CN101535332A - 用于提高抗体产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括抗体变体比如huC242的变体、或其片段的制造，其中，通过取代一个以上亲代抗体中的氨基酸残基来制造变体。这种取代优选在包含重链和轻链的亲代抗体的可变区构架序列中进行。这种取代的结果是，当被导入寄主细胞中时，与亲代抗体相比，变异的抗体或其片段显示出增强的抗体合成性。

Description

用于提高抗体产量的方法

[01]本申请要求于2006年10月31日申请的美国临时申请No.60/855,361的优先权，在此将其全部内容并入本文作为参考。

技术领域

[02]本发明涉及提高抗体产量的方法。更具体地说，涉及基因工程重新改造抗体的方法，以使得在寄主细胞中产生的基因工程再造抗体的产量相比基因工程再造抗体的亲代抗体产量更大。

背景技术

[03]单克隆抗体具有各种各样的应用，包括体外诊断、实验室试剂、以及治疗。当前，有至少200种经历临床试验的抗体或抗体片段(Morrow，K.J.，Jr.，单克隆抗体生产技术，Gen.Eng.News，2002，20(14)：21)。

[04]在CHO细胞中高水平表达抗体要求从转录到转译和分泌的最佳效力。通过使用有潜力的病毒增强子如hCMV立即早期基因增强子(immediate early gene enhancer)和启动子序列与转录稳定的聚腺苷酸化信号如SV40 poly A位点一起，哺乳动物表达质粒主要地被设计成能达到较高的mRNA水平。合成的cDNA构建体能够被设计成能通过删去抗体编码序列内隐蔽剪接位点及其他潜在的不利的顺式元件来更进一步增强mRNA水平。此外，通过最佳的密码子使用并且通过最小化mRNA二级结构能量，合成的构建体可以增强基因翻译机(Trinh R，Gurbaxani B，Morrison SL，Seyfzadeh M，在(GGGGS)3连结物序列内密码子对使用的优化导致提高的蛋白质表达，Mol Immunol.，2004年1月；40(10)：717-22)。然而，即使使用这样优化的表达系统，在哺乳动物细胞中的表达水平在不同的抗体当中也能够发生显著变化。从表达质粒中合成抗体分子所需的不同细胞阶段的分析导致抗体可变区性状能够影响给定抗体表达水平的观念。然而，人们很少知道序列特性和可变区结构不论转录或转译效率如何都能够影响基因表达。

[05]许多来源于特定次级的可变区基因的抗体是生物物理学地倾向于可能导致低基因表达的很小的稳定性。根据人类scFv噬菌体文库的分析，人类轻链和重链可变区能够被分类成具有不同程度结构稳定性的亚组(Ewert S，Honegge A，Plückthu A，用可归纳的方法进行的免疫球蛋白VH结构域生物物理学性状的基于结构的改进，Biochemistry，2003年2月18日；42(6)：1517-28)。属于具有很小稳定性的成员的亚群的抗体或片段可以具有聚集倾向，并且由于无效的折叠或装配而可能难以表达。

[06]进一步的，在一些过程如折叠和分泌中扮演关键角色的残基经常在种系序列中高度保守，但是在最初抗体库的传代以及经过体细胞突变的亲和力成熟期间可以被改变。这可能会导致稳定性很小并且低表达的抗体。单一残基变化能够显著地改变陪伴结合性或轻链/重链装配并且导致最终被降解的胞内未配对重链的增加(Dul J L，Argon Y.在轻链可变区中单一氨基酸置换尤其会阻断免疫球蛋白分泌。Proc Natl Acad Sci USA.1990年10月；87(20)：8135-9；Wiens GD，Lekkerkerker A，Veltman I，Rittenberg MB，在VH互补性确定区2中单一保守残基的突变导致严重的Ig分泌缺陷。J Immunol.，2001年8月15日；167(4)：2179-86)。其他的去稳定化突变包括导入隐蔽的疏水残基或表面疏水残基。无变化的核心填充残基如Glu 6/Gln 6的重链也对邻近位置如H7和H10的残基变化敏感(Honegger A，Plückthun A，在第6位隐蔽的谷氨酰胺或谷氨酸盐残基对免疫球蛋白可变区结构的影响。J Mol Biol.，2001年6月8日；309(3)：687-99)。只要体细胞突变不与关键的结构性阈值界限交叉，许多不符合生物物理学需要的序列能够在天然产生的抗体中被发现。

[07]多数抗体的稳定性和表达潜力能够用合理的序列基因工程再造方法增强。最简单的实现基因工程再造抗体的方法之一是，利用存在于有数千个抗体序列的数据库中的信息(参见，例如，Johnson G，WuTT.Kabat数据库及其应用：未来的方向，2001年1月1日；29(1)：205-6.)。仔细的分析或许可以识别可能有问题的残基。举例来说，在给定位置很少被发现的个别残基能够被改变以匹配用于该位置的共有序列残基从而提高稳定性(Steipe B，Schiller B，Plückthun A，Steinbacher S.序列统计学可靠地预测在蛋白质结构域中稳定化的突变体，J Mol Biol.，1994年7月15日；240(3)：188-92.)以及在哺乳动物细胞系中的表达(Whitcomb EA，Martin TM，Rittenberg MB，Ig分泌物的复原：在T15L链中种系编码的残基的变异导致游离轻链的分泌以及承受有损分泌物的重链的装配的抗体络合物，J Immunol.，2003年2月15日；170(4)：1903-9)。生物物理学攻击性的残基例如疏水表面残基的识别和逆转也会导致提高的表达(Nieba L，Honegger A，Krebber C，Plückthun A，疏水小块在抗体可变/恒定结构域界面处的断裂：基因工程scFv片段的改进的体内折叠和物理特性，Protein Eng，1997年4月；10(4)：435-44)。目前可用于支撑生物物理学稳定的抗体的合理再设计的大多数数据已经随着在细菌性表达的噬菌体展示系统中的抗体片段而产生(Ewert S，Honegger A，Plückthun A.用于胞外和胞内应用的抗体的稳定性提高：对稳定的构架和基于结构的构架基因工程的CDR嫁接，Methods，2004年10月；34(2)：184-99，综述)。

[08]在任何可能的情况下通过简单地从更稳定的种系亚群之一挑选人类供体可变区构架，通过CDR嫁接技术进行的人源化能够固定或者避免这些稳定性问题(Ewert等，2004，参见前述)。WO 2004/065417提供了一种进一步改进的方法，其通过将抗体可变域的高变区1(HVR1)和/或高变区2(HVR2)氨基酸序列与每一人类可变域亚群共有氨基酸序列中相应的HVR1和/或HVR2氨基酸序列相比较，并且选择与可变域的HVR1和/或HVR2氨基酸序列具有大多数序列一致性的亚群共有序列，在哺乳动物细胞培养物中以更高产率来生产这种抗体和/或抗原结合片段。在WO 2004/065417中，共有序列源自于具有最相同的HVR1和/或HVR2的抗体，并且被应用于嫁接CDR的抗体，其中所有的构架序列是完全的人类序列。

[09]其他的人源化方法，例如啮齿动物抗体表面重修(resurfacing)方法(美国专利No.5,639,641；Roguska MA，Pedersen JT，Keddy CA，Henry AH，Searle SJ，Lambert JM，Goldmacher VS，Blattler WA，Rees AR，Guild BC.通过可变域表面重修的鼠科单克隆抗体的人源化。Proc Natl Acad Sci USA.，1994年2月1日；91(3)：969-73；PedersenJT，Henry AH，Searle SJ，Guild BC，Roguska M，Rees AR.表面可以接近的残基在人类和鼠科的免疫球蛋白Fv结构域中的比较，对于鼠科抗体的人源化的暗示。J Mol Biol.，1994年1月21日；235(3)：959-73)、抗体镶饰(veneering)方法(美国专利No.6,797,492；Padlan E.A.1991，Mol，Immunolgy，28：489-498)、以及抗体去免疫化(deimmunizing)方法(申请公开WO 98/52976)，可以维持鼠科可变区的疏水核心。最终，这种在来源于具有较少生物物理学特性的鼠科种系的可变区具有鼠科核心结构的人源化抗体将可能继承这些特性。因此需要提供一种能够改善这种人源化抗体的生物物理学特性的方法。这些方法应产生较高的来自哺乳动物细胞的表面重修抗体的表达。

发明内容

[10]本发明提供了一种总体方法，用以改善导致抗体产量提高的抗体(在下文中称为“亲代抗体”)的生物物理学特性。该方法可以识别亲代抗体的可变区构架中一个以上非共有序列氨基酸残基，并且优选用一个以上共有序列残基代替它们。任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基替代。

[11]通过比对(aligning)来自根据假定的天然关系与亲代起源抗体所属相同的同种(例如，鼠科)、或者同属(例如，小鼠属和大鼠属)跨种、或者跨属或者其他系统分类的抗体的抗体可变区构架序列的集合，可以识别共有序列残基。

[12]更具体地讲，本发明包含一种方法，用于通过序列基因工程再造来提高在寄主细胞中亲代抗体或其表位结合片段的产量。该序列基因工程再造包括：

a)比对来自根据假定的天然关系与亲代起源抗体所属相同的同种(例如，鼠科)、或者同属(例如，小鼠属和大鼠属)跨种、或者跨属或者其他系统分类的抗体的抗体可变区构架序列的集合，其中，这种比对可识别在构架中各个位置处最频繁地出现的氨基酸残基；

b)将共有序列残基与亲代抗体可变区构架序列中的相应残基相比较；

c)在亲代抗体中识别可变区构架序列中一个以上非共有序列氨基酸残基；以及

d)在亲代抗体或其片段中用在等效位置处的共有序列残基取代一个以上非共有序列氨基酸残基，从而产生变异抗体，其中，在寄主细胞中以相比亲代抗体更高的产率来生产变异抗体。

[13]任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基替代。

[14]本发明通常还提供了一种方法，用以改善导致提高抗体产量的人源化抗体的生物物理学特性。该方法可以识别人源化抗体可变区构架的核心中一个以上非共有序列氨基酸残基，并且用一个以上共有序列残基代替它们。任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基替代。通过比对来自根据假定的天然关系与亲代起源抗体所属相同的同种(例如，鼠科)、或者来自同属(例如，小鼠属和大鼠属)跨种、或者来自跨属或者其他系统分类的抗体的抗体可变区构架序列集合，可以识别共有序列残基。

[15]因此，本发明包含一种方法，用于通过序列基因工程再造(sequence reengineering)来提高寄主细胞中的人源化抗体或其表位结合片段的产量。该序列基因工程再造包括：

a)比对来自根据假定的天然关系与人源化抗体起源所属相同的同种(例如，鼠科)、或者同属(例如，小鼠属和大鼠属)跨种、或者跨属或者其他系统分类的抗体的抗体可变区构架序列的集合，其中，这种比对可识别在构架中各个位置处最频繁地出现的氨基酸残基(共有序列残基)；

b)将共有序列残基与人源化抗体可变区构架序列中的相应残基相比较；

c)在人源化抗体中识别可变区构架序列中一个以上非共有序列残基；以及

d)在人源化抗体或其片段中用在等效位置处的共有序列残基取代所述一个以上非共有序列残基，从而产生变异抗体，其中，在细胞中以相比人源化抗体更高的产率来生产变异抗体。

[16]任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基替代。

[17]在另一个方面，本发明提供一种方法，用以改善导致提高抗体产量的人源化鼠抗体的生物物理学特性。该方法可以识别人源化抗体的可变区构架中一个以上非共有序列氨基酸残基，并且用一个以上共有序列残基代替它们。任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基替代。通过比对来自鼠抗体的抗体可变区构架序列的集合，可以识别共有序列残基。

[18]更具体地讲，本发明包含一种方法，用于通过序列基因工程再造来提高寄主细胞中的人源化鼠抗体或其表位结合片段的产量。该序列基因工程再造包括：

a)比对鼠抗体可变区构架序列的集合，其中，这种比对可以识别在构架中各个位置处最频繁地出现的氨基酸残基(共有序列残基)；

b)将共有序列残基与人源化抗体可变区构架序列中的相应残基相比较；

c)在人源化抗体中识别可变区构架序列中一个以上非共有序列氨基酸残基；以及

d)在人源化抗体或其片段的可变区构架序列中用在等效位置处的共有序列残基取代所述一个以上非共有序列残基，从而产生变异抗体，其中，在细胞中以相比人源化抗体更高的产率来生产变异抗体。

[19]任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基替代。

[20]本发明还包含编码变异抗体的分离的核酸。

附图说明

[21]图1显示了IgG抗体和重链及轻链可变区的示意图。重链和轻链可变区的草图被显示为右边，其中构架残基呈灰色，而CDR呈黑色。给出用于可变区端点以及用于各个CDR的分界线的Kabat抗体残基序列号。

[22]图2显示了在用含有huC242基因的质粒瞬时转染几小时后，293T细胞的较低的huC242产量。用于人源化抗体A、B和huC242的质粒的浓度被归一化，并且平行地以2μg/mL被导入293T细胞。在转染14hr、22hr和48hr后从培养基中收集分泌的抗体。通过使用抗huIgG1ELISA确定抗体浓度。

[23]图3显示了在瞬时转染的293T细胞中huC242HC和LC的mRNA水平。huC242及其它表面重修抗体A、B、C、D、E、F被平行地导入293T细胞。在转染72hr后从各个转染的细胞样本中分离总的mRNA，随后将样本逆转录成cDNA。

