EA016185B1 - Моноклональное антитело или его фрагмент к подобному ангиопоэтину белку 4 (angptl4) и их применение - Google Patents

Abstract

В изобретении предоставлены моноклональные антитела, которые специфично связываются с ANGPTL4. Предоставлены моноклональные антитела, которые нейтрализуют по меньшей мере один вид активности ANGPTL4. Предоставлены способы лечения нарушения липидного метаболизма с использованием нейтрализующих моноклональных антител.

Description

(57) В изобретении предоставлены моноклональные антитела, которые специфично связываются с ΑΝΟΡΤΕ4. Предоставлены моноклональные антитела, которые нейтрализуют по меньшей мере один вид активности ΑΝΟΡΤΕ4. Предоставлены способы лечения нарушения липидного метаболизма с использованием нейтрализующих моноклональных антител.

016185 В1

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 60/642022, поданной 7 января 2005 г., которая включена сюда в виде ссылки для любых целей.

I. Область техники, к которой относится изобретение

Предоставляются моноклональные антитела, которые специфично связываются с подобным ангиопоэтину белком 4 (АЫСРТЬ4). Предоставляются способы применения моноклональных антител, которые специфично связываются с подобным ангиопоэтину белком 4 (АЫСРТЬ4). Предоставляются фармацевтические композиции, включающие в себя моноклональные антитела, которые специфично связываются с подобным ангиопоэтину белком 4 (ΑΝ6ΡΙΈ4).

II. Введение

Подобный ангиопоэтину белок 4 консервативен среди нескольких видов млекопитающих, Се е! а1. (2004) 1. ΒίοΙ. С11ет. 279:2038-2045. Подобный ангиопоэтину белок 4 содержит Ν-концевой домен с двойной спиралью и С-концевой фибриногенподобный домен, К1т е! а1. (2000) Вюейет. 1. 345:603-610. Ν-концевой сверхскрученный домен опосредует олигомеризацию подобного ангиопоэтину белка 4, Се е! а1. (2004) 1. ΒίοΙ. Сйет. 279:2038-2045. Олигомеризованный подобный ангиопоэтину белок 4 претерпевает протеолитический процессинг ίη νίνο, что приводит к расщеплению фибриногенподобного домена, Се е! а1. (2004) 1. ΒίοΙ. Сйет. 279:2038-2045.

III. Сущность изобретения

В некоторых вариантах осуществления предоставляется моноклональное антитело, которое специфично связывается с АНСРТЕ4 и нейтрализует по меньшей мере один вид активности ΑNСΡТ^4. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является мышиным моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является гуманизированным моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело человека. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело повышает активность ЬРЬ. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело снижает уровень по меньшей мере одного сывороточного липида ίη νίνο.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело связывается с эпитопом в области 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1 или 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 50 от остатка 21 до остатка 174. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело связывается с эпитопом в области 8ЕС Ш ΝΟ: 2 от остатка 21 до остатка 169. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой 14Ό12. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой 15Р2. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой 90В4. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфично связывается с тем же эпитопом, что и 14Ό12. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфично связывается с тем же эпитопом, что и 15Р2. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфично связывается с тем же эпитопом, что и 90В4.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, специфично связывающееся с АНСРТБД. включающее в себя тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 12-14; по меньшей мере одну СЭЯ, включающую в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС Ш ΝΟ: 21, 39 и 20; или по меньшей мере одну СЭЯ, включающую в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 27-29; где антитело нейтрализует по меньшей мере один вид активности АНСРТБ4. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, специфично связывающееся с АНСРТБА включающее в себя легкую цепь, где легкая цепь включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 16-18; по меньшей мере одну СЭЯ, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 30-32; или по меньшей мере одну СЭЯ, включающую в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 33-35, где антитело нейтрализует по меньшей мере один вид активности АНСРТБ4.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, которая включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 12-14. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну СЭЯ, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕС Ш ΝΟ: 21, 39 и 20. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну СЭЯ, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 27-29. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, которая включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 16-18. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну СЭЯ, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 30-32. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну СЭЯ, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 33-35.

В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя тяжелую цепь, которая содержит

- 1 016185 аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ N0: 12. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 13. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 14.

В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 16. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 17. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 18.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую в себя СБК.1, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 21, СБВ2. приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 39, и СБК.3, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 20. В некоторых вариантах осуществления X в 8Е0 ΙΌ N0: 20 является любой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления X в 8Е0 ΙΌ N0: 20 является гидрофобной аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления X в 8Е0 ΙΌ N0: 20 представляет собой глицин, лейцин, изолейцин, валин или аланин. В некоторых вариантах осуществления X в 8Е0 ΙΌ N0: 20 представляет собой валин или изолейцин. В некоторых вариантах осуществления X в 8Е0 ΙΌ N0: 39 является любой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления X в 8Е0 ΙΌ N0: 39 представляет собой глицин, аспартат или тирозин. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую в себя СБК.1, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 27, СБК.2, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 28, и СБК.3, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 29.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, содержащую СЭРЕ приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 30, СБК.2, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 31, и СБК.3, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 32. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, включающую СБК.1, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 33, СБК.2, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 34, и СБК.3, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 35.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления оно представляет собой кеРу-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой РаЬ-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой Р(аЬ')₂-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой РаЬ'.

В некоторых вариантах осуществления антитело против АХСРТЕ4 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 40. В некоторых вариантах осуществления антитело против АХСРТЕ4 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 41. В некоторых вариантах осуществления антитело против АХСРТЕ4 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 43. В некоторых вариантах осуществления антитело против АХСРТЕ4 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 41, и связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 43.

В некоторых вариантах осуществления предоставляется фармацевтическая композиция, включающая в себя моноклональное антитело, которое специфично связывается с АХСРТЕ4 и нейтрализует по меньшей мере одну активность АХСРТЕ4. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения нарушения липидного метаболизма, где способ включает в себя введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ снижения уровня одного или нескольких липидов сыворотки, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения триглицеридемии, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения гиперхолестеринемии, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения ожирения, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения диабета, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции.

IV. Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов, холестерина и свободных жирных кислот (СЖК) у мышей дикого типа в различные моменты времени после инъекции аденовирусной конструкцией, гиперэкспрессирующей полноразмерный мышиный АХСРТЕ4, как описано в примере В.1.

На фиг. 2 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Аб5-шАпдр!1-4Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный АХСРТЕЖ как описано в примере В.1.

На фиг. 3 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого

- 2 016185 типа через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Аб5-тАпдр11-4Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный АЫСРТЬ4, как описано в примере В.1.

На фиг. 4 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа через четверо суток после инъекции аденовирусной конструкции (Аб5-тАпдр11-4Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный АЫСРТЬ4, как описано в примере В.2.

На фиг. 5 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа через четверо суток после инъекции аденовирусной конструкции (Аб5-тАпдр11-4Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный АЫСРТЬ4, как описано в примере В.2.

На фиг. 6 показаны сывороточные концентрации триглицеридов, холестерина и свободных жирных кислот (СЖК) у мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по Апдр114 (НОМ), подвергнутых различным условиям диеты, как описано в примере С.

На фиг. 7 показаны масса тела и количество жира в теле мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по Апдр114 (НОМ), которые получали стандартную диету (корм) или диету с высоким содержанием жиров (ΗΡΌ), как описано в примере С.

На фиг. 8 показан уровень активности эндогенной липопротеинлипазы (ЬРЬ) в мышах дикого типа (^Т) и нокаут-мышах по Апдр114 (НОМ) в состояниях с питанием и натощак, как описано в примере Ό.

На фиг. 9А показаны уровни липидов в печени у мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по Апдр114 (НОМ), получавших стандартную диету (корм) или диету с высоким содержанием жиров (ΗΡΌ). На фиг. 9В показано гистохимическое окрашивание срезов печени мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по Апдр114 (НОМ), получавших стандартную диету (корм) или диету с высоким содержанием жира (ΗΡΌ), как описано в примере Е.

На фиг. 10 показано содержание липидов в миоцитах мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по Апдр114 (НОМ), получавших диету с высоким содержанием жира (ΗΡΌ), как описано в примере Е.

На фиг. 11, панели А и В, показаны уровни глюкозы и инсулина у мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по Апдр114 (НОМ), получавших стандартную диету (корм) или диету с высоким содержанием жира (ΗΡΌ), как описано в примере Р. На панелях С и Ό показана толерантность к глюкозе и инсулину в мышах дикого типа (^Т) и нокаут-мышах Апдр114 (НОМ), получавших диету с высоким содержанием жира (ΗΡΌ).

На фиг. 12 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по Апдр114 через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Аб5-тАпдр!1-4Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный АЫОРТЕ4, как описано в примере О.

На фиг. 13 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по Апдр114 через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Аб5-тАпдр!1-4Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный АЫОРТЕ4, как описано в примере О.

На фиг. 14 показана активность липопротеинлипазы (ЬРЬ) ш νίΐτο в присутствии возрастающих количеств полноразмерного мышиного АЫОРТЕ4, как описано в примере 1.

На фиг. 15 показаны некоторые нейтрализующие моноклональные антитела против мышиного АЫОРТЕ4 (4А8, 14Ό12, и 15Р2), которые сохраняли активность ЬРЬ от ингибирования АЫОРТЕ4 ш νίΐτο, как описано в примере Ь.

На фиг. 16 показаны результаты экспериментов для классификации по эпитопам моноклональных антител 4А8, 14Ό12 и 15Р2, описанных в примере О.

На фиг. 17 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших стандартную диету, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного АЫОРТЕ4, как описано в примере Р.

На фиг. 18 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших стандартную диету, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного АЫОРТЕ4, как описано в примере Р.

На фиг. 19 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации свободных жирных кислот (РРА) у мышей дикого типа, получавших стандартную диету, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного АЫОРТЕ4, как описано в примере Р.

На фиг. 20 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного АЫОРТЕ4, как описано в примере Р.

На фиг. 21 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного АЫОРТЕ4, как описано в примере Р.

На фиг. 22 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, после единичной инъекции моноклональных антител против мышиного АЫОРТЕ4 и после еженедельных инъекций моноклональных антител против мышиного АЫОРТЕ4 в течение 5 недель, как описано в примере Р.

На фиг. 23 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, после единичной инъекции моноклональных

- 3 016185 антител против мышиного ЛЫСРТЬД и после еженедельных инъекций моноклональных антител против мышиного ΑΝΟΡΤΕ4 в течение 5 недель, как описано в примере Р.

На фиг. 24 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации кетоновых тел у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира (ΗΕΌ), после еженедельных инъекций моноклональных антител против мышиного ΑΝΟΡΤΕ4 в течение 5 недель, как описано в примере Р.

На фиг. 25 показаны измеренные натощак уровни сывороточного триглицерида, общего холестерина, липопротеидов высокой плотности (НЭЬ) и липопротеидов низкой плотности (ЬЭЬ) у самцов мышей дикого типа (^Т), гетерозигот (11сЬ). и нокаут-мышей (йоги) (панель А) и у самок мышей дикого типа (^Т) и нокаут (йоги) (панель В), получавших стандартную диету (корм), как описано в примере С.

На фиг. 26 показаны измеренные натощак уровни сывороточного триглицерида, общего холестерина, липопротеидов высокой плотности (НЭЬ) и липопротеидов низкой плотности (Ь-ЬЙ) у самцов мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей (йоги), получавших диету с высоким содержанием жира (ΗΕΌ), как описано в примере С.

На фиг. 27 показана масса жира тела в граммах у самок (панель А) и самцов (панель В) мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по ΑΝΟΡ^Τ (Ноги), получавших диету с высоким содержанием жира (ΗΕΌ), как описано в примере С.

На фиг. 28 показано потребление пищи (панель А) и процент фекального жира (панель В) у мышей дикого типа (^Т) и нокаут-мышей по ΑΝΟΡΊΕΤ (Ноги), получавших диету с высоким содержанием жира, как описано в примере С.

На фиг. 29 показано число мышат дикого типа, гетерозиготных и нокаут-мышат, родившихся при скрещивании гетерозиготных родителей, как обсуждается в примере С.

На фиг. 30 показана выживаемость мышей дикого типа и нокаут-мышей, получавших диету с высоким содержанием жира (ΗΕΌ), как описано в примере С.

На фиг. 31 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших инъекцию моноклональных антител против ΑΝ^Ρ^Α как описано в примере В.

На фиг. 32 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших инъекцию моноклональных антител против ΑΝΟΡΊΕΤ, как описано в примере В.

На фиг. 33 показано относительное сродство связывания моноклональных антител 14Ό12, 15Е2 и 90В4 в отношении N-тΑNСΡΤ^4 (панель А) и Ν-ΒΑΝ6Ρ^4 (панель В), как описано в примере 8.

На фиг. 34 показано снижение в процентах измеренного натощак уровня триглицеридов в сыворотке у мышей дикого типа на четвертые сутки (панель А) и седьмые сутки (панель В) после инъекции 14Ό12 или анти-КЕН, как описано в примере Т.

На фиг. 35, панели А, показан график концентрации 14Ό12 и сывороточной концентрации триглицеридов у мышей дикого типа в зависимости от времени после единичной инъекции 14Ό12, как описано в примере и. На панели В показан график концентрации 14Ό12 и измеренной натощак концентрации общего холестерина у мышей дикого типа в зависимости от времени после единичной инъекции 14Ό12, как описано в примере и.

На фиг. 36 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей, которые гиперэкспрессируют человеческий ΑΝΟΡ^4, через четверо суток после инъекции моноклональным антителом против КЕН, 14Ό12, 15Е2 или 90В4, как описано в примере V.

На фиг. 37 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей, которые гиперэкспрессируют человеческий ΑΝΟΡΙ'Ε4, через четверо суток после инъекции моноклональным антителом против КЕН, 14Ό12, 15Е2 или 90В4, как описано в примере V.

На фиг. 38 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по ЬЭЬг после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-КЬН или 14Ό12, как описано в примере

На фиг. 39 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по ЬЭЬг после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-КЕН или 14Ό12, как описано в примере

На фиг. 40 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по АроЕ после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-КЕН или 14Ό12, как описано в примере X.

На фиг. 41 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по АроЕ после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-КЬН или 14Ό12, как описано в примере X.

На фиг. 42 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по Шйг через четверо суток после единичной инъекции анти-КЬН или 14Ό12, как описано в примере ^.

На фиг. 43 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по ЬЭЬг через четверо суток после единичной инъекции анти-КЬН или 14Ό12, как описано в

- 4 016185 примере

На фиг. 44 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по АроЕ через четверо суток после единичной инъекции анти-КЕН или 14Ό12, как описано в примере X.

На фиг. 45 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по АроЕ через четверо суток после единичной инъекции анти-КЕН или 14Ό12, как описано в примере X.

На фиг. 46 панели А показан измеренный натощак сывороточный уровень триглицеридов у мышей бЬ/бЬ до и через неделю после инъекции анти-КЕН (Стр-1) и 14Ό12 (Стр-2), как описано в примере Υ. На панели В показан сывороточный уровень триглицеридов у мышей 6Ь/6Ь после 8 еженедельных инъекций анти-КЕН или 14Ό12, как обсуждается в примере Υ.

На фиг. 47 показано выравнивание вариабельных областей тяжелой цепи 14Ό12 (8ЕС ΙΌ N0: 12), 15Е2 (8ЕС ΙΌ N0: 13) и 90В4 (8ЕС ΙΌ N0: 14), как описано в примере Ζ. Также показана консенсусная последовательность (8ЕС Ш N0: 15). Процентная гомология между каждой парой вариабельных областей тяжелой цепи показана ниже.

На фиг. 48 показано выравнивание вариабельных областей легкой цепи 14Ό12 (8ЕС ΙΌ N0: 16), 15Е2 (8ЕС ΙΌ N0: 17) и 90В4 (8ЕС ΙΌ N0: 18), как описано в примере Ζ. Также показана консенсусная последовательность (8ЕС Ш N0: 19). Процентная гомология между каждой парой вариабельных областей легкой цепи показана ниже.

На фиг. 49 показано связывание некоторых моноклональных антител против ЛХСРТБТ с фрагментами ЛХСРТЕ4. как обсуждается в примере АА.

V. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Следует понимать, что следующее далее общее описание и следующее подробное описание являются только типовыми и объяснительными, но не ограничивают изобретение, определенное в формуле изобретения.

В данной заявке применение единственного числа включает в себя множественное число, кроме конкретно обозначенных иначе случаев. В данной заявке единственное число означает по меньшей мере один, кроме конкретно обозначенных иначе случаев. В данной заявке применение или означает и/или, кроме обозначенных иначе случаев. Более того, термин включающий в себя, а также другие термины, например включает и включено, не являются ограничивающими. Также такие термины, как элемент или компонент охватывают элементы или компоненты, включающие в себя одну единицу, и элементы или компоненты, включающие в себя более одной единицы, кроме конкретно обозначенных иначе случаев.

Используемые здесь заголовки разделов предназначены только для целей структуризации и не предполагается, что они ограничивают описанный объект. Все документы или части документов, цитируемые в данной заявке, включая в качестве неограничивающих примеров патенты, заявки на выдачу патента, статьи, книги и трактаты, четко включены сюда полностью в виде ссылки для любой цели. В случае, если один или несколько из включенных литературных или сходных материалов определяет термин противоречиво по отношению к определению термина в данной заявке, данная заявка является определяющей.

А. Некоторые определения.

Термин полипептид, пептид и белок используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на полимер аминокислотных остатков. Термины относятся к полимерам аминокислот, содержащим встречающиеся в природе аминокислоты, а также полимеры аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственными химическими аналогами встречающейся в природе аминокислоты. Полимеры аминокислот могут иметь любую длину.

Используемый здесь термин антитело относится к интактному антителу или фрагменту антитела, который конкурирует с интактным антителом за связывание антигена. Фрагменты антитела включают в качестве неограничивающих примеров ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂, Εν, ксЕу, Еб, диатела и другие фрагменты антител, которые сохраняют по меньшей мере одну часть вариабельной области интактного антитела, см., например, Нибкоп с1 а1. (2003) №11игс Меб. 9:129-134. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антитела получают ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антитела получают способами рекомбинантной ДНК.

Термин нативный полипептид относится к встречающемуся в природе полипептиду. Термин нативное антитело относится к встречающемуся в природе антителу.

Термин моноклональное антитело относится к антителу, по существу, из гомогенной популяции антител, которые специфично связываются с одним и тем же эпитопом. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело секретируется гибридомой. В некоторых таких вариантах осуществления гибридому продуцируют некоторыми способами, известными специалистам в данной области, см., например, КоЫет апб М1к1ет (1975) Ха1иге, 256:495-499. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают К использованием способов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело относится к фраг

- 5 016185 менту антитела, выделенного из библиотеки фагового дисплея (см., например, С1аск§ои е! а1. (1991) Να1ите 352:624-628 и Маткк е! а1. (1991) 1. Мо1. Бю1. 222:581-597). Для других различных способов получения моноклональных антител см., например, Нат1оте апб Ьаие (1988) ЛиНЬоФек: А ЬаЬота1оту Мапиа1 (Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1оту, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ).

Химерное антитело относится к антителу, полученному из компонентов по меньшей мере из двух разных источников. В некоторых вариантах осуществления химерное антитело включает в себя часть антитела, происходящего из первого вида, слитую с другой молекулой, например, с частью антитела, происходящего из второго вида. В некоторых таких вариантах осуществления химерное антитело включает в себя часть антитела, происходящего из не относящегося к человеку животного, слитую с частью антитела, происходящей из человека. В некоторых таких вариантах осуществления химерное антитело включает в себя всю вариабельную область или ее часть от антитела, происходящего из не относящегося к человеку животного, слитую константной областью антитела, происходящего из человека.

Гуманизированное антитело относится к не являющемуся человеческим антителу, которое модифицировали так, что оно ближе совпадает (по аминокислотной последовательности) с человеческим антителом. Таким образом, гуманизированное антитело является типом химерного антитела. В некоторых вариантах осуществления модифицируют аминокислотные последовательности вне антигенсвязывающих остатков вариабельной области не относящегося к человеку антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело конструировали путем замены всей определяющей комплементарность области (СОВ) или его части в человеческом антителе всей СОК. или ее частью из другого антитела, такого как не относящееся к человеку антитело, имеющего требуемую специфичность в отношении связывания антигена. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело включает в себя вариабельные области, в которых все или, по существу, все СОВ соответствуют СОВ не относящегося к человеку антитела, и все или, по существу, все каркасные области (РВ) соответствуют РВ человеческого антитела. В некоторых таких вариантах осуществления гуманизированное антитело дополнительно включает в себя константную область (Рс) человеческого антитела.

Термин человеческое антитело относится к моноклональному антителу, которое содержит последовательности человеческого антитела и не содержит последовательности антитела из животного, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело может содержать синтетические последовательности, не находящиеся в нативных антителах. Данный термин не ограничен способом, которым получены данные антитела. Например, в различных вариантах осуществления человеческое антитело может быть получено в трансгенной мыши, путем фагового дисплея, в человеческих В-лимфоцитах, или рекомбинантными способами.

Термин нейтрализующее антитело или антитело, которое нейтрализует относится к антителу, которое снижает по меньшей мере одну активность полипептида, содержащего эпитоп, с которым данное антитело специфично связывается. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело снижает активность ίη уйто и/или ίη νί\Ό.

Термин антигенсвязывающий участок относится к части антитела, способной специфично связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок предоставлен одним или несколькими вариабельными областями антитела.

Термин эпитоп относится к любой полипептидной детерминанте, способной специфично связываться с иммуноглобулином или В-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления эпитоп представляет собой область антигена, который специфично связывается антителом. В некоторых вариантов осуществления эпитоп может включать в себя химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные или сульфонильные группы. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может иметь конкретные характеристики трехмерной структуры (например, конформационный эпитоп) и/или конкретные характеристики заряда.

Эпитоп определяется как такой же как другой эпитоп, если конкретное антитело специфично связывается с обоими эпитопами. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, имеющие различные первичные аминокислотные последовательности, могут включать в себя эпитопы, являющиеся одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления эпитопы, которые являются одинаковыми, могут иметь различные первичные аминокислотные последовательности. О различных антителах говорят, что они связываются с одним и тем же эпитопом, если они конкурируют за специфичное связывание с данным эпитопом.

Антитело специфично связывается с антигеном, когда он преимущественно распознает антиген в комплексной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя антигенсвязывающий участок, которые специфично связывается с конкретным эпитопом. В некоторых таких вариантах осуществления антитело способно связывать различные антигены, если эти различные антигены включают в себя данный конкретный эпитоп. В некоторых случаях, например, гомологичные белки из различных видов могут включать в себя один и тот же эпитоп. В некоторых вариантах осуществления говорят, что антитело специфично связывается с антигеном, когда константа диссоциации (К_с) < 1 мкМ, в некоторых вариантах осуществления когда ίη константа диссоциации < 100

- 6 016185 нМ, и, в некоторых вариантах осуществления когда константа диссоциации составляет < 10 нМ.

Термин ΑΝΟΡΤΕ4 относится к подобному ангиопоэтину белку 4 из любого позвоночного или млекопитающего, включая в качестве неограничивающих примеров человека, крупный рогатый скот, кур, грызунов, мышь, крысу, свинью, овец, приматов, обезьян и морскую свинку, кроме определенных иначе случаев. Термин также относится к фрагментам и вариантам нативного ΑΝΟΡΤΕ4, которые сохраняют по меньшей мере один вид активности нативного ΑΝΟΡΤΕ4 ίη νίνο или ίη νίΐτο. Термин охватывает полноразмерные непроцессированные формы-предшественники ΑΝΟΡΤΕ4, а также зрелые формы, возникающие в результате пост-трансляционного расщепления сигнального пептида и формы, возникающие в результате протеолитического процессинга фибриногенового домена. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный, непроцессированный мышиный ΑΝΟΡΤΕ4 имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный, непроцессированный мышиный ΑΝΟΡΤΕ4 имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный, непроцессированный человеческий ΑΝΟΡΤΕ4 имеет аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2.

Термин Лпдр114 относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей ΛΝΟΡΤΕ4.

Термин 'ΈΡΕ относится к липопротеинлипазе из любого позвоночного или млекопитающего, включая в качестве неограничивающих примеров человека, крупный рогатый скот, кур, грызунов, мышь, крысу, свинью, овец, приматов, обезьян и морскую свинку. В некоторых вариантах осуществления липопротеинлипаза катализирует гидролиз триацилглицерола в хиломикронах и липопротеидах очень низкой плотности (УЪБЬ) с образованием диацилглицерола и аниона свободной жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления липопротеинлипаза также может гидролизовать диацилглицерол.

Термин агент относится к химическому соединению, к смеси химических соединений, к биологической макромолекуле или к экстракту, полученному из биологических материалов.

Термин антагонист относится к агенту, который снижает активность ΑΝΟΡΤΕ4.

Термин агонист относится к агенту, который повышает активность ΑΝΟΡΤΕ4.

Термин пациент включает в себя субъектов-людей и животных. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой млекопитающее. В некоторых таких вариантах осуществления пациент представляет собой человека.

Фрагмент референсного полипептида относится к непрерывному ряду аминокислот из любой части референсного полипептида. Фрагмент может быть любой длины, меньшей, чем длина референсного полипептида.

Вариант референсного полипептида относится к полипептиду, имеющему одну или несколько аминокислотных замен, делеций или инсерций по отношению к референсному полипептиду.

Консервативная аминокислотная замена относится к замене аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой, имеющей сходные свойства, например размер или заряд. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий консервативные аминокислотные замены, сохраняет по меньшей мере один вид активности незамещенного полипептида. Консервативная аминокислотная замена может включать в себя не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно вводятся путем химического пептидного синтеза, а не путем синтеза в биологических системах. Они включают в себя в качестве неограничивающих примеров пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы групп аминокислот.

Встречающиеся в природе остатки могут подразделяться на классы на основе общих свойств боковых цепей:

1) гидрофобные: норлейцин, МеЕ А1а, Уа1, Ьеи, 11е;

2) нейтральные гидрофильные: Сук, 8ет, ΤΙιγ. Αδη, Ο1η;

3) кислые: Αδρ, О1и;

4) основные: Ηίδ, Ьук, Агд;

5) остатки, которые влияют на ориентацию цепей: О1у, Ρτο; и

6) ароматические: Ττρ, Τυγ. ΡΙκ.

Например, неконсервативные замены могут включать в себя обмен представителя одного из данных классов на представителя из другого класса. Такие замещенные остатки могут вводиться в области человеческого антитела, гомологичной не относящемуся к человеку антителу, или в негомологичные области молекулы.

При проведении замен по настоящим вариантам осуществления может учитываться гидропатический индекс аминокислот. Каждой аминокислоте присвоен гидропатический индекс на основе ее гидрофобности и характеристикам заряда. Они составляют: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).

В данной области в ряде случаев известна значимость гидропатического аминокислотного индекса в распознавании биологической функции, связанной с взаимодействием белков, Ку1с е1 а1., 1. Мо1. Βίο1., 157:105-131 (1982). Известно, что в некоторых случаях некоторые аминокислоты могут замещаться на

- 7 016185 другие аминокислоты, имеющие сходный гидропатический индекс или коэффициент, и при этом сохраняется биологическая активность. При введении изменений, основанных на гидропатическом индексе, в некоторых вариантах осуществления вводится замена аминокислот, гидропатические индексы которых находятся в интервале ±2. В некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале ±1 и в некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале ±0,5.

Также в данной области известно, что замена подобных аминокислот может эффективно проводиться на основе гидрофильности, в особенности в случаях, где полученный таким образом биологически функциональный белок или пептид предназначается для применения в иммунологических вариантах осуществления, как в настоящем случае. В некоторых вариантах осуществления наибольшая местная средняя гидрофильность белка, направляемая гидрофильностью прилегающих к нему аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическими свойствами белка.

Данным аминокислотным остаткам присваиваются следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При введении изменений, основанных на сходстве значений гидрофильности, в некоторых вариантах осуществления вводится замена аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в интервале ±2, в некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале +1, и в некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале ±0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основе гидрофильности. Данные области также обозначаются как области ядра эпитопов.

Типовые аминокислотные замены приведены в табл. 1.

Таблица 1

Аминокислотные замены

Исходный остаток	Типовые замены
А1а	Уа1, Ьеи, 11е
Агд	Ьуз, С1п, Азп
Азп	Е1п
Азр	61и
Суз	Зег, А1а
С1п	Азп
С1и	Азр
С1 у	Рго, А1а
Н1з	Азп, С1п, Ьуз, Агд
Не	Ьеи, Уа1, А1а, РЬе, норлейцин
Ьеи	Норлейцин, 11е, Уа1, Ме+, А1а, РЬе

Ьуз	Агд, 1,4-диаминомасляная кислота, С1п,. Азп
Мер	Ьеи, РЬе, 11е
РЬе	Ьеи, Уа1, 11е, А1а, Туг
Рго	А1а
Зег	ТЬг, А1а, Суз
ТЬг	Зег
Тгр	Туг, РЬе
Туг	Тгр, РЬе, ТЬг, Зег
Уа1	Не, Ьеи, РЬе, А1а, норлейцин

Специалист в данной области может определить подходящие варианты приведенного здесь полипептида с использованием хорошо известных способов. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может определить подходящие области молекулы, которые могут быть изменены

- 8 016185 без нарушения активности путем воздействия на области, которые, как полагают, не значимы для активности. В некоторых вариантах осуществления можно идентифицировать остатки и части молекул, консервативных среди сходных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления даже области, которые могут быть значимыми для биологической активности или для структуры, могут быть объектами консервативных аминокислотных замен без нарушения биологической активности или без неблагоприятного воздействия на структуру полипептида.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может сделать обзор структурно-функциональных исследований, в которых идентифицируются остатки в сходных полипептидах, которые значимы для активности или структуры. В свете такого сравнения в некоторых вариантах осуществления можно предсказать значимость аминокислотных остатков, значимых для проявления активности или структуры в сходных белках. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может выбрать химически сходные аминокислотные замены для таких предсказанных значимых аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области также может анализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность в отношении к такой структуре в сходных полипептидах. В некоторых вариантах осуществления в свете такой информации специалист в данной области может предсказывать выравнивание аминокислотных последовательностей антитела в отношении его трехмерной структуры. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может решить не делать радикальных замен аминокислотных остатков, которые, как предсказано, находятся на поверхности белка, поскольку такие остатки могут вовлекаться в важные взаимодействия с другими молекулами. Более того, в некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может генерировать тестируемые варианты, содержащие единичную аминокислотную замену в каждом требуемом аминокислотном остатке. В некоторых вариантах осуществления данные варианты могут затем подлежать скринингу с использованием анализов активности, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления такие варианты могут использоваться для получения информации о подходящих вариантах. Например, в некоторых вариантах осуществления если открыто, что изменение в конкретном аминокислотном остатке приводит к нарушенной, нежелательно сниженной или неподходящей активности, варианты с такими изменениями могут избегаться. Иными словами, в некоторых вариантах осуществления на основе информации таких рутинных экспериментов специалист в данной области может легко определить аминокислоты, в которых должны избегаться дальнейшие замены отдельно или в комбинации с другими мутациями.

Некоторые научные публикации были посвящены предсказанию вторичной структуры, см., например, Мои1! 1., Сигг. Ор. ίη Вю!есй., 7(4):422-427 (1996), Сбои е! а1., ВюсйетШгу, 13(2):222-245 (1974); Сбои е! а1., ВюсйетШгу, 113 (2) :211-222 (1974); Сбои е! а1., Абт. Епхуто1. Ке1а!. Агеак Мо1. Вю1., 47:45148 (1978); Сбои е! а1., Апп. Кет. Вюсйет., 47:251-276 и Сбои е! а1., Вюрйук. 1., 26:367-384 (1979). Более того, в настоящее время доступны компьютерные программы для помощи с предсказанием вторичной структуры. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность последовательности свыше 30% или сходство выше 40%, часто имеют сходные структурные топологии. Рост базы данных структур белка (РОВ) предоставил повышение предсказательной силы в отношении вторичной структуры, включая потенциальное число вариантов фолдинга в структуре полипептида, см., например, Но1т е! а1., Иис1. Ас1б. Кек. 27 (1):244-247 (1999). Сделано предположение (Вгеппег е! а1., Сшт. Ор. 81гис!. Вю1. 7(3):369-376 (1997)), что имеется ограниченное количество вариантов фолдинга в данном полипептиде или пептиде, и что как только будет разрешено критическое число структур, структурные предсказания станут существенно более точными.

Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают в себя прочесывание (см., например, 1опек, Ό., Сшт. Орш. 81гис!. Вю1. 7(3):377-87 (1997); 8ίρρ1. е! а1., 8!гис!иге, 4(1):15-19 (1996)), анализ профиля (см., например, Во\\!е е! а1., 8с1епсе, 253:164-170 (1991); СпЬккот е! а1., Ме!й. Епхут., 183:146-159 (1990); СпЬккот е! а1., Ргос. Иа!. Асаб. δοί, 84(13):4355-4358 (1987)) и эволюционные связи (см., например, Но1т е! а1., Иис1. Ас1б. Кек., 27(1):244-247 (1999) и Вгеппег е! а1., Сигг. Ор. 81гис!. Вю1., 7(3):369-376 (1997)).

В некоторых вариантах осуществления вариант антитела сравнения включает в себя вариант гликозилирования, в котором число и/или тип участков гликозилирования изменен относительно аминокислотной последовательности референсного антитела. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает в себя большее или меньшее число участков Ν-гликозилирования относительно нативного полипептида. Ν-гликозилирование характеризуется последовательностью: Акп-Х-8ег или Акп-ХТ11Г. в которой аминокислотный остаток, обозначенный как X, может представлять собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания данной последовательности предоставляет потенциальный новый участок для добавления Ν-связанной углеводной цепи. Альтернативно, замены, которые элиминируют данную последовательность, будут удалять существующую Ν-связанную углеводную цепь. В некоторых вариантах осуществления предоставлена перестройка Ν-связанных углеводных цепей, при которой один или несколько участков Ν-гликозилирования (обычно

- 9 016185 те, которые встречаются в природе) элиминируются и создается один или несколько новых Ν-связанных участков. Типовые варианты антител включают в себя цистеиновые варианты, в которых один или несколько остатков цистеина подвергнуты делеции или заменены на другие аминокислоты (например, серин) по сравнению с референсной последовательностью антитела. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты могут использоваться, когда антитело должно претерпевать изменение фолдинга с образованием биологически активной конформации, например, после выделения нерастворимых телец включения. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты имеют меньше остатков цистеина, чем нативные полипептиды. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты имеют даже некоторое количество цистеиновых остатков для минимизации взаимодействий, происходящих вследствие неспаренных цистеинов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аминокислотные замены представляют собой те, которые: (1) снижают чувствительность к протеолизу, (2) снижают чувствительность к окислению, (3) изменяют сродство связывания для образования белковых комплексов, (4) изменяют сродство связывания и/или (4) образуют или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких полипептидов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления единичные или множественные аминокислотные замены (в некоторых вариантах осуществления консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны во встречающейся в природе последовательности (в некоторых вариантах осуществления в части полипептида вне домена(ов), образующего межмолекулярные контакты). В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена обычно может существенно не изменять структурных характеристик референсной последовательности (например, в некоторых вариантах осуществления замена аминокислоты не должна вызывать поломку спирали, которая случается в референсной последовательности, или разрушение других типов вторичной структуры, которая характеризует референсную последовательность). Примеры некоторых известных в данной области полипептидных вторичных и третичных структур описаны, например, в Рто1еш8, Збийитек апб Мо1еси1аг Рг1пс1р1с5 (Сте1дб(оп, Еб., ν.Η. Ргеешаи апб Сотрапу, №\ν Уотк (1984)); 1йтобисбоп (о Рго1еш Збисйте (С. Вгапбеп апб 1. Тоохе, ебк., 6ат1апб РиЬбкЫпд, №\ν Уотк, Ν.Υ. (1991)) и Тботйоп е! а1. №Шге 354:105 (1991).

Процентная идентичность или % идентичности при ссылке на последовательности нуклеиновой кислоты относятся к процентной доле нуклеотидов, идентичных по меньшей мере в двух полинуклеотидных последовательностях, выровненных с использованием алгоритма Ваис Ьоса1 Абдптей Зеатсб Тоо1 (ВЬЛЗТ), см. ТаШкоуа е! а1. (1999) ЕЕМЗ МютоЬю1 Ьеб. 174:247-250. Алгоритм ВЬАЗТ (версия 2.2.10) предоставлен публично в №1бопа1 Сейег Тот В^оΐесЬио1оду Шоттабоп (ΝΤΈΙ), Бетесда, Мэриленд. Для выравнивания двух полинуклеотидных последовательностей используют инструмент В1ак1 2 Зедиепсек, в котором используется программа Ыакй с параметрами, заданными следующим образом по умолчанию:

матрица: не применяется;

награда за совпадение: 1;

штраф за несовпадение: -2;

открытие пропуска: 5 штрафных очков; продление пропуска: 2 штрафных очка;

параметр для перехода в режим открытия пропусков: 50;

ожидание: 10,0; размер слова: 11; фильтр: включен.

