）。

5、PCR扩增产物测序

将所有PCR扩增产物及相应引物分装送至生工生物技术有限公司（上海）进行测序。

将扩增 PLIN基因的PCR产物进行直接测序，在第三外显子发现1个SNP位点，图3为 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点扩增产物测序峰图，其中图3-a为CC基因型峰图；图3-b为CT基因型峰图。

6、 PLIN基因遗传效应统计分析

PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点的基因频率和基因型频率计算结果见表3，该位点发现两种基因型，CC基因型出现的频率高于CT型出现的频率，没有发现TT基因型，等位基因C为优势等位基因。通过卡方检验所得的结果显示，该位点处于遗传平衡。根据基因频率计算 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点相关参数如表4所示，该位点的多态信息含量为0.25＜PIC=0.1638＜0.5，处于低度多态。

表3 延边黄牛 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点的基因频率及基因型频率

表4 延边黄牛PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点的遗传变异参数

实施例

1、试验动物与样品采集

本试验牛群体选取吉林省延边畜牧开发集团有限公司延边黄牛公牛70头，所有试验牛统一标准饲养条件育肥30月龄屠宰，按国家统一标准进行屠宰分割，采集12到13肋间背最长肌，真空包装后低温保存，用于测定肉质性状。

2、牛主要性状指标的测定

⑴ 水分含量测定:直接干燥法

水分质量分数按式（1）计算：

式（1）；

式中：M1为称量瓶及烘干前质量，g；M2为称量瓶及烘干后质量，g；M0为已恒重的称量瓶质量，g。

⑵ 脂肪含量测定：索氏提取法

脂肪的质量分数按式（2）计算：

式（2）；

式中：M为试样质量，g；M1为抽提后质量，g；M2为抽提前质量，g。

⑶ 蛋白质含量测定

选择凯氏定氮法检测牛肉中的蛋白质含量。

⑷ 背膘厚度测定

屠宰后利用螺旋测微器垂直测量背最长肌部位的皮下脂肪厚度。

⑸ 大理石花纹评级

参考大理石花纹评级图谱（见图4），观察背最长肌横切面，按6个等级评定延边黄牛大理石花纹等级，1级为最好大理石花纹级别，6级为最不好大理石花纹级别。

3、 PLIN基因多态性与肉质性状关联分析

通过对PLIN基因多态性与延边黄牛肉水分含量、脂肪含量、蛋白含量、宰前重、胴体重、背膘厚性状进行关联分析，结果见表5，可知，上述性状方面，序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点与延边黄牛的脂肪含量、宰前重、胴体重、背膘厚呈显著相关性，表现为CT基因型在脂肪含量、宰前重、胴体重以及背膘厚四种性状上均显著高于CC型（ P＜0.05）。

表5 PLIN基因中序列CCCC(C/T）TGGT的C/T位点多态性与肉质性状的关联分析

注：表中肩标不同小写字母表示差异显著（ P＜0.05），相同小写字母表示差异不显著（ P＞0.05）

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种延边黄牛高档肉牛早期筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以幼年延边黄牛的血液为样本提取基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，用引物对进行普通PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

3)将步骤2)中扩增产物进行测序，得到片段序列；

4)根据所述片段序列中PLIN基因中序列CCCC(C/T)TGGT的C/T多态性确定具体基因型；

5)根据所述基因型选择幼年延边黄牛的培育方向：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中普通PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中普通PCR扩增的反应体系：2×TaqPCRMastermix10μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O补充至20μl。