NO342525B1 - Et angiopoietinlignende 4-protein (ANGPTL4) eller en nukleinsyre som koder for ANGPTL4 eller en ANGPTL4-agonist, deres anvendelse og deres anvendelse for fremstilling av et medikament. - Google Patents

Abstract

ANGPTL4-preparater og fremgangsmåter for å anvende slike preparater, og agonister eller antagonister derav, til diagnostisering og behandlingen av sykdommer eller forstyrrelser er inkludert, inkludert fremgangsmåter for å modulere celleproliferasjon, celleadhesjon og cellemigrasjon.

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen vedrører angiopoietinlingnende-4-protein (ANGPTL4). Oppfinnelsen vedrører sammensetninger for fremgangsmåter for å anvende ANGPTL4 og agonister og antagonister derav til diagnostiseringen og behandlingen av sykdommer eller forstyrrelser.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Angiopoietinlignende-4-protein (ANGPTL4) er et medlem av angiopoietinfamilien av utskilte proteiner. Konserverte regioner i angiopoietinfamilien inkluderer et oppkveilet kveiledomene og et C-terminalt fibrinogenlingnende (FBN) domene. Se for eksempel Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000). Andre medlemmer av familien inkluderer angiopoietin-1, antiopoietin-2 og angiopoietin-3. Angiopoietin-1, angiopoietin-2 og angiopoietin-3/angiopoietin-4 binder til Tie2-reseptoren, se f. eks. Davis et al., Cell 87, 1161-1169 (1996); Maisonpierre et al, Science 277, 55-60 (1997); Valenzuela et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1904-1909 (1999) og US patentskrift nr. 5 521 973, 5 650 490 og 5 814 464. Angiopoietein-1 og -4 ser ut til å være agonist for Tie2-reseptoren, mens angiopoietin-2 og -3 ser ut til å være en antagonist (og muligens en agonist) for Tie2-reseptoren. Se f. eks. Folkman & D’amore, Cell, 87:1153-1155 (1996); Suri et al., Cell, 87:1171-1180 (1996); Masionpierre et al., Science 277:55-60 (1997); og Ward & Dumont, Seminars in Cell & Developmental Biology, 13:19-27 (2002). Tie2-reseptoren tilhører en familie med endotelcellespesifikke reseptortyrosinkinaser, som også inkluderer Tie1-orfanreseptoren. Et annet medlem av familien, angiopoietinlignende-3-protein ble funnet å binde til integrin αv β3. Se f. eks. US patentsøknad 20030215451 og Camenisch et al., J. Biol. Chem., 277(19):17281-17290 (2002).

ANGPTL4 er kjent ved andre betegnelser. For eksempel er ANGPTL4 også kjent som hepatisk fibrinogen/angiopoietinbeslektet protein (HFARP) (Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000)), PPAR γ angiopoietinbeslektet protein (PGAR) (Yoon et al., Mol. Cell. Biol., 20: 5343-5349 (2000)), og fasteindusert fettfaktor (FIAF) (Kerten et al., J. Biol. Chem., 275: 28488-28493 (2000)).

In vitro- og in vivo-studier og karakteriseringer av ANGPTL4 kan tilveiebringe verdifull identifisering og oppdagelse av terapeutiske midler og/eller behandlinger som er nyttige i forebyggelsen, lindringen eller korreksjonen av sykdommer eller dysfunksjoner som er assosiert med ANGPTL4-aktivitet og/eller –ekspresjon. For eksempel har vevskultur-studier og genetisk endrede mus vist seg å være uvurderlige redskaper for den funksjonelle oppdelingen av biologiske prosesser som er relevante for human sykdom, inkludert immunologi, kreft, neurobiologi, kardiovaskulær biologi, overvekt og mange andre. Det er et behov for å oppdage og forstå de mange, biologiske funksjonene til ANGPTL4. Oppfinnelsene ser på disse andre behov, slik det er åpenbart ved å se på den følgende beskrivelsen.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen vedrører angiopoietinlignende-4-protein (ANGPTL4). Oppfinnelsen tilveiebringer ANGPTL4 eller undersekvenser derav, eller en agonist eller antagonist derav, for anvendelse ved behandling av tilstander eller sykdommer som er karakterisert ved feilaktig ANGPTL4-ekspresjon eller –aktivitet og/eller involverer ANGPTL4-ekspresjon og/eller aktivitet, som definert i kravene.

Midler for å modulere proliferasjonen av hepatocytter ved ANGPTL4, eller agonister eller antagonister derav, blir tilveiebrakt, som definert i kravene. I visse utførelsesformer er midlene for å indusere proliferasjon for hepatocytter. For eksempel kan en effektiv mengde av en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist administreres til en populasjon av hepatocytter eller pre-hepatocytter for derved å indusere proliferasjon. I ett aspekt omfatter administreringstrinnet å administrere nukleinsyren som koder for ANGPTL4. Alternativt eller i tillegg kan en effektiv mengde av et middel som induserer produksjon av ANGPTL4 i en hepatocytt eller pre-hepatocytt bli administrert for å stimulere proliferasjon. ANGPTL4 eller agonister av ANGPTL4 kan bli benyttet i behandlingen av leverdysfunksjon, sykdommer og skade ved å administrere en effektiv mengde av en ANGPTL4 eller agonist. I ett aspekt blir ANGPTL4 tilveiebrakt ved en nukleinsyre som koder for ANGPTL4. I én utførelsesform av oppfinnelsen er en ANGPTL4-agonist en agonist for en αv β5-reseptor.

Midler for å inhibere proliferasjon av hepatocytter ble også tilveiebrakt som definert i kravene. I visse utførelsesformer er midlene for å administrere en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter en ANGPTL4-antagonist til en populasjon av hepatocytter eller pre-hepatocytter. I ett aspekt er ANGPTL4-antagonisten et middel som administrere ANGPTL4-proteinproduksjon, for eksempel et antisensmolekyl eller ribozymmolekyl. I ett aspekt er ANGPTL4-antagonisten et anti-ANGPTL4-antistoff. I ett aspekt er ANGPTL4-antagonisten et anti- αv β5-antagonist antistoff. I én utførelsesform er ANGPTL4-antagonisten et ANGPTL4-SiRNA. ANGPTL4-antagonister kan bli benyttet i behandlingen av f. eks. leverkreft eller uønsket leverhypertrofi ved å administrere en effektiv mengde av ANGPTL4-antagonisten til hepatocytten.

Fremgangsmåter for å modulere celleadhesjon av hepatocytter blir også beskrevet. I visse utførelsesformer inkluderer fremgangsmåtene å indusere celleadhesjon for hepatocytter ved å administrere en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist til en populasjon av hepatocytter. I andre utførelsesformer inkluderer fremgangsmåtene å inhibere celleadhesjon for hepatocytter ved å administrere en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter en ANGPTL4-antagonist til en populasjon av hepatocytter, for derved å inhibere celleadhesjon for hepatocyttene.

I tillegg til å modulere proliferasjon og celleadhesjon for hepatocytter, som er involvert i lipidhomeostase, så modellerer ANGPTL4 triglyserid- og kolesterolnivåer i serum, og stimulerer pre-adipocyttproliferasjon, som også er involvert i lipidhomeostase.

Beskrivelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å modulere et antall ulike aspekter av lipidhomeostase. Fremgangsmåter ifølge beskrivelsen inkluderer for eksempel å stimulere proliferasjon av pre-adipocytter ved å administrere en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist til en populasjon av preadipocytter, for derved å indusere proliferasjonen av pre-adipocytter. Fremgangsmåte for å inhibere prolifera-sjonen av pre-adipocytter ble også beskrevet. Fremgangsmåter inkluderer for eksempel å administrere en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter en ANGPTL4-antagonist til en populasjon av pre-adipocytter. Fremgangsmåter for modulering av cellemigrasjon for pre-adipocytter blir også beskrevet. Fremgangsmåter ifølge beskrivelsen inkluderer for eksempel å indusere cellemigrasjon for pre-adipocytter ved å administrere en effektiv mengde av ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist til en populasjon av pre-adipocytter. Fremgangsmåter for å inhibere cellemigrasjon for pre-adipocytter ble også beskrevet, som f. eks. inkluderer administrering av en effektiv mengde av en ANGPTL4-antagonist til en populasjon av pre-adipocytter for derved å indusere cellemigrasjon.

Fremgangsmåter for å modulere serumnivåer av triglyserider eller kolesterol hos et individ blir også beskrevet. Fremgangsmåter inkluderer for eksempel å administrere en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist eller en ANGPTL4-antagonist til et individ, for derved å modulere serumnivåene av triglyserider og/eller kolesterol hos et individ. I én utførelsesform blir en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist administrert, som resulterer i en akkumulering av triglyserider og/eller kolesterol i serum hos et individ sammenlignet med en kontroll. I en annen utførelsesform blir en effektiv mengde av en ANGPTL4-antagonist administrert til et individ for derved å redusere nivået av minst ett triglyserid, fire fettsyrer og/eller kolesterol i serum hos individet. I visse utførelsesformer er en kontroll et serum fra et individ før behandling eller et individ uten noen behandling eller redusert behandling osv.

En ANGPTL4 og ANGPTL4-modulator (agonist eller antagonist derav) kan bli benyttet i behandling av lipidhomeostase forstyrrelser ved å administrere en effektiv mengde av molekylet til et individ. Se ”Lipidhomeostase forstyrrelse” under definisjoner her. En fremgangsmåte omfatter for eksempel å administrere til et individ en sammensetning som omfatter ANGPTL4-antagonist i en mengde som er effektiv til å behandle hyperlipidemi.

Fremgangsmåte for å behandle overvekt og/eller redusere total kroppsmasse hos et individ ble også beskrevet. En fremgangsmåte inkluderer for eksempel å administrere en effektiv mengde av ANGPTL4-modulator til et individ, for derved å behandle overvekt og/eller redusere total kroppsmasse hos individet sammenlignet med ingen behandling eller behandling med en kontroll. I én utførelsesform blir fedme (fett) hos et individ redusert. På denne måten kan tilstander som er beslektet med overvekt også bli behandlet, f. eks. kardiovaskulær sykdom, diabetes osv.

I visse utførelsesformer av oppfinnelsen er cellene, f. eks. hepatocyttene, preadipocyttene i et individ. Typisk er individet et menneske.

En ANGPTL4 ifølge oppfinnelsen inkluderer full-lengde proteiner i tillegg til biologisk aktive molekyler, f. eks. rester tilsvarende det N-terminale, det N-terminale oppkveilede kveiledomenet, det C-terminale, det C-terminale fibrinogenlignende domenet eller ANGPTL4 (1-183), ANGPTL4 (23-183), ANGPTL4 (1 til omtrent 162), ANGPTL4 (omtrent 162-406), ANGPTL4 (23-406) eller ANGPTL4 (184-406), aminosyre undersekvens av humant ANGPTL4 og/eller mANGPTL4 (1-183), mANGPTL4 (23-183), mANGPTL4 (1 til omtrent 165), mANGPTL4 (23 til omtrent 165), mANGPTL4 (23-410) eller mANGPTL4 (184-410) aminosyre undersekvens av det murine ANGPTL4. Andre undersekvenser inkluderer også f. eks. 40-183, 60-183, 80-183, 100-183m 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 og 160-406 av hANGPTL4 og f. eks. 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 og 160-410 mANGPTL4-agonister av ANGPTL4 inkluderer molekyler som definert i kravene som frembringer ANGPTL4-aktiviteter.

ANGPTL4-antagonister ifølge oppfinnelsen er molekylersom definert i kravene som inhiberer eller reduserer aktiviteten til ANGPTL4. En ANGPTL4-inhibitor kan inkludere et polynukleotid, antisensmolekyler, RNA-aptamerer, ribozymer mot ANGPTL4 eller dens reseptorpolypeptider, et reseptor-polypeptid, et antistoff eller konjugater eller fusjonsproteiner derav, som inhiberer en ANGPTL4-aktivitet, direkte eller indirekte. I visse utførelsesformer av oppfinnelsen er et antagonist-ANGPTL4-antistoff et antistoff som inhiberer eller reduserer aktiviteten til ANGPTL4 ved å binde til en spesifikk undersekvens eller region av ANGPTL4-proteinet, f. eks. N-terminal, N-terminalt oppkveilet kveiledomene, C-terminal, C-terminal fibrinogenlignende domene eller ANGPTL4 (1-183), ANGPTL4 (23-183), ANGPTL4 (1 til omtrent 162), ANGPTL4 (omtrent 162-406), ANGPTL4 (23-406) eller ANGPTL4 (184-406), aminosyre undersekvens av humant ANGPTL4 og/eller mANGPTL4 (1-183), mANGPTL4 (23-183), mANGPTL4 (1 til omtrent 165), mANGPTL4 (23 til omtrent 165), mANGPTL4 (23-410) eller mANGPTL4 (184-410) aminosyre undersekvens av det murine ANGPTL4. Andre undersekvenser inkluderer også f. eks. 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 og 160-406 av hANGPTL4 og for eksempel 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 og 160-410 av mANGPTL4. I visse utførelsesformer av oppfinnelsen inkluderer en antagonist av ANGPTL4 et anti- αv β5-antistoff, f. eks. et antagonist-anti- αv β5-antistoff. I visse utførelsesformer er antistoffer ifølge oppfinnelsen humaniserte antistoffer. I visse utførelsesformer av oppfinnelsen er en ANGPTL4-antagonist et SiRNA-molekyl. I én utførelsesform er SiRNA-molekylet et ANGPTL4-SiRNA-molekyl, der molekylet målsøker en DNA-sekvens (f. eks.

GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA) i en nukleinsyre som koder for ANGPTL4. Et immunadhesin av ANGPTL4 omfatter minst reseptorbindingsregionen til ANGPTL4 fusjonert til en immun globulin sekvens. I visse utførelsesformer er ANGPTL4, agonist eller antagonist med en bærer, f. eks. en farmasøytisk akseptabel bærer.

ANGPTL4-transgene dyr og knockoutdyr blir beskrevet og anvendelse av disse transgene dyrene blir også beskrevet. Beskrivelsen tilveiebringer også en isolert celle som er avledet fra et ikke-humant transgent dyr hvis genom omfatter en forstyrrelse av et gen som koder for et ANGPTL4. I visse utførelsesformer omfatter den isolerte cellen en murin celle (f. eks. en embryonal stamcelle).

Muterte genforstyrrelser for ANGPTL4 har ført til fenotypiske observasjoner som er beslektet med ulike sykdomstilstander eller dysfunksjoner inkludert: kardiovasklære, endotele eller angiogene forstyrrelser inkludert aterosklerose, unormale metabolske forstyrrelser inkludert lipidhomeostase forstyrrelser, eller immunologiske og inflammatoriske forstyrrelser. Fremgangsmåter ifølge beskrivelsen inkluderer å behandle en kardiovaskulær, endotel eller angiogen forstyrrelse, unormale metabolske forstyrrelser, immunologiske forstyrrelser, en lipidhomeostase-forstyrrelse eller onkologiske forstyrrelser som er assosiert med forstyrrelsene i et gen som koder for en ANGPTL4 eller som er assosiert med en ANGPTL4-aktivitet ved å administrere en effektiv mengde av en ANGPTL4, en agonist eller antagonist av en ANGPTL4 til et individ for derved effektivt å behandle nevnte forstyrrelse eller sykdom.

Fremgangsmåter for å identifisere en fenotype som er assosiert med en forstyrrelse i et gen som koder for en ANGPTL4 blir også beskrevet. Fremgangsmåten inkluderer for eksempel (a) å måle et fysiologisk kjennetegn for et ikke-humant, transgent dyr hvis genom omfatter en forstyrrelse i et gen som koder for en ANGPTL4 og (b) sammenligne det målte, fysiologiske kjennetegnet med det for et kjønnsmatchet villtype dyr. En fenotype som skyldes genforstyrrelsen blir identifisert som det fysiologiske kjennetegnet for det ikkehumane, transgene dyret som er forskjellig fra det fysiologiske kjennetegnet for villtype dyret. Det ikke-humane, transgene dyret kan være homozygot eller heterozygot for forstyrrelsen i et gen som koder for en ANGPTL4.

Fremgangsmåter for å identifisere et middel som modulerer en fenotype som er assosiert med en forstyrrelse i et gen som koder for en ANGPTL4 ble også beskrevet. En fremgangsmåte inkluderer for eksempel (a) å måle et fysiologisk kjennetegn for et ikkehumant, transgent dyr hvis genom omfatter en forstyrrelse i genet som koder for ANGPTL4, (b) sammenligne det målte, fysiologiske kjennetegnet fra (a) med det for et kjønnsmatchet villtype dyr. En fenotype som skyldes genforstyrrelsen i det ikke-humane, transgene dyret er et fysiologisk kjennetegn for det ikke-humane, transgene dyret som er forskjellig fra det fysiologiske kjennetegnet til villtype dyret. Et testmiddel blir administrert til det ikkehumane, transgene dyret i (a) og det blir bestemt hvorvidt testmiddelet modulerer den identifiserte fenotypen som er assosiert med genforstyrrelsen. Et testmiddel som modulerer fenotypen er et middel som modulerer denne fenotypen.

I visse utførelsesformer er en fenotype som er assosiert med ANGPTL4-genforstyrrelsen eller –fenotypen som ble oppvist av det ikke-humane, transgene dyr sammenlignet med kjønnsmatchede villtype kull kamerater minst av de følgende f. eks. en kardiovaskulær, endotel eller angiogen forstyrrelse, en immunologisk forstyrrelse, en lipidhomeostase forstyrrelse eller en unormal, metabolsk forstyrrelse.

Fremgangsmåter for å identifisere et middel som modulerer et fysiologisk kjennetegn som assosiert med en forstyrrelse i genet som koder for en ANGPTL4 blir også beskrevet. I visse utførelsesformer inkluderer fremgangsmåten (a) å måle et fysiologisk kjennetegn oppvist av et ikke-humant, transgent dyr hvis genom omfatter en forstyrrelse i genet som koder for en ANGPTL4 og (b) å sammenligne det målte, fysiologiske kjennetegnet i (a) med det for et kjønnsmatchet villtype dyr. Et fysiologisk kjennetegn som blir oppvist av det ikke-humane, transgene dyret som er forskjellig fra det fysiologiske kjennetegnet som blir oppvist av villtype dyret blir identifisert som et fysiologisk kjennetegn som assosiert med genforstyrrelsen. Et testmiddel blir administrert til det ikke-humane, transgene dyret i (a) og det blir bestemt hvorvidt det fysiologiske kjennetegn som er assosiert med genforstyrrelsen blir modulert. Et testmiddel som modulerer det fysiologiske kjennetegnet er et middel som modulerer dette kjennetegnet.

I visse utførelsesformer oppviser det ikke-humane, transgene dyret minst ett av de følgende fysiologiske kjennetegnene sammenlignet med kjønnsmatchede villtype kullkamerater, f. eks. en modulering i gjennomsnittlig serumkolesterolnivåer, en modulering i gjennomsnittlige serumtriglyseridnivåer, en modulering i en glukosetoleransetest, en modulering i glukosehomeostase, et minsket gjennomsnittlig serumglukosenivå, en økning i gjennomsnittlig seruminsulinnivå, en minskning i gjennomsnittlig seruminsulinnivå, et økt gjennomsnittlig serum-IgG-nivå og økt gjennomsnittlig absolutt nøytrofil antall, en økning i gjennomsnittlig prosentvis kroppsfett, en minsket kroppsvekt og lengde, minsket totalvevsmasse og ren kroppsmasse, minsket totalfett masse, veksthemming med minsket kroppsvekt og lengde og/eller minsket gjennomsnittlig prosentandel av total kroppsvekt, total vevsmasse. I én utførelsesform er moduleringen av de gjennomsnittlige serumkolesterolnivåene en minskning i gjennomsnittlig serumkolesterolnivå. I én utførelsesform er moduleringen av gjennomsnittlig serumtriglyseridnivå en minskning av gjennomsnittlig serumtriglyseridnivå. I en annen utførelsesform er moduleringen i glukosetoleransetesten en forsterket glukosetoleranse.

Fremgangsmåter for å identifisere et middel som lindrer en kardiovaskulær, endotel eller angiogen forstyrrelse, en immunologisk forstyrrelse, en onkologisk forstyrrelse, en lipidmetabolsk forstyrrelse eller en unormal, metabolsk forstyrrelse som er assosiert med en forstyrrelse i genet som koder for en ANGPTL4 bli beskrevet. For eksempel inkluderer en fremgangsmåte (a) å administrere et testmiddel til et ikke-humant, transgent dyr som omfatter en forstyrrelse i et ANGPTL4-gen og (b) bestemme hvorvidt testmiddelet lindrer den kardiovaskulære, endotele eller angiogene forstyrrelsen, immunologiske forstyrrelsen, onkologiske forstyrrelsen, lipidmetabolske forstyrrelsen eller den metabolske forstyrrelsen assosiert med genforstyrrelsen i det ikke-humane, transgene dyret.

Beskrivelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å evaluere et terapeutisk middel som er i stand til å påvirke en tilstand som er assosiert med en forstyrrelse i et gen som koder for en ANGPTL4. En fremgangsmåte inkluderer for eksempel (a) å måle et fysiologisk kjennetegn for et ikke-humant, transgent dyr hvis genom omfatter en forstyrrelse i genet som koder for ANGPTL4, (b) sammenligne det målte fysiologiske kjennetegn fra (a) med det for et kjønnsmatchet villtype dyr, (c) administrere et testmiddel til det ikke-humane, transgene dyret i (a) og (d) evaluere effekten av testmiddelet på den identifiserte tilstanden som er assosiert med genforstyrrelse i det ikke-humane, transgene dyret. Det fysiologiske kjennetegnet i det ikke-humane, transgene dyret som er forskjellig fra det fysiologiske kjennetegnet i villtypedyret blir identifisert som en tilstand som skyldes genforstyrrelsen i det ikke-humane, transgene dyret. Tilstanden er for eksempel en kardiovaskulær, endotel eller angiogen forstyrrelse, en immunologisk forstyrrelse, en onkologisk forstyrrelse, en lipidhomeostaseforstyrrelse eller en metabolsk forstyrrelse.

Fremgangsmåte for å identifisere et middel som modulerer ekspresjonen av en ANGPTL4 ble også beskrevet. En fremgangsmåte inkluderer for eksempel (a) å kontakte et testmiddel med en vertscelle som uttrykker en ANGPTL4 og (b) bestemme hvorvidt testmiddelet modulerer ekspresjonen av ANGPTL4 i vertscellen.

Et middel som er identifisert ved hjelp av enhver av fremgangsmåtene ovenfor er også inkludert i beskrivelsen. I én utførelsesform omfatter middelet en agonist. I en annen utførelsesform omfatter middelet en antagonist av ANGPTL4. Midler som er terapeutiske midler er også inkludert i beskrivelsen sammen med en farmasøytisk sammensetning som inkluderer det terapeutiske middelet.

Et molekyl ifølge oppfinnelsen, f. eks. ANGPTL4, en agonist eller antagonist av ANGPTL4, et middel osv. som definert i kravene kan bli administrert til individet via et systemisk leveringssystem. I ett aspekt inkluderer det systemiske leveringssystemet et cellepreparat som omfatter pattedyrceller (f. eks. CHO-celler) som uttrykker en rekombinant form av middelet. I et annet aspekt kan det systemiske leveringssystemet omfatte et preparat med sakte frigjøring som omfatter renset middel og en polymermatriks. I visse utførelsesformer blir molekylet administrert til et individ sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Alternativt kan molekylet ifølge oppfinnelsen bli administrert via en vevsrettet (f. eks. adipocytter, lever osv.) genleveringsvektor som omfatter en nukleinsyre som koder for molekylet. Veletablerte virusvektorer eller ikkevirusvektorer til genterapi kan bli benyttet som den vevsrettede genleveringsvektoren i oppfinnelsen.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 illustrerer en nukleinsyresekvens for human ANGPTL4 (Sekv. id. nr. 1).

68 Detaljert beskrivelse

Definisjoner

Det er på det rene at terminologien som blir benyttet her for det formålet å kun beskrive spesielle utførelsesformer, ikke er ment å være begrensende. Som benyttet i denne beskrivelsen og i de tilhørende kravene inkluderer de singulære formene ”en”, ”ei” og ”et” flertallsreferansene, hvis ikke innholdet klart dikterer noe annet. Referanse til for eksempel ”et molekyl” inkluderer eventuelt en kombinasjon av to eller flere slike molekyler og lignende. Hvis ikke annet er definert så er alle vitenskapelige og tekniske uttrykk forstått slik at de har den samme betydningen som den som vanlig blir tillagt dem på fagområdet. For formålet av oppfinnelsen er de følgende uttrykkene definert nedenfor.

Uttrykket ”ANGPTL4” eller ”Angptl4” refererer til angiopoietinlignende-4-polypeptid eller –protein, sammen med naturlig forekommende allele, utskilte og produserte former derav. ANGPTL4 fra mennesket er for eksempel et protein på 406 aminosyrer, mens ANGPTL4 fra mus er et protein på 410 aminosyrer. Uttrykket ”ANGPTL4” blir også benyttet for å referere til fragmenter (f. eks. undersekvenser, trunkerte former osv.) av polypeptider som omfatter f. eks. N-terminalfragment, oppkveilet kveilet domene, C-terminalt fragment, fibrinogenlignende domene, aminosyrene 1-183, 23-183, 1 til omtrent 162, 23 til omtrent 162, 23-406, 184-406, omtrent 162-406 eller 23-184 av det humane angiopoietinlignende-4-proteinet og aminosyrene 1-183, 23-183, 1 til omtrent 165, 23 til omtrent 165, 23-410 eller 184-410 av det murine angiopoietinlignende-4-proteinet. Andre fragmenter inkluderer f. eks. 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 og 160-406 av hANGPTL4 og for eksempel 40-183, 60-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 100-410, 120-410, 140-410 og 160-410 av mANGPTL4. Referanse til enhver slik form av ANGPTL4 kan også bli identifisert i søknaden, f. eks. ved ”ANGPTL4 (23-406)”, ”ANGPTL4 (184-406)”, ”ANGPTL4 (23-183)”, ”mANGPTL4 (23-410)”, ”mANGPTL4 (184-410)” osv, der m indikerer murin sekvens. Aminosyreposisjonen for et nativt ANGPTL4-fragment er nummerert som indikert i den native ANGPTL4-sekvensen. For eksempel er aminosyreposisjon 22(Ser) i et ANGPTL4-fragment også posisjon 22(Ser) i nativ, human ANGPTL4, se f. eks. Figur 2. Vanligvis har det native ANGPTL4-fragmentet biologisk aktivitet.

Et «nativsekvens»-polypeptid omfatter et polypeptid som har den samme aminosyresekvensen som et polypeptid som er avledet fra naturen. Slik kan et nativsekvenspolypeptid ha aminosyresekvensene til et naturlig forekommende polypeptid fra et hvilket som helst pattedyr. Et slikt nativsekvens-polypeptid kan bli isolert fra naturen eller kan bli fremstilt ved hjelp av rekombinante eller syntetiske fremgangsmåter. Uttrykket «nativsekvens»-polypeptid omfatter spesifikt naturlig forekommende trunkerte eller utskilte former av polypeptidet (f. eks. en ekstracellulær domenesekvens), naturlig forekommende variantformer (f. eks. alternativt spleisede former) og naturlig forekommende allelvarianter av polypeptidet.

En polypeptid-«variant» betyr et biologisk aktivt polypeptid som har mindre enn omtrent 80 % aminosyresekvensidentitet med det tilsvarende nativsekvens-polypeptidet, eller et fragment derav. Slike varianter inkluderer for eksempel polypeptider der en eller flere aminosyrerester er tilført, eller fjernet, på den N-terminale og/eller C-terminale delen av polypeptidet. Ordinært vil en variant ha minst omtrent 80 % aminosyresekvensidentitet, eller minst omtrent 90 % aminosyresekvensidentitet, eller minst omtrent 95 % eller høyere aminosyresekvensidentitet med en nativsekvens-polypeptider eller fragmenter derav.

Uttrykket ”ANGPTL4-variant” refererer slik det blir benyttet her til en variant som beskrevet ovenfor og/eller en ANGPTL4 som inkluderer en eller flere aminosyremutasjoner i den native ANGPTL4-sekvensen. Eventuelt inkluderer den ene eller de flere aminosyremutasjonene aminosyresubstitusjon(er). ANGPTL4 og varianter derav til anvendelse i oppfinnelsen kan bli fremstilt ved hjelp av en mengde fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. Aminosyresekvensvarianter av ANGPTL4 kan bli fremstilt ved mutasjoner i ANGPTL4-DNA. Slike varianter inkluderer for eksempel delesjoner fra, insersjon i eller substitusjoner av rester innenfor aminosyresekvensen til ANGPTL4, f. eks. en human aminosyresekvens som er kodet for av nukleinsyren som er deponert under ATCC-deponeringsnummer 209284, eller som vist i Figur 2. Enhver kombinasjon av delesjon, insersjon og substitusjon kan bli gjort for å komme frem til den endelige konstruksjonen som har den ønskede aktiviteten. Mutasjonene som vil bli innført i DNA som koder for varianten må ikke plassere sekvensene ute av leserammen og vil fortrinnsvis ikke danne komplementære regioner som kan frembringe sekundære mRNA-struktur. EP 75 444A.

ANGPTL4-variantene blir eventuelt fremstilt ved hjelp av seterettet mutagenese av nukleotider i DNA som koder for den native ANGPTL4 eller phage-displayteknikker for derved å fremstille DNA som koder for varianten, og deretter uttrykke DNA i rekombinant cellekultur.

Mens setet for å introdusere en aminosyresekvensvariasjon er forhåndsbestemt, så trenger ikke mutasjonen i seg selv å være forutbestemt. For å optimalisere virkningen av en mutasjon på et gitt sete, kan for eksempel tilfeldig mutagenese bli utført på målkodonet eller regionen og de uttrykte ANGPTL4-variantene kan bli screenet for den optimale kombinasjonen av ønsket aktivitet. Teknikker for å fremstille substitusjonsmutasjoner på forhåndsbestemte seter i DNA som har en kjent sekvens er velkjente, slik som for eksempel seterettet mutagenese. Fremstilling av ANGPTL4-varianten som er beskrevet her, kan bli oppnådd ved hjelp av phage-displayteknikker slik som de som er beskrevet i PCT-publikasjon WO 00/63380.

Etter at en slik klon er valgt kan den muterte proteinregionen blir fjernet og plassert i en passende vektor for proteinproduksjon, vanligvis en ekspresjonsvektor av den typen som kan bli benyttet til transformasjon av en passende vert.

Aminosyresekvensdelesjoner strekker seg vanligvis fra omtrent 1 til 30 rester, fra eventuelt 1 til 10 rester, eventuelt 1 til 5 eller færre og er typisk kontinuerlige.

Aminosyresekvensinsersjon inkluderer aminoterminale og/eller karboksylterminale fusjoner av fra én rest til polypeptider av så å si ubegrenset lengde i tillegg til intrasekvensinsersjon av enkelte eller flere aminosyreserester. Intrasekvensinsersjon (dvs. insersjonen innenfor den native ANGPTL4-sekvensen) kan vanligvis strekke seg fra 1 til 10 rester, eventuelt 1 til 5 eller eventuelt 1 til 3. Et eksempel på en terminal insersjon inkluderer en fusjon av en signalsekvens, uansett om den er heterolog eller homolog for vertscellen, til N-terminalen for å fremme sekresjonen fra rekombinante verter.

Ytterligere ANGPTL4-varianter er de der minst én aminosyrerest i den native ANGPTL4 er blitt fjernet og der en annen rest har blitt satt inn i dennes plass. I én utførelsesform av oppfinnelsen inkluderer en ANGPTL4-varfiant, en substitusjon på 162 og/eller 164 i ANGPTL4 eller en substitusjon på 169 i mANGPTL4. Slike substitusjoner kan bli gjort i overensstemmelse med de som er vist i Tabell 1. ANGPTL4-varianter kan også omfatte ikke-naturlige aminosyrer som beskrevet her.

Aminosyrer kan bli gruppert i overensstemmelse med likheter i egenskapene til deres sidekjeder (i A.L. Lehninger, i Biochemistry, 2. utg., s. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) ikke-polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) uladde polare: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) sure: Asp (D), Glu (E)

(4) basiske: Lys (K), Arg (R), His (H)

Alternativt kan naturlig forekommende rester bli delt i grupper basert på felles sidekjedeegenskaper:

(1) hydrofobe: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) nøytrale hydrofile: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) sure: Asp, Glu;

(4) basiske: His, Lys, Arg;

(5) rester som påvirker kjedeorientering: Gly, Pro;

(6) aromatiske: Trp, Tyr, Phe.

Tabell 1

Opprinnelig Eksempel- Foretrukne rest substitusjoner substitusjoner Ala (A) Val, Leu, Ile Val

Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N) Gln, His, Asp, Lys, Arg Gln

Asp (D) Glu, Asn Glu

Cys (C) Ser, Ala Ser

Gln (Q) Asn, Glu Asn

Glu (E) Asp, Gln Asp

Gly (G) Ala Ala

His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucin Leu

Leu (L) Norleucin, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg

Met (M) Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F) Trp, Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Tyr

Pro (P) Ala Ala

Ser (S) Thr Thr

Thr (T) Val, Ser Ser

Trp (W) Tyr, Phe Tyr

Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, norleucin Leu

“Naturlig forekommende aminosyrerester” (dvs. aminosyrerester som er kodet for av den genetiske koden) kan bli valgt fra gruppen som består av: alanin (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), asparaginsyre (Asp), cystein (Cys), glutamin (Gln), glutaminsyre (Glu), glysin (Gly), histidin (His), isoleucin (Ile), leucin (Leu), lysin (Lys), metionin (Met), fenylalanin (Phe), prolin (Pro), serin (Ser), treonin (Thr), tryptofan (Trp), tyrosin (Tyr) og valin (Val). En ”ikke-naturlig forekommende naturlig aminosyrerest” refererer til en rest, som er forskjellig fra de naturlig forekommende aminosyrerestene som er fremlagt ovenfor, som er i stand til å binde kovalent til tilstøtende aminosyrerest(er) i en polypeptidkjede. Eksempler på ikke-naturlig forekommende aminosyrerester inkluderer f.eks. norleucin, ornitin, norvalin, homoserin og andre aminosyrerestanaloger slik som de som er beskrevet i Ellman et al., Met. Enzym. 202:301-336 (1991) og US patentpublikasjoner 20030108885 og 20030082575. Kort fortalt involverer disse prosedyrer å aktivere en suppressor-tRNA med en ikke-naturlig forekommende aminosyrerest etterfulgt av in vitro- eller in vivotranskripsjon og translasjon av RNA. Se f. eks. US patentsøknad publikasjoner 2003108885 og 20030082575, Noren et al. Science 244:182 (1989) og Ellman et al., ovenfor.

”Prosentvis (%) aminosyresekvensidentitet” er her definert som prosentandelen av aminosyrerester i en kandidatsekvens som er identiske med aminosyrerestene i en valgt sekvens etter å ha sammenstilt sekvensene og introdusert åpninger, hvis det er nødvendig, for å oppnå den maksimale, prosentvise sekvensidentiteten, og ikke overveie noen konservative substitusjoner som en del av sekvensidentiteten. Sammenstillingen for det formålet å bestemme prosentvis aminosyresekvensidentitet kan bli oppnådd på ulike måter som ligger innenfor kunnskapen på fagområdet, ved for eksempel å benytte allment tilgjengelige dataprogrammer slik som BLAST, BLAS-2, ALIGN, ALIGN-2 eller Meagling (DNASTAR)-programvare. Fagfolk på området kan bestemme passende parametere for å måle sammenstilling, inkludert enhver algoritme som er nødvendig for å oppnå maksimal sammenstilling over hele lengden av sekvensene som blir sammenlignet. For det formål her, blir likevel %-vis aminosyresekvensidentitetsverdier oppnådd som beskrevet nedenfor ved å benytte sekvenssammenligningsdataprogrammet ALIGN-2. ALIGN-2-sekvenssammenlignings dataprogrammet ble skrevet av Genentech, Inc., og har blitt sendt inn sammen med brukerdokumentasjon til the US Copyright Office, Washington D.C., 20559, der det er registrert under US Copyright Registration nr. TXU510087, og er allment tilgjengelig via Genentech Inc., South San Francisco, California. ALIGN-2-programmet bør bli kompilert for anvendelse på et UNIX-operasjonssystem, f. eks. digital UNIX V4.0D. Alle sekvenssammenligningsparametere er satt av ALIGN-2-programmet og varierer ikke.

For formål her blir den %-vise aminosyresekvensidentiteten til en gitt aminosyresekvens A med, eller mot en gitt aminosyresekvens B (som alternativt kan bli betegnet som en gitt aminosyresekvens A som har eller omfatter en viss %-vis aminosyresekvensidentitet med, mot, eller til en gitt aminosyresekvens B) beregnet som følger:

100 ganger fraksjon X/Y

der X er antallet aminosyrerester som er verdi tilordnet som identiske matcher ved hjelp av sekvenssammenstillingsprogrammet ALIGN-2 i dette programmets sammenstilling av A og B, og der Y er det totale antallet aminosyrerester i B. Det vil være åpenbart at der lengden til aminosyresekvens A ikke er lik lengden til aminosyresekvens B, så blir ikke den prosentvise aminosyresekvensidentiteten for A i forhold til B være lik den prosentvise aminosyresekvensidentiteten for B i forhold til A.

