KR101387781B1 - 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ａｎｇｐｔｌ４) 에 대한단일클론 항체 - Google Patents

Abstract

ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 제공된다. ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체가 제공된다. 중화 단일클론 항체를 사용하여 지질 대사 장애를 치료하는 방법이 제공된다.

ANGPTL4

Description

앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ＡＮＧＰＴＬ４) 에 대한 단일클론 항체 {MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ANGIOPOIETIN-LIKE PROTEIN 4 (ANGPTL4)}

본 출원은 임의의 목적을 위해 본원에 참조로써 삽입된 2005 년 1 월 7 일에 출원된 미국 가출원 번호 제 60/642,022 호의 이점을 청구한다.

I. 기술분야

앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 제공된다. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 사용 방법이 제공된다. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

II . 도입

앤지오포이에틴-유사 단백질 4 는 다수의 포유류 중에서 보존되어 있다 (Ge 등 (2004) J. Biol . Chem . 279:2038-2045). 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 는 N-말단 코일형-코일 도메인 및 C-말단 피브리노겐-유사 도메인을 함유한다 (Kim 등 (2000) Biochem . J. 346:603-610). N-말단 코일형-코일 도메인은 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 의 올리고머화를 매개한다 (Ge 등 (2004) J. Biol . Chem . 279:2038-2045). 올리고머화된 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 는 생체 내에서 단백용해성 과정을 수행하여, 피브리노겐-유사 도메인의 절단을 초래한다 (Ge 등 (2004) J. Biol . Chem . 279:2038-2045).

III . 요약

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 특이적으로 결합하고, ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 마우스 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 인간화된 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 LPL 활성을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 생체 내에서 감소시킨다.

특정 구현예에서, 단일클론 항체는 잔기 21 내지 잔기 174 로부터의 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 50 의 영역 내에 있는 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 잔기 21 내지 잔기 169 로부터의 SEQ ID NO:2 영역 내에 있는 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 14D12 이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 15F2 이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 90B4 이다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 14D12 와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 15F2 와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 90B4 와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다.

특정 구현예에서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되는데, 여기서, 중쇄는 SEQ ID NO : 12 내지 14 중 어느 하나에 있는 아미노산 서열을 포함하거나 ; 하나 이상의 CDR 는 SEQ ID NO : 21, 39, 및 20 중 어느 하나에 있는 아미노산 서열을 포함하거나 ; 또는 하나 이상의 CDR 는 SEQ ID NO : 27 내지 29 중 어느 하나에 있는 아미노산 서열을 포함하고 ; 여기서, 항체는 ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시킨다. 특정 구현예에서, 경쇄를 포함하는 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되는데, 여기서, 경쇄는 SEQ ID NO : 16 내지 18 중 어느 하나에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하거나 ; 하나 이상의 CDR 은 SEQ ID NO : 30 내지 32 중 어느 하나에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하거나 ; 또는 하나 이상의 CDR 은 SEQ ID NO : 33 내지 35 중 어느 하나에 있는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 항체는 ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시킨다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO : 12 내지 14 중 어느 하나에 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO : 21, 39, 및 20 중 어느 하나에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO : 27 내지 29 중 어느 하나에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO : 16 내지 18 중 어느 하나에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO : 30 내 지 32 중 어느 하나에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO : 33 내지 35 중 어느 하나에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다.

특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 12 에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 13 에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 14 에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 16 에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 17 에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 18 에서 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 21 에서 나타내어진 CDR1, SEQ ID NO: 39 에서 나타내어진 CDR2, 및 SEQ ID NO: 20 에서 나타내어진 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 20 에서 X 는 임의의 아미노산이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 20 에서 X 는 소수성 아미노산이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 20 에서 X 는 글리신, 루신, 이소루신, 발린, 또는 알라닌이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 20 에서 X 는 발린 또는 이소루신이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 20 에서 X 는 발린 또는 이소루신이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 39 에서 X 는 임의의 아미노산이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 39 에서 X 는 글리신, 아스파테이트, 또는 티로신이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 27 에서 나타내어진 CDR1, SEQ ID NO: 28 에서 나타내어진 CDR2, 및 SEQ ID NO: 29 에서 나타내어진 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체가 제공된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO: 30 에서 나타내어진 CDR1, SEQ ID NO: 31 에서 나타내어진 CDR2, 및 SEQ ID NO: 32 에서 나타내어진 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 33 에서 나타내어진 CDR1, SEQ ID NO: 34 에서 나타내어진 CDR2, 및 SEQ ID NO: 35 에서 나타내어진 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다.

특정 구현예에서, 항체는 항체 절편이다. 특정 구현예에서, 항체는 scFv 절편이다. 특정 구현예에서, 항체는 Fab 절편이다. 특정 구현예에서, 항체는 F(ab')₂ 절편이다. 특정 구현예에서, 항체는 Fab' 절편이다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 SEQ ID NO: 40 의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 SEQ ID NO: 41 의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 SEQ ID NO: 43 의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 SEQ ID NO: 41 의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합하고, SEQ ID NO: 43 의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합한다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 특이적으로 결합하고 ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 고중성지방혈증의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 콜레스테롤과잉혈증 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 비만 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 치료 방법이 제공된다.

도 1 은 실시예 B.1 에서 기술된 바와 같이, 전장 (full-length) 마우스 ANGPTL4 를 과다발현하는 아데노바이러스 구축물로 다양한 시점에서 후속 주사된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드, 콜레스테롤, 및 자유 지방산 (FFA) 수준을 보여준다.

도 2 는 실시예 B.1 에서 기술된 바와 같이, 전장 마우스 ANGPTL4 를 발현하는 아데노바이러스 구축물 (Ad5-mAngptl-4T) 로 주사한 후 3 일째에 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 3 은 실시예 B.1 에서 기술된 바와 같이, 전장 마우스 ANGPTL4 를 발현하는 아데노바이러스 구축물 (Ad5-mAngptl-4T) 로 주사한 후 3 일째에 야생형 마우스에서의 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 4 는 실시예 B.2 에서 기술된 바와 같이, 전장 인간 ANGPTL4 를 발현하는 아데노바이러스 구축물 (Ad5-mAngptl-4T) 로 주사한 후 4 일째에 야생형 마우스에서의 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 5 는 실시예 B.2 에서 기술된 바와 같이, 전장 인간 ANGPTL4 를 발현하는 아데노바이러스 구축물 (Ad5-mAngptl-4T) 로 주사한 후 4 일째에 야생형 마우스에서의 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 6 은 실시예 C 에서 기술된 바와 같이, 다양한 식이 조건에 놓여진 야생형 마우스 (WT) 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스에서의 혈청 트리글리세리드, 콜레스테롤, 및 자유 지방산 (FFA) 수준을 보여준다.

도 7 은 실시예 C 에서 기술된 바와 같이, 표준 ("쵸우") 또는 고 지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 (WT) 마우스 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스의 체중 및 체지방을 보여준다.

도 8 은 실시예 D 에서 기술된 바와 같이, 사육된 상태 및 단식 상태에서 야생형 (WT) 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스의 내인성 지질단백질 리파아제 (LPL) 활성의 수준을 보여준다.

도 9 는 표준 ("쵸우") 또는 고 지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 (WT) 마우스 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스로부터의 간에서의 지질 수준을 보여준다. 실시예 E 에서 기술된 바와 같이, 표준 ("쵸우") 또는 고 지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 (WT) 마우스 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스로부터의 간 절편의 조직화학 염색을 보여준다.

도 10 은 실시예 E 에서 기술된 바와 같이, 고 지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 (WT) 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스의 근육세포내 지질 함량을 보여준다.

도 11 의 패널 A 및 B 는 실시예 F 에서 기술된 바와 같이, 표준 ("먹이") 또는 고 지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 (WT) 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스의 포도당 및 인슐린 수준을 보여준다. 패널 C 및 D 는 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 (WT) 및 Angptl4 녹아웃 (HOM) 마우스의 포도당 및 인슐린 내성을 보여준다.

도 12 는 실시예 G 에서 기술된 바와 같이, 전장 마우스 ANGPTL4 를 발현하는 아데노바이러스 구축물 (Ad5-mAngptl-4T) 로 주사한 후 3 일째에 Angptl4 녹아웃 마우스의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 13 은 실시예 G 에서 기술된 바와 같이, 전장 마우스 ANGPTL4 를 발현하는 아데노바이러스 구축물 (Ad5-mAngptl-4T) 로 주사한 후 3 일째에 Angptl4 녹아웃 마우스의 단식된 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 14 는 실시예 I 에서 기술된 바와 같이, 증가량의 전장 마우스 ANGPTL4 의 존재 하, 시험관 내에서의 지질단백질 리파아제 (LPL) 의 활성을 보여준다.

도 15 는 실시예 L 에서 기술된 바와 같이, 시험관 내에서의 ANGPTL4 에 의한 억제로부터 LPL 활성을 구제하는 마우스 ANGPTL4 (4A8, 14D12, 및 15F2) 에 대 한 특정 중화 단일클론 항체를 보여준다.

도 16 은 실시예 O 에서 기술된 바와 같이, 단일클론 항체 4A8, 14D12, 및 15F2 에 대한 에피토프 바이닝 (binning) 실험의 결과를 보여준다.

도 17 은 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주사한 후 4 일째에, 표준 식이로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 18 은 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주사한 후 4 일째에 표준 식이로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 19 는 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주사한 후 4 일째에 표준 식이로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 자유 지방산 (FFA) 수준을 보여준다.

도 20 은 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주사한 후 4 일째에 고지방 식이로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 21 은 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주사한 후 4 일째에 고지방 식이로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 22 는 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 단일 주사한 후, 및 5 주 동안 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주마다 주사한 후, 고지방 식이로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 23 은 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 단일 주사한 후, 및 5 주 동안 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주마다 주사한 후, 고지방 식이로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 24 는 실시예 P 에서 기술된 바와 같이, 5 주 동안 마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 주마다 주사한 후 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 마우스에서의 단식된 케톤체의 혈청 수준을 보여준다.

도 25 는 실시예 C 에서 기술된 바와 같이, 표준 ("먹이") 식이로 사육된 수컷 야생형 ("WT"), 이형접합성 ("het"), 및 녹아웃 ("HOM") 마우스 (패널 A) 및 야생형 ("WT") 및 녹아웃 ("HOM") 암컷 마우스 (패널 B) 에서의 단식된 혈청 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 고밀도 지질단백질 (HDL), 및 저밀도 지질단백질 (LDL) 수준을 보여준다.

도 26 은 실시예 C 에서 기술된 바와 같이, 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 수컷 야생형 ("WT") 및 녹아웃 ("HOM") 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 고밀도 지질단백질 (HDL), 및 저밀도 지질단백질 (LDL) 수준을 보여준다.

도 27 은 실시예 C 에서 기술된 바와 같이, 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 ("WT") 및 ANGPTL4 녹아웃 ("HOM") 수컷 (패널 A) 및 암컷 (패널 B) 마우스에 서의 체지방 (g) 을 보여준다.

도 28 은 실시예 C 에서 기술된 바와 같이, 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 ("WT") 및 ANGPTL4 녹아웃 ("HOM") 마우스에서의 음식 섭취 (패널 A) 및 % 분지방 (패널 B) 을 보여준다.

도 29 는 실시예 C 에서 논의된 바와 같이, 이종교배된 이형접합성 부모에게서 태어난 야생형, 이형접합성, 및 녹아웃 자손의 수를 보여준다.

도 30 은 실시예 C 에서 논의된 바와 같이, 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 및 녹아웃 마우스의 생존을 보여준다.

도 31 은 실시예 R 에서 기술된 바와 같이, ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체로 주사된 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 32 는 실시예 R 에서 기술된 바와 같이, ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체로 주사된 야생형 마우스에서의 단식된 총 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 33 은 실시예 S 에서 기술된 바와 같이, N-mANGPTL4 (패널 A) 및 N-hANGPTL4 (패널 B) 에 대한 단일클론 항체 14D12, 15F2, 및 90B4 의 상대적 결합 친화성을 보여준다.

도 34 는 실시예 T 에서 기술된 바와 같이, 14D12 또는 항-KLH 중 어느 하나로 주사한 후 제 4 일 (패널 A) 및 제 7 일 (패널 B) 째의, 야생형 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드의 감소% 를 보여준다.

도 35, 패널 A 는 실시예 U 에서 기술된 바와 같이, 14D12 를 단일 주사한 후 시간 경과에 따른 야생형 마우스에서의 14D12 농도 및 단식된 혈청 트리글리세 리드 수준의 플랏을 보여준다. 패널 B 는 실시예 U 에서 기술된 바와 같이, 14D12 를 단일 주사한 후 시간 경과에 따른 야생형 마우스에서의 14D12 농도 및 단식된 총 콜레스테롤 수준의 플랏을 보여준다.

도 36 은 실시예 V 에서 기술된 바와 같이, 단일클론 항체 항-KLH, 14D12, 15F2, 또는 90B4 로 주사한 후 4 일째에, 인간 ANGPTL4 를 과다발현하는 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 37 은 실시예 V 에서 기술된 바와 같이, 단일클론 항체 항-KLH, 14D12, 15F2, 또는 90B4 로 주사한 후 4 일째에, 인간 ANGPTL4 를 과다발현하는 마우스에서의 단식된 총 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 38 은 실시예 W 에서 기술된 바와 같이, 비히클, 항-KLH, 또는 14D12 로 1 주에 1 회씩 15 회 주사한 후, LDLr 녹아웃 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 39 는 실시예 W 에서 기술된 바와 같이, 비히클, 항-KLH, 또는 14D12 로 1 주에 1 회씩 15 회 주사한 후, LDLr 녹아웃 마우스에서의 단식된 총 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 40 은 실시예 X 에서 기술된 바와 같이, 비히클, 항-KLH, 또는 14D12 를 1 주에 1 회씩 15 회 주사한 후, ApoE 녹아웃 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 41 은 실시예 X 에서 기술된 바와 같이, 비히클, 항-KLH, 또는 14D12 를 1 주에 1 회씩 15 회 주사한 후, ApoE 녹아웃 마우스에서의 단식된 총 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 42 는 실시예 W 에서 기술된 바와 같이, 항-KLH 또는 14D12 로 단일 주사한 후 4 일째에, LDLr 녹아웃 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 43 은 실시예 W 에서 기술된 바와 같이, 항-KLH 또는 14D12 로 단일 주사한 후 4 일째에, LDLr 녹아웃 마우스에서의 단식된 총 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 44 는 실시예 X 에서 기술된 바와 같이, 항-KLH 또는 14D12 로 단일 주사한 후 4 일째에, ApoE 녹아웃 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다.

도 45 는 실시예 X 에서 기술된 바와 같이, 항-KLH 또는 14D12 로 단일 주사한 후 4 일째에, ApoE 녹아웃 마우스에서의 단식된 총 콜레스테롤 수준을 보여준다.

도 46, 패널 A 는 실시예 Y 에서 기술된 바와 같이, 항-KLH (Grp-1) 및 14D12 (Grp-2) 로 주입하기 전 및 주입한 후 1 주일째에, db/db 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드를 보여준다. 패널 B 는 실시예 Y 에서 기술된 바와 같이, 항-KLH 또는 14D12 로 1 주에 1 회씩 8 회 주입한 후, db/db 마우스에서의 혈청 트리글리세리드를 보여준다.

도 47 은 실시예 Z 에서 기술된 바와 같이, 14D12 (SEQ ID NO: 12), 15F2 (SEQ ID NO: 13), 및 90B4 (SEQ ID NO: 14) 의 중쇄 가변 영역의 배열을 보여준다. 공통염기서열 (SEQ ID NO: 15) 을 또한 보여준다. 중쇄 가변 영역의 각 쌍 사이의 상동성% 를 하기에 보여준다.

도 48 은 실시예 Z 에서 기술된 바와 같이, 14D12 (SEQ ID NO: 16), 15F2 (SEQ ID NO: 17), 및 90B4 (SEQ ID NO: 18) 의 경쇄 가변 영역의 배열을 보여준다. 공통염기서열(SEQ ID NO: 19) 을 또한 보여준다. 경쇄 가변 영역의 각 쌍 사이의 상동성% 를 하기에 보여준다.

도 49 는 실시예 AA 에서 논의된 바와 같이, ANGPTL4 에 대한 특정 단일클론 항체의 ANGPTL4 의 절편에의 결합을 보여준다.

전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적인 것일뿐, 청구한 바와 같이, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

본 출원에서, 단수의 사용은 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 복수를 포함한다. 본 출원에서, 단어 "하나 (a)" 또는 "하나 (an)" 는 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, "하나 이상의" 를 의미한다. 본 출원에서, "또는" 의 사용은 달리 언급되지 않는 한, "및/또는" 을 의미한다. 더욱이, "포함한다" 와 같은 다른 형태뿐만 아니라, "포함하는" 이라는 용어의 사용은 제한적이지 않다. 또한, "요소" 또는 "성분" 은 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 하나의 단위를 포함하는 요소 또는 성분, 및 하나 초과의 단위를 포함하는 요소 또는 성분 둘 다를 포함한다.

본원에서 사용된 단락 전면은 구성상의 목적일 뿐이고, 기술되는 주제를 제한하려는 것은 아니다. 특허, 특허 출원, 기사, 도서, 및 논문 (이에 제한되지는 않음) 을 포함하여 본 출원에서 언급된 모든 문서, 또는 문서의 부분은 임의의 목적으로 그 전체가 참조로써 본원에 삽입된다. 삽입된 문헌 및 유사 물질의 하나 이상이 본 출원에서 용어의 정의에 모순되는 용어를 정의하는 경우, 본 출원은 조절한다.

A. 특정 정의

본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질" 은 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 상기 용어를 자연발생적 아미노산을 함유하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연발생적 아미노산의 인위적인 화학 유사체인 아미노산 중합체에도 적용한다. 아미노산 중합체는 임의의 길이일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체" 는 본래의 항체, 또는 항원 결합을 위해 본래의 항체와 경합하는 항체의 절편을 말한다. 항체 절편에는 본래의 항체의 가변 영역의 일부 이상을 유지하는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, Fd, 이항체 (diabodies), 및 기타 항체 절편이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, [Hudson 등 (2003) Nature Med . 9:129-134] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 항체 절편은 본래의 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된다. 특정 구현예에서, 항체 절편은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다.

용어 "자연 폴리펩티드" 는 자연발생적 폴리펩티드를 말한다. 용어 "자연 항체" 는 자연발생적 항체를 말한다.

용어 "단일클론 항체" 는 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터의 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 하이브리도마에 의해 분비된다. 일부 그러한 구현예에서, 하이브리도마는 당업자에게 알려진 특정 방법에 따라 제조된다 (예를 들어, [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499)] 참조). 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생성된다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호 참조). 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 항체 절편을 말한다 (예를 들어, [Clackson 등 (1991) Nature 352: 624-628], 및 [Marks 등 (1991) J. Mol . Biol . 222: 581-597] 참조). 다양한 기타 단일클론 항체 제조 기술에 대해서는, 예를 들어, [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다.

용어 "키메라 항체" 는 2 가지 이상의 상이한 근원의 성분으로 제조된 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 키메라 항체는 또다른 분자, 예를 들어, 두번째 종에서 유래된 항체의 일부에 융합된 첫번째 종으로부터 유래된 항체의 일부를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 유래의 항체의 일부에 융합된 비-인간 동물 유래의 항체의 일부를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 유래의 항체의 불변 영역에 융합된 비-인간 동물 유래의 항체의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다.

"인간화된" 항체는 인간 항체에 더욱 유사하게 일치하도록 (아미노산 서열에서) 개질된 비-인간 항체를 말한다. 따라서, 인간화된 항체는 키메라 항체의 한 유형이다. 특정 구현예에서, 비-인간 항체의 가변 영역의 항원 결합 잔기의 외부에 있는 아미노산 잔기가 개질된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는, 인간 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 전부 또는 일부를, 목적하는 항원 결합 특이성을 갖는 비-인간 항체와 같은 또다른 항체의 CDR 의 전부 또는 일부로 대체함으로써 구축된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 CDR 의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 항체의 CDR 에 상응하고 골격 영역 (FR) 의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 FR 에 상응하는 가변 영역을 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 인간화된 항체는 추가로 인간 항체의 불변 영역 (Fc) 을 포함한다.

용어 "인간 항체" 는 인간 항체 서열을 함유하고 비-인간 동물의 항체 서열을 함유하지는 않는 단일클론 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 인간 항체는 본래의 항체에서 발견되지 않는 합성 서열을 함유할 수 있다. 상기 용어는 항체가 생성되는 방식에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 인간 항체는 파지 디스플레이, 인간 B-림프구, 또는 재조합 방법에 의해 유전자도입 마우스에서 생성될 수 있다.

용어 "중화 항체" 또는 "중화시키는 항체" 는 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 감소시키는 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 중화 항체는 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 활성을 감소시킨다.

용어 "항원-결합 부위" 는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 말한다. 특정 구현예에서, 항원-결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 영역에 의해 제공된다.

용어 "에피토프" 는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 결정소를 말한다. 특정 구현예에서, 에피토프는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원의 영역이다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 곁사슬, 포스포릴, 또는 술포닐기와 같은 분자의 화학 활성 표면기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 특이적인 3 차 구조 특징 (예를 들어, "구조적" 에피토프) 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다.

특정 항체가 에피토프 둘 다에 특이적으로 결합한다면 하나의 에피토프가 또다른 에피토프와 "동일" 하다고 한다. 특정 구현예에서, 상이한 1 차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 동일한 에피토프를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 동일한 에피토프는 상이한 1 차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상이한 항체가 동일한 에피토프에의 특이적인 결합에 대해 경합한다면, 상기 항체들은 동일한 에피토프에 결합한다고 한다.

항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 항원을 우선적으로 인지할 때, 항체는 항원에 "특이적으로 결합한다". 특정 구현예에서, 항체는 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 상이한 항원이 그러한 특정 에피토프를 포함하는 한, 항체는 상이한 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 상이한 종으로부터의 동종 단백질은 동일한 에피토프를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서는 해리 상수 (K_D) 가 1 μM 이하일 때, 특정 구현예에서는 해리 상수가 100 nM 이하일 때, 특정 구현예에서는, 해리 상수가 10 nM 이하일 때, 항체가 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.

용어 "ANGPTL4" 는 달리 특정되지 않는 한, 인간, 소, 닭, 설치류, 마우스, 래트, 돼지, 양, 영장류, 원숭이, 및 기니아 피그를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물 또는 포유류 기원의 앤지오포이에틴 유사 단백질 4 를 말한다. 상기 용어는 또한 본래의 ANGPTL4 의 하나 이상의 생체 내 또는 시험관 내 활성을 유지하는 본래의 ANGPTL4 의 절편 및 변이체를 말한다. 상기 용어는 ANGPTL4 의 전장 비가공 전구체 형태뿐만 아니라, 신호 펩티드의 번역-후 절단으로부터 생성된 성숙한 형태, 및 피브리노겐 도메인의 단백용해성 과정으로부터 생성된 형태를 포함한다. 특정 구현예에서, 전장, 비가공 마우스 ANGPTL4 는 SEQ ID NO: 1 에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 전장, 비가공 마우스 ANGPTL4 는 SEQ ID NO: 50 에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 전장, 비가공 인간 ANGPTL4 는 SEQ ID NO: 2 에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는다.

용어 "Angptl4" 는 ANGPTL4 를 암호화하는 핵산을 말한다.

용어 "LPL" 은 인간, 소, 닭, 설치류, 마우스, 래트, 돼지, 양, 영장류, 원숭이, 및 기니아 피그를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물 또는 포유류 기원의 지질단백질 리파아제를 말한다. 특정 구현예에서, 지질단백질 리파아제는 유미입자 및 초저밀도 지질단백질 (VLDL) 내 트리아실글리세롤의, 디아실글리세롤 및 하나의 자유 지방산 음이온으로의 가수분해를 촉매한다. 특정 구현예에서, 지질단백질 리파아제는 또한 디아실글리세롤을 가수분해할 수 있다.

용어 "제제" 는 화학적 화합물, 화학적 화합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터의 추출물의 혼합물을 말한다.

용어 "안타고니스트" 는 ANGPTL4 의 활성을 감소시키는 제제를 말한다.

용어 "아고니스트" 는 ANGPTL4 의 활성을 증가시키는 제제를 말한다.

용어 "환자" 는 인간 및 동물 개체를 포함한다. 특정 구현예에서, 환자는 포유류이다. 일부 그러한 구현예에서, 환자는 인간이다.

참조 폴리펩티드의 "절편" 은 참조 폴리펩티드의 임의의 일부의 아미노산의 컨티규어스 스트레치 (contiguous stretch) 를 말한다. 절편은 참조 폴리펩티드의 길이보다 더 짧은 임의의 길이로 있을 수 있다.

참조 폴리펩티드의 "변이체" 는 참조 폴리펩티드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 소실 또는 삽입을 갖는 폴리펩티드를 말한다.

"보존적" 아미노산 치환은 폴리펩티드 내 아미노산의, 크기 또는 전하와 같은 특성이 유사한 또다른 아미노산으로의 치환을 말한다. 특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 비치환 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지한다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 생물계에서 합성에 의해서보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 삽입된 비-자연발생적 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 치환에는 펩티드모방체 및 아미노산 부분의 기타 가역 형태 또는 전환 형태가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

자연발생적 잔기는 공통된 곁사슬 특성을 바탕으로 하기 부류로 구분될 수 있다 :

1) 소수성 : 노르루신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;

2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ;

3) 산성 : Asp, Glu ;

4) 염기성 : His, Lys, Arg ;

5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및

6) 방향족 : Trp, Tyr, Phe.

예를 들어, 비-보존적 치환은 상기 부류 중 하나의 요소를 또다른 부류의 요소로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 상기 치환된 잔기는 비-인간 항체와 동종인 인간 항체의 영역, 또는 상기 분자의 비-동종 영역 내로 도입될 수 있다.

치환할 때, 특정 구현예에 따르면, 아미노산의 수치료 지수를 고려할 수 있다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징을 바탕으로 수치료 지수를 할당받는다. 각각의 아미노산의 수치료 지수는 하기와 같다 : 이소루신 (+4.5) ; 발린 (+4.2) ; 루신 (+3.8) ; 페닐알라닌 (+2.8) ; 시스테인/시스틴 (+2.5) ; 메티오닌 (+1.9) ; 알라닌 (+1.8) ; 글리신 (-0.4) ; 트레오닌 (-0.7) ; 세린 (-0.8) ; 트립토판 (-0.9) ; 티로신 (-1.3) ; 프롤린 (-1.6) ; 히스티딘 (-3.2) ; 글루탐산 (-3.5) ; 글루타민 (-3.5) ; 아스파르트산 (-3.5) ; 아스파라긴 (-3.5) ; 리신 (-3.9) ; 및 아르기닌 (-4.5).

특정 구현예에서, 단백질에 상호활성의 생물학적 기능을 부여하는 수치료 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 이해된다 ([Kyte et al., J. Mol. Biol., 157 : 105-131 (1982)]). 특정 구현예에서는, 일부 아미노산이 유사한 수치료 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다. 특정 구현예에서, 수치료 지수를 기준으로 변화시킬 때, 그의 수치료 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 구현예에서, ±1 내인 것들이 포함되고, 특정 구현예에서는, ±0.5 내인 것들이 포함된다.

아미노산의 치환이 친수성을 바탕으로 효과적으로 이루어질 수 있다는 것, 특히 그렇게 해서 제조되는 생물학적 기능성 단백질 또는 펩티드가 면역학적 구현예에서 사용되고자 한다는 것은 잘 이해된다. 특정 구현예에서, 그의 인접 아미노산의 친수성에 의해 부여되는 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상관있다.

