CN104804094A

CN104804094A - Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法

Info

Publication number: CN104804094A
Application number: CN201510114668.3A
Authority: CN
Inventors: G·佩恩; P·宗; D·塔瓦雷斯
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2005-08-22
Filing date: 2005-08-22
Publication date: 2015-07-29

Abstract

在本发明的所有实施方式中，公开了包含细胞结合剂和细胞毒性剂的细胞毒性偶联物、包含所述偶联物的治疗组合物、使用所述偶联物抑制细胞生长和治疗疾病的方法，及包含所述细胞毒性偶联物的试剂盒。特别地，细胞结合剂为单克隆抗体和其表位结合片段，其识别并结合CA6糖表位。本发明也涉及人源化或表面重构形式的DS6，抗CA6鼠单克隆抗体，及其表位结合片段。

Description

CA6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法

本申请是申请日为2005年08月22日和发明名称为“CA6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法”的200580051368.X号发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及鼠抗-CA6糖表位(glycotope)单克隆抗体及其人源化或表面重构形式(humanized or resurfaced versions)。本发明也涉及抗-CA6糖表位单克隆抗体的表位结合片段(epitope-binding fragments)，以及抗-CA6糖表位单克隆抗体的人源化或表面重构形式的表位结合片段。

本发明进一步涉及包含细胞结合剂和细胞毒性剂的细胞毒性偶联物，包含所述偶联物的治疗组合物，应用所述偶联物来抑制细胞生长和治疗疾病的方法，及包含所述细胞毒性偶联物的试剂盒。具体而言，细胞结合剂为识别并结合CA6糖表位的单克隆抗体或其表位结合片段，或其人源化或表面重构形式。

背景技术

对开发特异性地破坏目标癌细胞而不伤害周围的、非癌细胞和组织的抗癌治疗剂已经有很多的尝试。这样的治疗剂有潜力极大改善人类患者中癌症的治疗。

一个有前景的方法是连接细胞结合剂例如单克隆抗体与细胞毒性药物(Sela等，在Immunoconjugates 189-216(C.Vogel，ed.1987)；Ghose等，在TargetedDrugs 1-22(E.Goldberg，ed.1983)；Diener等，在Antibody mediated delivery systems1-23(J.Rodwell，ed.1988)；Pietersz等，在Antibody mediated delivery systems 25-53(J.Rodwell，ed.1988)；Bumol等，在Antibody mediated delivery systems 55-79(J.Rodwell，ed.1988)。取决于对细胞结合剂的选择，基于在这样的细胞的表面上所表达的分子的表达情况，这些细胞毒性偶联物可以被设计为仅仅识别和结合特定类型癌细胞。

细胞毒性药物，例如甲氨蝶呤、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C和苯丁酸氮芥已被用在这样的细胞毒性偶联物中，其被连接到各种鼠单克隆抗体上。在一些情形中，药物分子通过中间载体分子被连接到抗体分子上，中间载体分子例如血清白蛋白(Garnett等，46Cancer Res.2407-2412(1986)；Ohkawa等，23 Cancer Immunol.Immunother. 81-86(1986)；Endo等，47Cancer Res.1076-1080(1980))、葡聚糖(Hurwitz等，2 Appl.Biochem.25-35(1980)；Manabi等，34 Biochem.Pharmacol.289-291(1985)；Dillman等，46 Cancer Res.4886-4891(1986)；Shoval等，85 Proc.Natl.Acad.Sci.8276-8280(1988))、或聚谷氨酸(Tsukada等，73 J.Natl.Cane.Inst.721-729(1984)；Kato等，27 J.Med.Chem.1602-1607(1984)；Tsukada等，52 Br.J.Cancer 111-116(1985))。

已经显现出一些前景的特异性偶联物的例子为C242抗体和美登素衍生的DM1的偶联物，C242抗体针对CanAg，CanAg为表达在结肠直肠和胰腺肿瘤上的抗原(Liu等，Proc Natl Acad Sci USA，93：8618-8623(1996))。对该偶联物的体外评价显示，它对表达在细胞表面上的CanAg的结合亲和力很高，其表观K_d值为3×10^-11M，而且它对CanAg阳性细胞的细胞毒性效力高，IC₅₀为6×10^-11M。此细胞毒性是抗原依赖性的，因为其被过量的非偶联抗体阻断，而且因为抗原阴性细胞对该偶联物的敏感性要低大于100倍。对各自的靶细胞具有高亲和力以及具有高抗原选择性细胞毒性的抗体-DM1偶联物的其它例子包括下列物质的偶联物：huN901，其为抗人CD56抗体的人源化形式；huMy9-6，其为抗CD33抗体的人源化形式；huC242，其为抗CanAg Muc1表位的抗体的人源化形式；huJ591，其为抗PSMA的脱免疫抗体(deimmunized antibody)；曲妥珠单抗，其为抗Her2/neu的人源化抗体；和比伐珠单抗(bivatuzumab)，其为抗CD44v6的人源化抗体。

在不断改进用于治疗癌症患者的方法中，开发特异性识别特定类型癌细胞的其它的细胞毒性偶联物将是重要的。

为了此目标，本发明涉及抗体的开发，所述抗体识别并结合表达在癌细胞表面上的分子/受体，和涉及新型细胞毒性偶联物的开发，所述偶联物包含细胞结合剂例如抗体和细胞毒性剂，所述细胞毒性剂特异靶向表达在癌细胞表面上的分子/受体。

更具体而言，本发明涉及位于由癌细胞表达的Mucl粘蛋白受体上的新CA6唾液酸糖表位(sialoglycotope)的表征，和涉及抗体的预备，优选人源化抗体，其识别Mucl粘蛋白的新CA6唾液酸糖表位，而且在存在细胞毒性剂的情况下，可以被用来抑制表达CA6糖表位的细胞的生长。

发明概述

本发明包括抗体或其表位结合片段，所述抗体特异性识别并结合Mucl粘蛋白受体的新型CA6唾液酸糖表位。在另一个实施方案中，本发明包括人源化抗体或其表位结合片段，其识别Mucl粘蛋白受体的新型CA6唾液酸糖表位(“CA6糖表位”)。

在优选的实施方案中，本发明包括鼠抗-CA6单克隆抗体DS6(“DS6抗体”)和DS6抗体的表面重构或人源化形式，其中，在轻链和重链两者中，抗体或其表位结合片段的暴露于表面的残基被取代，以便更为接近地类似于已知的人抗体表面。本发明的人源化抗体及其表位结合片段具有改进的性质，因为与完全的鼠形式相比，它们在其被给予的人对象中具有更少的免疫原性(或完全是非免疫原性的)。因此，本发明的人源化DS6抗体及其表位结合片段特异性识别Mucl粘蛋白受体上的新型唾液酸糖表位，即CA6糖表位，而对人是没有免疫原性的。该人源化抗体及其表位结合片段可以与药物例如美登素类(maytansinoid)偶联，通过将该药物定向于Mucl CA6唾液酸糖表位，形成对抗原表达细胞具有特异细胞毒性的药物前体。因此可以使用包含这样的抗体和小的、高毒性药物(例如美登素类、紫杉烷类(taxanes)及CC-1065类似物)的细胞毒性偶联物作为治疗剂，用于治疗肿瘤，例如乳腺和卵巢肿瘤。

本发明的DS6抗体的人源化形式在以下方面在本文中被完整表征：轻链和重链可变区的各自氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的DNA序列，互补决定区(CDRs)的鉴定，其表面氨基酸的鉴定和其以重组形式表达的方法的公开。

在一个实施方案中，提供人源化DS6抗体或其表位结合片段，其具有包含互补决定区(CDRs)的重链，所述互补决定区(CDRs)具有SEQ ID NOS：1-3所示的氨基酸序列。

S Y N M H(SEQ ID NO：1)，

Y I Y P G N G A T N Y N Q K F K G(SEQ ID NO：2)，

G D S V P F A Y(SEQ ID NO：3)，

并具有包含互补决定区(CDRs)的轻链，所述互补决定区(CDRs)具有SEQ ID NOS：4-6所示的氨基酸序列：

S A H S S V S F M H(SEQ ID NO：4)，

S T S S L A S(SEQ ID NO：5)，

Q Q R S S F P L T(SEQ ID NO：6)。

也提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段，其具有轻链可变区，所述轻链可变区具有这样的氨基酸序列，即，此序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性：

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO：7)

EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO：8)。

也提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段，其具有重链可变区，所述重链可变区具有这样的氨基酸序列，即，此序列与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性：

QAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFKGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：9)

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：10)

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：11)。

在另一个实施方案中，提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段，其具有人源化或表面重构的轻链可变区，所述轻链可变区具有对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列：

EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKR.(SEQ ID NO：8)。

同样地，提供了人源化DS6抗体及其表位结合片段，其具有人源化或表面重构的重链可变区，所述重链可变区具有分别对应于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列：

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA.(SEQ ID NO：10)

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA.(SEQ ID NO：11)。

本发明的人源化DS6抗体及其表位结合片段也可以包括在轻链和/或重链氨基酸残基中的取代，所述取代发生在表1中带星号的残基所定义的一个或多个位置上，所述带星号的残基代表了被发现位于CDR的5埃之内的、需要变为人残基的鼠表面构架残基(murine surface framework residues)。例如，在鼠序列(SEQ IDNO：7)中的第一氨基酸残基Q已被E代替(SEQ ID NO：8)，以使得抗体人源化。然而，由于该残基与CDR接近，可能需要回复突变为鼠残基Q，以维持抗体亲和力。

表1

这在表2中被进一步显示，其中示出了muDS6可变区表面残基与三个最同源的人可变区表面残基比对。表1中的氨基酸残基对应于表2中带下划线的氨基酸残基。

表2

本发明进一步提供了细胞毒性偶联物，其包含(1)细胞结合剂，其识别并结合CA6糖表位，和(2)细胞毒性剂。在细胞毒性偶联物中，细胞结合剂对CA6糖表位具有高亲和力，细胞毒性剂对表达CA6糖表位的细胞具有高度的细胞毒性，因此本发明的细胞毒性偶联物形成了有效的杀伤剂。

在一个优选的实施方案中，所述细胞结合剂为抗-CA6抗体或其表位结合片段，更优选为人源化抗-CA6抗体或其表位结合片段，其中细胞毒性剂直接地或通过可切割的或不可切割的接头被共价连接到抗体或其表位结合片段。在更优选的实施方案中，细胞结合剂是人源化DS6抗体或其表位结合片段，细胞毒性剂是紫杉醇(taxol)、美登素类、CC-1065或CC-1065类似物。

在本发明优选的实施方案中，细胞结合剂是人源化抗-CA6抗体，细胞毒性剂为细胞毒性药物，例如美登素类或紫杉烷类。

更优选地，细胞结合剂为人源化抗-CA6抗体DS6，细胞毒性剂为美登素化合物，例如DM1或DM4。

本发明也包括抑制表达CA6糖表位的细胞生长的方法。在优选的实施方案中，用于抑制表达CA6糖表位的细胞生长的方法在体内进行，并导致细胞死亡，尽管也包括体外和离体应用。

本发明也提供了治疗组合物，其包含细胞毒性偶联物和药物学可接受的载体或赋形剂。

本发明进一步包括使用所述治疗组合物治疗患癌症的对象的方法。在优选的实施方案中，细胞毒性偶联物包含抗-CA6抗体和细胞毒性剂。在更优选的实施方案中，细胞毒性偶联物包括人源化DS6抗体-DM1偶联物、人源化DS6抗体-DM4或人源化DS6抗体-紫杉烷偶联物，所述偶联物与药物学可接受的载体或赋形剂一起被施用。

本发明也包括试剂盒，其包括抗-CA6抗体-细胞毒性剂偶联物和使用说明。在优选的实施方案中，抗-CA6抗体为人源化DS6抗体，细胞毒性剂为美登素化合物，例如DM1或DM4，或紫杉烷类，说明是关于使用该偶联物来治疗患癌症对象。试剂盒也包括用于制备药物学上可接受的制剂所需的组分，例如稀释剂——如果偶联物处于冻干状态或浓缩形式，并且包括用于施用该制剂的组分。

本发明也包括特异性结合和识别CA6糖表位的抗体的衍生物。在优选的实施方案中，通过表面重构或人源化结合CA6糖表位的抗体而制备抗体衍生物，其中衍生物对宿主具有降低的免疫原性。

本发明进一步提供了人源化抗体或其片段，其进一步被标记以便用于研究或诊断应用中。在优选的实施方案中，所述标记为放射性标记、荧光团、生色团、显像剂或金属离子。

也提供诊断方法，其中将所述标记的人源化抗体或其表位结合片段施用给怀疑患癌症的对象，并测量或监测标记在对象体内的分布。

本发明也提供了通过施用本发明的人源化抗体偶联物治疗患癌症对象的方法，所述偶联物或者单独施用或者与其它细胞毒性剂或治疗剂联合施用。癌症例如可以是下列一种或多种：乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、骨肉瘤、子宫颈癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、其中CA6被表达的肉瘤或癌、或其中CA6糖表位被显著表达的待确定的其它癌症。

除非有其它另有说明，本文所引用的所有参考文献和专利被引入本文作为参考。

附图说明

图1显示了用于测定DS6抗体结合所选择的癌细胞系表面的能力的研究结果。通过流式细胞术，测量用DS6一抗和FITC偶联的抗鼠IgG(H+L)二抗温育的细胞系的荧光。DS6抗体结合Caov-3(图1A)和T-47D(图1B)细胞，表观Kd分别是1.848nM和2.586nM。抗原阴性细胞系，SK-OV-3(图1C)和Colo205(图1D)显示无抗原特异性结合。

图2显示了表位表达的斑点印迹分析的结果。Caov-3(图2A和图2B)、SKMEL28(图2C)和Colo205(图2D)细胞裂解物被分别点到硝酸纤维素膜上，然后分别用链霉蛋白酶、蛋白酶K、神经氨酸酶或过碘酸温育。然后用DS6抗体(图2A)、CM1抗体(图2B)、R24抗体(图2C)或C242抗体(图2D)对该膜进行免疫印迹。

图3显示了DS6抗原表达的斑点印迹分析的结果。将Caov-3细胞裂解物分别点到PVDF膜上，然后在三氟甲磺酸(trifluoromethanesulfoni acid(TFMSA))存在的条件下温育。然后用CM1抗体(1&2)或DS6抗体(3&4)对膜进行免疫印迹。

图4显示了DS6抗原的糖表位分析的结果。将用N-聚糖酶(N-glycanase(“N-gly”))、O-聚糖酶(O-glycanase(“O-gly”))和/或唾液酸酶(sialidase(“S”))预处理的Caov-3裂解物点样至消硝酸纤维素上，然后用DS6抗体或CM1抗体(Muc-1VNTR)进行免疫印迹。

图5显示了DS6抗原的蛋白质印迹分析的结果。细胞裂解物用DS6抗体进行免疫沉淀(immunoprecipitated(“IP”))和免疫印迹。抗原对应于在抗原阳性Caov-3(图5A和图5B)和T47D(图5C)细胞中观察到的大于250kDa的蛋白条带。抗原阴性SK-OV-3(图5D)和Colo205(图5E)细胞系不显示此条带。免疫沉淀之后，用(图5A)神经氨酸酶(neuraminidase(“N”))或(图5B)过碘酸(periodic acid(“PA”))温育Caov-3细胞裂解物的蛋白质G珠子。在同一凝胶上使抗体(“α”)、IP前(“Lys”)和IP后流通物(flow through，“FT”)裂解物对照跑胶。也用N-聚糖酶(“N-gly”)、O-聚糖酶(“O-gly”)和/或唾液酸酶(“S”)温育Caov-3免疫沉淀物(参见图5F)，其中可选地用生物素化-DS6和链霉亲合素-HRP探查印迹。

图6显示了DS6抗体和CM1抗体在Caov-3(图6A)和HeLa(图6B)细胞裂解物上的免疫沉淀反应和/或免疫印迹的结果。叠加CM1和DS6蛋白印迹信号，表明DS6抗原在Muc1蛋白上。在HeLa裂解物中，Muc1双联体来自于Muc1的表达，该表达由串连重复数目不同的不同等位基因指导。

图7显示了DS6抗体夹心ELISA设计(图7A)和标准曲线(图7B)。使用已知浓度的商业可得的CA15-3标准品(其中1CA15-3单位＝1DS6单位)产生标准曲线。

图8显示了定量ELISA标准曲线。使用已知浓度的生物素-DS6，其或者由铺板的羊抗鼠IgG(图8A)捕获，或直接结合到ELISA平板上(图8B)，测定检测抗体(链霉亲合素-HRP/生物素-DS6)信号的标准曲线(图8C)。