Et ”isolert” polypeptid er et som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent i dets naturlige miljø. Forurensende komponenter i dets naturlige miljø og materialer som vil påvirke diagnostiske eller terapeutiske anvendelser av polypeptidet, og kan inkludere enzymer, hormoner, og andre proteininneholdende eller ikke-proteininneholdende løste stoffer. I visse utførelsesformer vil polypeptidet være renset (1) til mer enn 95% etter vekt av polypeptidet som bestemt ved hjelp av Lowry-fremgangsmåten eller mer enn 99% etter vekt, (2) til en grad som er tilstrekkelig for å oppnå minst 15 rester med N-terminal eller intern aminosyresekvens ved å benytte en spinning-cup-sekvenator eller (3) til homogenitet ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved å benytte Coomassie blått eller sølvfarging. Isolert polypeptid inkluderer polypeptidet in situ inne i rekombinante celler siden minst én komponent fra polypeptidets naturlige miljø ikke vil være tilstede. Ordinært vil likevel isolert polypeptid bli fremstilt ved hjelp av minst ett rensetrinn.

Uttrykket ”ANGPTL4-modulator” refererer til et molekyl som kan aktivere, f. eks. en agonist, ANGPTL4 eller dens ekspresjon, eller som kan inhibere for eksempel en antagonist (eller inhibitor), aktiviteten til ANGPTL4 eller dens ekspresjon. ANGPTL4-agonister inkluderer antistoffer og aktive fragmenter. En ANGPTL4-antagonist refererer til et molekyl som er i stand til å nøytralisere, blokkere, inhibere, avslutte, redusere eller påvirke ANGPTL4-aktiviteter, for eksempel celleproliferasjon eller vekst, migrasjon, adhesjon eller metabolsk, for eksempel lipidmodulering, eller dens ekspresjon inkludert dens binding til en ANGPTL4-reseptor, for eksempel αv β5. ANGPTL4-antagonister inkluderer for eksempel anti-ANGPTL4-antistoffer og antigenbindende fragmenter derav, reseptormolekyler og derivater som spesifikt binder til ANGPTL4 for derved å isolere dens binding til en eller flere reseptorer, anti-ANGPTL4-reseptorantistoffer og ANGPTL4-reseptorantagonister slik som småmolekylinhibitorer av reseptoren. Andre ANGPTL4-antagonister inkluderer også antagonistvarianter av ANGPTL4, antisensmolekyler (for eksempel ANGPTL4-SiRNA), RNA-aptamerer og ribozymer mot ANGPTL4 eller dens reseptor. I visse utførelsesformer er antagonist-ANGPTL4-antistoffer antistoffer som inhiberer eller reduserer aktiviteten til ANGPTL4 ved å binde til en spesifikk undersekvens eller region av ANGPTL4, for eksempel N-terminalt fragment, oppkveilet kveiledomene, C-terminalt fragment, fibrinogenlignende domene, aminosyrene 1-183, 23-183, 1 til omtrent 162, 23 til omtrent 162, 23-406, 184-406, omtrent 162-406 eller 23-184 i det humane angiopoietinlignende-4-proteinet og aminosyrene 1-183, 23-183, 1 til omtrent 165, 23 til omtrent 165, 23-410 eller 184-410 i det murine angiopoietinlignende-4-proteinet. Andre undersekvenser inkluderer også for eksempel 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 og 160-406 av hANGPTL4 og for eksempel 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 og 160-410 av mANGPTL4.

Modulatorer av ANGPTL4 er molekyler som modulerer aktiviteten til ANGPTL4, for eksempel agonister og antagonister. Uttrykket ”agonist” blir benyttet for å referere til peptid- og ikke-peptidanaloger av ANGPTL4, og til antistoffer som spesifikt binder slike ANGPTL4-molekyler, gitt at de har evnen til å signalisere via en nativ ANGPTL4-reseptor (for eksempel αv β5-integrin). Uttrykket ”agonist” er definert i konteksten av den biologiske rollen til en ANGPTL4-reseptor (for eksempel αv β5). I visse utførelsesformer innehar agonister de biologiske aktivitetene til en nativ ANGPTL4, som definert ovenfor, slik som fremmingen av proliferasjon, migrasjon og/eller adhesjon av celler og/eller modulering av lipidhomeostase.

Uttrykket ”antagonist” blir benyttet for å referere til molekyler som har evnen til å inhibere den biologiske aktiviteten til ANGPTL4 uavhengig hvorvidt de har evnen til å binde ANGPTL4 eller dennes reseptor, for eksempel αv β5. Antagonister som har evnen til å binde ANGPTL4 eller dens reseptor inkluderer for eksempel anti-ANGPTL4- og anti- αv β5-antistoffer. Antagonister som inhiberer ekspresjon av ANGPTL4 er inkludert, for eksempel ANGPTL4-SiRNA. Antagonist-ANGPTL4 kan for eksempel bli vurdert ved å inhibere aktiviteten til ANGPTL4, for eksempel adhesjon, migrasjon, proliferasjon og/eller modulering av lipidhomeostaseaktivitet for ANGPTL4. Med hensyn til αv β5-integrinreseptoraktivitet kan en modulator av αv β5-integrinreseptor bli bestemt ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. For eksempel kan fremgangsmåten som er beskrevet av J. W. Smith et al. i J. Biol. Chem. 265:12267-12271 (1990) bli benyttet.

Uttrykket ”anti-ANGPTL-antistoff” er et antistoff som binder til ANGPTL4 med tilstrekkelig affinitet og spesifisitet. I visse utførelsesformer av oppfinnelsen kan anti-ANGPTL4-antistoffer ifølge oppfinnelsen bli benyttet som et terapeutisk middel for å målsøke og påvirke sykdommer eller tilstander der ANGPTL4-aktivitet er involvert. Generelt vil et anti-ANGPTL4-antistoff vanligvis binde til andre ANGPTL4-homologer, for eksempel ANGPTL3.

Uttrykket ”antistoff” blir benyttet i sin bredeste betydning og inkluderer monoklonale antistoffer (inkludert fullengdeantistoffer eller intakte monoklonale antistoffer), polyklonale antistoffer, multivalente antistoffer, multispesifikke antistoffer (for eksempel bispesifikke antistoffer) og antistoff-fragmenter (se nedenfor) så lenge de oppviser den ønskede, biologiske aktiviteten.

Dersom ikke annet er indikert, blir uttrykket ”multivalent antistoff” benyttet gjennom hele denne beskrivelsen for å beregne et antistoff som omfatter 3 eller flere antigenbindende seter. Det multivalente antistoffet er typisk fremstilt slik at det har tre eller flere antigenbindende seter og er generelt ikke et nativsekvens-IgM- eller –IgA-antistoff.

”Antistoff-fragmenter” omfatter kun en del av et intakt antistoff, vanligvis inkluderende et antigenbindende sete fra det intakte antistoffet og opprettholder slik evnen til å binde antigen. Eksempler på antistoff-fragmenter som er omfattet av foreliggende definisjon inkluderer: (i) Fab-fragmentet som har VL-, CL-, VH- og CH1-domener, (ii) Fab’-fragmentet som er et Fab-fragment som har en eller flere cysteinrester på C-terminalen til CH1-domenet, (iii) Fd-fragmentet som har VH- og CH1-domener, (iv) Fd’-fragmentet som har VH- og CH1-domener og en eller flere cysteinrester på C-terminalen på CH1-domenet, (v) Fv-fragmentet som har VL- og VH-domenene fra en enkelt arm fra et antistoff, (vi) dAbfragmentet (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), som består av et VH-domene (vii) isolerte CDR-regioner, (viii) F(ab’)2-fragmenter, et bivalent fragment som inkluderer to Fab’-fragmenter bundet sammen ved en disulfidbro på hengselregionen, (ix) enkeltkjede antistoffmolekyler (for eksempel enkeltkjede-Fv, -scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988) og Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)), (x) ”diastoffr” med to antigenbindende seter som omfatter et tungkjede variabeldomene (VH) bundet til et lettkjede variabeldomene (VL) på den samme polypeptidkjeden (se for eksempel EP 404 097, WO 93/11161, og Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)), (xi) ”lineære antistoffer” som omfatter et par med tandem-Fd-segmenter (VH-CH1-VH-CH1) som sammen med komplementaritet lettkjedepolypeptider danner et par med antigenbindende regioner (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057 1062 (1995) og US patentskrift nr. 5 641 870).

Uttrykket ”monoklonalt antistoff”, slik som det blir benyttet her, refererer til et antistoff som er fremskaffet fra en populasjon med vesentlig homogene antistoffer, dvs. at de individuelle antistoffene som utgjør populasjonen er identiske bortsett fra mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke, der de er rettet mot et enkelt antigen. I motsetning til polyklonale antistoffpreparater som typisk inkluderer ulike antistoffer rettet mot ulike determinanter (epitoper) så er videre hvert monoklonale antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet. ”Monoklonal” er ikke å bli ansett som å kreve fremstilling av antistoffet ved noen spesiell fremgangsmåte. De monoklonale antistoffene som skal bli benyttet i overensstemmelse med oppfinnelsen kan for eksempel bli fremstilt ved hjelp av en hybridomfremgangsmåte som først ble beskrevet av Kohler et al., Nature 256:495 (1975) eller det kan bli fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter (se for eksempel US patentskrift nr. 4 815 567). De ”monoklonale antistoffene” kan også bli isolert fra bakteriofag antistoffbiblioteker ved å benytte teknikkene som er beskrevet i Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) eller Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

De monoklonale antistoffene her inkluderer spesifikt ”kimære” antistoffer der en del av tungkjeden og/eller lettkjeden er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer som er avledet fra en spesiell art eller som tilhører en spesiell antistoffklasse eller –underklasse, mens det gjenværende av kjeden/kjedene er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer som er avledet fra en annen art eller som tilhører en annen antistoffklasse eller –underklasse, i tillegg til fragmenter av slike antistoffer, så lenge de oppviser den ønskede, biologiske aktiviteten (US patentskrift nr. 4 816 567 og Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

”Humaniserte” former av ikke-humane (for eksempel murine) antistoffer er kimære antistoffer som inneholder minimalt med sekvens avledet fra ikke-humant immunglobulin. I hovedsak er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottagerantistoff) der residuer fra en hypervariabel region fra mottakeren er erstattet med rester fra en hypervariabel region fra en ikke-human art (donorantistoff) slik som mus, rotte, kanin eller ikkehuman primat som har den ønskede spesifisiteten, affiniteten og kapasiteten. I noen tilfeller er rammeverksregion (FR)-rester i det humane immunglobulinet erstattet med tilsvarende ikke-humane rester. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte rester som ikke er funnet i mottakerantistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifikasjonene ble gjort for ytterligere å raffinere antistoffutøvelse. Vanligvis vil det humaniserte antistoffet omfatte vesentlig alt av minst et, og typisk to, variabeldomener, der alle eller vesentlig alle hypervariabelløkkene tilsvarerer de fra et ikke-humant immunglobulin og alle eller vesentlig alle FRene er i de fra en human immunglobulinsekvens. Det humaniserte antistoffet vil eventuelt også omfatte minst én del av en immunglobulinkonstantregion (Fc), typisk den for et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer, se Jones et al., Nature 3421:522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Et ”humant antistoff” er et som innehar en aminosyresekvens som tilsvarer den for et antistoff som er fremstilt fra et humant antistoff og/eller har blitt fremstilt ved å benytte teknikkene for å fremstille humane antistoffer som er tilkjennegjort her. Denne definisjonen for et humant antistoff ekskluderer spesifikt et humanisert antistoff som omfatter ikke-humane antigenbindingsrester. Humane antistoffer kan bli fremstilt ved å benytte ulike teknikker som er kjent på fagområdet. I én utførelsesform er det humane antistoff valgt fra et bakteriofagbibliotek der dette bakteriofagbiblioteket uttrykker humane antistoffer (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996), Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998), Hoogenboom og Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Humane antistoffer kan også bli fremstilt for å introdusere humane immunglobulinlokus inn i transgene dyr, for eksempel mus der de endogene immunglobulingenene delvis eller fullstendig har blitt inaktivert. Ved utfordring blir human antistoffproduksjon observert, som nært ligner den som blir sett hos mennesker i alle henseender, inkludert genrearrangering, sammensetting og antistoffrepertoar. Denne tilnærmingen er for eksempel beskrevet i US patentskrift nr. 5 545 807, 5 545 806, 5 560 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 661 016 og i de følgende forskningspublikasjonene: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992), Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994), Morrison, Nature 368:812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996), Lonberg og Huszar, Intern Rev. Immjunol. 13:65-93 (1995). Alternativt kan det humane antistoffet bli fremstilt via udødeliggjøring av humane B-lymfocytter som produserer et antistoff som er rettet mot et målantigen (slike B-lymfocytter kan være gjenvunnet fra et individ eller kan ha blitt immunisert in vitro). Se for eksempel Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77 (1985), Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991) og US patentskrift nr. 5 750 373.

Uttrykket ”variabel” refererer til det faktumet at visse deler av variabeldomenet er svært forskjellig i sekvens blant annet i stoffer og blir benyttet i bindingen og spesifisiteten for hvert spesielle antistoff for dette spesielle antigen. Likevel er ikke variabiliteten jevnt fordelt på variabeldomenet i antistoffet. Den er konsentrert i tre segmenter kalt typer variabelregioner både på lettkjede- og tungkjede variabeldomene. De mer konserverte delene av variabeldomenene blir kalt rammeverksregionene (FR). Variabeldomenene til native tungkjeder og lettkjeder omfatter hver fire FRer, som i hovedsak har tilpasset en betaflatekonfigurasjon, sammenbundet av tre hypervariable regioner som danner løkker som binder den sammen, og som i noen tilfeller danner en del av betaflatestrukturen.

Hypervariabelregionene i hver kjede ble holdt sammen tett av FRene og bidrar sammen med hypervariabelregionene fra den andre kjeden til dannelsen av det antigenbindende sete på antistoffer (se Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Konstantdomenet er ikke involvert direkte i å binde et antistoff til et antigen, men oppviser ulike effektorfunksjoner slik som deltagelse for antistoffer i antistoffavhengig, cellemediert cytotoksisitet (ADCC).

Uttrykket ”hypervariabelregion”, refererer når det blir benyttet her til aminosyrerestene i et antistoff som er ansvarlig for antigenbinding. Hypervariabelregionen omfatter generelt aminosyrerester fra en ”komplementaritetsbestemmende region” eller ”CDR” (for eksempel restene 24-34 (L1), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) i lettkjedevariabeldomene og 31-35 (N1), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i tungkjedevariabeldomenet (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) og/eller restene fra en ”hypervariabel løkke” (for eksempel restene 26-32 (L1), 50-52 (L2) og 91-96 (L3) i lettkjedevariabeldomenet og 26-32 (H1), 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i tungkjedevariabeldomenet, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). ”Rammeverksregionrester” eller ”FR-rester” er de variabeldomenerestene som er forskjellige fra hypervariabelregionrestene som definert her.

Avhengig av aminosyresekvensen til konstantdomenet i deres tungkjeder kan intakte antistoffer bli tilordnet ulike ”klasser”. Det finnes fem hovedklasser av intakte antistoffer: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og flere av disse kan ytterligere bli delt i ”underklasser” (isotyper), for eksempel IgG1 (inkludert ikke-A- og A-allotyper), IgG2, IgG3, IgG4, IgA og IgA2. Tungkjedekonstantdomenet som tilsvarer de ulike klassene av antistoffer blir kalt α, δ, �, γ og μ. Subenhetstrukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene for ulike klasser av immunglobuliner er velkjente.

Lettkjedene til antistoffer fra enhver virveldyrart kan bli tilordnet en av to klart forskjellige typer kalt kappa (g) og lambda (8) basert på aminosyresekvensene til deres konstantdomene.

Uttrykket ”Fc-region” ble benyttet for å definere den C-terminale regionen til en immunglobulin tungkjede som kan bli generert ved hjelp av papainfordøying av et intakt antistoff. Fc-regionen kan være en aktiv sekvens-Fc-region eller en variant-Fc-region. Selv om grensene for Fc-regionen på en immunglobulintungkjede kan variere, så er den humane IgG-tungkjede-Fc-region vanligvis definert å strekke seg fra en aminosyrerest ved omtrent posisjon Cys226, eller fra omtrent posisjon Pro230 til karboksylterminalen i Fc-regionen. Fc-regionen til et immunglobulin omfatter generelt to konstantdomener, et CH2-domene og et CH3-domene, og omfatter eventuelt et CH4-domene. Med ”Fc-regionkjede” her er det ment en av de to polypeptidkjedene på en Fc-region.

”CH2-domenet” for en human IgG-Fc-region (også referert til som ”Cg2”-domene) strekker seg vanligvis fra en aminosyrerest på omtrent posisjon 231 til en aminosyrerest på omtrent posisjon 43. CH2-domenet er unikt ved at det ikke er nært paret med et annet domene. I stedet er to N-bundne forgrenede karbohydratkjeder plassert mellom de to CH2-domenene i et intakt, nativt IgG-molekyl. Det har blitt spekulert på om karbohydratet kan tilveiebringe et substitutt for domene-domene paringen og hjelpe til å stabilisere CH2-domenet. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985). CH2-domenet her kan være et nativsekvens-CH2-domene eller variant-CH2-domene.

”CH3-domenet” omfatter strekningen av residuer C-terminalt i forhold til et CH2-domenet i en Fc-region (dvs. fra en aminosyrerest på omtrent posisjon 341 til en aminosyrerest på omtrent posisjon 447 i en IgG). CH3-regionen her kan være et nativsekvens-CH3-domene eller et variant CH3-domene (for eksempel et CH3-domene med en introdusert ”utstikker” i en kjede derav og et tilsvarende introdusert ”hulrom” i den andre kjeden derav, se US patentskrift nr. 5 821 333. Slike variant-CH3-domener kan bli benyttet til å fremstille multispesifikke (for eksempel bispesifikke) antistoffer som beskrevet her.

”Hengselregionen” er generelt definert å strekke seg fra omtrent Glu216 eller omtrent Cys226 til omtrent Pro230 i human IgG1 (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Hengselregioner i andre IgG-isotyper kan være sammenstilt med IgG1-sekvensen ved å plassere de første og de siste cysteinrestene som danner inter-tungkjede-S-S-bindinger i de samme posisjonene. Hengselregionen her kan være en nativ sekvenshengselregion eller en variant hengselregion. De to polypeptidkjedene i en varianthengselregion opprettholder generelt minst én cysteinrest per polypeptidkjede, slik at de to polypeptidkjedene i varianthengselregionen kan danne en disulfidbinding mellom de to kjedene. Den foretrukne hengselregionen her er en nativ sekvens, human hengselregion, for eksempel en human nativsekvens-IgG-hengselregion.

En ”funksjonell Fc-region” innehar minst én ”effektorfunksjon” fra en nativsekvens-Fc-region. Eksempler på ”effektorfunksjoner” inkluderer C1q-binding, komplementavhengig cytotoksisitet (CDC), Fc-reseptorbinding, antistoffavhengig, cellemediert cytotoksisitet (ADCC), fagocytose, nedregulering av celleoverflatereseptor (for eksempel B-cellereseptor, BCR), osv. Slike effektorfunksjoner krever generelt at Fc-regionen er kombinert med et bindingsdomene (for eksempel et antistoff variabeldomene) og kan bli undersøkt ved å benytte ulike analyser som er kjent på fagområdet for å evaluere slike antistoff effektorfunksjoner.

En ”nativsekvens-Fc-region” omfatter en aminosyresekvens som er identisk med aminosyresekvensen til en Fc-region som blir funnet i naturen.

En ”variant-Fc-region” omfatter en aminosyresekvens som er forskjellig fra den i en nativsekvens-Fc-region i kraft av minst én aminosyremodifikasjon. Fortrinnsvis har variant-Fc-regionen minst én aminosyresubstitusjon sammenlignet med en nativsekvens-Fc-region eller med Fc-regionen i et morpolypeptid, for eksempel fra omtrent en til omtrent 10 aminosyresubstitusjoner, og fortrinnsvis fra omtrent en til omtrent 5 aminosyresubstitusjoner i en nativsekvens-Fc-region eller Fc-regionen i morpolypeptidet. Variant-Fc-regionen her vil typisk inneha for eksempel minst omtrent 80% sekvensidentitet med en nativsekvens-Fcregion og/eller med en Fc-region i et morpolypeptid, eller minst omtrent 90% sekvensidentitet med denne, eller minst omtrent 95% sekvensidentitet eller med identitet med denne.

”Antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet” og ”ADCC” refererer til en cellemediert reaksjon der ikke-spesifikke cytotoksiske celler som uttrykker Fc-reseptorer (FcR) (for eksempel naturlige dreperceller (NK)-celler, nøytrofiler og makrofager) gjenkjenner bundet antistoff på en målcelle og deretter forårsaker lysis av målcellen. De primære cellene for å mediere ADCC, NK-celler, uttrykker kun Fc γRIII, mens monocytter uttrykker Fc γRI, Fc γRII og Fc γRIII. FcR-ekspresjon på hematopoietiske celler oppsummert i Tabell 3 på side 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). For å undersøke ADCC-aktivitet for et molekyl av interesse, kan en in vitro-ADCC-analyse, slik som beskrevet i US patentskrift nr. 5 500 362 eller 5 821 337 bli utført. Nyttige effektorceller for slik analyse inkluderer perifere mononukleære blodceller (PBMC) og naturlige dreperceller (NK).

Alternativt, eller i tillegg kan ADCC-aktivitet for molekylet av interesse bli undersøkt in vivo, for eksempel i en dyremodell slik som den som er tilkjennegjort i Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

”Humane effektorceller” er leukocytter som uttrykker en eller flere FcRer og utfører effektorfunksjoner. Typisk uttrykker cellene minst Fc γRIII og utfører ADCC-effektorfunksjon. Eksempler på humane leukocytter som medierer ADCC inkluderer perifere mononukleære blodceller (PBMC), naturlige dreperceller (NK), monocytter, cytotoksiske T-celler og nøytrofiler, der PBMCer og NK-celler generelt er foretrukket. Effektorcellene kan bli isolert fra en nativ kilde derav, for eksempel fra blod eller PBMC som beskrevet her.

Uttrykkene ”Fc-reseptor” og ”FcR” blir benyttet for å beskrive en reseptor som binder til Fc-regionen i et antistoff. Den foretrukne FcR er en human, nativsekvens-FcR. Videre er en foretrukket FcR en som binder et IgG-antistoff (en gammareseptor) og inkluderer reseptorer av underklassene Fc γRI, Fc γRII og Fc γRIII, inkludert allelvarianter og alternativt spleisede former av disse reseptorene. Fc γRII-reseptorer inkluderer Fc γRIIA (en ”aktiverende reseptor”) og Fc γRIIB (en ”inhiberende reseptor”), som har tilsvarende aminosyresekvenser som primært er forskjellig i de cytoplasmiske domenene derav.

Aktiverende reseptor Fc γRIIA inneholder et immunreseptortyrosinbasert aktiveringsmotiv (ITAM) på sitt cytoplasmiske domene. Inhiberende reseptor Fc γRIIB inneholder et immunreseptor tyrosinbasert inhiberingsmotiv (ITIM) på sitt cytoplasmiske domene (gjennomgått i Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRer er gjennomgått i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991), Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) og de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-451 (1995). Andre FcRer, inkludert de som kommer til å bli identifisert i fremtiden, er omfattet av uttrykket ”FcR” her. Uttrykket inkluderer også den neonatale reseptoren, FcRn, som er ansvarlig for overføringen av IgGer fra mor til fosteret (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976), og Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

”Komplementavhengig cytotoksisitet” og ”CDC” refererer til lyseringen av et mål i nærvær av komplement. Komplement aktiveringsveien blir startet ved bindingen av den første komponenten i komplementsystemet (C1q) til et molekyl (for eksempel et antistoff) i kompleks med et tidligere antigen. For å undersøke komplementaktivering kan en CDCanalyse, for eksempel som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996) bli utført.

Uttrykket ”immunadhesin” refererer til antistofflignende molekyler som kombinerer bindingsspesifisiteten til et heterologt protein (et ”adhesin”) med effektorfunksjonene til immunglobulinkonstantdomener.

Strukturelt omfatter immunadhesinene en fusjon av en aminosyresekvens med den ønskede bindingsspesifisiteten som er forskjellig fra antigengjenkjenningen og bindingssetet på et antistoff (dvs. er ”heterologt”) og en immunglobulin konstantdomenesekvens.

Adhesindelen av et immunadhesinmolekyl er typisk en kontinuerlig aminosyresekvens som omfatter minst bindingssetet fra en reseptor eller en ligand. Immunglobulinkonstantdomenesekvensen i immunadhesinet kan være fremskaffet fra et hvilket som helst immunglobulin slik som undertypene IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4, IgA (inkludert IgA1 og IgA2), IgE, IgD eller IgM.

”Aktiv” eller ”aktivitet” for formålene her refererer til former av ANGPTL4 som opprettholder en biologisk og/eller en immunologisk aktivitet for nativt eller naturlig forekommende ANGPTL, der ”biologisk” aktivitet refererer til en biologisk funksjon (enten inhibitorisk eller stimulatorisk) som er forårsaket av en nativ eller naturlig forekommende ANGPTL4 som er forskjellig fra evnen til å indusere produksjon av et antistoff mot en antigenepitop innehatt av en nativ eller naturlig ANGPTL4 og en ”immunologisk” aktivitet refererer evnen til å indusere produksjonen av et antistoff mot en antigen epitop som er innehatt av en naturlig forekommende eller nativ ANGPTL4.

Et ”affinitetsmodnet” antistoff er et med en eller flere endringer i en eller flere CDRer derav som fører til en forbedring i affiniteten for antistoffet for antigen sammenlignet med et morantistoff som ikke innehar disse endringene. Foretrukne, affinitetsmodnede antistoffer vil ha nanomolare eller til og med pikomolare affiniteter for målantigenet.

Affinitetsmodnende antistoffer er fremstilt ved hjelp av prosedyrer som er kjent på fagområdet. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) beskriver affinitetsmodning ved hjelp av VH- og VL-domeneombytting. Tilfeldig mutagenese av CDR og/eller rammeverksrester er beskrevet av Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3809-3813 (1994), Shier et al., Gene 169:147-155 (1995), Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004 (1995), Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995) og Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Et ”funksjonelt antigenbindende sete” for et antistoff er et som er i stand til å binde et målantigen. Antigenbindingsaffiniteten for det antigenbindende setet er ikke nødvendigvis like sterkt som morantistoffet fra hvilket antigenbindingssetet er avledet, men evnen til å binde antigen må være målbar ved å benytte enhver av en mengde fremgangsmåter som er kjent for å evaluere antistoffbinding til et antigen. Videre trenger ikke den antigenbindende affiniteten for hvert av de antigenbindende setene i et multivalent antistoff her å være kvantitativt de samme. For de multimere antistoffene her, kan antallet funksjonelle antigenbindende seter bli evaluert ved å benytte ultrasentrifugeringsanalyse. Ifølge denne fremgangsmåten for analyse blir ulike forhold av målantigen i forhold til multimert antistoff kombinert og den gjennomsnittlige molekylvekten for kompleksene ble beregnet ved å anta ulike antall funksjonelle bindingsseter. Disse teoretiske verdiene ble sammenlignet med de faktiske, eksperimentelle verdiene som er fremskaffet for å evaluere antallet funksjonelle bindingsseter.

Et antistoff som har et ”biologisk kjennetegn” fra et designet antistoff er et som innehar et eller flere biologiske kjennetegnene for dette antistoffet som skiller seg fra andre antistoffer som binder til det samme antigenet. For å kunne screene for antistoffer som binder til en epitop på et antigen bundet av et antistoff av interesse, kan en rutinemessig kryssblokkeringsanalhyse slik som den som er beskrevet i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988) bli utført.

En ”polypeptidkjede” er et polypeptid der hvert av domenene derav er bundet til andre domener ved hjelp av peptidbindinger, i motsetning til ikke-kovalente interaksjoner eller disulfidbindinger.

En ”fleksibel linker” her refererer til et peptid som omfatter to eller flere aminosyrerester bundet sammen med peptidbindinger, og tilveiebringer mer roteringsmessig frihet for to polypeptider (slik som to Fd-regioner) bundet derved. Slik rotasjonsfrihet tillater to eller flere antigenbindende seter som er bundet med den fleksible linkeren og hver komme i kontakt med målantigenet/antigenene mer effektivt. Eksempler på passende fleksible linkerpeptidsekvenser inkluderer gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser og gly-gly-gly-ser.

Et ”dimeriseringsdomene” er dannet ved assosieringen av minst to aminosyrerester (generelt cysteinrester) eller av minst to peptider eller polypeptider (som kan ha de samme, eller forskjellige aminosyresekvenser). Peptidene eller polypeptidene kan interagere med hverandre via kovalente og/eller ikke-kovalente assosiasjoner. Eksempler på dimeriseringsdomener her inkluderer en Fc-region, en hengselregion, et CH3-domene, et CH4-domene, et CH1-CL-par, en ”grenseflate” med en fremstilt ”knapp” og/eller ”fremstikker” som beskrevet i US patentskrift 5 821 333, i en leucinzipper (for eksempel en jun/fos-leucinzipper, se Kostelney et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992), eller en gjær-GCN4-leucinzipper) en isoleucinzipper, et reseptordimerpar (for eksempel interleukin-8-reseptor (IL-8R) og integrinheterodimerer slik som LFA-1 og GPIIIb/IIIa), eller dimeriseringsregionen/regionene derav, dimere ligandpolypeptider (for eksempel nervevekstfaktor (NGF), neurotrofin-3 (NT-3), interleukin-8 (IL-8), vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), VEGF-C, VEGF-D, PDGF-medlemmer og hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF), se Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994) og Radziejewski et al., Biochem 32(48): 1350 (1993)) eller dimeriseringsregionen/regionene derav, et par med cysteinrester som er i stand til å danne en disulfidbinding, et par med peptider eller polypeptider der hver omfatter minst én cysteinrest (for eksempel fra omtrent en, to eller tre til omtrent i cysteinrester) slik at disulfidbindingen kan dannes mellom peptidene eller polypeptidene (heretter ”en syntetisk hengsel”) og antistoffvariabeldomene. Det mest foretrukne dimeriseringsdomenet her en Fc-region eller en hengselregion.

Uttrykket ”stimulerende proliferering av en celle” omfatter trinnet med å øke omfanget av vekst og/eller reproduksjon for cellen relativt i forhold til en ubehandlet celle eller en redusert behandlet celle enten in vitro eller in vivo. En økning i celleproliferasjon i cellekultur kan bli påvist ved å telle antallet celler før og etter eksponering og for et molekyl av interesse. Omfanget av proliferasjon kan bli kvantifisert via mikroskopundersøkelse av graden av konfluens. Celleproliferasjon kan også bli kvantifisert ved å benytte analyser som er kjent på fagområdet, for eksempel tymidininkorporeringsanalyse og kommersielt tilgjengelig analyse. Uttrykket ”inhibere proliferasjon for en celle” omfatter trinnet med må minske omfanget av vekst og/eller reproduksjon for cellen relativt i forhold til en ubehandlet celle eller en redusert behandlet celle enten in vitro eller in vivo. Den kan bli kvantifisert som beskrevet ovenfor. Administrering ”i kombinasjon med” et eller flere ytterligere terapeutiske midler inkluderer samtidig og/eller påfølgende administrering i enhver rekkefølge.

”Individ” refererer for formål ved behandling til et hvilket som helst dyr. Generelt er dyret et pattedyr. ”Pattedyr” for formål ved behandling refererer til et hvilket som helst dyr som er klassifisert som et pattedyr, inkludert mennesker, husdyr og gårdsdyr og dyrehage dyr, sportsdyr og kjæledyr, slik som hunder, hester, katter, kuer, sauer, griser osv. Typisk er pattedyret et menneske.

Uttrykket ”lindrer” eller ”lindring” blir her benyttet for å referere til en minskning, reduksjon eller eliminasjon av en tilstand, sykdom, forstyrrelse eller fenotype, inkludert en unormalhet eller symptom. En ”forstyrrelse” er enhver tilstand som vil dra nytte av behandling med et molekyl ifølge oppfinnelsen. Dette inkluderer kroniske og akutte forstyrrelser eller sykdommer inkludert de patologiske tilstandene som predisponerer individet og får forstyrrelsene det er snakk om.

Uttrykket ”effektiv mengde” eller ”terapeutisk effektiv mengde” refererer til en mengde av et legeme som er effektiv til å behandle en sykdom eller forstyrrelse hos et individ.

”Behandling” refererer til både terapeutisk behandling og profylaktiske eller preventive innsatser. De som har behov for behandling inkluderer de som allerede har forstyrrelsene i tillegg til de der sykdommen skal bli forebygget.

”Hypertrofi” slik det blir benyttet her, er definert som en økning i massen til et organ eller struktur uavhengig av naturlig vekst som ikke involverer tumordannelse. Hypertrofi i et organ eller i et vev skyldes enten en økning i massen av de individuelle cellene (sann hypertrofi) eller en økning i antallet celler som utgjør vevet (hyperplasi) eller begge. For eksempel er hypertrofisk vekst av adipocytter en økning i størrelse for adipocytt som er stimulert ved lipid akkumulering. Hyperplastisk vekst for adipocytter er en økning i antallet adipocytter i fettvev.

Uttrykkene ”kardiovaskulær og endotel forstyrrelse”, ”kardiovaskulær og endotel dysfunksjon” og ”kardiovaskulær, endotel eller angiogen forstyrrelse” blir benyttet om hverandre og refererer til forstyrrelser, typisk systemiske, som stimulerer angiogenese og/eller kardiovaskularisering. Dette inkluderer sykdommer som rammer kar, i tillegg til sykdommer i karene selv, slik som arteriene, kapillærene, venene og/eller lymfene. Slike forstyrrelser inkluderer for eksempel arteriesykdommer slik som aterosklerose, diabetes mellitus, hypertensjon, inflammatorisk vaskulitt, Reynauds sykdom og Reynauds fenomen, aneurisme og arteriell restenose, venøs og lymfatiske forstyrrelser slik som tromboflebitt, lymfangitt og lymfødem, kreft slik som vaskulære tumorer, for eksempel hemangiom (kapillært og kavernøst), glomustumorer, teleangiektasi, bacillær angiomatose, hemangioendoteliom, angiosarkom, hemantiopericytom, Kaposis sarkom, lymfangiom og lymfangiosarkom, tumor angiogenese og andre vaskulære forstyrrelser slik som perifer vaskulær sykdom, traume slik som sår, forbrenningen og andre skadde vev, implantatfiksering, sårdannelse, iskemi reperfusjonsskade, reumatoid artritt, cerebrovaskulær sykdom, nyresykdommer slik som akutt nyresvikt, slag, koronar arteriesykdom, hyperkolesterolemi, hypertriglyseridemi og/eller osteoporose. Dette vil også inkludere angina, hjerteinfarkt slik som akutt hjerteinfarkt, hjerte hypertrofi og hjertesvikt slik som kongestiv hjertesvikt (CHF). Kardiovaskulære sykdommer som er assosiert med dyslipidemi er også inkludert, for eksempel til hypertensjon, aterosklerose, hjertesvikt, slag, ulike koronar arteriesykdommer, overvekt, diabetes osv.

Uttrykket en ”lipid homeostaseforstyrrelse” inkluderer en forstyrrelse, sykdom eller tilstand som er assosiert med, forårsaket av og/eller bundet til unormal regulering (for eksempel oppregulering eller nedregulering) av lipid metabolisme. Lipid homeostaseforstyrrelser kan være forårsaket av eller assosiert med feilaktig lipolyse, feilaktig lipidopptak, feilaktig lipidsyntese og/eller utskilling, feilaktig intracellulær lipidfrigjøring og/eller omsetning, feilaktig intracellulær triglyseridfrigjøring og/eller omsetning, feilaktig intracellulær lipidmasse og/eller triglyseridmasse, og/eller feilaktig utskilt lipidmasse og/eller triglyseridmasse innenfor eller fra en celle, for eksempel en levercelle. Lipid homeostaseforstyrrelser inkluderer aterosklerose, fedme, tilstander som er relatert til fedme, diabetes, insulinresistens, hyperlipidemi, hypolipidemi, dyslipidemi, hyperkolesterolemi, hypokolesterolemi, triglyseridlagringssykdom, kardiovaskulær sykdom, koronar arteriesykdom, hypertensjon, slag, overvekt, anoreksi, kakeksi, hyperlipoproteinemi, hypolipoproteinemi, Niemann Pick sykdom, hypertriglyseridemi, hypotriglyseridemi, pankreatitt, diffus idiopatisk skjeletthyperostose (DISH), aterogen lipoproteinfenotype (ALP), epilepsi, leversykdom, fettlever, steatohepatitt, polysystisk ovariesyndrom, kreft osv. Uttrykket ”lipidmetabolsk forstyrrelse” refererer til unormale kliniske kjemiske nivåer av kolesterol og triglyserider. Uttrykker ”hyperlipidemi” eller ”hyperlipemi” refererer til en tilstand der det er høyere nivåer enn normalt av serumlipidnivåer. Serumlipider inkluderer kolesterol (ester og fritt), lipoproteiner, triglyserider, frie fettsyrer og andre steroler. I ett aspekt er forhøyede nivåer av disse lipidene en indikasjon på aterosklerose.