[24]图4显示了具有条带的凝胶，包括装配完整的抗体、标签H2L2、以及来自可产生huC242或表面重修Ab.A的CHO细胞的重链、标签H。Ab.A和huC242克隆1及克隆2的表达和装配被比较。用于Ab.A和两个C242克隆的CHO细胞系被平行地培养，并且溶解细胞。对整个细胞裂解液进行蛋白质A纯化。将分离出的IgG在不变性凝胶上进行分离并且用考马斯亮蓝染色。

[25]图5A显示了huC242抗体的重链可变区序列(SEQ ID NO：1)与Kabat数据库中鼠抗体的各自共有序列(SEQ ID NO：3)比对的情况。CDR的序列加有下划线并且用粗体标明。在序列间不同的残基用灰色背景以高亮度显示，而优选的在此详细论述的残基用黑色背景高亮度显示。表面残基在其下用星号“*”标明。

[26]图5B显示了huC242抗体的轻链可变区序列(SEQ ID NO：2)与Kabat数据库中鼠抗体的各自共有序列(SEQ ID NO：4)比对的情况。CDR的序列加有下划线并且用粗体标明。在序列间不同的残基用灰色背景以高亮度显示，而优选的在本专利中详细论述的残基用黑色背景高亮度显示。表面残基在其下用星号“*”标明。

[27]图5C显示了huC242抗体的轻链可变区序列(SEQ ID No：5)与来自免疫原的四个表面重修的人源化鼠抗体的各自共有序列(huMy96LC，SEQ ID NO：6；rB4LC，SEQ IDNO：7；huEM 164LC，SEQ ID NO：8；huN901 LC，SEQ ID NO：9；共有序列，SEQ ID NO：10)进行比对的情况，其显示，在四个人源化抗体中，氨基酸R对于在huC242中发现的非共有序列Q而言是保守氨基酸残基。在鼠的数据库中，R被最保守的氨基酸残基K取代。该情况下，由于两个氨基酸类似的特性，K可用R替换。尽管如此，Q用K置换的情况被包含在本发明范围内。比对以Kabat为基础。

[28]图6显示了在huC242HC或LC构架中单个氨基酸置换引起的IgG产量的适度提高。将具有单一构架氨基酸置换的huC242变体的生产率与亲代huC242和抗体B的生产率相比较。相等含量的质粒被转染入293T细胞。在72hr后，用ELISA确定分泌的IgG水平。通过FACS测量变异的huC242对表达抗原的Colo205细胞的结合。

[29]图7显示了通过在293T瞬时表达实验对象中两个或三个huC242HC和LC变种的组合使IgG产量显著提高。将原始huC242的生产率设定为1.0。在转染72hr后从培养基中收集分泌的IgG。

[30]图8显示了huC242HC和LC变体的mRNA水平保持未变。通过qPCR确定具体变异的huC242的mRNA水平，并且归一化成新mRNA。

[31]图9通过在变性凝胶上整体细胞裂解液的电泳，显示了胞内LC的蓄积量因HC构架残基取代而提高。293T细胞在转染72hr后被裂解。HC和LC分别用抗huIgG1抗体和抗huK抗体检测。

[32]图10(a)和10(b)显示了huC242变体导致在细胞中提高的HC和LC合成、以及整体抗体(H2L2)的提高的装配。

[33]图10(a)：293T细胞在转染72hr后被裂解。将裂解产物在凝胶上分离并且转印到薄膜上面，其被探测用于装配的和未装配的IgG HC和LC(在不变性的条件下进行电泳)。印迹被剥离并且用抗微管蛋白抗体再探测以显示样本加载水平。

[34]图10(b)：通过使用蛋白质A亲合磁珠，将IgG从如图10(a)所述制备的细胞裂解液中分离。然后将分离的样品在不变性凝胶上进行电泳，随后用考马斯亮蓝染色。

[35]图11(a)显示了huC242和huC242变体与Colo205细胞的结合性的FACS分析。Ab B是非结合性对照抗体。

[36]图11(b)显示了huC242和huC242变体的DM4接合物与Colo205细胞的结合性的FACS分析。Ab B是非结合性对照抗体。

[37]图11(c)显示了通过使用FACS分析得到的在Colo205细胞上亲代huC242抗体和变异的huC242抗体与FITC标记的亲代huC242竞争性结合的结果。抗体B用作非结合性、非竞争对照物。

[38]图12显示了huC242的重链(A组；SEQ ID NOs：11和12)和轻链(B组；SEQ IDNOs：13和14)的氨基酸和核酸序列。在C组中还显示了huC242的重链可变域序列(SEQID NO：15)和轻链可变域序列(SEQ ID NO：16)，描述了编码在huC242中被识别的氨基酸变化的密码子。

具体实施方式

[39]以下参考人源化的鼠抗体，对本发明进行描述。本领域的技术人员将会理解，基因工程再造(reengineering)方法能够被应用于任何有足够大的数据库的抗体，由该数据库可衍生出重链和/或轻链可变区的共有序列。

[40]对于人类抗原，产生单克隆抗体的标准途径是，用抗原免疫另一种动物种类，产生与动物免疫B细胞的杂交瘤，并且选择可分泌能结合于人类抗原的抗体的杂交瘤克隆。最常用的动物是小鼠或者大鼠，因此产生的抗体是鼠抗体。在人类体内使用对于人类抗原的单克隆抗体，用于各种疾病比如癌症、自身免疫疾病、炎症、以及感染的诊断目的或者治疗目的。然而在人类身上鼠源单克隆抗体的应用受到限制，因为该抗体会被认为是异种蛋白并且引起经常称为HAMA反应(human anti-mouse antibody response，人类抗小鼠抗体反应)的免疫反应。为防止HAMA反应，人们已经开发了多种用于鼠抗体人源化的方法。所有方法是用人类恒定区结构域替换鼠科恒定区结构域(对于IgG的结构域结构，请参见图1)，不同的是抗体可变区结构域的人源化策略。CDR嫁接的方法将6个CDR结构域从鼠的可变区通过代替人类CDR结构域而转移至同源的人类可变区，因此鼠的可变域构架区域被同源的人类构架区域完全替代。其他的人源化方法，比如啮齿动物抗体表面重修的方法(美国专利No.5,639,641；Roguska et al.，1994，Proc.Natl.Acad，Sci.USA.91：969-973，参见前述；Pedersen et al.，1994，J.Mol.Biol.，235：969-973，参见前述)、抗体镶饰的方法(美国专利No.6,797,492；Padlan E A 1991，Mol Immunolgy，28：489-498，参见前述)、以及抗体去免疫化的方法(国际专利申请公开WO 98/52976)维持了鼠的可变域构架区域的疏水核心，并且仅用人类残基改变构架区域中表面暴露的残基。例如，通过使用表面重修技术进行人源化的抗体在每种溶剂可接近的可变区构架位置中都含有人类残基，同时在CDR和隐蔽的可变区构架位置中保留鼠的残基。这些人源化抗体保持了原始鼠抗体的结合亲合力，该结合亲合力在其他的人源化方法比如CDR嫁接中当疏水核心被代替时经常会丧失。

[41]人源化抗体典型地通过使它们的基因在哺乳动物寄主细胞比如CHO(中国地鼠卵巢)细胞或T293细胞(人类肾细胞系)中表达而被生产出来。我们观察到通过表面重修技术制备的不同的人源化抗体在相同的哺乳动物寄主细胞中以不同的量被生产出来(图2)，虽然产生了类似量的用于抗体的mRNA(图3)。我们推断，可变区的初级氨基酸序列影响了抗体生产。因此，我们开发了一种提高在哺乳动物寄主细胞中人源化单克隆抗体生产率的方法，该抗体在可变域区域构架中具有隐蔽的鼠的氨基酸的核心。

缩写和定义

Mab    单克隆抗体

CH     重链的恒定区(结构域)

CH1、CH2、CH3  重链的恒定区1、2、和3

CL     轻链的恒定区

VH     重链的可变区(结构域)

VL        轻链的可变区(结构域)

CDR       互补性确定区域

CDRL1、CDRL2、CDRL3    轻链的互补性确定区域1、2、和3

CDRH1、CDRH2、CDRH3    重链的互补性确定区域1、2、和3

FR        可变域的构架区域(结构域)

FRL1、FRL2、FRL3、FRL4 轻链可变域的构架区域1、2、3、和4

FRH1、FRH2、FRH3、FRH4 重链可变域的构架区域1、2、3、和4

qPCR      定量聚合酶链反应

抗体的描述和定义

[42]如图1所示，抗体典型地包含两条通过二硫键连接在一起的重链和两条轻链。每一条轻链通过二硫键被连接于各自的重链上。每一条重链依序包含：从N-末端开始，可变域(区域)、恒定结构域(区域)1、铰合区、以及恒定结构域(区域)2和3。各条轻链具有在N-末端的可变域(区域)和在C-末端的恒定结构域。轻链可变域与重链的可变域排列在一起。轻链恒定结构域与重链的恒定结构域1排列在一起。在轻链和重链中的恒定结构域都不直接涉及抗原结合性。

[43]各对轻链和重链的可变域形成抗原结合位点。在轻链和重链上的结构域具有相同的普通结构，并且各个结构域包含具有四个区域的构架，这四个区域的序列相对保守，通过三个互补性确定区域(CDR)相连接。各个LC和HC的这四个构架区域主要采用β折叠构型，并且CDR形成环连接(loops connecting)，并且有时形成β折叠结构的一部分。抗体可变区的这6个CDR(来自LC和HC的各3个)被保持得非常接近于彼此和构架区域，并且形成抗原结合位点。通过参考Kabat，可以确定抗体的CDR和构架区域(“免疫学兴趣的蛋白质序列”。健康和人类服务美国部，美国政府印刷局，1987)。

[44]来自免疫球蛋白成熟重链和轻链可变区的氨基酸分别被标示为Hx和Lx，其中x是根据Kabat图表标示氨基酸位置的编号(参见前述)。Kabat列出了许多用于各个亚群(例如，小鼠、人类、大鼠等)抗体的氨基酸序列。Kabat使用了一种方法，用于对列出的序列中的各个氨基酸指定残基编号，并且用于指定残基编号的该方法已经变成本领域中的标准。通过参考保守的氨基酸，将所讨论的抗体与Kabat中共有序列之一进行比对，Kabat的图表可延伸至其他未包括在该纲要内的抗体。Kabat编号系统的使用可轻易地识别在不同抗体中的等效位置处的氨基酸。例如，在人类抗体Ln(n是任何整数，例如，5)位置处的氨基酸占据小鼠抗体第L5位的氨基酸的等效位置。通过使用Kabat(参见前述)中的编号方案，任何两个抗体序列仅能够以一种途径进行比对。因此，对于抗体，百分比一致性具有唯一性和定义明确的意义。

[45]在此使用的术语“构架区域”，指的是免疫球蛋白轻链和重链可变区的那些部分，所述可变区是在包含一个以上种类的属中不同免疫球蛋白间相对保守的区域(即，除CDR以外的区域)，正如Kabat等所定义的那样，参见前述。

[46]在此使用的术语“变异抗体”或“变体”，指的是氨基酸序列与亲代抗体氨基酸序列有区别的的抗体。这样的变体必要地与亲代抗体具有小于100％的序列一致性或者相似性。在一种优选实施方式中，变体的氨基酸序列将与亲代抗体重链或轻链可变域的氨基酸序列具有从约75％至小于100％的氨基酸序列一致性或者相似性；更优选一致性或者相似性为从约80％至小于100％、更优选从约85％至小于100％、更优选从约90％至小于100％、并且最优选从约95％至小于100％。相对于该序列的一致性或者相似性在此被定义为：在比对序列、以及必要时为取得最大百分比的序列一致性而导入的缺口染色体后，候选序列中与亲代抗体残基相同的氨基酸残基(即相同的残基)的百分比。N-末端、C-末端、或内部延伸部、缺失、或者插入可变域的抗体序列外侧之中的任一情况将不会被理解为影响序列一致性或者相似性。抗体变体通常是指，与亲代抗体对应的可变区相比在其可变区具有氨基酸取代(被一个以上氨基酸残基取代；例如，被至少一个至大约二十五个氨基酸残基、并且优选被大约一个至大约十个氨基酸残基取代)的抗体变体。

[47]在此使用的术语“亲代”抗体，包括由在自然群体中起主要作用的基因所产生的抗体。还包括自然突变体形式的抗体。进一步包括已经由抗体的这种自然群体或者由它们的自然突变体产生、或者很可能被生产出来的抗体。这样的抗体包括，但是不限于，人源化或表面重修的抗体、完全人源的抗体、或嵌合抗体、或者任何能够按照本发明的教导被产生或操控的抗体。这种抗体通常具有结合专一性或者具有原始抗体的抗原结合性残基，但是在有些情况下，这种抗体还可以具有不同的结合专一性。例如，抗体可以显示出提高的对于抗原的结合专一性，所述抗原是部分地与原始抗原相关或者与原始抗原无关。

[48]亲代抗体的一个非限制性实施例是“亲代C242抗体”，指的是具有属于、或来源于鼠源C242抗体的抗原结合性残基的抗体(美国专利No.5,552,293)或其衍生物。例如，单克隆抗体C242可以是鼠源单克隆抗体或人源化的鼠源单克隆抗体、嵌合体鼠源单克隆抗体、完全人源的鼠源单克隆抗体、具有鼠源单克隆抗体C242抗原结合性残基的C242。