하기 친수성 값은 상기 아미노산 잔기에 따라 할당된다 : 아르기닌 (+3.0) ; 리신 (+3.0) ; 아스파르트산 (+3.0 ± 0.1) ; 글루탐산 (+3.0 ± 0.1) ; 세린 (+0.3) ; 아스파라긴 (+0.2) ; 글루타민 (+0.2.) ; 글리신 (0) ; 트레오닌 (-0.4) ; 프롤린 (-0.5 ± 0.1) ; 알라닌 (-0.5) ; 히스티딘 (-0.5) ; 시스테인 (-1.0) ; 메티오닌 (-1.3) ; 발린 (-1.5) ; 루신 (-1.8) ; 이소루신 (-1.8) ; 티로신 (-2.3) ; 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값을 바탕으로 변화시킬 때, 특정 구현예에서는 친수성 값이 ± 2 내인 아미노산의 치환이 포함되고, 특정 구현예에서는 친수성 값이 ± 1 내인 아미노산의 치환이 포함되고, 특정 구현예에서는 친수성 값이 ± 0.5 내인 아미노산의 치환이 포함된다. 친수성을 바탕으로 1 차 아미노산 서열로부터 에피토프를 규명할 수 있다. 상기 영역을 또한 "에피토프 코어 영역" 이라고도 한다.

실례의 아미노산 치환을 하기 표 1 에 나타낸다.

당업자는 잘-알려진 기술을 사용하여 본원에서 나타낸 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적으로 함으로써, 활성을 파괴하지 않으면서 변화될 수 있는, 분자의 적합한 영역을 규명할 수 있다. 특정 구현예에서, 당업자는 유사한 폴리펩티드 사이에서 보존되는 분자의 잔기 및 부위를 동정할 수 있다. 특정 구현예에서, 당업자는 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역일지라도 생물학적 활성을 파괴하지 않거나 또는 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환을 시킬 수 있다.

추가로, 특정 구현예에서, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드 내 잔기를 규명하는 구조-기능 연구를 리뷰할 수 있다. 그러한 비교에 있어서, 특정 구현예에서, 당업자는 유사한 단백질 내의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질 내 아미노산 잔기의 중요성을 예견할 수 있다. 특정 구현예에서, 당업자는 그러한 예견된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.

특정 구현예에서, 당업자는 유사한 폴리펩티드 내의 3-차 구조와 관련된 3-차 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 특정 구현예에서, 그러한 정보를 위해, 당업자는 항체의 3차 구조에 대해 항체의 아미노산 잔기의 배열을 예견할 수 있다. 특정 구현예에서, 당업자는 단백질의 표면 상에 있을 것으로 짐작되는 아미노산 잔기에 라디칼 변화를 일으키지 않는 것을 선택할 수 있는데, 이는 그러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 포함될 수 있기 때문이다. 더욱이, 특정 구현예에서, 당업자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 테스트 변이체를 발생시킬 수 있다. 다음, 특정 구현예에서, 상기 변이체는 당업자에게 알려진 활성 어세이를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 변이체는 적합한 변이체에 대한 정보를 모으는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 특정 아미노산 잔기에 생긴 한 가지 변화가 활성을 파괴시키거나, 바람직하지 못하게 감소시키거나, 또는 부적합하게 되도록 만든다는 것을 발견한다면, 그러한 변화를 가진 변이체를 피할 수 있다. 즉, 특정 구현예에서, 그러한 일반적인 실험으로부터 모은 정보를 바탕으로, 당업자는 추가의 치환이 단독으로 또는 기타의 돌연변이와 함께 피하게 되는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.

수많은 과학 출판물이 2 차 구조를 짐작하도록 제공되어 있다. 예를 들어, [Moult J., Curr . Op . in Biotech ., 7(4):422-427 (1996)], [Chou 등 Biochemistry, 13(2):211-222 (1974)] ; [Chou 등, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978)] ; [Chou 등, Ann. Rev. Viochem., 47:251-276] 및 [Chou 등, Biophys. J. 26:367-384 (1979)] 를 참조한다. 더욱이, 컴퓨터 프로그램이 현재 2 차 구조를 짐작하는데 도움을 주는 것으로서 이용가능하다. 2 차 구조를 짐작하는 한 방법은 상동성 모델링을 바탕으로 한다. 예를 들어, 30% 초과의 서열 동일성, 또는 40% 초과의 유사성을 갖는 2 개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 형상을 가진다. 단백질 구조 데이타베이스 (PDB) 의 성장은 폴리펩티드의 구조 내 잠재적인 수의 접힘을 포함하여, 2 차 구조의 개선된 예견성을 제공한다. 예를 들어, [Holm 등, Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999)] 를 참조한다. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질 내에 한정된 수의 접힘이 있고 일단 임계 수의 구조가 분석되면, 구조 예견이 급격히 더욱 정확하게 될 것이다 (Brenner 등, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)).

2 차 구조를 예견하는 추가의 방법은 "스레딩 (threading)" (예를 들어, [Curr. Opin. Struct. Biol.377-87 (1997)] ; [Sippl 등, Structure, 4(1):15-19 (1996)] 참조), "프로파일 분석" (예를 들어, [Bowie 둥, Science, 253:164-170 (1991)] ; [Gribskov 등, Meth. Enzym.183:146-159 (1990)] ; [Gribskov 등, Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)] 참조), 및 "진화 연결" (예를 들어, [Holm 등, Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999)], 및 [Brenner 등, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)] 참조) 을 포함한다.

특정 구현예에서, 참조 항체의 변이체는 참조 항체의 아미노산 서열과 비교해 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형이 변경된 글리코실화 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드의 변이체는 본래의 폴리펩티드에 비해 더 많거나 또는 더 적은 수의 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결 글리코실화 부위는 하기 서열을 특징으로 한다 : Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr (여기서, X 로서 지정된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 아미노산 잔기일 수 있음). 상기 서열을 만들기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결 탄수화물 사슬의 첨가를 위해 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 대안적으로, 상기 서열을 제거하는 치환은 기존의 N-연결 탄수화물 사슬을 제거할 것이다. 특정 구현예에서, N-연결 탄수화물 사슬의 재배열이 제공되며, 여기서, 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위 (전형적으로 자연발생적인 것들) 가 제거되고, 하나 이상의 신규 N-연결 부위가 생성된다. 실례의 항체 변이체는 하나 이상의 시스테인 잔기가 참조 항체의 아미노산 서열에 비해 삭제되거나 또는 또다른 아미노산 (예를 들어, 세린) 으로 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 시스테인 변이체는, 항체가 불용성 삽입체의 단리 후에서와 같이 생물학적으로 활성인 구조로 재접힘되어야 할 때, 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 시스테인 변이체는 본래의 폴리펩티드보다 더 적은 수의 시스테인 잔기를 갖는다. 특정 구현예에서, 시스테인 변이체는 홀염기 시스테인으로부터 생성되는 상호작용을 최소화하기 위해 짝수의 시스테인 잔기를 갖는다.

특정 구현예에 따르면, 아미노산 치환은 하기와 같은 것들이다 : (1) 단백용해되는 가능성을 감소시킴, (2) 산화가능성을 감소시킴, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경시킴, (4) 결합 친화성 변경시킴, 및/또는 (4) 상기 폴리펩티드 상에서 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 또는 개질시킴. 특정 구현예에 따르면, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환) 은 자연-발생 서열 (특정 구현예에서, 분자내 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분) 내에서 일어날 수 있다. 특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 참조 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시킬 수 없다 (예를 들어, 특정 구현예에서, 대체 아미노산은 참조 서열에서 발생하는 나선을 깨뜨리거나, 또는 참조 서열을 특징화하는 2 차 구조의 다른 유형을 방해해서는 안됨). 특정 당업계에 인지된 폴리펩티드 2 차 및 3 차 구조의 예는 예를 들어, [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))] ; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton 등, Nature 354:105 (1991)] 에 기술되어 있다.

"동일성 백분율" 또는 "%동일성" 은 핵산 서열을 참조로 하여, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 엔진을 사용하여 배열된 2 개 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 말한다. [Tatusova 등 (1999) FEMS Microbiol Lett . 174:247-250] 를 참조한다. BLAST 엔진 (버전 2.2.10) 은 Bethesda, MD 에 있는 미국 생물기술 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 에게 제공되었다. 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열을 배열하기 위해, "블라스트 2 시퀀스 (Blast 2 서열)" 툴이 사용되는데, 이는 하기와 같이 디폴트값에서 세워진 변수를 이용하는 "블라스틴 (Blastin)" 프로그램을 사용한다 :

매트릭스 : 이용가능하지 않음

일치 가산점 : 1

불일치 가산점 : -2

오픈 갭: 5 페널티

신장 갭: 2 페널티

갭_x 드롭오프 : 50

기대값 : 10.0

워드 크기 : 11

필터 : 온 (on).

폴리펩티드 서열과 관련하여, "백분율 동일성" 또는 "%동일성" 은 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 엔진을 사용하여 배열된 2 개 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 동일한 아미노산의 백분율을 말한다. [Tatusova 등 (1999) FEMS Microbiol Lett . 174:247-250] 를 참조한다. BLAST 엔진 (버전 2.2.10) 은 Bethesda, MD 에 있는 미국 생물기술 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 에게 제공되었다. 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열을 배열하기 위해, "블라스트 2 시퀀스 (Blast 2 서열)" 툴이 사용되는데, 이는 하기와 같이 디폴트값에서 세워진 변수를 이용하는 "블라스트피 (Blastp)" 프로그램을 사용한다 :

매트릭스 : BLOSUM62

오픈 갭 : 11 패널티

신장 갭 : 1 패널티

갭_x 드롭오프 : 50

기대값 : 10.0

워드 크기 : 3

필터 : 온 (on).

용어 "유효 투여량" 또는 "유효량" 은 환자에서 증후를 감소시키거나 또는 목적하는 생물학적 결과를 초래하는, 중화 항체와 같은 제제의 양을 말한다. 특정 구현예에서, 유효투여량 또는 유효량은 ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 감소시키기에 충분하다. 특정 구현예에서, 유효투여량 또는 유효량은 하기 Part V.G 에서 기술된 바와 같이 결정된다.

용어 "치료" 는 달리 지시되지 않는 한, 치료적 및 예방적/방어적 목적을 포함한다. 치료가 필요한 사람에는, 이미 특정 증상 또는 장애를 가진 개인뿐만 아니라, 특정 증상 또는 장애를 가질 위험에 있는 개인 (예를 들어, 예방적/방어적 측정이 필요한 사람) 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "치료하기" 는 치료적 및/또는 예방적/방어적 목적을 위해 환자에게 제제를 투여하는 것을 말한다.

"치료제" 는 치료적 및/또는 예방적/방어적 효과를 초래하기 위해 생체 내에 투여될 수 있는 제제를 말한다.

"치료성 항체" 는 치료적 및/또는 예방적/방어적 효과를 초래하기 위해 생체 내에 투여될 수 있는 항체를 말한다.

용어 "단리된 핵산" 및 "단리된 폴리뉴클레오티드" 는 상호교환적으로 사용되며, 게놈, cDNA, 또는 합성 기원 또는 그의 일부의 조합의 폴리뉴클레오티드를 말한다. "단리된 폴리뉴클레오티드" 는 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드" 가 사실상 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합되지 않거나, (2) 사실상 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 (3) 사실상 더 큰 서열의 부분으로서 발생하지 않는다.

B. 본래의 항체 및 특정 항체 절편의 구조

본래의 항체는 전형적으로 4 차 구조를 갖는다. 사량체는 전형적으로 폴리펩티드 사슬의 2 개의 동일한 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 (특정 구현예에서, 약 25 kDa) 및 하나의 중쇄 (특정 구현예에서, 약 50 - 70 kDa) 를 갖는다. 본래의 항체에서, 중쇄는 가변 영역, V_H, 및 3 개의 불변 영역, C_H1, C_H2, 및 C_H3 를 포함한다. V_H 도메인은 중쇄의 아미노-말단에 있고, C_H3 도메인은 카르복시-말단에 있다. 본래의 항체에서, 경쇄는 가변 영역, V_L, 및 불변 영역, C_L 을 포함한다. 경쇄의 가변 영역은 경쇄의 아미노-말단에 있다. 본래의 항체에서, 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다. 불변 영역은 전형적으로 효과기 기능을 책임진다.

본래의 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 본래의 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 입실론으로서 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE 로서 한정한다. IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하위부류를 갖는다. IgM 은 IgM1 및 IgM2 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하위부류를 갖는다. IgA 는 IgA1 및 IgA2 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하위부류를 갖는다. 본래의 인간 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 전형적으로 약 12 개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 합해지고, 중쇄는 또한 약 10 개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들어, [Fundamental Immunology (1989) ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.)] 를 참조한다.

본래의 항체에서, 가변 영역은 전형적으로 상대적으로 보존된 골격 영역 (FR) 에 상보성 결정 영역 (CDR) 이라고도 하는 3 개의 초가변 영역이 조합된 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2 개의 사슬의 CDR 은 전형적으로 골격 영역에 의해 배열되고, 이는 특이적인 에피토프에 결합할 수 있게 한다. N-말단부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 둘 다 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 을 포함한다. 중쇄 상의 CDR 을 H1, H2, 및 H3 라고 하고, 한편 경쇄 상의 CDR 을 L1, L2, 및 L3 이라고 한다. 전형적으로, CDR3 은 항원-결합 부위 내에서 분자 다양성의 가장 큰 제공자이다. 예를 들어, H3 은 특정한 경우에, 2 개의 아미노산 잔기와 동일하게 짧거나 또는 26 보다 더 길 수 있다. 각각의 도메인에의 아미노산의 배열은 전형적으로 [Kabat 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, vols. 1-3, Bethesda, MD)] ; [Chothia & Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)] ; 또는 [Chothia 등 Nature 342:878-883 (1989)] 의 정의에 따라 이루어진다. 본 출원에서, 용어 "CDR" 은 달리 지시되지 않는 한, 경쇄 또는 중쇄로부터의 CDR 을 말한다.

"Fab" 절편은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 C_H1 및 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 또다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fab'" 절편은 하나의 경쇄, 및 C_H1 및 C_H2 도메인 사이에서 연장된 추가의 불변 영역을 포함하는 하나의 중쇄를 포함한다. 내부사슬 이황화 결합이 Fab' 절편의 2 개의 중쇄 사이에서 형성되어, "F(ab')₂" 분자를 형성할 수 있다.

"Fv" 절편은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하나, 불변 영역은 없다. 단일-사슬 Fv (scFv) 절편은 항원-결합 영역과 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하는 유연성 연결기에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 실례의 단일 사슬 항체는 WO 88/01649 및 미국 특허 제 4,946,778 호 및 제 5,260,203 호에 상세히 논의되어 있다. 일부 구현예에서, 단일 가변 영역 (Fv 의 반쪽) 은 항원을 인지하고 결합할 수 있는 능력을 가질 수 있으나, Fv 보다는 친화성이 더 낮다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄" 는 단독으로 또는 경쇄와 조합되어 항원 특이성을 부여하기에 충분한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄" 는 단독으로 또는 중쇄와 조합되어 항원 특이성을 부여하기에 충분한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다.

C. 특정 항체

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 제공된다. 일부 그러한 구현예에서, 단일클론 항체는 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 감소시키는 단일클론 항체를 중화시킨다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 시험관 내에서 ANGPTL4 의 존재 하에 LPL 활성을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 하나 이상의 혈청 지질 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 혈청 트리글리세리드 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 총 콜레스테롤 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 생체 내에서 자유 지방산 (FFA) 수준을 감소시킨다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 LDLr 녹아웃 마우스에서 생체 내 혈청 트리글리세리드를 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 LDLr 녹아웃 마우스에서 생체 내 총 콜레스테롤을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 ApoE 녹아웃 마우스에서 생체 내 혈청 트리글리세리드를 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 ApoE 녹아웃 마우스에서 생체 내 총 콜레스테롤을 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 db/db 마우스에서 생체 내 혈청 트리글리세리드를 감소시킨다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 db/db 마우스에서 생체 내 총 콜레스테롤를 감소시킨다.

특정 구현예에서, 마우스 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 인간 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 상이한 종의 ANGPTL4 에 있는 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체 (즉, 교차-활성을 갖는 항체) 가 제공된다. 일부 그러한 구현예에서, 상기 항체는 마우스 ANGPTL4 및 인간 ANGPTL4 둘 다에 특이적으로 결합한다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 마우스 ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 잔기 21 내지 잔기 174 의 마우스 ANGPTL4 (SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 50) 의 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 인간 ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 중화 단일클론 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 잔기 21 내지 잔기 169 의 인간 ANGPTL4 (SEQ ID NO:2) 의 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다.

특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 비-인간 단일클론 항체이다. 일부 그러한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 설치류 단일클론 항체이다. 일부 그러한 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 마우스 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 키메라성 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 인간화된 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 인간 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 키메라성, 인간화된, 및/또는 인간 단일클론 항체가 인간에서 치료적 항체로서 유용하다.

특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 항체 절편이다. 실례의 항체 절편에는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, Fd, 이항체, 및 기타 항체 절편이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

14D12, 90B4, 및 15F2 로 지정되는 실례의 중화 단일클론 항체가 제공된다. 상기 항체는 마우스 ANGPTL4 (SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 50) 의 잔기 21 내지 174 내의 에피토프에 결합한다. 상기 항체는 또한 ANGPTL4 활성을 중화시킨다. 따라서, 동일한 에피토프 (예를 들어, 인간 또는 마우스 ANGPTL4 내의 동일한 에피토프) 에 결합하는 항체가 또한 중화 활성을 가지는 것으로 예상될 것이다. 특정 ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 SEQ ID NO : 40 내지 48 로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드에 결합한다. 특정 ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 SEQ ID NO : 40 내지 43 으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 SEQ ID NO: 40 의 서열을 갖는 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 SEQ ID NO: 41 의 서열을 갖는 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 SEQ ID NO: 43 의 서열을 갖는 펩티드에 결합한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체는 SEQ ID NO: 41 의 서열을 갖는 펩티드 및 SEQ ID NO: 43 의 서열을 갖는 펩티드 둘 다에 결합한다.

특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 단일클론 항체 14D12 가 결합하는 동일한 에피토프에 결합하도록 제공된다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 단일클론 항체 15F2 가 결합하는 동일한 에피토프에 결합하도록 제공된다. 특정 구현예에서, 중화 단일클론 항체는 단일클론 항체 90B4 가 결합하는 동일한 에피토프에 결합하도록 제공된다.

특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 12 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 13 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 14 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 16 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 17 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 18 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 12 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 16 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 13 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 17 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 중화 항체는 SEQ ID NO: 14 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 18 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

1. 키메라화된 및 인간화된 단일클론 항체

특정 구현예에서, 비-인간 항체는 키메라화된다. 특정 구현예에서, 인간 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체가 키메라화된다. 키메라 항체를 제조하는 특정한 실례의 방법이 예를 들어, [Morrison 등 (1984) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 81:6851-6855] ; [Neuberger 등 (1984) Nature 312:604-608] ; [Takeda 등 (1985) Nature 314:452-454] ; 및 미국 특허 제 6,075,181 호 및 제 5,877,397 호에서 제공된다.

특정 구현예에서, 비-인간 항체는 "인간화"된다. 특정 구현예에서, 인간 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체가 인간화된다. 특정 구현예에서, 마우스 ANGPTL4 에 대해 발생되나, 인간 ANGPTL4 와 특이적으로 결합하는 (즉, 교차-반응하는) 마우스 단일클론 항체가 인간화된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 인간에게 투여되었을 때, 그의 결합 특이성을 유지하고, 면역원성을 감소 (예를 들어, 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 감소) 시킨다. 특정 구현예에서, 인간화는 하기 상세히 기술되는 바와 같이, CDR 이식 및 인간 엔지니어링을 포함하나 이에 제한되지 않는 방법에 의해 달성된다.

인간화된 항체의 특정 구현예에서, 목적하는 결합 특이성을 가진 항체 ("공여자" 항체) 의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 "수용기" 항체에 있는 인간 골격 영역 (FR) 에 이식한다. 실례의 CDR 이식은 예를 들어, 미국 특허 제 6,180,370 호, 제 5,693,762 호, 제 5,693,761 호, 제 5,585,089 호, 및 제 5,530,101 호 ; [Queen 등 (1989) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033] 에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로부터의 하나 이상의 CDR 을 수용기 항체 내의 일치하는 인간 FR 에 이식한다. 일치하는 (consensus) 인간 FR 을 제조하기 위해, 특정 구현예에서, 다수의 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 FR 은 일치하는 아미노산 서열을 규명하기 위해 배열된다.

특정 구현예에서, 수용기 항체 내의 특정 FR 아미노산은 공여자 항체의 FR 아미노산으로 대체된다. 일부 그러한 구현예에서, 공여자 항체의 FR 아미노산은 표적 항원에 대한 공여자 항체의 친화성에 기여하는 아미노산이다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,180,370 호, 제 5,693,762 호, 제 5,693,761 호, 제 5,585,089 호, 및 제 5,530,101 호 ; [Queen 등 (1989) Proc . Nat 'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 결합 항원에 관련되고/거나 또는 항원 결합 부위의 구조에 기여하기 쉬운 잔기를 규명하기 위해, 공여자 및/또는 수용자 항체를 모델링하고, 따라서 공여자 항체에 대체되는 FR 잔기와 같은 잔기의 선택을 돕는데에 컴퓨터 프로그램이 사용된다.

특정 구현예에서, 공여자 항체의 CDR 은 인간 불변 영역을 포함하는 수용자 항체에 이식된다. 일부 그러한 구현예에서, FR 은 또한 수용자에게 이식되기도 한다. 특정 구현예에서, 공여자 항체의 CDR 은 단일 사슬 Fv 항체로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 공여자 항체의 FR 은 단일 사슬 Fv 항체로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체 내의 이식된 CDR 은 추가로 개질되어 (예를 들어, 아미노산 치환, 소실, 또는 삽입에 의해 개질), 표적 항원에 대한 인간화된 항체의 친화성을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체 내의 이식된 FR 은 추가로 개질되어 (예를 들어, 아미노산 치환, 소실, 또는 삽입에 의해 개질), 표적 항원에 대한 인간화된 항체의 친화성을 증가시킨다.

특정 구현예에서, 비-인간 항체는 "인간 엔지니어링" 방법을 사용하여 인간화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,766,886 호 및 제 5,869,619 호를 참조한다. 인간 엔지니어링의 특정 구현예에서, 항체 가변 도메인의 구조에 대한 정보 (예를 들어, 결정 구조 및/또는 분자 모델링으로부터 수득된 정보) 는, 가변 영역 내의 주어진 아미노산 잔기가 (a) 항원 결합에 관련되거나, (b) 항체 표면상에서 노출되거나 (즉, 용매와 작용가능함), 또는 (c) 항체 가변 영역 내에 묻혀 있는지의 (즉, 가변 영역의 구조를 유지하는데 관련됨) 경향성을 평가하는데 사용된다. 더욱이, 특정 구현예에서, 인간 가변 영역 사이에서 보존되는 잔기를 규명하기 위해, 인간 가변 영역 일치 서열을 발생시킨다. 특정 구현예에서, 비-인간 항체의 가변 영역 내의 아미노산 잔기가 치환되어야 하는지를 알아보기 위해, 상기 정보가 지침을 제공한다.

일부 중화 항체는 14D12 의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 15F2 의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 90B4 의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 14D12 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 15F2 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 90B4 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 14D12 의 2 개 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 15F2 의 2 개 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 90B4 의 2 개 이상의 CDR 을 포함하는 중쇄를 포함한다.

일부 중화 항체는 14D12 의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 15F2 의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 90B4 의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 14D12 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 15F2 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 90B4 의 하나 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 14D12 의 2 개 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 15F2 의 2 개 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 중화 항체는 90B4 의 2 개 이상의 CDR 을 포함하는 경쇄를 포함한다.

2. 항체 아이소타입

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE 로부터 선택되는 임의의 아이소타입 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 IgG 아이소타입이다. 일부 그러한 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 IgM 아이소타입이다. 일부 그러한 구현예에서, 항체 는 하위부류 IgM1 또는 IgM2 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 IgA 아이소타입이다. 일부 그러한 구현예에서, 항체는 하위부류 IgA1 또는 IgA2 중 하나이다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1 또는 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 마우스 카파 경쇄 및 마우스 IgG1 또는 IgG2 중쇄를 포함한다.

3. 개질된 항체

다양한 구현예에서, 항체는 그의 특성 중 하나 이상을 변경시키도록 개질된다. 특정 구현예에서, 개질된 항체는 증가된 안정성, 증가된 순환 시간, 또는 감소된 면역원성과 같은, 비개질된 항체를 넘어서는 이점을 가질 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,179,337 호 참조). 특정 구현예에서, 항체는 비단백질성 부분에 항체를 연결시킴으로써 개질된다. 특정 구현예에서, 항체는 항체의 글리코실화 상태를 변경함으로써, 예를 들어, 항체 상의 탄수화물 사슬의 수, 유형, 연결, 및/또는 위치를 변경함으로써 개질된다. 특정 구현예에서, 항체는 글리코실화되지 않도록 개질된다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 화학적 부분은 항체의 아미노산 백본 및/또는 탄수화물 잔기에 연결된다. 항체에 화학적 부분을 연결하는 일부 실례의 방법이 당업자에게 알려져 있다. 상기 방법에는 아실화 반응 또는 알킬화 반응이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, EP 0 401 384 ; [Malik 등 (1992), Exp . Hematol ., 20:1028-1035] ; [Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2):4-10, published by Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK] ; EP 0 154 316 ; EP 0 401 384 ; WO 92/16221 ; WO 95/34326 ; WO 95/13312 ; WO 96/11953 ; WO 96/19459 및 WO 96/19459 를 참조한다. 특정 구현예에서, 상기 반응 중 임의의 것이 항체의 아미노-말단에서 화학적으로 개질된 항체를 생성하는데에 사용된다.

특정 구현예에서, 항체는 효소성, 형광성, 아이소토픽 또는 친화성 표지와 같은 검출가능한 표지에 연결된다. 일부 그러한 구현예에서, 검출가능한 표지는 항체의 검출 또는 단리를 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 검출가능한 표지는 항체에 의해 결합된 항원의 검출을 가능하게 한다.

특정 구현예에서, 항체는 하나 이상의 중합체에 항체를 연결시킴으로써 개질된다. 특정 구현예에서, 항체는 하나 이상의 수용성 중합체에 연결된다. 일부 그러한 구현예에서, 수용성 중합체에의 연결은 항체가 생리학적 환경과 같은 수성 환경에 참여할 경향성을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 치료적 항체는 수용성 중합체에 연결된다. 특정 구현예에서, 당업자는 중합체/항체 컨쥬게이트가 환자의 치료에 사용될 것인지와, 만약 그렇다면 항체의 약리학적 프로파일 (예를 들어, 반감기, 투여량, 활성, 항원성, 및/또는 기타 요소) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 바탕으로 적합한 수용성 중합체를 선택할 수 있다.

일부 실례의 임상적으로 허용가능한, 수용성 중합체에는, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) ; 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드 ; 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체 ; 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 ; 카르복시메틸셀룰로스 ; 덱스트란 ; 폴리비닐 알콜 (PVA) ; 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란 ; 폴리-1,3,6-트리옥산 ; 에틸렌/말레 무수물 공중합체 ; 폴리-β-아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체 중 하나) ; 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜 ; 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체 (PPG) 및 기타 폴리알킬렌 옥시드 ; 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드　공중합체 ; 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POG) (예를 들어,　글리세롤) 및 기타 폴리옥시에틸화된 폴리올 ; 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 폴리옥시에틸화된 포도당, 대장산 또는 기타 탄수화물 중합체 ; 및 피콜 (Ficoll), 덱스트란, 또는그의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실례의 PEG 에는 모노-(C₁-C₁₀) 알콕시- 또는 아릴옥시-PEG 와 같이, 항체 개질에 유용한 것으로 당업계에 알려진 일부 형태가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, PEG 프로피온알데하이드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조 시 이점을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 수용성 중합체는 임의의 분자량의 중합체이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체는 분지 또는 비분지되어 있다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa (범위의 끝점 사이의 모든 점을 포함) 이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 40 kDa 이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 10 kDa 내지 약 35 kDa 이다. 특정 구현예에서, 수용성 중합체의 평균 분자량은 약 15 kDa 내지 약 30 kDa 이다.