Uttrykket ”fedme” refererer til en tilstand hvorved et pattedyr har en Body Mass Indeks (BMI) som er beregnet som vekt (kg) per høyde<2>(m<2>) på minst 25,9. Den har personer med normal vekt en BMI på 19,9 til mindre enn 25,9. Fedme her kan skyldes hva som helst, uansett om det er en genetisk eller miljømessig årsak. Eksempler på forstyrrelser som kan føre til fedme eller bli forårsaket av fedme inkluderer for eksempel overspising og bulimi, polycystisk ovariesykdom, kraniofaryngiom, Prader-Willi-syndrom, Frohlich syndrom, Type-II-diabetes, GH-manglende individer, normalvariant kort høyde, Turners syndrom og andre patologiske tilstander som viser redusert metabolsk aktivitet eller en minskning i hvilende energiomsetning som en prosentandel av total fettfri masse, for eksempel barn med akutt lymfoblastisk leukemi. En ”fedmebestemmende egenskap” inkluderer fettceller og vev, slik som fettputer, total kroppsvekt, triglyseridnivåer i muskel, lever og fett og fastende og ikke-fastende nivåer av leptin, frie fettsyrer og triglyserider i blodet.

Uttrykket ”tilstander som er relatert til fedme” refererer til tilstander som skyldes eller som er forverret av fedme, slik som dermatologiske forstyrrelser slik som infeksjoner, varikøse vener, Acanthosis nigricans og eksem, treningsintoleranse, diabetes mellitus, insulinresistens, hypertensjon, hyperkolesterolemi, kolelitiasis, osteoartritt, ortopedisk skade, tromboembolisk sykdom, kreft (for eksempel brystkreft, kolonkreft, prostatakreft osv.) og koronar (for eksempel kardiovaskulær) hjertesykdom, spesielt de kardiovaskulære tilstander som er assosiert med høye triglyserider og frie fettsyrer i et individ.

Fedme er den mest forekommende av kroppsvektforstyrrelsene, og rammer omtrent 30 til 50% av den middelaldrende populasjonen i den vestlige verden. Andre kroppsvektsforstyrrelser, slik som anoreksia nervosa og bulimia nervosa, som til sammen rammer rundt 0,2% a den kvinnelige populasjonen i den vestlige verden, står også for alvorlige helsetrusler. Slike forstyrrelser som anoreksi og kakeksi (tæring) er videre også fremmerkende egen skaper ved andre slik sykdommer slik som kreft, cystisk fibrose og AIDS.

Uttrykket ”tæringsforstyrrelser” (for eksempel tæringssyndrom, kakeksi, sarkopeni) refererer til en forstyrrelse som er forårsaket av et uønsket og/eller uhelsemessig tap av vekt eller tap av kroppscellemasse. Hos de eldre i tillegg til hos AIDS- og kreftpasienter kan tæringssykdom føre til uønsket tap av kroppsvekt, inkludert både de fettholdige og de fettfrie områdene. Tæringssykdommer kan være resultatet av for dårlig inntak av mat og/eller metabolske endringer som er relatert til sykdom og/eller aldringsprosesser.

Kreftpasienter og AIDS-pasienter, i tillegg til pasienter etter omfattende kirurgi eller som har kroniske infeksjoner, immunologiske sykdommer, hypertyroidisme, ekstraintestinal Crohns sykdom, psykogen sykdom, kronisk hjertesvikt eller annet alvorlig traume, lider ofte av tæringssykdom som noen ganger også blir referert til som kakeksi, som noen ganger er en metabolsk forstyrrelse og noen ganger en spiseforstyrrelse. Kakeksi er ytterligere karakterisert ved hypermetabolisme og hyperkatabolisme. Selv om kakeksi og tæringssykdom ofte blir benyttet om hverandre for å referere til tæringstilstander, så foreligger det minst én mengde med forskning som skiller kakeksi fra tæringssyndrom som et tap av fettfri masse, og spesielt kroppscellemasse (Mayer, 1999, J. Nutr. 129(1S Suppl.):256S-259S). Sarkopeni, som er nok en annen slik forstyrrelse som kan ramme de aldrende individer, er typer karakterisert ved tap av muskelmasse.

Sluttstadiumtæringssykdom som beskrevet ovenfor kan utvikles hos individer som lider fra enten kakeksi eller sarkopeni.

Diabetes er en kronisk forstyrrelse som rammer karbohydrat-, fett- og proteinmetabolisme hos dyr. Diabetes er den ledende årsaken til blindhet, nyresvikt og amputasjoner av nedre lemmer hos voksne og er en hovedrisikofaktor for kardiovaskulær sykdom og slag.

Type-I-diabetes mellitus (eller insulinavhengig diabetes mellitus (”IDDM”) eller diabetes som fremkommer hos barn) omfatter omtrent 10% av elle diabetestilfeller.

Sykdommen er karakterisert ved et progressivt tap av insulinutskillingsfunksjon fra betaceller i pankreas. Dette kjennetegnet er også delt av ikke-idiopatisk eller ”sekundært” diabetes som har sitt opphav i pankreassykdom. Type-I-diabetes mellitus er assosiert med de følgende kliniske symptomer, for eksempel vedvarende, forhøyet plasmaglukose konsentrasjon eller hyperglykemi, polyuri, polydipsi og/eller hyperfagi, kronisk mikrovaskulære komplikasjoner slik som retinopati, nevropati og neuropati, og makrovaskulære komplikasjoner slik som hyperlipidemi og hypertensjon som kan føre til blindhet, endestadiumnyresykdom, lem-amptuasjon og hjerteinfarkt.

Type-II-diabetes mellitus (ikke-insulinavhengig diabetes mellitus eller NIDDM) er en metabolsk forstyrrelse som involverer feilreguleringen av glukosemetabolisme og ødelagt insulinsensitivitet. Type-II-diabetes mellitus utvikles vanligvis i voksenlivet og er assosiert med kroppens manglende evne til å benytte og fremstille tilstrekkelig insulin. I tillegg til insulinresistensen som er observert i målvevene så har pasienter som lider av Type-II-diabetes mellitus en relativ insulinmangel, dvs. at pasienter har lavere enn foreventede insulinnivåer for en gitt plasmaglukosekonsentrasjon. Type-II-diabetes mellitus er karakterisert ved de følgende kliniske tegn eller symptomer, for eksempel vedvarende forhøyede plasmaglukosekonsentrasjoner eller hyperglykemi, polyuri, polydipsi og/eller hyperfagi, kroniske mikrovaskulære komplikasjoner slik som retinopati, nevropati og neuropati, og makrovaskulære komplikasjoner slik som hyperlipidemi og hypertensjon som kan føre til blindhet, endestadiumnyresykdom, lem-amputasjon og hjerteinfarkt.

Syndrom-X, også betegnet insulinresistenssyndrom (IRS), metabolsk syndrom eller metabolsk syndrom-X, blir gjenkjent i ca. 2% av diagnostiske koronare kateriseringer. Den er ofte invalidiserende og viser symptomer eller risikofaktor for utviklingen av Type-II-diabetes mellitus og kardiovaskulær sykdom, inkludert for eksempel forstyrret glukosetoleranse (IGT), forstyrret fastende glukose (IFG), hyperinsulinemi, insulinresistens, dyslipidemi (for eksempel høytriglyserider, lav HDL), hypertensjon og fedme.

En immunologisk forstyrrelse inkluderer for eksempel systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, juvenil kronisk artritt, spondyloartropatier, systemisk sklerose (skleroderma), idiopatiske inflammatoriske myopatier (dermatomyositt, polymyositt), Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolyttisk anemi (immun pancytopeni, paroksysomal nokturn hemoglobinuri), autoimmun trombocytopeni (idiopatisk trombocytopenia purpura, immunmediert trombocytopeni), tyroiditt (Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, juvenil lymfocytt-tyroiditt, atrofisk tyroiditt), diabetes mellitus, immunmediert nyresykdom (glomerulonefritt, tubulointerstitial nefritt), demyelinerende sykdommer i sentralnervesystemet og det perifere nervesystemet slik som multiple sklerose, idiopatisk demyelinerende polyneuropati eller Guillain-Barré syndrom og kronisk inflammatorisk demyelinerende polyneuropati, hepatobilliære sykdommer slik som smittsom hepatitt (hepatitt A, B, C, D, E og andre ikke-hepatotrofiske virus), autoimmun kronisk aktiv hepatitt, primær billiær cirrhose, granulomatøs hepatitt og skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom (ulcerøs kolitt, Crohns sykdom), glutensensitiv enteropati og Whipple sykdom, autoimmune eller immunmedierte hudsykdommer inkludert bulløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt, psoriasis, allergiske sykdommer slik som astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, mathypersensitivitet og urtikaria, immunologiske sykdommer i lungen slik som eosinofile lungebetennelser, idiopatisk pulmonær fibrose og hypersensitivitetslungebetennelse og/eller transplantasjonsassosierte sykdommer inkludert transplantatfrastøtning og transplantat-versus-vertsykdom. Andre forstyrrelser kan foreligge, slik som en utviklende forstyrrelse (for eksempel embryonal dødelighet), en neurologisk forstyrrelse (for eksempel en minsket angstlignende respons i løpet av åpen-felt aktivitetstesting, en unormal døgnrytme i løpet av hjemmeaktivitetstesting) en øyeunormalhet (for eksempel retina unormalhet) og/eller en benmetabolsk unormalhet eller forstyrrelse (for eksempel artritt, osteoporose og/eller osteopetrose).

Uttrykket ”merke” refererer når det blir benyttet her til en påvisbar forbindelse eller preparat som er konjugert direkte eller indirekte til polypeptidet. Merket kan selv være påvisbart (for eksempel radioisotopmerker eller fluorescensmerker) eller kan i tilfellet med et enzymatisk merke katalysere kjemisk endring for en substratforbindelse eller preparat som er påvisbart.

Et ”isolert” nukleinsyremolekyl er et nukleinsyremolekyl som er identifisert og separert fra minst ett kontaminerende nukleinsyremolekyl som det ordinært er assosiert med i den naturlige kilden for polypeptidnukleinsyren. Et isolert nukleinsyremolekyl er forskjellig fra formen eller settingen det blir funnet i naturen. Isolerte nukleinsyremolekyler er derfor forskjellig fra nukleinsyremolekylet slik det eksisterer i naturlige celler. Likevel inkluderer et isolert nukleinsyremolekyl et nukleinsyremolekyl som er inneholdt i celler som ordinært uttrykker polypeptidet der for eksempel nukleinsyremolekylet er på en kromosomal lokalisering som er forskjellig fra den i naturlige celler.

Uttrykket ”kontrollsekvenser” refererer til DNA-sekvenser som er nødvendig for ekspresjonen av en opererbart bundet konsekvens i en spesiell vertsorganisme.

Kontrollsekvensene som er passende i prokaryoter inkluderer for eksempel en promotor, eventuelt en operatorsekvens og et ribosombindingssete. Eukaryote celler er kjent for å benytte promotorer, polyadenyleringssignaler og enhancere.

En nukleinsyre er ”opererbart bundet” når den er plassert i et funksjonelt forhold til en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA som en forsekvens eller sekretorisk leder opererbart bundet til DNA for et polypeptid hvis det blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjonen av polypeptidet, en promotor eller enhancer opererbart bundet til en kodende sekvens hvis den påvirker transkripsjon av sekvensen, eller et ribozombindingssete er opererbart bundet til en kodende sekvens hvis den er posisjonert slik at den fremmer translasjon. Generelt betyr ”opererbart bundet” at DNA-sekvensene som blir bundet er kontinuerlige, og i tilfellet med en sekretorisk leder er de kontinuerlige og i leseramme. Enhancere trenger likevel ikke å være kontinuerlige. Binding blir utført ved ligering på hensiktsmessige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer, blir de syntetiske oligonukleotid adaptorene eller linkerne benyttet i overensstemmelse med konvensjonell praksis.

Som benyttet her blir uttrykkene ”celle”, ”cellelinje” og ”cellekultur” benyttet om hverandre og alle slike betegnelser inkluderer etterkommere. Slik inkluderer ordene ”transformanter” og ”transformerte celler” den primære individcellen og kulturer som er avledet fra denne uten hensyn til antallet overføringer. Det er også forstått slik at alle etterkommere ikke trenger å være helt identiske når det gjelder DNA-innhold, noe som skyldes hensiktsmessig eller uhensiktsmessige mutasjoner. Mutante etterkommere som har den samme funksjonen eller biologisk aktivitet som screenet for den opprinnelige, transformerte cellen er inkludert. Der bestemte betegnelser er ment vil det være klart fra konteksten.

Uttrykket ”gen” refererer til (a) et gen som inneholder en DNA-sekvens som koder for ANGPTL4, for eksempel ATCC deponeringsnr. 209284, eller se Figur 1, (b) hver DNA-sekvens som koder for en ANGPTL4-aminosyresekvens (se for eksempel Fig. 2) og/eller (c) enhver DNA-sekvens som hybridiserer med komplementet av de kodende sekvensene som er tilkjennegjort her. I visse utførelsesformer inkluderer uttrykket kodende i tillegg til ikkekodende regioner og inkluderer fortrinnsvis alle sekvenser som er nødvendig for normal genekspresjon. Visse utførelsesformer inkluderer uttrykket kodende i tillegg til ikkekodende regioner og inkluderer fortrinnsvis alle sekvenser som er nødvendig for normal genekspresjon.

Uttrykket ”genstyring” refererer til en type homolog rekombinasjon som foregår når et fragment av genomisk DNA blir introdusert inn i en pattedyrcelle og dette fragmentet lokaliseres og rekombineres med endogene, homologe sekvenser. Genstyring ved homolog rekombinasjon benytter rekombinante-DNA-teknologier for å erstatte spesifikke, genomiske sekvenser med eksogen DNA av spesiell design.

Uttrykket ”homolog rekombinasjon” refererer til utbyttingen av DNA-fragmentet mellom to DNA-fragmenter mellom to DNA-molekyler eller kromatider på stedet med homologe nukleotidsekvenser.

Uttrykket ”målgen” (alternativt referert til som ”målgensekvens” eller ”mål-DNA-sekvens”) refererer til et hvilket som helst nukleinsyremolekyl, polynukleotid eller gen som skal bli modifisert ved homolog rekombinasjon. Målsekvensen inkluderer et intakt gen, et ekson eller intron, en regulatorisk sekvens eller enhver region mellom gener. Målgenet kan omfatte en del av et spesielt gen eller genetisk lokus i individets genomiske DNA.

”Ødeleggelse” av et ANGPTL4-gen foregår når et fragment med genomisk DNA lokaliseres og rekombineres med en endogen, homolog sekvens der ødeleggelsen er en delesjon av det native genet eller en del derav, eller en mutasjon i det native genet eller der ødeleggelsen er den funksjonelle inaktiveringen av det native genet. Alternativt kan sekvensødeleggelser bli generert ved hjelp av ikke-spesifikk insersjonsinaktivering ved å benytte en genfellevektor (dvs. ikke-humant transgent dyr som inneholder og uttrykker et tilfeldig innsatt transgen, se for eksempel US patentskrift nr. 6 436 707, meddelt 20. august 2002). Disse sekvensødeleggelsene eller modifiseringene kan inkludere insersjon, missens, rammeskift, delesjon eller substitusjon eller erstatninger av DNA-sekvens, eller enhver kombinasjon derav. Insersjon inkluderer insersjonen av hele gener, som kan være av planteopphav, dyreopphav, soppopphav, innsektopphav, prokaryot opphav eller virusopphav. Ødeleggelse kan for eksempel endre det normale genproduktet ved å inhibere dets produksjon delvis eller fullstendig eller ved å forsterke det normale genproduktets aktivitet. I én utførelsesform er ødeleggelsen en nullødeleggelse, der det ikke er noen vesentlig ekspresjon av ANGPTL4-genet.

Uttrykket ”nativ ekspresjon” refererer til ekspresjonen av fullengde polypeptidet som er kodet for av ANGPTL4-genet ved ekspresjonsnivåer som er tilstede i villtype musen. Slik refererer en ødeleggelse der ”det ikke er noen nativ ekspresjon” av det endogene ANGPTL4-genet til en delvis eller fullstendig reduksjon av ekspresjonen av minst én del av et polypeptid som er kodet for av et endogen ANGPTL4-gen fra en enkelt celle, valgte celler eller alle cellene i et pattedyr.

Uttrykket ”knockout” refererer til ødeleggelsen av et ANGPTL4-gen, der ødeleggelsen fører til: den funksjonelle inaktiveringen av det native genet, delesjon av det native genet eller en del derav, eller en mutasjon i det native genet.

Uttrykket ”knock-in” refererer til erstatningen av museortologen (eller annet musegen) med et humant cDNA som koder for ANGPTL4-kodende gener eller varianter derav (dvs. ødeleggelsen fører til en erstatning av et nativt musegen med et nativt humant gen).

Uttrykket ”konstruksjon” refererer til et kunstig sammensatt DNA-segment som skal bli overført inn i et målvev, cellelinje eller dyr. Typisk vil konstruksjonene inkludere et gen eller en nukleinsyresekvens av spesiell interesse, et markørgen og passende kontrollsekvenser. Som tilveiebrakt her inkluderer en målsøkende ANGPTL4-konstruksjon en DNA-sekvens som er homolog med minst én del av ANGPTL4-genet som er i stand til å produsere en ødeleggelse i et ANGPTL4-gen i en vertscelle.

Uttrykket ”transgen celle” refererer til en celle som i sitt genom inneholder et ANGPTL4-gen som har blitt ødelagt, modifisert, endret eller erstattet fullstendig eller delvis ved hjelp av fremgangsmåten for genstyring.

Uttrykket ”transgent dyr” refererer til et dyr som inneholder i sitt genom et spesifikt gen som har blitt ødelagt eller på annen måte modifisert eller mutert ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet her eller fremgangsmåter som ellers er velkjente på fagområdet. I visse utførelsesformer er det ikke-humane, transgene dyret et pattedyr. I én utførelsesform er pattedyret en gnager slik som rotte eller mus. I tillegg kan et ”transgent dyr” være et heterozygot dyr (dvs. et ødelagt allel og et villtype allel) eller et homozygot dyr (eller to ødelagte alleler). Et embryo er ansett å falle innenfor definisjonen av et dyr. Fremskaffelsen av et dyr inkluderer fremskaffelsen av et embryo eller foster in utero, uansett om dette skjer ved paring eller ikke, og uansett om embryoet går til spille eller ikke.

Som benyttet her refererer uttrykkene ”selektiv markør” og ”posisjonsseleksjonsmarkør” til et gen som koder for et produkt som kun gjør cellene i stand til å bære genet for å overleve og/eller vokse ved visse betingelser. For eksempel er planteceller og dyreceller som uttrykker det introduserte neomycinresistensgenet (Neo<r>) resistente ovenfor forbindelsen G418. Celler som ikke bærer Neo<r>-genmarkøren blir drept av G418. Andre positive seleksjonsmarkører er kjent for, eller er mulig å få tak i, av fagfolk på området.

Uttrykket ”modulerer” eller ”modulering” slik det blir benyttet her refererer til en minskning, inhibering, reduksjon, lindring, økning eller forsterkning av en ANGPTL4-genfunksjon, -ekspresjon, -aktivitet eller alternativt en fenotype assosiert med ANGPTL4-gen.

Uttrykket ”unormalhet” refererer til enhver sykdom, forstyrrelse, tilstand eller fenotype der ANGPTL4 er implisert, inkludert patologiske tilstander og adferdsobservasjoner.

ANGPTL4

Oppfinnelsen er et resultat av ønske om ytterligere å utlede den biologiske funksjon til ANGPTL4 og dens rolle i sykdomstilstander. ANGPTL4-ekspresjon er primært funnet i placenta, fettvev, levervev og nyrevev. Denne oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere anvendelser av ANGPTL4 og modulatorer av ANGPTL4 i områder med hepatocytter, adipocytter og lipidhomeostase. Oppfinnelsen beskriver også transgene mus eller knockoutmus som inneholder en ødeleggelse i ANGPTL4-genet, og anvendelse derav.

Angiopoietin-lignende-4-protein (ANGPTL4) er et utskilt protein som er et medlem av angiopoietinfamilien. Det er også kjent som hepatisk fibrinogen/angiopoietinbeslektet protein (HFARP) (Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000)), PGAR (PPAR γangiopoietinbeslektet protein) (Yoon et al., Mol. Cell. Biol., 20:5343-5349 (2000)), fast indusert fettfaktor (FIAF) (Kerten et al., J. Biol. Chem., 275:28488-28493 (2000)), angiopoietinbeslektet protein (ARP-4), NL2 (se US patentskrift nr. 6 348 350, 6 372 491 og 6 455 496) og Ang6.

ANGPTL4-proteinet fra mennesker er et protein på 406 aminosyrer (for eksempel US patentskrift nr. 6 348 350, 6 372 491 og 6 455 496), mens ANGPTL4 fra mus er et protein på 410 aminosyrer (Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000)). Utgaven fra mus og mennesker deler omtrent 75% identitet på aminosyrenivå. Kim et al., Biochem. J.

346:603-610 (2000). ANGPTL4 har et signalpeptid, tre potensielle N-glykosyleringsseter og fire cysteiner som kan være involvert i intramolekylær disulfidbinding. ANGPTL4 danner høyere molekylære strukturer, for eksempel som indikert i Figur 3, panel A. Se for eksempel også Ge et al., J. Biol. Chem., 279(3):2038-2045 (2004), G et al., J. Lipid Res. 45:2071-2079 (2004) og Mandard et al., J. of Biol. Chem., 279(33):34411-34420 (2004). ANGPTL4 kan også være proteolytisk prosessert, for eksempel fører substitusjonen av R162G og R164E i ANGPTL4 til varianten ANGPTL4 som kjører ved en høyere molekylærvekt på en SDS-gel enn villtype proteinet (se Figur 3, panel B). Se også for eksempel Ge et al., J. Biol. Chem., 279(3):2038-2045 (2004) og Mandard et al., J. of Biol. Chem., 279(33):3441-34420 (2004).

Konserverte regioner i angiopoietinfamilien inkluderer et oppkveilet kveiledomene og et C-terminalt fibrinogen (FBN)-lignende domene. Se for eksempel Kim et al., Biochem. J.

346:603-610 (2000). Det er foreslått at ANGPTL4 er proteolytisk prosessert på en regulert måte for å frigjøre det C-terminale fibrinogenlignende domenet. Se for eksempel Ge et al., J. Biol. Chem., 279(3):2038-2045 (2004).

ANGPTL4 binder til integrinet αv β5. Se for eksempel Figur 9, panel A-E. Et annet medlem av familien, angiopoietinlignende-3-protein (ANGPTL3) er en angiogen faktor som binder til integrin αv β3. Se for eksempel US patentsøknad 20030215451, publisert 20. november 2003 og Camenisch et al., J. Biol. Chem., 277(19):17281-17290 (2002).

ANGPTL3 ser ikke ut til å binde til reseptor Tie2. Camenish et al., Journal of Biol. Chem. 277(19):17281-17290 (2002). ANGPTL3 er også en regulator av plasmalipidnivåer. Se for eksempel Koishi et al., Nat. Genetics 30:151-157 (2002).

Integrin αv β5 er en reseptor for ekstracellulære matriksproteiner inkludert vitronektin og Del-1 (se for eksempel Stupack og Cheresh, Journal of Cell Science 115:3729-3738 (2002)). Alfa-v-integriner har blitt implisert i tumorprogresjon og metastaser. Se for eksempel Marshall, JF og Hart, IR, Semin. Cancer Biol. 7(3): 129-38 (1996). I tillegg har en rolle for alfa-v-integriner i angiogenese også blitt vist. Se for eksempel Eliceiri, B P og Cheresh D A, Molecular Medicine, 4: 741-750 (1998). Et monoklonalt antistoff for αv β5 ble for eksempel vist å inhibere VEGF-indusert angiogenese i kaninkornea og i chorioallantoinmembranmodellen hos høns. Se for eksempel M.C. Friedlander et al., Science, 270:1500-1502 (1995). Antagonister av αv β3 og αv β5 ble også vist å inhibere vekstfaktor- og tumorredusert angiogenese. Se for eksempel Eliceiri og Cheresh, Current Opinion in Cell Biology, 13:563-568 (2001).

Anvendelse av ANGPTL4 og modulatorer av ANGPTL4

Oppfinnelsen tilveiebringer anvendelser av ANGPTL4 eller en agonist eller en antagonist derav for å modulere en mengde av celleaktiviteter og prosesser, for eksempel hepatocytt proliferasjon og/eller celleadhesjon og pre-adipocytt proliferasjon og/eller preadipocytt cellemigrasjon. ANGPTL4 er involvert i modulering serumnivåer av triglyserider og kolesterol. I tillegg kan ANGPTL4 også være en negativ regulator av inflammatoriske responser. Modulatorer av ANGPTL4 kan bli benyttet til å behandle forstyrrelser og sykdommer som er relatert til disse aktivitetene.

Lever

ANGPTL4 stimulerer proliferasjon av hepatocytter og adhesjon av hepatocytter. Leveren er det viktigste organet for kolesterolhomeostase. Se også avsnittet ”Lipid Homeostasis” her. Leveren er ansvarlig for kolesterolbiosyntese og katabolisme av kolesterol. Leveren syntetiserer og utskiller svært lavtetthets lipoproteiner (VLDL). I sirkulasjon blir VLDL metabolisert slik at de blir lavtetthets lipoproteiner (LDL), som er de viktigste kolesteroltransporterende lipoproteiner i plasma.

Leveren virker som en beskytter som er satt inn mellom fordøyelsessystemet og resten av kroppen. En hovedhepatisk funksjon involverer effektivt opptak, lagring, metabolisme og fordeling til blod og galle av store mengder stoffer slik som karbohydrater, lipider, aminosyrer, vitaminer og sporstoffer. En annen funksjon for leveren er detoksifiseringen av xenobiotiske forurensninger, legemidler og endogene metabolitter, via både fase-I (oksidasjon/reduksjon) og fase-II (konjugering) mekanismer.

Leveren er det viktigste metabolske kontrollorganet i menneskekroppen som omfatter tusenvis av små lapper (lobuli hepatis), som er de funksjonelle enhetene i organene. Levervev inneholder to hovedtyper av differensierte celler, parenchymceller (dvs. hepatocytter) og ikke-parenchymceller. De komplekse funksjonene til cellen er utøvd i stor grad av hepatocytter, mens ikke-parenchymceller som Kupffer-celler, Ito-celler eller leversinus endotelceller (LSEC) spiller en viktig rolle i å støtte og tilveiebringe forsyninger til hepatocytter. Mochida et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 226:176-179 (1996).

I tillegg til normal vekst i løpet av tidlig utvikling har levervev en unik evne til å regenerere seg i voksent stadium. Leverregenerering etter tap av hepatisk vev er en fundamental komponent i gjenvinningsprosessen i respons på ulike former av leverskade slik som hepatotoksisitet, virusinfeksjon, vaskulær skade og partiell hepatektomi. Etter partiell hepatektomi blir leverstørrelsen for eksempel vanligvis gjenopprettet til sin opprinnelige masse i løpet av omtrent seks dager. Levervekst og –regenerering involverer proliferasjon av både hepatocytter og ikke-parenchymceller slik som sinusendotelceller. Typisk er hepatocyttene de første til å proliferere og andre celler i leveren går inn i DNA-syntesen omtrent 24 timer etter hepatocytter. Michalopoulos og Defrances, Science, 276:60-65 (1997).

Oppfinnelsen tilveiebringer midler som definert i kravene for å fremme levervekst og/eller hepatocyttcelleproliferasjon ved å administrere en effektiv mengde av ANGPTL4 eller agonist derav. De fremmende effektene i oppfinnelsen kan bli vurdert enten in vivo eller in vitro ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. Se for eksempel Drakes et al., J. Immunol., 159:4268 (2997), Omori et al., Hepatology, 26:720 (1997) og US patentskrift nr. 5 227 158. For eksempel blir celleproliferasjon vurdert i løpet av dyrking ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, inkludert å måle omfanget av DNA-syntese (se for eksempel Nakamura et al., Biochem. Biophy. Res. Comm., 122:1450 (1984), trypanblått fargestoffeksklusjon/hemacytometertelling (se for eksempel Omiri et al. (1997) ovenfor) eller flowcytometri (se for eksempel Drakes (1997) ovenfor).

I visse utførelsesformer av oppfinnelsen blir ANGPTL4 eller en agonist derav administrert for å indusere celleadhesjon for hepatocytter. Adhesjon av hepatocytter kan bli vurdert ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, inkludert for eksempel krystall fiolett analyse. Se også Landegren, U.J. Immunological Methods, 67:379-388 (1984). I én utførelsesform av oppfinnelsen blir hepatocytter og andre ikkeparenchymleverceller isolert fra målleverne og resuspendert i passende vev kulturmedium med ANGPTL4 eller en agonist derav til å indusere celleadhering. Hvis nødvendig kan ulike cellefraksjoner bli ytterligere separert (for eksempel parenchymalceller fra ikkeparenchymceller) ved sentrifugering ved ulike hastigheter i ulike tidsperioder.

I en annen utførelsesform blir den proliferative effekten av en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist på hepatiske celler og leverorgan en helhet målt in vivo ved for eksempel å benytte histokjemianalyser for levervevsprøvene. I ett aspekt blir in vivo-proliferasjon for hepatiske celler vurdert ved hjelp av reaktivitet ovenfor et antistoff som er rettet mot et protein som er kjent for å være tilstede i høyere konsentrasjoner i prolifererende celler enn i ikke-prolifererende celler, slik som prolifererende cellenukleært antigen (PCNA eller syklin). Rodgers et al., J. Burn Care Rehabil. 18:381-388 (1997). I et annet aspekt kan en BrdU-immunhistokjemianalyse bli benyttet som beskrevet av Gerber et al., Development, 126:1149-1159 (1999).

På grunn av dens essensielle rolle i livet, er leverdysfunksjon og leversykdommer ofte invalidiserende og livstruende. Et antall akutte eller kroniske patologiske tilstander er assosiert med strukturelle og/eller funksjonelle unormalheter i leveren. Disse inkluderer leversvikt, hepatitt (akutt, kronisk eller alkohol), levercirrose, toksisk leverskade, medikamentmessig leverskade, hepatisk encefalopati, hepatisk koma eller hepatittnekrose. Cellulær vekstforsterkning av hepatocytter kan være nyttig for å behandle leversykdom. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe reparasjonen av leverskade. Uten å være bundet av teori, så er det antatt at dette kan bli utført, enten direkte eller indirekte, ved å stimulere leverceller slik at de vokser og deler seg. Ifølge en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen midler som definert i kravene for å behandle en patologisk levertilstand hos et individ ved å administrere en effektiv mengde av en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist ifølge oppfinnelsen.

Uttrykket ”patologisk levertilstand” blir benyttet om hverandre med ”leverforstyrrelse” eller ”leversykdom” for å indikere enhver strukturell og/eller funksjonell leverunormalhet. Ikke-begrensende eksempler på patologiske levertilstander inkluderer de tilstandene som er assosiert med leversvikt, hepatitt (akutt, kronisk eller alkohol), levercirrose, toksisk leverskade, medikamentmessig leverskade, hepatisk encefalopati, hepatisk koma eller hepatisk nekrose.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen midler for å beskytte leveren fra skade hos et individ mistenkt for tilstander eller faktorer som forårsaker leverskade. Uttrykket ”leverskade” blir her benyttet i sin bredeste betydning og indikerer enhver strukturell eller funksjonell leverskade som direkte eller indirekte skyldes interne eller eksterne faktorer eller deres kombinasjoner. Leverskade kan bli indusert ved et antall faktorer inkludert eksponeringen ovenfor hepatotoksiske forbindelser, strålingseksponering, mekaniske leverskader, genetisk predisposisjon, virusinfeksjoner, autoimmunsykdom, slik som autoimmun kronisk hepatitt og som et resultat av forhøyede in vivo-nivåer av proteiner, slik som aktivin og TGF- β. Leverskade indusert ved hepatotoksiske forbindelser inkluderer direkte cytotoksisitet inkludert legemiddelhypersensitivitetsreaksjoner, kolestase og skade på det vaskulære endotelet.

Mange kjemiske og biologiske midler, enten terapeutiske eller rent skadelige, kan indusere leverskader og er slik hepatotoksiske. Hepatotoksiske forbindelser er også en viktig årsak til kronisk leversykdom, inkludert fettlever, hepatitt, cirrhose og vaskulære neoplastiske lesjoner i leveren. (Sinclair et al., Textbook of Internal Medicine, 569-575 (1992) (red. Kelley; utg. J.B. Lippincott Co.). Tilveiebrakt i oppfinnelsen er midler som definert i kravene for anvendelse i fremgangsmåter for å beskytte leveren hos et individ fra skade som skyldes eksponering ovenfor et hepatotoksisk middel, som omfatter å administrere en ANGPTL4 eller agonist til individet der nevnte ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist effektivt beskytter leveren fra skade. I ett aspekt blir ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonisten administrert før eller samtidig med eksponeringen av nevnte individ ovenfor det hepatotoksiske middelet, der nevnte hepatotoksiske middel er et terapeutisk middel slik som et kjemoterapeutisk middel eller strålingsmiddel for å behandle kreft. Som slike virker fremgangsmåtene for å forsterke effektiviteten til behandlingen ved å tillate individet toleranse ovenfor høye doser av de terapeutiske midlene. I et annet aspekt forblir ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonisten administrert etter eksponeringen av individet over et hepatotoksisk middel, men før en påvisbar leverskade er synlig hos individet. Slike fremgangsmåter kan være nyttige for å behandle leverskade som skyldes utilsiktet eksponering av individet ovenfor et hepatotoksisk middel.

Hepatotoksiske midler kan indusere leverskade ved cytotoksisitet på leveren direkte eller via produksjon av toksiske metabolitter (denne kategorien inkluderer hypersensitivitetsreaksjonen som hermer en legemiddelallergi), kolestase, stopp i strømningen av galle som skyldes blokkering av gallegangene, og vaskulære lesjoner slik som in veno-oklusiv sykdom (VOD), der skade på det vaskulære endotelet fører til hepatisk venetrombose. Individuell mottagelighet for leverskade som er indusert ved hepatotoksiske midler blir påvirket av genetiske faktorer, alder, kjønn, næringsstatus, eksponering ovenfor andre legemidler og systemiske sykdommer (Sinclair et al., Textbook of Internal Medicine, ovenfor).

Mange hepatotoksiske forbindelser gir uforutsigbar leverskade inn i små andeler av mottageren. Hos noen pasienter blir leverskaden referert til som en hypersensitivitetsreaksjon og ligner den for en legemiddelreaksjon, der pasienten viser feber, utslett og eosinofili og har et tilbakefall av symptomer ved ny utføring med legemiddelet. I andre situasjoner er mekanismen for skade ukjent og kan representere feilaktig metabolisme hos utsatte pasienter som muliggjør produksjon eller akkumuleringen av hepatotoksiske metabolitter.

De legemidlene som induserer cytotoksisitet ved direkte kjemiske angrep inkluderer følgende: bedøvelsesmidler slik som enfluran, fluroxen, halotan og metoksyfluran, neuropsykotropiske midler slik som kokain, hydrazider, metylfenidad og trisykliske midler, anti-brekkmidler slik som fenytoin og valproinsyre, smertestillende midler slik som acetaminofen, klorzoxazon, dantrolen, diklofenac, ibuprofen, indometacin, salicylater, tometin og zoxazolamin, hormoner slik som acetaheksamid, karbutamid, glipizid, metaheksamid, propyltiouracil, tamoksifen, dietylstilbestrol, antimikrobielle midler slik som amfotericin-B, klindamycin, ketokonazol, mebendazol, metroindazol, oksacillin, paraaminosalisylsyre, penicillin, rifampicin, sulfonamider, tetrasyklin og zidovudin, kardiovaskulære legemidler slik som amiodaron, dilitiazem, a-metyldopa, mekiletin, hydrazalin, nikotinsyre, papaverin, perheksilin, prokainamid, kinidin og tokainamid og immundempende midler og antineoplastiske midler slik som asparaginase, cisplatin, syklofosfamid, dakarbazin, doksorubicin, fluoruracil, metotreksat, mitramycin, 6-MP, nitrosoureaer, tamoksifen, tioguanin og vinkristin og ulike legemidler slik som disulfiram, jodion, oksyfenistgatin, vitamin-A og paraaminobenzosyre.

De hepatotoksiske forbindelsene som frembringer hypersensitivitetsreaksjon i leveren inkluderer det følgende: fenytoin, paraaminosalisylsyre, klorpromazin, sulfonamider, erytromycinestolat, isoniazid, halotan, metyldopa og valproinsyre.

Hepatotoksiske forbindelser inkluderer kolestase, som er en oppstopping av strømningen av galle, kan ta flere former. Sentribulær kolestase er fulgt av portal inflammatoriske endringer. Gallekanalendringer har blitt rapportert sammen med noen legemidler slik som erytromycin, mens ren kanalikulær kolestase er karakterisert ved andre legemidler slik som de anabole steroidene. Kronisk kolestase har blitt bundet til slike legemidler som til testosteron og østradiol.