Процентная идентичность или % идентичности в отношении полипептидных последовательностей относятся к проценту идентичных аминокислот по меньшей мере между двумя полипептидными последовательностями, выровненными с использованием алгоритма ВаДс Ьоса1 А1^дитеηΐ Зеатсб Тоо1 (ВЬАЗТ). Ст. ТаШкога е! а1. (1999) ЕЕМЗ М1стоЬю1 Ьеб. 174:247-250. Алгоритм ВЬАЗТ (версия 2.2.10) предоставляется публично в №1бопа1 Сейет Гог Вю1ес11по1оду 1пГоттабоп (ΝΤΈΙ), Бетесда, Мэриленд. Для выравнивания двух полипептидных последовательностей используется инструмент В1ай 2 Зедиепсек, в котором используется программа Ь1айр, с параметрами, установленными по умолчанию следующим образом:

матрица: ВЬОЗИМ62;

открытие пропуска: 11 штрафных очков; продление пропуска: 1 штрафное очко;

параметр для перехода в режим открытия пропусков: 50;

ожидание: 10.0; размер слова: 3;

фильтр: включен.

Термин эффективная доза или эффективное количество относится к количеству агента, например нейтрализующего антитела, которое приводит к снижению симптомов у пациента или приводит к требуемому биологическому исходу. В некоторых вариантах осуществления эффективной дозы или эф- 10 016185 фективного количества достаточно для снижения по меньшей мере одного вида активности ЛЫСРТЬ4. В некоторых вариантах осуществления эффективную дозу или эффективное количество определяют, как описано выше, в части У.С.

Термин лечение охватывает терапевтические и профилактические/превентивные меры, кроме указанных иначе случаев. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают в себя в качестве неограничивающих примеров субъектов, уже имевших конкретное состояние или нарушение, а также субъектов, которые рискуют приобрести конкретное состояние или нарушение (например, нуждающихся в профилактических/превентивных мерах). Термин лечение относится к введению пациенту средства для терапевтических и/или профилактических/превентивных целей.

Терапевтическое средство относится к средству, которое может вводиться ίη νίνο для обеспечения терапевтического и/или профилактического/превентивного эффекта.

Терапевтическое антитело относится к антителу, которое может вводиться ίη νίνο для обеспечения терапевтического и/или профилактического/превентивного эффекта.

Термины выделенная нуклеиновая кислота и выделенный полинуклеотид применяются взаимозаменяемо и относятся к полинуклеотиду геномного, синтетического происхождения или происхождения из кДНК, или к их комбинации. Выделенный полинуклеотид (1) не ассоциирован с частью или целым полинуклеотидом, с которым выделенный полинуклеотид находится в природе, или (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части большей последовательности.

В. Структура нативных антител и некоторых фрагментов антител.

Нативное антитело обычно имеет тетрамерную структуру. Тетрамер обычно включает в себя две идентичных пары полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну легкую цепь (в некоторых вариантах осуществления примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (в некоторых вариантах осуществления примерно 50-70 кДа). В нативном антителе тяжелая цепь включает в себя вариабельную область У_н и три константные области С_н1, С_н2 и С_н3. Домен У_н находится на Ν-конце тяжелой цепи, а С_н3-домен располагается на С-конце. В нативном антителе легкая цепь включает в себя вариабельную область У_ъ и константную область С_ъ. Вариабельная область легкой цепи находится на Ν-конце легкой цепи. В нативном антителе вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий участок. Константные области обычно отвечают за эффекторную функцию.

Нативные человеческие легкие цепи обычно классифицируют на легкие цепи каппа и лямбда. Нативные человеческие тяжелые цепи обычно классифицируют на мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как 1дМ, Ι§Ό, 1дС, 1дА и 1дЕ соответственно. 1дС имеет подклассы, включающие в себя в качестве неограничивающих примеров 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. 1дМ имеет подклассы, включающие в себя в качестве неограничивающих примеров 1дМ1 и 1дМ2. 1дА имеет подклассы, включающие в себя в качестве неограничивающих примеров 1дА1 и 1дА2. В нативных человеческих легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области обычно соединены Т'-областью длиной примерно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает в себя В -область длиной примерно 10 или более аминокислот, см., например, Еип6ашеп1а1 1тшипо1оду (1989) ей. 7 (Раи1, ^., еб., 2п6 еб. Вахеп Рге§8, Ν.Υ.).

В нативном антителе вариабельные области обычно характеризуются одинаковой общей структурой, в которой относительно консервативные каркасные области (ЕВ) соединены тремя гипервариабельными областями, также называемыми определяющими комплементарность областями (СЭВ). СЭВ из двух цепей каждой пары обычно выровнены по каркасным областям, что может обеспечивать связывание специфичного эпитопа. С Ν-конца на С-конец вариабельные области легких и тяжелых цепей обычно включают в себя домены ЕВ1, ί.ΌΡ1. ЕВ2, СЭР2. ЕВ3, СЭР3 и ЕВ4. СОВ на тяжелых цепях обозначаются как н1, н2, и Н3, тогда как СЭВ на легких цепях обозначаются как Ь1, Ь2 и Ь3. Обычно СЭВ3 представляет собой наибольший источник молекулярного разнообразия в антигенсвязывающем участке. Н3, например, в некоторых случаях может быть коротким, составляя в длину два аминокислотных остатка, или может быть более 26 остатков. Нумерация аминокислот каждого домена обычно приводится в соответствии с определениями КаЬа! е1 а1. (1991) 8ес.|иепее5 οί РгсИеиъ οί 1тшипо1од1са1 1п1егеь( (№10опа1 ИъШШех οί неаИй, РиЬНсайоп № 91-3242, νο1. 1-3, Вейейа, МО); С1ю11иа & Ьекк 1. Мо1. Βίο1. 196:901-917 (1987) или С1ю11иа с! а1. №1Шге 342:878-883 (1989). В настоящем описании термин СОВ относится к СЭВ тяжелой или легкой цепи, кроме указанных иначе случаев.

ЕаЬ-фрагмент включает в себя одну легкую цепь, С_н1 и вариабельную область одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы ЕаЬ не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. ЕаЬ'-фрагмент включает в себя одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая включает еще одну константную область, простирающуюся между С_н1- и С_Н2-доменами. Между двумя тяжелыми цепями ЕаЬ'-фрагмента может образовываться межмолекулярный дисульфидный мостик с образованием молекулы Е(аЬ')₂.

Εν''-фрагмент включает в себя вариабельные области из тяжелых и легких цепей, но не содержит константных областей. Одноцепочечный Εν-фрагмент ОсРх) включает в себя вариабельные области тяжелых и легких цепей, соединенные гибким линкером с образованием единичной полипептидной цепи с

- 11 016185 антигенсвязывающей областью. Типовые одноцепочечные антитела обсуждаются подробно в XVО 88/01649 и патенте США № 4946778 и 5260203. В некоторых случаях единственная вариабельная область (половина Ρν) может быть способна распознавать и связывать антиген, хотя с более низким сродством, чем Ρν.

Используемый здесь термин тяжелая цепь относится к полипептиду, содержащему часть последовательности вариабельной области тяжелой цепи, достаточную для придания специфичности в отношении антиген отдельно или в комбинации с легкой цепью.

Используемый здесь термин легкая цепь относится к полипептиду, содержащему часть последовательности вариабельной области легкой цепи, достаточную для придания специфичности в отношении антиген отдельно или в комбинации с тяжелой цепью.

С. Конкретные антитела.

В некоторых вариантах осуществления предоставляют моноклональные антитела, которые специфически связываются с АИСРТЬ4. В некоторых таких вариантах осуществления моноклональные антитела являются нейтрализующими моноклональными антителами, которые уменьшают по меньшей мере один вид активности АИСРТЬ4 ίη νίνο и/или ίη νίΐτο.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 восстанавливает активность ЬРЬ в присутствии АИСРТЬ4 ίη νίΐτο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 уменьшает общий уровень холестерина ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 уменьшает уровень свободных жирных кислот (РРА) ίη νίνο.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке у БОБт-нокаутных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 уменьшает уровень общего холестерина в сыворотке у ЬВЬт-нокаутных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке у АроЕ-нокаутных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЕ4 уменьшает уровень общего холестерина в сыворотке у АроЕ-нокаутных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЕ4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке у 6Ь/6Ь мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АИСРТЬ4 уменьшает уровень общего холестерина в сыворотке у 6Ь/6Ь мышей ίη νίνο.

В некоторых вариантах осуществления предоставляют моноклональные антитела, которые специфически связываются с АИСРТЕ4 мыши. В некоторых вариантах осуществления предоставляются моноклональные антитела, которые специфически связываются с АИСРТЬ4 человека. В некоторых вариантах осуществления предоставляются моноклональные антитела, которые специфически связываются с тем же эпитопом в АИСРТЕ4 из разных видов (т.е. антитела, которые демонстрируют перекрестную реактивность). В таких вариантах осуществления антитела специфически связываются как с АИСРТЕ4 мыши, так и с АИСРТЬ4 человека.

В некоторых вариантах осуществления предоставляют нейтрализующие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом в Ν-концевом домене двойной цепи АИСРТЬ4. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом в Ν-концевом домене двойной цепи АNСРТ^4 мыши. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом, находящимся в участке АNСРТ^4 мыши (8ЕО Ш N0: 1 или 8Е0 Ш N0: 50) с 21 по 174 остаток. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом в Ν-концевом домене двойной цепи АNСРТ^4 человека. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом, находящимся в участке АNСРТ^4 человека (8Е0 Ш N0: 2) с 21 по 169 остаток.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами, не относящимися к человеку. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами грызунов. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами мыши. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются химерными моноклональными антителами. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются гуманизированными моноклональными антителами. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами человека. В некоторых вариантах осуществления химерные, гуманизированные моноклональные антитела и/или моноклональные антитела человека используются как терапевтические антитела для человека.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются фраг

- 12 016185 ментами антител. Типичные фрагменты антител включены в нижеследующий список, но не ограничены им: ТаЬ, ТаЬ', Е(аЬ')₂, Εν, 5сЕт. Еб, диатела и другие фрагменты антител.

Предоставляются типичные нейтрализующие моноклональные антитела, обозначенные 14Ό12, 90В4 и 15Е2. Эти антитела связываются с эпитопом, находящимся между остатками 21 и 174 ΛΝΟΡΤΕ4 мыши (8ЕЭ ΙΌ N0: 1 или 8ЕС ΙΌ N0: 50). Эти антитела также нейтрализуют активность ΛΝ0ΡΤΕ4. Таким образом, антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом (например, в ΛΝ0ΡΤΕ4 либо человека, либо мыши), также ожидаются обладающими нейтрализующей активностью. Конкретные нейтрализующие моноклональные антитела против ΛΝ0ΡΤΕ4 связываются с одним или несколькими пептидами, выбранными из 8ЕС ΙΌ N0 40-48. Конкретные нейтрализующие моноклональные антитела против ΛΝ0ΡΤΕ4 связываются с одним или несколькими пептидами, выбранными из 8ЕС ΙΌ N0 40-43. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ΛΝ0ΡΤΕ4 связывается с пептидом, имеющим последовательность из 8ЕС ΙΌ N0: 43. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ΛΝ0ΡΤΕ4 связывается как с пептидом, имеющим последовательность из 8ЕС ΙΌ N0: 41, так и с пептидом, имеющим последовательность из 8ЕС ΙΌ N0: 43.

В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 14Ό12. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 15Е2. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 90В4.

Конкретные нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 12. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 13. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 14. Конкретные нейтрализующие антитела включают легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 16. Конкретные нейтрализующие антитела включают легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 17. Конкретные нейтрализующие антитела включают легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 18.

Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 12, и легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 16. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 13, и легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 17. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 14, и легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 18.

1. Химерные и гуманизированные моноклональные антитела.

В некоторых вариантах осуществления антитела, не относящиеся к человеку, являются химерными. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, которые специфически связываются с ΆΝ0ΡΤΕ4 человека, являются химеризованными. Конкретные примерные способы для получения химерных антител представлены, например, в Мотлкоп е! а1. (1984) Ггос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А 81:6851-6855; №иЬетдег е! а1. (1984) №1Шгс 312:604-608; Τакеба е! а1. (1985) №1Шгс 314:452-454 и патентах США 6075181 и 5877397.

В некоторых вариантах осуществления антитела, не относящиеся к человеку, являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, которые специфически связываются с ΛΝ0ΡΤΕ4 человека, являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, индуцированные против ΑΝ0ΡΤΕ4 мыши, но которые специфически связываются (т.е. перекрестно реагируют) с ΑΝ0ΡΤΕ4 человека, являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела сохраняют их специфичность связывания и имеют сниженную иммуногенность (например, сниженный ответ человека на мышиные антитела (НАМА)) при введении человеку. В некоторых вариантах осуществления гуманизация достигается способами, включая, но не ограничиваясь переносом СЭК. и конструированием с целью гуманизации инженерным способом, как ниже описано в подробностях.

В некоторых вариантах осуществления гуманизированных антител один или несколько гипервариабельных участков (СЭК) из легкой и тяжелой цепи вариабельных областей антитела с требуемой специфичностью связывания (донорное антитело) переносятся на каркасные области (ЕК) в акцепторном антителе человека. Примеры переноса гипервариабельных участков описаны, например, в патентах США 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101; Сиееп е! а1. (1989) Пос. ЫаП Асаб. δα. И8А 86:1002910033. В некоторых вариантах осуществления один или несколько гипервариабельных участков из легкой и тяжелой цепи вариабельных областей переносятся на консенсус каркасных областей в акцепторном

- 13 016185 антителе человека. Для создания консенсуса каркасных областей антител человека в некоторых вариантах осуществления каркасные области из нескольких тяжелых или легких цепей антител человека выравниваются с целью определения консенсуса аминокислотной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления определенные аминокислоты в каркасной области в акцепторном антителе могут быть заменены на аминокислоты из каркасной области донорного антитела. В некоторых таких вариантах осуществления аминокислоты из каркасной области донорного антитела являются аминокислотами, которые способствуют сродству донорного антитела для целевого антигена, см., например, патенты США 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101; Спее η е! а1. (1989) Ргос. №11'1 Лсаб. 8с1. И8А 86:10029-10033. В некоторых вариантах осуществления используются компьютерные программы для моделирования донорных и/или акцепторных антител для определения аминокислотных остатков, которые вероятно участвуют в связывании антигена и/или вносят вклад в структуру антиген-связывающего сайта, таким образом способствуя выбору аминокислотных остатков, таких как остатки каркасной области, подлежащих замене в донорном антителе.

В некоторых вариантах осуществления гипервариабельные участки из донорного антитела переносятся на акцепторное антитело, содержащее константную область антитела человека. В некоторых таких вариантах осуществления каркасные области также переносятся на акцептор. В некоторых вариантах осуществления гипервариабельные участки из донорного антитела получают из одноцепочечного Ρνфрагмента антитела. В некоторых вариантах осуществления каркасные области из донорного антитела получают из одноцепочечного Ρν-фрагмента антитела. В некоторых вариантах осуществления перенесенные гипервариабельные участки в гуманизированном антителе в дальнейшем модифицируются (например, путем замены аминокислот, делеций или вставок) для увеличения сродства гуманизированного антитела к целевому антигену.

В некоторых вариантах осуществления антитела, не встречающиеся у человека, могут быть гуманизированы, используя генно-инженерный способ, см., например, патенты США 5766886 и 5869619. В некоторых вариантах осуществления инженерного способа информация о структуре вариабельных доменов антитела (например, информация, полученная из кристаллических структур и/или путем молекулярного моделирования) используется для оценки вероятности того, что данный аминокислотный остаток в вариабельной области (а) участвует в связывании антигена, (Ь) находится на поверхности антитела (т.е. доступен для растворителя) или (с) находится внутри вариабельного участка атитела (т.е. участвует в поддержании структуры вариабельного участка). Более того, в некоторых вариантах осуществления консенсусные последовательности вариабельных участков антител человека генерируются, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди вариабельных участков антител человека. В некоторых вариантах осуществления эта информация способствует принятию решения о том, должен ли быть заменен аминокислотный остаток в вариабельном участке антител, не встречающихся у человека.

Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую СИК1, СЭВ2 и СИК.3 из 14Ό12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую СИК1, СИК.2 и СЭВ3 из 15Ρ2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую СИК.1, СИК.2 и СИК3 из 90В4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 14И12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 15Ρ2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 90В4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 14И12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 15Ρ2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 90В4.

Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую СИК1, СИК2 и СИК3 из 14И12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую СИК1, СИК2 и СИК3 из 15Ρ2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую СИК.1, СИК2 и СИК3 из 90В4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 14И12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 15Ρ2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 90В4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 14И12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 15Ρ2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 90В4.

2. Изотипы антител.

В некоторых вариантах осуществления антитело против АИСРТЬ4 может быть любым изотипом, выбранным из 1дМ, 1дИ, 1дС, 1дА и 1дЕ. В некоторых вариантах осуществления антитело против

- 14 016185

ΑΝ0ΡΙΈ4 имеет 1дС изотип. В некоторых таких вариантах осуществления антитело принадлежит субклассу 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΑΝΟΡΤΕ4 имеет 1дМ изотип. В некоторых таких вариантах осуществления антитело принадлежит субклассу 1дМ1 или 1дМ2. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΑΝΟΡΤΕ4 имеет 1дА изотип. В некоторых таких вариантах осуществления антитело принадлежит субклассу 1дА1 или 1дА2. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΑNСΡΤ^4 включает в себя легкую каппа-цепь антитела человека и тяжелую цепь 1дС1 или 1дС2 антитела человека. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΑNСΡΤ^4 включает в себя легкую каппа-цепь антитела мыши и тяжелую цепь 1дС1 или 1дС2 антитела мыши.

3. Модифицированные антитела.

В различных вариантах осуществления антитело модифицируется с целью изменить одно или несколько его свойств. В некоторых вариантах осуществления модифицированное антитело может обладать преимуществами по сравнению с немодифицированным антителом, такими как увеличенная стабильность, увеличенное время циркуляции или уменьшенная иммуногенность (см., например, патент США 4179337). В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируется путем присоединения небелковой группировки. В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируется путем изменения состояния гликозилирования антитела, например, изменяя число, тип, связь и/или позицию углеводных цепей на антителе.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько химических группировок присоединяются к аминокислотному остову и/или к углеводным остаткам антитела. Конкретные типовые способы присоединения химических группировок к антителу известны специалистам в этой области. Такие способы включают, но не ограничены следующим списком: реакции ацилирования или реакции алкилирования, см., например, ЕР 0401384; Майк е! а1. (1992), Ехр. Нета!о1., 20:1028-1035; Ргаис18 (1992), Росик ои Сго\\111 Рас!огк, 3(2):4-10, издатель Мебйспрк Моии!а1и Соий, Рпегп Вате! Ьапе, Ьоибои N20 ΘΕΌ, ИК; ЕР 0154316; ЕР 0401384; АО 92116221; АО 95134326; АО 95113312; АО 96111953; АО 96119459 и АО 96119459. В некоторых вариантах осуществления любые из этих реакций используются для получения антитела, которое является химически модифицированным на его Ν-конце.

В некоторых вариантах осуществления антитело присоединяется к детектируемой метке, такой как ферментной, флуоресцентной, изотопной или аффинной метке. В некоторых таких вариантах осуществления детектируемая метка позволяет определять или изолировать антитело. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка позволяет определять антиген, связанный с антителом.

В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируется путем присоединения его к одному или нескольким полимерам. В некоторых вариантах осуществления антитело присоединяется к одному или нескольким водорастворимым полимерам. В некоторых таких вариантах осуществления соединение с водорастворимым полимером уменьшает вероятность того, что антитело будет преципитировать в водном окружении, таком как физиологические условия. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело присоединяется к водорастворимому полимеру. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может выбрать подходящий водорастворимый полимер, основываясь на соображениях, включающих, но не ограниченных тем, будет ли конъюгат полимер/антитело использоваться в лечении пациента и, в таком случае, учесть фармакологические свойства антитела (например, время полужизни, дозу активность, антигенность и/или другие факторы).

Некоторые типичные клинически допустимые водорастворимые полимеры включают, но не ограничены следующим списком: полиэтиленгликоль (РЕС); полиэтиленгликоля пропиональдегид; сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля; монометокси-полиэтиленгликоль; карбоксиметилцеллюлоза; декстран; поливиниловый спирт (РУА); поливинилпирролидон; поли-1,3-диоксалан; поли-1,3,6-триоксан; сополимеры этилена/малеинового ангидрида; поли-в-аминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры); поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль; гомополимеры полипропиленгликоля (РРС) и других полиалкиленоксидов; сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида; полиоксиэтилированные полиолы (РОО (например, глицерин) и другие полиоксиэтилированные полиолы; полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированная глюкоза, кишечные кислоты или другие углеводные полимеры; и фиколл, декстран или смеси этого. Некоторые типичные РЕС включают в себя в качестве неограничивающих примеров некоторые формы, известные в данной области как использующиеся в модификации антител, например моно(С1-С10)алкокси- или арилокси-РЕС. В некоторых вариантах осуществления пропиональдегид-РЕС может иметь преимущества при производстве благодаря его стабильности в воде.

В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер может иметь любую молекулярную массу. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер может быть разветвленным или неразветвленным. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 2 до примерно 100 кДа, включая все точки между концевыми точками этого диапазона. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 5 до примерно 40 кДа. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 10 до примерно 35

- 15 016185 кДа. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 15 до примерно 30 кДа.

В некоторых вариантах осуществления антитело присоединено к РЕС (т.е. антитело является РЕСмодифицированным). В различных вариантах осуществления РЕС имеет низкую токсичность для млекопитающих, см. СатреШет е! а1. (1971) ^χΕοΙ Арр1. РИатта^., 18, 35-40. В частности, РЕСпроизводные аденозиндезаминазы были рекомендованы в Соединенных Штатах для применения у людей для лечения тяжелого комбинированного синдрома иммунодефицита. В различных вариантах осуществления РЕС может уменьшать иммуногенность антител. Например, в некоторых вариантах осуществления присоединение РЕС к антителу, имеющему последовательность, не встречающуюся у человека, может уменьшать антигенность этого антитела при введении людям.

В некоторых вариантах осуществления полимер присоединяется к одной или нескольким реакционноспособным аминокислотным остаткам антитела. Типичные примеры реакционноспособных аминокислотных остатков включают, но не ограничены следующим списком: альфа-аминогруппа Ν-концевой аминокислоты, эпсилон-аминогруппы боковых цепей лизина, сульфгидридные группы боковых цепей цистеина, карбоксильные группы боковых цепей аспартила и глутамила, альфа-карбоксильная группа Сконцевой аминокислоты, боковые цепи тирозина, активированные гликозильные цепи, присоединенные к некоторым остаткам аспарагина, серина или треонина. Некоторые типичные примеры активированных форм РЕС (РЕС-реагенты), подходящие для прямых реакций с белками, известны специалистам в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления РЕС-реагенты, подходящие для присоединения к аминогруппам включают, но не ограничены следующим списком: активные эфиры карбоновых кислот или карбоновые производные РЕС, например те, у которых группа замещения это Νгидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-4-сульфонат. В некоторых вариантах осуществления РЕС-реагенты, содержащие малеимидо- или галогенацетильные группы, используются для модификации сульфгидрильных групп. В некоторых вариантах осуществления РЕСреагенты, содержащие амино, гидразиновые и/или гидразидные группы, могут быть использованы в реакциях с альдегидами, полученными способом окисления периодатом углеводных групп в белках.

В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет по меньшей мере одну реакционноспособную группу. В некоторых вариантах осуществления активированная производная водорастворимого полимера, такого как РЕС создается путем реакции водорастворимого полимера с активирующей группой. В некоторых вариантах осуществления активирующая группа может быть монофункциональной, бифункциональной или мультифункциональной. Некоторые типичные примеры активирующих групп, которые могут быть использованы для сшивки водорастворимого полимера к двум или более антителам, включают, но не ограничены следующим списком: сульфоны (например хлорсульфоны, винилсульфоны и дивинилсульфоны), малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, трезилат, азиридин, оксиран и 5-пиридил. В некоторых вариантах осуществления производная РЕС обычно устойчива против гидролиза при длительном пребывании в водном окружении при рН около 11 или меньше. В некоторых вариантах осуществления производная РЕС, сшитая с другой молекулой, такой как антитело, придает устойчивость к гидролизу этой молекуле. Некоторые типичные гомобифункцинальные производные РЕС включают, но не ограничены следующим списком: РЕС-бис-хлорсульфон и РЕС-бис-винилсульфон (см. \\Ό 95/13312).

Ό. Некоторые способы получения моноклональных антител 1. Некоторые гибридомные способы.

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела получают стандартными способами. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела получают гибридомными способами. Некоторые такие способы известны специалистам в данной области, см., например, ΚοΗΕτ е! а1. (1975) Книге 256:495-497; Η;πΊο\ν апб Ьапе (1988) Αηί^Ьοб^е8: А ΕαόοηΙοΓν Мапиа1 Сй. 6 (С'.о1б 8рпп§ ΗπιΤογ ^аЬο^аΐο^у, ί.’ο16 8рппд ΗαΓόοΓ, ΝΥ). В некоторых таких вариантах осуществления подходящее животное, такое как мышь, крыса, хомяк, обезьяна или другое млекопитающее, иммунизируется иммуногеном для получения антиген-продуцирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления антиген-продуцирующими клетками являются В-клетки, такие как лимфоциты или спленоциты. В некоторых вариантах осуществления лимфоциты (например, лимфоциты человека) иммунизируются ίη νίίτο для получения антиген-продуцирующих клеток, см., например, ΒογιόΚιοΚ е! а1. (1988) Ргос. Νη1'1 Асаб. 8с1. И8А 85:3995-3999.

В некоторых вариантах осуществления антител-продуцирующие клетки сливают с иммортализованной клеточной линией, такой как миеломоподобная клеточная линия, для получения гибридомных клеток. В некоторых вариантах осуществления гибридомные клетки, которые продуцируют желаемые антитела, определяются, например, с помощью ЕЫ8А. В некоторых вариантах осуществления такие клетки могут быть потом еще раз пассированы и культивированы с использованием стандартных способов. В некоторых вариантах осуществления такие клетки также могут быть выращены ίη νίνο как асцитные опухоли в подходящем животном-хозяине. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела выделяют из среды для культуры гибридомы, сыворотки или асцитной жидкости с использованием стандартных методов разделения, таких как аффинная хроматография. Руководство для получения гибридом и очистке моноклональных антител представлено, например, в Η;πΊο\ν апб Йапе (1988) А^^б

- 16 016185

1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1 СИ. 8 (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, №Υ).

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши продуцируются путем иммунизации иммуногеном генетически-модифицированных мышей. В некоторых таких вариантах осуществления мыши являются АНСРТЕД-дефицитными мышами, у которых частично или полностью отсутствует функция АНСРТЬб. В некоторых таких вариантах осуществления мыши являются нокаутными мышами, у которых отсутствует весь ген или часть гена АНСРТЬб.

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела человека индуцируются в трансгенных животных (например, у мыши), которые способны к продуцированию антител человека, см., например, патенты США 6075181 А и 6114598 А и \У0 98124893 А2. Например, в некоторых вариантах осуществления гены иммуноглобулинов человека вводятся (например, используя искусственные хромосомы дрожжей, фрагменты хромосом человека или интеграцию в клетки зародышевой линии) в мышь, у которой эндогенные гены Ι§ были дезактивированы, см., например, ^акоЬоν^!к е! а1. (1993) №11иге 362:255-258; Тоткика е! а1. (2000) Ргос. N311 Асаб. 8οΐ. И8А 97:722-727 и Мепбе/ е! а1. (1997) N31. Сепе!. 15146-156 (описывающая трансгенную линию мышей ХепоМоике ΙΙ®).

В некоторых вариантах осуществления такие трансгенные мыши иммунизируются иммуногеном. В некоторых таких вариантах осуществления, получают лимфатические клетки (такие как В-клетки) мыши, которые экспрессируют антитела. В некоторых таких вариантах осуществления, таким образом, полученные клетки сливаются с иммортализованной клеточной линией, такой как миеломоподобная клеточная линия, для получения гибридомных клеток. В некоторых таких вариантах осуществления гибридомные клетки подвергаются скринингу и отбираются, чтобы идентифицировать те клетки, которые продуцируют антитела, специфичные к интересующему антигену. Некоторые типичные способы и трансгенные мыши, подходящие для продуцирования моноклональных антител человека описаны, например, в ^акоЬоν^!к е! а1. (1993) №11иге 362:255-258; 1акоЬоу11к (1995) Сигг. 0рт. Вю1ееЬпо1. 6:561-566; ЬопЬегд е! а1. (1995) Ш!. Реу. Iттипо1. 13:65-93; ИкЬдаИб е! а1. (1996) №11. Вю1ееЬпо1. 14:845-851; Мепбех е! а1. (1997) №11. Сепе!. 15:146-156; Сгееп (1999) I. Iттипо1. МеЙюбк 231:11-23; Топихика е! а1. (2000) Ргос. Асаб. 8с1. И8А 91:122-121; сделан обзор в ЫШе е! а1. (2000) Iттипо1. Тобау 21:364-370 и \У0 98124893.

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела человека против АNСРТ^4 могут быть использованы как терапевтические антитела, см. ниже часть У.С.

2. Некоторые способы, основанные на дисплее.

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела человека получают с использованием дисплей-ориентированного способа, такого, например, как любой из описанных ниже.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают с использованием технологий фагового дисплея. Некоторые типичные способы фагового дисплея применительно к антителам известны специалистам в данной области и описаны, например, в НоодепЬоот, 0νе^ν^еда о! Ап!1Ьобу РИаде-Б1кр1ау ТесИпо1оду апб Ι!κ Арр1юа!юпк, Ггот МеГйобк т Мо1еси1аг Бю1оду: АпбЬобу РИаде Б1кр1ау: Ме!Иобк апб Рго!осо1к (2002) 178:1-37 (0'Бпеп апб Лакеи ебк., Нитап Ргекк, То!одаа, N1). Например, в некоторых вариантах осуществления библиотека антител экспонируется на поверхности нитевидного фага, такого как нитевидный нелизирующий фаг Гб или М13. В некоторых вариантах осуществления антитела являются фрагментами антител, такими как ксЕт, ЕаЬ, Εν с введением путем инженерии внутримолекулярной дисульфидной связи для стабилизации пары У_Н-Уь и диател. В некоторых вариантах осуществления антитела с требуемой специфичностью связывания впоследствии могут быть отобраны. Некоторые типичные варианты осуществления способов фагового дисплея описаны ниже более подробно.

В некоторых вариантах осуществления библиотека фагового дисплея для антител может быть приготовлена с использованием некоторых способов, известных специалистам в данной области, см., например, НоодепЬоот, 0уег\зе\у оГ АпйЬобу РИаде-Э1кр1ау ТесИпо1оду апб Ι!κ Арр1юа!юпк, Ггот Ме!Иобк т Мо1еси1аг Бю1оду: АпйЬобу РИаде Б1кр1ау: МеГйобк апб Рго!осо1к (2002) 178: 1-37 (0'Бпеп апб Айкеп, ебк., Нитап Ргекк, То!одаа, N1). В некоторых вариантах осуществления различные репертуары генов приготовляются с помощью ПЦР-амплификации геномной ДНК или кДНК, полученной из мРНК антителпродуцирующих клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления кДНК приготовляется из мРНК В-клеток. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующую вариабельные области тяжелых и легких цепей, амплифицируют, например, с помощью ПЦР.

В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи клонируют в подходящий вектор. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи случайным образом комбинируют в процессе клонирования с получением, таким образом, объединенной библиотеки кДНК, кодирующей различные ксЕу или ЕаЬ-фрагменты. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи лигируют перед клонированием в подходящий вектор. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи лигируют путем последовательного клонирования в подходящий вектор.

В некоторых вариантах осуществления кДНК клонируется в вектор фагового дисплея, такой как фагмидный вектор. Некоторые типичные фагмидные векторы, такие как рСЕ81, известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая и тяжелую и легкую цепи,

- 17 016185 представлена на том же векторе. Например, в некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая 5сЕу, клонируется с сохранением рамки считывания с частью или с целым геном III, который кодирует малый белок ΡΙΙΙ оболочки фага. В некоторых таких вариантах осуществления фагмида управляет экспрессией комплекса 5сРу-рШ на поверхности фага. С другой стороны, в некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая тяжелую цепь (или легкую цепь), клонируется с сохранением рамки считывания с частью или с целым геном III, и кДНК, кодирующая легкую цепь (или тяжелую цепь), клонируется после сигнальной последовательности в том же самом векторе. Сигнальная последовательность управляет экспрессией легкой цепи (или тяжелой цепи) в периплазме клетки-хозяина, где тяжелые и легкие цепи собираются в РаЬ-фрагменты. С другой стороны, в некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая тяжелую цепь, и кДНК, кодирующая легкую цепь, представлены на отдельных векторах. В некоторых таких вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и легкой цепи клонируются раздельно, одна в фагмиду, а другая - в фаговый вектор, которые оба содержат сигналы для рекомбинации в клеткехозяине ίη νίνο.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная фагмида или фаговые векторы вводятся в подходящего бактериального хозяина, такого как Е. со11. В некоторых вариантах осуществления с использованием фагмиды хозяин инфицируется вспомогательным фагом для получения структурных белков фага, таким образом позволяя экспрессию фаговых частиц, несущих комплекс антитело-белок рШ на поверхности фага.

В некоторых вариантах осуществления конструируются синтетические библиотеки антител, используя репертуары вариабельных генов, которые пересортировываются ίη νίίτο. Например, в некоторых вариантах осуществления отдельные сегменты генов, кодирующие тяжелые или легкие цепи (У-Ω-Ι или У-Ι соответственно) случайным образом комбинируются с использованием ПЦР. В некоторых таких вариантах осуществления дополнительное разнообразие последовательностей может быть получено в СЭР и, возможно, ЕЕ, например, используя подверженную ошибкам ПЦР. В некоторых таких вариантах осуществления дополнительное разнообразие последовательностей может быть получено в СЭИЛ. например в Н3 тяжелой цепи.

В некоторых вариантах осуществления первичные или универсальные библиотеки фаговых дисплеев конструируются, как описано выше, используя нуклеиновые кислоты, полученные из неиммунизированных животных. В некоторых вариантах осуществления неиммунизированным животным является человек. В некоторых вариантах осуществления иммунизированные библиотеки фаговых дисплеев конструируются, как описано выше, используя нуклеиновые кислоты, полученные из иммунизированных животных. В некоторых вариантах осуществления неиммунизированным животным является человек, крыса, мышь, хомяк или обезьяна. В некоторых вариантах осуществления животные иммунизируются любым из описанных ниже иммуногенов.

Некоторые типичные библиотеки фаговых дисплеев антител человека доступны из коммерческих источников. Некоторые типичные библиотеки включают, но не ограничены следующим списком: наборы библиотек НиСЛЬ® от Могрйо8у5 АС (Мартинштрайд/Мюних, Германия); библиотеки от Сгисе11 (Лейден, Нидерланды) с использованием технологии МаЬЧгас!®; библиотека η-СоЭеИ'™ ЕаЬ от Βίοίηννηΐ (Лунд, Швеция) и библиотеки, доступные от СашЬпбде АийЬобу Тесйио1оду (Кембридж, Великобритания).

В некоторых вариантах осуществления отбор антител, имеющих желаемую специфичность связывания из библиотеки фаговых дисплеев, достигается путем последовательных шагов пэннинга. В некоторых вариантах осуществления пэннинга библиотека фаговых препаратов экспонируется антигену. В некоторых таких вариантах осуществления комплексы фаг-антиген отмываются и несвязавшийся фаг удаляется. В некоторых таких вариантах осуществления связавшийся фаг восстанавливается и повторно амплифицируется путем инфицирования Е. сой. В некоторых таких вариантах осуществления фаг, продуцирующий моноклональные антитела, может быть клонирован путем изъятия отдельных бляшек. В некоторых вариантах осуществления процесс, описанный выше, повторяется.

В некоторых вариантах осуществления антиген, используемый в пэннинге, может быть любым из иммуногенов, описанных ниже. В некоторых вариантах осуществления антиген иммобилизуется на твердой подложке для того, чтобы позволить очистку антигенсвязывающего фага путем аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления антиген биотинилируется, таким образом, позволяя разделение связавшегося фага от несвязавшегося фага, используя покрытые стрептавидином магнитные гранулы. В некоторых вариантах осуществления антиген может быть иммобилизован на клетках (для прямого пэннинга) в срезах замороженных тканей или на мембранах (например, нейлоновая или нитроцеллюлозная мембраны). Другие варианты некоторых процедур пэннинга могут быть обычно определены специалистом в данной области.

В некоторых вариантах осуществления система дрожжевого дисплея используется для получения моноклональных антител. В некоторых таких системах антитело экспрессируется как слитый белок с целым дрожжевым белком АСА2 или с его частью, который появляется на поверхности клеточной стенки дрожжей. В некоторых таких вариантах осуществления дрожжевые клетки, экспрессирующие антите

- 18 016185 ла с желаемой специфичностью связывания, могут потом быть определены путем экспозиции клеток флуоресцентно-меченному антигену. В некоторых таких вариантах осуществления дрожжевые клетки, которые связывают антиген, могут быть выделены путем проточной цитометрии, см., например, Вобег е! а1. (1997) Ыа!. Вю1еейпо1. 15:553-557.

3. Некоторые способы созревания сродства.

В некоторых вариантах осуществления сродство антитела к конкретному антигену увеличивается, когда антитело подвергают созреванию сродства (или направленной эволюции) ίη νίίΐΌ. Нативные антитела проходят созревание сродства ίη νί\Ό через соматическую гипермутацию с последующей селекцией. Некоторые способы ίη νίΐΐΌ имитируют этот процесс ίη νίνΌ, таким образом позволяя продуцировать антитела, имеющие сродство, которое равно или больше по сравнению с нативными антителами.