[49]靶向疗法比如抗体定向疗法优于非靶向疗法，非靶向疗法例如是经口服或静脉注射进行药物给药的系统疗法、或者全身疗法例如外部辐射疗法(XRT)。抗体定向疗法的优点、尤其是通过使用单克隆抗体(MAb)的疗法的优点是有能力将治疗剂的剂量释药至肿瘤，使正常组织更不受治疗剂影响的破坏。该定向疗法使用无保护的MAb或接合于细胞结合剂的MAb，所述细胞结合剂例如是药物、抗菌素或其他毒素、放射性核素、以及中子捕获试剂比如硼附加物。

[50]术语“表位”包括任何能够特异性结合于免疫球蛋白的蛋白质决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖类侧链，并且通常具有特定的三维结构特性、以及特定的荷电特性。

[51]如果在该位置处发现小于10％的在鼠抗体的大数据库中的所有抗体序列，则氨基酸残基被称作在构架区域序列中给定位置处的稀有可变区构架残基。

[52]大数据库的例子是Kabat抗体数据库(参见，例如，Johnson G，Wu TT.Kabat数据库及其应用：未来的方向。Nucleic Acids Res.2001年1月1日；29(1)：205-6)。大的抗体数据库含有至少1000个单个抗体可变区序列。

[53]使用上述定义，在不受限于特定实施方式的情况下，提供下述讨论以便于理解本发明。

[54]在一个非限制性方面，本发明提供一种增强在哺乳动物细胞中人源化抗体产量的方法，该抗体具有鼠的可变区核心结构。该方法可以识别鼠的可变区构架核心中的非共有序列氨基酸残基，并且用鼠的共有序列的氨基酸残基代替它们。

[55]因此，在一种实施方式中，本发明包括抗体变体或其片段的制造，其中，通过用来自共有序列可变区构架序列的对应残基取代一个以上亲代抗体中的氨基酸残基来制造变体。这种取代的结果是，当被导入寄主细胞中时，与亲代抗体相比，变异的抗体或其片段显示出增强的抗体合成性。

[56]在亲代抗体中，取代优选是用对应的共有序列氨基酸残基取代一个以上非共有序列氨基酸而进行，所述非共有序列氨基酸是通过将亲代抗体的每一重链和轻链可变域构架区域的序列与重链和轻链可变域构架区域的共有序列进行比对而识别的。

[57]在一种优选的实施方式中，亲代抗体中氨基酸残基的取代是在重链中进行的。在另一种优选的实施方式中，这种氨基酸取代是在轻链中进行的。在亲代抗体重链或轻链中的这种取代能够独立地或者同时地进行。共有序列源自于抗体亚群的序列，所述抗体属于根据假定的天然关系与亲代起源抗体所属相同的同种(例如，鼠科)、或者同属跨种(例如，小鼠属和大鼠属)、或者跨属或者其他系统分类。

[58]在另一个实施方式中，本发明提供一种方法，用于在寄主细胞中与亲代抗体相比可提高变异抗体或其片段的产量，该方法包含：

a)将亲代抗体的每一重链和轻链可变域构架区域序列与重链和轻链可变域构架区域的共有序列进行比对，其中共有序列的重链或轻链序列源自于鼠抗体可变域的数据库；

b)用鼠的重链共有序列残基取代亲代抗体可变域构架区域中的一个以上重链残基，或者用鼠的共有序列轻链残基取代亲代抗体可变域构架区域中的一个以上轻链残基，其中，当被导入寄主细胞中时，该取代会以相比亲代抗体更高的产率来产生变异抗体或其片段；

c)在亲代抗体中识别轻链中的选自于Q45或者A70的一个以上氨基酸残基、或者重链中的选自于E16、D26、K46或T89的一个以上氨基酸残基，所述氨基酸残基通过Kabat抗体残基编号方案确定；以及

d)用下述残基取代亲代抗体中的一个以上氨基酸残基：轻链中分别选自于K45(任选地，出于生物物理学考虑，K可以被非共有序列残基R替代)或D70的一个以上氨基酸残基；或重链中分别选自于A16、G26、E46或S46或V89的一个以上氨基酸残基，其中，当被导入寄主细胞中时，该取代会以相比亲代抗体更高的产率来产生变异抗体或其片段。

[59]在重链或轻链中的取代能够独立地或者同时地进行。

[60]在一种优选的实施方式中，在变异抗体轻链中，Q45被K45(任选地，出于生物物理学考虑，K可以被非共有序列残基R替代)取代并且A70被D70取代，而在变异抗体重链中，E16被A16取代；D26被G26取代；K46被E46或S46取代；并且T89被V89取代。这种取代优选可以将变异抗体产率提高至少约100％或约200％。在一种优选实施方式中，产率是至少约300％或更大。在一种更优选的实施方式中，产率是约400％或更大。在一种最优选的实施方式中，产率是约500％或更大。变体蛋白质产率的提高还依赖于其他的因素，比如，但不限于，生长因子的应用或者用无血清培养基来培养细胞。

[61]本发明还包括分离的核酸，该核酸包含全长的鼠的或人的、人源化的或嵌合的C242编码序列，该序列在用于编码重链可变区或轻链可变区的序列区域中具有氨基酸密码子中的至少一个变种，其中，所述至少一个变种可以提高被C242基因编码的蛋白质的产率，并且其中该蛋白质包括被所述至少一个密码子变种编码的至少一个氨基酸变种。

[62]在轻链中，取代选自于下述构架位置(Kabat编号方案)：

Q45至K45；任选地，出于生物物理学考虑，K可以用非共有序列残基R替代。

A70至D70

[63]在重链中，取代选自于下述构架位置(Kabat编号方案)：

E16至A16

D26至G26

K46至E46

T89至V89

[64]这种序列取代可以编码作为变异抗体的变体C242基因产物。

[65]本发明还包括用于提高抗体产率的方法，该抗体是亲代抗体的变体，来自通过在亲代抗体中取代SEQ ID NO：1(重链)或SEQ ID NO：2(轻链)上的一个以上氨基酸残基的寄主细胞培养物，该方法包括：

a)将SEQ ID NO：1(重链)与共有序列重链序列进行比对，或者将SEQ ID NO：2(轻链)与共有序列轻链序列进行比对，其中，通过使用氨基酸序列分析软件比如Vector NTI(Invitrogen公司)比对重链和轻链免疫球蛋白可变区构架，由鼠抗体序列数据库(例如，Kabat数据库-Johnson和Wu，2001)得到共有序列重链或轻链序列；

b)在亲代抗体中识别一个以上氨基酸残基，该残基选自于SEQ ID NO：1中的E16、D26、K46或T89、以及SEQ ID NO：2中的Q45或A70，氨基酸残基由Kabat方案确定；以及

c)分别地，用选自于来自共有序列的SEQ ID NO：1中的A16、G26、E46、S46或V89的氨基酸残基取代SEQ ID NO：1中的一个或多个氨基酸残基E16、D26、K46或T89；并且用选自于来自共有序列的SEQ ID NO：2中的K45(任选地，出于生物物理学考虑，K可以用非共有序列残基R替代)或D70的氨基酸残基取代SEQ ID NO：2中的一个或多个氨基酸残基Q45或A70，其中，取代会导致变异抗体的产生，并且其中当变异抗体被导入寄主细胞时，变体的产率大于亲代抗体产率。

[66]在另一个实施方式中，本发明包括一种变异抗体或其表位结合片段比如huC242变体，其中，该变体在亲代抗体中有一个以上氨基酸取代，所述亲代抗体具有包含SEQ IDNO：1的重链[huC242重链]和SEQ ID NO：2的轻链[huC242轻链]的可变区；并且当被导入单一寄主细胞中时，与亲代抗体相比，该变体显示出提高的重链和/或轻链合成量、以及提高的重链/轻链装配量，其中，所述取代是在选自于SEQ ID NO：1中第16、26、46、或89位的一个以上重链可变区位置进行，或者是在SEQ ID NO：2中的第45位或70位轻链可变区位置、或在这两个位置处进行，所述位置通过Kabat编号方案确定。更优选变异抗体具有选自下组的氨基酸取代：轻链残基Q45至K45(任选地，出于生物物理学考虑，K可以用非共有序列残基R替代)或者A70至D70；重链残基E16至A16、D26至G26、K46至E46、或者T89至V89，并且该取代位于重链或轻链的构架区域。

[67]在另一个实施方式中，本发明的细胞结合剂还可特异性地识别配体比如C242抗原(CD44/CanAg)，使得接合物将与靶细胞接触足够的时间周期，以允许接合物的细胞毒试剂部分作用于细胞，和/或允许接合物有足够的时间被细胞内在化。

[68]在一种优选的实施方式中，细胞毒性接合物包含抗C242抗体的变体作为细胞结合剂，更优选细胞毒性接合物包括选自于下组的变体：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V；A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G抗体或其表位结合片段。这些抗体能够特异性地识别C242抗原(CD44/CanAg)，并且以靶向方式将细胞毒试剂定向至异常的细胞或组织例如癌细胞。

[69]本发明的细胞毒性接合物的第二组成部分是细胞毒试剂。在此使用的术语“细胞毒试剂”指的是可以降低或者阻断细胞的功能或生长和/或引起细胞消亡的物质。

[70]在优选的实施方式中，细胞毒试剂是紫杉醇、美登木素生物碱(maytansinoid)比如DM1或者DM4、CC-1065或CC-1065类似物。在优选的实施方式中，本发明的细胞结合剂直接地、或者经由可分裂的或不可分裂的连接物而被共价附接于细胞毒试剂。

[71]在另一个实施方式中，通过将药物靶向于配体比如C242抗原(CD44/CanAg)，人源化抗体或其表位结合片段能够被接合于药物比如美登木素生物碱，从而形成具有针对抗原表达细胞的特异性细胞毒性的前体药物。包含这些抗体和较小的、高毒性的药物(例如，美登木素生物碱、紫杉烷(taxanes)、以及CC-1065类似物)的细胞毒性接合物可以用作治疗剂而被用于肿瘤比如乳腺癌和卵巢肿瘤的治疗。

[72]因此，在一种实施方式中，按照本发明的教导生产的亲代抗体的抗体变体可以作为无保护的抗体或者作为起细胞结合剂作用的抗体而被用于靶向疗法。

细胞毒试剂

[73]在本发明的细胞毒性接合物中使用的细胞毒试剂可以是任何可导致细胞死亡的、或诱导细胞死亡的、或以某种方式降低细胞成活力的化合物。优选的细胞毒试剂包括：例如，如下限定的美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物、紫杉醇类(taxoids)、CC-1065和CC-1065类似物、海兔毒素(dolastatin)和海兔毒素类似物。这些细胞毒试剂被接合于在此公开的抗体、抗体片段、功能等价物、改进的抗体和它们的类似物。

[74]通过体外方法可以制备细胞毒性接合物。为了将药物或前体药物连接于抗体，连接基团被使用。合适的连接基团为本领域技术人员所熟知，并且包括二硫基、硫醚基团、对酸不稳定基团、对光不稳定的基团、对肽酶不稳定的基团和对酯酶不稳定的基团。优选的连接基团是二硫基和硫醚基团。例如，通过使用二硫化物交换反应、或者通过在抗体和药物或者前体药物之间形成硫醚键，能够构建出接合物。

美登木素生物碱

[75]在可以在本发明中使用从而形成细胞毒性接合物的细胞毒试剂中，有美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物。合适的美登木素生物碱的例子包括美登木醇和美登木醇类似物。美登木素生物碱是可抑制微小管形成并且对哺乳动物细胞是高毒性的药物。

[76]合适的美登木醇类似物的例子包括具有修饰的芳香环的那些类似物以及在其他位置处具有修饰物的那些类似物。在美国专利No.4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307，016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；以及5,846,545中公开了一些合适的美登木素生物碱的例子。

[77]具有修饰的芳香环的合适的美登木醇类似物的具体例子包括：

(1)C-19-脱氯(美国专利No.4,256,746)(通过安沙霉素(ansamytocin)P2的LAH还原反应制备)；

(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌或放线菌经过脱甲基化反应制备或者通过使用LAH经过脱氯反应制备)；以及

(3)C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰氯经过酰化作用制备)。

[78]具有其他位置的修饰物的合适的美登木醇类似物的具体例子包括：

C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(通过美登木醇与H₂S或P₂S₅的反应制备)；

C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH₂OR)(美国专利No.4,331,598)；

C-14-羟甲基或者酰氧基甲基(CH₂OH或CH₂OAc)(美国专利No.4,450,254)(由诺卡氏菌制备)；

C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)(通过链霉菌转化美登木醇而制备)；

C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)(从滑桃树分离出来)；

C-18-N-脱甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌对美登木醇进行脱甲基化而制备)；以及

4，5-脱氧(美国专利No.4,371,533)(通过美登木醇经三氯化钛/LAH还原反应而制备)。

[79]在一种优选的实施方式中，本发明的细胞毒性接合物利用含有硫醇的美登木素生物碱DM1作为细胞毒试剂，DM1的正式名称为：N²-脱乙酰基-N²-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。DM1由下述结构式(I)：L(I)表示。

[80]在另一个优选的实施方式中，本发明的细胞毒性接合物利用含有硫醇的美登木素生物碱DM4作为细胞毒试剂，DM4的正式名称为：N²-脱乙酰基-N²-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素。DM4由下述结构式(II)表示：