De hepatotoksiske forbindelsene som induserer kolestatisk sykdom inkluderer de følgende: prevensjonssteroider, androgene sterioder, anabole sterioder, acetylsalisylsyre, azatrioprin, benzodiazepin, chenodeoksykolsyre, klordiazepoksid, erytromycinestolat, flufenazin, furosemid, griseofulvin, haloperidol, imipramin, 6-merkaptopurin, metimazol, metotreksat, metyldopa, metylendiamin, metyltestosteron, naproksen, nitrofurantoin, penicillamin, perfenazin, proklorperazin, promazin, tiobendazol, tioridazin, tolbutamid, trimetoprimsulfatmetoksazol, arsenikk, kobber og parakat.

Selv om de primært er kolestatiske, kan noen legemidler også frembringe hepatoksisitet og derfor er leverskaden det forårsaker blandet. Legemidlene som forårsaker en blandet leverskade inkluderer for eksempel de følgende: klorpromazin, fenylbutazon, halotan, klordiazepoksid, diazepam, allopurinol, fenobarbital, naproksen, propyltiouracil, kloramfenikol, trimetoprimsulfametoksazol, amrinon, diisopyramid, azatioprin, cimetidin og ranitidin.

Vaskulære lesjoner i leveren, inkludert trombose i de hepatiske vener, tilstopping av de hepatiske, små venene eller venookklusiv sykdom (VOD), og pliosehepatitt, kan bli frembrakt av legemidler. I tillegg kan lesjoner inkludert sinusdilasjon, perisinusfibrose og hepatoportal selerose forekomme. Midtsone og perisentral sinusdilatasjon ble først rapportert som en komplikasjon ved oral prevensjonsterapi. Peliosehepatitt er en tilstand som består av store blodfylte hulrom som skyldes lekkasje av røde blodceller gjennom den endotele barrieren, etterfulgt av perisinusfibrose. Den har blitt beskrevet hos pasienter som tar orale prevensjonsmidler, anabole steroider, azatioprin og danazol. Skade og tilstopning av de sentrale hepatiske, små venene er også kjent for å være relatert til inntaket av pyrrolizidinalkaloider, slik som bush te sorter. Den første lesjonen er sentral nekrose fulgt av en progressiv minskning i kaliber for små vener. Alle disse lesjonene kan kun delvis være reversible når legemiddelet blir stoppet og cirrhose kan bli utviklet.

Flere typer av godartet og ondartet hepatisk neoplasi kan være et resultat av administreringen av hepatotoksiske forbindelser. Adenomer, som er en lesjon som er begrenset til kvinner i fruktbar alder, er relatert til anvendelsen av prevensjonssterioder og risikoen øker med varigheten av anvendelse. Hepatocellulært karsinom kan også bli observert hos pasienter som tar androgene hormoner for aplastisk anemi eller hypopitutarisme.

Hepatotoksiske forbindelser som er kjent for å forårsake hepatiske lesjoner inkluderer de følgende: prevensjonssterioder, pyrriolizidinalkaloider, uretan, azatioprin, 6 merkaptopurin, 6-tioguanin, mitomycin, BCNU, vinkristin, adriamycin, intravenøst vitamin-E, anabol-androgene sterioder, azatioprin, medroksyprogesteronacetat, østronsulfat, tamoksifen, uorganiske arsenikkmidler, toriumdioksid, Vitamin-A, metotreksat, metylamfetaminhydroklorid, vitamin-A, kortikosterioder, toriumdioksid og radiumterapi.

Leverskade forårsaket av andre faktorer tar vanligvis lignende former. Leverskade, uansett om den er forårsaket av hepatotoksisiteten til en forbindelse, strålingsterapi, genetisk predisponering, mekanisk skade eller enhver kombinasjon av slike og andre faktorer, kan bli påvist ved hjelp av flere fremgangsmåter. Biokjemiske tester har blitt benyttet klinisk i mange år som standard måter for hepatotoksisitet. De fleste biokjemiske tester faller generelt inn i to kategorier: tester som måler de spesifikke levermarkører, for eksempel protrombinkoagulasjonstid og/eller hepatisk blodgjennomstrømning, eller tester som analyserer serummarkører for påvisning av nekrose, kolestase, progressiv fibrogenese eller hepatom (Cornelius, C. i Hepatotoxicology, Meeks et al., red., s. 181-185 (1991)). Viktigheten av slike tester ligger i deres enkelhet og det faktumet at de er ikke-invasive. Hensiktsmessigheten for anvendelsen av serumenzymer for å undersøke leverskade består i at disse enzymene som normalt er inneholdt i levercellene får tilgang til den generelle sirkulasjonen når leverceller blir skadd.

Forhøyet serumenzymaktivitet tyder på nekrose og/eller kolestase. Forhøyede nivåer av serumbilirubinkonjugater tyder på intrahepatisk eller ekstrahepatisk kolestase. Det foreligger likevel visse begrensninger for anvendelsen av serumenzymnivåer som en enkelt måte for å diagnostisere leverskade. Serumenzymnivåer kan øke som et resultat av lekkasje fra cellene med endret permeabilitet som skyldes systemiske effekter av et middel eller en spesifikk leverskade som er forårsaket av et kjemisk stoff. Histopatologisk undersøkelse av leveren er det neste logiske trinnet for å identifisere og kvantifisere egenskapene og omfanget av leverskade.

Serumenzymene som markører for leverskade kan bli delt i fire grupper basert på spesifisitet og sensitivitet for leverskade (Kodavanti et al., Toxicologic Pathology 20(4):556-69 (1992), Kodavanti et al., Archives of Teoxicology 63(5):367-75 (1989).

Gruppe I: disse enzymene indikerer mer selektivt hepatisk kolestase når de er forhøyede, for eksempel alkalisk fosfatase (AP), 5’-nukleotidase (5’-ND) og a-glutamyltranspeptidase (G-GT) og leucinaminopeptidase (LAP). Gruppe II: disse enzymene tyder på parenchymal skade når de er forhøyede, for eksempel aspartattransaminase (AST), alanintransaminase (ALT), fruktose-1,6-difosfataldolase (ALD), laktatdhydrogenase (LDH), isocitratdehydrogenase (ICDH), ornitinkarbamoyltransferase (OCT) og sorbitoldehydrogenase (SDH)-arginase og guanase. Gruppe III: disse enzymene representerer skade for andre vev når de er forhøyede, for eksempel kreatinfosfokinase (CPK). Gruppe IV: disse enzymene er undertrykt ved hepatisk skade, for eksempel kolinesterase (ChE).

Andre serummarkører inkluderer prokollagen type-III-peptidnivåer (PIIIP) for å undersøke om hepatisk fibrogenese er aktivt, ammoniumblodnivåer i hepatoencefalopatier, ligand i nivåer ved nekrose og hepatom, hyaluronatnivåer som skyldes hepatisk endotelcelleskade, a-1-fetoprotein (AFP)-nivåer for å påvise hepatom, karsinoembryonalt antigen (CEA)-nivåer for å påvise kreftmetastase i leveren, forhøyninger av antistoffer mot en mengde cellulære komponenter slik som miktokondrielt protein og nukleære og spesifikke levermembranprotein, og påvisning av proteiner slik som albumin, globin, aminosyrer, kolesterol og andre lipider. Biokjemisk analyse av en mengde mineraler, metabolitter og enzymer som er fremskaffet fra leverbiopsier kan også være nyttige for å studere spesifikke biokjemiske effekter i arvelige, pådratte eller eksperimentelt induserte leverforstyrrelser.

Leverfunksjonstester kan bli utført for å undersøke leverskade. Leverfunksjonstester inkluderer de følgende: Gruppe I-undersøkelse av hepatisk uttømming av organiske anioner slik som bilirubin, indocyaningrønt (ICG), sulfobromftalein (BSP) og gallesyrer, Gruppe-II-undersøkelse av hepatisk blodgjennomstrømning ved måling av galaktose- og ICG-uttømming og Gruppe-III-undersøkelse av hepatisk mikrosomal funksjon i anvendelsen av aminopyrin pustetesten og koffein uttømmingstesten. Serumbilirubin kan for eksempel bli målt for å bekrefte tilstedeværelsen og alvorligheten av gulsott og for å bestemme omfanget av hyperbilirubinemi, som observert ved parenchymal leversykdom.

Aminotransferase (transaminase)-forhøyninger gjenspeiler alvorligheten av aktiv hepatocellulær skade, mens forhøyning av alkalisk fosfatase ble funnet sammen med kolestase og hepatiske infiltrater (Isselbacher, K. og Podolsky, D. i Harrisson’s Principles of Internal Medicine, 12. utg., Wilson et al., red., 2:1301-1308 (1991)). Fremgangsmåter for å utføre serumenzymanalyser er kjent på fagområdet og er for eksempel beskrevet i Kodavanti et al., ovenfor.

Fordi omfattende leverskader kan føre til minskede blodnivåer av albumin, protrombin, fibrinogen og andre proteiner som kun blir syntetisert av hepatocytter, så kan disse proteinnivåene bli målt som indikatorer på leverskade. I motsetning til målinger av serumenzymer så gjenspeiler serumproteinnivåer syntetisk leverfunksjon heller enn kun celleskade (Podolsky, D. Harrisson’s Principles of Internal Medicine, 12. utgave, Wilson et al., red., 2: 1308-1311 (1991)).

Hos mange pasienter kan beregnet tomografi (CT), ultralyd, scintiscanner eller leverbiopsi være nødvendig for å bestemme omfanget av leversykdommen (Isselbacher, K. og Friedman, L. og Needleman, L. i Harrisson’s Princples of Internal Medicine, 12. utgave, Wilson et al., red., 2: 1303-1307 (1991)).

Oppfinnelsen tilveiebringer midler, som definert i kravene for å forsterke effekten av terapi hos et individ ved å administrere en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist til individet på en måte som er effektiv til å beskytte leveren til individet fra skade forårsaket av en hepatoksisk forbindelse før, eller samtidig med terapien, for derved å øke individets toleranse ovenfor terapien. For eksempel kan de kjemoterapeutiske midlene som blir benyttet i løpet av kjemoterapibehandlingen ha cytotoksiske effekter på hepatiske celler, og derfor begrense doseringen og/eller varigheten av det kjemoterapeutiske middelet som blir administrert til pasienten. Ved å eksponere leveren ovenfor et preparat som omfatter en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist kan slike toksiske effekter bli forhindret eller redusert. Som slike kan doseringen av de kjemoterapeutiske midler bli økt, for derved å forsterke effektiviteten av kreftterapien.

En ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist kan bli kombinert med andre midler i fremgangsmåtene som er beskrevet her. For eksempel har flere vekstfaktorer og cytokiner blitt implisert som å være i stand til å indusere leverregenerering, mest fremtredende hepatocyttvekstfaktor (HGF), epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor (TGF), interleukin-6 (IL-6), tumornekrosefaktor (TNF- α), basiske og sure fibroblastvekstfaktorer, CTGF, HB-EGF og norepinefrin. Fujiwara et al., Hepatol., 18:1443-9 (1993), Baruch et al., J. Hepatol., 23:328-32 (1995), Tio et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 198:25-31 (1994), Suzuma et al., J. Biol. Chem., 275:40725-31 (2000) og Michalopoulos og DeFrances (1997) ovenfor. Disse kan bli kombinert med ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonister.

Rundt HGF, som er en av de mest potente levermitogenene, ble først identifisert som en faktor som er i stand til å stimulere DNA-syntese i dyrkede hepatocytter, men er nå kjent for å ha flere bestemte funksjoner på en mengde epitelceller. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 122:1450 (1984) og Russell et al., J. Cell. Physiol., 119:183-192 (1984). HGF er også kjent som Scatter-faktor (SF), som fører til betegnelsen HGF/SF. Stoker og Perryman, J. Cell Sci., 77:209-223 (1985) og Gherardi og Stoker, Nature, 346:228 (1990). De biologiske effektene av HGF blir overført via en enkel tyrosinkinasereseptor, Met, som er produktet av Met-protoonkogenet. I leveren blir HGF uttrykt i ikke-hepatocyttceller slik som Ito-celler og LSECer, mens met-transkripter sterkt blir uttrykt i hepatocytter. Hu et al., Am. J. Pathol., 142:1823-1830 (1993). Etter kjemisk eller mekanisk leverskade øker HGF-nivåer skarpt, noe som fører til en sterk hepatocyttproliferasjon. Horimoto et al., J. Heptaol., 23:174-183 (1995). Levere fra transgene mus med leverspesifikk overekspresjon av HGF er to ganger større enn størrelsen på leverne fra kontrolldyr og de regenererer mye raskere etter partiell hepatektomi. Sakata et al. (1996) Cell Growth Differ., 7:1513-1523, Shiota et al. (1994) Hepatol., 19:962-972.

Angiogenese er en viktig cellulær hendelse der vaskulære endotelceller prolifererer, forgrener seg og reorganiserer for å danne nye blodkar fra allerede eksisterende vaskulært nettverk. Det er overbevisende bevis på at utviklingen av en vaskulær tilførsel er essensielt for normale og patologiske proliferative prosesser (Folkman og Klagsbrun (1987) Science, 235:442-447). Regenererende lever, i analogi til raskt voksende tumor, må syntetisere ny stroma og blodkar. Se for eksempel WO 03/103581, Yamane et al., Oncogene, 9:2683-2690 (1994), Mochida et al., Biochem. Biophy. Res. Comm., 226:176-179 (1996), Ajioka et al., Hepatology, 29:396-402 (1999) og Assy et al., J. Hepatol., 30:911-915 (1999).

Michalopoulos og DeFrances (1997) ovenfor, Mochida et al. (1996). I én utførelsesform av oppfinnelsen blir ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist administrert i kombinasjon med et angiogent middel, for eksempel VEGF eller aktivatorer av VEGFRer. En ”angiogen faktor eller middel” er en vekstfaktor som stimulerer utviklingen av blodkar, som for eksempel fremmer angiogenese, endotel cellevekst, stabilitet for blodkar og/eller vaskulogenese osv. Angiogene faktorer inkluderer for eksempel VEGF og medlemmer av VEGF-familien (A, B, C; D og E), PIGF, PDGF-familien, fibroblastvekstfaktorfamilien (FGF), TIE-ligander (angiopoietiner), ANGPTL3, efriner osv. De vil også inkludere faktorer som akselererer sårheling, slik som veksthormon, insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1), VIGF, epidermal vekstfaktor (EGF), CGTF og medlemmer av dens familie, og TGF- α og TGF- β. Se for eksempel Kalgsbrun og D’Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991), Streit og Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003), Ferrara & Alitalo, Nature Medicine, 5(12):1359-1364 (1999), Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (for eksempel Tabell 1 som fremlegger kjente angiogene faktorer) og Sato, Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).

Lipidhomeostase

ANGPTL4 er implisert i å modulere andre aspekter av energihomeostase, ved siden av leveren. ANGPTL4 er assosiert med fettdifferensiering, systemisk lipidmetabolisme og angiogenese. Se for eksempel Yoon et al., Molecular and Cellular Biology, 20(14):5343-5349 (2000), Le Jan et al., American Journal of Pathology, 162(5):1521-1528 (2003) og EP 1403367. ANGPTL4-ekspresjon blir også indusert av PPAR-gamma og –alfa i fettvev, og blir indusert ved hunger. Se for eksempel Yoon et al., Mol. Cell. Biol., 20:5343-5349 (2000) og Kersten et al., J. Biol. Chem., 275:28488-28493 (2000). Ekspresjon av ANGPTL4 er oppregulert ved fasting, og overskudd av proteinplasma minsker ved foring med nye sett.

I tillegg inhiberer ANGPTL4 lipoproteinlipase (LPL)-aktivitet. Se for eksempel EO 1403367. Lipoproteinlipase (LPL) er et utskilt glykoprotein som medierer lipoproteinmetabolisme ved å hydrolysere triglyserider som er tilstede i kylomikroner og svært lavtetthets lipoproteiner (VLDLer) for å produsere frie fettsyrer og fosfolipider.

Som beskrevet her har ANGPTL4-knockout mus minskede nivåer av kolesterol og serumtriglyserider sammenlignet med deres kjønnsmatchede villtype kullkamerater. Se avsnittet med tittelen transgene knockout dyr og Eksempel 4 her. I tillegg øker intravenøs injeksjon av ANGPTL4 sirkulerende plasmalipidnivåer hos mus og øker nivåene av svært lavtetthets lipoprotein. Se for eksempel Yoshida et al., Journal of Lipid Research, 43: 1770-1772 (2002) og se Figur 10.

Fremgangsmåter for å modulere serumnivåer av triglyserider eller kolesterol hos et individ blir beskrevet. Fremgangsmåter inkluderer for eksempel å administrere en effektiv mengde av en sammensetning som omfatter en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist eller en ANGPTL4-antagonist eller et individ, for derved å modulere serumnivåene av triglyserider og kolesterol hos et individ. I én utførelsesform blir en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist administrert, som fører til en akkumulering av triglyserider eller kolesterol i serum. I en annen utførelsesform blir en effektiv mengde av en ANGPTL4-antagonist administrert til et individ for derved å redusere nivået av minst ett triglyserid, frie fettsyrer og/eller kolesterol i serum hos individet sammenlignet med individet før behandling, eller et individ uten noen behandling eller redusert behandling. Gjennomsnittlige serumkolesterolnivåer og serumtriglyseridnivåer kan bli analysert slik det er kjent på fagområdet.

ANGPTL4 kan også modulere adipocytter. ANGPTL4 kan for eksempel stimulere preadipocytt proliferasjon eller indusere cellemigrasjon for pre-adipocytter. Fettvev består primært av adipocytter, som også spiller en avgjørende rolle i energihomeostase.

Adipocytter syntetiserer og lagrer lipider når næringstilgangen er rikelig, og frigjør fettsyrer inn i sirkulasjonen når næringsstoffer er nødvendige. Hvitt fettvev (WAT) og brunt fettvev (BAT) blir funnet i virveldyr. WAT lagrer og frigjør fett som er avhengig av næringsbehov for dyr. WAT-lagret fett blir benyttet til (1) varmeisolering (for eksempel subkutant fett), (2) mekanisk beskyttelse (for eksempel omgir det interne organet) og (3) som en kilde for energi. BAT brenner fett og frigjør energien som varme via termogenese for å opprettholde homeotenmi ved å øke termogenese i respons på lavere temperaturer og for å opprettholde energibalanser ved å øke energiomsetning i respons på økninger i kaloriinntak. Se for eksempel Sears, I.B. et al. (1996), Mol. Cell. Biol., 16(7):3410-3419 (1996). Generelt avtar BAT med alder, men kan bli reaktivert ved visse betingelser, for eksempel forlenget eksponering ovenfor kulde, opprettholdelse av en diett med høyt fettinnhold og tilstedeværelsen av noradrenalinproduserende tumorer.

Adipogenese involverer flere morfologiske endringer, vekststans, ekspresjon av lipogene enzymer, lipidakkumulering og krever sensitivitet ovenfor ulike hormoner, for eksempel insulin. Fremgangsmåter blir tilveiebrakt som inkluderer å stimulere adipocyttproliferasjon ved å administrere en effektiv mengde av ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist. Celleproliferasjon kan bli undersøkt i løpet av dyrkning ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, inkludert å måle hastigheten på DNA-syntese (se for eksempel Nakamura et al., Biochem. Biophy. Res. Comm., 122:1450 (1984), trypanblått fargestoffeksklusjon/hemacytometertelling (se for eksempel Omiri et al. (1997) ovenfor) eller flowcytometri (se for eksempel Drakes (1997) ovenfor). ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonister kan være nyttige for å indusere proliferasjon av adipocytter ved forstyrrelser der ytterligere adipocytter vil være fordelaktige, for eksempel som inkluderer, men ikke er begrenset til for eksempel tæringssykdommer (for eksempel slik som i ulike krefttyper, immunkompromitterte pasienter (for eksempel AIDS-pasienter osv.), aldrende individ) osv. Fremgangsmåter blir også tilveiebrakt som inkluderer å indusere preadipocyttcellemigrasjon ved å administrere en effektiv mengde av ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist.

ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonister kan også bli kombinert med andre faktorer som fremmer differensiering av adipocytter. Disse faktorene inkluderer for eksempel IGF-1, insulin, glukokortikoider, 3,3’,5’trijodtyronin, retinolsyre, PGF2 α, PGI2 osv. Ytterligere faktorer kan også bli kombinert med ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonister. Adipogenese er for eksempel utsatt for hormonell og transkripsjonell kontroll. Adipogenese kan for eksempel være mediert ved en kaskade av transkripsjonsfaktorer inkludert for eksempel medlemmer av peroksisomproliferatoraktivert reseptor (PPAR), for eksempel (PPAR α, γ)-familien, CCAAT/enhancerbindingsprotein (C/EBP)-familien og basisk helix-loop-helix-leucinzipper (bHLH)-familien, for eksempel ADD1/SREBP1. Se for eksempel Wu et al., Current Opin. Cell Biol, 11:689-694 (1999), Rosen og Spiegelman, Annu Rev Cell Dev Biol., 16:145-171 (2000), Gregoire et al., Physiological Reviews, 78(3) (1998) og Kim og Spiegelman, Genes Devel, 10:1096-1107 (1996)). PPAR γ virker i fettvev og fremmer adpipogenese og lipidlagring. Se for eksempel Rosen et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 16:145-171 (2000), Rosen et al., Mol. Cell., 4:611-617 (1999), Ren et al., Genes Dev., 16:27-32 (2002), Rosen et al., Genes Dev., 16:22-26 (2002) og Fukumura et al., Circ. Res., 93:e88-e97 (2003). PPAR medierer også lipoproteinlipase-mRNA og proteinnivåer i adipocytter og andre celler (se for eksempel Gbaguidi et al., FEBS Letters, 512:85-90 (2002)) og PPAR har også blitt implisert i kreft (se for eksempel Yoshimura et al., Int. J. Cancer, 104:597-602 (2003) og Kubota et al., Cancer Research, 58:3344-52 (1998)).

Vekst og/eller dannelse av fettvev er likevel ofte ikke ønskelig. Fedme er for eksempel typisk et resultat når energiinntaket overskrider energiomsetningen, noe som fører til veksten og/eller dannelsen av fettvev via hypertrofisk og hyperplastisk vekst.

Hypertrofisk vekst er en økning i størrelsen av adipocytter som er stimulert ved lipidakkumulering. Hyperplastisk vekst er definert som en økning i antallet adipocytter i fettvev.

Fedme er en kronisk sykdom som er svært forekommende i det moderne samfunn og er ikke bare assosiert med et sosialt stigma, men også med minsket livslengde og utallige medisinske problemer, inkludert skadelig psykologisk utvikling, reproduktive forstyrrelser slik som polycystisk ovariesvikt, dermatologiske forstyrrelser slik som infeksjoner, åreknuter, Acanthosis nigricans og eksem, treningsintoleranse, insulinresistens, hypertensjon, hyperkolesterolemi, kolelitiasis, osteoartritt, ortopedisk skade, tromboembolsykdom, kreft og koronar hjertesykdom. Rissanen et al., British Medical Journal, 301:835-937 (1990). Behandling av fedme involverer å benytte apetittdempere og andre vekttapsinduserere, diettmodifiseringer og lignende, men slik som for pasientene med insulinresistens gjennomgår hoveddelen av fedmepasienter primær diettsvikt over tid, og mislykkes dermed i å oppnå en ideell kroppsvekt. ANGPTL4-antagonister kan bli benyttet for å behandle fedme og/eller redusere total kroppsmasse hos et individ, ved å benytte en effektiv mengde av en ANGPTL4-antagonist. Fedme kan bli bestemt ved hjelp av BMI og/eller en fedmebestemmende egenskap som er kjent på fagområdet og beskrevet her.

Behandling av fedme referer generelt til å redusere BMI for pattedyret til mindre enn omtrent 25,9 og opprettholde den vekten i minst 6 måneder. Behandlingen resulterer hensiktsmessig i en reduksjon i mat og kaloriopptak av pattedyret. Behandling i denne konteksten refererer i tillegg til å foreligge fedme fra å oppstå hvis behandlingen blir administrert før fremkomsten av fedmetilstand. Behandling inkluderer inhiberingen og/eller den fullstendige undertrykkingen av lipogenese hos pattedyr med fedme, dvs. overskuddsakkumulering av lipidet i fettceller eller akkumulering av fettceller, som er en av hovedegenskapene ved human fedme og dyrefedme, i tillegg til tap av total kroppsvekt. En reduksjon i total kroppsmasse kan bli målt ved å benytte standardteknikker (for eksempel vekter). I én utførelsesform blir fett hos et individ redusert. På denne måten kan tilstander som er beslektet med fedme også bli behandlet, for eksempel kardiovaskulær sykdom, diabetes osv.

ANGPTL-4 er også implisert i moduleringen av leptin som er et adipocyttavledet hormon. Leptin, som er strukturelt beslektet med cytokiner, virker på reseptorer som tilhører cytokinreseptor superfamilien. Se for eksempel Zhang F. et al., Nature, 387:206-209 (1997), Tartaglia L A., et al., Cell, 83:1263-1271 (1995) og Lee G –H, et al., Nature, 379:632-635 (1996). Leptin er kodet for av genet som blir rammet i fedmemutasjon (ob) (Zhang F et al., Nature, 387:206-209 (1997)). Den lange formen av leptinreseptoren er kodet for av genet som ble rammet i diabetesmutasjonen (db) (Taraglia L A, et al., Cell, 83:1263-1271 (1995)). Leptinreseptoren, som foreligger i flere isoformer, er nærmest beslektet med gp130 og LIFR-signaloverføringssubenhetene som blir aktivert av cytokiner slik som IL-6, LIF og CNTF og hormonreseptorer for veksthormon slik som erytropoietin. Se for eksempel Tertaglia L A, et al., ovenfor. Mangel på funksjonelt leptin eller dens reseptor forårsaker alvorlig fedme. Se for eksempel Zhang et al, ovenfor, Lee et al., ovenfor og Chen H et al., Cell, 84:491-495 (1996). Leptin er kjent for å virke på visse regioner i hjernen (for eksempel hypotalamus) for å regulere matinntak, energiomsetning og neuroendokrin funksjon, den har for eksempel blitt vist å være en nøkkelregulator av fettlagre, der leptinnivåer øker med økende fettlagre. Se for eksempel Zhang Y, et al., nature, 372:425-432 (1994), Halaas J L, et al., Science, 269:543-546 (1995), Campfield L A, et al., Science, 269:546-549 (1995) og Pellymounter M A, et al., Science, 269:540-543 (1995).

Leptin ble også funnet å være en angiogen faktor. Se for eksempel Sierra-Honingmann et al., ”Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor”, Science, 281:1683-1686 (1998) og Bouloumie et al., Circ. Res., 83:1059-1066 (1998). Fettvev vekst avhenger av neovaskularisering. Se for eksempel Rupnick et al., PNAS USA, 99(16):10730-10735 (2002). Leptin slipper også en rolle i immunitet. Se for eksempel La Cava og Matarese, ”The Weight of Leptin in Immunity”, Nature Reviews, 4:371-379 (2004). Andre leptinaktiviteter inkluderer å modulere reproduksjon, modulere hematopoiese, modulere glukosemetabolisme og modulere proinflammatoriske immunresponser. Se for eksempel Chelab et al., Nature Genetics, 12:318-320 (1996), Stroebel et al., Nature Genetics, 18:213-215 (1998), Clement et al., Nature, 392:398-401 (1998), Cioffi et al., Nature Medicine, 2:585-589 (1996), Gainsford et al., PNAS USA, 93:14564-14568 (1996), Kamohara et al., Nature, 389:374-377 (1997), Loffreda et al., FASEB J., 12:57-65 (1998) og Lord et al., Nature, 394:897-901 (1998).

ANGPTL4 er oppregulert i ob/ob (leptin knockout) og db/db (leptin reseptorknockout)-mus. Beskrivelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å modulere leptin og/eller leptinaktiviteter ved å administrere en effektiv mengde av en ANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist. Leptinnivåer kan bli undersøkt ved å benytte standardteknikker, for eksempel SDS-PAGE, immunblott osv.

ANGPTL4, ANGPTL4-agonister og/eller ANGPTL4-antagonister kan bli benyttet i behandlingen av sykdommer og forstyrrelser som er relatert til forstyrrelser av lipidhomeostase og metabolisme av fett som inkluderer, men som ikke er begrenset til for eksempel metabolske sykdommer slik som hjerteforstyrrelser, kardiovaskulære, endotele og angiogene forstyrrelser, dyslipidemi, hypertensjon, aterosklerose, arteriosklerose, koronar arteriesykdom (CAD), koronar hjertesykdom, hyperkolesterolemi, hjertesvikt, slag, diabetes, pankreas dysfunksjon, osteoartritt, gallesten, kreft, glaukom, fedme, i tillegg til relaterte forstyrrelser slik som adipositas, spiseforstyrrelser, tæringssyndromer (kakeksi), søvnapné og andre. Flere humane tilstander er for eksempel karakterisert ved distinkte lipidsammensetninger i vev, celler, membraner og ekstracellulære regioner eller strukturer. Ved aterosklerose, kolesterol (ikke-forestrede, forestrede og oksiderte former) og andre akkumulerer for eksempel lipider i celler og i ekstracellulære områder i arterieveggen og andre steder. Disse lipidene har potensielt skadelige, biologiske effekter, for eksempel ved å endre cellulær funksjon, inkludert genekspresjon og ved å gjøre innsiden av blodkarene trangere og hindre blodgjennomstrømningen. Regulering av lipidnivåer vil tilveiebringe utallige, vesentlige fortrinn. Effektene av administrering av ANGPTL4, agonist eller antagonist kan bli målt tilsvarende ved hjelp av en mengde analyser som er kjent på fagområdet, inkludert analyse av fettceller og vev, slik som fettansamlinger, total kroppsvekt, triglyseridnivåer i muskel, lever og fett, fastende og ikke-fastende nivåer av leptin og nivåer av frie fettsyrer og triglyserider i blodet. ANGPTL4-antagonister kan også bli benyttet til å inhibere migrasjon av pre-adipocytter ved å administrere en effektiv mengde av en ANGPTL4-antagonist.

I visse aspekter av oppfinnelsen er det ønskelig å kombinere ANGPTL4, ANGPTL4-agonisten eller ANGPTL4-antagonisten med andre terapeutiske regimer. ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonister kan bli kombinert med administreringen av andre faktorer, for eksempel slike som er beskrevet her. Slik som for antagonister kan ANGPTL4-antagonister bli kombinert med administrering av for eksempel terapeutiske midler for å behandle hyperlipidemi (og sykdommer som er assosiert med hyperlipidemi, for eksempel fedme, hyperkolesterolemi, aterosklerose, kardiovaskulær sykdom, diabetes mellitus, hypotyroidisme, Cushings syndrom), for eksempel inkludert niacin, kolestyramin, kolestipol, gemfibrozil, klofibrat, statiner, fluvastatin (Lescol), pravastatin, simvastatin, rosuvastinkalsium (ZD-4522), pitavastatin (NK104), premarin/pravakol (østrogen/pravastatin), ezetimbe/-simvastatin, spuerstatin, lipitor, CETi-1-vaksine, antistoffer mot CETP (kolesterolesteroverføringsprotein), BMS-201038 (et mikrosomalt triglyserid transportprotein), FM-VP4 (kolesteroltransportinhibitor), fyostanol, hypoglykemimidler, insulin, pramlintid, amylin, AC2993-syntetisk exendin-4, Xenical (orlistat), ciliær neutrofisk faktor, axokin, metformin-XT, merformin, glukovanc (metformin/glyburid), dexlipotam (R+/-alfa-lipoinsyre), PPAR-agonister, beta-3-adrenerge reseptoragonister, lipaseinhibitorer, ATL-962, leptin, anoreksimidler eller appetittundertrykkere, fentermin, meridia (silbutramin), Wellbutrin (buproion), prokyglem (diazoksid), tenuate (dietylpropion), Revia (naltrexon), Bontril (fendimetrazin), zoloft (sertralin), ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), axokine, CB1-cannabinoid reseptorantagonister, SR 141716, fytofarm, AOD9604, hGH 177-191, vekttapsmiddel og derivater derav (for eksempel salter, pegylerte versjoner osv.). Se også WO 96/04260 (forbindelser til behandlingen av Type-II diabetes), WO 94/01420, WO 95/17394, WO 97/36579, WO 97/25042, WO 99/08501, WO 99/19313 og WO 99/16758). Livsstilsendringer kan også bli kombinert med de terapeutiske midlene ifølge oppfinnelsen. De inkluderer for eksempel diett, trening, begrenset kolesterolinntak, røkingsbegrensning osv. Se også WO 91/19702 (hypoglykemimidler og hypokolesterolemimidler). I visse aspekter kan ANGPTL4-antagonister bli kombinert med for eksempel cytokiner og andre proinflammatoriske molekyler og flere vekstfaktorer som inhiberer adipogenese. Disse inkluderer for eksempel tumornekrosefaktor (TNF)- α, IL-1, PDGF, FGF, EGF; transformerende vekstfaktor (TGF)- α, - β, prediadipocyttfaktor-1 (pref-1) osv. Se for eksempel Gregoire et al., Physiological Reviews, 78(3):783-809 (1998).

Et ”vekttapsmiddel” refererer til et molekyl som er nyttig i behandling eller forebyggelse av fedme. Slike molekyler inkluderer for eksempel hormoner (katekolaminer, glukagon, ACTH og veksthormon kombinert med IGF-1, Ob-protein, klofibrat, halogenat, cinkokain, klorpromazin, appetittdempende legemidler som virker på noradrenerge neurotransmittere slik som mazindol og derivater av fenetylamin, for eksempel fenylpropanolamin, dietylpropion, fentermin, fendimetrazin, benzfetamin, amfetamin, metamfetamin og fenmetrazin, legemidler som virker på serotonin neurotransmittere slik som fenfluramin, tryptofan, 5-hydroksytryptofan, fluoksetin og sertralin, sentralaktive legemidler slik som naloxon, neuropeptid-Y, galanin, kortikotropinfrigjørende hormon og kolecystokinin, en kolinerg agonist slik som pyridostigmin, et sfingolipid slik som lysosfingolipid eller derivat derav, termogene legemidler slik som tyroidhormon, efedrin, βadrenerge agonister, legemidler som påvirker gastrointestinaltraktus slik som enzyminhibitorer, for eksempel tetrahydrolipostatin, ufordøyelig mat slik som sukkrosepolyester og inhibitorer av magetømming slik som treoklorsitronsyre eller dens derivater, β-adrenerge agonister slik som isoproterenol og yohimbin, aminofyllin for å øke de beta-adrenerglignende effektene av yohimbin, et α2-adrenerg blokkeringelegemiddel slik som klonidin alene eller i kombinasjon med et veksthormon frigjørende peptid, legemidler som påvirker tarmabsorpsjon slik som biguanider slik som metformin og fenformin, fyllstoffer slik som metylcellulose, metabolske blokkeringslegemidler slik som hydroksycitrat, progesteron, kolecystokininagonister, små molekyler som hermer ketosyrer, agonister mot kortokotropinsyrefrigjørende hormon, en ergot-beslektet prolaktininhiberende forbindelse for å redusere kroppsfettlagre (US patentskrift nr. 4 783 469, meddelt 8. november 1988), beta-3-agonister, bromkriptin, antagonister mot opioidpeptider, antagonister mot neuropeptid-Y, glukokortikoidreseptorantagonister, veksthormonagonister, kombinasjoner derav osv.

Andre anvendelser

ANGPTL4 ser også ut til å være en negativ regulator av inflammatorisk respons. I visse utførelsesformer av beskrivelsen kan ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonister bli benyttet til å inhibere immunresponsen, for eksempel i tilfellet med uønsket eller skadelig immunrespons, for eksempel i transplantatfrastøtning eller transplantat-versusvertssykdom. ANGPTL4-antagonister kan være nyttige for å stimulere immunsystemet. Stimulering av immunsystemet vil for eksempel være ønskelig i leukemi, andre krefttyper, immunkompromitterte pasienter (for eksempel AIDS-pasienter osv.).

ANGPTL4 er også implisert i kreft. ANGPTL4 forårsaker, når den blir uttrykt i tumorceller, celleproliferasjon in vitro og in vivo (se foreløpig søknad 60/589 782 og WO 2006/014729). Når ANGPTL4 blir uttrykt inn i tumorer som blir behandlet med antiangiogenesefaktor, for eksempel anti-VEGF-antistoff, opprettholder tumoren fremdeles evnen til å vokse. Den har blitt vist å være oppregulert i nyrekreftformer. Se for eksempel attorney docket nummer P5032R1, WO 02/07941 og Le Jan et al., American Journal of Pathology, 162(5):1521-1528 (2003). I tillegg er ANGPTL4 en proangiogen faktor (se for eksempel S. Le Jan et al., Am. J. Pathol., 162(5):1521-1528 (2003)) som er mål for kreftterapi og er en apoptoseoverlevelsesfaktor for endotelceller (se for eksempel Kim et al., Biochem K., 346:603-610 (2000)). Slik som for VEGF (Shweiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:768-772 (1995), blir ANGPTL4-ekspresjon økt som respons på hypoksi. Se for eksempel Le Jan et al., American Journal of Pathology, 162(5):1521-1528 (2003). Forskere har rapportert sammenhenger mellom angiogenese og adipogenese eller fettvevsvekst. Se for eksempel Sierrea-Honigmann et al., ”Biological Action of Leptin as an Aniogenic Factor”, Science, 281:1683-1686 (1998), Rupnick et al., “Adipose tissue mass can be regulated through the vasculature”, Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 99(16):10730-10735 (2002), Kolonin et al., ”Reversal of obesity by targeted ablation of adipose tissue”, Nature Medicine Advance Online publication, 9. mai, 2004: 1-8 og Fukumura et la., “Paracrine Regulation of Agniogenesis and Adipocyte Differentiation During In Vivo Adipogenesis”, Circ. Res., 93:e88-e97 (2003).