В некоторых вариантах осуществления созревания сродства мутации вводятся в нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область антитела с желаемой специфичностью связывания, см., например, Ни6зоп е! а1. (2003) Ыа!иге Меб. 9:129-134; Вгекке е! а1. (2002) Ыа!иге Веν^еиз 2:52-62. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в вариабельную область тяжелой цепи, легкой цепи или в обе цепи. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в один или несколько СЭВ. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в Н3, Ь3 или в обе. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в одну или более РВ. В некоторых вариантах осуществления создается библиотека мутаций, например, в фаге, рибосоме или библиотека дрожжевого дисплея так, что антитела с повышенным сродством могут быть идентифицированы стандартными скрининговыми способами, см., например, Вобег е! а1. (2000) Ρι-ос. Ма1'1 Лсаб. 8с1. И8Л 97:10701-10705; Роо!е е! а1. (2000) Ρι-ос. №11'1 Лсаб. 8οί. υ8Α 97:10679-10681; Ноо^еи^от, Ονе^ν^еи о£ Лηί^Ьобν Ρйаде-^^зр1ау Тес1то1оду анб Из ДррйсаОонз, £гот Ме!йобз ίη Мо1еси1аг Вю1оду: Дн11Ьо6у Ρйаде 01зр1ау: Ме!йобз анб Ρι^^Ν (2002) 178:1-37 (0'Впеп анб Απί^η, ебз., Ηитаη Ρι-езз, То!оиа, ΝΙ) и Наиез е! а1. (1998) Ρι-ос. Ыа£'1 Лсаб. 8ск υ8Α 95:14130-14135.

В некоторых вариантах осуществления мутации вводят путем сайт-специфичного мутагенеза, основываясь на информации о структуре антитела, например антиген-связывающего сайта. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят, используя комбинаторный мутагенез гипервариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая вариабельную область частично или целиком, случайным образом подвергается мутации, например, используя мутаторные клетки Е. сой, перестановку гомологичных генов или подверженную ошибкам ПЦР. В некоторых вариантах осуществления мутации вводятся путем перетасовки ДНК, см., например, Статей е! а1. (1996) Ыа!иге Меб. 2:100-102; Регтег е! а1. (2004) Титог Вю1оду 25:7-13.

В некоторых вариантах осуществления перетасовка цепей используется для получения антител с повышенным сродством. В некоторых вариантах осуществления перетасовки цепей одну из цепей, например легкую цепь, замещают репертуаром легких цепей, в то время как другая цепь, например тяжелая цепь, остается неизмененной, таким образом обеспечивая специфичность. В некоторых таких вариантах осуществления создается библиотека антител с перетасованными цепями, где неизмененная тяжелая цепь экспрессируется в комбинации с каждой легкой цепью из набора легких цепей. В некоторых вариантах осуществления такие библиотеки могут быть проскринированы на антитела с повышенным сродством. В некоторых вариантах осуществления как легкая, так и тяжелая цепи последовательно замещаются. В некоторых вариантах осуществления замещаются только вариабельные области легкой/тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления замещается только часть вариабельных областей, например гипервариабельные участки, см., например, Ни6зоп е! а1. (2003) Ыа!иге Меб. 9:129-134; Вгекке е! а1. (2002) №11иге Вемеиз 2:52-62; Канд е! а1. (1991) Ρι-ос. Ыа!'1 Лсаб. 8οΐ. υ8Α 88:11120-11123; Магкз е! а1. (1992) Вю!ссйпо1о§у 10:779-83.

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, которые специфически связывают ΑNСΡΤ^4 человека (включая, но не ограничиваясь моноклональными антителами мыши, индуцированными против ΑΝ^Ρ^Α мыши, но которые специфически связываются (т.е. перекрестно взаимодействуют) с ΑΝ^Ρ^Α человека), подвергаются последовательной перетасовке цепей. В некоторых вариантах осуществления, например, тяжелая цепь данного моноклонального антитела мыши комбинируется с новым набором легких цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством. В некоторых таких вариантах осуществления легкие цепи отобранных антител комбинируются с новым набором тяжелых цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления отбираются антитела человека, имеющие желаемую антиген-связывающую специфичность.

В ином случае, в некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь данного моноклонального антитела мыши комбинируется с новым набором легких цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством из этого первого этапа перетасовки. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь первоначального моноклонального антитела мыши комбинируется с новым набором тяжелых цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством из этого второго этапа перетасовки. В некоторых вариантах осуществления легкие цепи человека из антител, отобранных на первом этапе перетасовки, потом комбинируются с тяжелыми цепями человека из антител, отобранных на втором этапе перетасов

- 19 016185 ки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления отбираются антитела человека, имеющие желаемую антиген-связывающую специфичность.

В некоторых вариантах осуществления используется способ рибосомного дисплея, который заменяет отбор антител с созреванием сродства. В некоторых вариантах осуществления способа рибосомного дисплея нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, амплифицируется с помощью ΚΤ-ПЦР между этапами отбора. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления подверженные ошибкам полимеразы могут быть использованы для введения мутаций в нуклеиновую кислоту. Неограничивающий пример такого способа описан в подробностях в Наиек е1 а1. (1998) Ργοο. Ναΐ'1 АсаД. 8с1. И8А 95:14130-14135.

4. Некоторые рекомбинантные способы.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают с помощью рекомбинантных способов, см., например, патент США 4816567. В некоторых таких вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи моноклонального антитела, клонируются и экспрессируются в подходящей клетке-хозяине. Например, в некоторых вариантах осуществления РНК может быть получена с использованием стандартных способов из клеток, экспрессирующих желаемое антитело, таких как зрелые В-клетки или клетки гибридомы.

В некоторых вариантах осуществления РНК впоследствии может быть использована для получения кДНК с использованием стандартных способов. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующую полипептид тяжелой или легкой цепи, амплифицируют, например, путем ПЦР, используя специфичные олигонуклеотидные праймеры. В некоторых вариантах осуществления кДНК клонируют в подходящий экспрессионный вектор. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор затем трансформируют или трансфецируют в подходящую клетку-хозяин, такую как клетка-хозяин, которая не продуцирует антитело эндогенно. Некоторые типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются следующим списком: Е. той. СО8-клетки, клетки яичников китайского хомячка (СНО се11к) и миеломные клетки. В некоторых вариантах осуществления, где тяжелая и легкая цепи совместно экспрессируются у одного хозяина, полученные антитела могут быть изолированы.

В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая тяжелую или легкую цепь, может быть модифицирована. Например, в некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой или легкой цепи мыши может быть заменена на константную область тяжелой или легкой цепи человека. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления может быть получено химерное антитело, которое имеет константные области антитела человека, но сохраняет специфичность связывания антитела мыши.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные антитела могут быть экспрессированы в определенных клеточных линиях. В некоторых вариантах осуществления последовательности, кодирующие определенные антитела, могут быть использованы для трансформации, подходящей клеткихозяина млекопитающих. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансформация может быть проведена любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Некоторые типичные способы включают, но не ограничиваются упаковкой полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор), трансдуцирование клетки-хозяина вирусом (или вектором) и использование некоторых процедур трансфекции, известных в данной области, как, например, в патентах США 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455. В некоторых вариантах осуществления процедура трансформации может зависеть от трансформируемого хозяина. Некоторые типичные способы для введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают, но не ограничиваются следующим списком: декстран-опосредованная трансфекция, преципитация с фосфатом кальция, полибрен-опосредованная трансфекция, слияние протопласта, электропорация, инкапсуляция полинуклеотида(ов) в липосомы и прямая микроинъекция ДНК в ядро.

Некоторые типичные клеточные линии млекопитающих, доступные как хозяева для экспрессии, известны в данной области и включают, но не ограничены различными иммортализованными клеточными линиями доступными от Американской Коллекции Типов Культур (АТСС), включающими, но не ограниченными клетками яичника китайского хомячка (СНО-клетки), НеЬа-клетками, клетками почек джунгарского хомячка (ВНК-клетки), клетками почек обезьяны (СО8-клетки), клетками гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер С2) и рядом других клеточных линий. В некоторых вариантах осуществления клеточные линии могут быть выбраны путем определения, какие из клеточных линий продуцируют высокие уровни антител, которые специфически связываются с АНСГ^А

Е. Некоторые полипетидные иммуногены.

В некоторых вариантах осуществления для получения антител животное иммунизируют иммуногеном. В некоторых вариантах осуществления иммуноген является полипетидом, включающим ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления иммуноген является полипетидом, включающим фрагмент ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления иммуноген является полипетидом, включающим Νконцевой домен двойной цепи ΑNСΡΤ^4.

В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ΑNСΡΤ^4 мыши. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ΑNСΡΤ^4 мыши, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ΑNСΡΤ^4 мыши,

- 20 016185 включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 50. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент ΛΝΟΓ^Α мыши. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент 8Е0 ΙΌ N0: 1 от остатка 21 до остатка 174. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент 8Е0 ΙΌ N0: 50 от остатка 21 до остатка 174. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает любой пептид из примерно 10-20 смежных аминокислот от остатка 21 до остатка 174 из 8Е0 ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает любой пептид из примерно 10-20 смежных аминокислот от остатка 21 до остатка 174 из 8Е0 ΙΌ N0: 50. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, выбранный из любых последовательностей от 8Е0 ΙΌ N0: 40 до 8Е0 ΙΌ N0: 48. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, выбранный из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 40, 41, 42 и 43. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, включающий одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 40, 41, 42 и 43. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 41, 42 и 43. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, чтобы он с большой вероятностью был иммуногенным. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, что он предсказан как гидрофильный и/или с большой вероятностью экспонирован на поверхности нативного АНСРТЕД мыши в его свернутом состоянии. Примерное руководство для выбора иммуногенных пептидов представлено, например, в Λи5иЬс1 с1 а1. (1989) Сиггсп! РгоЮсоЕ ш Мо1еси1аг Βίο1ο§ν СИ. 11.14 (Го11п ^11еу & 8оп§, ОТ) и ΗαιΊο\ν апб Ьапе (1988) Λиΐ^Ьοб^е8: А ΕαΕοηΙοίΎ Мапиа1 СИ. 5 (ОДб 8рпид ΗπγΕογ ΕαΕοηΙοίΎ. ^1б 8рпид ΗπγΕογ. ОТ).

Некоторые типичные алгоритмы для предсказания того, является ли пептидный участок белка гидрофильным и, следовательно, с большой вероятностью экспонирован на поверхности белка, известны специалистам в данной области. Некоторые такие алгоритмы используют информацию о первичной последовательности белка для генерации таких предсказаний. Некоторые такие алгоритмы основаны на способе, например, Норр апб \νοοά5 (1981) Ргос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А 78:3824-3828 или Ку1е апб Όοο1ίΐίΒ (1982) 1. Μο1. Βίο1. 157:105-132. Некоторые типичные алгоритмы для предсказания вторичной структуры белка, основанные на знании о первичной аминокислотной последовательности белка, известны специалистам в данной области, см., например, Сο^^^даи е1 а1. (1982) ^триЕ Ргодгатк Вютеб. 3:163-168. Некоторые такие алгоритмы основаны на способе, например, С1юи апб Рактап (1978) Апп. Вес. ВюсИет. 47:25-276. В некоторых вариантах осуществления пептидные участки, которые были предсказаны как формирующие β-поворот и, таким образом, которые с высокой вероятностью экспонированы на поверхности белка, могут быть выбраны в качестве иммуногенов.

В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ΛNСРТ^4 человека. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ΛNСРТ^4 человека, включающий аминокислотную последовательность из 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент 8Е0 ΙΌ N0: 2 от остатка 21 до остатка 169. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает любой пептид из примерно 10-20 смежных аминокислот от остатка 21 до остатка 169 из 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, чтобы он с большой вероятностью был иммуногенным. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, что он предсказан как гидрофильный и/или с большой вероятностью экспонирован на поверхности нативного ΛNСРТ^4 человека в его свернутом состоянии. Типовое руководство для выбора иммуногенных пептидов представлено, например, в Λи5иЬе1 е1 а1. (1989) СиггегИ Р^οΐοсο18 ш Μο^πΗγ Βίο1οβ\· СИ. 11.14 (Τοίιΐ'ΐ \νίΒ\· & δοτικ, ΠΥ) и ΗηιΊο\ν апб Ьапе (1988) Λиί^Ьοб^е8: А ^аЬο^аΐο^у Мапиа1 СИ. 5 (С.о1б 8рппд ΗπγΕογ ^аЬο^аΐο^у, Со1б 8рппд ΒηΓΕοΓ, ΜΥ).

В некоторых вариантах осуществления животное иммунизируют иммуногеном и одним или несколькими адъювантами. В некоторых вариантах осуществления адъювант используется для увеличения иммунного ответа в зависимости от вида организма-хозяина. Некоторые типичные адъюванты включают, но не ограничиваются следующим списком: адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральные соли, такие как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, поверхностно-активные вещества, хитозан, лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, и потенциально полезные адъюванты для человека, такие как ВСО (бацилла Кальмет-Герена) и ^ιύικΒκΒπιιπι рагсит. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ на иммуноген, например пептидный иммуноген, усиливается при присоединении иммуногена к другой иммуногенной молекуле или белку-носителю. Некоторые типичные белки-носители включают, но не ограничиваются следующим списком: гемоцианин морского блюдечка (ΚΒΗ), токсин тетануса, дифтерийный токсин, овальбумин, холерный токсин и их иммуногенные фрагменты. Для примерного введения в связывание пептидных иммуногенов с белковыми носителями, см., например, Аи5иЬе1 е1 а1. (1989) СиггегИ РюЮ^Е ш ΜοΒ^^ Βίο1οβ\· СИ. 11.15 (^οИи \νίΒ\· & δοϊ'!^ NΥ) и ΗηΓ1ο\ν апб Ьапе (1988) Λпι^Ьοб^е5: А ^аЬο^аΐο^у Мапиа1 СИ. 5 (Со1б 8рппд ЧагΕογ ^аЬο^аΐο^у, Со1б 8рппд ΗπγΕογ ОТ).

В некоторых вариантах осуществления любой из вышеперечисленных иммуногенов может быть получен с использованием стандартных рекомбинантных способов. Например, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий ΛNСРТ^4 мыши или человека, может быть клонирован в

- 21 016185 подходящий экспрессионный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает последовательность нуклеиновых кислот из 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8Е0 ΙΌ N0: 4. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вектор в дальнейшем вводится в подходящую клетку-хозяин. В некоторых вариантах осуществления полипептид потом выделяется из клетки-хозяина стандартными способами. Для некоторых типичных способов экспрессии рекомбинантных белков см., например, АикиЬе1 е! а1. (1991) Ситгеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Βίοίομν СЬ. 16 (ίοΐιη \¥Пеу & 8опк, НУ).

Р. Некоторые анализы.

1. Некоторые анализы на связывание.

В некоторых вариантах осуществления антитела скринируются на связывание с АКСРТЕТ с использованием некоторых стандартных способов, которые определяют связывание антитела с антигеном. Например, в некоторых вариантах осуществления способность моноклонального антитела связывать АКСРТЕТ определяется стандартными способами иммуноблоттинга, такими как вестерн-блот, см., например, АикиЬе1 е! а1. (1992) Ситгеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду СЬ. 10.8 (ίοΐιη \¥Пеу & 8опк, КУ); Наг1ο\ν апб Ьапе (1988) АпбЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рпп§ НагЬог, ИУ). В некоторых вариантах осуществления ΆΧΟΡΔΑ который используется в таких анализах, может быть выделен отдельно или может присутствовать в сложной смеси белков и/или макромолекул.

В некоторых вариантах осуществления способность моноклонального антитела связывать ΆNСΡТ^4 оценивается способом конкурентного связывания, который определяет способность антителакандидата конкурировать с известным анти-ΆNСΡТ^4 антителом за связывание ΆNСΡТ^4. В некоторых таких вариантах осуществления известное анти-ΆNСΡТ^4 антитело является любым из моноклональных антител, описанных в части УЬЬ В некоторых вариантах осуществления способ конкурентного связывания может быть осуществлен с помощью ЕЫ8А, см., например, Наг1о\г апб Ьапе (1988) АпбЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1 СЬ. 14 (Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рпп§ НагЬог, ИУ).

В некоторых вариантах осуществления анализ связывания используется для количественной оценки кинетики связывания (например, константы скорости) или аффинности связывания (например, константа ассоциации или диссоциации) антитела против ΆNСΡТ^4. В некоторых вариантах осуществления кинетика или аффинность связывания определяется в твердой фазе путем иммобилизации антигена (например, ΆNСΡТ^4) на твердой подложке. Иммобилизованный антиген захватывает антитела из раствора.

В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания определяются способами, основанными на ЕЫ8А. В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания определяются при помощи технологии, основанной на биосенсорах, такой как технология поверхностного плазменного резонанса В1асоге (В1асоге, Р1кса!агау, N1). Некоторые такие способы известны специалистам в данной области, см., например, МсСаГГейу е! а1. (ебк.) (1996) АпбЬобу Епдтееппд: А Ргас11са1 АрргоасЬ ([ВЬ, 0хГогб, ИК); Со1бЬег§ е! а1. (1993) Сигг. 0рш. Iттиηο1. 5:278-281; Каг1ккоп е! а1. (1991) Ь Iттиηο1. МеШобк 145:229-240; Ма1тду1к! (1993) Сигг. 0рш. ^типок 5:282-286; для обзора см. НоодепЬоот, 0уег\зе\у оГ АпбЬобу РЬаде-Б1кр1ау ТесЬпо1оду апб Ик Аррбсабопк, Ггот Ме!Ьобк ш Мо1еси1аг Вю1оду: АпбЬобу РЬаде Б1кр1ау: Ме!Ьобк апб РгоЮсо1к (2002) 178:1-37 а! 19 (0'Впеп апб Абкеп, ебк., Нитап Ргекк, То!о^а, N1).

В некоторых вариантах осуществления определяется кинетика связывания или аффинность связывания РаЬ-фрагмента, который специфически связывается с ΆNСΡТ^4. В некоторых случаях РаЬфрагменты имеют свойства не мультимеризоваться. В некоторых случаях мультимеризация может осложнять измерение кинетики связывания и аффинности связывания в твердофазных способах, см., например, НоодепЬоот, 0уег\зе\\· оГ АпбЬобу РЬаде-Б1кр1ау ТесЬпо1оду апб бк Аррбсабопк, Ггот Ме!Ьобк т Мо1еси1аг Вю1оду: АпбЬобу РЬаде Б1кр1ау: Ме!Ьобк апб РгоЮсо1к (2002) 178:1-37 а! 19 (0'Впеп апб Абкеп, ебк., Нитап Ргекк, То!о^а, N1). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления РаЬ-фрагмент, который специфически связывается с ΆNСΡТ^4. является подходящим для использования в анализе связывания, в котором антиген иммобилизован на твердой подложке, как, например, в способе, основанном на ЕЫ8А или В1асоге-способе. В некоторых вариантах осуществления РаЬ-фрагменты получают из интактного антитела, которое специфически связывается с ΆNСΡТ^4. с использованием энзиматических способов. В некоторых вариантах осуществления РаЬ-фрагменты получают путем экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих РаЬ-фрагменты в рекомбинантной экспрессионной системе, такой как те, которые описаны выше, часть У.Б.3.

В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания антитела против ΆNСΡТ^4 определяется с использованием способов жидкой фазы. В таких способах кинетика или аффинность связывания измеряется для комплекса антиген-антитело в растворе. Некоторые такие способы известны специалистам в данной области. Неограничивающим примером такого способа является способ кинетического исключения или КюЕхА, см., например, В1аке е! а1. (1996) Ь Вю1. СЬет. 271:27677-27685; Б гаке е! а1. (2004) Апа1. ВюсЬет. 328:35-43 (сравнивающий твердофазный В1асоге и жидкофазный КтЕхА способы). В некоторых вариантах осуществления оборудования для проведения КшЕхА предоставляется 8ар1бупе йкбитепб, Шс. (Во1ке, ГО).

В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания мультивалентного антитела или антитела, которое мультимеризуется, может быть определена, используя способ

- 22 016185 жидкой фазы. В некоторых случаях, измерение кинетики связывания или аффинности связывания мультивалентного антитела или антитела, которое мультимеризуется, подлежит анализу в жидкой фазе.

В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания анти-АНСРТЙТ антитела, измеренная через его К_с, примерно равна 10^-6 М или меньше. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания анти-АНСРТЙТ антитела примерно равна 10^-7 М, примерно равна 10^-8 М, примерно равна 10^-9 М или меньше. В некоторых таких вариантах осуществления анти-АНСРТЙТ антитело может быть использовано как терапевтическое антитело, см., например, Нибкоп е! а1. (2003) №1иге Меб. 9:129-134. В некоторых вариантах осуществления достижимы аффинности связывания меньше чем 10^-9 М (например, аффинности связывания начиная от примерно 500 до примерно 0,5 пМ, включая, но не ограничиваясь аффиностями связывания от примерно 100 до примерно 5 пМ), например, используя способы созревания сродства, см., например, Вобег е! а1. (2000) Ргос. Νηί1 Асаб. 8сг И8А 97:10701-10705.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое было индуцировано против АНСРТЙТ мыши, скринируется на специфическое связывание с АНСРТЬ4 человека с использованием некоторых стандартных способов детектирования, например те, которые здесь описаны. Способность моноклонального антитела связывать АНСРТЬб как мыши, так и человека (т.е. демонстрировать перекрестное взаимодействие), показывает наличие одного и того же эпитопа в АНСРТЙД мыши и человека. В некоторых вариантах осуществления способов детектирования, которые используют денатурирующие условия (например, вестерн-блот), перекрестное взаимодействие показывает, что моноклональное антитело мыши связывается с тем же самым линейным эпитопом в АЫСРТЬ4 мыши и человека. В некоторых вариантах осуществления способов детектирования, которые используют неденатурирующие условия (например, вестерн-блот), перекрестное взаимодействие показывает, что моноклональное антитело мыши связывается с тем же самым эпитопом (например, линейным эпитопом или конформационным эпитопом) в АНСРТЙТ мыши и человека.

2. Некоторые способы картирования эпитопа.

В различных вариантах осуществления эпитоп, с которым связывается моноклональное антитело, определяется любым из некоторого числа анализов. Некоторые типичные анализы описаны, например, в Мотк, Ме!йобк ш Мо1еси1аг В1о1оду, то1. 66: Ерйоре Марршд Рго!осо1к (1996) (Нитапа Ргекк, То!о^а, ΝΙ). Например, картирование эпитопа может быть получено через анализы экспрессии генных фрагментов или способы, основанные на пептидах. В некоторых вариантах осуществления анализа экспрессии генных фрагментов, например нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты АНСРТРб, экспрессируются в прокариотических клетках и выделяются. В некоторых таких вариантах осуществления оценивается способность моноклонального антитела связывать эти фрагменты, например, путем иммунопреципитации или иммуноблоттинга. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты АЫСРТЬ4, транскрибируются и транслируются ш т11го в присутствии радиоактивных аминокислот. Радиоактивно меченные фрагменты АЫСРТЬ4 после этого тестируют на связывание с моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления фрагменты АНСРТЙТ получают путем протеолитической фрагментации. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют с использованием библиотек случайных пептидов, находящихся на поверхности фага или дрожжевой клетки. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют путем тестирования библиотеки перекрывающихся синтетических пептидных фрагментов АНСРТЙТ на связывание с моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют, используя конкурентный способ, такой как те, которые описаны ниже.

3. Некоторые способы, основанные на конкуренции.

В некоторых вариантах осуществления идентифицируют моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом АНСРТРб, что и интересующее моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления такие моноклональные антитела идентифицируют путем картирования эпитопа, например, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления такие моноклональные антитела идентифицируют путем стандартных способов, основанных на конкуренции, см., например, Наг1оте апб Ьапе (1988) Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1 с11. 14 (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ). В типовом неограничивающим примере конкурентного способа АНСРТЙТ или его фрагмент иммобилизуют в лунках многолуночного планшета. В некоторых вариантах осуществления интересующее моноклональное антитело стандартными способами метят флуоресцентной меткой (в некоторых вариантах осуществления - флуоресцеин изотиоцианатом). В некоторых таких вариантах осуществления смеси меченого интересующего моноклонального антитела и немеченого тестируемого моноклонального антитела добавляют в лунки. В некоторых таких вариантах осуществления определяется флуоресценция в каждой лунке для определения того, насколько немеченое тестируемое моноклональное антитело блокирует связывание меченого интересующего моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления решают, что моноклональные антитела имеют общий эпитоп, если каждое антитело блокирует связывание другого антитела на 50% или больше. Типичные способы, основанные на конкуренции, также описаны, например, в Мотк, Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, то1. 66: Ерйоре Марртд Рго!осо1к (1996) (Нитапа Ргекк, То!о^а, ΝΙ). Неограниченный примерный способ, основанный на конкуренции, представлен ниже, часть VI.О.

- 23 016185

4. Некоторые способы для идентификации нейтрализующих антител.

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела скринируются на те из них, которые являются нейтрализующими антителами, т.е. те, которые уменьшают активность ΆNСРТ^4 ίη νίΐτο и/или ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления активностью ΆΝΤΕΡΑ является способность ΆΝ^^Α ингибировать ЬРЬ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело идентифицируют по его способности увеличивать активность ЬРЬ в присутствии АNСРТ^4. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующее антитело увеличивает активность ЬРЬ по меньшей мере примерно на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% относительно контрольного антитела. Некоторые типичные анализы для измерения активности ЬРЬ ίη νίΐτο и ίη νίνο представлены ниже, части νΐ.Ό и νΐ.Ι соответственно.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело, которое уменьшает активность АNСРТ^4 ίη νίνο, определяется по его способности уменьшать уровень по меньшей мере одного липида сыворотки. Некоторые типичные липиды сыворотки включают, но не ограничены триглицеридами, холестерином и свободными жирными кислотами. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующее антитело уменьшает уровень по меньшей мере одного липида сыворотки по меньшей мере примерно на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% относительно контрольного антитела. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело, которое уменьшает активность АNСРТ^4 ίη νίνο, определяют по его способности препятствовать некоторым эффектам жиросодержащей диеты или обеспечивать защиту от таких эффектов. Некоторые типичные эффекты включают, но не ограничены набором веса, ожирением, непереносимостью глюкозы (гипергликемия), нечувствительность к инсулина (гиперинсулинемия), стеатоз при гепатите (жировая печень) и накопление липида в миоцитах. Некоторые типичные анализы для измерения таких эффектов представлены ниже, часть VI.С, VI.Е и νΐ.Ρ.

С. Некоторые фармацевтические композиции и способы лечения с использованием нейтрализующих моноклональных антител.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело может быть использовано в качестве лекарственного антитела. Например, определенные нейтрализующие антитела, которые могут применяться как лекарственные антитела, включают в себя, но не ограничиваются ими, химерные антитела, гуманизированные антитела и человеческие антитела. Специалисты в этой области науки хорошо осведомлены о способах использования определенных антител как терапевтических агентов. Например, более дюжины антител были одобрены РОА для использования в качестве лекарственных агентов с середины 80-х, см., например, Нибюн е1 а1. (2003) №1Шге Меб. 9:129-134; Сига (2002) №11игс 417:584-586; Вгекке е1 а1. (2002) №11иге Яеу1е\\ъ 2:52-62. Некоторые антитела, одобренные РОА, включают в себя такие, которые используют для лечения различных форм рака, воспаления и вирусных инфекций, а также для предотвращения реакции отторжения трансплантата, см., например, Сига (2002) №11иге 417:584-586; Вгекке е1 а1. (2002) №11иге Яеу1е\\ъ 2:52-62. Кроме того, более дюжины антител проходят в настоящее время клинические испытания, см., например, Вгекке е1 а1. (2002) №11иге Яеу1е\\ъ 2:52-62.

В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения нарушений жирового обмена, в том числе введение эффективных количеств нейтрализующих антител против АNСРТ^4. В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения острых нарушений жирового обмена, в том числе введение эффективных количеств нейтрализующих антител против АNСРТ^4. В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения хронических нарушений жирового обмена, в том числе введение эффективных количеств нейтрализующих антител против АNСРТ^4.

Используемый здесь термин нарушения жирового обмена включает в себя, но не ограничивается ими, нарушения, которые могут вести к вторичной гиперлипидемии (включающей в себя гипертриглицеридемию и гиперхолестеринемию). Некоторые нарушения жирового обмена, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, атеросклероз, дислипидемию, гипертриглицеридемию (включающую в себя гипертриглицеридемию, вызванную лекарствами, гипертриглицеридемию, вызванную мочегонными средствами, гипертриглицеридемию, вызванную алкоголем, гипертриглицеридемию, вызванную бетаадренергическими блокирующими агентами, гипертриглицеридемию, вызванную эстрогенами, гипертриглицеридемию, вызванную глюкокортикоидами, гипертриглицеридемию, вызванную ретиноидами, гипертриглицеридемию, вызванную циметидином, и наследственную гипертриглицеридемию), острый панкреатит, связанный с гипертриглицеридемией, хиломикронный синдром, хиломикронемию, дефицит Апо-Е, дефицит или низкую активность ЛПЛ, гиперлипидемию (включающую в себя наследственную смешанную гиперлипидемию), гиперхолестеринемию, подагру, связанную с гиперхолестеринемией, ксантоматоз (подкожные отложения холестерина), болезнь коронарных артерий (также называемую ишемической болезнью сердца), воспаление, связанное с болезнью коронарных артерий, рестеноз, заболевания периферических сосудов и инсульт. Некоторые нарушения жирового обмена, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, нарушения, связанные с весом тела, такие как ожирение, метаболический синдром, включающий в себя независимые компоненты метаболического синдрома (например, общее ожирение, РВС/преддиабет/диабет, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию и гипертензию), гипотиреоидизм, уремию и другие состояния, связанные с увеличением веса (включающие в себя быстрое увеличение веса), потерю веса, поддержание сниженного веса или риск увеличения веса

- 24 016185 после потери веса. Некоторые нарушения жирового обмена, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, нарушения уровня сахара в крови, такие как диабет, гипертензию и синдром поликистоза яичников, связанный с инсулинорезистентностью. Некоторые нарушения жирового обмена, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, трансплантацию почки, нефротический синдром, синдром Кушинга, акромегалию, системную красную волчанку, дисглобулинемию, липодистрофию, гликогеноз I типа и болезнь Аддисона.

Нарушения жирового обмена включают в себя, но не ограничиваются ими, вторичную гипертриглицеридемию (ГТГ, включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, типы I, V и IV), включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, ГТГ, связанную с питанием (включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, избыточное потребление алкоголя, увеличение веса и ожирение), лекарствами (включающими в себя, но не ограничивающимися ими, экзогенные эстрогены, тамоксифен, ретиноиды, тиазиды, хлорталидон, бета-блокаторы, ингибиторы протеаз (включающие в себя, но не ограничивающиеся им, ритонавир), инфузионный пропофол и парентеральные инфузии липидов), нарушения метаболизма (включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, диабет, беременность, хроническую почечную недостаточность, гипотиреоидизм, наследственную гиперлипидемию и панкреатит).

Нарушения жирового обмена включают в себя, но не ограничиваются ими, нарушения жирового обмена, связанные с дисфункцией сосудов, связанные с нарушением кровоснабжения, нарушения жирового обмена, связанные с пролиферативными заболеваниями, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, неоплазию (включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, рак предстательной железы, рак почки, печени, груди, яичника, легкого и рак поджелудочной железы), нарушения, возникающие в ответ на воспаление, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, такие как связанные, например, с инфекционными заболеваниями, лечением повреждений, иммунодефицитными синдромами (СПИД и другие, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, синдромы, связанные с нарушением развития), образование шрамов, атеросклероз, рестеноз и отторжение трансплантата, аутоиммунные нарушения и хронические воспалительные заболевания и нарушения, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, заболевания, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, и нарушения, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, болезнь Крона, колит, воспалительное заболевание кишечника, реактивный артрит, включающий в себя болезнь Лайма, инсулин-зависимый диабет, органоспецифичные аутоиммунные реакции, рассеянный склероз, тиреоидит Хашимото и болезнь Грейвса, синдром Шегрена, контактный дерматит, псориаз, склеродермию, болезнь трансплантат против хозяина, саркоидоз, малярию, сепсис, панкреатит, атопические состояния, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, астму и аллергию, включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, аллергический ринит, гастроинтестинальные аллергии, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, пищевые аллергии, эозинофилию, конъюнктивит и гломерулонефрит, нарушения свертываемости крови, эндотоксический шок и другие нарушения, опосредованные воспалением, такие как ночное апноэ и сонливость.

В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения нарушений жирового обмена, включая в себя введение эффективных количеств антител к ΑΝΟΡΊΕ4 и других терапевтических агентов. В некоторых таких вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент вводят в эффективном количестве. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент является другим антителом к ΑΝΟΡΊΕ4. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент не является антителом. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент является агентом, снижающим уровень одного или более сывороточных липидов. Некоторые дополнительные терапевтические агенты, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, ингибиторы синтеза холестерина (статины), такие как ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (например, ловастатин, симвастатин, правастатин и флювастатин); секвестранты желчных кислот, такие как холестирамин и другие смолы; ингибиторы секреции ЛПОНП, такие как ниацин; стимуляторы липопротеинлипазы, такие как производные фиброевой кислоты; липофильные антиоксиданты, такие как пробукол; ингибиторы ацил-КоА-холестеринацилтрансферазы; антагонисты рецепторов фарнезоида X; активаторы белка, активирующего расщепление регуляторного связывающего стеролы белка (ЗСАР); ингибиторы микросомального белка переноса триглицеридов (МТР) и АпоЕ-связанный белок. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент является агентом, повышающим уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Неограниченные примеры таких агентов включают в себя, но не ограничиваются ими, ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина (СЕТР).

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать эффективное количество антитела к АХСРТЬ4 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, растворитель, эмульгатор, консервант и/или адъювант. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать эффективное количество антитела к АХСРТЬТ и эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, растворителем, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент отбирают из агентов, описанных выше.

- 25 016185

В некоторых вариантах осуществления материалы прописи, используемые в фармацевтических композициях, являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит материалы прописи для модификации, сохранения или консервации, например рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, уровня растворимости или высвобождения, абсорбции или проницаемости композиции. В некоторых вариантах осуществления приемлемые материалы прописи включают в себя, но не ограничиваются ими, аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин); антимикробные вещества; антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, сульфит натрия и гидросульфит натрия); буферы (например, бораты, бикарбонаты, Тп$-НС1. цитраты, фосфаты и другие органические кислоты); агенты-наполнители (например, маннит и глицин); хелатообразующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА); комплексообразующие агенты (например, кофеин, поливинилпиролидон, бета-циклодекстрин и гидроксипропил-бетациклодекстрин); наполнители; моносахариды, дисахариды и другие углеводороды (например, глюкозу, маннозу и декстрины); белки (например, сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулины); красящие, ароматизирующие и разбавляющие агенты; эмульгирующие агенты; гидрофильные полимеры (например, поливинилпиролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (например, натрий); консерванты (например, хлорид бензалкония, бензойную кислоту, салициловую кислоту, тимерозал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновую кислоту и пероксид водорода); растворители (например, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль); сахарные спирты (например, маннит и сорбит); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажняющие агенты (например, поверхностно-активные вещества, ПЭГ, эфиры сорбитана, полисорбаты (например, полисорбат 20 и полисорбат 80), тритон, трометамин, лецитин, холестерин и тилоксапал); агенты, повышающие стабильность (например, сахарозу и сорбит); агенты, повышающие тонус (например, галогениды щелочных металлов (например, хлорид натрия или калия), маннит и сорбит); средства доставки; разбавители; наполнители и фармацевтические адъюванты, Кетшдои'к Рйагтасеийса1 8с1еисе8, 18^4Ь Εάίΐίοη, А.К. Сеииаго, ей., Маск РиЬйкЫид Сотраиу (1990).

В некоторых вариантах осуществления антитело к АЫСРТЬ4 или другая терапевтическая молекула связаны с переносчиком, увеличивающим время полувыведения. Некоторые такие переносчики, увеличивающие время полувыведения, известны в науке. Некоторые такие переносчики включают в себя, но не ограничиваются ими, домен Рс, полиэтиленгликоль и декстран. Некоторые такие переносчики описаны, например, в опубликованной заявке РСТ № \¥О 99/25044.

В некоторых вариантах осуществления оптимальная фармацевтическая композиция может быть определена специалистом в этой области науки в зависимости, например, от намеченного пути введения, способа доставки и желательной дозировки, см., например, вышеуказанный Кетшдои'к Рйагтасеийса1 8с1епсе5. В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, уровень высвобождения ш νίνο или уровень клиренса нейтрализующего антитела ш νίνο.

В некоторых вариантах осуществления первичный переносчик или носитель в фармацевтической композиции может быть как водной, так и неводной природы. Например, в некоторых вариантах осуществления приемлемый переносчик или носитель может быть водой для инъекций, физиологическим солевым раствором или искусственной цереброспинальной жидкостью, возможно, дополненными другими материалами, обычно используемыми в композициях для парентерального введения. Некоторые, приведенные для примера, переносчики включают в себя, но не ограничиваются ими, нейтральные буферные соли или соли, смешанные с сывороточным альбумином. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат буфер Тгщ с уровнем рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с уровнем рН примерно 4,0-5,5, которые могут, кроме того, включать в себя сорбит или его приемлемый заменитель. В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая антитело к АЫСРТЬ4, вместе или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, может быть получена путем смешивания выбранной композиции, имеющей желательный уровень чистоты, с дополнительными агентами прописи (КетшдБои'к Рйагтасеи1гса1 8с1еисе5, см. выше) в форме лиофилизированного порошка или водного раствора. В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая антитело к АЫСРТЬ4, вместе или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, может быть получена в виде лиофилизата с использованием обычного наполнителя, такого как сахароза.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию выбирают для парентерального применения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию выбирают для ингаляции или для введения через пищеварительный тракт, то есть орально. Некоторые, приведенные для примера, способы получения фармацевтически приемлемых композиций хорошо известны специалистам в этой области науки.