图9显示了鼠DS6抗体的轻链(图9A)和重链(图9B)可变区的cDNA和氨基酸序列。每个序列中的三个CDR被加以下划线(Kabat定义)。

图10显示了按照Kabat定义确定的鼠DS6抗体的轻链(图10A)和重链(图10B)CDRs。对于重链CDRs，AbM模建软件产生稍微不同的定义(图10C)。

图11显示了鼠DS6抗体的轻链(“muDS6LC”)(SEQ ID NO：7的1-95残基)和重链(“muDS6HC”)(SEQ ID NO：9的残基1-98)氨基酸序列，它们与IgVκap4(SEQ ID NO：23)和IgVh J558.41(SEQ ID NO：24)基因的胚系序列进行比对。灰色表示序列差异。

图12显示了在Brookhaven数据库中具有解析结构(solved structure)文件的10个轻链和重链抗体序列，它们与鼠DS6(muDS6)轻链(“muDS6LC”)和重链(“muDS6HC”)序列最同源。以同源性最大到同源性最小的顺序排列序列。

图13显示了用于预测鼠DS6抗体轻链可变区的哪些骨架残基为表面可及的表面可及性(surface accessibility)数据和计算。具有25-35％的平均表面可及性的位置被标记(*？？*)，对它们进行第二轮分析。DS6抗体轻链可变区(图13A)和重链可变区(图13B)。

图14显示了prDS6 v1-0哺乳动物表达质粒图。该质粒被用来建立和表达重组嵌合的和人源化的DS6抗体。

图15显示了鼠(“muDS6”)和人源化(“huDS6”)(v1.0&v1.2)DS6抗体轻链(图15A)和重链(图15B)可变结结构域的氨基酸序列。

图16显示了人源化DS6抗体(“huDS6”)(1.01和1.21)的轻链可变区的cDNA和氨基酸序列。

图17显示了人源化DS6抗体1.01(图17A)和1.21(图17B)的重链可变区的cDNA和氨基酸序列。

图18显示了来自在KB细胞上进行的分析的鼠DS6(muDS6)、嵌合DS6(chDS6)，和人DS6形式1.01(huDS6v1.01)和huDS6形式1.21(huDS6v1.21)的流式细胞术结合曲线。鼠抗体、嵌合抗体和人v1.01和v1.21DS6抗体的亲和力(muDS6＝0.82nM、chDS6＝0.69nM、huDS6v1.01＝0.82nM、huDS6v1.21＝0.85nM)相似，这表明表面重构未降低亲和力。

图19显示了muDS6、chDS6、huDS6 v1.01和huDS6 v1.21抗体与生物素化muDS6的竞争结合试验的结果。将各种浓度的裸muDS6、chDS6、huDS6v1.01和huDS6v1.21与2nM生物素-muDS6和链霉亲合素-DTAF二级试剂混合。所有抗体的IC50(muDS6＝1.9nM、chDS6＝1.7nM、huDS6v1.01＝3.0nM和huDS6v1.21＝1.9nM)相似，这表明人源化未降低亲和力。

图20显示了未偶联的DS6抗体和DS6抗体-DM1偶联物的结合亲和力的测定结果。结果显示，DM1偶联没有不利地影响抗体的结合亲和力。DS6抗体-DM1偶联物的表观Kd(3.902nM)(“DS6-DM1”)较裸抗体(2.020nM)(“DS6”)稍大。

图21显示了在抗鼠IgG(H+L)DM1偶联物(2°Ab-DM1)存在或缺乏的情况下，使用DS6抗体进行的间接细胞存活率测定的结果。抗原阳性Caov-3细胞仅在存在二级偶联物(secondary conjugate)(“DS6+2°Ab-DM1”)的情况下以DS6抗体依赖性方式被杀死(IC₅₀＝424.9pM)。

图22显示了muDS6抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)试验的结果。结果表明，在HPAC(图22A)和ZR-75-1(图22B)细胞上，不存在DS6抗体的CDC介导的效应。

图23显示了DS6抗体-DM1偶联物和游离美登素在体外的细胞毒性测定的结果。在集落生成试验(clonogenic assay)中，将DS6抗原阳性卵巢(图23A)、乳腺(图23B)、子宫颈(图23C)和胰腺(图23D)癌细胞系连续暴露于DS6抗体-DM1偶联物，测定细胞毒性(左图)。通过72h暴露于游离的美登素，类似地测定了这些细胞系的美登素敏感性(右图)。被测试的卵巢癌细胞系是OVCAR5、TOV-21G、Caov-4和Caov-3。被测试的乳癌细胞系是T47D、BT-20和BT-483。被测试的子宫颈癌细胞系是KB、HeLa和WISH。被测试的胰腺癌细胞系为HPAC、Hs766T和HPAF-11。

图24显示了DS6抗体-DM1偶联物在体外的细胞毒性试验结果。在MTT细胞存活率分析中，人卵巢(图24A，图24B和图24C)、乳腺(图24D和图24E)、子宫颈(图24F和图24G)和胰腺(图24H和图24I)癌细胞以依赖于DS6抗体-DM1偶联物的方式被杀死。裸DS6没有不利地影响这些细胞的生长，这表明DM1偶联对于细胞毒性是需要的。

图25A显示了DS6抗体-DM1偶联物对已建立的皮下KB肿瘤异种移植物的体内抗肿瘤功效研究结果。在第0天接种肿瘤细胞，在第6天给予第一次治疗。连续每天进行免疫偶联物治疗，总计5个剂量。一旦肿瘤体积超过1500mm³，则处死PBS对照动物。以150或225μg/kg DM1的剂量施用偶联物，分别对应5.7和8.5mg/kg的抗体浓度。在研究期间监测小鼠的体重(图25B)。

图26显示了DS6抗体-DM1偶联物对已建立的皮下肿瘤异种移植物的抗肿瘤功效研究结果。在第0天接种OVCAR5(图26A和图26B)、TOV-21G(图26C和图26D)、HPAC(图26E和图26F)和HeLa(图26G和图26H)细胞，在第6天和第13天给予免疫偶联物治疗。一旦肿瘤体积超过1000mm³，则处死PBS对照动物。以600μg/kg DM1的剂量施用偶联物，对应于27.7mg/kg的抗体浓度。在研究期间监测小鼠的肿瘤体积(图26A，图26C，图26E和26G)和体重(图26B，图26D，图26F和图26H)。

图27显示了DS6抗体-DM1偶联物对腹膜内OVCAR5肿瘤的体内功效研究结果。在第0天腹膜内注射肿瘤细胞，在第6天和第13天给予免疫偶联物治疗。一旦体重损失超过20％，则处死动物。

图28显示了裸DS6抗体和紫杉烷偶联的DS6抗体在HeLa细胞上的结合亲和力研究得到的流式细胞术结合曲线。紫杉烷(MM1-202)偶联没有不利地影响抗体的结合亲和力。DS6-MM1-202偶联物的表观Kd(1.24nM)比裸DS6抗体(620pM)稍大。

图29显示了人源化DS6的1.01形式抗体偶联物的体外结合和效力。huDS6v1.01和DM4偶联对于huDS6v1.01与KB细胞的亲和力几乎没有影响(图29A)。huDS6v1.01-DM4对DS6表达WISH细胞表现出强有力的体外细胞毒性，IC₅₀是0.44nM(图29B)。

图30示出了在HPAC胰腺癌细胞模型中huDS6v1.01-DM4偶联物的体内效应研究结果。huDS6v1.01-DM4表现出有效的抗肿瘤活性，而其靶标在HPAC模型中不表达的B4-DM4对照偶联物基本上没有活性(图30A)。200μg/kg的给药剂量对动物没有毒性，如不存在体重损失所表明(图30B)。

发明详述

本发明提供了抗-CA6单克隆抗体、抗-CA6人源化抗体和抗-CA6抗体的片段，和其它特征。本发明的每个抗体和抗体片段被设计为特异性识别并结合在细胞表面上的CA6糖表位。已知CA6被许多人类肿瘤表达：95％的浆液性卵巢癌、50％的子宫内膜卵巢癌(endometrioid ovarian carcinomas)、50％的子宫颈瘤、69％的子宫内膜瘤(neoplasms of the endometrius)、80％的外阴瘤、60％的乳癌、67％胰腺瘤和48％的膀胱上皮瘤(tumors of the urothelium)，但它很少被人正常组织表达。

Kearse等人Int.J.Cancer 88(6)：866-872(2000)报告，当他们使用杂交瘤上清液鉴定时，将上面发现有CA6表位的蛋白错误地鉴定为具有包含CA6表位的N联糖的80kDa蛋白。通过使用纯化的DS6，我们已经证明了CA6表位被发现位于250kDa以上的非二硫键连接糖蛋白的O联糖上。此外，该糖蛋白经鉴定为粘蛋白，Muc1。因为不同的Muc1等位基因在不同数目串连重复(VNTR)结构域中具有数目不同的串连重复序列，因此细胞经常表达两种不同大小的不同Muc1蛋白(Taylor-Papadimitriou，Biochim.Biophys.Acta 1455(2-3)：301-13(1999)。由于在VNTR结构域中的重复数目不同以及糖基化作用的差异，Muc1的分子量随细胞系而变化。

CA6免疫反应性对过碘酸的敏感性表明，CA6是糖类表位“糖表位(glycotope)”。CA6免疫反应性对用来自霍乱弧菌(Vibrio cholera)的神经氨酸酶处理的另外的敏感性表明，CA6表位是唾液酸依赖性糖表位，因此为“唾液酸糖表位(sialoglycotope)”。

在实施例2中可以找到CA6的表征详细内容(参阅下述)。在WO 02/16401；Wennerberg等，Am.J.Pathol.143(4)：1050-1054(1993)；Smith等，Human Antibodies9：61-65(1999)；Kearse等，Int.J.Cancer 88(6)：866-872(2000)；Smith等，Int.J.Gynecol.Pathol.20(3)：260-6(2001)；和Smith等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.10(2)：152-8(2002)中，可以找到有关CA6的另外的详细内容。

本发明也包括含两种主要组分的细胞毒性偶联物。第一组分为细胞结合剂，其识别并结合CA6糖表位。所述细胞结合剂应当以高度的特异性识别在Muc 1上的CA6唾液酸糖表位，以便所述细胞毒性偶联物仅仅识别并结合所期望的细胞。高度的特异性允许该偶联物以靶向方式发挥作用，几乎没有因非特异性结合所导致的副作用。

在另一个实施方案中，本发明的细胞结合剂也以高度的亲和力识别CA6糖表位，以便该偶联物将与靶细胞接触足够的时间，从而使得偶联物的细胞毒性药物部分在细胞上起作用，和/或使得偶联物有足够的时间被细胞内化。

在一个优选的实施方案中，细胞毒性偶联物包含抗-CA6抗体作为细胞结合剂，更优选为鼠DS6抗-CA6单克隆抗体。在一个更优选的实施方案中，细胞毒性偶联物包含人源化DS6抗体或其表位结合片段。DS6抗体能以高度的特异性识别CA6，和以靶向方式将细胞毒性剂引导至异常细胞或组织，例如癌细胞。

本发明的细胞毒性偶联物的第二组分为细胞毒性剂。在优选的实施方案中，细胞毒性剂为紫杉醇、美登素类例如DM1或DM4、CC-1065或CC-1065类似物。在优选的实施方案中，本发明的细胞结合剂直接地或通过可切割或不可切割接头与细胞毒性剂共价连接。

细胞结合剂、细胞毒性剂和接头在下文中被更详细地论述。

细胞结合剂

本发明的化合物作为治疗剂的有效性取决于对合适的细胞结合剂的仔细选择。细胞结合剂可以是目前已知或将要已知的任何种类，包括肽和非肽类。细胞结合剂可以是能够以特异性或非特异性方式结合细胞的任何化合物。一般而言，这些细胞结合剂可以是抗体(特别是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养物转运因子(例如转铁蛋白)或任何其它细胞结合分子或物质。

可以被使用的细胞结合剂的更具体的例子包括：

(a)多克隆抗体；

(b)单克隆抗体；

(c)抗体片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)₂、Fv(Parham，J.Immunol.131：2895-2902(1983)；Spring等，J Immunol.113：470-478(1974)；Nisonoff等，Arch.Biochem.Biophys.89：230-244(1960))；

(d)干扰素(例如α、β、γ)；

(e)淋巴因子，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6；

(f)激素，例如胰岛素、TRH(促甲状腺素释放激素)、MSH(促黑激素)、类固醇激素，例如雄激素和雌激素；

(g)生长因子和集落刺激因子，例如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess，Immunology Today 5：155-158(1984))；

(h)转铁蛋白(O′Keefe等，J.Biol.Chem.260：932-937(1985))；和

(i)维生素，例如叶酸。

抗体

选择适合的细胞结合剂是选择的关键，这取决于欲被靶向的具体细胞群，但是一般而言，如果适合的抗体可以被利用或可以被制备，则优选抗体，更优选单克隆抗体。

单克隆抗体技术允许以特异性单克隆抗体的形式产生极其特异性的细胞结合剂。通过用感兴趣的抗原例如完整的靶细胞、从靶细胞中分离出的抗原、全病毒、减毒全病毒和病毒蛋白诸如病毒衣壳蛋白免疫小鼠、大鼠、仓鼠或任何其它哺乳动物而产生单克隆抗体的技术在本领域是特别熟知的。也可以使用敏化的人细胞。产生单克隆抗体的另一种方法是使用scFv(单链可变区)的噬菌体文库，尤其是人scFv(参见例如，Griffiths等，美国专利5,885,793和5,969,108；McCafferty等，WO92/01047；Liming等，WO 99/06587)。

典型的抗体由通过二硫键连接的两个相同的重链和两个相同的轻链组成。可变区为抗体重链和轻链的一部分，其在抗体间的序列不同，而且它在每个特定抗体对其抗原的结合性及特异性中协同作用。可变性通常并不是在整个抗体可变区均匀分布的。它典型地集中在可变区的三个片段之内，其被称作互补性决定区(CDRs)或高度可变区，位于轻链和重链可变区内。可变区中具有较高保守性的部分被称作骨架区。重链和轻链的可变区包括四个骨架区，主要采用β-片层构型，其中每个骨架区通过三个CDRs连接，所述三个CDRs形成连接β-片结构的环，在一些情况下，构成β-片结构的一部分。在每个链中的CDRs通过骨架区被保持在相互接近的位置，并且与来自另一链的CDRs一起帮助形成抗体的抗原结合位点(E.A.Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，1991，NIH)。

恒定区为重链的一部分。虽然不直接参与抗体与抗原的结合，然而它的确显示各种效应器功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

用在本发明中的适合的单克隆抗体包括鼠DS6单克隆抗体(美国专利6,596,503；ATCC保藏号PTA-4449)。

人源化或表面重构的DS6抗体

优选地，人源化抗-CA6抗体被用作本发明的细胞结合剂。这样的人源化抗体的优选实施方案为人源化DS6抗体，或其表位结合片段。

人源化的目标是减少引入到人体的异种抗体例如鼠抗体的免疫原性，同时保持该抗体的全部抗原结合亲和力及特异性。

使用几种技术可以产生人源化抗体，例如表面重构(resurfacing)和CDR移植(CDR grafting)。正如本文所用，表面重构技术使用了分子模建、统计分析和诱变的组合，来改变抗体可变区的非CDR表面，以模拟靶宿主的已知抗体的表面。

在美国专利5,639,641(Pedersen等)中公开了用于抗体的表面重构的策略和方法，以及用于减少抗体在不同的宿主中的免疫原性的其它方法，该在此引入其全部内容作为参考。简言之，在一个优选的方法中，(1)产生一系列抗体重链和轻链可变区的位置比对，以提供一组在重链和轻链可变区骨架表面暴露的位置，其中所有可变区的比对位置有至少大约98％是相同的；(2)为啮齿类动物抗体(或其片段)确定一组在重链和轻链可变区骨架表面暴露的氨基酸残基；(3)鉴定一组在重链和轻链可变区骨架表面暴露的氨基酸残基，其与所述啮齿类动物表面暴露氨基酸残基组最密切相同；(4)用在步骤(3)中鉴定的那组重链和轻链可变区骨架表面暴露氨基酸残基取代在步骤(2)中定义的那组重链和轻链可变区骨架表面暴露的氨基酸残基，除了那些位于啮齿类动物抗体的互补性决定区的任何残基的任何原子的之内的氨基酸残基；和(5)产生具有结合特异性的人源化啮齿类动物抗体。