在本发明的另一种实施方式中，可以使用其他的美登素，包括含有硫醇和二硫化物的在连接硫原子的碳原子上进行单烷基取代或二烷基取代的美登木素生物碱。这些物质包括：在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基、或C-20去甲基处具有连接有位阻硫氢基的酰基基团的酰化氨基酸侧链的美登木素生物碱。其中，连接有硫醇官能团的酰基基团的碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基是具有1～10个碳原子的线性烷基或者烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状烷基或烯基、苯基、经取代的苯基、或杂环芳香族或杂环烷基基团。进一步地，取代基之一能够是H，并且其中酰基基团在羰基官能团和硫原子之间具有至少三个碳原子的直链长度。

[81]这些额外的美登素包括结构式(III)表示的化合物：

其中：

Y′代表

(CR₇R₈)_l(CR₉＝CR₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_t(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ

其中：

R₁和R₂各自独立地是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或者杂环芳香族或杂环烷基基团，并且另外R2能够是H；

A、B、D是具有3～10个碳原子的环烷基或者环烯基、简单的或取代的芳基或杂环芳香族或杂环烷基基团；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、以及R₁₂各自独立地是H、具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或者杂环芳香族或杂环烷基基团；

l、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自独立地是0或者1到5的整数，只要1、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为零；并且

Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、或者简单的或取代的芳基或杂环芳香族或者杂环烷基基团。

[82]结构式(III)的优选实施方式包括结构式(III)所示的化合物，其中：

R₁是甲基、R₂是H并且Z是H。

R₁和R₂是甲基，并且Z是H。

R₁是甲基、R₂是H、并且Z是-SCH₃。

R₁和R₂是甲基、并且Z是-SCH₃。

[83]这些额外的美登素还包括结构式(IV-L)、(IV-D)、或者(IV-D，L)代表的化合物：

其中：

Y代表(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ

其中：

R₁和R₂各自独立地是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基基团，并且另外R2能够是H；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立地是H、具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基基团；

l、m和n各自独立地是1到5的整数，并且另外n能够是0；

Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、或者简单的或取代的芳基或杂环芳香族或杂环烷基基团；并且

May代表在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或者C-20去甲基处连接侧链的美登木素生物碱。

[84]结构式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的优选实施方式还包括结构式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)代表的化合物，其中：

R₁是甲基，R₂是H，R₅、R₆、R₇、以及R₈各自是H，l和m各自是1，n是0，并且Z是H。

R₁和R₂是甲基，R₅、R₆、R₇、R₈各自是H，l和m各自是1，n是0，并且Z是H。

R₁是H，R₂是甲基，R₅、R₆、R₇、以及R₈各自是H，l和m各自是1，n是0，并且Z是-SCH₃。

R₁和R₂是甲基，R₅、R₆、R₇、R₈各自是H，l和m是1，n是0，并且Z是-SCH₃。

[85]优选细胞毒试剂由结构式(IV-L)表示。

[86]这些额外的美登素还包括分子式(V)表示的化合物：

其中，

Y代表(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ

其中：

R₁和R₂各自独立地是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环芳香族或杂环烷基基团，并且另外R₂能够是H；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立地是H、具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基基团；

l、m和n各自独立地是1到5的整数，并且另外n能够是0；并且

Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、或者简单的或取代的芳基或杂环芳香族或杂环烷基基团。

[87]结构式(V)的优选实施方式包括结构式(V)所示的化合物，其中：

R₁是甲基；R₂是H；R₅、R₆、R₇、以及R₈各自是H；l和m各自是1；n是0；并且Z是H。

R₁和R₂是甲基；R₅、R₆、R₇、R₈各自是H；l和m是1；n是0；并且Z是H。

R₁是甲基，R₂是H，R₅、R₆、R₇、以及R₈各自是H，l和m各自是1，n是0，并且Z是-SCH₃。

R₁和R₂是甲基，R₅、R₆、R₇、R₈各自是H，l和m是1，n是0，并且Z是-SCH₃。

[88]这些额外的美登素进一步包括结构式(VI-L)、(VI-D)、或者(VI-D，L)代表的化合物

其中：

Y′代表

(CR₇R₈)_l(CR₉＝CR₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_l(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ，

其中：

R₁和R₂各自独立地是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环芳香族或杂环烷基基团，并且另外R₂能够是H；

A、B、D是具有3～10个碳原子的环烷基或者环烯基、简单的或取代的芳基或杂环芳香族或杂环烷基基团；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、以及R₁₂各自独立地是H、具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或者杂环芳香族或杂环烷基基团；

l、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自独立地是0或者1到5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为零；

Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、或者简单的或取代的芳基或杂环芳香族或杂环烷基基团；并且

May是美登木素生物碱。

[89]结构式(VI)的优选实施方式包括结构式(VI)所示的化合物，其中：

R₁是甲基、R₂是H并且Z是H。

R₁和R₂是甲基，并且Z是H。

R₁是甲基、R₂是H、并且Z是-SCH₃。

R₁和R₂是甲基，并且Z是-SCH₃。

[90]上述美登木素生物碱能够被接合于变异的抗C242抗体：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V；A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段；其中，通过使用硫醇或二硫化物官能团，抗体被连接于美登木素生物碱，其中，硫醇或二硫化物官能团存在于酰化氨基酸侧链的酰基基团上，该酰基基团在美登木素生物碱的C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处被发现；并且其中，酰化氨基酸侧链的酰基基团具有位于其上有一个或两个取代基的碳原子上的硫醇或者二硫化物官能团，所述取代基是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环芳香族或杂环烷基基团，并且另外的取代基之一能够是H，并且其中，酰基基团在羰基官能团和硫原子之间具有至少三个碳原子的直链长度。

[91]本发明的接合物的一种优选实施方式是，其包括下述结合于结构式(VIII)所示美登木素生物碱的变体：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V；A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。

其中：

Y₁′代表

(CR₇R₈)_l(CR₉＝CR₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_l(CR₃R₄)_nCR₁R₂S-

其中：

R₁和R₂各自独立地是CH₃、C₂H₅、具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环芳香族或杂环烷基基团；并且另外R₂能够是H；

A、B、以及D各自独立地是具有3～10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基、或者杂环芳香族或杂环烷基基团；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、以及R₁₂各自独立地是H、具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或杂环芳香族或杂环烷基基团；并且

l、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自独立地是0或者1到5的整数，只要l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少两个不同时为零。

[92]优选R₁是甲基、R₂是H，或者R₁和R₂都是甲基。

[93]本发明的接合物更优选的实施方式是，其包括下述结合于结构式(IX-L)、(IX-D)、或者(IX-D，L)所示美登木素生物碱的变异的抗C242抗体：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V；A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。

其中，

Y₁代表(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂S-，

其中：

R₁和R₂各自独立地是具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基、杂环芳香族或杂环烷基基团，并且另外R₂能够是H；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立地是H、具有1～10个碳原子的线性的烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链状或环状的烷基或烯基、苯基、经取代的苯基或者杂环芳香族或杂环烷基基团；

l、m和n各自独立地是1到5的整数，并且另外n能够是0；并且

May代表在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或者C-20去甲基处连接侧链的美登木醇。

[94]结构式(IX-L)、(IX-D)和(IX-D，L)的优选实施方式包括结构式(IX-L)、(IX-D)和(IX-D，L)代表的化合物，其中：

R₁是甲基、R₂是H，或者R₁和R₂都是甲基，

R₁是甲基；R₂是H；R₅、R₆、R₇和R₈各自是H；l和m各自是1；n是0，

R₁和R₂是甲基；R₅、R₆、R₇和R₈各自是H；l和m是1；n是0。

[95]优选细胞毒试剂由结构式(IX-L)表示。

[96]本发明的接合物进一步优选的实施方式是，其包括下述结合于结构式(X)所示美登木素生物碱的变异的抗C242抗体：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V；A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。

其中，取代基是为用于上述结构式(IX)而限定的取代基。

[97]本发明的接合物进一步优选的实施方式是，其包括下述结合于结构式(XI)所示美登木素生物碱的变异的抗C242抗体：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V；A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。

其中，取代基是为用于上述结构式(VIII)而限定的取代基。

[98]尤其优选是上述化合物的任何一种，其中R₁是H，R₂是甲基，R₅、R₆、R₇和R₈各自是H，l和m各自是1，并且n被是0。

[99]进一步优选是上述化合物的任何一种，其中R₁和R₂是甲基，R₅、R₆、R₇、R₈各自是H，l和m各自是1，并且n是0。

[100]进一步地，L-氨酰基立体异构体是优选的。

[101]具有1～10个碳原子的线性烷基或烯基的例子包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、丙烯基、丁烯基和己烯基。

[102]具有3～10个碳原子的支链烷基或烯基的例子包括，但不限于，异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、1-乙基-丙基、异丁烯基和异戊烯。

[103]具有3～10个碳原子的环状烷基或烯基的例子包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环戊烯、以及环己烯基。

[104]简单的芳基包括具有6～10个碳原子的芳基。取代芳基包括具有6～10个碳原子的芳基，该芳基连接有至少一个含有1～4个碳原子的烷基取代基，或者烷氧基取代基比如甲氧基、乙氧基，或者卤素取代基或硝基取代基。

[105]含有6～10个碳原子的简单芳基的例子包括苯基和萘基。

[106]取代芳基的例子包括硝基苯基、二硝基苯基。

[107]杂环芳基包括具有含有一个或两个选自N、O或S的杂原子的3至10元环的基团。

[108]杂环烷基基团包括环状化合物，其包含含有一个或两个选自N、O或S的杂原子的3至10元环体系。

[109]杂环芳基的例子包括吡啶基、硝基-吡啶基、吡咯基、恶唑基、噻吩基、噻唑基、以及呋喃基。

[110]杂烷基基团的例子包括二氢呋喃基、四氢呋喃基、四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、以及吗啉基。

[111]也可以在本发明的细胞毒性接合物中使用美国专利No.7,276,497公开的每一种美登木素生物碱。将美国专利No.7,276,497全部的公开内容引入本发明作为参考。

含有二硫化物的连接基团

[112]为了将美登木素生物碱连接至抗体，比如变异的抗C242抗体：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V：A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G，美登木素生物碱包含连接部分。该连接部分含有允许在特定位点处释放全活性的美登木素生物碱的化学键。合适的化学键为本领域技术人员所熟知，并且包括二硫键、对酸不稳定的键、对光不稳的键、对肽酶不稳定的键和对酯酶不稳定的键。优选是二硫键。

[113]该连接部分还包含反应性的化学基团。在优选的实施方式中，反应性的化学基团能够经由二硫键连接部分而被共价结合于美登木素生物碱。

[114]尤其优选的反应性化学基团是N-琥珀酰亚胺酯和N-硫代琥珀酰亚胺酯。

[115]尤其优选的包含含有反应性化学基团的连接部分的美登木素生物碱是美登木醇的C-3酯及其类似物。其中连接部分含有二硫键，并且化学反应基团包含N-琥珀酰亚胺酯或者N-硫代琥珀酰亚胺酯。

[116]在美登木素生物碱上的许多位置能够用作化学连接连接部分的位置。例如，具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置全部被预期是有用的。然而优选是C-3位置，并且尤其优选美登木醇的C-3位置。

[117]虽然具有连接部分的美登木醇酯的合成在关于含有二硫键的连接部分中进行了描述，但本领域的技术人员将会理解，具有其他化学键(如上所述)的连接部分也可以被用于本发明，如同能够使用其他的美登木素生物碱那样。其他化学键的具体例子包括对酸不稳定的键、对光不稳定的键、对肽酶不稳定的键和对酯酶不稳定的键。在此并入本文的美国专利No.5,208,020的公开教导了连接有这些键的美登木素生物碱的生产。

[118]具有连接有反应基团的二硫化物部分的美登木素生物碱及美登木素生物碱衍生物的合成在引入本文以供参考的美国专利No.6,441,163和6,333,410、以及美国专利公开No.2003-0055226A1中被描述。

[119]使含有反应基团的美登木素生物碱例如DM1与下述变异的抗C242抗体起反应，从而产生细胞毒性接合物：A70D；Q45K/R；D26G；K46E；K46E/T89V；K46E/K82S；K46E/E16A/D26G；A70D/K46E/T89V；K46E/D26G；K46E/K82S/D26G；K46E/T89V/D26G；A70D/K46E；Q45K(R)/K46E/T89V：A70D/D26G；Q45K(R)/K46E；A70D/K46E/D26G；Q45K(R)/D26G；Q45K(R)/K46E/D26G。这些接合物可以通过高效液体色谱(HPLC)或者通过凝胶过滤进行纯化。

[120]在其全部内容并入本文的美国专利No.6,333,410、6,411,163和6,716,821以及美国专利公开No.2003-0055226 A1中提供了数种出色的用于生产这种抗体-美登木素生物碱接合物的方案。

[121]通常，可以将缓冲水溶液中的抗体溶液与过量摩尔的具有连接反应基团的二硫化物部分的美登木素生物碱一起孵育。通过添加过量的胺类(比如乙醇胺、牛磺酸等)，反应混合物能够被抑制。然后美登木素生物碱-抗体接合物能够通过凝胶过滤进行纯化。

[122]每抗体分子结合的美登木素生物碱分子的数量能够通过分光光度法测量在252nm和280nm处吸光度的比率而确定。优选1-10个美登木素生物碱分子/抗体分子的平均值。