В некоторых вариантах осуществления компоненты композиции представлены в концентрациях, приемлемых для места введения. В некоторых вариантах осуществления используют буферы для поддержания композиции на физиологическом уровне рН или на немного более низком уровне рН, обычно в

- 26 016185 диапазоне рН от примерно 5 до примерно 8.

В некоторых вариантах осуществления, когда предусмотрено парентеральное введение, фармацевтическая композиция может быть в форме апирогенного, приемлемого для парентерального введения водного раствора, содержащего желательное антитело к ЛЕСРТЬ^ с или без дополнительного терапевтического агента в фармацевтически приемлемом переносчике. В некоторых вариантах осуществления переносчиком для парентеральных инъекций является стерильная вода, в которой присутствует антитело к АНСРТРЭ по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента и которую получают в виде стерильного изотонического раствора, должным образом хранящегося. В некоторых вариантах осуществления препарат может состоять из прописи желательной молекулы и агента, такого как приемлемые для инъекции микросферы, биоэродируемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые могут применяться для контролируемого или длительного высвобождения продукта и которые могут затем быть доставлены с помощью инъекционных депо. В некоторых вариантах осуществления может быть также использована гиалуроновая кислота, которая может вызывать эффект замедленного высвобождения в циркуляции. В некоторых вариантах осуществления для введения желательной молекулы могут быть использованы имплантируемые средства доставки лекарств.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть получена в форме, предназначенной для ингаляции. В некоторых вариантах осуществления антитело к АНСР^Й по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента может быть получено в виде сухого порошка для ингаляции. В некоторых вариантах осуществления ингаляционный раствор, содержащий антитело к АНСРТЬ4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, может содержать пропеллент для доставки в виде аэрозоля. В некоторых вариантах осуществления растворы можно распылять.

В некоторых вариантах осуществления пропись можно вводить орально. В некоторых вариантах осуществления антитело к АНСРТЬ4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, которое вводят таким способом, может быть изготовлено с или без носителей, обычно используемых в приготовлении твердых форм дозирования, таких как таблетки и капсулы. В некоторых вариантах осуществления капсулы могут предназначаться для высвобождения активного компонента прописи в том месте желудочно-кишечного тракта, где биодоступность максимальна, а разрушение до попадания в системный кровоток минимально. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный агент может быть добавлен для облегчения всасывания антитела к АНСРТЬ4 с или без каких-либо других дополнительных терапевтических агентов. В некоторых вариантах осуществления разбавители, ароматизаторы, легкоплавкие воски, растительные масла, лубриканты, суспендирующие агенты, агенты, способствующие дезинтеграции таблеток, и/или связывающие агенты также могут использоваться.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антитела к АНСРТЬ4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, используется в смеси с нетоксичным эксципиентом, пригодным для производства таблеток. В некоторых вариантах осуществления путем растворения таблеток в стерильной воде или другом обычном носителе могут быть получены растворы в форме дозированных единиц. Некоторые эксципиенты, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, инертные разбавители (например, карбонат кальция, карбонат натрия, бикарбонат натрия, лактозу и фосфат кальция); связывающие агенты (например, крахмал, желатин и акацию) и увлажняющие агенты (например, стеарат магния, стеариновую кислоту и тальк).

Дополнительные фармацевтические композиции очевидны специалисту в этой области науки, включая в себя прописи, содержащие антитело к АНСРТЬ4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, в формах с длительным или контролируемым высвобождением. Некоторые формы с длительным или контролируемым высвобождением, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, липосомные носители, биоэродируемые микрочастицы, пористые гранулы и инъекционные депо. Некоторые, приведенные для примера, способы получения определенных прописей известны специалистам в этой области науки. В некоторых вариантах осуществления препараты с замедленным высвобождением могут включать в себя полупроницаемые полимерные матрицы определенной формы, например пленки или микрокапсулы. Некоторые, приведенные для примера, матрицы с замедленным высвобождением включают в себя, но не ограничиваются ими, полиэфиры, гидрогели, полилактиды (см., например, патент США № 3773919 и Европейский патент 058481), кополимеры Ьглутаминовой кислоты и гамма этил-Ь-глутамат (см., например, 81бшап е! а1. (1983) Вюро1ушегк 22:547556), поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) (см., например, Ьапдег е! а1. (1981) 1. Вюшеб. Ма!ег. Век. 15:167277 и Ьапдег (1982) Сйет. Тесй. 12:98-105), этиленвинилацетат (Ъапдег е! а1., выше) и поли-Э(-)-3оксимасляную кислоту (Европейский патент 133988). В некоторых вариантах осуществления композиции с замедленным высвобождением могут включать в себя липосомы, которые могут быть получены в некоторых вариантах осуществления любым из нескольких известных в науке способов, см., например, Еррйеш е! а1. (1985) Ргос. №11. Асаб. 8с1 И8А, 82:3688-3692; Европейский патент 036676; Европейский

- 27 016185 патент 088046 и Европейский патент 143949.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предназначенная для введения ίη νί\Ό. обычно является стерильной. В некоторых вариантах осуществления это может быть достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. В некоторых вариантах осуществления, когда композиция лиофилизирована, стерилизация с использованием этого способа может проводиться как до, так и после лиофилизации и восстановления. В некоторых вариантах осуществления композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизованном виде или в виде раствора. В некоторых вариантах осуществления парентеральные композиции обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный доступ, например контейнер или флакон для внутривенных растворов, имеющий крышку, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций.

В некоторых вариантах осуществления после получения фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензий, геля, эмульсии, сухого вещества или обезвоженного или лиофилизированного порошка. В некоторых вариантах осуществления такие прописи можно хранить как в форме, готовой к применению, так и в форме, требующей предварительного восстановления перед введением (например, в лиофилизированной форме).

В некоторых вариантах осуществления используют наборы для получения единиц введения с разовой дозой. В некоторых вариантах осуществления каждый такой набор может содержать первый контейнер с сухим белком и второй контейнер, содержащий водную композицию. В некоторых вариантах осуществления наборы включают в себя предварительно наполненные одно- или многокамерные шприцы (например, шприцы с жидким или лиофилизированным содержимым).

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей антитело к ΑNСΡΤ^4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента и предназначенной для использования в лечебных целях, будет зависеть, например, от обстоятельств и объективных факторов лечения. Специалист в этой области науки должен учитывать, что применяемые для лечения уровни дозировки в соответствии с некоторыми вариантами осуществления будут варьировать в зависимости, в частности, от доставки молекулы, которая является показанием к применению антитела к ΛΝΟΡΤΕ-4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, пути введения и параметров (вес тела, поверхность тела или размер органа) и/или состояния (возраст и общее здоровье) пациента. В некоторых вариантах осуществления лечащий врач может изменять дозу и путь введения для достижения оптимального терапевтического эффекта. В некоторых вариантах осуществления обычная дозировка может меняться от примерно 0,1 мкг/кг веса тела пациента до примерно 100 мкг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. В некоторых вариантах осуществления дозировка может меняться от 0,1 до примерно 100 мкг/кг; от 1 до примерно 100 мкг/кг или от 5 до примерно 100 мкг/кг, включая в себя все промежуточные значения (и доли) между любыми вышеупомянутыми конечными точками. В некоторых вариантах осуществления может использоваться дозировка от примерно 10 мкг/кг веса тела до примерно 60 мкг/кг веса тела. В некоторых вариантах осуществления может использоваться дозировка примерно 10 мкг/кг веса тела, примерно 20 мкг/кг веса тела, примерно 30 мкг/кг веса тела, примерно 40 мкг/кг веса тела, примерно 50 мкг/кг веса тела или примерно 60 мкг/кг веса тела.

В некоторых вариантах осуществления приемлемая дозировка может быть определена на основе исследований на животных, таких как приведенные ниже, например, в частях УТР, К и от Т до Υ.

В некоторых вариантах осуществления для определения частоты дозирования должны быть учтены фармакокинетические параметры антитела к АНСТЕД и в случае применения любого дополнительного терапевтического агента, используемого в композиции. В некоторых вариантах осуществления лечащий врач должен вводить композицию до достижения дозировки, позволяющей получить желаемый эффект. В некоторых вариантах осуществления, таким образом, композицию можно вводить в виде единичной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать, а могут и не содержать равные количества желательной молекулы) через определенные промежутки времени или в виде длительной инфузии через имплантат или катетер. В некоторых вариантах осуществления специалистом в этой области науки обычно проводится дальнейшая оптимизация общепринятой дозы в рамках тех задач, которые обычно им преследуются. В некоторых вариантах осуществления общепринятые дозы могут быть индивидуализированы путем применения обычного способа доза-ответ. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело к ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну, две, три или четыре дозы в день фармацевтической композиции, содержащей антитело к ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну, две, три, четыре, пять или шесть доз в неделю фармацевтической композиции, содержащей антитело к ΛNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну или две дозы в месяц фармацевтической композиции, содержащей антитело к ΑNСΡΤ^4.

В некоторых вариантах осуществления путь введения фармацевтической композиции определяют в соответствии с известными способами, например оральный, путем внутривенной инъекции, интраперитонеальный, интрацеребральный, (интрапаренхимальный), интрацеребровентрикулярный, внутримышечный, внутриглазной, интраартериальный, интрапортальный или путь введения внутрь пораженных

- 28 016185 тканей; с помощью систем с замедленным высвобождением или с помощью имплантатов. В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить путем болюсной инъекции или длительной инфузии, или с помощью имплантатов.

В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить местно путем имплантации мембраны, губки или другого общепринятого материала, на котором желаемая молекула абсорбируется или инкапсулируется. В некоторых вариантах осуществления при применении имплантатов их можно имплантировать в любой подходящий орган или ткань, и доставка желаемой молекулы может осуществляться путем диффузии, в виде болюса с определенным временем высвобождения или путем длительного введения.

В некоторых вариантах осуществления может быть необходимым использование фармацевтической композиции, содержащей антитело к АНСРТЬА по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента способом ех νίνο. В таких случаях, клетки, ткани и/или органы, полученные от пациента, обрабатывают фармацевтической композицией, содержащей антитело к АКСРТЬ^ по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, после чего клетки, ткани и/или органы имплантируют обратно пациенту. В некоторых вариантах осуществления антитело к АНСРТЬ4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента доставляют путем имплантации определенных клеток, которые были генетически изменены с использованием описанных здесь способов, для экспрессирования и секретирования полипептидов. В некоторых вариантах осуществления эти клетки могут быть животными или человеческими, аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть иммортализированными. В некоторых вариантах осуществления с целью снижения вероятности иммунологического ответа клетки могут быть инкапсулированы для того, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующие материалы обычно являются биосовместимыми, полупроницаемыми полимерными пленками или мембранами, которые позволяют высвобождаться белковому(ым) продукту(ам), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими повреждающими факторами окружающих тканей.

Н. Некоторые способы выявления и диагностики.

В некоторых вариантах осуществления антитела против АНСРТЬД используют для определения присутствия АНСРТЬ4 ίη νίνο или ίη νίίτο. В некоторых вариантах осуществления уровень АНСРТЬ4 ίη νίνο коррелирует с медицинским состоянием, таким как нарушение жирового обмена, позволяя таким образом диагностировать медицинское состояние. Некоторые, приведенные для примера, медицинские состояния, которые могут быть диагностированы с помощью антител против ΑNСΡТ^4, указаны выше.

Некоторые, приведенные для примера, способы выявления известны в науке и включают в себя, но не ограничиваются ими, ЕЫ8А, радиоиммунный анализ, иммуноблотинг, вестерн-блот, иммунофлюоресцентный анализ и иммунопреципитацию. В некоторых вариантах осуществления антитела против АНСРТЬ4 модифицируют таким образом, что их можно определять непосредственно, например, путем связывания антитела с меткой. Некоторые, приведенные для примера, метки включают в себя, но не ограничиваются ими, флюорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы, электроноплотные реагенты, ферменты и лиганды. В некоторых вариантах осуществления антитела против АНСРТЬ4 определяют с использованием меченых вторичных антител, связывающихся с антителами определенного класса (например, антимышиные антитела козы).

Ι. Некоторые способы скрининга антагонистов и агонистов АНСРТЬ4.

В некоторых вариантах осуществления может быть применен способ скрининга агента, связывающего АНСРТЬ4. В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает в себя взаимодействие АНСРТЬД с одним или более кандидатными агентами при подходящих условиях и изучение связывания АНСРТЬД с одним или более кандидатными агентами. В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает в себя использование антитела против АНСРТЬД в анализе конкурентного связывания. В некоторых таких вариантах осуществления используют первую связывающую смесь, содержащую антитело против АНСРТЬД и АНСРТЬ4. Измеряют величину связывания между АНСРТЬ4 и антителом в первой связывающей смеси (М₀). Также используют вторую связывающую смесь, содержащую антитело, АНСРТЬ4 и исследуемый агент. Измеряют величину связывания между АНСРТЬ4 и антителом в второй связывающей смеси (М1). Величину связывания в первой связывающей смеси сравнивают с величиной связывания во второй связывающей смеси, например, путем вычисления соотношения М₁/М₀. Агент признается способным связывать ΑNСΡТ^4, если величина связывания антитела с АНСРТЬД во второй связывающей смеси меньше, чем величина связывания антитела с АНСРТЬ4 в первой связывающей смеси. В некоторых вариантах осуществления агент, связывающий АНСРТЬА уменьшает связывание антитела с АНСРТЬ4 по меньшей мере на примерно 10% (например, М₁/М₀<0,9), по меньшей мере на примерно 30% (например, М₁/М₀<0,7), по меньшей мере на примерно 50% (например, М₁/М₀<0,5), по меньшей мере на примерно 70% (например, М₁/М₀<0,3), по меньшей мере на примерно 80% (например, М₁/М₀<0,2), по меньшей мере на примерно 90% (например, М₁/М₀<0,1) или по меньшей мере на примерно 95% (например, М!/Мо<0,05).

В некоторых вариантах осуществления АКСРТЬ^ используемое в любых описанных выше спосо

- 29 016185 бах скрининга, является Ν-концевым суперскрученным доменом ΑNСΡΤ^4 или его фрагментом. Основываясь на наблюдении заявителя, что некоторые антитела, связывающие Ν-концевой суперскрученный домен ΑNСΡΤ^4, имеют нейтрализующую активность (см. ниже, часть VI.Ь. и νΐ.Ρ.), агент (например, антитело или агент, не являющийся антителом), идентифицируемый способом скрининга как связывающийся с Ν-концевым суперскрученным доменом ΑNСΡΤ^4, является кандидатом на роль антагониста активности ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления активность антагониста подтверждают путем демонстрации того, что кандидат на роль антагониста нейтрализует ΑNСΡΤ^4 в исследованиях ίη νίνο или ίη νίίτο, таких как описанные в части νΐ.Ό. и νΐ.Ι. В некоторых вариантах осуществления антагонисты ΑNСΡΤ^4 используются в лечении нарушений жирового обмена.

В некоторых вариантах осуществления могут быть применены способы скрининга агентов, которые связываются с доменом фибриногена ΑNСΡΤ^4. Основываясь на наблюдении заявителя, что антитело (6С11), которое связывает домен фибриногена ΑNСΡΤ^4, повышает активность ΑNСΡΤ^4 (см. части νΐ.Ε., νΐ-Р), агент (например, антитело или агент, не являющийся антителом), идентифицируемый способом скрининга как связывающийся с доменом фибриногена ΑNСΡΤ^4, является кандидатом на роль агониста активности ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления активность агониста подтверждают путем демонстрации того, что кандидат на роль агониста повышает ΑNСΡΤ^4 в анализах ίη νίίτο, таких как описанные в части νΐ.Ι., или путем введения кандидата на роль агониста ίη νίνο и изучения повышения уровней одного или более сывороточных липидов. В некоторых вариантах осуществления агонисты ΑNСΡΤ^4 используют в лечении некоторых нарушений, относящихся к выраженной потере веса, таких как нервная анорексия, нервная булимия и кахексия (истощение), связанных с такими заболеваниями, как рак, муковисцедоз и СПИД.

Некоторые, приведенные для примера, агенты, которые могут изучаться на связывание с ΑNСΡΤ^4, включают в себя, но не ограничиваются ими, антитела, малые молекулы (например, органические соединения, органометаллические соединения, соли органических и органометаллических соединений, сахариды, аминокислоты, нуклеозиды и нуклеотиды), алтамеры, пептиды и пептидомиметики. Некоторые, приведенные для примера, пептиды включают в себя растворимые пептиды, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, членов случайных пептидных библиотек (см., например, Ьат е1 а1. (1991) ИаШте 354:82-84; ΗοιίβΙιΑη е1 а1. (1991) №11иге 354:84-86) и членов полученных путем комбинаторной химии молекулярных библиотек, созданных из аминокислот Ό- и/или Ь-конфигураций; и фосфопептиды, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, членов случайных или частично вырожденных, направленных фосфопептидных библиотек (см., например, 8οпдуапд (1993) Се11 72:767-778).

В некоторых вариантах осуществления компьютерное моделирование и поисковые технологии позволяют идентифицировать соединения или усовершенствовать уже идентифицированные соединения, связывающие ΑNСΡΤ^4. Некоторые, приведенные для примера, системы молекулярного моделирования включают в себя, но не ограничиваются ими, программы СНАКММ и РИАЭТА (Ρο1удеη ί,’οΓροπιΙίοη. ХУаННаш. ^А). СНАКММ осуществляет функции минимизации энергии и молекулярной динамики. риАКГА осуществляет конструирование, графическое моделирование и анализ молекулярной структуры. риАКГА позволяет проводить интерактивное конструирование, модификацию, визуализацию и анализ взаимодействия молекул между собой.

ί. Нуклеиновые кислоты - антагонисты ΑNСΡΤ^4.

В некоторых вариантах осуществления предусматривается использование изолированных нуклеиновых кислот, которые снижают экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие ΑNСΡΤ^4, кодируют ΑNСΡΤ^4 мыши. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие ΑNСΡΤ^4, кодируют ΑNСΡΤ^4 человека. В некоторых вариантах осуществления изолированная нуклеиновая кислота является антисмысловой нуклеиновой кислотой. В некоторых таких вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота является одноцепочечной молекулой ДНК, вызывающей разрушение мРНК, являющейся мишенью, через механизм, основанный на РНКазе Н. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота является олигонуклеотидом длиной примерно в 8-30 нуклеотидов (включая в себя все точки между конечными точками). В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота является олигонуклеотидом длиной примерно в 18-26 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота включает в себя молекулу РНК, уменьшающую экспрессию нуклеиновой кислоты, являющейся мишенью, с помощью механизма, основанного на интерференции РНК. Например, некоторые молекулы РНК, подходящие для РНК1, включают в себя, но не ограничиваются ими, малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК (мРНК), сверхмалые некодирующие РНК (Шс-РНК) и малые модулирующие РНК (ммРНК). Для обзора некоторых, приведенных для примера, механизмов РНК1 и молекул РНК, использующихся в РНК1, см., например, Νονίηη е1 а1. (2004) №11иге 430:161-164.

В некоторых вариантах осуществления предусматривается использование миРНК, уменьшающей экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей ΑNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления миРНК является олигонуклеотидом длиной, примерно, в 18-26 нуклеотидов (включая в себя все точки между конечными точками). В некоторых вариантах осуществления миРНК является олигонуклеотидом

- 30 016185 длиной примерно в 20-24 нуклеотидов или олигонуклеотидом длиной примерно в 21-23 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления миРНК является двухцепочечной РНК. В некоторых вариантах осуществления миРНК вызывает разрушение мРНК, являющейся мишенью, комплементарной антисмысловой цепи миРНК, см., например, Νονίηη е! а1. (2004) Ыа1иге 430:161-164.

Активность антисмысловой нуклеиновой кислоты, такой как антисмысловая молекула ДНК или миРНК, часто зависит от вторичной структуры мРНК, являющейся мишенью, см., например, У1скегк е! а1. (2003) I. ΒίοΙ. СНет. 278:7108-7118. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления выбирают антисмысловую нуклеиновую кислоту, комплементарную области мРНК-мишени, доступной спариванию оснований. В некоторых вариантах осуществления подходящую область мРНК-мишени определяют с использованием прогулки по гену, например, путем эмпирической проверки нескольких антисмысловых олигонуклеотидов на их способность к гибридизации с различными областями на протяжении мРНК-мишени и/или к снижению экспрессии мРНК-мишени, см., например, Уюкетк е! а1. (2003) I. ΒίοΙ. СНет. 278:7108-7118; НШ е! а1. (1999) Аги. I. Векрщ. Се11. Мо1. ΒίοΙ. 21:728-737. В некоторых вариантах осуществления подходящую область мРНК-мишени определяют с использованием программ, предсказывающих вторичную структуру мРНК или схожих алгоритмов для идентификации областей мРНКмишени, которые не гибридизируются с любыми другими областями мРНК-мишени, см., например, НШ е! а1. (1999) Ат. I. ВекрВ. Се11 Мо1. ΒίοΙ. 21:728-737. В некоторых вариантах осуществления используют комбинацию обоих вышеуказанных способов для идентификации подходящей области мРНК-мишени, см., например, НШ е! а1. (1999) Ат. I. ВекрВ. Се11 Мо1. ΒίοΙ. 21:728-737.

В некоторых вариантах осуществления предусматривается использование способа снижения активности ΛΝ6ΡΤΓ·4 путем снижения экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ΛΝΟΡΤΓ·4. В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя снижение экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ΛNСΡΤ^4. в клетке ίη νίίτο или ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя введение антисмысловой нуклеиновой кислоты, снижающей экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей ΛNСΡΤ^4. в клетку ίη νίίτο или ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая ΛNСΡΤ^4. кодирует ΛNСΡΤ^4 человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая ΛNСΡΤ^4. кодирует ΛNСΡΤ^4 мыши.

В некоторых вариантах осуществления предусматривается использование способа лечения нарушения жирового обмена, такого как любое из описанных выше (часть У.С.). В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя введение пациенту эффективного количества антисмысловой нуклеиновой кислоты, снижающей экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей ΛNСΡΤ^4. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота доставляется в орган, экспрессирующий нуклеиновую кислоту, кодирующую ΛNСΡΤ^4. В некоторых исследованиях показано, что ΛNСΡΤ^4 индуцируется в условиях голодания в печени, гипофизе и жировой ткани, Се е! а1. (2004) ί. ЫрШ Век. 45:2071-2079. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота доставляется в печень, гипофиз или жировую ткань. Например, некоторые указания по введению ίη νίνο антисмысловых нуклеиновых кислот и непрерывной доставке антисмысловых нуклеиновых кислот ίη νίνο, включающие в себя непрерывную доставку к определенным органам, таким как печень, представлены в Κΐιηη е! а1. (2004) ί. Эгид Татде!тд 12:393-404. В некоторых вариантах осуществления непрерывная доставка достигается путем введения инкапсулированной или иным способом помещенной в полимер, разрушающийся в биологической среде, антисмысловой нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота может быть помещена в микросферы из поли(гликолевой кислоты) (РЬСА) (например, 0,5-20 мкм; 3000 М\У). В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота конъюгирована с липофильным агентом, см. Κΐιηη е! а1. (2004) I. Итид Татде!тд 12:393-404.

VI. Примеры

A. Содержание и питание мышей.

Исследования на мышах проводили в соответствии с федеральными руководствами. Мышей содержали при 24°С и фиксированном цикле 12-ч светлого времени/12-ч темного времени, со свободным доступом к воде и корму для грызунов (22% калорий от жира) (продукт № 5001; Ритта, 8!. Бошк, МО), или на диете с высоким содержанием жира (60% калорий от жира) (продукт № Ό12492; ВекеагсН И1е!к, Νονν ΒΓυηδνίοΚ N1.), как указано ниже. Мыши, которых кормили НЕИ, получали эту диету, начиная с возраста 4-5 недель и далее. Мыши, которых содержали, как указано ниже, в состоянии голода, были лишены пищи на 16 ч.

B. Избыточная экспрессия ΛNСΡΤ^4 ίη νίνο вызывает гиперлипидемию.

1. Избыточная экспрессия ΛNСΡΤ^4 мыши.

кДНК, кодирующую мышиное ΛNСΡΤ^4 полной длины (8ЕО ГО ΝΟ: 1), вводили в Аб Е1лишенную область аденовирусного вектора рРАИ, помещая таким образом кДНК под контроль промотора цитомегаловируса, см. НШ е! а1., Соик!тис!юи анб р^οрадаί^οи οί йитаи абеиον^^ик уесЮгк в Се11 Β^ο1οду: А ЬаЬота!оту На^Ьоок, νοί. 1, р. 500-512 (БЕ. СеЕк, еб., 2^и6 еб. 1998). Полученную в результате конструкцию, Аб5-тАидр!1-4Τ, использовали для инфицирования клеток СНО. В качестве контроля кДНК, кодирующую β-галактозидазу, вводили в Аб Е1-лишенную область аденовирусного вектора

- 31 016185 рРАЭ. помещая таким образом кДНК под контроль промотора цитомегаловируса. Полученную в результате конструкцию Аб5-в-да1 также использовали для инфицирования клеток СНО. Экспрессию как кДНК ΑNСΡΤ^4 мыши, так и кДНК β-галактозидазы подтверждали с помощью вестерн-блот анализа экстрактов инфицированных клеток СНО.

Аб5-тАидрб-4Т или Аб5-в-да1 вводили мышам С57ВБ/61 в дозе 5х10¹⁰ νρ путем инъекции в хвостовую вену. Образцы крови мышей, инфицированных аденовирусом, собирали в различные промежутки времени после инфицирования. Измеряли уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке с помощью СоЬак Еи!едга 500 (Воске, Ваке1, 8дакет1аиб). Уровни свободных жирных кислот (РРА) в сыворотке измеряли с помощью набора ΝΕΡΆ С (99475409, Аако, Вкктоиб, УА).

Как показано на фиг. 1А-1С, мыши, инъецированные Аб5-тАидрб-4Т (закрашенные столбцы) показали повышенные уровни триглицеридов, общего холестерина и свободных жирных кислот (РРА) в сыворотке натощак по сравнению с контрольными мышами, инъецированными Аб5-в-да1 (пустые столбцы). В частности, уровни в сыворотке натощак триглицеридов и РРА у мышей, инъецированных Аб5тАидр!1-4Т, повышались на второй день после инфицирования и достигали пика через 4 дня (фиг. 1А и 1С). На 4 день у мышей, инфицированных Аб5-тАидр!1-4Т, триглицериды были повышены примерно в 18 раз, а РРА - примерно в 9 раз по сравнению с контрольными мышами. Уровень в сыворотке натощак общего холестерина также значительно повышался у мышей, инфицированных Аб5-тАидрб-4, по сравнению с контрольными мышами (фиг. 1В). Уровни в сыворотке натощак триглицеридов и холестерина через три дня после инфицирования как Аб5-тАидр!1-4Т, так и Аб5-в-да1 показаны также на фиг. 2 и 3.

2. Избыточная экспрессия ΑNСΡΤ^4 человека.

Для определения влияния человеческого ΑNСΡΤ^4 на мышей ΑNСΡΤ^4 человека избыточно экспрессировали у мышей дикого типа. кДНК, кодирующую человеческое ΑNСΡΤ^4 полной длины (8ЕО ГО NО: 2), вводили в Аб Е1-лишенную область аденовирусного вектора рРАЭ, помещая таким образом кДНК под контроль промотора цитомегаловируса. Полученную в результате конструкцию, Аб5ЬАидр!14Т, или контрольную конструкцию, Аб5-в-да1, вводили мышам С57ВБ/61 в дозе 5х10¹⁰ νρ путем инъекции в хвостовую вену. Измеряли уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке через четыре дня после инъекции. Как показано на фиг. 4 и 5, ΑNСΡΤ^4 человека значительно повышало уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке, взятой натощак, по сравнению с контрольной конструкцией. Человеческое ΑNСΡΤ^4 не оказывало влияния на уровни глюкозы у мышей в этом исследовании (данные не приводятся). Эти результаты показывают, что ΑNСΡΤ^4 человека способно повышать у мышей уровни липидов в сыворотке, взятой натощак, сходно с ΑNСΡΤ^4 мыши.

С. Нокаут-мыши по гену Аидрб4 имеют пониженные уровни липидов сыворотки.

Нокаут-мышей по гену Аидрб4 использовали для определения, будет ли дефицит ΑNСΡΤ^4 оказывать противоположный эффект на сывороточные уровни липидов, по сравнению с избыточной экспрессией ΑNСΡΤ^4 (например, для определения, будет ли дефицит ΑNСΡΤ^4 снижать сывороточные уровни липидов). Для получения нокаут-мышей по гену Аидрб4, клон клеток Е8 с ретровирусным вектором, введенным в локус Аидрб4, инъецировали в С57ВЬ/6-Тут^с-Вгб бластоциты хозяина, см. ΖηιηΕΐΌ\νΟζ е! а1. (1998) №11иге 392:608-611. Получали химерных мышей и скрещивали с мышами С57ВЬ/6-Тут^с-Вгб. Полученных в результате Аидр!14^+/-потомков скрещивали для получения Аидр!14^-/- мышей. Фрагмент ДНК генотипировали путем количественного дот-блот анализа (Вю-Ваб, Нетси1е8, СА) с использованием генного фрагмента неомицин фосфотрансферазы и фрагмента, содержащего экзон 1 мышиного гена Скк (ММИ05247) в качестве проб для определения интеграции вируса и эндогенного гена с единственной копией соответственно.

Нокаут-мыши имели несколько сниженную жизнеспособность, как показано на фиг. 29. Более того, у некоторых детенышей были обнаружены растянутые брюшная полость и кишечник, лимфангиэктазия перед прекращением грудного кормления.

Кроме того, нокаут-мыши, которые находились на диете с высоким содержанием жиров (НРИ), имели низкие показатели выживаемости, чем мыши дикого типа, получавшие ту же диету, см. фиг. 30. У некоторых мертвых нокаут-мышей были обнаружены растянутые брюшные полости, а у некоторых были обнаружены хроническое воспаление и/или нагруженные липидами макрофаги в мезентериальных лимфатических узлах. Кроме того, некоторые мыши имели расширенные лимфатические сосуды.

Для изучения эффекта дефицита Аидр!14 на уровни липидов сыворотки у мышей, получавших стандартную диету (пищу), определяли уровни триглицеридов и холестерина сыворотки у нокаут-мышей и мышей дикого типа, получавших корм или лишенных его. Результаты представлены на фиг. 6 (и показывает количество использованных мышей). Уровни триглицеридов сыворотки у нокаут-мышей (НОМ) в состоянии голода были на 70% ниже, чем уровни триглицеридов сыворотки у мышей дикого типа в состоянии голода (фиг. 6А). Уровни общего холестерина сыворотки и уровни свободных жирных кислот (РРА) у нокаут-мышей в состоянии голода также были значительно ниже, чем уровни общего холестерина сыворотки и уровни свободных жирных кислот (РРА) у мышей дикого типа в состоянии голода (фиг. 6В и 6С).

Фиг. 25, панель А показывает уровни сывороточных триглицеридов, общего холестерина, липопро

- 32 016185 теинов высокой плотности (ЛПВП) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в голодном состоянии у самцов мышей дикого типа, гетерозиготных и нокаут-мышей, находившихся на стандартной диете (пища). В этом эксперименте в голодном состоянии уровни сывороточных триглицеридов у гетерозиготных самцов мышей были на 41% ниже, чем у самцов мышей дикого типа. В этом эксперименте в голодном состоянии уровни сывороточных триглицеридов у самцов нокаут-мышей были на 59% ниже, чем у самцов мышей дикого типа. В этом эксперименте в голодном состоянии уровни сывороточного общего холестерина у самцов гетерозиготных мышей и самцов нокаут-мышей были на 10 и 21% ниже соответственно чем у самцов мышей дикого типа.

Фиг. 25, панель В показывает уровни сывороточных триглицеридов, общего холестерина, липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в голодном состоянии у самок мышей дикого типа и нокаут-мышей, находившихся на стандартной диете (пища). В этом эксперименте в голодном состоянии уровни сывороточных триглицеридов у самок нокаут-мышей были на 27% ниже, чем у самок мышей дикого типа. В этом эксперименте в голодном состоянии уровни сывороточного общего холестерина у самок нокаут-мышей были на 33% ниже, чем у самок мышей дикого типа. В этом эксперименте в голодном состоянии уровни ЛПВП у самок нокаут-мышей были на 31% ниже, чем у самок мышей дикого типа.

Также изучали эффекты дефицита Апдр!14 на уровни липидов сыворотки у нокаут-мышей и мышей дикого типа с ожирением, вызванным диетой (ΌΙΟ). Нокаут-мыши и мыши дикого типа находились на диете с высоким содержанием жира (ΗΕΌ) для развития ΌΙΟ. Уровни сывороточных липидов у этих мышей изучали затем в сытом и голодном состоянии. Как показано на фиг. 6А и 6В, уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки были значительно ниже у нокаут-мышей как в сытом, так и в голодном состоянии. Дополнительно, уровни ЕЕА были также значительно ниже у нокаут-мышей в голодном состоянии, см. фиг. 6С.

Фиг. 26 показывает уровни сывороточных триглицеридов, общего холестерина, ЛПВП и ЛПНП в голодном состоянии у самцов мышей дикого типа и нокаут-мышей, находившихся на диете с высоким содержанием жира (ΗΕΌ). В этом эксперименте в голодном состоянии уровни сывороточных триглицеридов у самцов нокаут-мышей, находившихся на диете ΗΕΌ, были на 77% ниже, чем у самцов мышей дикого типа, находившихся на диете ΗΕΌ. В этом эксперименте в голодном состоянии уровни общего холестерина сыворотки у самцов нокаут-мышей, находившихся на диете ΗΕΌ, были на 35% ниже, чем у самцов мышей дикого типа, находившихся на диете ΗΕΌ.

Дополнительно, нокаут-мыши были в значительной степени защищены от развития ΌΙΟ. У мышей дикого типа, находившихся на диете ΗΕΌ, развивалось выраженное ожирение в сравнении с мышами дикого типа, находившимися на стандартной диете, см. фиг. 7А и 7В. Однако прирост веса тела и прирост жира были значительно меньшими для нокаут-мышей по гену Апдр!14, находившимися как на стандартной диете, так и на диете ΗΕΌ, см. фиг. 7Λ-7Ω. Большая часть снижения веса тела была связана со снижением количества жира, а не со снижением мышечной массы.

Фиг. 27, панель А показывает общее количество граммов жира на теле самцов мышей дикого типа С^Т) и нокаут-мышей (Ηот), находившихся на диете с высоким содержанием жира (ΗΕΌ). Самцы нокаут-мышей, находившиеся на диете ΗΕΌ, имели значительно меньший вес жира на теле, чем самцы мышей дикого типа, находившиеся на диете ΗΕΌ. Фиг. 27, панель В показывает общее количество граммов жира на теле самок мышей дикого типа (νΓ) и нокаут-мышей (Ηот), находившихся на диете ΗΕΌ. Этот эксперимент показывает тенденцию к уменьшению веса жира на теле самок нокаут-мышей, находившихся на диете ΗΕΌ, по сравнению с самками мышей дикого типа, находившимися на диете ΗΕΌ.

Самцы нокаут-мышей, находившиеся на диете ΗΕΌ, принимали сходное количество пищи, что и самцы мышей дикого типа, находившиеся на диете ΗΕΌ, см. фиг. 28, панель А. Самцы нокаут-мышей, находившиеся на диете ΗΕΌ, также имели сходные уровни содержания фекального жира, что и самцы мышей дикого типа, находившиеся на диете ΗΕΌ, см. фиг. 28, панель В.

В целом, эти результаты показывают, что дефицит Апдр!14 снижает сывороточные липиды и способствует защите от ожирения.

Ό. У нокаут-мышей по гену Апдр!14 не обнаружено снижение активности ЛПЛ адипоцитов в состоянии голода.

Изучали активность эндогенной ЛПЛ в жировой ткани (жировая ткань придатка яичка) у нокаутмышей и мышей дикого типа в сытом и голодном состоянии. Образцы ткани (0,3-1,0 г) гомогенизировали в ледяном буфере для гомогенизации (0,025 М ΝΗ₃ φΗ 8,2), 1 мг/мл ВЗА, 5 мМ ЕЭТА, 5 МЕ/мл гепарина и коктейль, ингибирующий протеазы) с помощью гомогенизатора Ктетабса. После центрифугирования при 3000хд в течение 10 мин при 4°С отбирали супернатант.

Активность ЛПЛ в супернатанте измеряли по количеству олеиновой кислоты, выделенной субстратом, глицерин-три[9,10(п)-³Н]олеатом, (на основе анализа Вегдо е( а1. (1996) Вюсбет. 1. 313:893-898). 100 мкл супернатанта добавляли к равному объему раствора субстрата (2 мМ глицерин-три[9,10(п)-³Н]олеата (131 кБк/мкмоль), 189 нг/мл Ь-а-фосфатидилхолина, 14 мг/мл альбумина бычьей сыворотки (ВЗА), 140

- 33 016185 мМ Тйз-НС1 (рН 8,0), 15% глицерина и 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием) в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 3,25 мл смеси метанол/хлороформ/гексан (141:125:100, о/о/о) и 1,05 мл 0,1 М буфера К₂СО₃-борная кислота (рН 10,5). После интенсивного перемешивания и разделения центрифугированием при 3000хд в течение 15 мин при комнатной температуре количество ³Н в 1 мл аликвоты фазы вода/метанол определяли с помощью жидкостного счетчика сцинтилляций Весктаη Сои1!ег Й86500.

