CN101128485A - 针对血管生成素样蛋白4（angptl4）的单克隆抗体 - Google Patents

针对血管生成素样蛋白4（angptl4）的单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明提供了特异结合ANGPTL4的单克隆抗体。本发明提供了中和ANGPTL4的至少一种活性的单克隆抗体。本发明还提供了使用中和性单克隆抗体治疗脂质代谢疾病的方法。

Description

针对血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）的单克隆抗体
本申请要求2005年1月7日提交的美国临时申请号60/642,022的权益，将该临时申请为了任何目的引入本文作为参考。
I.技术领域
提供了特异结合血管生成素(angiopoietin)样蛋白4(ANGPTL4)的单克隆抗体。提供了使用特异结合血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的单克隆抗体的方法。还提供了包含特异结合血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的单克隆抗体的药物组合物。
II.介绍
抗血管生成素样蛋白4在几种哺乳动物物种中保守Ge等人(2004)J. Biol.Chem.279：2038-2045。血管生成素样蛋白4含有N-末端卷曲螺旋结构域和C-末端血纤蛋白原样结构域。Kim等人(2000)Biochem.J.346：603-610。N-末端卷曲螺旋结构域介导血管生成素样蛋白4的寡聚化。Ge等人(2004)J.Biol.Chem.279：2038-2045。寡聚的血管生成素样蛋白4在体内经历蛋白酶解加工，导致血纤蛋白原样结构域的切割。Ge等人(2004)J.Biol.Chem.279：2038-2045。
III.概述
在一些实施方案中，提供了特异结合ANGPTL4并且中和ANGPTL4的至少一种活性的单克隆抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体是小鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体是人源化的单克隆抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体是人单克隆抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体增加LPL活性。在一些实施方案中，该单克隆抗体降低体内至少一种血清脂质的水平。
在一些实施方案中，该单克隆抗体结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：50从残基21到残基174的区域内的表位。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合SEQ ID NO：2的从残基21到残基169的区域内的表位。在一些实施方案中，该单克隆抗体是14D12。在一些实施方案中，该单克隆抗体是15F2。在一些实施方案中，该单克隆抗体是90B4。在一些实施方案中，该单克隆抗体特异结合与14D12相同的表位。在一些实施方案中，该单克隆抗体特异结合与15F2相同的表位。在一些实施方案中，该单克隆抗体特异结合与90B4相同的表位。
在一些实施方案中，提供了特异结合ANGPTL4的抗体，其包含重链和轻链，其中该重链包含SEQ ID NOs：12到14任一个中给出的氨基酸序列；包含SEQ ID NOs：21、39和20任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；或者包含SEQ ID NOs：27到29任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；其中该抗体中和ANGPTL4的至少一种活性。在一些实施方案中，提供了特异结合ANGPTL4的抗体，其包含轻链，其中该轻链包含SEQ ID NOs：16到18任一个中给出的氨基酸序列；包含SEQ ID NOs：30到32任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；或者包含SEQ ID NOs：33到35任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；其中该抗体中和ANGPTL4的至少一种活性。
在一些实施方案中，提供了包含重链的抗体，该重链包含SEQ ID NOs：12到14任一个中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了包含重链的抗体，该重链包含含有SEQ ID NOs：21、39和20任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR。在一些实施方案中，提供了包含重链的抗体，该重链包含含有SEQ ID NOs：27到29任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR。在一些实施方案中，提供了包含轻链的抗体，该轻链包含SEQID NOs：16到18任一个中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了包含轻链的抗体，该轻链包含含有SEQ ID NOs：30到32任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR。在一些实施方案中，提供了包含轻链的抗体，该轻链包含含有SEQ ID NOs：33到35任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR。
在一些实施方案中，抗体包含重链，该重链包含如SEQ ID NO：12中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含重链，该重链包含如SEQID NO：13中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含重链，该重链包含如SEQ ID NO：14中给出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO：16中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链，该轻链包含如SEQID NO：17中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了包含重链的抗体，该重链包含如SEQ IDNO：21中给出的CDR1，如SEQ ID NO：39中给出的CDR2，和如SEQ IDNO：20中给出的CDR3。在一些实施方案中，SEQ ID NO：20中的X是任一氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：20中的X是疏水氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：20中的X是甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：20中的X是缬氨酸或异亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：20中的X是缬氨酸或异亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：39中的X是任一氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：39中的X是甘氨酸、天冬氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，提供了包含重链的抗体，该重链包含如SEQ ID NO：27中给出的CDR1，如SEQ ID NO：28中给出的CDR2，和如SEQ ID NO：29中给出的CDR3。
在一些实施方案中，提供了包含轻链的抗体，该轻链包含如SEQ IDNO：30中给出的CDR1，如SEQ ID NO：31中给出的CDR2，和如SEQ IDNO：32中给出的CDR3。在一些实施方案中，提供了包含轻链的抗体，该轻链包含如SEQ ID NO：33中给出的CDR1，如SEQ ID NO：34中给出的CDR2，和如SEQ ID NO：35中给出的CDR3。
在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些实施方案中，抗体是scFv片段。在一些实施方案中，抗体是Fab片段。在一些实施方案中，抗体是F(ab’)2片段。在一些实施方案中，抗体是Fab’片段。
在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体结合具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体结合具有SEQID NO：41的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体结合具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体结合具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的肽并且结合具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的肽。
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含特异结合ANGPTL4并且中和ANGPTL4的至少一种活性的单克隆抗体。在一些实施方案中，提供了治疗脂质代谢病症的方法，其中该方法包括对患者施用有效量的该药物组合物。在一些实施方案中，提供了降低一种或几种血清脂质的水平的方法，其中该方法包括对患者施用有效量的该药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗高甘油三酯血症的方法，其中该方法包括对患者施用有效量的该药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗高胆固醇血症的方法，其中该方法包括对患者施用有效量的该药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗肥胖症的方法，其中该方法包括对患者施用有效量的该药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗糖尿病的方法，其中该方法包括对患者施用有效量的该药物组合物。
IV.附图简述
图1显示了注射过表达全长小鼠ANGPTL4的腺病毒构建体后，在不同的时间点，野生型小鼠中禁食血清甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸(FFA)水平，如实施例B.1中所述。
图2显示了注射表达全长小鼠ANGPTL4的腺病毒构建体(Ad5-mAngptl-4T)后3天，野生型小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例B.1中所述。
图3显示了注射表达全长小鼠ANGPTL4的腺病毒构建体(Ad5-mAngptl-4T)后3天，野生型小鼠中禁食血清胆固醇水平，如实施例B.1中所述。
图4显示了注射表达全长人ANGPTL4的腺病毒构建体(Ad5-mAngptl-4T)后4天，野生型小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例B.2中所述。
图5显示了注射表达全长人ANGPTL4的腺病毒构建体(Ad5-mAngptl-4T)后4天，野生型小鼠中禁食血清胆固醇水平，如实施例B.2中所述。
图6显示了不同饮食条件下野生型小鼠(WT)和Angptl4敲除(HOM)小鼠中血清甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸(FFA)水平，如实施例C中所述。
图7显示了喂饲标准(“chow”)饮食或者高脂肪饮食(HFD)的野生型(WT)小鼠和Angptl4敲除(HOM)小鼠的体重和体脂肪，如实施例C中所述。
图8显示了喂饲和禁食状态下野生型(WT)小鼠和Angptl4敲除(HOM)小鼠中内源脂蛋白脂肪酶(LPL)活性水平，如实施例D中所述。
图9A显示了喂饲标准(“chow”)饮食或者高脂肪饮食(HFD)的野生型(WT)小鼠和Angptl4敲除(HOM)小鼠的肝脏中脂质水平。图9B显示了喂饲标准(“chow”)饮食或者高脂肪饮食(HFD)的野生型小鼠(WT)和Angptl4敲除(HOM)小鼠的肝脏切片的组织化学染色，如实施例E中所述。
图10显示了喂饲高脂肪饮食(HFD)的野生型(WT)小鼠和Angptl4敲除(HOM)小鼠的肌细胞内脂质含量，如实施例E中所述。
图11，小图A和B显示了喂饲标准(“chow”)饮食或者高脂肪饮食(HFD)的野生型(WT)小鼠和Angptl4敲除(HOM)小鼠中葡萄糖和胰岛素水平，如实施例F中所示。小图C和D显示了喂饲高脂肪饮食(HFD)的野生型小鼠(WT)和Angptl4敲除(HOM)小鼠中葡萄糖和胰岛素耐受性。
图12显示了注射表达全长小鼠ANGPTL4的腺病毒构建体(Ad5-mAngptl-4T)后3天，Angptl4敲除小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例G中所述。
图13显示了注射表达全长小鼠ANGPTL4的腺病毒构建体(Ad5-mAngptl-4T)后3天，Angptl4敲除小鼠中禁食血清胆固醇水平，如实施例G中所述。
图14显示了增量的全长小鼠ANGPTL4存在下，体外脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性，如实施例I中所述。
图15显示了抗小鼠ANGPTL4的某些中和性单克隆抗体(4A8、14D12、和15F2)，其拯救了LPL活性免于受到ANGPTL4的体外抑制，如实施例L中所述。
图16显示了如实施例O中所述的单克隆抗体4A8、14D12和15F2的表位框并(epitope binning)实验的结果。
图17显示了注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体后4天，喂饲标准饮食的野生型小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例P中所示。
图18显示了注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体后4天，喂饲标准饮食的野生型小鼠中禁食血清胆固醇水平，如实施例P中所示。
图19显示了注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体后4天，喂饲标准饮食的野生型小鼠中禁食血清游离脂肪酸(FFA)水平，如实施例P中所示。
图20显示了注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体后4天，喂饲高脂肪饮食的野生型小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例P中所示。
图21显示了注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体后4天，喂饲高脂肪饮食的野生型小鼠中禁食血清胆固醇水平，如实施例P中所示。
图22显示了单次注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体后和每周注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体共5周后，喂饲高脂肪饮食的野生型小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例P中所示。
图23显示了单次注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体后和每周注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体共5周后，喂饲高脂肪饮食的野生型小鼠中禁食血清胆固醇水平，如实施例P中所示。
图24显示了每周注射抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体共5周后，喂饲高脂肪饮食(HFD)的野生型小鼠中禁食血清酮体水平，如实施例P中所示。
图25显示了喂饲标准(“chow”)饮食的雄性野生型(“WT”)、杂合的(“het”)和敲除的(“hom”)小鼠(小图A)和野生型(“WT”)和敲除的(“hom”)雌性小鼠(小图B)中禁食血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平，如实施例C中所示。
图26显示了喂饲高脂肪饮食(HFD)的雄性野生型(“WT”)和敲除(“hom”)小鼠中禁食血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平，如实施例C中所示。
图27显示了喂饲高脂肪饮食的雄性野生型(“WT”)和ANGPTL4敲除(“Hom”)雄性(小图A)和雌性(小图B)小鼠中体脂肪克数，如实施例C中所示。
图28显示了喂饲高脂肪饮食的野生型(“WT”)和ANGPTL4敲除(“Hom”)小鼠中食物摄入(小图A)和粪便中脂肪百分数(小图B)，如实施例C中所示。
图29显示了品种间杂合的亲本生下的野生型、杂合和敲除幼鼠的数目，如实施例C中所示。
图30显示了喂饲高脂肪饮食(HFD)的野生型和敲除小鼠的存活，如实施例C中所示。
图31显示了注射抗ANGPTL4的单克隆抗体的野生型小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例R中所示。
图32显示了注射抗ANGPTL4的单克隆抗体的野生型小鼠中禁食总胆固醇水平，如实施例R中所示。
图33显示了单克隆抗体14D12、15F2和90B4对N-mANGPTL4(小图A)和N-hANGPTL4(小图B)的相对结合亲和力，如实施例S中所示。
图34显示了注射14D12或抗-KLH后4天(小图A)和7天(小图B)，野生型小鼠中禁食血清甘油三酯减少的百分比，如实施例T中所示。
图35，小图A显示了单次注射14D12后，野生型小鼠中14D12浓度和禁食血清甘油三酯水平随时间的曲线，如实施例U中所示。小图B显示了单次注射14D12后，野生型小鼠中14D12浓度和禁食总胆固醇水平随时间的曲线，如实施例U中所示。
图36显示了注射单克隆抗体抗-KLH、14D12、15F2或90B4后4天，过表达人ANGPTL4的小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例V中所示。
图37显示了注射单克隆抗体抗-KLH、14D12、15F2或90B4后4天，过表达人ANGPTL4的小鼠中禁食总胆固醇水平，如实施例V中所示。
图38显示了每周注射载体、抗-KLH或者14D12共15次后，LDLr敲除小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例W中所示。
图39显示了每周注射载体、抗-KLH或者14D12共15次后，LDLr敲除小鼠中禁食总胆固醇水平，如实施例W中所示。
图40显示了每周注射载体、抗-KLH或者14D12共15次后，ApoE敲除小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例X中所示。
图41显示了每周注射载体、抗-KLH或者14D12共15次后，ApoE敲除小鼠中禁食总胆固醇水平，如实施例X中所示。
图42显示了单次注射抗-KLH或者14D12后4天，LDLr敲除小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例W中所示。
图43显示了单次注射抗-KLH或者14D12后4天，LDLr敲除小鼠中禁食总胆固醇水平，如实施例W中所示。
图44显示了单次注射抗-KLH或者14D12后4天，ApoE敲除小鼠中禁食血清甘油三酯水平，如实施例X中所示。
图45显示了单次注射抗-KLH或者14D12后4天，ApoE敲除小鼠中禁食总胆固醇水平，如实施例X中所示。
图46，小图A显示了用抗-KLH(Grp-1)和14D12(Grp-2)注射前和注射后1周，db/db小鼠中禁食血清甘油三酯，如实施例Y中所示。小图B显示了用抗-KLH或14D128次每周注射后，db/db小鼠中血清甘油三酯，如实施例Y中所示。
图47显示了14D12的重链可变区(SEQ ID NO：12)、15F2的重链可变区(SEQ ID NO：13)和90B4的重链可变区(SEQ ID NO：14)的比对，如实施例Z中所述。还显示了共有序列(SEQ ID NO：15)。每对重链可变区之间的百分比同源性在下面显示。
图48显示了14D12的轻链可变区(SEQ ID NO：16)、15F2的轻链可变区(SEQ ID NO：17)和90B4的轻链可变区(SEQ ID NO：18)的比对，如实施例Z中所述。还显示了共有序列(SEQ ID NO：19)。每对轻链可变区之间的百分比同源性在下面显示。
图49显示了抗ANGPTL4的某些单克隆抗体与ANGPTL4的片段的结合，如实施例AA中所讨论。
V.不同实施方案详述
将理解前面的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的本发明。
在本申请中，除非另外指出，单数的使用包括复数。在本申请中，词语“一个”或“一种”指“至少一个”，除非特别指出相反。在本申请中，除非指出相反意思，“或”的使用指“和/或”。此外，术语“包含”以及其它形式诸如“包括”和“含有”的使用不是限定性的。而且，术语如“成分”或者“组分”涵盖包括一个单位的成分或组分和包含一个以上单位的成分或组分，除非特别指出相反。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不理解为限定所描述的主题。本申请中引用的所有文件，或者文件的部分，包括但不限于，专利、专利申请、文章、书籍和论文都特别为了任何目的完整引入本文作为参考。对于引入的文献和相似材料的一种或多种对术语的定义与本申请中对该术语的定义相矛盾的情况，以本申请为准。
A.一些定义
术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于含有天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可以是任一长度。
本文使用的术语“抗体”指完整抗体或者与该完整抗体竞争抗原结合的抗体片段。抗体片段包括，但不限于Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、双抗体或者保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段。见例如，Hudson等人(2003)Nature Med.9：129-134。在一些实施方案中，通过完整抗体的酶促或者化学切割产生抗体片段。在一些实施方案中，通过重组DNA技术产生抗体片段。
术语“天然多肽”指天然存在的多肽。术语“天然抗体”指天然存在的抗体。
术语“单克隆抗体”指来自特异结合同一表位的基本上同质的抗体群体的抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤分泌。在一些此类实施方案中，根据本领域技术人员已知的一些方法产生杂交瘤。见例如，Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495-499)。在一些实施方案中，使用重组DNA方法(见例如，美国专利号4,816,567)产生单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体指从噬菌体展示文库分离的抗体片段(见例如，Clackson等人(1991)Nature 352：624-628，和Marks等人(1991)J.Mol. Biol.222：581-597)。关于多种其他单克隆抗体产生技术，见例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
“嵌合抗体”指由来自至少两种不同来源的组分组成的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含来自第一种物种的抗体的部分，其与另一分子，例如，来自第二种物种的抗体的部分融合。在一些此类实施方案中，嵌合抗体包含来自非人动物的抗体的部分，其与来自人的抗体的部分融合。在一些此类实施方案中，嵌合抗体包含来自来自非人动物的抗体的可变区的全部或者部分，其与来自人的抗体的恒定区融合。
“人源化”抗体指被修饰使得它更密切匹配(在氨基酸序列中)人抗体的非人抗体。从而，人源化抗体是一类嵌合抗体。在一些实施方案中，修饰非人抗体的可变区的抗原结合残基外的氨基酸残基。在一些实施方案中，通过将人抗体的互补决定区(CDR)的全部或者部分用具有希望的抗原结合特异性的另一抗体如非人抗体的CDR的全部或部分替换，构建人源化抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含可变区，其中所有或基本上所有CDRs对应于非人抗体的CDRs，并且所有或基本上所有构架区(FRs)对应于人抗体的FRs。在一些此类实施方案中，人源化抗体还包含人抗体的恒定区(Fc)。
术语“人抗体”指单克隆抗体，其含有人抗体序列并且不含有来自非人动物的抗体序列。在一些实施方案中，人抗体可以含有天然抗体中没有发现的合成序列。该术语不受到制备抗体的方式的限制。例如，在多种实施方案中，人抗体可以在转基因小鼠中、通过噬菌体展示、通过人B淋巴细胞或通过重组方法制备。
术语“中和抗体”或者“中和...的抗体”指这样的抗体，其减小包含该抗体特异结合的表位的多肽的至少一种活性。在一些实施方案中，中和抗体在体外和/或体内减小活性。
术语“抗原结合部位”指能够特异结合抗原的抗体的一部分。在一些实施方案中，通过一个或多个抗体可变区提供抗原结合部位。
术语“表位”指能够特异结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何多肽决定簇。在一些实施方案中，表位是抗原的被抗体特异结合的区域。在一些实施方案中，表位可以包括分子的化学活性表面基团如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在一些实施方案中，表位可以具有特定三维结构特征(例如，“构象”表位)和/或特定电荷特征。
将一个表位定义为与另一个表位“相同”，如果特定抗体特异结合两个表位的话。在一些实施方案中，具有不同一级氨基酸序列的多肽可以包含相同的表位。在一些实施方案中，相同的表位可以具有不同的一级氨基酸序列。如果不同的抗体竞争结合同一表位，那么说它们结合该相同表位。
当抗原优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中抗原时，该抗体“特异结合”该抗原。在一些实施方案中，抗体包含特异结合特定表位的抗原结合部位。在一些此类实施方案中，抗体能够结合不同的抗原，只要不同的抗原包含该特定表位。在一些情况下，例如，来自不同物种的同源蛋白质可以包含相同表位。在一些实施方案中，当解离常数(KD)≤1μM，在一些实施方案中，当解离常数(KD)≤100nM，在一些实施方案中，当解离常数(KD)≤10nM时，说抗体特异结合抗原。
术语“ANGPTL4”指来自任一脊椎动物或哺乳动物来源的血管生成素样蛋白4，除非指出相反，所述来源包括，但不限于，人、牛、鸡、啮齿动物、小鼠、大鼠、猪、羊、灵长类、猴、和豚鼠。该术语还指天然ANGPTL4的片段和变体，其保持天然ANGPTL4的至少一种体内或体外活性。该术语包括ANGPTL4的全长未加工的前体形式以及翻译后切割信号肽得到的成熟形式以及血纤蛋白原结构域的蛋白酶解加工得到的形式。在一些实施方案中，全长的、未加工的小鼠ANGPTL4具有SEQ ID NO：1中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，全长的、未加工的小鼠ANGPTL4具有SEQ ID NO：50中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，全长的、未加工的人ANGPTL4具有SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列。
术语“Angptl4”指编码ANGPTL4的核酸。
术语“LPL”指来自任一脊椎动物或哺乳动物来源的脂蛋白脂肪酶，所述来源包括，但不限于，人、牛、鸡、啮齿动物、小鼠、大鼠、猪、羊、灵长类、猴、和豚鼠。在一些实施方案中，脂蛋白脂肪酶催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白(VLDL)中的三酰基甘油水解成二酰基甘油和游离脂肪酸阴离子。在一些实施方案中，脂蛋白脂肪酶还能够水解二酰基甘油。
术语“试剂”指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或者由生物材料制备的提取物。
术语“拮抗剂”指降低ANGPTL4活性的试剂。
术语“激动剂”指增加ANGPTL4活性的试剂。
术语“患者”包括人和动物受试者。在一些实施方案中，患者是哺乳动物。在一些此类实施方案中，患者是人。
参考多肽的“片段”指来自参考多肽的任一部分的一段连续氨基酸。片段可以是小于参考多肽的长度的任一长度。
参考多肽的“变体”指相对于参考多肽具有一个或多个氨基酸替代、缺失或插入的多肽。
“保守”氨基酸替代指将多肽中氨基酸用具有相似性质，如大小或电荷的另一氨基酸替代。在一些实施方案中，包含保守氨基酸替代的多肽保持未替代的多肽的至少一种活性。保守氨基酸替代可以包含非天然存在的氨基酸残基，它们典型地通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成掺入。这些非天然存在的氨基酸残基包括，但不限于肽模拟物和氨基酸部分的其他逆转或者颠倒的形式。
天然存在的残基可以基于共同的侧链形式分类：
1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
3)酸性的：Asp，Glu；
4)碱性的：His，Lys，Arg；
5)影响链取向的残基：Gly，Pro；和
6)芳族：Trp，Tyr，Phe。
例如，非保守替代可以涉及这些类别之一的成员交换另一类别的成员。此类替代的残基可以引入人抗体的与非人抗体同源的区域中，或者引入分子的非同源区中。
根据一些实施方案，在进行替代中，可以考虑氨基酸的亲水指数。每个氨基酸基于它的疏水和电荷特征分配一个亲水指数。它们为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域中理解，在一些情况下，亲水氨基酸指数在赋予蛋白质的相互作用生物功能中的重要性。Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。理解在一些情况下，某些氨基酸可以替代具有相似亲水指数或者得分的其他氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在一些实施方案中，包括亲水指数在±2内的氨基酸替代。在一些实施方案中，包括亲水指数在±1内的氨基酸替代，在一些实施方案中，包括亲水指数在±0.5内的氨基酸替代。
本领域中还理解可以基于亲水性有效进行相似氨基酸的替代，尤其当由此产生的生物学功能蛋白质或者肽预期用于免疫学实施方案时，如本发明中的情况。在一些实施方案中，蛋白质的最大的局部平均亲水性受到它的相邻氨基酸的亲水性的控制，与它的免疫原性和抗原性，即与蛋白质的生物学性质相关。
已经为这些氨基酸残基分配了下面的亲水指数：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水性值进行改变时，在一些实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸替代，在一些实施方案中，包括亲水性值在±1内的氨基酸替代，在一些实施方案中，包括亲水性值在±0.5内的氨基酸替代。还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域已被称作“表位核心区”。
示例性氨基酸替代在表1中给出。
表1：氨基酸替代
  最初残基   示例性替代
  Ala   Val，Leu，Ile
  Arg   Lys，Gln，Asn
  Asn   Gln
  Asp   Glu
  Cys   Ser，Ala
  Gln   Asn
  Glu   Asp
  Gly   Pro，Ala
  His   Asn，Gln，Lys，Arg
  Ile   Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸
  Leu   正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe
  Lys   Arg，1，4二氨基-丁酸，Gln，Asn
  Met   Leu，Phe，Ile
  Phe   Leu，Val，Ile，Ala，Tyr
  Pro   Ala
  Ser   Thr，Ala，Cys
  Thr   Ser
  Trp   Tyr，Phe
  Tyr   Trp，Phe，Thr，Ser
  Val   Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸
技术人员使用公知的技术将能够确定如本文给出的多肽的合适的变体。在一些实施方案中，本领域技术人员通过靶定认为对于活性不重要的区域，可以鉴定分子的可以被改变而不破坏活性的合适区域。在一些实施方案中，可以鉴定分子的在相似多肽中保守的残基和部分。在一些实施方案中，甚至对于生物活性或者结构重要的区域也可以进行保守氨基酸替代而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
此外，在一些实施方案中，本领域技术人员可以回顾鉴定相似多肽中对于活性或结构重要的残基的结构-功能研究。考虑到这种比较，在一些实施方案中，可以预测蛋白质中对应于在相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。在一些实施方案中，本领域技术人员可以为此类预测的重要氨基酸残基选择化学上相似的氨基酸替代。
在一些实施方案中，本领域技术人员还可以关于相似多肽中的结构分析三维结构和氨基酸序列。在一些实施方案中，考虑到这种信息，本领域技术人员可以预测抗体的氨基酸残基关于其三维结构的排列。在一些实施方案中，本领域技术人员可以选择不对预测位于蛋白质表面上的氨基酸残基进行根本改变，因为此类残基可能参与与其他分子的重要的相互作用。此外，在一些实施方案中，本领域技术人员可以产生测试变体，其在每个希望的氨基酸残基上含有一个氨基酸替代。在一些实施方案中，然后可以使用本领域技术人员已知的活性测定法筛选变体。在一些实施方案中，此类变体可以用于收集关于合适的变体的信息。例如，在一些实施方案中，如果发现对特定氨基酸残基的改变导致破坏的、不希望的降低的或者不合适的活性，那么可以避免具有此类改变的变体。换句话说，在一些实施方案中，基于从此类常规实验收集的信息，本领域技术人员可以容易确定这样的氨基酸，其中应该仅避免其他替代或者还避免其他突变。
许多科学出版物致力于预测二级结构。见，例如，Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)：422-427(1996)，Chou等人，Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou等人，Biochemistry，113(2)：211-222(1974)；Chou等人，Adv. Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，47：45-148(1978)；Chou等人，Ann.Rev. Biochem.，47：251-276和Chou等人，Biophys.J.，26：367-384(1979)。此外，当前，可以用计算机程序辅助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性建模。例如，具有大于30％的序列同一性或者大于40％的相似性的两个多肽或蛋白质通常具有相似的结构拓扑学。蛋白质结构数据库(PDB)的增长已经提供了对二级结构，包括多肽结构内潜在的折叠数的增强可预测性。见例如，Holm等人，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)。已经提出(Brenner等人，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))在给定多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠并且一旦确定了临界数目的结构，那么结构预测将变得明显更准确。