可以使用多种其它技术来人源化抗体，包括CDR-移植(EP 0 239 400；WO91/09967；美国专利5,530,101；和5,585,089)，镶面(veneering)或表面重构(EP0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka G.M.等，1994，Protein Engineering 7(6)：805-814；Roguska M.A.等，1994，PNAS 91：969-973)和链重排(美国专利5,565,332)。可以通过多种在本领域已知的技术制备人抗体，包括噬菌体展示方法。也参见美国专利4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和国际专利申请公开号WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741(所述文献的全部内容被引入作为参考)。

在优选的实施方案中，本发明提供了识别Muc1粘蛋白上的新的唾液酸糖表位(CA6糖表位)的人源化抗体或其片段。在另一实施方案中，人源化抗体或其表位结合片段具有抑制表达CA6糖表位的细胞生长的额外的能力。

在更优选的实施方案中，提供了DS6抗体的表面重构或人源化形式，其中在轻链和重链中，抗体或其片段的表面暴露的残基被取代，以更加类似于已知的人抗体表面。本发明的人源化DS6抗体或其表位结合片段具有改进的特性。例如，人源化DS6抗体或其表位结合片段特异性地识别Muc1粘蛋白上的新的唾液酸糖表位(CA6糖表位)。更优选地，人源化DS6抗体或其表位结合片段具有抑制表达CA6糖表位的细胞生长的另外的能力。人源化抗体或其表位结合片段可以被偶联到药物例如美登素类，通过将药物靶向于新的Muc1唾液酸糖表位CA6，形成对抗原表达细胞具有特异性细胞毒性的前体药物。包含这样的抗体和小的、高毒性药物(例如美登素类、紫杉烷类和CC-1065类似物)的细胞毒性偶联物可以被用作治疗肿瘤，例如乳房肿瘤和卵巢肿瘤的治疗剂。

DS6抗体的人源化形式在本文中也在下列方面被充分表征：其轻链和重链可变区各自的氨基酸序列、轻链和重链可变区基因的DNA序列、CDRs的鉴定、其表面氨基酸的鉴定、和对其以重组形式进行表达的方法的公开。

在一个实施方案中，提供了人源化抗体或其表位结合片段，其具有包括CDRs的重链，所述CDRs具有由SEQ ID NOs：1-3所示的氨基酸序列：

S Y N M H(SEQ ID NO：1)

Y I Y P G N G A T N Y N Q K F K G(SEQ ID NO：2)

G D S V P F A Y(SEQ ID NO：3)

当重链CDRs通过AbM建模软件来测定时，其由SEQ ID NOs：20-22表示：

G Y T F T S Y N M H(SEQ ID NO：20)

Y I Y P G N G A T N(SEQ ID NO：21)

G D S V P F A Y(SEQ ID NO：22)

在相同的实施方案中，人源化抗体或其表位结合片段具有包括CDRs的轻链，所述CDRs具有SEQ ID NOS：4-6所示的氨基酸序列：

S A H S S V S F M H(SEQ ID NO：4)

S T S S L A S(SEQ ID NO：5)

Q Q R S S F P L T(SEQ ID NO：6)

也提供了具有轻链可变区的人源化抗体及其表位结合片段，所述轻链可变区具有的氨基酸序列，与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列共享至少90％的序列同一性：

同样地，提供了具有重链可变区的人源化抗体及其表位结合片段，所述重链可变区具有的氨基酸序列，与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列共享至少90％的序列同一性：

在另一个实施方案中，提供了具有人源化或表面重构的轻链可变区的人源化抗体及其表位结合片段，所述可变区具有对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列：

同样地，提供了具有人源化或表面重构的重链可变区的人源化抗体及其表位结合片段，所述可变区具有对应于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列：

本发明的人源化抗体及其表位结合片段也可以包括下述的轻链和/或重链可变区的形式，即，其中与CDRs接近的人表面氨基酸残基被相应的muDS6表面残基取代，所述取代发生在表1(Kabat编号)中用星号标记的残基所限定的一个或多个位置处，目的是保持muDS6的结合亲和力及特异性。

表1

本文公开了DS6抗体轻链和重链的初级氨基酸和DNA序列，及其人源化形式。然而，本发明的范围并不限于包含这些序列的抗体和片段。相反，特异性地结合作为Muc 1受体上独特的肿瘤特异性糖表位的CA6的所有抗体和片段，都包括在本发明中。优选地，特异性结合CA6的抗体和片段也拮抗受体的生物活性。更优选地，这样的抗体进一步基本上没有激动剂活性。因此，本发明的抗体和抗体片段在其框架的氨基酸序列、互不决定区(CDRs)和/或轻链和重链上可以不同于DS6抗体或其人源化衍生物，但仍然在本发明的范围之内。

DS6抗体的CDRs通过建模来鉴定，而且其分子结构已经被预测。此外，虽然互不决定区(CDRs)对于表位识别是重要的，然而它们对本发明的抗体和片段并不是必需的。因此，提供了具有改进特性的抗体和片段，其通过例如本发明的抗体的亲和力成熟而产生。

很可能衍生出DS6的鼠轻链IgVκap4胚系基因和重链IgVh J558.41胚系基因被示于图11中，其与DS6抗体的序列进行比对。该比较鉴定了在DS6抗体中可能的体细胞突变，包括在互不决定区(CDRs)中的几个体细胞突变。

DS6抗体的重链和轻链可变区的序列，以及DS6抗体的CDRs的序列并非是以前已知的，其在图9A和9B中被阐明。这样的信息可以被用于产生人源化形式的DS6抗体。

抗体片段

本发明的抗体包括上述公开的全长抗体以及表位结合片段。如本文所用，“抗体片段”包括抗体的任何部分，该部分保留了结合由全长抗体所识别的表位的能力，一般被称作“表位结合片段”。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)₂、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫连接的Fvs(dsFv)以及包含V_L或V_H区的片段。包括单链抗体在内的表位结合片段可以单独包含可变区或与下述区域的完整区域或部分区域相组合：铰链区、C_H1、C_H2和C_H3结构域。

这样的片段可以包含一个或两个Fab片段或者F(ab′)₂片段。优选地，抗体片段包含整个抗体的所有六个CDRs，尽管包含所有这样的区域以下的区域，例如三个、四个或五个CDRs的片段也是有功能的。此外，片段可以是或可以联合下列免疫球蛋白类别的任何一种：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类。

通过使用酶例如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab′)₂片段)，经蛋白水解剪切，可以产生Fab和F(ab′)₂片段。

单链FVs(scFvs)片段为表位结合片段，其包含与抗体轻链可变区(V_L)的至少一个片段连接的抗体重链可变区(V_H)的至少一个片段。接头可以是短的柔性肽，其被选择用以保证一旦(V_L)和(V_H)区域被连接时，可发生恰当的三维折叠，以便保持衍生出该单链抗体片段的完整抗体的靶分子结合特异性。(V_L)或(V_H)序列的羧基末端可以通过接头与互补(V_L)或(V_H)序列的氨基酸末端共价连接。

本发明的单链抗体片段包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列具有在本说明书中所述的完整抗体的可变区或互补性决定区(CDRs)中的至少一个，但是缺乏那些抗体的一些或所有的恒定结构域。这些恒定结构域对抗原结合不是必需的，但是构成了完整抗体结构的主要部分。因此单链抗体片段可以克服与使用包含部分或所有恒定结构域的抗体有关的一些问题。例如，单链抗体片段往往不存在在生物分子和重链恒定区之间的不期望的相互作用，或者其它不期望的生物活性。另外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可以比完整抗体具有更大的毛细管渗透性，这使得单链抗体片段可更加有效地定位和结合靶抗原结合部位。而且，可以在原核细胞中以相对大的规模产生抗体片段，从而便于其生产。此外，单链抗体片段的相对小的尺寸使其较完整抗体在受体内激发免疫反应的可能性更小。

可以通过分子克隆、抗体噬菌体展示文库或技术人员熟知的相似技术产生单链抗体片段。例如，可以在真核细胞或原核细胞，包括细菌中制备这些蛋白质。使用在本领域已知的各种噬菌体展示方法也可以产生本发明的表位结合片段。在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。特别地，这样的噬菌体可以被用来展示由天然来源文库(repertoire)或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的表位结合结构域。可以用抗原选择或鉴定表达结合感兴趣的抗原的表位结合结构域的噬菌体，例如使用被结合或捕获至固体表面或珠子的标记抗原。在这些方法中使用的噬菌体一般为丝状噬菌体，包括fd和M13，结合结构域由噬菌体表达，Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域通过重组方法融合到噬菌体的基因III或基因VIII蛋白上。

可以被用来制备本发明的表位结合片段的噬菌体展示方法的实例包括那些在Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等1997，Gene 187：9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT申请PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中所公开的方法，在此引入每个文献的全部内容作为参考。

在噬菌体选择之后，编码片段的噬菌体部分可以被分离和使用，通过在选择的宿主中进行表达来产生表位结合片段，宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，这使用重组DNA技术进行，例如下文详述。例如，也可以利用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)₂片段的技术，使用在本领域已知的方法进行，例如那些公开在PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6)：864-869；Sawai等，1995，AJRI 34：26-34和Better等，1988，Science 240：1041-1043中的方法；上述参考文献的全部内容被引入作为参考。可以被用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括那些在美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等，1991，Methods in Enzymology 203：46-88；Shu等，1993，PNAS 90：7995-7999；Skerra等，1988，Science 240：1038-1040中所述的技术。

功能等同物

抗-CA6抗体和人源化抗-CA6抗体的功能等同物也包括在本发明的范围之内。术语“功能等同物(functional equivalents)”包括例如具有同源序列的抗体、嵌合抗体、人工抗体和修饰抗体，其中各个功能等同物通过其结合CA6的能力被定义。技术人员将理解，在被称作“抗体片段”的分子群体和被称作“功能等同物”的群体中存在重叠。产生功能等同物的方法例如在PCT申请WO 93/21319、欧洲专利申请239,400；PCT申请WO 89/09622；欧洲专利申请338,745和欧洲专利申请EP 332,424中被公开，其各自的全部内容被引入作为参考。

具有同源序列的抗体是具有下述氨基酸序列的那些抗体，所述氨基酸序列与本发明的抗-CA6抗体和人源化抗-CA6抗体的氨基酸序列具有序列同源性。优选地，同源性是与本发明的抗-CA6抗体和人源化抗-CA6抗体的可变区的氨基酸序列同源。本文应用于氨基酸序列的“序列同源性”被定义为，一个序列与另一氨基酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％或94％的序列同源性，更优选具有至少大约95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，例如，根据Pearsonand Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-2448(1988)中的FASTA搜索方法测定的。

如本文所用，嵌合抗体为其中抗体的不同部分衍生自不同动物种类的抗体。例如，具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区的抗体与人免疫球蛋白恒定区配对。产生嵌合抗体的方法在本领域是已知的。参见例如Morrison，1985，Science 229：1202；Oi等，1986，BioTechniques 4：214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods 125：191-202；美国专利5,807,715；4,816,567和4,816,397，在此引入其全部内容作为参考。

通过将例如鼠抗体的互补决定区替换到人骨架结构域中，制备嵌合抗体的人源化形式，例如参见PCT公开号WO 92/22653。人源化嵌合抗体优选具有不同于基本上或专有地来源于相应人抗体区域的互补决定区(CDRs)的恒定区和可变区，和基本上或专有地来源于非人哺乳动物的互补决定区(CDRs)。

人工抗体包括scFv片段、双抗体、三链抗体、四链抗体和最小识别单位(mru)(参阅综述Winter，G.and Milstein，C.，1991，Nature 349：293-299；Hudson，P.J.，1999，Current Opinion in Immunology 11：548-557)，其中每一个都具有抗原结合能力。在单链Fv片段(scFv)中，抗体的V_H和V_L结构域由柔性肽连接。典型地，该接头肽为大约15个氨基酸残基的长度。如果接头更小，例如5个氨基酸，则形成双抗体，其为二价scFv二聚体。如果接头被减少到三个氨基酸残基以下，则形成被称作三链抗体和四链抗体的三聚结构和四聚结构。抗体最小的结合单元为CDR，典型地为重链的CDR2，其具有特异性识别和结合能力，可以单独被使用。这样的片段被称作分子识别单元(molecular recognition unit)或最小识别单位(mru)。可以用短的接头肽将几个这样的最小识别单位(mru)连接在一起，从而形成与单一最小识别单位(mru)相比具有更高亲合力的人工结合蛋白质。

本申请的功能等同物也包括修饰的抗体，例如通过任何类型的分子与抗体的共价连接所修饰的抗体。例如，修饰的抗体包括例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其它蛋白等而被修饰的抗体。共价连接并不阻止抗体产生抗独特型反应。可以通过已知的技术进行这些修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，修饰的抗体可以包含一个或多个非典型氨基酸。

通过交换不同链上不同框架内的不同CDRs，可以产生功能等同物。因此，例如，通过不同重链的替代，对于一组特定CDRs，不同类别的抗体是可能的，例如，由此可以产生IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗体类型和同种型。同样地，通过在完全合成的框架内嵌入一组给定的CDRs，可以产生包括在本发明范围之内的人工抗体。

使用在本领域已知的很多方法，通过在位于一组特定CDRs侧翼的可变和/或恒定区序列内进行突变、缺失和/或插入，可以容易地产生功能等同物。

本发明的抗体片段和功能等同物包括那些分子，其与DS6抗体比较，以可检测的程度结合CA6。可检测的结合程度包括鼠DS6抗体与CA6的结合能力的至少10％至100％范围之内的所有值，优选至少50％、60％或70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％。

改进的抗体

CDRs对于表位识别与抗体结合是最重要的。然而，可以对构成CDRs的残基进行改变，而不干扰抗体识别和结合其关联表位的能力。例如可以进行这样的改变，其不影响表位识别，然而增加抗体对表位的结合亲和力。

因此，鼠和人源化抗体的改进的形式也包括在本发明的范围之内，所述形式也特异性识别并结合CA6，优选具有增加的亲和力。

几项研究已经基于对初级抗体序列的了解，调查了在抗体序列的各种位置上引入一个或多个氨基酸变化对其特性例如结合作用及表达水平的影响(Yang，W.P.等，1995，J.Mol.Biol.，254，392-403；Rader，C.等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，8910-8915；Vaughan，T.J.等，1998，Nature Biotechnology，16，535-539)。

在这些研究中，使用例如寡核苷酸介导定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA重排或大肠杆菌的增变株这些方法，通过改变CDR1、CDR2、CDR3或骨架区中的重链和轻链基因序列，已经产生了初次抗体的等同物(Vaughan，T.J.等，1998，Nature Biotechnology，16，535-539；Adey，N.B.等，1996，Chapter 16，pp.277-291，在"Phage Display of Peptides and Proteins"，Eds.Kay，B.K.等，AcademicPress)。这些改变初次抗体的序列的方法已经导致二次抗体的亲和力改善(Gram，H.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，3576-3580；Boder，E.T.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，10701-10705；Davies，J.and Riechmann，L.，1996，Immunotechnolgy，2，169-179；Thompson，J.等，1996，J.Mol.Biol.，256，77-88；Short，M.K.等，2002，J.Biol.Chem.，277，16365-16370；Furukawa，K.等，2001，J.Biol.Chem.，276，27622-27628)。

通过改变抗体的一个或多个氨基酸残基的相似的定向策略，本发明中所述的抗体序列可以被用于开发具有改进功能的抗CA6抗体，包括对CA6改善的亲和力。

改进的抗体也包括那些具有改进特征的抗体，其通过动物免疫、杂交瘤形成和选择具有特定特征的抗体的标准技术被制备。

细胞毒性剂

在本发明的细胞毒性偶联物中使用的细胞毒性剂可以是任何化合物，该化合物导致细胞死亡或诱导细胞死亡或以某种方式降低细胞生存能力。例如，优选的细胞毒性剂包括如下定义的美登素类和美登素类类似物、紫杉类药物(taxoids)、CC-1065和CC-1065类似物、海兔毒肽(dolastatin)和海兔毒肽类似物。这些细胞毒性剂与本文公开的抗体、抗体片段、功能等同物、改进的抗体和它们的类似物偶联。

可以通过体外方法制备细胞毒性偶联物。为了连接药物或前体药物到抗体，使用连接基团。适合的连接基团在本领域是熟知的，包括二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团为二硫基和硫醚基。例如，可以使用二硫交换反应或通过在抗体和药物或前体药物之间形成硫醚键而构建偶联物。