У мышей дикого типа активность эндогенной ЛПЛ была значительно снижена в состоянии голода, в сравнении с активностью эндогенной ЛПЛ в сытом состоянии, см. фиг. 8. Эти результаты согласовались с предыдущими наблюдениями, что экспрессия ΑΝ^Ρ^Α индуцируется в состоянии голода, уменьшая таким образом активность ЛПЛ, см., например, Ос е! а1. (2004) 1. Ыр1б Вез. 45:2071-2079. У нокаут-мышей, однако, активность эндогенной ЛПЛ не снижалась в состоянии голода, в сравнении с активностью эндогенной ЛПЛ в сытом состоянии. Эти результаты согласовались с отсутствием ΑΝ^Ρ^Α у нокаут-мышей.

Е. Нокаут-мыши по гену Ληдрί14 были защищены от развития стеатоза печени (жировой дистрофии печени).

НРЭ ассоциировано с развитием стеатоза печени (жировой дистрофии печени). Для того чтобы определить, защищает ли дефицит Лηдрί14 от развития стеатоза печени, индуцированного НРЭ, использовали локальную протонную магнитную резонансную спектроскопию (МВ8) для измерения уровней липидов в печени нокаут-мышей и мышей дикого типа, находившихся на НРЭ диете и стандартной диете. Изучали как содержание жира в печени, так и степень жировой инфильтрации.

Ιη νί\Ό МВ8 проводили с использованием системы Ρйа^та8саη с каналом 7 Тез1а 16 см (Вгикег Вю8ρίη, ВШейса, МЛ) с решетчатой катушкой с внутренним диаметром 38 мм для радиочастотных передачи и приема. Мышам проводили анестезию 1,5-2% изофлураном с поддержанием температуры тела мышей с помощью системы циркуляции предварительно нагретой воды внутри прибора. Дыхательную активность мышей постоянно контролировали. Исследуемую область (νΟΙ) выбирали на основе серий предварительных Т1 снимков, захватывавших всю печень, при этом тщательно избегая сосудов и жировой ткани. Локальную ¹Н-МВ8 получали с использованием последовательности ΡΒΕ88 (ТЕ=28 мс, ТВ=1,0 с, 196 средних значений, водная супрессия: нет, νΟΙ: 1,8х1,8х1,8 мм³ или 2x2x2 мм) с дыхательной синхронизацией. Суммарную область под водным и жировым пиками использовали для вычисления содержания жира (% жира), см. Τйотзеη е! а1. (1994) Мадие^с Везоηаηсе 1тадтд 12:487-495.

Уровни липидов в печени мышей дикого типа, находившихся на диете НРЭ, были значительно выше, чем в печени мышей дикого типа, получавших стандартную диету (пищу), см. фиг. 9А. Однако уровни липидов в печени нокаут-мышей (НОМ), находившихся на диете НРЭ, не были значительно повышены по сравнению с уровнями липидов в печени нокаут-мышей, получавших стандартную диету. Далее, уровни липидов в печени нокаут-мышей, находившихся на диете НРЭ, были значительно ниже, чем в печени мышей дикого типа, находившихся на диете НРЭ. В соответствии с этими результатами окрашивание с помощью масляного красного среза печени нокаут-мышей, находившихся на диете НРЭ, выявило значительное снижение количества и размеров липидных включений по сравнению со срезами печени мышей дикого типа, находившихся на диете НРЭ, см. фиг. 9В. Более того, количество и размеры липидных включений в срезах печени нокаут-мышей, находившихся на диете НРЭ, было сходным с таковыми у мышей дикого типа, получавших стандартную диету. Эти результаты показывают, что мыши с дефицитом Лηдрί14 были защищены от стеатоза печени, вызываемого НРЭ.

Также изучали интрамиоцеллюлярное липидное содержимое (1МСЬ) скелетных мышц у нокаутмышей и мышей дикого типа для выяснения, защищена ли эта ткань так же, как печень, от накопления липидов у нокаут-мышей. Для определения интрамиоцеллюлярного липидного содержимого проводили ίη νί\Ό МВБ исследования на системе Ρйа^та8саη с каналом 7 Тез1а 16 см с использованием решетчатой катушки с внутренним диаметром 19 мм для радиочастотных передачи и приема. Мышам проводили анестезию 1,5-2% изофлураном, как описано выше, и помещали их внутрь катушки таким образом, что их задние конечности были вытянуты вдоль продольной оси магнита. Исследуемую область (νΟΙ) размером 1,5х1,5х1,5 мм³ выбирали в левой или правой М. йЫайз аЩепог, избегая сосудистых структур и больших депо жировой ткани. Локальную ¹Н-МВ8 получали с использованием последовательности ΡΒΕ88 (ТЕ=16 мс, ТВ=2,0 с, 292 средних значений, водная супрессия СНЕ88), для того, чтобы убедиться, что пики 1МСЬ и экстрамиоцеллюлярных липидов (ЕМСЬ) четко различались в спектре. Суммарную область под 1СМЬ и !Сг (общее произведение) пиками использовали для расчета 1СМЬ содержимого (соотношение 1СМЬ/!Сг) (концентрации !Сг для М. йЫайз аШепог у ΖΌΡ крыс с ожирением в возрасте 8 недель и 15 месяцев были 136±2,2 и 132±1,0 мкмоль/г сухого веса соответственно, см. Кий1тани е! а1. (2003) Э|аЬе1ез 52:138-44). У нокаут-мышей, находившихся на диете НРЭ, обнаружили значительное снижение интрамиоцеллюлярного липидного содержимого по сравнению с мышами дикого типа, находившихся на диете НРЭ, см. фиг. 10. Таким образом, дефицит Лηдрί14 защищал важные ткани, такие как печень и скелетные мышцы, от накопления липидов.

Р. Нокаут-мыши по гену Лηдр!14 были защищены от нарушения толерантности к глюкозе.

- 34 016185

Известно, что высокие уровни печеночного и интрамиоцеллюлярного содержания липидов связаны с нарушением чувствительности к инсулину. Кроме того, известно, что ΗΡΌ связана с нарушением толерантности к глюкозе. Для того чтобы выяснить, защищает ли дефицит Апдр114 от развития этих эффектов, измеряли уровни глюкозы и инсулина в сыворотке нокаут-мышей и мышей дикого типа.

Мышей дикого типа и нокаут-мышей кормили ΗΡΌ. Через 16 ч голодания измеряли уровень глюкозы крови с помощью Асси-Сйеск АбгаЩаде (2138930, ΡοοΚ. Iηб^апаρο1^8, ΙΝ). Сразу после этого принудительно через рот вводили 2 г глюкозы на 1 кг веса тела в виде 20% стерильного раствора глюкозы. Уровень глюкозы крови последовательно измеряли на нескольких отрезках времени, см. фиг. 11, панель С. В этом эксперименте нокаут-мыши, получавшие диету ΗΡΌ, лучше переносили нагрузку глюкозой, чем мыши дикого типа, получавшие диету ΗΡΌ, то есть нокаут-мыши, принудительно получавшие через рот 2 г глюкозы на 1 кг веса тела, постоянно имели уровни глюкозы крови ниже, чем мыши дикого типа, получавшие такое же лечение. Этот результат был статистически значим.

Мышей дикого типа и нокаут-мышей кормили ΗΡΌ. Через 6 ч голодания, в начале светового дня, измеряли уровень глюкозы крови. Сразу после этого, 750 мЕ/кг веса тела инсулина (Ηити1^η Я., Е11 ЬШу) вводили путем интраперитонеальной инъекции в виде раствора инсулина 75 мЕ/мл. Уровень глюкозы крови последовательно измеряли на нескольких отрезках времени, см. фиг. 11, панель Ό. В этом эксперименте нокаут-мыши, получавшие диету ΗΡΌ, были более чувствительны к инсулину, чем мыши дикого типа, получавшие диету ΗΡΌ, то есть инъекция 75 мЕ/мл инсулина приводила к большему снижению уровней глюкозы, чем у мышей дикого типа, получавших такое же лечение. Этот результат был статистически значим.

Уровни глюкозы и инсулина в сыворотке натощак у мышей дикого типа, получавших ΗΡΌ, были значительно выше, чем эти показатели у мышей дикого типа, получавших стандартную диету, что является проявлением гипергликемии и гиперинсулинемии, вызванных ΗΡΌ, см. фиг. 11, панели А и В. Однако уровни как глюкозы, так и инсулина в сыворотке натощак у нокаут-мышей, получавших ΗΡΌ, незначительно отличались от уровней у мышей дикого типа или нокаут-мышей, получавших стандартную диету, показывая, что дефицит Аг1др114 обеспечивает защиту от гипергликемии и гиперинсулинемии, вызванных ΗΡΌ, см. фиг. 11 панели А и В.

С. Избыточная экспрессия АНОРТБА вызывает повышение уровней липидов сыворотки у нокаутмышей.

Чтобы выяснить, может ли избыточная экспрессия АХОРТБА мыши спасать какой-либо из фенотипов нокаут-мышей по гену Аηдρΐ14, конструкцию Аб5-тАηдρ11-4Т (описанную выше, часть νΐ.β.1.) вводили путем инъекции дозы 5х 10¹⁰ νρ в хвостовую вену нокаут-мышей. В качестве контроля конструкцию Аб5-в-да1 (описанную выше, часть νΐ.β.1.) вводили путем инъекции дозы 5х10¹⁰ νρ в хвостовую вену нокаут-мышей. Через три дня после инъекции нокаут-мыши, инъецированные конструкцией Аб5тАηдρ11-4Т, показали значительно более высокие уровни триглицеридов и холестерина сыворотки натощак, чем нокаут-мыши, инъецированные контрольной конструкцией, см. фиг. 12 и 13. Действительно, уровни триглицеридов и холестерина у нокаут-мышей, инъецированных конструкцией Аб5-тАηдρ11-4Т, были сравнимы с этими показателями у мышей дикого типа, инъецированных конструкцией Аб5тАηдρ11-4Т, ср. фиг. 12 и 13 с фиг. 2 и 3. Эти результаты показывают, что избыточная экспрессия АКОРТБА мыши восстанавливает сниженные уровни липидов сыворотки у нокаут-мышей по гену Аηдρΐ14.

H. Получение и выделение АNСРТ^4 мыши.

Для экспрессии рекомбинантного АNСРТ^4 клетки СНО инфицировали дозой 1,5 х10^п νρ рекомбинантного аденовируса Аб5-тАηдρ11-4Т (описан выше, часть νίΒΟ.). Спустя 16-24 ч, среду заменяли на среду, свободную от сыворотки (ЕХ-СЕББ 325-РР СНО тебшт, 14335, АЯИ, Бегеха, К8). Использованную среду удаляли и заменяли 5 раз свежей средой, свободной от сыворотки, каждые 24-36 ч.

Использованную среду (1 л) помещали на 10-12-мл колонку с никель-желатиновой смолой (Я80101, Iην^ΐ^οдеη, СагЬЬаб, СА). Колонку промывали 5 об. промывочного буфера (10 мМ имидазола, 20 мМ Тп8 ρΗ 7,8, 500 мМ №1С1). Связавшееся АNСРТ^4 элюировали элюирующим буфером (500 мМ имидазола, 20 мМ Тпз ρΗ 7,8, 500 мМ №1С1) и собирали в серии фракций по 1,5 мл. Наличие АNСРТ^4 в собранных фракциях определяли с помощью вестерн-блот анализа и простого синего окрашивания. Фракции, содержавшие АNСРТ^4, объединяли, делили на аликвоты и замораживали при -70°С.

I. Ингибирование активности ЛПЛ с помощью АNСРТ^4.

Влияние АNСРТ^4 мыши на активность ЛПЛ изучали с помощью анализа ίη νίΐτο. Активность ЛПЛ измеряли по количеству олеиновой кислоты, выделенной субстратом, глицерин-три[9,10(ц)³Н]олеатом, следующим образом (на основе способа 81ит1/ида\\'а е1 а1. (2002) Б Вю1. С1ет. 277:3374233748).

Раствор восстановленной бычьей ЛПЛ (Б2254, 81дта, 8ΐ. Βουίδ, МО) инкубировали с равным объемом раствора субстрата (2 мМ глицерин-три[9,10(ц)-³Н]олеата (131 кБк/мкмоль), 189 нг/мл Б-αфосфатидилхолина, 14 мг/кг альбумина бычьей сыворотки (В8А), 140 мМ Тг18-ИС1 (ρΗ 8,0), 15% глицерина и 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием) в присутствии от 0 до 400

- 35 016185 нМ АНСРТЬ4 мыши (полученного, как описано выше, часть VI.Н.) в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 3,25 мл смеси метанол/хлороформ/гексан (141:125:100, о/о/о) и 1,05 мл 0,1 М буфера К₂СО₃-борная кислота (рН 10,5). После интенсивного перемешивания и разделения центрифугированием при 3000/д в течение 15 мин при комнатной температуре количество ³Н в 1 мл аликвоты фазы вода/метанол определяли с помощью жидкостного счетчика сцинтилляций Весктап Сои1!ег Й86500. Одну единицу активности ЛПЛ определяли как высвобождение из субстрата 1 мкмоль ³Н-меченной олеиновой кислоты в 1 мин при 37°С. АНСРТЬТ мыши ингибировало бычью ЛПЛ в 1С₅₀ (концентрация, необходимая для ингибирования на 50%) в дозе 25 нМ, см. фиг. 14.

I. Образование моноклональных антител против АНСРТЬТ у нокаут-мышей по гену Апдр!14.

Для получения моноклональных антител против АНСРТЬ4 мыши нокаут-мышей по гену Апдр!14 примировали и затем стимулировали каждые две-три недели очищенным АНСРТЬТ мыши, полученным, как описано выше, часть VI.Н. Полный и неполный адъюванты Фрейнда также использовали для примирования и стимулирования соответственно. После двух или трех бустер-инъекций определяли сывороточные титры с помощью ЕЫ8А. После получения достаточно высоких титров спленоциты иммунизированных мышей выделяли и проводили слияние с клетками миеломы (Р3/Ы81/1-Ад4-1) с использованием РЕС 1500 в качестве агента слияния. Полученные в результате продукты слияния клеток разводили в гибридомной среде и высаживали в 96-луночные планшеты для культур ткани. Через 1 сутки в культуры гибридомы добавляли среду НАТ. Среду меняли каждые три или четыре дня по необходимости. Через десять-четырнадцать дней селекции и культивирования гибридомы исследовали с помощью ЕЫ8А с АНСРТЬТ мыши в качестве антигена. Девять моноклональных антител, обозначенных 14Ό12, 15Е2, 2О12, 10Е4, 1А4, 5А6, 14Ό2 и 6О11, показали специфическое связывание с АНСРТЬТ мыши.

Моноклональные антитела также повышались против пептида, имеющего последовательность ^АΡТН^^N^V^КТ§К^КК, соответствующую аминокислотным остаткам 151-168 полной длины АНСРТЕЭ мыши (8Е0 ГО NО: 1) (пептид идентичен аминокислотным остаткам 151-168 в 8ЕО ГО NО: 1, за исключением того, что С-концевой аминокислотой пептида является аргинин, тогда как аминокислотой в положении 168 в 8ЕО ГО NО: 1 является лизин). Перед инъекцией пептид конъюгировали с КЕН. Моноклональное антитело против этого пептида было способно специфически связываться АНСРТЕТ мыши полной длины. Это моноклональное антитело обозначили 4А8.

К. Способы ЕЫ8А.

Изучали связывание антител с мышиными АНСРТЕЭ с использованием ЕЬ18А. Девяностошестилуночные планшеты Шпс Мах1-8огр 1ттипоР1а!ек™ (Шпс № 446612, Коккйбе, Эептагк) покрывали путем добавления в каждую лунку 50 мкл 2,5 мкг/мл раствора АНСРТЬ4 в покрывающем буфере (ВиРН™ карбонат -бикарбонатный буфер, Р1егсе № 28382, КоскЕогб, ГО) в течение ночи при 4°С. Покрывающий буфер удаляли и планшеты блокировали добавлением в каждую лунку 250 мкл блокирующего буфера (1% В1оскег™ В8А, Р1егсе № 37525, в РВ8) в течение 2 ч при комнатной температуре. 50 мкл супернатанта гибридомы (разведенного или неразведенного блокирующим буфером) или изолированных антиАНСРТЕЭ антител (разведенных или неразведенных блокирующим буфером) добавляли в лунку и инкубировали в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Лунки промывали четыре раза в РВ8/Т\уееп 20. 100 мкл разведенного (от 1:5000 до 1:10000) НКР-конъюгированного антимышиного 1дС козы (Р1егсе № 31446) добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Лунки промывали шесть раз в РВ8/Т\уееп 20. Анти-АНСРТЕЭ антитела определяли путем добавления в каждую лунку 50 мкл раствора ТМВ (тетраметилбензидин) (1ттипоРиге® ТМВ 8иЬк!га!е Кй, Р1егсе № 34021) на время от 5 до 10 мин. Проводили спектрофотометрию планшетов при 450 нм с помощью ридера микропланшетов (Мо1еси1аг Эетюек, 8иппута1е, СА).

Ь. Нейтрализующая активность моноклональных антител ш νί!ΐΌ.

Моноклональные антитела исследовали на их способность нейтрализовать активность АНСРТЕЭ в анализе активности ЛПЛ ш т11го, описанном выше, часть VII. Отдельное исследование активности ЛПЛ проводили в присутствии 25 нМ АНСРТЕЭ мыши и примерно 125 нМ каждого из вышеупомянутых девяти моноклональных антител. Результаты представлены на фиг. 15. Для каждого антитела нейтрализующая активность представлена способностью антитела повышать активность ЛПЛ, то есть спасать ЛПЛ от ингибирования АНСРТЕЭ. Спасательная активность показана на фиг. 15 в процентах повышения активности ЛПЛ в присутствии как АНСРТЕЭ, так и анти-АНСРТЕ-4 антитела, по отношению к активности ЛПЛ в присутствии только АНСРТЕЭ. Пять из девяти антител, 4А8, 14Ό12, 15Е2, 2О12 и 10Е4, вызывали повышение активности ЛПЛ, что означает, что эти антитела спасают активность ЛПЛ путем нейтрализации активности АНСРТЕ-4. В частности, антитела 4А8, 14Ό12 и 15Е2 спасали активность ЛПЛ более чем на 50%. Четыре из девяти антител, а именно 1А4, 5А6, 14Ό2 и 6О11, вызывали дальнейшее ингибирование ЕРЬ, проявляя свою способность увеличивать активность АНСРТЕ-4.

М. Изотипирование.

Изотипы 14Ό12, 15Е2, 4А8 и 6С11 определяли стандартными способами. 4А8 и 6С11 являются изотипами 1дО1, а 14Ό12 и 15Е2 являются изотипами 1§С2а (см. третью и четвертую колонки табл. 2 ниже, часть VI.Р.).

- 36 016185

N. Картирование эпитопов моноклональных антител.

Моноклональные антитела 14Ό12, 15Е2 и 6С11 исследовали на связывание с ^концевым доменом с двойной спиралью АNСРТ^4 мыши (от аминокислот 21-174 8Е0 ΙΌ N0: 1) и с С-концевым фибриногеноподобным доменом АNСРТ^4 мыши (от аминокислот 174-410 8Е0 ΙΌ N0: 1) с помощью ЕЫ8А. 14Ό12 и 15Е2 специфически связывались с ^концевым доменом с двойной спиралью АNСРТ^4 мыши. 6С11 специфически связывалось с С-концевым фибриногеноподобным доменом АNСРТ^4 мыши.

O. Классификация антител по эпитопам.

Для выяснения, связывают ли моноклональные антитела 14Ό12, 15Е2 и 4А8 одни и те же эпитопы, проводили классификацию антител по эпитопам с использованием мультиплексной технологии Ьиттех® 100™ и анализатора Ьиттех® 100™ (Ьиттех Согрогайоп, Аикбп, ТХ), см. Ла е! а1. (2004) I. Тттипо1. МеЙюбк 288:91-98. Для классификации антител по эпитопам обычно применяют конкурентный способ с использованием антител типа сэндвич, в котором пробное антитело тестируют на связывание с антигеном, связанным с стандартизованным антителом. Если пробное антитело связывается с тем же эпитопом, что и стандартизованное антитело, оно не будет эффективно связываться с антигеном, потому что этот эпитоп маскирован стандартизованным антителом.

Для проведения классификации антител по эпитопам меченные различными метками хМАР™ карбоксилированные микросферы (Ьиттех, АикЛп, ТХ) защищали от света и покрывали иммобилизованными антителами (моноклональные антимышиные ΙβΟ кролика). Покрытые микросферы с определенной меткой были затем использованы для селективного связывания одного из трех стандартизованных антител (14Ό12, 15Е2 или 4А8) таким образом, что каждое стандартизованное антитело было связано с меткой, отличной от других. Микросферы, меченные разными метками, объединяли и добавляли в лунки микропланшеты. Микросферы разливали по лункам и инкубировали в течение ночи при 4°С. АNСРТ^4 мыши добавляли в лунки и инкубировали при перемешивании при 25°С в течение 1 ч с последующим промыванием. Одно из трех пробных антител (14Ό12, 15Е2 или 4А8) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 25°С в течение 1 ч с последующим промыванием. Биотинилированное антитело (моноклональное антимышиное ΙβΟ кролика) добавляли в лунки для выявления связывания АNСРТ^4 пробным антителом. В лунки добавляли стрептавидин-РЕ и инкубировали в течение 30 мин. Анализатор Ьиттех® 100™ (двухпучковый лазер, проточная сортирующая и детектирующая платформа) использовали для изучения каждой лунки и определения конкретной метки, связанной с каждой микросферой (и, таким образом, для идентификации стандартизованного антитела), и интенсивности сигнала, вызванного РЕ и связанного с каждой микросферой. Интенсивность сигнала, вызванного РЕ, прямо пропорциональна количеству пробного антитела, связанного с АNСРТ^4 мыши.

Результаты представлены на фиг. 16. Когда 4А8 использовали в качестве пробного антитела (первая группа из трех столбцов), оно связывало АNСРТ^4 мыши при использовании как 14Ό12, так и 15Е2 в качестве стандартизованного антитела, что проявлялось в виде сильного флуоресцентного сигнала (черные и белые столбцы). Следовательно, 4А8 не связывается с тем же эпитопом, что и 14Ό12 и 15Е2. Когда 14Ό12 использовали в качестве пробного антитела (вторая группа из трех столбцов), оно связывало АNСРТ^4 мыши при использовании 4А8 в качестве стандартизованного антитела, но демонстрировало слабое связывание при использовании 15Ε2 в качестве стандартизованного антитела (ср. серые и белые столбцы). Следовательно, 14Ό12 и 15Е2, вероятно, связываются с одним и тем же эпитопом. Сходным образом, когда 15Е2 использовали в качестве пробного антитела (последняя группа из трех столбцов), оно связывало АNСРТ^4 мыши при использовании 4А8 в качестве стандартизованного антитела, но демонстрировало слабое связывание при использовании 14Ό12 в качестве стандартизованного антитела (ср. серые и черные столбцы), подтверждая таким образом, что 14Ό12 и 15Е2, вероятно, связываются с одним и тем же эпитопом.

Второй эксперимент по классификации антител по эпитопам проводили с использованием системы ЫАС0КЕ® 3000 (В1асоге АВ, Иррка1а 8даебеп) в соответствии с инструкциями производителя. Система ЫАС0КЕ® 3000 позволяет проводить анализ биомолекулярного взаимодействия в реальном времени с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса. В частности, способность комплекса антиген-антитело ингибировать связывание свободного антитела использовали для определения общих эпитопов связывания в процессе конкурентного ингибирования.

Эксперимент проводили с использованием антител 14Ό12, 15Е2, 90В4, 16В10, 4А8 и 9С10. Антитела были или непосредственно иммобилизованы на чипе ВIАС0ΚЕ, или связаны с чипом через антимышиный Ι§6 Ес, иммобилизованный на чипе. С целью определения эпитопа, связывающегося с каждым антителом, связанное антитело инкубировали с N-тΛNСРТ^4 и либо с таким же антителом в растворе, либо с другим антителом в растворе. Затем системе позволяли достичь равновесия. На основе реципрокного ингибирования связывания были выделены следующие эпитопные классы: класс Ι включал в себя 14Ό12 и 15Е2, класс ΙΙ включал в себя 90В4 и 16В10, класс ΙΙΙ включал в себя только 4А8 и класс Ιν включал в себя 9С10. Эти результаты согласуются с первым экспериментом классификации антител по эпитопам, описанным выше.

P. Введение ш νί\Ό моноклональных антител с нейтрализующей активностью симулирует нокаут

- 37 016185 фенотип.

Антитела с нейтрализующей активностью ш ν 11го вводили мышам для определения, могут ли эти антитела симулировать фенотип нокаут-мышей по гену Аидр!14. Для введения антител 1и у|уо, мышам, находившимся на стандартной диете (обычная пища) или мышам с ИЮ, вызванным диетой ΗΡΌ, инъецировали 30 мкг моноклонального антитела в объеме 10 мкл на 1 г веса тела, как показано ниже в табл.

2. Анти-КЬН антитело вводили в качестве контрольного антитела. Уровни триглицеридов, холестерина и РРА в сыворотке натощак измеряли через четыре дня.

Таблица 2

Группы (п=8 мышей в группе)	Диета	МАш (30 мг/всг)	ИЗотип
1	Обычная пища	Анти-КЬН	1дС1
2	Обычная пища	Анти-КЬН	1дС2а
3	Обычная пища	4ΑΘ	1д61
4	Обычная пища	14ϋ12	1дС2а
5	Обычная пища	15Е2	1дС2а
6	Обычная пища	6011	1дС1
7	ΗΓϋ	Анти-КЬН	1д61
8	ΗΓϋ	Анти-КЬН	1дС2а
9	НЕЬ	4А8	1д61
10	ΗΪΌ	14М2	1д62а
11	ΗΕΌ	15Г2	1д62а
12	ΗΕΌ	6611	1дС1

Результаты представлены на фиг. 17-19. У мышей, получавших стандартную диету, одно введение 14Ό12 значительно снижало уровни триглицеридов сыворотки натощак на 72,7 и 67,0% (в двух независимых исследованиях), уровни общего холестерина сыворотки натощак на 27,1 и 21,3% (в двух независимых исследованиях) и уровни РРА натощак на 44,3% (в одном исследовании). Сходным образом одно введение 15Р2 снижало уровни триглицеридов сыворотки натощак на 67,6 и 71,8% (в двух независимых исследованиях), уровни общего холестерина сыворотки натощак на 22,8 и 28,0% (в двух независимых исследованиях) и уровни РРА натощак на 39,3% (в одном исследовании). Эти наблюдения согласуются со способностью 14Ό12 и 15Р2 спасать активность ЛПЛ 1и νίΙΐΌ. Однако одно введение 4А8 не оказывало значительного эффекта на уровни триглицеридов, холестерина и РРА сыворотки натощак (см. столбиковые диаграммы, фиг. 17-19), даже несмотря на то, что антитело было способно спасать активность ЛПЛ 1и νίΙΐΌ. Напротив, одно введение 6011 повышало уровни триглицеридов сыворотки натощак на 66,4%, что согласуется со способностью этого антитела дополнительно подавлять активность ЛПЛ ш νίΙΐΌ. Введение 6011 не оказывало значительного эффекта на уровни холестерина и РРА сыворотки натощак (см. столбиковые диаграммы, фиг. 18-19).

Результаты, полученные с использованием мышей с ИЮ, вызванным диетой НРИ, представлены на фиг. 20-21. Одно введение 14Ό12 снижало уровни триглицеридов сыворотки натощак на 53,2% и уровни общего холестерина сыворотки натощак на 27,6%. Сходным образом, 15Р2 снижало уровни триглицеридов сыворотки натощак на 56,6% и уровни холестерина на 31,0%. 4А8 не оказывало значительного эффекта ни на уровни триглицеридов сыворотки натощак, ни на уровни общего холестерина (см. столбиковые диаграммы, фиг. 20-21). Одно введение 6011 значительно повышало уровни триглицеридов сыворотки натощак на 60,9%, но не оказывало значительного эффекта на уровни общего холестерина сыворотки натощак (см. столбиковые диаграммы, фиг. 21). Уровни РРА у мышей с ИЮ не измеряли.

Приведенные выше результаты показывают, что введение некоторых антител, нейтрализующих активность АЫ0РТЬ4, симулирует снижение уровней липидов сыворотки, наблюдающееся у нокаутмышей по гену Аидр!14. На основе этих результатов можно ожидать, что введение таких антител будет симулировать другие аспекты нокаут-фенотипа по гену Аидр!14, например повышение эндогенной активности ЛПЛ в состоянии голодания, повышение защиты от стеатоза печени и интрамиоцеллюлярного накопления липидов и повышение защиты от нарушения толерантности к глюкозе.

Нейтрализующие антитела также вводили курсом в течение пяти недель для достижения эффектов длительного введения. Мышам с ИЮ, вызванным диетой НРИ, инъецировали один раз в неделю 14Ό12, 15Р2 или подходящее по изотипу контрольное антитело (антиКЬН) в течение пяти недель. Доза составляла 30 мкг моноклонального тела в объеме 10 мкл на 1 г веса тела. Измеряли уровни липидов сыворотки натощак и сравнивали с уровнями липидов сыворотки натощак у мышей, которым антитело вводили только один раз. Как показано на фиг. 22, 23, одно введение 14Ό12 снижало триглицериды сыворотки натощак на 53,22% и холестерин на 27,58%, тогда как еженедельное введение 14Ό12 курсом в течение пяти недель снижало триглицериды сыворотки натощак на 59,36% и холестерин на 44,21%. Сходным

- 38 016185 образом, одно введение 15Е2 снижало триглицериды сыворотки натощак на 56,61% и холестерин на 30,97%, тогда как еженедельное введение 15Е2 курсом в течение пяти недель снижало триглицериды сыворотки натощак на 64,45% и холестерин на 32,73%. В этом исследовании еженедельное введение 14Ό12 или 15Е2 курсом в течение пяти недель не оказывало значительного эффекта на ЕЕА, толерантность к глюкозе или вес тела, в сравнении с однократным введением (данные не приводятся). Эти результаты показывают, что длительное введение антител, нейтрализующих активность ΑNСΡΤ^4, поддерживает или вызывает дальнейшее снижение уровней триглицеридов и общего холестерина сыворотки натощак, в сравнении с однократным введением.

Уровни кетоновых тел сыворотки натощак (КВ) также измеряли у мышей с ΌΙ0, получавших еженедельные инъекции 14Ό12, 15Е2 или контрольного антитела (антиКЬН) в течение пяти недель, как описано выше. Мыши с ΌΙ0, получавшие инъекции 14Ό12 или 15Е2, имели значительно повышенные уровни кетоновых тел, по сравнению с мышами с ΌΙ0, получавшими инъекции контрольного антитела, см. фиг. 24. Известно, что кетоновые тела образуются при падении уровня липидов в организме. Следовательно, повышенные уровни кетоновых тел могут быть вероятным механизмом, с помощью которого снижаются печеночные и интрамиоцеллюлярные уровни липидов у мышей, инъецированных нейтрализующим антителом.

0. Образование у нокаут-мышей по гену Апдр!14 моноклональных антител, которые перекрестно реагируют с ΛNСΡΤ^4 человека и мыши.

Уровни моноклональных антител, которые перекрестно реагируют как с человеческими, так и с мышиными ΛNСΡΤ^4. повышали у нокаут-мышей по гену Апдр!14 с использованием N-тΛNСΡΤ^4. который содержит область амино-терминального домена мышиного ΛNСΡΤ^4.

Полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты с 23 до 180 мышиного ΛNСΡΤ^4. клонировали в вектор экспрессии рЕЬ22Ь(+) (Nоνадеη). Этот вектор кодирует Ν-концевую реГВ лидерную последовательность, а также С-концевую Н18 !ад. Полученный в результате вектор экспрессии называется рЕΤ-N-тΛNСΡΤ^4. После трансляции белка и удаления всех, кроме 11 аминокислот последовательности реШ, N-тΛNСΡΤ^4 имеет последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 10. Эта последовательность содержит 11 аминокислот последовательности реГВ, после которых следуют аминокислоты с 23 до 180 мышиного ΛNСΡΤ^4 (подчеркнуто в табл. 6), после которых следуют 2 аминокислотных линкера и Н18 !ад.

N-тΛNСΡΤ^4 экспрессировали и выделяли из Е. сой следующим образом. 10 мл ЬВ, содержащих 50 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл карбенициллина, инокулировали с одной колонией Е. сой, трансформированной рЕΤ-N-тΛNСΡΤ^4. Культуру инкубировали при 37°С в течение ночи. Затем 10 мл культуры переносили в 500 мл ЬВ без антибиотиков и инкубировали при 37°С, пока 0И₆₀₀ не достигало 0,6 (примерно 2 ч). Добавляли ΙΡΤΟ до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали культуру при встряхивании 200 об/мин при 37°С в течение 4 ч. Затем культуру помещали на лед на 5 мин. Клетки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в роторе !ЬА16.25 в течение 15 мин. Затем осадок ресуспендировали в 50 мл лизирующего буфера (50 мМ Ίηκ, рН 7,5, 0,5 М ИаС1, 1% Ьгйоп Х-100, 1х коктейль, ингибирующий протеазы (Косйе) и 0,25 мл ΡΜ8Ε (0,1 М в изопропаноле)). Лизированные клетки затем центрифугировали при 9700 об/мин в роторе 1А25.5 в течение 30 мин. Супернатант удаляли и снова очищали центрифугированием при 28000 об/мин в роторе 8^28 в течение 30 мин. Затем рекомбинантное N-тΛNСΡΤ^4 может быть выделено из очищенного супернатанта с помощью хроматографии ΡιόЬопб (Νί) ДтЦгодеп).

Для выделения рекомбинантного N-тΛNСΡΤ^4 из нерастворимого осадка, остающегося после центрифугирования лизированных клеток, осадок промывали в 30 мл лизирующего буфера и центрифугировали при 9700 об/мин в роторе 1А25.5. Стадию промывания повторяли дважды, до трех промываний в целом. Нерастворимый белок из осадка затем растворяли в 10 мл денатурирующего буфера (50 мМ Ίηκ, рН 8,0, 6 М гуанидина НС1). Затем раствор центрифугировали при 28000 об/мин в роторе 1А25.5 в течение 30 мин. Затем супернатант загружали на 5-мл колонку со смолой Ρ^оЬоηб. Колонку промывали 50 мл промывочного буфера (50 мМ Ίηκ, рН 8,0, 1 М ИаС1, 8 М мочевины, 15 мМ имидазола). Рекомбинантный белок повторно загружали в колонку с 50 мл градиентом из промывочного буфера для ренатурирующего буфера (50 мМ Τηκ, рН 8,0, 1 М ИаС1, 0,5% Игееп 20). Рекомбинантный белок затем элюировали элюирующим буфером (ренатурирующий буфер с 250 мМ имидазола). Фракции, содержащие рекомбинантный белок, объединяли и диализировали против буфера хранения (50 мМ Ίηκ, рН 8,0, 100 мМ ИаС1, 0,2% Игееп 20). Выделенное N-тΛNСΡΤ^4 разделяли на аликвоты и хранили при -70°С.

Мышей примировали дозой 40 мкг N-тΛNСΡΤ^4 в полном адъюванте Фрейнда интраперитонеально. Через две недели мышей бустировали дозой 30 мкг N-тΛNСΡΤ^4 в неполном адъюванте Фрейнда интраперитонеально, а затем бустировали снова через следующие две недели дозой 20 мкг ΝтΛNСΡΤ^4 в ША интраперитонеально. Альтернативно, может быть использован адъювант на основе хитозана, см., например, патенты США №№ 5912000; 5965144 и 5980912. Через одну неделю после второй бустер-инъекции сывороточные титры измеряли с помощью ЕЫЗА, как описано выше в примере К, за исключением того, что лунки покрывали 50 мкл 0,25 мкг/мл тΛNСΡΤ^4. Через две недели после второй бустер-инъекции мышей бустировали дозой 10 мкг очищенного мышиного ΛNСΡΤ^4. полученного,

- 39 016185 как описано выше, часть νΐ.Η., в ΙΕΆ интраперитонеально. Через одну неделю после третьей бустеринъекции сывороточные титры снова измеряли с помощью ЕБ18А. как описано выше в этом параграфе. Примерно через две с половиной недели после третьей бустер-инъекции мышей бустировали дозой 10 мкг М-тЛМСРТЬ4 внутривенно.

Через три дня у иммунизированных мышей выделяли спленоциты и проводили слияние с клетками миеломы (N81) с использованием РЕС 1500 в качестве агента слияния. Полученные в результате продукты слияния клеток разводили в гибридомной среде и высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур. Через 1 сутки в культуры гибридом добавляли среду НАТ. Среду меняли каждые три или четыре дня по необходимости.

Через десять-четырнадцать дней селекции и культивирования гибридомы исследовали с помощью ЕЫ8А для идентификации тех. которые экспрессируют антитела. перекрестно реагирующие с человеческими и мышиными АNСРТ^4. Анализы ЕЬ18А проводили как описано выше в примере К. за исключением того. что лунки покрывали 50 мкл 0.25 мкг/мл раствора белка и каждое антитело отдельно тестировали как против мышиных АNСРТ^4. так и против человеческих АNСРТ^4. Мышиные АNСРТ^4 и человеческие АNСРТ^4 выделяли из кондиционированной среды клеток СНО. инфицированных АФ5тАпдрЙ4Т и АФ5-тАпдрЙ4Т соответственно. как обсуждалось в примере Н. Были выбраны пятнадцать моноклональных антител. которые перекрестно реагировали с мышиными и человеческими АNСРТ^4. Определили изотипы выбранных антител. которые показаны в табл. 3.