ANGPTL4 kan også bli benyttet i diagnostiske analyser. Mange ulike analyser og analysemåter kan bli benyttet for å påvise mengden av ANGPTL4 i en prøve relativt i forhold til en kontrollprøve. Disse formatene er i sin tur nyttige i de diagnostiske analysene ifølge beskrivelsen som blir benyttet for å påvise tilstedeværelsen eller fremkomsten av forstyrrelser som er beskrevet her hos et individ.

Enhver prosedyre som er kjent på fagområdet for å måle løselige analytter kan bli benyttet i utøvelsen av foreliggende beskrivelse. Slike prosedyrer inkluderer kompetitive og ikke-kompetitive analysesystemer ved å benytte teknikker slik som radioimmunanalyse, enzymimmunanalyse (EIA), for eksempel ELISA ”sandwich” immunanalyser, presipiteringsreaksjoner, geldiffusjonsreaksjoner, immundiffusjonsanalyse, agglutineringsanalyser, komplementfikseringsanalyser, immunradiometriske analyser, fluorescensimmunanalyser, protein-A-immunanalyser og immunelektroforeseanalyser. Se for eksempel US patentskrift nr. 4 845 026 og 5 006 459.

Transgene knockout dyr av ANGPTL4

Nukleinsyrer som koder for ANGPTL4 eller dens modifiserte former kan også bli benyttet for å generere enten transgene dyr eller ”knockout dyr” som i sin tur er nyttige i utviklingen av og screeningen av terapeutisk nyttige reagenser. Et transgent dyr (for eksempel en mus eller rotte) er et dyr som har celler som inneholder et transgen, der dette transgene blir introdusert inn i dyret eller en forløper for dyret på et fosterstadium, for eksempel et embryonalt stadium. Et transgen er et DNA som er integrert inn i genomet til en celle fra hvilket et transgent dyr utvikles. Beskrivelsen tilveiebringer cDNA som koder for en ANGPTL4 som kan bli benyttet for å klone genomisk DNA som koder for en ANGPTL4 i overensstemmelse med etablerte teknikker og de genomiske sekvensene som blir benyttet for å generere transgene dyr som inneholder celler som uttrykker DNA som koder for ANGPTL4.

Enhver teknikk som er kjent på fagområdet kan bli benyttet for å introdusere et målgentransgen inn i dyr for å fremstille opphavslinjene av transgene dyr. Slike teknikker inkluderer pronukleær mikroinjeksjon (US patentskrift nr. 4 873 191, 4 736 866 og

4 870 009), retrovirusmediert genoverføring inn i kjønnslinjer (Van der Putten et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 82:6148-6152 (1985)), genstyring i embryonale stamceller (Thompson et al., Cell, 56:313-321 (1989)), ikke-spesifikk insersjonsinaktivering ved å benytte en genfellevektor (US patentskrift nr. 6 436 707), elektroporering av embryoer (Lo, Mol. Cell. Biol., 3:1803-1814 (1983)) og spermamediert genoverføring (Lavitrano et al., Cell, 57:717-723 (1989)) osv.

Typisk vil spesielle celler være målsøkt for ANGPTL4-transgen inkorporering med vevsspesifikke enhancere. Transgene dyr som inkluderer en kopi av et transgen som koder for en ANGPTL4 som er introdusert inn i kjønnslinjen til dyret på et embryonalt stadium kan også bli benyttet for å undersøke effekten av økt ekspresjon av DNA som koder for ANGPTL4-polypeptidet. Slike dyr kan bli benyttet som testdyr for reagenser som er antatt å overføre beskyttelse for, for eksempel patologiske tilstander som er assosiert med dens overekspresjon. I overensstemmelse med denne delen av beskrivelsen blir et dyr behandlet med reagenset og en redusert forekomst av den patologiske tilstanden sammenlignet med ubehandlede dyr som bærer transgenet vil indikere en potensiell, terapeutisk intervensjon for den patologiske tilstanden.

Alternativt kan ikke-humane homologer av ANGPTL4 bli benyttet for å konstruere et ANGPTL4-”knockout dyr” som har et ødelagt eller endret gen som koder for et ANGPTL4-protein som et resultat av homolog rekombinasjon mellom det endogene genet som koder for ANGPTL4 og endret genomisk DNA som koder for ANGPTL4 som er introdusert inn i en embryonal stamcelle hos dyret. I visse utførelsesformer er knockout dyret et pattedyret, for eksempel en gnager slik som rotte eller mus. cDNA som koder for en ANGPTL4 kan for eksempel bli benyttet til å klone genomisk DNA som koder for en ANGPTL4 i overensstemmelse med etablerte teknikker. En del av det genomiske DNA som koder for ANGPTL4 kan bli fjernet eller erstattet med et annet gen, slik som et gen som koder for en selekterbar markør som kan bli benyttet til å overvåke integrasjon. Typisk blir flere kilobaser med uendret flankerende DNA (både på 5’ ende og 3’ ende) inkludert i vektoren (se for eksempel Thomas og Capecchi, Cell, 51:503 (1987) for en beskrivelse av homologe rekombinasjonsvektorer).

Vektoren blir introdusert inn i en embryonal stamcellelinje (for eksempel ved elektroporering) og celler der det introduserte DNA homologt har rekombinert med det endogene DNA bli valgt (se for eksempel Li et al., Cell, 69:915 (1992)). De valgte cellene er deretter injisert inn i en blastocyst hos et dyr (for eksempel en mus eller rotte) for å danne aggregeringskimærer (se for eksempel Bradley i Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, red. (IRL, Oxford, 1987), s. 113-152). Et kimært embryo kan deretter bli implantert inn i et passende pseudogravid fosterhunndyr og embryo frembrakt for å danne et ”knockout dyr”. Avkom som bærer det homologt rekombinerte DNA i deres kjønnsceller kan bli identifisert ved hjelp av standard teknikker og benyttet for å ale opp de i alle cellene til dyret inneholder det homologt rekombinerte DNA. Knockout dyr kan bli karakterisert for eksempel for deres evne til å beskytte seg mot visse patologiske tilstander og for deres utvikling av patologiske tilstander som skyldes fravær av genet som koder for ANGPTL4.

I tillegg kan knockout mus være svært informative i oppdagelsen av genfusjon og farmasøytisk anvendelse for et legemiddel som er målsøkt, i tillegg til i bestemmelsen av de potensielle bivirkninger som assosiert med et gitt mål. Genfunksjon og fysiologi er så godt konservert mellom mus og mennesker, siden de begge er pattedyr og inneholder et tilsvarende antall gener, som er svært konserverte mellom artene. Det har nylig blitt veldokumentert at for eksempel 98% av genene på musekromosom 16 har en human ortolog (Mural et al., Science, 296:1661-71 (2002)).

Selv om genmålsøking i embryonale stam (ES)-celler har muliggjort konstruksjon av mus med null mutasjoner i mange gener som er assosiert med human sykdom, hvor ikke alle genetiske sykdommer gjør det mulig å tilskrive nullmutasjoner. Man kan designe verdifulle musemodeller for humane sykdommer ved å etablere en fremgangsmåte for generstatning (knock-in) som vil ødelegge musens lokus og introdusere en human motpart med mutasjon, og deretter kan man utføre in vivo-legemiddelundersøkelser som målsøker det humane protein (Kitamoto et al., Al, Biochemical and Biophysical Res. Commun., 222:742-47 (1996)).

Anvendelse av transgene dyr

Også beskrevet er fremgangsmåter for å screene forbindelser for å identifisere de som hermer ANGPTL4 (agonister) eller hindrer effekten av ANGPTL4 (antagonister).

Agonister som hermer en ANGPTL4 vil være spesielt verdifull terapeutisk i de induserbare aktivitetene til ANGPTL4, for eksempel som beskrevet her, og i de tilfellene der en negativ fenotype blir observert basert på funnene med det ikke-humane, transgene dyret hvis genom omfatter en ødeleggelse av genet som koder for ANGPTL4. Antagonister som hindrer effekten av en ANGPTL4 vil være spesielt verdifulle terapeutisk i å forhindre ANGPTL4-aktiviteter, for eksempel som beskrevet her, og i de tilfellene der en positiv fenotype er observert, basert på observasjoner med det ikke-humane, transgene knockout dyret. Screeningsanalyser for antagonist legemiddelkandidater er designet for å identifisere forbindelser som binder eller lager kompleks med ANGPTL4 som er kodet for av genene som er identifisert her, eller som på annen måte påvirker interaksjonen av det kodede polypeptidet med andre cellulære proteiner, for eksempel en ANGPTL4-reseptor (for eksempel αv β5), lipolipaseprotein osv.

Effekten av en antagonist på en ANGPTL4 kan for eksempel bli undersøkt for å administrere en ANGPTL4-antagonist til en villtype mus for å herme en kjent knockout fenotype. Slik vil man i første omgang slå ut ANGPTL4-genet av interesse og observere den resulterende fenotypen som en konsekvens av å slå ut eller forstyrre ANGPTL4-genet.

Deretter kan man undersøke effektiviteten av en antagonist på ANGPTL4 ved å administrere en antagonist mot ANGPTL4 til en villtype mus. En effektiv antagonist vil bli forventet å herme den fenotypiske effekten som opprinnelig blir observert i knockout dyret.

Likeledes kan man undersøke effekten av en agonist for en ANGPTL4 ved å administrere en ANGPTL4-agonist til en ikke-human, transgen mus for å lindre en kjent, negativ knockout fenotype. Slik vil man i første omgang slå ut ANGPTL4-genet av interesse og observere den resulterende fenotypen som en konsekvens av å slå ut eller forstyrrelse ANGPTL4-genet. Deretter kan man undersøke effektiviteten av en agonist for ANGPTL4 ved å administrere en agonist for ANGPTL4 til en ikke-human, transgen mus. En effektiv agonist vil være forventet å lindre den negative, fenotypiske effekten som opprinnelig ble observert i knockoutdyret.

I en annen analyse for antagonister vil pattedyrceller eller membranpreparater som uttrykker reseptoren bli inkubert med en merket ANGPTL4 i nærvær av kandidatforbindelsen. Evnen til forbindelsen til å forsterke eller å blokkere reaksjonen kan deretter bli målt.

Antistoffer

Antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer anti-ANGPTL4-antistoffer eller antigenbindingsfragmenter av ANGPTL4, anti- αv β5-antistoffer eller andre antistoffer som er beskrevet her. Eksempler på antistoffer inkluderer for eksempel polyklonale, monoklonale og humaniserte antistoffer, fragmentantistoffer, multispesifikke antistoffer, heterokonjugatantistoffer, multivalente antistoffer, effektofunksjonsantistoffer osv.

Antistoffer kan være agonister eller antagonister.

Polyklonale antistoffer

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan omfatte polyklonale antistoffer. Fremgangsmåter for å fremstille polyklonale antistoffer er kjent for fagfolk på området. Polyklonale antistoffer mot ANGPTL4 blir for eksempel frembrakt i dyr ved hjelp av en eller flere subkutane (sc) eller intraperitoneale (ip) injeksjoner av det relevante antigenet og en adjuvans. Det kan være nyttig å konjugere det relevante antigenet til protein som er immungent i arten som skal være immunisert, for eksempel keyhole limpet hemocyanin, serumalbumin, bovint tyroglobulin eller soyabønnetrypsininhibitor ved å benytte et bifunksjonelt eller derivatiserende middel, for eksempel maleimidobenzoylsulfosuksinimidester (konjugering via cysteinrester), N-hydroksysuksinimid (via lysinrester), glutaraldehyd, suksinanhydrid, SOCl2 eller R<1>N=C=NR, der R og R<1>er ulike alkylgrupper.

De blir immunisert mot ANGPTL4, immunogene konjugater eller derivater ved å kombinere for eksempel 100 μg eller 5 μg av proteinet eller konjgatet (for henholdsvis kaniner eller mus) med 3 volumer med Freunds komplette adjuvans og injisere løsningen intradermalt flere steder. En måned senere blir dyrene boostet med 1/5 til 1/10 av den opprinnelige mengden av peptidet eller konjugatet i Freunds komplette adjuvans ved subkutan injeksjon på flere steder. 7 til 14 dager senere blir dyrene tapper og serumet blir analysert for antistofftiter. De blir boostet inntil titret når et platå. Dyret blir typisk boostet med konjugatet av det samme antigenet, men konjugert til et annet protein og/eller via et ulikt kryssbindingsmiddel. Konjugater kan også bli fremstilt i rekombinant cellekultur som proteinfusjoner. Aggregerende midler slik som alum er også passende benyttet for å forsterke immunresponsen.

Monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer kan bli fremstilt ved å benytte hybridomfremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), eller de kan bli fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter (US patentskrift nr. 4 816 567).

I hybridomfremgangsmåten blir en mus eller annet passende vertsdyr, slik som en hamster eller makakape, immunisert som beskrevet ovenfor for å utløse lymfocytter som produserer eller som er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt vil binde til proteinet som er benyttet til immunisering. Alternativt kan lymfocytter bli immunisert in vitro.

Lymfocytter blir deretter fusjonert med myelomceller ved å benytte et passende fusjoneringsmiddel, slik som polyetylenglykol, for å danne en hybridomcelle (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Hybridomcellene som slik blir fremstilt blir sådd ut og dyrket i et passende kulturmedium som typisk inneholder et eller flere stoffer som inhiberer veksten eller overlevelsen for de ufusjonerte, mormyelomcellene. Hvis mormyelomcellene for eksempel mangler enzymet hypoxantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), vil kulturmediet for hybridomet typisk inkludere hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium) som forhindrer veksten for HGPRT-manglende celler.

Typiske myelomceller er de som fusjonerer effektivt, som støtter stabil høynivåproduksjon av antistoff fra de valgte antistoffproduserende cellene og som er sensitive ovenfor et medium slik som HAT-medium. Blant disse foretrukne myelomcellelinjene er murine myelomlinjer, slik som de som er avledet fra MOPC-21- og MPC-11-musetumorer som er tilgjengelige fra the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, og SP-2 eller X63-Ag8-653-celler som er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Humane myelomcellelinjer og muse-humane heteromyelomcellelinjer er også blitt beskrevet for fremstillingen av humane, monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Kulturmedium der hybridomceller vokser blir analysert for produksjon av monoklonale antistoffer som er rettet mot ANGPTL4. Bindingsspesifisiteten til monoklonale antistoffer som blir produsert av hybridomcellene kan bli bestemt ved hjelp av immunpresipitering eller ved hjelp av en in vitro-bindingsanalyser, slik som radioimmunoanalyse (RIA) eller enzymbundet immunabsorbent analyse (ELISA). Slike teknikker og analyser er kjent på fagområdet. Bindingsaffiniteten til det monoklonale antistoffer kan for eksempel bli bestemt ved hjelp av Scatchard-analysis til Munson og Pollard i Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Etter at hybridomceller er identifisert som produserer antistoffer med den ønskede spesifisiteten, affiniteten og/eller aktiviteten kan klonene bli subklonet ved hjelp av begrensningsfortynningsprosedyrer og dyrket ved standard fremgangsmåter (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Prectice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Passende kulturmedium til dette formålet inkluderer for eksempel D-MEM eller RPMI-1640-medium. I tillegg kan hybridomcellene bli dyrket in vivo som ascitestumorer i et dyr.

De monoklonale antistoffene som blir utskilt av subklonene blir hensiktsmessig separert fra kulturmediet, ascitesvæsken eller serumet ved hjelp av konvensjonelle immunglobulin renseprosedyrer slik som for eksempel Protein-A-sefarose, hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.

De monoklonale antistoffene kan også bli fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter, slik som de som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 816 567. DNA som koder for de monoklonale antistoffene er enkelt isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer, for eksempel ved å benytte oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for de tunge og lette kjedene for de monoklonale antistoffene). Hybridomcellene virker som en kilde for slikt DNA. Med en gang det er isolert kan DNA bli plassert i ekspresjonsvektorer og som deretter blir transfektert inn i vertsceller slik som E. coli-celler, ape-COS-celler, kinesiske hamsterovarie (CHO)-celler eller myelomceller som ellers ikke produserer immunglobulinprotein, for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Rekombinant produksjon av antistoffer vil bli beskrevet i mer detalj nedenfor.

I en annen utførelsesform kan antistoffer eller antistoff-fragmenter bli isolert fra antistoff bakteriofagbiblioteker som er generert ved å benytte teknikkene som er beskrevet i McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 3523:624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) beskriver isoleringen av murine og humane antistoffer, ved å benytte bakteriofagbiblioteker. Påfølgende publikasjon beskriver produksjon av humane høyaffinitets antistoffer (nM-område) ved hjelp av kjedeombytting (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)) i tillegg til kombinatorisk infeksjon og in vivo-rekombinasjon som en strategi for å konstruere svært store bakteriofagbiblioteker (Waterhouse et al., Nuc. Acid. Res., 21:2265-2266 (1993)). Slik er disse teknikkene levedyktige alternativer til tradisjonelle monoklonale antistoffhybridomteknikker for å isolere monoklonale antistoffer.

DNA kan også bli modifisert, for eksempel ved å substituere den kodende sekvensen for humane tungkjede- og lettkjede konstantdomener i stedet for de homologe, murine sekvensene (US patentskrift nr. 4 816 567, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), eller ved å kovalent binde den immunglobulinkodende sekvensen til hele eller deler av den kodende sekvensen for et ikke-immunglobulinpolypeptid.

Typisk er slike ikke-immunglobulinpolypeptider substituert med konstantdomene til et antistoff, eller de er substituert med variabeldomenet til et antigenkombinerende sete fra et antistoff for å danne et kimært, bivalent antistoff som omfatter et antigenkombinerende sete som har spesifisitet for et antigen og et annet antigenkombinerende sete som har spesifisitet for et annet antigen.

Humaniserte og humane antistoffer

Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan omfatte humaniserte antistoffer eller humane antistoffer. Et humanisert antistoff har en eller flere aminosyrerester introdusert inn i seg fra en kilde som er ikke-human. Disse ikke-humane aminosyrerestene blir ofte referert til som ”importrester”, som typisk er tatt fra et ”importvariabeldomene”. Humanisering kan essensielt bli utført ved å følge fremgangsmåten til Winter og samarbeidspartnere (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), ved å substituere gnager-CDRer eller CDR-sekvenser for de tilsvarende sekvensene fra et humant antistoff. Slike ”humaniserte” antistoffer er dermed kimære antistoffer (US patentskrift nr. 4 816 567) der vesentlig mindre enn et intakt humant variabeldomene har blitt substituert med den tilsvarende sekvensen fra en ikke-human art. I praksis er humaniserte antistoffer typisk humane antistoffer der noen CDR-rester og muligens noen FR-rester er substituert med rester fra analoge steder i gnagerantistoffer.

Valget av humane variabeldomener, både lette og tunge, som skal bli benyttet for å fremstille de humaniserte antistoffene er svært viktig for redusere antigenisitet. Ifølge den såkalte ”best-fit”-fremgangsmåten, blir sekvensen til variabeldomenet til et gnagerantistoff screenet mot hele biblioteket av kjente humane variabeldomenesekvenser. Den humane sekvensen som ligger nærmest gnagersekvensen blir deretter akseptert som det humane rammeverket (FR) for det humaniserte antistoffet (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993), Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). En annen fremgangsmåte benytter et spesielt rammeverk som er avledet fra konsensussekvensen til alle humane antistoffer av en spesiell undergruppe av lettkjeder eller tungkjeder. Det samme rammeverket kan bli benyttet til flere ulike humaniserte antistoffer (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992), Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Det er videre viktig at antistoffer blir humanisert med tilbakeholdelse av høyaffinitet for antigenet og andre fordelaktige, biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet, ifølge en typisk fremgangsmåte, så blir humaniserte antistoffer fremstilt ved hjelp av en prosess for analyse av morsekvensen og ulike konseptmessige humaniserte produkter ved å benytte tredimensjonale modeller for morsekvensene og de humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er allment tilgjengelige og er kjent for fagfolk på området. Dataprogrammer er tilgjengelige og illustrerer og oppviser mulige tredimensjonale konformasjonsstrukturer for valgte kandidatimmunglobulinsekvenser.

Inspeksjon av disse oppvisningene tillater analyse av den sannsynlige rollen for restene i virkningen til kandidatimmunglobulinsekvensen, dvs. analysen av rester som påvirker evnen for kandidatimmunglobulinet i å binde sitt antigen. På denne måten kan FR-rester bli valgt og kombinert fra mottaker- og importsekvensen slik at de ønskede antistoffkjennetegnene, slik som økt affinitet for målantigenet/-antigenene blir oppnådd. Generelt er CDR-restene direkte og mest vesentlig involvert i å påvirke antigenbinding.

Alternativt er det nå mulig å produsere transgene dyr (for eksempel mus) som er i stand til, ved immunisering, å produsere et fult repertoar av humane antistoffer i fravær av endogen immunglobulinproduksjon. Det har for eksempel blitt beskrevet at den homozygote delesjonen av det antistofftungkjedesammenbindende region (JH)-genet i kimære og kjønnslinjemutante mus fører til fullstendig inhibering av endogen antistoffproduksjon. Overføring av den humane kjønnslinjeimmunglobulingensamlingen til slike kjønnslinjemutante mus vil føre til produksjon av humane antistoffer etter antigenutfordring. Se for eksempel Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993), Bruggermann et al., Year in Immuno, 7:33 (1993) og Duchosal et al., Nature, 355:258 (1992). Humane antistoffer kan også bli avledet fra phage-display-biblioteker (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:281 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), Vaughan et al., Nature Biotech, 14:309 (1996)).

Humane antistoffer kan også bli fremstilt ved å benytte ulike teknikker som er kjent på fagområdet, inkludert phage-display-biblioteker (Hoogenboom og Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991), Marsk et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Ifølge denne teknikken blir antistoff-V-domenegener klonet i ramme inn i enten et hovedkappeproteingen eller mindre kappeproteingen for en filamentøs bakteriofag, slik som M13 eller fd, og oppvist som funksjonelle antistoff-fragmenter på overflaten av fagpartikkelen. Fordi den filamentøse partikkelen inneholder en enkelttrådet DNA-kopi av faggenomet, fører seleksjonen som er basert på de funksjonelle egenskapene til antistoffet også til seleksjon av genet som koder for antistoffet som oppviser disse egenskapene. Slik hermer fagen noen av egenskapene til B-cellen. Phage-display kan bli utført i en mengde formater, i henhold til for eksempel Johnson, K.S. og Chiswell, D.J., Curr. Opin in Struct Biol., 3:564-571 (1993). Flere kilder for V-gensegmenter kan bli benyttet til phage-display. For eksempel isolerte Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) et stort utvalg med anti-oksazolonantistoffer fra et lite, tilfeldig kombinatorisk bibliotek fra V-gener som er avledet fra milter fra immuniserte mus. Et repertoar av V-gener fra ikke-immuniserte humane donorer kan bli konstruert og antistoffer mot et bredt utvalg antigener (inkluder selv-antigener) kan bli isolert, for eksempel ved essensielt å følge en teknikk som er beskrevet av Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) eller Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993). Se også US patentskrift nr. 5 565 332 og 5 573 905. Teknikkene til Cole et al. og Boerner et al., er også tilgjengelige for fremstillingen av humane monoklonale antistoffer (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77 (1985) og Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). Humane antistoffer kan også bli generert ved hjelp av in vitro-aktiverte B-celler (se US patentskrift nr. 5 567 610 og 5 229 275).

Antistoff-fragmenter

Antistoff-fragmenter er også inkludert i oppfinnelsen. Ulike teknikker har blitt utviklet for fremstillingen av antistoff-fragmenter. Tradisjonelt ble disse fragmentene avledet via proteolytisk fordøying av intakte antistoffer (se for eksempel Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992) og Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Disse fragmentene kan likevel nå bli fremstilt direkte ved hjelp av rekombinante vertsceller. Antistoff-fragmentene kan for eksempel bli isolert fra antistoff bakteriofagbibliotekene som er beskrevet ovenfor. Alternativt kan Fab’-SH-fragmenter bli direkte gjenvunnet fra E. coli og kjemisk koblet for å danne F(ab’)2-fragmenter (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Ifølge en annen tilnærming kan F(ab’)2-fragmenter bli isolert direkte fra rekombinant vertscellekultur. Andre teknikker for fremstillingen av antistoff-fragmenter vil være åpenbare for fagfolk på området. I andre utførelsesformer er antistoffet som er valgt et enkeltkjede-Fv-fragment (scFv). Se WP 93/16185, US patentskrift nr. 5 571 894 og US patentskrift nr. 5 587 458. Fv og sFv er de eneste enhetene med intakte kombinerende seter som mangler konstantregioner, og slik er det passende for redusert ikke-spesifikk binding i løpet av anvendelse in vivo. SFvfusjonsproteiner kan bli konstruert for å gi fusjon av et effektorprotein på enten aminoterminalen eller karboksyterminalen på en sFv. Se Antibody Engineering, red., Borrebaeck, ovenfor. Antistoff-fragmentet kan også være et ”lineært antistoff”, for eksempel som beskrevet i US patentskrift nr. 5 641 870. Slike lineære antistoff-fragmenter kan være monospesifikke eller bispesifikke.

Multispesifikke antistoffer (for eksempel bispesifikke)

Antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer også for eksempel multispesifikke antistoffer som har bindingsspesifisiteter på minst to ulike antigener. Mens slike molekyler normalt kun vil binde to antigener (dvs. bispesifikke antistoffer, BsAbs), så var antistoffet med ytterligere spesifisiteter slik som trispesifikke antistoffer omfattet av dette uttrykket når det ble benyttet her. Eksempler på BsAber inkluderer de som har en arm rettet mot et celleantigen og den andre armen rettet mot et cytotoksisk utløsermolekyl slik som anti-Fc γRI/anti-CD25, anti-p185<HER2>/Fc γRIII (CD16), anti-CD3/anti-malign B-celle (1D10), anti-CD2/anti-p185<HER2>, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-nyrecellekarsinom, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-kolonkarsinom), anti-CD3/anti-melanocyttstimulerende hormonanalog, anti-EGF-reseptor/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, antiCD3/MoV18, anti-neural celleadhesjonsmolekyl (NCAM)/anti-CD3, antifolatbindingsprotein (FBP)/anti-CD3, anti-pankarsinomassosiert antigen (AMOC-31)/anti-CD3, BsAber med en arm som binder spesifikt til et antigen på en celle og en arm som binder til et toksin slik som anti-saporin/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporin, anti-CD7/antisaporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-CEA/anti-ricin-A-kjede, anti-interferon- α(IFN- α)/antihybridomidiotype, anti-CEA/anti-vinkaalkaloid, BsAber for å konvertere enzymaktiverte prolegemidler slik som anti-CD30/anti-alkalifosfatase (som katalyserer konverteringen av mitomycinfosfatprolegemiddel til mitomycinalkohol), BsAber som kan bli benyttet som fibrinolytiske midler slik som anti-fibrin/anti-vevsplasminogenaktivator (tPA), antifibrin/anti-urokinasetypeplasminogenaktivator (uPA), BsAber for å styre immunkomplekser til celleoverflatereseptor slik som anti-lavtetthetslipoprotein (LDL)/anti-Fc-reseptorer (for eksempel Fc γRI, Fc γRII eller Fc γRIII), BsAber for anvendelse i terapi av smittsomme sykdommer slik som anti-CD3/anti-herpes simpleks virus (HSV), anti-T-cellereseptor/CD3-kompleks/anti-influensa, anti- Fc γR/anti-HIV, BsAber for tumorpåvisning in vitro eller in vivo slik som anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185<HER2>/anti-hapten, BsAber som vaksineadjuvanser og BsAber som diagnostiske redskaper slik som anti-kanin-IgG/antiferritin, anti-pepperrotperoksidase (HRP)/anti-hormon, anti-somatostatin/anti-substans-P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti- β-galaktosidase. Eksempler på trispesifikke antistoffer inkluderer anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 og anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Bispesifikke antistoffer kan bli fremstilt som fullengde antistoffer eller antistoff-fragmenter (for eksempel F(ab’)2-bispesifikke antistoffer).

Fremgangsmåter for å fremstille bispesifikke antistoffer er kjent på fagområdet. Tradisjonell fremstilling av bispesifikke fullengdeantistoffer er basert på den samtidige ekspresjon av to immunglobulintungkjede-lettkjede par, der de to kjedene har ulike spesifisiteter (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). På grunn av den tilfeldige blandingen av immunglobulin tungkjeder og immunglobulin lettkjeder produserer disse hybridomene (kvadromer) en potensiell blanding av 10 ulike antistoffmolekyler, der kun et har den korrekte, bispesifikke strukturen. Rensing av det korrekte molekylet, som vanligvis blir utført ved hjelp av aktivitetskromatografitrinn, er heller arbeidskrevende og produktutbyttene er lave. Lignende prosedyrer er tilkjennegjort i WO 93/08829 og i Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991).

Ifølge en annen tilnærming blir antistoff variabeldomener med de ønskede bindingsspesifisitene (antistoff-antigenkombinerende seter) fusjonert til immunglobulin konstantdomenesekvenser. Fusjonen er fortrinnsvis med et immunglobulin tungkjede konstantdomene, som omfatter minst én del av hengselregion, CH2- og CH3-region. Det er foretrukket at den første tungkjede konstantregionen (CH1) inneholder setet som er nødvendig for lettkjedebinding, tilstede på minst én av fusjonene. DNA som koder for immunglobulin tungkjedefusjonene og, hvis ønskelig, immunglobulin lettkjeden, blir innsatt i separate ekspresjonsvektorer og blir kotransfektert inn i en passende vertsorganisme. Dette gir stor fleksibilitet i justering av de felles proporsjonene for de tre polypeptidfragmentene i utførelsesformer der ulike forhold mellom de tre polypeptidkjedene som blir benyttet i konstruksjonen gir de optimale utbyttene. Det er likevel mulig å sette inn de kodende sekvensene for to eller alle tre polypeptidkjedene i en ekspresjonsvektor når ekspresjonen av minst to polypeptidkjeder i like forhold fører til høye utbytter eller når forholdene ikke spiller noen rolle.

I én utførelsesform av denne tilnærmingen er de bispesifikke antistoffene sammensatt av en hybrid immunglobulin-tungkjede med en første bindingsspesifisitet på en arm og et hybrid immunglobulintungkjede-lettkjedepar (som tilveiebringer en annen bindingsspesifisitet) på den andre armen. Det ble funnet at denne asymmetriske strukturen fremmer separasjonen av den ønskede bispesifikke forbindelsen fra uønskede immunglobulinkjedekombinasjoner, siden tilstedeværelsen av en immunglobulin lettkjede i kun halvparten av det bispesifikke molekylet tilveiebringer en god måte for separasjon. Denne tilnærmingen er tilkjennegjort i WO 94/04690. For ytterligere detaljer som gjelder å fremstille bispesifikke antistoffer, se for eksempel Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Ifølge en annen tilnærming som er beskrevet i WO 96/27011 kan grenseflaten mellom et par av antistoffmolekyler bli endret slik at man maksimerer prosentandelen av heterodimerer som er gjenvunnet fra rekombinant cellekultur. Den foretrukne grenseflaten omfatter minst én del av CH3-domenet fra et antistoff konstantdomene. I denne fremgangsmåten blir en eller flere små aminosyrerestkjeder fra grenseflaten for det første antistoffmolekylet erstattet med større sidekjeder (for eksempel tyrosin eller tryptofan). Kompensatoriske ”hulrom” av identisk eller tilsvarende størrelse med de store sidekjedene bli dannet på grenseflaten for det andre antistoffmolekylet ved å erstatte store aminosyrerestkjeder med mindre (for eksempel alanin eller treonin). Dette gir en mekanisme for å øke utbyttet av heterodimeren i forhold til uønskede endeprodukter slik som homodimerer.

Teknikker for å generere bispesifikke antistoffer fra antistoff-fragmenter er også blitt beskrevet i litteraturen. De spesifikke antistoffer kan for eksempel bli fremstilt ved å benytte kjemisk binding. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) beskriver en prosedyre der intakte antistoffer blir proteolytisk kløyvd for å generere F(ab’)2-fragmenter. Disse fragmentene blir redusert i nærvær av ditiolkompleksmiddelet natriumarsenitt for å stabilisere nærliggende ditioler og forhindre intermolekylær disulfiddannelse. Fab’-fragmentene som blir generert blir deretter konvertert til tionitrobenzoat (TNB)-derivater. Et av Fab’-TNB-derivatene blir deretter konvertert tilbake til Fab’-tiolen ved reduksjon med merkaptoetylamin og blir blandet med en lik molar mengde av det andre Fab’-TNB-derivatet for å danne det bispesifikke antistoffet. De bispesifikke antistoffene som blir fremstilt kan bli benyttet som midler for den selektive immobiliseringen av enzymer.

Nyere fremskritt har fremmet den direkte gjenvinningen av Fab’-SH-fragmenter fra E. coli, som kjemisk kan bli koblet for å danne bispesifikke antistoffer. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992), beskriver fremstillingen av et fult, humanisert, bispesifikt antistoff-F(ab’)2-molekyl. Hvert Fab’-fragment ble separat utskilt fra E. coli og utsatt for direkte kjemisk kobling in vitro for å danne det bispesifikke antistoffet. Det bispesifikke antistoffet som ble dannet på denne måten var i stand til å binde til celler som overuttrykker VEGF-reseptoren og normale, humane T-celler, i tillegg til å utløse den lytiske aktiviteten til humane, cytotoksiske lymfocytter mot humane brysttumormål.

Ulike teknikker for å fremstille og isolere bispesifikke antistoff-fragmenter direkte fra rekombinant cellekultur har også blitt beskrevet. Bispesifikke antistoffer har for eksempel blitt fremstilt ved å benytte leucinzippere. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Leucinzipperpeptidene fra Fos- og Jun-proteinene ble bundet til Fab’-delene av to ulike antistoffer ved hjelp av genfusjon. Antistoffhomodimerer ble redusert på hengselregionen for å danne monomerer og deretter oksidert på nytt for å danne antistoffheterodimerer. Denne fremgangsmåten kan også bli benyttet for å produsere antistoffhomodimerer. ”Diastoffteknologien” beskrevet av Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) har tilveiebrakt en alternativ mekanisme for å fremstille bispesifikke antistoff-fragmenter. Fragmentene omfatter et tungkjedevariabeldomene (VH) bundet til et lettkjedevariabeldomene (VL) ved hjelp av en linker som er for kort til å tillate paring mellom de to domenene på den samme kjeden. Dermed blir VH- og VL-domenen på et fragment tvunget til å pare med de komplementære VL- og VH-domenene på et annet fragment, og danner derved to antigenbindingsseter. En annen strategi for fremstille bispesifikke antistoff-fragmenter ved å benytte enkeltkjede-Fv (sFv)-dimerer har også blitt rapportert. Se (Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Antistoffene med mer enn to valenser er omfattet. For eksempel kan trispesifikke antistoffer bli fremstilt. Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991).

Heterokonjugatantistoffer

Bispesifikke antistoffer inkluderer kryssbundne antistoffer eller ”heterokonjugatantistoffer", som er antistoffer ifølge oppfinnelsen. Ett av antistoffene i heterokonjugatet kan for eksempel være koblet til et avidin, og den andre til biotin. Slike antistoffer har for eksempel blitt foreslått å styre immunsystemceller mot uønskede celler (US patentskrift nr.

4 676 980), og til behandling av HIV-infeksjon (WO 91/00360, WO 92/200373 og EP 03089). Heterokonjugatantistoffer kan bli fremstilt ved å benytte enhver hensiktsmessig kryssbindingsfremgangsmåte. Passende kryssbindingsmidler er velkjente på fagområdet og er fremlagt i US patentskrift nr. 4 676 980, sammen med et antall kryssbindingsteknikker.

Multivalente antistoffer

Antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer et multivalent antistoff. Et multivalent antistoff kan bli internalisert (og/eller katabolisert) raskere enn et bivalent antistoff ved en celle som uttrykker et antigen som antistoffet binder til. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan være multivalente antistoffer (som er forskjellig fra IgM-klasse) med tre eller flere antigenbindende seter (for eksempel tetravalente antistoffer), som enkelt kan bli fremstilt av rekombinant ekspresjon av en nukleinsyre som koder for polypeptidkjedene i antistoffet. Det multivalente antistoffet kan omfatte et dimeriseringsdomene og tre eller flere antigenbindende seter. Det foretrukne dimerinseringsdomenet omfatter (eller består av) en Fc-region eller en hengselregion. I dette scenarioet vil antistoffet omfatte en Fc-region og tre eller flere antigenbindende seter aminoterminalt til Fc-regionen. Det foretrukne, multivalente antistoffet her omfatter (eller består av) tre til omtrent åtte, men fortrinnsvis fire, antigenbindende seter. Det multivalente antistoffet omfatter minst én polypeptidkjede (og fortrinnsvis to polypeptidkjeder), der polypeptidkjedene omfatter to eller flere variabeldomener. Polypeptidkjeden/-kjedene kan for eksempel omfatte VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, der VD1 er et første variabeldomene, VD2 et andre variabeldomene, Fc er en polypeptidkjede eller en Fc-region, X1 og X2 representerer en aminosyre eller et polypeptid og n er 0 eller 1. For eksempel kan polypeptidkjeden/kjedene omfatte:VH-CH1-fleksibel linker-VH-CH1-Fc-regionkjede, eller VH-CH!-VH-CH1-Fc-regionkjede. Det multivalente antistoffet her omfatter fortrinnsvis ytterligere minst to (og fortrinnsvis fire) lettkjede variabeldomene polypeptider. Det multivalente antistoffet her kan for eksempel omfatte fra omtrent to til omtrent åtte lettkjede variabeldomene polypeptider. Lettkjede variabeldomene polypeptidene som er omfattet her omfatter et lettkjede variabeldomene og eventuelt ytterligere et CL-domene.