美登素类

美登素类和美登素类类似物属于可以被用在本发明中以形成细胞毒性偶联物的细胞毒性剂。适合的美登素类的例子包括美登醇(maytansinol)和美登醇类似物。美登素类是抑制微管形成并且对哺乳动物细胞具有高毒性的药物。

适合的美登醇类似物的例子包括那些具有修饰的芳香环和那些在其它位置具有修饰的药物。这样的适合的美登素类被公开在美国专利4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,33I,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371，533；6,333,410；5,475,092；5,585,499和5,846,545中。

具有修饰的芳香环的合适的美登醇类似物的具体实例包括：

(1)C-19-脱氯(美国专利4,256,746)(通过ansamytocin P2的LAH还原来制备)；

(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)脱甲基化或者使用LAH的脱氯而制备)；和

(3)C-20-脱甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利4,294,757)(通过使用酰氯的酰基化来制备)。

具有其它位置的修饰的合适的美登醇类似物的具体实例包括：

(1)C-9-SH(美国专利4,424,219)(通过美登醇与H₂S或P₂S₅的反应来制备)；

(2)C-14-烷氧甲基(脱甲氧基/CH₂OR)(美国专利4,331,598)；

(3)C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH₂OH或CH₂OAc)(美国专利4,450,254)(由诺卡菌(Nocardia)制备)；

(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利4,364,866)(通过链霉菌由美登醇的转化来制备)；

(5)C-15-甲氧基(美国专利4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewianudiflora)分离)；

(6)C-18-N-脱甲基(美国专利4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌由美登醇的脱甲基作用来制备)；和

(7)4，5-脱氧(美国专利4,371,533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。

在优选的实施方案中，本发明的细胞毒性偶联物利用含硫醇美登素类(DM1)作细胞毒性剂，其被正规地称作N^2′-脱乙酰-N^2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。DM1由下面的结构式(I)表示：

在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞毒性偶联物利用含硫醇美登素类N^2′-脱乙酰-N^2′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素作为细胞毒性剂。DM4由下面的结构式(ID表示：

在本发明进一步的实施方案中，可以使用其它的美登素，包括含硫醇和二硫物的美登素类，其在带有硫原子的碳原子上具有单烷基或二烷基取代。这些包括在C-3、C-14羟甲基，C-15羟基或C-20脱甲基上具有酰化的氨基酸侧链的美登索类，所述酰化的氨基酸侧链具有带有受阻的硫氢基的酰基，其中带有硫醇官能团的酰基基团的碳原子具有一个或两个取代基，所述取代基为CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性或支链烷基或链烯基、具有3到10个碳原子的环烷基或链烯基、苯基、取代苯基或杂环芳香基团或杂环基，进一步，其中所述取代基之一可以是H，其中所述酰基基团在羰基官能团和硫原子之间具有至少三个碳原子的线性链长度。

这样的另外的美登素包括由式(III)表示的化合物：

其中：

Y′代表

(CR₇R₈)_l(CR₉＝CR₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_t(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ，

其中：

R₁和R₂各自独立地为CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代苯基或杂环芳香基或杂环基，另外，R₂可以是H；

A、B、D为具有3-10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或者取代的芳基或杂环芳基或杂环基基团；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁和R₁₂各自独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代苯基或杂环芳基或杂环基基团；

l、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自独立地为0或从1到5的整数，条件是l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的至少两个不同时为0；和

Z为H、SR或-COR，其中R为具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基，具有3到10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基，或简单或取代的芳基或杂环芳基或杂环基基团。

式(III)优选的实施方案包括这样的式(III)的化合物，

其中：

R₁是甲基，R₂是H，Z是H；

R₁和R₂是甲基，Z是H；

R₁是甲基，R₂是H，Z是-SCH₃；

R₁和R₂是甲基，Z是-SCH₃。

这样的另外的美登素也包括由式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)表示的化合物：

其中：

Y代表(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ，

其中：

R₁和R₂各自独立地为CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基，另外，R₂可以是H；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立为H、CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团；

l、m和n各自独立地为1到5的整数，另外，n可以是0；

Z为H、SR或-COR，其中R为具有1到10个碳原子的线性的或分支的烷基或烯基、具有3到10个碳原子的环烷基或环烯基，或者简单的或取代的芳基或杂环芳基或杂环基基团；和

May代表美登素类(maytansinoid)，其在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处带有侧链。

式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的优选实施方案包括这样的式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的化合物，其中：

R₁为甲基，R₂是H，R₅、R₆、R₇和R₈每一个为H，l和m每一个为1，n为0，和Z为H。

R₁和R₂为甲基，R₅、R₆、R₇、R₈每个为H，l和m为1，n为0，和Z为H。

R₁为甲基，R₂是H，R₅、R₆、R₇和R₈每个为H，l和m每个为1，n为0，和Z为-SCH₃。

R₁和R₂为甲基，R₅、R₆、R₇、R₈每个为H，l和m为1，n为0，和Z为-SCH₃。

优选的细胞毒性剂由式(IV-L)表示。

这样的另外的美登素也包括由式(V)所示的化合物：

其中：

Y代表(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ，

其中：

R₁和R₂各自独立地为CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团，另外，R₂可以是H；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团；

l、m和n各自独立地为1到5的整数，另外，n可以是0；和

Z为H、SR或-COR，其中R为具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基，或简单的或取代的芳基或杂环芳基或杂环基基团。

式(V)的优选的实施方案包括这样的式(V)的化合物，其中：

R₁为甲基，R₂是H，R₅、R₆、R₇和R₈每个为H，l和m每个为1，n为0，和Z为H。

这样的另外的美登素进一步包括由式(VI-L)、(VI-D)或(VI-D，L)所示的化合物：

其中：

Y₂代表(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ₂，

其中：

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈各自独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性环烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团；

l、m和n各自独立地为1到5的整数，另外，n可以是0；

Z₂为SR或COR，其中R为具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支的或环状的烷基或烯基，或简单的或取代的芳基或杂环芳基或杂环基基团；和

May为美登素类。

这样的另外的美登素也包括由式(VII)表示的化合物：

其中：

Y₂′代表

(CR₇R₈)_l(CR₉＝CR₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_t(CR₃R₄)_nCR₁R₂SZ₂，其中：

R₁和R₂各自独立地为CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性或分支烷基或烯基、具有3到10个碳原子的环烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基，另外，R₂可以是H；

A、B和D各自独立地为具有3到10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基、或杂环芳基或杂环烷基基团；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁和R₁₂每个独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团；

l、m、n、o、p、q、r、s、t和u每个独立地为0或从1到5的整数，条件是l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的至少两个不同时为零；和

Z₂为SR或-COR，其中R为具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状的烷基或烯基，或简单的或取代的芳基或杂环芳基或杂环基基团。

式(VII)的优选实施方案包括这样的式(VII)的化合物，其中：R₁为甲基和R₂为H。

上述美登素类可以被偶联到抗CA6抗体DS6或其同源物或其片段，其中使用硫醇或二硫官能团将抗体连接到美登素类，所述硫醇或二硫官能团存在于美登素类的C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20脱甲基处的酰化氨基酸侧链的酰基基团上，其中酰化的氨基酸侧链的酰基基团所具有的硫醇或二硫官能团位于具有一个或两个取代基的碳原子上，所述取代基为CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团，另外，取代基之一可以是H，其中所述酰基基团在羰基官能基和硫原子之间具有至少三个碳原子的线性链长度。

本发明优选的偶联物为包含与式(VIII)美登素类偶联的抗-抗-CA6抗体DS6或其同源物或其片段的偶联物：

其中：

Y₁′代表

(CR₇R₈)_l(CR₉＝R₁₀)_p(C≡C)_qA_o(CR₅R₆)_mD_u(CR₁₁＝CR₁₂)_r(C≡C)_sB_t(CR₃R₄)_nCR₁R₂S-，

其中：

A、B和D各自独立的为具有3到10个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基，或杂环芳基或杂环基基团；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁和R₁₂每个独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团；和

l、m、n、o、p、q、r、s、t和u每个独立地为0或1到5的整数，条件是l、m、n、o、p、q、r、s、t和u的至少两个不是同时为零。

优选地，R₁甲基为和R₂为H或R₁和R₂为甲基。

本发明更优选的偶联物为包括与式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D，L)美登素类偶联的抗CA6抗体DS6或其同源物或片段的偶联物：

其中：

Y₁代表(CR₇R₈)_l(CR₅R₆)_m(CR₃R₄)_nCR₁R₂S-，

其中：

R₁和R₂各自独立地为CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳基或杂环基基团，另外，R₂可以是H；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈每个独立地为H、CH₃、C₂H₅、具有1到10个碳原子的线性烷基或烯基、具有3到10个碳原子的分支或环状烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳基或杂环基基团；

l、m和n每个独立地为1到5的整数，另外，n可以是0；和

May代表美登醇，其具有位于C-3，C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基处处的侧链。

式(IX-L)、(IX-D)和(IX-D，L)的优选实施方案包括这样的式(IX-L)、(IX-D)和(IX-D，L)的化合物，其中：

R₁为甲基和R₂为H，或R₁和R₂为甲基，

R₁为甲基，R₂为H，R₅、R₆、R₇和R₈每个为H，l和m每个为1，n为0，

R₁和R₂为甲基，R₅、R₆、R₇和R₈每个为H，l和m为1，n为0。

优选地，细胞毒性剂由式(IX-L)表示。

本发明进一步优选的偶联物为包含抗CA6抗体DS6或其同源物或片段并与式(X)的美登素类偶联的偶联物：

其中，取代基如上述式(IX)中所定义。

特别优选的是任何上述化合物，其中R₁为H，R₂为甲基，R₅、R₆、R₇和R₈每个为H，l和m每个为1，和n为0。

进一步特别优选的为任何上述化合物，其中R₁和R₂为甲基，R₅、R₆、R₇、R₈每个为H，l和m为1，和n为0。

更进一步，L-氨酰基立体异构体是优选的。

于2004年5月20提交的正在审理中的美国专利申请10/849,136中所述的各种美登素类也可以被用在本发明的细胞毒性偶联物中。在此引入美国专利申请10/849,136的全部公开内容作为参考。

含二硫化物的连接基团

为了将美登素类和细胞结合剂例如DS6抗体连接，美登素类包含连接部分。该连接部分包含化学键，该化学键允许完全活性的美登素类在特定部位释放。适合的化学键在本领域是熟知的，包括二硫键、酸不稳定性键、光不稳定性键、肽酶不稳定性键和酯酶不稳定性键。优选二硫键。

连接部分也包括活性化学基团。在一个优选的实施方案中，所述活性化学基团可以通过二硫键连接部分与美登素类共价连接。

特别优选的活性化学基团为N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl ester)和N-磺基琥珀酰亚胺酯(N-sulfosuccinimidyl esters)。

特别优选的包含含有活性化学基团的连接部分的美登素类为美登醇的C-3酯及其类似物，其中所述连接部分包含二硫键，活性化学基团包括N-琥珀酰亚胺酯或N-磺基琥珀酰亚胺酯。

美登素类上的很多位置可以作为化学连接所述连接部分的位置。例如，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位及具有羟基的C-20位都被认为是有用的。然而，优选C-3位，而且特别优选美登醇的C-3位。

尽管根据含二硫键的连接部分，描述了具有连接部分的美登醇的酯的合成，但本领域普通技术人员将理解，具有其它化学键(如上所述)的连接部分也可以被用于本发明，正如其它美登素类可以被用于本发明。其它化学键的具体例子包括酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不稳定键和酯酶不稳定键。在此所引入的美国专利5,208,020的公开内容教导了具有这样的键的美登素类的制备。

在美国专利6,441,163和6,333,410和美国申请号10/161,651中描述了具有含活性基团的二硫化物部分的美登素类和美登素类衍生物的合成，每篇专利在此被引入作为参考。

将含活性基团的美登素类例如DM1，与抗体例如DS6抗体反应，以产生细胞毒性偶联物。可以通过HPLC或凝胶过滤来纯化这些偶联物。

美国专利6,333,410和美国申请号09/867,598、10/161,651和10/024,290中提供了用于产生这样的抗体-美登素类偶联物的几个良好的方案，每篇专利以其全部内容引入本文。

一般而言，可以将具有含活性基团的二硫化物部分的摩尔过量的美登素类与在含水缓冲液中的抗体溶液温育。通过加入过量胺(例如乙醇胺、牛磺酸等)淬灭反应混合物。然后通过凝胶过滤来纯化美登素类-抗体偶联物。

通过分光光度测量252nm和280nm处的吸光度比值，可以测定每个抗体分子所结合的美登素类分子的数量。优选平均1-10个美登素类分子/抗体分子。

可以评价抗体与美登素类药物的偶联物在体外抑制各种不期望的细胞系增殖的能力。例如，细胞系如人表皮癌细胞系A-431、人小细胞肺癌细胞系SW2、人乳腺肿瘤细胞系SKBR3和伯基特淋巴瘤细胞系Namalwa可以容易地被用于评价这些化合物的细胞毒性。可以将待评价的细胞暴露于化合物24小时，通过已知的方法在直接测定中测量细胞的存活分数。然后由测定结果可以计算IC₅₀值。

含PEG的连接基团

也可以使用PEG连接基团将美登素类连接到细胞结合剂，如在美国申请号10/024,290中所述。这些PEG连接基团在水和非水溶剂中都是可溶的，可以被用来将一个或多个细胞毒性剂连接至细胞结合剂。示例性的PEG连接基团包括异双功能PEG接头，其通过一端的功官能性巯基或二硫基团和另一端的活性酯而将细胞毒性剂和细胞结合剂连接在接头的两端。

作为使用PEG连接基团合成细胞毒性偶联物的一般实例，其具体细节也可参考美国申请号10/024,290。合成始于使具有活性PEG部分的一个或多个细胞毒性剂与细胞结合剂反应，导致每个活性PEG部分的末端活性酯被细胞结合剂的氨基酸残基置换，以产生包含一个或多个细胞毒性剂的细胞毒性偶联物，所述细胞毒性剂经PEG连接基团与细胞结合剂共价连接。

紫杉烷类

用在本发明的细胞毒性偶联物中的细胞毒性剂也可以是紫杉烷或其衍生物。

紫杉烷(taxane)类为一类化合物家族，其包括紫杉醇(paclitaxel)(Taxol)，其为细胞毒性天然产物，和多烯紫杉醇(docetaxel)(Taxotere)，其为半合成衍生物，这两种化合物被广泛用于癌症的治疗。紫杉烷类为有丝分裂纺锤体毒剂，其抑制微管蛋白的解聚，从而导致细胞死亡。尽管在癌症的治疗中多烯紫杉醇和紫杉醇是有用的药剂，然而它们的抗肿瘤活性是有限的，原因在于它们对正常细胞具有非特异性毒性。此外，像紫杉醇和多烯紫杉醇这样的化合物本身并不能足够有效地应用在与细胞结合剂的偶联物中。

用于制备细胞毒性偶联物的优选的紫杉烷为式(XI)的紫杉烷：

可以用在本发明的细胞毒性偶联物中的紫杉烷类的合成方法，以及紫杉烷类和细胞毒性剂例如抗体的偶联方法，在美国专利5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931以及在美国申请号10/024,290、10/144,042、10/207,814、10/210,112和10/369,563中被详细描述。

CC-1065类似物

应用在根据本发明的细胞毒性偶联物中的细胞毒性剂也可以是CC-1065或其衍生物。

CC-1065是从泽耳链霉菌(Streptomyces zelensis)的培养物中分离出来的有效的抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外比普通使用的抗癌药的药效高约1000倍，普通使用的抗癌药例如阿霉素(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春新碱(vincristine)(B.K.Bhuyan等，Cancer Res.，42，3532-3537(1982))。CC-1065及其类似物在美国专利6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499中被公开。

CC-1065的细胞毒性效力与其烷基化活性和其DNA结合或DNA嵌入活性相关。这两种活性位于该分子的不同部分。因此，烷基化活性包含在环丙吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole)(CPI)亚单位中，DNA结合活性位于两个吡咯并吲哚(pyrroloindole)亚单位中。

尽管CC-1065作为细胞毒性剂具有一定的吸引人的特征，然而它在治疗用途上具有局限性。对小鼠施用CC-1065会引起延迟性肝毒性，这导致在单次静脉剂量12.5μg/kg之后的第50天死亡{V.L.Reynolds等，J.Antibiotics，XXIX，319-334(1986)}。这已经激励起开发不引起延迟毒性的类似物的努力，以CC-1065为模型的更简单的类似物的合成已经被描述{M.A.Warpehoski等，J.Med，Chem.，31，590-603(1988)}。