특정 구현예에서, 항체는 PEG 에 연결된다 (즉, 항체가 "PEG화됨"). 다양한 구현예에서, PEG 는 포유류에서 낮은 독성을 가진다. [Carpenter 등 (1971) Toxicol . Appl .　 Pharmacol ., 18, 35-40] 를 참조한다. 두드러지게는, 아데노신 디아미나제의 PEG　부가물은 중증 면역결핍 증후군의 치료를 위해 인간에서 사용되는 것으로 미국에서 승인되었다. 다양한 구현예에서, PEG 는 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, PEG 의, 비-인간 서열을 갖는 항체에의 연결은 인간에게 투여되는 경우, 항체의 항원성을 감소시킬 수 있다.

특정 구현예에서, 중합체는 항체에 있는 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 실례의 반응성 아미노산 잔기에는, 아미노-말단 아미노산의 알파-아미노기, 리신 곁사슬의 입실론 아미노기, 시스테인 곁사슬의 술피드릴기, 아스파르틸 및 글루타밀 곁사슬의 카르복실기, 카르복시-말단 아미노산의 알파-카르복실기, 티로신 곁사슬, 및 일부 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기에 연결된 활성화된 글리코실 사슬이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 단백질과의 직접적인 반응에 적합한, 일부 실례의 활성화된 형태의 PEG ("PEG 시약") 은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 아미노기에의 연결에 적합한 PEG 시약에는, 예를 들어, 이탈기가 N-히드록시숙신이미드, p-니트로페놀, 이미다졸 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-4-술포네이트인, PEG 의 카르복실산 또는 탄산염 유도체의 활성 에스테르가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 말레이미도 또는 할로아세틸기를 함유하는 PEG 시약은 술피드릴기를 개질하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 아미노, 히드라진 및/또는 히드라지드기를 함유하는 PEG 시약은 단백질 내 탄수화물기의 과요오드산 산화에 의해 생성되는 알데하이드와 반응하는데 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 수용성 중합체는 하나 이상의 반응성기를 가진다. 특정 구현예에서, PEG 와 같은 수용성 중합체의 활성화된 유도체는 수용성 중합체를 활성화기와 반응시킴으로써 생성된다. 특정 구현예에서, 활성화기는 단일작용성, 이작용성, 또는 다작용성일 수 있다. 수용성 중합체를 2 개 이상의 항체에 연결시키는데 사용될 수 있는 일부 실례의 활성화기에는 하기 기가 포함되나, 이에 제한되지 않는다 : 술폰 (예를 들어, 클로로술폰, 비닐술폰 및 디비닐술폰), 말레이미드, 술피드릴, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지디린, 옥시란 및 5-피리딜. 특정 구현예에서, PEG 유도체는 전형적으로 pH 약 11 이하의 pH 에서 수성 환경에서 연장된 기간 동안 가수분해에 대해 안정하다. 특정 구현예에서, 항체와 같은 또다른 분자에 연결된 PEG 유도체는 가수분해에 대한 안정성을 그 분자에 부여한다. 일부 실례의 단독이작용성 PEG 유도체에는, PEG-비스-클로로술폰 및 PEG-비스-비닐술폰이 포함되나, 이에 제한되지 않는다 (WO 95/13312 참조).

D. 특정 단일클론 항체 제조 방법

1. 특정 하이브리도마 방법

특정 구현예에서, 단일클론 항체를 표준 기술에 의해 제조한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체를 하이브리도마-기재 방법에 의해 제조한다. 일부 그러한 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, [Kohler 등 (1975) Nature 256:495-497] ; [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 6 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다. 일부 그러한 구현예에서, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 또는 기타 포유류와 같은 적합한 동물을 면역원으로 면역시켜, 항체-분비 세포를 제조한다. 특정 구현예에서, 항체-분비 세포는 림프구 또는 비장세포와 같은 B-세포이다. 특정 구현예에서, 림프구 (예를 들어, 인간 림프구) 를 시험관 내에서 면역시켜, 항체-분비 세포를 발생시킨다. 예를 들어, [Borreback 등 (1988) Proc . Nat 'l Acad . Sci . USA 85:3995-3999] 를 참조한다.

특정 구현예에서, 항체 분비 세포를 골수-형 세포주와 같은 "불사멸" 세포주와 융합하여, 하이브리도마 세포를 제조한다. 특정 구현예에서, 목적하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 예를 들어, ELISA 에 의해 동정한다. 그런 후, 특정 구현예에서, 상기 세포를 서브클로닝하고, 표준 방법을 사용하여 배양할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포를 또한 적합한 동물 숙주에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체를 친화성 크로마토그래피와 같은 표준 분리 과정을 사용하여 하이브리도마 배양 배지, 혈청, 또는 복수액로부터 단리한다. 일부 구현예에 따르면, 하이브리도마의 생성 및 단일클론 항체의 정제에 대한 지침이 예를 들어, [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 8 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 제공된다.

특정 구현예에서, 마우스 단일클론 항체를 유전적으로 변형된 마우스에 면역원으로 면역화시킴으로써 제조한다. 일부 그러한 구현예에서, 마우스는 부분적으로 또는 완전히 ANGPTL4 기능이 결여된 ANGPTL4-결핍 마우스이다. 일부 그러한 구현예에서, 마우스는 ANGPTL4 를 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부가 결여된 "녹아웃" 마우스이다. 특정 구현예에서, 상기 녹아웃 마우스를 마우스 ANGPTL4 로 면역화시킨다. 특정 구현예에서, 상기 녹아웃 마우스를 인간 ANGPTL4 로 면역화시킨다.

특정 구현예에서, 인간 단일클론 항체를 인간 항체를 생성할 수 있는 유전자도입 동물 (예를 들어, 마우스) 에서 발생시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,075,181 A 호 및 제 6,114,598 A 호 ; 및 WO 98/24893 A2 를 참조한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 인간 면역글로불린 유전자를 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 마우스 내에 도입한다 (예를 들어, 효모 인공 염색체, 인간 염색체 절편, 또는 생식선 혼입을 사용하여 도입). 예를 들어, [Jakobovits 등 (1993) Nature 362:255-258] ; [Tomizuka 등 (2000) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 97:722-727] ; 및 [Mendez 등 (1997) Nat. Genet. 15:146-156 (유전자도입 마우스의 제노마우스 II

주를 기술)] 를 참조한다.

특정 구현예에서, 상기 유전자도입 마우스를 면역원으로 면역시킨다. 일부 그러한 구현예에서, 항체를 발현하는 마우스의 림프구 세포 (예컨대 B-세포) 를 수득한다. 일부 그러한 구현예에서, 상기 회수된 세포를 골수종-형 세포주와 같은 "불사멸" 세포와 융합하여, 하이브리도마 세포를 제조한다. 일부 그러한 구현예에서, 하이브리도마 세포를 스크리닝하고, 선택하여, 관심 항원에 특이적인 항체를 생성하는 세포를 동정한다. 인간 단일클론 항체의 생성에 적합한 일부 실례의 방법 및 유전자도입 마우스는, 예를 들어, [Jakobovits 등 (1993) Nature 362:255-258; Jakobovits (1995) Curr . Opin . Biotechnol . 6:561-566; Lonberg 등 (1995) Int. Rev . Immunol . 13:65-93; Fishwild 등 (1996) Nat . Biotechnol . 14:845-851; Mendez 등 (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green (1999) J. Immunol . Methods 231:11-23; Tomizuka 등 (2000) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 97:722-727; 및 Little 등 (2000) Immunol . Today 21:364-370 에서 리뷰되어 있음 ; 및 WO 98/24893] 에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 인간 단일클론 항체는 치료적 항체로서 사용되기에 적합하다. 하기 Part V.G. 를 참조한다.

2. 특정 디스플레이-기재 방법

특정 구현예에서, 인간 단일클론 항체를 예를 들어, 하기 기술된 것들 중 임의의 것과 같은 디스플레이-기재 방법을 사용하여 제조한다.

특정 구현예에서, 단일클론 항체를 파지 디스플레이 기술을 사용하여 제조한다. 일부 실례의 항체 파지 디스플레이 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, [Hoogenboom, Overview of Antibody Phage - Dispaly Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology : Antibody Phage - Dispaly : Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien and Aitken, eds., Humana Press, Totowa, NJ)] 에 기술된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항체 라이브러리를 비용해성 섬유성 파지 fd 또는 M13 와 같은 섬유성 파지의 표면 상에 디스플레이한다. 특정 구현예에서, 항체는 V_H-V_L 쌍 및 이항체를 안정화시키기 위한 엔지니어링된 분자내 이황화 결합이 있는 scFv, Fab, Fv 와 같은 항체 절편이다. 다음, 특정 구현예에서, 목적하는 결합 특이성을 가진 항체를 선택할 수 있다. 항체 파지 디스플레이 방법의 일부 실례의 구현예는 하깅에서 추가로 상세히 설명된다.

특정 구현예에서, 항체 파지-디스플레이 라이브러리를 당업자에게 공지된 특정 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, [Hoogenboom, Overview of Antibody Phage - Dispaly Technology and Its Applications, from Methods in 분자 Biology: Antibody Phage - Dispaly : Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ)] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 가변 유전자 저장소를 항체-분비 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA 유래의 cDNA 의 PCR 증폭에 의해 제조한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, cDNA 를 B-세포의 mRNA 로부터 제조한다. 특정 구현예에서, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA 를 예를 들어, PCR 에 의해 증폭시킨다.

특정 구현예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를 적합한 벡터 내에 클로닝시킨다. 특정 구현예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를 클로닝 과정 동안에 무작위로 조합하고, 그리하여 다양한 scFvs 또는 Fabs 를 암호화하는 cDNA 라이브러리의 어셈블리를 제조한다. 특정 구현예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를, 적합한 벡터 내로 클로닝시키기 전에, 연결시킨다. 특정 구현예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA 를 적합한 벡터 내로 순차적으로 클로닝시킴으로써 연결한다.

특정 구현예에서, cDNA 를 파지미드 벡터와 같은 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝시킨다. pCES1 와 같은 특정 실례의 파지미드 벡터가 당업자에게 알려져 있다. 특정 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 cDNA 는 동일한 벡터 상에 존재한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, scFv 를 암호화하는 cDNA 를, 최소의 파지 코트 단백질 pIII 을 암호화하는 유전자 III 의 전부 또는 일부와 함께 프레임 내에서 클로닝시킨다. 일부 그러한 구현예에서, 파지미드는 파지 표면 상에서의 scFv-pIII 융합의 발현을 직접 지시한다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 중쇄 (또는 경쇄) 를 암호화하는 cDNA 를 유전자 III 의 전부 또는 일부와 함께 프레임 내에서 클로닝시키고, 경쇄 (또는 중쇄) 를 암호화하는 cDNA 를 동일한 벡터 내에서 신호 서열의 다운스트림 클로닝시킨다. 신호 서열은, 중쇄 및 경쇄가 Fab 절편 내로 어셈블리되는 숙주 세포의 주변질로의 경쇄 (또는 중쇄) 의 발현을 직접 지시한다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 중쇄를 암호화하는 cDNA 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 는 분리된 벡터 상에 존재한다. 일부 그러한 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 cDNA 를 따로 클로닝시키는데, 하나는 파지미드에, 그리고 나머지 다른 하나는 파지 벡터에 클로닝시킨다 (둘 다 숙주 세포 내에서의 생체 내 재조합을 위한 신호를 함유하고 있음).

특정 구현예에서, 재조합 파지미드 또는 파지 벡터를 E. coli 와 같은 적합한 박테리아 숙주에 도입한다. 파지미드를 사용하는 특정 구현예에서, 숙주를 파지 구조 단백질을 공급하는 조력자 파지로 감염시켜서, 파지 표면상에 항체-pIII 융합 단백질을 운반하는 파지 입자를 발현시킬 수 있다.

특정 구현예에서, "합성" 항체 라이브러리를, 시험관 내에서 재배열된 가변 유전자의 레퍼토리를 사용하여 구축한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 중쇄 또는 경쇄 (각각 V-D-J 또는 V-J) 를 암호화하는 개별 유전자 분절을 PCR 을 사용하여 무작위로 조합한다. 일부 그러한 구현예에서, 추가의 서열 다양성을 CDR, 및 가능하게는 예를 들어, 에러 프론 PCR 에 의해 FR 내에 도입할 수 있다. 일부 그러한 구현예에서, 추가의 서열 다양성을 CDR3, 예를 들어, 중쇄의 H3 내에 도입한다.

특정 구현예에서, "고유의 (naive)" 또는 "유니버셜" 파지 디스플레이 라이브러리를 비면역화된 동물의 핵산을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 구축한다. 특정 구현예에서, 비면역화된 동물은 인간이다. 특정 구현예에서, "면역화된" 파지 디스플레이 라이브러리를 면역화된 동물의 핵산을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 구축한다. 특정 구현예에서, 면역화된 동물은 인간, 래트, 마우스, 햄스터, 또는 원숭이이다. 일부 그러한 구현예에서, 동물을 하기 기술된 면역원 중 임의의 것을 사용하여 면역화시킨다.

일부 실례의 유니버셜 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리는 시중에서 구입가능하다. 일부 실례의 라이브러리에는, MorphoSys AG (Martinstreid/Munich, Germany) 의 라이브러리의 HuCAL 시리즈 ; MAbstract 기술을 사용한 Crucell (Leiden, the Netherlands) 의 라이브러리 ; BioInvent (Lund, Sweden) 의 n-CoDeR Fab 라이브러리 ; 및 Cambridge Antibody Technology (Cambridge, UK) 의 라이브러리가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체를 선택하는 것은 연속 패닝 단계 (successive panning step) 에 의해 달성된다. 패닝의 특정 구현예에서, 라이브러리 파지 제제를 항원에 노출시킨다. 일부 그러한 구현예에서, 파지-항원 복합체를 세정하고, 비결합 파지를 버린다. 일부 그러한 구현예에서, 결합 파지를 회수하고, 이어서 E. coli 를 감염시킴으로써 증폭시킨다. 일부 그러한 구현예에서, 단일 플라크를 집어냄으로써, 단일클론 항체-생성 파지를 클로닝할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 과정을 반복한다.

특정 구현예에서, 패닝에 사용된 항원은 하기 기술된 면역원 중 임의의 것이다. 특정 구현예에서, 항원을 고체 지지체 상에서 고정시켜, 친화성 크로마토그래피에 의해 항원-결합 파지를 정제할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원에 비오틴처리하고, 그리하여 스트렙타비딘-코팅 자기 비드를 사용하여 비결합 파지로부터 결합 파지를 분리해낼 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원을 세포 상에 (직접 패닝을 위해), 조직 동결편 내에, 또는 막 상에 (예를 들어, 나일론 또는 니트로셀룰로스 막) 고정시킬 수 있다. 일부 패닝 과정의 기타 변형이 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.

특정 구현예에서, 효모 디스플레이 시스템을 사용하여 단일클론 항체를 제조한다. 일부 상기 시스템에서, 항체를 효모 AGA2 단백질의 전부 또는 일부와의 융합 단백질로서 발현시키고, 이는 효모 세포벽의 표면상에서 나타나게 된다. 다음, 일부 그러한 구현예에서, 목적하는 결합 특이성을 가진 항체를 발현하는 효모 세포를 형광 표지된 항원에 상기 세포를 노출시킴으로써 동정할 수 있다. 다음, 일부 그러한 구현예에서, 항원에 결합된 효모 세포를 유세포분석기에 의해 단리할 수 있다. 예를 들어, [Boder 등 (1997) Nat . Biotechnol . 15:553-557] 를 참조한다.

3. 일부 친화성 성숙화 방법

특정 구현예에서, 항체를 시험관 내에서 친화성 성숙화 (또는 "직접적 진화") 를 시킴으로써, 특정 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킨다. 생체 내에서, 고유의 항체는 체세포 과성숙화를 통해 친화성 성숙화를 겪고 이어서 선택된다. 일부 시험관 내 방법은 상기 생체 내 방법을 흉내내는 것이고, 그리하여, 고유의 항체의 친화성에 동일하거나 또는 능가하는 친화성을 갖는 항체의 제조를 가능하게 한다.

친화성 성숙화의 특정 구현예에서, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열 내에 돌연변이를 도입한다. 예를 들어, [Hudson 등 (2003) Nature Med . 9:129-134; Brekke 등 (2002) Nature Reviews 2:52-62] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 중쇄, 경쇄, 또는 둘 다의 가변 영역에 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 CDR 내에 돌연변이를 도입한다. 일부 그러한 구현예에서, H3, L3, 또는 둘 다 내에 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 FR 내에 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서, 돌연변이의 라이브러리를 예를 들어, 파지, 리보솜, 또는 효모 디스플레이 라이브러리 내에서 제조하여, 증가된 친화성을 갖는 항체를 표준 스크리닝 방법에 의해 동정할 수 있다. 예를 들어, [Boder 등 (2000) Proc . Nat 'l Acad . Sci . USA 97:10701-10705; Foote 등 (2000) Proc . Nat 'l Acad . Sci . USA 97:10679-10681; Hoogenboom, Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology : Antibody Phage Display : 방법 and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien and Aitken, eds., Humana Press, Totowa, NJ); and Hanes 등 (1998) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:14130-14135] 를 참조한다.

특정 구현예에서, 항원 결합 부위와 같은 항체의 구조에 대한 정보를 바탕으로 한 위치-특이적 돌연변이생성에 의해 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서, CDR 의 조합 돌연변이생성을 사용하여 돌연변이를 도입한다. 특정 구현예에서, 가변 영역 코딩 서열의 전부 또는 일부를, 예를 들어, E. coli 돌연변이자 세포, 동종 유전자 재배열, 또는 실수 유발 PCR 을 사용하여 무작위로 돌연변이시킨다. 특정 구현예에서, "DNA 셔플링" 을 사용하여 돌연변이시킨다. 예를 들어, [Crameri 등 (1996) Nature Med . 2:100-102; Fermer 등 (2004) Tumor Biology 25:7-13] 를 참조한다.

특정 구현예에서, "사슬 셔플링" 을 사용하여, 증가된 친화성을 갖는 항체를 제조한다. 사슬 셔플링의 특정 구현예에서, 사슬 중 하나, 예를 들어, 경쇄를 경쇄의 레퍼토리로 대체하고, 한편, 나머지 다른 사슬, 예를 들어, 중쇄를 변화시키지는 않아서, 특이성을 제공한다. 일부 그러한 구현예에서, 사슬 셔플링된 항체의 라이브러리를 제조하고, 여기서 변하지 않은 중쇄는 경쇄의 레퍼토리의 각각의 경쇄와 함께 발현된다. 다음, 특정 구현예에서, 상기 라이브러리를 증가된 친화성을 가진 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 특정 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 연속적으로 대체한다. 특정 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역만을 대체한다. 특정 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 중 일부만을 예를 들어, CDR 만을 대체한다. 예를 들어, [Hudson 등 (2003) Nature Med. 9:129-134; Brekke 등 (2002) Nature Reviews 2:52-62; Kang 등 (1991) Proc . Nat 'l Acad . Sci . USA 88:11120-11123; Marks 등 (1992) Biotechnology 10:779-83] 를 참조한다.

특정 구현예에서, 인간 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체 (마우스 ANGPTL4 에 대해 발생되었으나 인간 ANGPTL4 와 특이적으로 결합하는 (즉, 교차 반응하는) 마우스 단일클론 항체를 포함하나 이에 제한되지 않음) 를 연속적인 사슬 셔플링시킨다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 주어진 마우스 단일클론 항체의 중쇄를 인간 경쇄의 신규 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화성을 가진 항체를 선택한다. 다음, 일부 그러한 구현예에서, 선택된 항체의 경쇄를 인간 중쇄의 신규 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화성을 가진 항체를 선택한다. 따라서, 특정 구현예에서, 목적하는 항원 결합 특이성 및 친화성을 가진 항체를 선택한다.

대안적으로, 특정 구현예에서, 주어진 마우스 단일클론 항체의 중쇄를 인간 경쇄의 신규 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화성을 가진 항체를 이러한 셔플링의 첫 라운드에서 선택한다. 특정 구현예에서, 원래의 마우스 단일클론 항체의 경쇄를 인간 중쇄의 신규 레퍼토리와 조합하고, 목적하는 친화성을 가진 항체를 이러한 셔플링의 두번째 라운드에서 선택한다. 다음, 특정 구현예에서, 셔플링의 첫 라운드에서 선택된 항체의 인간 경쇄를 셔플링의 두번째 라운드에서 선택된 항체의 인간 중쇄와 조합한다. 따라서, 특정 구현예에서, 목적하는 항원 결합 특이성 및 친화성을 가진 인간 항체를 선택한다.

특정 구현예에서, 친화성 돌연변이로 항체 선택을 변경시키는데에 "리보솜 디스플레이" 방법을 사용한다. 리보솜 디스플레이 방법의 특정 구현예에서, 항체-암호화하는 핵산을 선택 단계 사이의 RT-PCR 에 의해 증폭시킨다. 따라서, 특정 구현예에서, 실수 연발 중합효소를 사용하여, 핵산에 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 상기 방법의 비제한적 예는 [Hanes 등 (1998) Proc . Nat 'l Acad . Sci . USA 95:14130-14135] 에서 상세히 기술되어 있다.

4. 특정 재조합 방법

특정 구현예에서, 단일클론 항체를 재조합 기술에 의해 제조한다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호를 참조한다. 일부 그러한 구현예에서, 단일클론 항체 사슬을 암호화하는 핵산을 클로닝하고, 적합한 숙주 세포에서 발현시킨다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 표준 방법을 사용하여, 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포와 같은 목적하는 항체를 발현하는 세포로부터 RNA 를 제조할 수 있다. 다음, 특정 구현예에서, 표준 방법을 사용하여 cDNA 를 제조하는데 RNA 를 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 를 증폭시킨다. 특정 구현예에서, cDNA 를 적합한 발현 벡터 내에 클로닝시킨다. 다음, 특정 구현예에서, 발현 벡터를, 내인성으로 항체를 생성하지 않는 숙주 세포와 같은 적합한 숙주 세포 내로 형질전환시키거나 트랜스펙션시킨다. 일부 실례의 숙주 세포에는, E. coli, COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 및 골수종 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 중쇄 및 경쇄가 동일한 숙주 내에서 공동발현되는 경우, 재구축된 항체가 단리될 수 있다.

특정 구현예에서, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 cDNA 를 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 마우스 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역을 인간 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역으로 대체시킬 수 있다. 이러한 방식에서, 특정 구현예에서, 인간 항체 불변 영역을 가지나 마우스 항체의 결합 특이성을 유지하는 키메라 항체를 제조할 수 있다.

특정 구현예에서, 재조합 항체는 특정 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 특정 항체를 암호화하는 서열은 적합한 포유류 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 특정 실례의 방법에는, 미국 특허 제 4,399,216 호, 제 4,912,040 호, 제 4,740,461 호 및 제 4,959,455 호에서 예를 든 당업계에 공지된 특정 트랜스펙션 과정을 사용하여, 폴리뉴클레오티드를 바이러스 내에 (또는 바이러스 벡터 내로) 넣고, 숙주 세포를 바이러스 (또는 벡터) 로 형질도입시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 사용된 형질전환 과정은 형질전환되는 숙주에 따라 다를 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입하는 특정 실례의 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌 매개 트랜스펙션, 원형질체 융합법, 전기천공법, 리포좀 내에 폴리뉴클레오티드(들) 를 캡슐화시킴, 및 DNA 를 핵 내로 직접 마이크로주사함을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

발현을 위한 숙주로서 이용가능한 특정 실례의 포유류 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예를 들어, Hep G2), 및 수많은 기타 세포주를 포함하여, American Type Culture Collection (ATCC) 로부터 구입가능한 많은 불사멸 세포주를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 항체를 세포주가 높은 수준으로 생성하는가를 결정함으로써 세포주를 선택할 수 있다.

E. 특정 폴리펩티드 면역원

특정 구현예에서, 항체를 생성하기 위해, 동물을 면역원으로 면역화시킨다. 특정 구현예에서, 면역원은 ANGPTL4 를 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 면역원은 ANGPTL4 의 절편을 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 면역원은 ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다.

특정 구현예에서, 면역원은 마우스 ANGPTL4 를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 ANGPTL4 를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO: 50 의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 ANGPTL4 를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 마우스 ANGPTL4 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 잔기 21 내지 잔기 174 의 SEQ ID NO: 1 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 잔기 21 내지 잔기 174 의 SEQ ID NO: 50 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO: 1 의 잔기 21 내지 잔기 174 의 약 10 - 20 개의 컨티규어스 아미노산의 임의의 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO: 50 의 잔기 21 내지 잔기 174 의 약 10 - 20 개의 컨티규어스 아미노산의 임의의 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO : 40 내지 48 중 어느 하나로부터 선택되는 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO : 40, 41, 42, 및 43 으로부터 선택되는 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO : 40, 41, 42, 및 43 으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO : 41, 42, 및 43 을 포함하는 펩티드를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 펩티드는 면역원성 경향이 있는 것이 선택된다. 일부 그러한 구현예에서, 펩티드는 친수성인 것으로 짐작되고/거나, 또는 그의 접힌 상태에서 고유의 마우스 ANGPTL4 의 표면 상에 노출되는 경향이 있는 것이 선택된다. 적합한 면역원성 펩티드를 선택하기 위한 실례의 가이드가 예를 들어, [Ausubel 등 (1989) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 11.14 (John Wiley & Sons, NY)] ; 및 [Harlow and Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual Ch. 5 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 기술되어 있다.

단백질의 펩티드 분절이 친수성인지 그래서 단백질의 표면 상에 노출되는 경향이 있는지를 짐작하게 하는 특정 실례의 알고리즘이 당업자에게 공지되어 있다. 특정의 그러한 알고리즘은 상기 짐작을 하기 위해 단백질의 1 차 서열 정보를 이용한다. 특정의 그러한 알고리즘은 예를 들어, [Hopp and Woods (1981) Proc. Nat 'l Acad . Sci . USA 78:3824-3828], 또는 [Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol . 157:105-132] 에 기술된 방법을 바탕으로 한다. 특정의 실례의 알고리즘은 단백질의 1 차 아미노산 서열을 바탕으로 단백질의 2 차 구조를 예견하도록 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, [Corrigan 등 (1982) Comput . Programs Biomed . 3:163-168] 를 참조한다. 특정의 그러한 알고리즘은 예를 들어, [Chou and Fasman (1978) Ann . Rev . Biochem . 47:25-276] 의 방법을 바탕으로 한다. 특정 구현예에서, β-회전을 형성할 것으로 예상되고, 따라서 단백질의 표면상에 노출되기 쉬운 펩티드 분절을 면역원으로서 선택할 수 있다.

특정 구현예에서, 면역원은 인간 ANGPTL4 를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 포함하는 인간 ANGPTL4 를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 잔기 21 내지 잔기 169 의 SEQ ID NO:2 의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 SEQ ID NO:2 의 잔기 21 내지 잔기 169 의 약 10 - 20 개의 컨티규어스 아미노산의 임의의 펩티드를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 펩티드는 면역원성이기 쉬운 것으로 선택된다. 일부 그러한 구현예에서, 펩티드는 친수성이라고 예상되고/거나, 또는 그의 접힌 상태에서 본래의 인간 ANGPTL4 의 표면상에서 노출되기 쉬운 것으로서 선택된다. 적합한 면역원성 펩티드를 선택하는 실레의 지침은 예를 들어, [Ausubel 등 (1989) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 11.14 (John Wiley & Sons, NY); and Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 5 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 에 기술되어 있다.

특정 구현예에서, 동물을 면역원 및 하나 이상의 보조제로 면역시킨다. 특정 구현예에서, 숙주 종에 따라, 면역 반응을 증가시키는데 보조제를 사용한다. 일부 실례의 보조제에는, 프로인트 보조제 (Freund's adjuvant) (완전 또는 불완전), 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 광염, 표면활성 성분, 키토산, 리소레시틴, 플루로닉 (pluronic) 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum ) 과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 면역원, 예를 들어, 펩티드 면역원에 대한 면역 반응은 또다른 면역원성 분자 또는 "담체 단백질" 에 면역원을 커플링시킴으로써 증진된다. 일부 실례의 담체 단백질에는, 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin, KLH), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 오브알부민, 콜레라 톡소이드, 및 그의 면역원성 절편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 펩티드 면역원을 담체 단백질에 커플링시키는데 있어서 실례의 지침은 예를 들어, [Ausubel 등 (1989) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 11.15 (John Wiley & Sons, NY); and Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 5 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 에 기술되어 있다.