预测二级结构的其他方法包括″蛋白质结构预测线索法(threading)″(见例如，Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等人，Structure，4(1)：15-19(1996))，″模式分析(见例如，Bowie等人，Science，253：164-170(1991)；Gribskov等人，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)：4355-4358(1987))，和″进化连锁″(见例如，Holm等人，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)，和Brenner等人，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))。
在一些实施方案中，参考抗体的变体包括糖基化变体，其中已经相对于参考抗体的氨基酸序列改变了糖基化位点的数目和/或类型。在一些实施方案中，多肽的变体包含相对于天然多肽的或多或少数目的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征是序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中表示为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸外的任一氨基酸残基。为了产生该序列的氨基酸残基替代为另外的N-连接的糖链提供了潜在的新位点。备选地，除去该序列的替代将除去现有的N-连接的糖链。在一些实施方案中，提供了N-连接的糖链的重排，其中除去了一个或多个N-连接的糖基化位点(通常天然存在的)并且产生了一个或多个新的N-连接的位点。示例性抗体变体包括半胱氨酸变体，其中相对于参考抗体的氨基酸序列，缺失了一个或多个半胱氨酸残基或者用另一氨基酸(例如，丝氨酸)替代。在一些实施方案中，当抗体必须再折叠成生物活性构象时，如分离不溶性包含体后，半胱氨酸变体可以是有用的。在一些实施方案中，半胱氨酸变体具有比天然多肽更少的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，半胱氨酸变体具有偶数个半胱氨酸残基以使不配对半胱氨酸引起的相互作用最小化。
根据一些实施方案，氨基酸替代为这样的氨基酸替代：(1)减小对蛋白酶解的敏感性，(2)减小对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合体的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，和/或(4)对此类多肽赋予或者修饰其他理化或者功能性质。根据一些实施方案，可以在天然存在的序列(在一些实施方案中，在多肽的形成分子间接触的结构域外部分中)中进行单个或多个氨基酸替代(在一些实施方案中，保守氨基酸替代)。在一些实施方案中，保守氨基酸替代通常可以不实质改变参考序列的结构特征(例如，在一些实施方案中，置换氨基酸将不倾向于断裂在参考序列中存在的螺旋，或者破坏表征参考序列的其他类型的二级结构)。某些本领域中公知的多肽二级和三级结构的实例在例如Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，GarlandPublishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354：105(1991)中描述。
关于核酸序列，“百分比同一性”或者“％同一性”指使用Basic LocalAlignment Search Tool(BLAST)引擎，在比对的至少两个多核苷酸序列之间相同核苷酸的百分比。见Tatusova等人(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250。BLAST引擎(2.2.10版)由National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)，Bethesda，MD向公众提供。为了比对两个多核苷酸序列，使用“Blast 2 Sequences”工具，其使用“blastn”程序，使用如下的设置为默认值的参数：
矩阵(Matrix)：不可应用(not applicable)
匹配得分(Reward for match)：l
错配罚分：(Penalty for mismatch)：-2
打开缺口(Open gap)：5罚分
延伸缺口(Extension gap)：2罚分
Gap_x dropoff：50
期望值(Expect)：10.0
字长(Word size)：11
滤器(Filter)：打开(on)
关于多肽序列，“百分比同一性”或者“％同一性”指使用Basic LocalAlignment Search Tool(BLAST)引擎比对的至少两个多肽序列之间相同氨基酸的百分比。见Tatusova等人(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250。BLAST引擎(2.2.10版)由National Center for Biotechnology Information(NCBI)，Bethesda，MD向公众提供。为了比对两个多肽序列，使用“Blast 2Sequences”工具，其使用“blastp”程序，使用如下的设置为默认值的参数：
矩阵：BLOSUM62
打开缺口：11罚分
延伸缺口：1罚分
Gap_x dropoff：50
期望值：10.0
字长：3
滤器：打开
术语“有效剂量”或者“有效量”指导致患者中症状减轻或者导致希望的生物学结果的试剂，例如中和抗体的量。在一些实施方案中，有效剂量或者有效量足以减小ANGPTL4的至少一种活性。在一些实施方案中，如下V.G部分所述确定有效剂量或者有效量。
除非另外指出，术语“治疗”包括治疗和预防/防止性措施。需要治疗的那些包括但不限于，已经患有特定疾病或者病症的个体以及处于获得特定疾病或者病症的危险中的个体(例如，需要预防/防止性措施的那些)。术语“治疗”指为了治疗和/或预防/防止性目的，对患者施用试剂。
“治疗剂”指可以体内施用以引起治疗和/或预防/防止性效果的试剂。
“治疗抗体”指可以体内施用以引起治疗和/或预防/防止性效果的抗体。
术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”可以互换使用并且指基因组、cDNA或者合成来源的多核苷酸或者其某种组合。“分离的多核苷酸”(1)不与多核苷酸的全部或部分结合，其中该“分离的多核苷酸”见于自然界，(2)连接到它天然地不连接的多核苷酸，或(3)天然地，不作为更大的序列的部分存在。
B.天然抗体和某些抗体片段的结构
天然抗体通常具有四聚体结构。四聚体通常包含两个相同对的多肽链，每对具有一条轻链(在一些实施方案中，约25kDa)和一条重链(在一些实施方案中，约50-70kDa)。在天然抗体中，重链包含可变区VH，三个恒定区CH1、CH2和CH3。VH结构域在重链的氨基末端，CH3结构域在羧基末端。在天然抗体中，轻链包含可变区VL，和恒定区CL。轻链的可变区在轻链的氨基末端。在天然抗体中，每条轻/重链对的可变区通常形成抗原结合部位。恒定区通常负责效应子功能。
通常将天然人轻链分类成κ和λ轻链。天然人重链通常分类成μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有亚类，包括但不限于，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于，IgM1和IgM2。IgA具有亚类，包括但不限于，IgA1和IgA2。在天然人轻链和重链中，可变区和恒定区通常通过约12或者更多氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10或更多氨基酸的“D”区。见例如，Fundamental Immunology(1989)ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.)。
在天然抗体中，可变区通常显示出相同的一般结构，其中相对保守的构架区(FR)通过三个高变区连接，这些高变区也称作互补决定区(CDR)。来自每对的两条链的CDR通常与构架区排列，其可以使得结合特定表位。从N-末端到C-末端，轻链和重链可变区都通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链上的CDRs称作H1、H2和H3，而轻链上的CDRs通常称作L1、L2和L3。通常，CDR3是抗原结合部位中分子多样性的最大的来源。例如，在一些情况中，H3可以短至两个氨基酸残基或者大于26。通常根据Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Publication No.91-3242，vols.1-3，Bethesda，MD)；Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；或Chothia等人Nature 342：878-883(1989)的定义将氨基酸分配给每个结构域。在本申请中，除非另外指出，术语“CDR”指来自轻链或重链的CDR。
“Fab”片段包含一条轻链和一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab’”片段包含一条轻链和一条重链，该重链包含另外的恒定区，其在CH1和CH2结构域之间延伸。可以在Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成“F(ab’)2“分子。
“Fv”片段包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。单链Fv(scFv)片段包含重链和轻链可变区，它们通过柔性接头连接形成具有抗原结合区的一条多肽链。示例性单链抗体在WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论。在一些情况中，单链可变区(Fv的一半)可以具有识别并结合抗原的能力，尽管具有低于Fv的亲和力。
本文使用的术语“重链”指多肽，其包含足够的重链可变区序列以单独或者与轻链组合赋予抗原特异性。
本文使用的术语“轻链”指多肽，其包含足够的轻链可变区序列以单独或者与重链组合赋予抗原特异性。
C.某些抗体
在一些实施方案中，提供了特异结合ANGPTL4的单克隆抗体。在一些此类实施方案中，单克隆抗体是中和性单克隆抗体，其减小体内和/或体外ANGPTL4的至少一种活性。
在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体在体外ANGPTL4的存在下拯救了LPL活性。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体降低了体内至少一种血清脂质水平。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体降低了体内血清甘油三酯水平。在一些实施方案中，中和性单克隆抗体减少了体内总胆固醇水平。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体降低了体内游离脂肪酸(FFA)水平。
在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体在体内降低了LDLr敲除小鼠中的血清甘油三酯。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体在体内降低了LDLr敲除小鼠中的总胆固醇。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体在体内降低了ApoE敲除小鼠中的血清甘油三酯。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体在体内降低了ApoE敲除小鼠中的总胆固醇。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体在体内降低了db/db小鼠中血清甘油三酯。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体在体内降低了db/db小鼠中的总胆固醇。
在一些实施方案中，提供了特异结合小鼠ANGPTL4的中和性单克隆抗体。在一些实施方案中，提供了特异结合人ANGPTL4的中和性单克隆抗体。在一些实施方案中，提供了特异结合来自不同物种的ANGPTL4中相同表位的中和性单克隆抗体(即，显示出交叉反应性的抗体)。在一些此类实施方案中，所述抗体特异结合小鼠ANGPTL4和人ANGPTL4。
在一些实施方案中，提供了特异结合ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域内的表位的中和性单克隆抗体。在一些实施方案中，提供了特异结合小鼠ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域内的表位的中和性单克隆抗体。在一些实施方案中，中和性单克隆抗体特异结合小鼠ANGPTL4(SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：50)内从残基21到残基174的区域内表位。在一些实施方案中，提供了特异结合人ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域内的表位的中和性单克隆抗体。在一些实施方案中，中和性单克隆抗体特异结合人ANGPTL4(SEQ ID NO：2)内从残基21到残基169的区域内表位。
在一些实施方案中，中和性单克隆抗体是非人单克隆抗体。在一些此类实施方案中，中和性单克隆抗体是啮齿动物单克隆抗体。在一些此类实施方案中，中和性单克隆抗体是小鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，中和性单克隆抗体是嵌合单克隆抗体。在一些实施方案中，中和性单克隆抗体是人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，中和性单克隆抗体是人单克隆抗体。在一些实施方案中，嵌合的、人源化和/或人单克隆抗体用作人中的治疗抗体。
在一些实施方案中，中和性单克隆抗体是抗体片段。示例性抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、双抗体，和其他抗体片段。
提供了示例性中和性单克隆抗体，称作14D12、90B4和15F2。那些抗体结合小鼠ANGPTL4(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：50)的残基21到174内的表位。那些抗体也中和ANGPTL4活性。从而，将预期结合相同表位(例如，在人或者小鼠ANGPTL4中)的抗体也具有中和活性。某些抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体结合选自SEQ ID NOs：40到48的一种或多种肽。某些抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体结合选自SEQ ID NOs：40到43的一种或多种肽。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体结合具有SEQ ID NO：40的序列的肽。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体结合具有SEQ ID NO：41的序列的肽。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体结合具有SEQ ID NO：43的序列的肽。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的中和性单克隆抗体结合具有SEQ ID NO：41的序列的肽和具有SEQ ID NO：43的序列的肽。
在一些实施方案中，提供了与单克隆抗体14D12结合相同表位的中和性单克隆抗体。在一些实施方案中，提供了与单克隆抗体15F2结合相同表位的中和性单克隆抗体。在一些实施方案中，提供了与单克隆抗体90B4结合相同表位的中和性单克隆抗体。
某些中和抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO：12中给出的氨基酸序列。某些中和抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO：13中给出的氨基酸序列。某些中和抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO：14中给出的氨基酸序列。某些中和抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO：16中给出的氨基酸序列。某些中和抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO：17中给出的氨基酸序列。某些中和抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列。
某些中和抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：12中给出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO：16中给出的氨基酸序列。某些中和抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：13中给出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO：17中给出的氨基酸序列。某些中和抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：14中给出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列。
1.嵌合的和人源化单克隆抗体
在一些实施方案中，非人抗体是嵌合的。在一些实施方案中，特异结合人ANGPTL4的小鼠单克隆抗体是嵌合的。提供了制备嵌合抗体的某些示例性方法，例如在Morrison等人(1984)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA81：6851-6855；Neuberger等人(1984)Nature 312：604-608；Takeda等人(1985)Nature 314：452-454；和美国专利号6,075,181和5,877,397中提供。
在一些实施方案中，非人抗体是“人源化的”。在一些实施方案中，特异结合人ANGPTL4的小鼠单克隆抗体是人源化的。在一些实施方案中，针对小鼠ANGPTL4产生但是与人ANGPTL4特异结合(例如，交叉反应)的小鼠单克隆抗体是人源化的。在一些实施方案中，人源化抗体保留它们的结合特异性并且当施用于人时具有减小的免疫原性(例如，减小的人抗小鼠抗体(HAMA)应答)。在一些实施方案中，通过如下详述的包括但不限于CDR移植和人工程化的方法实现了人源化。
在人源化抗体的一些实施方案中，将来自具有理想的结合特异性的抗体(“供体”抗体)的轻链和重链可变区的一个或多个互补决定区(CDRs)移植到“受体”抗体中的人构架区(FRs)。示例性CDR移植在例如美国专利号6,180,370，5,693,762，5,693,761，5,585,089，和5,530,101；Queen等人(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033中描述。在一些实施方案中，将来自轻链和重链可变区的一个或多个CDRs移植到受体抗体的共有人FRs上。为了产生共有人FRs，在一些实施方案中，将来自几个人重链或轻链氨基酸序列的FRs进行比对以鉴定共有氨基酸序列。
在一些实施方案中，用来自供体抗体的FR氨基酸替换受体抗体中某些FR氨基酸。在一些此类实施方案中，来自供体抗体的FR氨基酸是促进供体抗体对靶抗原的亲和性的氨基酸。见，例如，美国专利号6,180,370，5,693,762，5,693,761，5,585,089，和5,530,101；Queen等人(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033。在一些实施方案中，用计算机程序对供体和/或受体抗体建模以鉴定可能涉及结合抗原和/或对抗原结合部位的结构有贡献的残基，从而辅助将在供体抗体中被替换的残基如FR残基的选择。
在一些实施方案中，将来自供体抗体的CDRs移植到包含人恒定区的受体抗体上。在一些此类实施方案中，还将FRs移植到受体上。在一些实施方案中，来自供体抗体的CDRs来自单链Fv抗体。在一些实施方案中，来自供体抗体的FRs来自单链Fv抗体。在一些实施方案中，进一步修饰(例如，通过氨基酸替代、缺失或插入)人源化抗体中移植的CDRs以增加该人源化抗体对靶抗原的亲和性。在一些实施方案中，进一步修饰(例如，通过氨基酸替代、缺失或插入)人源化抗体中移植的FRs以增加该人源化抗体对靶抗原的亲和性。
在一些实施方案中，可以用“人工程化”方法人源化非人抗体。见例如，美国专利号5,766,886和5,869,619。在人工程化的一些实施方案中，关于抗体可变结构域的结构的信息(例如，从晶体结构和/或分子建模得到的信息)用于评估可变区中的给定氨基酸残基(a)参与抗原结合，(b)暴露于抗体表面上(即，可接近溶剂)，或者(c)埋在抗体可变区内(即，参与保持可变区的结构)的可能性。此外，在一些实施方案中，产生人可变区共有序列来鉴定在人可变区中保守的残基。在一些实施方案中，该信息提供了关于是否应该替代非人抗体的可变区中氨基酸残基的教导。
某些中和性抗体包含重链，该重链包含14D12的CDR1、CDR2和CDR3。某些中和性抗体包含重链，该重链包含15F2的CDR1、CDR2和CDR3。某些中和性抗体包含重链，该重链包含90B4的CDR1、CDR2和CDR3。某些中和性抗体包含重链，该重链包含14D12的至少一个CDR。某些中和性抗体包含重链，该重链包含15F2的至少一个CDR。某些中和性抗体包含重链，该重链包含90B4的至少一个CDR。某些中和性抗体包含重链，该重链包含14D12的至少两个CDRs。某些中和性抗体包含重链，该重链包含15F2的至少两个CDRs。某些中和性抗体包含重链，该重链包含90B4的至少两个CDRs。
某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含14D12的CDR1、CDR2和CDR3。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含15F2的CDR1、CDR2和CDR3。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含90B4的CDR1、CDR2和CDR3。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含14D12的至少一个CDR。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含15F2的至少一个CDR。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含90B4的至少一个CDR。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含14D12的至少两个CDRs。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含15F2的至少两个CDRs。某些中和性抗体包含轻链，该轻链包含90B4的至少两个CDRs。
2.抗体同种型
在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体是选自IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE的任一同种型。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体是IgG同种型。在一些此类实施方案中，抗体是亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗体。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体是IgM同种型。在一些此类实施方案中，抗体是亚类IgM1或IgM2。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体是IgA同种型。在一些此类实施方案中，抗体是亚类IgA1或IgA2的抗体。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体包含人κ轻链和人IgG1或IgG2重链。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体包含小鼠κ轻链和小鼠IgG1或IgG2重链。
3.经修饰的抗体
在多种实施方案中，修饰抗体以改变它的一种或多种性质。在一些实施方案中，经修饰的抗体可以相对于未经修饰的抗体具有优点，如增加的稳定性、延长的循环时间，或者降低的免疫原性(见例如，美国专利号4,179,337)。在一些实施方案中，通过将抗体连接到非蛋白质部分对其修饰。在一些实施方案中，通过改变抗体的糖基化状态，如通过改变抗体上糖链的数目、类型、键和/或位置修饰该抗体。在一些实施方案中，改变抗体使得它不是糖基化的。
在一些实施方案中，将一个或多个化学部分连接到抗体的氨基酸主链和/或糖残基。将化学部分连接到抗体的某些示例性方法是本领域技术人员已知的。此类方法包括，但不限于，酰化反应或烷化反应。见例如，EP 0401384；Malik等人(1992)，Exp.Hematol.，20：1028-1035；Francis(1992)，Focus on Growth Factors，3(2)：4-10，Mediscript出版，Mountain Court，FriernBarnet Lane，London N20 OLD，UK；EP 0154316；EP 0401384；WO92/16221；WO 95/34326；WO 95/13312；WO 96/11953；WO 96/19459和WO96/19459。在一些实施方案中，用这些反应中任一种产生在它的氨基末端化学修饰的抗体。
在一些实施方案中，抗体连接到可检测的标记，如酶的、荧光的、同位素的或者亲和标记。在一些此类实施方案中，可检测的标记允许检测或分离抗体。在一些实施方案中，可检测的标记允许检测抗体结合的抗原。
在一些实施方案中，通过将抗体连接到一种或多种聚合物进行修饰。在一些实施方案中，抗体连接到一种或多种水溶性聚合物。在一些此类实施方案中，连接到水溶性聚合物减小了抗体将在水性环境如生理环境中沉淀的可能性。在一些实施方案中，将治疗性抗体连接到水溶性聚合物。在一些实施方案中，本领域技术人员可以基于如下考虑选择合适的水溶性聚合物，这些考虑包括但不限于，该聚合物/抗体缀合物是否将用于治疗患者，和如果是，该抗体的药理学模式(例如，半寿期、剂量、活性、抗原性和/或其他因素)。
某些示例性的临床上可接受的水溶性聚合物包括但不限于，聚乙二醇(PEG)；聚乙二醇丙醛；乙二醇/丙二醇的共聚物；单甲氧基-聚乙二醇；羧甲基纤维素；葡聚糖；聚乙烯醇(PVA)；聚乙烯吡咯烷酮；聚-1，3-二氧戊环；聚-1，3，6-三噁烷；乙烯/马来酸酐共聚物；聚-p-氨基酸(均聚物或者随机共聚物)；聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇；聚丙二醇均聚物(PPG)和其他聚环氧烷；聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物；聚氧乙烯化多元醇(POG)(例如，甘油)和其他聚氧乙烯化多元醇；聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、colonic酸或其他糖类聚合物；和聚蔗糖、葡聚糖或其混合物。某些示例性PEGs包括，但不限于本领域中已知用于抗体修饰的某些形式，如单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-PEG。在一些实施方案中，PEG丙醛由于其在水中的稳定性可以在生产中具有优点。
在一些实施方案中，水溶性聚合物为任一分子量。在一些实施方案中，水溶性聚合物为分枝或未分枝的。在一些实施方案中，水溶性聚合物具有约2kDa到约100kDa的平均分子量，包括该范围终点之间的所有点。在一些实施方案中，水溶性聚合物具有约5kDa到约40kDa的平均分子量。在一些实施方案中，水溶性聚合物具有约10kDa到约35kDa的平均分子量。在一些实施方案中，水溶性聚合物具有约15kDa到约30kDa的平均分子量。
在一些实施方案中，抗体连接到PEG(即，抗体被“PEG化”)。在多种实施方案中，PEG在哺乳动物中具有低毒性。见Carpenter等人(1971)Toxicol.Appl.Pharmacol.，18，35-40。值得注意的是，腺苷脱氨酶的PEG加合物在美国被批准用于人类治疗重度联合免疫缺陷综合征。在多种实施方案中，PEG可以减小抗体的免疫原性。例如，在一些实施方案中，PEG与具有非人序列的抗体的连接当施用于人时可以降低抗体的抗原性。
在一些实施方案中，将聚合物连接到抗体中的一个或多个反应性氨基酸残基。一些示例性反应性氨基酸残基包括，但不限于，氨基末端氨基酸的α氨基、赖氨酸侧链的ε氨基、半胱氨酸侧链的巯基、天冬氨酰和谷氨酰侧链的羧基、羧基末端氨基酸的α羧基、酪氨酸侧链和连接到某些天冬酰胺、丝氨酸或者苏氨酸残基的活化的糖基链。适于指导与蛋白质的定向反应的PEG的某些示例性活化形式(“PEG试剂”)是本领域技术人员已知的。例如，在一些实施方案中，适于连接到氨基的PEG试剂包括，但不限于，羧酸的活性酯或者PEG的碳酸酯衍生物，例如，其中离去基团为N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、咪唑或者1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸酯的碳酸酯衍生物。在一些实施方案中，含有马来酰亚胺基或者卤代乙酰基的PEG试剂用于修饰巯基。在一些实施方案中，含有氨基、肼基和/或酰肼基的PEG试剂可以用于与通过蛋白质中糖基的高碘酸盐氧化产生的醛反应。
在一些实施方案中，水溶性聚合物具有至少一个反应基。在一些实施方案中，通过将水溶性聚合物与活化基团反应产生水溶性聚合物如PEG的活化衍生物。在一些实施方案中，活化基团可以是单功能的、双功能的或者多功能的。可以用于将水溶性聚合物连接到两个或多个抗体的某些示例性活化基团包括，但不限于下面的基团：砜(例如，氯代砜、乙烯砜和二乙烯砜)、马来酰亚胺、巯基、硫羟、triflate、tresylate、azidirine、环氧乙烷和5-吡啶基。在一些实施方案中，PEG衍生物通常在约11或者更小的pH的水性环境下在长时期内对水解稳定。在一些实施方案中，连接到另一分子如抗体的PEG衍生物赋予该分子对水解的稳定性。一些示例性同双功能PEG衍生物包括，但不限于，PEG-二-氯代砜和PEG-二-乙烯砜(见WO 95/13312)。
D.制备单克隆抗体的一些方法
1.一些杂交瘤方法
在一些实施方案中，通过标准技术产生单克隆抗体。在一些实施方案中，通过基于杂交瘤的方法产生单克隆抗体。一些此类方法是本领域技术人员已知的。见例如，Kohler等人(1975)Nature256：495-497；Harlow andLane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual Ch.6(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)。在一些此类实施方案中，用免疫原免疫合适的动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、猴或者其他哺乳动物以产生分泌抗体的细胞。在一些实施方案中，分泌抗体的细胞是B细胞，如淋巴细胞或脾细胞。在一些实施方案中，在体外免疫淋巴细胞(例如，人淋巴细胞)以产生分泌抗体的细胞。见例如，Borreback等人(1988)Proc.Nat’l Acad. Sci.USA 85：3995-3999。
在一些实施方案中，将分泌抗体的细胞与“永生化”细胞系，如骨髓型细胞系融合，以产生杂交瘤细胞。在一些实施方案中，例如，通过ELISA鉴定了产生所希望的抗体的杂交瘤细胞。在一些实施方案中，然后可以使用标准方法亚克隆此类细胞并培养。在一些实施方案中，还可以在合适的动物宿主中在体内作为腹水肿瘤培养此类细胞。在一些实施方案中，使用标准分离步骤，如亲和层析从杂交瘤培养基、血清或者腹水分离单克隆抗体。产生根据一些实施方案的杂交瘤和纯化单克隆抗体的指导例如在Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual Ch.8(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)中提供。
在一些实施方案中，通过用免疫原免疫遗传改变的小鼠产生小鼠单克隆抗体。在一些此类实施方案中，小鼠是ANGPTL4缺陷小鼠，其部分或者完全缺乏ANGPTL4功能。在一些此类实施方案中，小鼠是“敲除”小鼠，其缺少编码ANGPTL4的基因的全部或部分。在一些实施方案中，用小鼠ANGPTL4免疫此类敲除小鼠。在一些实施方案中，用人ANGPTL4免疫此类敲除小鼠。
在一些实施方案中，在能够产生人抗体的转基因动物(例如，小鼠)中产生人单克隆抗体。见例如，美国专利号6,075,181A和6,114,598A；和WO 98/24893A2。例如，在一些实施方案中，将人免疫球蛋白基因引入(例如，使用酵母人工染色体、人染色体片段或者种系整合)其中内源Ig基因已经失活的小鼠中。见例如，Jakobovits等人(1993)Nature 362：255-258；Tomizuka等人(2000)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 97：722-727；和Mendez等人(1997)Nat.Genet.15：146-156(描述转基因小鼠的XenoMouse II品系)。
在一些实施方案中，用免疫原免疫此类转基因小鼠。在一些此类实施方案中，得到来自小鼠的表达抗体的淋巴细胞(如B细胞)。在一些此类实施方案中，将此类回收的细胞与“永生化”的细胞系，如骨髓型细胞系融合，以产生杂交瘤细胞。在一些此类实施方案中，筛选和选择杂交瘤细胞以鉴定产生对目的抗原特异的抗体的那些。适于产生人单克隆抗体的一些示例性方法和转基因小鼠在例如Jakobovits等人(1993)Nature362：255-258；Jakobovits(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6：561-566；Lonberg等人(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93；Fishwild等人(1996)Nat. Biotechnol.14：845-851；Mendez等人(1997)Nat.Genet.15：146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 231：11-23；Tomizuka等人(2000)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 97：722-727中描述；在Little等人(2000)Immunol.Today21：364-370和WO 98/24893中综述。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的人单克隆抗体适于用作治疗抗体。见下面的部分V.G.。