在另一系列的类似物中，CPI部分被环丙苯并吲哚(cyclopropabenzindole)(CBI)部分代替{D.L.Boger等，J.Org.Chem.，55，5823-5833，(1990)，D.L.Boger等，BioOrg.Med.Chem.Lett.，1，115-120(1991)}。这些化合物保持了母体药物的高体外效力，在小鼠中不引发延迟毒性。类似CC-1065，这些化合物是烷化剂，其以共价方式结合DNA的小沟以引起细胞死亡。然而，对最具前景的类似物阿多来新(Adozelesin)和卡折来新(Carzelesin)的临床评估已经产生令人失望的结果{B.F.Foster等，Investigational New Drugs，13，321-326(1996)；I.Wolff等，Clin.CancerRes.，2，1717-1723(1996)}。这些药物显示了不佳的治疗效果，原因在于其具有高全身毒性。

通过定向传输到肿瘤部位而改变体内分布，可以极大改善CC-1065类似物的治疗功效，从而使得对非靶组织具有较低毒性，并因此具有较低的全身毒性。为实现这个目标，CC-1065的类似物及衍生物与特异性靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的偶联物已经被描述{美国专利：5,475,092；5,585,499；5,846,545}。这些偶联物在体外典型地显示出高靶特异性细胞毒性，并在小鼠中的人肿瘤异种移植物模型中显示出非凡的抗肿瘤活性{R.V.J.Chari等，Cancer Res.，55，4079-4084(1995)}。

可用在本发明的细胞毒性偶联物中的CC-1065类似物的合成方法，以及所述类似物与细胞结合剂例如抗体的偶联方法在美国专利5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660和6,586,618以及在美国申请10/116,053和10/265,452中被详细描述。

其它药物

药物例如甲氨蝶呤(methotrexate)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、卡奇霉素(calicheamicin)、tubulysin及tubulysin类似物、duocarmycin及duocarmycin类似物、海兔毒肽及海兔毒肽类似物也适合制备本发明的偶联物。所述药物分子可以通过中间载体分子例如血清白蛋白与抗体分子连接。例如，Doxarubicin和Danorubicin化合物也可以是有用的细胞毒性试剂，如在美国序列号09/740991中所述。

治疗组合物

本发明也提供了治疗组合物，其包括：

(a)有效量的一种或多种细胞毒性偶联物；和

(b)药物学可接受的载体。

同样地，本发明提供用于抑制选择的细胞群的生长的方法，该方法包括：用有效量的细胞毒性偶联物或包含细胞毒性偶联物的治疗剂接触靶细胞或包含靶细胞的组织，所述细胞毒性偶联物或治疗剂单独施用或者与其它细胞毒性剂或治疗剂联合施用。

本发明也包括使用本发明的治疗组合物治疗患癌症对象的方法。

通过先前所述的方法，可以评价细胞毒性偶联物在体外的效价和特异性(参见，例如R.V.J.Chari等，Cancer Res.55：4079-4084(1995))。通过先前也已描述的方法，可以在小鼠的人肿瘤异种移植物模型中评价抗肿瘤活性(参见例如Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.93：8618-8623(1996))。

合适的药物学可接受的载体是熟知的，而且本领域普通技术人员能够确定其是否符合临床情况许可。正如本文所用，载体包括稀释剂和赋形剂。

合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH～7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))，和(3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween 20。

抑制所选择的细胞群的生长的方法可以在体外(in vitro)、在体内(in vivo)或离体(ex vivo)实施。正如本文所用，抑制生长意味着减慢细胞的生长、减少细胞存活率、引起细胞的死亡、裂解细胞和诱导细胞死亡，无论是在短的时间期间或长的时间期间内。

体外使用的例子包括在自体骨髓移植到同一患者体内之前对自体骨髓的处理，目的是杀死患病的或恶性的细胞；骨髓移植之前的处理，目的是杀死竞争性T细胞及预防移植物抗宿主病(graft-versus-host-disease(GVHD))；细胞培养物的处理，目的是杀死除了不表达靶抗原的期望变体之外的所有细胞；或杀死表达不期望的抗原的变体。

本领域普通技术人员可容易地确定非临床体外应用的情况。

离体的临床应用的例子是在癌症治疗或自身免疫疾病治疗中，在自体移植之前，从骨髓中去除肿瘤细胞或淋巴细胞，或在移植之前，从自体或异源骨髓或组织中去除T细胞和其它淋巴细胞，目的是预防移植物抗宿主病(graft versus hostdisease(GVHD))。治疗可以如下进行。从患者或其它个体采集骨髓，然后在含有血清并加入本发明的细胞毒性剂的培养基中温育。浓度在大约10μM到1pM，在大约37℃温育大约30分钟到大约48小时。本领域普通技术人员可以容易地确定确切的浓度条件和温育时间，即剂量。温育之后，用含血清的培养基洗涤骨髓细胞，并按照已知的方法通过静脉输注将其返回至患者。在一些情况下，在采集骨髓和再输注已处理的细胞之间的时期，患者接受其它治疗例如消融化疗或全身放射过程，此时，使用标准的医疗设备将已处理的骨髓细胞在液氮中冷冻保存。

对于在体内的临床应用，本发明的细胞毒性偶联物将以溶液形式予以供应，对该溶液的无菌性和内毒素水平进行检验。细胞毒性偶联物的合适的施用方案的实例如下。以每周静脉药丸(bolus)给药的方式每周给予偶联物，共4周。药丸剂量被提供于50到100ml的生理盐水中，其中可以加入5到10ml的人血清白蛋白。剂量为每次给药10μg到100mg，静脉给药(每天100ng到1mg/kg的范围)。更优选地，剂量范围是50μg到30mg。最优选，剂量范围是1mg到20mg。治疗四周之后，患者可以继续以周为基础接受治疗。当临床情况准许时，本领域普通技术人员可以决定有关给药途径、赋形剂、稀释剂、剂量、次数等具体临床方案。

根据杀死选择的细胞群体的体内或离体方法，可以被治疗的医学状况的实例包括任何类型的恶性病，包括例如肺癌、乳癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌和淋巴器官癌、骨肉瘤、滑膜癌、其中CA6被表达的肉瘤或癌以及其中CA6糖表位被明显表达的其它待确定的癌；自身免疫疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化；移植物排斥，例如肾移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病；病毒感染，例如mV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生虫感染，例如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病和本领域普通技术人员确定的其它疾病。

试剂盒

本发明也包括试剂盒，其例如包含所述细胞毒性偶联物和使用该细胞毒性偶联物杀死特定细胞类型的使用说明。所述使用说明可以包括用于在体外、在体内或离体使用细胞毒性偶联物的指导。

典型地，试剂盒将具有包含细胞毒性偶联物的分隔室(compartment)。细胞毒性偶联物可以是冻干形式、液体形式或可适于被包含在试剂盒中的其它形式。试剂盒也可以包含对于实施在试剂盒中的说明书上描述的方法所需的另外的组分，例如用于重构冻干粉末的无菌溶液，在向患者给药之前与细胞毒性偶联物组合的额外药剂，和帮助向患者施用偶联物的工具。

其它的实施方案

本发明进一步提供单克隆抗体、人源化抗体及其表位结合片段，它们被进一步标记以便用于研究或诊断应用中。在优选的实施方案中，所述标记为放射性标记、荧光团、生色团、显像剂或金属离子。

也提供了诊断方法，其中所述标记的抗体或其表位结合片段被施用给怀疑患癌症的对象，并测量或监测所述标记在对象体内的分布。

实施例

参考下列实施例可最好地理解本发明的广泛的范围，这些实施例并非意在使本发明限于具体的实施方案。

实施例1：通过流式细胞术结合试验进行的抗原阳性和阴性细胞系的鉴定

流式细胞分析被用来将DS6表位、CA6定位到细胞表面。人细胞系从美国典型培养物保藏中心(American Type Culturae Collection，ATCC)获得，除了OVCAR5(Kearse等，Int.J.Cancer 88(6)：866-872(2000))、OVCAR8和IGROV1细胞(M.Seiden，Massachusetts General Hospital)之外。所有的细胞在RPMI 1640中培养，其中补充有4mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素(CambrexBio Science，Rockland，ME)和10％v/v胎牛血清(Atlas Biologicals，Fort Collins，CO)，其在下文被称作培养基。细胞被保持在37℃，5％CO₂湿润温育箱中。

将细胞(1-2×10⁵个细胞/孔)与连续稀释浓度的DS6抗体在冰上温育3-4h，所述DS6抗体在96孔板中，在FACS缓冲液(2％羊血清，RPMI)中制备。在4℃，在台式离心机中以1500rpm旋转沉降细胞5分钟。去除培养基后，再用150μl的FACS缓冲液重新充填孔。然后重复洗涤步骤。FITC-标记的羊抗鼠IgG(Jackson hnmunoresearch)用FACS缓冲液稀释1∶100，并与细胞在冰上温育1h(小时)。用箔覆盖细胞培养板，以防止信号的光漂白。两次洗涤之后，用1％甲醛固定细胞，并在流式细胞仪上进行分析。

显著地，CA6表位被发现于卵巢、乳腺、子宫颈和胰腺来源的细胞系(表3)中，正如肿瘤免疫组织化学所预测。然而，其它肿瘤类型的一些细胞系显示出有限的CA6表达。DS6抗体结合具有135.6pM的表观K_D(在PC-3细胞中，表3)。在抗原阳性细胞系中，结合曲线(图1)的最大平均荧光(表3)表示了相对抗原密度。

表3

*平均最大相对平均荧光

实施例2：DS6表位的表征

通过对CA6阳性细胞裂解产物(Caov-3)的斑点印迹进行免疫印迹，来分析DS6抗原CA6的性质，所述细胞裂解产物用蛋白水解(链霉蛋白酶和蛋白酶K)和/或糖裂解(神经氨酸酶和过碘酸)处理进行消化。对阳性对照而言，在抗原阳性细胞系的裂解物上测试识别各种表位类型的其它抗体(Caov-3和CM1；Colo205和C242；SKMEL28和R24)。CM1是识别Muc-1的变化数目串连重复结构域(variablenumber tandem repeat domain(VNTR))的蛋白表位的抗体，因此为蛋白表位提供了对照。C242结合在Muc-1上的新的结肠直肠癌特异性唾液酸依赖性糖表位(CanAg)，其为蛋白上的糖表位提供了对照。R24结合特异于黑素瘤的GD3神经节苷脂，因此为非蛋白质骨架上的糖表位提供了对照。

Caov-3、Colo205和SKMEL28细胞被铺于15cm组织培养板上。在裂解的前一天，更新培养基(30mL/板)。在冰上预冷改良的RIPA缓冲液(50mM Tris-HClpH 7.6，150mM NaCl，5mM EDTA，1％NP40，0.25％去氧胆酸钠)、蛋白酶抑制剂(PMSF，胃蛋白酶抑制剂A，亮抑蛋白酶肽和抑酶肽)和PBS。将培养基从板中吸出之后，用10ml冷PBS洗细胞两次。在冰上和/或4℃冷室中进行所有随后的步骤。在PBS的最后洗涤物被吸出之后，用1-2mL裂解缓冲液(RIPA缓冲液，带有新鲜加入的蛋白酶抑制剂，最终浓度为1mM PMSF，1μM胃蛋白酶抑制剂A，10μg/ml亮抑蛋白酶和2μg/ml抑酶肽)裂解细胞。使用细胞收集器(cell lifter)将裂解产物刮离平板，并使用18G针通过上下吹吸悬液(5-10次)而将裂解产物粉碎。将裂解产物涡旋10分钟，然后在微离心机中以最大转速(13K rpm)离心10分钟。去掉沉淀，然后使用Bradford蛋白分析试剂盒(Biorad)测分析上清液。

裂解产物(2μl)被直接移取到干燥的0.2μm的硝化纤维素膜上。使斑点风干大约30分钟。该膜被切成片，每片包含一个点。在37℃，在存在链霉蛋白酶(1mg/ml酶，50mM Tris pH 7.5，5mM CaCl₂)、蛋白酶K(1mg/ml酶，50mM TrispH 7.5，5mM CaCl₂)、神经氨酸酶(20mU/ml酶，50mM醋酸钠pH 5，5mM CaCl₂，100μg/ml BSA)或过碘酸(20mM，0.5M醋酸钠pH 5)的条件下将斑点温育1h。试剂购自Roche(酶)和VWR(过碘酸)。膜在T-TBS洗涤缓冲液(0.1％Tween 20，1×TBS)中洗涤(5分钟)，在室温下用封闭缓冲液(3％BSA、T-TBS)封闭2h，并在4℃在封闭缓冲液中用2μg/ml一抗(即DS6、CM1、C242、R24)过夜温育。用T-TBS将膜洗涤三次，5分钟，然后在室温下，用HRP偶联的羊抗鼠(或人)IgG二抗(Jackson Immunoresearch；在封闭液中的1∶2000稀释液)温育1h。将免疫印迹洗涤三次，使用ECL系统(Amersham)显影。

被消化的对照裂解产物的免疫印迹(图2)显示，CM1信号被蛋白水解处理破坏，而糖裂解消化物的信号未受影响，如对于识别蛋白表位的抗体所预料。C242信号被蛋白水解或糖裂解处理破坏，如对识别在蛋白上发现的糖表位的抗体所预料。R24信号未受蛋白水解处理的影响，其被神经氨酸酶或过碘酸处理破坏，如对于识别神经节苷脂的抗体所预料。被消化的Caov-3裂解产物斑点印迹的DS6免疫印迹显示，用蛋白水解和糖裂解化合物处理之后信号丧失。因此，如同C242，DS6结合在蛋白质核(proteinaceous core)上的糖表位。此外，在DS6免疫印迹中的信号对神经氨酸酶处理敏感。因此，CA6如同CanAg，是唾液酸依赖性糖表位。

为了证实CA6的糖本质，Caov-3裂解产物被点到PVDF膜上并用化学的去糖基化试剂，三氟甲磺酸(trifluoromethane sulfonic acid)(TFMSA)，在氮气氛中，室温下处理5分钟。用T-TBS洗涤斑点，并用CM1或DS6进行免疫印迹(图3)。在用酸处理后DS6信号被破坏，这进一步提供了证据表明CA6是糖表位。在TFSMA处理后CM1信号增强，表明该酸处理没有影响过滤物上的蛋白质，而且表明糖裂解处理暴露了被CM1识别的蛋白表位。

为了进一步阐释容纳CA6的糖的结构，用N-聚糖酶、O-聚糖酶和/或唾液酸酶消化斑点印迹(图4)。在100℃，用2.5μl含SDS和β-巯基乙醇的变性缓冲液(Glyko)温育Caov-3细胞裂解产物(100μg，30μl)5分钟。然后在37℃，用1μl N-聚糖酶、O-聚糖酶和/或唾液酸酶A(Glyko)将该变性裂解产物消化1h。然后将消化的裂解产物点到(2μl)硝化纤维素上，并如上述进行免疫印迹。

N-聚糖酶对DS6免疫印迹信号无明显影响。然而，用唾液酸酶消化的样品没有产生信号。因为O-聚糖酶不能消化未经唾液酸酶预处理的唾液酸化O-联接糖，所以单独用O-聚糖酶处理的样品的DS6信号将不受影响。相反，N-聚糖酶的活性不需要用任何糖苷酶进行预处理。N-聚糖酶处理不影响DS6信号的事实表明，CA6表位极有可能位于唾液酸化的O-联糖链上。

实施例3：对在其上发现有CA6表位的抗原的阐释

为了鉴定在其上发现有CA6唾液酸糖表位的抗原，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析DS6免疫沉淀物。在4℃，细胞裂解物上清液(1mL/样品；3-5mg蛋白质)用由1ml RIPA缓冲液平衡的蛋白G珠子(30μl)预清理1-2h，伴随着旋转。在冰上和/或4℃冷室进行所有的后续步骤。在微量离心机中短时旋转沉降预清理珠子(2-3s)。将预处理的上清液转移到新管子中，并用2μg DS6在旋转状态下温育过夜。将新制备的平衡的蛋白G珠子(30μl)加入裂解产物中，并在旋转状态下温育1h。在微量离心机中短时旋转沉降珠子-裂解物悬液，可任选地取出免疫沉淀后裂解物的样品。用1mL RIPA缓冲液将珠子洗涤5-10次。