특정 구현예에서, 상기 면역원 중 임의의 것을 표준 재조합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 마우스 또는 인간 ANGPTL4 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 절편을 적합한 발현 벡터 내에 클로닝시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 의 핵산 서열을 포함한다. 다음, 특정 구현예에서, 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포 내에 도입한다. 다음, 특정 구현예에서, 폴리펩티드를 표준 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리한다. 재조합 단백질 발현의 일부 실례의 방법에 대해서는, 예를 들어, [Ausubel 등 (1991) Current Protocols in 분자 Biology Ch. 16 (John Wiley & Sons, NY)] 를 참조한다.

F. 특정 어세이

1. 특정 결합 어세이

특정 구현예에서, 항체를 항체의 항원에의 결합을 검출하는 일부 일반적인 방법을 사용하여 ANGPTL4 에의 결합을 스크리닝한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 단일클론 항체의 ANGPTL4 에의 결합 능력을 웨스턴 블롯과 같은 표준 면역화학 방법에 의해 어세이한다. 예를 들어, [Ausubel 등 (1992) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 10.8 (John Wiley & Sons, NY); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 상기 어세이에 사용된 ANGPTL4 는 단리될 수 있거나, 또는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내에 존재할 수 있다.

특정 구현예에서, 단일클론 항체의 ANGPTL4 에의 결합 능력을 경합 결합 어세이를 사용하여 어세이하는데, 이는 ANGPTL4 에의 결합에 대해서, 공지된 항-ANGPTL4 항체와 경합하는 후보 항체의 능력을 평가하는 것이다. 일부 그러한 구현예에서, 공지된 항-ANGPTL4 항체는 하기 파트 VI.J 에서 기술되는 단일클론 항체 중 임의의 것이다. 특정 구현예에서, ELISA 를 사용하여 경합 결합 어세이를 수행한다. 예를 들어, [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다.

특정 구현예에서, 결합 어세이를 사용하여 ANGPTL4 에 대한 항체의 결합 속도 (예를 들어, 속도 상수) 또는 결합 친화성 (예를 들어, 결합 또는 해리 상수) 을 정량화한다. 특정 구현예에서, 항원 (예를 들어, ANGPTL4) 을 고체 지지체 상에 고정함으로써 "고체-상" 내에서 결합의 속도 또는 친화성을 측정한다. 고정된 항원은 용액의 항체를 "잡는다". 특정 구현예에서, 결합 속도 또는 친화성을 항체 (예를 들어, ANGPTL4 에 대한 항체) 를 고체 지지체 상에 고정시킴으로써 "고체-상" 에서 측정하였다. 고정된 항체는 용액의 항체를 "잡는다".

특정 구현예에서, 결합 속도 또는 결합 친화성을 ELISA-기재 방법을 사용하여 측정한다. 특정 구현예에서, 결합 속도 또는 결합 친화성을 Biacore 표면 플라즈몬 공명 기술 (Biacore, Piscataway, NJ) 과 같은 바이오센서-기재 기술을 사용하여 측정한다. 일부 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, [McCafferty 등 (eds.) (1996) Antibody Engineering : A Practical Approach (IRL, Oxford, UK); Goldberg 등 (1993) Curr . Opin . Immunol . 5:278-281; Karlsson 등 (1991) J. Immunol . 방법 145:229-240; Malmqvist (1993) Curr . Opin . Immunol . 5:282-286; for review, see Hoogenboom, Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology : Antibody Phage Display : Methods and Protocols (2002) 178:1-37 at 19 (O'Brien and Aitken, eds., 인간 Press, Totowa, NJ)] 를 참조한다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 Fab 절편의 결합 속도 또는 결합 친화성을 측정한다. 일부 경우, Fab 절편은 다량체화하지 않는 특성을 가진다. 다량체화는 일부 경우에서, "고체상" 방법에서의 결합 속도 및 결합 친화성의 측정을 복잡하게 할 수 있다. 예를 들어, [Hoogenboom, Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology : Antibody Phage Display : Methods and Protocols (2002) 178:1-37 at 19 (O'Brien and Aitken, eds., Humana Press, Totowa, NJ)] 를 참조한다. 따라서, 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 Fab 절편은 예를 들어, ELISA-기재 어세이 또는 Biacore 어세이와 같이, 항원이 고체 지지체에 고정되는 결합 어세이에서 이용하기에 적합하다. 특정 구현예에서, Fab 절편을, 효소 방법을 사용하여 ANGPTL4 에 특이적으로 결합하는 본래의 항체로부터 발생시킨다. 특정 구현예에서, Fab 절편은, 상기 Part V.D.3 에서 기술된 것과 같은 재조합 발현 시스템에서 Fab 절편을 암호화하는 핵산을 발현시킴으로써 제조된다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체의 결합 속도 또는 결합 친화성을 "용액상" 방법을 사용하여 측정한다. 상기 방법에서, 결합의 속도 또는 친화성을 용액 내에서 항체-항원 복합체에 대해 측정한다. 일부 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 방법의 비제한적 실시예는 "속도 배제 어세이" 또는 "KinExA" 이다. 예를 들어, [Blake 등 (1996) J. Biol . Chem . 271:27677-27685; Drake 등 (2004) Anal . Biochem . 328:35-43 (comparing Biacore "Solid phase" and KinExA "Solution phase" 방법)] 를 참조한다. 특정 구현예에서, KinExA 를 수행하는 장비는 Sapidyne Instruments, Inc. (Boise, ID) 에 의해 공급된다.

특정 구현예에서, 다가 항체 또는 다량체화하는 항체의 결합 속도 또는 결합 친화성를 용액상 방법을 사용하여 측정한다. 일부 경우에, 다가 항체 또는 다량체화하는 항체의 결합 속도 또는 결합 친화성의 측정은 용액상 분석을 받을 수 있다.

특정 구현예에서, 항-ANGPTL4 항체의 결합 친화성은 그의 K_D 에 의해 측정된 바와 같이, 약 10^-6M 이하이다. 특정 구현예에서, 항-ANGPTL4 항체의 결합 친화성은 약 10^-7 M, 약 10^-8 M, 또는 약 10^-9 M 이하이다. 일부 그러한 구현예에서, 항-ANGPTL4 항체를 치료적 항체로서 사용할 수 있다. 예를 들어, [Hudson 등 (2003) Nature Med . 9:129-134] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 친화성 돌연변이 기술을 사용하여, 10^-9 M (예를 들어, 약 500 pM 내지 약 0.5 pM 의 결합 친화성, 약 100 pM 내지 약 5 pM 의 결합 친화성을 포함하나 이에 제한되지 않음) 미만의 결합 친화성이 달성가능하다. 예를 들어, [Boder 등 (2000) Proc . Nat 'l Acad . Sci . USA 97:10701-10705] 를 참조한다.

특정 구현예에서, 마우스 ANGPTL4 에 대해 키워진 단일클론 항체를 본원에 기술된 것과 같은 일부 일반적인 검출 방법을 사용하여 인간 ANGPTL4 에의 특이적인 결합에 대해 스크리닝한다. 단일클론 항체가 마우스 및 인간 ANGPTL4 둘 다에 결합하는 능력 (즉, "교차 반응성" 을 말함) 은 마우스 및 인간 ANGPTL4 에 동일한 에피토프가 존재한다는 것을 가리킨다. 변성 조건을 사용하는 검출 방법 (예를 들어, 웨스턴 블롯) 의 특정 구현예에서, 교차-반응성은, 마우스 단일클론 항체가 마우스 및 인간 ANGPTL4 에 동일한 "선형" 에피토프에 결합한다는 것을 가리킨다. 비-변성 조건을 사용하는 검출 방법의 특정 구현예에서, 교차-반응성은, 마우스 단일클론 항체가 마우스 및 인간 ANGPTL4 에서 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 에피토프 또는 구조적 에피토프) 에 결합한다는 것을 가리킨다.

2. 특정 에피토프 맵핑 방법

다양한 구현예에서, 단일클론 항체가 결합하는 에피토프는 수많은 어세이 중 임의의 것에 의해 동정된다. 일부 실례의 어세이는, 예를 들어, [Morris, 방법 in 분자 Biology Vol .66: 에피토프 맵핑 Protocols (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)] 에 기술되어 있다. 예를 들어, 유전자 절편 발현 어세이 또는 펩티드-기재 어세이에 의해 에피토프 맵핑을 할 수 있다. 유전자 절편 발현 어세이의 특정 구현예에서, 예를 들어, ANGPTL4 의 절편을 암호화하는 핵산을 원핵 세포에서 발현시키고, 단리한다. 일부 그러한 구현예에서, 단일클론 항체의 상기 절편에의 결합 능력을 예를 들어, 면역침전 또는 면역블로팅에 의해 평가한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 의 절편을 암호화하는 핵산을 전사시키고, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관 내에서 번역시킨다. 다음, ANGPTL4 의 방사성으로 표지된 절편을 단일클론 항체에의 결합에 대해 시험한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 의 절편을 단백용해성 절편화에 의해 제조한다. 특정 구현예에서, 에피토프를 파지 또는 효모의 표면상에 나타내어진 랜덤 펩티드 라이브러리를 사용하여 동정한다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체에의 결합에 대해 ANGPTL4 의 오버랩핑 합성 펩티드 절편의 라이브러리를 시험함으로, 에피토프를 동정한다. 특정 구현예에서, 하기 기술된 바와 같이, 경합 어세이를 사용하여 에피토프를 동정한다.

3. 특정 경합 어세이

특정 구현예에서, ANGPTL4 의 동일한 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 관심있는 단일클론 항체로서 동정한다. 특정 구현예에서, 상기 단일클론 항체를 예를 들어 상기 기술된 바와 같이, 에피토프 맵핑에 의해 동정한다. 특정 구현예에서, 상기 단일클론 항체를 일반적인 경합 어세이에 의해 동정한다. 예를 들어, [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 를 참조한다. 비제한적 실례의 경합 어세이에서, ANGPTL4 또는 그의 절편을 멀티웰 플레이트의 웰에 고정시킨다. 일부 그러한 구현예에서, 관심의 단일클론 항체를 표준 방법에 의해 형광 표지 (특정 구현예에서, 형과 이소티오시아네이트) 로 표지한다. 일부 그러한 구현예에서, 관심있는 표지 단일클론 항체 및 비표지 테스트 단일클론 항체의 혼합물을 웰에 첨가하였다. 일부 그러한 구현예에서, 각 웰의 형광을 정량화하여, 비표지 테스트 단일클론 항체가 관심있는 표지 단일클론 항체의 결합을 막는 정도를 측정하였다. 특정 구현예에서, 단일클론 항체는, 각각이 다른 항체의 결합을 50% 이상으로 막는다면, 에피토프를 공유하는 것으로 생각된다. 실례의 경합 어세이가 또한, 예를 들어, [Morris, 방법 in 분자 Biology Vol .66: 에피토프 맵핑 Protocols (1996) (인간a Press, Totowa, NJ)] 에 기술되어 있다. 비제한적 실례의 경합 어세이는 하기 Part VI.O 에서 제공된다.

4. 중화 항체를 동정하기 위한 특정 어세이

특정 구현예에서, 단일클론 항체를, 중화 항체, 즉, 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 ANGPTL4 의 활성을 감소시키는 것들에 대해 스크리닝한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 의 활성은 ANGPTL4 의 LPL 억제 능력이다. 따라서, 특정 구현예에서, 중화 항체는, ANGPTL4 의 존재 하에 LPL 활성을 증가시키는 능력에 의해 동정된다. 일부 그러한 구현예에서, 중화 항체는 LPL 활성을 대조군 항체에 대해, 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상 증가시킨다. 생체 내에서 및 시험관 내에서의 LPL 활성의 측정을 위한 일부 실례의 어세이는 각각 하기 Part VI.D. 및 VI.I 에서 제공된다.

특정 구현예에서, 생체 내에서 ANGPTL4 의 활성을 감소시키는 중화 항체는, 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 감소시키는 능력에 의해 동정된다. 일부 실례의 혈청 지질에는, 트리글리세리드, 콜레스테롤, 및 자유 지방산이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 그러한 구현예에서, 중화 항체는 LPL 활성을 대조군 항체에 대해, 하나 이상의 혈청 지질의 수준을 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상 증가시킨다. 특정 구현예에서, 생체 내에서 ANGPTL4 의 활성을 감소시키는 중화 항체를 지방-함유 식이의 특정 효과로부터 반작용하거나 또는 그로부터의 보호를 부여하는 능력에 의해 동정된다. 일부 실례의 효과에는, 체중 증가, 비만, 포도당 과민증 (고혈당증), 인슐린 둔감증 (고인슐린혈증), 간 지방증 (지방간), 및 근육세포내 지질 축적이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 효과를 측정하는 특정 실례의 어세이는 하기 Part VI.C., V즉, 및 VI.F 에서 제공된다.

G. 중화 단일클론 항체를 사용하는 특정 약학적 조성물 및 치료 방법

특정 구현예에서, 중화 항체를 치료적 항체로서 사용할 수 있다. 치료적 항체로서 사용되는 일부 실례의 중화 항체에는, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 치료제로서 일부 항체를 사용하는 것에 친숙하다. 예를 들어, 12 가지 초과의 항체가 1980 년대 중반부터 치료제로서의 용도에 대해 FDA 승인을 받아 왔다. 예를 들어, [Hudson 등 (2003) Nature Med . 9:129-134; Gura (2002) Nature 417:584-586; Brekke 등 (2002) Nature Reviews 2:52-62] 를 참조한다. 일부 FDA-승인 항체는 다양한 암, 염증, 및 바이러스 감염을 치료하고, 이식 거부반응을 예방하는데 사용되는 것들을 포함한다. 예를 들어, [Gura (2002) Nature 417:584-586; Brekke 등 (2002) Nature Reviews 2:52-62] 를 참조한다. 더욱이, 12 개 초과의 항체는 현재 임상 시도중이다. 예를 들어, [Brekke 등 (2002) Nature Reviews 2:52-62] 를 참조한다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 유효량의 중화 항체를 투여하는 것을 포함하는 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 유효량의 중화 항체를 투여하는 것을 포함하는 급성 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 유효량의 중화 항체를 투여하는 것을 포함하는 만성 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다.

본원에 사용된 바와 같이, "지질 대사 장애" 에는, 2 차 고지혈증 (고중성지방혈증 및 콜레스테롤과잉혈증 포함) 을 유발할 수 있는 장애가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실례의 지질 대사에는, 죽상동맥경화증, 이상지혈증, 고중성지방혈증 (약물-유도 고중성지방혈증, 이뇨-유도 고중성지방혈증, 알콜-유도 고중성지방혈증, β-아드레나교감신경차단제-유도 고중성지방혈증, 에스트로겐-유도 고중성지방혈증, 글루코코르티코이드-유도 고중성지방혈증, 레티노이드-유도 고중성지방혈증, 시메티딘-유도 고중성지방혈증, 및 가족성 고중성지방혈증 포함), 고중성지방혈증 관련 급성 췌장염, 유미입자 증후군, 유미입자증, Apo-E 부족, LPL 부족 또는 저활성, 고지질혈증 (가족성 조합 고지질혈증 포함), 콜레스테롤과잉혈증, 콜레스테롤과잉혈증 관련 통풍, 황색종증 (피하 콜레스테롤 침착), 심장동맥질환 (허혈성 심질환이라고도 함), 심장동맥질환 관련 염증, 재협착, 말초 혈관 질환, 및 뇌졸중이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실례의 지질 대사에는, 비만과 같은 체중 관련 장애, 대사 증후군의 독립적인 성분을 포함한 대사 증후군 (예를 들어, 중심 비만, FBG/전-당뇨병/당뇨병, 콜레스테롤과잉혈증, 고중성지방혈증, 및 고혈압), 갑상선기능저하증, 요독증, 및 체중 증가 (급격한 체중 증가를 포함), 체중 감소, 체중 감소의 유지, 또는 체중 감소 후 체중 재증가의 위험과 관련된 기타 상태가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실례의 지질 대사 장애에는, 당뇨병, 고혈압과 같은 혈당 장애, 및 인슐린 저항과 관련된 다낭성 난소 증후군이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실례의 지질 대사 장애에는, 신장 이식, 신증후군, 커싱 증후군, 말단비대증, 전신성 홍반성 낭창, 이상글로불린혈증, 지방이영양증, 글리코겐증 I 형, 및 애디슨 질환이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

지질 대사 장애에는, 식습관 (과다 알콜 소비, 체중 증가, 및 비만을 포함하나 이에 제한되지 않음), 약물 (외인성 에스트로겐, 타목시펜, 레티노이드, 티아지드, 클로르탈리돈, 베타-클로커, 프로테아제 억제제 (리토나비르를 포함하나 이에 제한되지 않음), 프로포폴 주입, 및 비경구 지질 주입을 포함하나 이에 제한되지 않음), 대사 장애 (당뇨병, 임신, 만성 신부전, 갑상선기능저하증, 가족성 고지질혈증, 및 췌장염을 포함하나 이에 제한되지 않음) 로 인한 HTG 를 포함하나 이에 제한되지 않는, 2 차 고트리글리세롤혈증 (HTG, 유형 I, V, 및 IV 를 포함하나 이에 제한되지 않음) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

지질 대사 장애에는, 혈관통로 기능부전 관련 지질 장애, 증식 질환 관련 지질 장애, 신생물형성증 (전립선암, 신장암, 간암, 유방암, 난소암, 폐암 및 췌장암을 포함하나 이에 제한되지 않음), 염증에 반응하여 발생하는 장애, 예를 들어, 감염 질환, 상처 치료, 면역결핍 증후군 (AIDS 및 비정상 발달과 관련된 증후군을 포함하나 이에 제한되지 않는 증후군), 반흔 형성, 죽상동맥경화증, 재협착 및 이식 거부반응, 자가면역 장애, 및 만성 염증 질환 및 장애, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 및 크론 질환, 대장염, 염증성 장질환, 반응성 관절염, 라임 질환 (Lyme disease), 인슐린 의존성 당뇨병, 기관 특이적 자가면역질환, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선종 및 그레이브스병, 스요그렌 질환, 접촉 피부염, 건선, 공피증, 숙주편대질환, 사코이드종, 말라리아, 패혈증, 췌장염, 아토피 증상 (천식 및 알레르기 (알레르기성 비염, 음식 알레르기 (음식 알레르기를 포함하나 이에 제한되지 않음) 를 포함하나 이에 제한되지 않음) 를 포함하나 이에 제한되지 않음), 호산구 증가증, 결막염 및 사구체 신염, 혈관 응고 장애, 내독소 쇼크 및 기타 염증 매개 장애 (예컨대 수면무호흡증 및 졸리움) 가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, 유효량의, ANGPTL4 에 대한 항체 및 또다른 치료제를 투여하는 것을 포함하는 지질 대사 장애 치료 방법이 제공된다. 일부 그러한 구현예에서, 추가의 치료제는 유효량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 ANGPTL4 에 대한 또다른 항체이다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 비-항체 제제이다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 하나 이상의 혈청 지질 수준을 저하시키는 제제이다. 일부 실례의 추가의 치료제에는, HMG-CoA 환원효소 억제제 (예를 들어, 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 및 프루바스타틴) 와 같은 콜레스테롤 합성 억제제 (스타틴) ; 콜레스티라민 및 기타 수지와 같은 담즙 격리제 ; 니아신과 같은 VLDL 분비 억제제 ; 피브린산 유도체와 같은 지질단백질 리파아제 자극원 ; 프로부콜과 같은 친지성 항산화제 ; 아실-CoA 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 억제제 ; 파네소이드 X 수용체 안타고니스트 ; 스테롤 조절 결합 단백질 절단 활성화 단백질 (SCAP) 활성화제 ; 미소체 트리글리세리드 이전 단백질 (MTP) 억제제 ; 및 ApoE-관련 펩티드가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 고밀도 지질단백질 (HDL) 을 증가시키는 제제이다. 상기 제제의 비제한적 예에는, 콜레스테릴 에스테르 이전 단백질 (CETP) 억제제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, 유효량의, ANGPTL4 에 대한 항체 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 용해제, 에멀젼화제, 방부제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량의, ANGPTL4 에 대한 항체 및 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 용해제, 에멀젼화제, 방부제 및/또는 보조제와 함께 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 상기 기술된 것들로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물용 제형 물질은 적용되는 투여량 및 농도에서 수령인에게 비독성이다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투성, 점도, 투명성, 색상, 등장성, 향, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡수 또는 침투를 변경, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함한다. 특정 구현예에서, 적합한 제형 물질에는, 아미노산 (예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 리신) ; 항균제 ; 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 나트륨 술피트 및 나트륨 히드로겐-술피트) ; 완충제 (예를 들어, 보레이트, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 및 기타 유기산) ; 벌크화제 (예를 들어, 만니톨 및 글리신) ; 킬레이트제 (예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)) ; 복합화제 (예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 및 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린) ; 충진제 ; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 기타 탄수화물 (예를 들어, 포도당, 만노스 및 덱스트린) ; 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린) ; 착색제, 풍미제, 및 희석제 ; 에멀젼화제 ; 친수성 중합체 (예를 들어, 폴리비닐피롤리돈) ; 저분자량 폴리펩티드 ; 염-형성 반대이온 (예를 들어, 나트륨) ; 방부제 (예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로사르 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 및 히드로겐 퍼록시드) ; 용매 (예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜) ; 당 알콜 (예를 들어, 만니톨 및 소르비톨) ; 현탁제 ; 계면활성제 또는 습윤제 (예를 들어, 플루로닉스, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80), 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 및 틸록사팔) ; 안정성 향상제 (예를 들어, 수크로스 및 소르비톨) ; 장력 향상제 (예를 들어, 알칼리 금속 할라이드 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 클로라이드), 만니톨, 및 소르비톨) ; 전달 비히클 ; 희석제 ; 부형제 ; 및 약학적 보조제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990).

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체 또는 기타 치료적 분자를 반감기 연장 비히클에 연결한다. 일부 실례의 반감기 연장 비히클은 당업계에 공지되어 있다. 일부 상기 비히클에는, Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜, 및 덱스트란이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 상기 비히클은 예를 들어, PCT 출원 번호 WO 99/25044 에서 공개되어 있다.

특정 구현예에서, 최적의 약학적 조성물은 예를 들어, 원하는 투여 경로, 전달 형식 및 원하는 투여량에 따라, 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 상기 Remington's 약학적 Sciences 를 참조한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 중화 항체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 또는 생체 내 소멸 속도에 영향을 줄 수 있다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물 내의 1 차 비히클 또는 담체는 본래 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에서 흔한 기타 물질로 보충되는, 주사용수, 생리 식염수, 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 일부 실례의 비히클에는, 중성 완충 식염수 및 혈청 알부민이 혼합된 식염수가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 약 pH 7.0 - 8.5 의 트리스 완충액, 약 pH 4.0 - 5.5 의 아세테이트 완충액을 포함하는데, 이는 추가로 소르비톨 또는 그에 대한 적합한 대체물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이, ANGPTL4 에 대한 항체를 포함하는 조성물을 동결건조된 형태 또는 수성 용액의 형태로, 원하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 최적의 제제와 혼합함으로써 저장용으로 제조할 수 있다 (상기 Remington's Pharmaceutical Sciences, supra). 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체를 포함하는 조성물을 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형할 수 있다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 흡입 또는 경구와 같은 소화관을 통한 전달을 위해 선택된다. 약학적으로 허용가능한 조성물의 일부 실례의 제조 기술은 당업계에 속해 있다.

특정 구현예에서, 제형 성분은 투여 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 완충제는 조성물을 생리학적 pH 에서 또는 조금 더 낮은 pH 에서, 전형적으로 약 5 내지 약 8 의 pH 범위 내에서 유지하는데 사용된다.

특정 구현예에서, 비경구 투여가 고려되는 경우, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 비히클 내에서 ANGPTL4 에 대한 목적하는 항체를 추가의 치료제와 함께 또는 없이 포함하는, 발열물질-없는, 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태로 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 비경구 주입용 비히클은 ANGPTL4 에 대한 항체가 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이, 적절하게 보존된 멸균, 등장성 용액으로서 제형되는 멸균 수용액이다. 특정 구현예에서, 상기 제제는 주사가능한 미세구, 생-섭취가능한 입자, 중합체성 화합물 (예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 제제 (디폿 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 조절된 또는 서방성 방출을 위해 제공될 수 있음) 와 함께 목적하는 분자의 제형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 히알루론산이 또한 사용될 수 있고, 순환 시 기간을 지연시키는 것을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 이식가능한 약물 전달 장치를 목적하는 분자를 도입하는데 사용할 수 있다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물을 흡입용으로 제형될 수 있다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이, 흡입용 건성 분말로서 제형할 수 있다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이 포함하는 흡입액을 아에로졸 전달용 프로펠런트와 함께 제형할 수 있다. 특정 구현예에서, 용액을 분무시킬 수 있다.

특정 구현예에서, 제제를 경구로 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체를, 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이, 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여량 형태의 조제에 통상 사용되는 담체와 함께 또는 없이 제형할 수 있다. 특정 구현예에서, 생물이용가능성을 최대화하고, 예비-전신성 분해를 최소화하는 경우, 위장관 내 지점에서 제제의 활성 부분을 방출시키도록 고안할 수 있다. 특정 구현예에서, 임의의 추가의 치료제와 함께 또는 없이 ANGPTL4 에 대한 항체의 흡수를 유용하게 하기 위해 하나 이상의 추가의 제제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 희석제, 풍미제, 저용융점 왁스, 식물유, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕괴제 및/또는 결합제를 또한 적용할 수 있다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 유효량의, ANGPTL4 에 대한 항체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이, 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물 내에 포함한다. 특정 구현예에서, 멸균수 내에서 정제, 또는 또다른 적절한 비히클을 용해시킴으로써, 용액을 단위-투여 형태로 제조할 수 있다. 일부 실례의 부형제에는, 불활성 희석제 (예를 들어, 칼슘 탄산염, 나트륨 탄산염, 나트륨 중탄산염, 락토스, 및 칼슘 포스페이트) ; 결합제 (예를 들어, 전분, 젤라틴, 및 아카시아) ; 및 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 및 탈크) 가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

서방성- 또는 조절성-전달 제제 내에서 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이 ANGPTL4 에 대한 항체를 포함하는 제제를 포함하여, 추가의 약학적 조성물은 당업자에게 분명히 알려질 것이다. 일부 실례의 서방성- 또는 조절성-전달 제제에는, 리포좀 담체, 생-섭취가능한 미세입자, 다공성 비드, 및 디폿 주사액이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실례의, 일부 제제의 제조 기술은 당업자에게 알려져 있다. 특정 구현예에서, 서방성 제제는 필름 또는 미세캡슐과 같은 형태를 지닌 물품의 형태 내에 반투과성 중합체 매트리스를 포함할 수 있다. 일부 실례의 서방성 매트리스에는, 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드 (예를 들어, 미국 특허 제 3,773,919 호 및 제 EP 058,481 호 참조), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (예를 들어, [Sidman 등 (1983) Bio 중합체s 22:547-556] 참조), 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (예를 들어, [Langer 등 (1981) J. Biomed . Mater . Res . 15:167-277] 및 [Langer (1982) Chem . Tech. 12:98-105] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트 (상기 Langer 등 참조), 및 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988) 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 서방성 조성물은 리포좀을 포함할 수 있고, 특정 구현예에서 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, [Eppstein 등 (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82:3688-3692 ; EP 036,676 ; EP 088,046 ; 및 EP 143,949] 를 참조한다.

특정 구현예에서, 전형적으로 생체 내로 투여되기 위한 약학적 조성물은 멸균된다. 특정 구현예에서, 멸균은 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물이 동결건조되는 경우, 상기 방법을 이용한 멸균을 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행할 수 있다. 특정 구현예에서, 비경구 투여용 조성물을 동결건조 형태 또는 용액 내에서 저장할 수 있다. 특정 구현예에서, 비경구 조성물을 일반적으로 멸균 수행 포트, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 구멍이 뚫어질 수 있는 스토퍼 (stopper) 를 가진 정맥 내 용액 백 또는 바이알을 가진 용기에 넣는다.