2.某些基于展示的方法
在一些实施方案中，使用基于展示的方法，如例如下述任一种方法产生人单克隆抗体。
在一些实施方案中，使用噬菌体展示技术产生人单克隆抗体。一些示例性抗体噬菌体展示方法是本领域技术人员已知的，并且例如在Hoogenboom，Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications，from Methods in Molecular Biology：Antibody Phage Display： Methods and Protocols(2002)178：1-37(O’Brien和Aitken，eds.，Human Press，Totowa，NJ)中描述。例如，在一些实施方案中，在丝状噬菌体、如非裂解性丝状噬菌体fd或M13的表面上展示抗体文库。在一些实施方案中，抗体是抗体片段，如scFvs、Fabs、Fvs，其具有工程化的分子间二硫键以稳定VH-VL对，和双抗体。在一些实施方案中，接着可以选择具有希望的结合特异性的抗体。在下面进一步描述抗体噬菌体展示方法的一些示例性实施方案。
在一些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的一些方法制备抗体噬菌体展示文库。见例如，Hoogenboom，Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications，from Methods in Molecular Biology：Antibody Phage Display：Methods and Protocols(2002)178：1-37(O’Brien and Aitken，eds.，Human Press，Totowa，NJ)。在一些实施方案中，通过从分泌抗体的细胞的mRNA衍生的基因组DNA或者cDNA的PCR扩增，制备可变基因所有组成成分。例如，在一些实施方案中，从B细胞的mRNA制备cDNA。在一些实施方案中，例如，通过PCR扩增编码重链和轻链的可变区的cDNA。
在一些实施方案中，将重链cDNA和轻链cDNA克隆到合适的载体中。在一些实施方案中，重链cDNA和轻链cDNA在克隆过程中随机组合，从而导致编码多种scFvs或Fabs的cDNA文库的装配。在一些实施方案中，重链cDNA和轻链cDNA在克隆到合适的载体前连接。在一些实施方案中，重链cDNA和轻链cDNA通过逐步克隆到合适的载体中连接。
在一些实施方案中，将cDNA克隆到噬菌体展示载体，如噬菌粒载体中。一些示例性噬菌粒载体，如pCES1，是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，将编码重链和轻链的cDNA呈递在相同载体上。例如，在一些实施方案中，将编码scFvs的cDNA与编码小噬菌体外壳蛋白pIII的基因III的全部或者部分克隆在框内。在一些此类实施方案中，噬菌粒指导scFv-pIII融合物在噬菌体表面的表达。备选地，在一些实施方案中，将编码重链(或轻链)的cDNA与基因III的全部或者部分一起克隆在框内，并将编码轻链(或重链)的cDNA克隆在相同载体中信号序列的下游。该信号序列指导轻链(或重链)在宿主细胞的周质中的表达，其中重链和轻链装配成Fab片段。备选地，在一些实施方案中，编码重链的cDNA和编码轻链的cDNA存在于不同的载体上。在一些此类实施方案中，分别克隆重链和轻链cDNA，一种克隆到噬菌粒中，另一种克隆到噬菌体载体中，其都含有用于体内重组到宿主细胞的信号。
在一些实施方案中，将重组噬菌粒或者噬菌体载体引入合适的细菌宿主，如大肠杆菌(E.coli)中。在一些实施方案中，使用噬菌粒，用辅助噬菌体感染宿主以提供噬菌体结构蛋白，从而允许携带抗体-pIII融合蛋白的噬菌体颗粒在噬菌体表面表达。
在一些实施方案中，使用在体外重排的可变基因的所有组成成分构建“合成的”抗体文库。例如，在一些实施方案中，使用PCR随机组合编码重链或轻链的各基因区段(分别为V-D-J或V-J)。在一些此类实施方案中，通过易错PCR，向CDRs和可能地FRs中引入另外的序列多样性。在一些此类实施方案中，向CDR3，例如，重链的H3中引入另外的序列多样性。
在一些实施方案中，使用来自未免疫的动物的核酸，如上述构建“幼稚”或者“通用的”噬菌体展示文库。在一些实施方案中，未免疫的动物是人。在一些实施方案中，使用来自经免疫的动物的核酸，如上述构建“免疫的”噬菌体展示文库。在一些实施方案中，经免疫的动物是人、大鼠、小鼠、仓鼠或者猴。在一些此类实施方案中，用下述免疫原的任一种免疫动物。
一些示例性通用人抗体噬菌体展示文库可以从商业来源得到。一些示例性文库包括，但不限于，来自MorphoSys AG(Martinstreid/Munich，Germany)的HuCAL系列文库；使用MAbstract技术的来自Crucell(Leiden，the Netherlands)的文库；来自BioInvent(Lund，Sweden)的n-CoDeRTM Fab文库；和可从Cambridge Antibody Technology(Cambridge，UK)得到的文库。
在一些实施方案中，通过连续淘选步骤实现从噬菌体展示文库选择具有希望的结合特异性的抗体。在淘选的一些实施方案中，将文库噬菌体制备物暴露于抗原。在一些此类实施方案中，洗涤噬菌体-抗原复合体，并丢弃未结合的噬菌体。在一些此类实施方案中，回收结合的噬菌体并随后通过感染大肠杆菌扩增。在一些此类实施方案中，可以通过挑选单个噬菌斑克隆产生单克隆抗体的噬菌体。在一些实施方案中，重复上述方法。
在一些实施方案中，淘选中使用的抗原是下述免疫原的任一种。在一些实施方案中，将抗原固定到固相支持体以允许通过亲和层析纯化结合抗原的噬菌体。在一些实施方案中，将抗原生物素化，从而允许使用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠分离结合的噬菌体与未结合的噬菌体。在一些实施方案中，可以将抗原固定在细胞(用于直接淘选)上、在组织细胞切片中，或者在膜上(例如，尼龙膜或者硝化纤维素)。本领域技术人员可以常规地确定一些淘选步骤的其他变通方案。
在一些实施方案中，用酵母展示系统产生单克隆抗体。在一些此类系统中，将抗体表达为具有酵母AGA2蛋白的全部或者部分的融合蛋白，其在酵母细胞壁的表面上展示。在一些此类实施方案中，然后通过将细胞暴露于荧光标记的抗原，可以鉴定表达具有所希望的结合特异性的抗体的酵母细胞。在一些此类实施方案中，然后通过流式细胞术分离结合抗原的酵母细胞。见例如，Boder等人(1997)Nat.Biotechnol.15：553-557。
3.一些亲和力成熟方法
在一些实施方案中，通过在体外将抗体进行亲和力成熟(或者“定向进化”)，增加抗体对特定抗原的亲和性。在体内，天然抗体通过体细胞高度突变接着通过选择进行亲和力成熟。一些体外方法模拟该体内过程，从而允许产生具有等于或者超过天然抗体的亲和性的抗体。
在亲和力成熟的一些实施方案中，将突变引入编码具有希望的结合特异性的抗体的可变区的核酸序列。见例如，Hudson等人(2003)Nature Med.9：129-134；Brekke等人(2002)Nature Reviews 2：52-62。在一些实施方案中，将突变引入重链、轻链或者两者的可变区中。在一些实施方案中，将突变引入一个或多个CDRs中。在一些此类实施方案中，将突变引入H3、L3或者两者中。在一些实施方案中，将突变引入一个或多个FRs中。在一些实施方案中，例如，在噬菌体、核糖体或者酵母展示文库中产生突变文库，从而，可以通过标准筛选方法鉴定具有增强的亲和性的抗体。见例如，Boder等人(2000)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 97：10701-10705；Foote等人(2000)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 97：10679-10681；Hoogenboom，Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications，from Methods in Molecular Biology：Antibody Phage Display：Methods and Protocols(2002)178：1-37(O’Brien和Aitken，eds.，Human Press，Totowa，NJ)；和Hanes等人(1998)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95：14130-14135。
在一些实施方案中，基于抗体的结构，如抗原结合部位的信息，通过位点特异性诱变引入突变。在一些实施方案中，使用组合的CDRs诱变引入突变。在一些实施方案中，例如，使用大肠杆菌突变细胞、同源基因重排或者易错PCR，随机诱变可变区编码序列的全部或者部分。在一些实施方案中，使用“DNA改组”引入突变。见例如，Crameri等人(1996)Nature Med.2：100-102；Fermer等人(2004)Tumor Biology25：7-13。
在一些实施方案中，用“链改组”产生具有增加的亲和性的抗体。在链改组的一些实施方案中，见一条链，如轻链，用轻链的所有组成成分替换，而另一条链，如重链不变，从而提供特异性。在一些此类实施方案中，产生链改组抗体的文库，其中未改变的重链与来自轻链所有组成成分的每条轻链组合表达。在一些实施方案中，然后对此类文库筛选具有增加的亲和性的抗体。在一些实施方案中，顺序替换重链和轻链。在一些实施方案中，仅仅替换重链和/或轻链的可变区。在一些实施方案中，仅仅替换重链和/或轻链的可变区的一部分，如CDR。见例如，Hudson等人(2003)Nature Med.9：129-134；Brekke等人(2002)Nature Reviews 2：52-62；Kang等人(1991)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA88：11120-11123；Marks等人(1992)Biotechnology 10：779-83。
在一些实施方案中，对特异结合人ANGPTL4的小鼠单克隆抗体(包括，但不限于，针对小鼠ANGPTL4产生但是特异结合(即，交叉反应)人ANGPTL4的小鼠单克隆抗体)进行连续的链改组。在一些实施方案中，例如，将给定小鼠单克隆抗体的重链与人轻链的新的所有组成成分组合，并选择具有希望的亲和性的抗体。在一些此类实施方案中，然后将所选抗体的轻链与人重链的新的所有组成成分组合，并选择具有希望的亲和性的抗体。从而，在一些实施方案中，选择具有所希望的抗原结合特异性和亲和性的人抗体。
备选地，在一些实施方案中，将给定小鼠单克隆抗体的重链与人轻链的新的所有组成成分组合，并从该第一轮改组选择具有希望的亲和性的抗体。在一些实施方案中，将最初的小鼠单克隆抗体的轻链与人重链的新的所有组成成分组合，并从该第二轮改组选择具有希望的亲和性的抗体。在一些实施方案中，从第一轮改组中选择的抗体的人轻链然后与第二轮改组中选择的抗体的人重链组合。从而，在一些实施方案中，选择具有希望的抗原结合特异性和亲和性的人抗体。
在一些实施方案中，使用“核糖体展示”方法，其交替进行抗体选择和亲和力成熟。在核糖体展示方法的一些实施方案中，在选择步骤之间通过RT-PCR扩增编码抗体的核酸。从而，在一些实施方案中，可以用易错聚合酶向核酸中引入突变。此类方法的非限制性实例在Hanes等人(1998)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：14130-14135中详细描述。
4.一些重组方法
在一些实施方案中，通过重组技术产生单克隆抗体。见例如，美国专利号4,816,567。在一些此类实施方案中，克隆编码单克隆抗体链的核酸并在合适的宿主细胞中表达。例如，在一些实施方案中，使用标准方法，可以从表达希望的抗体的细胞，如成熟B细胞或杂交瘤细胞制备RNA。在一些实施方案中，然后使用标准方法，可以用RNA制备cDNA。在一些实施方案中，例如，使用特定寡核苷酸引物，通过PCR扩增编码重链或者轻链多肽的cDNA。在一些实施方案中，将cDNA克隆到合适的表达载体中。在一些实施方案中，然后将表达载体转化或者转染到合适的宿主细胞，如不内源性产生抗体的宿主细胞中。一些示例性宿主细胞包括，但不限于，大肠杆菌、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、和骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，其中重链和轻链在相同宿主中共表达，可以分离重建的抗体。
在一些实施方案中，可以修饰编码重链或轻链的cDNA。例如，在一些实施方案中，可以将小鼠重链或轻链的恒定区用人重链或轻链的恒定区替换。以这种方式，在一些实施方案中，产生嵌合抗体，其具有人抗体恒定区，但是保留小鼠抗体的结合特异性。
在一些实施方案中，可以在一些细胞系中表达重组抗体。在一些实施方案中，编码特定抗体的序列可以用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。根据一些实施方案，可以通过用于向宿主细胞中引入多核苷酸的任一种已知方法进行转化。一些示例性方法，包括，但不限于，在病毒(或者向病毒载体中)包装多核苷酸并用病毒(或者载体)转导宿主细胞，和使用本领域中已知的一些转染方法，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455示例。在一些实施方案中，使用的转化方法可以依赖于转化的宿主。用于向哺乳动物细胞引入异源多核苷酸的一些示例性方法是本领域中已知的，并且包括但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包裹、和直接显微注射DNA到细胞核中。
可用作表达宿主的一些示例性哺乳动物细胞系是本领域中已知的并且包括，但不限于，可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的许多永生化细胞系，包括，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)，和许多其他细胞系。在一些实施方案中，通过确定哪些细胞系产生高水平的特异结合ANGPTL4的抗体，可以选择细胞系。
E一些多肽免疫原
在一些实施方案中，为了产生抗体，用免疫原免疫动物。在一些实施方案中，免疫原是包含ANGPTL4的多肽。在一些实施方案中，免疫原是包含ANGPTL4的片段的多肽。在一些实施方案中，免疫原是包含ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域的多肽。
在一些实施方案中，免疫原包含小鼠ANGPTL4。在一些实施方案中，免疫原包含小鼠ANGPTL4，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原包含小鼠ANGPTL4，包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原包含小鼠ANGPTL4的片段。在一些实施方案中，免疫原包含SEQ ID NO：1的从残基21到残基174的片段。在一些实施方案中，免疫原包含SEQ ID NO：50的从残基21到残基174的片段。在一些实施方案中，免疫原包含SEQ ID NO：1的从残基21到残基174的约10-20个连续氨基酸的任一肽。在一些实施方案中，免疫原包含SEQ ID NO：50的从残基21到残基174的约10-20个连续氨基酸的任一肽。在一些实施方案中，免疫原包含选自SEQ ID NOs：40到48任一种的肽。在一些实施方案中，免疫原包含选自SEQ ID NOs：40、41、42和43的肽。在一些实施方案中，免疫原包含肽，该肽包含选自SEQ ID NOs：40、41、42和43的一种或多种氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原包含肽，该肽包含SEQ ID NOs：41、42和43。在一些此类实施方案中，选择可能是免疫原性的肽。在一些此类实施方案中，选择预测为亲水的和/或可能暴露于折叠状态的天然小鼠ANGPTL4表面上的肽。选择合适的免疫原性肽的示例性指导在例如Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology Ch.11.14(John Wiley&Sons，NY)；and Harlow and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual Ch.5(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)中提供。
本领域技术人员已知一些示例性算法用于预测蛋白质的肽片段是否为亲水的并且因此可能暴露于蛋白质的表面上。一些此类算法使用蛋白质的一级序列信息进行这种预测。一些此类算法基于例如，Hopp和Woods(1981)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA78：3824-3828，或Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157：105-132的方法。本领域技术人员已知一些示例性算法用于基于蛋白质的一级氨基酸序列预测蛋白质的二级结构。见例如，Corrigan等人(1982)Comput.Programs Biomed.3：163-168。一些此类算法基于例如Chou和Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem.47：25-276的方法。在一些实施方案中，预测形成β转角并因此可能暴露于蛋白质的表面的肽区段可以被选择作为免疫原。
在一些实施方案中，免疫原包含人ANGPTL4。在一些实施方案中，免疫原包含人ANGPTL4，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原包含SEQ ID NO：2的从残基21到残基169的片段。在一些实施方案中，免疫原包含SEQ ID NO：2的从残基21到残基169的约10-20个连续氨基酸的任一肽。在一些此类实施方案中，选择可能为免疫原性的肽。在一些此类实施方案中，选择被预测为亲水的和/或可能暴露于天然折叠状态的人ANGPTL4表面上的肽。选择合适的免疫原性肽的示例性指导在例如Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology Ch.11.14(John Wiley & Sons，NY)；和Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual Ch.5(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)中提供。
在一些实施方案中，用免疫原和一种或多种佐剂免疫动物。在一些实施方案中，取决于宿主种类，用佐剂增强免疫应答。一些示例性佐剂包括，但不限于弗氏佐剂(完全和不完全的)、矿物盐，如氢氧化铝或者磷酸铝、表面活性物质、壳聚糖、溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、和潜在有用的人佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)。在一些实施方案中，通过将免疫原偶联到另一免疫原性分子或者“载体蛋白”，增强对免疫原例如肽免疫原的免疫应答。一些示例性载体蛋白包括，但不限于，匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风毒素、白喉类毒素、卵清蛋白、霍乱类毒素、和其免疫原性片段。关于将肽免疫原偶联到载体蛋白的示例性教导，见例如，Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology Ch.11.15(John Wiley&Sons，NY)；和Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual Ch.5(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
在一些实施方案中，使用标准重组方法可以产生上述免疫原的任一种。例如，在一些实施方案中，可以将编码小鼠或者人ANGPTL4的多核苷酸或者该多核苷酸的片段克隆到合适的表达载体中。在一些实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核酸序列。在一些实施方案中，然后将重组载体引入合适的宿主细胞。在一些实施方案中，通过标准方法从宿主细胞分离多肽。关于重组蛋白质表达的一些示例性方法，见例如，Ausubel等人(1991)Current Protocols in Molecular Biology Ch.16(John Wiley&Sons，NY)。
F.一些测定法
1.一些结合测定法
在一些实施方案中，使用检测抗体与抗原结合的一些常规方法，筛选抗体对ANGPTL4的结合。例如，在一些实施方案中，通过标准免疫印迹方法，如蛋白质印迹，测定单克隆抗体结合ANGPTL4的能力。见例如，Ausubel等人(1992)Current Protocols in Molecular Biology Ch.10.8(JohnWiley & Sons，NY)；Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。在一些实施方案中，将用于此类测定法中的ANGPTL4可以是分离的或者可以存在于蛋白质和/或大分子的复杂混合物中。
在一些实施方案中，使用竞争结合测定法测定单克隆抗体结合ANGPTL4的能力，该测定法评价候选抗体与已知的抗ANGPTL4抗体竞争结合ANGPTL4的能力。在一些此类实施方案中，已知的抗ANGPTL4抗体是下面部分VI.J中描述的单克隆抗体的任一种。在一些实施方案中，使用ELISA进行竞争性结合测定。见例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual Ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
在一些实施方案中，用结合测定法定量抗ANGPTL4的抗体的结合动力学(例如，速率常数)或者结合亲和性(例如，结合或者解离常数)。在一些实施方案中，通过将抗原(例如，ANGPTL4)固定在固相支持体上，在“固相”中确定结合动力学或者亲和性。固定的抗原从溶液中“捕获”抗体。在一些实施方案中，通过将抗体(例如，抗ANGPTL4的抗体)固定在固相支持体上，在“固相”中确定结合动力学或者亲和性。固定的抗体从溶液中“捕获”抗原。
在一些实施方案中，使用基于ELISA的方法确定结合动力学或者结合亲和性。在一些实施方案中，使用基于生物传感器的技术，如Biacore表面等离子体共振技术(Biacore，Piscataway，NJ)，确定结合动力学或者结合亲和性。一些此类方法是本领域技术人员已知的。见例如，McCafferty等人(eds.)(1996)Antibody Engineering：A Practical Approach(IRL，Oxford，UK)；Goldberg等人(1993)Curr.Opin.Immunol.5：278-281；Karlsson等人(1991)J.Immunol.Methods 145：229-240；Malmqvist(1993)Curr.Opin. Immunol.5：282-286；综述见Hoogenboom，Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications，from Methods in Molecular Biology：Antibody Phage Display：Methods and Protocols(2002)178：1-37at 19(O’Brien和Aitken，eds.，Human Press，Totowa，NJ)。
在一些实施方案中，确定特异结合ANGPTL4的Fab片段的结合动力学或者结合亲和性。在一些实例中，Fab片段具有不多聚化的性质。在一些实例中，多聚化可以使得“固相”方法中的结合动力学和结合亲和性的测量复杂化。见例如，Hoogenboom，Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications，from Methods in Molecular Biology： Antibody Phage Display：Methods and Protocols(2002)178：1-37 at 19(O’Brie和Aitken，eds.，Human Press，Totowa，NJ)。从而，在一些实施方案中，特异结合ANGPTL4的Fab片段适于用于其中抗原固定在固相支持体上的结合测定法，如例如基于ELISA的测定法或者Biacore测定法。在一些实施方案中，使用酶促方法，从特异结合ANGPTL4的完整抗体产生Fab片段。在一些实施方案中，通过在重组表达系统，如上面部分V.D.3中描述的重组表达系统中表达编码Fab片段的核酸产生Fab片段。
在一些实施方案中，使用“溶液相”方法测定抗体对ANGPTL4的结合动力学或者结合亲和性。在这些方法中，在溶液中测量抗体-抗原复合体的结合动力学或结合亲和性。此类方法是本领域技术人员已知的。这种方法的非限制性实例是“动力学排除测定法”，或者“KinExA”。见例如，Blake等人(1996)J.Biol.Chem.271：27677-27685；Drake等人(2004)Anal. Biochem.328：35-43(比较Biacore“固相”和KinExA“溶液相”方法)。在一些实施方案中，由Sapidyne Instruments，Inc.(Boise，ID)提供了进行KinExA的仪器。
在一些实施方案中，使用溶液相方法确定多价抗体或者多聚化抗体的结合动力学或者结合亲和性。在一些实例中，多价抗体或者多聚化抗体的结合动力学或者结合亲和性的测量适合于溶液相分析。
在一些实施方案中，如通过其KD测量的，抗ANGPTL4抗体的结合亲和性为约10-6M或更小。在一些实施方案中，抗ANGPTL4抗体的结合亲和性为约10-7M、约10-8M或约10-9M或更小。在一些此类实施方案中，抗ANGPTL4抗体可以用作治疗抗体。见例如，Hudson等人(2003)Nature Med.9：129-134。在一些实施方案中，例如，使用亲和力成熟技术，可以实现小于10-9M的结合亲和性(例如，约500pM到约0.5pM的结合亲和性，包括但不限于，约100pM到约5pM的结合亲和性)。见例如，Boder等人(2000)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 97：10701-10705。
在一些实施方案中，对针对小鼠ANGPTL4产生的单克隆抗体的使用一些常规检测方法，如诸如本文描述的方法筛选对人ANGPTL4的特异结合。单克隆抗体结合小鼠和人ANGPTL4(即，表现“交叉反应性”)的能力表明在小鼠和人ANGPTL4中存在相同表位。在使用变性条件的检测方法(如蛋白质印迹)的一些实施方案中，交叉反应性表明小鼠单克隆抗体结合小鼠和人ANGPTL4中相同的“线性”表位。在使用非变性条件的检测方法的一些实施方案中，交叉反应性表明小鼠单克隆抗体结合小鼠和人ANGPTL4中相同的表位(例如，线性表位或构象表位)。
2.表位作图的一些方法
在多种实施方案中，通过多种测定法的任一种鉴定单克隆抗体结合的表位。一些示例性测定法例如在例如Morris，Methods in Molecular Biology Vol.66：Epitope Mapping Protocols(1996)(Humana Press，Totowa，NJ)中描述。例如，通过基因片段表达测定法或者基于肽的测定法可以实现表位作图。在基因片段表达测定法的一些实施方案中，例如，在原核细胞中表达编码ANGPTL4的片段的核酸并且分离。在一些此类实施方案中，然后例如，通过免疫沉淀或免疫印迹评估单克隆抗体结合这些片段的能力。在一些实施方案中，在放射性氨基酸的存在下，在体外转录和翻译编码ANGPTL4的片段的核酸。然后测试ANGPTL4的放射性标记的片段对单克隆抗体的结合。在一些实施方案中，通过蛋白酶解片段化产生ANGPTL4的片段。在一些实施方案中，使用在噬菌体或酵母表面上展示的随机肽的文库鉴定表位。在一些实施方案中，通过测试ANGPTL4的重叠的合成肽片段的文库对单克隆抗体的结合，鉴定表位。在一些实施方案中，使用如下文描述的竞争测定法鉴定表位。
3.一些竞争测定法
在一些实施方案中，鉴定与目的单克隆抗体结合ANGPTL4的相同表位的单克隆抗体。在一些实施方案中，通过例如上述的表位作图鉴定此类单克隆抗体。在一些实施方案中，通过常规竞争测定法鉴定此类单克隆抗体。见例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。在非限制性示例性竞争测定法中，将ANGPTL4或者其片段固定到多孔板的孔中。在一些此类实施方案中，通过标准方法用荧光标记(在一些实施方案中，异硫氰酸荧光素)标记目的单克隆抗体。在一些此类实施方案中，向孔中加入标记的目的单克隆抗体和未标记的测试单克隆抗体的混合物。在一些此类实施方案中，定量每孔中的荧光以确定未标记的测试单克隆抗体阻断标记的目的单克隆抗体的结合的程度。在一些实施方案中，如果每种单克隆抗体阻断另一单克隆抗体的结合达50％或者以上，那么认为这些单克隆抗体共有一个表位。示例性竞争性测定法还在例如Morris，Methods in Molecular Biology Vol.66：Epitope Mapping Protocols(1996)(Humana Press，Totowa，NJ)中描述。非限制性示例性竞争测定法在下面的部分VI.O中提供。
4.用于鉴定中和抗体的一些测定法
在一些实施方案中，对单克隆抗体筛选中和抗体，即在体内和/或体外降低ANGPTL4的活性的抗体。在一些实施方案中，ANGPTL4的活性是ANGPTL4抑制LPL的能力。从而，在一些实施方案中，通过在ANGPTL4存在下，中和抗体增加LPL的活性的能力来鉴定中和抗体。在一些此类实施方案中，相对于对照抗体，中和抗体增加LPL活性至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。分别在下面的部分VI.D.和VI.I中提供体内和体外测量LPL活性的一些示例性测定法。
在一些实施方案中，在体内减小ANGPTL4的活性的中和抗体通过它降低至少一种血清脂质的水平的能力来鉴定。一些示例性血清脂质包括，但不限于，甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸。在一些此类实施方案中，相对于对照抗体，中和抗体降低至少一种血清脂质的水平至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在体内减小ANGPTL4的活性的中和抗体通过它抵消或者赋予对含有脂肪饮食的某些影响的保护的能力来鉴定。一些示例性效果包括，但不限于，体重增加、肥胖症、葡萄糖不耐性(高血糖症)、胰岛素不敏感性(高胰岛素血症)、肝脏脂肪变性(脂肪肝)、和肌细胞内脂质积累。测量此类效果的一些示例性测定法在下面的部分VI.C.、VI.E.和VI.F.中提供。
G.一些药物组合物和使用中和性单克隆抗体的治疗方法
在一些实施方案中，中和抗体可以用作治疗抗体。将用作治疗抗体的一些示例性中和抗体包括，但不限于，嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。本领域技术人员熟悉此类抗体作为治疗剂的用途。例如，从20世纪80年代中期以来FDA已经批准了十二种以上的抗体用作治疗剂。见例如，Hudson等人(2003)Nature Med.9：129-134；Gura(2002)Nature 417：584-586；Brekke等人(2002)Nature Reviews 2：52-62。一些FDA批准的抗体包括用于治疗多种癌症、炎症和病毒感染和预防移植物排斥的抗体。见，例如，Gura(2002)Nature 417：584-586；Brekke等人(2002)Nature Reviews2：52-62。此外，十二种以上的抗体当前正处于临床试验中。见例如，Brekke等人(2002)Nature Reviews 2：52-62。
在一些实施方案中，提供了治疗脂质代谢病症的方法，其包括施用有效量的抗ANGPTL4的中和抗体。在一些实施方案中，提供了治疗脂质代谢的急性病症的方法，其包括施用有效量的抗ANGPTL4的中和抗体。在一些实施方案中，提供了治疗脂质代谢的慢性病症的方法，其包括施用有效量的抗ANGPTL4的中和抗体。
如本文使用的，“脂质代谢的病症”包括，但不限于，可以导致继发性高脂血症(包括高甘油三酯血症和高胆固醇血症)的病症。脂质代谢的一些示例性病症包括，但不限于，动脉粥样硬化、血脂障碍、高甘油三酯血症(包括药物诱导的高甘油三酯血症、利尿剂诱导的高甘油三酯血症、酒精诱导的高甘油三酯血症、β-肾上腺素能阻滞剂诱导的高甘油三酯血症、雌激素诱导的高甘油三酯血症、糖皮质激素诱导的高甘油三酯血症、类视黄醇诱导的高甘油三酯血症、西咪替丁诱导的高甘油三酯血症、和家族性高甘油三酯血症)、与高甘油三酯血症有关的急性胰腺炎、乳糜微粒综合征、乳糜微粒血症、Apo-E不足、LPL不足或者低活性、高脂血症(包括家族性复合高脂血症)、高胆固醇血症、与高胆固醇血症相关的痛风、黄瘤病(皮下胆固醇沉积)、冠状动脉病(也称作缺血性心脏病)、与冠状动脉病相关的炎症、再狭窄、外周血管病，和中风。脂质代谢的一些示例性病症包括，但不限于，与体重相关的病症，如肥胖症、代谢综合征，包括代谢综合征的独立组分(例如，向心性肥胖症、FBG/前驱糖尿病/糖尿病/高胆固醇血症、高甘油三酯血症和高血压)、甲状腺功能减退、尿毒症和与体重增加有关的其他状况(包括快速体重增加)、体重减轻、体重减轻的维持、或者体重减轻后体重再次增加的危险。脂质代谢的一些示例性病症包括，但不限于，相关的血糖病症，如糖尿病、高血压和与胰岛素耐受性相关的多囊卵巢综合征。脂质代谢的一些示例性病症包括，但不限于，肾脏移植、肾病综合征、库欣综合征、肢端肥大症、系统性红斑狼疮、血内球蛋白异常、脂质营养不良、I型糖原病和艾迪生病。
脂质代谢的病症包括，但不限于，继发性高甘油三酯血症(HTG，包括但不限于I、V和IV型)，包括但不限于由于饮食引起的HTG(包括，但不限于，过量酒精摄入、体重增加和肥胖症)、药物(包括但不限于，外源雌激素、他莫昔芬、类视黄醇、噻嗪类、氯噻酮、β-阻滞剂、蛋白酶抑制剂(包括但不限于利托那韦)、异丙酚输注和肠胃外脂质输注)引起的HTG，代谢病症(包括但不限于，糖尿病、妊娠、慢性肾衰竭、甲状腺功能减退、家族性高脂血症和胰腺炎)。
脂质代谢的病症包括，但不限于，与血管通路功能异常有关的脂质病症、与增生性疾病包括但不限于，瘤形成(包括但不限于，前列腺癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌)有关的脂质异常，响应炎症发生的病症，包括但不限于，与例如感染性疾病、伤口愈合、免疫缺陷综合征(艾滋病和其他疾病，包括但不限于与异常发育有关的那些综合征)、瘢痕形成、动脉粥样硬化、再狭窄和移植排斥有关的病症、自身免疫病和慢性炎性疾病和病症，其包括但不限于，包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮的疾病和病症，包括但不限于局限性回肠炎、结肠炎、炎性肠病、反应性关节炎、包括莱姆病、依赖胰岛素的糖尿病、器官特异性自身免疫、多发性硬化、桥本甲状腺炎和格雷夫斯病、斯耶格伦综合征、接触性皮炎、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病、结节病、疟疾、脓毒病、胰腺炎、特应性状况，包括但不限于哮喘和变态反应，包括但不限于，变应性鼻炎、胃肠道变态反应，包括但不限于，食物变态反应、嗜酸粒细胞增多、结膜炎和肾小球肾炎、血液凝固病症、内毒素性休克和其他炎症介导的病症，如睡眠性呼吸暂停和嗜睡。