然后在37℃用30μl神经氨酸酶(20mU神经氨酸酶(Roche)，50mM乙酸钠pH 5，5mM CaCl₂，100μg/ml BSA)或30μl过碘酸(20mM过碘酸(VWR)，0.5M乙酸钠pH 5)消化免疫沉淀的DS6样品1h。然后将其重悬浮在30μl的2×样品加样缓冲液(含β-巯基乙醇)中。将珠子煮沸5分钟，并将加样缓冲液上清液上样到4-12％或4-20％Tris-甘氨酸凝胶上(Invitrogen)。在125V将该凝胶在Laemmli电泳缓冲液中跑胶1.5h。使用Mini Trans-blot转移装置(Biorad)，将凝胶样品转移到0.2μm的硝化纤维素膜上(Invitrogen)，20mA下过夜。如在上述实施例2中所述，用DS6免疫印迹此膜。

可选地，首先将免疫沉淀的珠子变性，然后用N-聚糖酶、O-聚糖酶和/或唾液酸酶A(Glyko)酶促消化。将珠子重悬浮于27μl温育缓冲液和2μl变性液(Glyko)中，并在100℃温育5分钟。冷却到室温之后，加入去污剂溶液(2μl)并用1μl N-聚糖酶、O-聚糖酶和/或唾液酸酶A在37℃将样品温育4小时。加入5×样品加样缓冲液(7μl)之后，将样品煮沸5分钟。如上所述，使样品进行SDS-PAGE和免疫印迹。

DS6免疫沉淀出＞250kDa的蛋白质条带，在抗原阳性细胞裂解物中可以看到此蛋白质带(图5A、B和C)。在一些细胞系中(即T-47D)，观察到双联体。在用神经氨酸酶或过碘酸(图5A和B)处理的Caov-3免疫沉淀物中，＞250kDa的条带被破坏，这表明CA6表位位于＞250kDa的条带上。＞250kDa的条带也显示出对免疫沉淀物的N-聚糖酶处理不敏感，这与CA6位于O-联糖上是一致的(图5F)。此外，支持250kDa条带为CA6抗原的是这样的事实，即在DS6抗原阴性细胞中DS6没有免疫沉淀出这样的条带(图5D和E)。

有几条证据表明CA6抗原为Muc1。由于其高分子量和对O-联糖特异性糖水解酶的敏感性，CA6抗原很可能是粘蛋白。粘蛋白的过量表达在肿瘤中特别是在乳腺和卵巢肿瘤中被很好地表征，这与DS6的主要肿瘤反应活性是一致的。此外，如同CanAg(其为在Muc1上的唾液酸糖表位)，CA6对高氯酸沉淀不敏感，这表明CA6抗原极大可能是(heavily)O-糖基化的。观察到在一些DS6表达细胞系中，DS6免疫沉淀出＞250kDa的双联体，表明CA6为Muc1。人类Muc1的特点是存在两种不同的Muc1等位基因，其串连重复的数目不同，这导致两种不同分子量的Muc1蛋白质的表达。

为了检验是否在Muc1上发现CA6，对来自Caov-3裂解物的DS6免疫沉淀物进行SDS-PAGE，并用DS6或Muc1 VNTR抗体CM1进行免疫印迹。如在图6A所观察到的，CM1与由DS6免疫沉淀出来的＞250kDa条带发生强烈反应。在图6B中，当用DS6或CM1进行免疫印迹时，来自HeLa细胞裂解物的DS6和CM1免疫沉淀物显示出同样的＞250kDa的双联体。这些结果表明CA6表位的确位于Muc-1蛋白质上。在HeLa(和T-47D)细胞中所观察到的DS6双联体可以通过这样的事实解释，即Muc-1的表达是由具有不同数目的串连重复序列的不同等位基因来指导。

尽管CM1和DS6结合相同的Muc-1蛋白，然而它们是不同的表位。Caov-3裂解物的斑点印迹通过三氟甲磺酸(TFMSA)的化学去糖基化作用，破坏了DS6信号(图3)。然而，这一相同的处理增强了CM1信号。去糖基化作用可能是暴露了被隐藏的CM1抗体的表位。此外，DS6和CM1的流式细胞术结合结果的比较(图4)表明，CA6表位并不是存在于表达Muc1的每个细胞上。有趣地发现，CA6表位在Colo205上不表达(表3)，已知Colo205细胞系表达高水平的Muc1 CanAg唾液酸糖表位。

表4

*MMF＝最大平均相对荧光

实施例4：流散(shed)CA6表位的定量分析

因为CA6表位位于Muc1上，已知在许多癌症患者中，Muc1分子会流散到血流中，所以采取定量方法，目的是确定这样的水平是否会抑制DS6抗体治疗。循环抗体与抗原的结合被认为可以导致免疫复合物从血液中快速清除。如果被施用的抗体剂量有很大部分被快速地从循环中去除，则到达肿瘤的量很可能减少，这导致抗体治疗剂的抗肿瘤活性降低。当抗体与高效的细胞毒性化合物偶联时，偶联物的快速清除可能潜在地增加非特异性毒性。因此，对于抗体-小的药物偶联物，例如DS6-DM1，可以预料到，高水平的流散抗原会降低抗肿瘤效应并增加剂量限制毒性(dose-limiting toxicity)。

近来的抗体治疗的临床试验已经获得了有关流散抗原浓度对药物动力学的影响的信息。例如，在曲妥珠单抗(Herceptin)——其为用于治疗表达her2/neu的转移性乳癌的抗体——的临床试验中，当流散的Her2/neu水平在500ng/mL以下时，曲妥珠单抗清除的药物动力学显示未被改变(Pegram等，J.Clin.Oncol.16(8)：2659-71(1998)。假定流散的Her2/neu的分子量为110,000道尔顿，流散的Her2/neu的摩尔浓度低于4.5nM似乎对药物动力学几乎没有影响。

在另一个例子中，采用cantuzumab mertansine(huC242-DM1)的临床试验表明，治疗前流散CanAg(C242表位)的水平与抗体清除的药物动力学没有关联(Tolcher等，J.Clin.Oncol.21(2)：211-22(2003)。CanAg表位，与由DS6识别的CA6表位相似，为在Muc1上的独特的肿瘤特异性O联唾液酸糖表位。然而，CanAg表位的异质性质使其难以用摩尔术语定量。在一般群体中，Muc1等位基因在长度上有变化，这取决于在变化数目的串连重复(VNTR)结构域中的串连重复的数目。在每个串连重复中都会出现几个O-联糖基化作用的位点。在固有糖基转移酶活性方面的细胞间变化赋予了CanAg表达复杂性。因此，甚至在一个病人身上，每个Muc1分子具有广泛范围的CanAg表位也是可能的。而且，在一群患者中，每个Muc1分子的CanAg表位的比例将是不同的。由于这个原因，通过夹心ELISA测量血清样品中的流散CanAg，其中带有CanAg表位的流散的Muc1被C242捕获，并通过生物素化C242/链霉抗生物素HRP系统进行检测。流散出的CanAg以标准单位(U)被定量，与每ml血清的表位数目成正比，而非通过Muc1的摩尔浓度来表示。类似地，对于流散的CA6表位的定量具有相似的情况。相反，对曲妥珠单抗而言，每个流散her2/neu分子仅有一个表位，这极大简化了对流散抗原的定量。

为了将CA6流散表位水平与那些在曲妥珠单抗和cantuzumab mertansine的临床试验中所发现的结果联系起来，开发了用于获得在Muc1上的复杂流散表位例如唾液酸糖表位的摩尔浓度的方法。首先，建立对DS6的简单夹心ELISA分析。对该分析的描绘被示于图7A中。DS6被用于捕获具有CA6表位的Muc1。因为每个Muc1分子具有多个CA6表位，所以生物素化的DS6也被用作示踪抗体。借助链霉抗生物素-HRP，使用ABTS作为底物，检测与被捕获的CA6结合的生物素化DS6。CA6表位捕获自卵巢癌患者血清或来自商业可得的Muc1检验试剂盒(CA15-3)的标准品，该标准品用于监测乳癌患者的流散Muc1。任意设置DS6单位/ml，其等同于CA15-3标准单位/ml。

在图7B中显示了DS6夹心ELISA的结果，其中使用了CA15-3标准品。所产生的曲线与在CA15-3分析中用CA15-3标准品所获得的曲线非常相似。为将DS6单位/ml转化为CA6的摩尔浓度，需要将信号转化为皮克DS6的生物素化DS6标准曲线。假定在CA6表位和生物素化DS6抗体之间是一对一的化学计量，而且生物素化DS6的分子量为160,000道尔顿，则可以计算所加入的每体积样品所捕获的CA6的摩尔数。

在图gA和B中描述了产生表示生物素化DS6的标准曲线的两种可供选择的方法。在图8A中，羊抗鼠IgG多克隆抗体被用于捕获生物素化DS6，其又以与在图7中所示的夹心ELISA分析中所用方式相同的方式被检测。在图8B所示的方法中，生物素化DS6被直接铺到ELISA板上，并如在图8A中所示被检测。如在图8C中看到的，通过每个方法所产生的生物素化DS6标准曲线非常一致。

在表5中显示了对卵巢癌患者血清样品的各种流散抗原所作的分析。通过测量流散出的CA125单位/ml，CA125 ELISA一般用于监测卵巢癌患者的治疗。血清样品的CA125状况被提供。使用识别不同于DS6所识别的表位的捕获抗体和检测抗体，通过测量流散的Muc1的单位/ml，CA15-3 ELISA一般被用于监测乳癌患者的治疗。在表5中，测量了卵巢癌患者血清样品中的CA15-3。

表5

¹由商业ELISA试剂盒测定

²由商业CA15-3标准品测定(1 CA15-3 U＝1 DS6 U)

³羊抗鼠IgG&生物素-DS6标准曲线

⁴生物素-DS6标准曲线

对于表5中所报告的CA15-3的值，使用了来自CanAg Diagnostics的商业可得的CA15-3酶免疫分析试剂盒(Enzyme Immuno Assay kit)。对于DS6单位/ml，在DS6夹心ELISA中，使用CA15-3标准品(来自CanAg Diagnostics的CA15-3酶免疫分析试剂盒)来产生标准曲线。任意设置DS6单位/ml等于CA15-3单位/ml。在最后两列中，使用在图8C中所示的生物素化DS6标准曲线来计算皮摩尔(pM)流散CA6。

对于CanAg水平的定量分析，所报告的CanAg血清水平是针对在治疗前参与cantuzumab mertansine临床试验的患者(Tolcher等，J.Clin.Oncol.21(2)：211-22(2003)。使用CanAg标准品，使用类似于对DS6所述的ELISA试验，制作CanAg标准曲线。C242被用于捕获CanAg标准品。使用生物素化C242示踪物，然后使用ABTS作为底物用链霉抗生物素-HRP进行显影，完成被捕获的CanAg的检测。建立生物素化C242标准曲线，如对生物素化DS6所作，以使单位/ml转化为循环CanAg表位的摩尔浓度。在表6中，报告了来自cantuzumab mertansine临床试验患者的CanAg水平，以及循环CanAg的相应的计算摩尔浓度。

表6

¹由夹心ELISA测量的循环CanAg的处理前水平

²羊抗鼠IgG&生物素-C242标准曲线

³生物素-C242标准曲线

卵巢癌患者的流散CA6的pM水平与CanAg阳性癌症患者的流散CanAg的计算pM水平的比较显示，一般地，流散出的CA6水平与流散出的CanAg水平类似。此外，16例卵巢癌患者的血清样品中仅有2例可能具有4.5nM以上的CA6水平，(血清样品5和9，它们的信号超出了标准曲线的范围)，在该水平之上，在Her2/neu阳性乳癌患者的临床试验中观察到可改变herceptin药物动力学。在37例临床试验患者中，仅有3例被发现CanAg水平高于4.5nM。在该临床试验中，流散CanAg水平与cantuzumab mertansine的更快清除没有关联。然而，具有最高CanAg水平(31240U/ml)的患者仅仅在输注后8小时被取样。这些结果表明，Muc1的一些表位，例如CA6和CanAg，虽然在癌症患者中流散出来，但其流散出的水平未达到抑制抗体治疗剂治疗的水平。

实施例6：克隆鼠DS6抗体可变区

在临床情况中，鼠单克隆抗体例如DS6具有有限的效用，因为它们被人免疫系统识别为外源物。患者很快生成人抗鼠抗体(human anti-mouse antibodies(HAMA))，这导致鼠抗体的快速清除。因此，鼠DS6(muDS6)的可变区被表面重构，以产生人源化DS6(huDS6)抗体。

通过RT-PCR克隆鼠DS6抗体可变区。使用Qiagen RNeasy小量制备试剂盒，从DS6杂交瘤细胞的汇合T175瓶纯化出总RNA。通过UV分光光度法测定RNA浓度，使用Gibco Superscript II试剂盒和随机六聚体引物，用4-5μg总RNA进行RT反应。

用简并引物进行PCR反应，基于Wang Z等，J Immunol Methods.Jan 13；233(1-2)：167-77(2000)中所述。RT反应混合物被直接用于简并PCR反应。使用3′轻链引物HindKL，

(TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC)(SEQ IDNO：25)

和3′重链引物BamIgGl，

(GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC)(SEQ ID NO：26)，

对于5′端的PCR引物，轻链的引物为SaclMK

(GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA)(SEQ ID NO：27)，

重链的引物为

EcoR1MH1(CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC)(SEQ ID NO：28)和

EcoR1MH2(CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG)(SEQ ID NO：29)的均等混合物(混合碱基：H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+T+G+C)。

PCR反应是标准的，例外的是用10％DMSO补充PCR反应(50μl反应混合物，含有如下的终浓度物质：1×反应缓冲液(ROCHE)，2mM的每一种dNTP，1mM的每一种引物，2μl RT反应产物，5μl DMSO和0.5μl Taq(ROCHE))。使用修改自Wang Z等，(J Immunol Methods.Jan 13；233(1-2)：167-77(2000))的程序，在MJ研究型热循环仪上，进行PCR反应：1)94℃，3分钟；2)94℃，15秒；3)45℃，1分钟；4)72℃，2分钟；5)循环回到步骤2，29次；6)在72℃用10分钟的最终延伸步骤结束。通过由PCR引物产生的限制性酶将PCR产物克隆到pBluescript II SK+(Stratagene)中。Seqwright测序服务对重链和轻链克隆进行测序。

为了确认5′末端cDNA序列，进行另外的PCR和克隆。由简并PCR克隆测定的DS6轻链和重链cDNA序列被放入NCBI的Blast搜索网站，带有已提交的信号序列的鼠抗体序列被保存。利用在相关DNA序列中的保守序列，由这些信号肽设计出PCR引物。EcoRI限制性位点被加入到前导序列引物中(表7)，这些被用于RT-PCR反应中，如上所述。

表7

几个单独的轻链和重链克隆被测序，以鉴定并避免可能的由聚合酶产生的序列错误。对于轻链和重链RT-PCR克隆，仅仅获得单一的序列。这些序列对于设计可以扩增延伸到信号序列中的鼠DS6轻链和重链序列的引物来说是足够的。来自这些继续的PCR反应的随后的克隆确认了可变区的5′末端序列，其曾被最初的简并引物改变。来自各种cDNA克隆的累加结果提供了在图9中所呈现的最终鼠DS6轻链和重链序列。使用Kabat和AbM定义，鉴定了三个轻链和重链CDRs(图9和10)。对NCBI IgBlast数据库的搜索显示，muDS6抗体轻链可变区最可能衍生自鼠IgVκ ap4胚系基因，而重链可变区最可能衍生自鼠IgVh J558.41胚系基因(图11)。

实施例7：DS6抗体的可变区表面残基的测定

由Pedersen等(1994)和Roguska等(1996)描述的抗体表面重构技术始于预测鼠抗体可变序列的表面残基。表面残基被定义为这样的氨基酸，即，其总表面积的至少30％可接近水分子。在缺乏解析结构以发现muDS6的表面残基的情况下，我们对127个抗体结构资料中的10个具有最同源序列的抗体进行比对(图12)。这些被比对的序列的每一个Kabat位置的溶剂可及性被平均(图13A和B)。

平均可及性在25％到35％之间的表面位置经历第二轮分析，通过比较在任一侧含有两个相同残基的抗体亚型进行(图13A和B)。第二轮分析之后，muDS6重链的21个预测表面残基被增加为23个，Tyr3和Lys23被加入到具有30％以上的预测表面可及性的残基列表中。在我们的大部分表面重构抗体中，使用了重链CDR1的Kabat定义，但是对于DS6，在计算过程中不经意使用了AbM定义，因此重链残基T28没有被定义为骨架表面残基，否则它则可能是。轻链表面位置的数目从16减少到15，因为在第二轮分析中，Ala80的预测表面可及性从30.5％减少到27.8％。muDS6重链和轻链可变序列合起来具有38个预测的表面可及骨架残基。