특정 구현예에서, 일단 약학적 조성물을 제형하면, 그것을 용액, 현탁액, 젤, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 멸균 바이알 내에 저장할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제제를 즉시-사용 형태 또는 투여 전에 재구성되는 형태 (예를 들어, 동결건조된 형태) 로 저장할 수 있다.

특정 구현예에서, 단일-투여량 투여 단위를 하기 위한 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 키트는 각각 건조된 단백질을 가진 제 1 용기 및 수성 제제를 가진 제 2 용기 둘 다를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 또는 복합-챔버 충전-전 주사기 (예를 들어, 액체 주사기 및 동결건조주사기) 를 함유하는 키트가 포함된다.

특정 구현예에서, 치료적으로 적용되는 ANGPTL4 에 대한 항체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이 포함하는 유효량의 약학적 조성물은, 예를 들어 치료의 내용 및 목적에 따라 다를 것이다. 당업자는 일부 구현예에 따라서 적절한 투여 수준이 부분적으로는 전달되는 분자, ANGPTL4 에 대한 항체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이 사용되는 처방, 투여 경로, 및 환자의 크기 (체중, 체표면 또는 기관 크기) 및/또는 상태 (연령 및 일반적인 건강상태) 에 따라 다를 것임을 알 것이다. 특정 구현예에서, 임상의는 최적의 치료 효과를 수득하기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 특정 구현예에서, 통상적인 투여량은 상기 언급된 요소에 따라, 약 0.1 ㎍/kg (환자 체중) 의 범위일 수 있고, 약 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg ; 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg ; 또는 5 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 의 범위 (전술한 종점 중 어느 것 사이의 모든 점 (분획을 포함) 을 포함함) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 약 10 mg/kg (체중) 내지 약 60 mg/kg (체중) 이다. 특정 구현예에서, 투여량은 약 10 mg/kg (체중), 약 20 mg/kg (체중), 약 30 mg/kg (체중), 약 40 mg/kg (체중), 약 50 mg/kg (체중), 또는 약 60 mg/kg (체중) 이다.

특정 구현예에서, 적합한 투여량은 하기, 예를 들어, Parts VI.P, R, 및 T 내지 Y 에서 제공된 것과 같이 동물 연구를 바탕으로 결정될 수 있다.

특정 구현예에서, 투여 빈도는 ANGPTL4 에 대한 항체 및, 이용가능하다면, 사용되는 제제 내의 임의의 추가의 치료제의 약동학적 변수를 고려할 것이다. 특정 구현예에서, 임상의는 투여량이 원하는 효과를 달성할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 특정 구현예에서, 따라서, 상기 조성물은 단일 투여량으로서, 또는 시간의 경과에 따라 2 번 이상의 투여량 (동일한 양의 목적 분자를 함유할 수 있거나 또는 함유할 수 없음) 으로서 투여될 수 있거나, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 적절한 투여량의 추가의 정련은 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무의 범위 내에 속한다. 특정 구현예에서, 적절한 투여량은 적절한 투여-반응 데이타를 사용하여 확인될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 ANGPTL4 에 대한 항체를 포함하는 약학적 조성물의 1 회 투여량을 투여받는다. 특정 구현예에서, 환자는 ANGPTL4 에 대한 항체를 포함하는 약학적 조성물을 일일 당 1, 2, 3, 또는 4 회 투여량을 투여받는다. 특정 구현예에서, 환자는 ANGPTL4 에 대한 항체를 포함하는 약학적 조성물을 주 당 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 회 투여량을 투여받는다. 특정 구현예에서, 환자는 ANGPTL4 에 대한 항체를 포함하는 약학적 조성물을 월 당 1 또는 2 회 투여량을 투여받는다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물의 투여 경로는 경구, 정맥 내 주사, 복강내, 뇌내 (뇌실질내), 측뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문정맥내, 또는 병변내 경로 ; 서방성계 또는 이식 장치에 의한 것과 같은 공지된 방법에 따른다. 특정 구현예에서, 조성물은 일시 주사 또는 주입에 의해 연속적으로, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 조성물은 원하는 분자가 흡수 또는 캡슐화된 막, 스폰지 또는 또다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 이식 장치가 사용되면, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관에 이식될 수 있고, 원하는 분자의 전달이 확산, 시간-방출형 볼루스, 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.

특정 구현예에서, 생체 외 방식으로, ANGPTL4 에 대한 항체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이 포함하는 약학적 조성물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 상기 경우에서, 이어서 세포, 조직 및/또는 기관을 환자에게 다시 이식한 후에, 환자로부터 제거한 세포, 조직 및/또는 기관을 ANGPTL4 에 대한 항체를 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 또는 없이 포함하는 약학적 조성물을 사용한다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제가 있거나 또는 없는 ANGPTL4 에 대한 항체는, 본원에서 기술된 방법과 같은 방법을 사용하여 폴리펩티드를 발현 및 분비하도록 유전자 조작된 일부 세포에 이식함으로써 전달된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 동종, 이종, 또는 제노지네틱일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 불사멸화될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 반응의 기회를 감소시키기 위해, 세포를 캡슐화시켜서 주변 조직의 침투를 피할 수 있게 한다. 특정 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로 단백질 생성물(들) 의 방출은 허용하나 환자의 면역계 또는 주변 조직의 기타 유해 인자에 의한 세포의 파괴를 방지하는, 생물호환성, 반-침투 중합체성 폐쇄물 또는 막이다.

H. 특정 검출 및 진단 방법

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 ANGPTL4 의 존재를 검출하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 생체 내 ANGPTL4 의 수준은 지질 대사 장애와 같은 의학적 상태와 연관있으며, 그로 인해 의학적 상태의 진단을 가능하게 한다. ANGPTL4 에 대한 항체에 의해 진단될 수 있는 일부 실례의 의학적 조건은 상기에 나타나 있다.

일부 실례의 검출 방법이 알려져 있으면, ELISA, 방사면역어세이, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 면역형광, 및 면역침전이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 개질되어, 항체를 표지에 연결시킴으로써, 그것들이 직접 검출될 수 있다. 일부 실례의 표지에는, 형광물질, 염색단, 방사성 원자, 전자-밀집 시약, 효소 및 리간드가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체는 항체의 부류에 결합하는 표지된 "2 차" 항체 (예를 들어, 염소 항-마우스 항체) 를 사용하여 검출된다.

I. 특정 ANGPTL4 안타고니스트 및 아고니스트 스크리닝 방법

특정 구현예에서, ANGPTL4 에 결합하는 제제의 스크리닝 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 스크리닝 방법은 ANGPTL4 를 적합한 조건 하에서 하나 이상의 후보 제제에 노출시키고, ANGPTL4 의 하나 이상의 후보 시약에의 결합을 평가하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 스크리닝 방법은 경합 결합 어세이에서 ANGPTL4 에 대한 항체를 사용하는 것을 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, ANGPTL4 에 대한 항체 및 ANGPTL4 를 포함하는 제 1 결합 혼합물을 사용한다. 제 1 결합 혼합물 (M₀) 내 ANGPTL4 및 항체 사이의 결합량을 측정한다. 항체, ANGPTL4, 및 스크리닝되는 제제를 포함하는 제 2 결합 혼합물을 또한 사용한다. 제 2 결합 혼합물 (M₁) 내 ANGPTL4 및 항체 사이의 결합을 측정한다. M₁/M₀ 비율을 계산함으로써, 제 1 결합 혼합물 내에서의 결합량을 제 2 결합 혼합물 내에서의 결합량과 비교한다. 제 2 결합 혼합물 내에서의 항체의 ANGPTL4 에의 결합량이 제 1 혼합물 내에서의 항체의 ANGPTL4 에의 결합량보다 더 적다면, 제제가 ANGPTL4 에 결합할 수 있는 것으로 간주한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 에 결합하는 제제는, 항체의 ANGPTL4 에의 결합을 약 10% (즉, M₁/M₀<0.9) 이상, 약 30% (즉, M₁/M₀<0.7) 이상, 약 50% (즉, M₁/M₀<0.5) 이상, 약 70% (즉, M₁/M₀<0.3) 이상, 약 80% (즉, M₁/M₀<0.2) 이상, 약 90% (즉, M₁/M₀<0.1) 이상, 또는 약 95% (즉, M₁/M₀<0.05) 이상 감소시킨다.

특정 구현예에서, 상기 기술된 임의의 스크리닝 방법에서 사용되는 ANGPTL4 는 ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인 또는 그의 절편이다. ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인 내에서 결합하는 일부 항체는 중화 활성 (하기 Part VI.L. 및 VI.P. 를 참조) 을 가진다는 출원인의 관찰을 바탕으로, ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인의 결합으로서 스크리닝 방법에 의해 규명되는 제제 (예를 들어, 항체 또는 비-항체 제제) 는 ANGPTL4 활성의 후보 안타고니스트이다. 특정 구현예에서, 안타고니스트 활성은 후보 안타고니스트가 Part VI.D. 및 VI.I 에서 기술된 바와 같은 생체 내 또는 시험관 내 어세이에서 ANGPTL4 을 중화시킨다는 것을 언급함으로써 증명된다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 의 안타고니스트는 지질 대사 장애의 치료에 사용된다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 의 피브리노겐 도메인에 결합하느 제제의 스크리닝 방법이 제공된다. ANGPTL4 의 피브리노겐 도메인 내에서 결합하는 항체 (6G11) 가 ANGPTL4 활성 (Part VI.L., VI.P 참조) 을 증진시킨다는 출원인의 관찰을 바탕으로, 제제 (예를 들어, 항체 또는 비-항체 제제) 는 ANGPTL4 의 피브리노겐 도메인에의 결합으로서 스크리닝 방법에 의해 규명되는 ANGPTL4 활성의 후보 아고니스트이다. 특정 구현예에서, 아고니스트 활성은, 후보 아고니스트가 Part VI.I. 에서 기술된 어세이와 같은 시험관 내 어세이에서 ANGPTL4 를 증진시킨다는 것을 언급함으로써, 또는 후보 아고니스트를 생체 내에 투여하고 하나 이상의 혈청 지질의 증가된 수준을 시험함으로써 증명된다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 의 아고니스트는 낭성 섬유증, 및 AIDS 와 같은 질환과 관련된 신경성 거식증, 신경성 대식증 및 악액질 (체력약화) 과 같은 과도한 체중 감소와 관련된 일부 장애의 치료에 사용된다.

ANGPTL4 에의 결합에 대해 스크리닝될 수 있는 일부 실례의 제제에는, 항체, 소분자 (예를 들어, 유기 화합물, 유기금속 화합물, 유기 및 유기금속 화합물의 염, 사카라이드, 아미노산, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드), 앱타머, 펩티드, 및 변형 펩티드가 포함되나, 이에 제하되지는 않는다. 수용성 펩티드를 포함하는 일부 실례의 펩티드에는 랜덤 펩티드 라이브러리의 원 (member) (예를 들어, [Lam 등 (1991) Nature 354:82-84] ; [Houghten 등 (1991) Nature 354:84-86] 참조) 및 D- 및/또는 L-구조 아미노산으로 이루어진 조합 화학-유도 분자 라이브러리의 원이 포함되나 이에 제한되지 않는 수용성 펩티드 ; 직접 인펩티드 라이브러리를 무작위로 또는 부분적으로 발생시키는 원이 포함되나 이에 제한되지 않는 인펩티드 (예를 들어, [Songyang (1993) Cell 72:767-778] 참조) 가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, 컴퓨터 모델링 및 연구 기술은 ANGPTL4 에 결합하는 화합물의 동정, 또는 이미 동정된 화합물의 향상을 가능하게 한다. 일부 실례의 분자 모델링에는 CHARMM 및 QUANTA 프로그램 (Polygen Corporation, Waltham, MA) 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. CHARMM 은 에너지 최소화 및 분자 동역학 기능을 수행한다. QUANTA 는 분자 구조의 구성, 그래픽 모델링 및 분석을 수행한다. QUANTA 는 분자 서로의 상호작용 구성, 개질, 시각화, 및 거동 분석을 수행한다.

J. ANGPTL4 의 핵산 안타고니스트

특정 구현예에서, ANGPTL4 를 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 단리된 핵산이 제공된다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 를 암호화하는 핵산은 마우스 ANGPTL4 를 암호화한다. 특정 구현예에서, 핵의 암호화하는 ANGPTL4 는 인간 ANGPTL4 를 암호화한다. 특정 구현예에서, 단리된 핵산은 안티센스 핵산이다. 일부 그러한 구현예에서, 안티센스 핵산 RNaseH-기재 기작에 의해 표적 mRNA 의 분해를 촉진하는 단일 가닥 DNA 분자이다. 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 길이가 약 8-30 (종점 사이의 모든 점을 포함) 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 길이가 약 18 - 26 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다.

특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 RNA 간섭 (RNAi)-기재 기작에 의해 표적 핵산의 발현을 감소시키는 RNA 분자를 포함한다. RNAi 에 적합한 일부 실례의 RNA 분자에는, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (mRNA), 작은 비-코딩 RNA (tncRNA), 및 작은 조절 RNA (smRNA) 가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실례의 RNAi 기작 및 RNAi 의 사용을 위한 RNA 분자에 대한 리뷰를 위해서는, 예를 들어, [Novina 등 (2004) Nature 430:161-164] 를 참조한다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 를 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 siRNA 가 제공된다. 특정 구현예에서, siRNA 는 길이가 약 18 - 26 (종점 사이의 모든 점을 포함) 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, siRNA 는 길이가 약 20 - 24 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드, 또는 siRNA 는 길이가 약 21 - 23 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, siRNA 는 이중-가닥 RNA 이다. 특정 구현예에서, siRNA 는 siRNA 의 안티센스 가닥에 상보적인 표적 mRNA 분자 의 분해를 유도할 것이다. 예를 들어, [Novina 등 (2004) Nature 430:161-164] 를 참조한다.

안티센스 DNA 분자 또는 siRNA 와 같은 안티센스 핵산의 활성은 종종 표적 mRNA 의 2 차 구조에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, [Vickers 등 (2003) J. Biol. Chem . 278:7108-7118] 를 참조한다. 따라서, 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 염기쌍에 이용가능한 표적 mRNA 의 영역에 상보적이게 선택된다. 특정 구현예에서, 표적 mRNA 의 적합한 영역은 예를 들어, 많은 안티센스 올리고뉴클레오티드의, 표적 mRNA 를 따라 다양한 영역에 혼성화되는 능력 및/또는 표적 mRNA 발현을 감소시키는 능력을 경험상으로 시험함으로써, "유전자 워크 (walk)" 를 수행함으로써 동정된다. 예를 들어, [Vickers 등 (2003) J. Biol . Chem . 278:7108-7118; Hill 등 (1999) Am . J. Respir . Cell Mol . Biol . 21:728-737] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 표적 mRNA 에 적합한 영역은 표적 mRNA 의 임의의 기타 영역에 혼성화하지 않는 표적 mRNA 의 영역을 동정하는 2 차 구조 예고 프로그램 또는 관련 알고리즘을 사용하여 동정된다. 예를 들어, [Hill 등 (1999) Am . J. Respir . Cell Mol . Biol . 21:728-737] 를 참조한다. 특정 구현예에서, 상기 방법 둘 다의 조합을 사용하여, 표적 mRNA 의 적합한 영역을 동정한다. 예를 들어, [Hill 등 (1999) Am . J. Respir . Cell Mol . Biol . 21:728-737] 를 참조한다.

특정 구현예에서, ANGPTL4 를 암호화하는 핵산의 발현을 감소시킴으로써 ANGPTL4 활성을 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포 내 ANGPTL4 를 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 ANGPTL4 를 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 안티센스 핵산을 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 를 암호화하는 핵산은 인간 ANGPTL4 를 암호화한다. 특정 구현예에서, ANGPTL4 를 암호화하는 핵산은 마우스 ANGPTL4 를 암호화한다.

특정 구현예에서, 상기 (Part V.G.) 기술된 것과 같은 지질 대사 장애의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 유효량의, ANGPTL4 를 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키는 안티센스 핵산을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 ANGPTL4 를 암호화하는 핵산을 발현하는 기관에 전달된다. 일부 연구는, ANGPTL4 가 간, 뇌하수체, 및 지방 조직에서 단식 상태 하에 유도된다는 것을 보여준다. [Ge 등 (2004) J. Lipid Res . 45:2071-2079] 을 참조한다. 따라서, 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 간, 뇌하수체, 또는 지방 조직에 전달된다. 안티센스 핵산의 생체 내 투여, 및 간과 같은 특정 기관에의 서방성 전달을 포함하여 안티센스 핵산의 생체 내 서방성 전달에 대한 일부 실례의 지침이 예를 들어, [Khan 등 (2004) J. Drug Targeting 12:393-404] 에서 제공된다. 특정 구현예에서, 서방성 전달은 생분해가능한 중합체에 의해 캡슐화되거나 또는 그렇지 않다면 함유된 안티센스 핵산을 투여함으로써 수행된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 폴리(글리콜산) (PLGA) 미세구 (예를 들어, 0.5-20 ㎛ ; 3000 MW) 내에 함유된다. 특정 구현예에서, 안티센스 핵산은 친지성 부분에 공액된다. [Khan 등 (2004) J. Drug Targeting 12:393-404] 를 참조한다.

II . 실시예

A. 마우스 케어 및 식이 연구

마우스 연구를 연방 지침에 따라 수행하였다. 마우스를 24℃, 고정된 12 시간 광/12 시간 암 순환에서 키우고, 하기 지시된 바와 같이 물 및 설치류 먹이 (지방 22% 칼로리) (제품 번호 5001; Purina, St. Louis, MO) 또는 고지방 식이 (지방 60% 칼로리) (제품 번호 D12492; Research Diets, New Brunswick, NJ.) 를 임의로 먹게 하였다. HFD 로 사육된 마우스는 4 - 5 주령 식이를 받았다. 하기에 언급된 "단식 상태" 에 놓인 마우스는 16 시간 동안 먹이를 먹지 못하였다.

B. 생체 내에서 ANGPTL4 의 과발현 유도 고지혈증

1. 마우스 ANGPTL4 의 과발현

전장 마우스 ANGPTL4 (SEQ ID NO:1) 를 암호화하는 cDNA 를 아데노바이러스 벡터 pFAD 의 Ad E1-소실 영역에 삽입하고, 그로 인해 cDNA 를 사이토메갈로바이러스 프로모터의 조절 하에 두었다. [Hitt 등, "Construction and propagation of Human Adenovirus Vetcors, in Cell Biology : A Laboratory Handbook Vol. 1, pp. 500-512 (J.E. Celis, ed., 2^nd ed. 1998)] 를 참조한다. 생성 구축물인 Ad5-mAngptl-4T 를 CHO 세포를 감염시키는데 사용하였다. 대조군으로서, β-갈락토시다제를 암호화하는 cDNA 를 아데노바이러스 벡터 pFAD 의 Ad E1-소실 영역에 삽입하고, 그로 인해 cDNA 를 사이토메갈로바이러스 프로모터의 조절 하에 두었다. 생성 구축물인 Ad5-β-갈을 또한 CHO 세포를 감염시키는데 사용하였다. 마우스 ANGPTL4 cDNA 또는 β-갈락토시다제 cDNA 의 발현을 감염된 CHO 세포 추출물의 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.

Ad5-mAngptl-4T 또는 Ad5-β-갈 (gal) 을 꼬리 정맥을 통해 C57BL/6J 마우스에 5 x 10¹⁰ vp 로 주사하였다. 아데노바이러스-감염 마우스의 혈액 샘플을 주사 후 다양한 시점에서 수합하였다. 혈청 내 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준을 Cobas Integra 500 (Roche, Basel, Switzerland) 을 사용하여 측정하였다. 혈청 내 자유 지방산 (FFA) 수준을 NEFA C 키트 (99475409, Wako, Richmond, VA) 를 사용하여 측정하였다.

도 1A, 1B, 및 1C 에서 나타낸 바와 같이, Ad5-mAngptl-4T (채워진 사각형) 주사된 마우스는 Ad5-β-갈로 주사된 대조군 마우스 (빈 사각형) 에 비해 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 및 자유 지방산 (FFA) 의 증가된 단식된 혈청 수준을 보여주었다. 구체적으로, Ad5-mAngptl-4T-주사된 마우스의 트리글리세리드 및 FFA 의 단식된 혈청 수준은 주사 후 2 일 내에 증가하였고, 4 일 후에 피크에 도달하였다 (도 1A 및 1C). 4 일째에, 대조군 마우스에 비해 Ad5-mAngptl-4T 주사된 마우스에서, 트리글리세리드는 약 18 배 증가하였고, FFA 는 약 9 배 증가하였다. 총 콜레스테롤의 단식된 혈청 수준이 또한 대조군 마우스에 비해 Ad5-mAngptl-4 주사된 마우스에서 유의하게 증가하였다 (도 1B). Ad5-mAngptl-4T 또는 Ad5-β -갈로 주사된 지 3 일후의 단식된 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준을 또한 도 2 및 3 에 나타낸다.

2. 인간 ANGPTL4 의 과발현

마우스에 대한 인간 ANGPTL4 의 효과를 측정하기 위해, 인간 ANGPTL4 를 야생형 마우스에서 과발현시켰다. 전장 인간 ANGPTL4 (SEQ ID NO:2) 를 암호화하는 cDNA 를 아데노바이러스 벡터 pFAD 의 Ad E1-소실 영역에 삽입하고, 그로 인해 cDNA 를 사이토메갈로바이러스 프로모터의 조절 하에 두었다. 생성 구축물인 Ad5-hAngptl4T 또는 대조군 구축물인 Ad5-β-갈을 C57BL/6J 마우스의 꼬리 정맥에 5 x 10¹⁰ vp 로 주사하였다. 혈청 내 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준을 주사한 후 4 일째에 측정하였다. 도 4 및 5 에서 나타낸 바와 같이, 인간 ANGPTL4 는 대조군 구축물에 비해 단식된 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준을 유의하게 증가시켰다. 인간 ANGPTL4 는 본 연구에서 마우스의 포도당 수준에 아무런 영향을 주지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 이러한 결과는, 인간 ANGPTL4 가 마우스 ANGPTL4 와 유사하게 마우스 내 단식된 혈청 지질 수준을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

C. Angptl4 녹아웃 마우스는 혈청 지질 수준을 감소시켰음.

ANGPTL4 과발현 시의 혈청 지질 수준에 대해 ANGPTL4 의 결핍이 반대 효과를 가질 것인지를 알아보기 위해 (즉, ANGPTL4 의 결핍이 혈청 지질 수준을 감소시킬 것인지를 알아보기 위해) Angptl4 를 마우스에서 "녹아웃" 시켰다. 마우스에서 Angptl4 를 녹아웃시키기 위해, Angptl4 좌 내로 삽입된 레트로바이러스 벡터와 함께 ES 세포 클론을 C57BL/6-Tyr^{c - Brd} 숙주 배반포에 주사하였다. [Zambrowicz 등 (1998) Nature 392:608-611] 를 참조한다. 키메라 마우스를 발생시키고, C57BL/6-Tyr^{c - Brd} 마우스로 키웠다. 생성 Angptl4^+/- 자손을 이종교배시켜, Angptl4^-/- 마우스를 제조하였다. 바이러스 혼입 및 단일-카피 내인성 유전자를 검출하기 위해 각각 프로브로서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 절편 및 쥣과 Csk 유전자 (MMU05247) 의 엑손 1 을 함유하는 절편을 사용하여, 꼬리 DNA 를 정량적 도트 블롯 (Bio-Rad, Hercules, CA) 에 의해 유전자형검사를 하였다.

녹아웃 마우스는 도 29 에 나타난 바와 같이, 온건하게 감소된 생존성을 가졌다. 더욱이, 일부 새끼 자손은 젖을 떼기 전에 복부 팽만 및 장림프관 확장증을 가진 것으로 밝혀졌다.

또한, 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 녹아웃 마우스는 HFD 로 사육된 야생형 마우스보다 더 낮은 생존율을 가졌다. 도 30 을 참조한다. 죽은 녹아웃 마우스 일부는 복부 팽만을 가진 것으로 밝혀졌고, 일부는 그의 장간막 림프절에서 만성 염증 및/또는 지질-함유 대식세포를 가진 것으로 밝혀졌다. 또한, 일부 마우스는 팽창된 림프구를 가진 것으로 밝혀졌다.

표준 ("쵸우") 식이로 사육된 마우스 내 혈청 지질 수준에 대한 Angptl4 결핍의 효과를 평가하기 위해, 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준을 녹아웃 마우스 및 야생형 마우스의 영양 및 단식 상태에서 시험하였다. 결과를 도 6 에 나타내었다 ("n" 은 사용된 마우스의 수를 가리킴). 단식된 상태의 녹아웃 마우스 ("HOM") 내의 혈청 트리글리세리드 수준은 단식된 상태의 야생형 마우스의 혈청 트리글리세리드 수준보다 70% 더 낮았다 (도 6A). 단식 상태의 녹아웃 마우스 내의 총 혈청 콜레스테롤 수준 및 자유 지방산 (FFA) 수준은 또한 단식 상태의 야생형 마우스 내의 총 혈청 콜레스테롤 수준 및 자유 지방산 (FFA) 수준보다 유의하게 더 낮았다 (도 6B 및 6C).

도 25, 패널 A 는 표준 ("쵸우") 식이로 사육된 수컷 야생형, 이형접합성, 및 녹아웃 마우스의 단식된 혈청 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 고밀도 지질단백질 (HDL), 및 저밀도 지질단백질 (LDL) 수준을 보여준다. 이형접합성 수컷 마우스에 대한 단식된 혈청 트리글리세리드 수준은 그 실험에서 야생형 수컷 마우스에 대한 것보다 41% 더 낮았다. 녹아웃 수컷 마우스에 대한 단식된 혈청 트리글리세리드 수준은 그 실험에서 야생형 수컷 마우스에 대한 것보다 59% 더 낮았다. 이형접합성 및 녹아웃 수컷 마우스에 대한 단식된 총 콜레스테롤 수준은 그 실험에서 야생형 수컷 마우스에 대한 것보다 각각 10% 및 21% 더 낮았다.

도 25, 패널 B 는 표준 ("쵸우") 식이로 키워진 암컷 야생형 및 녹아웃 마우스 내의 단식된 혈청 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 고밀도 지질단백질 (HDL), 및 저밀도 지질단백질 (LDL) 수준을 보여준다. 녹아웃 암컷 마우스에 대한 단식된 혈청 트리글리세리드 수준은 그 실험에서 야생형 암컷 마우스에 대한 것보다 27% 더 낮았다. 녹아웃 암컷 마우스에 대한 단식된 총 콜레스테롤 수준은 그 실험에서 암컷 야생형 수컷 마우스에 대한 것보다 33% 더 낮았다. 암컷 녹아웃 마우스에 대한 단식된 HDL 수준은 그 실험에서 암컷 야생형 마우스에 대한 것보다 31% 더 낮았다.

식이요법-유도 비만 (DIO) 을 가진 녹아웃 및 야생형 마우스의 혈청 지질 수준에 대한 Angptl4 부족의 효과를 또한 검사하였다. 녹아웃 마우스 및 야생형 마우스를 고지방 식이 (HFD) 로 사육하여, DIO 를 유도하였다. 다음, 영양 및 단식상태에서 상기 마우스의 혈청 지질 수준을 검사하였다. 도 6A 및 6B 에서 나타낸 바와 같이, 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준은 영양 및 단식 상태 둘 다에서 녹아웃 마우스에서 유의하게 감소되었다. 추가로, FFA 수준이 또한 단식 상태의 녹아웃 마우스에서 감소되었다. 도 6C 를 참조한다.