Effektorfunksjonsendring

Det kan være ønskelig å modifisere antistoffet ifølge oppfinnelsen med hensyn til effektorfunksjon, for å forsterke effektiviteten til antistoffet i å behandle for eksempel kreft. Cysteinrestt kan for eksempel bli introdusert i Fc-regionen, for derved å tillate interkjededisulfidbindingsdannelse i denne regionen. Det homodimere antistoffet som ble generert på denne måten kan ha forbedret internaliseringsevne og/eller økt komplementmediert celledreping og antistoffavhengig cellulær toksisitet (ADCC). Se Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) og Shopes, B, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Homodimere antistoffer med forsterket målsøkende aktivitet kan også bli fremstilt ved anvendelse av heterobifunksjonelle kryssbindinger som beskrevet i Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativt kan et antistoff bli frembrakt som har to Fc-regioner som derved kan ha forsterket komplementlysis og ADCC-evner. Se Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Deisgn, 3:219-230 (1989). For å øke halveringstiden med serum for antistoffet kan man inkorporere en redningsreseptor bindingsepitop i antistoffet (spesielt et antistoff-fragment) som beskrevet i for eksempel US patentskrift 5 739 277. Som benyttet her, refererer uttrykket ”redningsreseptor bindingsepitop” til en epitop i en Fc-region i et IgG-molekyl (for eksempel IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4) som er ansvarlig for å øke halveringstiden i serum in vivo for IgG-molekylet.

Immunkonjugater

Oppfinnelsen inneholder også immunkonjugater som omfatter antistoffet som beskrevet her konjugert til et cytotoksisk middel slik som et kjemoterapeutisk middel, toksin (for eksempel et enzymatisk aktivt toksin av bakterieopphav, soppopphav, planteeller dyreopphav, eller fragmenter derav), eller en radioaktiv isotop (for eksempel et radiokonjugat). En mengde av radionukleotider er tilgjengelige for fremstilling av radiokonjugatantistoffer. Eksempler inkluderer for eksempel<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y og<186>Re.

Kjemoterapeutiske midler er nyttig for fremstilling av slike immunkonjugater og har blitt beskrevet ovenfor. For eksempel kan BCNU, streptozoicin, vinkristin, 5-fluoruracil, familien av midler kjent som kollektivt LL-E22388-kompleks beskrevet i US patentskrift nr.

5 053 394, 5 770 710, esperamiciner (US patentskrift nr. 5 877 296) osv. (se også definisjonen for kjemoterapeutiske midler her) kan bli konjugert til anti-ANGTL4- eller antiangiogeneseantistoffer eller fragmenter derav.

For selektiv destruksjon av en celle kan antistoffet omfatte et svært radioaktivt atom. En mengde radioaktive isotoper er tilgjengelige for fremstilling av radiokonjugert anti-ANGPTL4 eller fragmenter derav. Eksempler inkluderer for eksempel<211>At,<131>I,<125>I,<90>Y,<186>Re,<188>Re,<153>Sm,<212>Bi,<32>P,<212>Pb,<111>In, radioaktive isotoper av Lu osv. Når konjugatet ble benyttet til diagnostisering, kan det omfatte et radioaktivt atom for scintigrafiske undersøkelser, for eksempel<99m>tc eller<123>I, eller et spinmerke for nukleær magnetisk resonans (NMR)-synliggjøring (også kjent som magnetisk resonans synliggjøring, MRI), slik som jod-123, jod-131, indium-111, fluor-19, karbon-13, nitrogen-15, oksygen-17, gadolinium, mangan og jern.

Radiomerkene eller andre merker kan bli inkorporert i konjugatet på kjente måter. For eksempel kan peptidet bli biosyntetisert eller kan bli syntetisert ved hjelp av kjemisk aminosyresyntese ved å benytte egnede aminosyreforløpere som for eksempel involverer fluor-10 i stedet for hydrogen. Merker slik som<99m>tc eller<123>I,<186>Re,<188>Re og<111>In kan bli bundet via en cysteinrest i peptidet. Yttrium-90 kan bli bundet via en lysinrest. IODOGEN-fremgangsmåten (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 80:49-57 (1978) kan bli benyttet for å inkorporere jod-123. Se for eksempel Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press, 1989) som beskriver andre fremgangsmåter i detalj.

Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav som kan bli brukt inkluderer difteri-A-kjede, ikke-bindende aktive fragmenter av difteritoksin, eksotoksin-A-kjede (fra Pseudomonas aeruginosa), ricin-A-kjede, abrin-A-kjede, modeccin-A-kjede, alfa-sarsin, Aleurites fordii-proteiner, diantinproteiner, Phytolacca americana-proteiner (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia-inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria offencinalis-inhibitor, gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomycin, neomycin og trikotecener. Se for eksempel WO 93/21232, publisert 28. oktober, 1993.

Konjugater av antistoffet og det cytotoksiske middelet ble fremstilt ved å benytte en mengde bifunksjonelle proteinkoblingsmidler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditiol)-propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-sykloheksan-1-karboksaylat, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat-HCL), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bisazidoforbindelser (slik som bis(p-azidobenzoyl)heksandiamin), bis-diazoniumderivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som tolyen-2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (slik som 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Et ricinimmunotoksin kan for eksempel bli fremstilt som beskrevet i Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). Karbon-14-merket 1-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylentriaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på chelaterende middel for å konjugere et radionukleotid til antistoffet. Se WO 94/11026. Linkeren kan være en ”kløyvbar linker” for å fremme frigjøring av det cytotoksiske legemiddelet i cellen. For eksempel kan en syrelabil linker, peptidasesensitiv linker, fotolabil linker, dimetyllinker eller disulfidinneholdende linker (Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992), US patentskrift nr. 5 208 020) bli benyttet.

Alternativt kan et fusjonsprotein som omfatter anti-ANGPTL4 og det cytotoksiske middel bli fremstilt, for eksempel ved hjelp av rekombinante teknikker eller peptidsyntese. Lengden av DNA kan omfatte respektive regioner som koder for de to delene av konjugatet enten ved siden av hverandre eller separat med en region som koder for et linkerpeptid som ødelegger de ønskede egenskaper til konjugatet.

I visse utførelsesformer blir antistoffet konjugert til en ”reseptor” (slik som streptavidin) for anvendelse i celle premålsøking der antistoffreseptorkonjugatet er administrert til pasienten, fulgt av fjerning av ubundet konjugat fra sirkulasjonen ved å benytte et uttømmingsmiddel og deretter administrering av en ”ligand” (for eksempel avidin) som blir konjugert til et cytotoksisk middel (for eksempel et radionukleotid). I visse utførelsesformer blir et immunkonjugat dannet mellom et antistoff og en forbindelse med nukleolytisk aktivitet (for eksempel en ribonuklease eller en DNA-endonuklease slik som en deoksyribonuklease, Dnase).

Maytansin og maytansinoider

Oppfinnelsen tilveiebringer et antistoff ifølge oppfinnelsen som er konjugert med et eller flere maytansinoidmolekyler. Maytansinoider er mitotiske inhibitorer som virker ved inhibering at tubulinpolymerisering. Maytansin blir først isolert fra den østafrikanske busken Maytenus serrata (US patentskrift nr. 3 896 111). Deretter ble det oppdaget at visse mikrober også produserer maytansinoider, slik som maytansinol og C-3-maytansinolestere (US patentskrift nr. 4 151 042). Syntetisk maytansinol og derivater og analoger derav er tilkjennegjort i for eksempel US patentskrift nr. 4 137 230, 4 248 870, 4 256 746,

4 260 608, 4 265 814, 4 294 757, 4 307 016, 4 308 268, 4 308 269, 4 309 428, 4 313 946, 4 315 929, 4 317 821, 4 322 348, 4 331 598, 4 361 650, 4 364 866, 4 424 219, 4 450 254, 4 362 663 og 4 371 533.

Et anti-ANGPTL4-antistoff eller anti- αv β5-antistoff ble for eksempel konjugert til et maytansinoidmolekyl uten vesentlig å minske den biologiske aktiviteten til enten antistoffet eller maytansinoidmolekylet. Gjennomsnittlig 3-4 maytansinoidmolekyler konjugert per antistoffmolekyl har vist effektivitet i å fremme cytotoksisitet for målceller uten negativt å påvirke funksjonene eller løseligheten til antistoffet, selv om til og med kun et molekyl med toksin/antistoff vil være forventet å forsterke cytotoksisitet i forhold til anvendelse av nakent antistoff. Maytansinoider er velkjente på fagområdet og kan bli syntetisert ved kjente teknikker eller isolert fra naturlige kilder. Passende maytansinoider er for eksempel tilkjennegjort i US patentskrift nr. 5 208 020 og i de andre patentene og ikke-patentpublikasjoner som er referert til ovenfor. I én utførelsesform er maytansinoider, maytansinol og maytansinolanaloger modifisert på den aromatiske ringen eller på andre posisjoner i maytansinolmolekylet, slik som ulike maytansinolestere.

Det finnes mange bindingsgrupper som er kjent på fagområdet for å fremstille antistoff-maytansinoidkonjugater, inkludert for eksempel de som er beskrevet i US patentskrift nr. 5 208 020 eller EP 0 425 235 B1 og Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992). Linkergruppene inkluderer disulfidgrupper, tioetergrupper, syrelabile grupper, fotolabile grupper, peptidaselabile grupper eller esteraselabile grupper, som beskrevet i patentene som er identifisert ovenfor, der disulfid- og tioetergrupper er foretrukket.

Konjugater av antistoffet og maytansinoidet kan bli fremstilt ved å benytte en mengde bifunksjonelle proteinkoblingsmidler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridyltio)-propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-1-karboksylat, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat HCL), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bisazidoforbindelser (slik som bis(p-azidobenzoyl)heksandiamin), bis-diazoniumderivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som toluen-2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (slik som 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen).

Typiske koblingsmidler inkluderer N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J., 173:723-737 (1978) og N-suksinimidyl-4-(2-pyridyltio)-pentanoat (SPP) for å tilveiebringe en disulfidbinding.

Linkeren kan være bundet til maytansinoidmolekylet på ulike posisjoner, avhengig av typen av linker. En esterbinding kan for eksempel bli dannet ved reaksjon med en hydroksylgruppe ved å benytte konvensjonelle koblingsteknikker. Reaksjonen kan foregå ved C-3-posisjonen som har en hydroksylgruppe, C-14-posisjonen modifisert med hydroksymetyl, C-15-posisjonen modifisert med en hydroksylgruppe og C-20-posisjonen som har en hydroksylgruppe. Bindingen blir dannet ved C-3-posisjonen til maytansinol eller en maytansinolanalog.

Calicheamicin

Et annet immunkonjugat av interesse omfatter et anti-ANGPTL4-antistoff eller antiαv β5-antistoff konjugert til et eller flere calicheamicinmolekyler. Calicheamicinfamilien er antibiotika i stand til å frembringe dobbelttrådede DNA-brudd ved sub-pikomolare konsentrasjoner. Ved fremstillingen av konjugater er calicheamicinfamilien, se for eksempel US patentskrift nr. 5 712 374, 5 714 586, 5 739 116, 5 767 285, 5 770 701, 5 770 710, 5 773 001, 5 877 296 (alle meddelt til American Cyanamid Company). Strukturelle analoger av calicheamicin som kan bli benyttet inkluderer γ1<I>, α2<I>, α3<I>, N-acetyl- γ1<I>, PSAG og �<I>1 (Hinman et al., Cancer Research, 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research, 58:2925-2928 (1998) og de tidligere nevnte US patentene til American Cyanamid). ET annet anti-tumor legemiddel som antistoffet kan bli konjugert til er QFA som er et antifolat. Både calicheamicin og QFA har intracellulære virkningsseter og krysser ikke enkelt plasmamembranen. Derfor forsterker cellulært opptak av disse midlene via antistoffmediert internalisering sterkt deres cytotoksisitet.

Andre antistoffmodifiseringer

Andre modifiseringer av antistoffet er omfattet her. For eksempel kan antistoffet bli bundet til en av en mengde ikke-proteininneholdende polymerer, for eksempel polyetylenglykol, polypropylenglykol, polyoksyalkylener eller kopolymerer av polyetylenglykol og polypropylenglykol. Antistoffet kan også være fanget i mikrokapsler som for eksempel er fremstilt ved hjelp av koacerveringsteknikker eller ved grenseflatepolymerisering (for eksempel hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler og poly-(metylmetakrylat)-mikrokapsler), i kolloidale legemiddelleveringssystemer (for eksempel liposomer, albuminmikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler), eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er tilkjennegjort i Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Olso, A., red., (1980).

Liposomer og nanopartikler

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan bli formulert i liposomer. Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan for eksempel bli formulert som immunliposomer. Liposomer som inneholder antistoffet er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåter kjent på fagområdet, slik som beskrevet i Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:3688 (1985), Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:4030 (1980) og US patentskrift nr. 4 485 045 og 4 544 545. Liposomer med forbedret sirkulasjonstid er tilkjennegjort i US patentskrift nr. 5 013 556. Generelt er formuleringen og anvendelsen av liposomer kjent for fagfolk på området.

Spesielt nyttige liposomer kan bli fremstilt ved hjelp av reversfase avdampingsfremgangsmåte med et lipidpreparat som omfatter fosfatidylcholin, kolesterol og PEG-derivatisert fosfatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomer blir presset gjennom filtre og en definert porestørrelse for å gi liposomer med den ønskede diameter. Fab’-fragmenter av antistoffet ifølge oppfinnelsen kan bli konjugert til liposomer som beskrevet i Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) via en disulfidinterendringsreaksjon. Nanopartikler eller nanokapsler kan også bli benyttet for å fange polypeptidene ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform kan biologisk nedbrytbare polyalkylcyanoakrylatnanopartikler bli benyttet med polypeptidene ifølge oppfinnelsen.

Andre anvendelser

Anti-ANGPTL4-antistoffene har ulike anvendelser. For eksempel kan anti-ANGPTL4-antistoffene bli benyttet i diagnostisk analyse for ANGPTL4 eller fragmenter av ANGPTL4, for eksempel for å påvise dens ekspresjon i spesifikke celler, vev eller i serum, til sykdomspåvisning, for eksempel av forstyrrelsene som er beskrevet her osv. I én utførelsesform blir ANGPTL4-antistoffer benyttet for å selektere pasientpopulasjonen til behandling med fremgangsmåtene som er tilveiebrakt her. Ulike diagnostiske analyseteknikker som er kjent på fagområdet kan bli benyttet, slik som i kompetitive bindingsanalyser, direkte eller indirekte sandwichanalyser og immunpresipiteringsanalyser som enten blir utført i heterogene eller homogene faser (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987), s. 147-158). Antistoffene som blir benyttet i de diagnostiske analysene kan bli merket med en påvisbar enhet. Den påvisbare enheten bør være i stand til å frembringe, enten direkte eller indirekte, et påvisbart signal. Den påvisbare enheten kan for eksempel være en radioisotop, slik som<3>H,<14>C,<32>P,<35>S eller<125>I), en fluorescerende eller kjemiluminiscerende forbindelse, slik som fluoresceinisotiocyanat, rodamin eller luciferin, eller et enzym slik som alkalisk fosfatase, beta-galaktosidase eller pepperrotperoksidase. Enhver kjent fremgangsmåte på fagområdet for å konjugere antistoffet til den påvisbare enheten kan bli benyttet, inkludert fremgangsmåtene som er beskrevet av Hunter et al., Nature, 144:945 (1962), David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth, 40:219 (1981) og Nygren, J. Histochem and Cytochem., 30:407 (1982).

Anti-ANGPTL4-antistoffer er også nyttige for affinitetsrensingen av ANGPTL4 fra rekombinant cellekultur eller naturlige kilder. I denne prosessen blir antistoffene mot ANGPTL4 immobilisert på en passende bærer, slik som et sefadex-resin eller filterpapir ved å benytte fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. Det immobiliserte antistoffet blir deretter kontaktet med en prøve som inneholder ANGPTL4 som skal bli renset og deretter blir bæreren vasket med et passende løsningsmiddel som vil fjerne vesentlig alt materiale i prøven, bortsett fra ANGPTL4, som blir bundet til det immobiliserte antistoffet. Til slutt blir bæreren vasket med et annet passende løsningsmiddel som vil frigjøre ANGPTL4 fra antistoffet.

Vektorer, vertsceller og rekombinante fremgangsmåter

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt rekombinant ved å benytte teknikker og materialer som er enkelt å få tak i.

For rekombinant fremstilling av et polypeptid ifølge oppfinnelsen blir for eksempel en ANGPTL4, et anti-ANGPTL4-antistoff, eller et anti- αv β5-antistoff, nukleinsyren som koder for dem, isolert og innsatt i en replikerbar vektor for ytterligere kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. DNA som koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen er enkelt isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer. For eksempel blir et DNA som koder for et monoklonalt antistoff isolert og sekvensert, for eksempel ved å benytte oligonukleotidprober som er i stand til binde spesifikt til gener som koder for de tunge og lette kjedene til antistoffet. Mange vektorer er tilgjengelige. Vektorkomponentene inkluderer generelt en eller flere av de følgende: en signalsekvens, et replikasjonsstartsted, et eller flere markørgener, en enhancerelement, en promotor og en transkripsjonstermineringssekvens.

Signalsekvens komponent

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt rekombinant ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid, som typisk er en signalsekvens eller annet polypeptid som har et spesifikt kløyvingssete på N-terminalen i det modne proteinet eller polypeptidet. Den heterologe signalsekvensen valgt er typisk en som blir gjenkjent og prosessert (dvs. kløyvd av en signalpeptidase) av vertscellen. For prokaryote vertsceller som ikke gjenkjenner og prosesserer den native polypeptidsignalsekvensen blir signalsekvensen substituert med en prokaryot signalsekvens som for eksempel er valgt fra gruppen av alkalisk fosfatase, penicillinase, lpp eller varmestabile enterotoksin-II-ledere. For gjærutskilling kan den native signalsekvensen bli substituert med for eksempel gjærinvertaselederen, α-faktorlederen (inkludert Saccharomyces- og Kluyveromyces- α-faktorlederne), eller sur fosfataseleder, C. albicans-glukoamylaselederen eller signalet som er beskrevet i WO 90/13646. I pattedyrcelleekspresjon er pattedyrsignalsekvenser i tillegg til virussekretoriske ledere, for eksempel herpes simplex gD-signalet tilgjengelige.

DNA for en slik forløperregion ble ligert i leseramme til DNA som koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Replikasjon startstedskomponent

Både ekspresjonsvektor og kloningsvektor inneholder en nukleinsyresekvens som gjør vektoren i stand til å replikere en eller flere valgte vertsceller. I kloningsvektorer er denne sekvensen generelt en som gjør vektoren i stand til å replikere uavhengig av vertskromosomalt DNA og inkluderer replikasjonsstartsteder eller autonomt replikerende sekvenser. Slike sekvenser er velkjente for en mengde bakterier, gjær og virus.

Replikasjonsstartstedet fra plasmidet pBR322 er hensiktsmessig for de fleste gramnegative bakterier, 2 μ-plasmid startstedet er passende for gjær og ulike virus startsteder (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er passende for kloningsvektorer i pattedyrceller. Vanligvis er ikke-replikasjon startstedkomponenten nødvendig for pattedyrekspresjonsvektorer (SV40 startstedet kan typisk bli benyttet kun fordi den inneholder den tidlige promotoren).

Seleksjonsgenkomponent

Ekspresjonsvektorer og kloningsvektorer kan inneholde et seleksjonsgen, også betegnet en selekterbar markør. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) overfører resistens overfor antibiotika eller andre toksiner, for eksempel ampicillin, neomycin, metotreksat eller tetrasyklin, (b) komplement auxotrofmangler eller (c) tilfører kritiske næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra det komplekse mediet (for eksempel gen som koder for D-alaninracemase for Bacilli.

Et eksempel på et seleksjonsskjema benytter et legemiddel for å stoppe veksten av en vertscelle. De cellene som vellykket blir transformert med et heterologt gen produserer et protein som overfører legemiddelresistens og overlever slik seleksjonsregimet.

Eksempler på slik dominant seleksjon benytter legemidlene neomycin, mykofenolsyre og hygromycin.

Et annet eksempel på passende selekterbare markører for pattedyrceller er de som muliggjør identifisering av celler som er kompetente til å ta opp antistoff nukleinsyren, slik som DHFR, tymidinkinase, metallotionein-I og –II, typiske primat metallotioneingener, adenosindeaminase, ornitindekarboksylase osv.

For eksempel blir celler som er transformert med DHFR-seleksjonsgenet først identifisert ved å dyrke alle transformantene i et kulturmedium som inneholder metotreksat (Mtx), som er en kompetitiv antagonist av DHFR. En passende vertscelle når villtype-DHFR blir benyttet er kinesiske hamsterovarie (CHO)-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet.

Alternativt kan vertsceller (spesielt villtype verter som inneholder endogent DHFR) transformert eller ko-transformert med DNA-sekvenser som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, villtype-DHFR-protein og en annen selekterbar markør slik som aminoglykosid-3’-fosfotransferase (APH) blir valgt for cellevekst i medium som inneholder et seleksjonsmiddel for den selekterbare markør slik som et aminoglykosid antibiotikum, for eksempel kanamycin, neomycin eller G418. Se US patentskrift nr. 4 965 199.

Et passende seleksjonsgen for anvendelse i gjær er trp-1-genet som foreligger i gjærplasmidet Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Trp-1-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant gjærstamme som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1. (Jones, Genetics, 85:12 (1977). Tilstedeværelsen av trp-1-lesjonen i gjærvertscellegenomet tilveiebringer da et effektivt miljø for å påvise transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan. Likeledes blir Leu2-manglende gjærstamme (ATCC 20 622 eller 38 626) komplementert ved kjente plasmider som bærer Leu2-genet.

I tillegg kan vektorer som er avledet fra det sirkulære plasmidet pKD1 på 1,6 μm bli benyttet til transformasjon av Kleuyveromyces-gjær. Alternativt ble et ekspresjonssystem for storskalaproduksjon av rekombinant kalve-chymosin rapportert for K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Stabile multikopiekspresjonsvektorer for utskilling av modent, rekombinant humant serumalbumin av industrielle stammer av Kluyveromyces har også blitt tilkjennegjort. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

Promotorkomponent

Ekspresjonsvektor og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promotor som blir gjenkjent av vertsorganismen og som er opererbart bundet til en nukleinsyre som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Promotorer som er passende for anvendelse med prokaryote verter inkluderer phoA-promotoren, β-laktamase- og laktosepromotorsystemet, alkalisk fosfatase, et tryptofan (trp) promotorsystem og hybridpromotorer slik som tacpromotoren. Andre kjente bakteriepromotorer er likevel også passende. Promotorer for anvendelse i bakteriesystemer vil også inneholde en Shine-Dalgarno (S.D.)-sekvens opererbart bundet til DNA som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Promotorsekvenser er kjent for eukaryoter. Nesten alle eukaryote gener har en AT-rik region lokalisert omtrent 25 til 30 baser oppstrøms fra stedet der transkripsjonen ble startet. En annen sekvens som ble funnet 70 til 80 baser oppstrøms fra startstedet for transkripsjon i mange gener er en CNCAAT-region, der N kan være et hvilket som helst nukleotid. På den 3’ enden av de fleste eukaryote gener ligger en AATAAA-sekvens som kan være signalet for påsetning av poly-A-halen på den 3’ enden av den kodende sekvensen. Alle disse sekvensene blir hensiktsmessig innsatt i eukaryote ekspresjonsvektorer.

Eksempler på passende promotorsekvenser for anvendelse med gjærverter inkluderer promotorene for 3-fosfoglyseratkinase eller andre glykolytiske enzymer, slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase.

Andre gjærpromotorer som er induserbare promotorer som har det ytterligere fortrinn av transkripsjon kontrollert ved vekstbetingelser, er promotorregionene for alkoholdehydrogenase-2, isocytokrom-C, sur fosfatase, degraderende enzymer som er assosiert med nitrogenmetabolisme, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer som er ansvarlige for maltose- og galaktoseomsetning. Passende vektorer og promotorer til anvendelse i gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i EP 73 657.

Gjærenhancere blir også fordelaktig benyttet med gjærpromotorer.

Transkripsjon av polypeptider ifølge oppfinnelsen fra vektorer i pattedyrvertsceller er kontrollert for eksempel av promotorer som er fremskaffet fra genomene til virus slik som polyomavirus, fuglekoppevirus, adenovirus (slik som adenovirus-2), bovint papillomvirus, fulgesarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og typisk apevirus-40 (SV40), fra heterologe pattedyrpromotorer, for eksempel aktinpromotoren eller en immunglobulinpromotor, fra varmesjokk promotorer, gitt at slike promotorer er kompatible med vertscellesystemene.

De tidlige og sene promotorene til SV40-virus blir hensiktsmessig fremskaffet som et SV40-restriksjonsfragment som også inneholder virusreplikasjonsstartestedet for SV40. Den umiddelbart tidlige promotoren til det humane cytomegaloviruset blir hensiktsmessig fremskaffet som et HINDIII E-restriksjonsfragment. Et system for å uttrykke DNA i pattedyrverter ved å benytte det bovine papillomviruset som en vektor er tilkjennegjort i US patentskrift nr. 4 419 446. En modifisering av dette systemet beskrevet i US patentskrift nr. 4 601 978. Se også Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) når det gjelder ekspresjon av humant β-interferon-cDNA i museceller under kontroll av en tymidinkinasepromotor fra herpes simplex-virus. Alternativt kan rous sarkomvirus langterminalrepetisjonen bli benyttet som promotoren.

Enhancerelementkomponent

Transkripsjon av et DNA som koder for et polypeptid ifølge denne oppfinnelsen ved høyere eukaryoter blir ofte økt ved å sette inn en enhancersekvens i vektoren. Mange enhancersekvenser er kjent fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, α-føtoprotein og insulin). Typisk vil man benytte en enhancer fra et eukaryot cellevirus. Eksempler inkluderer SV40-enhanceren på den sene siden av replikasjonsstartstedet (bp 100-270), cytomegalovirus tidligpromotor enhanceren, polyomaenhanceren på den sene siden av replikasjonstartstedet og adenovirusenhancerne. Se også Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) når det gjelder enhancerelementer til aktivering av eukaryote promotorer. Enhanceren kan bli spleiset inn i vektoren ved en posisjon 5’ eller 3’ i forhold til den polypeptidkodende sekvensen, men blir typisk lokalisert på et sted 5’ fra promotoren.

Transkripsjonstermineringskomponent

Ekspresjonsvektorer som blir benyttet i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, innsekt, plante, dyr, menneske eller celler med kjerner fra andre multicellulære organismer) vil også inneholde sekvenser som er nødvendig for en terminering av en transkripsjon og for å stabilisere mRNA. Slike sekvenser er allment tilgjengelige fra de 5’ og av og til 3’, utranslaterte regionene til eukaryote eller virale DNA eller cDNA. Disse regionene inneholder nukleotidsegmenter som blir transkribert som polyadenylerte fragmenter i den utranslaterte delen av mRNA som koder for polypeptider ifølge oppfinnelsen. En nyttig transkripsjonstermineringskomponent er den bovine veksthormon polyadenyleringsregionen. Se WO 94/11026 og ekspresjonsvektoren som er tilkjennegjort der.

Seleksjon og transformasjon av vertsceller

Passende vertsceller for kloning eller ekspresjon av DNA som koder for polypeptidene ifølge oppfinnelsen i vektoren her er de prokaryote cellene, gjærcellene eller høyere eukaryote cellene som er beskrevet ovenfor. Passende prokaryoter til dette formålet inkluderer eubakterier slik som gramnegative eller grampositive organismer, for eksempel enterobacteriaceae slik som Escherichia, for eksempel E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Slamonella typhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescans og Shigella, i tillegg til Bacilli slik som B. subtilis og B. licheniformis (for eksempel B. licheniformis 41P tilkjennegjort i DD 266 710, publisert 12. april, 1989), Pseudomonas slik som P. aeurginosa og Streptomyces. Typisk er E. colikloningsverten E. coli 294 (ATCC 31 446), selv om andre stammer slik som E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) og E. coli W3110 (ATCC 27 325) er passende. Disse eksemplene er illustrerende heller enn begrensende.

I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober slik som filamentøse sopper eller gjær passende klonings- eller ekspresjonsverter for vektorer som koder for polypeptider ifølge oppfinnelsen. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær er den mest vanlig benyttede blant de lavere eukaryote vertsorganismene. Likevel er et antall andre slekter, arter og stammer allment tilgjengelige og nyttige her, slik som Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces-verter slik som for eksempel K. lactis, K. Fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans og K. marxianus; yarrowia (EP 402 226), Pichia pastoris (EP 183 070), Candida, trochoderma reesia (EP 244 234), Neurospora crassa, Schwannimyces slik som Schwanniomyces occidentalis, og filamentøse sopper slik som for eksempel Neurospora, Penicillum, Tolypocladium og Aspergillus-verter slik som A. nidulans og A. niger.

Passende vertsceller for ekspresjonen av glykosylerte polypeptider ifølge oppfinnelsen er avledet fra multicellulære organismer. Eksempler på celler fra dyr som ikke er virveldyr inkluderer planteceller og innsektsceller. Utallige baculovirusstammer og varianter og tilsvarende mulige innsektsvertsceller fra verter slik som Spodoptera frugiperda (sommerfugllarve), Aedes aegypti (mygg), Aedes albopictus (mygg), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx mori har blitt identifisert. En mengde virusstammer for transfeksjon er allment tilgjengelige, for eksempel L-1-variantern av Autographa californica NPV og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV og slike virus kan bli benyttet som virusene her i overensstemmelse med oppfinnelsen, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda-celler. Plantecellekulturer av bomull, mais, potet, soyabønne, petunia, tomat og tobakk kan også bli benyttet som verter.

Interessen har likevel vært størst for virveldyrceller, og formering av virveldyrceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemessig prosedyre. Eksempler på nyttige pattedyrvertscellelinjer er apenyre-CV1-linje transformert med SV40 (Cos-7, ATCC CRL 1651), human embryonal nyrelinje (293- eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjonskulturer, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)), baby hamsternyreceller (BHK, ATCC CCL 10), kinesisk hamsterovarieceller/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), musesertoliceller (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), apenyreceller (CV1 ATCC CCL 70), nyreceller fra afrikansk grønnape (VERO-76, ATCC CRL-1587), humane cervikskarsinomceller (HELA, ATCC CCL 2), hundenyreceller (MDCK, ATCC CCL 34), buffelrotteleverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75), humane leverceller (Hep G2, HB 8065), muse brysttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI-celler (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)), MRC5-celler, FS4-celler og en human hepatomlinje (Hep G2).

Vertsceller blir transformert med ekspresjonkloningsvektoren som er beskrevet ovenfor for produksjon av polypeptider ifølge oppfinnelsen og dyrket i konvensjonelt næringsmiddelmedier som er modifisert slik det er hensiktsmessig for å indusere promotorer, selektere transformanter eller amplifisere genene som koder for de ønskede sekvensene.

Dyrking av vertsceller

Vertscellene som blir benyttet for å produsere polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan bli dyrket i en mengde ulike medier. Kommersielt tilgjengelige medier slik som Ham’s F10 (Sigma), minimalt essensielt medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ((DMEM), Sigma), normalt vekstmedium for hepatocytter (Cambrex), vekstmedium for pre-adipocytter (Cambrex) osv. er passende for å dyrke vertscellene. I tillegg kan et hvilket som helst av mediene som er beskrevet i Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), US patentskrift nr.

4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 eller 5 122 469, WO 90/03430, WO 97/00195 eller US patentskrift Re. 30 985 blir benyttet som kulturmedium for vertscellene. Et hvilket som helst av disse mediene kan bli tilsatt om nødvendig med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (slik som insulin, transferrin eller epidermalvekstfaktor), salter (slik som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (slik som HEPES), nukleotider (slik som adenosin og tymidin), antibiotika (slik som GENTAMYCIN-legemiddel), sporstoffer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis foreligger ved sluttkonsentrasjoner i mikromolar området) og glukose eller en ekvivalent energikilde. Alle andre nødvendige tilsetninger kan også være inkludert ved passende konsentrasjoner som vil være kjent for fagfolk på området. Dyrkningsbetingelsene, slik som temperatur, pH og lignende, er de som tidligere er benyttet med vertscellen som er valgt for ekspresjon, og vil være åpenbare for fagfolk på området.

Polypeptidrensing

Når man benytter rekombinante teknikker kan et polypeptid ifølge oppfinnelsen, for eksempel ANGPTL4, anti-ANGPTL4-antistgoff eller anti- αv β5-antistoff ble fremstilt intracellulært, i det periplasmatiske hulrommet, eller direkte utskilt i mediet. Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan bli gjenvunnet fra kulturmedium eller fra vertscellelysater. Hvis det er membranbundet kan det bli frigjort fra membranen ved å benytte passende detergentløsning (for eksempel Triton-X 100) eller ved hjelp av enzymatisk kløyving. Celler som blir benyttet i ekspresjonen av polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan bli ødelagt ved hjelp av ulike fysiske eller kjemiske innsatser, slik som fryse-tinings-syklus, sonikering, mekanisk ødeleggelse eller cellelyserende midler.

Det kan være ønskelig å rense et polypeptid ifølge oppfinnelsen fra rekombinante celleproteiner eller polypeptider. De følgende prosedyrene er eksempelmessige på passende renseprosedyrer: ved fraksjonering på en ionebytterkolonne, etanolpresipitering, reversfase-HPLC, kromatografi på silika, kromatografi på heparin-Sepharose, kromatografi på et anion- eller kationbytteresin (slik som polyasparaginsyrekolonne, DEAE osv.), kromatofokusering, SDS-PAGE, ammoniumsulfatpresipitering, gelfiltrering ved for eksempel å benytte Sefadex G-75, protein-A-Sefarosekolonne for å fjerne kontaminanter slik som IgG og metallchelaterende kolonner for å binde epitopmerkede former av polypeptider ifølge oppfinnelsen. Ulike fremgangsmåter for proteinrensing kan bli benyttet der slike fremgangsmåter er kjent på fagområdet og for eksempel beskrevet i Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Rensetrinnet/trinnene som blir valgt vil for eksempel være avhengig på egenskapene til fremstillingsprosessen som er benyttet, og det er spesielt polypeptidet ifølge oppfinnelsen som blir produsert.

For eksempel kan et antistoffpreparat som er fremstilt fra cellene bli renset ved for eksempel å benytte hydroksylapatitt kromatografi, gelelektroforese, dialyse og affinitetskromatografi der affinitetskromatografi er den typiske renseteknikken.

Hensiktsmessigheten for protein-A som en affinitetsligand avhenger av typen og isotypen av et hvilket som helst immunglobulin-Fc-domene som foreligger i antistoffet. Protein-A kan bli benyttet for å rense antistoffer som er basert på humane γ1-, γ2- eller γ4-tungkjeder (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Protein-G er anbefalt for alle museisotyper og for human γ3 (Guss et al., EMBO J, 5:15671575 (1986)). Matriksen som affinitetsliganden er bundet til er ofte agarose, men andre matriser er tilgjengelige.

Mekanisk stabile matrise slik som glass med kontrollert porestørrelse eller poly(styrendivinyl)benzen tillater raskere strømningshastigheter og kortere prosesseringstider enn det som kan bli oppnådd med agarose. Der antistoffet omfatter et CH3-domene er Bakerbond ABX-resin (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) nyttig til rensing. Andre teknikker for proteinrensing, for eksempel de som er indikert ovenfor, er også tilgjengelige avhengig av antistoffet som skal bli gjenvunnet. Se også (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) som beskriver en prosedyre for å beskrive antistoffer som blir utskilt i det periplasmatiske hulrommet i E. coli.

Kovalente modifiseringer på polypeptider ifølge oppfinnelsen

Kovalente modifiseringer av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, for eksempel ANGPTL4 eller polypeptidagonist eller polypeptidantagonist, er inkludert innenfor omfanget av denne oppfinnelsen. De kan bli fremstilt ved kjemisk syntese eller ved enzymatisk eller kjemisk kløyving av polypeptidet, hvis mulig. Andre typer av kovalente modifiseringer av polypeptidet blir introdusert inn i molekylet ved å reagere målrettede aminosyrerester i polypeptidet med et organisk derivatiserende middel som er i stand til å reagere med de valgte sidekjedene eller de N-terminale eller C-terminale restene, eller ved å inkorporere en modifisert aminosyre eller unaturlig aminosyre inn i den voksende polypeptidkjeden, se for eksempel Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991), Noren et al., Science, 244:182 (1989) og i US patentsøknadene 20030108885 og 20030082575.

Cysteinylrester blir vanligst reagert med α-haloacetater (og tilsvarende aminer), slik som kloreddiksyre og kloracetamid for å gi karboksymetyl- eller karboksyamidometylderivater. Cysteinylrester blir også derivatisert ved reaksjon med bromtrifluoraceton, α-brom- β-(5-imidzoyl)propionsyre, kloracetylfosfat, N-alkylmaleimider, 3-nitro-2-pyridyldisulfid, metyl-2-pyridyldisulfid, p-klormerkuribenzoat, 2-klormerkuri-4-nitrofenol eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol.