[123]能够评估抗体与美登木素生物碱药物的接合物在体外抑制各种不希望有的细胞系增殖的能力。例如，细胞系比如人类表皮样癌细胞系A-431、人类小细胞肺癌细胞系SW2、人类乳腺肿瘤细胞系SKBR3以及伯基特氏淋巴瘤细胞系Namalwa能够容易地用于这些该化合物的细胞毒性的评定。待被评估的细胞能够暴露于化合物24小时，并且通过已知的方法直接测定受测细胞的残存部分。然后能够由测定的结果计算出IC₅₀值。

含有PEG的连接基团

[124]通过使用PEG连接基团，也可以将美登木素生物碱连接于抗体，如同在美国专利No.6,716,821中的阐述。这些PEG连接基团在水中和非水溶剂中都是可溶的，并且能够被用于将一个以上细胞毒试剂连接于细胞结合剂。例举的PEG连接基团包括异型双功能的PEG连接物，其在连接物的两端位置可通过在一个端部的功能性巯基或二硫基、以及在另一端部的活性酯而结合细胞毒试剂和细胞结合剂。

[125]作为通过使用PEG连接基团合成细胞毒性接合物的普通例子，请再次参考美国专利No.6,716,821的详述。该合成开始于一个以上连接有反应性PEG部分的细胞毒试剂与抗体的反应，导致各个反应性PEG部分的末端活性酯被抗体的氨基酸残基置换，从而产生细胞毒性接合物，该细胞毒性接合物包含一个以上通过PEG连接基团共价结合于抗体的细胞毒试剂。

其他的连接基团

[126]包含不可分裂的连接物的美登木素生物碱接合物在美国专利公开No.2005-0169933A1中被描述，将其全部的公开内容引入本发明作为参考。

紫杉烷

[127]在根据本发明的细胞毒性接合物中使用的毒性剂也可以是紫杉烷或其衍生物。

[128]紫杉烷是一个化合物家族，其包括作为细胞毒的天然产物的紫杉醇(Taxol)、以及作为半合成衍生物的紫杉萜(Taxotere)，这两个化合物在癌症治疗中被广泛使用。紫杉烷是有丝分裂纺锤体毒物，其可抑制微管蛋白的解聚，导致细胞死亡。虽然紫杉萜和紫杉醇在癌症治疗中是有用的试剂，但由于它们针对正常细胞的非专一性毒性，它们的抗癌活性受到限制。另外，化合物比如紫杉醇和紫杉萜本身没有充足的潜力用于细胞结合剂的接合物。

[129]优选用于细胞毒性接合物的制备的紫杉烷是结构式(XI)所示的紫杉烷：

[130]用于合

成可以在本发明的细胞毒性接合物中使用的示例性紫杉烷的方法，以及用于将紫杉烷接合至细胞结合剂比如抗体的方法，在美国专利No.5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738、6,436,931、6,596,757、6,706,708和6,716,821以及美国专利公开No.2004-0024049A1中被详细描述。

CC-1065类似物

[131]在根据本发明的细胞毒性接合物中使用的毒性剂也可以是CC-1065或其衍生物。

[132]CC-1065是从链丝菌(Streptomyces zelensis)培养肉汤中分离的有潜力的抗肿瘤抗生素。CC-1065的体外效力比通常使用抗癌症药物比如阿霉素、氨甲蝶呤和长春新碱的效力高约1000倍(B.K.Bhuyan et al.，CancerRes.，42，3532-3537(1982))。用于本发明的合适的CC-1065及其类似物的非限制性的例子在美国专利No.6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499中被公开。

[133]CC-1065的细胞毒效力与其烷基化活性及其DNA结合活性或者DNA插入活性有关。这两种活性在于分子中的分离部分。因此，烷基化活性被包含在环丙基吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole，CPI)亚基中，而DNA结合活性在于两个吡咯并吲哚亚基。

[134]虽然CC-1065作为细胞毒试剂具有特定的有吸引力的特征，但其在治疗用途中有限制。将CC-1065给药小鼠会引起迟滞的肝脏毒性，导致在12.5μg/kg的单个静脉注射剂量后第50天死亡{V.L.Reynolds et al.J Antibiotics，XXIX，319-334(1986)}。这激发人们努力开发不会引起缓发毒性的类似物，并且模拟CC-1065的更简单的类似物的合成已经被描述{M.A.Warpehoski et al，J.Med.Chem.，31，590-603(1988)}。

[135]在本发明中有用的另一系列的类似物中，CPI部分被环丙基苯并吲哚(cyclopropabenzindole，CBI)部分替代{D.L.Boger et al.，J.Org.Chem.，55，5823-5833，(1990)，D.L.Boger et al.，BioOrg.Med.Chem.Lett.，1，115-120(1991)}。这些化合物维持较高的亲本药物的体外效力，没有引起小鼠体内缓发毒性。类似于CC-1065，这些化合物是以共价方式结合于DNA小沟从而引起细胞死亡的烷基化试剂。然而，最有前途的类似物阿多来新(Adozelesin)和卡折来新(Carzelesin)的临床评估导致了令人失望的结果{B.F.Fosteret al.，Investigational New Drugs，13，321-326(1996)；I.Wolff et al.，Clin.Cancer Res.，2，1717-1723(1996)}。由于它们较高的系统毒性，这些药物显示出很差的治疗效果。

[136]通过经由靶向释药至肿瘤位点来改变体内分配，导致对非靶向组织的较低毒性、从而导致较低的系统毒性，CC-1065类似物的治疗效能能够被大大地提高。为了实现这一目标，特异性地靶向肿瘤细胞的类似物和CC-1065衍生物与细胞结合试剂的接合物已经被描述{美国专利No.5,475,092；5,585,499；5,846,545}。这些接合物典型地显示出较高的体外靶向特异性的细胞毒性、以及在小鼠体内的人肿瘤异种移植模型中异常的抗肿瘤活性{R.V.J Chad et al.，Cancer Res.，55，4079-4084(1995)}。

[137]用于合成可以在本发明的细胞毒性接合物中使用的CC-1065类似物的方法，以及用于将这些类似物接合至细胞结合剂比如抗体的方法，在美国专利No.5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660、6,586,618和6,756,397以及美国专利公开No.2003-0195365A1中被详细描述。

其他药物

[138]药物比如氨甲蝶呤、道诺红菌素、阿霉素、长春新碱、长春花碱、米尔法兰、自力霉素、苯丁酸氮芥、加里刹霉素(calicheamicin)、微管利辛(tubulysin)和微管利辛类似物、多卡霉素(duocarmycin)和多卡霉素类似物、海兔毒素和海兔毒素类似物、比如奥里丝定(auristatins)和类似物也适合于本发明的接合物的制备。这些药物分子还可以通过中间载体分子比如血清白蛋白被连接于抗体分子。例如，在美国申请序列No.09/740991中描述的道萨比辛(Doxarubicin)和达诺比辛(Danorubicin)化合物也可以是有用的细胞毒试剂。这些药物还可以用于如下所述的共同疗法(co-therapy)。

共同疗法

[139]术语“组合疗法”(或“共同疗法”)意思是指变异抗体比如huC242抗体的变体、化学治疗剂、或免疫毒素的应用，并且包括各个试剂以将提供有利的药物组合效果的依序摄入的方式给药。共同疗法同样包括这些试剂以基本同时的方式的共同给药，比如摄取比率固定的这些活性试剂的单个剂量剂、或者对于各个试剂摄取多个分离的药物。“组合疗法”还包括同时的或者依序的通过静脉注射、肌内注射或其他肠胃外途径进入身体的给药，包括通过粘膜组织的定向吸收，比如在鼻窦通道中发现的给药。依序的给药还包括药物组合，其中单个元素可以在不同的时间、和/或通过不同的途径给药，但是其在组合中起作用从而提供有利的效果。

[140]术语“治疗性有效的”是指使用于组合疗法的各个试剂的量合格，将会实现减小或抑制肿瘤例如抑制肿瘤扩散的改进目标，同时避免典型地与各个试剂有关的不良副作用。

[141]优选的组合疗法将基本上包含两个以上活性试剂，即，变异的huC242无保护的抗体或其接合物，以及其他不同于变异抗体的选自免疫毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或抗体的试剂。这些试剂将在组合中以如下重量比使用：无保护的抗体或其接合物：其他试剂中的任何一个为约0.5:1～20:1。最终取决于抗体或接合物以及其他试剂中的任何一个的选择，这两种试剂优选的范围将是：约1:1至约15:1；更优选的范围将是：约1:1至约5:1。取决于病人需要，抗体或其接合物对其他试剂的比率还可以是相反的。例如，在最初治疗后，如果发现病人对其他试剂之一的较高剂量与变异的无保护抗体或其接合物相比更敏感，这种给药方法的提供者能够转换比率，以使得治疗更有效。免疫毒素的制备是本技术领域众所周知的(参见，例如，引入本发明作为参考的美国专利No.4,340,535)。进一步将每一个下述专利和专利申请引入本发明作为参考，用于更进一步补充关于免疫毒素产生、纯化和使用的现有教导的目的：美国专利No.5,855,866；5,776,427；5,863,538；6,004,554；5,965,132；6,051,230以及5,660,827和美国专利申请系列No.07/846,349。

[142]还可以将变异的抗体比如huC242变体直接或间接地结合于免疫调节剂。在能够以某些方式通过本发明的抗体增加肿瘤消亡的生物反应调节物(比如免疫调节剂)中，包括淋巴激活素，例如：肿瘤坏死因子、巨噬细胞活化因子、集落刺激因子、干扰素等。

[143]当共同疗法涉及可注射的复合物时，其可以进一步包含选自下组的治疗剂：激素、免疫抑制剂、抗生素、细胞抑制剂、利尿剂、肠胃病药、心血管的试剂、消炎剂、止痛药、局部麻醉剂、以及神经药理学试剂，其中，给药这些试剂以降低任何副作用的风险。

治疗剂组合物

[144]本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物高增生性紊乱(hyperproliferative disorder)的治疗剂组合物，其包含治疗有效量的本发明的变异抗体和药学可接受的载体。在一种实施方式中，药物组合物被用于治疗肺、乳房、结肠、前列腺、肾、胰腺、卵巢、宫颈以及淋巴器的癌症、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤或其中CanAg被表达的癌、以及其他还有待于确定其中CanAg被主要表达的癌症。在另一个实施方式中，药物组合物涉及治疗其他的紊乱，例如：自身免疫疾病，比如系统的狼疮、变形性关节炎、以及多发性硬化；移植排斥，比如肾移植排斥、肝脏移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥、以及骨髓移植排斥；对抗宿主移植疾病；病毒感染，比如mV感染、HIV感染、AIDS等；以及寄生虫感染，比如贾第鞭毛虫病、阿米巴病、血吸虫病、以及其它被本领域的普通技术人员确定的感染。

[145]本发明提供药物组合物，其包含：

有效量的本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物，以及

药学可接受的载体，其可以是惰性的或生理学活性的载体。

[146]在此使用的术语“药学可接受的载体”包括任选的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、及其生理学相容的类似物。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、及其类似物、以及其组合中的一种或多种。许多情况下，优选在组合物中包括等渗试剂，比如糖类、多元醇或氯化钠。特别地，有关的合适的载体的例子包括：(1)Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，pH～7.4，含有或者不含约1mg/ml至25mg/ml的人血清白蛋白；(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))；以及(3)5％(w/v)葡萄糖；还可以含有抗氧化剂比如色胺、以及稳定剂例如吐温(Tween)20。

[147]在此组合物也可以进一步含有为治疗中的特定紊乱所必需的治疗剂。优选本发明的变异抗体或其表位结合片段或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物、以及补充的活性化合物将具有不会不利地影响彼此的互补的活性。在一种优选实施方式中，进一步的治疗剂是成纤维细胞生长因子(FGF)拮抗剂、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板源性生长因子(PDGF)、或HER2受体。

[148]本发明的组合物可以呈多种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体、以及固体剂型，但优选的形式取决于想要的给药和治疗性应用模式。典型的优选的组合物是呈可注射的或能注入的溶液形式。优选的给药模式是肠胃外给药(例如静脉注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射)。在一种优选实施方式中，本发明的组合物是作为丸剂(bolus)的静脉内给药，或者通过在一段时期内的连续输注给药。在另一种优选的实施方式中，它们通过肌内注射、皮下注射、关节内注射、滑膜内注射、肿瘤内注射、肿瘤周围注射、病灶内注射、或病灶周围注射的途径注入，以发挥局部的以及系统的治疗效果。

[149]通过在适当的溶剂中以要求的含量合并本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物，接着通过微过滤灭菌，能够制备出用于肠胃外给药的无菌组合物。作为溶剂或媒介物，可以使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、及其类似物、以及其组合。许多情况下，优选在组合物中包括等渗试剂，比如糖类、多元醇或氯化钠。这些组合物也可以含有辅助剂，尤其是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外给药的无菌组合物也可以以无菌的固体组合物形式被制备，其可以在无菌水或任何其他的可注射的无菌培养基中使用时被溶解。

[150]本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物也可以被口服给药。作为用于口服的固体组合物，可以使用药片、药丸、粉末(胶囊、香粉)或者颗粒。在这些组合物中，在氩气保护下将根据本发明的活性成分与一种以上惰性稀释剂比如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅相混合。这些组合物也可以包含除稀释剂之外的物质，例如一种以上润滑剂比如硬脂酸镁或滑石粉、颜料、涂层(糖衣片剂)或光滑面。