Таблица 3

Обозначение антитела	Изотип
ЗН1	1дС1
5А8	1д61
8Ω8	1дС1
9С10	1дС1
19С9	1дС1
20С9	I 1
18А2	1дС2а
5Г2	1дС2Ь
7Н8	1дС2Ь
11С11	1д62Ь
16А11	1дС2Ь
1803	1дО2Ь
90В4	1дО2Ь

К. Активность ίη νίνο моноклональных антител против АNСРТ^4.

Антитела 14Ό12. 19С9. 18С3. 18А2. 9С10 и 90В4 так же. как и анти-КЕН. в качестве контроля тестировали на определенную активность у мышей ίη νίνο следующим образом. 30 мг/кг веса тела антитела инъецировали белым мышам дикого типа С57 интраперитонеально. Каждое антитело тестировали на пяти мышах. Через четыре дня измеряли уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки натощак. Уровни триглицеридов сыворотки натощак у мышей. инъецированных антителом. в этом эксперименте. представлены на фиг. 31. Антитела 14Ό12 и 90В4 статистически значимо снижали триглицериды сыворотки натощак на 73.6 и 54.9% соответственно. Уровни общего холестерина сыворотки натощак у мышей. инъецированных антителом. в этом эксперименте. представлены на фиг. 32. Антитела 14Ό12 и 90В4 статистически значимо снижали общий холестерин сыворотки натощак на 25.2 и 22.2% соответственно.

8. Сравнительное сродство связывания моноклональных антител против АNСРТ^4.

Сродство связывания антител 90В4. 15Е2 и 14Ό12 определяли для N-тАNСРТ^4 и N-йАNСРТ^4 с помощью ЕЫ8А. N-йАNСРТ^4 экспрессировали и выделяли из бактерий. как описано выше для ΝтАNСРТ^4 в примере О. Полинуклеотидную последовательность. кодирующую аминокислоты с 24 до 175 человеческого АNСРТ^4. клонировали в вектор экспрессии рЕТ22Ь(+). который кодирует Νконцевую ре1В лидерную последовательность. а также С-концевую Н18 1;щ. После трансляции белка и удаления всех. кроме 11 аминокислот последовательности ре1В. N-тАNСРТ^4 имеет последовательность. представленную в 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 11. Эта последовательность содержит 11 аминокислот последовательности ре1В. после которых следуют аминокислоты с 24 до 175 человеческого АNСРТ^4 (подчеркнуто в табл. 6). после которых следуют 2 аминокислотных линкера и Нщ 1ад. Анализы ЕЫ8А проводили. как описано выше в примере К. за исключением того. что планшеты покрывали 50 мкл 0.25 мкг/мл белка (N-тАNСРТ^4 или N-йАNСРТ^4) на лунку. Связывание измеряли при 0. 0.08. 0.4. 2 и 10 мкг/мл антитела. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 33. 90В4 имело большее сродство как к ΝтАNСРТ^4 (панель А). так и к N-йАNСРТ^4 (панель В). чем 15Е2 или 14Ό12. 15Е2 имело большее сродство к N-тАNСРТ^4. чем 14Ό12. но сравнимое со сродством 14Ό12 к N-йАNСРТ^4.

Т. Зависимость степени снижения триглицеридов сыворотки от дозы 14Ό12.

Пять белых мышей дикого типа С57. получавших диету ΗΕΌ. инъецировали подкожно различными концентрациями. обсуждаемыми ниже. либо антитела 14Ό12. либо антитела анти-КЬН. Через 4 дня и

- 40 016185 через 7 дней определяли процент снижения общих триглицеридов по сравнению с их уровнем, определенным в день 0. Концентрации антител, тестировавшиеся в этом эксперименте, были 0,3, 1, 3, 10, 30 и 90 мг/кг веса тела. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 34. Через 4 дня введение 10, 30 и 90 мг/кг веса тела привело к статистически значимому снижению триглицеридов сыворотки, см. фиг. 34, панель А. Этот эффект был длительным и оставался статистически значимым через 7 дней, см. фиг. 34, панель В.

и. Фармакодинамика и фармакокинетика моноклональных антител против АНСРТЬЭ.

Для изучения фармакодинамики 14Ό12 белых мышей С57 инъецировали дозой 14Ό12 30 мкг/г веса тела и измеряли у них уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки натощак через определенные промежутки времени, данные представлены в табл. 4 ниже. Мыши находились на обычной диете (пища). В эксперименте использовали восемь групп по три мыши в каждой группе. Одной группе из трех мышей не проводили инъекцию антитела и использовали эту группу в качестве группы сравнения. Остальные семь групп мышей получали инъекции 14Ό12. Мышей инъецировали, содержали в голодном состоянии и забирали кровь в соответствии со следующими режимами:

Таблица 4

Для изучения фармакокинетики 14Ό12 четырех белых мышей С57 инъецировали дозой 14Ό12 30 мг/г веса тела в 8 утра в день 1. Еще четырех белых мыши С57 инъецировали дозой 30 мг/кг анти-КЬИ в 8 утра в день 1 в качестве контроля. У каждой мыши затем забирали кровь через 1, 5, 10 ч, 1, 2, 4, 7, 10 и 14 дней и определяли концентрацию антител в крови следующим образом. Проводили анализ ЕЫ8А, как обсуждалось в примере К, за исключением того, что каждую лунку покрывали 50 мкл 0,5 мкг/мл ΝтАНСРТЬЧ С использованием ЕШ8А тестировали следующие разведения мышиной сыворотки: 1:10³, 1:10⁴, 1:10⁵, 1:10⁶. Стандарты, содержащие 0,08, 0,4, 2 и 10 мкг/мл 14Ό12, тестировали в параллели с разведениями мышиной сыворотки.

Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 35. Панель А представляет точечный график концентраций 14Ό12 и уровней триглицеридов сыворотки натощак за все время эксперимента. Концентрация 14Ό12 достигала максимума примерно через 24 ч после инъекции, тогда как концентрация триглицеридов сыворотки натощак достигала минимума примерно через 96 ч после инъекции и оставалась низкой в течение по меньшей мере 336 ч после инъекции, после чего эксперимент был закончен. Панель В представляет точечный график концентраций 14Ό12 и уровней общего холестерина сыворотки натощак за все время эксперимента. Как указано выше, концентрация 14Ό12 достигала максимума примерно через 24 ч после инъекции. Концентрация общего холестерина сыворотки натощак достигала минимума примерно через 168 ч после инъекции и оставалась низкой в течение по меньшей мере 336 ч после инъекции, после чего эксперимент был закончен.

V. Введение моноклональных антител против АНСРТЬЭ мышам с избыточной экспрессией человеческого АНСРТЬ4.

Для определения, могут ли определенные моноклональные антитела снижать триглицериды и общий холестерин у мышей с избыточной экспрессией человеческого АНСРТЬ4 натощак, Аб5-йАпдр114Т (описанный в примере В.2., выше) инъецировали в дозе 1 х 10⁹ МЕ/мышь в хвостовую вену белых мышей С57. Всего Аб5-йАпдр114Т инъецировали четырем группам по пять мышей в каждой. Каждой из четырех групп также инъецировали 30 мг/кг антитела в то же время, когда инъецировали вирус. Инъецируемыми антителами были анти-КЕН, 14Ό12, 15Е2 и 90В4. Через четыре дня у мышей измеряли уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки натощак.

На фиг. 36 представлены уровни триглицеридов сыворотки сытых мышей в этом эксперименте. Каждая из пяти мышей в каждой группе представлена на фиг. 36 отдельным символом. Мыши, инъецированные анти-КЕН, имели уровни триглицеридов сыворотки примерно между 750 и 1900 мг/дл. Три мыши из тех, которые были инъецированы 14Ό12, имели уровни триглицеридов сыворотки ниже, чем у мышей, инъецированных анти-КЕН. Остальные мыши, инъецированные 14Ό12, имели более высокие уровни триглицеридов по сравнению с мышами, инъецированными анти-КЬН. Три мыши из тех, которые были инъецированные 15Е2, имели уровни триглицеридов сыворотки ниже, чем у мышей, инъецированных анти-КЕН, тогда как остальные две мыши, инъецированные 15Е2, имели уровни триглицеридов, сходные с этими показателями у мышей, инъецированных анти-КЕН. Наконец, три мыши из тех, которые были инъецированны 90В4, имели уровни триглицеридов сыворотки ниже, чем у мышей, инъецированных анти-КЕН, тогда как остальные две мыши, инъецированные 90В4, имели более высокие уровни триглицеридов по сравнению с мышами, инъецированными анти-КЕН.

- 41 016185

Результаты показывают, что примерно половина мышей, инъецированных антителами против АНСРТЬ4, имели пониженные уровни триглицеридов сыворотки по сравнению с этими показателями у мышей, инъецированных аити-КЬн антителами. Некоторые мыши, инъецированные антителами против АНСРТЬ4, имели повышенные уровни триглицеридов сыворотки, что может быть связано с вариациями Аб-йАНСР1Е4Т инфекции и, возможно, экспрессии в печени.

На фиг. 37 представлены уровни общего холестерина сыворотки голодных мышей в этом эксперименте. Каждая из пяти мышей в каждой группе представлена тем же символом, что и на фиг. 36. Все пять мышей, инъецированных анти-КЕН имели уровни общего холестерина примерно между 180 и 240 мг/дл. Три мыши из тех, которые были инъецированы 14Ό12, имели уровни общего холестерина сыворотки ниже, чем у мышей, инъецированных анти-КЬн. Остальные мыши, инъецированные 14Ό12, имели уровни общего холестерина более высокие по сравнению с мышами, инъецированными анти-КЕн. Четыре мыши из тех, которые были инъецированы 15Ε2, имели уровни общего холестерина сыворотки ниже, чем у мышей, инъецированных анти-КЬн, тогда как одна мышь, инъецированная 15Е2, имела уровень общего холестерина, сравнимый с этим показателем у мышей, инъецированных анти-КЬн. Наконец, две мыши из тех, которые были инъецированы 90В4, имели уровни общего холестерина сыворотки ниже, чем у мышей, инъецированных анти-КЬн, тогда как одна мышь, инъецированная 90В4, имела уровни общего холестерина, сравнимые с этими показателями у мышей, инъецированных анти-КЬн, а одна из мышей, инъецированных 90В4, имела уровень общего холестерина выше, чем у мышей, инъецированных анти-КЬн.

В целом, примерно половина мышей, инфицированных Аб5-ЬАНСРТЬ4Т и инъецированных антителами против АНСРТЬ4, имела уровни общего холестерина ниже, чем у мышей, инфицированных Аб5ЬАНСРТЬ4Т и инъецированных анти-КЕн. Нужно еще раз указать, что повышенные уровни холестерина у мышей, инфицированных Аб5-ЬАНСРТЕ4Т и инъецированных антителами против АНСРТЬ4, могут быть результатом вариаций Аб-йАНСР1Е4Т инфекции и, возможно, экспрессии в печени.

Эти результаты демонстрируют, что инъецирование антителами 14Ό12, 15Е2 и 90В4 может снижать уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки у мышей с избыточной экспрессией человеческого АН6Р!Е4.

Введение моноклональных антител против АНСРТЬ4 нокаут-мышам по гену ЬЭЬг.

Было обнаружено, что нокаут-мыши по гену ЬЭЬг имеют повышенные уровни холестерина сыворотки, особенно если находятся на диете с высоким содержанием жиров, см., например, 1кЫЬакЫ е! а1. (1993) 1. С11п. 1пусЧ. 92:883-93. Для определения, могут ли некоторые моноклональные антитела против АНСРТБ4 снижать уровни холестерина и триглицеридов сыворотки у нокаут-мышей по гену ЕЭБт, был проведен следующий эксперимент. Трем группам по пятнадцать нокаут-мышей по гену БЭБт в возрасте 12-13 недель Цасккоп ЕаЬогайпек, линия В6.12987-Ьб1г^1т1не|'/1) инъецировали только носителем, 30 мг/кг анти-КЕн или 30 мг/кг 14Ό12 интраперитонеально. Каждой мыши вводили одну инъекцию в неделю в течение пятнадцати недель. Четвертую группу из пятнадцати мышей оставили интактной. Все мыши получали диету Клинтона (Векеагсй П1е1к, продукт № Ό12107), начиная со дня первой инъекции.

Уровни триглицеридов сыворотки натощак определяли у каждой мыши в конце 15 недели, см. фиг. 38. Уровни триглицеридов сыворотки у мышей, инъецированных 14Ό12, были значительно ниже, чем уровни триглицеридов сыворотки у мышей, инъецированных анти-КЕИ, носителем или у интактных мышей.

Уровни общего холестерина сыворотки натощак определяли у каждой мыши в конце 15 недели, см. фиг. 39. Уровни общего холестерина сыворотки у мышей, инъецированных 14Ό12, были значительно ниже, чем уровни общего холестерина сыворотки у мышей, инъецированных анти-КЕн, носителем или у интактных мышей.

В этом эксперименте нокаут-мыши по гену БЭБт, инъецированные 14Ό12 каждую неделю в течение 14 недель, показали различия в толерантности к глюкозе или уровнях инсулина по сравнению с нокаут-мышами по гену БЭЕг, инъецированных анти-КЕн или носителем каждую неделю в течение 14 недель. Более того, в этом эксперименте не было различий в содержании жира в организме, процента жира или сухой мышечной массы тела между мышами, инъецированными 14Ό12 каждую неделю в течение 8 недель, и мышами, инъецированными анти-КЕн или носителем каждую неделю в течение 8 недель. Наконец, процент бляшек в аортальном дереве мышей, инъецированных 14Ό12 каждую неделю в течение 15 недель, не был статистически значимо отличен от процента бляшек в аортальном дереве мышей, инъецированных как анти-КЕн, так и носителем, каждую неделю в течение 15 недель, в этом эксперименте (данные не приводятся).

Эти результаты показывают, что 14Ό12 может снижать уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки у нокаут-мышей по гену БЭБг. В этом эксперименте моноклональное антитело 14Ό12, однако, не вызывало улучшения толерантности к глюкозе или изменений уровня инсулина у этих мышей. В этом эксперименте моноклональное антитело 14Ό12 не вызывало изменения состояния организма этих мышей или снижения процента бляшек в аортальном дереве. Кроме того, в конце эксперимента, у одной из тринадцати нокаут-мышей по гену БЭЕг, получавших в течение 15 недель инъекции 14Ό12, произошло расширение брюшной полости, а у двух из тринадцати нокаут-мышей по гену БЭЕг, получавших в

- 42 016185 течение 15 недель инъекции 14Ό12, имелись типичные повреждения мезентериальных лимфатических узлов и сосудов. Наконец, воспалительные цитокины сыворотки не были повышены у нокаут-мышей по гену ЬПЬг, получавших в течение 15 недель инъекции 14Ό12, по сравнению с мышами, получавшими анти-ΚΕΗ или носитель (данные не приводятся).

Далее, изучали эффект одной инъекции 14Ό12 у нокаут-мышей по гену ЬОЬг. Каждая мышь получала одну интраперитонеальную инъекцию в дозе 30 мг/кг веса тела либо анти-ΚΕΗ, либо 14Ό12. Шесть мышей инъецировали 14Ό12, а пять мышей инъецировали анти-ΚΕΗ. Через четыре дня у мышей измеряли уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки натощак.

Уровни триглицеридов сыворотки натощак представлены на фиг. 42. Одна инъекция 14Ό12 привела к снижению на 68,8% триглицеридов сыворотки через 4 дня. Этот результат был статистически значим. Уровни общего холестерина сыворотки натощак представлены на фиг. 43. 14Ό12 не снижало уровни холестерина до статистически значимых величин в этом эксперименте.

Эти результаты демонстрируют, что одна инъекция моноклонального антитела против ΛNСРТ^4. тестировавшегося в этом эксперименте, приводит к значительному снижению триглицеридов сыворотки у нокаут-мышей по гену ЬЭЬг.

X. Введение моноклональных антител против АХСР^И нокаут-мышам по гену АроЕ.

Было обнаружено, что у нокаут-мышей по гену АроЕ развивается спонтанная гиперхолестеринемия, см., например, Р1ебгаИйа е1 а1. (1992) Ргос. №111. Асаб. 8сг и8А 89(10):4471-5 и 2Иапд е! а1. (1992) 8с1епсе 258(5081):468-71. Для определения, могут ли некоторые моноклональные антитела против ΛNСРТ^4 снижать уровни холестерина и триглицеридов сыворотки у нокаут-мышей по гену АроЕ, был проведен следующий эксперимент. Три группы по пятнадцать нокаут-мышей по гену АроЕ в возрасте 14 недель (Та^шс Ат1па1 Μοбе18, линия В6.129Р2-Λрοе^ίт1υпсN11) инъецировали только носителем, 30 мг/кг анти-ΚΕΗ или 30 мг/кг 14Ό12 интраперитонеально. Каждой мыши вводили одну инъекцию в неделю в течение пятнадцати недель. Четвертую группу из пятнадцати мышей оставили интактной. Все мыши получали диету Vе8ΐет (КекеагсИ П1е18, продукт № Ό12079Β), начиная со дня первой инъекции.

Уровни триглицеридов сыворотки натощак определяли у каждой мыши в конце 15 недели, см. фиг. 40. Уровни триглицеридов сыворотки у мышей, инъецированных 14Ό12, были значительно ниже, чем уровни триглицеридов сыворотки у мышей, инъецированных анти-ΚΕΗ или у интактных мышей. Однако в этом эксперименте уровни триглицеридов сыворотки у мышей, инъецированных 14Ό12, были значительно ниже, чем уровни триглицеридов сыворотки у мышей, которым вводили только носитель.

Уровни общего холестерина сыворотки натощак определяли у каждой мыши в конце 15 недели, см. фиг. 41. Уровни общего холестерина сыворотки у мышей, инъецированных 14Ό12, не были значительно ниже, чем уровни общего холестерина сыворотки у мышей, инъецированных анти-ΚΕΗ или носителем, в этом эксперименте, но были значительно ниже, чем уровни общего холестерина сыворотки у интактных мышей.

В этом эксперименте не было различий в содержании жира в организме, процента жира или сухой мышечной массы тела между мышами, инъецированными 14Ό12 каждую неделю в течение 15 недель, и мышами, инъецированными анти-ΚΕΗ или носителем, каждую неделю в течение 15 недель. Более того, процент бляшек в аортальном дереве мышей, инъецированных 14Ό12 каждую неделю в течение 15 недель, не был статистически значимо отличен от процента бляшек в аортальном дереве мышей, инъецированных как анти-ΚΕΗ, так и носителем, каждую неделю в течение 15 недель в этом эксперименте (данные не приводятся).

Эти результаты показывают, что 14Ό12 может снижать уровни триглицеридов сыворотки у нокаутмышей по гену АроЕ. В этом эксперименте моноклональное антитело 14Ό12, однако, не вызывало снижения уровней общего холестерина сыворотки у нокаут-мышей по гену АроЕ. В этом эксперименте моноклональное антитело 14Ό12 не вызывало также изменения состояния организма этих мышей или снижения процента бляшек в аортальном дереве. Кроме того, в конце эксперимента у трех из пятнадцати нокаут-мышей по гену АроЕ, получавших в течение 15 недель инъекции 14Ό12, произошло расширение брюшной полости, а у тринадцати из пятнадцати нокаут-мышей по гену АроЕ, получавших в течение 15 недель инъекции 14Ό12, имелись типичные повреждения мезентериальных лимфатических узлов и сосудов. Наконец, у шести из пятнадцати нокаут-мышей по гену АроЕ, получавших в течение 15 недель инъекции 14Ό12, отмечался хилезный асцит. Воспалительные цитокины сыворотки не были повышены у нокаут-мышей по гену АроЕ, получавших в течение 15 недель инъекции 14Ό12, по сравнению с мышами, получавшими анти-ΚΕΗ или носитель (данные не приводятся).

Далее изучали эффект одной инъекции 14Ό12 у нокаут-мышей по гену АроЕ. Каждая мышь получала одну интраперитонеальную инъекцию в дозе 30 мг/кг веса тела либо анти-ΚΕΗ, либо 14Ό12. Шесть мышей инъецировали 14Ό12, а семь мышей инъецировали анти-ΚΕΗ. Через четыре дня у мышей измеряли уровни триглицеридов и общего холестерина сыворотки натощак.

Уровни триглицеридов сыворотки натощак представлены на фиг. 44. Одна инъекция 14Ό12 привела к снижению на 55,4% триглицеридов сыворотки через 4 дня. Этот результат был статистически значим. Уровни общего холестерина сыворотки натощак представлены на фиг. 45. Одна инъекция 14Ό12 привела к снижению на 39,5% уровней холестерина сыворотки через 4 дня. Этот результат также был статистиче

- 43 016185 ски значим.

Эти результаты демонстрируют, что одна инъекция моноклонального антитела 14Б12 приводит к значительному снижению уровней триглицеридов сыворотки и общего холестерина сыворотки у нокаутмышей по гену АроЕ.

Υ. Введение моноклональных антител против ΑNС5ΡΤ^4 мышам ДЬ/ДЬ.

Было обнаружено, что ДЬ/ДЬ мыши представляют фенотипы ожирения и диабета, см., например, СНсп е! а1. (1996) Се11 84:491-495 и СНиа 1г. е! а1. (1996) Заенсе 271:994-996. Для изучения эффекта определенных моноклональных антител против ΑNСΡΤ^4 на параметры ожирения и диабета был проведен следующий эксперимент.

Каждую мышь в первой группе из десяти ДЬ/ДЬ мышей инъецировали 30 мг/кг веса тела анти-КЬН подкожно. Каждую мышь во второй группе из десяти ДЬ/ДЬ мышей инъецировали 30 мг/кг веса тела 14Б12 подкожно. Уровни триглицеридов сыворотки натощак измеряли перед инъекцией, а затем измеряли через одну неделю после инъекции. Затем мыши получали еженедельные инъекции, и уровни триглицеридов сыворотки натощак измеряли после 8 еженедельных инъекций. Мыши находились на обычной диете.

Результаты представлены на фиг. 46. Панель А представляет уровни триглицеридов сыворотки натощак через одну неделю после одной инъекции анти-КЬН или 14Б12. В этом эксперименте инъекция 14Б12 статистически значимо снижала триглицериды сыворотки. Панель В представляет уровни триглицеридов сыворотки натощак через 8 недель после еженедельных инъекций 14Б12 или анти-КЬН. В этом эксперименте 14Б12 снижало триглицериды сыворотки на 56%, что было статистически значимо.

Уровни глюкозы и инсулина сыворотки в этом эксперименте не изменялись после инъекции 14Б12. Также не изменялись в этом эксперименте показатели веса тела после инъекции 14Б12.

Ζ. Определение последовательностей некоторых моноклональных антител против ΑNСΡΤ^4.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей 14Б12, 15Б2 и 90В4 клонировали и секвенировали с использованием модифицированной версии способа, описанного в СИШа^ е! а1. (1996) Τίδδΐκ АнИденк 47:1-20. Способ модифицировали для использования КАСЕ и ПЦР праймеров, приемлемых для генетического фона мыши. Выравнивание вариабельной области тяжелой цепи, включающее в себя консенсусную последовательность (8ЕО ГБ ΝΟ: 15), представлено на фиг. 47. В дополнение, процент гомологии вариабельных областей тяжелых цепей между антителами представлен на этом чертеже. Вариабельные области тяжелых цепей 14Б12 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12) и 15Е2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 13) являются идентичными на 99%, тогда как вариабельная область тяжелой цепи 90В4 (8ЕО ГБ ΝΟ: 14) только на 40% идентична вариабельным областям тяжелых цепей 14Б12 и 15Е2.

Выравнивание вариабельной области легкой цепи, включающее в себя консенсусную последовательность (8ЕО ГБ ΝΟ: 19), представлено на фиг. 48. Также представлен процент гомологии вариабельных областей легких цепей. Вариабельные области легких цепей 15Е2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 17) и 90В4 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18) являются идентичными на 99%, тогда как вариабельная область легкой цепи 14Б12 (8ЕО ГБ ΝΟ: 16) только на 52 и 51% идентична вариабельным областям легких цепей 15Е2 и 90В4 соответственно.

АА. Картирование эпитопов определенных моноклональных антител против ΑNСΡΤ^4.

Для идентификации эпитопов для моноклональных антител 15Е2, 14Б12 и 90В4 был проведен следующий эксперимент. Различные фрагменты мышиного ΑNСΡΤ^4 транслировали ίη νίίτο. Локализация фрагментов показана в табл. 5, а последовательность фрагментов показана в табл. 6 (8ЕО ГБ от ΝΟ: 4048). Начальная аминокислота и конечная аминокислота в табл. 5 относятся к аминокислотной последовательности тΑNСΡΤ^4, показанной в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50.

Таблица 5

Фрагмент	Начальная аминокислота	Конечная аминокислота
дз1	024	М7 3
дз2	Σ49	Р98
дзЗ	А74	Ь123
дз4	Е99	Ь151
дз5	Е124	Р180
дз1-2	Ъ49	М73
дз2-3	Ά74	Р98
дзЗ-4	Е99	Ы23
дз4-5	Г124	Ь151

Каждый фрагмент экспрессировали из конструкции, полученной с использованием ПЦР. Каждая конструкция, полученная с использованием ПЦР, содержала промотор Т7, последовательность, кодирующую Н1к₆ 1ад, последовательность, кодирующую малый подобный убиквитину модификатор (8υМΟ) и последовательность, кодирующую фрагмент ΑNСΡΤ^4. ПЦР конструкции транслировали ίη νίίτο с использованием ΚΤ8 Е. сο1^ Ьтеаг Τетρ1аίе Сеηе^аί^οη Зе! (Кοсйе Бхадшкйск) и ΚΤ8 100 Е. сοI^ ΗΥ ΚίΙ (ΚοΠκ □(ад^кИск). каждый в соответствии с указаниями производителя. ΑN8ΡΤ^4 порция фрагмента обозначена как дк1, дк2 и т.д., как показано в табл. 5. Транслированные ίη νίίτο фрагменты белка, включающие в себя Н1к !ад и последовательность 8υМΟ, обозначены как Η^δ-8υМΟ-дδ1, Η^δ-8υМΟ

- 44 016185 дк2 и т.д., как показано на фиг. 49.

Транслированные 1и νίΙΐΌ фрагменты белка разделяли на четырех 8Ό 8-РАСЕ гелях, отдельно с ΝтΑNСΡΤ^4, и переносили на четыре нитроцеллюлозные блота. Блоты затем блокировали в течение от 1 до 2 ч с помощью ТВ8, содержащего 5% обезжиренного сухого молока (ТВ8-№ОМ). После блокирования блоты промывали ТВ8, содержащий 0,5% Тетееи-20 (ТВ8-Тетееи), четыре раза по 5 мин каждое промывание. Блоты затем инкубировали в ТВ8-№ОМ, содержащем тестируемое антитело (14Ό12, 15Р2, 90В4 или анти-Нщ) в течение ночи при 4°С. Блоты промывали ТВ8-Тетееи четыре раза по 5 мин каждое промывание и затем инкубировали в ТВ8-№ПМ, содержащем разведение 1:6000 НВР-связанного антимышиного антитела козы (8ои!кеги Вю!ескио1оду А88ос1а!е8), в течение 1 ч. Блоты промывали ТВ8Т\уееи четыре раза по 5 мин каждое промывание и затем давали развиться окраске с использованием 8ирег81диа1 Аек! Р1со СкетПитшексеи! 8иЬ§!га!е (Р1егсе В1о!ескио1оду) в соответствии с указаниями производителя. Альтернативно, окраска может развиться с использованием АеЦегп В^ееζе™ 1ттииобе!есйои К1! (1№Йгодеи).

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 49. В этом эксперименте антитело 14Ό12 связывалось только с N-тΑNСΡΤ^4. В этом эксперименте 14Ό12 не связывалось с какими-либо другими фрагментами. Этот результат может быть связан с тем фактом, что 14Ό12 является более слабым связывающим агентом, чем 15Р2 и 90В4, см., например, пример 8 и фиг. 33. Антитело 15Р2 связывало Нщ8ИМО-д81. Этот результат позволяет предположить, что 15Р2 связывается, по меньшей мере, с областью между 024 и Р98 тΑNСΡΤ^4 (8Е0 ГО NО: 40). Антитело 90В4 связывалось с Н15-8иМО-д52 и Нщ8иМО-д§4. Этот результат позволяет предположить, что эпитоп 90В4 содержит порции тΑNСΡΤ^4 между Ь49 и Р98 (8Е0 ГО ^: 41) и между Е99 и Ь151 (8Е0 ГО 43).

ВВ. миРНК.

Олигонуклеотиды для использования в качестве миРНК идентифицировали с помощью процесса 8МАВТ5е1ес1юи™ (Окагтасои, 1ис., ЬаГауе!!е, СО). Этот процесс использует многокомпонентный алгоритм для идентификации миРНК с высокой вероятностью потенциального и специфического разрушения мРНК, являющейся мишенью. С помощью этого процесса идентифицировали четыре олигонуклеотида РНК с двойной спиралью для использования в качестве миРНК. Последовательности четырех олигонуклеотидов представлены в 8Е0 ГО NО: 5-8.

Олигонуклеотиды использовали для индуцирования резрушения и, следовательно, экспрессии мРНК, кодирующей ΑNСΡΤ^4 человека.

Четыре олигонуклеотида объединяли с одним реагентом, 8МАВТроо1® (Экагтасои, 1ис., ЬаГауе!!е, СО), который ресуспендировали в буферном растворе, свободном от РНКаз, до конечной концентрации примерно 20 мкМ. Олигонуклеотиды переносили в культивируемые клетки с использованием стандартных способов трансфицирования в концентрации примерно 1-200 нМ миРНК.

Анализ с использованием клеток применяли для подтверждения того, что олигонуклеотиды вызывают разрушение мРНК, кодирующей ΑNСΡΤ^4 человека, 1и νίΙΐΌ. Клетки Не1а, трансфицированные олигонуклеотидами, высаживали на 6-луночные планшеты и позволяли им расти в течение ночи в инкубаторе при 37°С в присутствии 5% СО₂. Плотность высаживания составляла примерно 100000 клеток на лунку. Олигонуклеотиды трансфицировали в клетки на следующий день в конечной концентрации примерно 10-100 нМ в 1 мл среды роста. Клетки собирали через 48 ч после трансфицирования. Общую РНК изолировали с использованием набора О1адеи В№а5у. Количество мРНК Аидр!14 определяли с помощью нозерн-блот анализа.

Поскольку указанные выше примеры описывают, 1и!ег ака, определенные нейтрализующие моноклональные антитела против мышиных ΑNСΡΤ^4 и 1и у|уо эффекты этих антител у мышей, специалист в этой области легко определит, что могут быть получены и нейтрализующие моноклональные антитела против ΑNСΡΤ^4 человека, и эти антитела будут иметь такие же, или сходные, эффекты у человека 1и νί\Ό. Это заключение основывается, частично, на том наблюдении, что человеческие и мышиные ΑNСΡΤ^4 являются эволюционно стабильными белками, которые сохранили структурные и функциональные свойства, см., например, Се е! а1. (2004) 1. Вю1. Скет. 279:2038-2045. Например, человеческие и мышиные ΑNСΡΤ^4 сохранили примерно 77% идентичности аминокислотных последовательностей. Человеческие и мышиные ΑNСΡΤ^4 также имеют общие элементы вторичной структуры, например Νконцевой домен с двойной спиралью и С-концевой фибриногеноподобный домен. Далее, человеческое ΑNСΡΤ^4 имеет функцию, сходную с функцией мышиного ΑNСΡΤ^4, что демонстрируется способностью человеческого ΑNСΡΤ^4 повышать уровни липидов сыворотки при избыточной экспрессии у мышей, см. часть У1.В.2.

Также в науке общеизвестно, что мыши обычно используют в качестве моделей для лечения различных состояний и заболеваний с использованием нейтрализующих антител. Например, нейтрализующие антитела были использованы для лечения прионовой болезни, диабета и воспаления у мышей, см., например, А1Ше е! а1. (2003) №11иге 422:80-83; СаШеаи е! а1. (1997) П1аЬе!е8 46:937-940 и Ьоскиег е! а1. (2002) 1. 1ттиио1. Ме!кобк 259:149-157. В более поздних исследованиях моноклональные антитела, нейтрализующие мышиный 1Ь-18, применяли у мышей с дефицитом 1Ь-18. Эти мышиные моноклональные

- 45 016185 антитела были способны подавлять воспалительный ответ, вызванный липополисахаридами, у мышей дикого типа. Таким образом, специалист в этой области придет к заключению, что приведенные выше примеры подтверждают использование нейтрализующих моноклональных антител против АНСРТЬТ человека в лечении различных медицинских состояний человека.