实施例8：人抗体选择

将鼠DS6可变区的表面位置与Kabat数据库中人抗体序列中的相应位置进行比较(Johnson G，Wu TT.Nucleic Acids Res.Jan1；29(1)：205-6(2001))。使用抗体数据库管理软件SR(Searle，1998)提取并比对来自天然重链和轻链人抗体对的表面残基。选择具有最相同表面残基的人抗体可变区表面——对位于之内的位置给与特别考虑，以代替鼠DS6抗体可变区表面残基。

实施例9：嵌合和人源化抗体的表达载体

轻链和重链成对序列被克隆到单个哺乳动物表达载体中。人可变序列的PCR引物产生了限制性位点，这使得人信号序列被加入到pBluescriptII克隆载体中。然后，可变序列可以被克隆到哺乳动物表达质粒中，该质粒具有分别针对轻链或重链的EcoRI和BsiWI或HindIII和ApaI位点(图14)。轻链可变序列符合读框地被克隆到人IgKappa恒定区上，重链可变序列被克隆到人IgGammal恒定区序列上。在最终的表达质粒中，人CMV启动子驱动轻链和重链cDNA序列的表达。

实施例10：可能负面影响DS6活性的残基的鉴定

到目前为止，在大部分的人源化处理中，目标抗体的分子模型已被建立，从而鉴定出位置最接近CDR的残基作为潜在的问题残基(problem residues)。由于被研究的表面重构抗体的数目在不断增加，因此历史经验在预测问题方面至少和建模是一样有效的，因此未建立DS6的分子模型。相反，将鼠DS6表面残基与那些先前表面重构的抗体的残基进行比较，具有影响抗体结合活性的低至高风险的残基被鉴定。

在可获得的解析抗体结构和来自先前的人源化工作的分子模型中，相似的残基组被重复鉴定为位于CDR的之内。使用该数据，表1提供了可能最接近及可能位于CDR的之内的鼠DS6残基。在先前的人源化中，这些位置中的许多也已经被改变，但是仅有重链位置74曾经导致结合活性损失。在huC242和huB4中，鼠残基被保留在该位置，目的是保存鼠抗体的结合活性。另一方面，在人源化6.2G5C6中，此相同的位置被变成对应的人残基，而没有损失活性(6.2G5C6为抗IGF1-R抗体，经常被简单称作抗C6)。尽管表1中的任何残基都可能在人源化抗体中是个问题，然而重链残基P73将特别受到关注，考虑到关于该位置的先前的经验。

实施例11：最同源的人表面的选择

使用SR软件，从Kabat抗体序列数据库中找出用于表面重构muDS6的候选人抗体表面。该软件提供了一个界面，仅仅搜索针对该抗体数据库的特定残基位置。为了保留天然的配对，轻链和重链的表面残基被一起进行比较。来自Kabat数据库的最同源人表面按序列同一性的等级被排列。由SR Kabat数据库软件排列的前3个表面被提供在表2中。然后将这些表面进行比较，以鉴定哪些人表面将需要对在表1中所鉴定的残基作最少的变化。抗Rh(D)抗体，28E4(Boucher等，1997)，需要最少数目的表面残基变化(总共11)，而且这些残基中仅有三个被包括在潜在问题残基的列表中。因为28E4抗体提供最同源的人表面，它是表面重构muDS6的最佳候选者。

实施例12：人源化DS6抗体的DNA序列的构建

使用PCR诱变来进行DS6的11个表面残基的改变。在鼠DS6可变区cDNA克隆上进行PCR诱变，构建表面重构人DS6基因。人源化引物组被设计成产生表面重构DS6所需的氨基酸变化，如下表8中所示。

表8

PCR反应是标准的，不同的是用10％DMSO补充所述反应(50μl反应混合物，含有如下终浓度的物质：1×反应缓冲液(ROCHE)，2mM每种dNTP，1mM每种引物，100ng模板，5μl DMSO和0.5μl Taq(ROCHE))。它们按下列步骤，在MJ Research热循环仪上运行：1)94℃，1分钟；2)94℃，15秒；3)55℃，1分钟；4)72℃，1分钟；5)循环回到步骤2 29次；6)用72℃4分钟的最终延伸步骤结束。PCR产物用其相应的限制性酶消化，并将其克隆到pBluescript克隆载体中。对克隆进行测序，以确认氨基酸变化。

因为改变重链残基P73在过去已经引起过问题，所以建立了两种形式的重链，一种具有人28E4 T73，一种保留鼠P73。在两种形式的人源化DS6中，其它10个表面残基从鼠变为人28E4残基(表2)。忠于通常的命名方法，最人源化的是1.0形式，因为它具有所有11个人表面残基。在需要其它形式的情况下，保留P73的重链形式被命名为1.2形式，因此1.1形式保留为包含最多的鼠残基数的形式。在图15A和B中显示了与鼠DS6氨基酸序列进行比对的这两种人源化形式的氨基酸序列。这两种人源化DS6抗体基因都被克隆到抗体表达质粒(图14)，用于瞬时和稳定的转染。人源化形式1.01和1.21的轻链可变区的cDNA和氨基酸序列是相同的，并被示于图16中。人源化形式1.01和1.21的重链cDNA和氨基酸序列被示于图17A和B中。

实施例13：huDS6在CHO细胞中的表达和纯化与亲和力测定

为了测定人源化DS6形式是否保留了msDS6的结合亲和力，表达并纯化所述抗体是必需的。用具有人恒定区和鼠可变区的嵌合形式的DS6(chDS6)，或应用huDS6v1.01或huDS6v1.21稳定转染CHO细胞系。

将CHODG44细胞(4.32×10⁶个细胞胞/板)接种于非选择性培养基(α-MEM+核苷酸(Gibco)，补充以4mM L-谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素和10％v/v FBS)中的15cm板中，并放置于37℃，5％CO₂湿润温育箱中。第二天，使用Qiagen推荐的Polyfect Transfection方案的修改版本，用chDS6表达质粒转染细胞。从细胞中吸走非选择性培养基。用7ml预热(37℃)PBS洗板，并用20ml非选择性培养基再次充填所述板。将质粒DNA(11μg)稀释到800μlHybridoma SFM(Gibco)中。然后，将70μl Polyfect(Qiagen)加入到DNA/SFM混合物中。然后将该Polyfect混合物轻轻涡旋几秒钟，并在室温下温育10分钟。将非选择性培养基(2.7ml)加入混合物中。将此最终混合物与铺板的细胞温育24小时。

从板中除去转染混合物/培养基，然后对细胞进行胰蛋白酶处理并计数。然后，以不同的浓度(1800、600、200和67个细胞/孔)，将铺板于选择性培养基(α-MEM-核苷酸，补充以4mM L-谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，10％v/v FBS，1.25mg/ml G418)中的细胞置于96孔板(250μl/孔)。将细胞培养2-3周，如果必要，补充培养基。使用定量ELISA筛选各孔的抗体生产水平。将Immulon2HB 96孔板用羊抗人IgG F(ab)₂抗体包被(Jackson Immunoresearch；1μg/孔，在100μl 50mM碳酸钠缓冲液中，pH 9.6)，并在室温下温育1.5h，同时转动。所有随后的的步骤都在室温下进行。用T-TBS(0.1％Tween-20，TBS)洗孔两次，并用200μl的封闭缓冲液(1％BSA，T-TBS)封闭1h。用T-TBS将孔洗两次。在独立的平板中，在封闭缓冲液中，将抗体标准品，EM164(100ng/ml)和培养上清液进行连续稀释(1∶2或1∶3)。将这些稀释物(100μl)转移到ELISA板中，并温育1h。孔用T-TBS洗涤三次，与100μl羊抗人IgG Fc-AP(Jackson lmmunoResearch)温育45分钟，羊抗人IgG Fo-AP已用封闭缓冲液稀释成1∶3000。用T-TBS洗5次之后，使用100μl PNPP显色剂(development reagent)(10mg/ml PNPP(对-硝基苯磷酸二钠盐；Pierce)，0.1M二乙醇胺pH 10.3缓冲液)将孔显色25分钟。在ELISA平板读数计中测量405nm处的吸光度。在标准曲线的线性部分的吸光度读数(为培养物上清液的读数)用于确定抗体水平。

然后对ELISA鉴定出的最高生产克隆进行亚克隆、扩增，并制备冷冻细胞储液。

对于huDS6v1.01和huDS6v1.21的表达，将DG44CHO细胞(Dr.LawrenceChasin，Columbia University，NY)培养在带有核苷和脱氧核苷的Alpha MEM中(Gibco catalog#12571，Grand Island，New York)。所述培养基补充有10％胎牛血清(HyClone catalog#SH30071.03，Logan，UT)、1％庆大霉素(Mediatech catalog#30-005-CR，Herndon，VA)和2mM L-谷氨酰胺(L-glut)(BioWhittaker catalog#17-605E，Walkersville，MD)。此配制物称为CHO完全培养基。

用50μg的huDS6质粒DNA转染DG44CHO细胞(5x106)。转染之前，将细胞从带有胰蛋白酶(Gibco catalog#15090-046，Grand Island，NY)的瓶中移去，用缺乏核苷和脱氧核苷的未补充的Alpha MEM(Gibco catalog#12561，Grand Island，NY)洗涤两次。这被称为洗涤培养基。将细胞与质粒DNA在0.4cm间隔的电极杯(BioRad catalog#1652088，Hercules，PA)中混合。将它们置于冰上2分钟，随后在BioRad电穿孔装置中以1,000μF和260伏特接受作用。电穿孔后，将细胞在冰上温育2分钟。随后将细胞铺在CHO完全培养基中的5个24孔板上(Costar catalog#3524)，随后保持在带有5％CO2的37℃温育器中。48小时后，从孔中去除培养基。用洗涤培养基洗涤细胞一次，并加入不带有核苷和脱氧核苷的未补充的AlphaMEM(Gibco catalog#12561，Grand Island，NY)，所述MEM补充有1％庆大霉素、2mM L-glut、10％透析的胎牛血清(Gibco catalog#26400-044，Grand Island，NY)和1.25mg/mL geneticin(G418)(Gibco catalog#11811，Grand Island，NY)。此完全配制物称为选择培养基。将克隆在选择培养基温育约2周，此时通过定量ELISA筛选它们的抗体产生情况。随后对最高产量的克隆进行亚克隆、扩增，制备冷冻细胞贮液。

为了产生足够量的抗体用以纯化，用补充有Ultra Low IgG FBS(Gibco)的30ml选择性培养基在15cm板上扩增细胞(～1×10⁶细胞/板)，并培养1周。将培养上清液收集到250ml锥形管中，在台式离心机中旋转沉降(2000rpm，5分钟，4℃)，然后通过0.2μm滤器进行无菌过滤。

为了纯化DS6，将NaOH加入到过滤的培养上清液中，达到最终pH为8.0。用20-50个柱体积的结合缓冲液平衡Hi Trap rProtein A柱(Amersham)。使用蠕动泵将上清液加样到柱上。然后，用50个柱体积的结合缓冲液洗柱。使用洗脱缓冲液(100mM乙酸，50mM NaCl，pH 3)将结合的抗体从柱中洗脱到放置在分级收集器的试管组中。用中和缓冲液(2M K₂HPO₄，pH 10.0)中和洗脱下来的抗体，并在PBS中过夜透析。将透析的抗体通过0.2μm针筒式滤器过滤。测量280nm处的吸光度，以测定最终的蛋白质浓度。

通过流式细胞术来比较纯化的huIgG和muDS6的亲和力。在第一组试验中，测量与CA6-表达细胞系KB的直接结合。如图18所示，muDS6、chuDS6、huDS6v1.01和huDS6v1.21显示出非常相似的亲和力，其表观Kd分别为0.82nM、0.69nM、0.82和0.85nM，这表明表面重构没有破坏CDRs。为了确证huDS6形式保留了muDS6的亲和力，进行了竞争性结合试验。这一方式的优势在于同样的检测体系被用于鼠和人抗体；即生物素-muDS6/链霉抗生物素蛋白-DTAF。比较muDS6、chuDS6、huDS6v1.01和huDS6v1.21与生物素-DS6竞争能力的竞争性结合试验的结果在图19中示出。muDS6、chuDS6、huDS6v1.01和huDS6v1.21的表观EC50分别为1.9nM、1.7nM、3.0和1.9nM。这些结果说明，用以产生人源化DS6的对muDS6的表面重构几乎没有引起结合亲和力降低。

实施例14：DS6-DM1细胞毒性偶联物的制备

使用8倍摩尔过量的N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶二硫代)戊酸酯(SPP)修饰muDS6抗体(8mg/ml)，以引入二硫吡啶基。在室温下，在95％v/v缓冲液A(50mMKPi，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 6.5)和5％v/v DMA中将反应进行2h。通过NAP或Sephadex G25柱(在缓冲液A中平衡)将稍微膨胀的反应混合物进行凝胶过滤。通过测量抗体在280nm处的吸光度以及DTT释放的2-巯基吡啶(Spy)在280和343nm处的吸光度，测定修饰的程度。然后以2.5mg Ab/mL，使用相对于Spy为1.7倍摩尔过量的N^2’-脱乙酰基-N-^2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素(L-DM1)对修饰的muDS6进行偶联。在缓冲液A(97％v/v)和DMA(3％v/v)中进行此反应。将反应在室温下温育整夜，～20h。离心不透明反应混合物(1162×g，10分钟)，然后将上清液通过用缓冲液B(1X PBS pH 6.5)平衡的NAP-25或S300(Tandem 3，3x 26/10脱盐柱，G25介质)柱进行凝胶过滤。去除沉淀。使用0.22μm Millex-GV滤器将偶联物无菌过滤，然后在缓冲液B中用Slide-A-Lyzer进行透析。通过测量过滤后物质在252nm和2g0nm处的吸光度，测定每分子muDS6连接的DM1分子的数目。DM1/Ab比为4.36，偶联MUDS6的阶段收率为55％。偶联抗体浓度为1.32mg/mL。通过尺寸排阻层析(SEC)对纯化的偶联物进行生化表征，发现该偶联物92％为单体。纯化的偶联物中的DM1的分析显示，99％与抗体共价结合。在图20中，muDS6-DM1偶联物和未修饰的muDS6与Caov-3细胞的流式细胞结合分析表明，muDS6的偶联导致亲和力仅有些许损失。

实施例15：muDS6-DM1在体外的细胞毒性

作为裸抗体，muDS6已经显示在细胞培养物中没有增殖或生长抑制活性(图21)。然而，当在存在DM1偶联至羊抗鼠IgG重链和轻链的情况下，将细胞与muDS6温育时，muDS6非常有效地将该偶联物靶向并传送到细胞上，导致间接的细胞毒性(图21)。为了进一步测定裸muDS6的固有活性，使用muDS6进行了补体依赖性细胞毒性(CDC)测定。在存在5％人或兔血清和muDS6的各种稀释物的情况下，HPAC和ZR-75-1细胞(25000个细胞/孔)被置入96孔板，在200μl RHBP培养基(RPMI-1640，0.1％BSA，20mM HEPES(pH 7.2-7.4)，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素)中。在37℃温育细胞2h。然后将Alamar Blue(10％的终浓度)试剂(Biosource)加入上清液中。在测量荧光之前，将细胞温育5-24小时。在补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中，鼠DS6没有作用(图22)。这表明muDS6的治疗应用需要结合毒性效应分子。

用不同的DS6阳性细胞系，使用两种不同的测定形式来检验美登素类偶联的DS6抗体的细胞毒性。进行了集落生成分析，其中细胞(1000-2500个细胞/孔)被铺在6孔板中，处于用培养基稀释的2ml偶联物中。在几个浓度下，一般在3×10^-11M到3×10^-9M之间，将细胞持续暴露于偶联物，并在37℃，6％CO₂湿气箱中温育5-9天。用PBS洗涤孔，并用1％w/v结晶紫/10％v/v甲醛/PBS溶液染色集落。然后用蒸馏水从孔中充分洗去未结合的染料，并使板干燥。使用LeicaStereoZoom 4解剖显微镜对集落进行计数。