[151]而用于口服的液体组合物，可以使用药学可接受的溶液、悬浮液、乳剂、糖浆和含有惰性稀释剂比如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油的酏剂。这些组合物可以包含除稀释剂之外的物质，例如润湿剂、甜味剂、增稠剂、调味剂或稳定化产品。

[152]剂量取决于预期效果、治疗的持续时间和采用的给药途径；对于成年人口服，它们通常是5mg～1000mg每天，活性物质单位剂量范围为1mg～250mg。一般来讲，取决于具体的被治疗主体的年龄、体重和任何其他因素，医生将确定适当的剂量。

[153]本发明的改进的或者变异的抗体或其接合物能够作为激动剂或拮抗剂而被用于治疗剂型，通过把具有期望纯度的变体或其接合物与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混和起来，这些剂型呈水溶液或者冻干剂型形式被制备以用于存放[Remington药物科学，第16版，Osol，A.Ed.(1980)；美国专利申请No.10/846,129]。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括：缓冲液，比如磷酸盐、柠檬酸盐、以及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(比如十八基二甲基苯基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁基或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸比如甲基或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，比如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，比如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖；二糖；以及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，比如EDTA；糖类，比如蔗糖、甘露醇、海藻糖或者山梨糖醇；形成盐的平衡离子，比如钠；金属络合物(例如，锌-朊络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如吐温^TM(Tween^TM)、普卢兰尼克^TM(Pluronic^TM)、或聚乙二醇(PEG)。

[154]也可以在脂质体中配制变体。通过本技术领域已知的方法制备含有所研究分子的脂质体，这些方法比如在文献Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688(1985)；Hwanget al，Proc.Natl Acad.Sci.USA77：4030(1980)以及美国专利No.4,485,045和4,544,545中有描述。具有增强的循环时间的脂质体在美国专利No.5,013,556中被公开。

[155]特别有用的免疫脂质体(immunoliposomes)能够通过反相蒸发方法(reverse phaseevaporation method)用脂类组合物产生，所述脂类组合物包括磷脂酰胆碱、胆固醇以及PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂质体通过限定孔径大小的过滤器被挤出，从而产生具有期望直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段能够经由二硫化物交换反应而被结合于如文献Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述的脂质体。化学治疗剂(比如阿霉素)任选地被包含在脂质体内部。参见Gabizon et al.，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。

[156]在此剂型也可以含有一种以上为治疗中的特定适应症所必需的活性化合物，优选这些活性化合物具有互补的不会彼此不利地影响的活性。这些分子以对于预定目标有效的含量适当地组合存在。例如，C242变体或其接合物可以与共同治疗剂例如化学治疗剂组合。

[157]活性成分也可以例如通过凝聚技术或者通过界面聚合而被包含在制备的微胶囊中，例如分别包含在羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊中，包含在胶态药物发送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊剂)中，或者包含在粗滴乳状液(macroemulsion)中。这些技术在文献Remington药物科学第16版，Osol，A.Ed.(1980)中被公开。

[158]将用于体内给药的剂型必须是无菌的。这可以通过上述讨论的无菌过滤膜的过滤而轻易地完成。

[159]可以制备缓释制品。合适的缓释制品的例子包括半透性的含有拮抗剂的固体疏水性聚合物基质，其中基质呈成型物品例如薄膜、或微胶囊的形态。缓释基质的例子包括：聚酯，水凝胶[例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚乙烯醇]，聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物比如Lupron Depot^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮丙瑞林醋酸酯(Leuprolide acetate)组成的可注射的微球体)，以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然聚合物比如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能使分子的释放超过100天，但特定的水凝胶在更短的时间周期内释放蛋白质。当用微囊封装的抗体在身体内长时间保持时，由于37℃下暴露于湿环境，它们可能会变性或者聚集，导致生物活性的损失和免疫原性可能的改变。取决于有关的机制，能够设计合理的策略用于稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物交换而形成的分子间S-S键，那么通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适当的添加剂、以及开发特定的聚合母体组合物，可以实现稳定化。

采用的治疗方法

[160]在另一个实施方式中，本发明提供一种方法，用于通过将可以对抗抗CD44/CanAg(抗原)功能的抗体给药于需要其的病人来抑制C242抗原活性。可以治疗性地使用任何本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物。

[161]在一种优选的实施方式中，本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物被用于治疗哺乳动物高增生性紊乱。在更优选的实施方式中，上述公开的含有本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物的药物组合物之一，被用于治疗哺乳动物高增生性紊乱。优选地，该紊乱是肺、乳房、结肠、前列腺、肾、胰腺、卵巢、宫颈以及淋巴器的癌症、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤或其中CanAg被表达的癌、以及其他还有待于确定其中CanAg被主要表达的癌症。在另一个实施方式中，所述药物组合物涉及治疗其他的紊乱，例如：自身免疫疾病，比如系统的狼疮、变形性关节炎、以及多发性硬化；移植排斥，比如肾移植排斥、肝脏移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥、以及骨髓移植排斥；对抗宿主移植疾病；病毒感染，比如mV感染、HIV感染、AIDS等；以及寄生虫感染，比如贾第鞭毛虫病、阿米巴病、血吸虫病、以及其它被本领域的普通技术人员确定的感染。

[162]类似地，本发明提供一种方法，用于通过单独地、或者与其他的细胞毒试剂或治疗剂组合地使用有效量的本发明的变异抗体或其表位结合片段、或细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物；或者包含变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物的治疗剂，来抑制被选择的包括接触性靶细胞的细胞群的生长、或抑制含有表达CanAg的靶细胞的组织的生长。

[163]用于抑制被选择的细胞群的生长的方法能够在体外、在体内、或体表外实践。这里使用的术语“抑制生长”是指，减慢细胞的生长、降低细胞成活力、引起细胞死亡、溶解细胞和诱导细胞死亡，而不论周期长短。

[164]体外使用的例子包括：在其移植入同一病人体内之前处理自体的骨髓，以便杀死病态的或恶性的细胞；在其移植之前处理骨髓，以便杀死有竞争性的T细胞并且抑制移植对抗宿主病(graft-versus-host-disease，GVHD)；处理细胞培养物，以便杀死除不表达靶抗原的期望变体之外的所有细胞；或者杀死表达不希望有的抗原的变体。

[165]本领域的普通技术人员容易确定非临床的体外使用的条件。

[166]临床的体表外使用的例子是：在癌症治疗中或者在自身免疫病治疗中的自体移植之前，从骨髓中除去肿瘤细胞或淋巴样细胞；或者在移植之前，从自体的或异体的骨髓或组织中除去T细胞及其他淋巴样细胞，以便防止移植对抗宿主病(GVHD)。治疗能够按如下进行。从病人或其他个体体内收集骨髓，然后在含有血清的培养基中孵育，该血清内加入了本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物。浓度范围为10μm～1pm，在约37℃下保温约30分钟至约48小时。本领域的普通技术人员可以轻易地确定孵育时浓度和时间的精确条件，即，剂量。在孵育后，用含有血清的培养基洗涤骨髓细胞，并且根据已知的方法通过静脉内注射将其返回到病人体内。病人在收集骨髓和再输注处理后细胞之间的时间内接受其他治疗、比如一系列使人虚弱的化疗或全身辐射的情形中，通过使用标准医疗器械，将处理的骨髓细胞在液氮中冷冻储存。

[167]对于临床的体内使用，本发明的变异抗体或其表位结合片段、或者细胞毒试剂与变异抗体或其表位结合片段的接合物将被作为用于无菌测试和内毒素水平测试的溶液供应。细胞毒性接合物给药的合适方案的例子如下所述。每周接合物被作为静脉内注射丸剂给药，持续4周。丸剂剂量在50～100mL的生理盐水中给药，该生理盐水中可以加入5～10mL的人血清白蛋白。剂量将是每次静脉内给药10μg至1g(每天100ng至10mg/kg的范围)。更优选，剂量将为50μg至30mg。最优选剂量将是1mg至20mg。在治疗四周后，病人能够继续接受基于每周的治疗。本领域的普通技术人员可根据临床状态确定关于给药途径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床方案。

诊断

[168]本发明的抗体或抗体片段还可以被用于体外或者在体内检测生物样品中的C242抗原(抗CD44/CanAg)。在一种实施方式中，本发明的变异的C242抗体被用于确定组织中或者来源于组织的细胞中的抗CD44/CanAg水平。在一种优选实施方式中，组织是有病的组织。在该方法的一种优选实施方式中，组织是肿瘤或其活检样本。在该方法的一种优选实施方式中，组织或其活检样本首先从病人身上切除，然后能够在使用本发明的抗体或抗体片段的免疫测定中确定组织或活检样本中的抗CD44/CanAg水平。组织或其活检样本能够被冷冻或者固定。该相同的方法能够被用于确定抗CD44/CanAg的其他特性，比如转译修饰(例如，乙二醇化(glycolation))、细胞表面水平、或者细胞定位。

[169]上述方法能够被用于诊断已知或怀疑患有癌症的主体的癌症，其中，将在所述病人体内测量的CanAg水平与正常的参考主体或者标准相比较。然后所述方法能够被用于确定肿瘤是否表达CanAg，这可以建议肿瘤将较好地应答本发明的抗体、抗体片段或抗体接合物的治疗。优选地，该肿瘤是肺、乳房、结肠、前列腺、肾、胰腺、卵巢、宫颈以及淋巴器的癌症、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤或其中CanAg被表达的癌、以及其他还有待于确定其中CanAg被主要表达的癌症。

[170]本发明进一步提供被进一步标记的变异的单克隆抗体、变异的人源化抗体及其表位结合片段，用于研究或者诊断应用。在优选的实施方式中，标签是放射性同位素示踪、荧光团、生色团、显影剂或金属离子。

[171]本发明还提供了一种诊断方法，其中所述标记的抗体或其表位结合片段将被给药于怀疑患有癌症的主体，并且在主体体内的标签分布被测量或者监控。

试剂盒

[172]本发明还包括试剂盒，例如，其包含描述的细胞毒性接合物和关于使用细胞毒性接合物杀死特定细胞类型的说明书。该说明书可以包括体外、在体内或者体表外使用细胞毒性接合物的指导。

[173]典型地，试剂盒将具有包含细胞毒性接合物的分隔室。该细胞毒性接合物可以呈冻干形式、液体形式、或者其它可修正成被包含于试剂盒中的形式。该试剂盒也可以包含额外的为实践试剂盒中说明书上描述的方法所需要的组成部分，比如用于重新构成冻干粉的无菌溶液、用于在给药于病人之前与细胞毒性接合物组合的附加的试剂、以及有助于将接合物给药于病人的工具。

共有序列的设计

[174]通过标记在Kabat鼠抗体序列数据库中各个位置出现的残基，产生共有序列。用序列分析和数据管理软件“VectorNTI”(Invitrogen公司的产品)中的ClustalW模块比对数千个轻链和重链可变区序列。同时请参见Lu G，Moriyama EN VectorNTI，平衡的归一化(all-in-one)序列分析程序组，BriefBioinform，2004年12月；5(4)：378-88。将比对结果输进Microsoft Excel电子数据表，以计算哪些残基是最频繁地出现在鼠的轻链和重链可变区数据库中各个位置处，然后输出结果，作为“共有”序列。必要时，能够在两个氨基酸残基间将共有序列分开，其中，将两个保守氨基酸中的较小出现者挑选出来，以增强所考虑的抗体的生物物理学特性或者人源化。例如，在本案中，轻链中的Q45被R替代，R不会取代具有鼠的共有序列残基K的非共有序列残基。这些观测结果对本领域的技术人员而言是显而易见，从而无需过度的实验或者提供这些具体细节。

[175]通过购买许可证，可在市场上买到Kabat序列数据库。另外，数千个鼠抗体序列被公布，可在NCBI网址上下载，并且能够被用于产生类似的数据。

[176]所有在此引用和在下述实施例中引用的参考文献的全部内容被以参考形式并入本文。

[177]参考下述实施例，可以透彻地理解本发明的保护范围，但不应将本发明限定为具体的实施方式。

实施例

材料

[178]通过标准的CsCl₂纯化技术，制备出pSynC242和对照质粒制品。由Stratagene公司得到了QuikChange定位诱变体系(#200518)。RNeasy微型试剂盒(#74104)购自Qiagen公司。用于逆转录酶反应的Superscript First Strand Synthesis System(#11904-418)购自GibcoBRL公司。从APPLY BIOSYSTEM公司得到了Cyber Green实时PCR Master Mix(#4309155)。荧光接合物链霉抗生物素蛋白(Flourescencein Conjugated Streptavidin)(#016-010-0841mg/mL)来自Jackson Immuno Research。从FALCON公司购得96孔的U底平板(#3077)。EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(#21335)来自Pierce公司。