Таблица 6

Таблица последовательностей

Описание	ЗЕО Ю N0	Последовательность
Мышиный ΑΝΟΡΤί4 (Инвентарный номер ΝΡ_Μ5βΟ6)	1	тгсаркадаа 1?1саакад1 15зцдградр еррг£азж1е шпИаНдИд 1дЬд1геЬ^е гЬгдч1да1е гхтааасдпас ддркдк<£ар£ казесЬгчгред Ьд1кадпзк£ дд!£дктадд дгу1вкдп1г 1дп1дзд±О1 ГарЬЫдпд? <1кЬзгдкк1з кпЛд11д1ка аакЫксраг с1сде1£деде гНвд1£д1др 1дзрр£1упс еткзйддюку £дгг1пдзу<| Гпяа^еаукс! д£дс!рдде£м 1д1екп1Ьз1к дагдад1ауд 1дсЬ«1дпак1 1д£рхП1дде сИ:ауэ1я1Ъе ркапеХдакп. ν3ρη9131ρ£ зк<«1дс11131г дсИпсакзХа ддии£дксзЬ зп!пдду£Ъз хргдгдегкк д±£»ккмкдг уурХдаСкИ хдртеакааз
Мышиный ΑΝβΡΤί.4 (5ιλί58-Ργο(. Инвентарный номер Ο9Ζ1Ρ8)	50	МКСАРТАОАА. ЬУЬСААТАСЬ ЬЗА<2СРРАфР ЕРРРЕАЗИОЕ МЫЕЛАНбЬЬО ЬбНЗГНЕНУЕ КТПеОЬСАЬЕ ЙКМААССЫАС ООРКОКОАРЕ· КОЗЕОНУРЕС дТРЕТЪОЗЪО ТОЫОДНЗК! ΟΟΙΡΌΚνΑΏΟ Ο&ϊΊιδΚΟΝΙΗ ЮНЬОЗЗЮЬ ЬАРТНЬОНСУ 0КТ8К6КВГ.Р КМТОЫаЬТР МАТИЬНЙРРК ОСОЕЬЕОЕОЕ РН32ЬГ01<2Р ЪОЗРРЫЛТЛС ЕМТЗОССИТУ ΙΟΜΟιΝΘβνΟ ЕЫОЗИЕАУКО СГбОВаСЕГН Ь&ЬЕКМН31Т сыксзохауо ΙφϋΝϋΟΝΑΚΙι ЬОВТХНИСЕ ОТАУЗЬОЕТЕ ΡΤΑΝΕΙιΟΑΤΝ узрмсьзьрг зтюооноьк ооьыСАкзьз ееииготсзн зыьыдагнз грйороенкк еттктмкск уурюаттьь ЮРМ5АТАА5
Человеческий ΑΝ3ΡΊ14 (Инвентарный номер ΝΡ„647475)	2	тздарЪадаа 1т1ааа1гау1 1задддрудз кзрг£азмс!е тпуйаЬдИд 1ддд1геЬае гкгздХзаХе гг1засдзас дд£едзЬс11р 1арезгг0ре 71Ъ.з1дкд1к адпзгхдд1£ βΧνβςςφτΚΙ екдМх£д^1 дзд£д11«йгк ЫйЬе^акра гюкг1ратад ρνάραϊιηνίΓ 1Ъ11ргЗсде 1£дтдегдзд 1£ехдрддзр рПупскшкз <£дд«Ь^1дгг к<Ддзтс1£гиер меаукад£дс! р!где£ч1д1е к^ЬахЬдс&п 31;^ауд11;<1и ддаае11д£з тЬ1ддес1Ъау з1д1Ларуад дХдакктррз д1з<гр£з1:кЗ дс!М1ггс1кп сакз1зддыы £дксзЬзп1п дду£гз1рдд гак1ккд±£у/ ккигдгуур1 дакктИдрл ааеаэз
Мышиный АпдрШ (Инвентарный номер ИМ 020581) (МРНКВДНК)	3	дсассададс аадСскаадк екдадссддс ксссссадаа с^ссадсЪдс Ьдддксккда асксекдадк ЪссддадЪсс кадсдккдск дсасссаадд ссасссссад ааксакдсдс кдсдсксрда садсаддсдс кдесекддрд сПакдсдсдд скаскдсддд дскЫгкдадс дсксаадддс досскдсаса дссададсса ссдсдскккд саЪоскддда сдадакдаас ккдскддскс асдддскдск асадсксддс сакдддакдс дсдаасасдк. ддадсдсасс адкдддсадс кдддсдсдск ддадсдссдс акддскдсск дкддкаасдс ккдксадддд сссаадддаа аада^дсасс скксааадас кссдаддака дадкссскда аддссадасс сскдадаскс кдсададккк дсадасксад сЬсааддскс аааасадсаа даЪссадсаа ккдккссада аддъддссеа дсадсадада кассЬаЬсаа адсадааесЬ дадааСасад аакекксада дасадаЪада ссксккддсс сссасдааес Ъддасаакдд адкадасаад аскксдаддд дааадаадск ккссаадакд асссадскса Ькддсккдас ккссаасдсс асссасккас асаддссддс ссдддаскдс саддааскск Ъссаадаадд ддададдсас

- 46 016185

		адеддасеъе есса-да^сеа деееседддд 1хс1:ссассае ееъеддесаа сЬдЪдадаед асЬЬ садаед даддседдас адедаеесад адасдссЪда асдд-сеседе ддасЪесаас садесседдд аадссЪасаа ддаъ ддсеес ддадаесссе ваддсдадЬе сЬддсЬдддс с^дсгаааада едсасадсаЬ сасаддддас едаддаадее ааЪь ддседе дсадсЪссад даекдддаЪд дсааедесаа аеедсЬасаа ЕЕЬсссаЪас аеъЬдддддд Ъдаддасаса дссе асадсе едсадсесас Ьдадсссасд дсаааЬдадс еддд-Сдссае сааЪдЕЕСсс сссааЪддсе еееесседсе сеъс-ЬсЪасе Ьдддассаад аосаедассЬ ссдЕддддаа сЕ^ааседед ссаададесЕ сЕсЕддЕддс ЕддЕддЕЕЕд дЕасоЕдЕад ссаЕЕссааЕ сЕаааЕддас ааЕасЕЕсса сЬсЕаЕссса сддеаасддс аддадедЕаа ааадддЕаЕс ЕЕоЕ<ддаааа саЕддааддд седсЕасЬаЕ ссЕсЕдсадд сЕассасссЕ дЪЕдаЕссад сссаЕддадд сЕасадсадс сЕсехадссЕ ссЕсаседда дссЪддеесс аддссЕаада адвс-адЕдас ЕЕЕддЕЕдЕд дсссЕдадаЕ ЕЕддесаЕЕс ЕсЕдоЕдддд дсаддадсЕе ЕаадЕадддс ЕаЕсЕдсдЕс ЕЕдЕс,дасав адаадаадсс сдЕаасЕдда дадасЕддад дассссЕЕЕЕ ссдЕдЕЕддд дЕсЕдсаадс аЕЕдЕЕдЕсЕ даааоадЕса дадсаасадд ааасаааЕдд есеадаЕсса дааае^саЕдд дсЕсдадддд сасЕдааЕаЕ сасЕЕсЕсдс сеаесадада адЕЕддддаЕ дсададддас сасЕасадЬс саасСхадсЕд ддсссЕЕааЕ ддсддасъеа дееаЕаЕЕда с^заседдад асадддедсс аддадссеЕд даЕасасЕса ЕддЕсд-сЕдЕЕ дЕаддЕдеЕд еддаедсаса ддЕдсЕаасЕ дСддЕхЕесса ддсасадсЕс асадсаЕЕсЕ ЕасааЕаааа асаасссЕсад аасааааеаа зааааааааа аааааэаа
Мышиный АпдрН4 (Инвентарный номер ΑΡ1693Ϊ3) (мРНЮкДНК)	49	СГТССС6А6Т ССТАОСбТТС СТСЗСАСССАА (ЗБССАССССС АСААТСАТОС 0СТ0С5СТСС САС^УЗСАСОС ОСТЗСССТЙС тсстатсссс сестАстссс еесс1?тттсА ссосссаазс ОСОСССТССА СА<5ССАСА(ЗС САССОСССТТ ТССАТССТСС ЙАСЗАбАТвА АСТТССТСйС ТСАСООЙСТЙ СТАСАССТСС БССАТСбССТ (ЗССС6ААСАС бТСС?к<ЗСеСА ССС(ЗТ<ЗеССА (ЗСТбЗССССЗ СТСОАЗСССС бСАТЗесТЗС СТСТОБТААС ССТТОТСАСС (ЗССССААЗСС ААААОАТОСА. СССТТСАААС АСТССОАвОА ТА6АСТСССТ СААбОССАбА СТССТбАбАС ТСТбСАСАСТ ТТССАСАСТС АССТСААССС ТСААААСА6С ААСАТССАСС ААТТСТТССА СААбЭТбеСС СА6СА0СА6А 6АТАССТАТС АААБСАбААТ СТОА&ААТАС АбААТСТТСА бАбССАбАТА бАССТСТТбб СССССАСбСА ССТАЙАСААТ ООАбТАСАСА АЗАСТТСБАО СОСАА-АОАОб СТТСССААбА ТбАСССАССТ САТТСОСТТС АСТСССААСС ССАСССАСТТ АСАСАСбССЗ ССССОС&АСТ ОССАО-ОААСТ СТТССААОАА 66ССА0А66С АСАбТбОАСТ ТТТССАОАТС САСССТСТ63 6СТСТССАСС АТТТТТ6ОТС ААСТ5Т5АСА ТСЗАСТТСАОА Т&5А&ЗСТШ АСА5Т0АТТС АОАбА-СбССТ 6ААС66СТСТ СТЗОАСТТСА АССАСТССТЕ СОААО-ССТАС ААЗОАТСбСТ ТСООАОАТСС ССААббССАб ТТСТбССТбб ЗССТОСАААА САТССАСАбС АТСАСА6С6А АССбАСЗААС ССААТТСбСТ СТбСАбСТСС АЗбАСТбббА ТОССА-АТССС АААГТбСТСС аатттсссат ссАтттбеес сстсассаса саосстасаз ССТ6СА6СТС АСТЗАОСССА ОЭССС-аАТСА бСТОССТбСС АССААТбТТТ СССССААТЙ6 ССТТГСССТС СССТТСТСТА СТТбббАССА АОАССАТСзАС СТССбТбббб АССТТААСТ5 тзссаасаос отстегаете сстозсгсатт ТббТАССТбТ АЗССАТТССА АТСТСААТЗЗ АСААТ2АСТТС САСТСТАТСС

- 47 016185

		САССЙСААСО ССАССАСССТ ДААААСОСТА ТСТТСТ60АД ДАСАТСОААС 66СС6СТАСТ АТССТСТ6СА СйСТАССАСС СТССТЙАТСС АОСССАТ6С5А СССТАСАССА ОССТСТТАСС СГССТСАСТС САС5ССТССТТ ССАСССТААС АДО
Человеческий Апдр114 {Инвентарный номер ΝΜ 139314) (мРНЮкДНК)	4	а^ааааассд ЪссЬсдддсд сддеддддад аадседаде± дадсдда^сс ^сасасдасЪ дЬда^ссдаЬ ЪсЬЬЪссадс ддсЕЬсЕдса асааадсддд йсЫ:ассссс ддЪсс1:асдс дЪсЕссад^с сЕсдсасс^д даассссаас дЪссссдада дйссссдааЪ ссссдсЬссс аддс^ассЪа ададдаЬдад сдсгЬдс^ссд аеддседддд садсссЬдаЪ дсЪсЬдсдсс дссассдссд ЬдсЪааЕдад сдсЪсадддс ддасссдЪдс адСссаадЪс дссдсдсЪЪЪ додЬссЬддд асдадаЪдаа Ъд^ссЪддсд сасддасЪсс ЕдсадсЕсдд ссаддддсЬд сдсдаасасд сддадсдсас ссдсадЕсад сЕдадсдсде Ьддадсддсд ссЪдадсдсд ЬдсдддЕссд ссЬдЪсаддд аассдадддд Ессассдасс ЪсссдЪЪадс осс^дададс одддеддасс сЪдаддЬссЬ ЪсасадссЪд садасасаас Ъсааддскса даасадсадд аИссадсаас ЪсЬЪссасаа ддЪддсссад садсадсддс ассЬддадаа дсадсасс^д сдааЪЬсадс а^сЪдсааад ссадЪ^Ъддс сЪсаЪддасс асаадсассЪ адаесаъдад д^.ддссаадс сЪдсссдаад ааададдсЕд сссдадаЬдд сссадссад£ СдасссддсЬ сасааЕдЪса дссдсс^дса ссддсЬдссс адддаЫгдсс аддадсЬдЪЬ. ссаддЪЕддд дададдсада д£ддасЬа££ Ьдааайссад сс^саддддъ сЬссдссаСЪ Ссъдд^даас Ъдсаада<:да ссЪсадаЪдд адда&ддаса дЪаа^'Ьаада ддсдссасда ЁддсЪсадЬд дасЬЕсаасс ддсссЪддда адсс£асаад дсддддЕЪЕд дддаъсссса сддсдадиьс ЕддсСддд'Ьс ЪддадааддЪ дсаЕадса1:с асдддддасс дсаасадссд ссЕддссдЬд аадсЪдсддд ас^дддаЪдд саасдссдад ЪЪдсЬдсадЪ ЪсЬссдЬдса асЪдддЬддс даддасасдд ссЬаЬадсс! дсадсЬсасЬ дсасссд1:дд ссддссадсЪ дддсдссасс ассдЮссас ссадсддсс!: с£ссд1:ассс ^Сссссас^:? дддассадда -тхсасдассЕс сдсадддаса адаас^дсдс саададссЪс “ЬсЪддаддсЬ ддЬдд^ЕЕдд сасс£дсадс саЫзссаасс Ьсаасддсса дЬасЫ:саде ЪссаЪсссас адсадсддса чдаадсЪЬаад аадддааЬсЪ исЕддаадас сЪддсддддс сдсЬас^асс сдс^дсаддс сассассаЪд СкдаСссадс сзсаЪддсаде ададдсадсс ЬссЪадсдЪс сЬддсЪдддс окдд^сссад дсссасдааа дасддЪдасЪ сЕСддсЕсЬд оссдаддаЕд ЕддссдЕЪсс сЪдсС^дддс аддддсЬсса аддаддддсс аЕсЕддааас й^д^ддасад адаадаадаа саасдасЬдда даадсссссЪ «сЬдадЬдс аддддддсЬд оа£дсд£Ьдс сЪссЪдадаЪ сдаддсЕдса дда^аЕдс^с ^дас^ссада ддсдЕддасс ааддддсаЬд дадсЪЪсасЬ ссЪЬдсЪддс садддадСЬд дддасЬсада дддаасасЪЕ сддддссадсс адас_ддссЬ сааЬддсдда с£сад£саса *&Ъдас^дасд дддассаддд сЬедЬдЪддд Ъссгададсде осксаЪдд^д с1дд£дсСд£. Ъд^дЬдЪадд ЪссссЬдддд асасаадсад дсдссааЬдд ЬаЬсЕдддсд дадсЪсасад адЪ'ЬсЪЪдда аЬаааадсаа ссЪсадааса сЪ1ааааааа эааааааааа ааааааааэа ааааааэааа зааааааааа аааааааааа ааааааа
Олигонуклеотид 1 для миРНК	5	йАсесАСАсисзАсидиооои
Олигонуклеотид 2 для миРНК	6	исасиадАсиасААсдиодио

- 48 016185

Олигонуклеотид 3 для миРНК	7	ЗАиЗСАОССОЗ-ЗАСАЙОААиа
Олигонуклеотид 4 для миРНК	8	ОАСААСААсойССссйдедии
Пептид, против которого было получено 4АЗ	9	1АРТНЬМЯвУПКТЗШЗК&
Ν-Π1ΑΝΘΡΤ1.4	10	ΜΑΜ0Ι6ΙΝ80 РфЗКРАОРЕР РЕГАЗИОЕМЫ ЬЫШСЪЮЬС
ЙСЬкеИУЕКТ ШЗЬОАЪЕЕй МААССЫАСОС РК(ЗКОАРЕ*КО
ЗЕййУРЕЗДТ РЕТЬОЕЬОТЗ ЬКАОЫЗКХОО ЬГОКУА^ООН
уьзкаыьаю ыьозоюыа втяьоыбУОК тзвстркм
ТОЫСЪТРЬЕ нннннн
Ν-ίιΑΝΘΡΤΙ.4	11	МАМО1С11ЯЗ& ₽»3530Φ3₽ν ОЗКЗРКГАЗИ РЕМЫУЬАЖЗЬ
ЬОЬбОбЬЙЁН АЕНТЕЗОЬЗА ЬЕАЯЬЗАСОЗ АСО6ТЕСЗТО
ЪРЬАРЕЗКЛТ) РЕТЪНЗЬОТС ΕΚΑβΝδΕΙΟΟ ЬГЯКУАОООН
НЕЕКОНЬКГО НБОЗОЕСЬЕй НКНЬОНЕУАК РАНККЯЬРЕМ
АОРУОРАНХЕ НННННН
14012 вариабельная область тяжелой цепи	12	мигсьзыеъ νιιίιΚονΰΟΕ ткглшйзегъ укреззькъз САА35ГАГ5К. УОМЗИУЕОТР ЕККЬЕСТУАТ! 3Ί4335ΥΤΥΎΡ ОЗУКСАГПЗ КОИАКЫТЬУЪ ОЙОЗЬКЗЕОТ АГУГСУРНЕО ЗТУУРНУРЬО ϊ№3Ο3Τ3ντν ЗЗА
15Р2 вариабельная область тяжелой цепи	13	МКгаЬЗЫЕЬ УЫЬЮЗУССЕ УКХУЕЗСЙСЪ. УКР(3<35ЬК13 СААЗЗГАРЗЯ УОМ5«УВдТР ΕΚΕΟ-ΕΗνΑΤΙ 3Τ063ΥΤΥΎΡ ОЗУКСРчЕИЗ ЕЮКАЙЙТЬУЬ ОМСЗЬЙЗЕОТ АЬУГСУРНЕО 5ΤΐνΡΗΥΡΐΖ> ЭТГООСТЗУТУ 35А
90В4 вариабельная область тяжелой цели	14	МШЗНХГЬП» ЬЗЕТАСУЬЗЕ УО^ОЗСРЕЬ МКРСАЗУКМЗ СЯТЗСУТГТЦ Υ5ΙΉ«νΚ03Η вКЙЪЕИХСУ! ЙРХЖИНУСО ОЫГКСКАТЬТ ΕΝΚΑ33ΤΑΥΜ ЕГРНЬТЗрОЗ АУУУСТВНКТ ЮАРГАУИСЗ С'ГЬУТУЗА
Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи	15	МНЕСЬЗЫРЬ УЬХЬКЙУОСЕ УКЬУЕЗСЗЗЬ УКРСбЗЫСЕЗ СААЗСГАЕЗЙ ГОМЗНУКСТР ЕККЬЕИУАГГ 3ΤΧ03ΪΤΥΎΡ ОЗУКСЙГТ15 ΚϋΝΑΚΝΤΣΥΕ ОМОЗЬКЗЕОТ АЬУРСУНЯЕО δτχνρΗΥΡίιϋ уйбостзуту ззд
14012 вариабельная область легкой цепи	16	музтзоььеь ъьгнтзазес отумтозрат езутрсовх/з ЪЗСКАЗаЗКЗ ϋΥΕΗΚΥΏΟΚδ НЕЗРЯЬЫКУ АЭДБГЗЗХРЗ КЕЗСЗСЗСЗО ГТЬЗЮЗУЕР ЕЗУОУУУСаЫ СНЗГРЕТЕСЗ СТКЬЕХКК
15Р2 вариабельная область легкой цепи	17	МОМНАРАЙКЬ 61ЬЬЬИГ?СА ВСЕХОМТЗЗ? ЗЗМЗАЗЪООВ, 1Т1ТСОАТОО ХУКЫЬШТОа КРСКРРЗЕЫ ΗΥΑΤΕΐΑΕΟν РЗНГЗбЗСЗС ЗОУЗЬТХЗКЬ езеогаохус ьозуоррутг одоткьыкк
Й0В4 вариабельная область легкой цепи	18	юмйАрадгь схъылгррбА всЕхомтазр ззмзазъсон 1Т1ТСОАТОО ΐνΚΝΕΝΚΥΰΟ ΚΡ3ΚΡΡ3Ε1Ι ΗΥΑΤΕΧΑΕθν РЗЙГЗЙЗЙЗС 30У31хТ13КЬ ЕЗЕРГАОХУС ЬОЗУОГРУТТ ЗССТКЪЕ1Ы
Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цели	19	ΚΆΡΑΟΕΕΟΙΣ 1Д.НГРЙАЙСЕ ЮМТ03Р35М 5Α5Ι£ΌΚΙΊ?Ι ТС0АТОО1УК ΝΒΝΝΥΟΟΚΡΟ КРРЗРЫНУА ТЕГЛЕСУРЗН НЗСЗЗВОЗОГ ЗЕТХЗЫЪЕЗЕ ΡΕ^ΥΥΟΙβδ ΥΟΓΡΥΤΓΟΟΟ ΤΚΕΕΙΝΗ

- 49 016185

14012 СОМ тяжелой цели	21	ΒΥϋΜδ
14012 С0Н2 тяжелой цели	22	ΤΙ3ΤΘ63ΥΤΥΪΡΠ3νΚ0
14012 СОЯЗ тяжелой цепи	23	ΚΗΕαετννρΗΥΡίι
15Р2 СОМ тяжелой цепи	24	ΡΛΌΜ3
15РЗ С0Н2 тяжелой цепи	25	ΓΚΤ035ΥΤΥΥΡ08νΚβ
15Е2 СОКЗ тяжелой цепи	26	ΚΗΕ03Τΐν₽ΗΥΡΙ.
90В4 СОМ тяжелой цепи	27	ΟΥ3ΙΗ
90В4СРК2 тяжелой цепи	28	ΥΊΝΈΎΝΟΟΤΥΟΟΟΝΕΚ
90В4С0ЕЗ тяжелой цели	29	Й.ИКТ10АРЕ·
14012 СОМ легкой цепи	30	Ε<Α8ζ)5ΐβ0ΥΙιΗ
14012 С0Н2 леткой цепи	31	ΥΑ505Ι5
14012 СОКЗ легкой цепи „	32	ΟΝ0Η5ΓΡ
15Р2СОР1 легкой цепи	33	ΟΑΤΟΟίνΚΝΏΝ
15Г2 С0Н2 легкой цепи	34	ΪΑΤΕΙΛΕ
15Е2 СОЯЗ легкой цепи	35	ЪОЗУОГР
Э0В4 СОМ легкой цепи	38	ΟΑΤβΟίνΚΝΕΝ
90В4СОН2 леткой цепи	37	ΥΑ.ΤΕΕΑΕ
90В4 СОЕЗ легкой цепи	38	ЬОЗУОГР
14012 и 15Р2 консенсус С0Я2 тяжелой цепи	39	ττ 5Τ0Χ3ΥΤΥΥΡ08 νκα
14012 и 15Е2 консенсус СОКЗ тяжелой цепи	20	ННЕОЗТХУРНУРЬ
03’1 фрагмент ΓηΑΝΟΡΤΙ.4	40	СеаРАОРЕРЕЯГАЗИОЕМПЫАНСЬЬОЬСНбЬЕЕНУЕ КГКСОЬСАЬЕККМ

дв-2 фрагмент ητΑΝΘΡΤΙ.4	41	ЬОКЗНСЬКЕНУЕВТВейЬеАЪЕНЕГМАЛСеЫАС дСРКСКОАРЕКОЗЕОВУР
дз-3 фрагмент γπΑΝΟΡΠΑ	42	ААССМАСОСЕКСКОАВГК05ЕРПУ?ЕСОТРЕТЬ05Ъ<2 ТОЬКВДЗКЮОЬ
дз4 фрагмент ΓηΑΝ0ΡΤΕ4	43	ЕЗОТ РЕТЩЗЬдТ0ЬКА0НЗК1О0 ьеокуаос □куьзконьмоньдзоюьь
дз5 фрагмент ΓΠΑΝ0ΡΤ14	44	гакУАсйар.уьзконькюньсзагсъър.ртнзоггау октзнеккьркмтоысьтр
дз1 -2 фрагмент Π1ΑΝΘΡΤ14	45	игьснсьЕ^В7Ш1ткеоьоАЪЕКвм
дз2-3 фрагмент тА№РТ14	46	ААСС^ТАСОСРКСКОАРЕКОЗЕОКУР
дзЗ-4 фрагмент γπΑΝΘΡΤΙΛ	47	ЕСОТРЕГЬОеЬОТаЬЕСАОНЗКЮОЬ
да 4-5 фрагмент тАЧ6РТЬ4	48	ГСКУАОООКУЬЗКОЫЬКХОЫЬОЗОЮЪЬ

- 50 016185

Список последовательностей <110> Ьех±соп СепеЪхсе 1псогрога!ес1

Ьее, Е-СН1апд

Ьапйез, Згедогу

СНипд, Куи

СНеп, Ыпд

Оеза!, Пгу± ₽оие11, ЬаУ1ё Ееед

Нопд, Зеок^оо <120> МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ПОДОБНОГО АНГИОПОЭТИНУ БЕЛКА 4 (АЫСРТЬ4) <130> 7705.24-304 <150> 60/642,022 <151> 2005-01-07 <160>50 <170> Ра!еп!1п ν€Γ5ΐοη 3.3 <210> 1 <211>410 <212> Белок <213> Миз тизси1оз <400>1

Ме! 1

Агд

Суз

А1а

Рго 5

ТНг

А1а

С1у А1а А1а 10

Ьеи

Уа1

Ьеи

Суз

А1а 15

А1а

ТНг

А1а

С1у

Леи

Ьеи

Зег

А1а

С1п

С1у

Агд

Рго

А1а

С1п

Рго

С1и

Рго

20

25

50

Рго

Агд

РНе

А1а

Зег

Тгр

Азр

С1и

Ме!

Азп

Ьеи

Ьеи

А1а

,Н±3

С1у

Ьеи

35

40

45

Ьеи

С1п

Беи

31у

Н1з

С1у

Ьеи

Агд

С1и

Нхз

Уа1

С1и

Агд

ТНг

Агд

С1у

50

55

60

01л

Ьеи

31у

А1а

Ьеи

С1П

Агд

Агд

Ме!

А1а

А1а

Суз

С1у

Азп.

А1а

Суз

65

70

75

80

С1п

С1у

Рго

Ьуз

С1у

ьуз

Азр

А1а

Рго

РНе

Ьуз

Азр

Зег

С1и

Азр

Агд

85

90

95

Уа1

Рго

С1и

С1у

С1п

ТНг

Рго

С1и

ТНг

Ьеи

С1п

Зег

Ьеи

С1п

ТНг

С1п

100

105

НО

Ьеи

Ьуз

А1а

С1п

Азп

Зег

Ьуз

11е

С1п

С1п

Ьеи

РНе

С1п

Ьуз

Уа1

А1а

115

120

125

С1п

С1п

31п

Агд

Туг

Ьеи

Зег

Ьуз

С1п

Азп

Ьеи

Агд

11е

С1п

Азп

Ьеи

130

135

140

С1л

Зег

С1п

Не

Азр

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТНг

Н1з

Ьеи

Азр

Азп

С1у

Уа1

145

150

155

160

Азр

Буз

ТНг

Зег

Агд

С1у

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Зег

Ьуз

Ме!

ТНг

С1п

Ьеи

11е

165

170

175

С1у

Ьеи

ТНг

Зег

Азп

А1а

ТЬг

Н1з

Ьеи

ΗΪ3

Агд

Рго

А1а

Агд

Азр

Суз

180 185 190

СЬп Сэ1|_1

Ьеи 195

РНе

СЬп

С1и С1у

СЬи Агд НЬз Зег СЬу Ьеи

РНе

СЬп

11е

200

205

СЬп

Рго

Ьеи

СЬу

Зег

Рго

Рго

РНе

Ьеи

УаЬ

Азп

Суз

СЬи

Меи

ТЫ

Зег

210

215

220

Азр

С1у

СЬу

Тгр

ТЫ

УаЬ

11е

СЬп

Агд

Агд

Ьеи

Азп

СЬу

Зег

УаЬ

Азр

225

230

235

240

РНе

Азп

СЬп

Зег

Тгр

С1и

АЬа

Туг

Ьуз

Азр

С1у

РНе

СЬу

Азр

Рго

СЬп

245

250

255

СЬу

СЬи

РНе

Тгр

Ьеи

СЬу

Ьеи

СЬи

Ьуз

МеЬ

ΗΪ3

Зег

11е

ТЫ

СЬу

Азр

260

265

270

Агд

СЬу

Зег

31п

Ьеи

А1а

νβΐ

СЬп

Ьеи

С1п

Азр

Тгр

Азр

С1у

Азп

АЬа

275

280

285

Ьуэ

Ьеи

Ьеи

СЬп

РНе

Рго

Не

ΗΪ3

Ьеи

СЬу

СЬу

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа

Туг

290

295

300

Зег

Ьеи

СЬп

Ьеи

ТНг

81 и

Рго

ТЬг

АЬа

Азп

СЬи

Ьеи

СЬу

АЬа

ТЬг

Азп

305

310

315

320

Уа1

Зег

Рго

Азп

СЬу

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

РНе

Зег

ТЬг

Тгр

Азр

СЬп

Азр

325

330

335

Н13

Авр

Ьеи.

Агд

СЬу

Азр

Ьеи

Азп

Суз

АЬа

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

СЬу

СЬу

340

345

350

Тгр

Тгр

РЬе

СЬу

ТНг

Суз

Зег

ΗΪΕ

зег

Айп

Ьеи

Азп

СЬу

СЬп

Туг

РНе

355

360

365

НЬз

Зег

Не

Рго

Агд

СЬп

Агд

СЬп

СЬи

Агд

Ьуз

Ьуз

СЬу

Не

РНе

Тгр

370

375

380

Ьуз

ТЬг

Тгр

Ьуз

С1у

Агд

Туг

Туг

Рго

Ьеи

СЬп

АЬа

ТЬг

ТНг

Ьеи

Ьеи

385

390

395

400

Не

С1п

Рго

МеЬ

СЬи

АЬа

ТНг

А1а

АЬа

Зег

405 410

<210> <211> <212> <213>	2 406 Белок Ното зарЬепз
<400>	2

МеН 1

Зег

СЬу А1а

Рго 5

ТНг

АЬа СЬу

АЬа АЬа 10

Ьеи

МеН

Ьеи

Суз

А1а 15

АЬа

ТНг

АЬа

УаЬ

Ьеи

Ьеи

Зег

АЬа

СЬп

СЬу

СЬу

Рго

УаЬ

СЬп

Зег

Ьуз

Зег

20

25

30

Рго

Агд

РНе

А1а

Зег

Тгр

Азр

СЬи

Меи

Азп

УаЬ

Ьеи

А1а

Н1В

61у

Ьеи

35

40

45

Ьеи

СЬп

Ьеи

С1у

СЬп

С1у

Ьеи

Агд

СЬи

Η13

А1а

СЬи

Агд

ТНг

Агд

Зег

50

55

60

СЬп

Ьеи

Зег

А1а

Ьеи

СЬи

Агд

Агд

Ьеи

Зег

АЬа

Суз

СЬу

Зег

АЬа

Суз

- 52 016185

70 75 30

61η

СБу

ТЬг С1и С1у Зег ТЬг Азр Беи Рго

Беи

А1а

Рго

СБи

Зег 95

Агд

85

90

Уа1

Азр

Рго

С1и

УаБ

Беи

Н1з

Зег

Беи

СБп

ТЬг

СБп

Беи

Буз

А1а

СБп

100

105

НО

Азп

Зег

Агд

Не

С1п

СБп

Беи

РЬе

НБз

Буз

УаБ

А1а

СБп

СБп

СБп

Агд

115

120

125

Н13

Беи

СБи

Буз

С1п

НБз

Беи

Агд

Не

СБп

Ηίε

Беи

СБп

Зег

61п

РЬе

130

135

140

СБу

Беи

Беи

Азр

НБз

Буз

НБз

Беи

Азр

НБз

СБи

УаБ

АБа

Буз

РГО

А1а

145

150

155

160

Агд

Агд

Буз

Агд

Беи

Рго

СБи

МеБ

А1а

СБп

Рго

УаБ

Азр

Рго

АБа

НБз

165

170

175

Азп

УаБ

Зег

Агд

Беи

Н1з

Агд

Беи

Рго

Агд

Азр

Суз

СБп

СБи

Беи

РЬе

180

185

190

СБп

УаБ

С1У

61и

Агд

С1п

Зег

СБу

Беи

РЬе

СБи

11е

СБп

Рго

СБп

СБу

195

200

205

Зег

Рго

Рго

РЬе

Беи

УаБ

Азп

Суз

Буз

МеБ

ТЬг

Зег

Азр

СБу

СБу

Тгр

210

215

220

ТЬг

Уа1

Не

СБп

Агд

Агд

НБз

Азр

СБу

Зег

УаБ

Азр

РЬе

Азп

Агд

Рго

225

230

235

240

Тгр

СБи

А1а

Туг

Буз

А1а

СБу

РЬе

СБу

Азр

Рго

ΗΪ3

СБу

СБи

РЬе

Тгр

245

250

255

Беи

СБу

Беи

СБи

Буз

УаБ

НБз

Зег

11е

ТЬг

СБу

Аар

Агд

Азп

Зег

Агд

260

265

270

Беи

АБа

УаБ

СБп

Беи

Агд

Азр

Тгр

Азр

СБу

Азп

А1а

СБи

Беи

Беи

СБп

275

280

285

РЬе

Зег

Уа1

НБз

Беи

СБу

СБу

С1и

Азр

ТЬг

АБа

Туг

Зег

Беи

С1п

Беи

290

295

300

ТЫ

АБа

Рго

ν&ι

А1а

С1у

С1п

Беи

СБу

АБа

ТЬг

ТЬг

УаБ

Рго

Рго

Зег

305

310

315

320

СБу

Беи

Зег

УаБ

Рго

РЬе

Зег

ТЬг

Тгр

Азр

СБп

Азр

НБз

Азр

Беи

Агд

325

330

335

Агд

Азр

Буз

Азп

Суз

АБа

Буз

Зег

Беи

Зег

СБу

СБу

Тгр

Тгр

РЬе

СБу

340

345

350

ТЬг

Суз

Зег

НБз

Зег

Азп

Беи

Азп

СБу

СБп

Туг

РЬе

Агд

Зег

Не

Рго

355

360

365

СБп

СБп

Агд

СБп

Буз

Беи

Буз

Буз

С1у

Не

РЬе

Тгр

Буз

ТЬг

Тгр

Агд

370

375

330

С1у

Агд

Туг

Туг

Рго

Беи

СБп

АБа

ТЬг

ТЬг

МеЬ

Беи

Не

СБп

Рго

МЫ

385

390

395

400

АБа

АБа

СБи

АБа

А1а

Зег

405

- 53 016185 <210> 3 <211> 1658 <212> ДНК <213> Миз ти$си1и$ <400> 3

дсассададс	аадЪекаад!	скдадссдде	кессесадаа	скссадс!де	кдддкеккда	60
ас^ссбдсд!.	кссддадксс	кадедккдек	дсасссаадд	ссасссссад	ааксакдсдс	120
ΐдеде^седа	садсаддедс	кдссскддкд	скакдсдсдд	скаскдсддд	дсккккдадс	180
дс^саадддс	дссскдсаса	дсеададсса	ссдсдскккд	саксскддда	сдадакдаас	240
гсдсиддсСс	асдддссдск	асадсксддс	сакдддскдс	дедаасаедк	ддадсдсасс	300
сдЬдддсадс	кдддсдсдск	ддадсдссдс	акддскдсск	дкддкаасдс	ккдкеадддд	360
сссаадддаа	аадакдсасс	скксааадас	кссдаддака	дадкссскда	аддссадаск	420
сс£дадас±с	кдеададккк	дсадасксад	сксааддскс	аааасадсаа	дакссадсаа	480
Ъ£д£Ъссада	аддкддссса	дсадсадада	касскаксаа	адсадаакск	дадаакасад	540
аа^сь^еада	дссадакада	ссксккддсс	сссасдсасс	кддасаакдд	адкадасаад	600
асИсдаддд	дааадаадс!	Ыссаадак д	асссадскса	ккддсккдас	ккесаасдсс	660
асссасЪЪас	асаддссддс	ссдддаскдс	саддааскск	кссаадаадд	ддададдсас	720
ад^ддасС!·!	кссадаксса	дсскскдддд	кскссассак	ккккддксаа	скдкдадакд	780
ас££сада£д	даддскддас	ад~да“ксад	адасдсскда	асддскскдк	ддаскксаас	840
садЪссСддд	аадсскасаа	ддакддекке	ддадаксссс	ааддсдадкк	скддскдддс	900
ебддаааада	кдсасадсак	сасаддддас	сдаддаадсс	ааккддскдк	дсадскссад	960
дасЬддда-Ьд	дсаакдссаа	аккдс-Ьесаа	к к ксссаксс	аббТдддддд	кдаддасаса	1020
дсс1:асадсс	кдсадскеас	кдадсссасд	дссаакдадс	кдддкдесас	саакдккксс	1080
сссаа^ддсс	ЪЪЪсссЛдсс	сггсгсгасг	кдддассаад	ассакдасск	ссдкддддас	1140
с1£.аас±д£д	ссаададсск	скскддкддс	кддкддкккд	дкасскдкад	ссаккссаак	1200
сЬсааЪддас	аакаскксса	скскакссса	еддсаасддс	аддадедкаа	ааадддкакс	1260
ЪЪсЪддаааа	сакддааддд	ссдскаскак	сскскдсадд	скассассск	дккдакссад	1320
ссеаЪддадд	скасадсадс	сЪсЪЪадсс!	ссксаскдда	десзддгксс	аддсскаада	1380
адасадЪдас	кккддккдъд	десскдадак	ккддссакко	кекдекдддд	дсаддадскс	1440
1:аадЪадддс	какскдсдкс	ккдкддасаа	адаадаадсс	сдкааскдда	дадаскддад	1500
дассссбИЛ	ссдкдккддд	дкскдсаадс	аккдккдкек	дааасадкеа	дадсаасадд	1560
ааасаааЪдд	сссадаксса	даааасакдд	дсксдадддд	саскдаакак	саскксксдс	1620
сЬассадада	адккддддак	дсададддас	саскасадкс	сааскадскд	ддсссккаак	1630
ддсддаеЪса	дкеакаккда	скдаскддад	асадддкдсс	аддадссскд	дакасаскса	1740

- 54 016185

£ддгдс!:д£Ъ	дЪадд^дсЪд	Ъдда^дсаса	дд£дсЪаас£	дЪддЪЪссса	ддсасадсСс	1800
асадса££сЁ	Ёасаа^аааа	асаассРсад	аасаааасаа	аааааааааа	аааааааа	1858
<210> 4 <211> 1967 <212> ДНК <213> Ното зархепз
<40С> 4 а^ааааассд	(зссЪсдддсд	сддсддддад	аадссдадсе	дадсддаЛ сс	Ьсасасдас^	60
дЕда'ЬссдаЪ	ьсЁ'Ь'Ьссадс	ддсЪЬсЪдса	ассаадсддд	ЪсЪбассссс	дд^ссЪссдс	120
дЕсбссадбс	сЪсдсассЁд	даассссаас	д^ссссдада	дЪссссдаа^	ссссдсЬссс	180
аддс£асс£а	ададдардад	сддЪдсЪссд	асддссдддд	садсссЪдаЪ	дсРсХдсдсс	240
дссассдссд	ЪдсЪасЪдад	сдоъсадддс	ддасссд^дс	адЁссаадьс	дссдсдсЫзЪ	300
дсдЬссЪддд	асдадаРдаа	ίдЪссЪддсд	сасддасРсс	ЪдсадсГсдд	ссаддддсЁд	360
сдсдаасасд	сддадсдсас	ссдсадСсад	сЬдадсдсдс	Ьддадсддсд	ссГдадсдсд	420
ЪдсдддЬссд	сс±д1:саддд	аассдадддд	Ъссассдасс	Ьсссд^Ъадс	ссс^дададс	480
сдддЁддасс	с1:дадд(:сс«:	РсасадссХд	садасасаас	ЪсааддсСса	даасадсадд	540
абссадсаас	Ъсб-Ьссасаа	ддбддессад	садсадсддс	ассЪддадаа	дсадсасс^д	600
сдаагс.садс	а^с^деааад	ссадСЁЪддс	сЕссЁддасс	асаадсассд	адассабдад	660
д^ддссаадс	сЪдсссдаад	ааададдсЁд	сссдадаСдд	сссадссад^	ЁдасссддсЪ	720
сасаа1д1:са	дсодсс^дса	ссддсЬдссс	адддаЪЪдсс	аддадсСд^е	ссаддРЪддд	780
дададдсада	дЪддаС'Ьа'Ьб.	ЁдаааГосад	ссбсаддддб	сЁСсдсса1Х	ЁТАддЪдаас	840
£дсаадаЪда	ссЪсада1:дд	аддсРддаса	дЪааЪЪсада	ддсдссасда	СддсЪсад'Ьд	900
дасЪЪсаасс	ддсссЁддда	адссЁасаад	дсдддд^ЪЁд	дддаЪсссса	сддсдад^Ъс	960
ЪддсЪддд^с	ЪддадааддР	дса£адса1:с	асдддддасс	дсаасадссд	ссЬддссд'бд	1020
садсЬдсддд	асЪддда^дд	саасдссдад	Ъ’Ьдс'Ь.дсад'Ь	Ъс£ссд£дса	ссЬдддЪддс	1080
даддасасдд	саГа^адспЁ	дсадсЪсасЬ	доасссдддд	ссддссадсь	дддсдссасс	1140
ассдРсссас	ссадсддссЪ	с^ссд^ассс	дьсЁссасЁр	дддассадда	бсасдаасЪд	1200
сдсадддаса	адаасРдсдс	саададсс^-с	СсРддаддсЪ	дд^ддЪЬЪдд	сасс1дсадс	1260
са^Рссаасс	ьсаасддсса	д^асбТ-ссде	бссаАсссас	адсадсддса	даадсЪЪаад	1320
аадддааЪ с±	Ес^ддаадас	с^ддсддддс	сдсЪасЪасс	сдсЪдсаддс	сассассаРд	1380
ЪРдаЪесадс	сса^ддсадс	ададдсадсс	ЪссбадсдЬс	сЪддсЪдддс	с^дд1.сссад	1440
дсссасдааа	дасдд^дасЪ	с^Ъддс^с^д	сссдадда1:д	ЪддссдЪЪсс	с^дссРдддс	1500
аддддсЬсса	аддаддддсс	ассЁддааас	ЁЁдЁддасад	адаадаадас	сасдасАдда	1560
даадсссссЪ	ъесСдадЪдс	аддддддс^д	саЪдсдГЪдс	СЁссЁдадаЬ	сдаддсбдса	1620

- 55 016185 ддаЕа^дсЬс адассссада ддсд1:ддасс ааддддса^д дадсЬЪсасЪ ссЪ^дсЪддс 1680 садддадкЬд дддас^сада дддассасЪЁ ддддссадсс адас^ддссС саа1:ддсдда 1740 сГсадЪсаса Ь'ЬдасЪдасд дддассаддд сЬГдГдкддд 1;сдададсдс ссЪсаЬддЪд 1800 с^ддЪдсГдЬ ^д^дЬдЪадд (юсссСдддд асасаадсад дсдссаа! дд £а£с£дддсд 1860 дадсисасад ад^ЬсЬЪдда аЪаааадсаа сс^садааса с^Аааааааа аааааааааа 1920 аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа ааааааа 1967 <210> 5 <211> 21 <212> РНК <213> Искусственная <220 <223> Олигонуклеотид для миРНК <400>5 даддсадади ддасиаииии и21 <210 6 <2И>21 <212> РНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотид для миРНК <400 <400 б ииддидааси дсаадаидаи и <210 7 <211> 21 <212> РНК <213> Искусственная <220>

<223> Олигонуклеотид для миРНК <400> 7 даиддаддси ддасадиааи и 21 <210> 8 <211> 21 <212> РНК <213> Искусственная <220 <223> Олигонуклеотид для миРНК <400 8 дасаадааси дсдссаадаи и <210> 9 <211> 18

- 56 016185

ТЬг Зег Агд С1у <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Пептид для иммунизации <400>9

Пеп А1а Рго ТЬг Н1з Беи Азр Азп 61у Уа1 Азр Буз 1510

Буз Агд <210> 10 <211>176 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Белок слияния <400> 10

Μβΐ: 1

А1а

Ме£ Азр

11е 5

С1у

Не

Азп

Зег Азр 10

Рго

С1п 61у

Агд

Рго 15

А1а

С1п

Рго

С1и

Рго

Рго

Агд

РЬе

А1а

Зег

Тгр

Азр

С1и

Ме£

1\ЗП

Беи

Беи

20

25

30

А1а

Н1я

21 у

Беи

Беи

61п

Беи

С1у

Н1з

61у

Беи

Агд

С1и

1ΪΞ

να!