在一些实施方案中，提供了治疗脂质代谢病症的方法，其包括施用有效量的抗ANGPTL4的抗体和另一种治疗剂。在一些此类实施方案中，以有效量施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗ANGPTL4的另一抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是非抗体剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是降低一种或多种血清脂质的水平的试剂。一些示例性的另外治疗剂包括，但不限于，胆固醇合成抑制剂(他汀类药物)，如HMG-CoA还原酶抑制剂(如洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀和氟伐地汀)；胆汁螯合剂，如消胆胺和其他树脂；VLDL分泌抑制剂，如烟酸；脂蛋白脂肪酶刺激剂，如fibric acid衍生物；亲脂性抗氧化剂，如普罗布考；酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶抑制剂；法尼醇X受体拮抗剂；甾醇调节性结合蛋白切割激活蛋白(SCAP)激活物；微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂；和ApoE相关肽。在一些实施方案中，另外的治疗剂是升高高密度脂蛋白(HDL)的治疗剂。此类治疗剂的非限制性实例包括，但不限于，胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂。
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含有效量的抗ANGPTL4的抗体和药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含有效量的抗ANGPTL4的抗体和有效量的至少一种另外的治疗剂，以及药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂选自如上述的那些治疗剂。
在一些实施方案中，药物组合物的配制材料在使用的剂量和浓度下对受者是无毒的。
在一些实施方案中，药物组合物包含用于修饰、保持或者维持例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或者释放速率、吸附或者渗透的配制材料。在一些实施方案中，合适的配制材料包括，但不限于，氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如，硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐和其他有机酸)；膨胀剂(例如，甘露醇和甘氨酸)；螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖、二糖和其他糖类(例如，葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如，苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢)；溶剂(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如，甘露醇和山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或者增湿剂(例如，泊洛沙姆、PEG、山梨醇酯、聚山梨酯(例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80)、triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇和四丁酚醛)；稳定性增强剂(例如，蔗糖和山梨醇)；张力增强剂(例如，碱金属卤化物(例如，氯化钠或钾)、甘露醇和山梨醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂；和药物佐剂(Pemington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company(1990)。
在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体或者其他治疗分子连接到延长半寿期的载体。一些示例性延长半寿期的载体是本领域中已知的。一些此类载体包括，但不限于，Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。一些此类载体描述于例如公布的PCR申请号WO 99/25044中。
在一些实施方案中，本领域技术人员将根据，例如预期的施用途径、递送形式和希望的剂量确定最佳的药物组合物。见例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，如上文。在一些实施方案中，此类组合物可以影响中和抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率、或者体内清除速率。
在一些实施方案中，药物组合物中的初级载体的性质可以是水性或非水性的。例如，在一些实施方案中，合适的载体可以是注射用水、生理盐溶液或者人工脑脊液，可能补充肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。一些示例性载体包括，但不限于，中性缓冲盐水和与血清白蛋白混合的盐水。在一些实施方案中，药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液，或者约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可以还包括山梨醇或者其合适的替代物。在一些实施方案中，包含针对ANGPTL4的抗体与或不与至少一种另外的治疗剂的组合物可以如下制备用于保存：将所选的具有所希望的纯度的组合物与任选的配制试剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，上文)以冻干饼或者水溶液的形式混合。在一些实施方案中，包含针对ANGPTL4的抗体与或不与至少一种另外的治疗剂的组合物可以用合适的赋形剂如蔗糖配制成冻干物。
在一些实施方案中，选择药物组合物用于肠胃外递送。在一些实施方案中，选择药物组合物用于吸入或者通过消化道如经口递送。用于制备药用组合物的一些示例性技术在本领域技术人员能力之内。
在一些实施方案中，制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。在一些实施方案中，用缓冲剂保持组合物在生理pH或者稍低的pH，通常在约5到约8的pH范围内。
在一些实施方案中，当预期肠胃外施用时，药物组合物可以是无致热原的、肠胃外可接受的水溶液，其可在药用载体中包含希望的针对ANGPTL4的抗体，与或者不与另外的治疗剂。在一些实施方案中，用于肠胃外注射的载体是无菌蒸馏水，其中抗ANGPTL4的抗体，与或者不与至少一种另外的治疗剂配制为无菌的等渗溶液，适当保存。在一些实施方案中，制备可以包括配制所希望的分子与试剂，如可注射的微球、可生物蚀解的颗粒、聚合物化合物(如聚乳酸或者聚乙醇酸)、珠或者脂质体，其可以提供产品的控释或者缓释，该产品可以接着通过长效制剂注射递送。在一些实施方案中，还可以使用透明质酸，其可以具有促进循环中延长的持续时间的作用。在一些实施方案中，可以用可植入的药物递送装置引入希望的分子。
在一些实施方案中，可以配制药物组合物用于吸入。在一些实施方案中，抗ANGPTL4的抗体，与或者不与至少一种另外的治疗剂可以配制为用于吸入的干燥粉剂。在一些实施方案中，包含抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂的吸入溶液可以与用于气溶胶递送的推进剂配制。在一些实施方案中，可以雾化溶液。
在一些实施方案中，可以经口施用制剂。在一些实施方案中，以这种方式施用的抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂可以与或不与通常用于调剂固体剂型如片剂和胶囊剂的载体配制。在一些实施方案中，可以将胶囊剂设计成在胃肠道中生物利用率最大化并且系统前降解最小的时候释放制剂的活性部分。在一些实施方案中，可以包括至少一种另外的试剂以方便抗ANGPTL4的抗体与或者不与任何一种另外的治疗剂的吸收。在一些实施方案中，还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和/或粘合剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂，其与适于生产片剂的无毒赋形剂混合。在一些实施方案中，通过将片剂溶解在无菌水，或者另一种合适的载体中，可以以单位剂型制备溶液剂。一些示例性赋形剂包括，但不限于，惰性稀释剂(例如，碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠、乳糖和磷酸钙)；粘合剂(例如，淀粉、明胶和阿拉伯胶)；和润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸和滑石粉)。
另外的药物组合物将是本领域技术人员已知的，包括在持续或受控递送剂型中包含抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂的制剂。一些示例性缓释或控制递送剂型包括，但不限于，脂质体载体、可生物蚀解的微粒、多孔珠、和长效注射剂。用于制备某些剂型的一些示例性技术是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，缓释制剂可以包括成形物品，例如薄膜或者微囊剂形式的半透性聚合物基质。一些示例性缓释基质包括，但不限于，聚酯、水凝胶、聚交酯(见例如，美国专利号3,773,919和EP 058,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(见例如，Sidman等人(1983)Biopolymers 22：547-556)、聚(2-羟乙基-异丁烯酸)(见例如，Langer等人(1981)J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer(1982)Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，上文)，和聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。在一些实施方案中，缓释组合物可以包括脂质体，其可以在一些实施方案中，通过本领域中已知的方法的任一种制备。见例如，Eppstein等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692；EP 036,676；EP 088,046；和EP 143,949。
在一些实施方案中，将用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在一些实施方案中，这可以通过无菌滤膜过滤来完成。在一些实施方案中，当冻干组合物时，使用该方法除菌可以在冻干和重构之前或之后进行。在一些实施方案中，用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或者溶液保存。在一些实施方案中，通常将肠胃外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有塞子的静脉内溶液包或者瓶子中，通过皮下注射针头可以刺穿塞子。
在一些实施方案中，一旦已经配制了药物组合物，就可以将它作为溶液剂、混悬剂、凝胶剂、乳剂、固体或者作为脱水或者冻干的粉剂保存在无菌瓶中。在一些实施方案中，这种制剂可以以即用的形式或者以施用前重构的形式(例如，冻干的形式)保存。
在一些实施方案中，提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以每种含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在一些实施方案中，包括含有单个或多个腔的预先填充的注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
在一些实施方案中，将治疗使用的包含抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂的药物组合物的有效量将取决于例如治疗的背景和目的。本领域技术人员将明白根据一些实施方案，用于治疗的合适的剂量水平将从而部分随着递送的分子、与或者不与至少一种另外的治疗剂的抗ANGPTL4抗体所适用的适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或者器官大小)和/或状况(年龄和一般健康)而变。在一些实施方案中，临床医生可以确定剂量和修改施用途径以得到最佳的治疗效果。在一些实施方案中，典型的剂量可以为约0.1μg/kg患者体重，高达约100mg/kg或以上，这取决于上述因子。在一些实施方案中，剂量可以为0.1μg/kg到高达约100mg/kg；1μg/kg到高达约100mg/kg；或5μg/kg到高达约100mg/kg，包括任一个前面端点之间的所有点(包括分数)。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg体重到约60mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg体重、约20mg/kg体重、约30mg/kg体重、约40mg/kg体重、约50mg/kg体重，或约60mg/kg体重。
在一些实施方案中，可以基于动物研究，如例如下文在部分VI.P、R和T到Y中提供的动物研究，确定合适的剂量。
在一些实施方案中，给药频率将考虑所用的制剂中针对ANGPTL4的抗体和如果适用，任一另外的治疗剂的药物代谢动力学参数。在一些实施方案中，临床医生将施用该组合物直到剂量达到实现希望的效果的剂量。在一些实施方案中，组合物可以因此作为单次剂量或者作为两次或者多次剂量(其可以含有或不含有相同量的希望的分子)随时间施用，或者通过植入装置或者导管作为连续输注施用。在一些实施方案中，对合适剂量的进一步完善通过本领域技术人员常规地进行并且在他们进行的常规任务的范围内。在一些实施方案中，通过使用合适的剂量反应数据，可以确定合适的剂量。在一些实施方案中，患者接受一剂包含抗ANGPTL4抗体的药物组合物。在一些实施方案中，患者每天接受1、2、3或者4剂包含抗ANGPTL4抗体的药物组合物。在一些实施方案中，患者每周接受1、2、3、4、5或6剂包含抗ANGPTL4抗体的药物组合物。在一些实施方案中，患者每月接受1或2剂包含抗ANGPTL4抗体的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物的施用途径是按照已知的方法，例如，经口、通过静脉内注射、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、肝门内或者损伤内途径；通过缓释系统或者通过植入装置。在一些实施方案中，可以通过快速浓注或者通过连续输注或者通过植入装置施用组合物。
在一些实施方案中，可以通过已经吸收或者包裹了目的分子的膜、海绵或者另一合适的材料的植入，局部施用组合物。在一些实施方案中，当使用植入装置时，可以将该装置植入任一合适的组织或者器官中，并且可以通过扩散、定时释放的丸剂或者连续施用递送目的分子。
在一些实施方案中，可以希望以离体方式使用包含抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂的药物组合物。在一些此类实例中，已经从患者除去的细胞、组织和/或器官接触包含抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂的药物组合物，之后将该细胞、组织和/或器官植入回到患者体内。
在一些实施方案中，通过植入某些细胞递送抗ANGPTL4的抗体与或者不与至少一种另外的治疗剂，所述细胞已经用如上述的方法进行基因工程改造，以表达和分泌所述多肽。在一些实施方案中，此类细胞可以是动物或者人细胞，并且可以是自体的、异源的或者异基因的。在一些实施方案中，细胞可以是永生化的。在一些实施方案中，为了减小免疫应答的机会，可以将细胞包裹以避免周围组织的浸润。在一些实施方案中，包裹材料通常是生物相容的、半透性聚合物包裹物或者膜，其允许蛋白质产物的释放，但是阻止患者免疫系统或者来自周围组织的其他有害因子对细胞的破坏。
H.一些检测和诊断方法
在一些实施方案中，用抗ANGPTL4的抗体在体内或体外检测ANGPTL4的存在。在一些实施方案中，体内ANGPTL4的水平与医学状况，如脂质代谢的疾病相关，从而允许诊断该医学状况。可以通过抗ANGPTL4的抗体诊断的一些示例性医学状况在上面给出。
一些示例性检测方法是本领域中已知的并且包括，但不限于，ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、蛋白质印迹、免疫荧光、和免疫沉淀。在一些实施方案中，修饰抗ANGPTL4的抗体使得它们可以例如，通过将抗体连接到标记而直接检测。一些示例性标记包括，但不限于，荧光团、生色团、放射性原子、密电子试剂、酶和配体。在一些实施方案中，使用结合一类抗体的经标记的“次级”抗体(例如，山羊抗小鼠抗体)检测抗ANGPTL4的抗体。
I.针对ANGPTL4拮抗剂和激动剂的一些筛选方法
在一些实施方案中，提供了结合ANGPTL4的试剂的筛选方法。在一些实施方案中，筛选方法包括将ANGPTL4在合适条件下暴露于一种或多种候选试剂，并评估ANGPTL4与该一种或多种候选试剂的结合。在一些实施方案中，筛选方法包括在竞争性结合测定中使用抗ANGPTL4的抗体。在一些此类实施方案中，使用包含抗ANGPTL4的抗体和ANGPTL4的第一结合混合物。测量第一结合混合物中ANGPTL4和抗体之间结合的量(M0)。还使用第二结合混合物，其包含抗体、ANGPTL4和将筛选的试剂。测量第二结合混合物中ANGPTL4和抗体之间结合的量(M1)。例如通过计算M1/M0的比率，比较第一结合混合物中结合的量和第二结合混合物中结合的量。如果第二结合混合物中抗ANGPTL4的抗体的结合量小于第一结合混合物中抗ANGPTL4的抗体的结合量，那么认为试剂能够结合ANGPTL4。在一些实施方案中，结合ANGPTL4的试剂将抗体与ANGPTL4的结合降低了至少约10％(即，M1/M0＜0.9)、至少约30％(即，M1/M0＜0.7)、至少约50％(即，M1/M0＜0.5)、至少约70％(即，M1/M0＜0.3)、至少约80％(即，M1/M0＜0.2)、至少约90％(即，M1/M0＜0.1)或至少约95％(即，M1/M0＜0.05)。
在一些实施方案中，将用于上述筛选方法任一种中的ANGPTL4是ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域或者其片段。基于申请人的观察，即结合在ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域内的一些抗体具有中和活性(见下面的部分VI.L.和VI.P.)，通过筛选方法鉴定为结合ANGPTL4的N-末端卷曲螺旋结构域的试剂(例如，抗体或者非抗体试剂)是ANGPTL4活性的候选拮抗剂。在一些实施方案中，拮抗剂活性通过如下验证：证明候选拮抗剂在体内或体外测定，如部分VI.D和VI.I中描述的测定中中和ANGPTL4。在一些实施方案中，ANGPTL4的拮抗剂用于治疗脂质代谢病症。
在一些实施方案中，提供了筛选结合ANGPTL4的血纤蛋白原结构域的试剂的方法。基于申请人的观察，即结合在ANGPTL4的血纤蛋白原结构域的抗体(6G11)增强ANGPTL4活性(见部分VI.L.，VI.P)，通过筛选方法鉴定为结合ANGPTL4的血纤蛋白原结构域的试剂(例如，抗体或者非抗体试剂)是ANGPTL4活性的候选激动剂。在一些实施方案中，激动剂活性通过如下验证：阐明候选激动剂在体外测定、如部分VI.I.中描述的测定中增强ANGPTL4，或者通过在体内施用候选激动剂并测试一种或多种血清脂质的升高的水平。在一些实施方案中，ANGPTL4的激动剂用于治疗与过量体重减轻有关的一些病症，如神经性厌食症、神经性贪食症和与疾病如癌症、囊性纤维病和艾滋病相关的恶病质(消瘦)。
可以筛选对ANGPTL4的结合的一些示例性试剂包括，但不限于，抗体、小分子(例如，有机化合物、有机金属化合物、有机化合物和有机金属化合物的盐、糖类、氨基酸、核苷、和核苷酸)、适体、肽和肽模拟物。一些示例性肽包括可溶性肽，其包括但不限于，随机肽文库的成员(见例如，Lam等人(1991)Nature 354：82-84；Houghten等人(1991)Nature354：84-86)和由D-和/或L-构型氨基酸组成的组合化学衍生的分子文库的成员；和磷酸肽，其包括，但不限于，随机或者部分简并的定向磷酸肽文库的成员(见例如，Songyang(1993)Cell 72：767-778)。
在一些实施方案中，计算机建模和检索技术允许鉴定结合ANGPTL4的化合物，或者改进已经鉴定的化合物。一些示例性分子建模系统包括，但不限于，CHARMM和QUANTA程序(Polygen Corporation，Waltham，MA)。CHARMM执行能量最小化和分子动力学函数。QUANTA执行分子结构的构建、图形建模和分析。QUANTA允许相互作用构建、修饰、可视化和分析分子相互的行为。
J.ANGPTL4的核酸拮抗剂
在一些实施方案中，提供了降低编码ANGPTL4的核酸的表达的分离的核酸。在一些实施方案中，编码ANGPTL4的核酸编码小鼠ANGPTL4。在一些实施方案中，编码ANGPTL4的核酸编码人ANGPTL4。在一些实施方案中，分离的核酸是反义核酸。在一些此类实施方案中，反义核酸是单链DNA分子，其通过基于RNA酶H的机理促进靶mRNA的降解。在一些实施方案中，反义核酸是长约8-30个(包括端点之间的所有点)核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，反义核酸是约18-26个核苷酸长度的寡核苷酸。
在一些实施方案中，反义核酸包含RNA分子，其通过基于RNA干扰(RNAi)的机理降低靶核酸的表达。适于RNAi的一些示例性RNA分子包括，但不限于，短干扰RNA(siRNAs)、微RNA(mRNAs)、小的非编码RNA(tncRNAs)和小调节RNA(smRNA)。关于一些示例性RNAi机理和用于RNAi中的RNA分子的综述，见例如，Novina等人(2004)Nature430：161-164。
在一些实施方案中，提供了降低编码ANGPTL4的核酸的表达的siRNA。在一些实施方案中，siRNA是长约18-26个(包括端点之间的所有点)核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，siRNA是长约20-24个核苷酸的寡核苷酸，或者长约21-23个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，siRNA是双链RNA。在一些实施方案中，siRNA将诱导与该siRNA的反义链互补的靶mRNA分子的降解。见例如，Novina等人(2004)Nature430：161-164。
反义核酸，如反义DNA分子或者siRNA的活性通常受到靶mRNA的二级结构的影响。见例如，Vickers等人(2003)J.Biol.Chem.278：7108-7118。从而，在一些实施方案中，选择与靶mRNA的可以用于碱基配对的区域互补的反义核酸。在一些实施方案中，通过进行“基因步移(gene walk)”，例如，通过经验测试许多反义寡核苷酸与沿着靶mRNA的多个区域杂交和/或减小靶mRNA表达的能力，鉴定靶mRNA的合适区域。见例如，Vickers等人(2003)J.Biol.Chem.278：7108-7118；Hill等人(1999)Am.J. Respir.Cell Mol.Biol.21：728-737。在一些实施方案中，使用mRNA二级结构预测程序或者相关的算法鉴定不与靶mRNA的任何其他区域杂交的靶mRNA的区域，鉴定靶mRNA的合适区域。见例如，Hill等人(1999)Am. J.Respir.Cell Mol.Biol.21：728-737。在一些实施方案中，上面两种方法组合用于鉴定靶mRNA的合适区域。见例如，Hill等人(1999)Am.J.Respir. Cell Mol.Biol.21：728-737。
在一些实施方案中，提供了通过减小编码ANGPTL4的核酸的表达，减小ANGPTL4活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括在体外或体内减小细胞中编码ANGPTL4的核酸的表达。在一些实施方案中，该方法包括在体外或体内对细胞施用减小编码ANGPTL4的核酸的表达的反义核酸。在一些实施方案中，编码ANGPTL4的核酸编码人ANGPTL4。在一些实施方案中，编码ANGPTL4的核酸编码小鼠ANGPTL4。
在一些实施方案中，提供了治疗脂质代谢的疾病的方法，如上述任一种方法(部分V.G.)。在一些实施方案中，该方法包括对患者施用有效量的减小编码ANGPTL4的核酸的表达的反义核酸。在一些实施方案中，将反义核酸递送到表达编码ANGPTL4的核酸的器官。一些研究已经表明在禁食条件下，在肝脏、脑垂体或脂肪组织中ANGPTL4被诱导。Ge等人(2004)J.Lipid Res.45：2071-2079。从而，在一些实施方案中，将反义核酸递送到肝脏、脑垂体或脂肪组织中。例如，在Khan等人(2004)J.Drug Targeting12：393-404中提供了体内施用反义核酸和持续体内递送反义核酸，包括持续递送到特定器官如肝脏的一些示例性教导。在一些实施方案中，通过施用被包裹或者包含在生物可降解的聚合物中的反义核酸，实现持续递送。例如，在一些实施方案中，反义核酸可以包含在聚(乙醇酸)(PLGA)微球体(例如，0.5-20μm；3000MW)内。在一些实施方案中，反义核酸缀合到亲脂部分。见Khan等人(2004)J.Drug Targeting 12：393-404。
VI.实施例
A.小鼠照料和饮食研究
根据联邦政府的指导进行小鼠研究。将小鼠饲养在24℃下固定12小时光/12小时暗周期并且随意获得水和啮齿动物标准饮食(chow)(22％卡路里来自脂肪)(产品号5001；Purina，St.Louis，MO)或者高脂肪食物(60％卡路里来自脂肪)(产品号D12492；Research Diets，New Brunswick，NJ.)，如下述。喂饲HFD的小鼠从4-5周龄以上接受该食物。在下文中称作“禁食状态”的小鼠被剥夺食物16小时。
B.导致高脂血症的ANGPTL4的体内过表达
1.小鼠ANGPTL4的过表达
将编码全长小鼠ANGPTL4(SEQ ID NO：1)的cDNA插入到腺病毒载体pFAD的Ad E1缺失的区域中，从而将cDNA置于巨细胞病毒启动子的控制下。见Hitt等人，“Construction and propagation of human adenovirusvectors，”in Cell Biology：A Laboratory Handbook Vol.1，pp.500-512(J.E.Celis，ed.，2nd ed.1998)。得到的构建体Ad5-mAngptl-4T用于感染CHO细胞。作为对照，将编码β-半乳糖苷酶的cDNA插入到腺病毒载体pFAD的Ad E1缺失区中，从而将cDNA置于巨细胞病毒启动子控制下。将所得构建体Ad5-β-gal也用于感染CHO细胞。通过受感染的CHO细胞提取物的蛋白质印迹证实小鼠ANGPTL4cDNA或者β-半乳糖苷酶cDNA的表达。
将Ad5-mAngptl-4T或Ad5-β-gal通过尾静脉以5×1010vp注射到C57BL/6J小鼠中。在感染后不同的时间点从腺病毒感染的小鼠收集血样。使用Cobas Integra 500(Roche，Basel，Switzerland)测量血清中甘油三酯和胆固醇水平。使用NEFA C试剂盒(99475409，Wako，Richmond，VA)测量血清中游离脂肪酸(FFA)水平。
如图1A、1B和1C中所示，注射Ad5-mAngptl-4T(实心正方形)的小鼠相对于注射Ad5-β-gal(空心正方形)的对照小鼠显示出甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸(FFA)的升高的禁食血清水平。具体地，Ad5-mAngptl-4T注射的小鼠中甘油三酯和FFA的禁食血清水平在注射后两天内增加并且在4天后达到峰值(图1A和1C)。在第4天，相对于对照小鼠，在注射Ad5-mAngptl-4T的小鼠中，甘油三酯增加约18倍，FFA增加约9倍。相对于对照小鼠，在注射Ad5-mAngptl-4的小鼠中，总胆固醇的禁食血清水平也显著升高(图1B)。在图2和3中还显示了注射Ad5-mAngptl-4T或Ad5-β-gal后3天的禁食血清甘油三酯和胆固醇水平。
2.人ANGPTL4的过表达
为了确定人ANGPTL4对小鼠的影响，在野生型小鼠中过表达人ANGPTL4。将编码全长人ANGPTL4(SEQ ID NO：2)的cDNA插入腺病毒载体pFAD的Ad E1缺失的区域中，从而将cDNA置于巨细胞病毒启动子控制下。将所得的构建体Ad5-hAngptl4T或对照构建体Ad5-β-gal以5×1010vp注射到C57BL/6J小鼠的尾静脉中。注射后4天测量血清中甘油三酯和胆固醇水平。如图4和5中所示，相对于对照构建体，人ANGPTL4显著升高禁食血糖甘油三酯和胆固醇水平。在该研究中，人ANGPTL4对小鼠中葡萄糖水平没有影响。(数据未显示)。这些结果表明人ANGPTL4能够与小鼠ANGPTL4相似地升高小鼠中禁食血清脂质水平。
C.Angptl4敲除小鼠具有降低的血清脂质水平
“敲除”小鼠中的Angptl4以确定ANGPTL4的缺乏是否对血清脂质水平具有与ANGPTL4的过表达相反的作用(即，确定ANGPTL4的缺乏是否降低血清脂质水平)。为了敲除小鼠中的Angptl4，将具有插入Angptl4基因座的逆转录病毒的ES细胞克隆注射到C57BL/6-Tyrc-Brd宿主胚泡。见Zambrowicz等人(1998)Nature 392：608-611。产生嵌合小鼠并与C57BL/6-Tyrc-Brd小鼠育种。得到的Angptl4+/-后代品种间杂交产生Angptl4-/-小鼠。通过定量斑点印迹(Bio-Rad，Hercules，CA)确定尾DNA的基因型，使用新霉素磷酸转移酶基因片段和含有鼠Csk基因(MMU05247)的外显子1的片段作为探针分别检测病毒整合和单拷贝内源基因。
如图29中所示，敲除小鼠具有适度降低的存活力。此外，发现一些幼仔在断奶前具有膨胀的腹部和肠淋巴管扩张症。
此外，喂饲高脂肪饮食(HFD)的敲除小鼠比喂饲HFD的野生型小鼠具有更低的存活率。见图30。发现一些死亡的敲除小鼠具有膨胀的腹部，并且发现一些在它们的肠系膜淋巴结中具有慢性炎症和/或充满脂质的巨噬细胞。此外，发现一些小鼠具有膨胀的淋巴管。
为了评估Angptl4不足对喂饲标准(“chow”)饮食的小鼠中血清脂质水平的影响，检查了敲除小鼠和野生型小鼠的喂饲和禁食状态中血清甘油三酯和胆固醇水平。结果在图6中显示(“n”表示使用的小鼠数目)。禁食状态下，敲除小鼠(“HOM”)中血清甘油三酯水平比禁食状态下野生型小鼠中血清甘油三酯水平低70％(图6A)。禁食状态下，敲除小鼠中总的血清胆固醇水平和游离脂肪酸(FFA)水平也显著低于禁食状态下野生型小鼠中总的血清胆固醇水平和游离脂肪酸(FFA)水平(图6B和6C)。
图25，小图A显示了喂饲标准(“chow”)饮食的雄性野生型、杂合和敲除小鼠中禁食血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平。该实验中，杂合雄性小鼠中禁食血清甘油三酯水平比野生型雄性小鼠低41％。该实验中，敲除雄性小鼠中禁食血清甘油三酯水平比野生型雄性小鼠低59％。该实验中，杂合和敲除雄性小鼠中禁食总胆固醇水平比野生型雄性小鼠中分别低10％和21％。
图25，小图B显示了喂饲标准(“chow”)饮食的雌性野生型和敲除小鼠中禁食血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平。该实验中，敲除的雌性小鼠中禁食血清甘油三酯水平比野生型雌性小鼠低27％。该实验中，敲除雌性小鼠中禁食总胆固醇水平比雌性野生型雄性小鼠低33％。该实验中，雌性敲除小鼠中禁食HDL水平比雌性野生型小鼠中低31％。
还检查了Angptl4不足对具有饮食诱导的肥胖症(DIO)的敲除的和野生型小鼠中血清脂质水平的影响。对敲除小鼠和野生型小鼠喂饲高脂肪饮食(HFD)以诱导DIO。然后检查喂饲和禁食状态下那些小鼠中的血清脂质水平。如图6A和6B中所示，在喂饲和禁食状态下，敲除小鼠中血清甘油三酯和总胆固醇水平都显著降低。此外在禁食状态下，敲除小鼠中FFA水平也显著降低。见图6C。
图26显示了喂饲高脂肪饮食(HFD)的野生型和敲除雄性小鼠中禁食血清甘油三酯、总胆固醇、HDL和LDL水平。在该实验中，喂饲HFD饮食的敲除雄性小鼠中禁食血清甘油三酯水平比喂饲HFD的野生型小鼠低77％。在该实验中，喂饲HFD饮食的敲除雄性小鼠中禁食总胆固醇水平比喂饲HFD的野生型小鼠中低35％。
此外，敲除小鼠在很大程度上受到保护而免于DIO。与标准饮食的野生型小鼠相比，喂饲HFD的野生型小鼠产生显著的肥胖。见图7A和7B。然而，对于喂饲标准的或者HFD的Angptl4敲除小鼠，体重增长和体脂肪增长显著减小。见图7A-7D。减小的体重主要归因于体脂肪量的减少而不是瘦体重的减少。
图27，小图A，显示了喂饲高脂肪饮食(HFD)的雄性野生型(“WT”)和敲除(“Hom”)小鼠中体脂肪的总克数。喂饲HFD的敲除雄性小鼠比喂饲HFD的野生型雄性小鼠具有显著较低的体脂肪。图27，小图B显示了喂饲HFD的雌性野生型(“WT”)和敲除(“Hom”)小鼠中，体脂肪随时间的总克数。该实验表明与喂饲HFD的雌性野生型小鼠相比，喂饲HFD的雌性敲除小鼠中向更低的体脂肪发展的趋势。
喂饲HFD的雄性敲除小鼠具有与喂饲HFD的雄性野生型小鼠相似的食物摄入。见图28，小图A。喂饲HFD的雄性敲除小鼠也具有与喂饲HFD的雄性野生型小鼠相似水平的粪便中脂肪含量。见图28，小图B。
总之，这些结果表明Angptl4不足降低了血清脂质并赋予抗肥胖症的保护。
D.Angptl4敲除小鼠在禁食状态不显示出降低的脂肪细胞LPL活性
检查了来自喂饲和禁食状态下野生型和敲除小鼠的脂肪组织(附睾脂肪垫组织)中内源LPL活性。使用Kinematica匀浆器在冰预冷的匀浆缓冲液(0.025M NH3(pH 8.2)，BSA 1mg/ml，5mM EDTA，肝素5IU/ml，和蛋白酶抑制剂混合物)中匀浆组织样品(0.3-1.0g)。在4℃以3,000g离心10分钟后，收集上清液。
基于Berg等人(1996)Biochem.J.313：893-898)的测定，通过从底物甘油-三[9，10(n)-3H]油酸酯释放的油酸的量测量上清液中的LPL活性。将100μl上清液加入等体积的底物溶液(2mM甘油三[9，10(n)-3H]油酸酯(131kbeq/μmol)，189ng/ml L-α-磷脂酰胆碱，14mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，140mM Tris-HCl(pH 8.0)，15％甘油，和10％热失活的胎牛血清)中于37℃下1小时。通过加入3.25ml的甲醇/氯仿/己烷混合物(141∶125∶100，v/v/v)和1.05ml的0.1MK2CO3-硼酸缓冲液(pH 10.5)来终止反应。在剧烈涡旋和在室温下以3,000g离心分离15分钟后，使用Beckman Coulter LS6500液体闪烁计数器测定水/甲醇相的1ml等分试样中3H的量。
在野生型小鼠中，相对于喂饲状态的内源LPL活性，禁食状态下内源LPL活性显著降低。见图8。该结果与以前的观察，即在禁食状态下诱导ANGPTL4表达，从而降低LPL活性相一致。见例如，Ge等人(2004)J.Lipid Res.45：2071-2079。然而，在敲除小鼠中，相对于喂饲状态下内源LPL活性，禁食状态下内源LPL活性没有降低。该结果与敲除小鼠中ANGPTL4不存在相一致。
E.Angptl4敲除小鼠受到保护免于肝脏脂肪变性(脂肪肝)
HFD与肝脏脂肪变性(脂肪肝)有关。为了确定Angptl4不足是否保护免于HFD诱导的肝脏脂肪变性，使用局部磁共振质子波谱(MRS)测量来自给予HFD和标准饮食的野生型和敲除小鼠的肝脏中的脂质水平。评估了肝脏脂肪浓度和脂肪浸润的程度。