도 26 은 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 야생형 및 녹아웃 수컷 마우스에서 단식된 혈청 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, HDL, 및 LDL 수준을 나타내었다. 상기 실험에서, HFD 식이요법으로 사육된 녹아웃 수컷 마우스의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준은 HFD 로 사육된 야생형 마우스에서보다 77% 더 낮았다. HFD 식이요법으로 사육된 녹아웃 수컷 마우스 내의 단식된 총 콜레스테롤수준은 상기 실험에서 HFD 로 사육된 야생형 마우스의 것보다 35% 더 낮았다.

추가로, 녹아웃 마우스는 DIO 를 유의한 범위로 보호하였다. HFD 로 사육된 야생형 마우스는 표준 식이요법의 야생형 마우스와 비교해서 현저한 비만을 발달시켰다. 도 7A 및 7B 를 참조한다. 그러나, 체중 증가 및 체지방 증가는 표준식이요법 또는 HFD 로 사육된 Angptl4 녹아웃 마우스에 대해서 유의하게 감소되었다. 도 7A-7D 를 참조한다. 감소된 체중의 대부분은 체지방량의 감 소로 인한 것이었고, 제지방 체중 감소에 의한 것은 아니었다.

도 27, 패널 A 는 고지방 식이 (HFD) 로 사육된 수컷 야생형 ("WT") 및 녹아웃 ("HOM") 마우스에서 체지방의 총 그램을 보여준다. HFD 로 사육된 녹아웃 수컷 마우스는 HFD 로 사육된 야생형 수컷 마우스보다 유의하게 더 낮은 체지방을 가졌다. 도 27, 패널 B 는 HFD 로 사육된 암컷 야생형 ("WT") 및 녹아웃 ("HOM") 마우스에서 시간 경과에 따른 체지방의 총 그램을 보여준다. 상기 실험은 HFD 로 사육된 암컷 야생형 마우스에 비해 HFD 로 사육된 암컷 녹아웃 마우스에서의 더 낮은 체지방으로의 경향성을 보여준다.

HFD 로 사육된 수컷 녹아웃 마우스는 HFD 로 사육된 수컷 야생형 마우스와 유사한 먹이 섭취를 가졌다. 도 28, 패널 A 를 참조한다. HFD 로 사육된 암컷 마우스는 또한 HFD 로 사육된 수컷 야생형 마우스와 유사한 분 지방 함량 수준을 가졌다. 도 28, 패널 B 를 참조한다.

결국, 상기 결과는 Angptl4 부족이 혈청 지질을 저하하고, 비만에 대한 보호를 부여한다는 것을 보여주었다.

D. Angptl4 녹아웃 마우스는 단식 상태에서의 감소된 지방세포 LPL 활성을 보여주지 않았음.

영양 및 단식 상태의 야생형 및 녹아웃 마우스 내 지방 조직 (부고환 지방 패드 조직) 에서의 내인성 LPL 활성을 시험하였다. 조직 샘플 (0.3 - 1.0 g) 을 Kinematica 균질기를 사용하여, 얼음-냉각 균질화 완충제 (0.025 M NH₃ (pH 8.2), BSA 1 mg/ml, 5 mM EDTA, 헤파린 5 IU/ml, 및 프로테아제 억제제 칵테일) 내에서 균질화시켰다. 4℃, 3,000 g 에서 10 분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 수합하였다.

상청액 내 LPL 활성을 [Bergo 등 (1996) Biochem . J. 313:893-898)] 의 어세이를 바탕으로, 기질인 글리세롤-트리[9,10(n)- ³H]올레에이트로부터 방출된 올레산의 양에 의해 측정하였다. 100 ㎕ 의 기질 용액 (2 mM 글리세롤 트리[9, 10 (n)-³H]올레에이트 (131 kbeq/mmol), 189 ng/ml L-α-포스파티딜콜린, 14 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA), 140 mM Tris-HCl (pH 8.0), 15% 글리세롤, 및 10% 가열-불활성화된 태아 소 혈청) 에 동부피의 상청액을 37℃ 에서 1 시간 동안 첨가하였다. 메탄올/클로로포름/헥산 혼합물 (141:125:100, v/v/v) 3.25 ml 및 0.1 M K₂CO₃-보론산 완충제 (pH 10.5) 1.05 ml 을 첨가함으로써, 반응을 중지시켰다. 실온, 3,000 g 에서 15 분 동안 격렬한 보텍스 및 원심분리를 한 후, 수성/메탄올 상의 1 ml 분획 내의 ³H 의 양을 Beckman Coulter LS6500 액체 섬광 계수기를 사용하여 측정하였다.

야생형 마우스에서, 내인성 LPL 활성은 영양 상태의 내인성 LPL 활성에 비해 단식 상태에서 유의하게 감소하였다. 도 8 을 참조한다. 이러한 결과는 ANGPTL4 발현이 단식 상태에서 유도되고, 그로 인해 LPL 활성을 감소시킨다는 이전의 관찰과 일치하였다. 예를 들어, [Ge 등 (2004) J. Lipid Res . 45:2071- 2079] 를 참조한다. 그러나, 녹아웃 마우스에서, 내인성 LPL 활성은 영양 상태의 내인성 LPL 활성에 비해 단식 상태에서 감소되지 않았다. 상기 결과는 녹아웃 마우스에서 ANGPTL4 의 부재와 일치하였다.

E. Angptl4 녹아웃 마우스는 간 지방증 (지방간) 으로부터 보호되었음.

HFD 는 간 지방증 (지방간) 과 연관있다. Angptl4 부족이 HFD-유도 간 지방증에 대해 보호하는지를 알아보기 위해, 국소화된 양성자 자기 공명 스펙트럼 (MRS) 을 사용하여, HFD 및 표준 식이요법의 야생형 및 녹아웃 마우스의 간에서의 지질 수준을 측정하였다. 간 지방 농도 및 지방 침투도 둘 다를 평가하였다.

무선 주파수 송신 및 수신을 위한 내부 직경이 38 mm 인 버드케이지 코일을 사용하여, 7 Tesla 16 cm bore PharmaScan 시스템 (Bruker BioSpin, Billerica, MA) 를 사용하여 생체 내 MRS 를 수행하였다. 마우스를, 자석 내부의 예비-온수 순환계에 의해 체온을 유지시키면서, 1.5-2% 이소플루란으로 마취시켰다. 그의 호흡 활성을 지속적으로 모니터링하였다. 전체 간을 덮는 T1 스카우트 이미지 시리즈를 바탕으로 관 및 지방 조직을 조심스럽게 피해서, 관심 부위 (VOI) 를 선택하였다. 호흡 동시성을 가진 PRESS 시퀀스 (TE = 28 ms, TR= 1.0 초, 196 평균, 물 억제 : 오프, VOI : 1.8X1.8X1.8 mm³, 또는 2X2X2 mm) 를 사용하여 국소화된 ¹H-MRS 를 수득하였다. 물 및 지방 피크 하 면적의 적분을 사용하여, 지방 함량 (지방%)을 계산하였다. [Thomsen 등 (1994) Magnetic Resonance Imaging 12:487-495] 를 참조한다.

HFD 의 야생형 마우스의 간은 표준 ("쵸우") 식이를 받은 야생형 마우스의 간에 비해 유의하게 더 높은 지질 수준을 보여주었다. 도 9A 를 참조한다. 그러나, HFD 를 받은 녹아웃 ("HOM") 마우스의 간은 표준 식이를 받은 야생형 마우스의 간에 비해 유의하게 증가된 지질 수준을 보여주지 않았다. 추가로, HFD 를 받은 녹아웃 마우스의 간은 HFD 를 받은 야생형 마우스의 간에 비해 유의하게 더 낮은 지질 수준을 보여주었다. 상기 결과와 일치하게도, HFD 를 받은 녹아웃 마우스의 간 섹션의 오일 적색 O 염색은 HFD 를 받은 야생형 마우스의 간 섹션에 비해 유의하게 감소된 지질 방울의 수 및 크기를 보여주었다. 도 9B 를 참조한다. 더욱이, HFD 를 받은 녹아웃 마우스의 간 섹션의 지질 방울의 수 및 크기는 표준 식이요법을 받은 야생형 마우스의 것과 닮았다. 상기 결과는, Angptl4-부족 마우스가 HFD-유도 간 지방증에 대해 보호된다는 것을 가리킨다.

간과 같은 조직이 녹아웃 마우스에서 지질 축적으로부터 보호되는지 알아보기 위해, 골격근의 근육세포 내 지질 (IMCL) 함량을 또한 녹아웃 및 야생형 마우스에서 측정하였다. 근육세포내 지질 함량의 측정을 위해, 무선 주파수 송신 및 수신을 위한 직경이 19 mm 인 버드케이지 코일을 사용하여 7 Tesla 16 cm bore PharmaScan 시스템을 사용하여 생체 내 MRS 연구를 수행하였다. 마우스를 상기 기술된 바와 같이, 1.5-2% 이소플루란으로 마취시키고, 마우스의 뒷다리를 자기 장축을 따라 정렬되도록 코일 내부에 위치시켰다. 1.5X1.5X1.5 mm³ 의 관심부위 (VOI) 를, 혈관 구조 및 그로스 지방 조직 침착을 피하면서, 왼쪽 또는 오른쪽 M. 전경골근에서 선택하였다. PRESS 시퀀스 (TE = 16 ms, TR= 2.0 초, 292 평균, CHESS 수압) 을 사용하여 국소화된 ¹H-MRS 를 수득하여, IMCL 및 근육세포외 지질 (EMCL) 피크가 스펙트럼에서 분명히 구분되는 것을 확인하였다. ICML 및 tCr (총 크리에이션) 피크 하의 면적을 적분하여, ICML 함량 (ICML/tCr 비율) 을 계산하였다 (8 주 및 15 개월령 비만 ZDF 래트의 M. 전경골근에 대한 tCr 농도는 각각 136+/-2.2 및 132+/-1.0 μmol/g (건성 중량) 이었다. [Kuhlmann 등 (2003) 당뇨병 52:138-44] 를 참조).

HFD 를 받은 녹아웃 마우스는 HFD 를 받은 야생형 마우스보다 유의하게 더 낮은 근육세포내 지질 함량을 나타내었다. 도 10 을 참조한다. 따라서, Angptl4 부족은 지질 축적으로부터 간 및 골격근과 같은 중요 조직을 보호하였다.

F. Angptl4 녹아웃 마우스는 포도당 과민증으로부터 보호되었음.

더 높은 수준의 간 및 근육세포내 지질 함량은 인슐린 둔감증과 연관있는 것으로 알려져 있다. 또한, HFD 는 포도당 과민증과 연관있는 것으로 알려져 있다. Angptl4 부족이 그러한 영향으로부터 보호한다는 것을 알아보기 위해, 야생형 및 녹아웃 마우스에서의 포도당 및 인슐린 혈청 수준을 검사하였다.

야생형 및 녹아웃 마우스를 HFD 로 사육하였다. 단식 16 시간 후, 혈당를 Accu-Check Advantage (2138930, Roche, Indianapolis, IN) 에 의해 측정하였다. 그 후 바로, 2 g 포도당/kg (체중) 을 20% 멸균 포도당 용액 내에서 경구 위관 영양법에 의해 투여하였다. 이어서, 혈당를 다수의 시점에서 측정하였다. 도 11, 패널 C 를 참조한다. 그 실험에서, HFD 로 사육된 녹아웃 마우스는 HFD 로 사육된 야생형 마우스보다 더욱 포도당 내성이었고, 이는 2 g 포도당/kg (체중) 의 경구 위관 영양법을 받은 녹아웃 마우스가 동일한 처리를 받은 야생형 마우스보다 시간에 따른 더 낮은 포도당 수준을 가졌음을 의미하였다. 그 결과는 통계적으로 유의하였다.

야생형 및 녹아웃 마우스를 HFD 로 사육하였다. 광주기의 시작에서 단식시킨 지 6 시간 후에, 혈당을 측정하였다. 그 후 바로, 인슐린 (Humulin R, Eli Lilly) 750 mU/kg (체중) 을 75 mU/ml 인슐린 용액을 사용하여 복강내 주사하였다. 이어서, 다수의 시점에서 혈당을 측정하였다. 도 11, 패널 D 를 참조한다. 그 실험에서, HFD 로 사육된 녹아웃 마우스는 HFD 로 사육된 야생형 마우스보다 더욱 인슐린 민감성이었고, 이는 인슐린 75 mU/ml 를 주사하는 것이 동일한 처리를 받은 야생형 마우스보다 시간에 따라 더 낮은 포도당 수준을 초래하는 것을 의미하였다. 그 결과는 통계적으로 유의하였다.

HFD 로 사육된 야생형 마우스에서의 포도당 및 인슐린의 단식된 혈청 수준은 표준 식이요법을 받은 야생형 마우스의 것보다 유의하게 더 높았으며, 이는 HFD-유도 고혈당증 및 고인슐린혈증을 나타내었다. 도 11, 패널 A 및 B 를 참조한다. 그러나, HFD 로 사육된 녹아웃 마우스에서의 포도당 및 인슐린 둘 다의 단식된 혈청 수준은 표준 식이요법으로 사육된 야생형 마우스 또는 녹아웃 마우스의 수준과 유의하게 다르지 않았으며, 이는 Angptl4 부족이 HFD-유도 고혈당증 및 고인슐린혈증으로부터의 보호를 제공하였음을 제시하였다. 도 11, 패널 A 및 B 를 참 조한다.

G. 마우스 ANGPTL4 의 과발현은 녹아웃 마우스에서의 혈청 지질 수준을 증가시켰다.

마우스 ANGPTL4 의 과발현이 Angptl4 녹아웃 마우스의 임의의 표현형에서 벗어나도록 알아보기 위해, Ad5-mAngptl-4T 구축물 (상기 기술된 Part VI.B.1.) 을 녹아웃 마우스의 꼬리 정맥에 5 x 10¹⁰ vp 로 주사하였다. 대조군으로서, Ad5-β-갈 구축물 (상기 기술된 바와 같이 파트 VI.B.1.) 을 녹아웃 마우스의 정맥 꼬리에 5 x 10¹⁰ vp 로 주사하였다. 주사한 지 3 일 후에, Ad5-mAngptl-4T 구축물로 주사한 녹아웃 마우스는 대조군 구축물로 주사된 녹아웃 마우스보다 단식된 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤의 유의하게 더 높은 수준을 보여주었다. 도 12 및 13 을 참조한다. 실제로, Ad5-mAngptl-4T 구축물로 주사된 녹아웃 마우스의 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준은 Ad5-mAngptl-4T 구축물로 주사된 야생형 마우스의 것에 필적하였다. 도 12 및 13 을 도 2 및 3 과 비교한다. 상기 결과는, 마우스 ANGPTL4 의 과발현이 Angptl4 녹아웃 마우스의 감소된 혈청 지질 수준을 뒤집는다는 것을 나타낸다.

F. 마우스 ANGPTL4 의 제조 및 정제

재조합 ANGPTL4 를 발현하기 위해, CHO 세포에 재조합 아데노바이러스 Ad5-mAngptl-4T 를 1.5 x 10¹¹ vp 로 주사하였다 (상기 기술된 Part VI.B.1.). 배지를 16 - 24 시간 후에 혈청-없는 배지 (EX-CELL 325-PF CHO 배지, 14335, JRH, Lenexa, KS) 로 교환하였다. 조건화된 배지를 수합하고, 총 5 회의 수합 동안 매 24 - 36 시간마다 새로운 혈청-없는 배지로 교환하였다.

조건화된 배지 (1 L) 를 Nickel-Chelating Resin (R801-01, Invitrogen, Carlsbad, CA) 의 10 - 12 ml 칼럼에 놓았다. 칼럼을 세척 완충액 (10 mM 이미다졸, 20 mM Tris pH 7.8, 500 mM NaCl) 5 칼럼 부피로 세척하였다. 결합된 ANGPTL4 를 용출 완충액 (500 mM 이미다졸, 20 mM Tris pH 7.8, 500 mM NaCl) 으로 용출하고, 1.5 ml 분획 시리즈에서 수합하였다. 수합된 분획 내 ANGPTL4 의 존재를 웨스턴 블롯 및 간단한 블루 염색에 의해 측정하였다. ANGPTL4 를 함유하는 분획을 함께 모으고, 나누고, -70℃ 에서 보관하였다.

I. ANGPTL4 에 의한 LPL 활성의 억제

LPL 활성에 대한 마우스 ANGPTL4 의 효과를 시험관 내 어세이를 사용하여 측정하였다. LPL 활성을 하기와 같이, 기질인 글리세롤-트리[9,10(n)-³H]올레에이트로부터 방출된 올레산의 양에 의해 측정하였다 ([Shimizugawa 등 (2002) J. Biol . Chem . 277:33742-33748] 의 방법을 바탕으로).

재구성된 소 LPL (L2254, Sigma, St. Louis, MO) 의 용액을 같은 부피의 기질 용액 (2 mM 글리세롤 트리[9, 10 (n)-³H]올레에이트 (131 kbeq/mmol), L-α-포스파티딜콜린 189 ng/ml, 소 혈청 알부민 (BSA) 14 mg/ml, 140 mM Tris-HCl (pH 8.0), 15% 글리세롤, 및 10% 가열-불활성화 태아 소 혈청) 으로 0 내지 400 nM 마우스 ANGPTL4 (상기 Part VI.H. 에서 기술된 바와 같이 제조됨) 의 존재 하에 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 메탄올/클로로포름/헥산 혼합물 (141:125:100, v/v/v) 3.25 ml 및 0.1 M K₂CO₃-보론산 완충액 (pH 10.5) 1.05 ml 을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 실온, 3,000 g 에서 15 분 동안 격렬히 보텍스하고 원심분리한 다음, 수성/메탄올 상 1 ml 분획 내 ³H 의 양을 Beckman Coulter LS6500 액체 섬광 계수기를 사용하여 측정하였다. LPL 활성 1 단위를 37℃ 에서 기질로부터 매 분 당 ³H-표지된 올레산 1 μmol 의 방출로서 정의하였다. 마우스 ANGPTL4 는 약 25 nM 의 IC₅₀ (50% 억제에 필요한 농도) 으로 소 LPL 을 억제시켰다. 도 14 를 참조한다.

J. Angptl4 녹아웃 마우스에서의 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 발생

마우스 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체를 발생시키기 위해, Angptl4 녹아웃 마우스를 프라이밍한 다음, 상기 Part VI.H 에서 기술된 바와 같이 제조된 정제된 마우스 ANGPTL4 로 2 내지 3 주마다 부스팅하였다. 완전 및 불완전 프로인트 보조제를 또한 프라이밍 및 부스팅하는데 각각 사용하였다. 2 내지 3 회의 부스팅 후에, 혈청 타이터를 ELISA 에 의해 모니터링하였다. 일단 적합하게 높은 타이터가 달성되면, 비장세포를 면역 마우스로부터 수합하고, 융합제로서 PEG150O 를 사용하여 골수종 세포 (P3/NSI/1-Ag4-1) 와 융합하였다. 생성 세포 융합물을 하이브리도마 배지에 희석시키고, 96-웰 조직 배양 플레이트에 심었다. 1 일 후에, HAT 배지를 하이브리도마 배양물에 첨가하였다. 배지를 필요하다면 3 또는 4 일마다 교환하였다. 선택 및 배양한 지 10 내지 14 일 후에, 하이브리도마를 항원으로서 사용된 마우스 ANGPTL4 를 사용한 ELISA 에 의해 스크리닝하였다. 14D12, 15F2, 2G12, 10E4, 1A4, 5A6, 14D2, 및 6G11 로 지정된 9 가지의 단일클론 항체는 마우스 ANGPTL4 에의 특이적인 결합을 보여주었다.

단일클론 항체를 또한 전장 마우스 ANGPTL4 (SEQ ID NO:1) 의 아미노산 잔기151-168 에 상응하는 LAPTHLDNGVDKTSRGKR 의 서열을 갖는 펩티드에 대해 배양하였다 (펩티드의 C-말단 아미노산이 아르기닌이라는 점을 제외하고는, 펩티드는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 잔기 151-168 과 동일하였고, 반면 SEQ ID NO:1 의 위치 168에서의 아미노산은 리신임). 펩티드를 주사 전에 KLH 와 공액시켰다. 펩티드에 대한 단일클론 항체는 전장 마우스 ANGPTL4 에 특이적으로 결합할 수 있었다. 그 단일클론 항체를 4A8 로 지정하였다.

K. ELISA 방법

항체를 ELISA 를 사용하여 마우스 ANGPTL4 에의 결합에 대해 스크리닝하였다. 96-웰 Nunc Maxi-Sorp ImmunoPlates^TM (Nunc #446612, Roskilde, Denmark) 를 코팅 완충액 (BupH^TM 탄산염-중탄산염 완충액, Pierce #28382, Rockford, IL) 내 ANGPTL4 의 용액 2.5 ㎍/ml 를 웰 당 50 ㎕ 씩 첨가하여 4℃ 에서 밤새 코팅시켰다. 코팅 완충액을 제거하고, 차단 완충액 (PBS 내 1% Blocker^TM BSA, Pierce #37525)을 웰 당 250 ㎕ 씩 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 차단시켰다. 하이브리도마 상청액 (차단 완충액 내에서 비희석 또는 희석됨) 또는 단리 된 항-ANGPTL4 항체 (차단 완충액 내에서 비희석 또는 희석됨) 50 ㎕ 를 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 이상 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 PBS/Tween 20 으로 4 회 세척하였다. 희석된 (1:5,000 내지 1:10,000) HRP-공액 염소 항-마우스 IgG (Pierce #31446) 100 ㎕ 를 웰에 첨가하고, 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 PBS/Tween 20 으로 6 회 세척하였다. 항-ANGPTL4 항체를 TMB (테트라메틸 벤지딘) 용액 (ImmunoPure TMB Substrate Kit, Pierce #34021) 50 ㎕ 를 웰에 5 내지 10 분 동안 첨가하여 검출하였다. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 를 사용하여 450 nm 에서 분광광도학적으로 판독하였다.

L. 단일클론 항체의 시험관 내 중화 활성

단일클론 항체를 상기 Part VI.I 에서 기술된 바와 같은 LPL 활성에 대한 시험관 내 어세이에서 ANGPTL4 활성을 중화시키는 상기 항체의 능력에 대해 어세이하였다. 25 nM 마우스 ANGPTL4 및 약 125 nM 의 상기 9 가지의 단일클론 항체 각각의 존재 하에, 분리된 LPL 활성 어세이를 수행하였다. 그 결과를 도 15 에 나타내었다. 각각의 항체에 대해, 중화 활성은 LPL 활성을 증가시키는, 즉, ANGPTL4 에 의한 억제로부터 LPL 을 구출하는 항체의 능력으로 나타내었다. 구출 활성을, ANGPTL4 단독의 존재 하에서의 LPL 활성에 대해, ANGPTL4 및 항-ANGPTL4 항체 둘 다의 존재 하에서의 LPL 활성의 증가% 에 의해 도 15 에서 나타내었다. 9 가지의 항체 중 5 가지인 4A8, 14D12, 15F2, 2G12, 및 10E4 는 LPL 활성의 증가를 초래하였고, 이는 상기 항체가 ANGPTL4 활성의 중화에 의해 LPL 활성 을 구출하였음을 나타내었다. 특히, 항체 4A8, 14D12, 및 15F2 는 LPL 활성을 50% 초과로 구출하였다. 9 가지의 항체 중 4 가지인 1A4, 5A6, 14D2, 및 6G11 는 LPL 을 추가로 억제하는 것으로 보였고, 이는 상기 항체가 ANGPTL4 활성을 증진시킬 수 있음을 나타내었다.

M. 아이소타이핑

14D12, 15F2, 4A8, 및 6G11 의 아이소타입을 표준 방법에 의해 결정하였다. 4A8 및 6G11 은 IgG1 아이소타입의 것이고, 14D12 및 15F2 은 IgG2a 아이소타입의 것이었다 (하기 표 2 Part VI.P. 의 3 번째 및 4 번째 칼럼을 참조).

N. 단일클론 항체의 에피토프 맵핑

단일클론 항체 14D12, 15F2, 및 6G11 을 마우스 ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인 (SEQ ID NO:1 의 아미노산 21-174) 및 마우스 ANGPTL4 의 C-말단 피브리노겐-유사 도메인 (SEQ ID NO:1 의 아미노산 174-410) 의 결합에 대해 ELISA 를 사용하여 테스트하였다. 14D12 및 15F2 는 마우스 ANGPTL4 의 N-말단 코일형-코일 도메인에 특이적으로 결합하였다. 6G11 은 마우스 ANGPTL4 의 C-말단 피브리노겐-유사 도메인에 특이적으로 결합하였다.

O. 에피토프 결합

단일클론 항체 14D12, 15F2, 및 4A8 가 동일한 에피토프에 결합하는지 알아보기 위해, 에피토프 결합을 Luminex 100 멀티플렉스 기술 및 Luminex 100 분석기 (Luminex Corporation, Austin, TX) 를 사용하여 수행하였다. [Jia 등 (2004) J. Immunol . Methods 288:91-98] 참조. 에피토프 결합은 전형적으로 항체 샌드 위치-형 경합 어세이를 사용하고, 여기에서 "프로브" 항체를 "참조" 항체에 의해 결합되는 항원에의 결합에 대해 시험하였다. 프로브 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합한다면, 그것은 항원에 효율적으로 결합하지 않을 것인데, 이는 상기 에피토프가 참조 항체에 의해 가려지기 때문이다.

에피토프 결합을 수행하기 위해, 상이하게 표지된 xMAP 카르복실화 미세구 (Luminex, Austin, TX) 를 빛으로부터 보호하고, 캡처 항체 (토끼 단일클론 항-마우스 IgG) 로 코팅시켰다. 다음, 주어진 표지를 갖는 코팅된 미세구가 3 가지 참조 항체 (14D12, 15F2, 또는 4A8) 중 하나를 선택적으로 캡처하도록 하여, 각각의 참조 항체를 상이한 표지와 연관시켰다. 상이하게 표지된 미세구를 조합하고, 마이크로웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 미세구를 웰에 분산하고, 4℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 마우스 ANGPTL4 를 웰에 첨가하고, 25℃ 에서 1 시간 동안 진탕하면서 인큐베이션시킨 다음 세척하였다. 3 가지 프로브 항체 (14D12, 15F2, 또는 4A8) 중 하나를 각 웰에 첨가하고, 5℃ 에서 1 시간 동안 진탕하면서 인큐베이션시킨 다음 세척하였다. 바이오틴화 검출 항체 (토끼 단일클론 항-마우스 IgG) 를 웰에 첨가하여, 프로브 항체에 의한 ANGPTL4 의 결합을 검출하였다. 스트렙타비딘-PE 를 웰에 첨가하고, 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 각 웰에 대해, Luminex 100 분석기 (이중 레이저, 유동-기재, 소팅 및 검출 플랫폼) 를 사용하여, 각 미세구와 연관된 특정 표지 (및 따라서 참조 항체의 동정) , 및 각 미세구와 연관된 PE-유도 신호의 크기를 검출하였다. PE-유도 신호의 크기는 마우스 ANGPTL4 에 결합된 프로브 항체의 양에 바로 비례하였다.

결과를 도 16 에 나타내었다. 4A8 를 프로브 항체로서 사용한 경우 (3 개의 막대 중 첫번째 세트), 강한 형광 신호에 의해 지시된 바와 같이 (흑색 및 백색 막대), 14D12 및 15F2 둘 다를 참조 항체로서 사용한 경우, 그것은 마우스 ANGPTL4 에 결합하였다. 따라서, 4A8 은 14D12 및 15F2 와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 14D12 를 프로브 항체로서 사용한 경우 (3 개의 막대 중 두번째 세트), 그것은 4A8 를 참조 항체로서 사용한 경우, 마우스 ANGPTL4 에 결합하였으나 그것은 15F2 를 참조 항체로서 사용한 경우, 약한 결합을 나타내었다 (회색 및 백색 막대를 비교). 따라서, 14D12 및 15F2 는 동일한 에피토프에 결합하려는 경향이 있다. 유사하게는, 15F2 를 프로브 항체로서 사용한 경우 (3 개의 막대 중 마지막 세트), 그것은 4A8 를 참조 항체로서 사용한 경우 마우스 ANGPTL4에 결합하였으나, 그것은 14D12 를 참조 항체로서 사용된 경우 약한 결합을 나타내었고 (회색 및 흑색 막대를 비교), 따라서 14D12 및 15F2 가 동일한 에피토프에 결합하려는 경향이 있음을 확인해 주었다.