方法

通过定点诱变的huC242HC和LC构架上的氨基酸取代

引物设计

[179]用于突变反应的互补的PCR引物对长度为30个碱基，并且在引物当中包含期望的核苷酸置换。其中引物经PAGE纯化并且以150ng/μL的浓度进行重构。

PCR突变反应

[180]PCR反应按如下方式进行：5μL的10x反应缓冲液(购自Stratagene)、20ng的dsDNA模板、0.85μL(125ng)的正向引物、0.85μL(125ng)的反向引物、1μL的400mM dNTP(购自Stratagene)，以及ddH₂O在薄壁的epidorf管中被加至50μL的最终体积。最后，将1μL的Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5U/μL，购自Stratagene)加入反应混合物中，并且将epidorf管置于MJ Research热循环控制器中。反应条件如下所述：95℃下1个循环，30秒；95℃下12个循环，30秒；接着55℃下1分钟；并且68℃下11分钟(1分钟/kb，共11kb模板)；当两个碱基将被改变时，将循环数增加到14；在68℃下1个循环，8分钟；4℃下保持。

竞争性细胞的转化按如下进行：

[181]通过用甲基化依赖性限制性内切酶Dpnl(购自Stratagene)消化，中和PCR模板DNA。用直接加入到PCR反应物中并且在27℃下保温1小时的1μL的Dpnl进行限制性消化。然后通过将3μL经Dpnl消化的PCR产物加入至50μL的XL-1竞争性细胞(购自Stratagene)、在冰上保温30分钟、接着42℃下加热脉动45秒、返回到冰上2分钟、然后加入0.5mL的SOC缓冲液用于在37℃和225rpm转速摇动下最终孵育1小时，来转化该反应物。将转化的细胞平铺在LB/Amp平板(300μL每个平板)上，并且在37℃下保温过夜。

突变的确认

[182]使用Qiagen微型制品柱从转化菌落中分离质粒DNA并且通过琼脂糖凝胶电泳筛选。通过VH和VL区域测序，对维持同一电泳迁移率而作为模板DNA的质粒做进一步分析，以便确认期望的突变产品。测序反应通过标准的自动测序技术(Sterky F，Lundeberg J。基因和基因组的序列分析。J Biotechnol.2000年1月7日；76(1)：1-31)进行。

瞬时转染

[183]用Qiagen公司的Superfection试剂盒进行使用抗体表达质粒的瞬时转染。为确保测试质粒间的转染等效性，DNA浓度通过OD₂₆₀进行测量，并且通过在琼脂糖凝胶上的显象进行确认。在转染之前，3×10⁵个293T细胞被铺入6孔盘上的每个孔中。用2μg的质粒DNA将转染混合物补至每孔0.6mL(或用于空白对照的TE)，接着将其与15μl的Superfect(购自Qiagen)相混合，并且在RT下保温10min。该混合物被加至293T细胞，然后将其置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2hr。接着，用细胞培养基洗涤细胞，并且最后置于1ml培养基中，在37℃、5％CO₂的培养箱中保温0hr、14hr、22hr和48hr，以允许抗体产生。在转染0hr、14hr、22hr和48hr后，从培养基中收集分泌的抗体。通过抗huIgG1定量ELISA(QE)测量抗体浓度。

定量ELISA

[184]在涂敷有抗羊人类IgG抗体(The Binding Site有限公司，英国，产品代码AU0006)的96孔板中于室温下进行定量ELISA1小时。该孔板然后用PBS中1％新生山羊血清在室温下封闭1小时。转染上清液进行连续的稀释，并且被涂覆于封闭的平板，接着在室温下再孵育1hr。该ELISA平板然后用PBS/0.05％Teen-20洗涤4次，加入二次抗体(过氧化物酶结合的抗人Kappa抗体(The Binding Site有限公司，英国，产品代码AP015)，并且平板再次在室温下被孵育1小时。最后，用PBS/0.05％ Teen-20洗涤平板4次，并且加入ABTS(0.5mg/ml ABTS、0.1M柠檬酸盐缓冲液中0.03％ H₂O₂)。在OD₄₀₅处读取ELISA平板吸光度，并且相对于内标吸光度计算出人类IgG1浓度。

原始huC242和突变huC242的mRNA和胞内HC/LC水平的定量比较

总RNA分离物

[185]试剂盒操作之后用Qiagen RNeasy旋转柱(spin columns)从6×10⁶个瞬时转染的293T细胞中分离总的RNA。细胞进行胰蛋白酶化、用PBS洗涤、以及团粒化细胞，除去上清液，并且细胞团在-80℃下冷冻过夜。细胞团在500μL的含有1％(v/v)β-巯基乙醇的RLT缓冲液中进行破裂，彻底地混合，然后通过20号针(20-gauge needle)进行均质化5次。将500μL的70％乙醇加入各个匀浆产物中，混合试管，然后将700μL的样本施加于RNeasy微型柱，并且将试管在10,000rpm下旋转15秒。弃去流经物，并且用350μL缓冲液RW1洗涤柱子，接着再在10,000rpm下旋转15秒。用80μL加至柱膜中心的脱氧核糖核酸酶I(DnaseI)溶液(70μL缓冲液RDD中的10μL脱氧核糖核酸酶I)除去细胞的DNA、在RT(20-30℃)下保温15min，然后将350μL缓冲液RW1加入柱中，并且将试管在10,000rpm下旋转15秒。弃去流经物，并且将柱子转移入新的2mL接收管，用500μL缓冲液RPE进行如下两次附加的洗涤：第一次洗涤，在10,000rpm下旋转15秒：第二次洗涤，在10,000rpm下旋转2分钟。该柱被置于新的2mL接收管，并且全速旋转1分钟，以便使柱子完全干燥。最后，将柱子转移至新的1.5mL接收管，并且用30μL无核糖核酸酶的水洗脱RNA，并且在10,000rpm下旋转1分钟。通过OD₂₆₀测量RNA浓度，然在-80℃下储存后样本。

cDNA合成

[186]试剂盒操作之后使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen公司)进行第一条cDNA链的合成反应。用3μg总RNA、3μL任意六聚体(random hexamer)、1μL的10mMdNTP制备反应混合物，接着用DEPC处理过的水使体积达到10μL。该混合物在65℃下保温5分钟，然后放在冰上至少1分钟。将2μL的10x RT缓冲液、4μL的25mMMgCl₂、2μL的0.1M DTT、以及1μL的RNaseOUT核糖核酸酶抑制剂加入各个反应物中，混合，并且在25℃下保温2min。接着，将1μL(50U)Superscript II逆转录酶加入各个试管，混合，并且在25℃下保温10分钟、42℃下保温50min、70℃下保温15min，然后在冰上冷却。通过短暂旋转收集反应物，并且在进行定量PCR之前，用核糖核酸酶H(将1μL核糖核酸酶H加入各个试管，并且在37℃下保温20分钟)除去RNA。

定量PCR的进行

[187]通过使用Cyber Green Real Time PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems公司)，在96孔平板中进行定量PCR反应。按1:500稀释逆转录酶反应物，并且将10μL的各个样本一式三份铺入孔中。对于各个引物对，通过使用10μL的按1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600比例稀释的一种RNA样本，产生标准曲线(4-5个点)。对于各个样本，使用对各个质粒上出现的新霉素抗性基因特异的引物对，还一式三份地进行内部转染对照。对于各个样本，通过使用肌动蛋白特异性引物，还进行分离的细胞数量对照。将15μL的反应混合物(各为0.05μL的100μM引物、12.5μL的2X Cyber Green PCR MasterMix和2.4μl的ddH₂O)加入各个实验孔和对照孔。在被置于ABI prism7000实时热循环器之前，平板被密封并旋转，以便收集内容物。按如下进行反应：在95℃下10分钟；接着95℃下15秒，40个循环；60℃下1分钟。用ABl prism 7000软件分析原始数据。

胞内重链和轻链水平的分析

[188]将细胞稳定表达的IgG或者细胞瞬时表达的IgG在RIPA缓冲液中裂解，并且将蛋白质浓度归一化。对细胞裂解产物在变性或不变性条件下进行电泳。在电泳之前，视需要通过蛋白质A沉淀技术对裂解产物中的IgG进行纯化或浓缩。使用抗人IgG抗体和抗人LCK抗体，通过Western blotting技术分析了丙烯酰胺凝胶以便分别地显现重链和轻链条带。

huC242对抗原阳性细胞的结合亲合力的测量

非竞争性的结合

[189]用FACS缓冲液(RPMI培养基中2.5％NGS)将huC242和变异的抗体归一化为1-2μg/ml。将两份50μL样本施加于96孔平板，并且在FACS缓冲液中按1:1进行连续的稀释。将Colo205细胞再悬浮于FACS缓冲液，至4×10⁶个细胞/mL，并且以50μL加入各个孔中。将平板孵育2小时，然后用每孔200μL FACS缓冲液洗涤2次，接着在4℃、1200rpm下旋转5分钟。除去上清液，并且将50μL的FITC标记的二次抗体(在FACS缓冲液中按1:100稀释)加入各个孔，并且将平板在4℃下保温30分钟。最后，按如上所述洗涤平板，并且用200μL/孔的PBS中1％甲醛固定细胞。在BD FACScalliber流式细胞仪上通过荧光分析了相对的抗体对靶细胞的结合。

竞争性结合

[190]使用在室温下保温1小时的1mg/mL的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce#21335)将huC242生物素化。用牛磺酸抑制反应，然后用1XPBS在4℃下透析过夜。将生物素化huC242稀释至1.6×10^-9M，最终的反应物浓度为4×10^-10M。

[191]未标记huC242和变异抗体按1:2的比例由4×10^-8M连续稀释至1×10^-11M，并且将50μL的各个样本加至平板。接着，通过上下吸动3次，每孔混入50μL的生物素化huC242。Colo205细胞用FACS缓冲液洗涤两次，以2×10⁵个细胞/ml再悬浮，并且以100μL混入含有抗体混合物的各个孔中。该平板在冰上保温2小时，用FACS缓冲液洗涤2次，然后加入50μL按1:100稀释的结合荧光素的链霉抗生物素蛋白。接着，平板在冰上保温1小时，用FACS缓冲液洗涤2次，并且用每孔200μL的PBS中1％甲醛固定细胞。在BD FACScalliber流式细胞仪上分析竞争性结合。

发现了在瞬时转染293T细胞后数小时内较低的huC242产量

[192]在293T细胞中进行瞬时转化，从而将huC242的表达与对照抗体相比较，已知该对照抗体具有中等至高表达的潜力。并行地将编码两个对照物人源化抗体以及huC242的质粒转染入293T细胞，并且在转染0hr、14hr、22hr和48hr后从培养基中收集分泌的抗体。早在转染14个小时后，分泌的huC242已经远低于两个对照物抗体(图2)，并且该差异随时间逐渐增大。在48小时时，累积的huC242产率仅为对照物A的约7％和对照物B的12％。

在293T瞬时转染中huC242重链和轻链mRNA水平显得正常

[193]为了检查低的huC242产量是否是起因于低的IgG信使RNA水平，将huC242的重链和轻链mRNA与免疫原库中的其他人源化抗体相比较。将huC242和对照物抗体平行地转染入293T细胞，并且在72hr以后由细胞中分离出mRNA。通过定量RT-PCR技术分析了这些样本，并且结果(图3)表明huC242的mRNA水平是可以与对照物抗体相比的。归一化的huC242重链mRNA稍高于抗体的最大值，但是类似于对照物C。huC242轻链mRNA低于对照物A的mRNA，但是类似于对照物A和C的mRNA。总的来看，研究发现huC242重链和轻链这两者的细胞的mRNA水平可与能够具有高产量的数种其他的抗体相比较。

在稳定的CHO细胞系中装配的huC242(H2L2)对于HC(H)的相对比率明显低于huB4比率

[194]以qPCR结果为基础，低产率的huC242很可能是转录后的产率。为了分析转录后的发生，在对照物A和huC242之间比较重链和轻链肽的胞内表达和装配。将稳定的CHO细胞系表达的对照物A与两个稳定的CHO细胞系表达的huC242相比较。对所有的细胞裂解液进行蛋白质A纯化，并且将分离出的IgG在不变性凝胶上进行分离，并用考马斯亮蓝染色(图4)。在huC242与对照抗体相比较后，huC242多个不完全装配的种类的存在表明，效率低的重链和轻链装配可能是huC242抗体低表达的根本原因，该效率低的装配或许可归因于在肽之间很小的兼容性、或者不足的轻链供应。

多个huC242重链和轻链构架残基与共有序列不一致

[195]通过将huC242可变区氨基酸序列与已知能够在稳定的CHO细胞系中高水平表达的对照物表面重修的抗体进行比对，初始实现非共有序列残基在huC242重链和轻链构架中的存在。因为导致低表达的残基本质上不大可能占优势，分别将huC242重链和轻链可变区构架与由全部的Kabat鼠IgG1和Kappa轻链数据库产生的共有序列进行比对(图5)。因为在表面重修的抗体比如huC242中隐蔽的残基保持了原始鼠亲本抗体所有的鼠残基，并且通常认为人抗体表面残基不会被取代，故使用鼠的共有序列。如图5所示的残基26(D)对于作为隐蔽的残基是个例外，因为其被暴露在表面上。残基用G取代，因为首先其(D)是鼠的残基，并且通常鼠的残基可以被取代，即使它们在隐蔽的残基外侧被发现。来自鼠的共有序列的G残基在该情况下碰巧与用于C242人源化的人的序列一致。

[196]不与小集合的重组抗体匹配的相同huC242构架位置也不与来自很大的数据库的共有序列相匹配。另外，这些huC242残基中有许多被发现在Kabat数据库中相同的位置中是极稀有的，它们在鼠的抗体中的存在为从16％到仅仅0.8％(参见下表)。这些稀有的、隐蔽的构架残基被挑选出来，用于进一步调查是否对huC242抗体的低表达潜力做出任何贡献。