使用7Tesla 16cm孔PharmaScan系统(Bruker BioSpin，Billerica，MA)进行体内MRS，使用38mm内径的鸟笼线圈用于射频发射和接收。将小鼠用1.5-2％异氟烷麻醉并通过磁体内预热的水循环系统保持它们的体温。持续监视它们的呼吸活动。基于覆盖整个肝脏的一系列T1探测图像并通过小心避免血管和脂肪组织，选择目的体积(VOI)。使用PRESS序列(TE＝28ms，TR＝1.0s，196平均值，水抑制：关，VOI：1.8×1.8×1.8mm3，或2×2×2mm)，用呼吸同步化得到局部的1H-MRS。水和脂肪峰下面积的积分用于计算脂肪含量(％脂肪)。见Thomsen等人(1994)Magnetic Resonance Imaging 12：487-495。
来自喂饲HFD的野生型小鼠的肝脏相对于喂饲标准(“chow”)饮食的野生型小鼠的肝脏显示出显著更高的脂质水平。见图9A。然而，来自喂饲HFD的敲除(“HOM”)小鼠的肝脏相对于喂饲标准饮食的敲除小鼠的肝脏没有显示出显著升高的脂质水平。此外，喂饲HFD的敲除小鼠的肝脏相对于喂饲HFD的野生型小鼠的肝脏显示出显著较低的脂质水平。与这些结果一致的是，来自喂饲HFD的敲除小鼠的肝脏切片的油红O染色揭示相对于来自喂饲HFD的野生型小鼠的肝切片显示出显著减少了脂质小滴的数目和大小。见图9B。此外，喂饲HFD的敲除小鼠的肝脏切片中脂质小滴的数目和大小与喂饲标准饮食的野生型小鼠的那些相似。这些结果表明Angptl4缺陷小鼠受到保护而免于HFD诱导的肝脏脂肪变性。
还测量了敲除的和野生型小鼠中骨骼肌的肌细胞内脂质(IMCL)含量，以确定敲除小鼠中该组织是否像肝脏一样受到保护免于脂质积累。为了确定肌细胞内脂质含量，在7 Tesla 16cm bore PharmaScan系统上进行体内MRS研究，使用19mm内径的鸟笼线圈用于射频发射和接收。如上述用1.5-2％异氟烷麻醉小鼠，并置于线圈内，将它们的后肢沿着磁体的长轴排列。在左或者右胫骨前肌选择1.5×1.5×1.5mm3的目的体积(VOI)，避免血管结构和总脂肪组织沉积。使用PRESS序列(TE＝16ms，TR＝2.0s，292平均值，CHESS水抑制)得到局部1H-MRS，以确保IMCL和肌细胞外脂质(EMCL)的峰在波谱中显著不同。用ICML和tCr(总的产生)峰下面积积分计算ICML含量(ICML/tCr比)。(8周和15个月龄的肥胖ZDF大鼠中胫骨前肌的tCr浓度分别为136+/-2.2和132+/-1.0μmol/g干重。见Kuhlmann等人(2003)Diabetes52：138-44.)。
喂饲HFD的敲除小鼠比喂饲HFD的野生型小鼠显示出显著更低的肌细胞内脂质含量。见图10。从而，Angptl4不足保护重要的组织，如肝脏和骨骼肌免于脂质积累。
F.Angptl4敲除小鼠受到保护免于葡萄糖不耐性
已知肝脏和肌细胞内脂质含量的较高水平与胰岛素不敏感性有关。此外，已知HFD与葡萄糖不耐性有关。为了确定Angptl4不足是否保护免于那些影响，检查了野生型和敲除小鼠中葡萄糖和胰岛素的血清水平。
对野生型和敲除小鼠喂饲HFD。禁食后16小时，通过Accu-CheckAdvantage(2138930，Roche，Indianapolis，IN)测量血糖。之后，通过用20％无菌葡萄糖溶液经口强饲法施用2g葡萄糖/kg体重。然后在几个时间点测量血糖。见图11，小图C。在该实验中，喂饲HFD的敲除小鼠比喂饲HFD的野生型小鼠更耐受葡萄糖，意味着接受2g葡萄糖/kg体重经口强饲的敲除小鼠比接受相同处理的野生型小鼠随时间具有更低的血糖水平。该结果是在统计学上有意义的。
对野生型和敲除小鼠喂饲HFD。在光周期开始时禁食6小时后，测量血糖。之后，立即用75mU/ml胰岛素溶液腹膜内注射750mU/kg体重胰岛素(Humulin R，Eli Lilly)。随后在几个时间点测量血糖。见图11，小图D。在该实验中，喂饲HFD的敲除小鼠比喂饲HFD的野生型小鼠对胰岛素更敏感，意味着注射75mU/ml胰岛素导致比接受相同处理的野生型小鼠随时间更低的血糖水平。该结果是统计学上有意义的。
喂饲HFD的野生型小鼠中葡萄糖和胰岛素的禁食血清水平显著高于喂饲标准饮食的野生型小鼠中的那些水平，表明HFD诱导的高血糖和高胰岛素血症。见图11，小图A和B。然而，喂饲HFD的敲除小鼠中葡萄糖和胰岛素的禁食血清水平与喂饲标准饮食的野生型小鼠或敲除小鼠中的水平无显著不同，表明Angptl4不足提供了保护免于HFD诱导的高血糖症和高胰岛素血症。见图11，小图A和B。
G.敲除小鼠中小鼠ANGPTL4的过表达升高血清脂质水平
为了确定小鼠ANGPTL4的过表达是否可以挽救Angptl4敲除小鼠中的任一种表型，将Ad5-mAngptl-4T构建体(上述，部分VI.B.1.)以5×1010vp注射到敲除小鼠的尾静脉中。作为对照，将Ad5-β-gal构建体(上述，部分VI.B.1.)以5×1010vp注射到敲除小鼠的尾静脉中。注射后3天，注射Ad5-mAngptl-4T构建体的敲除小鼠比注射对照构建体的敲除小鼠显示显著更高水平的禁食血清甘油三酯和胆固醇。见图12和13。实际上，注射Ad5-mAngptl-4T构建体的敲除小鼠中甘油三酯和胆固醇的水平与注射Ad5-mAngptl-4T构建体的野生型小鼠中的那些水平相当。比较图12和13与图2和3。这些结果表明小鼠ANGPTL4的过表达逆转了Angptl4敲除小鼠中降低的血清脂质水平。
H.产生和纯化小鼠ANGPTL4
为了表达重组ANGPTL4，用1.5×1011vp重组腺病毒Ad5-mAngptl-4T(上述，部分VI.B.1.)感染CHO细胞。16-24小时后，培养基更换为无血清的培养基(EX-CELL 325-PF CHO培养基，14335，JRH，Lenexa，KS)。每24-36小时收获条件培养基，然后用新鲜的无血清培养基更换，共收获5次。
将条件培养基(1L)装入10-12ml镍螯合树脂的柱(R801-01，Invitrogen，Carlsbad，CA)。将柱子用5柱体积的洗涤缓冲液(10mM咪唑，20mM TrispH 7.8，500mM NaCl)洗涤。结合的ANGPTL4用洗脱缓冲液(500mM咪唑，20mM Tris pH 7.8，500mM NaCl)洗脱并以一系列的1.5ml级分收集。通过蛋白质印迹和简单的蓝色染色证实收集的级分中存在ANGPTL4。将含有ANGPTL4的级分合并在一起，等分，并在-70℃冷冻。
I.通过ANGPTL4抑制LPL活性
使用体外测定法测定小鼠ANGPTL4对LPL活性的影响。如下通过从底物甘油-三[9，10(n)-3H]油酸酯释放的油酸的量测定LPL活性(基于Shimizugawa等人(2002)J.Biol.Chem.277：33742-33748的方法)。
将重构的牛LPL(L2254，Sigma，St.Louis，MO)的溶液与等体积的底物溶液(2mM甘油三[9，10(n)-3H]油酸酯(131kbeq/μmol)，189ng/ml L-α-磷脂酰胆碱，14mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，140mM Tris-HCl(pH 8.0)，15％甘油和l0％热失活的胎牛血清)在0到400nM小鼠ANGPTL4(如上述产生，部分VI.H.)存在下于37℃下温育1小时。通过加入3.25ml甲醇/氯仿/己烷混合物(141∶125∶100，v/v/v)和1.05ml 0.1M K2CO3-硼酸缓冲液(pH10.5)停止反应。在室温下剧烈涡旋和以3,000g离心分离15分钟后，使用Beckman Coulter LS6500液体闪烁计数器测定水/甲醇相的1ml等分试样中3H的量。将1单位LPL活性定义为37℃下每分钟从底物释放1μmol 3H标记的油酸。小鼠ANGPTL4抑制牛LPL的IC50(50％抑制所需的浓度)为约25nM。见图14。
J.在Angptl4敲除小鼠中产生抗ANGPTL4的单克隆抗体
为了产生抗小鼠ANGPTL4的单克隆抗体，将Angptl4敲除小鼠接触抗原进行激活，然后每2到3周用如上面部分VI.H中产生的纯化的小鼠ANGPTL4加强。完全和不完全弗氏佐剂也分别用于接触抗原激活和加强。2到3次加强后，通过ELISA监视血清效价。一旦实现了合适的高效价，就从免疫的小鼠收获脾细胞并与骨髓瘤细胞(P3/NSI/1-Ag4-1)融合，使用PEG1500作为融合剂。将得到的细胞融合产物稀释到杂交瘤培养基中并接种在96孔组织培养板中。1天后，向杂交瘤培养物加入HAT培养基。如需要，每3或4天更换培养基。选择和培养10到14天后，通过ELISA，以小鼠ANGPTL4用作抗原来筛选杂交瘤。称作14D12、15F2、2G12、10E4、1A4、5A6、14D2、和6G11的9种单克隆抗体显示出对小鼠ANGPTL4的特异结合。
还针对具有对应于全长小鼠ANGPTL4(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基151-168的序列LAPTHLDNGVDKTSRGKR的肽产生单克隆抗体(该肽与SEQ ID NO：1的氨基酸残基151-168相同，只是肽的C末端氨基酸为精氨酸，而SEQ ID NO：1的168位氨基酸为赖氨酸)。注射前，将肽缀合到KLH。抗该肽的单克隆抗体能够特异结合全长小鼠ANGPTL4。将该单克隆抗体称作4A8。
K.ELISA方法
使用ELISA筛选抗体对小鼠ANGPTL4的结合。通过加入50μl/孔包被缓冲液(BupHTM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，Pierce#28382，Rockford，IL)中ANGPTL4的2.5μg/ml溶液，在4℃过夜包被96孔Nunc Maxi-SorpImmunoPlatesTM(Nunc#446612，Roskilde，Denmark)。除去包被缓冲液，并通过每孔加入250μl封闭缓冲液(1％BlockerTM BSA，Pierce#37525，PBS中)，在室温封闭平板2小时。向孔中加入50μl杂交瘤上清液(不稀释或用封闭缓冲液稀释)或者分离的抗ANGPTL4抗体(不稀释或用封闭缓冲液稀释)，并在室温温育至少1小时。用PBS/Tween 20洗涤孔4次。向孔中加入100μl稀释的(1∶5,000到1∶10,000)HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Pierce#31446)，并在37℃温育1小时。用PBS/Tween 20洗涤孔6次。通过在5-10分钟向孔中加入50μl TMB(四甲基联苯胺)溶液(ImmunoPureTMB Substrate Kit，Pierce#34021)，检测抗ANGPTL4抗体。使用微板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm以分光光度法读出平板。
L.单克隆抗体的体外中和活性
在如上面部分VI.I中讨论的对LPL活性的体外测定法中，对单克隆抗体测定它们中和ANGPTL4活性的能力。在25nM小鼠ANGPTL4和约125nM每种上面的9种单克隆抗体的存在下，进行单独的LPL活性测定。结果在图15中显示。对于每种抗体，通过抗体增加LPL活性，即，“挽救”LPL免于被ANGPTL4的抑制的能力证明中和活性。挽救活性在图15中通过ANGPTL4和抗-ANGPTL4抗体存在下的LPL活性相对于仅ANGPTL4存在下的LPL活性的增加百分比来表示。9种抗体中的5种，4A8、14D12、15F2、2G12和10E4导致LPL活性的增加，表明那些抗体通过中和ANGPTL4活性挽救了LPL活性。具体地，抗体4A8、14D12和15F2挽救LPL活性50％以上。9种抗体的4种1A4、5A6、14D2和6G11似乎进一步抑制LPL，表明那些抗体能够增强ANGPTL4活性。
M.同种型确定
通过标准方法确定了14D12、15F2、4A8和6G11的同种型。4A8和6G11为IgG1同种型，14D12和15F2为IgG2a同种型(见下面部分VI.P.的表2的第三和第四列)。
N.单克隆抗体的表位作图
使用ELISA测试单克隆抗体14D12、15F2和6G11与小鼠ANGPTL4的N末端卷曲螺旋结构域(从SEQ ID NO：1的氨基酸21-174)和小鼠ANGPTL4的C-末端血纤蛋白原样结构域(从SEQ ID NO：1的氨基酸174-410)的结合。14D12和15F2特异结合小鼠ANGPTL4的N末端卷曲螺旋结构域。6G11特异结合小鼠ANGPTL4的C-末端血纤蛋白原样结构域。
O.表位框并
为了确定单克隆抗体14D12、15F2和4A8是否结合相同的表位，使用Luminex100多路技术和Luminex100TM分析仪(Luminex Corporation，Austin，TX)进行表位框并。见Jia等人(2004)J.Immunol.Methods288：91-98。表位框并通常利用抗体夹层型竞争测定法，其中测试“探针”抗体对被“参考”抗体结合的抗原的结合。如果探针抗体与参考抗体结合相同的表位，那么它将不有效结合该抗原，因为该抗原被参考抗体掩蔽。
为了进行表位框并，将差别标记的xMAPTM羧基化微球体(Luminex，Austin，TX)避光并用捕获抗体(兔单克隆抗小鼠IgG)包被。然后使具有给定标记的经包被的微球体选择性捕获三种参考抗体之一(14D12、15F2，或4A8)，从而每种参考抗体与不同的标记结合。合并差别标记的微球体并加入微孔板的孔中。将微球体分配到孔中并在4℃过夜温育。向孔中加入小鼠ANGPTL4并在25℃搅拌下温育1小时，然后洗涤。向每孔中加入三种探针抗体之一(14D12、15F2或4A8)，并在25℃温育1小时，然后洗涤。向孔中加入生物素化的检测抗体(兔单克隆抗小鼠IgG)以检测探针抗体与ANGPTL4的结合。向孔中加入链霉抗生物素蛋白-PE并温育30分钟。对于每孔，用Luminex100TM分析仪(双重激光器、流式分选和检测平台)检测与每种微球体结合的特定标记(从而检测参考抗体的身份)和与每种微球体结合的PE衍生信号的量级。PE衍生信号的量级与结合小鼠ANGPTL4的探针抗体的量直接成比率。
结果在图16中显示。当将4A8用作探针抗体(第一组三个条形)时，当14D12和15F2都用作参考抗体时，4A8结合小鼠ANGPTL4，如通过强烈的荧光信号所示(黑色和白色条形)。从而，4A8不与14D12和15F2结合相同的表位。当14D12用作探针抗体(第二组三个条形)时，当4A8用作参考抗体时，14D12结合小鼠ANGPTL4，但是当15F2用作参考抗体时，14D12显示出弱结合(比较灰色和白色条形)。从而，14D12和15F2可能结合相同的表位。类似地，当4A8用作参考抗体时，当15F2用作探针抗体(最后一组三个条形)时，它结合小鼠ANGPTL4，但是当14D12用作参考抗体时，它显示出弱结合(比较灰色和黑色条形)，从而证明14D12和15F2可能结合相同的表位。
根据生产商的使用说明，用BIACORE3000系统(Biacore AB，Uppsala Sweden)进行第二个表位框并实验。BIACORE3000系统使用表面等离子体共振技术允许实时生物分子相互作用分析。基本上，用抗原-抗体复合体抑制游离抗体结合的能力确定竞争性抑制过程中的共同表位结合。
使用抗体14D12、15F2、90B4、16B10、4A8和9C10进行实验。将抗体直接固定在BIACORE芯片上或者通过用结合抗小鼠IgG Fc的芯片捕获连接到该芯片。为了确定每种抗体的表位框，将结合的抗体与N-mANGPTL4和溶液中的相同抗体或者溶液中的不同抗体温育。然后让系统达到平衡。基于相互结合抑制，分配下面的表位框：框I含有14D12和15F2，框II含有90B4和16B10，框III仅含有4A8，框IV含有9C10。那些结果与上面讨论的第一个表位框并实验相一致。
P.体内施用具有中和活性的单克隆抗体重现了敲除表型
对小鼠施用具有体外中和活性的抗体以确定此类抗体是否可以重现Angptl4敲除小鼠的表型。为了体内施用该抗体，喂饲标准饮食的小鼠(“喂饲chow”的小鼠)或者具有HFD诱导的DIO的小鼠用30μg单克隆抗体以每克体重10μl的体积注射，如下表2中指出。施用抗-KLH抗体作为对照抗体。4天后测量甘油三酯、胆固醇和FFA的禁食血清水平。
表2
  组(n＝8小鼠/组)   饮食   MAb(30mg/kg)   同种型
  1   喂饲chow   抗-KLH   IgG1
  2   喂饲chow   抗-KLH   IgG2a
  3   喂饲chow   4A8   IgG1
  4   喂饲chow   14D12   IgG2a
  5   喂饲chow   15F2   IgG2a
  6   喂饲chow   6G11   IgG1
  7   HFD   抗-KLH   IgG1
  8   HFD   抗-KLH   IgG2a
  9   HFD   4A8   IgG1
  10   HFD   14D12   IgG2a
  11   HFD   15F2   IgG2a
  12   HFD   6G11   IgG1
结果在图17-19中显示。在喂饲标准饮食的小鼠中，单次施用14D12显著降低禁食血清甘油三酯水平72.7％和67.0％(在两个独立的研究中)，降低禁食总胆固醇水平27.1％和21.3％(在两个独立的研究中)，降低禁食FFA水平44.3％(单次研究中)。类似地，单次施用15F2降低禁食血清甘油三酯水平67.6％和71.8％(在两个独立的研究中)，降低禁食总胆固醇水平22.8％和28.0％(在两个独立的研究中)，降低禁食FFA水平39.3％(单次研究中)。这些观察与14D12和15F2挽救体外LPL活性的能力相一致。然而，单次施用4A8对禁食血清甘油三酯、胆固醇和FFA水平没有显著影响(见条形图，图17-19)，尽管该抗体能够挽救体外LPL活性。相比，单次施用6G11升高禁食血清甘油三酯水平66.4％，其与该抗体进一步抑制体外LPL活性的能力相一致。施用6G11对禁食总胆固醇和FFA水平没有显著影响(见条形图，图18-19)。
使用HFD诱导的DIO得到的结果在图20-21中显示。单次施用14D12降低禁食血清甘油三酯水平53.2％和降低禁食总胆固醇水平27.6％。类似地，15F2减少禁食血清甘油三酯水平56.6％，和降低胆固醇水平31.0％。4A8对于禁食血清甘油三酯或者总胆固醇水平没有影响(见条形图，图20-21)。单次施用6G11显著升高禁食血清甘油三酯水平60.9％，但是对禁食总胆固醇水平没有显著影响(见条形图，图21)。没有测定DIO小鼠中FFA水平。
上面的结果表明施用中和ANGPTL4活性的一些抗体重现了在Angptl4敲除小鼠中看到的降低的血清脂质水平。基于那些结果，预期施用此类抗体将重现Angptl4敲除表型的其他方面，如升高禁食状态中内源LPL活性、增强保护免于肝脏脂肪变性和肌细胞内脂质积累，和增强保护免于葡萄糖耐受性。
还在5周时间内施用中和抗体以评估持续施用的效果。用14D12、15F2或者同种型匹配的对照抗体(抗KLH)每周一次注射具有HFD诱导的DIO的小鼠，持续5周。剂量为30μg单克隆抗体，每克体重10μl的体积。测量禁食血清脂质水平并与来自接受仅单次施用抗体的小鼠的禁食血清脂质水平比较。如图22-23中所示，单次施用14D12将禁食血清甘油三酯降低53.22％，降低胆固醇27.58％，而在5周内每周施用14D12将禁食血清甘油三酯降低59.36％，降低胆固醇44.21％。类似地，单次施用15F2将禁食血清甘油三酯降低56.61％，降低胆固醇30.97％，而在5周内每周施用15F2将禁食血清甘油三酯降低64.45％，降低胆固醇32.73％。在该研究中，与单次施用相比，在5周内每周施用14D12或15F2对于FFA、葡萄糖耐受性或者体重没有显著影响。(数据未显示)。这些结果表明持续施用中和ANGPTL4活性的抗体相对于单次施用保持或者进一步降低禁食血清甘油三酯和总胆固醇水平。
还在如上述每周注射14D12、15F2或者对照抗体(抗KLH)5周的DIO小鼠中测量酮体(KB)的禁食血清水平。注射14D12或15F2的DIO小鼠比注射对照抗体的DIO小鼠具有显著更高水平的酮体。见图24。已知当身体分解脂质时产生酮体。从而，升高水平的酮体可以是在注射中和抗体的小鼠中降低肝脏和肌细胞内脂质水平的可能的机理。
Q.在Angptl4敲除小鼠中产生与人和小鼠ANGPTL4交叉反应的单克隆抗体
使用N-mANGPTL4在Angptl4敲除小鼠中产生与人和小鼠ANGPTL4交叉反应的单克隆抗体，所述N-mANGPTL4含有小鼠ANGPTL4的氨基末端结构域的部分。
将编码小鼠ANGPTL4的氨基酸23到180的多核苷酸序列克隆到表达载体pET22b(+)(Novagen)中。该载体编码N-末端pelB前导序列，以及C-末端His标记物。所得的表达载体称作pET-N-mANGPTL4。蛋白质翻译和除去pelB序列的除11个氨基酸之外的全部序列后，N-mANGPTL4具有SEQ ID NO：10中显示的序列。该序列含有来自pelB序列的11个氨基酸，接着是小鼠ANGPTL4的氨基酸23到180(表6中加下划线)，接着是2个氨基酸接头和His标记物。
如下从大肠杆菌表达和纯化N-mANGPTL4。用以pET-N-mANGPTL4转化的大肠杆菌的一个菌落接种10ml含有50μg/ml氯霉素和100μg/ml羧苄青霉素的LB。将培养物在37℃过夜温育。然后将10ml培养物转移到500ml没有抗生素的LB中并在37℃温育直到OD600达到0.6(约2小时)。加入IPTG至终浓度1mM并将培养物在200rpm摇动下30℃温育4小时。然后将培养物置于冰上5分钟。通过以8000rpm在JLA16.25转子中离心15分钟沉淀细胞。接着将沉淀物重悬浮在50ml裂解缓冲液(50mM Tris，pH7.5，0.5M NaCl，1％Triton X-100，1x蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和0.25ml PMSF(异丙醇中0.1M))中。然后在JA25.5转子中以9700rpm离心裂解的细胞30分钟。除去上清液并在SW28转子中以28,000rpm离心30分钟进一步澄清。然后使用Probond(Ni)层析(Invitrogen)从澄清的上清液纯化重组N-mANGPTL4。
为了从离心裂解细胞后剩余的不溶沉淀物纯化重组N-mANGPTL4，用30ml裂解缓冲液洗涤沉淀物并在JA25.5转子中以9700rpm离心。重复洗涤步骤2次，共三次洗涤。然后将来自沉淀物的不溶蛋白质溶解在10ml变性缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，6M盐酸胍)中。然后在JA25.5转子中以28,000rpm离心溶液30分钟。接着将上清液装入5ml Probond树脂柱上。用50ml洗涤缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，1M NaCl，8M尿素，15mM咪唑)洗涤柱子。在柱子中用从洗涤缓冲液到复性缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，1M NaCl，0.5％Tween 20)的50ml梯度中再折叠重组蛋白质。然后用洗脱缓冲液(含有250mM咪唑的复性缓冲液)洗脱重组蛋白。收集含有重组蛋白质的级分并对贮存缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，0.2％Tween 20)透析。将纯化的N-mANGPTL4等分并在-70℃保存。
小鼠用完全弗氏佐剂中的40μg N-mANGPTL腹膜内接触抗原。2周后用不完全弗氏佐剂(IFA)中的30μg N-mANGPTL4腹膜内加强小鼠，然后再过两周后用IFA中的20μg N-mANGPTL4腹膜内再次加强。备选地，可以使用基于壳聚糖的佐剂。见例如，美国专利号5,912,000；5,965,144；和5,980,912。第二次加强后1周，通过ELISA测量血清效价，如上面实施例K中所述，除了将孔用50μl 0.25μg/ml mANGPTL4包被。第二次加强后2周，用IFA中如上面部分VI.H.中所述产生的10μg纯化的小鼠ANGPTL4腹膜内加强小鼠。第三次加强后1周，如该段落中上面所述通过ELISA再次测量血清效价。第三次加强后约2周半，用10μgN-mANGPTL4静脉内加强小鼠。
三天后从免疫的小鼠收获脾细胞并使用PEG1500作为融合剂，与骨髓瘤细胞(NSI)融合。将得到的细胞融合产物稀释到杂交瘤培养基中并接种在96孔组织培养板中。1天后，向杂交瘤培养物加入HAT培养基。如需要，每3或4天更换培养基。
选择和培养10到14天后，通过ELISA筛选杂交瘤以鉴定表达与人和小鼠ANGPTL4交叉反应的抗体的那些杂交瘤。如上面实施例K中讨论的进行ELISAs，除了平板用50μl 0.25μg/ml蛋白质溶液包被并且对小鼠ANGPTL4和人ANGPTL4单独测试每种抗体。如上面实施例H中讨论的，从分别用Ad5-mAngptl4T和Ad5-mAngptl4T感染的CHO细胞的条件培养基纯化小鼠ANGPTL4和人ANGPTL4。选择与小鼠和人ANGPTL4交叉反应的15种单克隆抗体。确定所选抗体的同种型，并且在表3中显示。
表3
  抗体命名   同种型
  3H1   IgG1
  5A8   IgG1
  8D8   IgG1
  9C10   IgG1
  19C9   IgG1
  20C9   IgG1
  18A2   IgG2a
  5F2   IgG2b
  7H8   IgG2b
  11C11   IgG2b
  16A11   IgG2b
  18G3   IgG2b
  90B4   IgG2b
R.抗ANGPTL4的单克隆抗体的体内活性
如下在小鼠中测试了抗体14D12、19C9、18G3、18A2、9C10和90B4以及作为对照的抗-KLH的某些体内活性。将30mg/kg体重的抗体腹膜内注射到C57白化野生型小鼠中。在5只小鼠中测试每种抗体。4天后，测量禁食血清甘油三酯和总胆固醇水平。在图31中显示了该实验中注射抗体的小鼠的禁食血清甘油三酯水平。抗体14D12和90B4在统计学上有意义的程度上降低了禁食血清甘油三酯，分别降低73.6％和54.9％。图32中显示了该实验中注射抗体的小鼠的禁食总胆固醇水平。抗体14D12和90B4在统计学上有意义的程度上降低了禁食总胆固醇水平，分别降低25.2％和22.2％。
S.抗ANGPTL4的单克隆抗体的相对结合亲和性
通过ELISA对N-mANGPTL4和N-hANGPTL4的每种测定抗体90B4、15F2和14D12的结合亲和性。如上面实施例Q中关于N-mANGPTL4所述从细菌表达和纯化N-hANGPTL4。将编码人ANGPTL4的氨基酸24到175的多核苷酸序列克隆到表达载体pET22b(+)中，该表达载体编码N-末端pelB前导序列和C-末端His标记物。蛋白质翻译和除去pelB序列的除11个氨基酸之外的全部序列后，N-hANGPTL4具有SEQ ID NO：11中显示的序列。该序列含有来自pelB序列的11个氨基酸，接着是人ANGPTL4的氨基酸24到175(表6中加下划线)，接着是2个氨基酸接头和His标记物。如上实施例K中讨论的进行ELISAs，除了平板用每孔50μl的0.25μg/ml蛋白质(N-mANGPTL4或N-hANGPTL4)包被。在0μg/ml、0.08μg/ml、0.4μg/ml、2μg/ml、和10μg/ml抗体下测量结合。该实验的结果在图33中显示。90B4对N-mANGPTL4(小图A)和N-hANGPTL4(小图B)比15F2或14D12具有更大的亲和力。15F2比14D12对N-mANGPTL4具有更大的亲和力，但是对N-hANGPTL4具有与14D12相当的亲和力。
T.14D12在降低血清甘油三酯中的剂量反应
对喂饲HFD的5只C57白化野生型小鼠皮下注射下面讨论的特定浓度的14D12抗体或者抗-KLH抗体。4天和7天后，确定相对于时间0，总甘油三酯的降低百分比。该实验中测试的抗体浓度为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、10mg/kg体重、30mg/kg体重和90mg/kg体重。该实验的结果在图34中显示。4天后，施用10mg/kg体重、30mg/kg体重、和90mg/kg体重导致血清甘油三酯的统计学意义上的降低。见图34，小图A。该效果持续，并且在7天后保持统计学上是有意义的。见图34，小图B。
U.抗ANGPTL4的单克隆抗体的药物动力学和药物代谢动力学
为了确定14D12的药物动力学，对C57白化小鼠注射30μg/g体重的14D12，并在下面表4中给出的一定时间间隔后测量它们的禁食血清甘油三酯和总胆固醇水平。对小鼠喂饲常规的(“chow”)饮食。在实验中使用总共8组小鼠，每组3只小鼠。一组3只小鼠不注射抗体并且用作基线。剩余的7组小鼠接受14D12注射。根据下面的方案进行小鼠的注射、禁食和取血：
表4：
  组   注射日   禁食日   取血日   时间点(天)
  1   3   3   4   1
  2   2   3   4   2
  3   1   3   4   3
  4   4   7   8   4
  5   3   7   8   5
  6   2   7   8   6
  7   1   7   8   7
为了测定14D12的药物代谢动力学，在第1天上午8点用30mg/kg体重的14D12注射4只C57白化小鼠。在第1天上午8点用30mg/kg抗-KLH注射四只另外的C57白化小鼠作为对照。然后在1小时、5小时、10小时、1天、2天、4天、7天、10天和14天后对每只小鼠取血，并如下测定血液中的抗体的浓度。如上面实施例K中讨论的进行ELISA，除了每孔用50μl 0.5μg/ml N-mANGPTL4包被。通过ELISA测试小鼠血清的下面的稀释度：1∶103、1∶104、1∶105、1∶106。用这些小鼠血清稀释度平行地测试含有0.08μg/ml、0.4μg/ml、2μg/ml和10μg/ml14D12的标准品。
那些实验的结果在图35中显示。小图A显示了14D12浓度和禁食血清甘油三酯水平随时间的曲线图。14D12浓度在注射后约24小时得到峰值，而禁食血清甘油三酯浓度在注射后约96小时达到最小值，并且保持降低，直到注射后至少336小时，此时结束实验。小图B显示了14D12浓度和禁食总胆固醇水平随时间的曲线图。如上述，14D12浓度在注射后约24小时达到峰值。禁食总胆固醇在注射后约168小时达到最小值，并且保持降低，直到注射后至少336小时，此时结束实验。
V.在过表达人ANGPTL4的小鼠中施用抗ANGPTL4的单克隆抗体
为了确定某些单克隆抗体是否可以降低过表达人ANGPTL4的小鼠中禁食血清甘油三酯和总胆固醇，将Ad5-hAngptl4T(如上面实施例B.2中描述)以1×109IU/小鼠注射到C57白化小鼠的尾静脉中。用Ad5-hAngptl4T注射总共4组，每组5只小鼠。四组的每组还在病毒感染同时注射了30mg/kg的抗体。注射的抗体为抗-KLH、14D12、15F2和90B4。4天后，测量小鼠中禁食血清甘油三酯和总胆固醇水平。
图36显示了该实验中小鼠中的喂饲血清甘油三酯水平。每组中5只小鼠的每只在图36中用不同的符号代表。注射抗-KLH的小鼠具有约750mg/dl到约1900mg/dl之间的血清甘油三酯水平。注射14D12的小鼠中有三只具有低于注射抗-KLH的小鼠的水平的血清甘油三酯水平。注射14D12的剩余小鼠相对于注射抗-KLH的小鼠具有升高的甘油三酯水平。注射15F2的小鼠中有三只的血清甘油三酯水平低于注射抗-KLH的小鼠的那些水平，而剩余的两只注射15F2的小鼠具有与注射抗-KLH的小鼠相似的血清甘油三酯水平。最后，注射90B4的小鼠中三只具有低于注射抗-KLH的小鼠的那些水平的血清甘油三酯水平，而注射90B4的小鼠的两只相对于注射抗-KLH的小鼠具有升高的血清甘油三酯水平。
结果表明注射抗ANGPTL4的抗体的小鼠的约一半相对于注射抗-KLH抗体的小鼠具有降低的血清甘油三酯水平。一些注射抗ANGPTL4抗体的小鼠具有升高的血清甘油三酯水平，其可以是由于肝脏中Ad-hANGPTL4T感染和可能的表达的差异。
图37显示了该实验中小鼠中的禁食总胆固醇水平。每组中5只小鼠的每一只通过与图36中相同的符号代表。注射抗-KLH的所有5只小鼠具有约180mg/dl到约240mg/dl之间的总的胆固醇水平。注射14D12的小鼠中三只具有低于注射抗-KLH的小鼠的总胆固醇水平。剩余的两只注射14D12的小鼠具有高于注射抗-KLH的小鼠的总胆固醇水平。注射15F2的小鼠的四只具有低于注射抗-KLH的小鼠的总胆固醇水平，而一只注射15F2的小鼠具有与注射抗-KLH的小鼠相当的总胆固醇水平。最后，注射90B4的小鼠的两只具有低于注射抗-KLH的小鼠的总胆固醇水平，而一只注射90B4的小鼠具有与注射抗-KLH的小鼠相当的胆固醇水平，一只注射90B4的小鼠具有大于注射抗-KLH的小鼠的总胆固醇水平。
总之，感染Ad5-hANGPTL4T并且注射抗ANGPTL4抗体的小鼠约一半具有低于感染Ad5-hANGPTL4T并且注射抗KLH的小鼠的总胆固醇水平。此外，感染Ad5-hANGPTL4T并且注射抗ANGPTL4抗体的具有升高的胆固醇水平的小鼠可以是由于肝脏中Ad5-hANGPTL4T感染和可能的表达的差异的结果。
这些结果表明用抗体14D12、15F2和90B4注射可以降低过表达人ANGPTL4的小鼠中血清甘油三酯和总胆固醇。
W.在LDLr敲除小鼠中施用抗ANGPTL4的单克隆抗体
已经发现LDLr敲除小鼠具有升高的血清胆固醇水平，特别当喂饲高脂肪饮食时。见例如，Ishibashi等人(1993)J.Clin.Invest.92：883-93。为了确定某些抗ANGPTL4的单克隆抗体是否可以降低LDLr敲除小鼠中的血清胆固醇和甘油三酯水平，进行下面的实验。对三组15只12-13周龄的LDLr敲除小鼠(Jackson Laboratories，品种B6.129S7-LdlrtmIHer/J)腹膜内注射仅载体、30mg/kg抗-KLH或30mg/kg 14D12。每只小鼠每周接受一次注射，共15周。第四组15只小鼠不处理。所有小鼠都在第一次注射当天开始喂饲Clinton饮食(Research Diets，产品号D12107)。
在15周结束时，确定每只小鼠中禁食血清甘油三酯水平。见图38。注射14D12的小鼠中血清甘油三酯水平显著低于注射抗-KLH、载体的小鼠或者不处理的小鼠中血清甘油三酯水平。
在15周结束时测定每只小鼠中禁食总胆固醇水平。见图39。注射14D12的小鼠中总胆固醇水平显著低于注射抗-KLH、载体的小鼠或者不处理的小鼠中总胆固醇水平。
在该实验中，每周注射14D12共14周的LDLr敲除小鼠相对于每周注射抗KLH或者载体共14周的LDLr敲除小鼠在葡萄糖耐受性或者胰岛素水平中没有差异。此外，在该实验中，在每周注射14D12共8周的小鼠和每周注射抗KLH或者载体共8周的小鼠之间的体脂肪含量、体脂肪百分数或者瘦体重中没有差异。最后，该实验中，每周注射14D12共15周的小鼠的主动脉树中斑块的百分比与每周注射抗KLH或者载体共15周的小鼠的主动脉树中斑块的百分比没有显示在统计学上有意义的差异(数据未显示)。
那些结果表明14D12可以降低LDLr敲除小鼠中血清甘油三酯和总胆固醇水平。然而，在该实验中，单克隆抗体14D12不引起那些小鼠中增加的葡萄糖耐受性或者胰岛素水平的改变。在该实验中，单克隆抗体14D12不改变那些小鼠中身体组成或者降低主动脉树中斑块的百分比。此外，在实验结束时，接受15次每周注射14D12的13只LDLr敲除小鼠的一只具有膨胀的腹部，而接受15次每周注射14D12的13只LDLr敲除小鼠的两只在肠系膜淋巴结和淋巴管中具有典型的损伤。最后，相对于接受抗-KLH或者载体的小鼠，在接受15次每周注射14D12的LDLr敲除小鼠中血清炎性细胞因子没有升高(数据未显示)。
接着，测定了LDLr敲除小鼠中单次注射14D12的效果。每只小鼠接受单次腹膜内注射30mg/kg体重的抗-KLH或者14D12。6只小鼠用14D12注射，5只小鼠用抗-KLH注射。4天后，测定小鼠中禁食血清甘油三酯和总胆固醇水平。
在图42中显示了禁食血清甘油三酯水平。单次注射14D12导致4天后血清甘油三酯降低68.8％。该结果是统计学上有意义的。图43中显示了禁食总胆固醇水平。14D12没有在该实验中将胆固醇水平降低到统计学上有意义的程度。
那些结果表明单次注射在该实验中测试的抗ANGPTL4的单克隆抗体导致LDLr敲除小鼠中血清甘油三酯的显著降低。
X.在ApoE敲除小鼠中施用抗ANGPTL4的单克隆抗体