Histidylrester blir derivatisert ved reaksjon med dietylpyrokarbonat med pH 5,5-7,0 fordi dette middelet er relativt spesifikt for histidylsidekjeden. Parabromfenacylbromid er også nyttig, og reaksjonen blir typisk utført i 0,1 M natriumcacodylat ved pH 6,0.

Lysinyl- og aminoterminale rester blir reagert med suksinsyreanhydrider eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse midlene har effekten av å reversere ladningen på lysinylrestene. Andre passende reagenser for å derivatisere αaminoinneholdende rester inkluderer imidoestere slik som metylpikolinimidat, pyridoksalfosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O-metylisourea, 2,4-pentandion og transaminasekatalysert reaksjon med glyoksylat.

Arginylrester blir modifisert med reaksjon med et av flere konvensjonelle reagenser, blant den fenylglyoksal, 2,3-butandion, 1,2-sykloheksandion og ninhydrin.

Derivatisering av argininrester krever at reaksjonen blir utført i alkaliske betingelser på grunn av den høye pKa for den funksjonelle guanidingruppen. Videre kan disse reagensene reagere med gruppene på lysin i tillegg til arginin-epsilon-aminogruppen.

Den spesifikke modifiseringen av tyrosylrester kan bli utført med spesiell interesse for å introdusere spektralmerking i tyrosylrester ved reaksjon med aromatiske diazoniumforbindelser eller tetranitrometan. Vanligst blir N-acetylimidizol og tetranitrometan benyttet for å danne O-acetyltyrosylenheter og 3-nitroderivater.

Tyrosylrester blir jodert ved å benytte<125>I eller<131>I for å fremstille merkede proteiner til anvendelse i radioimmunanalyse.

Karboksylsidegrupper (aspartyl eller glutamyl) blir selektivt modifisert ved reaksjon med karbodiimider (R-N=C=N-R’) der R og R’ er ulike alkylgrupper slik som 1-sykloheksyl-3-(2-morfolinyl-4-etyl)karbodiimid eller 1-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Videre blir aspartyl- og glutamylrester konvertert til asparaginyl- og glutaminylrester ved reaksjon med ammoniumioner.

Glutaminyl- og asparaginylrester blir ofte deamidert til henholdsvis de tilsvarende glutamyl- og aspartylrestene. Disse restene blir deamidert ved nøytrale eller basiske betingelser. Den deamiderte formen av disse restene faller innenfor omfanget av denne oppfinnelsen.

Andre modifiseringer inkluderer hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksylgrupper på seryl- og treonylrester, metylering av α-aminogruppene på lysin-, arginin- og histidinsidekjeder (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Fransisco, s. 79-86 (1983)), acetylering av det N-terminale aminet og amidering av enhver C-terminal karboksylgruppe.

En annen type kovalent modifisering involverer kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Disse prosedyrene er fordelaktig i at de ikke krever produksjon av polypeptider i en vertscelle som har glykosyleringsevne for N- eller O-bundet glykosylering. Avhengig av koblingsmåten som blir benyttet, kan sukkere/sukkerne bli bundet til (a) arginin og histidin, (b) frie karboksylgrupper, (c) frie sulfhydrylgrupper slik som de for cystein, (d) frie hydroksylgrupper slik som de for serin, treonin eller hydroksyprolin, (e) aromatiske rester slik som de for fenylalanin, tyrosin eller tryptofan eller (f) amidgruppen i glutamin. Disse fremgangsmåtene er beskrevet i WO 98/05330, publisert 11. september 1987 og i Aplin og Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., s. 259-306 (1981).

Ved fjerning av enhver karbohydratenhet som er tilstede på et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan bli utført kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever eksponering av polypeptidet ovenfor forbindelsen trifluormetansulfonsyre eller en ekvivalent forbindelse. Denne behandlingen fører til kløyvingen av de fleste eller alle sukkerne, bortsett fra det sammenbundne sukker (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), mens polypeptidet forblir intakt. Kjemisk deglykosylering er beskrevet av Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) og av Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Enzymatisk kløyving av karbohydratenheter, for eksempel på antistoffer, kan bli oppnådd ved anvendelsen av en mengde endo- og eksoglukosidaser som beskrevet av Thotakura et al., Meth. Enzymol, 138:350 (1987).

En annen type kovalent modifisering av et polypeptid ifølge oppfinnelsen omfatter bindende polypeptider til en av en mengde ikke-proteininneholdende polymerer, for eksempel polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkylener på måten som er fremlagt ifølge US patentskrift nr. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 eller 4 179 337.

Farmasøytiske sammensetninger

Terapeutiske formuleringer av molekyler ifølge oppfinnelsen, ANGPTL4, ANGPTL4-agonister eller ANGPTL4-antagonister, benyttet i overensstemmelse med oppfinnelsen ble fremstilt for lagring ved å blande et molekyl, for eksempel et polypeptid, som har den ønskede graden av renhet med eventuelt farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol, A. red (1980)), i formen av lyofiliserte formuleringer eller vandige løsninger. Akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske ovenfor mottagerne ved å doseringen og konsentrasjonen som ble benyttet, og inkluderer buffere slik som fosfat, citrat og andre organiske syrer, antioksidanter inkludert askorbinsyre og metionin, preserveringsmidler (slik som oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkylparabener slik som metyl- eller propylparaben, katekol, resorcinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylærvekts polypeptider (mindre enn omtrent 10 rester), proteiner slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon, aminosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstriner, chelaterende midler slik som EDTA, sukkertyper slik som sukkrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner slik som natrium, metallkomplekser (for eksempel Znproteinkomplekser) og/eller ikke-ioniske overflateaktive midler slik som TWEEN, PLURONICS eller polyetylenglykol (PEG).

De aktive ingrediensene kan også bli fanget i mikrokapsler, for eksempel fremstilt ved koacerveringsteknikker eller ved grenseflatepolymerisering, for eksempel hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler og poly-(metylmetacylat)mikrokapsler, i koloidale legemiddelleveringssystemer (for eksempel liposomer, albuminmikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er tilkjennegjort i Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. utg., Osol, A. red. (1980). Se også Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996), Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993), Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990), Cleland, ”Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems” i Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell og Newman, red., (Plenum Press: New York, 1995), s. 439-462, WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 og US patentskrift nr. 5 654 010.

I visse utførelsesformer er formuleringene som skal bli benyttet til in vivoadministrering sterile. Dette er enkelt utført ved hjelp av filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner.

Preparater med vedvarende frigjøring kan bli fremstilt. Passende eksempler på preparater med vedvarende frigjøring inkluderer halvgjennomtrengelige matriser av faste hydrofobe polymerer som inneholder et polypeptid ifølge oppfinnelsen, der matrisene foreligger i form av formgitte artikler, for eksempel filmer eller mikrokapsler. Eksempler på matriser med vedvarende frigjøring inkluderer polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksyetylmetakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (US patentskrift nr.

3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og γ-etyl-L-glutamat, ikke-nedbrytbart etylenvinylacetat, nedbrytbare melkesyre-glykolsyre-kopolymerer slik som LUPRON DEPOT (injiserbare mikrokuler sammensatt av melkesyre-glykolsyre-kopolymer og leuprolidacetat), poly-melkesyre-koglykolsyre (PLGA)-polymer og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre. Mens polymerer slik som etylenvinylacetat og melkesyre-glykolsyre muliggjør frigjøring av molekyler i mer enn 100 dager, frigjør visse hydrogeler proteiner i kortere tidsperioder. Når innkapslet antistoff forblir i kroppen i en lang periode, kan de denaturere eller aggregere som et resultat av eksponering ovenfor fuktighet ved 37<o>C, noe som fører til et tap av biologisk aktivitet og mulige endringer i immunogenisitet. Rasjonelle strategier kan bli benyttet for stabilisering avhengig av mekanismen som er involvert. Hvis aggregeringsmekanismen er funnet å være intermolekylær S-S-bindingsdannende via tiodisulfidombytting, kan for eksempel stabilisering bli oppnådd ved å modifisere sulhydrylrester, lyofilisere fra syreløsninger, kontrollere fuktig innhold, benytte passende tilsetningsstoffer og utvikle spesifikke polymermatrikspreparater, se også for eksempel US patentskrift nr. 6 699 501, som beskriver kapsler med polyelektrolyttbelegg.

Det er videre omfattet at et terapeutisk proteinmiddel ifølge oppfinnelsen (ANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist) kan bli introdusert til et individ ved hjelp av genterapi. Genterapi refererer til terapi som er utført ved administreringen av en nukleinsyre til et individ. I genterapiapplikasjoner blir gener introdusert inn i celler for å oppnå in vivo-syntese av et terapeutisk effektivt genetisk produkt, for eksempel for erstatning av et ødelagt gen. ”Genterapi” inkluderer både konvensjonell genterapi der en varig effekt ble oppnådd med en enkelt behandling, og administreringen av genterapeutiske midler, som involverer engangs administrering eller gjentatt administrering av et terapeutisk effektivt DNA eller mRNA. Antisens-RNA og DNA kan bli benyttet som terapeutiske midler for å blokkere ekspresjonen av visse gener in vivo. Se for eksempel Ad-ANGPTL4-SiRNA beskrevet her. Det har allerede blitt vist at korte antisensoligonukleotider kan bli importert inn i celler der de virker som inhibitorer, på tross av deres lave intracellulære konsentrasjoner forårsaket av deres begrensede opptak av cellemembranen (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4143-4146 (1986)). Oligonukleotidene kan bli modifisert for å forbedre deres opptak, f.eks. ved å substitueres deres negativt ladde fosfodiestergrupper med uladde grupper. For generelle gjennomganger av fremgangsmåter for genterapi, se for eksempel Goldspiel et al., Clinical Pharmacy, 12:488-505 (1993), Wu og Wu, Biotherapy, 3:87-95 (1991), Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596 (1993), Mulligan, Science, 260:926-932 (1993), Morgan og Anderson, Ann. Rev. Biochem., 62:191-217 (1993) og May, TIBTECH, 11:155-215 (1993). Fremgangsmåter som er vanlig kjent på fagområdet for rekombinant DNA-teknologi som kan bli benyttet er beskrevet i Ausubel et al., red. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons., NY, og Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

Det finnes en mengde teknikker tilgjengelige for å introdusere nukleinsyrer inn I levedyktige celler. Teknikkene varierer avhengig av hvorvidt nukleinsyren blir overført inn i dyrkede celler in vitro eller in vivo i cellene til den påtenkte verten. Teknikker som er tilgjengelige for overføring av nukleinsyrer inn i pattedyrceller in vitro inkluderer anvendelsen av liposomer, elektroporering, mikroinjeksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfat presipiteringsfremgangsmåten osv. In vivo-genoverføringsteknikker inkluderer for eksempel transfeksjon med virusvektorer (typisk retrovirus) og viruskappeprotein-liposommediert transfeksjon (Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11, 205-210 (1993)). In vivo-nukleinsyreoverføringsteknikker inkluderer for eksempel transfeksjon med virusvektorer (slik som adenovirus, herpes simplex-I-virus, lentivirus, retrovirus eller adenoassosiert virus) og lipidbaserte systemer (nyttige lipider for lipidmediert overføring av genet er for eksempel DOTMA, DOPE og DC-Chol). Eksempler på å benytte virusvektor i genterapi kan bli funnet i Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994), Kiem et al., Blood, 83:1467-1473 (1994), Salmons og Gunzberg, Human Gene Therapy, 4:129-141 (1993), Grossman og Wilson, Curr. Opin. In Genetics and Devel.

3:110-114 (1993), Bout et al., Human Gene Therapy, 5:3-10 (1994), Rosenfeld et al., Science, 252:431-434 (1991), Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155 (1992), Mastrangeli et al., J. Clin. Invest., 91:225-234 (1993) og Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 204:289-300 (1993).

I noen situasjoner er det ønskelig å tilveiebringe nukleinsyrekilden med et middel som målsøker målcellene, slik som et antistoff som er spesifikt for et celleoverflatemembranprotein eller målcellen, en ligand for en reseptor på målcellen osv. Der liposomer blir benyttet, kan proteiner som binder til celleoverflatemembranprotein som er assosiert med endocytose bli benyttet for å målsøke og/eller fremme opptak, for eksempel kapsidproteiner eller fragmenter derav, som er tropiske for en spesiell celletype, antistoffer for proteiner som gjennomgår internalisering i sykling, proteiner som målsøker intracellulær lokalisering og forsterker intracellulær halveringstid. Teknikkene med respetormediert endocytose er for eksempel beskrevet av Wu et al., J. Biol. Chem., 262, 4429-4432 (1987) og Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 3410-3414 (1990). For en gjennomgang av genmarkør- og genterapi protokoller, se Anderson et al., Science, 256, 808-813 (1992).

Dosering og Administrering

Doseringer og ønsket legemiddelkonsentrasjon av farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan variere avhengig av den spesielle anvendelsen som er påtenkt. Bestemmelsen av den passende doseringen eller administreringsmåten ligger godt innenfor kunnskapen til en ordinær lege. Dyreeksperimenter tilveiebringer pålitelig rettledning for bestemmelsen av effektive doser til human terapi. Skalering av effektive doser mellom arter kan bli utført ved å følge prinsippene som nedlagt av Mordenti, J. og Chappell, W., ”The use of interspecies scaling in toxicokinetics”, In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., red., Pergamon Press, New York, 1989, s. 42-96.

Avhengig av typen og alvorligheten av sykdommen er omtrent 1 μg/kg til 50 mg/kg (for eksempel 0,1 til 20 mg/kg) med ANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist en utgangskandidatdosering for administrering til pasienten, uavhengig av hvorvidt det for eksempel er med en eller flere separate administreringer, eller ved kontinuerlig infusjon. Når in vivo-administrering av en ANGPTL4 eller agonist eller antagonist derav blir benyttet, kan normale doseringsmengder variere fra omtrent 10 ng/kg til opp til 100 mg/kg av pattedyrets kroppsvekt eller mer per dag, fortrinnsvis omtrent 1 μg/kg/dag til 10 mg/kg/dag, avhengig av administreringsmåten. Rettledning for spesielle doseringer og leveringsfremgangsmåter blir tilveiebrakt i litteraturen, se for eksempel US patentskrift nr.

4 657 760, 5 206 344 eller 5 225 212. Det er forventet at ulike formuleringer vil være effektive for ulike behandlingsforbindelser og ulike forstyrrelser, slik at administrering som målsøker et organ eller vev, for eksempel kan nødvendiggjøre levering på mulig måte i forhold til denne til et annet organ eller vev. For gjentatte administreringer over flere dager eller lenger, avhengig av tilstanden, blir behandlingen opprettholdt inntil en ønsket undertrykkelse av sykdomssymptomer forekommer. Andre doseringsregimer kan likevel være nyttige. Typisk vil klinikeren administrere et molekyl ifølge oppfinnelsen inntil en dosering er nådd som tilveiebringer den nødvendige, biologiske effekten. Progresjonen til terapien ifølge oppfinnelsen er enkelt overvåket ved hjelp av konvensjonelle teknikker og analyser.

De terapeutiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert på enhver passende måte, inkludert parenteral, subkutan, intraperitoneal, intrapulmonær, intracerebrospinal, subkutan, intraartikulær, intrasynovial, intratekal, oral, topisk og intranasal administrering. Parenterale infusjoner inkluderer intramuskulær, intravenøs, intraarteriell, intraperitoneal eller subkutan administrering. I tillegg blir den terapeutiske sammensetningen passende administrert ved hjelp av pulsinfusjon, spesielt med minskende doser av antistoffet. I visse utførelsesformer blir den terapeutiske sammensetningen gitt ved injeksjoner, for eksempel intravenøse eller subkutane injeksjoner, avhengig delvis av hvorvidt administreringen er kort eller kronisk.

Som beskrevet her kan ANGPTL4, ANGPTL4-agonister eller AGNTPL4-antagonister bli kombinert med et eller flere terapeutiske midler. Den kombinerte administreringen inkluderer ko-administrering ved å benytte separate formuleringer eller en enkel farmasøytisk formulering, og påfølgende administrering i enhver rekkefølge. Anvendelse av flere midler er også inkludert i oppfinnelsen. For eksempel kan en ANGPTL4 eller ANGPTL4-agonist bli gitt i forkant av etter eller alternerende med administrering av det ytterligere terapeutiske middelet, eller kan bli gitt samtidig med dette. I én utførelsesform er det en tidsperiode mens begge (eller alle) aktive midler samtidig utøver deres biologiske aktiviteter.

I visse utførelsesformer involverer behandlingen ifølge oppfinnelsen den kombinerte administreringen av en ANGPTL4-antagonist og et eller flere terapeutiske midler.

Oppfinnelsen omfatter også administrering av flere inhibitorer. Den kombinerte i administreringen inkluderer ko-administrering ved å benytte separate formuleringer eller en enkelt farmasøytisk formulering, og påfølgende administrering i enhver rekkefølge. En ANGPTL4-antagonist kan for eksempel bli gitt i forkant av, etter eller alternerende med administrering av det enklere terapeutiske middelet, eller kan bli gitt samtidig med denne. I én utførelsesform er det en tidsperiode mens begge (eller alle) aktive midler samtidig utøver deres biologiske aktiviteter.

Til forebyggingen eller behandlingen av sykdom vil den passende doseringen av ANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist være avhengig av typen av sykdom som skal bli behandlet, som definert ovenfor, alvorligheten og utviklingen av sykdommen, hvorvidt middelet som blir administrert er til preventive eller terapeutiske formål, til terapi, pasientens kliniske historie og respons på middelet, og vurderingen til den ansvarlige legen. Middelet blir hensiktsmessig administrert til pasienten på et tidspunkt eller over en serie med behandlinger. I et kombinasjonsterapiregime blir preparatene ifølge oppfinnelsen administrert i en terapeutisk effektiv mengde eller en terapeutisk synergistisk mengde. Som benyttet her, er en terapeutisk effektiv mengde slik at ko-administrering av ANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist og et eller flere andre terapeutiske midler, eller administrering av en sammensetning ifølge oppfinnelsen, fører til reduksjon eller inhibering av den målsøkte sykdommen eller tilstanden. En terapeutisk synergistisk mengde er den mengden av ANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist, og et eller flere andre terapeutiske midler, for eksempel som beskrevet her, som er nødvendig for synergistisk eller signifikant å redusere eller eliminere tilstander eller symptomer som er assosiert med en spesiell sykdom.

Fremstilte artikler

En fremstilt artikkel som inneholder materialer som er nyttige i fremgangsmåtene og behandlingen av forstyrrelser som er beskrevet ovenfor er også beskrevet. Den fremstilte artikkelen omfatter en beholder, et merke og et forpakningsinnstikk. Passende beholder inkluderer for eksempel flasker, rør, sprøyter osv. Beholderne kan bli utformet fra en mengde materialer slik som glass eller plastikk. Beholderen inneholder et preparat som er effektivt til å behandle tilstanden og kan ha en steril inngangsåpning (for eksempel kan beholderen være en intravenøs løsningspose eller et rør som har en stopper som er gjennomtrengbar med en hypoderm injeksjonsnål). Minst ett aktivt middel i preparatet er enANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist. Merket på, eller assosiert med, beholderen indikerer at preparatet blir benyttet for å behandle tilstanden som er valgt. Den fremstilte artikkelen kan ytterligere omfatte en andre beholder, som omfatter en farmasøytisk akseptabel buffer, slik som fosfatbufret fysiologisk saltløsning, Ringers løsning og dekstroseløsning. Den kan ytterligere inkludere andre materialer som er ønskelige fra et kommersielt ståsted og et brukerståsted, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtre, nåler og sprøyter. Eventuelt er et sett med instruksjoner, generelt skrevne instruksjoner, inkludert, som vedrører anvendelsen av doseringen av ANGPTL4, agonist eller antagonist for en forstyrrelse som er beskrevet her. Instruksjonene som er inkludert i settet inkluderer generelt informasjon som gjelder dosering, doseringsskjema og administreringsmåte for behandlingen av forstyrrelsen. Beholderen med ANGPTL4, ANGPTL4-agonist eller ANGPTL4-antagonist kan være enhetsdoser, pakker med flere doser (for eksempel multidose forpakninger) eller sub-enhetsdoser.

Deponering av materialer

De følgende materialene blir deponert hos the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, USA (ATCC):

Materiale ATCC Dep. Nr. Deponeringsdato ANGPTL4 (NL2-DNA 22780- 209284 9/18/97

1078)

Deponeringen ble gjort under bestemmelsene til the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure og reguleringene under denne (Budapest Avtalen). Dette sikrer opprettholdelse av en levedyktig kultur av det som er deponert i 30 år fra deponeringsdatoen. Det deponerte vil være tilgjengelig fra ATCC under bestemmelsene i Budapest Avtalen, og er utsatt for en overensstemmelse mellom Genentech, Inc. og ATCC, som sikrer permanent og uregulert tilgjenglighet for etterkommere av kulturen av det som er deponert til allmennheten ved utstedelse av det gjeldende US patentet eller ved frigivelsen til allmennheten av enhver søknad fra USA eller fremmed land, dvs. den som kommer først, og sikre tilgjengelighet for etterkommerne til en som er bestemt av the U.S. Commissioner of Patents and Trademarks som er berettiget dertil ifølge 35 USC §122 og Commissioners regler som gjelder dertil (inkludert 37 CFR §1.14 med spesiell referanse til 886 og 638).

Eieren av foreliggende søknad har gått med på at hvis en kultur med materialene som er deponert skulle dø eller gå tap, eller bli ødelagt når det blir dyrket under passende betingelser, så vil materialene raskt bli erstattet på tilsagn med en annen av det samme. Tilgjengelighet for det deponerte materialet er ikke å bli ansett som en tillatelse til å utøve oppfinnelsen i strid med rettighetene som er gitt under myndigheten til enhver myndighet i overensstemmelse med dens patentlovgivning.

EKSEMPLER

Eksempel 1: ANGPTL4 induserer celleadhesjon og proliferasjon for humane hepatocytter

Generering av adenovirusvektorer og transduksjon: Adenoviruskonstruksjoner har blitt konstruert ved å klone Not1-Not1-cDNA-insersjon inn i polylinkersetet til Ad-easyvektorkonstruksjonssettene fra Stratagene (LaJolla, CA), essensielt som beskrevet av produsenten. Se for eksempel Hesser et al., Blood, 104(1):149-158 (2004).

Generering av hAngptl4(23-406) (PUR9384), mAngptl4(184-410)-IgG (PUR9388) og mAngptl4(23-410) (PUR9452)-enkelt flag merket protein: Høstet cellekulturvæske ble passert over natt på anti-flag-M2-resin (Sigma kat.nr. A-2220). Kolonnen ble vasket til baselinje med PBS og deretter eluert med 50 mM Na-citrat, pH 3,0. Dette volumet ble konsentrert på Amicon-15 10 000 MWCO (Millipore kat.nr. UFC901024). Det siste trinnet var dialyse 1 mM HCl/Super Q H2O og 0,2 um filtrering. En 4-20% tris/glysin (Invitrogen kat.nr. EC6028box) SDS-pagegel /- 10 mM DTT ble benyttet for å bestemme renhet.

Korrekte proteiner ble identifisert med enten massespektrometri eller Edman’s n-terminale sekvensering.

Generering av hAngptl4(184-406)-IgG (PUR9441)-n-terminalt flag-merket fulgt i serie av et n-terminalt hu-Fc-merke: Høstet cellekulturvæske ble passert over natt på PoSep-A (Amersham kat.nr. 113111835). Kolonnen ble vasket til baselinje med PBS.

Deretter ble et vasketrinn med fire kolonnevolumer 0,5M TMAC/PBS pH 7,5 fulgt av en PBS-vasking til baselinje. Elueringstrinn ble utført med 50 mM Na-citrat, pH 3,0. Dette volumet ble konsentrert på Amicon-15 10 000 MWCO (Millipore kat.nr. UFC901024). Det siste trinnet var dialyse i 1 mM HCl/Super Q H2O og 0,2 um filtrering. En 4-20% tris/glysin (Invitrogen kat.nr. EC6028box) SDS-pagegel /- 10 mM DTT er benyttet for å bestemme renhet. Kortekte proteiner ble identifisert ved enten massespektrometri eller Edmans N-terminale sekvensering. Rekombinante proteiner kan også bli fremstilt ved å benytte standardteknikker som er kjent på fagområdet.

Generering av Ad-ANGPTL4-SiRNA: 4 potensielle ANGPTL4-SiRNA-molekyler (Qiagen) ble generert basert på hANGPTL4-fullengdesekvensen. Én ANGPTL4-SiRNA ble valgt basert på evnen til SiRNAet til å inhibere hANGPTL4-ekspresjon. Den målsøkte den følgende DNA-målsekvensen GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (Sekv. id. nr. 3) av ANGPTL4, f. eks. r(GGCCAAGCCUGCCCGAAGAUU) (Sekv. id. nr. 4) og/eller r(UCUUCGGGCAGGCUUGGCCAC) (Sekv. id. nr. 5). SiRNA ble klonet inn i CMVpShuttle-H1.1-overføringsvektoren med en RNA-promotor, for eksempel H1-promotoren (GenScript). SiRNA-ekspresjonskassetten ble deretter klonet for å generere et adnovirus-AdhANGPTL4-SiRNA-konstruksjon. Adenoviruskonstruksjoner har blitt konstruert ved å klone Not1-Not1-cDNA-insersjonen inn i polylinkersetet til Ad-easy-vektor konstruksjonssettene fra Stratagene (LaJolla, CA), essensielt som beskrevet av produsenten. Se f. eks. Hesser et al., Blood, 104(1):149-158 (2004).

Ekspresjon av ANGPTL4 ble bekreftet ved hjelp av Western blottingsanalyse ved å benytte et anti-FLAG-antistoff. En sterkt uttrykkende klon ble valgt og titret ble amplifisert ifølge produsentens instruksjoner. Viruspreparatet ble renset ved hjelp av CsClsentrifugering og estet for revertanter ved hjelp av PCR. Virustitre ble bestemt ved hjelp av 96-brønners cellelysiseksperimenter ifølge produsentens instruksjoner. Disse vektorene, sammen med den medfølgende pShuttleCMV-lacZ, ble rekombinert i BJ5183-elektrokompetente bakterier med AdEasy-vektoren inneholdende Ad5-genomet der E1- og E3-regionene var fjernet. Primære virusstokkløsninger ble fremstilt ved transient å transfektere de rekombinerte AdEasy-plasmidene inn i HEK293-vertsceller. Adenovirus stokkløsningen ble ytterligere amplifisert i HEK293-celler og renset ved å benytte CsC1-gradient rensefremgangsmåte som beskrevet av produsenten. Adenovirusarbeidstitere ble fremskaffet ved hjelp av Elisa-analyse.

Generering av mANGPTL4: 293-celler ble transient transfektert med en konstruksjon som inneholdt en nukleinsyre som koder for fullengde-mANGPTL4 (1-410). mANGPTL4 ble renset fra supernatanten og benyttet i eksperimentet.

Celleadhesjon for hepatocytter: Evnen til ANGPTL4 i å indusere celleadhesjon for primære hepatocytter ble evaluert i 96-brønners plater. Platene ble belagte med murin Angptl4-undersekvens 23-410, fibronektin eller et kontrollprotein NL4 ved ulike konsentrasjoner, for eksempel ingen belegning, 0,3 μg/ml, 3,0 μg/ml eller 30 μg/ml i 60 μl ved 4<o>C over natt. Overskudd av protein ble fjernet og belagte celler ble blokkert med 200 μl 3% BSA i PBS ved 37<o>C i 1,5 time. Etter inkubering ble supernatanten aspirert og vasket en gang med PBS.

De primære, humane hepatocyttene ble fremstilt og dyrket i normalt vekstmedium (Cambrex). Cellene ble vasket 3 ganger med PBS. Cellene ble trypsinert etterfulgt av en trypsinnøytraliseringsløsning (Clonetics). Cellene ble deretter resuspendert i normalt vekstmedium (Cambrex). Cellene ble sådd ut ved 1,5 x 10<4>celler/brønn i et totalt volum på 200 μl. Cellene ble splittet i 5% serum 24 timer før dosering. Cellene ble inkubert i brønner ved 37<o>C i 2 timer. Supernatanten ble fjernet. Cellefesting ble målt ved å benytte en krystallfiolett analyse. 50 μl med 10% formalinløsning ble tilsatt til brønnene og fiksert i 10 minutter. Cellene ble vasket forsiktig en gang med PBS. 50 μl med 0,5% krystallfiolettløsning ble tilsatt som var filtrert før anvendelse. Løsning ble inkubert i brønner i 30 minutter eller mer ved romtemperatur. Brønnene ble vasket 3 til 5 ganger med PBS. PBS ble fjernet fra brønnene og tørket. 96-Brønners platen ble avlest ved en OD550. Se Figur 4. PNAG-fremgangsmåten til Landegren kan også bli benyttet. Se Landegren, U. (1984), J. Immunol. Methods, 67:379-388. Som observert i Figur 4 induserer recombinant mAngptl4 (23-410) celleadhesjon for primære hepatocytter in vitro.

Proliferasjon for hepatocytter: Proliferasjonseffekten til Angptl4 på primære, humane hepatocytter ble undersøkt. Adenoviruskonstruksjoner av Ad-human (h)Angptl4, Ad-LacZ og Ad-Angptl3 ble fremstilt. Se for eksempel Hesser et al., Blood, 104(1):149-158 (2004). Primære, humane hepatocytter ble transdusert med enten en konstruksjon som omfatter adenovirus-Angptl4-konstruksjonen (Ad-Angptl4), adenovirus-LacZ-konstruksjonen (Ad-LacZ) som en kontroll eller adenovirus-Angptl3-konstruksjonen (Ad-Angptl3) ved infeksjonsmultiplisiteten (MOI) på 10, 100 og 1000. Etter 5 dager med vekst for hepatocyttene i normalt hepatocytt vekstmedium (Cambrex), ble cellene talt. Som vist i Figur 5 induserer Ad-Angptl4 hepatocyttproliferasjon in vitro ved MOI på 10.

Eksempel 2: ANGPTL4 induserer proliferasjon av pre-adipocytter

Pre-adipocyttproliferasjon: Evnen til ANGPTL4 til å indusere pre-adipocyttproliferasjon ble evaluert. Humane pre-adipocytter (viceral eller subkutan) ble dyrket på 6-brønners skåler (Falcon, Primari) ved å splitte celler ved en tetthet på 30 000 celler/brønn i et volum på 3 ml med vekstmedium inneholdende serum (pre-adipocytt vekstmedium (Cambrex)). 500 μl med COS-celle kondisjonsmedium fra COS-celler som var transudert med adenoviruskonstruksjoner, for eksempel Ad-LacZ (4), Ad-human (h) Angptl4 (23-406) (5) eller Ad-human (h)Angptl3 (fullengdeprotein) (6) eller rekombinante proteiner (rekombinant, murint Angptl4 (23-410) (2), IgG-mAngptl4 (184-410) (3) eller ingen tilsatt (1) ved de følgende konsentrasjonene (rmAngptl4 (23-410) (5 μg/ml), IgG-mAngptl4 (5 μg/ml)) ble tilsatt direkte etter utsåing av cellene. Cellene ble dyrket i 5 dager ved 37<o>C i 5% CO2 i inkubator. Cellene ble trypsinert med 500 μl 1 x trypsin i 3 til 5 minutter.

Celleblandingen (0,5 ml) ble pipettert inn i 9,5 ml isoton bufferløsning og talt i et celletellerør (ved å ta hensyn til en fortynningsfaktor på 20). Som vist i Figur 6, panel A, induserer både rekombinant, murint Angptl4 (23-410) (2) og kondisjonert COS-cellemedium inneholdende hAngptl4 (23-406) (5) induserer primær, human viceral pre-adipocyttproliferasjon. Figur 6, panel B viser at både rekombinant, murint Angptl4 (23-410) (2) og kondisjonert COS-cellemedium inneholdende hAngptl4 (23-406) (5) induserer primær, human, subkutan pre-adipocyttproliferasjon.

FACS-analyse av Angptl4-binding til humane, primære adipocytter: Binding av ANGPTL4 til humane, primære adipocytter ble undersøkt ved hjelp av FACS-analyse.

Primære, humane, subkutane adipocytter ble plassert i 10 cm kulturskåler ved 500 000 til 1 x 10<6>celler/prøvebrønn. Cellene ble splittet dagen før FACS. Cellene ble vasket en gang med PBS og deretter ble 10 ml 20 mM EDTA i PBS tilsatt og inkubert i 10 til 20 minutter. Etter 20 minutter ble cellene skrapet vekk fra platen. 10 ml 5% FCS i PBS ble tilsatt og celler ble overført til et 50 ml Falcon-rør. Cellene ble spunnet ned ved 1,8 K rpm i 5 minutter ved 4<o>C. Supernatanten ble fjernet og cellene ble resuspendert i 1 ml 5% FCS i PBS. 100 μl cellesuspensjon ble fordelt i et 5 ml FACS-rør inneholdende 1 μg protein inkubert i 30 minutter eller mer på is. De følgende proteiner ble benyttet: mAngptl4 (23-410), PUR 9452, 0,4289 mg/ml (2 μl/prøve), hAngptl4 (23-406), PUR 9384, /- 99 μg/ml (10 μl/prøve), mAngptl4 (184-410)-IgG, PUR 9388, 8,5 mg/ml (0,2 μl/prøve), hAngplt4 (184-406)-IgG, PUR 9441, 1,5 mg/ml (1 μl/Uprøve) og kontroll-FLAG-BAP (Sigma) 0,1 mg/ml (2 μl/prøve). Etter inkubering ble rørene fylt med 5 ml 5% FCS i PBS på is. Cellene ble spunnet ned i 5 minutter ved 2K rpm. Supernatanten ble fjernet. Anti-FLAG-FITC-antistoff (Sigma) ble tilsatt (2 μl med antistoff (100 μg/ml stokkløsning) og inkubert på is i 5 minutter eller mer. Den endelige antistoffkonsentrasjonen var 1 μg/ml. 5 ml 5% FCS i PBS ble tilsatt og celler ble spunnet ned i 5 minutter ved 1,8 K rpm ved 4<o>C. Supernatanten ble fjernet og cellene ble resuspendert i 0,25 ml PBS med 5% FCS på is. 0,05% natriumazid kan også være tilstede for å hindre reseptorinternalisering. 1 μl med 1:50 fortynnet stokkløsning av propidiumjodid (PI) ble tilsatt per prøve. Cellene ble deretter utsatt for FACS. Som vist i Figur 7, under disse betingelsene, binder både human Angptl4 former, rhAngptl4 (23-406) og rhIgG-hAngptl4 (184-406) mer effektivt til subkutane adipocytter sammenlignet med den murine ortologen.

Eksempel 3: Angptl4 induserer migrasjon for primære, humane, subkutane preadipocytter

Angptl4 induserer cellemigrasjon: Vi undersøkte Angptl4 sin evne til å indusere cellemigrasjon for primære, humane, subkutane pre-adipocytter. Cellebevegelighet ble målt som beskrevet (se for eksempel Camenish et al., J. Biol. Chem., 277(19):17281-17290 (2002)) ved å benytte HTS-multibrønn vevskulturinsersjonene med 3 μm porestørrelse (Becton Dickinson, NJ), hANGPTL4 (1-406) ble fortynnet i 50/50/0,1% BSA til 5,1 og 0,2 μg/ml. Som en positiv kontroll ble membranene inkubert med enten 10% fetalt kalveserum (FCS) inneholdende medium eller 0,1 μg/ml rekombinant, humant PDGF-BB (R&B Systems). PBM/0,1% BSA ble benyttet som en negativ kontroll. Primære, humane adipocytter ble vasket tre ganger med PBS, høstet og suspendert ved omrent 2-5 x 10<5>celler/ml i PBM/0,1% BSA. De følgende cellepreparatene ble testet, der ANGPTL4 er indikert som NL2.

Adipocytt

Figur 8, Panel A NL2 5 μg PBM/0,1% BSA NL2 0,5 μg 10% FBS

NL2 0,2 μg 10% FBS PDGF-BB 0,1 μg PBM/0,1% BSA

Figur 8, Panel B og C NL2 6,0 μg PBM/0,1% BSA NL2 1,5 μg PBM/0,1% BSA NL2 0,375 μg PBM/0,1% BSA PDGF-BB 0,1 μg PBM/0,1% BSA

Preparatene ble tilsatt til bunnkammeret og preparatene ble inkubert ved 37<o>C i 19 timer.

Cellesuspensjon (250 μl) ble tilsatt til det øvre kammeret og cellene ble tillatt å migrere over natt ved 37<o>C i en fuktinkubator ved 5% CO2. Etter inkubering ble mediumet aspirert fra både toppkammeret og bunnkammeret, og cellene som hadde migrert til den nedre overflaten av membranen ble fiksert med metanol (400 μl med MeOH i 30 minutter ved 4<o>C, fjerne MeOH og lufttørke i 40 minutter) og farget med YO-PRO-1-jodid (Molecular Probes, OR) (400 μl YO-PRO-1-jodid med 10 μm (1:100 fra 1 mM stokkløsning)).