두번째 에피토프 결합 실험을 제조업자의 지시에 따라, BIACORE 3000 시스템 (Biacore AB, Uppsala Sweden) 을 사용하여 수행하였다. BIACORE 3000 시스템은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용한 실시간 생분자 상호작용 분석을 가능하게 한다. 본질적으로는, 자유 항체의 결합을 억제시키는 항원-항체 복합체의 능력을 사용하여, 경합 억제의 과정에서 공통의 에피토프 결합을 측정하였다.

항체 14D12, 15F2, 90B4, 16B10, 4A8, 및 9C10 을 사용하여 실험하였다. 항체는 BIACORE 칩 상에서 직접 고정되어 있거나 또는 칩 결합 항-마우스 IgG Fc 로 캡처된 칩에 연결되어 있었다. 각각의 항체에 대한 에피토프의 결합을 측정하기 위해, 결합된 항체를 N-mANGPTL4, 및 용액 내 동일한 항체 또는 용액 내 상이한 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 다음, 상기 시스템이 평형에 도달하도록 두었다. 상호 결합 억제를 바탕으로, 하기 에피토프 결합을 지정하였다 : Bin I 은 14D12 및 15F2 를 함유하였고, Bin II 는 90B4 및 16B10 을 함유하였고, Bin III 은 단지 4A8 만 함유하였고, Bin IV 은 9C10 을 함유하였다. 상기 결과는 상기 논의된 첫번째 에피토프 결합 실험과 일치하였다.

P . 중화 활성을 가진 단일클론 항체의 생체 내 투여는 녹아웃 표현형을 재현하였음.

시험관 내에서 중화 활성을 가진 항체가 Angptl4 녹아웃 마우스의 표현형을 반복할 수 있는지 알아보기 위해 상기 항체를 마우스에 투여하였다. 항체를 생체 내에서 투여하기 위해서, 표준 식이요법으로 사육된 마우스 ("쵸우-사육된" 마우스) 또는 HFD-유도 DIO 를 갖는 마우스에 하기 표 2 에서 지시된 바와 같이, 체중 g 당 10 ㎕ 의 부피로 단일클론 항체 30 ㎍ 을 주사하였다. 항-KLH 항체를 대조군 항체로서 투여하였다. 트리글리세리드, 콜레스테롤, 및 FFA 의 단식된 혈청 수준을 4 일 후에 측정하였다.

결과를 도 17-19 에서 나타내었다. 표준 식이요법으로 사육된 마우스에서, 14D12 의 단일 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 72.7% 및 67.0% (2 가지 독립적인 연구에서) 까지, 단식된 총 콜레스테롤 수준을 27.1% 및 21.3% (2 가지 독립적인 연구에서) 까지, 그리고 단식된 FFA 수준을 44.3% (단일 연구에서) 까지 유의하게 감소시켰다. 유사하게는, 15F2 의 단일 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 67.6% 및 71.8% 까지 (2 가지 독립적인 연구에서), 단식된 총 콜레스테롤 수준을 22.8% 및 28.0% 까지 (2 가지 독립적인 연구에서), 그리고 단식된 FFA 수준을 39.3% 까지 (단일 연구에서) 감소시켰다. 상기 관찰은 시험관 내에서 LPL 활성을 감소시키는 14D12 및 15F2 의 능력과 일치하였다. 그러나, 4A8 의 단일 투여는, 상기 항체가 LPL 활성을 시험관 내에서 구출할 수 있었더라도, 단식된 혈청 트리글리세리드, 콜레스테롤, 및 FFA 수준에 대해 유의한 효과를 가지지 않았다 (도 17-19 의 막대 그래프 참조). 반대로, 6G11 의 단일 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 66.4% 까지 상승시켰고, 이는 LPL 활성을 시험관 내에서 추가로 억제시키는 상기 항체의 능력과 일치하였다. 6G11 의 투여는 단식된 총 콜레스테롤 및 FFA 수준에 대해 유의한 효과를 가지지 않았다 (도 18-19 의 막대 그래프 참조).

HFD-유도 DIO 를 갖는 마우스를 사용하여 수득된 결과는 도 20-21 에 나타나 있다. 14D12 의 단일 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 53.2% 까지, 그리고 단식된 총 콜레스테롤 수준을 27.6% 까지 감소시켰다. 유사하게는, 15F2 는 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 56.6% 까지, 그리고 콜레스테롤 수준을 31.0% 까지 감소시켰다. 4A8 는 단식된 혈청 트리글리세리드 또는 총 콜레스테롤 수준에 대해 유의한 효과를 가지지 않았다 (도 20-21 의 막대 그래프 참조). 6G11 의 단일 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 60.9% 까지 유의하게 상승시켰으나, 단식된 총 콜레스테롤 수준에 대해서는 유의한 효과를 가지지 않았다 (도 21 의 막대 그래프 참조). FFA 수준은 DIO 마우스에서 측정되지 않았다.

상기 결과는, ANGPTL4 활성을 중화시키는 일부 항체의 투여가 Angptl4 녹아웃 마우스에서 보여진 감소된 혈청 지질 수준을 재현하는 것을 보여주었다. 상기 결과를 바탕으로, 상기 항체의 투여는, Angptl4 녹아웃 표현형의 다른 측면, 예를 들어, 단식된 상태에서의 증가된 내인성 LPL 활성, 간 지방증 및 근육세포내 지질 축적으로부터의 증가된 보호, 및 포도당 내성으로부터의 증가된 보호를 재현할 것이라고 기대된다.

계속되는 투여의 효과를 평가하기 위해 중화 항체를 또한 5 주의 경과에 걸쳐 투여하였다. HFD-유도 DIO 를 갖는 마우스에 14D12, 15F2, 또는 아이소타입-매치 대조군 항체 (항KLH) 를 5 주 동안 1 주에 1 회씩 주사하였다. 투여량은 체중 g 당 10 ㎕ 의 부피 중 단일클론 항체 30 ㎍ 이었다. 단식된 혈청 지질 수준을 측정하고, 항체의 단일 투여만을 받은 마우스의 단식된 혈청 지질 수준과 비교하였다. 도 22-23 에서 나타낸 바와 같이, 14D12 의 단일 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드를 53.22% 까지, 그리고 콜레스테롤을 27.58% 까지 감소시킨 반면, 5 주의 경과에 걸친 14D12 의 주마다의 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드를 59.36% 까지, 그리고 콜레스테롤을 44.21% 까지 감소시켰다. 유사하게는, 15F2 의 단일 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드를 56.61% 까지, 그리고 콜레스테롤을 30.97% 까지 감소시킨 반면, 5 주의 경과에 걸친 15F2 의 주마다의 투여는 단식된 혈청 트리글리세리드를 64.45% 까지, 그리고 콜레스테롤을 32.73% 까지 감소시켰다. 본 연구에서, 14D12 또는 15F2 의 5 주에 걸친 주마다의 투여는 단일 투여에 비해, FFA, 포도당 내성, 또는 체중에 관하여 유의한 효과를 가지지 않았다 (데이타 제시되지 않음). 상기 결과는, ANGPTL4 활성을 중화시키는 항체의 계속된 투여가 단일 투여에 비해, 단식된 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 유지하거나 또는 추가로 저하시키는 것을 보여주었다.

상기 기술된 바와 같이 14D12, 15F2, 또는 대조군 항체 (항KLH) 를 5 주 동안 주마다 주사한 DIO 마우스에서 케톤체 (KB) 의 단식된 혈청 수준을 또한 측정하였다. 14D12 또는 15F2 를 주사한 DIO 마우스는 대조군 항체로 주사받은 DIO 마우스가 가진 케톤체보다 유의하게 더 높은 수준의 케톤체를 가지고 있었다. 도 24 를 참조한다. 몸이 지질을 분해할 때 케톤체가 생성된다는 것은 알려져 있다. 따라서, 케톤체의 증가된 수준은 간 및 근육세포내 지질 수준이 중화 항체를 주사받은 마우스에서 감소되는 가능한 기작일 수 있다.

Q. Angptl4 녹아웃 마우스에서의, 인간 및 마우스 ANGPTL4 와 교차작용하는 단일클론 항체의 발생

인간 및 마우스 ANGPTL4 둘 다와 교차작용하는 단일클론 항체를 N-mANGPTL4 (마우스 ANGPTL4 의 아미노 말단 도메인의 일부를 함유함) 를 사용하여 Angptl4 녹아웃 마우스에서 배양하였다.

마우스 ANGPTL4 의 아미노산 23 내지 180 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 pET22b(+) (Novagen) 내로 클로닝하였다. 상기 벡터는 C-말단 His 태그뿐만 아니라, N-말단 pelB 리더 서열을 암호화한다. 생성 발현 벡터를 pET-N-mANGPTL4 라고 한다. 단백질의 번역 및 pelB 서열의 11 개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산의 제거 후, N-mANGPTL4 는 SEQ ID NO: 10 에서 보여진 서열을 가진다. 상기 서열은 pelB 서열의 11 개의 아미노산, 다음에 마우스 ANGPTL4 의 아미노산 23 내지 180 (표 6 에서 밑줄친 부분), 이어서 2 개의 아미노산 연결기 및 His 태그를 함유한다.

N-mANGPTL4 을 하기와 같이 E. coli 로부터 발현하고 정제하였다. 클로르암페니콜 50 ㎍/ml 및 카베니실린 100 ㎍/ml 를 함유하는 LB 10 ml 을 pET-N-mANGPTL4 로 형질전환된 E. coli 의 한 콜로니에 접종하였다. 배양물을 37℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음, 10 ml 배양물을 항생제가 없는 LB 500 ml 에 옮기고, OD₆₀₀ 가 0.6 에 도달할 때까지 (약 2 시간) 37℃ 에서 인큐베이션시켰다. IPTG 를 최종 농도 1 mM 로 첨가하고, 상기 배양물을 30℃ 에서 4 시간 동안 200 rpm 에서 흔들면서 인큐베이션시켰다. 다음, 배양물을 얼음 위에 5 분 동안 놓았다. 세포를 JLA16.25 로터 내, 8000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리시켜 펠렛화시켰다. 다음, 상기 펠렛을 파쇄 완충액 (50 mM Tris, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1% Triton X-100, 1x 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche) 및 0.25 ml PMSF (이소프로판올 내 0.1 M)) 50 ml 중에 재현탁시켰다. 다음, 파쇄된 세포를JA25.5 로터 내 9700 rpm 에서 30 분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 추가로 SW28 로터 내, 28,000 rpm 에서 30 분 동안 상청액을 원심분리시켜 투명하게 하였다. 다음, Probond (Ni) 크로마토그래피 (Invitrogen) 를 사용하여 투명하게 된 상청액으로부터 재조합 N-mANGPTL4 를 정제할 수 있다.

파쇄된 세포를 원심분리시킨 후 남아 있는 불용성 펠렛으로부터 재조합 N-mANGPTL4 를 정제하기 위해, 상기 펠렛을 30 ml 파쇄 완충액으로 세척하고, JA25.5 로터 내, 9700 rpm 에서 원심분리하였다. 총 3 회의 세척 동안, 세척 단계를 2 회 반복하였다. 다음, 상기 펠렛의 불용성 단백질을 변성 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 6 M Guanadine HCl) 10 ml 중에 용해시켰다. 다음, 상기 용액을 JA25.5 로터 내, 28,000 rpm 에서 30 분 동안 원심분리하였다. 다음, 상청액을 5 ml Probond 수지 칼럼에 옮겼다. 칼럼을 세척 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 8 M 우레아, 15 mM 이미다졸) 50 ml 로 세척하였다. 재조합 단백질을, 세척 완충액으로부터 재변성 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 0.5% Tween 20) 으로 가는 50 ml 구배로 칼럼 내에서 재접힘시켰다. 다음, 재조합 단백질을 용출 완충액 (250 mM 이미다졸이 있는 재변성 완충액) 으로 용출하였다. 재조합 단백질을 함유하는 분획을 수합하고, 저장 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.2% Tween 20) 에 대해 투석하였다. 정제된 N-mANGPTL4 를 나누고, -70℃ 에서 보관하였다.

마우스를 완전 프로인트 보조제 중 N-mANGPTL4 10 을 사용하여 복강 내 프라이밍하였다. 마우스를 불완전 프로인트 보조제 (IFA) 중 N-mANGPTL4 30 ㎍ 으로 2 주 후에 복강 내로 부스팅하고, 그런 다음, IFA 중 N-mANGPTL4 20 ㎍ 으로 또 2 주 후에 다시 부스팅하였다. 대안적으로, 키토산 기재 보조제를 사용할 수 있다. 예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,912,000; 5,965,144; 및 5,980,912 를 참조한다. 2 번째 부스팅 후 1 주째에, 혈청 타이터를 실시예 K 에서 상기 기술된 바와 같이 (웰을 0.25 ㎍/ml mANGPTL4 50 ㎕ 로 코팅시키는 것을 제외함) ELISA 에 의해 측정하였다. 2 번째 부스팅 후 2 주째에, 마우스를 상기 Part VI.H. 에서 기술된 바와 같이 제조된 정제된 마우스 ANGPTL4 10 ㎍ (IFA 중) 으로 복강 내로 부스팅하였다. 세번째 부스팅 후 1 주째에, 혈청 타이터를 본 단락에서 상기 기술된 바와 같이 ELISA 에 의해 다시 측정하였다. 세번째 부스팅 후 약 2.5 주째에, 마우스를 10 ㎍ N-mANGPTL4 로 정맥내로 부스팅하였다.

면역 마우스로부터 3 일 후에 비장세포를 수합하고, 융합제로서 PEG1500 를 사용하여 골수종 세포 (NSI) 와 융합하였다. 생성 세포 융합물을 하이브리도마 배지로 희석시키고, 96-웰 조직 배양 플레이트에 심었다. 1 일 후에, HAT 배지를 하이브리도마 배양물에 첨가하였다. 상기 배지를 필요한 경우, 매 3 또는 4 일마다 교환하였다.

선택 및 배양한 지 10 내지 14 일 후에, 인간 및 마우스 ANGPTL4 와 상호작용하는 항체를 발현하는 것들을 동정하기 위해 ELISA 에 의해 하이브리도마를 스크리닝하였다. ELISA 를 실시예 K 에서 상기 논의된 바와 같이 수행하고 (플레이트를 단백질 0.25 ㎍/ml 용액 50 ㎕ 로 코팅시키는 것을 제외함), 각각의 항체를 마우스 ANGPTL4 및 인간 ANGPTL4 둘 다에 대해 분리해서 시험하였다. 마우스 ANGPTL4 및 인간 ANGPTL4 를 실시예 H 에서 상기 기술된 바와 같이, Ad5-mAngptl4T 및 Ad5-mAngptl4T 로 각각 감염시킨 CHO 세포이 조건화된 배지로부터 정제하였다. 마우스 및 인간 ANGPTL4 와 상호작용하는 15 개의 단일클론 항체를 선택하였다. 선택된 항체의 아이소타입을 결정하고 표 3 에 나타내었다.

R . ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 생체 내 활성

항체 14D12, 19C9, 18G3, 18A2, 9C10, 및 90B4 뿐만 아니라, 대조군으로서 항-KLH 를 하기와 같이 마우스에서의 특정 생체 내 활성에 대해 시험하였다. 항체 30 mg/kg (체중) 을 C57 알비노 야생형 마우스에 복강 내로 주사하였다. 각각의 항체를 5 마리의 마우스에서 시험하였다. 4 일 후에, 단식된 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 측정하였다. 상기 실험에서의 항체-주사 마우스의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 도 31 에 나타내었다. 항체 14D12 및 90B4 는 단식된 혈청 트리글리세리드를 각각 73.6% 및 54.9% 만큼 통계적으로 유의한 범위까지 감소시켰다. 상기 실험에서 항체-주사 마우스의 단식된 총 콜레스테롤 수준을 도 32 에 나타내었다. 항체 14D12 및 90B4 는 각각 단식된 총 콜레스테롤을 각각 25.2% 및 22.2% 만큼 통계적으로 유의한 범위까지 감소시켰다.

S. ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 상대적 결합 친화성

항체 90B4, 15F2, 및 14D12 의 결합 친화성을 ELISA 에 의해 N-mANGPTL4 및 N-hANGPTL4 각각에 대해 측정하였다. N-hANGPTL4 를 실시예 Q 에서 N-mANGPTL4 에 대해 상기 기술된 바와 같이 박테리아로부터 발현시키고 정제하였다. 인간 ANGPTL4 의 아미노산 24 내지 175 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 pET22b(+) 로 클로닝하고, 이는 N-말단 pelB 리더 서열 및 C-말단 His 태그를 암호화한다. 단백질의 번역 및 pelB 서열의 11 개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산의 제거 후, N-hANGPTL4 은 SEQ ID NO: 11 에서 나타내어진 서열을 가진다. 상기 서열은 pelB 서열로부터의 11 개의 아미노산, 이어서 인간 ANGPTL4 의 아미노산 24 내지 175 (표 6 에 밑줄쳐 있음), 및 이어서 2 개의 아미노산 연결기 및 His 태그를 함유한다. 플레이트를 웰 당 0.25 ㎍ /ml 단백질 (N-mANGPTL4 또는 N-hANGPTL4) 50 ㎕ 로 코팅시키는 것을 제외하고는, ELISA 를 실시예 K 에서 상기 논의된 바와 같이 수행하였다. 0 ㎍/ml, 0.08 ㎍/ml, 0.4 ㎍/ml, 2 ㎍/ml, 및 10 ㎍/ml 항체에서 결합을 측정하였다. 상기 실험의 결과를 도 33 에 나타내었다. 90B4 는 N-mANGPTL4 (패널 A) 및 N-hANGPTL4 (패널 B) 둘 다에 대해 15F2 또는 14D12 보다 더 큰 친화성을 가졌다. 15F2 는 14D12 보다 N-mANGPTL4 에 대해 더 큰 친화성을 가졌으나, N-hANGPTL4 에 대해서는 14D12 와 유사한 친화성을 가졌다.

T. 혈청 트리글리세리드를 저하시키는데 있어서 14 D12 의 투여량 반응

HFD 로 사육된 5 마리의 C57 알비노 야생형 마우스에 14D12 항체 또는 항-KLH 항체를 하기 기술된 특정 농도에서 피하주사하였다. 4 일 및 7 일 후에, 0 시간에 대한 총 트리글리세리드의 % 감소를 측정하였다. 상기 실험에서 시험된 항체 농도는 0.3 mg/kg (체중), 1 mg/kg (체중), 3 mg/kg (체중), 10 mg/kg (체중), 30 mg/kg (체중), 및 90 mg/kg (체중) 이었다. 상기 실험의 결과를 도 34 에 나타내었다. 4 일 후에, 10 mg/kg (체중), 30 mg/kg (체중), 및 90 mg/kg (체중) 의 투여가 혈청 트리글리세리드에서 통계적으로 유의한 감소를 초래하였다. 도 34, 패널 A 를 참조한다. 상기 효과는 지속되었고, 7 일 후에도 통계적으로 유의한 채로 있었다. 도 34, 패널 B 를 참조한다.

U. ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 약역학 및 약동학

14D12 의 약역학을 측정하기 위해, C57 알비노 마우스에 30 ㎍/g (체중) 14D12 를 투여하고, 그의 단식된 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 하기 표 4 에 나타낸 특정 시간 간격 후에 측정하였다. 마우스를 일상 식이요법 ("쵸우") 으로 사육하였다. 각각 3 마리씩 총 8 개의 군을 실험에 사용하였다. 상기 3 마리의 마우스의 한 군에는 항체를 주사하지 않았고, 기준선으로서 사용하였다. 남아 있는 7 개의 군의 마우스에는 14D12 를 주사하였다. 하기 스케쥴에 따라, 마우스에 주사를 놓고, 단식시키고, 피를 뽑았다:

14D12 의 약동학을 알아보기 위해, 4 마리의 C57 알비노 마우스에 제 1 일째 오전 8 시에 14D12 를 30 mg/kg (체중) 으로 주사하였다. 4 마리의 추가의 C57 알비노 마우스에는 대조군으로서 제 1 일째 오전 8 시에 30 mg/kg 항-KLH 를 주사하였다. 다음, 각각의 마우스를 1 시간, 5 시간, 10 시간, 1 일, 2 일, 4 일, 7 일, 10 일, 및 14 일 후에 피를 뽑고, 혈액 내 항체 농도를 하기와 같이 측정하였다. 0.5 ㎍/ml N-mANGPTL4 50 ㎕ 로 각 웰을 코팅하는 것을 제외하고는, 실시예 K 에서 상기 논의된 바와 같이 ELISA 를 수행하였다. 마우스 혈청의 하기 희석액을 ELISA 로 측정하였다 : 1:10³, 1:10⁴, 1:10⁵, 1:10⁶. 14D12 0.08 ㎍/ml, 0.4 ㎍/ml, 2 ㎍/ml, 및 10 ㎍/ml 을 함유하는 표준을 마우스 혈청 희석액과 동시에 시험하였다.

상기 실험의 결과를 도 35 에 나타내었다. 패널 A 는 시간 경과에 따른 14D12 농도 및 단식된 혈청 트리글리세리드 수준의 플롯을 보여준다. 주사 후 약 24 시간째에 14D12 농도 피크가 나타난 한편, 단식된 혈청 트리글리세리드 농도는 주사 후 약 96 시간째에 최소에 도달하였고, 주사 후 336 시간 이상까지 저하된 채로 유지되었으며, 이 때 실험을 종료하였다. 패널 B 는 시간 경과에 따른 14D12 농도 및 단식된 총 콜레스테롤 수준의 플롯을 보여주었다. 상기 언급된 바와 같이, 14D12 농도는 주사 후 약 24 시간째에 피크에 도달하였다. 단식된 총 콜레스테롤은 주사 후 약 168 시간째에 최소에 도달하였고, 주사 후 336 시간 이상까지 저하된 채로 유지되었으며, 이 때 실험을 종료하였다.

V. 인간 ANGPTL4 을 과발현하는 마우스 내 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 투여

특정 단일클론 항체가 인간 ANGPTL4 를 과발현하는 마우스에서 단식된 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤을 감소시킬 수 있는지 알아보기 위해, Ad5-hAngptl4T (상기 실시예 B.2. 에서 기술됨) 를 C57 알비노 마우스의 꼬리 정맥에 1 x 10⁹ IU/마우스로 주사하였다. 각각 5 마리의 마우스로 된 총 4 개의 군에 Ad5-hAngptl4T 를 주사하였다. 4 개의 군의 각각에 또한 바이러스 감염과 동시에 항체 30 mg/kg 을 주사하였다. 주사된 항체는 항-KLH, 14D12, 15F2, 및 90B4 이었다. 4 일 후에, 단식된 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 마우스에서 측정하였다.

도 36 은 상기 실험에서 마우스 내의 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여준다. 각 군에 있는 5 마리의 마우스 각각은 도 36 에서 상이한 기호로 나타내어져 있다. 항-KLH 로 주사된 마우스는 약 750 mg/dl 및 약 1900 mg/dl 사이의 혈청 트리글리세리드 수준을 가졌다. 14D12 로 주사된 마우스 중 3 마리의 혈청 트리글리세리드 수준은 항-KLH 로 주사된 마우스의 것 미만이었다. 14D12 로 주사된 나머지 마우스는 항-KLH 로 주사된 마우스에 비해 상승된 트리글리세리드 수준을 가졌다. 15F2 로 주사된 마우스 중 3 마리의 혈청 트리글리세리드 수준은 항-KLH 로 주사된 마우스의 것보다 미만이었으며, 한편 15F2 로 주사된 나머지 2 마리의 마우스의 혈청 트리글리세리드 수준은 항-KLH 로 주사된 마우스와 유사하였다. 마지막으로, 90B4 으로 주사된 마우스 중 3 마리의 혈청 트리글리세리드 수준은 항-KLH 로 주사된 마우스의 것보다 미만이었으며, 한편 90B4 로 주사된 나머지 2 마리의 마우스는 항-KLH 로 주사된 마우스에 비해 상승된 혈청 트리글리세리드 수준을 가졌다.

결과는, ANGPTL4 에 대한 항체로 주사된 마우스의 약 절반이 항-KLH 항체로 주사된 마우스에 비해 감소된 혈청 트리글리세리드 수준을 가졌음을 보여준다. ANGPTL4 에 대한 항체로 주사된 마우스 중 일부는 혈청 트리글리세리드 수준이 상승되었으며, 이는 Ad-hANGPTL4T 감염의 변이 및 간에서의 가능한 발현으로 인한 것일 수 있다.

도 37 은 상기 실험에서 마우스 내의 단식된 총 콜레스테롤 수준을 보여준다. 각 군의 5 마리의 마우스 각각은 도 36 에서와 동일한 기호로서 나타내어진다. 항-KLH 로 주사받은 마우스의 5 마리 모두는 약 180 mg/dl 내지 약 240 mg/dl 의 총 콜레스테롤 수준을 가졌다. 14D12 로 주사받은 마우스 중 3 마리는 항-KLH 로 주사받은 마우스의 것 미만의 총 콜레스테롤 수준을 가졌다. 14D12 로 주사받은 나머지 2 마리의 마우스는 항-KLH 로 주사받은 마우스의 것 초과의 총 콜레스테롤 수준을 가졌다. 15F2 로 주사받은 마우스 중 4 마리는 항-KLH 로 주사받은 마우스의 것 미만의 총 콜레스테롤 수준을 가졌으나, 한편 15F2 로 주사받은 1 마리의 마우스의 총 콜레스테롤 수준은 항-KLH 로 주사받은 마우스와 유사하였다. 마지막으로, 90B4 로 주사받은 마우스 중 2 마리의 총 콜레스테롤 수준은 항-KLH 로 주사받은 마우스의 것보다 더 낮았으며, 한편 90B4 로 주사받은 마우스 중 1 마리는 항-KLH 로 주사받은 마우스와 유사한 콜레스테롤 수준을 가졌으며, 90B4 로 주사받은 마우스 중 1 마리는 항-KLH 로 주사받은 마우스보다 더 큰 총 콜레스테롤 수준을 가졌다.

결국, Ad5-hANGPTL4T 로 감염되고 ANGPTL4 에 대한 항체로 주사된 마우스의 대략 절반은 Ad5-hANGPTL4T 로 감염되고 항-KLH 로 주사된 마우스보다 더 낮은 총 콜레스테롤 수준을 가졌다. 또, 상승된 콜레스테롤 수준을 갖는, Ad5-hANGPTL4T 로 감염되고 ANGPTL4 에 대한 항체로 주사된 마우스는 Ad5-ANGPTL4T 감염의 변이 및 간에서의 가능한 발현의 결과일 수 있다.

상기 결과는, 항체 14D12, 15F2, 및 90B4 의 주사는 인간 ANGPTL4 를 과발현하는 마우스에서 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤을 감소시킬 수 있음을 보여준다.

W. LDLr 녹아웃 마우스에 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 투여

LDLr 녹아웃 마우스는 특히 고지방 식이로 영양공급되는 경우 상승된 혈청 콜레스테롤 수준을 가진 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, [Ishibashi 등 (1993) J. Clin . Invest . 92 :883-93] 를 참조한다. ANGPTL4 에 대한 특정 단일클론 항체가 LDLr 녹아웃 마우스에서 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 감소시킬 수 있는지 알아보기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 12- 내지 13-주령 LDLr 녹아웃 마우스 (Jackson Laboratories, 계통 B6.129S7-Ldlr ^tm1Her /J) 15 마리로 된 3 개의 군을 비히클 단독, 30 mg/kg 항-KLH, 또는 30 mg/kg 14D12 으로 복강내 주사하였다. 각각의 마우스는 15 주 동안 주 당 1 회 주사받았다. 15 마리의 마우스의 4 번째 군은 처리하지 않은 채 두었다. 제 1 주사일부터 시작해서, 모든 마우스에 Clinton 식이요법 (Research Diets, 제품 번호 D12107) 으로 영양공급하였다.