已经发现ApoE敲除小鼠患自发性高胆固醇血症。见例如，Piedrahita等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(10)：4471-5；和Zhang等人(1992)Science 258(5081)：468-71。为了确定某些抗ANGPTL4的单克隆抗体是否可以降低ApoE敲除小鼠中血清胆固醇和甘油三酯水平，进行下面的实验。用仅载体、30mg/kg抗-KLH或30mg/kg 14D12腹膜内注射3组每组15只14周龄的ApoE敲除小鼠(Taconic Aminal Models，品系B6.129P2-ApoetmIUncN11)。每只小鼠每周接受一次注射，共15周。第四组15只小鼠不处理。在第一次注射当天开始，所有小鼠都喂饲Western饮食(Research Diets，产品号D12079B)。
在15周结束时测定每只小鼠中禁食血清甘油三酯水平。见图40。注射14D12的小鼠中血清甘油三酯水平显著低于注射抗-KLH的小鼠或者不处理的小鼠中血清甘油三酯水平。然而，注射14D12的小鼠中血清甘油三酯水平不显著低于在该实验中仅用载体处理的小鼠中血清甘油三酯水平。
在15周结束时测定每只小鼠中禁食总胆固醇水平。见图41。注射14D12的小鼠中总胆固醇水平不显著低于在该实验中注射抗KLH或者载体的小鼠中总胆固醇水平，但是显著低于不处理的小鼠中总胆固醇水平。
在该实验中，在每周注射14D12共15周的小鼠和每周注射抗KLH或者载体的小鼠之间，体脂肪含量、体脂肪百分数或者瘦体重之间没有差异。此外，在该实验中，每周注射14D12共15周的小鼠的主动脉树中斑块的百分数与每周注射抗KLH或者载体的小鼠的主动脉树中斑块的百分数之间没有统计学上有意义的差异。(数据未显示)。
那些结果表明14D12可以降低ApoE敲除小鼠中血清甘油三酯水平。然而，在该实验中，单克隆抗体14D12未降低ApoE敲除小鼠中总胆固醇水平。在该实验中，单克隆抗体14D12还未改变那些小鼠中身体组成或者降低主动脉树中斑块百分数。此外，在实验结束时，接受15次每周注射14D12的15只ApoE敲除小鼠中3只具有膨胀的腹部，而接受15次每周注射14D12的15只ApoE敲除小鼠中的13只在肠系膜淋巴结和淋巴管中具有典型损伤。最后，接受15次每周注射14D12的15只ApoE敲除小鼠中的6只具有乳糜性腹水。相对于接受抗KLH或者载体的小鼠，接受15次每周注射14D12的ApoE敲除小鼠中血清炎性细胞因子没有升高(数据未显示)。
接着，测定了ApoE敲除小鼠中14D12的单次注射的效果。每只小鼠接受单次腹膜内注射30mg/kg体重的抗-KLH或者14D12。6只小鼠用14D12注射，7只小鼠用抗-KLH注射。4天后，测定小鼠中禁食血清甘油三酯和总胆固醇水平。
在图44中显示了禁食血清甘油三酯水平。单次注射14D12导致4天后血清甘油三酯降低55.4％。该结果是统计学上有意义的。图45中显示了禁食总胆固醇水平。单次注射14D12导致4天后血清甘油三酯降低39.5％。该结果也是统计学上有意义的。
那些结果表明单次注射单克隆抗体14D12可以导致ApoE敲除小鼠中血清甘油三酯和总胆固醇水平的显著降低。
Y.对db/db小鼠施用抗ANGPTL4的单克隆抗体
已经发现db/db小鼠显示出肥胖症和糖尿病表型。见例如，Chen等人(1996)Cell 84：491-495；和Chua Jr等人(1996)Science 271：994-996。为了测定某些抗ANGPTL4的单克隆抗体对肥胖症和糖尿病参数的影响，进行下面的实验。
在第一组10只db/db小鼠中的每只小鼠接受30mg/kg体重抗-KLH皮下注射。第二组10只db/db小鼠中的每只小鼠皮下注射30mg/kg体重14D12。注射前测量禁食血清甘油三酯水平，然后注射后一周测量。小鼠然后接受每周注射，并在8次每周注射后测量禁食血清甘油三酯水平。小鼠用chow饮食喂饲。
结果在图46中显示。小图A显示了用抗-KLH或者14D12单次注射后1周的禁食血清甘油三酯水平。在该实验中，注射14D12将血清甘油三酯降低到统计学上有意义的程度。小图B显示8次每周注射14D12或抗-KLH后，小鼠中禁食血清甘油三酯。在该实验中，14D12将血清甘油三酯降低56％，其是统计学上有意义的。
在该实验中14D12注射没有改变血清葡萄糖和胰岛素水平。在该实验中，14D12注射也没有改变小鼠的体重。
Z.抗ANGPTL4的某些单克隆抗体的测序
使用Gilliland等人(1996)Tissue Antigens 47：1-20中描述的方法的修改版本，克隆并测序14D12、15F2和90B4的重链和轻链可变区。改进该方法以使用RACE和适于小鼠遗传背景的PCR引物。在图47中显示了重链可变区，包括共有序列(SEQ ID NO：15)的比对。此外，在该图中显示每种抗体之间重链可变区的百分数同源性。14D12(SEQ ID NO：12)和15F2(SEQ ID NO：13)的重链可变区为99％同一的，而90B4(SEQ ID NO：14)的重链可变区与14D12和15F2的重链可变区仅为40％同一。
图48中显示了轻链可变区，包括共有序列(SEQ ID NO：19)的比对。还显示了轻链可变区的同源性百分数。15F2(SEQ ID NO：17)和90B4(SEQID NO：18)的轻链可变区为99％同一的，而14D12(SEQ ID NO：16)的轻链可变区与15F2和90B4的轻链可变区分别仅为52％和51％同一。
AA.抗ANGPTL4的某些单克隆抗体的表位作图
为了鉴定单克隆抗体15F2、14D12和90B4的表位，进行下面的实验。在体外翻译小鼠ANGPTL4的不同片段。在表5中显示了片段的位置并且在表6中显示了片段的序列(SEQ ID NOs：40到48)。表5中的起始氨基酸和终止氨基酸指SEQ ID NO：50中显示的mANGPTL4的氨基酸序列。
表5
  片段   起始氨基酸   终止氨基酸
  gs1   Q24   M73
  gs2   L49   P98
  gs3   A74   L123
  gs4   E99   L151
  gs5   F124   P180
  gs1-2   L49   M73
  gs2-3   A74   P98
  gs3-4   E99   L123
  gs4-5   F124   L151
每种片段从使用PCR产生的构建体表达。每种PCR衍生的构建体含有T7启动子、编码His6标记物的序列、编码小泛蛋白样修饰物(SUMO)的序列，和编码ANGPTL4片段的序列。使用RTS E.coli Linear TemplateGeneration Set(Roche Diagnostics)和RTS 100 E.coli HY试剂盒(RocheDiagnostics)，都按照生产商的教导在体外翻译PCR构建体。片段的ANGPTL4部分称作“gs1，”“gs2，”等，如表5中显示。体外翻译的蛋白质片段，包括His标记物和SUMO序列，称作“His-SUMO-gs1，”“His-SUMO-gs2，”等，如图49中显示。
在四块SDS-PAGE凝胶上分离体外翻译的蛋白质片段以及N-mANGPTL4，并转移到四个硝化纤维素印迹。接着将印迹用含有5％脱脂干燥奶粉的TBS(TBS-NFDM)封闭1到2小时。封闭后，用含有0.5％Tween-20的TBS(TBS-Tween)冲洗印迹四次，每次冲洗5分钟。然后将印迹在含有测试抗体(14D12、15F2、90B4或抗-His)的TBS-NFDM中4℃下过夜温育。将印迹用TBS-Tween冲洗四次，每次冲洗5分钟，然后在含有1∶6000稀释度的HRP-偶联的山羊抗小鼠抗体(Southern BiotechnologyAssociates)的TBS-NFDM中温育1小时。将印迹用TBS-Tween冲洗四次，每次冲洗5分钟，然后用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce Biotechnology)按照生产商的教导显色。备选地，可以使用WesternBreezeTM Immunodetection Kit(Invitrogen)对印迹显色。
该实验的结果在图49中显示。在该实验中，抗体14D12仅结合N-mANGPTL4。14D12似乎不结合该实验中其他片段的任一种。该结果可能是由于14D12是比15F2和90B4更弱的结合者的事实。见例如，实施例S和图33。抗体15F2结合His-SUMO-gs1。该结果提示15F2至少结合mANGPTL4的Q24和P98之间的区域(SEQ ID NO：40)。抗体90B4结合His-SUMO-gs2和His-SUMO-gs4。该结果提示90B4表位含有mANGPTL4的L49和P98之间(SEQ ID NO：41)和E99和L151(SEQ ID NO：43)之间的部分。
BB.siRNA
使用SMARTselectionTM方法(Dharmacon，Inc.，Lafayette，CO)鉴定用作siRNAs的寡核苷酸。该方法使用多组分算法用于鉴定具有有效和特异降解靶mRNA的高度可能性的siRNAs。使用该方法鉴定了用作siRNAs的四种双链RNA寡核苷酸。这四种寡核苷酸的序列在SEQ ID NOs：5-8中给出。
这些寡核苷酸用于诱导降解，从而表达编码人ANGPTL4的mRNA。四种寡核苷酸在一种试剂：SMARTpool试剂(Dharmacon，Inc.，Lafayette，CO)中组合，将其重悬浮在缓冲的无RNA酶的溶液中至终浓度约20μM。使用标准转染方法以约1-200nM siRNA的浓度将寡核苷酸转染到培养的细胞中。
用基于细胞的测定法证实寡核苷酸在体外诱导编码人ANGPTL4的mRNA的降解。将用寡核苷酸转染的Hela细胞接种在6孔板上并允许在37C的补充5％CO2的培养箱中过夜生长。接种密度约为100,000个细胞/孔。第二天以1ml生长培养基中约10-100nM的终浓度将寡核苷酸转染到细胞中。转染后48小时收获细胞。用Qiagen RNeasy试剂盒分离总RNA。通过RNA印迹分析分析Angptl4 mRNA的量。
尽管描述了上面的实施例，特别是抗小鼠ANGPTL4的一些中和单克隆抗体和这些抗体在小鼠中的体内效果，但是本领域技术人员将容易认识到也可以产生抗人ANGPTL4的中和性单克隆抗体，并且此类抗体将在人体中具有相同或相似的体内效果。该结论部分基于如下观察，即人和小鼠ANGPTL4是进化上保守的蛋白质，它们共有结构和功能特征。见例如，Ge等人(2004)J.Biol.Chem.279：2038-2045。例如，人和小鼠ANGPTL4共有约77％的氨基酸序列同一性。人和小鼠ANGPTL4还共有共同的二级结构元件，如N-末端卷曲螺旋结构域和C-末端血纤蛋白原样结构域。此外，人ANGPTL4具有与小鼠ANGPTL4相似的功能，如通过人ANGPTL4当在小鼠中过表达时能够升高血清脂质水平所证明的。见部分VI.B.2。
本领域中还公认，小鼠通常用作使用中和抗体治疗多种病症和疾病的模型。例如，中和抗体已经用于治疗小鼠中的朊病毒病、糖尿病和炎症。见例如，White等人(2003)Nature422：80-83；Cailleau等人(1997)Diabetes46：937-940；和Lochner等人(2002)J.Immunol.Methods259：149-157。在后一研究中，在IL-18缺陷小鼠中产生了中和小鼠IL-18的单克隆抗体。那些小鼠单克隆抗体能够抑制野生型小鼠中脂多糖诱导的炎症反应。从而，本领域技术人员将作出结论，即前面的实施例支持在人医学状况的治疗中中使用抗人ANGPTL4的中和性单克隆抗体。
表6：序列列表
描述  SEQIDNO：   序列
  小鼠ANGPTL4(登记号NP_065606)   1   mrcaptagaa lvlcaatagl lsaqgrpaqp epprfaswdemnllahgllq lghglrehve rtrgqlgale rrmaacgnacqgpkgkdapf kdsedrvpeg qtpetlqslq tqlkaqnskiqqlfqkvaqq qrylskqnlr iqnlqsqidl lapthldngvdktsrgkkls kmtqliglts nathlhrpar dcqelfqegerhsglfqiqp lgsppflvnc emtsdggwtv iqrrlngsvdfnqsweaykd gfgdpqgefw lglekmhsit gdrgsqlavqlqdwdgnakl lqfpihlgge dtayslqlte ptanelgatnvspnglslpf stwdqdhdlr gdlncaksls ggwwfgtcshsnlngqyfhs iprqrqerkk gifwktwkgr yyplqattlliqpmeataas
  小鼠ANGPTL4(Swiss-Prot.登记号Q9Z1P8)   50   MRCAPTAGAA LVLCAATAGL LSAQGRPAQP EPPRFASWDEMNLLAHGLLQ LGHGLREHVE RTRGQLGALE RRMAACGNACQGPKGKDAPF KDSEDRVPEG QTPETLQSLQ TQLKAQNSKIQQLFQKVAQQ QRYLSKQNLR IQNLQSQIDL LAPTHLDNGVDKTSRGKRLP KMTQLIGLTP NATHLHRPPR DCQELFQEGERHSGLFQIQP LGSPPFLVNC EMTSDGGWTV IQRRLNGSVDFNQSWEAYKD GFGDPQGEFW LGLEKMHSIT GNRGSQLAVQLQDWDGNAKL LQFPIHLGGE DTAYSLQLTE PTANELGATNVSPNGLSLPF STWDQDHDLR GDLNCAKSLS GGWWFGTCSHSNLNGQYFHS IPRQRQERKK GIFWKTWKGR YYPLQATTLLIQPMEATAAS
  人ANGPTL4(登记号NP_647475)   2   msgaptagaa lmlcaatavl lsaqggpvqs ksprfaswdemnvlahgllq lgqglrehae rtrsqlsale rrlsacgsacqgtegstdlp lapesrvdpe vlhslqtqlk aqnsriqqlfhkvaqqqrhl ekqhlriqhl qsqfglldhk hldhevakparrkrlpemaq pvdpahnvsr lhrlprdcqe lfqvgerqsglfeiqpqgsp pflvnckmts dggwtviqrr hdgsvdfnrpweaykagfgd phgefwlgle kvhsitgdrn srlavqlrdwdgnaellqfs vhlggedtay slqltapvag qlgattvppsglsvpfstwd qdhdlrrdkn cakslsggww fgtcshsnlngqyfrsipqq rqklkkgifw ktwrgryypl qattmliqpmaaeaas
  小鼠Angptl4(登记号NM_020581)(mRNA/cDNA)   3   gcaccagagc aagtctaagt ctgagccggc tcccccagaactccagctgc tgggtcttga actcctgcgt tccggagtcctagcgttgct gcacccaagg ccacccccag aatcatgcgctgcgctccga cagcaggcgc tgccctggtg ctatgcgcggctactgcggg gcttttgagc gctcaagggc gccctgcacagccagagcca ccgcgctttg catcctggga cgagatgaacttgctggctc acgggctgct acagctcggc catgggctgcgcgaacacgt ggagcgcacc cgtgggcagc tgggcgcgctggagcgccgc atggctgcct gtggtaacgc ttgtcaggggcccaagggaa aagatgcacc cttcaaagac tccgaggatagagtccctga aggccagact cctgagactc tgcagagtttgcagactcag ctcaaggctc aaaacagcaa gatccagcaattgttccaga aggtggccca gcagcagaga tacctatcaaagcagaatct gagaatacag aatcttcaga gccagatagacctcttggcc cccacgcacc tggacaatgg agtagacaagacttcgaggg gaaagaagct ttccaagatg acccagctcattggcttgac ttccaacgcc acccacttac acaggccggcccgggactgc caggaactct tccaagaagg ggagaggcac
  agtggacttt tccagatcca gcctctgggg tctccaccatttttggtcaa ctgtgagatg acttcagatg gaggctggacagtgattcag agacgcctga acggctctgt ggacttcaaccagtcctggg aagcctacaa ggatggcttc ggagatccccaaggcgagtt ctggctgggc ctggaaaaga tgcacagcatcacaggggac cgaggaagcc aattggctgt gcagctccaggactgggatg gcaatgccaa attgctccaa tttcccatccatttgggggg tgaggacaca gcctacagcc tgcagctcactgagcccacg gccaatgagc tgggtgccac caatgtttcccccaatggcc tttccctgcc cttctctact tgggaccaagaccatgacct ccgtggggac cttaactgtg ccaagagcctctctggtggc tggtggtttg gtacctgtag ccattccaatctcaatggac aatacttcca ctctatccca cggcaacggcaggagcgtaa aaagggtatc ttctggaaaa catggaagggccgctactat cctctgcagg ctaccaccct gttgatccagcccatggagg ctacagcagc ctcttagcct cctcactggagcctggttcc aggcctaaga agacagtgac tttggttgtggccctgagat ttggccattc tctgctgggg gcaggagctctaagtagggc tatctgcgtc ttgtggacaa agaagaagcccgtaactgga gagactggag gacccctttt ccgtgttggggtctgcaagc attgttgtct gaaacagtca gagcaacaggaaacaaatgg cccagatcca gaaaacatgg gctcgaggggcactgaatat cacttctcgc ctaccagaga agttggggatgcagagggac cactacagtc caactagctg ggcccttaatggcggactca gtcatattga ctgactggag acagggtgccaggagccctg gatacactca tggtgctgtt gtaggtgctgtggatgcaca ggtgctaact gtggttccca ggcacagctcacagcattct tacaataaaa acaacctcag aacaaaacaaaaaaaaaaaa aaaaaaaa
  小鼠Angptl4(登记号AF169313)(mRNA/cDNA)   49   GTTCCGGAGT CCTAGCGTTG CTGCACCCAA GGCCACCCCCAGAATCATGC GCTGCGCTCC GACAGCAGGC GCTGCCCTGGTGCTATGCGC GGCTACTGCG GGGCTTTTGA GCGCGCAAGGGCGCCCTGCA CAGCCAGAGC CACCGCGCTT TGCATCCTGGGACGAGATGA ACTTGCTGGC TCACGGGCTG CTACAGCTCGGCCATGGGCT GCGCGAACAC GTGGAGCGCA CCCGTGGGCAGCTGGGCGCG CTGGAGCGCC GCATGGCTGC CTGTGGTAACGCTTGTCAGG GGCCCAAGGG AAAAGATGCA CCCTTCAAAGACTCCGAGGA TAGAGTCCCT GAAGGCCAGA CTCCTGAGACTCTGCAGAGT TTGCAGACTC AGCTCAAGGC TCAAAACAGCAAGATCCAGC AATTGTTCCA GAAGGTGGCC CAGCAGCAGAGATACCTATC AAAGCAGAAT CTGAGAATAC AGAATCTTCAGAGCCAGATA GACCTCTTGG CCCCCACGCA CCTAGACAATGGAGTAGACA AGACTTCGAG GGGAAAGAGG CTTCCCAAGATGACCCAGCT CATTGGCTTG ACTCCCAACG CCACCCACTTACACAGGCCG CCCCGGGACT GCCAGGAACT CTTCCAAGAAGGGGAGAGGC ACAGTGGACT TTTCCAGATC CAGCCTCTGGGGTCTCCACC ATTTTTGGTC AACTGTGAGA TGACTTCAGATGGAGGCTGG ACAGTGATTC AGAGACGCCT GAACGGCTCTGTGGACTTCA ACCAGTCCTG GGAAGCCTAC AAGGATGGCTTCGGAGATCC CCAAGGCGAG TTCTGGCTGG GCCTGGAAAAGATGCACAGC ATCACAGGGA ACCGAGGAAG CCAATTGGCTGTGCAGCTCC AGGACTGGGA TGGCAATGCC AAATTGCTCCAATTTCCCAT CCATTTGGGG GGTGAGGACA CAGCCTACAGCCTGCAGCTC ACTGAGCCCA CGGCCAATGA GCTGGGTGCCACCAATGTTT CCCCCAATGG CCTTTCCCTG CCCTTCTCTACTTGGGACCA AGACCATGAC CTCCGTGGGG ACCTTAACTGTGCCAAGAGC CTCTCTGGTG GCTGGTGGTT TGGTACCTGTAGCCATTCCA ATCTCAATGG ACAATACTTC CACTCTATCC
  CACGGCAACG GCAGGAGcGT AAAAAGGGTA TCTTCTGGAAAACATGGAAG GGCCGCTACT ATCCTCTGCA GGCTACCACCCTGCTGATCC AGCCCATGGA GGCTACAGCA GCCTCTTAGCCTCCTCACTG GAGCCTGGTT CCAGGCTAAG AAG
  人Angptl4(登记号NM_139314)(mRNA/cDNA)   4   ataaaaaccg tcctcgggcg cggcggggag aagccgagctgagcggatcc tcacacgact gtgatccgat tctttccagcggcttctgca accaagcggg tcttaccccc ggtcctccgcgtctccagtc ctcgcacctg gaaccccaac gtccccgagagtccccgaat ccccgctccc aggctaccta agaggatgagcggtgctccg acggccgggg cagccctgat gctctgcgccgccaccgccg tgctactgag cgctcagggc ggacccgtgcagtccaagtc gccgcgcttt gcgtcctggg acgagatgaatgtcctggcg cacggactcc tgcagctcgg ccaggggctgcgcgaacacg cggagcgcac ccgcagtcag ctgagcgcgctggagcggcg cctgagcgcg tgcgggtccg cctgtcagggaaccgagggg tccaccgacc tcccgttagc ccctgagagccgggtggacc ctgaggtcct tcacagcctg cagacacaactcaaggctca gaacagcagg atccagcaac tcttccacaaggtggcccag cagcagcggc acctggagaa gcagcacctgcgaattcagc atctgcaaag ccagtttggc ctcctggaccacaagcacct agaccatgag gtggccaagc ctgcccgaagaaagaggctg cccgagatgg cccagccagt tgacccggctcacaatgtca gccgcctgca ccggctgccc agggattgccaggagctgtt ccaggttggg gagaggcaga gtggactatttgaaatccag cctcaggggt ctccgccatt tttggtgaactgcaagatga cctcagatgg aggctggaca gtaattcagaggcgccacga tggctcagtg gacttcaacc ggccctgggaagcctacaag gcggggtttg gggatcccca cggcgagttctggctgggtc tggagaaggt gcatagcatc acgggggaccgcaacagccg cctggccgtg cagctgcggg actgggatggcaacgccgag ttgctgcagt tctccgtgca cctgggtggcgaggacacgg cctatagcct gcagctcact gcacccgtggccggccagct gggcgccacc accgtcccac ccagcggcctctccgtaccc ttctccactt gggaccagga tcacgacctccgcagggaca agaactgcgc caagagcctc tctggaggctggtggtttgg cacctgcagc cattccaacc tcaacggccagtacttccgc tccatcccac agcagcggca gaagcttaagaagggaatct tctggaagac ctggcggggc cgctactacccgctgcaggc caccaccatg ttgatccagc ccatggcagcagaggcagcc tcctagcgtc ctggctgggc ctggtcccaggcccacgaaa gacggtgact cttggctctg cccgaggatgtggccgttcc ctgcctgggc aggggctcca aggaggggccatctggaaac ttgtggacag agaagaagac cacgactggagaagccccct ttctgagtgc aggggggctg catgcgttgcctcctgagat cgaggctgca ggatatgctc agactctagaggcgtggacc aaggggcatg gagcttcact ccttgctggccagggagttg gggactcaga gggaccactt ggggccagccagactggcct caatggcgga ctcagtcaca ttgactgacggggaccaggg cttgtgtggg tcgagagcgc cctcatggtgctggtgctgt tgtgtgtagg tcccctgggg acacaagcaggcgccaatgg tatctgggcg gagctcacag agttcttggaataaaagcaa cctcagaaca cttaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaa
siRNA的oligo 1   5   GAGGCAGAGUGGACUAUUUUU
  siRNA的oligo 2   6   UUGGUGAACUGCAAGAUGAUU
siRNA
siRNA的oligo 3  7  GAUGGAGGCUGGACAGUAAUU
siRNA的oligo 4  8  GACAAGAACUGCGCCAAGAUU
借以产生4A8的肽  9  LAPTHLDNGVDKTSRGKR
N-mANGPTL4  10  MAMDIGINSD PQGRPAQPEP PRFASWDEMN LLAHGLLQLGHGLREHVERT RGOLGALERR MAACGNACOG PKGKDAPFKDSEDRVPEGQT PETLQSLQTQ LKAQNSKIQQ LFQKVAQQQRYLSKQNLRIQ NLQSQIDLLA PTHLDNGVDK TSRGKRLPKMTQLIGLTPLE HHHHHH
N-hANGPTL4  11  MAMDIGINSD PNSSSQGGPV QSKSPRFASW DEMNVLAHGLLQLGQGLREH AERTRSQLSA LERRLSACGS ACQGTEGSTDLPLAPESRVD PEVLHSLQTQ LKAQNSRIQQ LFHKVAQQQRHLEKQHLRTQ HLQSQFGLLD HKHLDHEVAK PARRKRLPEMAQPVDPAHLE HHHHHH
14D12重链可变区  12  MNFGLSLIFL VLILKGVQCE VKLVESGGGL VKPGGSLKLSCAASGFAFSR YDMSWVRQTP EKRLEWVATI STGGSYTYYPDSVKGRFTIS RDNARNTLYL QMGSLRSEDT ALYFCVRHEQSTVVPHYPLD rWGQGTSVTV SSA
15F2重链可变区  13  MNFGLSLIFL VLILKGVQCE VKLVESGGGL VKPGGSLKLSCAASGFAFSR YDMSWVRQTP EKRLEWVATI STDGSYTYYPDSVKGRFTIS RDNARNTLYL QMGSLRSEDT ALYFCVRHEQSTIVPHYPLD rWGQGTSVTV SSA
9084重链可变区  14  MGWSWIFLFL LSETAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMSCRTSGYTFTD YSIHWVKQSH GKRLEWIGYI NPYNGDTYCDQNFKGKATLT FNKASSTAYM EIPRLTSDDS AVYYCTRWKTIQAPFAYWGQ GTLVTVSA
重链可变区共有序列  15  MNFGLSLIFL VLILKGVQCE VKLVESGGGL VKPGGSLKLSCAASGFAFSR YDMSWVRQTP EKRLEWVATI STXGSYTYYPDSVKGRFTIS RDNARNTLYL QMGSLRSEDT ALYFCVRHEQSTIVPHrPLD YWGQGrSVTV SSA
14D12轻链可变区  16  MVSTSQLLGL LLFWTSASRC DIVMTQSPAT LSVTPGDRVSLSCRASQSIG DYLHWYQQKS HESPRLLIKY ASQSISGIPSRFSGSGSGSD FTLSIDSVEP EDVGVYYCQN GHSFPFTFGSGTKLEIKR
15F2轻链可变区  17  MDMRAPAQFL GILLLWFPGA RCEIQMTQSP SSMSASLGDRITITCQATQD IVENLNWYQQ KPGKPPSFLI HYATELAEGVPSRFSGSGSG SDYSLTISNL ESEDFADYYC LQSYDFPYTFGGGTKLEINR
9084轻链可变区  18  MDMRAPAQFL GILLLWFPGA RCEIQMTQSP SSMSASLGDRITITCQATQD IVKNLNWYQQ KPGKPPSFLI HYATELAEGVPSRFSGSGSG SDYSLTISNL ESEDFADYYC LQSYDFPYrFGGGTKLEIN
轻链可变区  19  RAPAQFLGIL LLWFPGARCE IQMTQSPSSM SASLGDRITITCQATQDIVK NLNWYQQKPG KPPSFLIHYA TELAEGVPSR
共有序列  FSGSGSGSDY SLTISNLESE DFADYYCLQS YDFPYTFGGGTKLEINR
  14D12重链CDR1   21  RYDMS
  14D12重链CDR2   22  TISTGGSYTYYPDSVKG
  14D12重链CDR3   23  RHEQSTVVPHYPL
  15F2重链CDR1   24  RYDMS
  15F2重链CDR2   25  TISTDGSYTYYPDSVKG
  15F2重链CDR3   26  RHEQSTIVPHYPL
  90B4重链CDR1   27  DYSIH
  90B4重链CDR2   28  YINPYNGDTYCDQNFK
  90B4重链CDR3   29  RWKTIQAPF
  14D12轻链CDR1   30  RASQSIGDYLH
  14D12轻链CDR2   31  YASQSIS
  14D12轻链CDR3   32  QNGHSFP
  15F2轻链CDR1   33  QATQDIVKNLN
  15F2轻链CDR2   34  YATELAE
  15F2轻链CDR3   35  LQSYDFP
  90B4轻链CDR1   36  QATQDIVKNLN
  90B4轻链CDR2   37  YATELAE
  90B4轻链CDR3   38  LQSYDFP
  14D12和15F2重链CDR2共有序列   39  TISTDXSYTYYPDSVKG
  14D12和15F2重链CDR3共有序列   20  RHEQSTXVPHYPL
  mANGPTL4的gs-1片段   40  QGRPAQPEPPRFASWDEMNLLAHGLLQLGHGLREHVERTRGQLGALERRM
  mANGPTL4的gs-2片段   41   LQLGHGLREHVERTRGQLGALERRMAACGNACQGPKGKDAPFKDSEDRVP
  mANGPTL4的gs-3片段   42   AACGNACQGPKGKDAPFKDSEDRVPEGQTPETLQSLQTQLKAQNSKIQQL
  mANGPTL4的gs4片段   43   EGQTPETLQSLQTQLKAQNSKIQQLFQKVAQQQRYLSKQNLRIQNLQSQIDLL
  mANGPTL4的gs5片段   44   FQKVAQQQRYLSKQNLRIQNLQSQIDLLAPTHLDNGVDKTSRGKRLPKMTQLIGLTP
  mANGPTL4的gs1-2片段   45   LQLGHGLREHVERTRGQLGALERRM
  mANGPTL4的gs2-3片段   46   AACGNACQGPKGKDAPFKDSEDRVP
  mANGPTL4的gs3-4片段   47   EGQTPETLQSLQTQLKAQNSKIQQL
  mANGPTL4的gs4-5片段   48   FQKVAQQQRYLSKQNLRIQNLQSQIDLL
序列表
<110>莱克康制药公司
     李宜疆
     格雷戈里·兰德斯
     郑圭锡
     乌尔维·德赛
     戴维·里德·鲍威尔
     洪锡柱
<120>针对ANGPTL4的单克隆抗体
<130>7705.24-304
<150>60/642,022
<151>2005-01-07
<160>50
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>410
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro
            20                  25                  30
Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu
        35                  40                  45
Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly
    50                  55                  60
Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys
65                  70                  75                  80
Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg
                85                  90                  95
Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala
        115                 120                 125
Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu
    130                 135                 140
Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val
145                 150                 155                 160
Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Lys Leu Ser Lys Met Thr Gln Leu Tle
                165                 170                 175
Gly Leu Thr Ser Asn Ala Thr His Leu His Arg Pro Ala Arg Asp Cys
            180                 185                 190
Gln Glu Leu Phe Gln Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile
        195                 200                 205
Gln Pro Leu Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser
    210                 215                 220
Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp
225                 230                 235                 240
Phe Asn Gln Ser Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln
                245                 250                 255
Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asp
            260                 265                 270
Arg Gly Ser Gln Leu Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Leu Leu Gln Phe Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr
    290                 295                 300
Ser Leu Gln Leu Thr Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn
305                 310                 315                 320
Val Ser Pro Asn Gly Leu Ser Leu Pro Phe 5er Thr Trp Asp Gln Asp
                325                 330                 335
His Asp Leu Arg Gly Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly
            340                 345                 350
Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe
        355                 360                 365
His Ser Ile Pro Arg Gln Arg Gln Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp
    370                 375                 380
Lys Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu
385                 390                 395                 400
Ile Gln Pro Met Glu Ala Thr Ala Ala Ser
                405                 410
<210>2
<211>406
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser
            20                  25                  30
Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu
        35                  40                  45
Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser
    50                  55                  60
Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys
65                  70                  75                  80
Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg
                85                  90                  95
Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln
            100                 105                 110
Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg
        115                 120                 125
His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln  Ser Gln Phe
    130                 135                 140
Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala
145                 150                 155                 160
Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His
                165                 170                 175
Ash Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe
            180                 185                 190
Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly
        195                 200                 205
Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp
    210                 215                 220
Thr Val Tle Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro
225                 230                 235                 240
Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp
                245                 250                 255
Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg
            260                 265                 270
Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln
        275                 280                 285
Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu
    290                 295                 300
Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser
305                 310                 315                 320
Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg
                325                 330                 335
Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly
            340                 345                 350
Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro
        355                 360                 365
Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg
    370                 375                 380
Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Tle Gln Pro Met
385                 390                 395                 400
Ala Ala Glu Ala Ala Ser
                405
<210>3
<211>1858
<212>DNA
<213>小鼠
<400>3
gcaccagagc aagtctaagt ctgagccggc tcccccagaa ctccagctgc tgggtcttga     60
actcctgcgt tccggagtcc tagcgttgct gcacccaagg ccacccccag aatcatgcgc    120
tgcgctccga cagcaggcgc tgccctggtg ctatgcgcgg ctactgcggg gcttttgagc    180
gctcaagggc gccctgcaca gccagagcca ccgcgctttg catcctggga cgagatgaac    240
ttgctggctc acgggctgct acagctcggc catgggctgc gcgaacacgt ggagcgcacc    300
cgtgggcagc tgggcgcgct ggagcgccgc atggctgcct gtggtaacgc ttgtcagggg    360
cccaagggaa aagatgcacc cttcaaagac tccgaggata gagtccctga aggccagact    420
cctgagactc tgcagagttt gcagactcag ctcaaggctc aaaacagcaa gatccagcaa    480
ttgttccaga aggtggccca gcagcagaga tacctatcaa agcagaatct gagaatacag    540
aatcttcaga gccagataga cctcttggcc cccacgcacc tggacaatgg agtagacaag    600
acttcgaggg gaaagaagct ttccaagatg acccagctca ttggcttgac ttccaacgcc    660
acccacttac acaggccggc ccgggactgc caggaactct tccaagaagg ggagaggcac    720
agtggacttt tccagatcca gcctctgggg tctccaccat ttttggtcaa ctgtgagatg    780
acttcagatg gaggctggac agtgattcag agacgcctga acggctctgt ggacttcaac    840
cagtcctggg aagcctacaa ggatggcttc ggagatcccc aaggcgagtt ctggctgggc    900
ctggaaaaga tgcacagcat cacaggggac cgaggaagcc aattggctgt gcagctccag    960
gactgggatg gcaatgccaa attgctccaa tttcccatcc atttgggggg tgaggacaca   1020
gcctacagcc tgcagctcac tgagcccacg gccaatgagc tgggtgccac caatgtttcc   1080
cccaatggcc tttccctgcc cttctctact tgggaccaag accatgacct ccgtggggac   1140
cttaactgtg ccaagagcct ctctggtggc tggtggtttg gtacctgtag ccattccaat   1200
ctcaatggac aatacttcca ctctatccca cggcaacggc aggagcgtaa aaagggtatc   1260
ttctggaaaa catggaaggg ccgctactat cctctgcagg ctaccaccct gttgatccag   1320
cccatggagg ctacagcagc ctcttagcct cctcactgga gcctggttcc aggcctaaga   1380
agacagtgac tttggttgtg gccctgagat ttggccattc tctgctgggg gcaggagctc   1440
taagtagggc tatctgcgtc ttgtggacaa agaagaagcc cgtaactgga gagactggag   1500
gacccctttt ccgtgttggg gtctgcaagc attgttgtct gaaacagtca gagcaacagg   1560
aaacaaatgg cccagatcca gaaaacatgg gctcgagggg cactgaatat cacttctcgc   1620
ctaccagaga agttggggat gcagagggac cactacagtc caactagctg ggcccttaat   1680
ggcggactca gtcatattga ctgactggag acagggtgcc aggagccctg gatacactca   1740
tggtgctgtt gtaggtgctg tggatgcaca ggtgctaact gtggttccca ggcacagctc   1800
acagcattct tacaataaaa acaacctcag aacaaaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa     1858
<210>4
<211>1967
<212>DNA
<213>人
<400>4
ataaaaaccg tcctcgggcg cggcggggag aagccgagct gagcggatcc tcacacgact     60
gtgatccgat tctttccagc ggcttctgca accaagcggg tcttaccccc ggtcctccgc    120
gtctccagtc ctcgcacctg gaaccccaac gtccccgaga gtccccgaat ccccgctccc    180
aggctaccta agaggatgag cggtgctccg acggccgggg cagccctgat gctctgcgcc    240
gccaccgccg tgctactgag cgctcagggc ggacccgtgc agtccaagtc gccgcgcttt    300
gcgtcctggg acgagatgaa tgtcctggcg cacggactcc tgcagctcgg ccaggggctg    360
cgcgaacacg cggagcgcac ccgcagtcag ctgagcgcgc tggagcggcg cctgagcgcg    420
tgcgggtccg cctgtcaggg aaccgagggg tccaccgacc tcccgttagc ccctgagagc    480
cgggtggacc ctgaggtcct tcacagcctg cagacacaac tcaaggctca gaacagcagg    540
atccagcaac tcttccacaa ggtggcccag cagcagcggc acctggagaa gcagcacctg    600
cgaattcagc atctgcaaag ccagtttggc ctcctggacc acaagcacct agaccatgag    660
gtggccaagc ctgcccgaag aaagaggctg cccgagatgg cccagccagt tgacccggct    720
cacaatgtca gccgcctgca ccggctgccc agggattgcc aggagctgtt ccaggttggg    780
gagaggcaga gtggactatt tgaaatccag cctcaggggt ctccgccatt tttggtgaac     840
tgcaagatga cctcagatgg aggctggaca gtaattcaga ggcgccacga tggctcagtg     900
gacttcaacc ggccctggga agcctacaag gcggggtttg gggatcccca cggcgagttc     960
tggctgggtc tggagaaggt gcatagcatc acgggggacc gcaacagccg cctggccgtg    1020
cagctgcggg actgggatgg caacgccgag ttgctgcagt tctccgtgca cctgggtggc    1080
gaggacacgg cctatagcct gcagctcact gcacccgtgg ccggccagct gggcgccacc    1140
accgtcccac ccagcggcct ctccgtaccc ttctccactt gggaccagga tcacgacctc    1200
cgcagggaca agaactgcgc caagagcctc tctggaggct ggtggtttgg cacctgcagc    1260
cattccaacc tcaacggcca gtacttccgc tccatcccac agcagcggca gaagcttaag    1320
aagggaatct tctggaagac ctggcggggc cgctactacc cgctgcaggc caccaccatg    1380
ttgatccagc ccatggcagc agaggcagcc tcctagcgtc ctggctgggc ctggtcccag    1440
gcccacgaaa gacggtgact cttggctctg cccgaggatg tggccgttcc ctgcctgggc    1500
aggggctcca aggaggggcc atctggaaac ttgtggacag agaagaagac cacgactgga    1560
gaagccccct ttctgagtgc aggggggctg catgcgttgc ctcctgagat cgaggctgca    1620
ggatatgctc agactctaga ggcgtggacc aaggggcatg gagcttcact ccttgctggc    1680
cagggagttg gggactcaga gggaccactt ggggccagcc agactggcct caatggcgga    1740
ctcagtcaca ttgactgacg gggaccaggg cttgtgtggg tcgagagcgc cctcatggtg    1800
ctggtgctgt tgtgtgtagg tcccctgggg acacaagcag gcgccaatgg tatctgggcg    1860
gagctcacag agttcttgga ataaaagcaa cctcagaaca cttaaaaaaa aaaaaaaaaa    1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa                  1967
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>SiRNA的寡核苷酸
<400>5
gaggcagagu ggacuauuuu u                                                21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>SiRNA的寡核苷酸
<400>6
uuggugaacu gcaagaugau u                                                21
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>SiRNA的寡核苷酸
<400>7
gauggaggcu ggacaguaau u                                                    21
<210>8
<211>21
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>SiRNA的寡核苷酸
<400>8
gacaagaacu gcgccaagau u                                                    21
<210>9
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>用于免疫的肽
<400>9
Leu Ala Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val Asp Lys Thr Ser Arg Gly
1               5                   10                  15
Lys Arg
<210>10
<211>176
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>融合蛋白
<400>10
Met Ala Met Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp Pro Gln Gly Arg Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Pro Glu Pro Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu
            20                  25                  30
Ala His Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Gly Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys
    50                  55                  60
Gly Asn Ala Cys Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp APg Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe
            100                 105                 110
Gln Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg
        115                 120                 125
Ile Gln Asn Leu Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His Leu
    130                 135                 140
Asp Asn Gly Val Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Arg Leu Pro Lys Met
145                 150                 155                 160
Thr Gln Leu Ile Gly Leu Thr Pro Leu Glu His His His His His His
                165                 170                 175
<210>11
<211>176
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>融合蛋白
<400>11
Met Ala Met Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ser Gln
1               5                   10                  15
Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu
            20                  25                  30
Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg
        35                  40                  45
Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg
    50                  55                  60
Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp
65                  70                  75                  80
Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe
            100                 105                 110
His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg
        115                 120                 125
Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu
    130                 135                 140
Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met
145                 150                 155                 160
Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His Leu Glu His His His His His His
                165                 170                 175
<210>12
<211>143
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Arg Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Val Arg His Glu Gln Ser Thr Val Val Pro His Tyr Pro
        115                 120                 125
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala
    130                 135                 140
<210>13
<211>143
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Arg Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Thr Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Val Arg His Glu Gln Ser Thr Ile Val Pro His Tyr Pro
        115                 120                 125
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala
    130                 135                 140
<210>14
<211>138
<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Glu Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Tyr Cys Asp
65                  70                  75                  80
Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Phe Asn Lys Ala Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Ile Pro Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Trp Lys Thr Ile Gln Ala Pro Phe Ala Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135
<210>15
<211>143
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>misc_feature
<222>(73)..(73)
<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸
<400>15
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Arg Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Thr Xaa Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Val Arg His Glu Gln Ser Thr Ile Val Pro His Tyr Pro
        115                 120                 125
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala
    130                 135                 140
<210>16
<211>128
<212>PRT
<213>小鼠
<400>16
Met Val Ser Thr Ser Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Thr Ser
1               5                   10                  15
Ala Ser Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Ile Gly Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Sec His Glu Ser Pro
    50                  55                  60
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asp
                85                 90                 95
Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His
            100                 105                 110
Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
<210>17
<211>130
<212>PRT
<213>小鼠
<400>17
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20                  25                  30
Met Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr cys Gln Ala Thr
        35                  40                  45
Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Pro Pro Ser Phe Leu Ile His Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Asn Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
Ser Tyr Asp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        115                 120                 125
Asn Arg
    130
<210>18
<211>129
<212>PRT
<213>小鼠
<400>18
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20                  25                  30