植板效率(plating efficiency)(PE)被计算为集落数目/被铺板细胞的数目。存活分数被计算为处理细胞的PE/未处理细胞的PE。通过绘制细胞存活分数对偶联物的摩尔浓度，测定IC₅₀浓度。在集落生成试验中(图23)，muDS6-DM1对杀死Caov-3细胞是有效的，其估算的IC₅₀为800pM。浓度为3×10^-9M的偶联物对抗原阴性细胞A375仅有稍微的影响，3×10^-9M为被测试的muDS6-DM1的最高浓度，这表明偶联物的细胞杀伤活性是特异性地针对抗原表达细胞。然而，尽管对美登素是明显敏感的，许多其它的DS6阳性细胞系对免疫偶联物不是特别敏感。所有的子宫颈细胞系(HeLa，KB和WISH)都对该偶联物敏感，然而，仅有选择数目的卵巢和乳腺细胞系显示出任何细胞毒性效应。胰腺细胞系看起来无一受到影响。

在MTT分析中，细胞以1000-5000个细胞/孔的密度被植入96孔板中。细胞被铺在板中，裸muDS6或muDS6-DM1免疫偶联物用200μl培养基作连续稀释。样品一样三份操作。然后将细胞和抗体/偶联物混合物温育2-7d，此时通过MTT([3(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物])分析来评价细胞存活率。将MTT(50μg/孔)加入培养上清液中，并使其在37℃温育3-4h。除去培养基，将MTT formazan溶于DMSO(175μl/孔)中。测量540-545nm处的吸光度。在MTT细胞存活率分析中(图24C)，免疫偶联物能有效杀死Caov-3细胞，其估计IC₅₀为1.61nM。与没有效果的裸抗体相比较，具有最高浓度的偶联物的孔中未含存活的细胞(图21和图24)。

在其它细胞系上的MTT分析的结果稍稍不同(图24A、B和D-I)。在许多情况下，尽管观察到一些细胞毒性，偶联物不能完全杀死全部细胞群(除了WISH细胞)。BT-20、OVCAR5和HPAC细胞是特别具有抗性的：在最高的偶联物浓度(32nM)孔中，超过50％的细胞仍是活的。

实施例16：体内偶联物抗肿瘤活性

为了证明muDS6-DM1偶联物在体内的活性，在SCID鼠中建立了人肿瘤异种移植。人子宫颈癌细胞系KB的皮下模型被建立。KB细胞在体外生长，收集并将5×10⁶个细胞于100μL无血清培养基中注入每只鼠的右肩下，并使其生长6天，平均肿瘤体积达144±125mm³，此时开始药物处理。鼠每天被静脉给予PBS，150μg/kg DM1的偶联物，或者225μg/kg DM1的偶联物(每组两只鼠)，共5天。在治疗期间每天监测毒性反应。在研究过程中，监测肿瘤体积(图25A)和相应的体重(图25B)。

用PBS对照处理的KB肿瘤生长迅速，其倍增时间大约为4天。相反，对于225μg/kg和150μg/kg剂量组，分别在处理开始之后的14天和18天，用偶联物处理的两组鼠都显示出完全的肿瘤消退。在150μg/kg剂量下，肿瘤延迟大约70天。在225μg/kg下的处理导致治愈，因为在第120天研究终止时，无肿瘤复发的迹象。如在图25B中所观察到的，在150μg/kg组中的鼠显示无重量损失，表明剂量得以很好的耐受。在更高的剂量，鼠的体重仅仅发生临时性的3％的降低。在5天的治疗期间，鼠未显示明显中毒迹象。总言之，该研究显示，muDS6-DM1处理能够以非毒性剂量治愈有KB异种移植肿瘤的鼠。

在一组皮下异种移植物模型上进一步测试DS6-DM1活性(见图26)。被用于制备异种移植物的肿瘤细胞系显示了一定范围的体外美登素敏感性和CA6表位密度(下面的表9)。OVCAR5细胞和TOV-21G为卵巢肿瘤细胞系；HPAC为胰腺肿瘤细胞系；HeLa为子宫颈肿瘤细胞系。OVCAR5和TOV-21G细胞具有低的表面CA6表达；HeLa细胞具有中等水平的表面CA6表达；HPAC细胞具有高的表面表达的CA6密度。TOV-21G和HPAC细胞对美登素敏感；OVCAR5和HeLa细胞对美登素的敏感性少2-7倍。

表9

^*平均最大相对平均荧光

四种细胞系在体外培养，收集，将100μL无血清培养基中的1×10⁷个细胞注入每只鼠的右肩下(每个模型6只鼠)，并使其生长6天，对于OVCAR5的测试组和对照组，平均肿瘤体积分别达57.6±6.7和90.2±13.4mm³，对于HPAC的测试组和对照组，分别达147.1±29.6和176.2±18.9mm³，对于HeLa的测试组和对照组，分别达194.3±37.2和201.7±71.7mm³，对于TOV-21G的测试组和对照组，分别达96.6±22.8和155.6±13.4mm³，此时开始药物治疗。对于每个模型，用两次周剂量的PBS静脉处理三只对照鼠，用两次周剂量的偶联物(600μg/kgDM1)静脉处理三只测试鼠。在治疗期间每天监测毒性反应，在研究过程中监测肿瘤体积和体重。针对各种模型的偶联物效果被图形示于图26A、C、E和G中，相应的体重被绘制在图26B、D、F和H中。OVCAR5、TOV-21G和HPAC细胞系形成侵入性肿瘤，正如在每个模型的PBS对照中所观察的。在开始指数生长之前，HeLa模型具有大约3周的滞后期。在所有模型中，DS6-DM1偶联物处理导致在所有的鼠中出现完全的肿瘤消退。对于TOV-21G、HPAC和HeLa模型，鼠在第61天保持无肿瘤。在OVCAR5模型中，在肿瘤接种之后大约45天，肿瘤复发。因此，在该模型中的muDS6-DM1处理导致肿瘤生长延迟大约34天。生长延迟是有意义的，因为OVCAR5细胞对美登素较不敏感，而且具有低的CA6表位表达。在一些模型中，CA6表位密度更高或者模型具有更大的美登素敏感性，肿瘤消退则更加强劲。要注意到仅仅施用了两次剂量，这是很重要的。很明显，本研究中应用的剂量方案对鼠没有毒性，因为没有观察到重量损失。用额外的或更高的偶联物剂量则可能实现治愈。

人卵巢癌大多是腹膜的疾病。OVCAR5细胞在SCID鼠中侵袭性地生长为腹膜内(IP)模型，形成肿瘤结节，并以与人类疾病相似的方式产生腹水。为了证明在IP模型中的活性，muDS6-DM1被用于治疗具有OVCAR5 IP肿瘤的鼠(图27)。OVCAR5细胞在体外生长，收获，并将100μL无血清培养基中的1×10⁷个细胞进行腹膜内注射。使肿瘤生长6天，此时开始治疗。或用PBS或用在600μg/kg DM1剂量的DS6-DM1偶联物每周处理鼠，共两周，并监测由腹膜疾病导致的体重损失。到28天时，PBS组的鼠已经损失了20％以上的体重，其被处死。在第45天，在治疗组的体重损失超过20％之后将其处死。该研究表明，muDS6-DM1能够延迟侵袭性OVCAR5 IP模型中的肿瘤生长，尽管存在这样的事实，即，OVCAR5细胞对美登素较不敏感，而且每个细胞具有很少的CA6表位。因为所用的剂量方案未引起可见的毒性迹象，所以额外的或更高的剂量可能被用于实现进一步的肿瘤生长延迟或治愈。

实施例17：DS6-SPP-MM1-202 Taxoid细胞毒性偶联物的合成和表征

用N-磺基琥珀酰亚胺基4-硝基-2-吡啶-戊酸酯(SSNPP)接头修饰muDS6。将10当量的在DMA中的SSNPP加入到90％缓冲液A、10％DMA中的50mgmuDS6Ab中。Ab的终浓度为8mg/ml。在室温下，将反应搅拌4小时，然后通过G25层析纯化。使用在280nm(抗体)和325nm(接头)处的吸光度，分光光度法测量抗体修饰的程度，发现具有3.82个接头/抗体。抗体回收为43.3mg，收率为87％。用Taxoid MM1-202(1812 P.16)来偶联muDS6-nitroSPP偶联物。在90％缓冲液A、10％DM1中以42mg的规模进行此偶联。在大约20小时的期间内，将taxoid以4等份的0.43eq/接头(每等份)加入。此时，反应已经变得明显浑浊。在G25纯化之后，所得到的偶联物，其以大约64％的收率被回收，具有大约4.3个taxoid/Ab，大约1当量的未反应的接头剩余。为了终止未反应的接头，将1当量的半胱氨酸/未反应接头加入偶联物中，同时过夜搅拌。在半胱氨酸加入时，一定的黄色色调是显著的，这表明了硫代吡啶的释放。然后在缓冲液B/0.01％Tween 20中透析反应溶液，接着在单独的缓冲液B中进一步透析数天。最终的偶联物具有2.86个药物/抗体。抗体回收量为14.7mg，总共产生35％的收率。通过SEC进一步对偶联物进行生化表征，其被发现具有89％单体、10.5％二聚物和0.5％更高分子量的聚集体。

流式细胞术分析比较了muDS6-SPP-MM1-202 taxoid和muDS6抗体在HeLa细胞上的结合，结果被示于图28。此结果显示，当muDS6偶联至紫杉烷时，其保留了结合活性。

实施例18：人源化DS6偶联物的体外和体内活性

构建huDS6v1.01-SPDB-DM4偶联物。此偶联物类似于实施例14中描述的muDS6-SPP-DM1偶联物，除了偶联物中的接头/美登素药物部分在二硫键周围的结构不同；muDS6-SPP-DM1偶联物在接头的抗体侧的二硫碳上具有一个甲基位阻，而SPDB-DM4偶联物在接头的美登素侧的二硫碳上具有两个甲基位阻。

huDS6v1.01抗体(8mg/ml)用8倍摩尔数过量的N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)修饰，以引入二硫代吡啶基。在95％v/v缓冲液A(50mMKPi，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 6.5)和5％v/v乙醇中室温下进行反应1.5小时。反应混合物通过15ml Sephadex G25柱(在缓冲液A中平衡)凝胶过滤。通过测定抗体在280nm的吸光度和DTT释放的2-巯基吡啶(Spy)在280和343nm的吸光度，测定修饰程度。然后以1.8mg Ab/mL，使用相对于Spy为1.7倍摩尔过量的N^2’-脱乙酰基-N-^2’-(4-甲基4-巯基-1-氧苯基)-美登素(L-DM4)对修饰的DS6进行偶联。在缓冲液A(97％v/v)和DMA(3％v/v)中进行此反应。将反应在室温下温育过夜，～20h。相对于muDS6偶联，此反应混合物清澈，立即通过在柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸盐，135mM NaCl，pH 5.5)平衡的NAP15ml 25G柱进行凝胶过滤。使用0.22μm Millex-GV滤器将偶联物无菌过滤。通过测量过滤的物质在252nm和280nm处的吸光度，测定每分子DS6连接的DM4分子的数目。发现DM4/Ab比为3.2，偶联DS6的阶段收率为69％。偶联的抗体浓度为1.51mg/mL。通过尺寸排阻层析(SEC)对纯化的偶联物进行生化表征，发现该偶联物为92.5％单体。纯化的偶联物中的DM4的分析显示，＞99％与抗体共价结合。

在图29A中，huDS6v1.01-DM4偶联物和未修饰的DS6与KB细胞的流式细胞结合表明，huDS6v1.01的偶联使得亲和力基本不丧失。基本上如图20所示进行所述结合，除了应用KB细胞而不是CaOv-3细胞。基本上如图24G所述测定huDS6v1.01的体外毒性。huDS6v1.01杀死WISH细胞，IC₅₀是4.4×10^-10M，而未偶联huDS6v1.01未表现出细胞毒性活性。

huDS6v1.01-DM4的体内活性在HPAC胰腺模型中测定。在第0天接种HPAC细胞，在第13天进行免疫偶联处理。一旦肿瘤体积超过1000mm³，处死PBS对照动物。以200μg/kg或600μg/kg DM4的剂量给予偶联物，这分别对应于抗体浓度15mg/kg和45mg/kg。在研究期间监测小鼠的肿瘤体积(图30A)和体重(图30B)。huDS6v1.01-DM4在200μg/kg DM4时表现出有效的抗肿瘤活性，所有小鼠取得完全的肿瘤消退。识别HPAC异种抑制物上不表达的抗原的对照B4-DM4偶联物在200μg/kg基本上无活性。小鼠体重末丢失(图30B)表明，用200μg/kg偶联物处理低于最大耐受剂量。这一结果表明，人源化形式的DS6能够介导美登素类药物的靶向输送，实现有效的抗肿瘤活性。

本发明特别地涉及以下各项：

1.抗体或其表位结合片段，包含至少一个重链可变区或其片段和至少一个轻链可变区或其片段，其中所述重链可变区或其片段与选自SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ IDNO：11的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性：

2.第1项所述的抗体或其表位结合片段，其中所述重链可变区或其片段与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。

3.第1项所述的抗体或其表位结合片段，其中所述重链可变区或其片段具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

4.第1项所述的抗体或其表位结合片段，其中所述轻链可变区或其片段与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性：

5.第1项所述的抗体或其表位结合片段，其中所述轻链可变区或其片段与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。

6.第1项所述的抗体或其表位结合片段，其中所述轻链可变区或其片段具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

7.第1项所述的抗体或其表位结合片段，其中所述重链可变区或其片段具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区或其片段具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

8.多核苷酸，其编码根据第1项所述的抗体或其表位结合片段。

9.多核苷酸，其编码根据第4项所述的抗体或其表位结合片段。

10.多核苷酸，其编码根据第7项所述的抗体或其表位结合片段。

11.多核苷酸，其编码根据第1项所述的抗体或其表位结合片段的重链。

12.表达载体，其包括第8项所述的多核苷酸。

13.表达载体，其包括第9项所述的多核苷酸。

14.表达载体，其包括第10项的多核苷酸。

15.宿主细胞，其包括第12项所述的表达载体。

16.宿主细胞，其包括第13项所述的表达载体。

17.宿主细胞，其包括第14项所述的表达载体。

18.制备抗体或其表位结合片段的方法，包括在促进所述抗体或其表位结合片段表达的条件下培养第15项所述的宿主细胞，和从所述细胞培养物回收所述多肽，其中所述抗体或其表位结合片段包括至少一个重链可变区或其片段和至少一个轻链可变区或其片段，其中所述重链可变区或其片段与选自SEQ ID NO：9、SEQID NO：10和SEQID NO：11的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性：

19.制备抗体或其表位结合片段的方法，包括在促进所述抗体或其表位结合片段表达的条件下培养第16项所述的宿主细胞，和从所述细胞培养物回收所述多肽，其中所述重链可变区或其片段与选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性：

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：10)

QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：11)，

并且其中所述轻链可变区或其片段与SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性：

20.制备抗体或其表位结合片段的方法，包括在促进所述抗体或其表位结合片段表达的条件下培养第17项所述的宿主细胞，和从所述细胞培养物回收所述多肽，其中所述重链可变区或其片段具有SEQID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区或其片段具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

Claims

1.一种抗体或其表位结合片段，包含至少一个重链可变区或其片段和至少一个轻链可变区或其片段，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的抗体或其表位结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

3.一种细胞毒性偶联物，包含权利要求1或2所述的抗体或其表位结合片段和细胞毒性剂。

4.权利要求3所述的细胞毒性偶联物，其中所述细胞毒性剂是美登素类。

5.权利要求3所述的细胞毒性偶联物，其中所述美登素类和所述抗体或其表位结合片段通过酸不稳定键、光不稳定键、二硫键、肽酶不稳定键或酯酶不稳定键共价连接。

6.一种包含抗体或其表位结合片段和通过SPDB接头共价连接的细胞毒性剂的细胞毒性偶联物，其中

所述抗体或其表位结合片段包含至少一个重链可变区或其片段和至少一个轻链可变区或其片段，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

7.权利要求6所述的细胞毒性偶联物，其中所述细胞毒性剂是紫杉烷。

8.一种监测接受人源化DS6抗体或其表位结合片段的乳腺癌患者的治疗的方法，所述抗体或其表位结合片段包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6所示的CDR序列，所述方法包括使从所述患者获得的样品与其识别的表位不同于DS6所识别表位的抗-CA6抗体接触。

9.一种测定抗-muc1抗体或其抗原结合片段的抗肿瘤活性的方法，包括在体外使BT-20、BT-483、Caov-3、Caov-4、HeLa、HPAC、HPAF-II、Hs766T、KB、OVCAR5、T-47D、TOV-21G、WISH和ZR75-1细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触。