단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 15 주의 마지막에 각각의 마우스에서 측정하였다. 도 38 을 참조한다. 14D12 로 주사된 마우스에서의 혈청 트리글리세리드 수준은 항-KLH, 비히클로 주사된 마우스, 또는 비처리 마우스에서의 혈청 트리글리세리드 수준보다 유의하게 더 낮았다.

단식된 총 콜레스테롤 수준을 15 주의 마지막에 각각의 마우스에서 측정하였다. 도 38 을 참조한다. 14D12 로 주사된 마우스에서의 총 콜레스테롤 수준은 항-KLH, 비히클로 주사된 마우스, 또는 비처리 마우스에서의 총 콜레스테롤 수준보다 유의하게 더 낮았다.

상기 실험에서, 14 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 LDLr 녹아웃 마우스는 14 주 동안 매주 항-KLH 또는 비히클로 주사받은 LDLr 녹아웃 마우스에 비교해, 포도당 내성 또는 인슐린 수준에서 차이가 없었다. 더욱이, 상기 실험에서, 8 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 마우스 및 8 주 동안 매주 항-KLH 또는 비히클로 주사받은 마우스 사이에, 체지방 함량, 체지방 %, 또는 제 지방량의 차이가 없었다. 마지막으로, 15 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 마우스의 대동맥 트리 (tree) 내의 플라크의 % 는 상기 실험에서 15 주 동안 매주 항-KLH 또는 비히클로 주사받은 마우스의 대동맥 트리 내의 플라크의 % 와 통계학적으로 유의하게 다르지 않았다 (데이타 나타나지 않음).

이러한 결과는, 14D12 가 LDLr 녹아웃 마우스에서 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 저하시킬 수 있음을 보여주었다. 상기 실험에서, 그러나, 단일클론 항체 14D12 는 상기 마우스에서 증가된 포도당 내성 또는 인슐린 수준의 변화를 야기하지 않았다. 상기 실험에서, 단일클론 항체 14D12 는 상기 마우스에서 체내 조성물을 변경시키거나, 또는 대동맥 트리 내의 플라크의 % 를 감소시키지 않았다. 또한, 실험의 말기에, 14D12 를 15 주 동안 매주 주사받은 LDLr 녹아웃 마우스 13 마리 중 한 마리는 복부 팽만을 가졌고, 한편 14D12 를 15 주 동안 매주 주사받은 LDLr 녹아웃 마우스 13 마리 중 2 마리는 장간막 림프절 및 림프구에서 전형적인 병변을 가졌다. 마지막으로, 혈청 염증 사이토카인은 항-KLH 또는 비히클을 받은 마우스에 비해, 14D12 를 15 주 동안 매주 주사받은 LDLr 녹아웃 마우스에서 상승되지 않았다 (데이타 나타나지 않음).

다음, LDLr 녹아웃 마우스에 14D12 를 단일 주사한 효과를 측정하였다. 각각의 마우스는 30 mg/kg (체중) 의 항-KLH 또는 14D12 로 단일 복강내 주사받았다. 6 마리의 마우스는 14D12 로 주사받았고, 5 마리의 마우스는 항-KLH 로 주사받았다. 4 일 후에, 마우스의 단식된 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 측정하였다.

단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 도 42 에 나타내었다. 14D12 의 단일 주사는 4 일 후에 혈청 트리글리세리드의 68.6% 감소를 초래하였다. 상기 결과는 통계학적으로 유의하였다. 단식된 총 콜레스테롤 수준을 도 43 에 나타내었다. 14D12 는 상기 실험에서 통계학적으로 유의한 범위로 콜레스테롤 수준을 감소시키지 않았다.

이러한 결과는, 상기 실험에서 시험된 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 단일 주사가 LDLr 녹아웃 마우스에서 혈청 트리글리세리드의 유의한 감소를 초래하였음을 보여주었다.

X. ApoE 녹아웃 마우스에 ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 투여

ApoE 녹아웃 마우스는 자발성 콜레스테롤과잉혈증을 발달시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, [Piedrahita 등 (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89(10):4471-5; and Zhang 등 (1992) Science 258(5081):468-71] 을 참조한다. ANGPTL4 에 대한 특정 단일클론 항체가 ApoE 녹아웃 마우스에서 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 감소시킬 수 있는지 알아보기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 14-주령 ApoE 녹아웃 마우스 (Taconic Aminal Models, 계통 B6.129P2-Apoe ^tm1Unc N11) 15 마리로 된 3 개의 군에 비히클 단독, 30 mg/kg 항-KLH, 또는 30 mg/kg 14D12 을 복강내 주사하였다. 각각의 마우스에 15 주 동안 매 주 1 회씩 주사하였다. 15 마리의 마우스 중 4 번째 군은 처리하지 않은 채 놔두었다. 제 1 주사일로부터 시작하여, 모든 마우스에 Western 식이요법 (Research Diets, 제품 번호 D12079B) 으로 영양공급하였다.

단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 15 주의 말기에, 각각의 마우스에서 측정하였다. 도 40 을 참조한다. 14D12 로 주사받은 마우스에서의 혈청 트리글리세리드 수준은 항-KLH 로 주사받은 마우스 또는 비처리 마우스에서의 혈청 트리글리세리드 수준보다 유의하게 더 낮았다. 그러나, 14D12 로 주사받은 혈청 트리글리세리드 수준은 상기 실험에서 비히클 단독으로 처리된 마우스에서의 혈청 트리글리세리드 수준보다 유의하게 더 낮지는 않았다.

단식된 총 콜레스테롤 수준은 15 주의 말기에 각각의 마우스에서 측정하였다. 도 41 을 참조한다. 14D12 로 주사받은 마우스에서의 총 콜레스테롤 수준은 항-KLH 또는 비히클로 주사받은 마우스에서의 총 콜레스테롤 수준보다 유의하게 더 낮지는 않았으나, 비처리된 마우스에서의 총 콜레스테롤 수준보다는 유의하게 더 낮았다.

상기 실험에서, 15 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 마우스 및 15 주 동안 매주 항-KLH 또는 비히클로 주사받은 마우스 사이에는 체지방 함량, 체지방 %, 또는 제 지방량에서 차이가 없었다. 더욱이, 15 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 마우스의 대동맥 트리에서의 플라크의 % 는 상기 실험에서 항-KLH 또는 비히클로 주사받은 마우스의 대동맥 트리에서의 플라크의 % 와 통계학적으로 유의하게 상이하지 않았다 (데이타 나타나지 않음).

상기 결과는, 14D12 가 ApoE 녹아웃 마우스에서 혈청 트리글리세리드 수준을 저하시킬 수 있음을 나타낸다. 그러나, 상기 실험에서, 단일클론 항체 14D12 는 ApoE 녹아웃 마우스에서 총 콜레스테롤 수준을 감소시키지 않았다. 상기 실험에서, 단일클론 항체 14D12 는 또한 상기 마우스 내 체내 조성물을 변경시키거나, 또는 대동맥 트리에서 플라크의 % 를 감소시키지 않았다. 또한, 상기 실험의 말기에, 15 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 ApoE 녹아웃 마우스 15 마리 중 3 마리가 복부 팽만을 가졌고, 한편 15 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 ApoE 녹아웃 마우스 15 마리 중 13 마리는 장간막 림프절 및 림프구에서 전형적인 병변을 가졌다. 마지막으로, 15 주 동안 매주 14D12 로 주사받은 ApoE 녹아웃 마우스 15 마리 중 6 마리는 유미성 복수증을 가졌다. 혈청 염증 사이토카인은 항-KLH 또는 비히클을 수여받은 마우스에 비해, 14D12 를 15 주 동안 매주 주사받은 ApoE 녹아웃 마우스에서 상승되지 않았다 (데이타 나타나지 않음).

다음, ApoE 녹아웃 마우스에서의 14D12 의 단일 주사의 효과를 측정하였다. 각각의 마우스는 항-KLH 또는 14D12 을 30 mg/kg (체중) 으로 단일 복강내 주사받았다. 6 마리의 마우스에는 14D12 를 주사하고, 7 마리의 마우스에는 항-KLH 를 주사하였다. 4 일 후에, 마우스 내 단식된 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 측정하였다.

단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 도 44 에 나타내었다. 14D12 의 단일 주사는 4 일 후에 혈청 트리글리세리드를 55.4% 감소시켰다. 상기 결과는 통계학적으로 유의하였다. 단식된 총 콜레스테롤 수준을 도 45 에 나타내었다. 14D12 의 단일 주사는 4 일 후에 혈청 트리글리세리드를 39.5% 감소시켰다. 상기 결과 또한 통계학적으로 유의하였다.

이러한 결과는, 단일클론 항체 14D12 의 단일 주사가 ApoE 녹아웃 마우스에서 혈청 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤 수준을 유의하게 감소시킬 수 있음을 나타내었다.

Y. ANGPTL4 에 대한 단일클론 항체의 db / db 마우스에의 투여

db/db 마우스는 비만 및 당뇨병성 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, [Chen 등 (1996) Cell 84 :491-495; and Chua Jr 등 (1996) Science 271 :994-996] 를 참조한다. 비만 및 당뇨병 변수에 대하여 ANGPTL4 에 대한 특정 단일클론 항체의 효과를 알아보기 위해, 하기 실험을 수행하였다.

10 마리의 db/db 마우스의 첫번째 군에 있는 각각의 마우스에 항-KLH 를 30 mg/kg (체중) 으로 피하 주사하였다. 10 마리의 db/db 마우스의 두번째 군에 있는 각각의 마우스에는 14D12 를 30 mg/kg (체중) 으로 피하주사하였다. 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 주사 전, 및 주사한 지 1 주일 후에 측정하였다. 다음, 마우스에 매주 주사하고, 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 8 주간의 주사 후에 측정하였다. 마우스는 쵸우 식이요법으로 사육하였다.

결과는 도 46 에 나타내었다. 패널 A 는 항-KLH 또는 14D12 로 단일 주사한 후 1 주일째에 단식된 혈청 트리글리세리드 수준을 보여주었다. 상기 실험에서, 14D12 의 주사는 혈청 트리글리세리드를 통계학적으로 유의한 범위로 감소시켰다. 패널 B 는 14D12 또는 항-KLH 로 8 주간의 주사를 받은 후 마우스에서의 단식된 혈청 트리글리세리드를 보여주었다. 상기 실험에서, 14D12 는 혈청 트리글리세리드를 56% 만큼 감소시켰고, 이 값은 통계학적으로 유의하였다.

혈청 포도당 및 인슐린 수준은 상기 실험에서 14D12 주사에 의해 변하지 않았다. 마우스의 체중은 상기 실험에서 14D12 주사에 의해 변하지 않았다.

Z. ANGPTL4 에 대한 특정 단일클론 항체의 서열화

14D12, 15F2, 및 90B4 의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝하고, [Gilliland et al (1996) Tissue Antigens 47: 1-20] 에서 기술된 방법의 개질된 버전을 사용하여 서열화하였다. 상기 방법은 마우스 유전적 배경에 적합한 RACE 및 PCR 프라이머를 사용하도록 개질되었다. 공통염기서열(SEQ ID NO: 15) 을 포함하여 중쇄 가변 영역의 배열은 도 47 에 나타나 있다. 또한, 각각의 항체 사이의 중쇄 가변 영역의 동종성% 를 상기 도면에 나타내었다. 14D12 (SEQ ID NO: 12) 및 15F2 (SEQ ID NO: 13) 의 중쇄 가변 영역은 99% 동일하였고, 한편 90B4 (SEQ ID NO: 14) 의 중쇄 가변 영역은 14D12 및 15F2 의 중쇄 가변 영역과 단지 40% 동일하였다.

공통염기서열(SEQ ID NO: 19) 을 포함하여 경쇄 가변 영역의 배열은 도 48 에 나타나 있다. 경쇄 가변 영역의 동종성% 또한 잘 나타나 있다. 15F2 (SEQ ID NO: 17) 및 90B4 (SEQ ID NO: 18) 의 경쇄 가변 영역은 99% 동일하였고, 한편 14D12 (SEQ ID NO: 16) 의 경쇄 가변 영역은 15F2 및 90B4 의 경쇄 가변 영역 각각과 단지 52% 및 51% 동일하였다.

AA . ANGPTL4 에 대한 특정 단일클론 항체의 에피토프 맵핑

단일클론 항체 15F2, 14D12, 및 90B4 의 에피토프를 동정하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 마우스 ANGPTL4 의 다양한 절편을 시험관 내에서 이식하였다. 절편의 위치는 표 5 에 나타내고, 절편의 서열은 표 6 (SEQ ID NO : 40 내지 48) 에 나타내었다. 표 5 의 출발 아미노산 및 종결 아미노산을 SEQ ID NO: 50 에 나타내어진 mANGPTL4 의 아미노산 서열이라고 한다.

PCR 을 사용하여 발생시킨 구축물로부터 각각의 절편을 발현시켰다. 각각의 PCR-유도 구축물은 T7 프로모터, His₆ 태그를 암호화하는 서열, 작은-유비퀴틴-유사 개질제 (SUMO) 를 암호화하는 서열, 및 ANGPTL4 절편을 암호화하는 서열을 함유하였다. PCR 구축물을 RTS E. coli 선형 템플레이트 발생 세트 (Roche Diagnostics) 및 RTS 100 E. coli HY 키트 (Roche Diagnostics) 를 사용하여 시험관 내에서 번역하였다 (둘 다 제조업자의 지시에 따라). 절편의 ANGPTL4 부분을 표 5 에서 나타낸 것처럼 "gs1", "gs2" 등이라고 한다. His 태그 및 SUMO 서열을 포함하여 시험관 내에서 번역된 단백질 절편을 도 49 에서 나타낸 바와 같이, "His-SUMO-gs1", "His-SUMO-gs2" 등이라고 한다.

시험관 내에서 번역된 단백질 절편을 N-mANGPTL4 와 함께 4 개의 SDS-PAGE 젤 상에서 분리하고, 4 개의 니트로셀룰로스 블롯에 옮겼다. 다음, 상기 블롯을 5% 비지방 건성 밀크를 함유하는 TBS (TBS-NFDM) 로 1 내지 2 시간 동안 차단하였다. 차단 후, 상기 블롯을 0.5% Tween-20 을 함유하는 TBS (TBS-Tween) 로 각 헹굼마다 5 분 동안 4 회 헹구었다. 다음, 상기 블롯을 테스터 항체 (14D12, 15F2, 90B4, 또는 항-His) 를 함유하는 TBS-NFDM 내에서 4℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기 블롯을 TBS-Tween 으로 각 헹굼마다 5 분 동안 4 회 헹구었고, 그런 다음 HRP-결합된 염소 항-마우스 항체 (Southern Biotechnology Associates) 의 1:6000 희석액을 함유하는 TBS-NFDM 내에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 블롯을 각 헹굼마다 5 분 동안 4 회 TBS-Tween 로 헹군 다음, 제조업자의 지시에 따라 Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology) 을 사용하여 발색시켰다. 대안적으로, 블롯을 Western Breeze Immunodetection Kit (Invitrogen) 를 사용하여 발색시킬 수 있다.

상기 실험의 결과를 도 49 에 나타내었다. 항체 14D12 는 상기 실험에서 단지 N-mANGPTL4 에만 결합하였다. 14D12 는 상기 실험에서 기타 절편 중 임의의 것에 결합하지 않는 것으로 보였다. 그 결과는 14D12 가 15F2 및 90B4 보다 더 약한 결합제라는 사실로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 실시예 S 및 도 33 을 참조한다. 항체 15F2 는 His-SUMO-gs1 에 결합하였다. 그 결과는, 15F2 가 mANGPTL4 (SEQ ID NO: 40) 의 Q24 및 P98 사이의 영역에 적어도 결합한다는 것을 가리킨다. 항체 90B4 는 His-SUMO-gs2 및 His-SUMO-gs4 에 결합하였다. 상기 결과는, 90B4 에피토프가 L49 및 P98 (SEQ ID NO: 41) 사이, 및 E99 및 L151 (SEQ ID NO: 43) 사이에서 mANGPTL4 의 부분을 함유한다는 것을 제안한다.

BB. siRNA

siRNA 로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 SMARTselection^TM 방법 (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO) 을 사용하여 동정하였다. 상기 방법은 표적 mRNA 의 잠재적이고 특이적인 분해의 가능성이 높은 siRNA 를 동정하기 위한 복합-성분 알고리즘을 사용한다. siRNA 로서 사용하기 위한 4 개의 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 상기 방법을 사용하여 동정하였다. 4 개의 올리고뉴클레오티드의 서열을 SEQ ID NO :5-8 에 나타내었다.

올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 ANGPTL4 를 암호화하는 mRNA 의 분해, 및 따라서 발현을 유도하였다. 4 개의 올리고뉴클레오티드를 단일 시약인 SMARTpool시약 (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO) 내에서 조합하고, 이를 완충 RNase-없는 용액 내에서 약 20 μM 의 최종 농도로 재현탁시켰다. 올리고뉴클레오티드를 약 1-200 nM siRNA 의 농도에서 표준 트랜스펙션 방법을 사용하여 배양된 세포로 트랜스펙션시켰다.

세포-기재 어세이를 사용하여, 올리고뉴클레오티드가 인간 ANGPTL4 를 암호화하는 mRNA 의 분해를 시험관 내에서 유도한다는 것을 확인하였다. 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션된 Hela 세포를 6-웰 플레이트에 심고, 5% CO₂ 보충된 37℃ 인큐베이터에서 밤새 성장하도록 놔두었다. 심는 밀도는 약 100,000 세포/웰이었다. 다음날, 올리고뉴클레오티드를 1 ml 성장 배지 중 약 10-100 nM 의 최종 농도에서 세포에 트랜스펙션시켰다. 세포를 트랜스펙션 후 48 시간째에 수합하였다. 총 RNA 를 Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 단리하였다. Angptl4 mRNA 의 양을 노던 블롯 분석에 의해 분석하였다.

상기 실시예는, 특히 마우스 ANGPTL4 에 대한 특정 중화 단일클론 항체 및 마우스에서 상기 항체의 생체 내에서의 효과를 기술하는 한편 당업자는 인간 ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체가 발생될 수 있고, 그러한 항체가 인간에서 동일하거나 또는 유사한 생체 내 효과를 가질 것이라는 것을 쉽게 알 것이다. 그러한 결론은 부분적으로는, 인간 및 마우스 ANGPTL4 가 구조 및 기능적 특징을 공유하는 진화적으로 보존된 단백질이라는 관찰을 바탕으로 한 것이다. 예를 들어, [Ge 등 (2004) J. Biol . Chem . 279:2038-2045] 를 참조한다. 예를 들어, 인간 및 마우스 ANGPTL4 는 약 77% 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 인간 및 마우스 ANGPTL4 는 또한 N-말단 코일형-코일 도메인 및 C-말단 피브리노겐-유사 도메인과 같은 공통적인 2 차 구조 요소를 공유한다. 더욱이, 마우스에서 과발현되는 경우 혈청 지질 수준을 증가시키는 인간 ANGPTL4 의 능력에 의해 나타내어진 바와 같이, 인간 ANGPTL4 는 마우스 ANGPTL4 와 유사한 기능을 가진다. 파트 VI.B.2 를 참조한다.

마우스가 중화 항체를 사용한 다양한 상태 및 질환의 치료 모델로서 일반적으로 사용된다는 것이 또한 일반적으로 당업계에 인지되어 있다. 예를 들어, 중화 항체는 마우스에서 프리온 질환, 당뇨병, 및 염증을 치료하기 위해 사용되어 왔다. 예를 들어, [White 등 (2003) Nature 422:80-83] ; [Cailleau 등 (1997) 당뇨병 46:937-940] ; 및 [Lochner 등 (2002) J. Immunol . Methods 259:149-157] 를 참조한다. 후자의 연구에서, 마우스 IL-18 을 중화시키는 단일클론 항체를 IL-18 부족 마우스에서 제조하였다. 상기 마우스 단일클론 항체는 야생형 마우스에서 리포폴리사카라이드-유도 염증 반응을 억제할 수 있었다. 따라서, 당업자는 전술한 실시예가 인간 의학적 상태의 치료에서 인간 ANGPTL4 에 대한 중화 단일클론 항체의 용도를 지지한다고 결론을 내릴 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Lexicon Genetics Incorporated Lee, E-Chiang Landes, Gregory Chung, Kyu Chen, Ling Desai, Urvi Powell, David Reed Hong, Seokjoo <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ANGPTL4 <130> 7705.24-304 <150> 60/642,022 <151> 2005-01-07 <160> 50 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 410 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly 50 55 60 Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg 85 90 95 Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln 100 105 110 Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala 115 120 125 Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu 130 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<222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 20 Arg His Glu Gln Ser Thr Xaa Val Pro His Tyr Pro Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Arg Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Arg His Glu Gln Ser Thr Val Val Pro His Tyr Pro Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Arg Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Thr Ile Ser Thr Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Arg His Glu Gln Ser Thr Ile Val Pro His Tyr Pro Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Asp Tyr Ser Ile His 1 5 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Arg Trp Lys Thr Ile Gln Ala Pro Phe 1 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu His 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Gln Asn Gly His Ser Phe Pro 1 5 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn 1 5 10 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Leu Gln Ser Tyr Asp Phe Pro 1 5 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Leu Gln Ser Tyr Asp Phe Pro 1 5 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 39 Thr Ile Ser Thr Asp Xaa Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp 1 5 10 15 Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu 20 25 30 Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg 35 40 45 Arg Met 50 <210> 41 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys 20 25 30 Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg 35 40 45 Val Pro 50 <210> 42 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro 1 5 10 15 Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr 20 25 30 Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln 35 40 45 Gln Leu 50 <210> 43 <211> 53 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys 1 5 10 15 Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln 20 25 30 Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser 35 40 45 Gln Ile Asp Leu Leu 50 <210> 44 <211> 57 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu 1 5 10 15 Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His 20 25 30 Leu Asp Asn Gly Val Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Arg Leu Pro Lys 35 40 45 Met Thr Gln Leu Ile Gly Leu Thr Pro 50 55 <210> 45 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met 20 25 <210> 46 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro 1 5 10 15 Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg Val Pro 20 25 <210> 47 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys 1 5 10 15 Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu 20 25 <210> 48 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu 1 5 10 15 Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu 20 25 <210> 49 <211> 1313 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 49 gttccggagt cctagcgttg ctgcacccaa ggccaccccc agaatcatgc gctgcgctcc 60 gacagcaggc gctgccctgg tgctatgcgc ggctactgcg gggcttttga gcgcgcaagg 120 gcgccctgca cagccagagc caccgcgctt tgcatcctgg gacgagatga acttgctggc 180 tcacgggctg ctacagctcg gccatgggct gcgcgaacac gtggagcgca cccgtgggca 240 gctgggcgcg ctggagcgcc gcatggctgc ctgtggtaac gcttgtcagg ggcccaaggg 300 aaaagatgca cccttcaaag actccgagga tagagtccct gaaggccaga ctcctgagac 360 tctgcagagt ttgcagactc agctcaaggc tcaaaacagc aagatccagc aattgttcca 420 gaaggtggcc cagcagcaga gatacctatc aaagcagaat ctgagaatac agaatcttca 480 gagccagata gacctcttgg cccccacgca cctagacaat ggagtagaca agacttcgag 540 gggaaagagg cttcccaaga tgacccagct cattggcttg actcccaacg ccacccactt 600 acacaggccg ccccgggact gccaggaact cttccaagaa ggggagaggc acagtggact 660 tttccagatc cagcctctgg ggtctccacc atttttggtc aactgtgaga tgacttcaga 720 tggaggctgg acagtgattc agagacgcct gaacggctct gtggacttca accagtcctg 780 ggaagcctac aaggatggct tcggagatcc ccaaggcgag ttctggctgg gcctggaaaa 840 gatgcacagc atcacaggga accgaggaag ccaattggct gtgcagctcc aggactggga 900 tggcaatgcc aaattgctcc aatttcccat ccatttgggg ggtgaggaca cagcctacag 960 cctgcagctc actgagccca cggccaatga gctgggtgcc accaatgttt cccccaatgg 1020 cctttccctg cccttctcta cttgggacca agaccatgac ctccgtgggg accttaactg 1080 tgccaagagc ctctctggtg gctggtggtt tggtacctgt agccattcca atctcaatgg 1140 acaatacttc cactctatcc cacggcaacg gcaggagcgt aaaaagggta tcttctggaa 1200 aacatggaag ggccgctact atcctctgca ggctaccacc ctgctgatcc agcccatgga 1260 ggctacagca gcctcttagc ctcctcactg gagcctggtt ccaggctaag aag 1313 <210> 50 <211> 410 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly 50 55 60 Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg 85 90 95 Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln 100 105 110 Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala 115 120 125 Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu 130 135 140 Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val 145 150 155 160 Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Arg Leu Pro Lys Met Thr Gln Leu Ile 165 170 175 Gly Leu Thr Pro Asn Ala Thr His Leu His Arg Pro Pro Arg Asp Cys 180 185 190 Gln Glu Leu Phe Gln Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile 195 200 205 Gln Pro Leu Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser 210 215 220 Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp 225 230 235 240 Phe Asn Gln Ser Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln 245 250 255 Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asn 260 265 270 Arg Gly Ser Gln Leu Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala 275 280 285 Lys Leu Leu Gln Phe Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr 290 295 300 Ser Leu Gln Leu Thr Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn 305 310 315 320 Val Ser Pro Asn Gly Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp 325 330 335 His Asp Leu Arg Gly Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly 340 345 350 Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe 355 360 365 His Ser Ile Pro Arg Gln Arg Gln Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp 370 375 380 Lys Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu 385 390 395 400 Ile Gln Pro Met Glu Ala Thr Ala Ala Ser 405 410

Claims (61)

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6. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하고, ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체로서, 단일클론 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 SEQ ID NO : 12 의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 SEQ ID NO : 16 의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체.
7. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하고, ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체로서, 단일클론 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 SEQ ID NO : 14 의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 SEQ ID NO : 18 의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체.
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20. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하고, ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체로서, 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄가 SEQ ID NO: 21 에 나타나 있는 CDR1, SEQ ID NO: 22 에 나타나 있는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 23 에 나타나 있는 CDR3 을 포함하는 항체로서, 경쇄가 SEQ ID NO: 30 에 나타나 있는 CDR1, SEQ ID NO: 31 에 나타나 있는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 32 에 나타나 있는 CDR3 을 포함하는 항체.
21. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하고, ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체로서, 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄가 SEQ ID NO: 27 에 나타나 있는 CDR1, SEQ ID NO: 28 에 나타나 있는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 29 에 나타나 있는 CDR3 을 포함하는 항체로서, 경쇄가 SEQ ID NO: 33 에 나타나 있는 CDR1, SEQ ID NO: 34 에 나타나 있는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 35 에 나타나 있는 CDR3 을 포함하는 항체.
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23. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하고, ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체로서, 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄가 SEQ ID NO: 21 에 나타나 있는 CDR1, SEQ ID NO: 25 에 나타나 있는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 26 에 나타나 있는 CDR3 을 포함하는 항체로서, 경쇄가 SEQ ID NO: 33 에 나타나 있는 CDR1, SEQ ID NO: 34 에 나타나 있는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 35 에 나타나 있는 CDR3 을 포함하는 항체.
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36. 제 6 항, 제 7 항, 제 20 항, 제 21 항 또는 제 23 항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 포함하는 약학적 조성물로서, 지질 대사 장애의 치료를 위한 약학적 조성물.
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38. 제 6 항, 제 7 항, 제 20 항, 제 21 항 또는 제 23 항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 포함하는 약학적 조성물로서, 고중성지방혈증, 콜레스테롤과잉혈증, 비만, 당뇨병 및 허혈성 심질환으로부터 선택되는 상태의 치료를 위한 약학적 조성물.
39. 앤지오포이에틴-유사 단백질 4 (ANGPTL4) 에 특이적으로 결합하고, ANGPTL4 의 하나 이상의 활성을 중화시키는 단일클론 항체로서, 단일클론 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 SEQ ID NO : 13 의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 SEQ ID NO : 17 의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체.
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