Met Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr
        35                  40                  45
Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Pro Pro Ser Phe Leu Ile His Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Asn Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
Ser Tyr Asp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        115                 120                 125
Asn
<210>19
<211>127
<212>PRT
<213>小鼠
<400>19
Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Cys Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala
            20                  25                  30
Ser Leu Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Val Lys Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser
    50                  55                  60
Phe Leu Ile His Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn
                85                  90                  95
Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Tyr Asp
            100                 105                 110
Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
        115                 120                 125
<210>20
<211>13
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸
<400>20
Arg His Glu Gln Ser Thr Xaa Val Pro His Tyr Pro Leu
1               5                   10
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>21
Arg Tyr Asp Met Ser
1               5
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>22
Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>23
<211>13
<212>PRT
<213>小鼠
<400>23
Arg His Glu Gln Ser Thr Val Val Pro His Tyr Pro Leu
1               5                   10
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>24
Arg Tyr Asp Met Ser
1               5
<210>25
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>25
Thr Ile Ser Thr Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>小鼠
<400>26
Arg His Glu Gln Ser Thr Ile Val Pro His Tyr Pro Leu
1               5                   10
<210>27
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>27
Asp Tyr Ser Ile His
1               5
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>28
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe Lys
1               5                   10                  15
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>29
Arg Trp Lys Thr Ile Gln Ala Pro Phe
15
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>30
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu His
1               5                   10
<210>31
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>31
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1               5
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>32
Gln Asn Gly His Ser Phe Pro
1               5
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>33
Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn
1               5                   10
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>34
Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>35
Leu Gln Ser Tyr Asp Phe Pro
1               5
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>36
Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn
1               5                   10
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>37
Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu
1               5
<210>38
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>38
Leu Gln Ser Tyr Asp Phe Pro
1               5
<210>39
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸
<400>39
Thr Ile Ser Thr Asp Xaa Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>40
<211>50
<212>PRT
<213>小鼠
<400>40
Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp
1               5                   10                  15
Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu
            20                  25                  30
Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg
        35                  40                  45
Arg Met
    50
<210>41
<211>50
<212>PRT
<213>小鼠
<400>41
Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly
1               5                   10                  15
Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys
            20                  25                  30
Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg
        35                  40                  45
Val Pro
    50
<210>42
<211>50
<212>PRT
<213>小鼠
<400>42
Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro
1               5                   10                  15
Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr
            20                  25                  30
Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Gln Leu
    50
<210>43
<211>53
<212>PRT
<213>小鼠
<400>43
Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys
1               5                   10                  15
Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln
            20                  25                  30
Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser
        35                  40                  45
Gln Ile Asp Leu Leu
    50
<210>44
<211>57
<212>PRT
<213>小鼠
<400>44
Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu
1               5                   10                  15
Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His
            20                  25                  30
Leu Asp Asn Gly Val Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Arg Leu Pro Lys
        35                  40                  45
Met Thr Gln Leu Ile Gly Leu Thr Pro
    50                  55
<210>45
<211>25
<212>PRT
<213>小鼠
<400>45
Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly
1               5                   10                  15
Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met
            20                  25
<210>46
<211>25
<212>PRT
<213>小鼠
<400>46
Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro
1               5                   10                  15
Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg Val Pro
            20                  25
<210>47
<211>25
<212>PRT
<213>小鼠
<400>47
Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys
1               5                   10                  15
Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu
            20                  25
<210>48
<211>28
<212>PRT
<213>小鼠
<400>48
Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu
1               5                   10                  15
Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu
            20                  25
<210>49
<211>1313
<212>DNA
<213>小鼠
<400>49
gttccggagt cctagcgttg ctgcacccaa ggccaccccc agaatcatgc gctgcgctcc      60
gacagcaggc gctgccctgg tgctatgcgc ggctactgcg gggcttttga gcgcgcaagg     120
gcgccctgca cagccagagc caccgcgctt tgcatcctgg gacgagatga acttgctggc     180
tcacgggctg ctacagctcg gccatgggct gcgcgaacac gtggagcgca cccgtgggca     240
gctgggcgcg ctggagcgcc gcatggctgc ctgtggtaac gcttgtcagg ggcccaaggg     300
aaaagatgca cccttcaaag actccgagga tagagtccct gaaggccaga ctcctgagac     360
tctgcagagt ttgcagactc agctcaaggc tcaaaacagc aagatccagc aattgttcca     420
gaaggtggcc cagcagcaga gatacctatc aaagcagaat ctgagaatac agaatcttca     480
gagccagata gacctcttgg cccccacgca cctagacaat ggagtagaca agacttcgag     540
gggaaagagg cttcccaaga tgacccagct cattggcttg actcccaacg ccacccactt     600
acacaggccg ccccgggact gccaggaact cttccaagaa ggggagaggc acagtggact     660
tttccagatc cagcctctgg ggtctccacc atttttggtc aactgtgaga tgacttcaga     720
tggaggctgg acagtgattc agagacgcct gaacggctct gtggacttca accagtcctg     780
ggaagcctac aaggatggct tcggagatcc ccaaggcgag ttctggctgg gcctggaaaa     840
gatgcacagc atcacaggga accgaggaag ccaattggct gtgcagctcc aggactggga     900
tggcaatgcc aaattgctcc aatttcccat ccatttgggg ggtgaggaca cagcctacag     960
cctgcagctc actgagccca cggccaatga gctgggtgcc accaatgttt cccccaatgg    1020
cctttccctg cccttctcta cttgggacca agaccatgac ctccgtgggg accttaactg    1080
tgccaagagc ctctctggtg gctggtggtt tggtacctgt agccattcca atctcaatgg    1140
acaatacttc cactctatcc cacggcaacg gcaggagcgt aaaaagggta tcttctggaa    1200
aacatggaag ggccgctact atcctctgca ggctaccacc ctgctgatcc agcccatgga    1260
ggctacagca gcctcttagc ctcctcactg gagcctggtt ccaggctaag aag           1313
<210>50
<211>410
<212>PRT
<213>小鼠
<400>50
Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro
            20                  25                  30
Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu
        35                  40                  45
Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly
    50                  55                  60
Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Ash Ala Cys
65                  70                  75                  80
Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg
                85                  90                  95
Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala
        115                 120                 125
Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu
    130                 135                 140
Gln Ser Gln Tle Asp Leu Leu Ala Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val
145                 150                 155                 160
Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Arg Leu Pro Lys Met Thr Gln Leu Ile
                165                 170                 175
Gly Leu Thr Pro Ash Ala Thr His Leu His Arg Pro Pro Arg Asp Cys
            180                 185                 190
Gln Glu Leu Phe Gln Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile
        195                 200                 205
Gln Pro Leu Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser
210                 215                 220
Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp
225                 230                 235                 240
Phe Asn Gln Ser Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln
                245                 250                 255
Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asn
            260                 265                 270
Arg Gly Ser Gln Leu Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Leu Leu Gln Phe Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr
    290                 295                 300
Ser Leu Gln Leu Thr Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn
305                 310                 315                 320
Val Ser Pro Asn Gly Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp
                325                 330                 335
His Asp Leu Arg Gly Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly
            340                 345                 350
Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe
        355                 360                 365
His Ser Ile Pro Arg Gln Arg Gln Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp
    370                 375                 380
Lys Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu
385                 390                 395                 400
Ile Gln Pro Met Glu Ala Thr Ala Ala Ser
                405                 410

Claims (61)

1.单克隆抗体，其特异结合ANGPTL4并且中和ANGPTL4的至少一种活性。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是小鼠单克隆抗体。
3.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人源化单克隆抗体。
4.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
5.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体增加LPL活性。
6.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体降低体内至少一种血清脂质的水平。
7.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：50的从残基21到残基174的区域内的表位。
8.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合SEQ ID NO：2的从残基21到残基169的区域内的表位。
9.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是14D12。
10.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是90B4。
11.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体特异结合与14D12相同的表位。
12.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体特异结合与15F2相同的表位。
13.权利要求1的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是抗体片段。
14.权利要求13的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是scFv片段。
15.权利要求13的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是Fab片段。
16.权利要求13的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是F(ab’)2片段。
17.权利要求13的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是Fab’片段。
18.特异结合ANGPTL4的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链包含：
a)SEQ ID NOs：12到14任一个中给出的氨基酸序列；
b)包含SEQ ID NOs：21、39和20任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；或
c)包含SEQ ID NOs：27到29任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；
其中所述抗体中和ANGPTL4的至少一种活性。
19.权利要求18的抗体，其中所述轻链包含：
a)SEQ ID NOs：16到18任一个中给出的氨基酸序列；
b)包含SEQ ID NOs：30到32任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；或
c)包含SEQ ID NOs：33到35任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR。
20.权利要求19的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO：12中给出的氨基酸序列并且其中所述轻链包含SEQ ID NO：16中给出的氨基酸序列。
21.权利要求19的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO：13中给出的氨基酸序列并且其中所述轻链包含SEQ ID NO：17中给出的氨基酸序列。
22.权利要求19的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO：14中给出的氨基酸序列并且其中所述轻链包含SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列。
23.权利要求19的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO：21中给出的CDR1，SEQ ID NO：39中给出的CDR2，和SEQ ID NO：20中给出的CDR3。
24.权利要求19的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO：27中给出的CDR1，SEQ ID NO：28中给出的CDR2，和SEQ ID NO：29中给出的CDR3。
25.权利要求19的抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO：30中给出的CDR1，SEQ ID NO：31中给出的CDR2，和SEQ ID NO：32中给出的CDR3。
26.权利要求19的抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO：33中给出的CDR1，SEQ ID NO：34中给出的CDR2，和SEQ ID NO：35中给出的CDR3。
27.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体是小鼠单克隆抗体。
28.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体是人源化单克隆抗体。
29.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
30.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体增加LPL活性。
31.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体降低体内至少一种血清脂质的水平。
32.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：50的从残基21到残基174的区域内的表位。
33.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体结合SEQ ID NO：2的从残基21到残基169的区域内的表位。
34.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体特异结合与14D12抗体相同的表位。
35.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体特异结合与90B4抗体相同的表位。
36.权利要求18的抗体，其中所述单克隆抗体是抗体片段。
37.权利要求36的抗体，其中所述抗体片段是scFv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、或Fab’片段。
38.特异结合ANGPTL4的抗体，其包含重链和轻链，其中所述轻链包含：
a)SEQ ID NOs：16到18任一个中给出的氨基酸序列；
b)包含SEQ ID NOs：30到32任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；或
c)包含SEQ ID NOs：33到35任一个中给出的氨基酸序列的至少一个CDR；
其中所述抗体中和ANGPTL4的至少一种活性。
39.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体是小鼠单克隆抗体。
40.权利要求39的抗体，其中所述单克隆抗体是人源化单克隆抗体。
41.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
42.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体增加LPL活性。
43.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体降低体内至少一种血清脂质的水平。
44.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：50的从残基21到残基174的区域内的表位。
45.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体结合SEQ ID NO：2的从残基21到残基169的区域内的表位。
46.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体特异结合与14D12相同的表位。
47.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体特异结合与90B4相同的表位。
48.权利要求38的抗体，其中所述单克隆抗体是抗体片段。
49.权利要求48的抗体，其中所述抗体片段是scFv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、或Fab’片段。
50.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO：40的肽。
51.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO：41的肽。
52.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO：43的肽。
53.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO：41的肽并且结合SEQ ID NO：43的肽。
54.药物组合物，其包含权利要求1-53任一项的单克隆抗体。
55.治疗脂质代谢疾病的方法，其包括对患者施用有效量的权利要求54的药物组合物。
56.降低一种或多种血清脂质的水平的方法，其包括对患者施用有效量的权利要求54的药物组合物。
57.治疗高甘油三酯血症的方法，其包括对患者施用有效量的权利要求54的药物组合物。
58.治疗高胆固醇血症的方法，其包括对患者施用有效量的权利要求54的药物组合物。
59.治疗肥胖症的方法，其包括对患者施用有效量的权利要求54的药物组合物。
60.治疗糖尿病的方法，其包括对患者施用有效量的权利要求54的药物组合物。
61.治疗缺血性(ischaemic)心脏病的方法，其包括对患者施用有效量的权利要求54的药物组合物。
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