Migrasjonsresultater er kvantifisert i kraft av det gjennomsnittlige antallet celler/mikroskopisk felt ved en forstørrelse på 20 ganger ved å benytte Openlab-programvaren (Improvision, MA). Som observert i Figur 8, Panel A, induserte tilsatt hAngptl4 til primære, humane, subkutane pre-adipocytter dem til å migrere. Figur 8, Panel B illustrerer migrasjon i 7 timer. Figur 8, Panel C illustrer grafisk migrasjonen av adipocytter etter 7 timer med behandling, enten uten serum (1), 10% fetalt kalveserum (FCS) (2), PDGF-BB (3), mANGPTL4 (4).

Eksempel 4: Variant av Angptl4

En variant-ANTPTL4 ble fremstilt ved å benytte et standard mutagenesesett (for eksempel QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, California)) ved å følge produsentens protokoll. To aminosyresubstitusjoner ble innført i den humane ANGPTL4-sekvensen (se for eksempel Figur 2). Substitusjonene var på posisjon 162 og 164 (R162G og R164E) som fører til en endring fra RKR til GKE. ANGPTL4-protein (L280-plasmid, aa 1-406) eller variant-ANGPTL4 ble isolert fra supernatanten fra transient, transfekterte COS-7-celler. Til rensing ble supernatanten lastet opp på en nikkelkolonne. Protein ble påvist ved hjelp av Western-blotting med et anti-FLAG-HRP-antistoff. Se Figur 3, Panel B. Når substitusjoner ble innført og variant-ANGPTL4 ble sammenlignet med nativt ANGPTL4-protein eller villtype-ANGPTL4-protein ble variant-ANGPTL4 funnet å ha en høyere molekylvekt enn den native ANGPTL4 ved Western-blotting. Substitusjon fra RKR til GKE og posisjon 162 og 164 i det native proteinet forhindret proteolytisk degradering av ANGPTL4.

Eksempel 5: Angptl4 binder til integrin αv β5

Angiopoietiner er utskilte faktorer som regulerer angiogenese ved å binde til den endotelcellespesifikke tyrosinkinasereseptoren Tie2 via deres fibronogen (FBN)-lignende domene. Det oppkveilede kveiledomenet som foreligger i familien med utskilte ligander ble funnet å være nødvendig for ligandoligomerisering (se for eksempel Procopio et al., J. Biol. Chem., 274:30196-201 (1999)).

Tilsvarende som for angiopoietiner, er ANGPTL3 og ANGPTL4 utskilte glykoproteiner, der hver består av et N-terminale signalpeptid etterfulgt av et oppkveilet kveieldomene og et C-terminalt FBN-lignende domene. Det ble bestemt at ANGPTL3 binder til αv β3 via det FBN-lignende domenet. Vi bestemte at ANGPTL4 binder til αv β5. 293-1953-cellelinje som var stabilt transfektert med αv β5-integrinet ble testet for evnen til å binde eller addere til ANGPTL4-belagte plater. Celler ble høstet og fortynnet til 10<5>celler/ml i serumfritt medium inneholdende PBS, 1% BSA, 1 mM CaCl2 og 1 mM MgCl2. Celler ble forhåndsinkubert med eller uten anti-integrin- αv β5-antistoffer (MAB1961 (Chemicon, Temecula, CA)) eller peptider i 15 minutter ved 37<o>C. Rekombinant mANGPTL4, BSA eller vitronektin (1 μg, 3 μg, 10 μg eller 30 μg/ml) ble belagt på en Nunc Maxisorp 96-brønners flatbunnet mikrotiterplate over natt ved 4<o>C og blokkert med 200 μl 3% BSA i fosfatbufret fysiologisk saltløsning (PBS), pH 7,4 i 1,5 timer ved 37<o>C. Cellesuspensjoner (5 x 10<4>celler/100 μl/brønn (5 x 10<5>/ml)) ble tilsatt til de belagte brønnene og platene ble inkubert ved 37<o>C i 5,5 time. Ikke-adderende celler ble fjernet ved hjelp av PBS-vaskinger og cellefesting ble målt ved å tilsette 200 μl med CyQuant GD Dye (Molecular Probes (Invitrogen detection Technologies (Carlsbad, California)) (1:400)/cellelysisbuffer og inkubert i 2-5 minutter. Prøvefluorescensen ble målt ved å benytte 480 nm eksitering og 520 nm emisjonsmaksima. PNAG-fremgangsmåten til Landegren kan bli benyttet (se for eksempel Landegren, J. Immunol. Methods., 67:379-388 (1984)). Celler som uttrykker αv β5 viste addering til ANGPTL4 og vitronektin (USBiological, Swampscott, Massachusetts), en positiv kontroll, sammenlignet med BSA, en negativ kontroll. Se Figur 9, Panel A.

For å bestemme hvorvidt αv β5-integrinet var tilstrekkelig for å mediere ANGPTL4-celleadhesjon, ble blokkerende antistoffer testet for deres evne til å inhibere adhesjonen i celleadhesjonsanalysen. Funksjonelle blokkeringsantistoffer (anti- αv β5-antistoff (MAB1961 (Chemicon, Temecula, CA)) eller anti-hANGPTL4-antistoffer) ble tilsatt til 293-1953-celler før inkubering med de proteinbelagte brønnene (BSA (1), vitronektin (2) eller ANGPTL4 (3)). Se Figur 9, Panel B. Anti- αv β5- og anti-ANGPTL4-antistoffer avbrøt ANGPTL4-celleadhesjonsakvitet.

Ytterligere eksperimenter ble utført for å bekrefte at ANGPTL4 binder αv β5. ELISA-eksperimentet ble utført for å påvise om mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal (1-183) og/eller IgG-hANGPTL4-C-terminal (184-406) binder til αv β5 (USBiological, 37K, Swampscott, Massachusetts) belagte plater. 100 μl/brønn med integrin- αv β5-fortynningsmiddel (1 μg/ml belegningsbuffer (50 mM karbonat/bikarbonat, pH 9,6)) med belegningsbuffer ble inkubert over natt ved 4<o>C. Platene ble vasket tre ganger med vaskebuffer (PBS, pH 7,4, 0,05% Tween-20) og 100 μl/brønn med blokkeringsbuffer (PBS, pH 7,4, 0,5% BSA) ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Ulike mengder (0,070 μg, 0,22 μg, 0,66 μg, 2 μg eller 6 μg) med prøver, mANGPTL4, IgG-hANTPL4-N-terminal (1-183) og/eller IgG-hANGPTL4-C-terminal (184-406) ble klargjort i prøvebuffer (0,5% BSA, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,05% Tween 20, 1 mM MnCl2, 50 μM CaCl2, 50 μM MgCl2, 100 mM NaCl) og inkubert i 30 minutter. Prøver ble tilstat til plater (100 μl/brønn i mengdene som er inkubert ovenfor) og inkubert i 2 timer ved romtemperatur ved forsiktig risting. Platene ble vasket med buffer og 100 μl/brønn anti-Flag-pepperrotperoksidase (HPR) (100 ng/ml) (Jackson, kat.nr. 109-036-098) i analysebuffer (PBS, pH 7,4, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20) ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Platene ble vasket.

100 μl/brønn med tetrametylbenzidin (TMB) (Moss, Inc.) ble tilsatt og inkubert i platene inntil god farge var utviklet ved romtemperatur. 100 μl/brønn stoppløsning (1 M H3PO4) ble tilsatt for å stoppe reaksjonen. Platene ble avlest ved 630 nm. mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal og IgG-hANGPTL4-C-terminal bandt til αv β5-belagte plater, selv om noe mer IgG-hANGPTL4-C-terminal bandt til platene. Se Figur 9, Panel C.

Anti-ANGPTL4-antistoffer inhiberer binding av ANGPTL4 til αv β5-belagt plate.

ELISA-eksperimenter ble utført. 100 μl/brønn med integrin- αv β5-fortynningsmiddel (1 μg/ml belegningsbuffer (50 mM karbonat/bikarbonat, pH 9,6)) med belegningsbuffer ble inkubert over natt ved 4<o>C. Platene ble vasket tre ganger med vaskebuffer (PBS, pH 7,4, 0,05% Tween-20) og 100 μl/brønn med blokkeringsbuffer (PBS, pH 7,4, 0,5% BSA) ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur ved forsiktig risting. 0,6 μg til 6,0 μg med prøver, mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal (1-183) og/eller IgG-hANGPTL4-C-terminal (183-406) i prøvebuffer (0,5% BSA, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,05% Tween 20, 1 mM MnCl2, 50 μM CaCl2, 50 μM MgCl2, 100 mM NaCl) ble inkubert med anti-ANGPTL4-antistoffer (1,5 μg) eller anti-Dscr (1,5 μg) i 30 minutter. Etter inkubering ble 100 μl/brønn med prøve /- antistoff inkubert med platene i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig risting. Plater ble vasket med buffer og 100 μl/brønn av anti-Flag-HRP (100 ng/ml) i analysebuffer (PBS, pH 7,4, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20) ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Platene ble vasket og 100 μl/brønn med TMB ble tilsatt og inkubert i platene inntil god farge var utviklet ved romtemperatur. 100 μl/brønn stopp-løsning (1 M H3PO4) ble tilsatt for å stoppe reaksjonen. Platene ble avlest ved 630 nm. Anti-ANGPTL4-antistoffer reduserte mengden av mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-N-terminal og IgG-hANGPTL4-C-terminal binding til de αv β5-belagte platene sammenlignet med anti-Dscrantistoff, 5G7-monoklonalt antistoff eller medium. Se Figur 9, Panel D.

I et annet eksperiment ble binding av ANGPTL4 og integrin- αv β5 vist ved ELISA. I dette eksperimentet ble 80 μl/brønn med hANGPTL4-C-terminal, vitronektin eller BSA (5 μg/ml) tilsatt til plater i belegningsbuffer (50 mM karbonat/bikarbonat, pH 9,6) og inkubert over natt ved 4<o>C. Platene ble vasket (vaskebuffer: PBS, pH 7,4, 0,05% Tween 20 og 100 μl/brønn blokkeringsbuffer (PBS, pH 7,4, 0,5% BSA) med enten medium, anti-hANGPTL4-antistoffer (15 μg/100 μl) eller anti-Dscr-antistoffer (15 μg/100 μl) ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Platene ble vasket og αv β5100 μl (3-9 μg/ml) ble tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig risting. Platene ble vasket og 1 μg/ml (1:1000) med anti- αv β5-antistoff (Chemicon) (5 μg/100 μl) ble tilsatt i analysebuffer (PBS, pH 7,4, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20) og inkubert i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Etter inkubering ble platene vasket og 100 μl/brønn med pepperrotperoksidase (HRP)-anti-mus (1:5000) ble tilsatt i analysebuffer. Platene ble vasket og 100 μl/brønn tetrametylbenzidin (TMB) ble tilsatt og inkubert ved romtemperatur inntil det forelå god fargeutvikling. Reaksjonen ble stoppet med 100 μl/brønn med 1 M H3PO4 og platen ble avlest ved 630 nm. αv β5 binder til ANGPTL4 (spor 1) og vitronektrin (spor 4)-belagteplater. Bindingen blir blokkert med et anti-ANGPTL4-antistoff (spor 2), men ikke når kontrollantistoffet anti-Dscr ble benyttet (spor 3) eller når et kontrollprotein er belagt på platene (spor 5). Se Figur 9, Panel E.

Dermed viser disse funnene at rekombinant ANGPTL4 binder spesifikt til αv β5-integrin.

Eksempel 6: Angptl4 øker triglyserider i en mus når den blir injisert intravenøst Triglyseridnivåer ble bestemt i C57B1-6-mus injisert med ulike adenoviruskonstruksjoner som inkluderer ANGPTL4. C57B1-6-mus ble injisert intravenøst i halen med enten (1) adenovirus-GFP-konstruksjon, (2) adenovirus-Gd-konstruksjon, (3) adenovirus-ANGPTL4 (1-406)-konstruksjoner, (4) adenovirus-ANGPTL4 (1-183)-konstruksjon, (5) adenovirus-ANGPTL4 (184-406)-konstruksjon, (6) adenovirus-ANGPTL4-variantkonstruksjon, (7) adenovirus-ANGPTL4 (1-408)-konstruksjon og (8) adenovirus kontrollkonstruksjon. Triglyseridnivåer (mg/dl) ble målt fra blodprøver fra mus 7 dager etter injeksjon. Som observert i Figur 10, har ANGPTL4-N-terminal konstruksjon (1-183) den mest uttalte effekten på triglyseridnivåer sammen med fullengde-ANGPTL4-konstruksjon og ANGPTL4-variantkonstruksjon.

Eksempel 7: Generering og analyse av mus som omfatter en ANGPTL4-genforstyrrelse

For å undersøke rollen til en ANGPTL4, ble forstyrrelse i et ANGPTL4-gen frembrakt ved hjelp av homolog rekombinasjon. Spesifikt ble transgene mus som omfatter forstyrrelser i ANGPTL4-genet (dvs. knockout mus) fremstilt ved enten genmålsøking eller geninnfangning. Mutasjoner ble bekreftet ved hjelp av southern-blott-analyse for å bekrefte korrekt målsøking på både den 5’ og 3’ enden. Genspesifikk genotyping ble også utført ved hjelp av genomisk PCR for å bekrefte tapet av det endogene, native transkriptet som vist ved RT-PCR ved å benytte primere som annealer til exon som flankerer insersjonssetet. Målsøkingsvektorer ble elektroporert inn i 129-stamme-ES-celler og målsøkte kloner ble identifisert. Målsøkte kloner ble mikroinjisert inn i vertsblastocytter for å produsere kimerer. Kimerer ble alet opp med C57-dyr for å produsere F1-heterozygoter.

Heterozygoter ble interkrysset for å fremstille F2-villtype-, heterozygote og homozygote grupper som ble benyttet til fenotypisk analyse. Hvis ikke nok F1-hetgerozygoter ble produsert, så ble F1-heterozygotene krysset med villtype C57-mus for å frembringe tilstrekkelig heterozygoter for å ale opp grupper for å bli analysert for en fenotype. Alle fenotypiske analyser blir utført fra 12-16 uker etter fødsel.

Resultater

Generering og analyse av mus som omfatter ANGPTL4-genforstyrrelser: I disse knockout eksperimentene ble genet som koder for ANGPTL4 (PRO197-polypeptid betegnet som DNA 22780-1078, UNQ171) forstyrret. Den genspesifikke informasjonen for disse undersøkelsene er som følger: det muterte musegenet tilsvarer nukleotidreferanse:

NM_020581. Aksesjon: NM_020581 NID: 10181163, eller mus-muskulus-angiopoietinlignende-4 (Angptl4), proteinreferanse: Q9Z1P8. Aksesjon: Q9SZ1P9 NID, eller musmuskulus (mus). NG27 (hepatisk angiopoietinbeslektet protein) (hypotetisk protein 425O18-1) (fibrinogen/angiopoietinbeslektet protein) (angiopoietinlignende protein) (angiopoietinlignende-4). MOUSESTRNRDB, den humane gensekvensreferansen:

NM_139314. Aksesjon: NM_139314 NID:21536397 Homo sapiens-angiopoietinlignende-4 (ANGPTL4), den humane proteinsekvensen tilsvarer referanse: Q9BY76. Aksesjon: Q9BY78 NID: eller homo sapiens (menneske). Angiopoietinbeslektet protein-3-forløper (angiopoietinlignende-4) (hepatisk fibrinogen/angiopoietinbeslektet protein) (HFARP) (angiopoietinlignende protein PP1158). HUMANSTRNRDB.

Det forstyrrede musegenet Angptl4 (angiopoietinlignende-4) som er ortologen av human ANGPTL4. Aliaser inkluderer de som er beskrevet her og BK89, Bk89, FIAF, NG27, Ng27, HFARP, Farp-pending, fibrinogen/angiopoietinbeslektet protein, viktigste vevsforlikelighetskompleksregsion NG27, ARP4, PGAR, PPARG, PP1158, ANGPTL2, fasteindusert adiposefaktor, PPARG-angiopoietinbeslektet protein, hepatisk angiopoietinbeslektet protein og hepatisk fibrinogen/angiopoietinbeslektet protein.

Målsøkte mutasjoner eller genfangingsmutasjoner ble generert i stamme 129SvEVBrd-avledede, embryonale stamceller (ES). De kimere musene ble krysset med C57BL/6J-albinomus for å generere F1-heterozygote dyr. Disse avkommene ble interkrysset for å generere F2-villtype, heterozygote og homozygote mutante avkom. Ved sjeldne tilfeller, for eksempel, når svært få F1-mus ble fremskaffet fra kimerene, ble F1-heterozygote mus krysset med 129SvEVBrd/C57-hybride mus for å gi ytterligere heterozygote dyr til interkryssingen for å generere F2-musene. Fenotypisk analyse ble utført på mus fra denne generasjonen som beskrevet nedenfor.

wt het hom Totalt

Observert 18 38 11 67

Forventet 16,75 33,5 16,75 67

Chi-kvadrat = 2,76, signifikans = 0,26294 (hom/n) = 0,16, gjennomsnittlig kullstørrelse=7.

Retrovirusinsersjon (OST) forekom som forstyrret genet mellom kodende ekson 2 og 3 (NCBI aksesjonnummer NM_020581.1).

Villtypeekspresjon av målgen ble påvist embryonale stamceller (ES) og i alle voksne vevsprøver som ble testet med RT-PCT, bortsett fra hale. RT-PCR-analyse avslørte at transkriptet var fraværende i (-/-)-musen som ble analysert.

1. Fenotypisk analyse

Total fenotypisk oppsummering: Mutasjon av gen som koder for ortologen av humant angiopoietinlignende-4 (ANGPTL4) førte til minskede kolesterol- og triglyseridnivåer hos (-/-)-mus. I tillegg oppviste (-/-)-hannmusene en forbedret glukosetoleranse i glukosetoleransetest. De mutange (-/-)-musene viste også immunologiske unormalheter, inkludert forhøyede, gjennomsnittlige serum-IgM-nivåer og gjennomsnittlige, absolutte neutrofilantall sammenlignet med deres (+/+)-kullkamerater. Transkript var fraværende ved RT-PCR.

Kardiovaskulær fenotypisk analyse/metabolisme blodkjemi: I området med kardiovaskulær biologi ble fenotypisk testing utført for å identifisere potensielle mål for behandlingen av kardiovaskulære, endotele eller angiogene forstyrrelser slik som hypertensjon, aterosklerose, hjertesvikt, slag, ulike koronare arteriesykdommer, dyslipidemier slik som høyt kolesterol (hyperkolesterolemi) og forhøyede serumtriglyserider (hypertriglyseridemi), kreft og/eller fedme. De fenotypiske testene inkluderte målingen av serumkolesterol og serumtriglyserider. I tillegg er blodkjemi fenotypeanalyser også inkludert glukosetoleransetester til å måle insulinsensitivitet og endringer i glukosemetabolisme. Unormale glukosetoleranse testresultater er indikative på, men behøver ikke å være begrenset til, de følgende forstyrrelsene eller tilstandene: diabetes type-I og type-II, Syndrom-X.

De fenotypiske testene i denne omgang inkluderte målingen av serumkolesterol og serumtriglyserider.

Blodlipider

Prosedyre: En gruppe på 4 villtype hanner og 8 homozygote hanner ble benyttet i disse analysene. Gjennomsnittlige serumkolesterolnivåer og triglyseridnivåer ble målt og sammenlignet med kjønnsmatchede (+/+)-kullkamerater. Samtidig testing av glukosetoleranse ble utført siden denne testen er standarden for å definere forstyrret glukosehomeostase hos pattedyr. Glukosetoleransetesten ble utført ved å benytte et LIfescan-glukometer. Dyr ble injisert IP med 2 g/kg med D-glukose levert som en 20% løsning og blodglukosenivåer ble målt ved 0, 30, 60 og 90 minutter etter injeksjon. COBAS Integra 400 (Roche) ble benyttet for å kjøre blodkjemiske tester på mus.

Resultater: De homozygote, mutante hunnmusene og hannmusene oppviste et merkbart minsket gjennomsnittlig triglyseridnivå sammenlignet med deres kjønnsmatchede, villtype kullkamerater og de historiske gjennomsnittene. Disse mutantene viste også minskede, gjennomsnittlige serumkolesterolnivåer sammenlignet med deres villtype kullkamerater. Samtidig viste (-/-)-hannmus en forbedret glukosetoleranse i nærvær av normal fastende glukose ved alle tre intervaller som ble testet sammenlignet med deres kjønnsmatchede (+/+)-kullkamerater og de historiske gjennomsnittene, mens (-/-)-hunnmusene viste et minsket, gjennomsnittlig serumglukosenivå. Oppsummert oppviste disse knockout musene en positiv fenotype med hensyn på lipid og/eller glukosemetabolisme. Slike kan mutante mus som mangler ANGPTL4-gener virke som en modell for behandling av kardiovaskulær sykdom. Antagonister av ANGPTL4 eller dens kodende gen vil spille en viktig rolle i å regulere blodlipider, spesielt i å opprettholde normal kolsterol- og triglyseridmetabolisme. Slike inhibitorer eller antagonister av ANGPTL4 vil være nyttige i behandlingen av slike kardiovaskulære sykdommer som er assosiert med dyslipidemi som: hypertensjon, aterosklerose, hjertesvikt, slag, ulike koronare arteriesykdommer, fedme og/eller diabetes.

Immunologifenotypisk analyse: Immunbeslektede og inflammatoriske sykdommer er manifesteringene eller konsekvensene av ganske kompleks, ofte flersammenbundne biologiske veier som i normal fysiologi er kritiske for å respondere på angrep eller skade, sette i gang reparasjon fra angrep eller skade og sette i gang iboende eller tillært forsvar mot fremmede organismer. Sykdom eller patologi foregår når disse normale, fysiologiske veiene forårsaker ytterligere angrep eller skade, enten som direkte relatert til intensiteten av responsen, som en konsekvens av unormal regulering eller overdreven stimulering, som en reaksjon på selv, eller en kombinasjon av disse.

Selv om fremkomsten av disse sykdommene ofte involverer flertrinnsveier og ofte flere ulike biologiske systemer/veier, kan intervensjon på kritiske punkter i en eller flere av disse veiene ha en lindrende eller terapeutisk effekt. Terapeutisk intervensjon kan foregå ved enten antagonisme av en skadelig prosess/vei eller stimulering av en fordelaktig prosess/vei.

T-lymfocytter (T-celler) er en viktig komponent i en pattedyr immunrespons. T-celler gjenkjenner antigener som er assosiert med et selvmolekyl som er kodet for av gener innenfor det viktigste vevsforlikelighetskomplekset (MHC). Antigenet kan være oppvist sammen med MHC-molekyler på overflaten av antigenpresenterende celler, virusinfiserte celler, kreftceller, transplantater osv. T-cellesystemet eliminerer disse endrede cellene som utgjør en helserisiko for vertsdyret. T-celler inkluderer hjelpe-T-celler og cytotoksiske T-celler. Hjelpe-T-celler proliferer omfattende etter gjenkjenning av et antigen-MHC-kompleks på en antigenpresenterende celle. Hjelpe-T-celler utskiller også en mengde cytokiner, for eksempel lymfokiner, som spiller en sentral rolle i aktiveringen av B-celler, cytotoksiske T-celler og en mengde andre celler som deltar i immunresponsen.

I mange immunresponser infiltrerer inflammatoriske celler skadestedet eller infeksjonsstedet. De migrerende cellene kan være neutrofile, eosinofile, monocyttiske eller lymfocyttiske slik som dette kan bli bestemt ved hjelp av histologisk undersøkelse av de rammede vevene. Se for eksempel Current Protocols in Immunology, red., Joh E. Coligen, 1994, John Wiley & Sons, Inc.

Mange immunrelaterte sykdommer er kjent og har blitt omfattende undersøkt. Slike sykdommer inkluderer immunmedierte inflammatoriske sykdommer (for eksempel reumatoid artritt, immunmediert nyresykdom, hepatobiliære sykdommer, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), psoriasis og astma), ikke-immunmedierte inflammatoriske sykdommer, smittsomme sykdommer, immunsvikt sykdommer, neoplasi og transplantatfrastøtning osv. På området med immunologi ble mål identifisert for behandlingen av inflammasjonssykdommer og inflammatoriske sykdommer.

Området med immunologi har nå blitt identifisert her for behandlingen av inflammasjon og inflammatoriske forstyrrelser. Immunrelaterte sykdommer kan i et tilfelle bli behandlet ved å undertrykke immunresponsen. Ved å benytte nøytraliserende antistoffer som inhiberer molekyler som har immunstimulatorisk aktivitet, vil dette være fordelaktig behandling av immunmedierte og inflammatoriske sykdommer. Molekyler som inhiberer immunresponsen kan bli benyttet (proteiner direkte eller via anvendelsen av antistoff agonister) til å inhibere immunresponsen og slik lindre immunrelatert sykdom.

Den følgende testen ble utført:

Serumimmunglobulin isotypingsanalyser: Serumimmunglobulin isotypingsanalysen ble utført ved å benytte et Cytometric Bead Array (CBA) sett. Denne analysen blir benyttet for raskt å identifisere tungkjede- og lettkjede isotypene til et monoklonalt museantistoff i en enkelt prøve. Verdiene som er uttrykt er ”relative fluorescensenheter” og er basert på påvisningen av kappa lettkjede. Enhver verdi <6 er ikke signifikant..

Resultater: Serumimmunglobulin isotypingsanalysen avslørte at mutante (-/-)-mus oppviste en forhøying av IgM-serumimmunglobulinet med deres kjønnsmatchede (+/+)-kullkamerater. IgM-immunglobuliner er det første som blir produsert i en humoral immunrespons for å nøytralisere bakterielle toksiner og er spesielt viktig for å aktivere komplementsystemet. Likeledes har IgG-immunglobuliner nøytraliserende effekter og i mindre omfang er de viktige for aktivering av komplementsystemet. I tillegg oppviste (-/-)-musene et økt, gjennomsnittlig, absolutt nøytrofilantall sammenlignet med deres (+/+)-kullkamerater og det historiske gjennomsnittet. Den observerte fenotypen tyder på at ANGPTL4 er en negativ regulator av inflammatoriske responser. Disse immunologiske unormalhetene tyder på at inhibitorer (antagonister) av ANGPTL4 kan være viktige midler som kan stimulere immunsystemet (slik som T-celleproliferasjon) og vil finne anvendelse i tilfellene der denne effekten vil være fordelaktig for individet slik som i tilfellet med leukemi og andre typer av kreft, og hos immunkomprimitterte pasienter, slik som AIDS-pasienter. I overensstemmelse med dette kan ANGPTL4 eller agonister derav spille en rolle i å inhibere immunresponsen og vil være nyttige kandidater for å undertrykke skadelige immunresponser, for eksempel i tilfellet med transplantatfrastøtning eller transplantatversus-vertssykdom.

Eksempel 8: Fremstilling av antistoffer som binder til Angptl4

Teknikker for å fremstille de polyklonale antistoffene og monoklonale antistoffene er kjent på fagområdet og er beskrevet her. Antigener (eller immunogener) som kan bli benyttet inkluderer renset protein ifølge oppfinnelsen, proteinfragmenter, fusjonsproteiner inneholdende slikt protein og celler som uttrykker rekombinant protein og/eller proteinfragmenter på celleoverflaten. Seleksjon av antigenet kan bli gjort av fagfolk på området uten unødvendig eksperimentering.

Mus, slik som Balb/c-mus, blir immunisert med antigenet emulgert i komplett Freunds adjuvans og injisert subkutant eller intraperitonealt i en mengde fra 1-100 mikrogram. Alternativt blir antigenet emulgert i MPL-TDM-adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mont.) og injisert inn i dyrets bakfotblader. De immuniserte musene ble deretter boostet 10-12 dager senere med ytterligere antigen emulgert i den valgte adjuvansen. I flere uker deretter kan musene også bli boostet med ytterligere immuniseringsinjeksjoner. Serumprøver kan periodisk bli fremskaffet fra mus ved hjelp av retroorbital tapning for testing i ELISA-analyse for å påvise antistoffene.

Etter at et passende antistofftiter har blitt påvist, kan dyrene som er ”positive” for antistoffer bli injisert med en siste intravenøs injeksjon med den gitte liganden. Tre til fire dager senere blir musene avlivet og miltcellene blir høstet. Miltcellene blir deretter fusjonert (ved å benytte 35% polyetylenglykol) til en valgt murin myelomcellelinje slik som P3X63AgU.1, som er tilgjengelig fra ATCC, nr. CRL 1597. Fusjonen genererer hybridomceller som kan bli platet ut i 96-brønners vevskulturplater inneholdende HAT-medium (hypoksantin, aminopterin og tymidin) for å inhibere proliferfasjon av ikkefusjonerte celler, myelomhybrider og miltcellehybrider.

Hybridomcellene vil bli screenet i en ELISA for reaktivitet mot antigen.

Bestemmelse av ”positive” hybridomceller som utskiller de ønskede monoklonale antistoffene mot ANGPTL4 her, ligger innenfor kunnskapen på fagområdet.

De positive hybridomcellelinjene kan bli injisert intraperitonealt inn i syngeneisk Balb/c-mus for å produsere ascites inneholdende de monoklonale anti-ANGPTL4-antistoffene. Alternativt kan hybridomcellene bli dyrket i vevskulturflasker eller rulleflasker. Rensing av de monoklonale antistoffene som er produsert i ascites kan bli utført ved å benytte ammoniumsulfatpresipitering, etterfulgt av gleksklusjonskromatografi. Alternativt kan affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein-A eller protein-G bli benyttet.

For eksempel ble polyklonale kaninantistoffer generert ved immunisering av kanin med 500 μg med rekombinant, humant ANGPTL4-protein (23-406) generert i E. coli på dag 1, 40 og 70. Serum ble høstet på dag 80 og 120 etter immunisering og antistoff ble renset ved hjelp av protein-A-sefadeks kolonne.

Eksempel 9: Blokkerings- eller nøytraliseringsantistoffer

Antistoffer mot antigener som er beskrevet her, for eksempel ANGPTL4, kan bli identifisert ved hjelp av en mengde teknikker som er kjent på fagområdet, for eksempel ELISA. Plater kan for eksempel bli belagt med polypeptidet av interesse, for eksempel ANGPTL4 eller et fragment derav, og inkubert med antistoffer som er generert mot dette polypeptidet, for eksempel ANGPTL4 (se for eksempel beskrivelsen i US patentskrift nr. 6 348 350, 6 372 491 og 6 455 496). Bundet antistoff kan bli påvist ved hjelp av ulike fremgangsmåter.

Antagonist antistoffer (for eksempel blokkerende eller nøytraliserende) kan bli identifisert ved hjelp av konkurranseanalyse og/eller aktivitetsanalyse. For eksempel stimulerer ekspresjon av ANGPTL4 cellehepatocytt- eller pre-adipocyttproliferasjon, adipocyttmigrasjon, regulere triglyseridmengder eller binder til αv β5-integrin. Bestemmelse av et blokkerende eller nøytraliserende antistoff for ANGPTL4 kan bli vist ved evnen for antistoffet til å blokkere disse aktivitetene, for eksempel (se for eksempel Figur 9, Panel B, D og E). Hepatocytter eller pre-adipocyttceller kan for eksempel bli platet ut og inkubert med supernatant fra COS7-celler transdusert med Ad-hAngptl4 sammen med et anti-ANGPTL4-antistoff eller et kontrollantistoff eller PBS. Etter flere dager kan cellene bli trypsinert og talt. Antistoffer som redusere antallet celler blir identifisert som blokkerende eller nøytraliserende antistoffer. ANGPTL4 ble også vist å indusere hepatocyttadhesjon og pre-adipocytt migrasjon, og slik kan bestemmelse av et blokkerende eller nøytraliserende antistoff mot ANGPTL4 bli vist ved evnen for antistoffet til å blokkere hepatocyttadhesjon og/eller pre-adipocytt cellemigrasjon. ANGPTL4 ble også vist å være en proangiogen faktor. Se for eksempel Le Jan et al., American Journal of Pathology, 164(5): 1521-1528 (2003). Slik kan blokkerende eller nøytraliserende antistoffer mot ANGPTL4 bli identifisert ved å benytte antistoffene i kombinasjon med ANGPTL4 i angiogeneseanalyse, for eksempel CAM-analyse.

Beskrivelsen er ansett for å være tilstrekkelig for å gjøre det mulig for en fagperson på området å utøve oppfinnelsen.

Claims (20)

P a t e n t k r a v

1. Et angiopoietinlignende 4-protein (ANGPTL4) eller en nukleinsyre som koder for ANGPTL4 eller en ANGPTL4-agonist, for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling av leverdysfunksjon, sykdom eller skade, hvor ANGPTL4-agonisten er en peptidanalog av ANGPTL4 som er i stand til å signalere gjennom αv β5 integrin og fremmer proliferasjon av primære humane hepatocytter.

2. ANGPTL4, nukleinsyre eller agonist ifølge krav 1, for anvendelse ved reparasjon av leverskade.

3. ANGPTL4, nukleinsyre eller agonist ifølge krav 1 eller 2, hvor leverskaden er leverskade som følge av eksponering for en hepatotoksisk forbindelse, strålingseksponering, mekanisk leverskade, genetisk predisponering, virusinfeksjon, autoimmun sykdom eller forhøyet in vivo nivåer av aktivin eller TGF- β.

4. ANGPTL4, nukleinsyre eller agonist ifølge krav 1, hvor leversykdommen er leversvikt, akutt hepatitt, kronisk hepatitt, alkoholhepatitt, levercirrhose, toksisk leverskade, medikamentel leverskade, hepatisk encefalopati, hepatisk koma eller levernekrose.

5. ANGPTL4, nukleinsyre eller agonist ifølge et hvlket som helst av de foregående krav, hvor individet er et menneske.

6. ANGPTL4 eller nukleinsyre for anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor ANGPTL4 eller kodet ANGPTL4 er et biologisk aktivt fragment av humant eller murint ANGPTL4 eller en biologisk aktiv variant som har minst 80 % aminosyresekvensidentitet med det humane eller murine ANGPTL4 eller aktivt fragment, og hvor den biologiske aktiviteten stimulerer proliferasjon og/eller celleadhesjon av hepatocytter.

7. ANGPTL4 for anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor ANGPTL4 omfatter aminosyrerestene 23 til 406 i humant ANGPTL4.

8. ANGPTL4 for anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor ANGPTL4 omfatter aminosyrerestene 184 til 406 i humant ANGPTL4.

9. Anvendelse av et middel valgt fra et angiopoietinlignende 4-protein (ANGPTL4) eller en nukleinsyre som koder for ANGPTL4 eller en ANGPTL4-agonist, i fremstillingen av et medikament for behandling av leverdysfunksjon, sykdom eller skade, hvor ANGPTL4-agonisten er en peptidanalog av ANGPTL4 som er i stand til å signalere gjennom αv β5 integrin og fremmer proliferasjon av primære humane hepatocytter.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor medikamentet er for reparasjon av leverskade.

11. Anvendelse ifølge krav 9 eller 10, hvor leverskaden er leverskade som følge av eksponering for en hepatotoksisk forbindelse, strålingseksponering, mekanisk leverskade, genetisk predisponering, virusinfeksjon, autoimmun sykdom eller forhøyet in vivo nivåer av aktivin eller TGF- β.

12. Anvendelse ifølge krav 9, hvor leversykdommen er leversvikt, akutt hepatitt, kronisk hepatitt, alkoholhepatitt, levercirrhose, toksisk leverskade, medikamentel leverskade, hepatisk encefalopati, hepatisk koma eller levernekrose.

13. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 12, hvor individet er et menneske.

14. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 13, hvor ANGPTL4 eller kodet ANGPTL4 er et biologisk aktivt fragment av humant eller murint ANGPTL4 eller en biologisk aktiv variant som har minst 80 % aminosyresekvensidentitet med det humane eller murine ANGPTL4 eller aktivt fragment, og hvor den biologiske aktiviteten stimulerer proliferasjon og/eller celleadhesjon av hepatocytter.

15. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 14, hvor ANGPTL4 omfatter aminosyrerestene 23 til 406 i humant ANGPTL4.

16. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 14, hvor ANGPTL4 omfatter aminosyrerestene 184 til 406 i humant ANGPTL4.

17. En ANGPTL4-antagonist for anvendelse i en fremgangsmåte for å behandle leverkreft eller uønsket leverhypertrofi ved inhiberingen av proliferasjon av hepatocytter, hvor ANGPTL4-antagonisten inhiberer aktiviteten til ANGPTL4 til å fremme proliferasjon av primær humane hepatocytter, og hvor ANGPTL4-antagonisten er:

et antisensmolekyl eller ribozymmolekyl, eller

en aptamer; eller

et siRNA; eller

et anti-ANGPTL4-antistoff; eller

et anti- αv β5-antistoff; eller

et ANGPTL4-reseptormolekyl som er i stand til å binde spesifikt til ANGPTL4.

18. ANGPTL4-antagonisten for anvendelse i henhold til krav 17, som binder til C-terminalen på ANGPTL4.

19. ANGPTL4-antagonisten for anvendelse i henhold til krav 18, der ANGPTL4-agonisten blokkerer Angptl4 fra å binde til αv β5.

20. Anvendelse av en ANGPTL4-antagonist i fremstillingen av et medikament for anvendelse ved behandlingen av leverkreft eller uønsket leverhypertrofi ved inhiberingen av proliferasjon av hepatocytter, hvor antagonisten er som definert i et hvilket som helst av kravene 17 til 19.