С1и

35

40

45

Агд

ТЬг

Агд

С1у

С1п

Беи

С1у

А1а

Беи

С1и

Агд

Агд

Ме1:

А1а

А1а

Суз

50

55

60

С1у

Азп

А1а

Суз

С1п

31у

Рго

Буз

С1у

Буз

Азр

А1а

Рго

РЬе

Буз

Азр

65

70

75

80

Зег

С1и

Азр

Агд

Уа1

Рго

С1и

С1у

С1п

ТЬг

Рго

С1и

ТЬг

Беи

С1п

Зег

85

90

95

Беи

С1п

ТЬг

С1п

Беи

Буз

А1а

С1п

Азп

5ег

Буз

11е

(31п

С1п

Беи

РЬе

100

105

] 10

С1п

Луз

Уа1

А1а

31п

С1п

С1п

Агд

Туг

Беи

5ег

Буз

С1п

Азп

Беи

Агд

115

120

125

Не

ΰΐη

Абп

Беи

ΰΐη

Зег

С1п

Не

Азр

Беи

Беи

А1а

Рго

ТЬг

Н1з

Беи

130

135

140

Азр

Азп

О1у

Уа1

Азр

Буз

ТЬг

Зег

Агд

С1у

Буз

Агд

Беи

Рго

Буз

Ме5

145

150

155

160

ТЬг

ΰΐη

Беи

Не

01у

Беи

ТЬг

Рго

Беи

С1и

ΗΪ3

Н1з

ЬИз

ΗΪ3

Н1з

Нгз

165

170

175

<210> 11 <211> 176 <212> Белок <213> Искусственная

- 57 016185 <220>

<22 3> Белок слияния <40011

МеЪ 1

А1а ΜβΈ Азр

11е 5

С1у

11©

Азп

Зег

Азр 10

Рго

Азп

Зег

Зег

Зег 15

С1п

С1у

61у

Рго

Уа1

61л

Зег

Ьуз

Зег

Рго

Агд

РНе

А1а

Зег

Тгр

Азр

С1и

20

25

30

Ме£

Азл

Уа1

Ьеи

А1а

ΗΪ5

С1у

Ьеи

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

С1п

С1у

Ьеи

Агд

35

40

45

С1и

Н15

А1а

С1и

Агд

ТЬг

Агд

Зег

С1п

Ьеи

Зег

А1а

Ьеи

С1и

Агд

Агд

50

55

60

Ьеи

Зег

А1а

Суз

С1у

Зег

А1а

Суз

С1п

51 у

ТНг

С1и

С1у

Зег

ТЬг

Азр

65

70

75

80

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Рго

01и

Зег

Агд

Уа1

Азр

Рго

б1и

Уа1

Ьеи

Низ

Зег

85

90

95

Ьеи

С1п

ТНг

С1п

Ьеи

Ьуз

А1а

С1п

Азп

Зег

Агд

Г1е

<31п

С1п

Ьеи

РНе

100

105

110

Н1з

Ьуз

Уа1

А1а

С1п

С1л

С1п

Агд

ΗΪ3

Ьеи

С1и

Ьуз

С1п

Н±з

Ьеи

Агд

115

120

125

Не

С1л

ΗΪ3

Ьеи

С1п

Зег

С1п

РНе

С1у

Ьеи

Ьеи

Азр

Н1з

Ьуз

Низ

Ьеи

130

135

140

Азр

Н±з

С1и

Уа1

А1а

Ьуз

Рго

А1а

Агд

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

Рго

С1и

МеЬ

145

150

155

160

А1а

С1п

Рго

Уа1

Азр

Рго

А1а

Н1з

Ьеи

С1и

Н15

Н1з

Н1з

Низ

Низ

Низ

165 170 175 <210> 12 <211>143 <212> Белок <213> Мыз шизси1из <400?12

МеЬ 1

Азп

РНе

С1у Ьеи 5

Зег

Ьеи

Не

РНе

Ьеи 10

Уа1 Ьеи

Не

Ьеи

Ьуз 15

С1у

Уа1

С1п

Суз

С1и

Уа1

Ьуз

Ьеи

Уа1

С1и

Зех

С1у

С1у

С1у

Ьеи

7а1

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

С1у

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РНе

А1а

РНе

35

40

45

Зег

Агд

Туг

Азр

МеЕ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

ТНг

Рго

51и

Ьуз

Агд

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Уа1

А1а

ТНг

Не

Зег

ТЬг

С1у

С1у

Зег

Тух

ТЬг

Туг

Тух

Рго

65

70

75

80

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у

Агд

РНе

ТНг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Агд

Азп

85

90

95

ТЬг

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

МеЪ

С1у

Зег

Ьеи

Ахд

Зег

С1и

Азр

ТНг

А1а

Ьеи

- 58 016185

100 105 110

Туг Ьеи

РЬе Азр 130

Суз Уа1

Агд С1у

Нхз С1п

С1и 61п 120

Зег ТНг

УаЬ ТЬг

УаЬ Уа1 140

Рго 125 Зег

НЬз Зег

Туг А1а

Рго

115 Туг

Тгр

Зег

Уа1

61у 135

ТЬг

<210>

13

<2Н>

143

<212> .

Белок

<213> 1

Миз тизси!из

<4 00>

13

МеЪ

Азп

РЬе

61у

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

РЬе

Ьеи

Уа1

Ьеи

Т1е

Ьеи

Ьуз

61у

1

5

10

15

7а1

61л

Суз

С1и

Уа1

1,уЕ

Ьеи

Уа1

61и

Зег

61у

61у

61у

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

С1у

Бег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61у

РЬе

А1а

РЬе

35

40

45

Зег

Агд

Туг

Азр

МеЬ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

61п

ТЬг

Рго

61и

Ьуз

Агд

Ьеи

50

55

60

61и

Тгр

Уа1

А1а

ТЬг

Не

Зег

ТЬг

Азр

С1у

Зег

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

65

70

75

90

Азр

Зег

7а1

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

2ег

Агд

Азр

Азп

А1а

Агд

Азп

85

90

95

ТЬг

Ьеи

Туг

Ьеи

61п

Ме£

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Агр

ТЬг

А1а

Ьеи

100

105

НО

Туг

РЬе

Суз

Уа1

Агд

НЬз

61и

61п

Зег

ТЬг

Не

Уа1

Рго

Н1з

Туг

Рго

115

120

125

Ьеи

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

61у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

7а1

Зег

Зег

А1а

130 135 140 <210> 14 <2Η> 138 <212> Белок <213> Мид пизси1из <400> 14

МеЬ 61у Тгр Зег Тгр

Не

РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи 10

Зег 61и

ТЬг

А1а 15

С1у

1

5

Уа1

Ьеи

Зег

61и

Уа1

61п

Ьеи

б1п

εΐη

Зег

С1у

Рго

С1и

Ьеи

меь

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

МеГ

Зег

Суз

Агд

ТЬг

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

35

40

45

ТЬг

Авр

Туг

Зег

Не

ΗΪ5

Тгр

Уа1

Ьуз

61п

Зег

Н1з

С1у

Ьуз

Агд

Ьеи

50

55

60

61и

Тгр

11е

С1у

Туг

Не

Азп

Рго

Туг

Азп

С1у

Азр

№г

Туг

Суз

Азр

65

70

75

80

- 59 016185

С1п

Азп РЬе

Ъуз

С1у 85

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТНг 90

РЬе

Азп

Ьуз

А1а

Зег 95

Зег

ТНг

А1а

Туг

Ме5

С1и

Не

Рго

Агд

Ьеи

ТНг

Зег

Азр

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Туг

Суз

ТНг

Агд

Тгр

Ьуз

ТЬг

Не

61п

А1а

Рго

РЬе

А1а

Туг

Тгр

115

120

125

Е1у

С1п

С1у

ТНг

Ьеи

ν&ι

ТНг

νβΐ

Зег

А1а

130

135

<210> 15 <211> 143 <212> Белок <213> Миз тизси1из <220>

<221> т1зс_£еа£иге <222> (73)..(73) <223> Хаа может быть любой встречающейся в природе аминокислотой <400> 15

Ме£ 1

Азп

РЬе <31у

Ьеи 5

Зег

Ьеи

Не

РЬе

Ьеи 10

Уа1

Ьеи

Не

Ьеи

Ьуз 15

С1у

Уа1

С1п

Суз

С1и

Уа1

Ьуз

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

31у

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

А1а

РЬе

35

40

45

Зег

Агд

Туг

Азр

Μθΐ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

31п

ТЬг

Рго

Е1и

Ьуз

Агд

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Уа1

А1а

ТЬг

Не

Зег

ТЬг

Хаа

С1у

Зег

Туг

ТНг

Туг

Туг

Рго

65

70

75

80

Азр

Зег

ναΐ

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Аеп

А1а

Агд

Азп

85

90

95

ТНг

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

МеЬ

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТНг

А1а

Ьеи

100

105

НО

Туг

РЬе

Суз

Уа1

Агд

Н1з

С1и

С1п

Зег

ТНг

Не

Уа1

Рго

ΗΪ8

Туг

Рго

115

120

125

Ьеи

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Бег

А1а

130 135 140 <210> 16 <211> 128 <212> Белок <213> Миз ттдзсиГпз <400> 16

МеЪ Уа1 Зег ТЬг Зег С1п Ьеи Ьеи С1у Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Тгр ТНг Зег 15 10 15

А1а Зег Агд

Суз Азр 20

11е

Уа1

МеН

ТЬг 25

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг 30

Беи

Зег

Уа1

ТНг

Рго

С1у

Азр

Агд

Уа1

Зег

Беи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

35

40

45

Не

С1у

Азр

Туг

Беи

Н1з

Тгр

Туг

С1п

С1п

Буз

Зег

ΗΪ3

С1и

Зег

Рго

50

55

60

Агд

Беи

Беи

11е

Буз

Туг

А1а

Зег

31п

Зег

11е

Зег

61у

Не

Рго

Зег

65

70

75

90

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

Азр

РНе

ТЬг

Беи

Зег

Не

Азр

Θ5

90

95

Зег

7а1

С1и

Рго

31и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

С1п

Азп

С1у

ΗΪ5

100

105

110

Зег

РНе

Рго

РНе

ТЬг

РНе

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Буз

Беи

С1и

11е

Буз

Агд

115 120 125 <210> 17 <211> 130 <212> Белок <213> Миз шизси1из <400> 17

Ме1 1

Азр МеН

Агд А1а 5

Рго

А1а

С1п РНе

Беи 10

С1у

11е

Беи

Беи

Беи 15

Тгр

РЬе

Рго

С1у

А1а

Агд

Суз

С1и

Не

С1п

МеП

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

20

25

30

МеН

Зег

А1а

Зег

Беи

С1у

Азр

Агд

Не

ТНг

Не

ТЬг

Суз

(ЯП

А1а

ТЬг

35

40

45

С1п

Азр

Не

Уа1

Ьуз

Азп

Беи

Азп

Тгр

Туг

С1п

С1п

Буз

РГО

С1у

Буз

50

55

60

Рго

Рго

Зег

РНе

Беи

Не

Н15

Туг

А1а

ТЬг

С1и

Беи

А1а

С1и

С1у

Уа1

65

70

75

80

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

(31у

Зег

С1у

Зег

Й1у

Зег

Азр

Туг

Зег

Беи

ТЬг

85

90

95

Не

Зег

Азп

Беи

61и

Зег

<31и

Азр

РНе

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

Беи

61 п

100

105

110

8ег

Туг

Азр

РЬе

Рго

Туг

ТЬг

РНе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Буз

Беи

С1и

Не

115 120 125

Азп Агд

130 <210> <21 <212>

<213>

00>

129

Белок

Мча тизсиТиз

- 61 016185

1

5

10

15

РЬе

Рго

С1у

А1а

Агд

Суз

СБи

Не

СБп

МЫ

ТЬг

СБп

Зег

Рго

Зег

Зег

20

25

30

МЫ

Зег

АБа

Зег

Беи

СБу

Азр

Агд

Не

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

СБп

АБа

ТЬг

35

40

45

С1п

Азр

11е

УаБ

Буз

Азп

Беи

Азп

Тгр

Туг

СБп

СБп

Буз

Рго

СБу

Буг

50

55

ео

Рго

Рго

Зег

РЬе

Беи

11е

НБз

Туг

АБа

ТЬг

СБи

Беи

АБа

СБи

СБу

УаБ

€5

70

75

80

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

СБу

Зег

СБу

Зег

СБу

Зег

Азр

Туг

Зег

Беи

ты

85

90

95

Не

Зег

Азп

Беи

СБи

Зег

СБи

Азр

РЬе

АБа

Азр

Туг

Туг

Суз

Беи

СБп

100

105

НО

Зег

Туг

Азр

РЬе

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

СБу

СБу

СБу

ТЬг

Буз

Беи

СБи

Не

115 120 125

Азп

<210>

19

<211>

127

<212>

Белок

<213> :

Миз тизсиБиз

<400>

19

Агд

АБа

Рго

А1а

СБп

РЬе

Беи

СБу

Не

Беи

Беи

Беи

Тгр

РЬе

Рго

СБу

1

5

10

15

АБа

Агд

Суз

СБи

Не

СБп

МЫ

ТЬг

СБп

Зег

Рго

Зег

Зег

МеЬ

Зег

АБа

20

25

30

Зет

Беи

СБу

Азр

Агд

Не

ТЬг

1Бе

ТЬг

Суз

СБп

АБа

ТЬг

СБп

Азр

Не

35

40

45

УаБ

Буз

Азп

Беи

Азп

Тгр

Туг

ΟΣπ

СБп

Буз

Рго

С1у

Буз

Рго

Рго

Зег

50

55

60

РЬе

Беи

Не

Н1з

Туг

АБа

ТЬг

С1и

Беи

АБа

СБи

СБу

УаБ

Рго

Зег

Агд

65

70

75

80

РЬе

Зег

СБу

Зег

СБу

Зег

СБу

5ег

Азр

Туг

Зег

Беи

ТЬг

11е

Зег

Азп

85

90

95

Беи

СБи

Зег

СБи

Азр

РЬе

АБа

Азр

Туг

Туг

Суз

Беи

СБп

Зег

Туг

Азр

100

105

но

РЬе

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

СБу

СБу

б!у

ТЬг

Бу$

Беи

С1и

11е

АЗП

Агд

115 120 125 <210> 20 <211> 13 <212> Белок <213> Миз гсизсиБиз

- 62 016185 <220>

<221> πιί$ο_ί еаЪиге <222> (7) . .(7) <223> Хаа может быть любой встречающейся в природе аминокислотой <4О0>20

Агд Ηίβ 61и СЬп Зег ТНг Хаа Уа1	Рго НЬз 10	Туг	Рго	Ьеи
1	5
<210>	21
<211>	5
<212>	Белок
<213>	Миз тизсиЬиз
<400>	21
Агд Туг Азр Меи Зег
1	5
<210>	22
<211>	17
<212>	Белок
<213>	Миз тизсиЬиз
<400	22
ТНг Не	- Зег ТНг СЬу СЬу Зег Туг	ТНг Туг	Туг	Рго	Азр Зег УаЬ Ьуз
1	5	10			15
СЬу

<210>	23
<211>	13
<212>	Белок
<213>	Миз тпизсиЬиз
<4 00>	23
Агд Ηΐ£	: 61и ΰΐη Зег ТНг УаЬ УаЬ	Рго Н1з Туг Рго Ьеи
1	5	10

<210>24 <211>5 <212> Белок <213> Миз тизсиЬиз <400>24

Агд Туг Азр Меи Зег

1	5
<210>	25
<211>	17
<212>	Белок
<213>	Миз тизсиЬиз
<400>	25

- 63 016185

ТНг Не Зег ТНг Азр С1у Зег Туг ТНг Туг Туг Рго Азр Зег Уа1 Ьуз

1015

С1у <210> 26 <211>13 <212> Белок <213> Миз гш5си1из <400>26

Агд Н1з С1и С1п Зег ТНг Не Уа1 Рго Н1з Туг Рго Ьеи

1510 <210>27 <211>5 <212> Белок <213> Миз ти5си1из <400>27

Азр Туг Зег Не Н1з <210>23 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400>28

Туг Не Азп Рго Туг Азп С1у Азр ТНг Туг Суз Азр С1п Азп РЬе Ьуз
1	5	10	15
<210>	29
<211>	9
<212>	Белок
<213>	Миз тиасиЬив
<400>	29
Агд Тгр Ьуз ТНг 11е	С1п А1а Рго РНе
1	5
<210>	30
<211>	11
<212>	Белок
<213>	Миз тигсиЬиз
<400>	30
Агд А1а	ι Зег <31п Зег	Не <31у Азр Туг Ьеи НЬз
1	5	10

<210> 31 <211> 7 <212> Белок <213> Миз тизси1из

- 64 016185 <400> 31

Туг А1а Зег 61п Зег Не Зег
1	5
<210>	32
<211>	7
<212>	Белок
<213>	Миз тизси1из
<400>	32
01п Азп С1у Н15 Зег	РЬе	Рго
1	5
<210>	33
<211>	11
<212>	Белок
<213>	Миз тизси1из
<400>	33
С1п А1а ТЬг С1п Азр	Не	Уа1	Ьуз	Азп	Беи	Азп
1	5					10
<210>	34
<211>	7
<212>	Белок
<213>	Миз тизси1из
<400>	34
Туг А1а ТЬг 61и Ьеи	А1а	С1и
1	5
<210>	35
<211>	7
<212>	Белок
<213>	Миз 1лизси1из
<400>	35
Ъеи С1п	ι Зег Туг Азр	РЬе	Рго
1	5
<210>	36
<211>	11
<212>	Белок
<213>	Миз тизси!из
<400>	36
С1п А1а	. ТЬг 61п Азр	Не	Уа1	Ъуз	Азп	Беи	Азп
1	5					10

<210> 37 <211> 7 <212> Белок <213> Миз тизси!из

- 65 016185 <400>37

Туг А1а ТЬг 61и Ьеи А1а 61и <210>38 <211>7 <212> Белок <213> Миз гоизсиЬиз <400>38

Ьеи 61п Зег Туг Азр РЬе Рго <210>39 <211>17 <212> Белок <213> Миз тизсиЬиз <220>

<221> т1зс_£еа1:иге <222> (6)..(6) <223> Хаа может быть любой встречающейся в природе аминокислотой <400>39

ТЬг Не 5ег ТЬг Азр Хаа 5ег Туг ТЬг Туг Туг Рго Азр Зег 7а1 Ьуз 15 1015

61у <210>40 <211>50 <212> Белок <213> Мцз тизсиЬиз <400>40

(31п 1

С1у

Агд

Рго

А1а 5

61п

Рго

С1и Рго

Рго 10

Агд

РЬе

А1а

2ег

Тгр 15

Азр

61и

МеЬ

Азп

Ьеи

Ьеи

А1а

Н13

Й1у

Ьеи

Ьеи

61п

Ьеи

С1у

Н1з

61 у

Ьеи

20

25

30

Агд

61и

ΗΪΞ

7а 1

61и

Агд

ТЬг

Агд

61у

ΰΐη

Ьеи

61у

А1а

Ьеи

61 и

Агд

40 45

Агд МеЬ

<210> <211> <212> <213>	41 50 Белок Миз кгазси1из
<4 00>	41

- 66 016185

Ьеи 1

61п

Ьеи

61у Н1з С1у Ьеи Агд 61и Ηί$ Уа1

С1и

Агд ТНг

Агд 15

С1у

5

10

С1п

Ьеи

С1у

А1а

Ьеи

С1и

Агд

Агд

МеЬ

А1а

А1а

Суз

С1у

Азп

А1а

Суз

20

25

30

С1п

Й1у

Рго

Ьуз

С1у

Ьуз

Азр

А1а

Рго

РЬе

Ьуз

Азр

Зег

С1и

Азр

Агд

35

40

45

Уа1 Рго <210>42 <211>50 <212> Белок <213> Низ тпизси1из <400>42

А1а 1

А1а

Суз

С1у

Азп 5

А1а

Суз

31п

С1у

Рго 10

Ьуз

61у

Ьуз

Азр

А1а 15

Рго

РЬе

Ьуз

Азр

Зег 20

С1и

Азр

Агд

Уа1

Рго 25

С1и

Й1у

С1п

ТЬг

Рго 30

С1и

ТЬг

Ьеи

31п

Зег

Ьеи

61п

ТЬг

61п

Ьеи

Ьуз

А1а

С1п

Азп

Зег

Ьуз

Не

61п

40 45

01п Ьеи <210>43 <211>53 <212> Белок <213> Миз шизси1из <400>43

31и 1

С1у

31п

ТЬг

Рго 5

С1и

ТЬг

Ьеи

31п

5ег 10

Ьеи

С1п

ТЬг

с;1п

Ьеи 15

Ьуз

А1а

Θΐη

Азп

Зег 20

Ьуз

Не

61п

61п

Ьеи 25

РЬе

С1п

Ьуз

Уа1

А1а 30

С1п

С1п

С1п

Ахд

Туг 35

Ьеи

Зег

Ьу5

С1п

Азп 40

Ьеи

Агд

11е

С1п

Азп 45

Ьеи

С1п

Зег

51п

Не

Азр

Ьеи

Ьеи

<210>44 <211>57 <212> Белок <213> Миз тизси1из

<400>

44

РЬе

С1п

Ьуз

Уа1

А1а

С1п

С1п

С1п

Агд

Туг

Ьеи

Зег

Ьуз

С1п

Азп

Ьеи

1

5

10

15

Агд

Не

С1п

Азп

Ьеи

С1п

Зег

31п

Не

Азр

Ьеи

Ьеи

А1а

Рго

ТНг

ΗΪ3

20

25

30

- 67 016185

Ьеи	Азр	А5П	С1у	Уа1	Азр	Ьуз	ТНг	Зег Агд	С1у Ьуз Агд Ьеи Рго Ьуз
		35					40		45
Ме!	ТНг	31п	Ьеи	Не	С1у	Ьеи	ТНг	Рго
	50					55

<210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Миз гаизси!из <400>

Ьеи 31п Ьеи

61у Н1з

С1у

Ьеи

Агд

С1и

Н1з

Уа1

С1и

Агд

ТНг

Агд

С1у

С1п Ьеи С1у

А1а Ьеи

С1и

Агд

Агд

Ме!

<210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Миз шизси1из <400>

А1а А1а Суз

С1у Азп

А1а

Суз

С1п (31у

Рго

Ьуз

С1у

Ьуз

Азр

Рго

РНе Ьуз Азр

Азр

Агд

Уа1

Рго <210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Миз тпизси1из <400

С1и С1у С1п

ТНг Рго

С1и

ТНг

Ьеи

С1п

Зег

Ьеи

С1п

ТНг

Ьеи

Ьуз

А1а С1п Азп

Зег Ьуз

Не

С=1п

С1п

Ьеи

<210>	48
<211>	28
<212>	Белок
<213>	Миз тизсиХиз
<400>	48
РНе С1п Ьуз Уа1 А1а б1п	С1п (31п Агд Туг Ьеи	Зег Ьуз 61п Азп Ьеи
1	5	10	15

Агд Не С1п Азп Ьеи Θΐη Зег С1п 11е Азр Ьеи Ьеи

25 <210> 49 <211> 1313 <212> ДНК <213> Миз шизси1из <400> 49

д£1:ссддадЕ	ссЕадсдЬПд	с^дсасссаа	ддссассссс	адааЕса! дс	дс£дсдс£сс	60
дасадсаддс	дсЕдсссСдд	НдсНайдсдс	ддс£ас±дсд	дддсЕЕМ да	дсдсдсаадд	120
дсдссскдса	садссададс	сассдсдс£1:	ЪдсаЪссЪдд	дасдада!да	ас1:ЪдсСддс	180
Исасдддс^д	с±аоадс£сд	дсса^дддс!:	дсдсдаасас	д1:ддадсдса	сссдЕдддса	240
дсЪдддСдсд	сЬддадсдсс	дсаЕддсЪдс	сИд^ддПаас	дс^СдЬсадд	ддсссааддд	300
аааадайдса	ССССЕоааад	ас£ссдадда	£адад£ссс£	дааддссада	с^ссЪдадас	360
НсНдсададг	ЫдсадасСс	адсЕсааддс	Есаааасадс	аада^ссадо	ааЪЪдЪЪсса	420
дааддПддсс	садсадсада	даНассНаПс	ааадсадааЪ	сХдадааЕас	адаанс11Ъс.а	480
дадссада^а	дасс£сС£дд	сссосасдса	ссНадасааЪ	ддадНадаса	адасЕ^сдад	540
дддааададд	сЫзсссаада	£дасссадсЬ	саН£ддс£Сд	асЕсссааед	ссасссас1:1:	600
асасаддссд	ссссдддаог	дссаддаасН	сЫзссаадаа	ддддададдс	асад£ддас£	660
£Ь£ссада-Ьс	садссЕсСдд	дд^сЕссасс	аЕЪб^ддЕс	аас^д^дада	Едас^Ъсада	720
Ьддаддс±дд	асадЬда^Ес	ададасдссН	даасддс1:с11	д£ддас±1:са	ассадЕссНд	780
ддаадсс^ас	аадда£ддс£	1:сддада1:сс	ссааддсдад	£НсСддс±дд	дссНддаааа	840
да1:дсасадс	а^сасаддда	ассдаддаад	ссаа££ддс£	дСдсадсЕсс	аддас± ддда	900
^ддсааНдсс	ааа^Идс^сс	ааЕМссса·!:	сса££Ндддд	дд^даддаса	садссЬасад	960
ссНдсадс5с	асЬдадссса	сддссаа'Ьда	дс^дддЕдсс	ассааЕдПЕТ:	сссссааНдд	1020
ссН^сссНд	сссЫзсСсНа	сЕЪдддасса	адассаЬдас	с1:ссд1:дддд	асс^Наас^д	1080
£дссаададс	сНсНсЕдд^д	дсГдд£дд£1:	£дд£асс±дН	адссаЪ^сса	а£с£саа£дд	1140
асаа£ас1:1:с	сасЕсНаНсс	сасддсаасд	дсаддадсдЪ	аааааддд!а	£с±Ьс£ддаа	1200
ааса^ддаад	ддссдс±ае1:	а£сс±с!дса	ддс^ассасо	с£дс1:да1:сс	адссса1:дда	1260
ддс£асадса	дссЕс^Надс	е^ссЬсасЬд	дадссЕддЕЕ	ссаддсЕаад	аад	1313

<210>50 <211>410 <212> Белок <213> Миа кшзои1из <400>50

Ме£

Агд

Суз

А1а

Рго

ТИг

А1а

С1у

А1а

А1а

Ьеи

¥а1

Ьеи

Суз

А1а

А1а

1

5

10

15

ТНг

А1а

С1у

Ьеи

Ьеи

5ег

А1а

С1п

61у

Агд

Рго

А1а

С1п

Рго

61и

Рго

20

25

30

Рго

Агд

РНе

А1а

5ег

Тгр

Азр

С1и

МеП

Азп

Ьеи

Ьеи

А1а

ΗΪΞ

01 у

Ьеи

35

40

45

- 69 016185

Ьеи

СЬп 50

Ьеи

СЬу НЬз

СЬу Ьеи Агд 55

СЬи

Н1з

ν&ι

СЬи 60

Агд

ТЬг

Агд

СЬу

СЬп

Ьеи

СЬу

АЬа

Ьеи

СЬи

Агд

Агд

Мер

АЬа

АЬа

Суз

сьу

Азп

АЬа

Суз

65

70

75

80

С1п

СЬу

Рго

Ьуз

СЬу

Ьуз

Азр

АЬа

Рго

РНе

Ьуз

Азр

Зег

СЬи

А5Р

Агд

85

90

95

7аЬ

Рго

СЬи

СЬу

СЬп

ТНг

Рго

СЬи

ТНг

Ьеи

СЬп

Зег

Ьеи

СЬп

ТНг

СЬп

100

105

но

Ьеи

Ьуз

АЬа

С1п

Азп

Зег

Ьуз

Не

СЬп

СЬп

Ьеи

РНе

СЬп

Ьуз

Уа1

АЬа

115

120

125

СЬп

СЬп

СЬп

Агд

Туг

Ьеи

Зег

Ьуз

СЬп

Азп

Ьеи

Агд

Не

СЬп

Азп

Ьеи

130

135

140

СЬп

Зег

СЬп

Пе

Азр

Ьеи

Ьеи

АЬа

Рго

ТНг

Н1э

Ьеи

Азр

Азп

СЬу

УаЬ

145

150

155

160

Азр

Ьуз

ТНг

Зег

Агд

СЬу

Ьуз

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Мер

ТЬг

СЬп

Ьеи

Не

165

170

175

С1у

Ьеи

ТНг

Рго

Азп

АЬа

ТНг

Н13

Ьеи

Н1з

Агд

Рго

Рго

Агд

Азр

Суз

180

185

190

СЬп

СЬи

Ьеи

РНе

СЬп

СЬи

СЬу

СЬи

Агд

НЬз

Зег

сьу

Ьеи

РНе

СЬп

11е

195

200

205

С1П

Рго

Ьеи

СЬу

Зег

Рго

Рго

РНе

Ьеи

УаЬ

Азп

Суз

СЬи

Мер

ТЬг

Зег

210

215

220

Азр

С1у

СЬу

Тгр

ТНг

УаЬ

Не

СЬп

Агд

Агд

Ьеи

Азп

СЬу

Зег

Уа1

Азр

225

230

235

240

РНе

Азп

СЬп

Зег

Тгр

СЬи

АЬа

Туг

Ьуз

Азр

СЬу

РНе

СЬу

Азр

Рго

СЬп

245

250

255

С1у

СЬи

РНе

Тгр

Ьеи.

СЬу

Ьеи

СЬи

Ьуз

Мер

НЬз

Зег

Не

ТНг

СЬу

Азп

260

265

270

Агд

СЬу

Зег

СЬп

Ьеи

А1а

Уа1

01 п

Ьеи

С1п

Азр

Тгр

Азр

СЬу

Азп

АЬа

275

280

285

Ьуз

Ьеи

Ьеи

СЬп

РНе

Рго

11е

НЬз

Ьеи

СЬу

СЬу

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа

Туг

290

295

300

Зег

Ьеи

СЬп

Ьеи

ТНг

61и

Рго

ТНг

АЬа

Азп

СЬи

Ьеи

СЬу

АЬа

ТНг

Азп

305

310

315

320

УаЬ

Зег

Рго

Азп

СЬу

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

РНе

Зег

ТНг

Тгр

Азр

СЬп

Азр

325

330

335

НЬз

Азр

Ьеи

Агд

СЬу

Азр

Ьеи

Азп

Суз

АЬа

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

С1у

СЬу

340

345

350

Тгр

Тгр

РНе

СЬу

ТНг

Суз

Зег

ΗΪ5

Зег

Азп

Ьеи

Азп

СЬу

СЬп

Туг

РНе

355

360

365

НЬз

Зег

11е

Рго

Агд

СЬп

Агд

СЬп

СЬи

Агд

Ьуз

Ьуз

СЬу

Не

РНе

Тгр

370

375

380

Ьуз

ТНг

Тгр

Ьуз

СЬу

Агд

Туг

Туг

Рго

Ьеи

СЬп

АЬа

ТНг

ТЬг

Ьеи

Ьеи

385

390

395

400

11е

сьп

Рго

МеР

СЬи

АЬа

ТНг

А1а

АЬа

Зег

405 410

Claims (29)

1. Моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфично связываются подобным ангиопоэтину белком 4 (АNСРТ^4), обладающие по меньшей мере одним видом активности, выбранным из повышения активности липопротеинлипазы (ЬРЬ) в присутствии АNСРТ^4 и снижения уровня по меньшей мере одного сывороточного липида ίη νίνο; где антитело или его фрагмент связываются с эпитопом в составе 8ЕО ΙΌ Ν0: 2 от остатка 21 до остатка 169; и включают тяжелую цепь и легкую цепь, причем:

а) тяжелая цепь содержит:

ί) аминокислотную последовательность, выбранную из ЗЕЦ ΙΌ Ν0: 12-14;

ίί) по меньшей мере одну СОЯ, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из ЩЬ) ГО Ν0: 21, 39 и 20; или ϊϊΐ) по меньшей мере одну СОЯ, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из

- 70 016185

81Т) ΙΌ N0: 27-29; и

Ь) легкая цепь содержит:

ί) легкую цепь, где легкая цепь включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 16-18;

ίί) по меньшей мере одну СОЯ, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из 81Т) ΙΌ N0: 30-32; или ϊϊΐ) по меньшей мере одну СОЯ, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из 81Т) ΙΌ N0: 33-35.

2. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, где моноклональное антитело является мышиным моноклональным антителом.

3. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, где моноклональное антитело является гуманизированным моноклональным антителом.

4. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, где моноклональное антитело является человеческим моноклональным антителом.

5. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, которые повышают активность ЬРЬ.

6. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, которые снижают уровень по меньшей мере одного сывороточного липида ш νί\Ό.

7. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, которые связываются с эпитопом в области 8Е0 ΙΌ N0: 50 от остатка 21 до остатка 174.

8. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, где моноклональное антитело представляет собой 14Ό12.

9. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.1, где моноклональное антитело представляет собой 90В4.

10. Фрагмент по п.1, выбранный из 8сΡν-фрагмента, Р(аЬ')₂-фрагмента и РаЬ'-фрагмента.

11. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 12 и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 16.

12. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 13 и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:

17.

13. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 14 и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:

18.

14. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых тяжелая цепь включает СОЯ1, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 21, СОЯ2, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 39, и СОЯ3, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 20.

15. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых тяжелая цепь включает СОЯ1, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 27, СОЯ2, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 28, и СОЯ3, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 29.

16. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых легкая цепь включает СОЯ1, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 30, СОЯ2, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 31, и СОЯ3, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 32.

17. Антитело или его фрагмент по п.1, в которых легкая цепь включает СОЯ1, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 33, СОЯ2, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 34, и СОЯ3, имеющую 8Е0 ΙΌ N0: 35.

18. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.7, которые связываются с пептидом 8Е0 ΙΌ N0: 40.

19. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.7, которые связываются с пептидом 8Е0 ΙΌ N0: 41.

20. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.7, которые связываются с пептидом 8Е0 ΙΌ N0: 43.

21. Моноклональное антитело или его фрагмент по п.7, которые связываются с пептидом 8Е0 ΙΌ N0: 41 и связываются с пептидом 8Е0 ΙΌ N0: 43.

22. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-21.

23. Способ лечения нарушения липидного метаболизма, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.22.

24. Способ снижения уровня одного или нескольких сывороточных липидов, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.22.

25. Способ лечения гипертриглицеридемии, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.22.

26. Способ лечения гиперхолестеринемиии, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.22.

27. Способ лечения ожирения, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.22.

28. Способ лечения диабета, включающий введение пациенту эффективного количества фармацев

- 71 016185 тической композиции по п.22.

29. Способ лечения ишемической болезни сердца, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.22.