通过在huC242或轻链构架中进行单一氨基取代的IgG产量的适度提高

[197]为研究在huC242重链和轻链构架中被识别的罕有的残基是否可以消极地影响抗体产量，通过使用定点突变，这些残基被对应的共有序列残基取代。通过瞬时转染，将huC242的单一氨基酸变体的抗体表达与huC242和对照物抗体相比较。将各自的表达质粒转染入293T细胞，并且在72小时以后、通过定量ELISA确定分泌的IgG的水平。通过在huC242的重链或者轻链构架区域中的单一氨基酸取代，实现了IgG产量的适度提高(图6)。

[198]为确保残基取代不会改变抗体结合活性，通过抗原阳性的Colo205细胞上的FACS评估huC242变体。结果显示，氨基酸取代不会改变结合分布型(图6)。

通过在huC242重链和轻链构架中两个至三个残基改变的组合，实现了抗体产率的显著提高

[199]将huC242氨基酸取代扩大至包括多个构架残基改变。变体重链和轻链构造还被混合搭配，以便构建huC242变体配对的阵列，各个阵列含有两个以上残基取代。按如上所述在293T瞬时转染中比较huC242变体的相对产率。各种残基取代的组合导致不同的产率水平，在huC242重链和轻链可变区构架两者之间含有两种或三种变化的组合中可看到最大的提高(图7)。

[200]huC242变体重链和轻链的mRNA水平保持不变。

[201]所见huC242产率随着变体序列的提高可能起因于提高的抗体的转录、转译或转译后特性。为了研究提高的huC242表达的源由，进行qPCR实验，评估huC242的mRNA水平和在瞬时转染的293T细胞中表达的huC242序列变体。结果表明，与huC242相比，huC242变体对重链和轻链这两者产生了类似的的mRNA水平(图8)。这显示，提高的huC242变体的抗体产量不是由于提高的转录或mRNA稳定性，而或许是由于提高的转录后的特性。

研究发现胞内轻链肽的提高是重链变化的结果

[202]为了进一步研究与通过可变区构架残基取代而提高的huC242产率有关的可能机制，比较了胞内的重链肽和轻链肽水平。将huC242和序列变体瞬时转染入被裂解72小时后的293T细胞中，并且通过Western blotting技术在变性条件下评估所有的细胞裂解液。抗huIgG1和抗huK二次抗体被用于在同一凝胶上显现重链和轻链条带。有趣的是，在重链可变区构架中的残基取代不会影响重链表达，而是提高了不包含残基取代的huC242轻链的胞内蓄积量(图9)。这些结果表明，huC242重链变体或许是通过增强的重链与轻链的相容性来保护huC242轻链不被降解，从而导致提高的抗体装配和最终提高的抗体产量。这些结果还显示，huC242变体的产率大致与它们的胞内轻链水平、而不是重链水平成比例。

huC242残基取代导致提高的重链和轻链装配

[203]在不变性的条件下进行的Western blot，为huC242变体中提高的转译后特性提供了进一步证据。通过不变性Western blotting技术评估了来自用huC242和变体构建体瞬时转染的293T细胞的所有细胞裂解液(图10)。在这些实验中，不变性的完全地装配的抗体能够被与未装配的重链和轻链以及中间装配产品一起显现。作为氨基酸取代的结果，完全装配的IgG(H2L2)对中间装配产品(H2、H2L1等)的胞内比例明显地被提高(图10(a))。另外，这些结果显示，当重链和轻链变体被组合使用时，两种链的胞内水平得到提高。这提示，重链和轻链变体序列之间改善的交互作用导致免于降解的交互链内保护。

[204]在考马斯亮蓝染色凝胶上评估huC242和变体构建体，以避免潜在的与Westernblotting技术有关的人为因素(图10(b))。对来自瞬时转染的293T细胞的所有细胞裂解液进行蛋白质A纯化技术，然后将分离的IgG应用于不变性的PAGE，随后用考马斯亮蓝染色。结果与通过Western blot观察的结果一致，显示了在huC242泳道中部分地装配的抗体的显著性水平、和在huC242变体泳道中完全装配的抗体(H2L2)的比例的提高。

在huC242变体中的残基取代不会影响抗原结合活性

[205]通过FACS，在抗原阳性的Colo205细胞上评估了huC242和变体构建体的相对结合活性。能够增强抗体产率的huC242变体在抗原结合性活性方面未显示出显著的变化(图11(a))。为进一步确认这些结果，通过用逐次稀释的、未标记的huC242变体挑战(challenge)结合于Colo205细胞上的生物素化huC242(图11(b))，进行竞争性结合测试。该实验显示，对于以依赖浓度的方式结合抗原阳性的Colo205细胞，huC242变体能够与huC242竞争。定向的和竞争性的结合测试的综合结果表明，huC242和变体构建体具有类似的结合活性。

[206]本领域的技术人员将会理解，无需借助于过多的实验，包括除在此具体阐明的工艺以外的工艺的基因工程再造条件和技术可以用于实施要求保护的本发明。本领域的普通技术人员将认识并理解在此阐明的步骤、工艺条件、以及技术的功能等同物存在于现有技术领域中。所有这些已知的等价物都应包含在本发明的范围内。

序列表

<110>周晓迈

     丹尼尔.塔瓦雷斯

<120>用于提高抗体产量的方法

<130>A9267

<150>US 60/855361

<151>2006-10-31

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huC242重链

<400>1

<210>2

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huC242轻链

<400>2

<210>3

<211>132

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>鼠的重链共有序列

<400>3

<210>4

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>鼠的轻链共有序列

<400>4

<210>5

<211>132

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huC242轻链序列

<400>5

<210>6

<211>132

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huMy96轻链序列

<400>6

<210>7

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>rB4轻链序列

<400>7

<210>8

<211>132

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huEM164轻链序列

<400>8

<210>9

<211>132

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huN901轻链序列

<400>9

<210>10

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>轻链共有序列

<400>10

<210>11

<211>468

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huC242重链序列

<400>11

<210>12

<211>1404

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>huC242重链序列

<400>12

<210>13

<211>238

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huC242轻链序列

<400>13

<210>14

<211>714

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>huC242轻链序列

<400>14

<210>15

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huC242重链可变域序列

<400>15

<210>16

<211>113

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>huC242轻链可变域序列

<400>16

Claims (28)

1.一种用于通过序列基因工程再造来提高寄主细胞中人源化鼠抗体或其片段的产量的方法，其包含：

a)比对鼠抗体可变区构架序列的集合，其中，这种比对可以识别在所述构架中各个位置处出现最频繁的氨基酸残基(共有序列残基)；

b)将所述共有序列残基与人源化抗体可变区构架序列中的相应残基相比较；

c)在所述人源化抗体中识别可变区构架序列中一个以上非共有序列氨基酸残基；以及

d)在所述人源化抗体或其片段中用等效位置处的共有序列残基取代一个以上非共有序列氨基酸残基，以产生变异的抗体，其中在所述寄主细胞中以与所述人源化抗体相比更高的产率来生产所述变异的抗体；以及

e)任选地，出于生物物理学考虑，用非共有序列残基取代一个以上氨基酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述更高的产率是至少2倍或更大。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述取代发生在所述重链中。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述取代发生在所述轻链中。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述取代同时发生在重链和轻链中。

6.如权利要求3、4和5中任一项所述的方法，其特征在于，所述取代发生在所述可变区构架序列的核心。

7.如权利要求3、4和5中任一项所述的方法，其特征在于，所述非共有序列氨基酸是稀有氨基酸。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗体是huC242，所述取代发生在下述位置处：选自SEQ ID NO：1中第16、26、46、或89位的一个以上重链可变区位置；或者SEQ ID NO：2中第45或70位的轻链可变区位置；或者同时上述两处位置，所述位置由Kabat编号方案确定，其中所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示，所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗体是huC242，所述取代是所述轻链中选自Q45K/R和A70D的一个以上、所述重链中选自氨基酸残基E1A、D26G、K46E和T89V中的一个以上，所述氨基酸残基由Kabat抗体残基编号方案确定，其中所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示，所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ IDNO：1表示。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗体是huC242，所述取代是所述轻链中选自Q45K/R和A70D中的一个以上，所述氨基酸残基由Kabat抗体残基编号方案确定，其中所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗体是huC242，所述取代是所述重链中选自氨基酸残基E1A、D26G、K46E和T89V中的一个，所述氨基酸残基由Kabat抗体残基编号方案确定，其中所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗体是huC242，并且所述取代是所述重链中选自氨基酸残基E1A、D26G、K46E、T89V、K46E/D26G、K46E/K82S、K46E/T89V、K46E/E16A/D26G、K46E/K82S/D26G和K46E/T89V/D26G中的一个，所述氨基酸残基由Kabat抗体残基编号方案确定，其中所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ IDNO：1表示。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗体是huC242，所述取代是所述轻链中Q45K/R或A70D之一以及重链中氨基酸残基K46E、D26G、K46E/D26G或K46E/T89V之一，所述氨基酸残基由Kabat抗体残基编号方案确定，其中所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示，所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示。

14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述更高的产率是至少2倍或更大。

15.一种通过如权利要求1和8-13中任一项所述的方法所生产的抗体。

16.一种分离的核酸，其包含全长的人C242编码序列，该编码序列在编码重链可变区或轻链可变区的序列区域中具有至少一种变化，其中所述至少一种变化提高了被所述C242基因编码的蛋白质的产率，并且其中所述蛋白质包含所述至少一种变化。

17.如权利要求16所述的核酸，其特征在于，所述至少一种变化包括在所述编码重链可变区(图12)氨基酸基序、或轻链可变区(图12)、或者同时两者的序列的区域中的变化。

18.如权利要求17所述的核酸，其特征在于，在所述基序中的所述至少一种变化选自下述氨基酸的编码密码子的取代：Gln(CAG)对于Lys(AAA)或Arg(CGG)；Ala(GCT)对于Asp(GAT)；Glu(GAG)对于Ala(GCC)；Asp(GAC)对于Gly(GGC)；Lys(AAA)对于Glu(GAA)；或者Thr(ACC)对于Val(GTC)。

19.如权利要求16所述的核酸，其特征在于，所述密码子的取代发生在轻链或重链。

20.如权利要求16所述的核酸，其特征在于，所述轻链取代选自下述：

Q45K/R   Gln(CAG)对于Lys(AAA)或Arg(CGG)；或者

A70D     Ala(GCT)对于Asp(GAT)。

21.如权利要求16所述的核酸，其特征在于，所述重链取代选自下述：

E16A    Glu(GAG)对于Ala(GCC)；

D26G    Asp(GAC)对于Gly(GGC)；

K46E    Lys(AAA)对于Glu(GAA)；或者

T89V    Thr(ACC)对于Val(GTC)。

22.如权利要求16所述的核酸，其特征在于，所述序列编码变异的C242的基因产物。

23.如权利要求22所述的核酸，其特征在于，所述基因产物是抗体。

24.一种变异抗体或其表位结合片段，其中所述变体具有一个以上在具有可变区的亲代抗体中的氨基酸取代，所述可变区包含SEQ ID NO：1[huC242]所示的重链和SEQ ID NO：2[huC242]所示的轻链，当被导入单一寄主细胞中时，所述变体显示出与所述亲代抗体相比提高的合成性。

25.如权利要求24所述的抗体，其特征在于，所述取代发生在一个以上选自下述的位置：所述SEQ ID NO：2中第45和70位；或者所述SEQ ID NO：1中第16、26、46、或89位，所述位置由Kabat编号方案确定。

26.如权利要求24所述的抗体，其特征在于，所述取代选自下组：重链中的Q45K/R、A70D、E16A、D26G、K46E、或T89V，所述位置由Kabat编号方案确定。

27.一种用于通过序列基因工程再造来提高寄主细胞中人源化抗体或其表位结合片段的产量的方法，其包含：

a)比对来自与人源化抗体来源所属相同的属或其他接近的系统分类的抗体的抗体可变区构架序列的集合，其中，这种比对可以识别出在构架中各个位置出现最频繁的氨基酸残基(共有序列残基)；

b)将共有序列残基与人源化抗体可变区构架序列中相应残基相比较；

c)在人源化抗体中识别可变区构架序列中一个以上非共有序列残基；以及

d)在人源化抗体或其片段中用等效位置处的共有序列残基取代所述一个以上非共有序列氨基酸残基，从而产生变异抗体，其中，在细胞中以相比人源化抗体更高的产率来生产变异抗体；

e)任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基取代。

28.一种用于通过序列基因工程再造来提高寄主细胞中亲代抗体或其抗原结合片段的产量的方法，其包含：

a)比对来自与亲代起源抗体所属相同的属或接近的系统分类的抗体的抗体可变区构架序列的集合，其中，这种比对可以识别出在构架中各个位置最频繁地出现的氨基酸残基(共有序列残基)；

b)将共有序列残基与亲代抗体可变区构架序列中相应残基相比较；

c)在亲代抗体中识别可变区构架序列中一个以上非共有序列氨基酸残基；以及

d)在亲代抗体或其片段中用等效位置处的共有序列残基取代一个以上非共有序列氨基酸残基，从而产生变异抗体，其中，在寄主细胞中以相比亲代抗体更高的产率来生产变异抗体；

e)任选地，出于生物物理学考虑，一个以上氨基酸可以用非共有序列残基取代。

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